KR20160073885A - 유전자 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

유전자 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 측면은 표적 유전자의 발현을 활성화하기 위해 후보물질 올리고뉴클레오타이드를 선택하는 방법들을 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 표적 유전자의 발현을 활성화하는 올리고뉴클레오타이드들이 풍부한 올리고뉴클레오타이드 세트를 선택하는 방법들을 제공한다. 또 다른 측면들은 유전자 발현을 조절하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드들, 및 이들을 포함하는 조성물 및 키트를 제공한다. 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드들을 사용하여 유전자 발현을 조절하는 방법들도 또한 제공된다.

Description

유전자 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING GENE EXPRESSION}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2012년 5월 16일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING GENE EXPRESSION”인 미국 가출원 제61/648,016호, 2012년 5월 16일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING GENE EXPRESSION”인 미국 가출원 제61/648,021호, 2013년 3월 14일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING GENE EXPRESSION”인 미국 가출원 제 61/786,232호, 2012년 5월 16일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING SMN GENE FAMILY EXPRESSION”인 미국 가출원 제 61/647,858호, 2012년 10월 27일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING SMN GENE FAMILY EXPRESSION”인 미국 가출원 제 61/719,394호, 2013년 3월 14일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING SMN GENE FAMILY EXPRESSION”인 미국 가출원 제 61/785,529호, 2012년 5월 16일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING UTRN EXPRESSION”인 미국 가출원 제 61/647,886호, 2012년 5월 16일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING HEMOGLOBIN GENE FAMILY EXPRESSION”인 미국 가출원 제 61/647,901호, 2013년 3월 14일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING HEMOGLOBIN GENE FAMILY EXPRESSION”인 미국 가출원 제 61/785,956호, 2012년 5월 16일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING ATP2A2 EXPRESSION”인 미국 가출원 제 61/647,925호, 2013년 3월 14일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING ATP2A2 EXPRESSION”인 미국 가출원 제 61/785,832호, 2012년 5월 16일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING APOA1 AND ABCA1 EXPRESSION”인 미국 가출원 제 61/647,949호, 2013년 3월 14일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING APOA1 AND ABCA1 EXPRESSION”인 미국 가출원 제 61/785,778호, 2012년 5월 16일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING PTEN EXPRESSION”인 미국 가출원 제 61/648,041호, 2013년 3월 14일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING PTEN EXPRESSION”인 미국 가출원 제 61/785,885호, 2012년 5월 16일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING BDNF EXPRESSION”인 미국 가출원 제 61/648,058호, 및 2012년 5월 16일 출원된 발명의 명칭이 “COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING MECP2 EXPRESSION”인 미국 가출원 제 61/648,051호을 35 U.S.C. §119(e)하에, 그 이익을 주장하고 있으며, 상기 문헌들 각각의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
기술분야
본 발명은 올리고뉴클레오타이드계 조성물, 뿐만 아니라 질병 치료를 위한 올리고뉴클레오타이드계 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.
전사체 분석으로부터, 포유동물 게놈의 1-2%만 단백질 코딩한다 하더라도, 70-90%가 전사 활성이라는 사실이 제시되었다. 최근의 발견들은 상기 비-단백질 코딩 전사물들의 서브셋이 유전자 외적 조절에 중요한 역할을 한다고 주장하고 있다. 이들의 편재성에도 불구하고, 많은 상기 전사물들의 구조 및 기능이 특징화되지 않은채로 남아있다. 최근의 연구들은 일부 긴 비-코딩 RNA들이 폴리콤 억제 복합체2(PRC2)와의 상호반응을 통한 크로마틴 리모델링에서 유전자 외적 조절물질/RNA 보조인자로서 기능하고, 따라서 유전자 발현을 조절하는 기능을 한다는 것을 보여준다.
본 발명의 양태들은 표적 유전자들의 발현을 활성화 또는 개선시키기 위한 올리고뉴클레오타이드를 선택하는 방법들을 제공한다. 이 방법들은 질병을 일으키거나 질병에 기여하는 발현 또는 활성을 감소시키기 위한 표적 유전자의 발현을 활성화 또는 개선시키기 위한 후보 올리고뉴클레오타이드를 확인하기 위해 특히 사용가능하다. 본 발명의 또 다른 양태들은 표적 유전자의 발현을 활성화하는 올리고뉴클레오타이드들이 풍부한 올리고뉴클레오타이드들의 세트를 선택하는(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드들의 무작위 선택과 비교되는) 방법을 제공한다. 따라서, 이 방법들은 유전자 발현을 활성화하는 올리고뉴클레오타이드들이 풍부한 임상 후보물질들의 큰 라이브러리들을 확립하는데 사용될 수 있다. 상기 라이브러리들은 예를 들면, 치료제 개발을 위한 리드(lead) 올리고뉴클레오타이드들을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 제공된 방법들은 단백질 코딩 유전자들을 포함하는, 가장 알려져 있는 유전자들의 발현을 표적으로 하기 위한 후보물질 올리고뉴클레오타이드들의 광역 플랫폼을 확립하기 위해 사용가능하다. 또 다른 양태들은 유전자 발현을 조절하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드들, 및 이들을 포함하는 조성물 및 키트들을 제공한다. 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드들을 사용하여 유전자 발현을 조절하는 방법들이 또한 제공된다.
일부 양태들에서, 본 발명은 제1 뉴클레오타이드 서열내 PRC2-연관 영역을 선택하고(제1 뉴클레오타이드 서열은 표적 유전자의 5’말단의 50킬로베이스 상류와 표적 유전자의 3’말단의 50킬로베이스 하류 사이의 제1 염색체의 위치로 맵핑됨); PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 제2 뉴클레오타이드 서열을 결정하고; 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 후보물질 올리고뉴클레오타이드로서 선택함으로써, 표적 유전자의 발현을 활성화하기 위한 후보물질 올리고뉴클레오타이드를 선택하는 방법이며, 상기 올리고뉴클레오타이드는 하기 특징들 중 적어도 하나: a) 5’-X-Y-Z를 포함하는 서열(여기에서, X는 뉴클레오타이드이며, Y는 인간 마이크로RNA의 시드 서열이 아닌 길이가 6개 뉴클레오타이드들인 뉴클레오타이드 서열이며, 및 Z는 길이가 1 내지 23개 뉴클레오타이드들인 뉴클레오타이드 서열이며, X는 올리고뉴클레오타이드의 5’말단에 앵커링됨); b) 3개 이상의 연속 구아노신 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 서열; c) 오프-표적 유전자의 5’말단의 50킬로베이스 상류와 오프-표적 유전자의 3’말단의 50킬로베이스 하류 사이에 있는 제2 뉴클레오타이드 서열과 균등한 길이의 뉴클레오타이드들의 모든 서열들과의 역치 수준보다 낮은 서열 상동성을 갖는 서열; d) 2개 이상의 단일 가닥 루프들을 포함하는 2차 구조를 형성하는 RNA를 코딩하는 PRC2-연관 영역과 상보적인 서열; 및/또는 e)60% 초과 G-C 함량을 갖는 서열을 가진다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 특징들 a), b), c), d), 및 e) 중 1가지만 가진다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 a), b), c), d), 및 e)의 특징들 중 2가지 이상을 가지며, 각각은 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 a), b), c), d), 및 e)의 특징들 중 3가지 이상을 가지며, 각각은 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 a), b), c), d), 및 e)의 특징들 중 4가지 이상을 가지며, 각각은 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 a), b), c), d), 및 e)의 특징들을 각각 가진다. 소정의 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 5'X-Y-Z 서열을 가지며, 올리고뉴클레오타이드의 길이는 8-50개 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, Y는 표 3에서 선택되는 서열이다.
다른 측면에서, 본 발명은 표적 유전자의 발현을 활성화하는 올리고뉴클레오타이드가 풍부한 올리고뉴클레오타이드들 세트를 선택하는 방법으로서, 상기 방법은, 표적 유전자의 5’말단의 50킬로베이스 상류와 표적 유전자의 3’말단의 50킬로베이스 하류 사이의 제1 염색체의 위치로 맵핑하는 제1 뉴클레오타이드 서열내 PRC2-연관 영역을 선택하고; PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 및 하기 특징들 중 적어도 하나를 가지는 올리고뉴클레오타이드들 세트를 선택함으로써 이루어지며: a) 서열: 5’-X-Y-Z(여기에서, X는 특정의 뉴클레오타이드이며, Y는 마이크로RNA의 인간 시드 서열이 아닌, 길이가 6개 뉴클레오타이드들인 뉴클레오타이드 서열이며, 및 Z는 길이가 1 내지 23개 뉴클레오타이드들인 뉴클레오타이드 서열이며, X는 올리고뉴클레오타이드의 5’말단에 앵커링됨); b) 3개 이상의 연속 구아노신 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 서열; c) 오프-표적 유전자의 5’말단의 50킬로베이스 상류와 오프-표적 유전자의 3’말단의 50킬로베이스 하류 사이에 있는 제2 뉴클레오타이드 서열과 균등한 길이의 뉴클레오타이드들의 모든 서열들과 역치 수준보다 낮은의 서열 상동성을 갖는 서열; d) 2개 이상의 단일 가닥 루프들을 포함하는 2차 구조를 형성하는 RNA를 코딩하는 PRC2-연관 영역과 상보적인 서열; 및/또는 e)60% 초과 G-C 함량을 갖는 서열; 및 상기 올리고뉴클레오타이드 세트는 표적 유전자의 발현을 활성화하는 올리고뉴클레오타이드들이 풍부하다.
일부 구현예에서, 각 올리고뉴클레오타이드들은 특징들 a), b), c), d), 및 e) 중 1가지만 가진다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 a), b), c), d), 및 e)의 특징들 중 2가지 이상을 가지며, 각각은 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 a), b), c), d), 및 e)의 특징들 중 3가지 이상을 가지며, 각각은 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 a), b), c), d), 및 e)의 특징들 중 4가지 이상을 가지며, 각각은 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 a), b), c), d), 및 e)의 특징들을 각각 가진다. 소정의 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 5'X-Y-Z 서열을 가지며, 올리고뉴클레오타이드의 길이는 8-50개 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, Y는 표 3에서 선택되는 서열이다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 각 올리고뉴클레오타이드들은 길이가 100, 50, 40, 30 또는 20개 이하의 뉴클레오타이드들이다. 다른 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 각 올리고뉴클레오타이드들은 길이가 8 내지 30개 뉴클레오타이드들이다.
일부 구현예에서, 서열 상동성의 역치 수준은 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 상동성이다.
한 구현예에서, Y는 표 3에 개시된 길이가 6개 뉴클레오타이드들인 뉴클레오타이드 서열이다.
다른 구현예에서, 제1 염색체는 첫번째 종의 염색체이며, 상기 방법은 제2 뉴클레오타이드 서열이 두번째 종들의 제2 염색체의 제2 영역에 대하여 상보적인지를 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제2 영역은 표적 유전자의 호모로그의 5’말단의 50킬로베이스 상류와 표적 유전자의 호모로그의 3’말단의 50킬로베이스 하류 사이에 위치되어 있다.
제2 뉴클레오타이드 서열은 제2 염색체의 제2 영역에 대하여 적어도 80% 상보적일 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 표적 유전자의 센스 가닥을 포함하는 제1 염색체의 가닥으로 맵핑한다. 다른 구현예에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 표적 유전자의 안티센스 가닥을 포함하는 제1 염색체의 가닥으로 맵핑한다.
일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 5’말단의 상류가며, 다른 구현예에서 PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 3’말단의 하류가다. 선택적으로, PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 인트론 또는 엑손내에 있을 수 있거나, 또는 PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 인트론-엑손 접합부, 5’-UTR-엑손 접합부 또는 3’-UTR-엑손 접합부를 횡단할 수 있다.
PRC2-연관 영역은 2개 이상의 단일 가닥 루프들을 포함하는 2차 구조를 형성하는 RNA를 코딩할 수 있다. 선택적으로, 2차 구조는 2개 이상의 단일 가닥 루프들 사이에 이중 가닥 스템을 포함한다. 일부 구현예에서, PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드들은 1개 이상 또는 2개 이상의 루프들의 적어도 일부 또는 이중 가닥 스템의 적어도 일부를 코딩한다.
다른 측면에서, 본 발명은 표적 유전자의 5’말단의 50킬로베이스 상류와 표적 유전자의 3’말단의 50킬로베이스 하류 사이의 제1 염색체에 위치된 PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드와 상보적인 상보성 영역을 포함하며, 상기 올리고뉴클레오타이드는: a) 5’-X-Y-Z(여기에서, X는 특정의 뉴클레오타이드이며, Y는 마이크로RNA의 인간 시드 서열이 아닌 길이가 6개 뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드 서열이며, 및 Z는 길이가 1 내지 23개 뉴클레오타이드들인 뉴클레오타이드 서열임)를 포함하는 서열; b) 3개 이상의 연속 구아노신 뉴클레오타이드들을 포함하지 않는 서열; c) 오프-표적 유전자의 5’말단의 50킬로베이스 상류와 오프-표적 유전자의 3’말단의 50킬로베이스 하류 사이에 있는, 제2 뉴클레오타이드 서열과 균등한 길이의 모든 뉴클레오타이드 서열과 역치 수준보다 낮은 서열 상동성을 갖는 서열; d) 2개 이상의 단일 가닥 루프들을 포함하는 2차 구조를 형성하는 RNA를 코딩하는 RPC2-연관 영역에 대하여 상보적인 서열, 및/또는 e) 60% 초과 G-C 함량을 갖는 서열 중 적어도 하나를 가진다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 특징들 a), b), c), d) 및 e) 중 1가지만 가진다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 a), b), c), d), 및 e)의 특징들 중 2가지 이상을 가지며, 각각은 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 a), b), c), d), 및 e)의 특징들 중 3가지 이상을 가지며, 각각은 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 a), b), c), d), 및 e)의 특징들 중 4가지 이상을 가지며, 각각은 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 a), b), c), d), 및 e)의 특징들을 각각 가진다. 소정의 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 5'X-Y-Z 서열을 가지며, 올리고뉴클레오타이드의 길이는 8-50개 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, Y는 표 3에서 선택되는 서열이다.
제1 염색체는 일부 구현예들에서 제1 종들의 염색체이다. 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드들을 포함하는 서열은 표적 유전자의 호모로그의 5’말단의 50킬로베이스 상류와 표적 유전자의 호모로그의 3’말단의 50킬로베이스 하류 사이의 제2 염색체내에 위치되어 있으며, 제2 염색체는 제2 종들의 염색체이다. 제1 종은 인간일 수 있으며, 제2 종은 마우스일 수 있다.
본 발명은 또한, 길이가 8-30개 뉴클레오타이드들인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 표적 유전자의 5’말단의 50킬로베이스 상류와 표적 유전자의 3’말단의 50킬로베이스 하류 사이의 염색체내에 위치된 PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적이며, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열은 (X)Xxxxxx, (X)xXxxxx, (X)xxXxxx, (X)xxxXxx, (X)xxxxXx 및 (X)xxxxxX, (X)XXxxxx, (X)XxXxxx, (X)XxxXxx, (X)XxxxXx, (X)XxxxxX, (X)xXXxxx, (X)xXxXxx, (X)xXxxXx, (X)xXxxxX, (X)xxXXxx, (X)xxXxXx, (X)xxXxxX, (X)xxxXXx, (X)xxxXxX 및 (X)xxxxXX, (X)XXXxxx, (X)xXXXxx, (X)xxXXXx, (X)xxxXXX, (X)XXxXxx, (X)XXxxXx, (X)XXxxxX, (X)xXXxXx, (X)xXXxxX, (X)xxXXxX, (X)XxXXxx, (X)XxxXXx (X)XxxxXX, (X)xXxXXx, (X)xXxxXX, (X)xxXxXX, (X)xXxXxX 및 (X)XxXxXx, (X)xxXXX, (X)xXxXXX, (X)xXXxXX, (X)xXXXxX, (X)xXXXXx, (X)XxxXXXX, (X)XxXxXX, (X)XxXXxX, (X)XxXXx, (X)XXxxXX, (X)XXxXxX, (X)XXxXXx, (X)XXXxxX, (X)XXXxXx, 및 (X)XXXXxx, (X)xXXXXX, (X)XxXXXX, (X)XXxXXX, (X)XXXxXX, (X)XXXXxX 및 (X)XXXXXx, 및 XXXXXX, XxXXXXX, XXxXXXX, XXXxXXX, XXXXxXX, XXXXXxX 및 XXXXXXx로부터 선택되는 1개 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, “X”는 뉴클레오타이드 유사체를 가리키며, (X)는 임의 뉴클레오타이드 유사체를 가리키며, 및 “x”는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 유닛을 가리킨다.
표적 유전자의 발현을 조절하는 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 상보성 영역을 갖고, 올리고뉴클레오타이드의 2-19개 뉴클레오타이드들이 뉴클레오타이드 유사체인, 길이가 8 내지 30개 뉴클레오타이드들의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 본 발명의 다른 측면들로 제공된다.
다른 측면에서, 표적 유전자의 발현을 조절하는 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)의 5개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 상보성 영역을 갖고, 올리고뉴클레오타이드가 제거가능한 링커에 의해 제2 올리고뉴클레오타이드에 연결되는, 길이가 5 내지 30개 뉴클레오타이드들인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 본 명세서에 설명된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드들 중 어느 하나의 구조를 가진다.
단백질-코딩 참조 유전자의 발현을 조절하는 PRC2-결합 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)의 5개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 상보성 영역을 갖고, 단백질-코딩 참조 유전자를 함유하는 게놈 영역내 단백질-코딩 참조 유전자로서 반대 가닥으로부터 lncRNA가 전사되며, 엑손, 인트론, 엑손, 인트론-엑손 접합부, 5’UTR, 3’UTR, 해독 개시 영역, 또는 해독 종결 영역내에서 기원하거나 또는 중첩되는 lncRNA의 영역과 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 결합하는, 길이가 8 내지 40개 뉴클레오타이드들인 단일 가닥 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 본 발명의 다른 측면에 제공된다.
표적 유전자의 발현을 조절하는 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)의 5개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 상보성 영역을 갖는, 길이가 8 내지 40개 뉴클레오타이드들인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 본 발명의 다른 측면들에 제공된다. 올리고뉴클레오타이드는 표적 유전자의 전사된 영역의 외측인 lncRNA의 영역내 lncRNA에 대하여 상보성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 표적 유전자의 발현을 억제하는 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)의 5개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 상보성 영역을 갖고, 표적 유전자의 비-코딩 부분으로부터 전사된 lncRNA의 영역내 lncRNA에 대하여 올리고뉴클레오타이드가 상보성을 갖는, 길이가 8 내지 30개 뉴클레오타이드들인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 제공된다.
일부 구현예에서, lncRNA는 PRC2-연관 영역이다.
본 발명은 2011년 11월 12일에 출원되고, 2012년 5월 18일자로 WO/2012/065143으로 공개된 국제특허출원 PCT/US2011/060493, 발명의 명칭 “POLYCOMB-ASSOCIATED NON-CODING RNAS”에 SEQ ID NOs:1-193,049로 열거된 뉴클레오타이드 서열들을 참조문헌으로 통합한다. 상기 서열들은 “A”뒤에 그들의 서열확인숫자로 언급한다. 따라서, 국제특허출원 PCT/US2011/060493으로부터 참조로 통합된 뉴클레오타이드 서열 세트는 “서열 A1-A193,049”로 언급된다.
본 발명은 2011년 12월 19일에 출원되고, 2012년 6월 28일자로 WO/2012/087983으로 공개된, 발명의 명칭이 “POLYCOMB-ASSOCIATED NON-CODING RNAS”인 국제특허출원 PCT/US2011/65939에서 SEQ ID NOs: 1 내지 916,209, 또는 916,626 내지 934,931로 열거된 뉴클레오타이드 서열을 참조로 통합한다. 상기 서열들은 “B”뒤의 그들의 서열확인숫자로 언급된다. 따라서, 국제특허출원 PCT/US2011/65939로부터 참고로 통합된 뉴클레오타이드 서열 세트는 “서열 B1 내지 B916,209, 또는 B916,626 내지 B934,931”로 언급된다.
일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은 서열 A1 내지 A193,049, B1 내지 B916,209, 및 B916,626 내지 B934,931로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 가진다.
일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은 SEQ ID NO: 1-1212로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 가진다.
올리고뉴클레오타이드는 어느 길이나 될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 길이가 100, 50, 40, 30, 또는 20개 이하의 뉴클레오타이드가다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 길이가 8 내지 30개 뉴클레오타이드가다. 또 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 길이가 8 내지 10개 뉴클레오타이드이며, PRC2-연관 영역의 상보서열의 뉴클레오타이드 1, 2 또는 3개를 제외한 모두 시토신 또는 구아노신 뉴클레오타이드들이다.
일부 구현예에서, PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드들은 표적 유전자의 안티센스 가닥을 포함하는 염색체의 가닥내에 있고, 다른 구현예에서는 표적 유전자의 센스 가닥을 포함하는 염색체의 가닥내에 있다.
일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 5’말단의 상류가고, 다른 구현예에서 PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 3’말단의 하류가다. 선택적으로, PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 인트론 또는 엑손내에 있을 수 있으며, 또는 PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 인트론-엑손 접합부, 5’-UTR-엑손 접합부 또는 3’-UTR-엑손 접합부를 횡단할 수 있다.
PRC2-연관 영역은 2개 이상의 단일 가닥 루프들을 포함하는 2차 구조를 형성하는 RNA를 코딩할 수 있다. 선택적으로, 2차 구조는 2개 이상의 단일 가닥 루프들 사이에 이중 가닥 스템을 포함한다. 일부 구현예에서, PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드는 1개 이상 또는 2개 이상의 루프들의 적어도 일부 또는 이중 가닥 스템의 적어도 일부를 코딩한다.
일부 구현예에서, 1개 이상의 뉴클레오타이드 유사체로 인해, 1개 이상의 뉴클레오타이드 유사체를 갖지 않는 올리고뉴클레오타이드에 비해, 올리고뉴클레오타이드의 Tm이 1 내지 5℃ 범위내에서 증가한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 1개 이상의 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 유사체를 포함한다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 각 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 유사체를 포함한다. 예를 들면, 뉴클레오타이드 유사체는 2’O-메틸 또는 가교 뉴클레오타이드일 수 있다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 1개 이상의 리보뉴클레오타이드, 1개 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 1개 이상의 가교 뉴클레오타이드를 포함한다. 가교 뉴클레오타이드는 예를 들면, LNA 뉴클레오타이드, cEt 뉴클레오타이드 또는 ENA 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다. 선택적으로, 올리고뉴클레오타이드의 각 뉴클레오타이드는 LNA 뉴클레오타이드가다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 교대의 뉴클레오타이드 타입들을 포함한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 2’-플루오로-데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 교대의 데옥시리보뉴클레오타이드 및 2’-O-메틸 뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 교대의 데옥시리보뉴클레오타이드 및 ENA 뉴클레오타이드 유사체를 포함하며, 또는 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 교대의 데옥시리보뉴클레오타이드 및 LNA 뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 교대의 LNA 뉴클레오타이드 및 2’-O-메틸 뉴클레오타이드를 포함한다.
올리고뉴클레오타이드의 5’뉴클레오타이드는 다른 특성들을 가질 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 5’뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 LNA 뉴클레오타이드가다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드의 5’ 및 3’말단 각각 상에서 1개 이상의 LNA 뉴클레오타이드에 의해 플랭킹된 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다.
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 2개 이상의 뉴클레오타이드들 또는 모든 뉴클레오타이드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합들을 포함할 수도 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 3’위치에서 뉴클레오타이드는 3’하이드록실기를 가진다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 3’위치에서의 뉴클레오타이드는 3’티오포스페이트를 가진다.
선택적으로, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 5’ 또는 3’뉴클레오타이드에 콘쥬게이트된 비오틴 부분을 가진다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 5’ 또는 3’뉴클레오타이드 또는 둘다에 대한 하기 콘쥬게이트들을 1개 이상 가진다: 콜레스테롤, 비타민 A, 엽산, 시그마 수용체 리간드, 앱타머, 펩타이드, 예를 들면 CPP, 소수성 분자들, 예를 들면 지질, ASGPR 또는 동적 폴리콘쥬게이트 및 이들의 변이체들.
다른 측면에서, 조성물이 제공된다. 조성물은 본 명세서에 설명된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 및 운반체, 버퍼 용액 및/또는 약제학적 허용 운반체가다.
일부 측면에서, 본 발명은 표적 유전자의 발현을 조절하는 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)의 5개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 상보성 영역을 갖는 길이의 8 내지 20개 뉴클레오타이드들의 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오타이드의 조성물이며, 상기 올리고뉴클레오타이드의 2-19개 뉴클레오타이드들은 뉴클레오타이드 유사체들이며, 약제학적 허용 운반체로 배합되며, 상보성 RNA 올리고뉴클레오타이드는 조성물내에 존재하지 않는다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 유사체들은 가교 뉴클레오타이드, 2’플루오로, 및 2’O-메틸 뉴클레오타이드로 구성된 그룹에서 선택된다. 다른 구현예에서, 가교 뉴클레오타이드는 LNA, ENA 또는 cEt 뉴클레오타이드가다.
lncRNA는 표적 유전자를 함유하는 게놈 영역내에서 표적 유전자로서 반대 가닥으로부터 전사될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 표적 유전자의 비-코딩 부분으로부터 전사되는 lncRNA의 영역에서 lncRNA에 대하여 상보성을 가진다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 표적 유전자의 전사된 영역 바깥쪽에 있는 lncRNA의 영역에서 lncRNA에 대하여 상보성을 가진다.
특정 조성물을 보관하는 용기를 포함하는 키트도 또한 제공된다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 설명된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 세포에 전달함으로써, 세포내 표적 유전자의 발현을 증가시키는 방법이다.
본 명세서에 설명된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 개체에게 투여함으로써, 개체내 표적 유전자의 수준을 증가시키는 방법이 본 발명의 다른 측면에서 제공된다.
본 명세서에 설명된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 개체에게 투여함으로써, 개체내 표적 유전자의 감소된 수준과 관련된 질병을 치료하는 방법이 본 발명의 또 다른 측면에서 제공된다.
유전자 발현을 상향조절하는 방법이 다른 측면들에서 제공된다. 상기 방법은 표적 유전자의 발현을 억제하는 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)의 5개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 상보성 영역을 갖는 길이의 8 내지 30개 뉴클레오타이드들의 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오타이드와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다.
하기 출원들은 이후에 전문참조된다: 2011년 12월 19일 출원되고, 2012년 6월 28일 WO/2012/087983으로 공개된 국제특허출원 PCT/US2011/65939, 발명의 명칭 POLYCOMB-ASSOCIATED NON-CODING RNAS, 및 2011년 11월 12일 출원되고, 2012년 5월 18일 WO/2012/065143 으로 공개된 국제특허출원 PCT/US2011/060493, 발명의 명칭 POLYCOMB-ASSOCIATED NON-CODING RNAS.
본 발명의 각 한계조건들은 본 발명의 다양한 구현예들을 포함할 수 있다. 그러므로, 특정의 한 요소 또는 요소들의 조합을 포함하는 본 발명의 한계조건들 각각이 본 발명의 각 측면에 포함될 수 있을 것으로 기대된다. 본 발명은 하기 설명에 설정된 또는 도면에 도시된 요소들의 배열 및 구성요소의 상세한 설명에 용도를 제한하지 않는다. 본 발명은 다른 구현예들 및 다양한 방법으로 수행 또는 실시될 수 있다. 또한, 본 명세서의 어법 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이며, 제한의 의미로 간주되지 않아야 한다. 본 발명에 사용된 “포함하는(including)”, “포함하는(comprising)”, 또는 “갖는(having)”, “함유하는(containing)”, “포함하는(involving)” 및 이들의 여러 변형예들은 이후에 열거된 항목들 및 이들의 균등예 뿐만 아니라 추가의 항목들을 포함하는 것으로 의미된다.
서열 목록의 간단한 설명
서열번호 염색체 유전자 염색체 개시 염색체 말단 가닥 유기체 대략적인 길이
1 chr9 FXN 71638478 71705993 + 호모사피엔스 67515
2 chr9 FXN 71638478 71705993 - 호모사피엔스 67515
3 chr19 Fxn 24323942 24367076 - 생쥐 43134
4 chr19 Fxn 24323942 24367076 + 생쥐 43134
5 chr9 FXN 71651581 71651633 + 호모사피엔스 52
6 chr9 FXN 71651674 71651733 + 호모사피엔스 59
7 chr9 FXN 71664748 71664793 + 호모사피엔스 45
8 chr9 FXN 71676243 71676290 + 호모사피엔스 47
9 chr9 FXN 71677819 71678190 + 호모사피엔스 371
10 chr9 FXN 71649581 71653633 + 호모사피엔스 4052
11 chr9 FXN 71649674 71653733 + 호모사피엔스 4059
12 chr9 FXN 71662748 71666793 + 호모사피엔스 4045
13 chr9 FXN 71674243 71678290 + 호모사피엔스 4047
14 chr9 FXN 71675819 71680190 + 호모사피엔스 4371
15 chr9 FXN 71661444 71661499 - 호모사피엔스 55
16 chr9 FXN 71679886 71679910 - 호모사피엔스 24
17 chr9 FXN 71659444 71663499 - 호모사피엔스 4055
18 chr9 FXN 71677886 71681910 - 호모사피엔스 4024
19 chr5 SMN1 70208768 70260842 + 호모사피엔스 52070
20 chr5 SMN2 69333350 69385422 + 호모사피엔스 52073
21 chr9 SMNP 20319406 20344375 + 호모사피엔스 24970
22 chr5 SMN1 70208768 70260838 - 호모사피엔스 52071
23 chr5 SMN2 69333350 69385422 - 호모사피엔스 52073
24 chr9 SMNP 20319406 20344375 - 호모사피엔스 24970
25 chr13 Smn1 100881160 100919653 + 생쥐 38494
26 chr13 Smn1 100881160 100919653 - 생쥐 38494
27 chr5 SMN1 70240095 70240127 + 호모사피엔스 32
27 chr5 SMN2 69364672 69364704 + 호모사피엔스 32
28 chr5 SMN1 70214393 70214822 + 호모사피엔스 429
28 chr5 SMN2 69338976 69339405 + 호모사피엔스 429
29 chr5 SMN1 70214064 70214108 + 호모사피엔스 44
29 chr5 SMN2 69338647 69338691 + 호모사피엔스 44
30 chr5 SMN1 70214276 70214317 + 호모사피엔스 41
30 chr5 SMN2 69338859 69338900 + 호모사피엔스 41
31 chr5 SMN1 70214445 70214472 + 호모사피엔스 27
31 chr5 SMN2 69339028 69339055 + 호모사피엔스 27
32 chr5 SMN1 70238095 70242127 + 호모사피엔스 4032
32 chr5 SMN2 69362672 69366704 + 호모사피엔스 4032
33 chr5 SMN1 70212393 70216822 + 호모사피엔스 4429
33 chr5 SMN2 69336976 69341405 + 호모사피엔스 4429
34 chr5 SMN1 70212064 70216108 + 호모사피엔스 4044
34 chr5 SMN2 69336647 69340691 + 호모사피엔스 4044
35 chr5 SMN1 70212276 70216317 + 호모사피엔스 4041
35 chr5 SMN2 69336859 69340900 + 호모사피엔스 4041
36 chr5 SMN1 70212445 70216472 + 호모사피엔스 4027
36 chr5 SMN2 69337028 69341055 + 호모사피엔스 4027
37 chr5 SMN1 70240510 70240551 - 호모사피엔스 41
37 chr5 SMN2 69365087 69365128 - 호모사피엔스 41
38 chr5 SMN1 70241924 70241968 - 호모사피엔스 44
38 chr5 SMN2 69366499 69366543 - 호모사피엔스 44
39 chr5 SMN1 70238510 70242551 - 호모사피엔스 4041
39 chr5 SMN2 69363087 69367128 - 호모사피엔스 4041
40 chr5 SMN1 70239924 70243968 - 호모사피엔스 4044
40 chr5 SMN2 69364499 69368543 - 호모사피엔스 4044
41 chr5 SMN1 70247831 70247845 + 호모사피엔스 14
41 chr5 SMN2 69372411 69372425 + 호모사피엔스 14
42 chr5 SMN2 69372402 69372845 + 호모사피엔스 443
43 chr6 UTRN 144600872 145186170 + 호모사피엔스 585298
44 chr6 UTRN 144600872 145186170 - 호모사피엔스 585298
45 chr10 Utrn 12089985 12593533 - 생쥐 503548
46 chr10 Utrn 12089985 12593533 + 생쥐 503548
47 chr6 UTRN 144610489 144610535 + 호모사피엔스 46
48 chr6 UTRN 144612994 144613040 + 호모사피엔스 46
49 chr6 UTRN 144614120 144614162 + 호모사피엔스 42
50 chr6 UTRN 144614968 144615021 + 호모사피엔스 53
51 chr6 UTRN 144618862 144618901 + 호모사피엔스 39
52 chr6 UTRN 144621690 144621714 + 호모사피엔스 24
53 chr6 UTRN 144625028 144625096 + 호모사피엔스 68
54 chr6 UTRN 144625129 144625174 + 호모사피엔스 45
55 chr6 UTRN 144625319 144625379 + 호모사피엔스 60
56 chr6 UTRN 144628965 144629011 + 호모사피엔스 46
57 chr6 UTRN 144633818 144633869 + 호모사피엔스 51
58 chr6 UTRN 144633933 144633968 + 호모사피엔스 35
59 chr6 UTRN 144658267 144658302 + 호모사피엔스 35
60 chr6 UTRN 144685087 144685140 + 호모사피엔스 53
61 chr6 UTRN 144695039 144695063 + 호모사피엔스 24
62 chr6 UTRN 144699670 144699699 + 호모사피엔스 29
63 chr6 UTRN 144704043 144704398 + 호모사피엔스 355
64 chr6 UTRN 144706312 144706345 + 호모사피엔스 33
65 chr6 UTRN 144706654 144706704 + 호모사피엔스 50
66 chr6 UTRN 144721683 144721738 + 호모사피엔스 55
67 chr6 UTRN 144722580 144722627 + 호모사피엔스 47
68 chr6 UTRN 144724848 144724889 + 호모사피엔스 41
69 chr6 UTRN 144727897 144727947 + 호모사피엔스 50
70 chr6 UTRN 144746408 144746448 + 호모사피엔스 40
71 chr6 UTRN 144749102 144749152 + 호모사피엔스 50
72 chr6 UTRN 144749948 144750026 + 호모사피엔스 78
73 chr6 UTRN 144750728 144750789 + 호모사피엔스 61
74 chr6 UTRN 144750789 144750853 + 호모사피엔스 64
75 chr6 UTRN 144757162 144757214 + 호모사피엔스 52
76 chr6 UTRN 144757214 144757274 + 호모사피엔스 60
77 chr6 UTRN 144758752 144758807 + 호모사피엔스 55
78 chr6 UTRN 144758807 144758864 + 호모사피엔스 57
79 chr6 UTRN 144761513 144761579 + 호모사피엔스 66
80 chr6 UTRN 144765456 144765506 + 호모사피엔스 50
81 chr6 UTRN 144768420 144768461 + 호모사피엔스 41
82 chr6 UTRN 144768737 144768764 + 호모사피엔스 27
83 chr6 UTRN 144772549 144772627 + 호모사피엔스 78
84 chr6 UTRN 144774960 144775001 + 호모사피엔스 41
85 chr6 UTRN 144779914 144779960 + 호모사피엔스 46
86 chr6 UTRN 144780026 144780070 + 호모사피엔스 44
87 chr6 UTRN 144780278 144780324 + 호모사피엔스 46
88 chr6 UTRN 144783879 144783933 + 호모사피엔스 54
89 chr6 UTRN 144783933 144783995 + 호모사피엔스 62
90 chr6 UTRN 144800953 144800999 + 호모사피엔스 46
91 chr6 UTRN 144802780 144802822 + 호모사피엔스 42
92 chr6 UTRN 144803427 144803473 + 호모사피엔스 46
93 chr6 UTRN 144803714 144803742 + 호모사피엔스 28
94 chr6 UTRN 144803774 144803849 + 호모사피엔스 75
95 chr6 UTRN 144806673 144806714 + 호모사피엔스 41
96 chr6 UTRN 144808684 144808739 + 호모사피엔스 55
97 chr6 UTRN 144808739 144808803 + 호모사피엔스 64
98 chr6 UTRN 144809834 144809881 + 호모사피엔스 47
99 chr6 UTRN 144811266 144811310 + 호모사피엔스 44
100 chr6 UTRN 144814476 144814522 + 호모사피엔스 46
101 chr6 UTRN 144815156 144815199 + 호모사피엔스 43
102 chr6 UTRN 144820469 144820529 + 호모사피엔스 60
103 chr6 UTRN 144832193 144832243 + 호모사피엔스 50
104 chr6 UTRN 144835120 144835166 + 호모사피엔스 46
105 chr6 UTRN 144835862 144835907 + 호모사피엔스 45
106 chr6 UTRN 144837423 144837465 + 호모사피엔스 42
107 chr6 UTRN 144837943 144837989 + 호모사피엔스 46
108 chr6 UTRN 144844263 144844304 + 호모사피엔스 41
109 chr6 UTRN 144858722 144858798 + 호모사피엔스 76
110 chr6 UTRN 144870778 144870817 + 호모사피엔스 39
111 chr6 UTRN 144871113 144871154 + 호모사피엔스 41
112 chr6 UTRN 144872123 144872165 + 호모사피엔스 42
113 chr6 UTRN 144872599 144872669 + 호모사피엔스 70
114 chr6 UTRN 144873625 144873662 + 호모사피엔스 37
115 chr6 UTRN 144875136 144875182 + 호모사피엔스 46
116 chr6 UTRN 144875895 144875938 + 호모사피엔스 43
117 chr6 UTRN 144886315 144886378 + 호모사피엔스 63
118 chr6 UTRN 144904604 144904645 + 호모사피엔스 41
119 chr6 UTRN 144905276 144905300 + 호모사피엔스 24
120 chr6 UTRN 144906334 144906358 + 호모사피엔스 24
121 chr6 UTRN 144907025 144907055 + 호모사피엔스 30
122 chr6 UTRN 144908864 144908908 + 호모사피엔스 44
123 chr6 UTRN 144909055 144909078 + 호모사피엔스 23
124 chr6 UTRN 144910040 144910085 + 호모사피엔스 45
125 chr6 UTRN 144918990 144919013 + 호모사피엔스 23
126 chr6 UTRN 144935390 144935427 + 호모사피엔스 37
127 chr6 UTRN 144938199 144938248 + 호모사피엔스 49
128 chr6 UTRN 144941446 144941489 + 호모사피엔스 43
129 chr6 UTRN 144941551 144941596 + 호모사피엔스 45
130 chr6 UTRN 144941700 144941748 + 호모사피엔스 48
131 chr6 UTRN 144941856 144941912 + 호모사피엔스 56
132 chr6 UTRN 144941912 144941988 + 호모사피엔스 76
133 chr6 UTRN 144942080 144942136 + 호모사피엔스 56
134 chr6 UTRN 144944667 144944712 + 호모사피엔스 45
135 chr6 UTRN 144945160 144945207 + 호모사피엔스 47
136 chr6 UTRN 144950918 144950987 + 호모사피엔스 69
137 chr6 UTRN 144952595 144952650 + 호모사피엔스 55
138 chr6 UTRN 144954758 144954804 + 호모사피엔스 46
139 chr6 UTRN 144960952 144960996 + 호모사피엔스 44
140 chr6 UTRN 144968386 144968438 + 호모사피엔스 52
141 chr6 UTRN 144981668 144981709 + 호모사피엔스 41
142 chr6 UTRN 144985026 144985072 + 호모사피엔스 46
143 chr6 UTRN 144999637 144999686 + 호모사피엔스 49
144 chr6 UTRN 144999750 144999785 + 호모사피엔스 35
145 chr6 UTRN 144999904 144999956 + 호모사피엔스 52
146 chr6 UTRN 145012224 145012561 + 호모사피엔스 337
147 chr6 UTRN 145017897 145017969 + 호모사피엔스 72
148 chr6 UTRN 145017978 145018021 + 호모사피엔스 43
149 chr6 UTRN 145019229 145019261 + 호모사피엔스 32
150 chr6 UTRN 145021232 145021278 + 호모사피엔스 46
151 chr6 UTRN 145021336 145021382 + 호모사피엔스 46
152 chr6 UTRN 145031285 145031331 + 호모사피엔스 46
153 chr6 UTRN 145038424 145038467 + 호모사피엔스 43
154 chr6 UTRN 145042706 145042751 + 호모사피엔스 45
155 chr6 UTRN 145047775 145047820 + 호모사피엔스 45
156 chr6 UTRN 145051549 145051592 + 호모사피엔스 43
157 chr6 UTRN 145061899 145061941 + 호모사피엔스 42
158 chr6 UTRN 145063569 145063615 + 호모사피엔스 46
159 chr6 UTRN 145069445 145069497 + 호모사피엔스 52
160 chr6 UTRN 145072959 145073005 + 호모사피엔스 46
161 chr6 UTRN 145079115 145079162 + 호모사피엔스 47
162 chr6 UTRN 145079204 145079271 + 호모사피엔스 67
163 chr6 UTRN 145080780 145080816 + 호모사피엔스 36
164 chr6 UTRN 145080843 145080885 + 호모사피엔스 42
165 chr6 UTRN 145081884 145081930 + 호모사피엔스 46
166 chr6 UTRN 145087734 145087827 + 호모사피엔스 93
167 chr6 UTRN 145087827 145087911 + 호모사피엔스 84
168 chr6 UTRN 145088046 145088124 + 호모사피엔스 78
169 chr6 UTRN 145088210 145088245 + 호모사피엔스 35
170 chr6 UTRN 145088678 145088723 + 호모사피엔스 45
171 chr6 UTRN 145090281 145090327 + 호모사피엔스 46
172 chr6 UTRN 145090884 145090934 + 호모사피엔스 50
173 chr6 UTRN 145093542 145093591 + 호모사피엔스 49
174 chr6 UTRN 145094155 145094199 + 호모사피엔스 44
175 chr6 UTRN 145096714 145096756 + 호모사피엔스 42
176 chr6 UTRN 145101237 145101284 + 호모사피엔스 47
177 chr6 UTRN 145101598 145101642 + 호모사피엔스 44
178 chr6 UTRN 145127145 145127194 + 호모사피엔스 49
179 chr6 UTRN 145127467 145127507 + 호모사피엔스 40
180 chr6 UTRN 145127866 145127929 + 호모사피엔스 63
181 chr6 UTRN 145128105 145128160 + 호모사피엔스 55
182 chr6 UTRN 145128415 145128460 + 호모사피엔스 45
183 chr6 UTRN 145132350 145132397 + 호모사피엔스 47
184 chr6 UTRN 145132917 145132974 + 호모사피엔스 57
185 chr6 UTRN 145133779 145133802 + 호모사피엔스 23
186 chr6 UTRN 145134097 145134169 + 호모사피엔스 72
187 chr6 UTRN 145134835 145134881 + 호모사피엔스 46
188 chr6 UTRN 145142034 145142135 + 호모사피엔스 101
189 chr6 UTRN 145142629 145142676 + 호모사피엔스 47
190 chr6 UTRN 145148750 145148806 + 호모사피엔스 56
191 chr6 UTRN 145149936 145149984 + 호모사피엔스 48
192 chr6 UTRN 145153900 145154300 + 호모사피엔스 400
193 chr6 UTRN 145154735 145154782 + 호모사피엔스 47
194 chr6 UTRN 145155438 145155468 + 호모사피엔스 30
195 chr6 UTRN 145156972 145157019 + 호모사피엔스 47
196 chr6 UTRN 145157440 145157555 + 호모사피엔스 115
197 chr6 UTRN 145157566 145157621 + 호모사피엔스 55
198 chr6 UTRN 145158149 145158194 + 호모사피엔스 45
199 chr6 UTRN 145160356 145160409 + 호모사피엔스 53
200 chr6 UTRN 145161881 145161927 + 호모사피엔스 46
201 chr6 UTRN 145167107 145167151 + 호모사피엔스 44
202 chr6 UTRN 145167205 145167243 + 호모사피엔스 38
203 chr6 UTRN 145168292 145168344 + 호모사피엔스 52
204 chr6 UTRN 145169033 145169085 + 호모사피엔스 52
205 chr6 UTRN 145169156 145169202 + 호모사피엔스 46
206 chr6 UTRN 145169270 145169315 + 호모사피엔스 45
207 chr6 UTRN 145171814 145171863 + 호모사피엔스 49
208 chr6 UTRN 145173631 145173718 + 호모사피엔스 87
209 chr6 UTRN 144608489 144612535 + 호모사피엔스 4046
210 chr6 UTRN 144610994 144615040 + 호모사피엔스 4046
211 chr6 UTRN 144612120 144616162 + 호모사피엔스 4042
212 chr6 UTRN 144612968 144617021 + 호모사피엔스 4053
213 chr6 UTRN 144616862 144620901 + 호모사피엔스 4039
214 chr6 UTRN 144619690 144623714 + 호모사피엔스 4024
215 chr6 UTRN 144623028 144627096 + 호모사피엔스 4068
216 chr6 UTRN 144623129 144627174 + 호모사피엔스 4045
217 chr6 UTRN 144623319 144627379 + 호모사피엔스 4060
218 chr6 UTRN 144626965 144631011 + 호모사피엔스 4046
219 chr6 UTRN 144631818 144635869 + 호모사피엔스 4051
220 chr6 UTRN 144631933 144635968 + 호모사피엔스 4035
221 chr6 UTRN 144656267 144660302 + 호모사피엔스 4035
222 chr6 UTRN 144683087 144687140 + 호모사피엔스 4053
223 chr6 UTRN 144693039 144697063 + 호모사피엔스 4024
224 chr6 UTRN 144697670 144701699 + 호모사피엔스 4029
225 chr6 UTRN 144702043 144706398 + 호모사피엔스 4355
226 chr6 UTRN 144704312 144708345 + 호모사피엔스 4033
227 chr6 UTRN 144704654 144708704 + 호모사피엔스 4050
228 chr6 UTRN 144719683 144723738 + 호모사피엔스 4055
229 chr6 UTRN 144720580 144724627 + 호모사피엔스 4047
230 chr6 UTRN 144722848 144726889 + 호모사피엔스 4041
231 chr6 UTRN 144725897 144729947 + 호모사피엔스 4050
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429 chr6 UTRN 145142105 145142152 - 호모사피엔스 47
430 chr6 UTRN 145149926 145149972 - 호모사피엔스 46
431 chr6 UTRN 145153110 145153155 - 호모사피엔스 45
432 chr6 UTRN 145155586 145155641 - 호모사피엔스 55
433 chr6 UTRN 145156956 145157020 - 호모사피엔스 64
434 chr6 UTRN 145161886 145161931 - 호모사피엔스 45
435 chr6 UTRN 145166490 145166527 - 호모사피엔스 37
436 chr6 UTRN 145167701 145167736 - 호모사피엔스 35
437 chr6 UTRN 145173585 145173627 - 호모사피엔스 42
438 chr6 UTRN 144606031 144610073 - 호모사피엔스 4042
439 chr6 UTRN 144610926 144614972 - 호모사피엔스 4046
440 chr6 UTRN 144626552 144630595 - 호모사피엔스 4043
441 chr6 UTRN 144631946 144635970 - 호모사피엔스 4024
442 chr6 UTRN 144648739 144652804 - 호모사피엔스 4065
443 chr6 UTRN 144655045 144659093 - 호모사피엔스 4048
444 chr6 UTRN 144694995 144699041 - 호모사피엔스 4046
445 chr6 UTRN 144745612 144749674 - 호모사피엔스 4062
446 chr6 UTRN 144745879 144749925 - 호모사피엔스 4046
447 chr6 UTRN 144757816 144761863 - 호모사피엔스 4047
448 chr6 UTRN 144766238 144770312 - 호모사피엔스 4074
449 chr6 UTRN 144778036 144782082 - 호모사피엔스 4046
450 chr6 UTRN 144780886 144784935 - 호모사피엔스 4049
451 chr6 UTRN 144793766 144797789 - 호모사피엔스 4023
452 chr6 UTRN 144804556 144808601 - 호모사피엔스 4045
453 chr6 UTRN 144852365 144856401 - 호모사피엔스 4036
454 chr6 UTRN 144856769 144860809 - 호모사피엔스 4040
455 chr6 UTRN 144859763 144863805 - 호모사피엔스 4042
456 chr6 UTRN 144863560 144867594 - 호모사피엔스 4034
457 chr6 UTRN 144869095 144873118 - 호모사피엔스 4023
458 chr6 UTRN 144870146 144874179 - 호모사피엔스 4033
459 chr6 UTRN 144871792 144875815 - 호모사피엔스 4023
460 chr6 UTRN 144873726 144877775 - 호모사피엔스 4049
461 chr6 UTRN 144879389 144883429 - 호모사피엔스 4040
462 chr6 UTRN 144900992 144905093 - 호모사피엔스 4101
463 chr6 UTRN 144911242 144915292 - 호모사피엔스 4050
464 chr6 UTRN 144914606 144918629 - 호모사피엔스 4023
465 chr6 UTRN 144951033 144955075 - 호모사피엔스 4042
466 chr6 UTRN 144955938 144959985 - 호모사피엔스 4047
467 chr6 UTRN 144958849 144962900 - 호모사피엔스 4051
468 chr6 UTRN 144961737 144965802 - 호모사피엔스 4065
469 chr6 UTRN 144978957 144983000 - 호모사피엔스 4043
470 chr6 UTRN 144979226 144983271 - 호모사피엔스 4045
471 chr6 UTRN 144979350 144983396 - 호모사피엔스 4046
472 chr6 UTRN 144979507 144983542 - 호모사피엔스 4035
473 chr6 UTRN 144981660 144985707 - 호모사피엔스 4047
474 chr6 UTRN 145003066 145007095 - 호모사피엔스 4029
475 chr6 UTRN 145003500 145007548 - 호모사피엔스 4048
476 chr6 UTRN 145019339 145023384 - 호모사피엔스 4045
477 chr6 UTRN 145034068 145038136 - 호모사피엔스 4068
478 chr6 UTRN 145034766 145038820 - 호모사피엔스 4054
479 chr6 UTRN 145036552 145040606 - 호모사피엔스 4054
480 chr6 UTRN 145056056 145060096 - 호모사피엔스 4040
481 chr6 UTRN 145057402 145061450 - 호모사피엔스 4048
482 chr6 UTRN 145058834 145062905 - 호모사피엔스 4071
483 chr6 UTRN 145060448 145064475 - 호모사피엔스 4027
484 chr6 UTRN 145061125 145065160 - 호모사피엔스 4035
485 chr6 UTRN 145061273 145065302 - 호모사피엔스 4029
486 chr6 UTRN 145069318 145073359 - 호모사피엔스 4041
487 chr6 UTRN 145077495 145081543 - 호모사피엔스 4048
488 chr6 UTRN 145088227 145092266 - 호모사피엔스 4039
489 chr6 UTRN 145093420 145097465 - 호모사피엔스 4045
490 chr6 UTRN 145095191 145099232 - 호모사피엔스 4041
491 chr6 UTRN 145096097 145100128 - 호모사피엔스 4031
492 chr6 UTRN 145096960 145101005 - 호모사피엔스 4045
493 chr6 UTRN 145104983 145109024 - 호모사피엔스 4041
494 chr6 UTRN 145122174 145126220 - 호모사피엔스 4046
495 chr6 UTRN 145126278 145130325 - 호모사피엔스 4047
496 chr6 UTRN 145140105 145144152 - 호모사피엔스 4047
497 chr6 UTRN 145147926 145151972 - 호모사피엔스 4046
498 chr6 UTRN 145151110 145155155 - 호모사피엔스 4045
499 chr6 UTRN 145153586 145157641 - 호모사피엔스 4055
500 chr6 UTRN 145154956 145159020 - 호모사피엔스 4064
501 chr6 UTRN 145159886 145163931 - 호모사피엔스 4045
502 chr6 UTRN 145164490 145168527 - 호모사피엔스 4037
503 chr6 UTRN 145165701 145169736 - 호모사피엔스 4035
504 chr6 UTRN 145171585 145175627 - 호모사피엔스 4042
505 chr11 HBB 5234695 5260301 - 호모사피엔스 25606
506 chr11 HBB 5234695 5260301 + 호모사피엔스 25606
507 chr11 HBD 5242058 5267858 - 호모사피엔스 25800
508 chr11 HBD 5242058 5267858 + 호모사피엔스 25800
509 chr11 HBE1 5277579 5303373 - 호모사피엔스 25794
510 chr11 HBE1 5277579 5303373 + 호모사피엔스 25794
511 chr11 HBG1 5257501 5283087 - 호모사피엔스 25586
512 chr11 HBG1 5257501 5283087 + 호모사피엔스 25586
513 chr11 HBG2 5262420 5288011 - 호모사피엔스 25591
514 chr11 HBG2 5262420 5288011 + 호모사피엔스 25591
515 chr7 Hbb-b1 110949041 110974437 - 생쥐 25396
516 chr7 Hbb-b1 110949041 110974437 + 생쥐 25396
517 chr7 Hbb-bh1 110978151 111003676 - 생쥐 25525
518 chr7 Hbb-bh1 110978151 111003676 + 생쥐 25525
519 chr7 Hbb-y 110988267 111013721 - 생쥐 25454
520 chr7 Hbb-y 110988267 111013721 + 생쥐 25454
521 chr11 HBB/HBD 5246366 5246414 + 호모사피엔스 48
522 chr11 HBB/HBD 5244366 5248414 + 호모사피엔스 4048
523 chr12 ATP2A2 110707031 110800897 + 호모사피엔스 93866
524 chr12 ATP2A2 110707031 110800897 - 호모사피엔스 93866
525 chr5 Atp2a2 122891521 122964234 - 생쥐 72713
526 chr5 Atp2a2 122891521 122964234 + 생쥐 72713
527 chr12 ATP2A2 110719627 110719694 + 호모사피엔스 67
528 chr12 ATP2A2 110720529 110720579 + 호모사피엔스 50
529 chr12 ATP2A2 110721473 110721523 + 호모사피엔스 50
530 chr12 ATP2A2 110723314 110723392 + 호모사피엔스 78
531 chr12 ATP2A2 110725261 110725324 + 호모사피엔스 63
532 chr12 ATP2A2 110727087 110727134 + 호모사피엔스 47
533 chr12 ATP2A2 110729885 110729930 + 호모사피엔스 45
534 chr12 ATP2A2 110734433 110734479 + 호모사피엔스 46
535 chr12 ATP2A2 110764013 110764059 + 호모사피엔스 46
536 chr12 ATP2A2 110765378 110765425 + 호모사피엔스 47
537 chr12 ATP2A2 110765494 110765540 + 호모사피엔스 46
538 chr12 ATP2A2 110765734 110765819 + 호모사피엔스 85
539 chr12 ATP2A2 110770988 110771034 + 호모사피엔스 46
540 chr12 ATP2A2 110771832 110771877 + 호모사피엔스 45
541 chr12 ATP2A2 110777332 110777374 + 호모사피엔스 42
542 chr12 ATP2A2 110777482 110777528 + 호모사피엔스 46
543 chr12 ATP2A2 110778549 110778580 + 호모사피엔스 31
544 chr12 ATP2A2 110778678 110778748 + 호모사피엔스 70
545 chr12 ATP2A2 110780135 110780183 + 호모사피엔스 48
546 chr12 ATP2A2 110780320 110780386 + 호모사피엔스 66
547 chr12 ATP2A2 110781060 110781169 + 호모사피엔스 109
548 chr12 ATP2A2 110781169 110781235 + 호모사피엔스 66
549 chr12 ATP2A2 110782732 110782779 + 호모사피엔스 47
550 chr12 ATP2A2 110783060 110783131 + 호모사피엔스 71
551 chr12 ATP2A2 110783131 110783186 + 호모사피엔스 55
552 chr12 ATP2A2 110783143 110783843 + 호모사피엔스 700
553 chr12 ATP2A2 110783803 110783845 + 호모사피엔스 42
554 chr12 ATP2A2 110784061 110784090 + 호모사피엔스 29
555 chr12 ATP2A2 110784453 110784505 + 호모사피엔스 52
556 chr12 ATP2A2 110784577 110784623 + 호모사피엔스 46
557 chr12 ATP2A2 110784786 110784835 + 호모사피엔스 49
558 chr12 ATP2A2 110784919 110784969 + 호모사피엔스 50
559 chr12 ATP2A2 110788463 110788513 + 호모사피엔스 50
560 chr12 ATP2A2 110717627 110721694 + 호모사피엔스 4067
561 chr12 ATP2A2 110718529 110722579 + 호모사피엔스 4050
562 chr12 ATP2A2 110719473 110723523 + 호모사피엔스 4050
563 chr12 ATP2A2 110721314 110725392 + 호모사피엔스 4078
564 chr12 ATP2A2 110723261 110727324 + 호모사피엔스 4063
565 chr12 ATP2A2 110725087 110729134 + 호모사피엔스 4047
566 chr12 ATP2A2 110727885 110731930 + 호모사피엔스 4045
567 chr12 ATP2A2 110732433 110736479 + 호모사피엔스 4046
568 chr12 ATP2A2 110762013 110766059 + 호모사피엔스 4046
569 chr12 ATP2A2 110763378 110767425 + 호모사피엔스 4047
570 chr12 ATP2A2 110763494 110767540 + 호모사피엔스 4046
571 chr12 ATP2A2 110763734 110767819 + 호모사피엔스 4085
572 chr12 ATP2A2 110768988 110773034 + 호모사피엔스 4046
573 chr12 ATP2A2 110769832 110773877 + 호모사피엔스 4045
574 chr12 ATP2A2 110775332 110779374 + 호모사피엔스 4042
575 chr12 ATP2A2 110775482 110779528 + 호모사피엔스 4046
576 chr12 ATP2A2 110776549 110780580 + 호모사피엔스 4031
577 chr12 ATP2A2 110776678 110780748 + 호모사피엔스 4070
578 chr12 ATP2A2 110778135 110782183 + 호모사피엔스 4048
579 chr12 ATP2A2 110778320 110782386 + 호모사피엔스 4066
580 chr12 ATP2A2 110779060 110783169 + 호모사피엔스 4109
581 chr12 ATP2A2 110779169 110783235 + 호모사피엔스 4066
582 chr12 ATP2A2 110780732 110784779 + 호모사피엔스 4047
583 chr12 ATP2A2 110781060 110785131 + 호모사피엔스 4071
584 chr12 ATP2A2 110781131 110785186 + 호모사피엔스 4055
585 chr12 ATP2A2 110781143 110785843 + 호모사피엔스 4700
586 chr12 ATP2A2 110781803 110785845 + 호모사피엔스 4042
587 chr12 ATP2A2 110782061 110786090 + 호모사피엔스 4029
588 chr12 ATP2A2 110782453 110786505 + 호모사피엔스 4052
589 chr12 ATP2A2 110782577 110786623 + 호모사피엔스 4046
590 chr12 ATP2A2 110782786 110786835 + 호모사피엔스 4049
591 chr12 ATP2A2 110782919 110786969 + 호모사피엔스 4050
592 chr12 ATP2A2 110786463 110790513 + 호모사피엔스 4050
593 chr12 ATP2A2 110764239 110764284 - 호모사피엔스 45
594 chr12 ATP2A2 110771869 110771910 - 호모사피엔스 41
595 chr12 ATP2A2 110777311 110777357 - 호모사피엔스 46
596 chr12 ATP2A2 110778603 110778648 - 호모사피엔스 45
597 chr12 ATP2A2 110781134 110781180 - 호모사피엔스 46
598 chr12 ATP2A2 110783112 110783161 - 호모사피엔스 49
599 chr12 ATP2A2 110783116 110783161 - 호모사피엔스 45
600 chr12 ATP2A2 110784019 110784061 - 호모사피엔스 42
601 chr12 ATP2A2 110784142 110784184 - 호모사피엔스 42
602 chr12 ATP2A2 110762239 110766284 - 호모사피엔스 4045
603 chr12 ATP2A2 110769869 110773910 - 호모사피엔스 4041
604 chr12 ATP2A2 110775311 110779357 - 호모사피엔스 4046
605 chr12 ATP2A2 110776603 110780648 - 호모사피엔스 4045
606 chr12 ATP2A2 110779134 110783180 - 호모사피엔스 4046
607 chr12 ATP2A2 110781112 110785161 - 호모사피엔스 4049
608 chr12 ATP2A2 110781116 110785161 - 호모사피엔스 4045
609 chr12 ATP2A2 110782019 110786061 - 호모사피엔스 4042
610 chr12 ATP2A2 110782142 110786184 - 호모사피엔스 4042
611 chr11 APOA1 116694468 116720338 - 호모사피엔스 25870
612 chr11 APOA1 116694468 116720338 + 호모사피엔스 25870
613 chr4 Abca1 53031660 53184767 - 생쥐 153107
614 chr4 Abca1 53031660 53184767 + 생쥐 153107
615 chr9 ABCA1 107531283 107702527 - 호모사피엔스 171244
616 chr9 ABCA1 107531283 107702527 + 호모사피엔스 171244
617 chr9 Apoa1 46024712 46050549 + 생쥐 25837
618 chr9 Apoa1 46024712 46050549 - 생쥐 25837
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800 chr9 ABCA1 107631948 107635996 + 호모사피엔스 4048
801 chr9 ABCA1 107646816 107650890 + 호모사피엔스 4074
802 chr9 ABCA1 107648500 107652558 + 호모사피엔스 4058
803 chr9 ABCA1 107663550 107667591 + 호모사피엔스 4041
804 chr9 ABCA1 107664033 107668073 + 호모사피엔스 4040
805 chr10 PTEN 89611194 89740532 + 호모사피엔스 129338
806 chr10 PTEN 89611194 89740532 - 호모사피엔스 129338
807 chr19 Pten 32820066 32912650 + 생쥐 92584
808 chr19 Pten 32820066 32912650 - 생쥐 92584
809 chr10 PTEN 89624228 89624270 + 호모사피엔스 42
810 chr10 PTEN 89624833 89624878 + 호모사피엔스 45
811 chr10 PTEN 89624926 89624970 + 호모사피엔스 44
812 chr10 PTEN 89625394 89625442 + 호모사피엔스 48
813 chr10 PTEN 89625544 89625602 + 호모사피엔스 58
814 chr10 PTEN 89625817 89625863 + 호모사피엔스 46
815 chr10 PTEN 89625913 89625938 + 호모사피엔스 25
816 chr10 PTEN 89625981 89626027 + 호모사피엔스 46
817 chr10 PTEN 89626204 89626244 + 호모사피엔스 40
818 chr10 PTEN 89626597 89626641 + 호모사피엔스 44
819 chr10 PTEN 89626724 89626775 + 호모사피엔스 51
820 chr10 PTEN 89626875 89626911 + 호모사피엔스 36
821 chr10 PTEN 89627125 89627169 + 호모사피엔스 44
822 chr10 PTEN 89628194 89628243 + 호모사피엔스 49
823 chr10 PTEN 89630898 89630936 + 호모사피엔스 38
824 chr10 PTEN 89633768 89633831 + 호모사피엔스 63
825 chr10 PTEN 89637731 89637778 + 호모사피엔스 47
826 chr10 PTEN 89655949 89655994 + 호모사피엔스 45
827 chr10 PTEN 89685417 89685446 + 호모사피엔스 29
828 chr10 PTEN 89686532 89686579 + 호모사피엔스 47
829 chr10 PTEN 89686846 89686893 + 호모사피엔스 47
830 chr10 PTEN 89690160 89690213 + 호모사피엔스 53
831 chr10 PTEN 89691658 89691701 + 호모사피엔스 43
832 chr10 PTEN 89692927 89692973 + 호모사피엔스 46
833 chr10 PTEN 89693941 89693990 + 호모사피엔스 49
834 chr10 PTEN 89695260 89695313 + 호모사피엔스 53
835 chr10 PTEN 89695827 89695873 + 호모사피엔스 46
836 chr10 PTEN 89697310 89697355 + 호모사피엔스 45
837 chr10 PTEN 89698069 89698110 + 호모사피엔스 41
838 chr10 PTEN 89698500 89698543 + 호모사피엔스 43
839 chr10 PTEN 89698790 89698828 + 호모사피엔스 38
840 chr10 PTEN 89699611 89699656 + 호모사피엔스 45
841 chr10 PTEN 89700446 89700493 + 호모사피엔스 47
842 chr10 PTEN 89700876 89700919 + 호모사피엔스 43
843 chr10 PTEN 89701325 89701377 + 호모사피엔스 52
844 chr10 PTEN 89701617 89701717 + 호모사피엔스 100
845 chr10 PTEN 89701764 89701818 + 호모사피엔스 54
846 chr10 PTEN 89701915 89701962 + 호모사피엔스 47
847 chr10 PTEN 89712065 89712111 + 호모사피엔스 46
848 chr10 PTEN 89712351 89712402 + 호모사피엔스 51
849 chr10 PTEN 89712411 89712510 + 호모사피엔스 99
850 chr10 PTEN 89714201 89714228 + 호모사피엔스 27
851 chr10 PTEN 89717191 89717238 + 호모사피엔스 47
852 chr10 PTEN 89720717 89720765 + 호모사피엔스 48
853 chr10 PTEN 89723393 89723443 + 호모사피엔스 50
854 chr10 PTEN 89725518 89725564 + 호모사피엔스 46
855 chr10 PTEN 89725617 89725658 + 호모사피엔스 41
856 chr10 PTEN 89725819 89725865 + 호모사피엔스 46
857 chr10 PTEN 89726333 89726368 + 호모사피엔스 35
858 chr10 PTEN 89726640 89726709 + 호모사피엔스 69
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861 chr10 PTEN 89728125 89728171 + 호모사피엔스 46
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863 chr10 PTEN 89728128 89728172 + 호모사피엔스 44
864 chr10 PTEN 89730064 89730112 + 호모사피엔스 48
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866 chr10 PTEN 89622228 89626270 + 호모사피엔스 4042
867 chr10 PTEN 89622833 89626878 + 호모사피엔스 4045
868 chr10 PTEN 89622926 89626970 + 호모사피엔스 4044
869 chr10 PTEN 89623394 89627442 + 호모사피엔스 4048
870 chr10 PTEN 89623544 89627602 + 호모사피엔스 4058
871 chr10 PTEN 89623817 89627863 + 호모사피엔스 4046
872 chr10 PTEN 89623913 89627938 + 호모사피엔스 4025
873 chr10 PTEN 89623981 89628027 + 호모사피엔스 4046
874 chr10 PTEN 89624204 89628244 + 호모사피엔스 4040
875 chr10 PTEN 89624597 89628641 + 호모사피엔스 4044
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877 chr10 PTEN 89624875 89628911 + 호모사피엔스 4036
878 chr10 PTEN 89625125 89629169 + 호모사피엔스 4044
879 chr10 PTEN 89626194 89630243 + 호모사피엔스 4049
880 chr10 PTEN 89628898 89632936 + 호모사피엔스 4038
881 chr10 PTEN 89631768 89635831 + 호모사피엔스 4063
882 chr10 PTEN 89635731 89639778 + 호모사피엔스 4047
883 chr10 PTEN 89653949 89657994 + 호모사피엔스 4045
884 chr10 PTEN 89683417 89687446 + 호모사피엔스 4029
885 chr10 PTEN 89684532 89688579 + 호모사피엔스 4047
886 chr10 PTEN 89684846 89688893 + 호모사피엔스 4047
887 chr10 PTEN 89688160 89692213 + 호모사피엔스 4053
888 chr10 PTEN 89689658 89693701 + 호모사피엔스 4043
889 chr10 PTEN 89690927 89694973 + 호모사피엔스 4046
890 chr10 PTEN 89691941 89695990 + 호모사피엔스 4049
891 chr10 PTEN 89693260 89697313 + 호모사피엔스 4053
892 chr10 PTEN 89693827 89697873 + 호모사피엔스 4046
893 chr10 PTEN 89695310 89699355 + 호모사피엔스 4045
894 chr10 PTEN 89696069 89700110 + 호모사피엔스 4041
895 chr10 PTEN 89696500 89700543 + 호모사피엔스 4043
896 chr10 PTEN 89696790 89700828 + 호모사피엔스 4038
897 chr10 PTEN 89697611 89701656 + 호모사피엔스 4045
898 chr10 PTEN 89698446 89702493 + 호모사피엔스 4047
899 chr10 PTEN 89698876 89702919 + 호모사피엔스 4043
900 chr10 PTEN 89699325 89703377 + 호모사피엔스 4052
901 chr10 PTEN 89699617 89703717 + 호모사피엔스 4100
902 chr10 PTEN 89699764 89703818 + 호모사피엔스 4054
903 chr10 PTEN 89699915 89703962 + 호모사피엔스 4047
904 chr10 PTEN 89710065 89714111 + 호모사피엔스 4046
905 chr10 PTEN 89710351 89714402 + 호모사피엔스 4051
906 chr10 PTEN 89710411 89714510 + 호모사피엔스 4099
907 chr10 PTEN 89712201 89716228 + 호모사피엔스 4027
908 chr10 PTEN 89715191 89719238 + 호모사피엔스 4047
909 chr10 PTEN 89718717 89722765 + 호모사피엔스 4048
910 chr10 PTEN 89721393 89725443 + 호모사피엔스 4050
911 chr10 PTEN 89723518 89727564 + 호모사피엔스 4046
912 chr10 PTEN 89723617 89727658 + 호모사피엔스 4041
913 chr10 PTEN 89723819 89727865 + 호모사피엔스 4046
914 chr10 PTEN 89724333 89728368 + 호모사피엔스 4035
915 chr10 PTEN 89724640 89728709 + 호모사피엔스 4069
916 chr10 PTEN 89725525 89729567 + 호모사피엔스 4042
917 chr10 PTEN 89725527 89729569 + 호모사피엔스 4042
918 chr10 PTEN 89726125 89730171 + 호모사피엔스 4046
919 chr10 PTEN 89726126 89730170 + 호모사피엔스 4044
920 chr10 PTEN 89726128 89730172 + 호모사피엔스 4044
921 chr10 PTEN 89728064 89732112 + 호모사피엔스 4048
922 chr10 PTEN 89728269 89732384 + 호모사피엔스 4115
923 chr10 PTEN 89623576 89623622 - 호모사피엔스 46
924 chr10 PTEN 89623906 89623956 - 호모사피엔스 50
925 chr10 PTEN 89624031 89624073 - 호모사피엔스 42
926 chr10 PTEN 89624202 89624247 - 호모사피엔스 45
927 chr10 PTEN 89624760 89624805 - 호모사피엔스 45
928 chr10 PTEN 89625073 89625113 - 호모사피엔스 40
929 chr10 PTEN 89628887 89628953 - 호모사피엔스 66
930 chr10 PTEN 89665539 89665573 - 호모사피엔스 34
931 chr10 PTEN 89692964 89693006 - 호모사피엔스 42
932 chr10 PTEN 89695528 89695586 - 호모사피엔스 58
933 chr10 PTEN 89695765 89695876 - 호모사피엔스 111
934 chr10 PTEN 89695889 89695911 - 호모사피엔스 22
935 chr10 PTEN 89697361 89697418 - 호모사피엔스 57
936 chr10 PTEN 89697767 89697812 - 호모사피엔스 45
937 chr10 PTEN 89721856 89721896 - 호모사피엔스 40
938 chr10 PTEN 89621576 89625622 - 호모사피엔스 4046
939 chr10 PTEN 89621906 89625956 - 호모사피엔스 4050
940 chr10 PTEN 89622031 89626073 - 호모사피엔스 4042
941 chr10 PTEN 89622202 89626247 - 호모사피엔스 4045
942 chr10 PTEN 89622760 89626805 - 호모사피엔스 4045
943 chr10 PTEN 89623073 89627113 - 호모사피엔스 4040
944 chr10 PTEN 89626887 89630953 - 호모사피엔스 4066
945 chr10 PTEN 89663539 89667573 - 호모사피엔스 4034
946 chr10 PTEN 89690964 89695006 - 호모사피엔스 4042
947 chr10 PTEN 89693528 89697586 - 호모사피엔스 4058
948 chr10 PTEN 89693765 89697876 - 호모사피엔스 4111
949 chr10 PTEN 89693889 89697911 - 호모사피엔스 4022
950 chr10 PTEN 89695361 89699418 - 호모사피엔스 4057
951 chr10 PTEN 89695767 89699812 - 호모사피엔스 4045
952 chr10 PTEN 89719856 89723896 - 호모사피엔스 4040
953 chr11 BDNF 27664441 27693196 - 호모사피엔스 28755
954 chr11 BDNF 27664441 27693196 + 호모사피엔스 28755
955 chr11 BDNF-AS1 27516398 27731718 + 호모사피엔스 215320
956 chr11 BDNF-AS1 27516398 27731718 - 호모사피엔스 215320
957 chr2 Bdnf 109502856 109579200 + 생쥐 76344
958 chr2 Bdnf 109502856 109579200 - 생쥐 76344
959 chr11 BDNF 27678819 27678888 - 호모사피엔스 69
960 chr11 BDNF 27679423 27679469 - 호모사피엔스 46
961 chr11 BDNF 27679512 27679558 - 호모사피엔스 46
962 chr11 BDNF 27679705 27679749 - 호모사피엔스 44
963 chr11 BDNF 27686657 27686742 - 호모사피엔스 85
964 chr11 BDNF 27718502 27718548 - 호모사피엔스 46
965 chr11 BDNF 27719743 27719780 - 호모사피엔스 37
966 chr11 BDNF 27721391 27721434 - 호모사피엔스 43
967 chr11 BDNF 27676819 27680888 - 호모사피엔스 4069
968 chr11 BDNF 27677423 27681469 - 호모사피엔스 4046
969 chr11 BDNF 27677512 27681558 - 호모사피엔스 4046
970 chr11 BDNF 27677705 27681749 - 호모사피엔스 4044
971 chr11 BDNF 27684657 27688742 - 호모사피엔스 4085
972 chr11 BDNF 27716502 27720548 - 호모사피엔스 4046
973 chr11 BDNF 27717743 27721780 - 호모사피엔스 4037
974 chr11 BDNF 27719391 27723434 - 호모사피엔스 4043
975 chr11 BDNF 27739230 27739276 - 호모사피엔스 46
976 chr11 BDNF 27741576 27741622 - 호모사피엔스 46
977 chr11 BDNF 27742481 27742526 - 호모사피엔스 45
978 chr11 BDNF 27742552 27742602 - 호모사피엔스 50
979 chr11 BDNF 27737230 27741276 - 호모사피엔스 4046
980 chr11 BDNF 27739576 27743622 - 호모사피엔스 4046
981 chr11 BDNF 27740481 27744526 - 호모사피엔스 4045
982 chr11 BDNF 27740552 27744602 - 호모사피엔스 4050
983 chr11 BDNF 27518527 27518574 - 호모사피엔스 47
984 chr11 BDNF 27518780 27518823 - 호모사피엔스 43
985 chr11 BDNF 27518870 27518922 - 호모사피엔스 52
986 chr11 BDNF 27519285 27519333 - 호모사피엔스 48
987 chr11 BDNF 27520498 27520547 - 호모사피엔스 49
988 chr11 BDNF 27520913 27520996 - 호모사피엔스 83
989 chr11 BDNF 27521081 27521112 - 호모사피엔스 31
990 chr11 BDNF 27523348 27523395 - 호모사피엔스 47
991 chr11 BDNF 27523423 27523469 - 호모사피엔스 46
992 chr11 BDNF 27516527 27520574 - 호모사피엔스 4047
993 chr11 BDNF 27516780 27520823 - 호모사피엔스 4043
994 chr11 BDNF 27516870 27520922 - 호모사피엔스 4052
995 chr11 BDNF 27517285 27521333 - 호모사피엔스 4048
996 chr11 BDNF 27518498 27522547 - 호모사피엔스 4049
997 chr11 BDNF 27518913 27522996 - 호모사피엔스 4083
998 chr11 BDNF 27519081 27523112 - 호모사피엔스 4031
999 chr11 BDNF 27521348 27525395 - 호모사피엔스 4047
1000 chr11 BDNF 27521423 27525469 - 호모사피엔스 4046
1001 chr11 BDNF 27681917 27681964 + 호모사피엔스 47
1002 chr11 BDNF 27697978 27698023 + 호모사피엔스 45
1003 chr11 BDNF 27718599 27718680 + 호모사피엔스 81
1004 chr11 BDNF 27679917 27683964 + 호모사피엔스 4047
1005 chr11 BDNF 27695978 27700023 + 호모사피엔스 4045
1006 chr11 BDNF 27716599 27720680 + 호모사피엔스 4081
1007 chr11 BDNF 27523708 27523784 + 호모사피엔스 76
1008 chr11 BDNF 27527959 27528009 + 호모사피엔스 50
1009 chr11 BDNF 27528063 27528106 + 호모사피엔스 43
1010 chr11 BDNF 27521708 27525784 + 호모사피엔스 4076
1011 chr11 BDNF 27525959 27530009 + 호모사피엔스 4050
1012 chr11 BDNF 27526063 27530106 + 호모사피엔스 4043
1013 chr11 BDNF 27734836 27734884 + 호모사피엔스 48
1014 chr11 BDNF 27740311 27740344 + 호모사피엔스 33
1015 chr11 BDNF 27741786 27741828 + 호모사피엔스 42
1016 chr11 BDNF 27742450 27742493 + 호모사피엔스 43
1017 chr11 BDNF 27732836 27736884 + 호모사피엔스 4048
1018 chr11 BDNF 27738311 27742344 + 호모사피엔스 4033
1019 chr11 BDNF 27739786 27743828 + 호모사피엔스 4042
1020 chr11 BDNF 27740450 27744493 + 호모사피엔스 4043
1021 chr3 ADIPOQ 186548462 186588252 + 호모사피엔스 39790
1022 chr3 ADIPOQ 186548462 186588252 - 호모사피엔스 39790
1023 chr16 Adipoq 23134608 23170041 + 생쥐 35433
1024 chr16 Adipoq 23134608 23170041 - 생쥐 35433
1025 chr3 ADIPOQ 186566781 186566827 + 호모사피엔스 46
1026 chr3 ADIPOQ 186571630 186571674 + 호모사피엔스 44
1027 chr3 ADIPOQ 186564781 186568827 + 호모사피엔스 4046
1028 chr3 ADIPOQ 186569630 186573674 + 호모사피엔스 4044
1029 chr3 ADIPOQ 186572160 186572189 - 호모사피엔스 29
1030 chr3 ADIPOQ 186570160 186574189 - 호모사피엔스 4029
1031 chrX MECP2 153275263 153375188 - 호모사피엔스 99925
1032 chrX MECP2 153275263 153375188 + 호모사피엔스 99925
1033 chrX Mecp2 71260160 71342932 - 호모사피엔스 82772
1034 chrX Mecp2 71260160 71342932 + 호모사피엔스 82772
1035 chrX MECP2 153278064 153278111 - 호모사피엔스 47
1036 chrX MECP2 153278111 153278156 - 호모사피엔스 45
1037 chrX MECP2 153278706 153278747 - 호모사피엔스 41
1038 chrX MECP2 153279512 153279556 - 호모사피엔스 44
1039 chrX MECP2 153279613 153279658 - 호모사피엔스 45
1040 chrX MECP2 153281486 153281531 - 호모사피엔스 45
1041 chrX MECP2 153283707 153283737 - 호모사피엔스 30
1042 chrX MECP2 153284059 153284105 - 호모사피엔스 46
1043 chrX MECP2 153287944 153287992 - 호모사피엔스 48
1044 chrX MECP2 153288681 153288722 - 호모사피엔스 41
1045 chrX MECP2 153290087 153290134 - 호모사피엔스 47
1046 chrX MECP2 153290216 153290263 - 호모사피엔스 47
1047 chrX MECP2 153290364 153290414 - 호모사피엔스 50
1048 chrX MECP2 153291585 153291633 - 호모사피엔스 48
1049 chrX MECP2 153292312 153292362 - 호모사피엔스 50
1050 chrX MECP2 153292731 153292774 - 호모사피엔스 43
1051 chrX MECP2 153293138 153293185 - 호모사피엔스 47
1052 chrX MECP2 153293331 153293377 - 호모사피엔스 46
1053 chrX MECP2 153293427 153293469 - 호모사피엔스 42
1054 chrX MECP2 153293568 153293614 - 호모사피엔스 46
1055 chrX MECP2 153293715 153293764 - 호모사피엔스 49
1056 chrX MECP2 153293792 153293878 - 호모사피엔스 86
1057 chrX MECP2 153293901 153293948 - 호모사피엔스 47
1058 chrX MECP2 153294420 153294467 - 호모사피엔스 47
1059 chrX MECP2 153297927 153297972 - 호모사피엔스 45
1060 chrX MECP2 153315466 153315571 - 호모사피엔스 105
1061 chrX MECP2 153343401 153343447 - 호모사피엔스 46
1062 chrX MECP2 153344298 153344339 - 호모사피엔스 41
1063 chrX MECP2 153348654 153348702 - 호모사피엔스 48
1064 chrX MECP2 153348997 153349021 - 호모사피엔스 24
1065 chrX MECP2 153349179 153349222 - 호모사피엔스 43
1066 chrX MECP2 153349694 153349734 - 호모사피엔스 40
1067 chrX MECP2 153350493 153350518 - 호모사피엔스 25
1068 chrX MECP2 153356667 153356713 - 호모사피엔스 46
1069 chrX MECP2 153356742 153356795 - 호모사피엔스 53
1070 chrX MECP2 153357047 153357106 - 호모사피엔스 59
1071 chrX MECP2 153357161 153357204 - 호모사피엔스 43
1072 chrX MECP2 153361085 153361163 - 호모사피엔스 78
1073 chrX MECP2 153361423 153361467 - 호모사피엔스 44
1074 chrX MECP2 153362464 153362527 - 호모사피엔스 63
1075 chrX MECP2 153276064 153280111 - 호모사피엔스 4047
1076 chrX MECP2 153276111 153280156 - 호모사피엔스 4045
1077 chrX MECP2 153276706 153280747 - 호모사피엔스 4041
1078 chrX MECP2 153277512 153281556 - 호모사피엔스 4044
1079 chrX MECP2 153277613 153281658 - 호모사피엔스 4045
1080 chrX MECP2 153279486 153283531 - 호모사피엔스 4045
1081 chrX MECP2 153281707 153285737 - 호모사피엔스 4030
1082 chrX MECP2 153282059 153286105 - 호모사피엔스 4046
1083 chrX MECP2 153285944 153289992 - 호모사피엔스 4048
1084 chrX MECP2 153286681 153290722 - 호모사피엔스 4041
1085 chrX MECP2 153288087 153292134 - 호모사피엔스 4047
1086 chrX MECP2 153288216 153292263 - 호모사피엔스 4047
1087 chrX MECP2 153288364 153292414 - 호모사피엔스 4050
1088 chrX MECP2 153289585 153293633 - 호모사피엔스 4048
1089 chrX MECP2 153290312 153294362 - 호모사피엔스 4050
1090 chrX MECP2 153290731 153294774 - 호모사피엔스 4043
1091 chrX MECP2 153291138 153295185 - 호모사피엔스 4047
1092 chrX MECP2 153291331 153295377 - 호모사피엔스 4046
1093 chrX MECP2 153291427 153295469 - 호모사피엔스 4042
1094 chrX MECP2 153291568 153295614 - 호모사피엔스 4046
1095 chrX MECP2 153291715 153295764 - 호모사피엔스 4049
1096 chrX MECP2 153291792 153295878 - 호모사피엔스 4086
1097 chrX MECP2 153291901 153295948 - 호모사피엔스 4047
1098 chrX MECP2 153292420 153296467 - 호모사피엔스 4047
1099 chrX MECP2 153295927 153299972 - 호모사피엔스 4045
1100 chrX MECP2 153313466 153317571 - 호모사피엔스 4105
1101 chrX MECP2 153341401 153345447 - 호모사피엔스 4046
1102 chrX MECP2 153342298 153346339 - 호모사피엔스 4041
1103 chrX MECP2 153346654 153350702 - 호모사피엔스 4048
1104 chrX MECP2 153346997 153351021 - 호모사피엔스 4024
1105 chrX MECP2 153347179 153351222 - 호모사피엔스 4043
1106 chrX MECP2 153347694 153351734 - 호모사피엔스 4040
1107 chrX MECP2 153348493 153352518 - 호모사피엔스 4025
1108 chrX MECP2 153354667 153358713 - 호모사피엔스 4046
1109 chrX MECP2 153354742 153358795 - 호모사피엔스 4053
1110 chrX MECP2 153355047 153359106 - 호모사피엔스 4059
1111 chrX MECP2 153355161 153359204 - 호모사피엔스 4043
1112 chrX MECP2 153359085 153363163 - 호모사피엔스 4078
1113 chrX MECP2 153359423 153363467 - 호모사피엔스 4044
1114 chrX MECP2 153360464 153364527 - 호모사피엔스 4063
1115 chrX MECP2 153279614 153279660 + 호모사피엔스 46
1116 chrX MECP2 153281662 153281720 + 호모사피엔스 58
1117 chrX MECP2 153281946 153281988 + 호모사피엔스 42
1118 chrX MECP2 153284367 153284448 + 호모사피엔스 81
1119 chrX MECP2 153284489 153284534 + 호모사피엔스 45
1120 chrX MECP2 153288786 153288832 + 호모사피엔스 46
1121 chrX MECP2 153289895 153289940 + 호모사피엔스 45
1122 chrX MECP2 153292315 153292365 + 호모사피엔스 50
1123 chrX MECP2 153292496 153292548 + 호모사피엔스 52
1124 chrX MECP2 153297642 153297688 + 호모사피엔스 46
1125 chrX MECP2 153297723 153297765 + 호모사피엔스 42
1126 chrX MECP2 153300816 153300879 + 호모사피엔스 63
1127 chrX MECP2 153315579 153315621 + 호모사피엔스 42
1128 chrX MECP2 153316595 153316640 + 호모사피엔스 45
1129 chrX MECP2 153348783 153348830 + 호모사피엔스 47
1130 chrX MECP2 153349199 153349250 + 호모사피엔스 51
1131 chrX MECP2 153358221 153358285 + 호모사피엔스 64
1132 chrX MECP2 153277614 153281660 + 호모사피엔스 4046
1133 chrX MECP2 153279662 153283720 + 호모사피엔스 4058
1134 chrX MECP2 153279946 153283988 + 호모사피엔스 4042
1135 chrX MECP2 153282367 153286448 + 호모사피엔스 4081
1136 chrX MECP2 153282489 153286534 + 호모사피엔스 4045
1137 chrX MECP2 153286786 153290832 + 호모사피엔스 4046
1138 chrX MECP2 153287895 153291940 + 호모사피엔스 4045
1139 chrX MECP2 153290315 153294365 + 호모사피엔스 4050
1140 chrX MECP2 153290496 153294548 + 호모사피엔스 4052
1141 chrX MECP2 153295642 153299688 + 호모사피엔스 4046
1142 chrX MECP2 153295723 153299765 + 호모사피엔스 4042
1143 chrX MECP2 153298816 153302879 + 호모사피엔스 4063
1144 chrX MECP2 153313579 153317621 + 호모사피엔스 4042
1145 chrX MECP2 153314595 153318640 + 호모사피엔스 4045
1146 chrX MECP2 153346783 153350830 + 호모사피엔스 4047
1147 chrX MECP2 153347199 153351250 + 호모사피엔스 4051
1148 chrX MECP2 153356221 153360285 + 호모사피엔스 4064
1149 chrX FOXP3 49094896 49133288 - 호모사피엔스 38392
1150 chrX FOXP3 49094896 49133288 + 호모사피엔스 38392
1151 chrX Foxp3 7567675 7607243 + 생쥐 39568
1152 chrX Foxp3 7567675 7607243 - 생쥐 39568
1153 chrX FOXP3 49091852 49146158 + 호모사피엔스 54306
1154 chrX FOXP3 49105387 49126985 + 호모사피엔스 21598
1155 chrX FOXP3 49105442 49121156 + 호모사피엔스 15714
1156 chrX FOXP3 49131266 49131313 + 호모사피엔스 47
1157 chrX FOXP3 49131123 49131172 + 호모사피엔스 49
1158 chrX FOXP3 49127994 49128033 + 호모사피엔스 39
1159 chrX FOXP3 49127843 49127890 + 호모사피엔스 47
1160 chrX FOXP3 49127628 49127670 + 호모사피엔스 42
1161 chrX FOXP3 49124798 49124897 + 호모사피엔스 99
1162 chrX FOXP3 49123918 49123965 + 호모사피엔스 47
1163 chrX FOXP3 49120701 49120753 + 호모사피엔스 52
1164 chrX FOXP3 49118531 49118555 + 호모사피엔스 24
1165 chrX FOXP3 49115652 49115685 + 호모사피엔스 33
1166 chrX FOXP3 49112995 49113044 + 호모사피엔스 49
1167 chrX FOXP3 49112863 49112906 + 호모사피엔스 43
1168 chrX FOXP3 49112637 49112717 + 호모사피엔스 80
1169 chrX FOXP3 49107522 49107575 + 호모사피엔스 53
1170 chrX FOXP3 49106607 49106653 + 호모사피엔스 46
1171 chrX FOXP3 49106128 49106175 + 호모사피엔스 47
1172 chrX FOXP3 49105839 49105886 + 호모사피엔스 47
1173 chrX FOXP3 49105669 49105701 + 호모사피엔스 32
1174 chrX FOXP3 49105241 49105285 + 호모사피엔스 44
1175 chrX FOXP3 49089852 49148158 + 호모사피엔스 58306
1176 chrX FOXP3 49103387 49128985 + 호모사피엔스 25598
1177 chrX FOXP3 49103442 49123156 + 호모사피엔스 19714
1178 chrX FOXP3 49129266 49133313 + 호모사피엔스 4047
1179 chrX FOXP3 49129123 49133172 + 호모사피엔스 4049
1180 chrX FOXP3 49125994 49130033 + 호모사피엔스 4039
1181 chrX FOXP3 49125843 49129890 + 호모사피엔스 4047
1182 chrX FOXP3 49125628 49129670 + 호모사피엔스 4042
1183 chrX FOXP3 49122798 49126897 + 호모사피엔스 4099
1184 chrX FOXP3 49121918 49125965 + 호모사피엔스 4047
1185 chrX FOXP3 49118701 49122753 + 호모사피엔스 4052
1186 chrX FOXP3 49116531 49120555 + 호모사피엔스 4024
1187 chrX FOXP3 49113652 49117685 + 호모사피엔스 4033
1188 chrX FOXP3 49110995 49115044 + 호모사피엔스 4049
1189 chrX FOXP3 49110863 49114906 + 호모사피엔스 4043
1190 chrX FOXP3 49110637 49114717 + 호모사피엔스 4080
1191 chrX FOXP3 49105522 49109575 + 호모사피엔스 4053
1192 chrX FOXP3 49104607 49108653 + 호모사피엔스 4046
1193 chrX FOXP3 49104128 49108175 + 호모사피엔스 4047
1194 chrX FOXP3 49103839 49107886 + 호모사피엔스 4047
1195 chrX FOXP3 49103669 49107701 + 호모사피엔스 4032
1196 chrX FOXP3 49103241 49107285 + 호모사피엔스 4044
1197 chrX FOXP3 49091852 49146158 - 호모사피엔스 54306
1198 chrX FOXP3 49105387 49126985 - 호모사피엔스 21598
1199 chrX FOXP3 49127432 49127481 - 호모사피엔스 49
1200 chrX FOXP3 49127343 49127398 - 호모사피엔스 55
1201 chrX FOXP3 49117756 49117794 - 호모사피엔스 38
1202 chrX FOXP3 49100610 49100635 - 호모사피엔스 25
1203 chrX FOXP3 49100129 49100194 - 호모사피엔스 65
1204 chrX FOXP3 49099553 49099595 - 호모사피엔스 42
1205 chrX FOXP3 49089852 49148158 - 호모사피엔스 58306
1206 chrX FOXP3 49103387 49128985 - 호모사피엔스 25598
1207 chrX FOXP3 49125432 49129481 - 호모사피엔스 4049
1208 chrX FOXP3 49125343 49129398 - 호모사피엔스 4055
1209 chrX FOXP3 49115756 49119794 - 호모사피엔스 4038
1210 chrX FOXP3 49098610 49102635 - 호모사피엔스 4025
1211 chrX FOXP3 49098129 49102194 - 호모사피엔스 4065
1212 chrX FOXP3 49097553 49101595 - 호모사피엔스 4042
표 2: 확장된 PRC2 전사체에 의한 각인 영역(imprinted region)
각인된 유전자 좌표에 의한 PRC2 전사체의 교차(온라인 geneimprint.com에서 사용가능). PRC2 결합 전사체에 의해 표적이 된 쥐 각인 유전자(즉, 교차 또는 인근 유전자)는 컬럼 1에 보여진다. 컬럼 1은 또한, 쥐 각인 유전자의 염색체 가닥(“+” 표시는 유전자가 탑 또는 플러스 가닥으로부터 전사되는 것을 나타내는 반면, “-” 표시는 PRC2 결합 전사체가 염색체의 바닥부 또는 마이너스 가닥으로부터 전사되는 것을 나타냄)도 보여준다. PRC2 결합 전사체의 mm9에서 염색체 정위 및 뉴클레오타이드 좌표는 컬럼 2, 뿐만 아니라 PRC2 결합 전사체가 염색체의 상부 가닥(플러스 가닥 히트) 또는 하부 가닥(마이너스 가닥 히트)로부터 전사되는지의 여부를 표시하는 “+” 표시 또는 “-” 표시에 나타나 있다. 컬럼 3은 마우스 PRC2 결합 전사체의 서열 식별자(즉, T를 U로 치환함으로써 RNA로 전환된, 컬럼 2의 마우스 염색체 좌표 및 가닥으로부터 전사된 뉴클레오타이드 서열)를 나타낸다. 컬럼4는 마우스 게놈 데이터베이스(MGD), 마우스 게놈 인포메틱스(Mouse Genome Informatics), 더 잭슨 래보래토리(The Jackson Laboratory), 바 하보(Bar Harbor), 마이네. 월드 와이드 웹(Maine.World Wide Web)(informatics.jax.org.)으로부터 얻은, 컬럼 1의 쥐 각인 유전자에 대한 대응 인간 유전자명을 나타낸다. 본 명세서에 설명된 대로 UCSC 게놈 브라우저에서 수행된, 컬럼 2에서 마우스 염색체 좌표의 마우스 대 인간 리프트오버(LiftOver)는 컬럼 5에 나타난 이종상동성 인간 염색체 좌표들을 생성시켰다. 50% 보존이 리프트오버 분석에 사용되었다. 마우스로부터 인간 게놈까지 매우 보존된 또는 상동성 영역을 맵핑함으로써 추가의 인간 염색체 좌표들이 생성되었다. 컬럼 6은 예측된 인간 PRC2 결합 전사체(즉, T를 U로 치환함으로써 RNA로 전환된, 컬럼 5의 인간 염색체 좌표 및 가닥으로부터 전사된 뉴클레오타이드 서열)의 서열 식별자를 나타낸다. PRC2 상호작용시에, 전사체는 컬럼 1에서 각인된 참조 유전자에 비해, 반대 가닥으로부터 전사되며, 이는 PRC 상호작용 RNA가 참조 각인된 유전자에 대하여, 상보적이거나, 또는 방향에 있어서 안티센스 가닥(“반대 가닥”)임을 지칭한다. PRC2 결합 전사체가 참조 각인된 유전자 자체가 아니라, 위치가 중첩되는 구별된 전사체를 필요로 한다는 것을 주목한다.
표 3: 인간 miRNA의 시드 서열이 아닌 헥사머
본 명세서에 참조로 전문 포함되는, 2010년 12월 20일자로 출원된 미국 가출원 61/425,174의 첨부자료 I은 완전한 RIP 서열 데이터세트 목록이며, 이는 데이터세트의 모든 리드들을 보여준다. 첨부자료 I는 여기에 첨부하지 않는다. 첨부자료 I의 서열 리드는 일루미나(Illumina) GA II 게놈 분석기를 바로 제거하며, PRC2 결합 전사체의 역 상보체인 방향으로 있다. 첨부자료 I는 제거된 어댑터/프라이머 다이머, 미토콘드리아 RNA, rRNA, 호모폴리머, 비결정적 뉴클레오타이드, 및 절단된 리드들(<15nt)을 바이오인포메틱 여과후 모든 리드들의 여과된 서브세트이다.
본원에서 제공되는 본 발명의 측면은 폴리콤 억제 복합체 2 (PRC2)-상호작용 RNA의 발견에 관한 것이다. 폴리콤 억제 복합체 2 (PRC2)는 히스톤 메틸트랜스퍼라제로서, 히스톤 H3의 메틸화를 통해 게놈 영역의 침묵화(silencing)에 관여하는 공지된 후성유전학적 조절자(epigenetic regulator)이다. 다른 기능들 중에서도, PRC2는 길이가 긴 비-코딩 RNA(lncRNAs), 예컨대 RepA, Xist, 및 Tsix와 상호작용하여, 히스톤 H3-라이신27의 트리메틸화를 촉매한다. PRC2는 4가지 서브유닛인 Eed, Suz12, RbAp48, 및 Ezh2를 포함한다.
본 명세서에서 “RNA 면역침전(RIP)-seq”로 언급된 방법은 배아줄기세포들에서 >100,000 폴리콤 억제 복합체 2(PRC2)-상호작용 RNA의 게놈-와이드 풀을 확인하기 위해 사용했다. 대다수의 전사체들은 각인된 영역, 온코진 및 종양 억제자 loci, 및 줄기-세포-연관 2가 도메인들 내에서 및 주변에서 발생한다. Ezh2 서브유닛을 통해, 직접적인 RNA-단백질 상호작용에 대한 입증이 이루어졌다. 상기 PRC2-상호작용 RNA에 결합하기 위해 설계된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 다양한 별도의 및 독립적인 실시예들에서 유전자 발현을 성공적으로 상향조절할 수 있어서, 이것이 상기 표적 유전자들의 PRC2 매개된 억제를 방해할 것으로 믿는, 추가의 입증이 이뤄졌다. 따라서, PRC2 복합체들은 게놈-수준의 RNA 종류와 상호작용하게 되어, 인간 질병을 위한 치료용 표적으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, RPC2와 상호작용하는 RNA의 서열들은 길이가 40 내지 60개 뉴클레오타이드들이었다.
본원에서, 용어 "PRC2-연관 영역"은 PRC2의 구성요소와 직간접적으로 상호작용하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하거나 또는 코딩하는 핵산 영역을 지칭한다. PRC2-연관 영역은 PRC2와 상호작용하는 RNA(예를 들어, 길이가 긴 비-코딩 RNA(lncRNA))에 존재할 수 있다. PRC2-연관 영역은 PRC2와 상호작용하는 RNA를 코딩하는 DNA에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은, RNA를 발현하는 세포의 인 시추(in situ) 자외선 조사에 반응하여 PRC2의 구성요소에 가교하는 RNA 영역, 또는 상기 RNA 영역을 코딩하는 게놈 DNA 영역이다. 일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은, PRC2의 구성요소를 표적으로 하는 항체로 면역침전되는 RNA 영역, 또는 상기 RNA 영역을 코딩하는 게놈 DNA 영역이다. 일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은, SUZ12, EED, EZH2 또는 RBBP4 (전술한 바와 같이 PRC2의 구성요소임)를 표적으로 하는 항체로 면역침전되는 RNA 영역, 또는 상기 RNA 영역을 코딩하는 게놈 DNA 영역이다.
일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은, PRC2의 구성요소를 표적으로 하는 항체를 이용하는 RNA-면역침전 분석법에서 뉴클레아제(예를 들어, RNase)로부터 보호되는 RNA 영역, 또는 상기 보호된 RNA 영역을 코딩하는 게놈 DNA 영역이다. 일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은, SUZ12, EED, EZH2 또는 RBBP4를 표적으로 하는 항체를 이용하는 RNA-면역침전 분석법에서 뉴클레아제(예를 들어, RNase)로부터 보호되는 RNA 영역, 또는 상기 보호된 RNA 영역을 코딩하는 게놈 DNA 영역이다.
일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은, PRC2의 구성요소를 표적으로 하는 항체를 이용하는 RNA-면역침전 분석법의 산물의 시퀀싱 반응(sequencing reaction)에서 서열 판독(sequence read)이 상대적으로 높은 빈도로 발생하는 RNA 영역, 또는 상기 RNA 영역을 코딩하는 게놈 DNA 영역이다. 일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은, SUZ12, EED, EZH2 또는 RBBP4를 표적으로 하는 항체를 이용하는 RNA-면역침전 분석법의 산물의 시퀀싱 반응에서 서열 판독이 상대적으로 높은 빈도로 발생하는 RNA 영역, 또는 상기 보호된 RNA 영역을 코딩하는 게놈 DNA 영역이다. 이러한 구현예에서, PRC2-연관 영역은 "피크(peak)"로 지칭될 수 있다.
일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은, PRC2 복합체와 상호작용하는 40개 내지 60개 뉴클레오타이드로 이루어진 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은, PRC2와 상호작용하는 RNA를 코딩하는 40개 내지 60개 뉴클레오타이드로 이루어진 서열을 포함한다.　일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은, PRC2와 상호작용하는 서열(예를 들어, 40개 내지 60개 뉴클레오타이드)을 포함하는, 길이가 5 kb 이하인 서열을 포함한다.　일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은, PRC2와 상호작용하는 것으로 알려진 서열(예를 들어, 40개 내지 60개 뉴클레오타이드)을 가진, RNA가 코딩되는 길이 5 kb 이하의 서열을 포함한다.　일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은, PRC2와 상호작용하는 서열(예를 들어, 40개 내지 60개 뉴클레오타이드)을 포함하는, 길이가 약 4 kb인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은, PRC2와 상호작용하는 것으로 알려진 서열(예를 들어, 40개 내지 60개 뉴클레오타이드)을 포함하는, RNA가 코딩되는 길이 약 4 kb의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은 서열들 A1 내지 A193,049, B1 내지 B916,209 및 B916,626 내지 B934,931 중 어느 하나에 개시된 서열을 가진다.
일부 구현예에서, PRC2-연관 영역, 예를 들면 서열들 A1 내지 A193,049, B1 내지 B916,209 및 B916,626 내지 B934,931에 개시된 서열을 갖는 핵산에 특이적으로 결합하거나 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 제공된다. 본 발명의 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이들 올리고뉴클레오타이드는 PRC2가 특정 염색체 유전자 좌(chromosomal locus)에 동원(recruitment)되는 것을 방지함으로써, PRC2의 결합 및 작용을 방해할 수 있다. 예를 들어, PRC2-연관 영역 lncRNA에 특이적으로 결합하도록 설계된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 단일 투여함으로써, lncRNA뿐만 아니라, lncRNA에 결합하는 PRC2를 결합 크로마틴(binding chromatin)으로부터 안정하게 치환(displacement)할 수 있다. 치환 후, PRC2의 완전한 보완(full complement)은 24시간 이하 동안 회복되지 않는다. 그리고, 본 명세서에 개시된 데이터는 lncRNA가 전사되는 특정 염색체 정위에서 또는 부근에서 유전자 발현을 억제하여, PRC2의 기능을 억제하고, 특정 표적 유전자의 발현을 증가시키는 올리고뉴클레오타이드를 설계할 수 있게 하는 cis 방식으로 lncRNA가 PRC2를 구성할 수 있음을 뒷받침한다.
본 발명의 추가 구현예에서, 표적 유전자의 발현을 활성화하기 위해 후보 올리고뉴클레오타이드를 선택하는 방법이 제공된다. 일반적으로, PRC2-연관 영역에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 후보 올리고뉴클레오타이드로서 선택하는 단계를 포함한다(예를 들면, 서열 A1 내지 A193,049, B1 내지 B916,209, 및 B916,626 내지 B934,931에 개시된 뉴클레오타이드 서열). 일부 구현예에서, 표적 유전자의 발현을 활성화하는 올리고뉴클레오타이드가 풍부한(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드의 무작위 선택과 비교하여) 올리고뉴클레오타이드 세트가 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, PRC2-결합 RNA에 의해 발현이 조절되는 유전자를 의미하는 “PRC2-결합 RNA에 의해 표적이 된 유전자”(예를 들면, 표 1-3에 개시된 교차 또는 부근 유전자)의 발현을 조절하는 방법에 사용하기 위해, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 제공된다. 용어 “PRC2-결합 RNA” 또는 “PRC2와 결합하는 RNA”는 “PRC2-연관 RNA” 및 “PRC2-상호작용 RNA”와 서로 바꾸어 사용되며, PRC2와 직접 또는 간접적으로 결합하는 lncRNA, RNA 전사체 또는 그의 PRC2-연관영역(예를 들면, 하기 설명된 피크(Peak))을 지칭한다. 상기 결합은 Ezh2와 같은 PRC2 복합체의 성분에 대한 항체들을 사용한 면역침전 기술들에 의해 측정될 수 있다. 서열 A1 내지 A193,049, B1 내지 B916,209, 및 B916,626 내지 B934,931은 본 명세서에 설명된 RIP-seq 방법을 사용하여 PRC2에 결합하기 위해 실험적으로 측정되는 부분들을 함유하는 쥐 RNA 서열, 또는 상기 쥐 RNA 서열들에 대응하는 인간 RNA 서열을 나타낸다.
유전자 발현을 조절하는 상기 방법들은 시험관내, 생체외 또는 생체내로 실시될 수 있다. 국제특허출원공개 WO/2012/065143의 표 8은 PRC2-결합 RNA에 의해 표적이 되는 유전자들을 나타내며, PRC2-결합 RNA의 서열 식별자들은 유전자명과 같은 열에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 국제특허출원 공보 WO/2012/065143의 표 9 또는 표 2에 개시된 질병 카테고리와 같은 질병을 치료하는 방법에 사용하기 위해 제공된다. 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2는 PRC2-결합 RNA에 의해 표적이 된 유전자들을 나타내며; PRC2-결합 RNA의 서열 식별자는 유전자 명칭과 동일한 열에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 3 또는 표 2에 개시된 질병 카테고리와 같은 질병을 치료하는 방법에 사용하기 위해 제공된다. 치료방법은 PRC2-결합 RNA에 의해 표적이 된 유전자의 발현을 조절하는 단계, 바람직하게는 유전자 발현을 상향조절하는 단계를 포함할 수 있다. 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 비경구 투여를 위한 멸균 조성물로서 배합될 수 있다. 명세서 전체에 걸쳐 화합물들을 사용하는 것에 대한 참조가 질병 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물 또는 약제를 제조하는데 화합물을 사용하는 것을 고려한다고 이해된다. 따라서, 비제한예로서, 본 발명의 본 구현예는 질병 치료에 사용하기 위한 약제를 제조하는데 상기 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것을 포함하며, 상기 치료는 PRC2-결합 RNA에 의해 표적이 된 유전자의 발현을 상향조절하는 단계를 포함한다.
유전자 발현을 활성화하기 위해 후보물질 올리고뉴클레오타이드를 선택하는 방법
표적 유전자의 발현을 활성화하기 위해 후보물질 올리고뉴클레오타이드를 선택하기 위한 방법들이 제공된다. 목적하는 표적 유전자는 예를 들면, 국제특허출원 공보 WO/2012/065143의 표 9의 유전자일 수 있다. 목적하는 표적 유전자는 국제특허출원 공보 WO/2012/087983호의 표 3의 유전자일 수 있다. 목적하는 표적 유전자는 FXN, SMN1, SMN2, SMNP, UTRN, HBB, HBD, HBE1, HBG1, HBG2, Hbb-b1, Hbb-bh1, Hbb-y, HBB/HBD, ATP2A2, APOA1, Abca1, PTEN, BDNF, BDNF-AS1, ADIPOQ, MECP2 또는 FOXP3일 수 있다. 따라서, 후보물질 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NOS: 1-1212에 개시된 서열들로부터 선택된 서열과 상보적일 수 있다.
전형적으로, 상기 방법들은 표적 유전자와 기능적으로 관계된 PRC2-연관 영역, 예를 들면 표적 유전자로 PRC2를 구성하는 것을 용이하게 함으로써(예를 들면, cis-조절 방법으로) 표적 유전자의 발현을 조절하는 lncRNA의 PRC2-연관 영역을 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드들을 확인하는 것을 목적으로 하는 1개 이상의 단계들을 포함한다. 상기 올리고뉴클레오타이드들은 핵산의 PRC2-연관 영역(예를 들면, lncRNA)과 함께 혼성화할 수 있는 그들의 능력 때문에, 표적 유전자의 발현을 활성화하기 위한 후보물질일 것으로 기대된다. 일부 구현예에서, 상기 혼성화 반응은 PRC2와 핵산(예를 들면, lncRNA)와의 상호작용을 파괴하여, 결국 PRC2 및 그의 관련 동시-억제제(예를 들면, 크로마틴 리모델링 요소들)를 표적 유전자 정위로 구성하는 것을 파괴한다고 이해된다.
후보물질 올리고뉴클레오타이드를 선택하는 방법은 목적하는 표적 유전자를 둘러싸거나 주위에 있는 염색체 위치로 맵핑하는 PRC2-연관 영역(서열 A1 내지 A193,049, B1 내지 B916,209, 및 B916,626 내지 B934,931)을 선택하는 단계를 포함할 수 있다. PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 센스 가닥을 포함하는 염색체의 가닥으로 맵핑할 수 있으며, 이 경우 후보물질 올리고뉴클레오타이드는 표적 유전자의 센스 가닥에 대하여 상보적이다(즉, 표적 유전자에 대한 안티센스이다). 선택적으로 PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 안티센스 가닥을 포함하는 제1 염색체의 가닥으로 맵핑할 수 있으며, 이 경우 올리고뉴클레오타이드는 표적 유전자의 안티센스 가닥(주형 가닥)에 대하여 상보적이다(즉, 표적 유전자에 대하여 센스이다).
표적 유전자의 발현을 활성화하는 올리고뉴클레오타이드에 풍부한 후보물질 올리고뉴클레오타이드 세트를 선택하는 방법은 표적 유전자를 둘러싸거나 주변에 있는 염색체 위치로 맵핑하는 1개 이상의 PRC2-연관 영역들을 선택하는 단계, 및 세트내 각 올리고뉴클레오타이드가 1개 이상의 PRC2-연관 영역들과 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드들 세트를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 구절 “표적 유전자의 발현을 활성화하는 올리고뉴클레오타이드들이 풍부한 올리고뉴클레오타이드 세트”는 강화된 세트로서 같은 물리화학적 특성들(예를 들면, 같은 GC 함량, Tm, 길이 등)의 올리고뉴클레오타이드들의 무작위 선택과 비교되는 표적 유전자의 발현을 활성화하는 매우 많은 올리고뉴클레오타이드들을 갖는 올리고뉴클레오타이드 세트를 지칭한다.
PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 5’말단의 50 킬로베이스 상류와 표적 유전자의 3’말단의 50 킬로베이스 하류 간의 염색체 위치에 대해 맵핑할 수 있다. PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 5’말단의 25 킬로베이스 상류와 표적 유전자의 3’말단의 25 킬로베이스 하류 간의 염색체 위치에 대해 맵핑할 수 있다. PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 5’말단의 12 킬로베이스 상류와 표적 유전자의 3’말단의 12 킬로베이스 하류 간의 염색체 위치에 대해 맵핑할 수 있다. PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 5’말단의 5 킬로베이스 상류와 표적 유전자의 3’말단의 5 킬로베이스 하류 간의 염색체 위치에 대해 맵핑할 수 있다.
표적 유전자에 대한, 선별되는 PRC2-연관 영역의 게놈 위치는 다양할 수 있다. 예를 들어, PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 5’말단 상류일 수 있다. PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 3’말단 하류일 수 있다. PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 인트론 내에 존재할 수 있다. PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 엑손 내에 존재할 수 있다. PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 인트론-엑손 접합부, 5’-UTR-엑손 접합부 또는 3’-UTR-엑손 접합부를 횡단할 수 있다.
후보물질 올리고뉴클레오타이드 선택 방법들은 일반적으로, 또한 PRC2-연관 영역과 상보적인 적당한 뉴클레오타이드 서열을 결정 또는 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 PRC2-연관 영역의 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 15개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적일 수 있다.
후보물질 올리고뉴클레오타이드는 식 X-Y-Z(여기에서, X는 특정의 뉴클레오타이드이며, Y는 마이크로RNA의 인간 시드 서열이 아닌 길이의 6개 뉴클레오타이드들의 뉴클레오타이드 서열이며, 및 Z는 길이가 다양한 뉴클레오타이드 서열임)를 갖는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, X는 올리고뉴클레오타이드의 5’ 말단에서 앵커링된다. 일부 구현예에서, X가 올리고뉴클레오타이드의 5’말단에 앵커링되는 경우, 올리고뉴클레오타이드는 X에 대하여 5’연결된 임의의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체를 가지지 않는다. 일부 구현예에서, 펩타이드 또는 스테롤과 같은 다른 화합물들은 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체가 아닌 한, 이 구현예에서 5’말단에 연결될 수 있다. 상기 서열 특성들을 갖는 후보물질 올리고뉴클레오타이드는 miRNA 경로를 피할 것으로 예상된다. 그러므로, 일부 구현예에서, 상기 서열 특성들을 갖는 올리고뉴클레오타이드들은 miRNA 분자로서 세포내에서 기능하는 의도치않은 결과를 가질 것 같지 않다. Y 서열은 표 3에 개시된 길이의 6개 뉴클레오타이드들의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
후보물질 올리고뉴클레오타이드는 구아노신 뉴클레오타이드 스트레치(stretch)(예를 들어, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상의 연속 구아노신 뉴클레오타이드)를 포함하지 않는 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 구아노신 뉴클레오타이드 스트레치를 가진 올리고뉴클레오타이드는 구아노신 뉴클레오타이드 스트레치를 가지지 않는 올리고뉴클레오타이드와 비교해, 증가된 비-특이적 결합 및/또는 오프-표적 효과를 가진다.
후보물질 올리고뉴클레오타이드는 오프-표적 유전자를 포함하거나 또는 이에 근접한 게놈 위치를 맵핑하며, 길이가 동일하고, 뉴클레오타이드의 모든 서열과의 서열 상동성은 역치 수준보다 낮은 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 후보물질 올리고뉴클레오타이드는 표적 유전자 이외의 모든 공지된 유전자(예를 들면, 모든 공지된 단백질 코딩 유전자)를 포함하거나 또는 이와 근접한 게놈 위치를 맵핑하는 서열을 가지지 않도록 설계될 수 있다. 유사한 구현예에서, 후보물질 올리고뉴클레오타이드는, 임의의 다른 공지된 PRC2-연관 영역, 특히 임의의 다른 공지된 유전자(예를 들어, 임의의 기타 공지된 단백질 코딩 유전자)와 기능적으로 관련된 PRC2-연관 영역으로 맵핑하는 서열(예를 들면, 서열 A1 내지 A193,049, B1 내지 B916,209 및 B916,626 내지 B934,931에 개시된 뉴클레오타이드 서열)을 가지지 않도록 설계될 수 있다. 어느 경우든지, 후보물질 올리고뉴클레오타이드는 오프-표적 효과를 가지는 경향이 감소하는 것으로 예상된다. 서열 상동성의 역치 수준은 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 상동성일 수 있다.
후보물질 올리고뉴클레오타이드는 2개 이상의 단일 가닥 루프를 포함하는 2차 구조를 형성하는 RNA를 코딩하는 PRC2-연관 영역에 상보적인 서열을 가지도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단일 가닥 루프(예를 들어, 2개 이상의 단일 가닥 루프들)를 포함하는 2차 구조를 형성하는 RNA를 코딩하는 PRC2-연관 영역에 상보적인 올리고뉴클레오타이드는 랜덤 선별된 올리고뉴클레오타이드보다 활성이 큰 가능성이 높다는 것을 발견하였다. 일부 경우, 2차 구조는 2개 이상의 단일 가닥 루프들 사이에 이중 가닥 스템(stem)을 포함할 수 있다. 따라서, 선택방법은 올리고뉴클레오타이드와 PRC2-연관 영역 간의 상보성 영역이 루프들 중 하나 이상의 적어도 일부를 코딩하는 PRC2-연관 영역의 위치에 존재하도록 올리고뉴클레오타이드에 대한 서열을 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우, 올리고뉴클레오타이드와 PRC2-연관 영역 간의 상보성 영역이 루프들 중 2개 이상의 적어도 일부를 코딩하는 PRC2-연관 영역의 위치에 존재하도록 올리고뉴클레오타이드에 대한 서열을 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우, 선택 방법은 올리고뉴클레오타이드와 PRC2-연관 영역 간의 상보성 영역이 이중 가닥 스템의 적어도 일부를 코딩하는 PRC2-연관 영역의 위치에 존재하도록 올리고뉴클레오타이드에 대한 서열을 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PRC2-연관 영역(예를 들면 lncRNA의 영역)이(예를 들면, RIP-Seq 방법론 또는 그로부터 얻은 정보를 사용하여) 확인된다. 일부 구현예에서, PRC2-연관 영역을 함유하는 예상된 2차 구조 RNA(예를 들면, lncRNA)는 RNA 2차 구조 예측 알고리즘, 예를 들면 RNAfold, mfold를 이용해 결정된다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는, 2개 이상의 단일 가닥 루프들 사이에 이중 가닥 스템을 포함할 수 있는 하나 이상의 단일 가닥 루프(예를 들면, 2개 이상의 단일 가닥 루프) 구조를 포함하는 2차 구조를 형성하는 RNA 영역을 표적으로 하도록 설계된다.
후보물질 올리고뉴클레오타이드는 30% 초과 G-C 함량, 40% 초과 G-C 함량, 50% 초과 G-C 함량, 60% 초과 G-C 함량, 70% 초과 G-C 함량, 또는 80% 초과 G-C 함량을 갖는 서열을 가지도록 선택될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 길이가 8개 내지 10개 뉴클레오타이드인 일부 구현예에서, PRC2-연관 영역의 상보적 서열의 뉴클레오타이드 중 1, 2, 3, 4 또는 5개를 제외하고는 모두 시토신 또는 구아노신 뉴클레오타이드가다.
후보물질 올리고뉴클레오타이드 선택방법들은 여러 가지 종(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 원숭이 등)의 표적 유전자의 호모로그를 포함하거나 또는 이에 근접한 위치에서 해당 종의 염색체에 대하여 후보물질 올리고뉴클레오타이드가 상보적인지 측정하는 단계를 포함할 수도 있다. 이 단계는 복수의 종(예를 들어, 인간 및 마우스)에서 생체내 또는 시험관내 효능이 시험될 수 있는 올리고뉴클레오타이드들의 설계를 가능하게 한다. 또한, 이러한 방법을 통해, 질환에 대해 적절한 동물이 존재하는 종을 선별함으로써, 인간의 질환을 치료하는 임상적 후보물질의 개발이 용이해진다. 후보물질 올리고뉴클레오타이드는 동물 모델에서 손쉽게 시험될 수 있다.
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 설계 및/또는 합성이 상기 서열정보에 의해 설명된 핵산 또는 PRC2-연관 영역에 대하여 상보적인 서열의 설계 및/또는 합성을 포함하는 경우, 당 분야에 통상의 기술을 가진 자는 이 분야에서 통상적인 일반적인 지식의 일부를 이루는 왓슨 크릭 염기쌍 법칙을 이해함으로써, 상보서열을 쉽게 측정할 수 있다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 설계 및/또는 합성은 당 분야에 통상이 기술을 가진 자들에게 공지된 기술들에 의해 개시물질들로부터 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 단계를 포함하며, 상기 합성은 PRC2-연관 영역의 서열, 또는 그의 일부에 기초할 수 있다.
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 설계 및/또는 합성 방법은:
PRC2-연관 영역을 확인 및/또는 선택하는 단계;
원하는 정도의 서열상동성 또는 PRC2-연관 영역에 대한 상보성 또는 그의 일부를 갖는 핵산서열을 설계하는 단계;
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 설계된 서열로 합성하는 단계;
합성된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 정제하는 단계; 및
상기 합성된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 운반체 또는 부형제와 선택적으로 혼합하여, 약제학적 조성물 또는 약제를 제조하는 단계
중 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다.
상기와 같이 설계 및/또는 합성된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 본 명세서에 설명된 바와 같이 유전자발현을 조절하는 방법에 사용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 화학적으로 합성된다. 본 발명을 실시하는데 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 잘-알려진 화학합성 기술들에 의해 시험관내 합성될 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 변형과 같은 변형을 도입함으로써 뉴클레오타이드 분해에 대하여 안정화될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 핵산서열은 뉴클레오타이드 서열의 5’ 또는 3’말단에서 적어도 제1, 제2 또는 제3 뉴클레오타이드간 결합의 포스포로티오에이트를 포함한다. 다른 예로서, 핵산서열은 2'-변형된 뉴클레오타이드, 예를 들면, 2'-데옥시, 2'-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸 (2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O--N-메틸아세트아미도 (2'-O--NMA)를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 핵산서열은 1개 이상의 2'-O-메틸-변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 및 일부 구현예에서, 모든 뉴클레오타이드들은 2'-O-메틸 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 “잠겨 있으며” 즉2’-O 원자 및 4’-C 원자를 연결하는 메틸렌 가교에 의해 리보스 고리가 “잠겨있는” 핵산 유사체들을 포함한다.
본 명세서에 설명된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 변형된 화학적 성질들 또는 구성들 중 어느 하나는 서로 조합될 수 있으며, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 다른 변형타입들이 동일한 분자내에 포함될 수 있음을 이해한다.
일부 구현예에서, 이 방법은 합성된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 증폭시키는 단계, 및/또는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드(또는 증폭된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드)를 정제하는 단계, 및/또는 이렇게 얻어진 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기와 같이, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 방법은 선택적으로 치료방법이 PRC2-연관 영역과 관련된 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 질병의 치료방법에 사용하기 위한 약제학적 조성물 또는 약제를 제조하는데 사용하기 위한 방법일 수 있다.
상기 방법에서, PRC2-연관 영역은 PRC2에 결합하는 RNA를 확인하는 단계를 포함하는 방법에 의해 확인되거나 얻어질 수 있거나, 확인되거나 얻어져왔다.
상기 방법들은 핵 리보핵산을 함유하는 샘플을 제공하는 단계, 이 샘플을PRC2 또는 그의 서브유닛에 특이적으로 결합하는 제제와 접촉시켜서, 샘플내 제제와 단백질 사이에 복합체를 형성시키는 단계, 상기 복합체들을 분할하는 단계, 복합체내에 존재하는 핵산에 대하여 상보적인 핵산을 합성하는 단계를 포함할 수 있다.
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 PRC2-연관 영역에 기초한 경우, 상기 서열의 일부인 경우, 서면 또는 전자양식으로 사용가능한 서열정보와 같은 서열에 대한 정보에 기초할 수 있으며, 이는 공개사용가능한 과학 공보들 또는 서열 데이터베이스에 포함된 서열정보를 포함할 수 있다.
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드
본 발명의 한 측면에서, PRC2-연관 영역에 대하여 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 세포내 표적 유전자의 발현을 조절하기 위해 제공된다. 일부 구현예에서, 표적 유전자들의 발현은 상향조절되거나 증가된다. 일부 구현예에서, 상기 PRC2-연관 영역에 대하여 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 PRC2가 긴 RnA 전사체들와 상호작용하는 것을 저해하여, 히스톤 H3의 메틸화가 감소되고, 유전자 불활성화가 감소되어, 상기 유전자 발현이 상향조절 또는 증가된다. 일부 구현예에서, PRC2에 대한 결합을 방해 또는 감소시키는 긴 RNA의 구조 변경으로 인해 이러한 상호작용이 방해 또는 억제될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 표적 유전자의 발현을 활성화하기 위한 후보물질 올리고뉴클레오타이드를 선택하기 위해 본 명세서에 개시된 방법들 중 어느 하나를 사용하여 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 상보성 영역은 PRC2-연관 영역의 적어도 8개 내지 15개, 8개 내지 30개, 8개 내지 40개, 또는 10개 내지 50개, 또는 5개 내지 50개, 또는 5개 내지 40개의 염기, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 연속 뉴클레오타이드와 상보적이다. 일부 구현예에서, 상보성 영역은 PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드와 상보적이다. 일부 구현예에서, 상보성 영역은 PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드와 상보적이다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 서열은 PRC2에 결합하는 RNA 서열 또는 이의 일부를 토대로 하며, 상기 일부는 길이가 5개 내지 40개 연속 염기쌍, 약 8개 내지 40개 염기, 약 5개 내지 15개, 약 5개 내지 30개, 약 5개 내지 40개 염기, 또는 약 5개 내지 50개 염기이다.
본 명세서에 개시된 올리고뉴클레오타이드들은 제거가능한 링커에 의해 본 발명의 1개 이상의 다른 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다.
상보성이라는 용어는 당해 기술분야에 사용되는 바처럼, 2개의 뉴클레오타이드들 사이에서 페어링(pairing)이 정확하게 이루어지는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 특정 위치에 존재하는 뉴클레오타이드가 PRC2-연관 영역의 동일한 위치에 존재하는 뉴클레오타이드와 수소 결합할 수 있는 경우, 단일 가닥 뉴클레오타이드 및 PRC2-연관 영역은 그 위치에서 서로 상보성인 것으로 간주된다. 단일 가닥 뉴클레오타이드 및 PRC2-연관 영역은, 각 분자에서 충분한 수의 상응하는 위치가 이들의 염기를 통해 서로 수소 결합할 수 있는 뉴클레오타이드에 의해 점유(occupied)되는 경우, 서로 상보적이다. 따라서, "상보성"은, 단일 가닥 뉴클레오타이드와 PRC2-연관 영역 간에 안정하면서 특이적인 결합이 발생하기에 충분한 정도의 상보성 또는 정확한 페어링을 의미하는 데 사용되는 용어이다. 예를 들어, 단일 가닥 뉴클레오타이드의 하나의 위치에 존재하는 염기가 PRC2-연관 영역의 상응하는 위치에 존재하는 염기와 수소 결합을 할 수 있는 경우, 염기는 해당 위치에서 서로 상보적인 것으로 간주된다. 100% 상보성은 요구되지 않는다.
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 PRC2-연관 영역의 연속 뉴클레오타이드와 80% 이상 상보적 (선택적으로 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 상보적)일 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 PRC2-연관 영역의 연속 뉴클레오타이드의 부분과 비교해 1, 2 또는 3개의 염기 미스매치를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 15개 염기 당 3개 이하의 미스매치, 또는 10개 염기 당 2개 이하의 미스매치를 가질 수 있다.
당해 기술분야에서는, 상보성 뉴클레오타이드 서열은, 특이적으로 혼성화되는 이의 표적의 서열과 100% 상보적일 필요가 없는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 본 발명을 위한 상보성 핵산 서열은, 상기 서열이 표적 분자(예를 들어, lncRNA)에 결합되어 표적(예를 들어, lncRNA)의 정상적인 기능을 방해하여 활성 손실을 야기하며(예를 들어, 유전자 발현의 결과적인 상향조절과 더불어 PRC2-연관 억제를 저해), 비-특이적 결합을 피하는 것이 바람직한 조건 하에, 예를 들어, 생체 내 분석법 또는 치료적 치료의 경우 생리학적 조건하에, 그리고 시험관 내 분석법의 경우 분석법이 적절한 엄격성 조건 하에 수행되는 조건 하에, 서열이 비-표적 서열에 비-특이적으로 결합하는 것을 피하기 위해 충분한 정도의 상보성이 존재하는 경우, 특이적으로 혼성화한다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 길이가 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드이다. 바람직한 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 길이가 8개 내지 30개 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, PRC2-연관 영역은 유전자 서열과 동일한 DNA 가닥에 발생한다 (센스). 일부 구현예에서, PRC2-연관 영역과 반대편 DNA 가닥에 발생한다 (안티센스). PRC2-연관 영역에 상보적인 올리고뉴클레오타이드는 센스 서열 또는 안티센스 서열에 결합할 수 있다. 염기 페어링은 표준(canonical) 왓슨-크릭 염기 페어링(Watson-Crick base pairing) 및 비-왓슨-크릭 염기 페어링(예를 들어, 워블 염기 페어링(Wobble base pairing) 및 후그스틴 염기 페어링(Hoogsteen base pairing))을 둘 다 포함할 수 있다. 상보성 염기 페어링의 경우, 아데노신 염기 (A)은 티미딘형 염기 (T) 또는 우라실형 염기 (U)와 상보적이고 시토신형 염기 (C)는 구아노신형 염기 (G)와 상보적이며, 3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌과 같은 유니버셜(universal) 염기는 임의의 A, C, U, 또는 T에 상보적인 것으로 간주되는 것으로 이해된다. 이노신 (I)은 또한 당해 기술분야에서 유니버셜 염기인 것으로 간주되고 있으며, 임의의 A, C, U 또는 T에 상보적인 것으로 간주된다.
일부 구현예에서, 서열 목록에 제공되는 서열을 비롯하여 본원에 제공되는 서열에서 임의의 하나 이상의 티미딘 (T) 뉴클레오타이드 (또는 이의 변형된 뉴클레오타이드) 또는 우리딘 (U) 뉴클레오타이드 (또는 이의 변형된 뉴클레오타이드)는 아데노신 뉴클레오타이드와의(예를 들어, 왓슨-크릭 염기쌍을 통한) 염기 페어링에 적절한 임의의 다른 뉴클레오타이드로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 서열 목록에 제공되는 서열을 비롯하여 본원에 제공되는 서열에서 임의의 하나 이상의 티미딘 (T) 뉴클레오타이드 (또는 이의 변형된 뉴클레오타이드) 또는 우리딘 (U) 뉴클레오타이드 (또는 이의 변형된 뉴클레오타이드)는 상이한 피리미딘 뉴클레오타이드로 적절하게 대체될 수 있거나 또는 그 반대일 수 있다. 일부 구현예에서, 서열 목록에 제공되는 서열을 비롯하여 본원에 제공되는 서열에서 임의의 하나 이상의 티미딘 (T) 뉴클레오타이드 (또는 이의 변형된 뉴클레오타이드)은 우리딘 (U) 뉴클레오타이드 (또는 이의 변형된 뉴클레오타이드)로 적절하게 대체될 수 있거나 또는 그 반대일 수 있다. 이노신 (I)은 또한 당해 기술분야에서 유니버셜 염기인 것으로 간주되고 있으며, 임의의 A, C, U 또는 T에 상보적인 것으로 간주된다.
이노신 (I)은 또한 당해 기술분야에서 유니버셜 염기인 것으로 간주되고 있으며, 임의의 A, C, U 또는 T에 상보적인 것으로 간주된다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 GC 함량은 바람직하게는 약 30-60%이다. 3개 이상의 G 또는 C의 연속 진행(run)은 일부 구현예에서 바람직하지 않을 수 있다. 즉, 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 3개 이상의 구아노신 뉴클레오타이드의 스트레치를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 게놈(예를 들어, 인간 게놈)에서 단일 연속성 전사체(예를 들어, 비-스플라이싱된 RNA)로서 코딩되는 RNA에 특이적으로 결합하거나 또는 상보적이다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 게놈(예를 들어, 인간 게놈)에서 코딩되는 RNA에 특이적으로 결합하거나 또는 상보적이며, RNA의 코딩 영역의 5' 말단과 RNA의 코딩 영역의 3' 말단 사이의 게놈 거리는 1 kb 미만, 2 kb 미만, 3 kb 미만, 4 kb 미만, 5 kb 미만, 7 kb 미만, 8 kb 미만, 9 kb 미만, 10 kb, 또는 20 kb 미만이다.
본 명세서에 제공된 올리고뉴클레오타이드는 배제될 수 있음을 이해한다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NOs: 1213 내지 1226 중 하나 이상에 대하여 상보적이지 않다.
뉴클레오타이드 유사체들
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 리보뉴클레오타이드, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드, 및/또는 하나 이상의 가교 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 LNA 뉴클레오타이드, cEt 뉴클레오타이드, 또는 ENA 뉴클레오타이드 유사체와 같은 가교 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드의 예는 본원에 개시되어 있으며 당해 기술분야에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 하기의 미국 특허 또는 특허 출원 공개: US 7,399,845, US 7,741,457, US 8,022,193, US 7,569,686, US 7,335,765, US 7,314,923, US 7,335,765, 및 US 7,816,333, US 20110009471 중 하나에 개시된 뉴클레오타이드 유사체를 포함하며, 각 문헌의 전체 내용은 모든 목적을 위해 원용에 의해 본 명세서에 포함되어 있다. 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 2'-O-메틸 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 완전히 2'-O-메틸 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다.
종종 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체를 가진다. 예를 들어, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체를 가질 수 있으며, 이로써 하나 이상의 뉴클레오타이드 유사체를 가지지 않는 올리고뉴클레오타이드와 비교해, 올리고뉴클레오타이드의 Tm을 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 또는 5℃ 증가시킨다. 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 복수 개의 뉴클레오타이드 유사체를 가질 수 있으며, 이로써 뉴클레오타이드 유사체를 가지지 않는 올리고뉴클레오타이드와 비교해, 올리고뉴클레오타이드의 Tm을 전체적으로 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃ 또는 그 이상 증가시킨다.
올리고뉴클레오타이드는, 올리고뉴클레오타이드 중 2 내지 10, 2 내지 15, 2 내지 16, 2 내지 17, 2 내지 18, 2 내지 19, 2 내지 20, 2 내지 25, 2 내지 30, 2 내지 40, 2 내지 45개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 유사체인, 길이 50개 이하의 뉴클레오타이드일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는, 올리고뉴클레오타이드 중 2 내지 10, 2 내지 15, 2 내지 16, 2 내지 17, 2 내지 18, 2 내지 19, 2 내지 20, 2 내지 25, 2 내지 30개의 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 유사체인, 길이 8개 내지 30개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는, 올리고뉴클레오타이드 중 2 내지 4, 2 내지 5, 2 내지 6, 2 내지 7, 2 내지 8, 2 내지 9, 2 내지 10, 2 내지 11, 2 내지 12, 2 내지 14개의 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 유사체인, 길이 8개 내지 15개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 선택적으로, 올리고뉴클레오타이드는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오타이드가 변형된 것을 제외하고는, 모든 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 완전히 가교 뉴클레오타이드(예를 들어, LNA 뉴클레오타이드, cEt 뉴클레오타이드, ENA 뉴클레오타이드)로 이루어질 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 교대 데옥시리보뉴클레오타이드 및 2'-플루오로-데옥시리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 교대 데옥시리보뉴클레오타이드 및 2'-O-메틸 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 교대 데옥시리보뉴클레오타이드 및 ENA 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 교대 데옥시리보뉴클레오타이드 및 LNA 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 교대 LNA 뉴클레오타이드 및 2'-O-메틸 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 가교 뉴클레오타이드(예를 들어, LNA 뉴클레오타이드, cEt 뉴클레오타이드, ENA 뉴클레오타이드)인 5' 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드인 5' 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는, 데옥시리보뉴클레오타이드의 5' 및 3' 말단의 각각에서 하나 이상의 가교 뉴클레오타이드(예를 들어, LNA 뉴클레오타이드, cEt 뉴클레오타이드, ENA 뉴클레오타이드)에 의해 플랭킹된 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는, 데옥시리보뉴클레오타이드의 5' 및 3' 말단의 각각에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상의 가교 뉴클레오타이드(예를 들어, LNA 뉴클레오타이드, cEt 뉴클레오타이드, ENA 뉴클레오타이드)에 의해 플랭킹된 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 3' 위치는 3' 하이드록실기를 가질 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 3' 위치는 3' 티오포스페이트를 가질 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 표지(label)와 공액될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 이의 5' 말단 또는 3' 말단에서 비오틴 모이어티, 콜레스테롤, 비타민 A, 폴레이트, 시그마 수용체 리간드, 앱타머, 펩타이드, 예컨대 CPP, 소수성 분자, 예컨대 지질, ASGPR 또는 동적 폴리컨쥬게이트 및 이의 변이체와 공액될 수 있다.
바람직하게는, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는, 변형된 당 모이어티, 및/또는 변형된 인터뉴클레오사이드 연결부, 및/또는 변형된 뉴클레오타이드 및/또는 이들의 조합을 포함하는 하나 이상의 변형을 포함한다. 주어진 올리고뉴클레오타이드에서 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없으며, 사실상 본원에 기술되는 변형들 중 둘 이상은 단일 올리고뉴클레오타이드에 혼입될 수 있거나 또는 심지어 올리고뉴클레오타이드 내의 단일 뉴클레오사이드 내에 혼입될 수 있다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는, 각각이 하나 이상의 뉴클레오타이드로 이루어진, 2개 이상의 화학적으로 분리된 영역을 포함하는 키메라 올리고뉴클레오타이드이다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로, 1가지 이상의 유리한 특성(예를 들어, 뉴클레아제 내성 증가, 세포로의 취득 증가, 표적에 대한 결합 친화성 증가)을 부여하는 변형된 뉴클레오타이드의 하나 이상의 영역, 및 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질인 영역을 포함한다. 본 발명의 키메라 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 전술한 바와 같이 2종 이상의 올리고뉴클레오타이드, 변형된 올리고뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오사이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드 미메틱(mimetic)의 복합 구조로서 형성될 수 있다. 이러한 화합물은 또한 당해 기술분야에서 하이브리드 또는 갭머(gapmer)로 지칭되기도 한다. 이러한 하이브리드 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는, 미국 특허 5,013,830; 5,149,797; 5, 220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; 및 5,700,922를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니며, 이들 각각은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는, 당의 2' 위치에서 변형된 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 2'-O-알킬, 2'-O-알킬-O-알킬 또는 2'-플루오로-변형된 뉴클레오타이드를 하나 이상 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, RNA 변형은 피리미딘의 리보스에 2'-플루오로, 2'-아미노 및 2' O-메틸 변형, 및 RNA의 3' 말단에 무염기성(abasic) 잔기 또는 인버티드 염기(inverted base)를 포함한다. 이러한 변형은 올리고뉴클레오타이드에 일상적으로 혼입되며, 이들 올리고뉴클레오타이드는 주어진 표적에 대해 2'-데옥시올리고뉴클레오타이드보다 높은 Tm (즉, 보다 높은 표적 결합 친화성)을 가지는 것으로 확인된 바 있다.
다수의 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 변형은, 이들이 혼입되는 올리고뉴클레오타이드를 천연(native) 올리고데옥시뉴클레오타이드보다 뉴클레아제 분해에 대한 내성을 더 크게 만드는 것으로 확인되었으며; 이들 변형된 올리고는 비변형된 올리고뉴클레오타이드보다 장기간 동안 본래대로 생존한다. 변형된 올리고뉴클레오타이드의 구체적인 예로는, 변형된 백본, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 인터슈거(intersugar) 연결부 또는 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 인터슈거 연결부를 포함하는 것들을 포함한다. 포스포로티오에이트 백본을 가진 올리고뉴클레오타이드, 및 헤테로원자 백본, 특히 CH2 -NH-O-CH2, CH,~N(CH3)~O~CH2 (메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 백본], CH2--O--N (CH3)-CH2, CH2-N (CH3)-N (CH3)-CH2 및 O-N (CH3)- CH2-CH2 백본, 여기서, 천연 포스포다이에스테르 백본은 O- P-- O- CH로 표시됨); 아미드 백본 (De Mesmaeker et al. Ace. Chem. Res. 1995, 28:366-374 참조); 모르폴리노 백본 구조 (Summerton and Weller, U.S. Pat. No. 5,034,506 참조); 펩타이드 핵산 (PNA) 백본 (여기서, 올리고뉴클레오타이드의 포스포다이에스테르 백본은 폴리아미드 백본으로 대체되며, 뉴클레오타이드는 폴리아미드 백본의 아자 질소 원자에 직간접적으로 결합되며, Nielsen et al., Science 1991, 254, 1497를 참조함)을 가진 올리고뉴클레오타이드가 가장 바람직하다. 인-함유 연결부로는, 포스포로티오에이트, 키랄(chiral) 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트를 포함하는 포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 연결부 및 2'-5' 연결된 이들의 유사체를 가진 보라노포스페이트, 및 인버티드 극성을 가진 것들을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니며, 여기서, 뉴클레오사이드 단위의 인접한 쌍들은 3'-5' 내지 5'-3' 또는 2'-5' 내지 5'-2' 연결되며; 미국 특허 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5, 177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455, 233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563, 253; 5,571,799; 5,587,361; 및5,625,050을 참조한다.
모르폴리노계 올리고머 화합물은 Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510); Genesis, volume 30, issue 3, 2001; Heasman, J., Dev. Biol., 2002, 243, 209-214; Nasevicius et al., Nat. Genet., 2000, 26, 216-220; Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 9591-9596; 및 1991년 7월 23일에 발행된 미국 특허 5,034,506에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 모르폴리노계 올리고머 화합물은 포스포로다이아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)이다(예를 들어, Iverson, Curr. Opin. Mol. Ther., 3:235-238, 2001; 및 Wang et al., J. Gene Med., 12:354-364, 2010 참조; 이의 개시내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
사이클로헥세닐 핵산 올리고뉴클레오타이드 미메틱은 Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602에 기술되어 있다.
인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오타이드 백본은, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 인터뉴클레오사이드 연결부, 혼합형 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 인터뉴클레오사이드 연결부, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 인터뉴클레오사이드 연결부에 의해 형성되는 백본을 가진다. 이들은 모르폴리노 연결부 (뉴클레오사이드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실록산 백본; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 알켄-함유 백본; 술파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 백본; 술포네이트 및 술폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 혼합형 N, O, S 및 CH2 구성요소 부분을 가진 것들을 포함하며; 미국 특허 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; 및 5,677,439를 참조하며, 이들은 각각 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한, 아라비노뉴클레오타이드 또는 변형된 아라비노뉴클레오타이드 잔기를 토대로 하거나 또는 이로부터 제작되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 알려져 있다. 아라비노뉴클레오사이드는 리보뉴클레오사이드의 입체이성질체로서, 당 고리의 2' 위치에서의 배열이 차이날 뿐이다. 일부 구현예에서, 2'-아라비노 변형은 2'-F 아라비노이다. 일부 구현예에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 2'-플루오로-D-아라비노핵산 (FANA)이다(예를 들어, Lon et al., Biochem., 41:3457-3467, 2002 및 Min et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 12:2651-2654, 2002 참조; 이의 개시내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 유사한 변형은 또한, 3' 말단 뉴클레오사이드 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오타이드에서 당의 다른 위치, 특히 당의 3' 위치, 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다.
PCT 공개 WO 99/67378은 상보적인 메신저 RNA와 연관됨으로써 유전자 발현의 서열 특이적인 저해를 개선하기 위한 아라비노핵산 (ANA) 올리고머 및 이들의 유사체를 개시하고 있다.
다른 바람직한 변형은 에틸렌-가교 핵산 (ENA)을 포함한다(예를 들어, 국제 특허 공개. WO 2005/042777, Morita et al., Nucleic Acid Res., Suppl 1:241-242, 2001; Surono et al., Hum. Gene Ther., 15:749-757, 2004; Koizumi, Curr. Opin. Mol. Ther., 8:144-149, 2006 및 Horie et al., Nucleic Acids Symp. Ser (Oxf), 49:171-172, 2005 참조; 이의 개시내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 바람직한 ENA로는 2'-O,4'-C-에틸렌-가교 핵산을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
LNA의 예는 WO/2008/043753에 기술되어 있으며, 하기 일반식의 화합물을 포함한다.
Figure pct00001

식에서, X 및 Y는 독립적으로 -O-,
-S-, -N(H)-, N(R)-, -CH2- 또는 -CH- (이중 결합의 일부인 경우),
-CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-N(H)-, -CH2-N(R)-, -CH2-CH2- 또는 -CH2-CH- (이중 결합의 일부인 경우),
-CH=CH-로 이루어진 군으부터 선택되며, 여기서, R은 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택되며; Z 및 Z*는 독립적으로 인터뉴클레오사이드 연결부, 말단 기 또는 보호 기로부터 선택되며; B는 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드 염기 모이어티를 구성하며; 비대칭성 기는 어느 배향에서도 확인될 수 있다.
바람직하게는, 본원에 기술되는 올리고뉴클레오타이드에 사용되는 LNA는 하기 식들 중 임의의 식에 따른 LNA를 하나 이상 포함한다.
Figure pct00002
식에서, Y는 -O-, -S-, -NH-, 또는 N(RH)이며; Z 및 Z*는 독립적으로 인터뉴클레오사이드 연결부, 말단 기 또는 보호 기로부터 선택되며; B는 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드 염기 모이어티를 구성하며; RH는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머 화합물, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 사용된 라킹된 핵산(LNA)은 PCT/DK2006/000512의 화학식 2에 도시된 구조식들 중 어느 하나에 따른 라킹된 핵산(LNA) 유닛을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 올리고머에 사용되는 LNA는 -0-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -0-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -0-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(RH)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRH)-O-, -0-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRH)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -NRH-CO-O-로부터 선택되는 인터뉴클레오사이드 연결부를 포함하며, 여기서, RH는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택된다.
LNA 유닛들의 특정 예들은 도식 2에 도시되어 있다:
Figure pct00003
용어 "티오-LNA"는, 상기 일반식에서 X 또는 Y 중 하나 이상이 S 또는 -CH2-S-로부터 선택되는, 라킹된 뉴클레오타이드를 포함한다. 티오-LNA는 베타-D 배열 및 알파-L-배열 둘다에 존재할 수 있다.
용어 "아미노-LNA"는, 상기 일반식에서 X 또는 Y 중 하나 이상이 -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)-, 및 -CH2-N(R)-로부터 선택되며, 여기서, R은 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택되는, 라킹된 뉴클레오타이드를 포함한다. 아미노-LNA는 베타-D 배열 및 알파-L-배열 둘다에 존재할 수 있다.
용어 "옥시-LNA"는, 상기 일반식에서 X 또는 Y 중 하나 이상이 -O- 또는 -CH2-O-를 나타내는, 라킹된 뉴클레오타이드를 포함한다. 옥시-LNA는 베타-D 배열 및 알파-L-배열 둘다에 존재할 수 있다.
용어 "에나-LNA"는, 상기 일반식에서 Y가 -CH2-O- (여기서, -CH2-O-의 산소 원자는 염기 B에 대해 2'-위치에 부착됨)인, 라킹된 뉴클레오타이드를 포함한다.
LNA는 본원에 부가적으로 상세히 기술된다.
하나 이상의 치환된 당 모이어티가 또한 포함될 수 있는데, 예를 들어, 2' 위치에 하기들 중 하나 이상이 포함될 수 있다: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2 또는 O(CH2)n CH3 (여기서, n은 1 내지 약 10임); C1 내지 C10 저급 알킬, 알콕시알콕시, 치환된 저급 알킬, 알카릴 또는 아랄킬; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; 헤테로사이클로알킬; 헤테로사이클로알카릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실릴; RNA 절단 기; 리포터 기; 인터칼레이터(intercalator); 올리고뉴클레오타이드의 약동학적 특성을 개선하는 기; 또는 올리고뉴클레오타이드의 약력학적 특성을 개선하는 기 및 유사한 특성을 가진 기타 치환기. 예시적인 변형은 2'-메톡시에톡시 [2'-0-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸)로도 알려져 있음]을 포함한다 (Martin et al, HeIv. Chim. Acta, 1995, 78, 486). 다른 바람직한 변형은 2'-메톡시 (2'-0-CH3), 2'-프로폭시 (2'-OCH2 CH2CH3) 및 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 유사한 변형은 또한, 올리고뉴클레오타이드의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오타이드의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 이루어질 수도 있다. 올리고뉴클레오타이드는 펜토푸라노실기 대신에 사이클로부틸과 같은 당 미메틱을 가질 수도 있다.
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 또한, 부가적으로 또는 다른 예로, 뉴클레오베이스 (종종 당해 기술분야에서 간단히 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환기를 포함할 수 있다. 본원에서, "비변형된" 또는 "천연" 뉴클레오베이스는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오베이스는 천연 핵산에서 단지 드물게 또는 일시적으로 확인되는 뉴클레오베이스, 예를 들어, 하이폭산틴, 6-메틸아데닌, 5-Me 피리미딘, 특히 5-메틸시토신 (5-메틸-2' 데옥시시토신으로 지칭되며 종종 당해 기술분야에서 5-Me-C로 지칭됨), 5-하이드록시메틸시토신 (HMC), 글리코실 HMC 및 겐토비오실(gentobiosyl) HMC, 이소시토신, 슈도이소시토신, 뿐만 아니라 합성 뉴클레오베이스, 예를 들어, 2-아미노아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(이미다졸릴알킬)아데닌, 2-(아미노알킬아미노)아데닌 또는 기타 헤테로치환된 알킬아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 5-프로피닐우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 2-클로로-6-아미노퓨린 및 2,6-다이아미노퓨린 또는 기타 다이아미노퓨린을 포함한다. 예를 들어, Kornberg, "DNA Replication," W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, pp75-77; 및 Gebeyehu, G., et al. Nucl. Acids Res., 15:4513 (1987)을 참조한다. 당해 기술분야에 공지된 "유니버셜" 염기, 예를 들어, 이노신이 또한 포함될 수 있다. 5-Me-C 치환기는 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6-1.2℃ 증가시키는 것으로 확인된 바 있으며 (Sanghvi, in Crooke, and Lebleu, eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 염기 치환기로서 사용될 수 있다.
주어진 올리고뉴클레오타이드에서 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없으며, 사실상 본원에 기술되는 변형들 중 둘 이상은 단일 올리고뉴클레오타이드에 혼입될 수 있거나 또는 심지어 올리고뉴클레오타이드 내의 단일 뉴클레오사이드 내에 혼입될 수 있다.
일부 구현예에서, 당 및 인터뉴클레오사이드 연결부, 즉, 뉴클레오타이드 단위의 백본은 둘 다 새로운 기로 대체된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과 혼성화되도록 유지된다. 이러한 1종의 올리고머 화합물, 우수한 혼성화 특성을 가지는 것으로 확인된 올리고뉴클레오타이드 미메틱은 펩타이드 핵산 (PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오타이드의 당-백본은 아미드-함유 백본, 예를 들어, 아미노에틸글리신 백본으로 대체된다. 뉴클레오베이스는 유지되며, 백본의 아미드 부분의 아지 질소 원소에 직간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는, 미국 특허 5,539,082; 5,714,331; 및 5,719,262를 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니며, 이들은 각각 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. PNA 화합물에 대한 추가적인 교시는 Nielsen et al, Science, 1991, 254, 1497-1500에서 확인할 수 있다.
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 또한, 하나 이상의 뉴클레오베이스 (종종 당해 기술분야에서 간단히 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환기를 포함할 수 있다. 본원에서, "비변형된" 또는 "천연" 뉴클레오베이스는 퓨린 염기인 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 피리미딘 염기인 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오베이스는 기타 합성 및 천연 뉴클레오베이스, 예를 들어, 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 산틴, 하이폭산틴, 6-메틸아데닌, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도-우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8- 티오알킬, 8-하이드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5- 브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸쿠아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다.
추가적으로, 뉴클레오베이스는, 미국 특허 3,687,808에 개시된 것들, "The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering" pages 858-859, Kroschwitz, ed. John Wiley & Sons, 1990에 개시된 것들; Englisch et al., Angewandle Chemie, International Edition, 1991, 30, page 613에 개시된 것들, 및 Sanghvi, Chapter 15, Antisense Research and Applications," pages 289-302, Crooke, and Lebleu, eds., CRC Press, 1993에 개시된 것들을 포함한다. 이들 뉴클레오베이스 중 특정한 것들은 특히 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화성을 증가시키는 데 유용하다. 이들로는, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5- 프로피닐시토신을 포함하는, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6-1.2℃ 증가시키는 것으로 확인된 바 있으며 (Sanghvi, et al., eds, "Antisense Research and Applications," CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 보다 더 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합된 경우 바람직한 염기 치환이다. 변형된 뉴클레오베이스는 미국 특허 3,687,808, 뿐만 아니라 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175, 273; 5, 367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,596,091; 5,614,617; 5,750,692, 및 5,681,941에 기술되어 있으며, 이들은 각각 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는, 올리고뉴클레오타이드의 활성, 세포 분포, 또는 세포 취득을 증가시키는 모이어티 또는 컨쥬게이트 하나 이상에 화학적으로 연결된다. 예를 들어, 동일하거나 또는 상이한 유형의 하나 이상의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 서로 공액될 수 있거나; 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 세포 유형 또는 조직 유형에 대한 특이성이 증가된 표적 모이어티에 공액될 수 있다. 이러한 모이어티로는, 지질 모이어티, 예컨대 콜레스테롤 모이어티 (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), 담즙산 (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올 (Manoharan et al, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), 티오콜레스테롤 (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸다이올 또는 운데실 잔기 (Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49- 54), 인지질, 예를 들어, 다이-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-다이-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 (Mancharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), 또는 아다만탄 아세트산 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), 팔미틸 모이어티 (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-t 옥시콜레스테롤 모이어티 (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937)를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 미국 특허 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552, 538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486, 603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762, 779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082, 830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5, 245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391, 723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5, 565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599, 928 및 5,688,941을 또한 참조하며, 이들은 각각 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
이들 모이어티 또는 컨쥬게이트는 1차 또는 2차 하이드록실기와 같은 관능기에 공유 결합된 컨쥬게이트 기를 포함할 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트 기로는, 인터칼레이터, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약력학적 특성을 증가시키는 기, 및 올리고머의 약동학적 특성을 증가시키는 기를 포함한다. 전형적인 컨쥬게이트 기로는, 콜레스테롤, 지질, 인지질, 비오틴, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린, 및 염료를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 약력학적 특성을 증가시키는 기로는, 취득을 개선하거나, 분해에 대한 내성을 증가시키거나, 및/또는 표적 핵산과의 서열-특이적 혼성화를 강화하는 기를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 약동학적 특성을 증가시키는 기로는, 본 발명의 화합물의 취득, 분포, 대사 또는 분비를 개선하는 기를 포함한다. 대표적인 컨쥬게이트 기는 1992년 10월 23일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US92/09196, 및 미국 특허 6,287,860에 개시되어 있으며, 이들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 컨쥬게이트 모이어티로는, 지질 모이어티 예컨대 콜레스테롤 모이어티, 담즙산, 티오에테르, 예를 들어, 헥실-5-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸다이올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들어, 다이-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-다이-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 아다만탄 아세트산, 팔리틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시 콜레스테롤 모이어티를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 미국 특허 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 및 5,688,941을 참조한다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 변형은 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 또는 3' 말단의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단은 하이드록실기 또는 티오포스페이트를 포함한다. 부가적인 분자(예를 들어, 비오틴 모이어티 또는 플루오로포르)는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 또는 3' 말단에 공액될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 5' 뉴클레오타이드에 공액된 비오틴 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 라킹된 핵산 (LNA), 에나-개질화된 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 뉴클레오타이드, 또는 2'-플루오로-데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 교대 데옥시리보뉴클레오타이드 및 2'-플루오로-데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 교대 데옥시리보뉴클레오타이드 및 2'-O-메틸 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 교대 데옥시리보뉴클레오타이드 및 에나-개질화된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 교대 데옥시리보뉴클레오타이드 및 라킹된 핵산 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 교대 라킹된 핵산 뉴클레오타이드 및 2'-O-메틸 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 5' 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 5' 뉴클레오타이드는 라킹된 핵산 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드들은 데옥시리보뉴클레오타이드의 5’ 및 3’ 말단의 각각 위에서 하나 이상의 라킹된 핵산 뉴클레오타이드에 의해 플랭킹된(flanked) 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 3’위치에서 존재하는 뉴클레오타이드는 3’하이드록실기 또는 3’티오포스페이트를 가진다.
일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결부를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 2개 이상의 뉴클레오타이드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합들을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 모든 뉴클레오타이드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결부를 포함한다.
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 본원에 기술되는 변형들 중 임의의 조합을 가질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
올리고뉴클레오타이드는 하기 변형 패턴들 중 하나 이상을 가진 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
(a) (X)Xxxxxx, (X)xXxxxx, (X)xxXxxx, (X)xxxXxx, (X)xxxxXx 및 (X)xxxxxX,
(b) (X)XXxxxx, (X)XxXxxx, (X)XxxXxx, (X)XxxxXx, (X)XxxxxX, (X)xXXxxx, (X)xXxXxx, (X)xXxxXx, (X)xXxxxX, (X)xxXXxx, (X)xxXxXx, (X)xxXxxX, (X)xxxXXx, (X)xxxXxX 및 (X)xxxxXX,
(c) (X)XXXxxx, (X)xXXXxx, (X)xxXXXx, (X)xxxXXX, (X)XXxXxx, (X)XXxxXx, (X)XXxxxX, (X)xXXxXx, (X)xXXxxX, (X)xxXXxX, (X)XxXXxx, (X)XxxXXx (X)XxxxXX, (X)xXxXXx, (X)xXxxXX, (X)xxXxXX, (X)xXxXxX 및 (X)XxXxXx,
(d) (X)xxXXX, (X)xXxXXX, (X)xXXxXX, (X)xXXXxX, (X)xXXXXx, (X)XxxXXXX, (X)XxXxXX, (X)XxXXxX, (X)XxXXx, (X)XXxxXX, (X)XXxXxX, (X)XXxXXx, (X)XXXxxX, (X)XXXxXx, 및 (X)XXXXxx,
(e) (X)xXXXXX, (X)XxXXXX, (X)XXxXXX, (X)XXXxXX, (X)XXXXxX 및 (X)XXXXXx, 및
(f) XXXXXX, XxXXXXX, XXxXXXX, XXXxXXX, XXXXxXX, XXXXXxX 및 XXXXXXx,
상기 “X”는 뉴클레오타이드 유사체를 지칭하며, (X)는 선택적인 뉴클레오타이드 유사체를 지칭하고, 및 “x”는 DNA 또는 RNA 뉴클레오타이드 단위를 지칭한다. 상기 열거된 패턴들은 각각 단독으로 또는 기타 개시된 변형 패턴들 중 임의와 조합되어 올리고뉴클레오타이드 내에서 1회 이상 나타날 수 있다.
올리고뉴클레오타이드들의 추가 특징들
상기 올리고뉴클레오타이드들이 유전자에 대응하는 mRNA의 발현을 50% 이상(즉, 정상의 150% 또는 1.5배), 또는 약 2배 내지 약 5배까지 증가시켰다는 것이 본 명세서에 입증된다. 일부 구현예에서, 상기 발현은 약 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 100배 이상까지, 또는 상기 숫자들 중 어느 하나 사이의 범위로 증가될 수 있다고 고려된다. 다른 실험에서, 증가된 mRNA 발현은 증가된 단백질 발현과 서로 연관성이 있는 것으로 나타났다.
표 2에 설명된 서열 식별자는 국제특허출원 공보 WO/2012/087983에 개시된 PRC2(즉, 올리고뉴클레오타이드들에 대한 RNA)와 연합(결합)하는 RNA의 서열을 지칭한다. 따라서, 각 서열들은 PRC2-연관 영역들을 포함한다. (a)표들에 설명된 참조 유전자들, (b)상기 유전자들(의 발현을 조절)을 표적으로 하는 PRC2 결합 전사체들 또는 피크들(즉, PRC2에 결합하는 RNA의 작은 영역들), 및 (c)PRC2 결합 전사체 또는 피크들에 특이적으로 결합하거나 또는 상보적인 올리고뉴클레오타이드들 중 각각은 상기 카테고리들로 편리하게 분류될 수 있으며, 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 3에서 숫자로 나타내거나, 또는 하기와 같이 국제특허출원 공보 WO/2012/065143의 표 9에서 숫자로 나타낼 수 있다: 질병들은 카테고리 숫자들 11, 14, 15, 17, 21, 24, 26, 42, 44, 49, 58, 69, 82, 103, 119, 120, 126, 143, 163, 167, 172, 177, 182, 183, 184, 187, 191, 196, 200, 203, 204, 219, 220, 221, 227, 234, 239, 240, 244, 249, 300-323 중 어느 하나, 또는400-643 중 어느 하나로 표시된다.
다른 기능성 그룹들은 카테고리 숫자들 10, 12, 13, 16, 18, 19, 20, 22, 23, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 100, 101, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 121, 122, 123, 124, 125, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 158, 160, 161, 162, 164, 165, 166, 168, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 176, 178, 179, 180, 181, 185, 186, 188, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 213, 215, 216, 217, 218, 222, 223, 224, 226, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 235, 236, 237, 238, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 248, 250, 251, 252, 또는 253으로 표시된다.
카테고리
번호 이름
10 액틴 세포골격 조직
11 급성 골수성 백혈병
12 접착대
13 아디포사이토킨 신호전달 경로
14 노화
15 알츠하이머병
16 아미노당 및 뉴클레오타이드 당대사
17 근위축성 측삭 경화증(ALS)
18 혈관형성
19 아포프토시스
20 아르기닌 및 프롤린 대사
21 부정맥 형성 우심실 심근증
22 축색 돌기 유도
23 B 세포 수용체 신호전달 경로
24 기저세포암종, 카테고리 644에도 있음.
25 기본전사인자
26 방광암, 카테고리 644에도 있음.
27 혈액 응고
28 혈관 발달
29 뼈 발달
30 칼슘 신호전달 경로
31 심근 수축
32 양이온 채널 활동
33 세포 부착
34 세포 주기
35 세포 주기
36 세포 운동
37 세포표면 수용체 결합된 신호전달
38 스트레스에 대한 세포반응
39 채널 활성
40 케모킨 신호전달 경로
41 콜레스테롤 대사 프로세스
42 만성 골수성 백혈병
43 구연산회로(TCA 회로)
44 직장암
45 보완 및 응고 캐스케이드
46 사이토킨 활성
47 세포골격 단백질 결합
48 시토졸
49 확장형 심근병증
50 DNA 결합
51 DNA 복구
52 DNA 복제
53 DNA 복제
54 약물 대사
55 배아 형태형성
56 세포내섭취
57 세포내섭취
58 자궁내막암
59 소포체
60 ErbB 신호전달 경로
61 세포외 영역
62 눈 발달
63 지방산 대사
64 프룩토스 및 만노스 대사
65 G-단백질 결합된 수용체 단백질 신호전달 경로
66 생식세포 생성
67 간극 결합
68 miRNA에 의한 유전자 침묵화
69 신경교종
70 글루코스 대사 프로세스
71 당분해/글루코스 신합성
72 골지체
73 성장인자 활성
74 GTP아제 조절물질 활성
75 심장 발달
76 고슴도치 신호전달 경로
77 조혈세포 계통
78 적혈구생성
79 조혈기관 또는 림프기관 발달
80 히스톤 변형
81 헌팅턴 무도병
82 비대 심장근육병증
83 면역반응
84 면역계 발달
85 염증반응
86 인슐린 신호전달 경로
87 세포내 신호전달 캐스케이드
88 이온 채널 활성
89 이온 수송
90 Jak-STAT 신호전달 경로
91 학습 또는 기억
92 백혈구 활성화
93 백혈구 경내피 세포 이동
94 사지 발생
95 이동물 행동
96 장기 상승작용
97 폐 발달
98 리소좀
99 리소좀
100 MAPK 신호전달 경로
101 MAPKKK 캐스케이드
102 멜라닌 형성
103 흑색종
104 부정합 복구
105 미토콘드리아
106 미토콘드리아 조직
107 mTOR 신호전달 경로
108 근육조직 발달
109 ncRNA 대사 프로세스
110 신경 발달
111 뉴로트로핀 신호전달 경로
112 비-소세포 폐암, 카테고리 644에도 있음
113 노취 신호전달 경로
114 핵소체
115 난모세포 감수분열
116 산화환원
117 산화성 인산화
118 p53 신호전달 경로
119 췌장암, 카테고리 644에도 있음
120 파킨슨병
121 암의 경로, 카테고리 644에도 있음
122 인산분해효소 활성
123 인단백질 인산분해효소 활성
124 세포 생합성 프로세스의 포지티브 조절
125 PPAR 신호전달 경로
126 전립선암, 카테고리 644에도 있음
127 프로테아좀
128 단백질 아미노산 탈인산화
129 단백질 접힘
130 단백질 키나제 활성
131 단백질 세린/트레오닌 키나제 활성
132 퓨린 대사
133 피리미딘 대사
134 Ras 단백질 신호전달
135 액틴 세포골격의 조절
136 자식작용의 조절
137 세포사 조절, 카테고리 644에도 있음
138 세포증식의 조절, 카테고리 644에도 있음
139 세포 크기의 조절
140 단백질 유비퀴틴화의 조절
141 Ras 단백질 신호전달의 조절
142 전사 조절
143 신세포암, 카테고리 644에도 있음
144 저산소증에 대한 반응
145 스테로이드 호르몬 자극에 대한 반응
146 바이러스에 대한 반응
147 리보솜
148 RNA 분해
149 RNA 프로세싱
150 RNA 스플라이싱, 에스테르 교환반응을 통함
151 분비
152 골격시스템 발달
153 골격시스템 형태형성
154 저분자량 GTP아제 조절물질 활성
156 정자형성
157 스핑고지질 대사
158 스플라이세오솜
159 스플라이세오솜
160 줄기세포 분화
161 스테로이드 생합성
162 시냅스
163 전신 홍반성 루푸스
164 T 세포 활성화
165 T 세포 수용체 신호전달 경로
166 TGF-베타 신호전달 경로
167 갑상선암, 카테고리 644에도 있음
168 톨-유사 수용체 신호전달 경로
169 전사활성화인자 활성
170 전사인자 활성
171 해독
172 제2형 당뇨병
173 유비퀴틴 매개 단백질 가수분해
174 혈관 평활근 수축
175 혈관구조 발달
176 VEGF 신호전달 경로
177 바이러스성 심근염
178 Wnt 신호전달 경로
179 아미노산 생합성
180 ank 반복
181 브로모도메인
182 심근증
183 백내장
184 사르코-마리-치아 질병
185 사이토카인
186 사이토카인 수용체
187 난청
188 질병 돌연변이
189 egf-유사 도메인
190 엔도솜
191 간질
192 글리코단백질
193 성장인자
194 성장인자 결합
195 성장인자 수용체
196 어린선
197 면역글로불린 도메인
198 이온 채널
199 류신-풍부 반복
200 백질이영양증
201 메틸화
202 메틸트랜스퍼라제
203 신경퇴화
204 신경병증
205 세포핵
206 비만
207 단백질 포스파타제
208 단백질 포스파타제 억제물질
209 온코진(프로토-온코진 포함), 카테고리 644에도 있음
210 분비됨
211 세린/트레오닌-특이적 단백질 키나아제
212 전신 홍반성 루푸스
213 막관통
214 막관통 단백질
215 종양 억제제, 카테고리 644에도 있음
216 티로신-단백질 키나아제
217 ubl 활용경로
218 wd 반복
300 방광암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
301 백혈병에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
302 뇌종양에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
303 유방암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
304 자궁경부암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
305 대장암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
306 식도암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
307 위암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
308 두경부암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
309 신장암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
310 간암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
311 폐암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
312 림프종에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
313 흑색종에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
314 다발성 골수증에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
315 난소암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
316 췌장암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
317 전립선암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
318 육종에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
319 비-흑색종 피부암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
320 자궁암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
321 중피종에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
322 부신암종에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
323 부갑상선암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
400 신장의 투명세포 육종에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
401 급성 호흡부전 증후군에서 상향조절됨
402 급성 거핵아세포 백혈병에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
403 급성 골수성 백혈병에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
404 비특정 급성 췌장염에서 상향조절됨
405 식도의 선암에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
406 폐의 선암에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
407 소장의 선암에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
408 아데노바이러스 감염에서 상향조절됨
409 뇌염동반 AIDS에서 상향조절됨
410 알코올 중독에서 상향조절됨
411 알렉산더 질병에서 상향조절됨
412 알파-1-안티트립신 결핍에서 상향조절됨
413 알츠하이머병에서 상향조절됨
414 악성 핍지성상세포종에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
415 안드로겐 저항성 증후군에서 상향조절됨
416 성상 세포종에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
417 근위측증에서 상향조절됨
418 자가면역 간염에서 상향조절됨
419 세균감염에서 상향조절됨
420 바레트 식도에서 상향조절됨
421 소장 상피내암에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
422 심근증에서 상향조절됨
423 만성 육아종증에서 상향조절됨
424 만성 림프성 백혈병에서 상향조절됨
425 만성 폐색성 기도 질병에서 상향조절됨
426 만성 다관절 청소년 류마티스 관절염에서 상향조절됨
427 간경변증에서 상향조절됨
428 코카인 중독에서 상향조절됨
429 복합 충치에서 상향조절됨
430 크론병에서 상향조절됨
431 비대상성 심부전에서 상향조절됨
432 탈수에서 상향조절됨
433 확장성 심근병증에서 상향조절됨
434 확장성 심근병증 2차에서 바이러스성 심근염으로 상향조절됨
435 상피 증식에서 상향조절됨
436 중추신경계의 대장균감염에서 상향조절됨
437 본태성 혈소판혈증에서 상향조절됨
438 과로로 인한 탈진에서 상향조절됨
439 가계성 저인산혈성 골병에서 상향조절됨
440 골절에서 상향조절됨
441 대퇴골 골절에서 상향조절됨
442 일반화 허혈성 심근기능장애에서 상향조절됨
443 교아종에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
444 함만-리치 증후군에서 상향조절됨
445 헬리코박터 파일로리 위장관 감염에서 상향조절됨
446 C형 간염에서 상향조절됨
447 HIV 감염에서 상향조절됨
448 헌팅톤병에서 상향조절됨
449 과콜레스테롤혈증에서 상향조절됨
450 비대에서 상향조절됨
451 특발성 혈소판감소성 자색반증에서 상향조절됨
452 예르시니아 엔테로콜리티카 감염에서 상향조절됨
453 무정자증으로 인한 불임에서 상향조절됨
454 심장 손상에서 상향조절됨
455 피부의 ISM-상피내 흑색종에서 상향조절됨
456 레버 흑내장에서 상향조절됨
457 간암에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
458 시력 감퇴에서 상향조절됨
459 악성 림프종에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
460 자궁경부의 악성 종양에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
461 십이지장의 악성 종양에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
462 전립선의 악성 종양에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
463 위의 악성 종양에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
464 고환의 악성 종양에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
465 직장의 악성 종양에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
466 다중 양성 멜라노세포성 모반에서 상향조절됨
467 당뇨병성 신장증에서 상향조절됨
468 비-인슐린 의존성 당뇨병에서 상향조절됨
469 영양결핍에서 상향조절됨
470 수면 무호흡증에서 상향조절됨
471 희돌기교종에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
472 유두 갑상선암에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
473 파킨슨병에서 상향조절됨
474 돼지 신증에서 상향조절됨
475 전 자간증에서 상향조절됨
476 원발성 심근증에서 상향조절됨
477 원발성 개방 우각 녹내장에서 상향조절됨
478 원발성 폐 형성부전에서 상향조절됨
479 슈도모나스 감염에서 상향조절됨
480 폐기종에서 상향조절됨
481 폐고혈압에서 상향조절됨
482 제2형 당뇨병과 관련된 신장병에서 상향조절됨
483 망막 손상에서 상향조절됨
484 색소성 망막염에서 상향조절됨
485 류마티스성 관절염에서 상향조절됨
486 편평상피암종에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
487 폐의 편평상피암종에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
488 간질 지속증에서 상향조절됨
489 전신감염에서 상향조절됨
490 혈소판감소증에서 상향조절됨
491 흉선 암에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
492 이행세포 암종에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
493 이행세포 상피내암종에서 상향조절됨, 카테고리 644에도 있음
494 궤양성 대장염에서 상향조절됨
495 자궁 섬유양에서 상향조절됨
496 호흡기-연관 폐 손상에서 상향조절됨
497 심실비대에서 상향조절됨
498 좌심실 비대에서 상향조절됨
499 비타민 A 결핍에서 상향조절됨
500 신장의 투명세포 육종에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
501 급성 폐 손상에서 하향조절됨
502 급성 거핵아세포 백혈병에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
503 급성 골수성 백혈병에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
504 급성 비지정 췌장염에서 하향조절됨
505 식도의 선암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
506 폐의 선암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
507 소장의 선종에서 하향조절됨
508 아데노바이러스 감염에서 하향조절됨
509 뇌염 동반 AIDS에서 하향조절됨
510 알코올 중독에서 하향조절됨
511 알렉산더병에서 하향조절됨
512 알파-1-항트립신 결핍에서 하향조절됨
513 알츠하이머병에서 하향조절됨
514 악성 핍지성상세포종에서 하향조절됨
515 안드로겐 불감 증후군에서 하향조절됨
516 성상세포종에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
517 근위축증에서 하향조절됨
518 자가면역간염에서 하향조절됨
519 세균감염에서 하향조절됨
520 바레트 식도에서 하향조절됨
521 소장 상피내암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
522 심근증에서 하향조절됨
523 만성 육아종증에서 하향조절됨
524 만성 림프성 백혈병에서 하향조절됨
525 만성 폐색성 기도 질병에서 하향조절됨
526 만성 다관절 청소년 류마티스 관절염에서 하향조절됨
527 간경변증에서 하향조절됨
528 코카인 중독에서 하향조절됨
529 복합 충치에서 하향조절됨
530 크론병에서 하향조절됨
531 비대상성 심부전에서 하향조절됨
532 탈수에서 하향조절됨
533 확장성 심근병증에서 하향조절됨
534 확장성 심근병증 2차에서 바이러스성 심근염으로 하향조절됨
535 상피 증식에서 하향조절됨
536 중추신경계의 대장균감염에서 하향조절됨
537 본태성 혈소판혈증에서 하향조절됨
538 과로로 인한 탈진에서 하향조절됨
539 가계성 저인산혈성 골병에서 하향조절됨
540 골절에서 하향조절됨
541 대퇴골 골절에서 하향조절됨
542 일반화 허혈성 심근기능장애에서 하향조절됨
543 교아종에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
544 함만-리치 증후군에서 하향조절됨
545 헬리코박터 파일로리 위장관 감염에서 하향조절됨
546 C형 간염에서 하향조절됨
547 HIV 감염에서 하향조절됨
548 헌팅톤병에서 하향조절됨
549 과콜레스테롤혈증에서 하향조절됨
550 비대에서 하향조절됨
551 특발성 혈소판감소성 자색반증에서 하향조절됨
552 예르시니아 엔테로콜리티카 감염에서 하향조절됨
553 무정자증으로 인한 불임에서 하향조절됨
554 심장 손상에서 하향조절됨
555 피부의 ISM-상피내 흑색종에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
556 레버 흑내장에서 하향조절됨
557 간암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
558 시력 감퇴에서 하향조절됨
559 악성 림프종에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
560 자궁경부의 악성 종양에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
561 십이지장의 악성 종양에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
562 전립선의 악성 종양에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
563 위의 악성 종양에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
564 고환의 악성 종양에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
565 직장의 악성 종양에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
566 다중 양성 멜라노세포성 모반에서 하향조절됨
567 당뇨병성 신장증에서 하향조절됨
568 비-인슐린 의존성 당뇨병에서 하향조절됨
569 영양결핍에서 하향조절됨
570 수면 무호흡증에서 하향조절됨
571 희돌기교종에서 하향조절됨,
572 유두 갑상선암에서 하향조절됨,
573 파킨슨병에서 하향조절됨
574 돼지 신증에서 하향조절됨
575 전 자간증에서 하향조절됨
576 원발성 심근증에서 하향조절됨
577 원발성 개방 우각 녹내장에서 하향조절됨
578 원발성 폐 형성부전에서 하향조절됨
579 슈도모나스 감염에서 하향조절됨
580 폐기종에서 하향조절됨
581 폐고혈압에서 하향조절됨
582 제2형 당뇨병과 관련된 신장병에서 하향조절됨
583 망막 손상에서 하향조절됨
584 색소성 망막염에서 하향조절됨
585 류마티스성 관절염에서 하향조절됨
586 편평상피암종에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
587 폐의 편평상피암종에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
588 간질 지속증에서 하향조절됨
589 전신감염에서 하향조절됨
590 혈소판감소증에서 하향조절됨
591 흉선 암에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
592 이행세포 암종에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
593 이행세포 상피내암종에서 하향조절됨, 카테고리 644에도 있음
594 궤양성 대장염에서 하향조절됨
595 자궁 섬유양에서 하향조절됨
596 호흡기-연관 폐 손상에서 하향조절됨
597 심실비대에서 하향조절됨
598 좌심실 비대에서 하향조절됨
599 비타민 A 결핍에서 하향조절됨
600 골 질병과 연관되어 있음
601 암 질병과 연관되어 있음, 카테고리 644에도 있음
602 심장 혈관계 질병과 연관되어 있음
603 결합조직 장애 질병들과 연관되어 있음
604 피부과 질병들과 연관되어 있음
605 발육병들과 연관되어 있음
606 퀴, 코, 목구멍 질병들과 연관되어 있음
607 내분비성 질환들과 연관되어 있음
608 위장관 질병들과 연관되어 있음
609 혈액학적 질병들과 연관되어 있음
610 면역학적 질병들과 연관되어 있음
611 대사 질병들과 연관되어 있음
612 복합 질병들과 연관되어 있음
613 근육병들과 연관되어 있음
614 신경질병들과 연관되어 있음
615 영양성 질병들과 연관되어 있음
616 안과학 질병들과 연관되어 있음
617 다른 질병들과 연관되어 있음
618 정신 질병들과 연관되어 있음
619 신장 질병들과 연관되어 있음
620 호흡 질병들과 연관되어 있음
621 골격 질병들과 연관되어 있음
622 골 질병이 감소됨
623 암 질병이 감소됨, 카테고리 644에도 있음
624 심장 혈관계 질병이 감소됨
625 결합조직 장애 질병들이 감소됨
626 피부과 질병들이 감소됨
627 발육병들이 감소됨
628 퀴, 코, 목구멍 질병들이 감소됨
629 내분비성 질환들이 감소됨
630 위장관 질병들이 감소됨
631 혈액학적 질병들이 감소됨
632 면역학적 질병들이 감소됨
633 대사 질병들이 감소됨
634 복합 질병들이 감소됨
635 근육병들이 감소됨
636 신경질병들이 감소됨
637 영양성 질병들이 감소됨
638 안과학 질병들이 감소됨
639 다른 질병들이 감소됨
640 정신 질병들이 감소됨
641 신장 질병들이 감소됨
642 호흡 질병들이 감소됨
643 골격 질병들이 감소됨
644 암에 포함됨
따라서, 다양한 측면에서, 본 발명은 유전자의 발현을 조절하는데 사용하기 위해, 본 명세서에 설명된 RNA 서열들 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오타이드들을 특징으로 한다. 다른 측면에서, 본 발명은 또한, 표적 유전자와 “반대 가닥” 또는 “동일한 가닥”의, 서열 B47,408 내지 B616,428 [마우스 피크] 또는 B652,256 내지 B916,209 [인간 피크] 또는 B916,626 내지 B934,761 - [인간 피크를 둘러싼 더 긴 영역]의 RNA 서열들 중 어느 하나에 대하여 특이적으로 결합하거나 상보적인 올리고뉴클레오타이드들(예를 들면, 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에 표시되어 있음)을 특징으로 한다. 일부 측면에서, 올리고뉴클레오타이드는 PRC2 결합 RNA에 의해 표적이 되는 유전자(예를 들면, 교차 유전자 또는 부근 유전자)의 발현을 조절하는 방법에 사용하기 위해 제공된다. 상기 방법들은 시험관내, 생체외, 또는 생체내에서 실시될 수 있다. 일부 측면에서, 올리고뉴클레오타이드는 질병을 치료하는 방법에 사용하기 위해 제공된다. 상기 치료방법들은 PRC2 결합 RNA에 의해 표적이 되는 유전자의 발현을 조절하는 방법, 바람직하게는 유전자 발현을 상향조절하는 방법을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 올리고뉴클레오타이드는 비경구투여를 위한 멸균 조성물로서 배합된다. 상기 RNA 서열들에 의해 표적이 된 참조 유전자들은 표 2-3에 개시되어 있으며, 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 3에서 카테고리 1-644에 따라 그룹핑되거나, 표 2에 개시된 각인 유전자들이다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 카테고리 1-644 중 어느 하나에서 RNA 서열들 그룹, 전사체 또는 피크들에 대하여 특이적으로 결합하거나 상보적인 올리고뉴클레오타이드 그룹을 설명한다. 특히, 본 발명은 WO/2012/087983의 표 3에 개시된 특정 카테고리들(예를 들면, 카테고리 번호 11, 14, 15, 17, 21, 24, 26, 42, 44, 49, 58, 69, 82, 103, 119, 120, 126, 143, 163, 167, 172, 177, 182, 183, 184, 187, 191, 196, 200, 203, 204, 212, 300 323, 및/또는 400-644 중 1개 이상)에 개시된 질병, 장애, 질환 또는 조합을 치료하는데 사용하기 위해, 표 2에 개시된 참조 유전자들 중 어느 유전자들의 발현을 상향조절하기 위해 상기 올리고뉴클레오타이드들을 사용하는 것을 특징으로 한다.
비-제한적인 실시예에 의해, 카테고리 45(보완 및 응고 캐스케이드)는 A2M, SERPINC1, BDKRB1, BDKRB2, CFB, SERPING1, C1QA, C1QB, C1QC, C1R, C1S, C2, C3, C3AR1, C4A, C4B, C4BPA, C4BPB, C5, C5AR1, C6, C7, C8A, C8B, C9, CD59, CPB2, CR1, CR2, CD55, CFD, F2, F3, F5, F7, F8, F9, F10, F11, F12, F13A1, F13B, FGA, FGB, FGG, SERPIND1, CFH, CFI, KLKB1, KNG1, MBL2, CD46, SERPINE1, SERPINA1, PLAT, PLAU, PLAUR, PLG, SERPINF2, PROC, PROS1, MASP1, TFPI, THBD, VWF 및/또는 MASP2로 구성된 그룹에서 선택되는 참조 유전자들을 포함한다.
차례로, A2M, SERPINC1, BDKRB1, BDKRB2, CFB, SERPING1, C1QA, C1QB, C1QC, C1R, C1S, C2, C3, C3AR1, C4A, C4B, C4BPA, C4BPB, C5, C5AR1, C6, C7, C8A, C8B, C9, CD59, CPB2, CR1, CR2, CD55, CFD, F2, F3, F5, F7, F8, F9, F10, F11, F12, F13A1, F13B, FGA, FGB, FGG, SERPIND1, CFH, CFI, KLKB1, KNG1, MBL2, CD46, SERPINE1, SERPINA1, PLAT, PLAU, PLAUR, PLG, SERPINF2, PROC, PROS1, MASP1, TFPI, THBD, VWF 및/또는 MASP2는 각각 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2의 적용가능한 열에 표시된 서열 식별자들을 갖는 PRC2-연합 RNA에 의해 표적이 된다. 예를 들면, F2 표적 서열들은 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에 따른, 코딩 유전자와 같은 가닥 상에서 서열들: B620037 [F], B620035 [4027], B790730 [4752], B4539 [2059], B341288 [3278], B4537 [4639], 및 반대 가닥 상에서 서열들: B620036 [F], B790731 - [F], B4538 [F], B341286 [F], B341287 [F]을 포함한다.
국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에 표적이 된 참조 유전자로서 개시되어 있는 서열들 A2M, SERPINC1, BDKRB1, BDKRB2, CFB, SERPING1, C1QA, C1QB, C1QC, C1R, C1S, C2, C3, C3AR1, C4A, C4B, C4BPA, C4BPB, C5, C5AR1, C6, C7, C8A, C8B, C9, CD59, CPB2, CR1, CR2, CD55, CFD, F2, F3, F5, F7, F8, F9, F10, F11, F12, F13A1, F13B, FGA, FGB, FGG, SERPIND1, CFH, CFI, KLKB1, KNG1, MBL2, CD46, SERPINE1, SERPINA1, PLAT, PLAU, PLAUR, PLG, SERPINF2, PROC, PROS1, MASP1, TFPI, THBD, VWF 및/또는 MASP2 중 어느 하나에 대하여 특이적으로 결합하거나, 상보적인 올리고뉴클레오타이드 그룹은 카테고리 45의 질병(보완 및 응고 캐스케이드)을 치료하는데 사용하는 것을 포함하는, 본 명세서에 설명된 조성물 및 방법들에 사용하기 위한 것으로 고려되며, 상기 치료는 참조유전자 A2M, SERPINC1, BDKRB1, BDKRB2, CFB, SERPING1, C1QA, C1QB, C1QC, C1R, C1S, C2, C3, C3AR1, C4A, C4B, C4BPA, C4BPB, C5, C5AR1, C6, C7, C8A, C8B, C9, CD59, CPB2, CR1, CR2, CD55, CFD, F2, F3, F5, F7, F8, F9, F10, F11, F12, F13A1, F13B, FGA, FGB, FGG, SERPIND1, CFH, CFI, KLKB1, KNG1, MBL2, CD46, SERPINE1, SERPINA1, PLAT, PLAU, PLAUR, PLG, SERPINF2, PROC, PROS1, MASP1, TFPI, THBD, VWF 및/또는 MASP2를 조절하는 것을 포함하며, 여기에 국한되지는 않는다.
이와 유사하게, 카테고리 643(“골격 질병이 감소됨”)의 유전자들에 대하여 특이적으로 결합하거나 상보적인 올리고뉴클레오타이드들이 골격 질병을 치료하는데 사용하는 것을 포함하는, 본 명세서에 설명된 조성물 및 방법들에 사용하기 위한 것으로 고려되지만, 이들로 국한되지 않는다. 카테고리 644(암 포함)의 일부인 카테고리의 유전자들에 대하여 특이적으로 결합하거나 상보적인 올리고뉴클레오타이드는 암을 치료하는데 사용되는 것을 포함하는, 본 명세서에 설명된 조성물 및 방법들에 사용하기 위한 것으로 고려되지만, 이들로 국한되지 않는다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 본 명세서에 개시된 피크들, 또는 비-피크 영역들, 또는 피크에 인접한 영역들에 상보적이거나, 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 이해되고 있다. 다양한 측면에서, 본 발명은 서로 100 염기들, 200 염기들, 300 염기들, 400 염기들, 500 염기들, 1kb, 또는 2kb 내로 서로 가까운 염색체 좌표들에 대응하는 2개 이상의 피크들 사이의 RNA 서열들에 결합하고, 국제특허출원 공보 WO/2012/065143의 표 8 또는 국제특허출원 PCT/US2011/65939의 표 2에서 같은 참조 유전자와 바람직하게 연합하는 올리고뉴클레오타이드들을 특징으로 한다. 예를 들면, 본 발명은 서열 A1 내지 A21582 또는 A191089 내지 A193049 또는 B1 내지 B47,407 또는 B934,762 내지 B934,863[마우스 전사체] 또는 B616,429 내지 B652,255 또는 B916,210 내지 B916,625 또는 B934,864 내지 B934,968 [인간 전사체] 또는 B916,626 내지 B934,761 [인간 피크들을 둘러싼 더 큰 영역]의 RNA 전사체들의 단편에 특이적으로 결합하거나, 또는 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 특징으로 하며, 상기 단편은 길이가 약 2000, 약 1750, 약 1500, 약 1250개 뉴클레오타이드, 또는 바람직하게 약 1000, 약 750, 약 500, 약 400, 약 300개 뉴클레오타이드, 또는 보다 바람직하게 약 200, 약 150, 또는 약 100개 뉴클레오타이드이며, RNA의 단편은 이후에 참조로 전문 포함되는, 2010년 12월 20일자로 출원된 미국 가출원 제61/425,174호의 첨부서류 I의 서열들 A124437 내지 A190716, 또는 A190934 내지 A191086, 또는 A191087 [인간 피크], 또는 서열들 A21583 내지 A124436, 또는 A190717 내지 190933, 또는 191088 [마우스 피크], 또는 서열들 B47,408 내지 B616,428 [마우스 피크] 또는 서열들 B652,256 내지 B916,209 [인간 피크] 내 5개 이상의 연속 뉴클레오타이드 스트레치, 또는 특정의 cDNA 서열들의 역 보완물을 포함한다. 예시적인 구현예에서, RNA의 단편은 2010년 12월 20일자로 출원된 미국 가출원 제61/425,174 호의 첨부서류 I의 서열들 A124437 내지 A190716, 또는 A190934 내지 A191086, 또는 A191087 [인간 피크], 또는 서열들 A21583 내지 A124436, 또는 A190717 내지 A190933, 또는 A191088 [마우스 피크], 또는 서열들 B47,408 내지 B616,428 [마우스 피크] 또는 서열들 B652,256 내지 B916,209 [인간 피크] 내 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 연속 뉴클레오타이드들 또는 cDNA 서열들의 역 보완물을 포함한다.
따라서, 예를 들면, 본 발명은 길이가 약 2000, 약 1750, 약 1500, 약 1250개 뉴클레오타이드들, 또는 바람직하게 약 1000, 약 750, 약 500, 약 400, 약 300개 뉴클레오타이드들, 또는 보다 바람직하게 약 200, 약 150, 또는 약 100개 뉴클레오타이드들인 단편들에 결합하는 올리고뉴클레오타이드들을 포함하며,
상기 단편들은
(a) 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2의 같은 참조 유전자와 바람직하게 연합한, 서열들 B47408-B616428 [마우스 피크]내에서, 적어도 5개의 연속 뉴클레오타이드들, 또는 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 스트레치를 포함하는 서열들 B1-B47407 [마우스 전사체]의 단편들;
(b) 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2의 같은 참조 유전자와 바람직하게 연합한, 서열들 B652256-B916209 [인간 피크]내에서, 적어도 5개의 연속 뉴클레오타이드들, 또는 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 스트레치를 포함하는 서열들 B616429-B652255 [인간 전사체]의 단편들;
(c) 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2의 같은 참조 유전자와 바람직하게 연합한, 서열들 B652256-B916209 [인간 피크]내에서, 적어도 5개의 연속 뉴클레오타이드들, 또는 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 스트레치를 포함하는 서열들 B916626-B934761 [인간 피크들 주위의 더 긴 영역]의 단편들;
(d) 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2 또는 표 2의 같은 참조 유전자와 바람직하게 연합한, 서열들 B47408-B616428 [마우스 피크]내에서, 적어도 5개의 연속 뉴클레오타이드들, 또는 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 스트레치를 포함하는 서열들 B934762-B934863 [마우스 각인 전사체들]의 단편들;
(e) 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2 또는 표 2의 같은 참조 유전자와 바람직하게 연합한, 서열들 B652256-B916209 [인간 피크들] 내에서, 적어도 5개의 연속 뉴클레오타이드들, 또는 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 스트레치를 포함하는 서열들 B629991, B629992, B630983, B630984, B630990, B631003, B631004, B632396, B632397, B632402, B632403, B632419, B632422, B634959, B638303, B638304, B647595, B647596, B647597, B647598, B647601, B649028, 및 B934864-B934931 [인간 각인 전사체]의 단편들;
(f) 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2의 같은 참조 유전자와 바람직하게 연합한, 서열들 B652256-B916209 [인간 피크]내에서, 적어도 5개의 연속 뉴클레오타이드들, 또는 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 스트레치를 포함하는 서열들 B916210-B916625 [인간 전사체들]의 단편들; 또는
(g) 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2의 같은 참조 유전자와 바람직하게 연합한, 서열들 B652256-B916209 [인간 피크]내에서, 적어도 5개의 연속 뉴클레오타이드들, 또는 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 스트레치를 포함하는 서열들 B934932-B934968 [인간 전사체들]의 단편들.
따라서, 상기 검토된 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드는 표적 RNA의 적어도 10, 또는 10-30 또는 10-40개의 연속 염기들에 대하여 적어도 80% 상보적이거나, 표적 RNA의 적어도 15, 또는 15-30, 또는 15-40개의 연속 염기들에 대하여 적어도 80% 상보적이거나, 표적 RNA의 적어도 20, 또는 20-30, 또는 20-40개의 연속 염기들에 대하여 적어도 80% 상보적이거나, 표적 RNA의 적어도 25, 또는 25-30, 또는 25-40개의 연속 염기들에 대하여 적어도 80% 상보적이거나, 표적 RNA의 적어도 30, 또는 30-40개의 연속 염기들에 대하여 적어도 80% 상보적이거나, 또는 표적 RNA의 적어도 40개의 연속 염기들에 대하여 적어도 80% 상보적인 염기들의 서열을 포함하거나 또는 이들로 구성될 수 있다. 그리고, 올리고뉴클레오타이드는 표적 RNA의 적어도 5, 또는 5-30 또는 5-40 또는 8-40개의 연속 염기들에 대하여 적어도 90% 상보적이거나, 표적 RNA의 적어도 10, 또는 10-30, 또는 10-40개의 연속 염기들에 대하여 적어도 90% 상보적이거나, 표적 RNA의 적어도 15, 또는 15-30, 또는 15-40개의 연속 염기들에 대하여 적어도 90% 상보적이거나, 표적 RNA의 적어도 20, 또는 20-30, 또는 20-40개의 연속 염기들에 대하여 적어도 90% 상보적이거나, 표적 RNA의 적어도 25, 또는 25-30, 또는 25-40개의 연속 염기들에 대하여 적어도 90% 상보적이거나, 표적 RNA의 적어도 30, 또는 30-40개의 연속 염기들에 대하여 적어도 90% 상보적이거나, 또는 표적 RNA의 적어도 40개의 연속 염기들에 대하여 적어도 90% 상보적인 염기들의 서열을 포함하거나, 또는 이들로 구성될 수 있다. 이와 유사하게, 올리고뉴클레오타이드는 표적 RNA의 적어도 5, 10 또는 15개의 연속 염기들에 대하여 완전히 상보적인 염기들의 서열을 포함하거나, 또는 이들로 구성될 수 있다. 일부 추가의 비상보적인 염기들이 포함될 수 있음을 이해하고 있다. 설명된 염기들의 상기 서열들을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 다른 비-상보적 염기들을 포함할 수도 있음을 이해하고 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드는 전체 길이가 20개의 염기들일 수 있지만, 표적 RNA의 15개의 염기들에 대하여 완전히 상보적인 15개의 염기 부분을 포함한다. 이와 유사하게, 올리고뉴클레오타이드는 전체 길이가 20개의 염기들일 수 있지만, 표적 RNA의 15개의 염기들에 대하여 적어도 80% 상보적인 15개의 염기 부분을 포함한다.
상보성은 상기와 같이, 상보성 염기 페어링에 있어서 미스매치의 수의 용어로 참고될 수도 있다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드는 표적 RNA의 10개의 연속 염기들에 대하여 3개 이하의 미스매치, 또는 표적 RNA의 15개의 연속 염기들에 대하여 3개 이하의 미스매치, 또는 표적 RNA의 20개의 연속 염기들에 대하여 3개 이하의 미스매치, 또는 표적 RNA의 25개의 연속 염기들에 대하여 3개 이하의 미스매치들, 또는 표적 RNA의 30개의 연속 염기들에 대하여 3개 이하의 미스매치들을 갖는 염기들의 서열을 포함하거나, 또는 이들로 구성될 수 있다. 이와 유사하게, 올리고뉴클레오타이드는 표적 RNA의 10개의 연속 염기들에 대하여 2개 이하의 미스매치들, 또는 표적 RNA의 15개의 연속 염기들에 대하여 2개 이하의 미스매치들, 또는 표적 RNA의 20개의 연속 염기들에 대하여 2개 이하의 미스매치들, 또는 표적 RNA의 25개의 연속 염기들에 대하여 2개 이하의 미스매치들, 또는 표적 RNA의 30개의 연속 염기들에 대하여 2개 이하의 미스매치들을 갖는 염기들의 서열을 포함하거나, 또는 이들로 구성될 수 있다. 이와 유사하게, 올리고뉴클레오타이드는 표적 RNA의 10, 15, 20, 25, 또는 30개의 연속 염기들에 대하여 1개의 미스매치를 갖는 염기들의 서열을 포함하거나, 또는 이들로 구성될 수 있다.
본 명세서(예를 들면, 요약서, 상세한 설명 또는 실시예들)에 설명된 올리고뉴클레오타이드의 일부 또는 특정 실시형태, 또는 이들의 설계 또는 합성 방법에서, 올리고뉴클레오타이드는 1개 이상의 하기 공보들에 개시된 1개 이상의 올리고뉴클레오타이드를 선택적으로 배제할 수 있다: 표적으로서, HOTAIR RNA(Rinn et al., 2007), Tsix, RepA, 또는 Xist RNAs((Zhao et al., 2008) [서열들 B936166 - B936170], 또는 (Sarma et al., 2010) [서열들 B936177 - B936186] 또는 (Zhao et al., 2010) [서열들 B936187 - B936188] 또는 (Prasnath et al., 2005) [서열들 B936173 - B936176 ]. 또는 (Shamovsky et al., 2006) [서열 B936172] 또는 (Mariner et al., 2008) [서열 B936171] 또는 (Sunwoo et al., 2008) 또는 (Bernard et al., 2010) [서열 B936189]; 또는 후보물질 PRC2 조절물질로서 확인된 50 200 nt의 표적으로 하는 짧은 RNA로서 (Kanhere et al., 2010); 또는 (Kuwabara et al., US 2005/0226848) [서열들 B936190 - B936191] 또는 (Li et al., US 2010/0210707) [서열들 B936192 - B936227] 또는 (Corey et al., 7,709,456) [서열들 B936228 - B936245] 또는 (Mattick et al., WO 2009/124341), 또는 (Corey et al., US 2010/0273863) [서열들 B936246 - B936265], 또는 (Wahlstedt et al., US 2009/0258925) [서열들 B935060 - B935126], 또는 BACE: US 2009/0258925 [서열들 B935060 - B935126]; ApoA1: US 2010/0105760 / EP235283 [서열들 B935127 - B935299], P73, p53, PTEN, WO 2010/065787 A2 / EP2370582 [서열들 B935300 - B935345]; SIRT1: WO 2010/065662 A2 / EP09831068 [서열들 B935346 - B935392]; VEGF: WO 2010/065671 - A2 / EP2370581 - [서열들 B935393 - B935403]; EPO: WO 2010/065792 A2 / EP09831152 [서열들 B935404 - B935412]; BDNF: WO2010/093904 [서열들 B935413 - B935423], DLK1: WO 2010/107740 [서열들 B935424 - B935430]; NRF2/NFE2L2: WO 2010/107733 [서열들 B935431 - - B935438]; GDNF: WO 2010/093906 [서열들 B935439 - B935476]; SOX2, KLF4, Oct3A/B, "재프로그래밍 인자들: WO 2010/135329 [서열들 B935477 - B935493]; 다이스트로핀(Dystrophin): WO 2010/129861 - [서열들 B935494 - B935525]; ABCA1, LCAT, LRP1, ApoE, LDLR, ApoA1: WO 2010/129799 [서열들 B935526 - B935804]; HgF: WO 2010/127195 [서열들 B935805 - B935809]; TTP/Zfp36: WO 2010/129746[서열들 B935810 - B935824]; TFE3, IRS2: WO 2010/135695 [서열들 B935825 - B935839]; RIG1, MDA5, IFNA1: WO 2010/138806 [서열들 B935840 - B935878]; PON1: WO 2010/148065 [서열들 B935879 - B935885]; Collagen: WO/2010/148050 [서열들 B935886 - B935918]; Dyrk1A, Dscr1, "Down Syndrome Gene": WO/2010/151674 [서열들 B935919 - B935942]; TNFR2: WO/2010/151671 - [서열들 B935943 - B935951]; 인슐린: WO/2011/017516 [서열들 B935952 - B935963]; ADIPOQ: WO/2011/019815 [서열들 B935964 - B935992]; CHIP: WO/2011/022606 [서열들 B935993 - B936004]; ABCB1: WO/2011/025862 [서열들 B936005 - B936014]; NEUROD1, EUROD1, HNF4A, MAFA, PDX, KX6, "췌장 발달 유전자": WO/2011/085066 [서열들 B936015 - B936054]; MBTPS1: WO/2011/084455 [서열들 B936055 - B936059]; SHBG: WO/2011/085347 [서열들 B936060 - B936075]; IRF8: WO/2011/082409 [서열들 B936076 - B936080]; UCP2: WO/2011/079263 [서열들 B936081 - - B936093]; HGF: WO/2011/079261 - [서열들 B936094 - B936104]; GH: WO/2011/038205 [서열들 B936105 - B936110]; IQGAP: WO/2011/031482 [서열들 B936111 - - B936116]; NRF1: WO/2011/090740 [서열들 B936117 - B936123]; P63: WO/2011/090741 - [서열들 B936124 - B936128]; RNAseH1: WO/2011/091390 [서열들 B936129 - B936140]; ALOX12B: WO/2011/097582 [서열들 B936141 - - B936146]; PYCR1: WO/2011/103528 [서열들 B936147 - B936151]; CSF3: WO/2011/123745 [서열들 B936152 - B936157]; FGF21: WO/2011/127337 [서열들 B936158 - B936165]; SIRTUIN (SIRT): WO2011/139387 [서열들 B936266 - B936369 및 B936408 - B936425]; PAR4: WO2011/143640 [서열들 B936370 - B936376 및 B936426]; LHX2: WO2011/146675 [서열들 B936377 - B936388 및 B936427 B936429]; BCL2L11: WO2011/146674 [서열들 B936389 - B936398 및 B936430 B936431]; MSRA: WO2011/150007 [서열들 B936399 - B936405 및 B936432]; ATOH1: WO2011/150005 [서열들 B936406 - B936407 및 B936433], 이들 각각은 본 명세서에 참조로 포함된다. 일부 또는 특정 구현예에서, 하기 영역들 중 하나 이상에 특이적으로 결합하거나, 상보적인 올리고뉴클레오타이드들이 본 발명으로부터 선택적으로 배제된다: 서열 B935128의 뉴클레오타이드들 1 - 932; 서열 B935306의 뉴클레오타이드들 1 - 1675; 서열 B935307의 뉴클레오타이드들 1 - 518; 서열 B935308의 뉴클레오타이드들 1 - 759; 서열 B935309의 뉴클레오타이드들 1 - 25892; 서열 B935310의 뉴클레오타이드들 1 - 279; 서열 B935311의 뉴클레오타이드들 1 - 1982; 서열 B935312의 뉴클레오타이드들 1 - 789; 서열 B935313의 뉴클레오타이드들 1 - 467; 서열 B935347의 뉴클레오타이드들 1 - 1028; 서열 B935348 뉴클레오타이드들 1 - 429; 서열 B935349의 뉴클레오타이드들 1 - 156; 서열 B935350의 뉴클레오타이드들 1 - 593; 서열 B935395의 뉴클레오타이드들 1 - 643; 서열 B935396의 뉴클레오타이드들 1 - 513; 서열 B935406의 뉴클레오타이드들 1 - 156; 서열 B935414의 뉴클레오타이드들 1 - 3175; 서열 B935426의 뉴클레오타이드들 1 - 1347; 서열 B935433의 뉴클레오타이드들 1 - 5808; 서열 B935440의 뉴클레오타이드들 1 - 237; 서열 B935441의 뉴클레오타이드들 1 - 1246; 서열 B935442의 뉴클레오타이드들 1 - 684; 서열 B935473의 뉴클레오타이드들 1 - 400; 서열 B935474의 뉴클레오타이드들 1 - 619; 서열 B935475의 뉴클레오타이드들 1 - 813; 서열 B935480의 뉴클레오타이드들 1 - 993; 서열 B935480의 뉴클레오타이드들 1 - 401; 서열 B935481의 뉴클레오타이드들 1 - 493; 서열 B935482의 뉴클레오타이드들 1 - 418; 서열 B935496의 뉴클레오타이드들 1 - 378; 서열 B935497의 뉴클레오타이드들 1 - 294; 서열 B935498의 뉴클레오타이드들 1 - 686; 서열 B935499의 뉴클레오타이드들 1 - 480; 서열 B935500의 뉴클레오타이드들 1 - 501; 서열 B935533의 뉴클레오타이드들 1 - 1299; 서열 B935534의 뉴클레오타이드들 1 - 918; 서열 B935535의 뉴클레오타이드들 1 - 1550; 서열 B935536의 뉴클레오타이드들 1 - 329; 서열 B935537의 뉴클레오타이드들 1 - 1826; 서열 B935538의 뉴클레오타이드들 1 - 536; 서열 B935539의 뉴클레오타이드들 1 - 551; 서열 B935540의 뉴클레오타이드들 1 - 672; 서열 B935541의 뉴클레오타이드들 1 - 616; 서열 B935542의 뉴클레오타이드들 1 - 471; 서열 B935543의 뉴클레오타이드들 1 - 707; 서열 B935544의 뉴클레오타이드들 1 - 741; 서열 B935545의 뉴클레오타이드들 1 - 346; 서열 B935546의 뉴클레오타이드들 1 - 867; 서열 B935547의 뉴클레오타이드들 1 - 563; 서열 B935812의 뉴클레오타이드들 1 - 970; 서열 B935913의 뉴클레오타이드들 1 - 1117; 서열 B935814의 뉴클레오타이드들 1 - 297; 서열 B935827의 뉴클레오타이드들 1 - 497; 서열 B935843의 뉴클레오타이드들 1 - 1267; 서열 B935844의 뉴클레오타이드들 1 - 586; 서열 B935845의 뉴클레오타이드들 1 - 741; 서열 B935846의 뉴클레오타이드들 1 - 251; 서열 B935847의 뉴클레오타이드들 1 - 681; 서열 B935848의 뉴클레오타이드들 1 - 580; 서열 B935880의 뉴클레오타이드들 1 - 534; 서열 B935889의 뉴클레오타이드들 1 - 387; 서열 B935890의 뉴클레오타이드들 1 - 561; 서열 B935891의 뉴클레오타이드들 1 - 335; 서열 B935892의 뉴클레오타이드들 1 - 613; 서열 B935893의 뉴클레오타이드들 1 - 177; 서열 B935894의 뉴클레오타이드들 1 - 285; 서열 B935921의 뉴클레오타이드들 1 - 3814; 서열 B935922의 뉴클레오타이드들 1 - 633; 서열 B935923의 뉴클레오타이드들 1 - 497; 서열 B935924의 뉴클레오타이드들 1 - 545; 서열 B935950의 뉴클레오타이드들 1 - 413; 서열 B935951의 뉴클레오타이드들 1 - 413; 서열 B935962의 뉴클레오타이드들 1 - 334; 서열 B935963의 뉴클레오타이드들 1 - 582; 서열 B935964의 뉴클레오타이드들 1 - 416; 서열 B935990의 뉴클레오타이드들 1 - 3591; 서열 B935991의 뉴클레오타이드들 1 - 875; 서열 B935992의 뉴클레오타이드들 1 - 194; 서열 B936003의 뉴클레오타이드들 1 - 2074; 서열 B936004의 뉴클레오타이드들 1 - 1237; 서열 B936013의 뉴클레오타이드들 1 - 4050; 서열 B936014의 뉴클레오타이드들 1 - 1334; 서열 B936048의 뉴클레오타이드들 1 - 1235; 서열 B936049의 뉴클레오타이드들 1 - 17,964; 서열 B936050의 뉴클레오타이드들 1 - 50,003; 서열 B936051의 뉴클레오타이드들 1 - 486; 서열 B936052의 뉴클레오타이드들 1 - 494; 서열 B936053의 뉴클레오타이드들 1 - 1992; 서열 B936054의 뉴클레오타이드들 1 - 1767; 서열 B936059의 뉴클레오타이드들 1 - 1240; 서열 B936074의 뉴클레오타이드들 1 - 3016; 서열 B936075의 뉴클레오타이드들 1 - 1609; 서열 B936080의 뉴클레오타이드들 1 - 312; 서열 B936092의 뉴클레오타이드들 1 - 243; 서열 B936093의 뉴클레오타이드들 1 - 802; 서열 B936102의 뉴클레오타이드들 1 - 514; 서열 B936103의 뉴클레오타이드들 1 - 936; 서열 B936104의 뉴클레오타이드들 1 - 1075; 서열 B936110의 뉴클레오타이드들 1 - 823; 서열 B936116의 뉴클레오타이드들 1 - 979; 서열 B936123의 뉴클레오타이드들 1 - 979; 서열 B936128의 뉴클레오타이드들 1 - 288; 서열 B936137의 뉴클레오타이드들 1 - 437; 서열 B936138의 뉴클레오타이드들 1 - 278; 서열 B936139의 뉴클레오타이드들 1 - 436; 서열 B936140의 뉴클레오타이드들 1 - 1140; 서열 B936146의 뉴클레오타이드들 1 - 2082; 서열 B936151의 뉴클레오타이드들 1 - 380; 서열 B936157의 뉴클레오타이드들 1 - 742; 서열 B936165의 뉴클레오타이드들 1 - 4246; 서열 B936408의 뉴클레오타이드들 1 - 1028; 서열 B936409의 뉴클레오타이드들 1 - 429; 서열 B936410의 뉴클레오타이드들 1 - 508; 서열 B936411의 뉴클레오타이드들 1 - 593; 서열 B936412의 뉴클레오타이드들 1 - 373; 서열 B936413의 뉴클레오타이드들 1 - 1713; 서열 B936414의 뉴클레오타이드들 1 - 660; 서열 B936415의 뉴클레오타이드들 1 - 589; 서열 B936416의 뉴클레오타이드들 1 - 726; 서열 B936417의 뉴클레오타이드들 1 - 320; 서열 B936418의 뉴클레오타이드들 1 - 616; 서열 B936419의 뉴클레오타이드들 1 - 492; 서열 B936420의 뉴클레오타이드들 1 - 428; 서열 B936421의 뉴클레오타이드들 1 - 4041; 서열 B936422의 뉴클레오타이드들 1 - 705; 서열 B936423의 뉴클레오타이드들 1 - 2714; 서열 B936424의 뉴클레오타이드들 1 - 1757; 서열 B936425의 뉴클레오타이드들 1 - 3647; 서열 B936426의 뉴클레오타이드들 1 - 354; 서열 B936427의 뉴클레오타이드들 1 - 2145, 서열 B936428의 뉴클레오타이드들 1 - 606; 서열 B936429의 뉴클레오타이드들 1 - 480; 서열 B936430의 뉴클레오타이드들 1 - 3026; 서열 B936431의 뉴클레오타이드들 1 - 1512; 서열 B936432의 뉴클레오타이드들 1 - 3774; 및 서열 B936433의 뉴클레오타이드들 1 - 589. 본 명세서에 설명된 올리고뉴클레오타이드들, 또는 이들을 설계 또는 합성하는 방법들의 구현예들 중 일부에서, 올리고뉴클레오타이드들은 유전자 발현을 상향조절할 것이며, 단백질 코딩 참조유전자와 같은 가닥으로부터 전사된 PRC2 결합 RNA에 대하여 특이적으로 결합하거나, 특이적으로 혼성화되거나, 또는 상보적일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 참조 유전자(refGene)의 단백질 코딩 센스 가닥의 인트론, 엑손, 인트론 엑손 접합부, 5’UTR, 3’UTR, 해독개시 영역, 또는 해독종결 영역내에서 유래되거나 중첩되는 PRC2 결합 RNA의 영역에 결합할 수 있다.
본 명세서에 설명된 올리고뉴클레오타이드들, 또는 이들을 설계 또는 합성하는 방법들의 구현예들 중 일부에서, 올리고뉴클레오타이드들은 유전자 발현을 상향조절할 것이며, 단백질 코딩 참조유전자의 반대 가닥(안티센스 가닥)으로부터 전사된 PRC2 결합 RNA에 대하여 특이적으로 결합하거나, 특이적으로 혼성화되거나, 또는 상보적일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 참조 유전자의 단백질 코딩 안티센스 가닥의 인트론, 엑손, 인트론 엑손 접합부, 5’UTR, 3’UTR, 해독개시 영역, 또는 해독종결 영역내에서 유래되거나 중첩되는 PRC2 결합 RNA의 영역에 결합할 수 있다.
본 명세서에 설명된 올리고뉴클레오타이드는 변형될 수 있는데, 예를 들면, 변형된 당부분, 변형된 뉴클레오타이드간 결합, 변형된 뉴클레오타이드 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 그리고, 올리고뉴클레오타이드는 하기 특성들을 1개 이상 나타낼 수 있다: 표적 RNA의 실질적인 제거 또는 분해를 유도하지 않는 특성; 표적 RNA를 실질적으로 완전히 제거하지 않거나, 분해하지 않는 특성; RNA아제 H 경로를 활성화하지 않는 특성; RISC를 활성화하지 않는 특성; 아르고너트(Agronaute)과 단백질을 모집하지 않는 특성; Dicer에 의해 제거되지 않는 특성; 교대 스플라이싱을 매개하지 않는 특성; 면역 자극적이지 않는 특성; 뉴클레아제 내성인 특성; 변형되지 않은 올리고뉴클레오타이드들에 비해 개선된 세포 흡수를 갖는 특성; 세포들 또는 포유동물들에 대하여 독성이 아닌 특성; 개선된 엔도솜 출구를 가질 수 있는 특성; lncRNA와 PRC2, 바람직하게는 Ezh2 서브유닛, 선택적으로 Suz12, Eed, RbAp46/48 서브유닛 또는 Jarid2와 같은 보조인자들과의 상호작용을 방해하지 않는 특성; 히스톤 H3 라이신27 메틸화를 감소시키는 특성 및/또는 유전자 발현을 상향조절하는 특성.
본 명세서에 설명된 올리고뉴클레오타이드들, 또는 이들을 설계 또는 합성하는 방법들의 구현예들 중 일부에서, 올리고뉴클레오타이드들은 Kuwabara et al., US 2005/0226848 또는 Li et al., US 2010/0210707 또는 Corey et al., 7,709,456 또는 Mattick et al., WO 2009/124341에 설명된, 프로모터 영역의 DNA와 결합하는 것들, 또는 Corey et al., US 2010/0273863에 설명된, 3’UTR 영역의 DNA와 결합하는 것들을 선택적으로 배제할 수 있다.
유전자 발현을 조절하기 위해 RNA와 상호작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드들은 DNA 표적과 결합하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드들로부터의 염기 서열들의 구별된 서브셋이다(예를 들면, RNA가 전사되는 기본적인 게놈 DNA 서열에 대하여 상보적임)
유전자 발현을 조절하는 방법
다른 측면에서, 본 발명은 유전자 치료 또는 에피제네틱 치료를 위한 세포, 예를 들면 암세포, 줄기세포, 또는 다른 정상세포 타입들에 있어서 유전자 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다. 세포들은 시험관내, 생체외, 또는 생체내(종양과 같은 암을 가진 개체에) 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포에서 유전자 발현을 조절하는 방법은, 본원에 기술된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 전달하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 세포에 전달하는 경우, 유전자의 발현 수준은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 전달되지 않은 대조군 세포에서의 유전자 발현 수준보다 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 또는 그 이상 높게 된다. 소정의 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 세포에 전달하는 경우, 유전자의 발현 수준은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 전달되지 않은 대조군 세포에서의 유전자 발현 수준보다 50% 이상 높게 된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 방법은, 본원에 기술되는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 개체(예를 들어, 인간)에게 투여하여 개체에서 단백질 수준을 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 수준의 증가는 투여 전에 개체에서 측정되는 단백질의 양보다 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 또는 그 이상 더 높다.
다른 예로서, 세포내 종양 억제물질의 발현을 증가시키기 위해, 방법들은 표적 유전자(예를 들면, 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에 개시된 종양 억제물질, 표 2의 각인된 유전자, 및/또는 국제특허출원 공보 WO/2012/087983 표 2의 다른 성장-억제 유전자들(예를 들면, 폐선암 환자와 같은 암을 갖는 개체들의 Nkx2-1 또는 Titf-1))를 둘러싸거나 또는 부근에 있는 게놈 위치로 맵핑하는(예를 들면, 긴 비-코딩 RNA의) PRC2-연관 영역에 대하여 충분히 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 세포에 도입하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 개체내 특정 유전자의 발현 수준의 감소와 관련된 질병(예를 들면, 암)을 치료하는 방법, 본 명세서에 기술된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
개체는 비-인간 포유동물, 예를 들면 마우스, 쥐, 기니어 피그, 토끼, 고양이, 개, 염소, 소 또는 말을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 설명된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 특정 암들은 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 3에 열거되어 있으며, 예를 들면 유방암, 폐암, 전립선암, CNS(예를 들면, 신경교종), 타액선, 전립선암, 난소암 및 백혈병(예를 들면, ALL, CML, 또는 AML)을 포함하며, 여기에 국한되지 않는다. 특정 암과 상기 유전자들의 연합들은 당 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 Futreal et al., Nat Rev Cancer. 2004;4;177-83(예를 들면, 표 1을 참조, 여기에 참조문헌으로 포함됨); 및 The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) 데이터베이스 및 웹사이트, Bamford et al., Br J Cancer. 2004;91;355-8에 설명되어 있으며, 또한 Forbes et al., Curr Protoc Hum Genet. 2008; Chapter 10;Unit 10.11, 및 the COSMIC database, e.g., v.50 (2010년 11월 30일)를 참조한다. 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 3에서 특정 종류의 암에 대한 참조는 다른 종류의 암, 즉 일반적인 암을 갖는 환자들이 치료될 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다.
게다가, 본 명세서에 설명된 방법들은 줄기 세포의 전분화능을 조절(예를 들면, 개선 또는 감소)하기 위해, 및 내배엽, 중배엽, 외배엽, 및 이들의 발달상 파생물들을 형성하기 위한 특정 분화 경로들로 줄기 세포들을 보내기 위해 사용될 수 있다. 전분화능을 증가, 유지 또는 개선하기 위해, 상기 방법들은 (본 명세서에 개시된 특정의 긴 비-코딩 RNA의) 핵산의 PRC2-연관 영역에 특이적으로 결합하거나, 또는 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 설명된 방법들에 사용될 수 있는 줄기세포들은 성인 줄기 세포들(예를 들면, 개체, 예를 들면 치료받는 개체의 내이, 골수, 간엽, 피부, 지방, 간, 근육 또는 혈액); 배아 줄기세포들 또는 태반 및 탯줄로부터 얻은 줄기세포들; 간세포들(예를 들면, 내이, 골수, 간엽, 피부, 지방, 간, 근육 또는 혈액으로부터 유도된 간세포들); 및 유도된 전분화능 줄기세포들(예를 들면, iPS 세포들)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법들은(예를 들면, 서열 A1 내지 A193,049, B1 내지 B916,209, 및 B916,626 내지 B934,931에 개시된 것과 같은 본 명세서에 기술된 lncRNA의) 핵산의 PRC2-연관 영역에 대하여 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물, 예를 들면 멸균 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 1개 이상의 변형된 뉴클레오타이드들(예를 들면, 잠긴 핵산(LNA) 분자)를 포함한다.
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 인간을 비롯한 동물에서 질환의 상태를 치료하기 위해 치료적 모이어티로서 사용된다. 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 세포, 조직 및 동물, 특히 인간을 치료하기 위한 치료 계획에 유용하도록 구성될 수 있는 유용한 치료적 요법(therapeutic modalities)일 수 있다.
치료를 위해, 암을 앓는 것으로 의심되는 동물, 바람직하게는, 인간은 본 발명에 따른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 투여함으로써 치료된다. 예를 들어, 하나의 비-제한적인 구현예에서, 본 방법은 치료가 필요한 동물에게 본원에 기술되는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
제형, 전달 및 투여
본 명세서에 설명된 올리고뉴클레오타이드는 개체에 투여하기 위해 배합될 수 있다. 제형, 조성물 및 방법들은 본 명세서에 설명된 특정 올리고뉴클레오타이드들에 의해 실시될 수 있음을 이해해야 한다.
제형은 단위 투약 형태로 편리하게 제시될 수 있으며, 약학 분야에 잘 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 운반체 물질과 조합되어 단일 투약 형태를 생성할 수 있는 활성 성분(예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 화합물)의 양은 치료되는 숙주, 특정 투여 방식, 예를 들어 피내 또는 흡입에 따라 다양할 것이다. 운반체 물질과 조합되어 단일 투약 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로, 종양 억제와 같은 치료 효과를 낳는 화합물의 양일 것이다.
본 발명의 약제학적 제형은 제약 제조 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있다. 이러한 제형은 감미제, 풍미제, 착색제 및 보존제를 포함할 수 있다. 제형은 제조에 적절한 무독성의 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 혼합될 수 있다. 제형은 1종 이상의 희석제, 유화제, 보존제, 완충제, 부형제 등을 포함할 수 있으며, 액체, 분말, 에멀젼, 동결건조된 분말, 스프레이, 크림, 로션, 조절된 방출 제형, 정제, 알약, 젤, 패치, 임플란트 등과 같은 형태로 제공될 수 있다.
제형화된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 조성물은 다양한 상태를 취할 수 있다. 일부 예에서, 조성물은 적어도 부분적으로 결정질, 일정하게 결정질, 및/또는 무수성(예를 들어, 물의 함량이 80%, 50%, 30%, 20%, 또는 10% 미만임)이다. 또 다른 예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 수성상, 예를 들어 물을 포함하는 용액에 존재한다. 수성상 또는 결정질 조성물은 예를 들어, 전달 비히클, 예를 들어, 리포좀 (특히 수성상용 리포좀) 또는 입자(예를 들어, 결정질 조성물에 적절할 수 있는 마이크로입자) 내로 혼입될 수 있다. 일반적으로, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 조성물은 의도하는 투여 방법과 상용성인 방식으로 제형화된다.
일부 구현예에서, 조성물은 분무 건조, 동결건조, 진공 건조, 증발, 유동층 건조, 또는 이들 기술의 조합; 또는 지질을 이용한 소니케이션, 동결-건조, 축합 및 기타 자가조립 중 하나 이상에 의해 제조된다.
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 조제물은 또 다른 제제, 예를 들어, 또 다른 치료제, 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 안정화하는 제제, 예를 들어, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드와 복합체를 이루는 단백질과 조합되어 (함께 또는 개별적으로) 제형화되거나 또는 투여될 수 있다. 보다 다른 제제로는, 킬레이터, 예를 들어,(예를 들어, Mg2+와 같은 이가 양이온을 제거하기 위한) EDTA, 염, RNAse 저해제(예를 들어, RNAsin과 같은 광범위한 특이성의 RNAse 저해제) 등을 포함한다.
일 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 조제물은 또 다른 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 제2 유전자의 발현 및/또는 mRNA 가공을 조절하는 제2 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드, 또는 제1 유전자의 발현을 조절하는 제2 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 보다 다른 조제물은 상이한 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 화학종을 3, 5, 10, 20, 50 또는 100가지 이상으로 포함할 수 있다. 이러한 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 유사한 수의 서로 다른 유전자에 대해 유전자 발현을 매개할 수 있다.
일 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 조제물은 적어도 제2의 치료제(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드가 아닌 제제)를 포함한다. 예를 들면, 암을 치료하기 위한 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 조성물은 화학요법제를 추가로 포함한다.
전달경로
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 다양한 경로들을 통해 개체에게 전달될 수 있다. 경로의 예로는 정맥내, 피내, 국소, 직장, 비경구, 항문, 질내, 비강내, 폐, 안구가 포함된다.
본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 분자는 투여에 적절한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 전형적으로 1종 이상의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 화학종 및 약학적으로 허용가능한 운반체를 포함한다. 본원에서, "약학적으로 허용가능한 운반체"란, 약제학적 투여에 상용성인, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항균제, 등장성제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 매질 및 약제학적 활성 성분용 제제의 사용은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비융화성것을 제외하는 한, 조성물에서의 이의 용도가 고려된다. 보조적인 활성 화합물 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은, 국소 또는 전신 치료가 바람직한지 그리고 치료 영역에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소 (안내, 질내, 직장내, 비내, 경피), 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여로는, 정맥내 드립(drip), 피하, 복강내 또는 근육내 주사, 또는 척추강내 또는 뇌실내 투여를 포함한다.
투여 경로 및 부위는 표적화를 증가시키도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 근육 세포를 표적화하기 위해, 관심 근육으로의 근육내 주사는 타당한 선택일 것이다. 폐세포는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 에어로졸 형태로 투여함으로써 표적화될 것이다. 혈관 내피 세포는 벌룬 카테터를 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드로 코팅하는 단계, 및 올리고뉴클레오타이드를 기계적으로 도입하는 단계에 의해, 표적화될 수 있다.
국소 전달
국소 투여는 제형을 개체의 표면에 직접 접촉시킴으로써 개체에게 전달되는 것을 지칭한다. 국소 전달의 가장 보편적인 형태는 피부에의 전달이지만, 본원에 개시되는 조성물은 신체의 다른 표면, 예를 들어, 눈, 점막, 체강 표면 또는 내부 표면에 직접 적용될 수도 있다. 전술한 바와 같이, 가장 보편적인 국소 전달은 피부에의 전달이다. 용어는 국소 및 경피를 포함하지만 이들로 한정되지 않는, 몇몇의 투여 경로를 포함한다. 이들 투여 방식은 전형적으로, 피부의 투과성 벽의 침투, 및 표적 조직 또는 층(stratum)으로의 효율적인 전달을 포함한다. 국소 투여는, 상피 및 진피를 투과하고 궁극적으로는 조성물의 전달을 달성하는 수단으로서 사용될 수 있다. 국소 투여는 또한, 올리고뉴클레오타이드를 개체의 상피 또는 진피, 이의 특정 층, 또는 기저(underlying) 조직에 선택적으로 전달하는 수단으로서 사용될 수도 있다.
국소 투여용 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 점적액, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 운반체, 수성, 분말 또는 유성 베이스(base), 증점제 등은 필수적이거나 또는 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔, 글로브 등이 또한 유용할 수 있다.
경피 전달은 지용성 치료제의 투여에 유용한 경로이다. 진피는 상피보다 투과성이므로, 흡수는 찰과상을 입은 피부, 화상 피부 또는 벗겨진 피부를 통해 훨씬 더 신속하다. 피부로의 혈류를 증가시키는 염증 및 기타 생리학적 병태 또한 경피 흡수를 증가시킨다. 이러한 경로를 통한 흡수는 유성 비히클의 사용 (도유(inunction))에 의해 또는 1종 이상의 투과 증가제의 사용을 통해 증가될 수 있다. 본원에 개시되는 조성물을 경피 투여를 통해 전달하는 다른 효과적인 방식은 피부의 수화(hydration) 및 조절 방출성 국소 패치의 사용을 포함한다. 경피 경로는 전신 및/또는 국소 치료를 위해 본원에 개시되는 조성물을 전달하는 데 잠재적으로 효과적인 수단을 제공한다. 또한, 이온토포레시스(iontophoresis) (전기장의 영향 하에 생물학적 막을 통해 이온성 용질의 전달), 포노포레시스(phonophoresis) 또는 소노포레시스(sonophoresis) (생물학적 막, 특히 피부 및 각막을 가로질러 다양한 치료제의 흡수를 증가시키기 위한 초음파의 사용), 및 투약 위치 및 투여 부위에서의 체류에 대한 비히클 특징의 최적화는, 국소 적용된 조성물을 피부 및 점막 부위를 가로질러 수송하는 것을 증가시키는 데 유용한 방법일 수 있다.
경구 또는 비경구 전달
경구막 및 비경구 막은 둘 다 다른 투여 경로를 능가하는 이점을 제공한다. 예를 들어, 이들 막을 통해 투여되는 올리고뉴클레오타이드는 신속한 작용 개시를 가지며, 치료적 혈장 수준을 제공하며, 간 대사의 제1 통과 효과(pass effect)를 피하고, 올리고뉴클레오타이드가 적대적인 위장관(GI) 환경에 노출되는 것을 피할 수 있다. 부가적인 이점으로는 막 부위로의 용이한 접근을 포함하며, 따라서 올리고뉴클레오타이드는 적용되어 국소화된 다음 용이하게 제거될 수 있다.
경구 전달에서, 조성물은 구강 표면, 예를 들어 혀의 앞면 및 입 바닥의 막을 포함하는 설하 점막 또는 뺨의 라이닝(lining)을 구성하는 볼 점막으로 표적화될 수 있다. 설하 점막은 상대적으로 투과성이어서, 많은 제제의 신속한 흡수 및 허용가능한 생체이용률을 제공한다. 추가로, 설하 점막은 편리하며 허용가능하며 용이하게 접근가능하다.
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 약제학적 조성물은 또한, 계량된 투약 분무 디스펜서(dispenser), 전술한 혼합된 미셀형(micellar) 약제학적 제형 및 추진제로부터 흡입 없이 구강으로 분무함으로써 인간의 구강에 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 디스펜서를 먼저 흔든 다음, 약제학적 제형 및 추진제를 구강(buccal cavity)에 분무한다.
경구 투여용 조성물은 분말 또는 과립, 현탁액 또는 수용액, 시럽, 슬러리, 에멀젼, 엘릭셔(elixir) 또는 비-수성 매질, 정제, 캡슐, 로젠지(lozenge), 또는 트로키(troche)를 포함한다. 정제의 경우, 사용될 수 있는 운반체로는, 락토스, 소듐 시트레이트 및 인산의 염을 포함한다. 전분과 같은 다양한 붕괴제, 및 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트 및 탈크와 같은 윤활제가 정제에 보편적으로 사용된다. 캡슐 형태로 경구 투여하기 위해, 유용한 희석제는 락토스 및 고 분자량 폴리에틸렌 글리콜이다. 수성 현탁액이 경구용으로 필요한 경우, 핵산 조성물은 유화제 및 현탁화제와 조합될 수 있다. 바람직한 경우, 소정의 감미제 및/또는 풍미제가 첨가될 수 있다.
비경구 전달
비경구 투여로는, 정맥내 드립, 피하, 복강내 또는 근육내 주사, 척추강내 또는 뇌실내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 비경구 투여는 질환 부위로 직접 투여하는 것(예를 들어, 종양으로의 주사)를 포함한다.
비경구 투여용 제형은 완충제, 희석제 및 기타 적절한 첨가제를 포함할 수도 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다. 뇌실내 주사는 예를 들어, 레저보어(reservoir)에 부착된 뇌실내 카테터에 의해 촉진될 수 있다. 정맥내 용도의 경우, 용질의 총 농도는 조제물을 등장성으로 유지시키도록 조절되어야 한다.
안구 전달
본원에 기술되는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 중 임의의 것은 눈(ocular) 조직에 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 눈 또는 근접한 조직의 표면, 예를 들어 눈꺼풀 안쪽에 적용될 수 있다. 안내 투여의 경우, 연고 또는 점적액은 어플리케이터(applicator) 또는 점안 기구(eye dropper)와 같은 당해 기술분야에 공지된 안내 전달 시스템에 의해 전달될 수 있다. 이러한 조성물은 뮤코미메틱(mucomimetic), 예컨대 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 또는 폴리(비닐 알코올), 보존제, 예컨대 소르브산, EDTA 또는 벤질크로늄 클로라이드, 및 통상적으로 사용되는 양의 희석제 및/또는 운반체를 포함할 수 있다. 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 눈 안에 투여될 수도 있으며, 선택된 영역 또는 구조에 이를 도입할 수 있는 바늘 또는 기타 전달 기구에 의해 도입될 수 있다.
폐내 전달
폐내 전달 조성물은 환자가 분산액을 흡입함으로써 전달될 수 있으며, 조성물, 바람직하게는 분산액 내의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 폐에 도달하여 폐포 영역을 통해 쉽게 흡수되어 혈액 순환으로 직접 들어갈 수 있다. 폐내 전달은 폐질환의 치료를 위한 전신 전달 및 국소 전달 모두에 효과적일 수 있다.
폐내 전달은 네불라이즈화된(nebulized), 에어로졸화된(aerosolized), 미셀형 및 건조 분말계 제형을 사용하는 것을 비롯하여 여러 가지 방법으로 달성될 수 있다. 전달은 액체 네불라이저, 에어로졸계 흡입기, 및 건조 분말 분산액 기구로 달성될 수 있다. 계량된-투약 기구가 바람직하다. 애토마이저(atomizer) 또는 흡입기를 사용하는 이점들 중 하나는, 기구가 자가-함유되어 있으므로 오염 가능성이 최소화된다는 점이다. 건조 분말 분산액 기구, 예를 들어, 전달 제제는 건조 분말로서 쉽게 제형화될 수 있다. 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 조성물은 그 자체로 또는 적절한 분말 운반체와 조합되어, 동결건조되거나 또는 분무-건조된 분말로서 안정하게 보관될 수 있다. 흡입용 조성물의 전달은, 기구에 혼입되는 경우 투약 추적, 순응도(compliance) 모니터링, 및/또는 에어로졸 의약의 투여 동안 환자로의 투약 트리거링(triggering)을 가능하게 하는, 타이머, 투약 계수기, 시간 측정 기구, 또는 시간 인디케이터(indicator)를 포함할 수 있는 투약 타이밍 요소(dosing timing element)에 의해 매개될 수 있다.
용어 "분말"은, 자유 유동하며 흡입 기구에 쉽게 분산될 수 있으며 후속해서 개체에 의해 흡입되어, 입자가 폐에 도달하여 폐포로 투과될 수 있는, 미세하게 분산된 고체 입자로 이루어진 조성물을 의미한다. 따라서, 분말은 "호흡가능한(respirable)" 것으로도 일컬어진다. 바람직하게는, 평균 입자 크기는 직경이 약 10 ㎛ 미만이며, 바람직하게는, 상대적으로 균일한 타원체 모양 분포를 가진다. 보다 바람직하게는, 직경은 약 7.5 ㎛ 미만이며 가장 바람직하게는 약 5.0 ㎛ 미만이다. 통상 입자 크기 분포는 직경이 약 0.1 ㎛ 내지 약 5 ㎛, 특히 약 0.3 ㎛ 내지 약 5 ㎛ 미만이다.
용어 "건조"는, 조성물의 수분 함량이 물 약 10 중량% (% w) 미만, 통상 약 5% w 미만, 바람직하게는 약 3% w 미만임을 의미한다. 건조 조성물은 입자가 흡입 기구에서 쉽게 분산가능하여 에어로졸을 형성하는 것일 수 있다.
용어 “치료적으로 효과적인 양”은 기대되는 생리반응을 제공하기 위해 치료받는 개체의 원하는 수준의 표적 유전자 발현을 제공하기 위해 필요한 조성물내에 존재하는 올리고뉴클레오타이드의 양이다. 용어 “생리학적으로 효과적인 양”은 원하는 완화 또는 치료 효과를 제공하기 위해 개체에게 전달되는 양이다. 용어 “약제학적으로 허용가능한 운반체”는 운반체가 폐에 상당한 독물학적 부작용이 없이 폐에 흡수될 수 있는 것을 지칭한다.
운반체로서 유용한 약제학적 부형제의 유형은 인간 혈청 알부민 (HSA)과 같은 안정화제, 벌킹제(bulking agent) 예컨대 카르보하이드레이트, 아미노산 및 폴리펩타이드; pH 조절제 또는 완충제; 염, 예컨대 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 이들 운반체는 결정질 또는 비정질 형태로 존재할 수 있거나 또는 이들 두가지의 혼합물일 수 있다.
적절한 pH 조절제 또는 완충제로는, 유기 산 및 유기 염으로부터 제조되는 유기 염, 예컨대 소듐 시트레이트, 소듐 아스코르베이트 등을 포함하며; 소듐 시트레이트가 바람직하다. 미셀형 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 제형의 폐내 투여는 추진제, 예컨대 테트라플루오로에탄, 헵타플루오로에탄, 다이메틸플루오로프로판, 테트라플루오로프로판, 부탄, 이소부탄, 다이메틸 에테르 및 기타 비-CFC 및 CFC 추진제를 이용하여, 계량된 투약 분무 기구를 통해 달성될 수 있다.
기구 및 이식기구
예시적인 기구로는, 맥관 구조에 도입되는 기구, 예를 들어, 혈관 조직의 루멘(lumen)에 삽입되는 기구, 또는 스텐트, 카테터, 하트 밸브, 및 기타 혈관 기구를 비롯하여 그 자체가 맥관 구조의 일부를 형성하는 기구를 포함한다. 카테터 또는 스텐트와 같은 이들 기구는 폐, 심장 또는 다리의 맥관 구조에 위치할 수 있다.
다른 기구로는 비-혈관 기구, 예를 들어, 복막, 또는 기관 또는 샘 조직, 예를 들어 인공 기관에 이식되는 기구를 포함한다. 기구는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 외에도 치료 성분을 방출할 수 있는데, 예를 들어, 기구는 인슐린을 방출할 수 있다.
일 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물의 단위 투약 또는 측정된 투약은 이식된 기구에 의해 분배된다. 기구는 개체 내에서 파라미터를 모니터링하는 센서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기구는 예를 들어 펌프와, 선택적으로는 관련 전자 기구를 포함할 수 있다.
세포 또는 기관과 같은 조직은 생체 외에서 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드로 처리된 다음 개체에 투여되거나 또는 이식될 수 있다. 조직은 자가 조직, 동종 이계(allogeneic) 조직, 또는 이종(xenogeneic) 조직일 수 있다. 예를 들어, 조직은 숙주편대질환을 저하하도록 처리될 수 있다. 다른 구현예에서, 조직은 동종 이계이며, 조직은 해당 조직에서 바람직하지 못한 유전자 발현을 특징으로 하는 장애를 치료하도록 처리된다. 예를 들어, 골수 조혈모세포와 같은 조혈모세포와 같은 조직은 바람직하지 못한 세포 증식을 저해하도록 처리될 수 있다. 자가 조직 또는 이식 조직이든간에 처리된 조직의 도입은 다른 치료법과 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드로 처리된 세포는, 예를 들어 세포가 이식물로부터 방출되는 것은 방지하지만 체내 분자들이 세포에 도달하고 세포에 의해 생성되는 분자들이 체내로 들어가게 하는 반-투과성 다공성 장벽에 의해, 다른 세포로부터 분리된다. 일 구현예에서, 다공성 장벽은 알기네이트로부터 형성된다.
일 구현예에서, 피임 기구는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드로 코팅되거나 또는 이를 포함한다. 예시적인 기구로는 콘돔, 페서리(diaphragm), IUD (이식형 자궁 기구), 스폰지, 질 시스(vaginal sheath), 및 산아 제한 기구를 포함한다.
투약량
일 측면에서, 본 발명은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 화합물 또는 조성물의 성분으로서)를 개체(예를 들어, 인간 개체)에게 투여하는 방법을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 화합물(예를 들어, 본원에 개시되는 식 A-B-C의 화합물, 또는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드)을 단위 투약량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 단위 투약량은 체중 kg 당 약 10 mg 내지 25 mg이다. 일 구현예에서, 단위 투약량은 체중 kg 당 약 1 mg 내지 100 mg이다. 일 구현예에서, 단위 투약량은 체중 kg 당 약 0.1 mg 내지 500 mg이다. 일부 구현예에서, 단위 투약량은 체중 kg 당 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 25, 50 또는 100 mg 초과이다.
규정된 양은 질환 또는 장애, 예를 들어 SMN1 또는 SMN2와 연관된 질환 또는 장채를 치료하거나 또는 예방하기에 효과적인 양일 수 있다. 단위 투약량은 예를 들어, 주사(예를 들어, 정맥내 또는 근육내 주사), 흡입된 투약, 또는 국소 적용에 의해 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 단위 투약량은 매일 투여된다. 일부 구현예에서, 1일 1회 미만, 예를 들어 2일, 4일, 8일 또는 30일마다 1회 미만이다. 또 다른 구현예에서, 단위 투약량은 빈도로 투여되지 않는다(예를 들어, 정기적인 빈도로 투여되지 않음). 예를 들어, 단위 투약량은 1회 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 단위 투약량은 1일 1회 초과, 예를 들어, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간에 1회 등으로 투여된다.
일 구현예에서, 개체는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 초기 투약량으로 투여된 다음 1회 이상의 유지 투약량으로 투여된다. 유지 투약량 또는 투약량들은 일반적으로 초기 투약량보다 낮은데, 예를 들어 초기 투약량의 절반 미만이다. 유지 계획은 개체를 0.0001 내지 100 mg/체중 kg/day, 예를 들어, 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 또는 0.0001 mg/체중 kg/day 범위의 투약량 또는 투약량들로 치료하는 것을 포함할 수 있다. 유지 투약량은 1, 5, 10 또는 30일에 1회 이하로 투여될 수 있다. 추가로, 치료 계획은 특정 질환의 성질, 이의 중증도 및 환자의 전반적인 상태에 따라 다양할 기간 동안 지속될 수 있다. 일부 구현예에서, 투약량은 1일 1회 이하, 예를 들어 24, 36, 48, 또는 그 이상 시간 당 1회 이하, 예를 들어 5일 또는 8일마다 1회 이하로 전달될 수 있다. 치료 후, 환자는 이의 병태 변화 및 질환 상태의 증상의 완화에 대해 모니터링될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드의 투약량은 환자가 현재의 투약량 수준에 유의하게 반응하지 않는 경우 증가될 수 있거나, 또는 질환 상태의 증상이 완화되는 것으로 관찰되는 경우, 질환 상태가 소멸된 경우, 또는 바람직하지 못한 부작용이 관찰된 경우, 투약량은 감소될 수 있다.
유효 투약량은 특정 조건 하에 바람직하거나 적절한 것으로 간주되는 대로, 단일 투약량 또는 2회 이상의 투약량으로 투여될 수 있다. 반복되거나 또는 빈번한 주입을 촉진하는데 바람직한 경우, 펌프, 반-투과성 스텐트(예를 들어, 정맥내, 복강내, 낭내(intracisternal) 또는 캡슐내(intracapsular)), 또는 레저보어와 같은 전달 기구의 이식이 권고될 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 약제학적 조성물은 복수의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 화학종을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 화학종은, 자연적으로 존재하는 표적 서열(예를 들어, PRC2-연관 영역)에 대해 또 다른 화학종에 비-중복적이며 비-인접한 서열을 가진다. 또 다른 구현예에서, 복수의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 화학종은 상이한 PRC2-연관 영역에 특이적이다. 또 다른 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 대립 형질(allele) 특이적이다.
일부 경우, 환자는 다른 치료적 요법과 병용된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드로 치료된다. 예를 들면, 암 치료받는 환자는 화학요법과 함께 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 투여받을 수 있다.
성공적인 치료 후, 질환 상태의 재발을 예방하기 위해 환자는 유지 치료법을 받는 것이 바람직할 수 있으며, 여기서, 본 발명의 화합물은 체중 kg 당 0.0001 mg 내지 100 mg의 유지 투약량으로 투여된다.
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 조성물의 농도는 인간에서 장애를 치료하거나 또는 예방하는 데 효과적이거나 또는 생리학적 상태를 조절하는 데 효과적으로 충분한 양이다. 투여되는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 농도 또는 양은 제제, 및 비내, 볼내, 폐내와 같은 투여 방법에 대해 결정된 파라미터에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 비내 제형은 일부 성분의 경우 비내 통과 시 자극 또는 화상을 피하기 위해 훨씬 더 낮은 농도를 필요로 하는 경향이 있을 수 있다. 때로는, 적절한 비내 제형을 제공하기 위해 경구 제형을 10-100배 이하 희석하는 것이 바람직하다.
소정의 인자들은 개체를 효과적으로 치료하는 데 필요한 투약량에 영향을 미칠 수 있는데, 이로는 질환 또는 장애의 중증도, 이전이 치료, 개체의 일반적인 건강상태 및/또는 연령, 및 존재하는 기타 질환을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 더욱이, 치료적 유효량의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드로 개체를 치료하는 것은 단일 치료를 포함할 수 있거나, 바람직하게는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 또한, 치료에 사용되는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 유효 투약량은 특정 질환의 경로 동안 증가되거나 또는 감소될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 개체는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 조성물을 투여한 후 모니터링될 수 있다. 모니터링한 정보를 토대로, 부가적인 양의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 조성물이 투여될 수 있다.
투약은 치료되는 질환 병태의 중증도 및 반응성에 따라 다르며, 치료 기간은 수일 내지 수개월 동안 지속되거나, 또는 치료 효과가 나타나거나 또는 질환의 상태가 감소될 때까지 지속된다. 최적의 투약 스케쥴은 환자의 신체에서 SMN1 또는 SMN2 발현 수준을 측정한 것으로부터 계산될 수 있다. 당업자는 최적의 투약량, 투약 방법론 및 반복수를 쉽게 결정할 수 있다. 최적의 투약량은 개별 화합물의 상대적인 효능(potency)에 따라 다양할 수 있으며, 일반적으로 시험관 내 및 생체 내 동물 모델에서 효과적인 것으로 확인된 EC50을 토대로 추정될 수 있다. 일부 구현예에서, 동물 모델은 인간 표적 유전자를 발현하는 트랜스제닉 동물을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 시험용 조성물은, 동물 모델내 표적 유전자와 인간내 표적 유전자 사이에 보존된 서열에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 적어도 내부 영역에서 포함한다.
일 구현예에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 조성물의 투여는 비경구로서, 예를 들어 정맥내(예를 들어, 볼루스(bolus) 또는 확산성 주입으로서), 피내, 복강내, 근육내, 척추강내, 뇌실내, 두개내, 피하, 경점막, 볼측, 설하, 내시경(endoscopic), 직장내, 경구, 질내, 국소, 폐내, 비내, 요도내 또는 안내 투여이다. 투여는 개체, 또는 헬스 케어 제공자와 같은 다른 사람에 의해 제공될 수 있다. 조성물은 측정된 투약량, 또는 계량된 투약량을 전달하는 디스펜서에서 제공될 수 있다. 선택된 전달 방식은 보다 상세히 후술한다.
키트
본 발명의 소정의 측면에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 담는 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 운반체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물의 개별 성분들은 하나의 용기에 제공될 수 있다. 다른 예로, 약제학적 조성물의 성분들을 2개 이상의 용기에 개별적으로, 예를 들어, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드용의 하나의 용기, 및 운반체 화합물용의 적어도 또 다른 용기에 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 키트는 하나 이상의 용기를 단일 박스에 배열하는 것과 같이 다수의 상이한 배열로 포장될 수 있다. 상이한 성분들은 예를 들어, 키트와 함께 제공되는 지시사항에 따라 조합될 수 있다. 성분들은 본원에 기술되는 방법에 따라 조합되어, 예를 들어 약제학적 조성물을 제조하고 투여할 수 있다. 키트는 또한 전달 기구를 포함할 수도 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 어떤 식으로든 추가적인 제한으로 간주되어서는 안 된다. 본 출원 전체에서 언급되는 참조 문헌 (문헌 참조, 발행된 특허, 공개된 특허 출원, 및 계류중인 특허 출원 포함) 모두의 내용 전체는 원용에 의해 표현적으로 포함된다.
실시예
본 발명은 하기의 실시예에서 추가로 기술되며, 실시예는 청구항에 기술되는 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.
물질들 및 방법들
하기 물질들 및 방법들이 하기 실시예 1-7에서 사용되었다.
RIP-seq
RNA 면역침전은 107 야생형16.7 (Lee and Lu, 1999) 및 Ezh2-/- ES 세포들을 사용하여 실시하였다. RIP-seq 라이브러리들을 구조하기 위해, 세포핵을 분리하고, 핵 분리물을 제조하고, 400 U/ml DNAse로 처리하고, 및 항-Ezh2 항체들(Active Motif) 또는 대조군 IgG (Cell Signaling Technology)와 함께 배양하였다. RNA-단백질 복합체들을 단백질 A 아가로스 비드와 함께 면역침전반응시키고, 트리졸(Invitrogen)을 사용하여 RNA 추출하였다. 가닥 정보를 보호하기 위해, 라이브러리 구조에 주형 스위칭을 사용하였다. 슈퍼스크립트(Superscript) II 역전사 키트(Reverse Transcription Kit)(Invitrogen)를 사용한 제1-가닥 cDNA 합성을 위해, 20-150 ng RNA 및 Adaptor1 (5’-CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3’; SEQ ID NO: 1277)을 사용하였다. 슈퍼스크립트 II는 비-주형 CCC 3’ 오버행들을 첨가하며, 어댑터2-GGG 주형-스위치 프라이머(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGGG-3’; SEQ ID NO: 1278)로 혼성화하는데 사용하였다. 제1-가닥 cDNA 합성동안, 샘플들을 20℃에서 10분간, 37℃에서 10분간 및 42℃에서 45분간 어댑터와 함께 배양하였다. 그후, 변성된 주형 스위치 프라이머를 첨가하고, 각 튜브를 42℃에서 30분간, 75℃에서 15분간 배양하였다. 얻은 cDNA를 전방향(5’- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’; SEQ ID NO: 1279) 및 역방향(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT-3’; SEQ ID NO: 1280) 일루미나(Illumina) 프라이머까지 증폭하였다. Phusion 폴리머라제(BioRad)에 의해 하기와 같이 PCR을 수행하였다: 98℃에서 30초, [98℃ 10s, 65℃ 30s, 72℃ 30s]의 20-24사이클, 및 72℃에서 5분. 크기-분별을 위해, PCR 산물들을 3% NuSieve 겔 상에 로딩하고, 및 200-1,200 bp 산물을 잘라내고, QIAEX II 아가로스 겔 추출 키트(Qiagen)에 의해 추출하였다. 마이너스(Minus)-RT 샘플들은 일반적으로 산물들을 형성하지 않았다. PicoGreen에 의해 DNA 농도를 정량화하였다. Illumina GAII 상에서, Dept. of Molecular Biology, MGH의 시퀀싱 코어 시설(Sequencing Core Facility)에 의해, 5-10 ml의 2-20 nM cDNA 샘플들을 시퀀싱하였다.
생물정보 분석
하기 노트한 것 외에, C++ 프로그램들을 사용하여 모든 분석들을 수행하였다. Illumina 파이프라인을 사용하여 이미지 프로세싱 및 염기 결정을 수행하였다. 크로스매치에 의해 3’어댑터 서열들을 검출하고, 5개 이상의 염기들의 매치들을 잘라내고, 호모폴리머 리드를 여과하고, 미토콘드리아 게놈 및 리보솜 RNA와 매칭하는 리드들을 모든 이후 분석들로부터 배제하였다. 그후, ShortQueryLookup((Batzoglou et al., 2002)을 사용하여, 남은 서열들을 mm9 마우스 참조 게놈으로 정렬하였다. 1 이하의 오차를 갖는 정렬들을 보유하였다. 모든 추가의 분석에서, 라이브러리 구성 및 시퀀싱이 PRC2-결합 RNA의 반대 가닥으로부터의 서열을 생성하기 때문에, 본 발명자들은 역-보완된 것처럼 각 리드를 처리하였다. 원래의 a-Ezh2 RIP-seq 라이브러리를 그의 기술적 및 생물학적 복제물 및 Ezh2-/- 대조군 라인의 RIP-seq에 대하여 비교하는 상관계수를 측정하기 위해, 2개의 샘플들 사이에서 유전자당 리드의 수를 비교하고, 각 쌍에 대하여, 각 refGene으로 맵핑된 리드의 수 사이에서 피어슨(Pearson) 상관관계를 계산하였다. 즉, 각 샘플에 대하여, 각 refGene으로 맵핑된 리드들의 카운트들을 생성하고, 모든 벡터 쌍들 사이의 피어슨 상관관계를 계산하였다.
mm9(RepeatMasker)에서 반복 서열들의 위치를 UCSC 게놈 브라우저 데이터베이스로부터 얻었다. RepeatMasker 데이터의 좌표들을 리드 정렬의 좌표와 교차시킴으로써, 상기 반복들을 갖는 PRC2 전사체 리드들의 오버랩을 얻었다. UCSC 전사체를 일반적인 참조군으로서 사용하였다. 비-오버랩핑하는 구별된 전사 영역의 세트를 얻기 위해, 개시 좌표에 의해 UCSC 전사체 전사물들을 분류하고, 같은 가닥 상에서 오버랩핑 전사물들을 병합하였다(조인된 UCSC 전사체: 총 39,003개의 전사물). 리드 정렬 좌표들을 병합된 UCSC 전사물의 좌표와 교차시켜, PRC2 전사체내에 존재하는 UCSC 전사물들의 수를 결정하였다. 전사물들에 대한 히트는 RPKM 유닛으로 전환시키고, 여기에서 리드 카운트는 1/(n*K*M)이고, 및 n은 게놈내 정렬 수이며, K는 1,000으로 나눈 전사물 길이이며, 및 M은 1,000,000으로 나눈 mm9로의 리드 맵핑만 포함하는 시퀀싱 뎁쓰이다. 이러한 정규화는 상이한 길이의 전사물들 사이에서, 및 상이한 시퀀싱 뎁쓰의 샘플들 사이에서 비교하도록 한다.
프로모터 맵을 생성하기 위해, (UCSC Genome Browser의 refGene 카탈로그에서 얻은) TSS에 대하여 -10,000 내지 +2000 염기들로 프로모터 영역을 정의하였다. 10개의 정렬들의 제한만 릴랙스한 것 외에, 프로모터 영역에 오버랩핑하는 리드 카운트들을 플롯팅하였다. 염색체 정렬을 위해, 각 염색체 상에서 모든 비-오버랩핑 연속 100kb 윈도우들에 대하여 리드 수들을 계산하였다. n위치로 맵핑하는 것들이 각 위치에서 리드의 1/nth로서 계산되도록 리드를 정규화하였다. R로 씌어진 일반적인 스크립트를 사용하여 그래프를 플롯팅하였다. WT 및 Ezh2-/- 샘플들의 모든 전사물들에 대한 각 가닥 상에서 RPKM 스코어를 비교하여 모든 강화된 전사물들의 목록을 발견했다. 그후, 이들의 좌표들을 관심 특징의 좌표와 교차시켰다. NCBI37/mm9 마우스 어셈블리 좌표에 없는 특징들은 UCSC의 LiftOver 유틸리티를 사용하여 그들의 좌표들로 전환하였다. liftOver 유틸리티는 한 게놈을 다른 게놈으로 효과적으로 맵핑하여, 동일한 종류의 연속 어셈블리 또는 2개의 구별된 종들 사이에서 관심 영역을 신속하게 확인한다.
RIP/qRT-PCR
5 ul의 토끼 항-마우스-Ezh2 항체들(Active Motif) 또는 정상 토끼 IgG (Millipore)를 사용하여, 기존의 방법들에 기초하여, 입증시험(Validation) RIP를 수행하였다. ICYCLER IQTM 실시간 검출시스템(BioRad)을 사용한 정량적인, 가닥-특이적 RT-PCR에 의해, RIP을 수행하였다. 유전자-특이적 PCR 프라이머 쌍들은:
Malat-1: 전방향 5’-GCCTTTTGTCACCTCACT-3’ ; SEQ ID NO: 1281
역방향 5’-CAAACTCACTGCAAGGTCTC-3’; SEQ ID NO: 1282
Malat1-as: 전방향 5’-TACTGGGTCTGGATTCTCTG-3’; SEQ ID NO: 1283
역방향 5’-CAGTTCCGTGGTCTTTAGTG-3’; SEQ ID NO: 1284
Foxn2-as: 전방향 5’-GGCTATGCTCATGCTGTAAC; SEQ ID NO: 1285
역방향 5’-GTTACTGGCATCTTTCTCACA-3’; SEQ ID NO: 1286
Ly6e-as: 전방향 5’-CCACACCGAGATTGAGATTG-3’; SEQ ID NO: 1287
역방향 5’-GCCAGGAGAAAGACCATTAC-3’; SEQ ID NO: 1288
Bgn-as: 전방향 5’-TGTGAACCCTTTCCTGGA-3’; SEQ ID NO: 1289
역방향 5’-CTTCACAGGTCTCTAGCCA-3’; SEQ ID NO: 1290
Gtl2: 전방향 5’- CGAGGACTTCACGCACAAC -3’; SEQ ID NO: 1291
역방향 5’- TTACAGTTGGAGGGTCCTGG -3’; SEQ ID NO: 1292
Gtl2-as: 전방향 5’-CACCCTGAACATCCAACA-3’; SEQ ID NO: 1293
역방향 5’-CATCTGCTTTTCCTACCTGG-3’ ; SEQ ID NO: 1294
Hapa1-상류: 전방향 5’-GGTCCAAAATCGGCAGT-3’ ; SEQ ID NO: 1227
역방향 5’-GTCCTCAAATCCCTACCAGA-3’; SEQ ID NO: 1228
Htr6-하류: 전방향 5’-ACACGGTCGTGAAGCTAGGTA-3’ ; SEQ ID NO: 1229
역방향 5’-CAGTTGGAGTAGGCCATTCCC-3’; SEQ ID NO: 1230
Nespas/TR019501: 전방향 5’-AGATGAGTCCAGGTGCTT-3’; SEQ ID NO: 1231
역방향 5’-CAAGTCCAGAGTAGCCAAC-3’; SEQ ID NO: 1232
Xist-전방향 3F5 및 -역방향 2R 프라이머들은 설명되어 왔다(Zhao et al., 2008). 가닥-특이적 cDNA 합성을 위해, 역방향 프라이머를 사용하였으며, SYBR 그린 (BioRad)에 의해 qPCR을 실시하였으며, 역치 크로싱들(Ct)을 기록하였다. RNA 레벨을 입력하기 위해 각 값을 정규화하였다.
노덧 블롯 분석
16.7 ES 세포들로부터 5 μg의 폴리(A+) RNA 를 분리하고, 포름알데히드를 함유하는 0.8% 아가로스 겔에 의해 분리하고, Hybond-XL (GE Healthcare) 상에서 블롯팅하고, 및 Ultrahyb (Ambion)을 사용한 프로브로 42℃에서 혼성화하였다. STRIP-EZ PCR 키트 (Ambion)를 사용하여 프로브들을 생성하고, 하기 목록을 갖는 게놈 DNA로부터 증폭시켰다:
Malat1-AS-F, 5’-TGGGCTATTTTTCCTTACTGG-3’; SEQ ID NO: 1233
Malat1-AS-R, 5’-GAGTCCCTTTGCTGTGCTG-3’; SEQ ID NO: 1234
(Gtl2) Meg3-F, 5’-GCGATAAAGGAAGACACATGC-3’; SEQ ID NO: 1235
Meg3-R, 5’-CCACTCCTTACTGGCTGCTC-3’; SEQ ID NO: 1236
Meg3 ds-F3, 5’- ATGAAGTCCATGGTGACAGAC-3’; SEQ ID NO: 1237
Meg3 ds-R2, 5’-ACGCTCTCGCATACACAATG-3’; SEQ ID NO: 1238
Rtl1-F, 5’-GTTGGGGATGAAGATGTCGT-3’; SEQ ID NO: 1239
Rtl1-R, 5’-GAGGCACAAGGGAAAATGAC-3’; SEQ ID NO: 1240
Nespas ds-F, 5’-TGGACTTGCTACCCAAAAGG-3’; SEQ ID NO: 1241
Nespas ds-R, 5’-CGATGTTGCCCAGTTATCAG-3’; SEQ ID NO: 1242
Bgn-AS-F, 5’-CAACTGACCTCATAAGCAGCAC-3’; SEQ ID NO: 1243
Bgn-AS-R, 5’-AGGCTGCTTTCTGCTTCACA-3’; SEQ ID NO: 1244
Htr6 up-F, 5’-ATACTGAAGTGCCCGGAGTG-3’; SEQ ID NO: 1245
Htr6 up-R, 5’-CAGGGGACAGACATCAGTGAG-3’; SEQ ID NO: 1246
UV-가교 RIP
RT-PCR을 위한 전장 RNA를 보존하기 위해, RNA 분리 이전에 RNA아제 처리에 의해, RNA-단백질 복합체들의 전사물들이 잘라내지 않은 것 외에는, 종래의 방법들을 사용하여, UV-가교 IP를 수행하였다. 마우스 ES 세포들을 (Stratagene STRATALINKER 사용하여) 254nm에서, 400 mJ/cm2로 마우스 ES 세포들을 UV-조사하고, 파괴적 초음파처리에 의해 RSB-TRITON 버퍼(10mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 35 ㎍/mL 디기토닌, 0.5% 트리톤 X-100)에서 세포핵을 분리하였다. 핵 분리물을 4℃에서 1시간동안 연어정자 DNA/단백질 아가로스 비드에 의해 사전-클리어링하고, 밤새 항체들과 함께 배양하였다. 그후, RNA/항체 복합체들을 단백질 DYNABEADS (Invitrogen)에 의해 침전시키고, 저-엄격성 버퍼(1XPBS [150 mM NaCl], 0.1% SDS, 0.5% 디옥시콜레이트, 0.5% NP-40)에서 첫번째로 세척하고, 그후 고-엄격성, 고-염 버퍼(5XPBS [750 mM NaCl], 0.1% SDS, 0.5% 디옥시콜레이트, 0.5% NP-40)에서 2회 세척하고, 및 프로테이나제 K에 의해 처리하였다. TRIZOL (Invitrogen)을 사용하여 RNA를 추출하고, 및 상기 설명한 대로 RT-qPCR을 수행하였다.
인간 PRC2 성분들의 발현 및 정제
인간 PRC2 서브유닛들을 발현하기 위해, pFastBac1내 N-말단 플래그-태그된 EZH2 및 SUZ12를 Sf9 세포들에서 발현하였다. 전체 PRC2 복합체를 발현하기 위해, 플래그-태그된 EZH2를 태그되지 않은 SUZ12, EED, 및 RBAP48과 함께 동시발현하였다. BC300 버퍼(20mM HEPES pH 7.9, 300mM KCl, 0.2mM EDTA, 10% 글리세롤, 1mM DTT, 0.2mM PMSF, 및 완전한 프로테아제 억제제(Roche))에서 4번의 냉동-해동 주기에 의해 추출물들을 제조하고, 및 M2 비드에 4시간동안 결합시키고, 및 0.4mg/ml 플래그 펩타이드에 의해 BC300에서 용출시키기 전에, BC2000에 의해 세척하였다. EZH2 및 PRC2를 100mM KCl로 조정하고, 및 HiTrap Heparin FF 1ml 컬럼 상에 로딩하고, 및 100-1000mM KCl 구배에 의해 용출하였다. Amicon ultra 10kDa MWCO 농축기(Millipore)를 사용하여 피크 프랙션을 농축시키고, BC300에 의해 평형시킨 Superose 6 컬럼 상에 로딩하였다. 피크 프랙션을 수집하고, 농축하였다. SUZ12를 위해, 플래그 용출액을 농축시키고, BC300에 의해 평형시킨 Superdex 200 컬럼 상에 로딩하였다.
전기영동 이동성 변화 분석(EMSA)
RNA-EMSA를 위해, 30 nt Hes-1 프로브 (안티센스 방향의 TSS의 ~270 bp 하류)를 겔 쉬프트에 사용하였다. T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제(Ambion)를 사용하여, [γ-33p]ATP에 의해 RNA 프로브들을 방사선표시하였다. 정제된 PRC2 단백질(1 μg)을 상기 표시된 프로브와 함께 4℃에서 1시간동안 배양하였다. 4°C에서 1시간동안 0.5×TBE에서 250V로, RNA-단백질 복합체들을 4% 비-변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하였다. 겔을 건조시키고, Kodak BioMax 필름에 노출시켰다.
RNA 풀다운 분석법
RepA의 PCR 산물, Xist 엑손 1에 대한 전방 프라이머로 T7 프로모터 서열을 포함시키고, Gtl2를 절단시켰다. 전장 Gtl2를 pYX-ASC로 클로닝하고, 및 XistE1을 pEF1/V5/HisB (Invitrogen)로 클로닝하였다. 특정 프라이머 서열들은 아래와 같았다:
RepA-F: TAATACGACTCACTATAGGGAGAcccatcggggccacggatacctgtgtgtcc; SEQ ID NO: 1247
RepA-R: taataggtgaggtttcaatgatttacatcg; SEQ ID NO: 1248
절단된-Gtl2-F: TAATACGACTCACTATAGGGAGATTCTGAGACACTGACCATGTGCCCAGTGCACC; SEQ ID NO: 1249
단축된-Gtl2-R: CGTCGTGGGTGGAGTCCTCGCGCTGGGCTTCC; SEQ ID NO: 1250
Xist E1-F: atgctctgtgtcctctatcaga; SEQ ID NO: 1251
Xist E1-R: gaagtcagtatggagggggt; SEQ ID NO: 1252
그후, 메가 스크립트 T7 (Ambion)를 사용하여 RNA를 전사시키고, 트리졸(Trizol)을 사용하여 정제하고, 및 서냉시켜서, 2차 구조 형성을 용이하게 하였다. 풀다운 분석을 위해, 20U RNAsin이 보충된 3㎍의 Flag-PRC2 또는 Flag-GFP 및 5 pmol의 RNA를 얼음 위에서 30분간 배양하였다. 10㎕의 플래그 비드들을 첨가하고, 회전 휠 상에서 4℃에서 1시간동안 배양하였다. 150mM KCl, 25mM Tris pH 7.4, 5mM EDTA, 0.5mM DTT, 0.5% NP40 및 1mM PMSF를 함유하는 200㎕ 버퍼에 의해 비드들을 3회 세척하였다. 35㎕의 0.2M-글리신 pH2.5를 첨가하여, RNA-단백질 복합체들을 플래그 비드들로부터 용출하였다. 1/10th 부피의 1M Tris pH 8.0을 첨가하여, 용출액들을 중화하고, 겔 전기영동에 의해 분석하였다.
넉다운(knockdown) 분석 및 qRT-PCR
shRNA 올리고들을 MISSION pLKO.1-puro (Sigma-Aldrich) 벡터로 클로닝하고, 및 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 (Invitrogen)에 의해 야생형 마우스 ES 세포들로 형질감염시켰다. 퓨로마이신 선택한지 10일후, 세포들을 수집하고, 및 qRT-PCR을 수행하여, RNA 넉다운을 확인하였다. 대응하는 스크램블 서열(MISSION 비-표적 shRNA)을 대조군(Scr)으로 사용하였다. Gtl2에 대한 shRNA 올리고들: (상부 가닥) 5' - CCG GGC AAG TGA GAG GAC ACA TAG GCT CGA GCC TAT GTG TCC TCT CAC TTG CTT TTT G - 3'; SEQ ID NO: 1253 (하부 가닥) 5' - AAT TCA AAA AGC AAG TGA GAG GAC ACA TAG GCT CGA GCC TAT GTG TCC TCT CAC TTG C - 3'; SEQ ID NO: 1254. Gtl2 및 Gtl2-as RNAs를 위한 qPCR 프라이머들은 상기 설명한 바와 같다. Dlk1 RNAs를 위한 프라이머: (전방향) 5' - ACG GGA AAT TCT GCG AAA TA -3'; SEQ ID NO: 1255 (역방향) 5' - CTT TCC AGA GAA CCC AGG TG -3'; SEQ ID NO: 1256. 다른 Gtl2 shRNA는 Open Biosystems (V2MM_97929)로부터 구입하였다. 본 shRNA에 의한 넉다운 후 Ezh2 레벨은 qPCR에 의해 시험하였다. 다중 클론들을 테스트한 후, 본 발명자들은 Gtl2가 초기 통과 클론들(50-70%)에서 넉다운되었지만, 넉다운 클론들은 장기간 배양시에 유지하기가 어렵다고 결론내렸다.
DNA ChIP 및 실-시간 PCR
ChIP은 (Zhao et al., 2008)에 설명한대로 수행하였다. 5㎕의 α-Ezh2 항체들(Active Motif 39103), 정상 토끼 IgG (Upstate 12-370), 및 α-H3K27me3 (Upstate)을 IP마다 사용하였다. ChIP DNA를 위한 실-시간 PCR을 prGtl2F/prGtl2R를 갖는 Gtl2-근위DMR으로, DMR-F/DMR-R을 갖는 Gtl2-원위 DMR으로, prDlk1F/prDlk1R을 갖는 Dlk1 프로모터로, 및 prGAPDH-F/prGAPDH-R을 갖는 Gapdh 프로모터로 수행하였다. 프라이머 서열들은 하기와 같다:
근위-DMR 5’ - CATTACCACAGGGACCCCATTTT; SEQ ID NO: 1257
근위-DMR 5’ - GATACGGGGAATTTGGCATTGTT; SEQ ID NO: 1258
prDlk1F 5’ - CTGTCTGCATTTGACGGTGAAC; SEQ ID NO: 1259
prDlk1R 5’ - CTCCTCTCGCAGGTACCACAGT; SEQ ID NO: 1260
원위-DMR-F 5’ - GCCGTAAAGATGACCACA; SEQ ID NO: 1261
원위-DMR-R 5’ - GGAGAAACCCCTAAGCTGTA; SEQ ID NO: 1262
prGAPDH-F 5’ - AGCATCCCTAGACCCGTACAGT; SEQ ID NO: 1263
prGAPDH-R 5’ - GGGTTCCTATAAATACGGACTGC; SEQ ID NO: 1264
prActin-F 5’ - GCA GGC CTA GTA ACC GAG ACA; SEQ ID NO: 1265
prActin-R 5’ - AGT TTT GGC GAT GGG TGC T; SEQ ID NO: 1266
하기 물질들 및 방법들은 하기 개시된 실시예 6-10에 사용하였다.
LNA 뉴클레오펙션 - 100㎕의 Mef 뉴클레오펙터 용액(Lonza)내에 2 X 106 SV40T 형질전환된 MEFs를 재현탁하였다. Cy3-표시된 LNA 분자들을 2μM의 최종 농도로 첨가하였다. T-20 프로그램을 사용하여 세포들을 형질감염시켰다. 2 ml의 배양 배지를 세포에 첨가하고, 및 100㎕의 상기 현탁액을 시간지점당 1개의 젤라틴화 10 웰 슬라이드 상에 플레이팅하였다. Exiqon(엑시콘) 소프트웨어(exiqon.com에서 사용가능)를 사용하여, LNA 서열을 설계하였다. 자가-혼성화 점수를 최소화하면서, 표적 친화도(Tm)를 최대화하기 위해, 변형된 LNA 염기들을 전략적으로 도입하였다. LNA 분자 서열들(5’로부터 3’까지)은 하기와 같았다:
LNA-Scr, GTGTAACACGTCTATACGCCCA; SEQ ID NO: 1267
LNA-C1, CACTGCATTTTAGCA; SEQ ID NO: 1268
LNA-C2, AAGTCAGTATGGAG; SEQ ID NO: 1269
LNA-B, AGGGGCTGGGGCTGG; SEQ ID NO: 1270
LNA-E, ATAGACACACAAAGCA; SEQ ID NO: 1271
LNA-F, AAAGCCCGCCAA; SEQ ID NO: 1272
LNA-4978, GCTAAATGCACACAGGG; SEQ ID NO: 1273
LNA-5205, CAGTGCAGAGGTTTTT; SEQ ID NO: 1274
LNA-726, TGCAATAACTCACAAAACCA ; SEQ ID NO: 1275
LNA-3’, ACCCACCCATCCACCCACCC; SEQ ID NO: 1276
실시간 PCR - 트리졸(Trizol)(Invitrogen)을 사용한 뉴클레오펙션 후, 전체 RNA를 추출하였다. i사이클러 SYBR 그린 케미스트리(Biorad)를 사용하여, cDNA 샘플상에서 수행된 슈퍼스크립트 II 키트 및 실시간 PCR을 사용하여, 역전사효소 반응을 수행하였다.
ChIP - 1% 포름알데히드 용액내 뉴클레오펙션후, 여러 시간지점에서 세포들을 고정시켰다. 글리신을 0.125M으로 첨가하여 앵커링을 정지시키고, 및 (28)에 설명한 바와 같이 ChIP을 수행하고, qPCR에 의해 정량화하였다.
항체들 - 다양한 에피토프들에 대한 항체들은 하기와 같이 구입하였다: H3K27me3, 액티브 모티프(Active Motif) 39535. Ezh2, 액티브 모티프 39639 및 BD Pharmingen 612666. 면역염색을 위해, H3K27me3 항체들을 1:100 희석하여 사용하고, 및 Ezh2 항체들(BD Pharmingen)을 1:500으로 사용하였다. Alexa-Fluor 2차 항체들은 Invitrogen으로부터 구입하였다. 웨스턴 블롯을 위해, Ezh2 항체들(BD Pharmingen)을 1:2000 희석하여 사용하였다. 액틴 항체(Sigma A2066)를 1:5000 희석하여 사용하였다.
DNA FISH, RNA FISH, 및 면역염색 - 젤라틴화 유리 슬라이드 또는 사이토스펀(cytospun) 상에서 세포들을 재배하였다. RNA FISH, DNA FISH, 시리얼 RNA-DNA FISH, 면역염색, 및 면역FISH는 종래 방법들에 기초하여 수행하였다. nick-해독된 pSx9-3 프로브 또는 Xist 리보프로브 칵테일을 사용하여. Xist RNA FISH를 수행하였다. Xist DNA FISH에 대한 프로브로서 pSx9-3을 사용하였다. 중기 확산을 위해, 콜히친을 세포에 1시간동안 첨가하였다. 세포를 트립신화하고, 3ml의 0.056M KCl내에 실온에서 30분간 재현탁하고, 원심분리하고, 및 메탄올:아세트산(3:1) 고정액내에 재현탁하였다. 고정액을 여러 번 바꿔준 후, 세포들을 냉각 슬라이드 상에 떨어뜨리고, RNA 또는 DNA FISH를 위하 처리하였다.
실시예 1. RIP-seq에 의한 PRC2 전사체 포획
PRC2에 결합된 RNA의 게놈-와이드 풀을 포획하는 방법은 2개의 종래 방법들을 조합하여 본래의 RIP 및 RNA-seq (이 방법은 “RIP-seq”라고 언급됨)를 개발하였다. -Ezh2 항체들에 의해 면역침전된 핵 RNA를 마우스 ES 세포들 및 Ezh2-/- 대조군으로부터 분리하고, 가닥-특정 어댑터들을 사용하여 cDNAs를 생성하고, 및 200-1,200 nt로부터의 것들을 정제하고, Illumina 시퀀싱하였다.
파일롯 실험에서, 본 발명자들은 107 ES 세포들 상에서 RIP를 수행하고, α-Ezh2 풀다운의 특이성을 평가하기 위해 여러 대조군 RIP들을 포함시켰다. 야생형 풀다운 및 그의 기술적 및 생물학적 복제물에서, α-Ezh2 항체들이 107 ES 세포들로부터 RNA 70-170ng을 침강시키고, 및 >200 nt의 cDNA 스미어(smear)를 생성했다. RNA아제에 의해 처리하여, 상기 크기범위의 산물들을 제거하고, 및 -RT 샘플들은 산물을 생성하지 않았으며, 이는 면역침전된 물질이 정말 RNA였음을 제시하는 것이다. Ezh2-/- 풀다운(~14 ng)에서 및 야생형 세포들이 IgG(~24 ng)에 의해 면역침전될때, ~10-배 적은 RNA가 있었다. 가짜 RIP 대조군(세포들 없음)에 대하여는 500-배 농축이 관찰되었다. >200 nt 크기 범위에서, 대조군 RIPs(널 세포(null cells), IgG 풀다운, 가짜)가 RNA를 추가로 고갈시켰으며, 이러한 샘플들은 어댑터 및 프라이머 다이머에 의해 지배되었다. 어댑터/프라이머 다이머, rRNA, 미토콘드리아 RNA, <18 nt 또는 부정형 뉴클레오타이드들을 갖는 리드들, 및 15개의 염기 초과 호모폴리머를 계산적으로 걸러내었다. 균등수의 세포들로부터, 대조군 RIP는 리드들이 상당히 소실되었다. 야생형 라이브러리에서, 여과후 231,880-1.2 백만 리드들이 남았다. 대조에 의해, 4,888 내지 73,691개의 리드들만 대조군내에 남았다. 대조군내 상당수의 전사물들이 거짓 성질을 가졌다(어댑터/프라이머 다이머, 호모폴리머 등). 그러므로, 야생형 RIPs는 실질적인 RNA 강화, 및 대조군 RIP에 비해 더 높은 등급의 RNA 복잡성을 나타냈다.
야생형 라이브러리에서 모든 리드들의 대략 절반은 3회 이상 기술되었다. 복제물들을 제거한 후에도, 잠재적 PCR 인공물을 피하기 위해, 야생형 라이브러리는 301,427개의 구별된 리드들(각각 98,704 및 87,128개의 기술적 및 생물학적 복제물들)을 포함한 반면, 대조군 샘플들은 1,050 (IgG) 및 17,424 (널)개만 생성하였다. 야생형 라이브러리는 Ezh2-/- 및 IgG 대조군에 대하여 각각 비교될때, 0.27-0.01에 비해, 0.71-0.90의 상관계수(CC)를 가지며, 서로 매우 유사했다. >10 복사본들/게놈의 반복 요소들로 맵핑하는 리드들은 전체 야생형 리드들의 <20%를 차지하고, 상기 간단한 반복은 가장 일반적이며, 85.714%를 차지하는 반면, LINEs, SINEs, 및 LTRs는 각각 과소표시되었다. ≤10의 정렬을 갖는 리드들은 최대 표시이므로, 본 발명자들은 본 발명에서 상기 리드들에 대한 분석에 집중한다(저-복사본 게놈 복제를 갖는 ≤10의 보유 유전자들의 컷오프).
게놈 분포는 염색체 위치의 함수로서 분명한 리드들을 플롯팅함으로써 조사하였다. 정렬들은 PRC2-연관 RNAs가 야생형 라이브러리내 모든 염색체 상에서 일어남을 보여줬다. IgG 및 Ezh2-/- 대조군은 적은 및 산발적인 리드들을 입증했다. 그러므로, 본 발명의 RIP-seq은 PRC2 전사체에 대한 특이적 및 재생성 프로파일을 생성했다. 대다수의 야생형 리드는 X-염색체와 부딪히며, 및 X-불활성화 중심의 줌은 포지티브 대조군, 즉 Tsix, RepA, 및 Xist RNAs가 각각 12회 나타냈다. 고감도의 RIP-seq 검출은 RepA 및 Xist로 표현됨으로써 제시되며, 이는 <10 복사본/ES 세포로 응집되어 표현된다. 한편, X-불활성화 중심의 다른 비코딩 RNA내에서 힛트들이 발생하지 않았다. 따라서, RIP-seq 기술은 민감하며, 및 구체적이다.
실시예 2. PRC2 전사체
포화 범위를 얻기 위해, 시퀀싱을 확대하고, 원래의 야생형 샘플들을 위해, 31.9백만개의 리드들을 얻고, 및 그의 생물학적 복제물들을 위해 36.4백만개의 리드들을 얻었다. 복제물들을 제거하고, 정렬 ≤10의 1,030,708 및 852,635개의 분명한 리드들이 각 라이브러리에 대하여 각각 남았다. 그후, 이러한 리드들을 이후의 분석을 위해 파일롯 야생형 리드들과 조합하고(여기에, WT 라이브러리), 및 대조군으로서 Ezh2-/- 라이브러리를 사용하여 모든 분석들을 수행하였다.
진짜 포지티브들이 WT에 풍부해져야 하는 이유로, WT 대 널 라이브러리에서 상대적 표시에 기초하여 전략을 세웠다. 유전자 표현은 유전자 길이 및 시퀀싱의 깊이를 정상화 수단으로서 “백만개의 리드당 킬로베이스당 리드(reads per kilobase per million reads)(RPKM)”를 사용하여 계산되었으며, 그후 UCSC 결합 전사체내 모든 39,003개의 전사물들은 그들의 WT RPKM (x-축) 및 그들의 널 RPKM (y-축) 값들에 의해 산점도로 맵핑되었다. 두 라이브러리에서 0 또는 0 부근의 대표값을 갖는 전사물들은 가장많은 데이터지점 수를 차지하였다[(0,0)에서 블루 클라우드]. 0이 아닌 x값들과 0인 y값을 갖는 전사물들은 WT 풀다운에서만 나타난 군집을 가리켰다. 적당한 풍부(enrichment) 역치값을 측정하기 위해, 본 발명자들은 실리코 공제(silico substraction)를 수행하였다. 같은 교정기에 대하여 WT/널 RPKM 비율을 시험하였다. Xist/RepA는 4.18/0으로 기록되었으며, 이는 WT 라이브러리에서 수십만개의 대표들이 있지만, 널에는 없음을 지칭한다. Tsix는 10.35/3.27로 기록되었으며, Bsn pasr는 0.95/0, 및 Kcnq1ot1은 1.17/0이다. 네가티브 대조군은 낮은 비율을 기록했는데, 즉 Pax3- pasr은 0.11/0.26, Hey1-pasr 0.28/0, Hotair 0.25/0, Insl6 0.27/3.09, 및 Ccdc8 0.22/5.04였다. 이것에 근거하여, RPKM(WT)/RPKM(널)에 대한 3:1 풍부 비율 및 0.4의 최소 RPKM이 일컬어졌다.
“PRC2 전사체”에 대한 전사물 확인은 Ezh2-널 라인에서보다는 야생형 세포 라인에서 EZH2 항체들에 의해 풀다운된 ~10-배 이상의 RNA들이 있다는 사실에 기초를 두고 있으며, 이는 야생형 라이브러리가 PRC2-연관 전사물들이 풍부하고, 실리코 공제는 더 이상 필요하지 않음을 가리킨다. 이러한 기준을 사용하여, 확대된 PRC2 전사체의 크기는 ~57K RNAs로 추정된다.
실시예 3: 첨부자료 I로부터 PRC2-결합 피크들(PRC2-연관 영역)의 확인
일부 또는 특정 구현예에서, 단백질 결합 파트너(예를 들면, PRC2)가 결합하는 RNA의 영역은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드가 혼성화되는 표적 lncRNA 위의 위치들 중 하나이다. 예를 들면, 이러한 영역들은 첨부자료 I의 데이터를 검토하고, 데이터 세트내에 많은 영역들을 확인함으로써 확인될 수 있으며, 이러한 영역들은 PRC2-결합 서열들을 포함하기 쉽다.
첨부자료 I의 서열 리드들은 Illumina GA-II 게놈 분석기와 직접 떨어지며, 및 PRC2-결합 전사물의 역상보(reverse complement)인 방향으로 있다. 첨부자료 I은 제거된 어댑터/프라이머 다이머, 미토콘드리아 RNA, rRNA, 호모폴리머, 부정형 뉴클레오타이드를 갖는 리드들 및 절단된 리드들(<15nt)을 생물정보 여과후 모든 리드들의 여과된 서브셋이다. 이들은 상기 실시예 1에 설명된 RIP 및 이후의 RNA 정제 단계들(RIP-seq 방법) 동안 내인성 뉴클레아제로부터 보호된 최선의 영역들을 나타내기 쉬우며, PRC2 또는 관련 단백질 또는 복합체들에 결합하는 RNA의 후보 영역들을 나타낸다. 첨부자료 I로부터, WT 대 널이 3:1로 강화되고[RPKM(WT)/RPKM(널)≥3.0], 및 0.4의 최소 RPKM 값을 갖는 전사물들에 대응하는 리드들이 추출되었다. 리드들의 중단되지 않는 파일-업(피크들)을 갖는 PRC2-결합 전사물들의 영역을 확인하고, RNA내 후보 PRC2 접촉영역들을 고려하였다.
Broad Institute's Arachne aligner, ShortQueryLookup을 사용하여 참조 게놈 상의 서열 커버리지(coverage)를 생성하기 위해 첨부자료 I의 서열 리드들을 사용하였으며, 이는 참조 게놈의 k-mer (K=12) 사전을 생성하고, 게놈내 매칭하는 k-mer 위치들에 기초한 리드의 후보 위치들 상에서 국소 Smith-Waterman 정렬을 수행하는 것에 기초를 두고 있다. 얼라이너(aligner)는 여러 개의 위치들이 있다. 최선의 정렬은 많아야 1개의 오차이고, 최선의 정렬의 오차수가 1개 다른 정렬도 또한 허용된다. 그 커버리지는 리드가 정렬된 곳의 수로 나눠서 정상화된다(예를 들면, 리드가 4군데로 정렬된다면, 네 곳에서 각 염기에 0.25가 부가됨).
표적 피크를 얻기 위해, 하기 방법론을 사용했다. 전사체의 야생형 커버리지가 Ezh2 -/- 전사체의 커버리지에 걸쳐 적어도 3배 풍부하고, 적어도 0.4의 최소 RPKM 커버리지를 갖는 영역의 베이스-레벨 마우스(mm9) 범위 파일이 개시점으로 제공된다. 범위는 커버리지-특이적이다. 다음으로, 길이가 100bps인 비-오버랩핑 연속 윈도우에서, 피크값들 및 이들의 위치를 측정한다. 그후, 더 큰 피크쪽 위에 있는 것으로 측정되는 윈도우의 모서리 상에 있는 상기 피크들에 대하여 피크 위치들을 교정한다. 상기 피크들을 더 큰 피크의 상부로 이동시켰다. 그후, 똑같은 피크 위치들을 제거한다. 고원(plateau) 상에 있는 피크 위치들은 고원의 중심으로 이동한다. 그후 가우시안 커널(Gaussian kernel), (1/sqrt(2*sigma*pi))*exp(-t^2/(2*sigma))(여기에서, sigma = 5.0)을 사용하여 커버리지를 평활화한다. 그후, 평활화 커버리지가 최대 커버리지의 1/3 이하가 되도록 하는 피크로 가장 가까운 위치를 위치시킴으로써 피크 폭을 측정한다. 피크들 사이의 중간점에서 그들 사이에 그들 사이의 경계를 둠으로써, 서로 오버랩하는 인접한 피크들을 해결한다. 그후, 위치, 폭, 최대 진폭, 및 피크 폭아래 비평활 커버리지의 합을 갖는 표로 피크들이 출력된다. (T를 U로 치환하여 RNA로 전환되는) mm9에서 마우스 피크의 대응 뉴클레오타이드 서열은 서열 B47,408 내지 B616,428에 나타난다[마우스 피크]. 상기 마우스 피크들의 가닥 및 마우스 염색체 좌표들의 마우스-투-인간 리프트오버(LiftOver)를 본 명세서에 설명된 UCSC 게놈 브라우저에서 수행하여, 이종상동성 인간 염색체 좌표들을 생성하였다. 이러한 방법 및 리프트오버 사슬들은 당 분야에 공지되어 있다. 각 마우스 피크의 마우스 좌표들(mm9)이 대응하는 인간(hg19) 좌표들로 전환될때, 매치가 언제 발생하던지, 50, 65 75 및 95의 백분율을 맵핑하면 근본적으로 동일한 위치 및 길이결과가 얻어졌다. 결과적으로, 50% 맵핑 파라미터가 사용되었다.
각 대응하는 인간 피크 RNA 서열(즉, T를 U로 치환하여 RNA로 전환된, 인간 염색체 좌표들 및 가닥의 뉴클레오타이드 서열)은 서열 B652,256 내지 B916,209에 나타나 있다[인간 피크]. 표 1은 마우스 서열 및 대응하는 인간 서열을 나타낸다. 상기 인간 피크들 및 인간 PRC2 전사체(즉, PRC2-결합 전사물의 인간 서열)는 PRC2-결합 RNA에 의해 표적이 된 유전자들을 확인하기 위해, NCBI 데이터베이스로부터 공지된 유전자들과 교차했다(즉, 교차하는 또는 인간의 유전자).
국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2는 각 피크의 인근에 있거나 교차된 유전자들의 이름을 갖는 마우스 및 인간 피크들의 주석을 나타내고 있다. 인간 유전자(첫번째 목록) 또는 마우스 유전자(두번째 목록)와 관련된 독특한 NCBI 유전자 ID는 유전자 이름에 괄호로 나타나 있다. 피크 좌표들과 유전자 좌표들 사이의 오버랩 정도는 꺽쇠 괄호로 나타나 있다. 양수는 둘 사이의 오버랩핑 뉴클레오타이드 수를 나타내고, 및 음수는 둘 사이의 갭 크기를 나타낸다(즉, 둘 사이의 떨어져있는 뉴클레오타이드 수). 피크에 대해, 꺽쇠 괄호는 피크 좌표가 유전자 좌표와 완전히 오버랩하는 것을 나타낸다. 전사물에 대해, 꺽쇠 괄호안 “F”는 전사물 좌표가 유전자 좌표와 완전히 오버랩하거나, 그 반대인 경우를 나타낸다. RNA 전사물 또는 피크는 “반대 가닥” 컬럼의 참조 유전자에 대하여 “안티센스”인 반면, RNA 전사물 또는 피크는 “같은 가닥” 컬럼에서 참조 유전자로서 동일한 “센스”방향에 있다.
생물정보 분석은 평균 피크가 약 40-60개의 염기들임을 나타내며, 이것은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드들의 초기 설계를 위한 우수한 크기이다. 상기 각 피크들은 첨부자료 I의 역-상보 리드들에 의해 완전히 나타내어지는데, 왜냐하면 첨부자료 I로부터 오버랩핑 역-상보 리드들의 세그먼트에 대응하기 때문이다. 피크들은 코딩 유전자내 어디에서나, 및 센스 또는 안티센스 방향에서 발견될 수 있다. 피크들은 프로모터/5’UTR 영역, 인트론, 내부 엑손 및 3’UTR 및 그 이후에서 발견될 수도 있다. PRC2-상호작용 전사물들이 단백질-코딩 mRNA가 아닌, mRNA 서열과 오버랩하는 전사물 또는 분명한 전사물임이 분석으로부터 강하게 제시되고 있다. 이미 설명되지 않은 새로운 RNA들이 많다.
본 명세서에 개시된 방법들은 충분한 특이성으로 표적 위치 또는 세그먼트에 결합하거나, 또는 원하는 효과를 제공하기 위해 표적 RNA에 대하여 충분히 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 설계하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법들은 2차 구조, 예를 들면 1, 2 또는 그 이상의 스템-루프 구조들, 또는 유사매듭의 영역을 확인하기 위해 당 분야에 공지된 생물정보 방법들을 사용하는 단계, 및 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 갖는 표적에 대한 상기 영역들을 선택하는 단계를 포함한다.
피크내에서 적어도 5개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함하거나, 그에 바로 인접해 있는 길이가 5-500개 뉴클레오타이드들, 또는 길이가 약 5 내지 약 100개 뉴클레오타이드들, 또는 길이가 약 2kb인, 추가의 표적 세그먼트들이 또한 표적으로 하는데 적당한 것으로 고려된다.
더 긴 인간 전사물 서열과 매치하지 않은 각 인간 피크에 대하여, 주위의 인간 염색체 서열의 더 긴 2kb 단편이 확인되었으며, 서열 B916,626-B934,761[인간 피크 주위의 더 큰 영역]에 나타나 있다.
실시예 4. 피크 영역에서 또는 피크 영역 주위에서 PRC2에 대한 RNA의 직접적인 결합을 지지하는 증거
실시예 2의 기준을 사용하여 확인된 RNA가 PRC2와 직접 결합하는 아이디어를 테스트하기 위한 실험들을 실시하였다. 시험관내 생화학 분석들은 정제된 재조합 인간 PRC2 서브유닛, EED, EZH2, SUZ12, 및 RBAP48을 사용하여 수행하였다. Hes1(노치 신호전달 경로에서의 전사인자)에 대한 새로 확인된 안티센스 RNA는 2중 스템-루프 구조, RepA에서 또한 발견된 모티프를 포함한다. RNA 전기영동 이동성 변화 분석(EMSA)에서, 28-nt RepA 및 30-nt Hes1-as 프로브들 둘다 PRC2에 의해 이동되는 반면, Xist(DsI, DsII)의 다른 영역들로부터 유도된 RNA는 이동하지 않았다. 스템-루프 구조들을 변이시키는 것은 PRC2 결합을 감소시켰다. PRC2의 서브유닛이 Hes1-as와 결합하는지 측정하기 위해, 본 발명자들은 특정 서브유닛들을 사용하여 EMSA를 수행하였다. EZH2는 야생형을 강하게 이동시키지만, 변이된 Hes1-as RNA는 이동시키지 않은 반면, SUZ12 또는 EED는 Hes1-as를 이동시키지 않았다. RNA-단백질 이동은 전체 PRC2가 사용될 때 보다 떨어져 있었으며, 이는 다른 서브유닛들이 상호작용을 안정화시킨다는 것을 제시한다.
이러한 결과들은 Hes1-as RNA는 PRC2와 직접 및 특이적으로 상호작용하며, 및 Ezh2는 RNA-결합 서브유닛이다. Xist/Tsix 장소내 가장 큰 피크들 중 2개가 반복 A 영역, 전방 가닥 및 역방 가닥들 모두 상에서EZH2와 직접 상호작용하는 것으로 알려진 28-nt 반복된 모티프로 국한된다는 관찰로부터 추가의 증거가 비롯된다. “피크”로부터 유도된 RNA 단편들은 PRC2에 의한 강력한 이동을 나타낸 반면, 상기 “피크” 외부의 맵핑은 약하게 이동했다. 그러므로, 본 발명자들은 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2의 확인된 “피크들” 중 많은 것들(전체는 아님)이 RNA의 진짜 PRC2-상호작용 도메인들을 나타낸다고 생각한다. 상기 결과들은 피크들, 및 거의 인접한 영역이 PRC2 복합체와 직접 및 특이적으로 상호작용하는 것을 보여준다.
실시예 5. mRNA 발현의 상향조절에 대한 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 시험관내 효과
A.ApoE
단일 가닥 올리고뉴클레오타이드들은 ApoE를 상향조절하기 위해 lncRNA를 표적으로 하도록 설계되었다. 올리고뉴클레오타이드들은 길이가 16개 이하의 염기들이었으며, 변형되지않은 DNA 및 다중 잠김 핵산 변형된 염기들을 포함했으며, 모두 포스포로티오에이트 결합들에 의해 결합되었다. 트랙스펙션 및 데이터 분석은 하기와 같이 간단하게 실시하였다.
RNA는 DNA아제 단계를 생략한 Promega SV 96 Total RNA 분리 시스템을 사용하여 Hep 3B 세포들로부터 수확되었다. 별도의 파일럿 실험에서, 50 ng의 RNA가 역전사효소 반응을 위한 충분한 주형이 될 것으로 측정되었다. Hep3B 세포들로부터 수확된 RNA가 정상화되어, 50ng의 RNA가 각 역전사 반응에 입력되었다. 상기 한계에 도달하기에는 너무 희석된 몇몇 샘플들에 대하여, 최대 입력 용량이 첨가되었다. 그후, 정량 PCR 평가가 완성되었다.
ApoE mRNA 발현의 기준선 레벨은 상기 정해진 바와 같이 정량적 PCR을 통해 측정되었다. 기준선 레벨은 또한, 구성발현된 다양한 하우스키핑 유전자들의 mRNA에 대하여도 측정되었다. ApoE mRNA와 같은 레벨의 기준선 발현을 대략 갖는 “대조군” 하우스키핑 유전자들은 ApoE에 대한 비교목적을 위해 선택되었다.
Hep3B 세포는 500 ㎕ 당 25,000개 세포의 밀도로 24-웰 플레이트의 각 웰에 접종하였으며, 리포펙타민 및 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 사용해 형질감염을 수행하였다. 대조군 웰은 리포펙타민만 포함하였다. 형질감염 후 48시간째에, 세포 상층액 약 200 ㎕를 ELISA용으로 -80℃에 보관하였다. 형질감염 후 48시간째에, RNA를 세포로부터 수집하고, 정량적 PCR을 전술한 바와 같이 수행하였다. 각각의 올리고뉴클레오타이드에 의한 표적 mRNA 발현의 유도%는, 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서의 mRNA 수준을 대조군 (리포펙타민 단독)의 존재 하에서의 mRNA 수준에 대해 정상화함으로써, 측정하였다. 이를 "대조군" 하우스키핑 유전자의 mRNA 발현 증가와 나란히 비교하였다.
시험된 총 26개의 올리고뉴클레오타이드들은 상기 실시예 2에 따라 확인된 PRC2-결합 RNA 서열들에 대하여 상보적이었다. 상기 26개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, “대조군” 하우스키핑 유전자에 대하여 증가된 ApoE mRNA 레벨에 의해 알 수 있는 바와 같이, 사람 Hep3B 세포에서 7개가 apoE 발현을 상향조절하였다.
상기 과정은 인간 세뇨근위관 상피세포(RPTEC)를 사용하여 반복되었다. 상기 실시예 2에 따라 확인된 PRC2-결합 RNA 서열들에 대하여 상보적인 26개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, “대조군” 하우스키핑 유전자에 대하여 신세포에서 5개가 ApoE mRNA 레벨을 증가시켰다. 기준선 발현에 대하여 약 1.5배 내지 약 5배까지 레벨이 증가하였다.
그리고, 상기 실시예 3에 따라 확인된 apoE와 관련된 피크들에 대하여 상보적인 11개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 3개가 apoE 발현을 상향조절하였다.
길이가 8개 뉴클레오염기만큼 짧은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드들은 유전자 발현을 상향조절하는 것으로 증명되었다.
B. Nkx2-1
Nkx2-1을 상향조절하기 위해, lncRNA를 표적으로 하기 위해 설계된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드들에 대하여 상기 실시예 5A에 설명된 실험들을 반복하였다. 시험된 13개의 올리고뉴클레오타이드들 전체가 상기 실시예 2에 따라 확인된 PRC2-결합 RNA 서열에 대하여 상보적이었다. 상기 13개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 3개가 Nkx2-1 발현을 상향조절하였으며, 이는 기준선에 대한 증가된 Nkx2-1 mRNA 발현을 통해 알 수 있지만, 낮은 레벨의 고유 발현으로 인해, Nkx2-1과 매치될 수 있었던 “대조군” 하우스키핑 유전자는 없었다. 게다가, 상기 실시예 3에 따라 확인된 Nkx2-1과 관련된 피크들에 대하여 상보적인 9개의 올리고뉴클레오타이드들 중 3개가 Nkx-21 발현을 상향조절하였다.
C. Brca1
Brca1을 상향조절하기 위해, lncRNA를 표적으로 하기 위해 설계된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드들에 대하여 상기 실시예 5A에 설명된 실험들을 반복하였다. 시험된 총 30개의 올리고뉴클레오타이드들은 상기 실시예 2에 따라 확인된 2개의 PRC2-결합 RNA 서열들에 대하여 상보적이었다. 상기 30개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 5개의 올리고뉴클레오타이드가 Brca1 발현을 상향조절하였다. 상기 30개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 13개의 올리고뉴클레오타이드들이 상기 실시예 3에 따라 확인된 Brca1과 관련된 피크들에 대하여 또한 상보적이었다. 피크들에 대하여 상보적인 상기 13개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 2개의 올리고뉴클레오타이드들이 Brca1 발현을 상향조절하였다. 기준선 발현에 대하여 약 2 내지 약 3배까지 레벨이 증가되었다.
D. Smad7
Smad7을 상향조절하기 위해, 서열목록에 개시된 표적 lncRNA를 표적으로 하기 위해 설계된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드들에 대하여 상기 실시예 5A에 설명된 실험들을 반복하였다(예외 사항: HepB3 대신에 신장 세포주 RPTEC을 사용함). 시험된 총 28개의 올리고뉴클레오타이드들은 서열 B18602에 대하여 상보적이었다. 총 28개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 4개가 Smad7 발현을 상향조절하였다. 게다가, Smad7과 관련된 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에서 피크들에 대하여 상보적인 28개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 4개가 Smad7 발현을 상향조절하였다.
E.SirT6
SirT6을 상향조절하기 위해, lncRNA를 표적으로 하기 위해 설계된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드들에 대하여, 상기 실시예 5A에 설명된 실험들을 반복하였다. 시험된 총 25개의 올리고뉴클레오타이드들은 상기 실시예 2에 따라 확인된 PRC2-결합 RNA 서열에 대하여 상보적이었다. 상기 25개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 3개가 SirT6 발현을 상향조절하였다. 시험된 총 2개의 올리고뉴클레오타이드들이 상기 실시예 2에 따라 확인된 다른 PRC2-결합 RNA 서열에 대하여 상보적이었다. 상기 2개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 1개가 SirT6 발현을 상향조절하였다. 시험된 총 2개의 올리고뉴클레오타이드들이 상기 실시예 2에 따라 확인된 다른 PRC2-결합 RNA 서열에 대하여 상보적이었다. 상기 2개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 어떤 것도 SirT6 발현을 상향조절하지 않았다. 기준선 발현에 대하여 레벨들이 2 내지 6배 증가하였다. 게다가, 상기 실시예 3에 따라 확인된 SirT6과 관련된 피크들에 대하여 상보적인 6개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 1개가 SirT6 발현을 상향조절하였다.
F.SerpinF1
SerpinF1을 상향조절하기 위해, lncRNA를 표적으로 하기 위해 설계된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드들에 대하여 상기 실시예 5A에 설명된 실험들을 반복하였다. 시험된 총 38개의 올리고뉴클레오타이드들은 상기 실시예 2에 따라 확인된 2개의 PRC2-결합 RNA 서열들에 대하여 상보적이었다. 상기 38개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 3개가 SerpinF1 발현을 상향조절하였다. 기준선 발현에 대하여 레벨들이 1.2 내지 2배 증가하였다. 게다가, 상기 실시예 3에 따라 확인된 SerpinF1과 관련된 피크들에 대하여 상보적인 32개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 3개가 SerpinF1 발현을 상향조절하였다.
G.KLF1
KLF1을 상향조절하기 위해, 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표2에 개시된 lncRNA를 표적으로 하기 위해 설계된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드들에 대하여 상기 실시예 5A에 설명된 실험들을 반복하였다. 시험된 총 30개의 올리고뉴클레오타이드는 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에서 서열 B15688 및 B15689에 대하여 상보적이었다. 상기 30개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, “대조군” 하우스키핑 유전자에 대하여 증가된 KLF1 mRNA 레벨에 의해 표시된 바와 같이, 15개가 인간 Hep3B 세포내 KLF1 발현을 상향조절하였다. 게다가, KLF1과 관련된 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2의 피크에 대하여 상보적인 2개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 1개가 KLF1 발현을 상향조절하였다. 기준선 발현에 대하여 2 내지 50배까지 레벨이 증가하였다.
H.Rps19
Rps19를 상향조절하기 위해, 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에 개시된 바와 같이 lncRNA를 표적으로 하기 위해 설계된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 대하여 상기 실시예 5A에 설명된 실험들을 반복하였다. 시험된 총 30개의 올리고뉴클레오타이드들이 서열들 B630259 및 B630260에 대하여 상보적이었다. 상기 30개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, “대조군”하우스키핑 유전자에 대하여 증가된 rps19 mRNA 발현으로 표시된 바와 같이, 7개가 rps19 발현을 상향조절하였다. 게다가, rps19와 관련된 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2의 피크들에 대하여 상보적인 25개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 7개가 Rps19 발현을 상향조절하였다. 기준선 발현에 대하여 레벨들이 1.2 내지 1.6배까지 증가하였다.
I.PTEN
PTEN을 상향조절하기 위해, 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에 개시된 lncRNA를 표적으로 하기 위해 설계된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 대하여 상기 실시예 5A에 설명된 실험들을 반복하였다. 시험된 총 40개의 올리고뉴클레오타이드는 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에서 서열 B650,560 및 B650,559에 대하여 상보적이었다. 상기 40개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 18개의 올리고뉴클레오타이드들이 PTEN 발현을 상향조절하였다. 이들 40개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 31개도 또한 PTEN과 관련된 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2의 피크들에 대하여 상보적이었다. 피크들에 대하여 상보적인 상기 31개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 11개의 올리고뉴클레오타이드들이 기준선 발현에 대하여 약 1.5 내지 약 5배까지 증가된 PTEN 발현 레벨을 상향조절하였다.
J.EPO
에리트로포이에틴(EPO)를 상향조절 111하기 위해, 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에 개시된 바와 같이 lncRNA를 표적으로 하기 위해 설계된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 대하여, 상기 실시예 5A에 설명된 실험들을 반복하였다. 총 13개의 시험된 올리고뉴클레오타이드들은 서열 B932,189 또는 B932,190에 대하여 상보적이었다. 상기 13개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 5개가 EPO 발현을 상향조절하였다. 게다가, EPO와 관련된 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에서 피크들에 대하여 상보적인 2개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 1개가 EPO 발현을 상향조절하였다. 기준선 발현에 대하여 4배까지 레벨이 증가하였다.
세포 상층액내에 존재하는 분비단백질을 측정하기 위해, 제조사의 설명에 따라상업용으로 사용가능한 키트[DEP00, RnD Systems]를 사용한 ELISA 분석법을 사용하였다. 올리고뉴클레오타이드에 의해 유도된 단백질 레벨을 대조군(리포펙타민 단독)에 의해 유도된 단백질 레벨로 정상화함으로써, 단백질의 폴드 유도(Fold Induction)가 결정된다. 데이터는 EPO mRNA 발현을 증가시킨, 시험된 1개의 올리고뉴클레오타이드들의 데이터를 나타냈으며, 대응하는 EPO 단백질 발현이 증가함을 입증했다. 서열 B14486 및 B14487에 대하여 상보적인 3개의 올리고뉴클레오타이드들(마우스 EPO 유전자와 오버랩하는 전사물)은 마우스 EPO 발현을 상향조절할 수 있는 능력에 대하여 생체내 시험되었다.
게다가, 하류 피크 영역들을 표적으로 하는 2개의 다른 올리고들도 마찬가지로 시험되었다. 이들 중에서, EPO와 관련된 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에서 피크 영역에 대하여 4개의 올리고뉴클레오타이드들이 상보적이었다. 수컷 C57Bl6/J 마우스[6-8주됨 및 20-25g]에게 올리고뉴클레오타이드의 단일 주사를 멸균 인산완충식염수 100 μl 에서 10mg/kg 또는 25mg/kg의 투여량으로 피하 투여하였다.
주사후 48시간지점에서, 심장천자를 통해 말단 혈액샘플들을 얻고, 제조사의 설명서에 따라 ELISA 분석법[MEP00, RnD Systems]을 사용하여 EPO 단백질의 수준에 대하여 분석하였다. 서열 B14486 또는 B14487 또는 피크에 대하여 상보적인 시험된 올리고들 중에서, 1개는 5-배 유도를 입증했고, 다른 것은 25mg/kg의 투여량에서 7배 EPO 단백질 유도를 입증했다. 생체내 EPO 단백질 발현을 유도한 2개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 1개는 150개의 염기(및 다른 것은 1500개의 염기)내에 있으며, 둘다 서열 B461812인 마우스 피크와 반대가닥 상에 있다. 이 마우스 피크는 서열 B845472의 인간 피크에 대응한다.
K.BDNF
BDNF를 상향조절하기 위해, 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에 개시된 lncRNA를 표적으로 하기 위해 설계된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 대하여 상기 실시예 5A에 설명된 실험들을 반복하였다. 시험된 총 21개의 올리고뉴클레오타이드들은 서열 B620236 및 B620237에 대하여 상보적이었다. 이들 21개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 9개가 BDNF 발현을 상향조절하였다. 시험된 총 2개의 올리고뉴클레오타이드들은 서열 B130,694에 대하여 상보적이었다. 상기 2개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 1개가 BDNF 발현을 상향조절하였다. 레벨들은 기준선 발현에 대하여 1.5 내지 6배까지 증가되었다. 게다가, BDNF와 관련된 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2의 피크들에 대하여 상보적인 14개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 6개가 BDNF 발현을 상향조절하였다. 레벨은 기준선 발현에 대하여 2 내지 7배 증가되었다.
L.그래눌린
그래눌린을 상향조절하기 위해, 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에 개시된 lncRNA를 표적으로 하기 위해 설계된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드들에 대하여, 상기 실시예 5A에 설명된 실험들을 반복하였다. 시험된 총 30개의 올리고뉴클레오타이드들이 서열 B640164 및 B192311에 대하여 상보적이었다. 이들 30개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 6개가 “대조군” 하우스키핑 유전자에 대하여 증가된 그래눌린 mRNA 발현에 의해 그래눌린 발현을 상향조절하였다. 게다가, 그래눌린과 관련된 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2의 피크들에 대하여 상보적인 22개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 4개가 그래눌린 발현을 상향조절하였다. 레벨들은 기준선 발현에 대하여 1.5 내지 2배까지 증가되었다.
M.KLF4
시험된 총 30개의 올리고뉴클레오타이드들은 서열 B624099에 대하여 상보적이었다. 이들 30개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, “대조군” 하우스키핑 유전자에 대하여 증가된 KLF4 mRNA 레벨에 의해 표시된, 인간 Hep3B 세포들에서 13개가 KLF1 발현을 상향조절하였다. 게다가, KLF4와 관련된 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2의 피크들에 대하여 상보적인 20개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 10개가 KLF4 발현을 상향조절했다. 레벨들은 기준선 발현에 대하여 2 내지 15배까지 증가되었다.
N.Fvii(인자 VII)
Fvii를 상향조절하기 위해, 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에 개시된 lncRNA를 표적으로 하기 위해 설계된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드에 대하여 상기 실시예 5A에서 설명된 실험들을 반복하였다. Fvii를 표적으로 하기 위해 설계된 올리고뉴클레오타이드들은 길이가 약 20개의 염기들이며, 전체 포스포로티오에이트 결합 백본을 갖는 2’-O-Me를 갖는 변형된 DNA를 포함했다. 총 25개의 시험된 올리고뉴클레오타이드들은 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에서 서열 B632564 및 B632565에 대하여 상보적이었다. 이들 25개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 12개가 Fvii 발현을 상향조절하였다. 기준선 발현에 대하여 레벨이 2- 내지 25배까지 증가하였다. 게다가, Fvii와 관련된 국제특허출원 공보 WO/2012/087983의 표 2에서 피크들에 대하여 상보적인 25개의 올리고뉴클레오타이드들 중에서, 12개가 Fvii 발현을 상향조절하였다.
실시예 6. Xist 반복 C를 표적으로 하는 LNA 분자들은 Xi로부터 Xist RNA를 신속하게 치환한다
반복 C는 Geneious(Geneious v5.1, 인터넷 geneious.com에서 사용가능)를 사용하여 정렬되었으며, 및 고도의 사이-반복 보호를 갖는 두 영역들에 대하여 상보적인 LNA 분자들이 합성되었다. 첫번째 LNA 분자는 모든 14회 반복시에 보호를 나타냈으며(LNA-C1) 및 두번째는 14회 중 13회 반복시에 나타냈다(LNA-C2). LNA 분자들은 형질전환된 마우스 배아 섬유아세포들(MEF)로 별도로 뉴클레오펙션되었으며, 및 슬라이드 상에 세포들이 부착되고, 뉴클레오펙션후 0분(뉴클레오펙션 직후) 및 뉴클레오펙션후 8시간 사이의 다양한 시간지점에서 원 위치에 고정되었다. Xist RNA에 미치는 효과를 시험하기 위해, Xist-특이 프로브들을 사용하여 RNA 형광동소 보합법(FISH)을 수행하였다(MEF 세포들은 형질전환으로 인해 4배체가 되었으며; 각 4배성 세포는 2개의 Xa 및 2개의 Xi를 가짐). 스크램블된 LNA 분자들(LNA-Scr)에 의해 형질감염된 대조군에서, 모든 시간지점에서 세포들의 80-90%에서 강력한 Xist 클라우드가 관찰되었다. 흥미롭게는, LNA-C1 또는 LNA-C2를 도입하면, Xi로부터 Xist RNA가 바로 손실되었다. t=0에서도(LNA 도입후 수초 내지 수분내에 바로 고정된 세포들), ~10%의 핵은 Xist RNA 클러스터들의 헐거워짐을 표시했으며, 클러스터들은 희미해지고 확산되었다. 전체 Xist 클라우드를 갖는 핵의 백분율은 첫 시간동안 계속 떨어졌으며, t=60분에서 최대에 도달했다(21%, n=190). 이러한 발견들은 LNA 분자들이 도입되자마자 크로마틴에 대한 Xist 결합을 파괴했음을 보여준다. 그러나, Xi로부터 Xist의 손실이 일시적이며, 비분화 배아줄기(ES) 세포들에서 보여지는 초기 전사물들을 대표하는 Xist RNA의 핀포인트로서, t=3시간에서 볼 수 있게 되었다. Xist 클라우드의 전체 회복은 8-24hr 후-뉴클레오펙션까지 관찰되지 않았다(8시간에서 81%, n=117).
다음 실험들은, LNA 분자들이 마우스 ES 세포들에서 유사한 효과를 나타내는지를 다루었으며, 배양액내에서 분화하는 세포로서 XCI를 재정리하는 생체외 모델을 성립하였다. 비분화 상태에서, 야생형 암컷 ES 세포들은 낮은 레벨의 Xist RNA를 나타내며, RNA FISH에 의해 핀포인트 신호로서 볼 수 있다. 6일 분화에 의해, ~40%의 세포들이 정상적으로 Xist RNA를 상향조절하였다. ES 세포들이 Day 6에 LNA-C1에 의해 뉴클레오펙션되었을 때, Xist가 신속하게 치환되어, 1시간에 최대에 도달하고, 8시간까지 회복하였다. 따라서, LNA 분자들은 체세포에서 뿐만 아니라 ES 세포들에서 효과적이었다. 이러한 결과들은 Xist의 같은 영역을 향해 siRNA 또는 shRNA에 의해 뉴클레오펙션된 MEF로부터 얻은 것들과 심하게 대비되었다. siRNA도 shRNA도 1, 3 또는 24시간 시간지점에서 Xist의 손실을 야기하지 않았으며, 48시간에서만 Xist 클라우드의 부분적인 감소가 일어났다(83%, 1시간에서 n=84; 80%, 24시간에서 n=106). 따라서, LNA 분자들은 다중 세포타입에서 siRNA 또는 shRNA의 작용보다 더 많이 신속하게, 극히 신속한 동력학으로 Xist와 같은 긴 핵 ncRNA를 표적으로 하기 위해 효과적으로 사용될 수 있다.
LNA 분자들의 특이성을 시험하기 위해, 인간 293개의 세포들이 반복 C LNA 분자들에 의해 뉴클레오펙션되었다. 마우스와 인간 Xist/XIST 사이의 서열 비교는 LNA-C1에 의해 표적이 된 영역이 15nt중 10에 보존되고, LNA-C2에 대하여 14nt 중 10에 보존됨을 보여줬다. 스크램블 LNA 분자들의 뉴클레오펙션후, 인간 세포내 XIST RNA FISH는 거의 모든 세포들(92%, n=108)에서 2개의 정상 XIST 클라우드를 나타냈다. 이와 유사하게, LNA-C1 또는 LNAC-2에 의한 뉴클레오펙션은 XIST 클라우드를 변경시키지 않았다(LNA-C1, 89%, n=126; LNA-C2, 85%, n=139). 따라서, 마우스 반복 C LNA 분자들은 인간 XIST 국한에 영향을 미치지 않으며, 이는 이들이 종-특이적 방법으로 기능한다는 것을 제시한다. 인간 반복 C가 인간 XIST를 치환할 수 있는지를 측정하기 위해, 인간 반복 C에 대하여 상보적인 LNA 분자들을 293개의 세포들로 뉴클레오펙션하였지만, XIST 클라우드의 손실은 관찰되지 않았다(91%, 1 hr에서 n=103; 87%, 3 hr에서 n=95 및 92%, 8 hr에서 n=85). 이러한 발견은 반복 C가 인간에 역할을 할 수 있더라도, 추가의 인간 요소들이 RNA 국한에 기능한다는 것을 보여주는 것이다. 마우스 반복 C가 14회 일어난 반면, 인간 반복은 단 1회만 나타난다.
실시예 7. Xist RNA는 전사 불안정화 없이 치환된다
여러 기작들이 Xist 사라짐을 설명할 수 있었다. LNA 분자들은 상보적인 영역으로 어닐링하고, 분해를 위해 Xist를 표적으로 할 수 있었다. 선택적으로, LNA 분자들로의 잡종형성은 전사물 안정성에 영향을 미치지 않으면서 Xi로부터 Xist RNA를 치환할 수 있었다. 상기 가능성들 사이를 구별하기 위해, Xist 레벨들을 qRT-PCR에 의해 다른 시간지점에서 Gadph 레벨(대조군)에 대하여 정량화하였다. 1hr에, Xist 클라우드가 더 이상 볼 수 없을 때, Xist 레벨은 스크램블 대조군에서 보여진 레벨과 비교가능했었다. 3 및 8hr에서도, Xist 레벨은 크게 변하지 않았다. 이러한 결과들은 완전한 RNA 분해없이 Xist의 치환이 일어났음을 보여주었다. 따라서, LNA 분자들은 RNA의 안정성을 변경시키기 보다는 Xist와 크로마틴과의 상호작용을 차단함으로써 기능한다.
Xist의 신속한 치환 및 느린 회수 키네틱은 Xist의 국한 기작과 관련된 여러 비응답 질문들을 조사하기 위한 기회를 제공하였다. Xi 상에서 Xist가 재출현하는 것이 치환된 Xist 분자들의 재국소화로 인한 것인지, 또는 새로 합성된 RNA에 의한 코팅으로 인한 것인지 질문하기 위해, RNA 폴리머라제 II의 억제제인 악티노마이신 D(ActD)의 존재하에서 시간-과정 분석을 수행하였다. 종래의 연구들은 세포내 Xist의 반감기가 대략 4-6시간이라고 보여주고 있다. 왜냐하면, 0-8시간동안 ActD로 세포들을 처리하면, 상기 시간프레임동안 Xist RNA의 새로운 합성이 방해되고, 따라서 Xist 클라우드의 재출현이 Xi 상으로 되돌아와 치환된 RNA의 재국소화를 암시하기 때문이다. LNA 분자들을 세포에 도입한 후, ActD를 함유하는 배지에 세포들을 회수시켰다. 스크램블 대조군에서, Xist 클라우드는 ActD 없이 모든 시간지점에서 분명하게 볼 수 있었다. ActD에 의해, Xist 클라우드는 1 및 3시간 시간지점에서 분명했으며, 8시간까지 손실되고, 4-6시간 반감기와 일치했다. ActD없이 회수된 LNA-C1- 또는 LNA-C2-처리된 샘플들에서, Xist의 핀포인트는 3시간에서 볼 수 있었으며, 및 Xist 클라우드는 8시간 시간지점까지 회복되었다. 그러나, ActD에 의해, Xist 클라우드는 완전히도 부분적으로도 절대 회복되지 않았다. 따라서, Xi로부터의 LNA 분자-매개 치환후 Xist 회수는 새로운 RNA 합성으로 인한 것이지, 치환된 전사물의 재국소화로 인한 것은 아니다.
실시예 8. Xist RNA는 X-불활성화 중심 부근에 첫번째로 국소화한다
급속한 치환 및 느린 회수의 또 다른 잇점을 고려하면, Xist가 단편적인 방법으로 퍼지거나, Xi 도처에 동시에 국소화되는지의 오래된 질문이 제기되었다. 한 가설은 Xist 중심지 부근에서 코팅이 개시되고, X를 따라 위치된 부스터 요소들을 통해 염색체의 양 말단으로 진행한다는 것이다. 선택적으로, 코팅은 국소 확산을 촉진하는 다중 X-결합 시딩 포인트를 통해, 한번에 모두 발생할 수 있다. 중기 염색체 상에서 Xist 국소화는 3-8시간의 회수기간동안 분석되었다. 스크램블 LNA 분자들에 의해 처리된 세포들에서, XistRNA에 의해 코딩된 모든 중기 염색체들은 초기 작업에서 설명된 이종 패턴과 유사한 밴드 패턴을 나타냈다. 이와 대조적으로, LNA-C1 처리된 세포들은 중간 패턴을 제공했다. 1hr에서, 어떤 중기 염색체들도 XistRNA의 코트를 나타내지 않았다(0%, n=41). 3hr에서, XistRNA가 중기 세포내 핀포인트에서 보여질 수 있었을 때, 두드러진 패턴은 X 상 어디에나 소수의 매우 희미한 밴드들과 함께 중기 염색체의 중앙에 있는 단일의 밝은 밴드의 조합이었다(52%, n=46). 이러한 결과는 Xist RNA가 초기에 국소결합된다고 제시하였다. 강한 RNA 밴드가 Xist 영역에 국소화되는지의 여부를 측정하기 위해, Xist RNA FISH를 비-변성 핵 상에서 실시하고, Xist 프로브로 변성 및 혼성화를 진행하였다. 정말로, 3-hr 마크에서 관찰된 중심의 RNA 밴드는 Xist 영역에 의해 동시에 발생하였다. 5hr에, 코팅 및 세기의 중간 정도가 관찰될 수 있었다(68%, n=38). 8hr에, 뚜렷한 패턴은 대조군 세포들의 전형적인 전체-염색체 페인팅 패턴이었다(78%, n=38). 대조군에서는, 어느 시간에서도 중간 패턴들이 관찰되지 않았다. 이러한 발견들은 FISH 기술의 시간적인 및 공간적인 해결내에서, Xist RNA가 초기에 바로 가까이에 결합하지만, 동시에 Xi의 나머지로 퍼지는 것 같다고 주장하였다.
실시예 9. Xist RNA 치환은 PRC2 국소화의 손실을 수반한다
Xi에 결합하는 폴리콤 억제 복합체 2(PRC2)의 패턴은 그의 Ezh2 서브유닛이 라이신 27에서 히스톤(Histone) H3의 트리메틸화(H3K27me3)를 촉매하기 때문에, 주로 고려되어 왔다. ES 세포들내 Xist를 결실시키면, 분화하는 동안 PRC2 보충을 못하게 하고, MEF 세포내에서 Xist를 조건부로 결실시키면, Xi 상에서 PRC2를 손실시키므로, Xist-의존적 방법으로 PRC2를 Xi에 국소시키는 여러 연구들이 보여져 왔다. 그러나, PRC2가 모집되고, X로부터 손실된 키네틱들은 알려지지 않았다. Xist RNA가 PRC2를 직접 모집하기 때문에, Xist의 LNA 분자-매개된 치환으로 인해 LNA 분자 전달후 MEF내에서 Ezh2에 대하여 면역염색함으로써, PRC2를 바로 손실하는지 여부가 질문되었다. 반복 C LNA 분자들에 의해 치료할 때, Ezh2가 신속하게 손실되었다. Xist와 PRC2 손실 사이에 거의 완벽한 일치가 있었다. 1 및 3hr에, Xist가 손실된 핵 안에서 Ezh2 초점들이 발견되지 않았으며, 그 결과, 복구된 Xist 클라우드들을 갖는 핵에서 항상 관찰되었다. Xi 상에서 Ezh2가 손실되는 것은 Ezh2 단백질 턴오버로 인한 것이었다. 그러나, PRC2의 일시적인 치환은 1-8hr 시간프레임내에서 주목할만한 H3K27me3 손실을 일으키지 않는다. 따라서, Xi 상에서 PRC2의 국소화는 XCI가 형성된 후 안정한 연합 및 초기 표적으로 하는 것 모두에 대하여 Xist RNA에 절대적으로 의존하지만, H3K27me3 마크는 Xist 및 PRC2가 치환될 때 단시간내에 안정적이다.
그렇다면, LNA 분자들이 유전자 침묵화에 영향을 미치는지의 여부가 질문되었다. Xist가 최대로 치환될 때 3hr에, RNA FISH는 Xist 및, XCI에 속하는 2개의 X-결합된 유전자들인 Pgk1 또는 Hprt에 대하여 수행되었다. 대조군-뉴클레오펙션된(LNA-Scr) 세포들에서, Xist 클라우드는 Xi로부터 관찰되고, 초기 Pgk1 또는 Hprt 전사물은 Xa로부터 관찰되었다. LNA-C1 및 LNA-4978에 의한 뉴클레오펙션은 발견패턴을 변경시키지 않았으며, Pgk1 전사물들 중 2개의 중심들이 대조군의 79%(n=39) 및 LNA-C1-처리된 세포들의 80%(n=36)에서 여전히 보여지고, 및 Hprt RNA의 두 중심들이 대조군의 84%(n=44) 및 LNA-C1-처리된 세포들의 79%(n=35)에서 보여졌다. Pgk1 또는 Hprt 전사물들의 네 중심들이 전혀 보이지 않았다. 따라서, H3K27me3의 보유와 일관되게, Xist 및 PRC2의 일시적인 손실에 의해 침묵화가 파괴되지 않았다.
실시예 10. Xist 국소화를 위해, 반복 C 주변의 더 넓은 도메인이 요구된다.
다음 실험들은 Xist 내 다른 보존된 반복들을 조사하였다. 반복 A가 PRC2를 표적으로 하기 위해 필수적인 것으로 이미 보여졌기 때문에, 반복 B, E 및 F에 중심을 두고, Xist 국소화가 발견된 실험은 개별적으로 또는 조합하여 특정의 반복을 표적으로 하는 것에 의해 영향을 받지 않았다. LNA-726, LNA-4978 및 LNA-5205, 및 LNA-3’(Xist의 원위 말단)을 포함하는, Xist의 보존된 독특한 영역들도 또한 시험하였다. LNA-4978을 제외한 어떤 것도 Xist 국소화에 영향을 미치지 않았으며, 이는 반복 C의 280bp 하류에 위치된 15-nt 요소 에 대응한다. LNA-4978은 LNA-C1/C2와 유사한 효과들을 유도하였지만, 그의 더 느린 키네틱에 의해 상이했다. 1hr에, Xist 클라우드들은 여전히 볼 수 있었지만, 희미해지고 사라졌다(78%, n=125). 클라우드 수는 3hr에 최소에 도달했다(25%, n=158). 8hr에, Xist는 작은 핀포인트만큼 볼 수 있었다(39%, n=123). 24-hr 시간지점까지 회복이 완전하지 않았다. 반복 C LNA 분자들에 대한 것과 같이, Xist의 손실은 qRT-PCR에 의해 측정된, RNA 턴오버로 인한 것이 아니었으며, 및 Ezh2 단백질 레벨이 변하지 않거나 H3K27me3에 영향을 미치지 않으면서, Ezh2가 치환되었다. 그러므로, 크로마틴으로의 Xist 국소화는 반복의 직접적인 하류의 반복 C 및 독특한 영역 모두를 포함하는 광범위한 영역을 포함한다.
두 모티프들이 서로 협조하는지를 측정하기 위해, LNA-4978 및 LNA-C1이 MEF로 별개로 또는 함께 뉴클레오펙션되었다. 기대한 바와 같이, LNA-C1 단독으로 처리하여 1hr까지 Xist RNA 클라우드들을 손실하였으며, 3hr에 회복되지 시작하고, LNA-4978에 의해 처리하여, 3hr 및 8hr 각각에 손실 및 회복을 나타냈다. LNA 분자들 모두에 의해 처리하면 Xist 결실 창이 확대된다: Xist RNA 및 Ezh2의 손실은 1hr까지 관찰되었으며(LNA-C1 단독에 대한 경우와 같이), 및 8hr 시간지점까지 회복이 시작하지 않았다(LNA-4978 단독에 대한 경우와 같이). 따라서, LNA 분자 효과는 부가적이지만, 상승적이며, Xist-결실된 시간 창(window)의 확대 이후 개선되지 않았다.
실시예 11. LNA 분자 뉴클레오펙션 후 Ezh2 회복은 느리지만, Xi에 따라 균일하다
마지막으로, Xi에 재 표적으로 하는 Ezh2가 회복단계동안 Xist RNA의 단편적인 재국소화에 바로 뒤따르는지 여부가 질문되었다. PRC2는 일반적으로 프로모터 부근에서 결합하기 때문에, X-유전자 프로모터에서의 Ezh2 국소화는 정량적 크로마틴 면역침전(qChIP)에 의해 분석하였다. 암컷 세포들이 2개의 X들을 가지고, 및 항체에 의해 풀다운된 Ezh2 에피토프들이 Xa 또는 Xi로부터 이론적으로 유래되더라도, 증거는 광대한 양의 Ezh2 및 H3K27me3이 Xi에 결합된다. Ezh2는 Xi 상에서 침묵화된 유전자들의 프로모터들(예를 들면, Xmr, Pgkl)이 매우 풍부했지만, XCI가 빠져나온 유전자들의 프로모터(예를 들면, Jaridlc)는 풍부하지 않았다. 그후, MEF 세포들은 LNA-C1에 의해 뉴클레오펙션되었지만, 1 내지 24hr 사이에 항-Ezh2 항체들을 사용하여 qChIP를 수행하였다. t=1hr에, Ezh2 레벨은 모든 시험된 표적유전자 프로모터들에서 배경 레벨로 드라마틱하게 감소되었으며, 이는 프로모터-결합된 Ezh2의 결실 직후 Xi를 따라 Xist가 치환되었음을 보여준다. 3-hr 및 8-hr 지점에서, 모든 유전자들에서 Ezh2 레벨이 점차적으로 균일하게 증가하였으며, 많은 유전자들이 포화량의 Ezh2를 t=8hr까지 도달하는 것으로 나타났다. t=0hr에서 최고수준의 Ezh2를 갖는 프로모터상에서, Ezh2 레벨은 24hr까지 완전히 회복되지 않았다. 따라서, ChIP 풀다운은 거의 독점적이 아니라면, Xi로부터 대부분 기원하는 것으로 기대되었다. 이와 대조적으로, Enl 대조군에서 Ezh2 레벨, 공지된 상염색체 PRC2 표적은 크게 변하지 않았다. 따라서, Ezh2 레벨은 Xi 도처에 유사한 키네틱으로 내려가고 올라갔다. 1 내지 8hr 사이의 Xist RNA 및 Ezh2 결합 손실은 세포들이 새로운 후생유전 상태를 얻도록 재프로그램될 수 있는 동안의 기회창을 나타낸다.
[표 3]
인간 miRNA의 시드 서열이 아닌 헥사머들
AAAAAA, AAAAAG, AAAACA, AAAAGA, AAAAGC, AAAAGG, AAAAUA, AAACAA, AAACAC, AAACAG, AAACAU, AAACCC, AAACCU, AAACGA, AAACGC, AAACGU, AAACUA, AAACUC, AAACUU, AAAGAU, AAAGCC, AAAGGA, AAAGGG, AAAGUC, AAAUAC, AAAUAU, AAAUCG, AAAUCU, AAAUGC, AAAUGU, AAAUUA, AAAUUG, AACAAC, AACAAG, AACAAU, AACACA, AACACG, AACAGA, AACAGC, AACAGG, AACAUC, AACAUG, AACCAA, AACCAC, AACCAG, AACCAU, AACCCC, AACCCG, AACCGA, AACCGC, AACCGG, AACCUA, AACCUU, AACGAA, AACGAC, AACGAG, AACGAU, AACGCU, AACGGG, AACGGU, AACGUA, AACGUC, AACGUG, AACGUU, AACUAU, AACUCA, AACUCC, AACUCG, AACUGA, AACUGC, AACUGU, AACUUA, AACUUC, AACUUG, AACUUU, AAGAAA, AAGAAG, AAGAAU, AAGACG, AAGAGA, AAGAGC, AAGAGG, AAGAGU, AAGAUU, AAGCAA, AAGCAC, AAGCAG, AAGCAU, AAGCCA, AAGCCC, AAGCCG, AAGCCU, AAGCGA, AAGCGG, AAGCGU, AAGCUA, AAGGAA, AAGGAC, AAGGCU, AAGGGC, AAGGGU, AAGGUU, AAGUAA, AAGUAC, AAGUAU, AAGUCC, AAGUCG, AAGUGA, AAGUGG, AAGUUA, AAGUUU, AAUAAA, AAUAAC, AAUAAG, AAUAAU, AAUACA, AAUACC, AAUACG, AAUAGA, AAUAGC, AAUAGG, AAUAGU, AAUAUC, AAUAUU, AAUCAA, AAUCAU, AAUCCA, AAUCCC, AAUCCG, AAUCGA, AAUCGC, AAUCGU, AAUCUA, AAUCUG, AAUCUU, AAUGAA, AAUGAC, AAUGAG, AAUGAU, AAUGCG, AAUGCU, AAUGGA, AAUGGU, AAUGUA, AAUGUC, AAUGUG, AAUUAA, AAUUAC, AAUUAG, AAUUCC, AAUUCG, AAUUGA, AAUUGG, AAUUGU, AAUUUC, AAUUUG, ACAAAA, ACAAAC, ACAAAG, ACAAAU, ACAACC, ACAACG, ACAACU, ACAAGA, ACAAGC, ACAAGU, ACAAUC, ACAAUG, ACAAUU, ACACAG, ACACCA, ACACCC, ACACCG, ACACCU, ACACGA, ACACGC, ACACGU, ACACUC, ACACUG, ACACUU, ACAGAA, ACAGAC, ACAGCC, ACAGCG, ACAGCU, ACAGGG, ACAGUC, ACAGUG, ACAGUU, ACAUAA, ACAUAC, ACAUCC, ACAUCG, ACAUCU, ACAUGA, ACAUGC, ACAUGU, ACAUUG, ACAUUU, ACCAAA, ACCAAC, ACCAAG, ACCAAU, ACCACC, ACCACG, ACCAGA, ACCAGU, ACCAUA, ACCAUG, ACCAUU, ACCCAA, ACCCAC, ACCCCA, ACCCCG, ACCCGA, ACCCGC, ACCCUA, ACCCUC, ACCCUU, ACCGAA, ACCGAC, ACCGAU, ACCGCA, ACCGCC, ACCGCG, ACCGCU, ACCGGA, ACCGGC, ACCGGU, ACCGUA, ACCGUC, ACCGUG, ACCGUU, ACCUAA, ACCUAC, ACCUAG, ACCUAU, ACCUCA, ACCUCC, ACCUCG, ACCUCU, ACCUGA, ACCUGC, ACCUGU, ACCUUA, ACCUUC, ACCUUU, ACGAAA, ACGAAC, ACGAAG, ACGAAU, ACGACA, ACGACC, ACGACG, ACGACU, ACGAGA, ACGAGC, ACGAGG, ACGAGU, ACGAUA, ACGAUC, ACGAUG, ACGAUU, ACGCAA, ACGCAG, ACGCAU, ACGCCC, ACGCCG, ACGCCU, ACGCGA, ACGCGG, ACGCGU, ACGCUA, ACGCUG, ACGCUU, ACGGAA, ACGGAC, ACGGAG, ACGGAU, ACGGCC, ACGGCG, ACGGCU, ACGGGC, ACGGGG, ACGGGU, ACGGUA, ACGGUC, ACGGUG, ACGGUU, ACGUAA, ACGUAC, ACGUAU, ACGUCC, ACGUCG, ACGUCU, ACGUGA, ACGUGC, ACGUGG, ACGUGU, ACGUUA, ACGUUC, ACGUUG, ACGUUU, ACUAAA, ACUAAG, ACUAAU, ACUACA, ACUACC, ACUACG, ACUACU, ACUAGG, ACUAUC, ACUAUG, ACUAUU, ACUCAU, ACUCCC, ACUCCG, ACUCCU, ACUCGA, ACUCGC, ACUCGG, ACUCUC, ACUCUU, ACUGAG, ACUGAU, ACUGCC, ACUGCG, ACUGCU, ACUGGG, ACUGGU, ACUGUC, ACUUAA, ACUUAC, ACUUAU, ACUUCA, ACUUCC, ACUUCG, ACUUCU, ACUUGA, ACUUGC, ACUUGU, ACUUUA, ACUUUC, ACUUUG, AGAAAA, AGAAAC, AGAAAG, AGAACC, AGAACG, AGAACU, AGAAGC, AGAAGU, AGAAUA, AGAAUC, AGAAUG, AGAAUU, AGACAA, AGACAC, AGACAU, AGACCA, AGACCC, AGACCG, AGACCU, AGACGA, AGACGC, AGACGU, AGACUA, AGACUC, AGACUU, AGAGAC, AGAGAG, AGAGAU, AGAGCC, AGAGCG, AGAGCU, AGAGGC, AGAGGG, AGAGGU, AGAGUA, AGAGUU, AGAUAC, AGAUAG, AGAUAU, AGAUCC, AGAUCG, AGAUCU, AGAUGA, AGAUGC, AGAUGG, AGAUUA, AGAUUC, AGAUUG, AGAUUU, AGCAAC, AGCACA, AGCACG, AGCACU, AGCAGA, AGCAUA, AGCAUC, AGCAUG, AGCCAA, AGCCAU, AGCCCA, AGCCGA, AGCCGC, AGCCGG, AGCCGU, AGCCUA, AGCCUC, AGCGAA, AGCGAG, AGCGAU, AGCGCA, AGCGCC, AGCGCG, AGCGCU, AGCGGA, AGCGGC, AGCGGU, AGCGUA, AGCGUC, AGCGUG, AGCGUU, AGCUAA, AGCUAC, AGCUAG, AGCUAU, AGCUCA, AGCUCC, AGCUCG, AGCUCU, AGCUGA, AGCUGG, AGCUGU, AGCUUC, AGCUUU, AGGAAU, AGGACC, AGGACG, AGGAGA, AGGAGU, AGGAUA, AGGCAA, AGGCAU, AGGCCG, AGGCGA, AGGCGC, AGGCGG, AGGCUA, AGGCUC, AGGCUU, AGGGAC, AGGGAU, AGGGGA, AGGGGU, AGGGUA, AGGGUG, AGGUAA, AGGUAC, AGGUCA, AGGUCC, AGGUCU, AGGUGA, AGGUGC, AGGUGG, AGGUGU, AGGUUC, AGGUUG, AGUAAA, AGUAAG, AGUAAU, AGUACA, AGUACG, AGUAGC, AGUAGG, AGUAUA, AGUAUC, AGUAUG, AGUAUU, AGUCAA, AGUCAC, AGUCAG, AGUCAU, AGUCCA, AGUCCG, AGUCCU, AGUCGA, AGUCGC, AGUCGG, AGUCGU, AGUCUA, AGUCUC, AGUCUG, AGUCUU, AGUGAA, AGUGAC, AGUGCG, AGUGGG, AGUGUC, AGUUAA, AGUUAC, AGUUAG, AGUUCC, AGUUCG, AGUUGA, AGUUGC, AGUUGU, AGUUUA, AGUUUC, AGUUUG, AGUUUU, AUAAAC, AUAAAU, AUAACA, AUAACC, AUAACG, AUAACU, AUAAGA, AUAAGC, AUAAGG, AUAAGU, AUAAUC, AUAAUG, AUAAUU, AUACAC, AUACAG, AUACAU, AUACCA, AUACCC, AUACCG, AUACGA, AUACGC, AUACGG, AUACGU, AUACUA, AUACUC, AUACUG, AUACUU, AUAGAA, AUAGAC, AUAGAU, AUAGCA, AUAGCG, AUAGCU, AUAGGA, AUAGGU, AUAGUA, AUAGUC, AUAGUG, AUAGUU, AUAUAC, AUAUAG, AUAUCC, AUAUCG, AUAUCU, AUAUGA, AUAUGC, AUAUGG, AUAUGU, AUAUUC, AUAUUG, AUAUUU, AUCAAA, AUCAAC, AUCAAG, AUCAAU, AUCACA, AUCACC, AUCACG, AUCAGC, AUCAGG, AUCCAA, AUCCAU, AUCCCC, AUCCCG, AUCCGA, AUCCGC, AUCCGG, AUCCUA, AUCCUC, AUCCUG, AUCGAA, AUCGAC, AUCGAG, AUCGAU, AUCGCA, AUCGCC, AUCGCG, AUCGCU, AUCGGC, AUCGGG, AUCGGU, AUCGUC, AUCGUG, AUCGUU, AUCUAA, AUCUAC, AUCUAG, AUCUAU, AUCUCC, AUCUCG, AUCUGU, AUCUUG, AUCUUU, AUGAAA, AUGAAC, AUGAAG, AUGAAU, AUGACC, AUGACU, AUGAGG, AUGAGU, AUGAUA, AUGAUC, AUGAUU, AUGCAA, AUGCAG, AUGCCA, AUGCCC, AUGCCG, AUGCGA, AUGCGG, AUGCGU, AUGCUC, AUGCUU, AUGGAC, AUGGCC, AUGGGA, AUGGGC, AUGGGU, AUGGUC, AUGGUG, AUGUAC, AUGUAU, AUGUCA, AUGUCC, AUGUCG, AUGUGU, AUGUUA, AUGUUC, AUUAAA, AUUAAC, AUUAAG, AUUAAU, AUUACA, AUUACC, AUUACG, AUUACU, AUUAGA, AUUAGC, AUUAGG, AUUAGU, AUUAUA, AUUAUC, AUUAUG, AUUCAC, AUUCCA, AUUCCG, AUUCCU, AUUCGA, AUUCGC, AUUCGG, AUUCGU, AUUCUA, AUUCUC, AUUCUU, AUUGAA, AUUGAC, AUUGAU, AUUGCC, AUUGCG, AUUGCU, AUUGGA, AUUGGC, AUUGGG, AUUGGU, AUUGUA, AUUGUC, AUUGUG, AUUGUU, AUUUAA, AUUUAG, AUUUAU, AUUUCC, AUUUCG, AUUUCU, AUUUGA, AUUUGC, AUUUGU, AUUUUA, AUUUUC, AUUUUG, AUUUUU, CAAAAG, CAAACA, CAAACC, CAAACG, CAAACU, CAAAGA, CAAAGG, CAAAUA, CAAAUU, CAACAC, CAACAU, CAACCA, CAACCC, CAACCG, CAACGA, CAACGC, CAACGG, CAACGU, CAACUA, CAACUC, CAACUG, CAACUU, CAAGAA, CAAGAC, CAAGAU, CAAGCA, CAAGCC, CAAGCG, CAAGCU, CAAGGA, CAAGGG, CAAGUC, CAAGUG, CAAGUU, CAAUAA, CAAUAC, CAAUAG, CAAUCC, CAAUCG, CAAUCU, CAAUGA, CAAUGC, CAAUGG, CAAUGU, CAAUUC, CAAUUG, CAAUUU, CACAAU, CACACA, CACACG, CACACU, CACAGA, CACAGC, CACAGG, CACAUA, CACAUC, CACAUU, CACCAA, CACCAC, CACCAU, CACCCA, CACCCC, CACCCG, CACCGA, CACCGC, CACCGG, CACCGU, CACCUA, CACCUU, CACGAA, CACGAC, CACGAG, CACGAU, CACGCA, CACGCC, CACGCU, CACGGA, CACGGC, CACGGG, CACGGU, CACGUA, CACGUC, CACGUG, CACGUU, CACUAA, CACUAG, CACUAU, CACUCA, CACUCG, CACUGA, CACUGC, CACUGG, CACUUA, CACUUC, CACUUU, CAGAAA, CAGAAG, CAGAAU, CAGACC, CAGACG, CAGAGC, CAGAUA, CAGAUC, CAGCCG, CAGCCU, CAGCGA, CAGCGC, CAGCGG, CAGCGU, CAGCUC, CAGCUU, CAGGAU, CAGGGG, CAGGGU, CAGGUA, CAGGUC, CAGGUU, CAGUAC, CAGUCG, CAGUUG, CAUAAA, CAUAAC, CAUAAG, CAUAAU, CAUACA, CAUACC, CAUACG, CAUACU, CAUAGA, CAUAGG, CAUAGU, CAUAUA, CAUAUC, CAUAUG, CAUCAA, CAUCAC, CAUCAG, CAUCAU, CAUCCA, CAUCCC, CAUCCG, CAUCGA, CAUCGC, CAUCGG, CAUCGU, CAUCUA, CAUCUC, CAUCUG, CAUCUU, CAUGAA, CAUGAC, CAUGAG, CAUGAU, CAUGCA, CAUGCC, CAUGCG, CAUGCU, CAUGGC, CAUGGG, CAUGGU, CAUGUA, CAUGUC, CAUGUU, CAUUAA, CAUUAC, CAUUAG, CAUUCA, CAUUCC, CAUUCG, CAUUCU, CAUUGA, CAUUGG, CAUUUC, CAUUUG, CAUUUU, CCAAAA, CCAAAC, CCAAAG, CCAAAU, CCAACA, CCAACC, CCAACG, CCAACU, CCAAGA, CCAAGC, CCAAGG, CCAAUC, CCAAUG, CCAAUU, CCACAA, CCACAC, CCACAG, CCACAU, CCACCA, CCACCC, CCACCG, CCACCU, CCACGA, CCACGC, CCACGG, CCACGU, CCACUA, CCACUC, CCACUU, CCAGAA, CCAGAC, CCAGAG, CCAGCC, CCAGGU, CCAGUC, CCAGUU, CCAUAA, CCAUAC, CCAUAG, CCAUAU, CCAUCA, CCAUCC, CCAUCU, CCAUGA, CCAUGC, CCAUGG, CCAUUC, CCAUUG, CCAUUU, CCCAAC, CCCAAG, CCCAAU, CCCACA, CCCAGA, CCCAGC, CCCAGU, CCCAUA, CCCAUC, CCCAUG, CCCAUU, CCCCAA, CCCCAG, CCCCAU, CCCCCC, CCCCCG, CCCCCU, CCCCGA, CCCCGC, CCCCGU, CCCCUA, CCCCUC, CCCGAA, CCCGAC, CCCGAU, CCCGCA, CCCGCU, CCCGGA, CCCGGC, CCCGUA, CCCGUG, CCCGUU, CCCUAA, CCCUAG, CCCUCA, CCCUCU, CCCUGC, CCCUUA, CCCUUC, CCCUUU, CCGAAA, CCGAAC, CCGAAU, CCGACA, CCGACC, CCGACG, CCGACU, CCGAGA, CCGAGG, CCGAGU, CCGAUA, CCGAUC, CCGAUG, CCGAUU, CCGCAA, CCGCAC, CCGCAG, CCGCAU, CCGCCA, CCGCCC, CCGCCG, CCGCCU, CCGCGA, CCGCGC, CCGCGG, CCGCGU, CCGCUA, CCGCUC, CCGCUG, CCGCUU, CCGGAA, CCGGAU, CCGGCA, CCGGCC, CCGGCG, CCGGCU, CCGGGA, CCGGGC, CCGGGG, CCGGGU, CCGGUA, CCGGUC, 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확대된 PRC2 전사체에 의한 각인 영역 힛트
PRC2-결합 전사물 및 염색체 가닥에 의해 터겟팅된 각인 유전자 PRC2-결합 전사물의 mm9 좌표들 및 염색체 가닥 서열 마우스 refGene에 대한 MGI 인간 유전자 명칭 PRC2-결합 전사물의 인간 리프트오버 좌표들(hg19) 및 염색체 가닥 서열
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Wt1 (22431)+ chr2: 104956685-105023768- B934763 WT1(7490)- chr11:32400584-32466719+ B934865
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전술한 명세서는 당해 기술분야의 당업자가 본 발명을 실행하기에 충분한 것으로 여겨진다. 본 발명은 제공되는 실시예가 본 발명의 일 측면의 단일 예시로서 의도되며 다른 기능적으로 대등한 구현예가 본 발명의 범위 내에 존재하기 때문에, 실시예에 의해 범위가 제한되지 않는다. 본원에 도시되며 기술되는 것 외에도 본 발명의 다양한 변형들은 상기 상세한 설명을 통해 당해 기술분야의 당업자에게 명확해질 것이며 첨부되는 청구항의 범위에 속할 것이다. 본 발명의 이점 및 목적은 본 발명의 각 구현예에 의해 본질적으로 포함되지 않는다.

Claims (107)

  1. 표적 유전자의 발현을 활성화시키기 위해 후보물질 올리고뉴클레오타이드를 선택하는 방법으로서,
    상기 방법은 제1 뉴클레오타이드 서열내 PRC2-연관 영역을 선택하는 단계(제1 뉴클레오타이드 서열은 표적 유전자의 5’말단의 50킬로베이스 상류와 표적 유전자의 3’말단의 50킬로베이스 하류 사이의 제1 염색체의 위치로 맵핑됨);
    PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 제2 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계; 및
    제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 후보물질 올리고뉴클레오타이드로서 선택하는 단계를 포함하며,
    상기 올리고뉴클레오타이드는 하기 특징들 중 적어도 하나:
    a) 서열: 5’-X-Y-Z(여기에서, X는 뉴클레오타이드이며, Y는 인간 마이크로RNA의 시드 서열이 아닌, 길이가 6개 뉴클레오타이드들인 뉴클레오타이드 서열이며, 및 Z는 길이가 1 내지 23개 뉴클레오타이드들인 뉴클레오타이드 서열이며, X는 올리고뉴클레오타이드의 5’말단에 앵커링됨);
    b) 3개 이상의 연속 구아노신 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 서열;
    c) 오프-표적 유전자의 5’말단의 50킬로베이스 상류와 오프-표적 유전자의 3’말단의 50킬로베이스 하류 사이에 있는, 제2 뉴클레오타이드 서열과 균등한 길이의 뉴클레오타이드들의 모든 서열들과의 역치 수준보다 낮은 서열 상동성을 갖는 서열;
    d) 2개 이상의 단일 가닥 루프들을 포함하는 2차 구조를 형성하는 RNA를 코딩하는 PRC2-연관 영역에 대하여 상보적인 서열; 또는
    e)60% 초과 G-C 함량을 갖는 서열.
  2. 제1항에 있어서,
    단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 길이가 50개 이하의 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 길이가 8 내지 30개 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드는 특징들 a), b), c), d) 및 e) 중 2가지 이상을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드는 특징들 a), b), c), d) 및 e) 중 3가지 이상을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드는 특징들 a), b), c), d) 및 e) 중 4가지 이상을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드는 각 특징들 a), b), c), d) 및 e)를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 표적 유전자의 발현을 활성화하는 올리고뉴클레오타이드가 풍부한 올리고뉴클레오타이드들 세트를 선택하는 방법으로서,
    상기 방법은, 표적 유전자의 5’-말단의 50킬로베이스 상류와 표적 유전자의 3’-말단의 50킬로베이스 하류 사이의 제1 염색체의 위치로 맵핑된 제1 뉴클레오타이드 서열내 PRC2-연관 영역을 선택하는 단계;
    PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 및 하기 특징들 중 적어도 하나를 가지는 올리고뉴클레오타이드들 세트를 선택하는 단계를 포함하며:
    a) 서열: 5’-X-Y-Z(여기에서, X는 뉴클레오타이드이며, Y는 마이크로RNA의 인간 시드 서열이 아닌 길이가 6개 뉴클레오타이드들인 뉴클레오타이드 서열이며, 및 Z는 길이가 1 내지 23개 뉴클레오타이드들인 뉴클레오타이드 서열이며, X는 올리고뉴클레오타이드의 5’말단에 앵커링됨);
    b) 3개 이상의 연속 구아노신 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 서열;
    c) 오프-표적 유전자의 5’말단의 50킬로베이스 상류와 오프-표적 유전자의 3’말단의 50킬로베이스 하류 사이에 있는 제2 뉴클레오타이드 서열과 균등한 길이의 뉴클레오타이드들의 모든 서열들과의 역치 수준보다 낮은 서열 상동성을 갖는 서열;
    d) 2개 이상의 단일 가닥 루프들을 포함하는 2차 구조를 형성하는 RNA를 코딩하는 PRC2-연관 영역에 대하여 상보적인 서열; 및/또는
    e) 60% 초과 G-C 함량을 갖는 서열, 및
    상기 올리고뉴클레오타이드 세트는 표적 유전자의 발현을 활성화하는 올리고뉴클레오타이드들이 풍부한 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    각 올리고뉴클레오타이드들은 길이가 50개 이하의 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    각 올리고뉴클레오타이드들은 길이가 8 내지 30개 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    세트내 각 올리고뉴클레오타이드들은 특징들 a), b), c), d), 및 e) 중 1가지 이상을 공유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    세트내 각 올리고뉴클레오타이드들은 특징들 a), b), c), d), 및 e) 중 2가지 이상을 공유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제8항에 있어서,
    세트내 각 올리고뉴클레오타이드들은 특징들 a), b), c), d), 및 e) 중 3가지 이상을 공유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제8항에 있어서,
    세트내 각 올리고뉴클레오타이드들은 특징들 a), b), c), d), 및 e) 중 4가지 이상을 공유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제8항에 있어서,
    세트내 각 올리고뉴클레오타이드들은 각 특징들 a), b), c), d), 및 e)를 공유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 상동성의 역치 수준은 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 상동성인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 염색체는 첫번째 종의 염색체이며, 및
    상기 방법은 제2 뉴클레오타이드 서열이 두번째 종들의 제2 염색체의 제2 영역에 대하여 상보적인지를 결정하는 단계를 포함하며,
    상기 제2 영역은 표적 유전자의 호모로그의 5’-말단의 50킬로베이스 상류와 표적 유전자의 호모로그의 3’-말단의 50킬로베이스 하류 사이에 위치되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    제2 뉴클레오타이드 서열은 제2 염색체의 제2 영역에 대하여 적어도 80% 상보적인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 뉴클레오타이드 서열은 표적 유전자의 센스 가닥을 포함하는 제1 염색체의 가닥으로 맵핑하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 뉴클레오타이드 서열은 표적 유전자의 안티센스 가닥을 포함하는 제1 염색체의 가닥으로 맵핑하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 5’말단의 상류인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 3’말단의 하류인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 인트론내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 엑손내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 인트론-엑손 접합부, 5’-UTR-엑손 접합부 또는 3’-UTR-엑손 접합부를 횡단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRC2-연관 영역은 2개 이상의 단일 가닥 루프들을 포함하는 2차 구조를 형성하는 RNA를 코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    2차 구조는 2개 이상의 단일 가닥 루프들 사이에 이중 가닥 스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서,
    상기 방법은 PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드들이 1개 이상의 루프들의 적어도 일부를 코딩하는지를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드들이 2개 이상의 루프들의 적어도 일부를 코딩하는지를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드들은 이중 가닥 스템의 적어도 일부를 코딩하는지를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 표적 유전자의 5’-말단의 50킬로베이스 상류와 표적 유전자의 3’-말단의 50킬로베이스 하류 사이의 제1 염색체에 위치된 PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드와 상보적인 상보성 영역을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드로서,
    상기 올리고뉴클레오타이드는:
    a) 5’-X-Y-Z(여기에서, X는 뉴클레오타이드이며, Y는 마이크로RNA의 인간 시드 서열이 아닌 길이가 6개 뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드 서열이며, 및 Z는 길이가 1 내지 23개 뉴클레오타이드들인 뉴클레오타이드 서열임)를 포함하는 서열;
    b) 3개 이상의 연속 구아노신 뉴클레오타이드들을 포함하지 않는 서열;
    c) 오프-표적 유전자의 5’-말단의 50킬로베이스 상류와 오프-표적 유전자의 3’-말단의 50킬로베이스 하류 사이에 있는, 제2 뉴클레오타이드 서열과 균등한 길이의 모든 뉴클레오타이드 서열과 역치 수준보다 낮은 서열 상동성을 갖는 서열;
    d) 2개 이상의 단일 가닥 루프들을 포함하는 2차 구조를 형성하는 RNA를 코딩하는 RPC2-연관 영역에 대하여 상보적인 서열; 및/또는
    e) 60% 초과 G-C 함량을 갖는 서열
    중 적어도 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  32. 제31항에 있어서,
    제1 염색체는 제1 종들의 염색체이며, 및 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드들을 포함하는 서열은 표적 유전자의 호모로그의 5’말단의 50킬로베이스 상류와 표적 유전자의 호모로그의 3’말단의 50킬로베이스 하류 사이의 제2 염색체내에 위치되어 있으며, 제2 염색체는 제2 종들의 염색체인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  33. 제32항에 있어서,
    제1 종은 인간이며, 제2 종은 마우스인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드는 특징들 a), b), c), d) 및 e) 중 2가지 이상을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드는 특징들 a), b), c), d) 및 e) 중 3가지 이상을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드는 특징들 a), b), c), d) 및 e) 중 4가지 이상을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드는 각 특징들 a), b), c), d) 및 e)를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드는 길이가 50개 이하의 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드는 길이가 8 내지 30개 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  40. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드는 길이가 8 내지 10개 뉴클레오타이드이며, PRC2-연관 영역의 상보서열의 1, 2 또는 3개 뉴클레오타이드들 외에 모두가 시토신 또는 구아노신 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  41. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    염색체의 가닥내 PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드들은 표적 유전자의 센스 가닥을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  42. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    염색체의 가닥내 PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드들은 표적 유전자의 안티센스 가닥을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  43. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 5’말단의 상류인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  44. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 3’말단의 하류인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  45. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 인트론 내에 있는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  46. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 엑손 내에 있는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  47. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRC2-연관 영역은 표적 유전자의 인트론-엑손 접합부, 5’-UTR-엑손 접합부 또는 3’-UTR-엑손 접합부를 횡단하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  48. 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRC2-연관 영역은 2개 이상의 단일 가닥 루프들을 포함하는 2차 구조를 형성하는 RNA를 코딩하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  49. 제48항에 있어서,
    2차 구조는 2개 이상의 단일 가닥 루프들 사이에 이중 가닥 스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서,
    PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드는 1개 이상의 루프들의 적어도 일부를 코딩하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드는 2개 이상의 루프들의 적어도 일부를 코딩하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    PRC2-연관 영역의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드는 이중 가닥 스템의 적어도 일부를 코딩하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  53. 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 1개 이상의 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 유사체인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  54. 제53항에 있어서,
    1개 이상의 뉴클레오타이드 유사체로 인해, 1개 이상의 뉴클레오타이드 유사체를 갖지 않는 올리고뉴클레오타이드에 비해, 올리고뉴클레오타이드의 Tm이 1 내지 5℃ 범위내에서 증가하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  55. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 1개 이상의 뉴클레오타이드는 2’O-메틸을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  56. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 각 뉴클레오타이드는 2’O-메틸을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  57. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드는 1개 이상의 리보뉴클레오타이드, 1개 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 1개 이상의 가교 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  58. 제57항에 있어서,
    가교 뉴클레오타이드는 LNA 뉴클레오타이드, cEt 뉴클레오타이드 또는 ENA 뉴클레오타이드 유사체인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  59. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 각 뉴클레오타이드는 LNA 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  60. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 교대의 데옥시리보뉴클레오타이드들 및 2’-플루오로-데옥시리보뉴클레오타이드들을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  61. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 교대의 데옥시리보뉴클레오타이드들 및 2’-O-메틸 뉴클레오타이드들을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  62. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 교대의 데옥시리보뉴클레오타이드 및 ENA 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  63. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 교대의 데옥시리보뉴클레오타이드 및 LNA 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 5’뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  65. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 교대의 LNA 뉴클레오타이드 및 2’-O-메틸 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  66. 제65항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 5’뉴클레오타이드는 LNA 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  67. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드의 5’ 및 3’말단 각각 상에서 1개 이상의 LNA 뉴클레오타이드에 의해 플랭킹된 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  68. 제31항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    2개 이상의 뉴클레오타이드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합들을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  69. 제68항에 있어서,
    모든 뉴클레오타이드들 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합들을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  70. 제31항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 3’위치에서 뉴클레오타이드는 3’하이드록실기를 가지는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  71. 제31항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 3’위치에서 뉴클레오타이드는 3’티오포스페이트를 가지는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  72. 제31항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    5’ 뉴클레오타이드에 공액된 비오틴 부분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  73. 제31항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    5’ 또는 3’뉴클레오타이드 또는 둘다에 대한 1개 이상의 하기 콘쥬게이트들: 콜레스테롤, 비타민 A, 엽산, 시그마 수용체 리간드, 앱타머, 펩타이드, 예를 들면 CPP, 소수성 분자들, 예를 들면 지질, ASGPR 또는 동적 폴리콘쥬게이트 및 이들의 변이체들을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  74. 표적 유전자의 발현을 조절하는 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)의 8개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 상보성 영역을 갖는 길이가 8 내지 30개 뉴클레오타이드들인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드로서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 2-19개 뉴클레오타이드들은 뉴클레오타이드 유사체들인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  75. 제74항에 있어서,
    각 뉴클레오타이드 유사체로 인해, 뉴클레오타이드 유사체를 갖지 않는 올리고뉴클레오타이드에 비해, 올리고뉴클레오타이드의 Tm이 1 내지 5℃ 범위내에서 증가하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  76. 제74항에 있어서,
    뉴클레오타이드 유사체는 가교 뉴클레오타이드, 2’플루오로 및 2’O-메틸 뉴클레오타이드로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  77. 제76항에 있어서,
    가교 뉴클레오타이드는 LNA, ENA 또는 cEt 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  78. 제74항에 있어서,
    뉴클레오타이드는 교대 데옥시리보뉴클레오타이드 및 2’-플루오로-데옥시리보뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  79. 제74항에 있어서,
    뉴클레오타이드는 교대 데옥시리보뉴클레오타이드 및 2’-O-메틸 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  80. 제74항에 있어서,
    뉴클레오타이드는 교대 데옥시리보뉴클레오타이드 및 ENA 뉴클레오타이드 유사체들을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  81. 제74항에 있어서,
    뉴클레오타이드는 교대 데옥시리보뉴클레오타이드 및 LNA 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  82. 제74항에 있어서,
    단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 5’뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  83. 제74항에 있어서,
    뉴클레오타이드는 교대 LNA 뉴클레오타이드 및 2’-O-메틸 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  84. 제74항에 있어서,
    단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 5’뉴클레오타이드는 LNA 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  85. 제74항에 있어서,
    뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드의 각 5’ 및 3’ 말단 상에서 1개 이상의 LNA 뉴클레오타이드에 의해 플랭킹된 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  86. 제74항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서,
    2개 이상의 뉴클레오타이드들 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합들을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  87. 제74항에 있어서,
    단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 3’ 위치에 있는 뉴클레오타이드는 3’하이드록실기를 가지는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  88. 제74항에 있어서,
    단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 3’위치에 있는 뉴클레오타이드는 3’티오포스페이트를 가지는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  89. 표적 유전자의 발현을 조절하는 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)의 5개 이상의 연속 뉴클레오타이드와 상보적인 상보성 영역을 갖는, 길이가 5 내지 30개 뉴클레오타이드들인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드로서,
    올리고뉴클레오타이드는 제거가능한 링커에 의해 제2 올리고뉴클레오타이드에 결합되는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  90. 제74항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드는 제31항 내지 제73항 중 어느 한 항의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  91. 단백질-코딩 참조 유전자의 발현을 조절하는 PRC2-결합 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)의 5개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 상보성 영역을 갖는, 길이가 8 내지 40개 뉴클레오타이드들인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드로서,
    lncRNA는 단백질-코딩 참조유전자를 함유하는 게놈 영역에서 단백질-코딩 참조유전자와 반대 가닥으로부터 전사되며,
    단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 엑손내에서 기원하거나 엑손과 오버랩하는 lncRNA의 영역, 인트론, 엑손, 인트론-엑손 접합부, 5’UTR, 3’UTR, 해독 개시 영역 또는 해독 종결 영역에 결합하는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  92. 표적 유전자의 발현을 조절하는 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)의 5개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 상보성 영역을 갖는, 길이가 8 내지 40개 뉴클레오타이드들인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드로서,
    올리고뉴클레오타이드는 표적 유전자의 전사된 영역의 외부에 있는 lncRNA의 영역에서 lncRNA에 대하여 상보성을 갖는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  93. 표적 유전자의 발현을 억제하는 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)의 5개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 상보성 영역을 갖는, 길이가 8 내지 30개 뉴클레오타이드들인 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드로서,
    올리고뉴클레오타이드는 표적 유전자의 비-코딩 부분으로부터 전사된 lncRNA의 영역에서 lncRNA에 대하여 상보성을 갖는 것을 특징으로 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드.
  94. 제31항 내지 제73항 중 어느 한 항의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 및 운반체를 포함하는 조성물.
  95. 제31항 내지 제73항 중 어느 한 항의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 및 버퍼 용액을 포함하는 조성물.
  96. 제31항 내지 제73항 중 어느 한 항의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 및 약제학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약제학적 조성물.
  97. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항의 조성물을 담는 용기를 포함하는 키트.
  98. 표적 유전자의 발현을 조절하는 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)의 5개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 상보성 영역을 갖는, 길이가 8 내지 20개 뉴클레오타이드들인 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오타이드의 조성물로서,
    올리고뉴클레오타이드의 2 내지 19개 뉴클레오타이드는 약제학적으로 수용가능한 운반체내에 배합된, 뉴클레오타이드 유사체들이며, 상보적인 RNA 올리고뉴클레오타이드는 조성물에 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  99. 제98항에 있어서,
    뉴클레오타이드 유사체들은 가교 뉴클레오타이드, 2’플루오로 및 2’O-메틸 뉴클레오타이드로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  100. 제99항에 있어서,
    가교 뉴클레오타이드는 LNA, ENA 또는 cEt 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  101. 제98항에 있어서,
    lncRNA는 표적 유전자를 함유하는 게놈 영역에서 표적 유전자와 반대인 가닥으로부터 전사되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  102. 제98항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드는 표적 유전자의 비-코딩 부분으로부터 전사된 lncRNA의 영역에서 lncRNA에 대하여 상보성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  103. 제98항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드는 표적 유전자의 전사된 영역의 외부에 있는 lncRNA의 영역에서 lncRNA에 대하여 상보성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  104. 세포내 표적 유전자의 발현을 증가시키는 방법으로서,
    상기 방법은 제31항 내지 제73항 중 어느 한 항의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 세포에 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  105. 개체내 표적 유전자의 레벨을 증가시키는 방법으로서,
    상기 방법은 제31항 내지 제73항 중 어느 한 항의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  106. 개체내 표적 유전자의 감소된 레벨과 관련된 질환을 치료하는 방법으로서,
    상기 방법은 제31항 내지 제73항 중 어느 한 항의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  107. 유전자 발현을 상향조절하는 방법으로서,
    표적 유전자의 발현을 억제하는 긴 비-코딩 RNA(lncRNA)의 5개 이상의 연속 뉴클레오타이드들과 상보적인 상보성 영역을 갖는, 길이가 8 내지 30개 뉴클레오타이드인 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오타이드와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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