KR20160034332A - Ａａｖ 벡터 및 항―ａａｖ （아데노-관련 바이러스） 중화 항체에 대한 검정 - Google Patents

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Abstract

바이러스 벡터, 바이러스 입자, 및 바이러스 항체를 스크리닝하고, 검출하고, 분석하고 이의 양을 측정하거나, 샘플의 항체 활성을 중화하기 위한 방법 및 용도가 제공된다. 이러한 바이러스 벡터, 바이러스 입자, 및 방법 및 용도가 광범위한 바이러스 타입 예컨대, 렌티바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 (AAV) 혈청형에 적용가능하다. 방법 및 용도는 바이러스 항체 스크리닝 예컨대, 스크리닝되고, 검출되고, 분석되고 그 양이 측정되는 항-바이러스 면역글로불린을 포함한다.

Description

ＡＡＶ 벡터 및 항―ＡＡＶ （아데노-관련 바이러스） 중화 항체에 대한 검정 {AAV VECTOR AND ASSAY FOR ANTI-AAV (ADENO-ASSOCIATED VIRUS) NEUTRALIZING ANTIBODIES}
관련 출원 정보
본 출원은 제목 "AAV 벡터 및 항-AAV (아데노-관련 바이러스) 중화 항체에 대한 검정 (AAV VECTOR AND ASSAY FOR ANTI-AAV (ADENO ASSOCIATED VIRUS) NEUTRALIZING ANTIBODIES)"의 2013년 7월 12일 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/845,841에 대한 우선권을 주장하며, 이 출원은 그 전체가 본원에 참조로서 명백히 통합된다.
아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터에 대한 체액성 면역은 혈관내 유전자 전이에 대한 중요한 배리어를 나타내며, 이는 벡터가 표적 세포로 유입되기 전에 벡터의 제거를 유도한다. AAV 캡시드에 대해 유도된 항체는 이러한 바이러스에 대한 천연 숙주인 인간에서 고도로 널리 퍼져있으며, 캡시드 단백질 서열의 상동성 정도로 인해 광범위한 혈청형과 상호반응한다. 그 결과, 벡터가 혈류내로 도입되는 경우 비교적 훨씬 낮은 역가의 중화 항체 (NAb)가 AAV 형질도입을 차단할 수 있다. 정반대로, AAV 벡터의 눈, 뇌로의 유전자 전이 또는 직접적인 근육내 전달은 NAb에 의한 중화에 덜 민감한 것으로 보인다.
AAV에 대한 NAb는 윤활액 (SF)에서 발견되며, 혈청형 의존 방식으로 벡터-매개된 형질도입을 억제할 잠재력을 갖는다. 그러나, SF에서 다양한 혈청형에 대한 Nab 수준 및 혈청 vs SF중 항-AAV NAb 역가 간의 관계에 대해서는 알려지지 않았다. 최종적으로, NAb가 생체내에서 AAV-매개된 형질도입을 효율적으로 차단할 수 있기 때문에, 바이러스 캡시드에 대한 체액성 면역을 극복하기 위한 전략은 성공적인 유전자 전이를 달성하는데 매우 중요하다.
요약
바이러스 벡터, 바이러스 입자, 및 바이러스 항체를 스크리닝하고, 검출하고, 분석하고 이의 양을 측정하거나, 샘플의 항체 활성을 중화시키는 방법 및 용도가 본원에 기술되어 있다. 이러한 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 방법 및 용도는 광범위한 바이러스 유형 예컨대, 렌티바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 (AAV) 혈청형에 적용가능하다. 다양한 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 항체 스크리닝 방법 및 용도를 이용하여, 항-바이러스 면역글로불린 (g), 예컨대, IgG, IgA, IgM, IgE, IgD가 스크리닝되고, 검출되고, 분석되고 그 양이 측정될 수 있다.
이러한 스크리닝, 검출, 분석 또는 양 측정 결과는 렌티바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스 (AAV) 혈청형을 사용하여 (결함 또는 결핍 유전자를 대체하거나 보충하기 위해 또는 결함 또는 바람직하지 않은 유전자의 발현을 넉다운 또는 넉아웃시키기 위해) 유전자 요법에 대한 벡터 유형 또는 용량, 또는 대상체의 적합성을 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체가 특정 바이러스 혈청형 예컨대, AAV 혈청형 2 (AAV2)에 대한 항체를 거의 또는 전혀 발현하지 않는 경우, 그러면 대상체는 AAV2 매개된 유전자 요법에 대한 적합한 후보자일 것이다. 대상체가 특정 바이러스 혈청형 예컨대, AAV2에 대한 중간 또는 상당한 양의 항체를 발현하는 경우, 그러면 대상체는 AAV2 매개된 유전자 요법 또는 B-세포 반응의 약물학적 조절 제제 또는 방법과 조합된 그러한 요법에 대한 더 많은 용량 또는 그 초과의 용량의 AAV2 벡터를 요구할 수 있다. 따라서, 대상체에서 유전자 전이가 달성될 수 있으며, 그렇지 않으면 바이러스 벡터 유전자 전이 요법에 대한 이상적인 후보자가 아닐 것이다. 대안적으로, 이용가능한 경우, 비(non)-AAV2 벡터 (예컨대, 또 다른 AAV 혈청형)가 이러한 대상체에 대한 유전자 요법을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 바이러스 벡터 투여는 바이러스 항체의 존재 또는 부재, (존재한다면) 존재하는 바이러스 항체의 유형 및/또는 양 (예를 들어, 역가), 및 대상체에서 바이러스 항체의 존재, 유형 및 양을 기반으로 해당 대상체에 대해 선택된 벡터를 기반으로 개인에 맞춰질 수 있다.
본 발명에 따르면, 재조합 AAV 벡터 서열이 제공되며, 벡터 서열은 리포터 전이유전자를 포함한다. 일 구체예에서, 재조합 AAV 벡터 서열은 리포터 전이유전자를 포함하며, 이러한 리포터 전이유전자는 (a) 단일-가닥 또는 자기-상보성 게놈을 포함하며, (b) 하나 이상의 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결되며, (c) 하나 이상의 측면인접 요소에 의해 인접하게 된다.
본 발명에 따르면, 재조합 AAV 벡터로서, 리포터 전이유전자를 포함하는 벡터가 또한 제공된다. 일 구체예에서, 재조합 AAV 벡터는 리포터 전이유전자를 포함하며, 이러한 리포터 전이유전자는 (a) 단일-가닥 또는 자기-상보성 게놈을 포함하며, (b) 하나 이상의 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결되며, (c) 하나 이상의 측면인접 요소에 의해 인접하게 된다. 특정 구체예에서, 재조합 AAV 벡터는 감염성 재조합 AAV 입자를 포함한다.
본 발명에 따르면, AAV에 결합하는 항체를 분석하거나 검출하거나 측정하기 위한 방법 및 용도가 추가로 제공된다. 일 구체예에서, 방법 또는 용도는 A) 재조합 벡터를 캡시드화시키는 감염성 재조합 AAV 입자를 제공하며 (여기에서, (i) 벡터는 리포터 전이유전자를 포함하며, (ii) 리포터 전이유전자는 단일-가닥 또는 자기-상보성 게놈을 포함하며, (iii) 리포터 전이유전자는 하나 이상의 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결되며, 하나 이상의 측면인접 요소에 의해 인접하게 됨); B) AAV에 결합하는 항체를 분석하거나 검출하기 위한 대상체로부터 생물학적 샘플을 제공하고; C) 상기 감염성 재조합 AAV 입자로 감염될 수 있는 세포를 제공하고; D) (A)의 감염성 재조합 AAV 입자와 (B)의 생물학적 샘플과 접촉시키거나 인큐베이션시켜 반응 혼합물 (M)을 생성시키고; (C)의 세포와 생성 혼합물 (M)을 (A)의 감염성 재조합 AAV 입자가 감염되고 상기 세포에서 리포터 전이유전자를 발현할 수 있는 조건하에 접촉시키고; 리포터 전이유전자의 발현을 측정하고; (f)의 상기 리포터 전이유전자 발현을 대조군의 리포터 전이유전자 발현과 비교하는 것 (상기 대조군은 (i) AAV에 결합하는 항체가 결여되거나 (ii) AAV에 결합하는 소정량의 항체를 갖는 음성 (-) 대조군임)을 포함한다. 상기 (-) 대조군의 리포터 전이유전자 발현보다 큰 (f)의 리포터 전이유전자 발현은 생물학적 샘플에서 AAV에 결합하는 항체의 존재를 분석하거나 검출하거나 측정한다. AAV에 결합하는 소정량의 항체의 리포터 전이유전자 발현과 비교된 (f)의 리포터 전이유전자 발현은 대조군보다 많거나 적은 생물학적 샘플에서 항체를 분석하거나 검출하거나 측정한다.
본 발명의 특정 양태에서, 재조합 벡터는 AAV 벡터를 포함한다. 더욱 특정 양태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74, 또는 Rh10, 또는 임의의 상기 AAV 벡터의 하이브리드 또는 키메라를 포함한다.
본 발명의 특정 양태에서, 방법 또는 용도는 시험관내에서 수행된다. 예를 들어, 세포는 감염성 재조합 AAV 입자와 시험관내에서 접촉되거나 인큐베이션될 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예에서, 분석되거나, 검출되거나 측정된 항체는 바이러스 엔벨로프 또는 캡시드 단백질 예컨대, AAV 캡시드 단백질에 결합한다. 본 발명의 특정 양태에서, 분석되거나 검출되거나 측정된 항체는 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74, 또는 Rh10, 또는 임의의 상기 AAV 혈청형의 하이브리드 또는 키메라에 결합한다.
본 발명의 다양한 구체예에서, AAV에 결합되는 소정량의 항체는 임의의 AAV 혈청형일 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 소정량의 항체는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74, 또는 Rh10, 또는 임의의 상기 AAV 혈청형의 하이브리드 또는 키메라에 결합한다.
본 발명의 추가의 특정 양태에서, 세포는 포유동물 세포 예컨대, 영장류 (예를 들어, 인간) 세포를 포함한다. 본 발명의 더욱 특정 양태에서, 세포는 HEK-293(예를 들어, 2V6.11) 세포, CHO, BHK, MDCK, 10T1/2, WEHI 세포, COS, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, MRC5, A549, HT1080, 293, B-50, 3T3, NIH3T3, HepG2, Saos-2, Huh7, HER, HEK, HEL, 또는 HeLa 세포를 포함한다.
추가의 양태에서, 세포는 AAV 복제 및/또는 게놈 통합을 위한 헬퍼 작용부를 엔코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 본 발명의 더욱 특정 양태에서, 세포는 AAV E4 유전자 및/또는 AAV rep 또는 cap를 발현한다.
추가의 양태에서, 세포는 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74, 또는 Rh10, 또는 임의의 상기 AAV 혈청형의 하이브리드 또는 키메라의 VP1, VP2 또는 VP3 서열과 90% 또는 그 초과로 동일한 VP1, VP2 또는 VP3 서열을 포함하는 AAV 입자로 감염될 수 있거나, 세포는 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74, 또는 Rh10, 또는 임의의 상기 AAV 혈청형의 하이브리드 또는 키메라로 감염될 수 있다.
더욱 추가의 양태에서, 세포는 6-48 시간의 기간, 12-36 시간의 기간, 20-30 시간의 기간, 또는 약 24 시간의 기간 동안 생성 혼합물 (M)과 접촉된다. 더욱 추가의 양태에서, 세포는 리포터 전이유전자의 발현을 측정하기 전에 용해된다.
본 발명의 다양한 구체예에서, 리포터 전이유전자는 효소, 비색, 형광, 발광, 화학발광, 또는 전기화학 시그널을 제공하는 단백질을 엔코딩한다. 특정 양태에서, 리포터 전이유전자는 루시퍼라제 유전자 예컨대, 레닐라 루시퍼라제 또는 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 포함한다. 추가의 특정 양태에서, 리포터 전이유전자는 β-갈락토시다제 유전자, β-글루코로니다제 유전자, 클로람페니콜 트랜스퍼라제 유전자를 포함한다. 추가의 특정 양태에서, 리포터 전이유전자는 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP) 또는 알칼리성 포스파타제를 엔코딩한다.
본 발명의 추가의 다양한 구체예에서, 리포터 전이유전자는 단일 가닥 게놈이거나, 리포터 전이유전자는 자기-상보성 게놈이다. 본 발명의 추가의 양태에서, 자기-상보성 리포터 전이유전자 게놈은 이중 가닥 (또는 듀플렉스) 역방향 반복부 서열 구조를 포함한다. 본 발명의 추가의 양태에서, 자기-상보성 리포터 전이유전자 게놈은 헤어핀 루프 구조를 포함한다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 벡터 또는 벡터 서열은 포유동물 세포에서 작동가능한 하나 (또는 그 초과의) 발현 조절 요소 예컨대, 프로모터 및/또는 인핸서 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 더욱 추가의 구체예에서, 벡터 또는 벡터 서열은 하나 이상의 측면인접 요소(들), 예컨대, 하나 이상의 AAV 역방향 말단 반복부 서열 (ITR)을 포함한다. 본 발명의 추가의 양태에서, 리포터 전이유전자는 하나 이상의 측면인접 요소(들) 예컨대, 하나 이상의 5' 및/또는 3' AAV ITR 사이에 위치한다.
본 발명의 더욱 특정 구체예에서, 벡터 또는 벡터 서열은 AAV의 제 1 역방향 말단 반복부 (ITR); 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터; 리포터 전이유전자; 폴리아데닐화 시그널; 및 선택적으로 AAV의 제 2 ITR을 포함한다. 본 발명의 특정 양태에서, 재조합 벡터 또는 벡터 서열은 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터의 다운스트림에 리포터 전이유전자의 삽입을 허용하는 제한 부위, 및 제한 부위의 다운스트림에서 전사후 조절 요소를 포함한다. 본 발명의 추가의 특정 양태에서, 재조합 벡터 또는 벡터 서열은 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터의 다운스트림에 리포터 전이유전자의 삽입을 허용하는 제한 부위, 및 제한 부위의 다운스트림에서 전사후 조절 요소를 포함한다. 특정 양태에서, 프로모터, 제한 부위 및 전사후 조절 요소는 5' AAV ITR의 다운스트림 및 선택적 3' AAV ITR의 업스트림에 위치한다.
본 발명의 더욱 특정 양태에서, 측면인접 요소(들)는 AAV Rep 단백질에 의해 처리되지 않은 돌연변이된 또는 변종의 AAV ITR이다. 본 발명의 추가의 더욱 특정 양태에서, 측면인접 요소(들)는 감염성 재조합 AAV 입자에서 이중 가닥 역방향 반복부 서열 구조 내로 자기-상보성 리포터 전이유전자 게놈의 형성을 허용하거나 촉진하는 돌연변이된 또는 변종의 AAV ITR이다. 본 발명의 추가의 더욱 특정 양태에서, 측면인접 요소(들)는 결실된 D 서열 및/또는 결실된 말단 결정 부위 (TRS) 서열을 갖는 돌연변이된 또는 변종의 AAV ITR이다 (예를 들어, 돌연변이된 또는 변종의 AAV ITR은 리포터 전이유전자의 자기-상보성 서열 사이에 위치함). 본 발명의 여전히 추가의 더욱 특정 양태에서, 돌연변이된 또는 변종의 AAV ITR은 돌연변이된, 변형된, 변화된 또는 결실된 AAV2 게놈 서열의 뉴클레오티드 122-144에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖는 AAV2 ITR을 포함한다.
본 발명의 추가의 특정 구체예에서, 감염성 재조합 AAV 입자는 영장류를 감염시키는 AAV 혈청형을 포함한다. 특정 양태에서, 감염성 재조합 AAV 입자는 인간 또는 레서스 원숭이를 감염시키는 AAV 혈청형을 포함한다. 다양한 특정 양태에서, 감염성 재조합 AAV 입자는 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74, 또는 Rh10, 또는 임의의 상기 AAV 혈청형의 하이브리드 또는 키메라의 VP1, VP2 또는 VP3 서열과 90% 또는 그 초과로 동일한 VP1, VP2 또는 VP3를 포함한다. 추가의 다양한 특정 양태에서, 감염성 재조합 AAV 입자는 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74, 또는 Rh10, 또는 임의의 상기 AAV 혈청형의 하이브리드 또는 키메라를 포함한다.
본 발명의 다양한 구체예에서, 생물학적 샘플은 영장류 샘플을 포함한다. 이러한 샘플은 비제한적으로, 혈청, 혈장 또는 혈액, 예컨대, 인간 혈청, 인간 혈장 또는 인간 혈액을 포함한다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 생물학적 샘플은 열 불활성되거나 열 불활성화되었다. 특정 양태에서, 생물학적 샘플은 약 15분 내지 1시간 이하의 기간 동안 섭씨 약 50-70 도에서 열 불활성화되거나 불활성화되었거나, 약 30분의 기간 동안 섭씨 약 56 도에서 열 불활성화되거나 불활성화되었다.
본 발명의 더욱 추가의 구체예에서, 생물학적 샘플은 감염성 재조합 AAV 입자와 접촉되거나 인큐베이션되기 전에 희석된다. 특정 양태에서, 생물학적 샘플의 복수의 희석물이 분석되거나 측정되거나 검출된다. 추가의 특정 양태에서, 복수의 다양한 희석비의 생물학적 샘플이 분석되거나 측정되거나 검출된다. 더욱 특정 양태에서, 생물학적 샘플은 감염성 재조합 AAV 입자와 접촉되거나 인큐베이션되기 전에 1:1 내지 1:500으로 희석되거나; 생물학적 샘플이 감염성 재조합 AAV 입자와 접촉되거나 인큐베이션되기 전에 1:500 내지 1:5000으로 희석된다. 추가의 특정 양태에서, 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상이한 희석비의 생물학적 샘플이 분석되거나, 측정되거나 검출된다.
본 발명의 다양한 구체예에서, 대상체 (예를 들어, 바이러스 벡터 매개된 유전자 요법에 대한 후보자 예컨대, AAV 벡터)는 포유동물 (예를 들어, 영장류)이다. 특정 양태에서, 대상체는 인간이다.
본 발명의 다양한 구체예에서, 대상체는 단백질의 불충분한 발현 또는 활성으로 인한 질병으로 고통받거나, 이상, 비정상 또는 바람직하지 않은 단백질의 발현 또는 활성으로 인한 질병으로 고통받는다.
본 발명의 추가의 다양한 구체예에서, 대상체는 유전 질환으로부터 고통받는다. 본 발명의 추가의 다양한 구체예에서, 대상체는 유전자 대체 또는 보충 요법 예컨대, 유전자 넉다운 또는 넉아웃 요법에 대한 후보자이다. 본 발명의 더욱 특정 구체예에서, 대상체는 폐 질환 (예를 들어, 낭성 섬유증), 출혈성 질환 (예를 들어, 억제제 함유 또는 비함유 혈우병 A 또는 혈우병 B), 지중해빈혈, 혈액 질환 (예를 들어, 빈혈), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 증근위축측삭경화증 (ALS), 간질, 라이소좀 축적병, 구리 또는 철 축적병 (예를 들어, 윌슨병 또는 멘케스병) 라이소좀 산 리파제 결핍증, 신경성 또는 신경퇴행성 질환, 암, 타입 1 또는 타입 2 당뇨병, 고셰병, 헐러병, 아데노신 데아미나제 결핍증, 대사 결함 (예를 들어, 글리코겐 축적병), 망막 변성증 (예컨대, RPE65 결핍증, 범맥락막위축, 및 기타 안구 질환), 고형 기관 질환 (예를 들어, 뇌, 간, 신장, 심장), 또는 감염성 바이러스 (예를 들어, B형 및 C형 간염, HIV, 등등), 박테리아 또는 진균류 질환으로부터 고통받는다.
본 발명의 다양한 추가의 구체예에서, 생물학적 샘플에서 AAV에 결합하는 항체의 양이 결정/계산된다. 일 구체예에서, 항체는 음성 (-) 대조군과 비교한 (f)의 리포터 전이유전자 발현을 기반으로 계산된다. 또 다른 구체예에서, 항체는 소정량의 AAV 항체 대조군과 비교한 (f)의 리포터 전이유전자 발현을 기반으로 계산된다.
본 발명의 더욱 추가의 구체예에서, 항체의 양은 생물학적 샘플이 수득되는 대상체와 관계된 데이터베이스 또는 리포터에 입력된다. 이렇게 해서, 엔트리는 대상체와 관계된 데이터베이스 엔트리 또는 리포터를 생성한다.
도 1a는 세포 계대의 수의 함수로서 루시퍼라제 리포터 유전자 최대 시그널(Max Signal)을 보여준다. GraphPad Prism Version 5.0b를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 선형 회귀: R2 곡선 0.1509, p<0.0001, 곡선의 기울기는 유의하게는 0이 아니다. 추가적인 통계학적 분석은 계대 1-12로부터의 세포를 사용하여 얻은 최대 시그널 (RLU)의 평균을 계대 13-25로부터의 것과 비교함으로써 수행하였다. 이러한 목적에 있어서, 2-테일드 언페이드 t 평가(2-tailed unpaired t test)를 이용하였다. 평균의 평균 +/- 표준 오차: 계대 1-12, 17921+/-1181, n=53; 계대 13-25, 11427+/-903, n=45, p<0.0001.
도 1B는 세포 계대의 수의 함수로서 루시퍼라제 리포터 유전자 배경 시그널을 보여준다. GraphPad Prism Version 5.0b를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 선형 회귀: R2 곡선 0.04720, p=0.0308, 곡선 기울기는 유의하게는 0이 아니다. 추가적인 통계학적 분석은 계대 1-12로부터의 세포를 사용하여 얻은 배경 시그널 (RLU)의 평균을 계대 13-25의 것과 비교함으로써 수행하였다. 이러한 목적에 있어서, 2-테일드 언페어드 t 평가를 이용하였다. 평균의 평균+/- 표준 오차: 계대 1-12, 320+/-24, n=54; 계대 13-25, 252+/-27, n=45, p=0.0651.
도 2는 오퍼레이터 1 및 2에 있어서 인간 혈청 샘플에 대한 평균 NAb 역 가를 보여준다. 오차 막대는 ± 표준 편차를 보여준다.
도 3은 " CGGTTG " 로서 나타낸 돌연변이된 TRS 서열을 갖는 AAV2 ITR의 구조를 보여준다. RBS: Rep 결합 서열; Flop/Flip: ITR (+/- 균주와 유사).
도 4는 루시퍼라제 리포터 전이유전자를 갖는 유전자 플라스미드 작제 구조를 보여준다. CBA: 닭 베타-액틴 프로모터; pA: 폴리아데닐화.
본 발명은 적어도 부분적으로, 바이러스 항체 또는 중화 항체를 스크리닝하고, 검출하고, 분석하고 이의 양을 측정하기 위한 민감성 검정을 기반으로 한다. 따라서, 본 발명은 벡터, 바이러스 벡터 및 입자, 및 예를 들어, 샘플에서 바이러스 항체 또는 중화 항체를 스크리닝하고, 검출하고, 분석하고 이의 양을 측정하기 위한 방법 및 용도를 제공한다.
본원에 제시된 바와 같이, 벡터 서열, 벡터 (예를 들어, 바이러스 벡터) 및 입자는 바이러스 항체 또는 중화 항체를 스크리닝하고, 검출하고, 분석하고 이의 양을 측정하기 위한 수단을 제공한다. 본 발명의 벡터 서열, 벡터 (예를 들어, 바이러스 벡터) 및 입자, 및 바이러스 항체를 스크리닝하고, 검출하고, 분석하고 이의 양을 측정하기 위한 방법 및 용도는 리포터 전이유전자 (전이유전자는 검출가능한 시그널을 제공함)를 사용하며, 이러한 전이유전자는 단일-가닥 또는 자기-상보성 게놈을 포함한다. 자기-상보성 전이유전자 게놈은 바이러스 입자 (바이러스 벡터) 내로 패키징될 때 또는 바이러스 벡터 세포 형질도입 및 형질도입된 세포에서 바이러스 언코딩(uncoating) 시 이중 가닥이 되거나 이중 가닥 이량체가 된다.
폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자 예컨대, 전이유전자에 대한 언급에 사용되는 경우 용어 "상보성" 또는 "상보체"는 염기 짝지음을 통해 하나의 단일 가닥 서열이 또 다른 단일 가닥 서열에 "특이적으로 하이브리드화" 또는 결합(어닐링)되거나 될 수 있어 이중-가닥 또는 듀플렉스 분자를 형성하게 하는 복수의 화학적 염기를 나타낸다. 2개의 단일 가닥 서열의 서로 특이적으로 하이브리드화되거나 결합 (어닐링)하여 이중-가닥 (또는 듀플렉스) 분자를 형성하는 능력은 하나의 가닥 (예를 들어, 센스) 상의 염기의 작용성 기에 의한 것이며, 이는 마주보는 핵산 가닥 (예를 들어, 안티-센스) 상의 또 다른 염기에 수소 결합할 것이다. 전형적으로 서로 결합할 수 있는 상보성 염기는 DNA에 있어서, A와 T 및 C와 G이며, RNA에 있어서, C와 G 및 U와 A이다. 따라서, 자기 상보적 서열의 예는 ATCGXXXCGAT일 수 있으며, X는 비-상보성 염기를 나타내며, X 염기가 하이브리드화 되지 않은 이러한 이중-가닥 또는 듀플렉스 분자의 구조는 하기와 같이 나타낼 것이다:
Figure pct00001
따라서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자 예컨대, 전이유전자에 대한 언급에 사용되는 경우 용어 "상보성" 및 "상보체"는 이중-가닥 또는 듀플렉스 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자가 형성되는 물리적 상태를 기술하고자 하는 것이거나, 각 단일 가닥 분자가 서로 이중 가닥을 형성할 수 있게 하는 2개 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자 사이의 서열 관계를 단순히 기술하고자 하는 것이다. 따라서, "상보성" 및 "상보체"는 각 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자 가닥의 염기의 관계를 나타내며, 이중 가닥 (또는 듀플렉스) 형상 또는 듀플렉스에서의 서로의 물리적 상태로서 2-가닥이 존재해야 함을 나타내는 것은 아니다.
전형적으로, 단일 가닥 핵산을 패키징하는 바이러스 벡터 예컨대, AAV에 있어서, 역방향 말단 반복부 (ITR) 서열은 복제에 관여하여 헤어핀 루프를 형성하며, 이는 제 2 DNA 가닥의 개시 및 합성을 허용하는 자기-프라이밍에 기여한다. 제 2 DNA 가닥의 합성 후, AAV ITR은 헤어핀 루프가 바이러스 패키징을 위한 5' 및 3' 말단 반복부를 갖는 각각 2개의 단일 가닥으로 절단되도록 소위 말단 결정 부위 (TRS)를 갖는다.
적어도 하나의 ITR에서 결실되거나, 돌연변이되거나, 변형된 또는 비-작용성 TRS의 사용은 TRS에서 절단되지 않는 이중 가닥 듀플렉스의 형성을 유도한다. 자기-상보성 리포터 전이유전자 이중-가닥 듀플렉스 구조의 구체예에서, 2개의 상보적 가닥 사이에 위치한 결실된, 돌연변이된 또는 변종의 TRS를 갖는 ITR이 전형적으로 존재한다. 비-절단성 또는 비-분해성 TRS는 자기-상보성 리포터 전이유전자 이중-가닥 듀플렉스 구조 형성을 허용하는데, 왜냐하면 이중 가닥 형성물이 절단되지 않기 때문이다. 결실된, 돌연변이된 또는 변종의 TRS를 갖는 비-분해성 ITR 또는 분해성 ITR은 바이러스 패키징에 적합할 수 있다. 분해성 AAV ITR은 ITR이 요망되는 기능 예를 들어, 바이러스 패키징 또는 통합을 매개하는 한 야생형 ITR 서열일 필요는 없다.
결실될 수 있거나, 돌연변이될 수 있거나, 변형될 수 있거나 변화될 수 있는 다양한 AAV 혈청형의 ITR 및 TRS 서열은 본원에 제시된 또는 당업자에게 공지된 임의의 AAV 혈청형을 포함한다. 예를 들어, 다양한 AAV 혈청형의 ITR 및 TRS 서열은 예를 들어, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -rh74, -rh10 또는 AAV-2i8를 포함한다. AAV2에 있어서, 대표적인 돌연변이된 TRS 서열은 "CGGTTG"이다.
전이유전자 외부에 고려된 자기-상보성 리포터 전이유전자 서열 예컨대, 하나 이상의 ITR, 발현 또는 조절 조정 서열, 다운스트림 서열 등을 갖는 벡터 또는 벡터 서열에 있어서, 리포터 전이유전자 외부의 벡터 서열의 그러한 서열은 자기-상보성일 수 있으나 그렇지 않아도 된다. 따라서, 자기-상보성은 특정 상황 예를 들어, 전이유전자 예컨대, 리포터 전이유전자에 대한 언급에 이용될 수 있어 단지 전이유전자 예컨대, 리포터 전이유전자만이 자기-상보성인 반면, 다른 비-번이유전자 서열은 자기-상보성일 수 있거나 없다.
자기-상보성 전이유전자에 있어서, 단일 가닥의 모든 염기가 반대의 상보적 가닥의 각각 및 모든 염기에 대해 상보적이지 않아도 된다. 단지 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자가 서로에 대한 특이적으로 하이브리드화되거나 결합 (어닐링)될 수 있게 하기에 충분한 수의 상보적 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 염기가 필요하다. 따라서, 자기-상보성 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자 간에는 비-상보성 염기의 짧은 서열 세그먼트 또는 영역이 존재할 수 있다. 예를 들어, 1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-75, 75-100, 또는 100-150 또는 그 초과의 연속 또는 불연속의 비-상보성 염기가 존재할 수 있으나, 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자가 서로에 대해 특이적으로 하이브리드화되거나 결합 (어닐링)되어 이중-가닥 (또는 듀플렉스) 서열을 형성할 수 있도록 2개의 서열 길이에 걸쳐 충분한 상보성 염기가 존재할 수 있다. 따라서, 2개의 단일 가닥 영역의 서열은 서로에 대해 100% 미만의 상보성일 수 있으며, 여전히 이중-가닥 듀플렉스 분자를 형성할 수 있다. 특정 구체예에서, 2개의 단일 가닥 서열은 서로에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과의 상보성을 갖는다.
자기-상보성 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자 간의 비-상보성 염기의 이러한 세그먼트 또는 영역은 내부 서열일 수 있어, 2개의 단일 가닥 분자의 상보적 부분이 이중 가닥 또는 듀플렉스를 형성하는 경우, 비-상보성 염기가 루프 또는 벌지 형상을 형성하고, 전체적인 구조는 헤어핀을 닮게 된다. 자기-상보성 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자 간의 비-상보성 염기의 이러한 세그먼트 또는 영역은 또한, 5' 또는 3 측면인접 영역이 이중-가닥 듀플렉스를 형성하지 않을 수 있는 경우, 상보적 영역의 한쪽 또는 양쪽의 측면에 인접할 수 있다.
이중 가닥 또는 듀플렉스 서열을 형성하는 자기-상보성 전이유전자는 전형적으로, 단일 가닥 전이유전자 대응물 보다 더욱 신속하게 (더욱 신속하게 시작) 발현된다. 따라서, 이러한 발현은 시간에 걸쳐 예컨대, 규정된 시점 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 12-16, 16-20, 20-24 시간, 예를 들어)에서의 발현을 측정함으로써 검출될 수 있다. 게다가, 이중 가닥 자기-상보성 전이유전자의 발현의 양은 전형적으로 단일 가닥 리포터 전이유전자 대응물 보다 많다. 따라서, 이러한 발현은 발현이 최대치이거나 최대치에 도달하는 것으로 간주되는 시점에서 측정함으로써 검출될 수 있다. 따라서, 이중 가닥 자기-상보성 전이유전자 형상은 검출 민감성을 향상시키고, 특히, 특정 세포 유형을 감염시키는데 덜 효율적인 바이러스, 즉, 비교적 낮은 비율의 세포 감염성 또는 향성을 갖는 바이러스의 바이러스 항체 정량 측정의 정확도를 증가시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "벡터"는 핵산 (예를 들어, 리포터 전이유전자)를 세포 내로 전달하는데 사용될 수 있는 바이러스 입자 예컨대, 파르보바이러스 (예를 들어, AAV)를 지칭할 수 있으며, 이러한 벡터는 바이러스 단백질 (엔벨로프 단백질 또는 캡시드 단백질 예컨대, AAV 캡시드)에 의해 캡시드화되거나 비리온 내로 패키징된 핵산 (예를 들어, 리포터 전이유전자)를 포함한다. 대안적으로, 용어 "벡터"는 더욱 한정된 상황하에서 벡터 서열 또는 핵산을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 벡터는 핵산 (예를 들어, 리포터 전이유전자)를 포함하는 바이러스 입자를 나타내거나 단지 핵산 또는 서열을 나타내기 위해 사용될 수 있으며, 상기 서열은 "벡터 서열" 또는 기타 등등으로서 언급될 수 있다.
바이러스 벡터는 바이러스 게놈을 포함하는 하나 이상의 핵산 요소로부터 유래되거나 이를 기반으로 한다. 특정 바이러스 벡터는 파르보바이러스 벡터 예컨대, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터를 포함한다.
특정 구체예에서, 재조합 벡터 (예를 들어, AAV)는 파르보바이러스 벡터이다. 파르보바이러스는 단일-가닥 DNA 게놈을 갖는 작은 바이러스이다. "아데노-관련 바이러스" (AAV)는 파르보바이러스 패밀리에 속한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터 예컨대, 바이러스 벡터의 수식어는 물론 재조합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 같은 서열의 수식어로서 용어 "재조합"은, 조성물 (예를 들어, AAV 또는 서열)이 자연에서 일반적으로 발생하지 않는 양식으로 조작 (즉, 유전자조작)되었음을 의미한다. 재조합 벡터 서열의 특정 예 예컨대, AAV 벡터는, 야생형 바이러스 (예를 들어, AAV) 게놈에 일반적으로 존재하지 않는 폴리뉴클레오티드가 바이러스 게놈 내부로 삽입되는 경우일 것이다. 예를 들어, 재조합 벡터의 예는, 이종 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 전이유전자)가 5', 3', 및/또는 유전자가 바이러스 (예를 들어, AAV) 벡터 게놈과 같은 벡터 내부에서 일반적으로 결합되는 인트론 영역의 존재 또는 부재하에 벡터 서열 내부로 클로닝되는 경우일 것이다. 용어 "재조합"은 AAV 벡터와 같은 바이러스 벡터는 물론 벡터 서열 및 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 언급에 있어서 본원에서 항상 사용되는 것은 아니나, 바이러스 벡터 예컨대, AAV, 벡터 서열 및 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 재조합 형태는 임의의 이러한 누락에도 불구하고 명시적으로 포함된 것이다.
재조합 "벡터" 또는 "AAV 벡터"는, 분자 방법을 이용하여 바이러스 (예를 들어, AAV) 서열로부터 야생형 게놈을 제거하고 비-천연 핵산 예컨대, 리포터 전이유전자로 대체함으로써, 바이러스 예컨대, AAV의 야생형 게놈으로부터 유래될 수 있다. 전형적으로, AAV에 있어서, 야생형 AAV 게놈의 한쪽 또는 양쪽 역방향 말단 반복부 (ITR) 서열은 AAV 벡터에 보유된다. 재조합 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV)는 바이러스 (예를 들어, AAV) 게놈과 구별되는데, 왜냐하면 바이러스 게놈 서열 모두 또는 일부가 바이러스 (예를 들어, AAV) 핵산에 있어서 비-천연 서열 예컨대, 리포터 전이유전자로 대체되었기 때문이다. 따라서, 리포터 전이유전자와 같은 비-천연 서열의 통합은 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV)를 "재조합" 벡터로서 규정하며, AAV의 경우 이는 "rAAV 벡터"로서 언급될 수 있다.
재조합 벡터 "게놈" (예를 들어, 바이러스 또는 AAV 벡터 게놈)은 생체외, 시험관내 또는 생체내에서 세포의 후속 감염 (형질도입 또는 형질전환)을 위해 바이러스 (또한, 본원에서는 "입자" 또는 "비리온"으로서 언급됨) 내로 캡시드화되거나 패키징될 수 있다. 재조합 AAV 벡터 게놈이 AAV 입자 내부로 캡시드화되거나 패키징되는 경우, 입자는 "rAAV"로서 언급될 수 있다. 이러한 입자 또는 비리온은 전형적으로, 벡터 게놈을 캡시드화하거나 패키징하는 단백질을 포함할 것이다. 특정 예는 바이러스 캡시드 및 엔벨로프 단백질 및 AAV의 경우, AAV 캡시드 단백질을 포함한다.
재조합 플라스미드에 있어서, 벡터 "게놈"은 궁극적으로 패키징되거나 캡시드화되어 바이러스 입자를 형성하는 재조합 플라스미드 서열의 일부를 지칭한다. 재조합 플라스미드가 재조합 벡터의 작제 또는 제작에 사용되는 경우, 벡터 게놈은 재조합 플라스미드의 벡터 게놈 서열에 상응하지 않는 "플라스미드"의 일부를 포함하지 않는다. 재조합 플라스미드의 이러한 비(non) 벡터 게놈 부분은 '플라스미드 백본'으로서 지칭되며, 이는 증식 및 재조합 바이러스 생성에 필요한 과정인 플라스미드의 클로닝 및 증폭에 중요하나, 그 자체는 바이러스 (예를 들어, AAV) 입자 내로 패키징되거나 캡시드화되지 않는다.
따라서, 벡터 "게놈"은 바이러스 (예를 들어, AAV)에 의해 패키징되거나 캡시드되며, 이종 (전이유전자) 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터 플라스미드의 일부를 지칭한다. 재조합 플라스미드의 비 벡터 게놈 부분은 플라스미드의 클로닝 및 증폭에 중요한 백본을 포함하나, 그 자체는 바이러스 (예를 들어, AAV)에 의해 패키징되거나 캡시드화되지 않는다.
재조합 벡터 서열은 폴리뉴클레오티드의 삽입 또는 통합에 의해 조작된다. 본원에 기술된 바와 같이, 벡터 서열 또는 플라스미드는 일반적으로 적어도 세포에서 증식을 위한 복제 오리진 및 하나 이상의 발현 조정 요소를 함유한다.
재조합 벡터 (예를 들어, AAV), 벡터 서열 또는 플라스미드는 물론 이들의 방법 및 용도는 임의의 바이러스 균주 또는 혈청형을 포함한다. 비제한된 예로서, 재조합 벡터 (예를 들어, AAV) 플라스미드는 임의의 AAV 게놈 예컨대, 예를 들어, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -rh74, -rh10 또는 AAV-2i8를 기반으로 할 수 없다. 이러한 벡터는 동일한 균주 또는 혈청형 (또는 아집단 또는 변종)을 기반으로 할 수 있거나, 서로 상이할 수 있다. 비제한적 예로서, 하나의 혈청형 게놈을 기반으로 하는 재조합 벡터 (예를 들어, AAV) 플라스미드는 벡터를 패키징하는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 동일할 수 있다. 또한, 재조합 벡터 (예를 들어, AAV) 플라스미드는 벡터를 패키징하는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 구별되는 AAV (예를 들어, AAV2) 혈청형 게놈을 기반으로 할 수 있다. 따라서, 단지 예로서, rAAV-2 벡터 플라스미드는 AAV-2로부터의 3개의 캡시드 단백질 중 적어도 하나 (또는 그 초과) 또는 임의의 기타 AAV 캡시드 예컨대, 예를 들어, AAV-1, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -rh74, -rh10 또는 AAV-2i8 캡시드를 가질 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 벡터는 리포터 전이유전자로 표적 세포를 형질도입시키는데 이용되며, 이러한 전이유전자는 후속적으로 전사되며 선택적으로 번역되며, 이에 따라 검출가능한 시그널을 제공하여 전이유전자 발현을 검출하거나 측정한다. 시그널의 양은 세포 형질도입 및 후속 발현의 효율에 비례한다. 리포터 전이유전자를 패키징하거나 캡시드화하는 벡터 단백질에 결합하는 항체는 전이유전자 형질도입 및 후속 발현을 억제할 것이다. 따라서, 벡터 단백질 예컨대, 바이러스 (예를 들어, AAV) 벡터 단백질에 결합하는 항체의 존재에 대한 검출, 측정 및 분석이 확인될 수 있다.
본원에 기술된 검정에서, 항체의 검출, 측정 및 분석은 리포터 전이유전자를 패키징하거나 캡시드화하는 엔벨로프 또는 캡시드 단백질(들)의 확인에 의해 결정될 것이다. 따라서, AAV-2 항체를 검출하는 것이 요망되는 경우, 리포터 전이유전자는 AAV-2 캡시드 단백질(들)에 의해 캡시드화되어야 한다. AAV-7 항체를 검출하는 것이 요망되는 경우, 리포터 유전자는 AAV-7 캡시드 단백질(들)에 의해 캡시드화되어야 한다. AAV-8 항체를 검출하는 것이 요망되는 경우, 리포터 유전자는 AAV-8 캡시드 단백질(들)에 의해 캡시드화되어야 한다. 항체가 존재하는 경우, 항체가 리포터 전이유전자를 캡시드화하는 엔벨로프 또는 캡시드 단백질(들)에 결합하여, 세포 형질도입 및 그 결과에 따른 리포터 전이유전자 발현을 감소시킨다. 엔벨로프 또는 캡시드 단백질(들)에 결합하는 항체의 양이 더 많을수록, 세포의 벡터 형질도입 및 그 결과에 따른 리포터 전이유전자 발현이 덜하게 된다.
전통적인 정의하에, 혈청형은 관심 바이러스가 활성을 중화시키기 위한 모든 존재하는 특성결정된 혈청형에 대해 특이적인 혈청에 대해 평가되었으며, 관심 바이러스를 중화시키는 항체는 발견되지 않았음을 의미한다. 더욱 자연 발생적인 바이러스 분리물이 발견되고/거나 캡시드 돌연변이체가 발생하기 때문에, 현재 존재하는 혈청형 중 임의의 혈청형과 혈청학적으로 차이가 있을 수 있거나 없다. 따라서, 새로운 바이러스 (예를 들어, AAV)가 혈청학적 차이를 갖지 않는 경우에, 이러한 새로운 바이러스 (예를 들어, AAV)는 상응하는 혈청형의 아집단 또는 변종일 것이다. 그러나 많은 경우에, 중화 활성에 대한 혈청학 테스트는 캡시드 서열 변형된 돌연변이체 바이러스에 대해 수행되어 이들이 전통적인 혈청형 정의에 따라 또 다른 혈청형인지를 결정해야 한다. 따라서, 편의를 위해서 그리고 반복을 피하기 위해, 용어 "혈청형"은 광범위하게는, 혈청학적으로 구별되는 바이러스 (예를 들어, AAV)는 물론 주어진 혈청형의 아집단 또는 변종 내에 속할 수 있는 혈청학적으로 구별되지 않은 바이러스 (예를 들어, AAV) 둘 모두를 지칭한다.
AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 또는 AAV-2i8을 포함하는 재조합 벡터 (예를 들어, AAV) 및 벡터 서열은 하나 이상의 기능성 AAV ITR 서열 측면에 인접한 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오티드 서열 (전이유전자)를 포함하도록 당업자에게 공지된 재조합 기법을 이용하여 작제될 수 있다. 이러한 벡터는 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 야생형 AAV 유전자 중 하나 이상 예를 들어, rep 및/또는 cap 유전자를 가질 수 있으나, AAV 벡터 입자 내로의 재조합 벡터의 구조 (rescue), 복제 및 패키징에 필요한 것으로서 적어도 하나의 기능성 측면인접 ITR 서열 (예를 들어, AAV2 또는 임의의 기타 AAV 혈청형 ITR)을 보유한다. 따라서, AAV 벡터 게놈은 복제 및 패키징을 위한 시스 (cis)에 필요한 서열 (예를 들어, 기능성 ITR 서열)을 포함할 것이다.
용어 "전이유전자", "서열", "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)을 포함하는 모든 형태의 핵산, 올리고뉴클레오티드를 나타내기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 전이유전자는 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않은 게놈 DNA, cDNA 및 안티센스 DNA를 포함한다. 전이유전자는 천연 발생, 합성, 및 고의로 변화시키거나 변형시킨 폴리뉴클레오티드는 물론 유사체 및 유도체를 포함한다. 전이유전자는 전형적으로 단일 또는 이중 가닥의 선형 또는 환형일 수 있으며, 임의의 길이일 수 있다. 전이유전자를 논의하는데 있어서, 특정 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 구조는 5' 내지 3' 방향의 서열을 제공하는 관례에 따라 본원에서 기술될 수 있다.
"이종" 전이유전자, 서열 또는 폴리뉴클레오티드는 세포로의 폴리뉴클레오티드의 벡터 매개된 전이/전달을 목적으로 벡터 (예를 들어, AAV)에 삽입된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이종 전이유전자, 서열 또는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로, 벡터 (예를 들어, AAV) 핵산과 구별되며, 즉, 바이러스 (예를 들어, AAV) 핵산 서열과 관련하여 "비-천연"이다. 일단 세포 내로 전이/전달되면, 비리온 내에 함유된 이종 전이유전자, 서열 또는 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있다 (예를 들어, 전사되고, 적합하다면, 번역됨). 대안적으로, 비리온 내에 함유된, 세포 내의 전이/전달된 이종 전이유전자, 서열 또는 폴리뉴클레오티드는 발현되지 않아도 된다. 용어 "이종"이 본원에서 항상 전이유전자, 서열 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용되지 않지만, 심지어 수식어 "이종"의 부재하에서도 전이유전자, 서열 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 언급은 이의 누락에도 불구하고 이종 전이유전자, 서열 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "전이유전자"는 세포 또는 유기체 내로 도입된 이종 폴리뉴클레오티드를 편리하게 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 전이유전자는 매개 전사체에 의해 전형적으로 폴리펩티드 또는 단백질을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 유전자로 전사되는 유전자와 같은 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "리포터" 전이유전자는 검출가능한 시그널을 제공하는 유전자이다. 시그널은 전이유전자 자체, 전이유전자의 전사체 또는 전이유전자에 의해 엔코딩된 단백질에 의해 제공될 수 있다. 리포터 전이유전자의 특정한 비제한적 예는 루시퍼라제 단백질을 엔코딩하는 루시퍼라제 유전자 등등을 포함한다.
"전이유전자" 또는 "폴리뉴클레오티드 서열"에 의해 엔코딩된 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는, 천연 발생 단백질과 같이 천연 전장 서열은 물론, 기능성 부분서열, 변형된 형태 또는 서열 변종이 천연 전장 단백질의 기능을 어느 정도 보유하는 한, 이러한 기능성 부분서열, 변형된 형태 또는 서열 변종을 포함한다. 본 발명의 방법 및 용도에서, 전이유전자 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 이러한 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드는 야생형 단백질과 동일할 수 있으나 그럴 필요는 없다.
본원에 기재된 비제한적 리포터 전이유전자 및 엔코딩된 단백질을 포함하는, 공지되거나 비공지된 모든 포유동물 및 비-포유동물 형태의 전이유전자, 서열 및 폴리뉴클레오티드가 명백하게 포함된다. 따라서, 본 발명은 비-포유동물, 인간외 포유동물 및 인간으로부터의 리포터 전이유전자 및 단백질을 포함하며, 이러한 리포터 전이유전자 및 단백질은 본원에 기술된 바와 같이 형질도입 또는 전이 후 세포에서 검출가능하다.
전이유전자를 갖는 세포에서, 전이유전자는 벡터 예컨대, 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV)에 의해 도입/전이되었다. 이러한 과정은 세포의 "형질도입" 또는 "형질전환" 또는 "형질감염"으로서 지칭된다. 용어 "형질도입되다", "형질전환되다" 또는 "형질감염되다"는 전이유전자와 같은 분자의 세포 내로의 도입을 지칭한다.
전이유전자가 도입된 세포는 "형질전환된 세포" 또는 "형질전환주"로서 언급된다. 따라서, "형질도입된", "형질전환된" 또는 "형질감염된" 세포 (예를 들어, 포유동물에서, 예컨대, 세포 또는 조직 또는 기관 세포)는 외인성 분자 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 (예를 들어, 전이유전자)의 세포 내로의 혼입 후 세포에서의 유전자 변화를 의미한다. 이와 같이, "형질도입된", "형질감염된" 또는 "형질전환된" 세포는 예를 들어, 외인성 분자가 도입된 세포 또는 이의 자손이다. 이러한 세포(들)는 증식될 수 있으며, 도입된 전이유전자는 전사되고/거나 단백질 발현된다.
도입된 전이유전자는 수령체 세포의 핵산 내로 통합될 수 있거나 없다. 도입된 전이유전자가 수령체 세포 또는 유기체의 핵산 (게놈 DNA) 내로 통합되는 경우, 이는 그 세포 또는 유기체 내에 안정하게 유지될 수 있으며, 게다가 수령체 세포 또는 유기체의 자손 세포 또는 유기체로 전달되거나 유전될 수 있다. 마지막으로, 도입된 전이유전자는 단지 일시적으로 수령체 세포 또는 숙주 유기체에 존재할 수 있다.
전이유전자를 보유하는 벡터 (예를 들어, 바이러스 벡터)로의 형질도입을 위한 표적일 수 있는 세포는 벡터로의 감염에 민간한 임의의 세포일 수 있다. 이러한 세포는 감염에 대한 낮은, 중간의 또는 높은 비율의 민감성을 가질 수 있다. 따라서, 표적 세포는 임의의 조직 또는 기관 타입, 임의의 기원 (예를 들어, 중배엽, 외배엽 또는 내배엽)의 세포를 포함한다. 세포의 특정 비제한적 예는 간 (예를 들어, 간세포, 굴 내피 세포), 췌장 (예를 들어, 베타 섬 세포), 폐, 중추 또는 말초 신경계, 예컨대, 뇌 (예를 들어, 신경, 아교 또는 뇌실막 세포) 또는 척추, 신장 (HEK-293 세포), 눈 (예를 들어, 망막, 세포 구성요소), 비장, 피부 가슴샘, 고환, 폐, 횡경막, 심장(심장(cardiac)), 근육 또는 요근, 또는 장 (예를 들어, 내분비), 지방 조직 (백색, 갈색 또는 베이지색), 근육 (예를 들어, 섬유아세포), 윤활막세포, 연골세포, 파골세포, 상피 세포, 내피 세포, 침샘 세포, 내이 신경 세포 또는 조혈 (예를 들어, 혈액 또는 림프) 세포를 포함한다. 추가적인 예는 간 (예를 들어, 간세포, 굴 내피 세포), 췌장 (예를 들어, 베타 섬 세포), 폐, 중추 또는 말초 신경계, 예컨대, 뇌 (예를 들어, 신경, 아교 또는 뇌실막 세포) 또는 척추, 신장, 눈 (망막, 세포 구성요소), 비장, 피부 가슴샘, 고환, 폐, 횡경막, 심장 (심장), 근육 또는 요근, 또는 장 (예를 들어, 내분비), 지방 조직 (백색, 갈색 또는 베이지색), 근육 (예를 들어, 섬유아세포), 윤활막세포, 연골세포, 파골세포, 상피 세포, 내피 세포, 침샘 세포, 내이 신경 세포 또는 조혈 (예를 들어, 혈액 또는 림프) 세포로 발달되거나 분화되는 만능성 또는 다능성 전구 세포와 같은 줄기 세포를 포함한다.
바이러스 벡터 예컨대, AAV 벡터 및 벡터 서열은 하나 이상의 "발현 조정 요소" 또는 "조절 요소"를 포함할 수 있다. 전형적으로, 발현 조정 또는 조절 요소는 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 끼치는 핵산 서열(들)이다. 벡터 내에 존재하는 프로모터 및 인핸서와 같은 본원에 제시된 바와 같은 발현 조정 및 조절 요소를 포함하는 조정 요소는 적절한 이종 폴리뉴클레오티드 (전이유전자) 전사 및 적절한 경우 번역을 촉진하기 위해 포함된다 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론에 대한 스플라이싱 시그널, mRNA의 인-프래임 번역을 허용하는 유전자의 정확한 해독틀의 유지 및 정지 코돈 등). 이러한 요소는 전형적으로 시스로 작용하나, 또한 트랜스로 작용할 수 있다.
발현 조정은 전사, 번역, 스플라이싱, 메시지 안정성 등의 수준에서 일어날 수 있다. 전형적으로, 전사를 조절하는 발현 조정 요소는 전사된 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 근처 (즉, "업스트림")에서 나란히 놓인다. 발현 조정 요소는 또한, 전사된 서열의 3' 말단 (즉, "다운스트림") 또는 전사체내 (예를 들어, 인트론내)에 위치할 수 있다. 발현 조정 요소는 전사된 서열로부터 멀리 떨어진 거리 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드로부터 100 내지 500, 500 내지 1000, 2000 내지 5000, 5000 내지 10,000 개 또는 그 초과의 뉴클레오티드)를 두고, 심지어 상당한 거리를 두고 위치할 수 있다. 그럼에도 불구하고, AAV 벡터에 대한 폴리뉴클레오티드 길이 제한으로 인해, 이러한 발현 조정 요소는 전형적으로, 폴리뉴클레오티드로부터 1 내지 1000개 뉴클레오티드 내에 위치할 것이다.
기능적으로, 작동가능하게 연결된 이종 폴리뉴클레오티드 (전이유전자)의 발현은 요소 (예를 들어, 프로모터)가 폴리뉴클레오티드의 전사 및 적합하다면, 전사체의 번역을 조절하도록 요소에 의해 적어도 부분적으로 조정가능하다. 발현 조정 요소의 특정 예는 프로모터이며, 이는 일반적으로 전사된 서열의 5'에 위치한다. 발현 조정 요소의 또 다른 예는 인핸서이며, 이는 전사된 서열의 5', 3' 또는 전사된 서열 내에 위치할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프로모터"는 전이유전자에 근접하게 위치하는 DNA 서열을 지칭할 수 있다. 프로모터는 전형적으로, 근접 서열 예를 들어, 이종 폴리뉴클레오티드(전이유전자)에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 전형적으로, 프로모터가 존재하지 않는 경우 발현된 양과 비교하여 이종 폴리뉴클레오티드(전이유전자)로부터 발현된 양을 증가시킨다.
본원에 사용된 바와 같은 "인핸서"는 이종 폴리뉴클레오티드(전이유전자)에 근접하게 위치하는 서열을 지칭할 수 있다. 인핸서 요소는 프로모터 요소의 업스트림에 전형적으로 위치하나 또한 작용하며, DNA 서열 (예를 들어, 전이유전자)의 다운스트림 또는 DNA 서열 내에 위치할 수 있다. 따라서, 인핸서 요소는 이종 폴리뉴클레오티드(전이유전자)의 100 개 염기 쌍, 200 개 염기 쌍, 또는 300 개 또는 그 초과의 염기 쌍 업스트림 또는 다운스트림에 위치할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로, 프로모터 요소에 의해 제공된 증가된 발혈을 초과하여 이종 폴리뉴클레오티드(전이유전자)의 발현을 증가시킨다.
"조직-특이적 발현 조정 요소/프로모터"로서 본원에서 언급된 발현 조정 요소 (예를 들어, 프로모터)는 특정 조직 또는 세포 타입에서 활성인 것들을 포함한다. 조직-특이적 발현 조정 요소는 전형적으로 특정 세포 또는 조직(예를 들어, 간, 뇌, 중추신경계, 척수, 눈, 망막, 뼈, 근육, 폐, 췌장, 심장, 신장 세포 등등)에서 활성이다. 발현 조정 요소는 전형적으로 이들 세포, 조직 또는 기관에서 활성적인데, 왜냐하면 이들이 특이적 세포, 조직 또는 기관 타입에 독특한 전사 활성 인자 단백질 또는 기타 전사의 조절 인자에 의해 인식되기 때문이다.
발현 조정 요소는 또한, 많은 다양한 세포 타입에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 추진할 수 있는 편재하거나 뒤섞인 프로모터/인핸서를 포함한다. 이러한 요소는 거대세포바이러스 (CMV) 극초기 프로모터/인핸서 서열, 라우스 육종바이러스 (RSV) 프로모터/인핸서 서열, 및 다양한 포유동물 세포 타입에서 활성인 기타 바이러스 프로모터/인핸서, 또는 자연적으로는 존재하지 않는 합성 요소 (예를 들어, 문헌 [Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)] 참조), SV40 프로모터, 디하이드로엽산 환원효소 (DHFR) 프로모터, 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터 및 신장 인자-1 알파 (EF1-알파) 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
발현 조정 요소는 또한, 조절가능한 방식으로 발현을 부여할 수 있으며, 즉, 시그널 또는 자극은 작동가능하게 연결된 이종 폴리뉴클레오티드 (전이유전자)의 발현을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 시그널 또는 자극에 반응하여 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키는 조절가능한 요소는 또한, "유도성 요소" (즉, 시그널에 의해 유도됨)로서 언급된다. 특정 예는 호르몬 (예를 들어, 스테로이드) 유도성 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 시그널 또는 자극에 반응하여 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시키는 조절가능한 요소는 "억제성 요소"로서 언급된다 (즉, 시그널이 제거되거나 존재하지 않는 경우 발현이 증가되도록, 시그널은 발현을 감소시킴). 전형적으로, 이러한 요소에 의해 부여된 증가 또는 감소의 양은 존재하는 시그널 또는 자극의 양에 비례한다; 시그널 또는 자극의 양이 더 클수록, 발현의 증가 또는 감소가 더 크다. 특정 비제한적 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌 (MT) 프로모터; 스테로이드 호르몬-유도성 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터; T7 폴리머라제 프로모터 시스템 (WO 98/10088); 테트라시클린-억제성 시스템 (Gossen, et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)); 테트라시클린-유도성 시스템 (Gossen, et al., Science. 268:1766-1769 (1995); 또한, 문헌 [Harvey, et al., Curr . Opin . Chem . Biol . 2:512-518 (1998))] 참조; RU486-유도성 시스템 (Wang, et al., Nat. Biotech. 15:239-243 (1997) and Wang, et al., Gene Ther. 4:432-441 (1997)]; 및 라파마이신-유도성 시스템 (Magari, et al., J. Clin. Invest. 100:2865-2872 (1997); Rivera, et al., Nat. Medicine. 2:1028-1032 (1996))을 포함한다. 이러한 상황에서 유용할 수 있는 기타 조절가능한 조정 요소는 특정 생리학적 상태 예를 들어, 온도, 급성기 (acute phase)에 의해 조절되는 것들이다.
발현 조정 요소는 또한, 이종 폴리뉴클레오티드 (전이유전자)에 대한 천연 요소(들)를 포함한다. 천연 조정 요소 (예를 들어, 프로모터)는, 이종 폴리뉴클레오티드의 발현이 천연 발현을 모방하는 것이 바람직한 경우 이용될 수 있다. 천연 요소는, 이종 폴리뉴클레오티드의 발현이 일시적으로 또는 발달적으로, 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특이적 전사 자극에 대해 반응하여 조절되어야 하는 경우 이용될 수 있다. 기타 천연 발현 조정 요소 예컨대, 인트론, 폴리아데닐화 부위 또는 코자크 컨센서스 서열이 또한 이용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "작동가능한 연결" 또는 "작동가능하게 연결된"은 구성요소들이 이들의 의도된 방식으로 작용하는 것을 허용하도록, 기술된 바와 같은 구성요소의 물리적 또는 기능적 근위를 나타낸다. 전이유전자와 작동가능하게 연결되는 발현 조정 요소의 예에서, 조정 요소가 전이유전자의 발현을 조절하도록 관계가 이루어진다. 더욱 특히, 예를 들어, 작동가능하게 연결된 2개의 DNA 서열은, 2개의 DNA가 DNA 서열중 적어도 하나가 다른 서열에 대해 생리학적 영향을 발휘할 수 있는 관계로 배열 (시스 또는 트랜스)됨을 의미한다.
본원에 기재된 바와 같이, AAV와 같은 바이러스 벡터를 포함하는 벡터 및 벡터 서열은 여전히 추가의 핵산 요소를 포함할 수 있다. 이들 요소는 비제한적으로, AAV ITR 서열의 하나 이상의 복사체, 프로모터/인핸서 요소, 전사 종결 시그널, 전이유전자 측면에 인접한 5' 또는 3' 비번역된 영역 (예를 들어, 폴리아데닐화 서열), 또는 인트론 I 전체 또는 일부를 포함한다. 이러한 요소는 또한, 선택적으로 전사 종결 시그널을 포함한다. 전사 종결 시그널의 특정한 비제한적 예는 SV40 전사 종결 시그널이다.
벡터 또는 벡터 서열 예컨대, 전이유전자의 요소와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "측면인접 (flank)"은 언급된 요소가 5' 또는 3'에 위치함을 의미한다. 따라서, 발현 조정 요소가 전이유전자 측면인접되는 경우, 조정 요소는 전이유전자의 5' 또는 3'에 위치한다. 용어 "측면인접"은 이들 사이의 매개 서열을 배제하지 않는다. 예를 들어, 전이유전자 및 조정 요소 사이에 매개 서열 예를 들어, 제한 부위가 있을 수 있다. 제한 부위는 전이유전자 및 조정 요소 사이의 매개 서열일 수 있다. 따라서, 요소에 "측면인접"하는 서열은 하나의 요소가 그 서열의 5' 또는 3'에 위치하나, 측면인접 서열이 측면인접되는 서열에 바로 인접하지 않도록 매개 서열이 존재할 수 있음을 나타낸다.
본원에 기재된 바와 같은, 전형적으로 AAV 벡터는 일반적으로 약 4 kb 내지 약 5.2 kb 또는 약간 더 큰 규정된 크기 범위를 갖는 DNA의 삽입물을 전형적으로 수용한다. 따라서, 리포터 전이유전자가 단일 가닥 게놈이거나 자기-상보성인 경우, 전이유전자 크기는 약 4kb 내지 약 5.2kb 미만일 수 있다.
더 짧은 벡터 서열에 있어서, 삽입 단편에서 스터퍼 또는 필러의 포함은 길이를 바이러스 입자 내로 AAV 벡터 패키징에 허용가능한 바이러스 게놈 서열의 정상 크기 또는 그에 인접한 길이로 조절하기 위한 것이다. 다양한 구체예에서, 필러/스터퍼 핵산 서열은 핵산의 비번역된 (비-단백질 엔코딩) 세그먼트이다. AAV 벡터의 특정 구체예에서, 이종 폴리뉴클레오티드 서열은 4.7 KBb 미만의 길이를 가지며, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 전이유전자 서열과 조합되는 경우 (예를 들어, 벡터로 삽입되는 경우) 약 3.0-5.5Kb 또는 약 4.0-5.0Kb 또는 약 4.3-4.8Kb의 전체 길이를 갖는 길이이다.
변형된 형태를 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 다양한 표준 클로닝, 재조합 DNA 기법을 이용하여, 세포 발현을 통해, 또는 시험관내 번역 및 화학 합성 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 순도는 시퀀싱, 겔 전기영동 등을 통해 측정될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 하이브리드화 또는 컴퓨터-기반 데이터베이스 스크리닝 기법을 이용하여 분리될 수 있다. 이러한 기법은 (1) 상동 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 프로브와 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리의 하이브리드화; (2) 예를 들어, 발현 라이브러리를 사용하여 공유된 구조적 특징을 갖는 폴리펩티드를 검출하기 위한 항체 스크리닝; (3) 관심 핵산 서열에 어닐링될 수 있는 프라이머를 사용한 게놈 DNA 또는 cDNA에 대한 중합효소 연쇄 반응 (PCR); (4) 관련된 서열에 대한 서열 데이터베이스의 컴퓨터 탐색; 및 (5) 감수된 핵산 라이브러리의 차등적 스크리닝을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
변형된 형태를 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 또한, 당업자에게 공지된 방법 예를 들어, 자동화된 합성 장치를 사용하여 화학 합성에 의해 생성될 수 있다 (예를 들어, [Applied Biosystems, Foster City, CA] 참조). 펩티드는 화학 방법을 이용하여 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Caruthers (1980).　Nucleic Acids Res. Symp . Ser .　215; Horn (1980); and Banga, A.K.,　Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and De간y Systems　(1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA] 참조). 펩티드 합성은 다양한 고체상 기법 (예를 들어, 문헌 [Roberge　Science　269:202 (1995); Merrifield,　Methods Enzymol .　289:3(1997)] 참조)을 사용하여 수행될 수 있으며, 자동화된 합성은 예를 들어, 제조업자의 지시에 따라 ABI 431A 펩티드 합성기 (Perkin Elmer)를 사용하여 달성될 수 있다.
조성물 (예를 들어, 벡터)의 수식어로서 사용되는 경우 용어 "분리된"은 조성물이 수동으로 제조되거나, 생체내 환경에서 자연 발생하는 것으로부터 완전히 또는 적어도 부분적으로 분리됨을 의미한다. 일반적으로, 분리된 조성물에는 이들이 자연에서 일반적으로 관련된 하나 이상의 물질 예를 들어, 하나 이상의 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물, 세포 막이 실질적으로 존재하지 않는다. 용어 "분리된"은 수동으로 생성된 조합물 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV), 벡터 서열 또는 벡터 게놈 및 약제 제형을 패키징하거나 캡시드화시키는 바이러스 입자(예를 들어, AAV)를 배제하지 않는다. 용어 "분리된"은 또한, 조성물의 대안적인 물리적 형태 예컨대, 하이브리드/키메라, 멀티머/올리고머, 변형물 (예를 들어, 인산화, 당화, 지질화) 또는 유도체 형태, 또는 수동으로 생성된 숙주 세포에서 발현된 형태를 배제하지 않는다.
재조합 벡터, 벡터 서열, 입자 등을 보유하는 리포터 전이유전자는 바이러스 항원, 예컨대, AAV 캡시드를 포함하는 엔벨로프 또는 캡시드 단백질에 결합하는 항체의 검출 (측정/정량화)을 허용하거나 이의 분석을 허용한다. 본 발명에 따르면, 바이러스 항원에 결합하는 항체를 검출 (측정/정량화)하거나 이를 분석하기 위한 방법이 제공된다. 일 구체예에서, 방법은 재조합 벡터를 캡시드화시키는 감염성 재조합 바이러스 입자를 제공하는 단계로서, (i) 벡터는 리포터 전이유전자를 포함하며, (ii) 리포터 전이유전자는 단일-가닥 또는 자기-상보성 게놈이며, (iii) 리포터 전이유전자는 하나 이상의 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결되며, 하나 이상의 측면인접 요소에 의해 측면인접하게 되는 단계; 바이러스에 결합하는 항체를 분석하거나 검출하기 위한 대상체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 상기 감염성 바이러스 입자로 감염될 수 있는 세포를 제공하는 단계; 생물학적 샘플과 감염성 재조합 바이러스 입자를 접착시키거나 인큐베이션시켜 생성 혼합물을 생성하는 단계; 감염성 재조합 바이러스 입자가 감염되고 세포에서 리포터 전이유전자를 발현할 수 있는 조건하에서 생성 혼합물과 감염될 수 있는 세포를 접촉시키는 단계; 및 리포터 전이유전자의 발현을 측정하는 단계를 포함한다. 음성 (-) 대조군에서 리포터 전이유전자와 혼합물의 리포터 전이유전자 발현을 비교하며, 여기에서 (-) 대조군은 (i) 감염성 바이러스에 결합하는 항체가 결여되어 있거나 (ii) 감염성 바이러스에 결합하는 소정량의 항체를 갖는다. 혼합물의 리포터 전이유전자 발현이 (-) 대조군보다 큰 경우, 이는 생물학적 샘플에서 바이러스에 결합하는 항체의 존재를 측정하거나 검출한다.
특정 양태에서, AAV 입자 및/또는 감염성 재조합 바이러스 입자에 결합하는 것으로 분석되거나 검출된 항체는 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질(들)을 포함하고/거나 재조합 벡터는 선택적으로, 하나 이상의 AAV ITR과의 바이러스 벡터 예컨대, AAV 벡터를 포함한다.
용어 "대상체"는 동물, 전형적으로, 포유동물 예컨대, 인간, 인간외 영장류 (유인원, 긴팔원숭이, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 마카크 (macaque)), 애완 동물 (개 및 고양이), 가축 (가금류 예컨대, 닭 및 오리, 말, 소, 염소, 양, 돼지) 및 실험용 동물 (마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그)를 나타낸다. 인간 대상체는 태아, 신생아, 유아, 청소년 및 성인 대상체를 포함한다.
본 발명은 포장 물질 및 그 안의 하나 이상의 구성요소를 갖는 키트를 제공한다. 키트는 전형적으로, 구성요소의 설명 또는 내포된 구성요소의 시험관내, 생체내 또는 생체외 사용을 위한 설명서를 포함하는 라벨 또는 패키징 삽입물을 포함한다. 키트는 이러한 구성요소 예를 들어, 벡터 (예를 들어, AAV), 벡터 서열, 게놈 또는 바이러스 입자 또는 조성물의 수집물을 함유할 수 있다.
키트는 키트의 하나 이상의 구성요소를 하우징하는 물리적 구조물을 나타낸다. 패키징 물질은 멸균된 구성요소를 함유할 수 있으며, 이러한 목적을 위해 통상적으로 사용되는 재료 (예를 들어, 종이, 골판지, 유리, 플라스틱, 호일, 앰플, 바이알, 튜브 등)로 제조될 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 내포된 하나 이상의 구성요소, 용량, 작용 메카니즘을 포함하는 활성 성분(들)의 임상적 약리학, 약동학 및 약역학을 확인시켜주는 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업자, 로트 번호, 제조 위치 및 날짜 즉, 유통 기일을 확인시켜주는 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업자 정보, 로트 번호, 제조업자 위치 및 날짜를 확인시켜주는 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 방법 또는 용도에서 키트 구성요소중 하나 이상을 사용하기 위한 임상의 또는 대상체를 위한 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 본원에 기술된 방법 및 용도 중 임의의 것을 실행하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물은 구성요소, 키트 또는 포장 물질 (예를 들어, 박스)에 부착되거나 분리되거나, 키트 구성요소를 함유하는 앰플, 튜브 또는 바이알에 부착된 "인쇄된 물질" 예를 들어, 종이 또는 판지를 포함한다. 라벨 또는 삽입물은 추가적으로 컴퓨터 판독 매체 예컨대, 바-코드 인쇄된 라벨, 디스크, 광학 디스크 예컨대, CD- 또는 DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, 자석 테이프, 또는 전기 저장 매체 예컨대, RAM 및 ROM, 또는 이들의 하이브리드 예컨대, 자석/광 저장 매체, FLASH 매체 또는 메모리 타입 카드를 추가적으로 포함할 수 있다.
다르게 규정되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 당해 기술분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 뜻을 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 이용될 수 있으나, 적합한 방법들 및 재료들이 본원에 기술되어 있다.
본원에 인용된 모든 출원, 공개문헌, 특허 및 기타 참조, GenBank 인용 및 ATCC 인용은 그 전체가 참조로 통합된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 기준이 될 것이다.
본원에 기재된 특징들 모두는 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 기재된 각 특징은 동일하거나, 동등하거나 유사한 목적으로 작용하는 대안적인 특징에 의해 대체될 수 있다. 이와 같이, 다르게 명확히 언급되지 않는 한, 기재된 특징들 (예를 들어, 재조합 벡터 (예를 들어, AAV), 벡터 서열, 플라스미드, 게놈 또는 전이유전자, 또는 재조합 바이러스 입자 (예를 들어, AAV))는 동등하거나 유사한 부류의 특징들의 예이다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥에서 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수의 지시 대상물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "폴리뉴클레오티드"에 대한 언급은 복수의 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하며, "벡터"에 대한 언급은 복수의 이러한 벡터를 포함하며, "벡터 서열, 플라스미드 또는 게놈"은 복수의 이러한 벡터를 포함하며, "바이러스" 또는 "입자"에 대한 언급은 복수의 이러한 비리온들/입자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 모든 수치 값 또는 수치 범위는 문맥에서 명백히 달리 명시하지 않는 한 이러한 범위내의 정수 및 범위내의 정수 또는 값의 소수를 포함한다. 따라서, 설명하자면, 적어도 80% 상보성 또는 동일성에 대한 언급은 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 등등은 물론 81.1%, 81.2%, 81.3%, 81.4%, 81.5%, 등등, 82.1%, 82.2%, 82.3%, 82.4%, 82.5%, 등등 및 기타 등등을 포함한다.
초과 (넘는) 또는 미만과 같이 쓰인 정수에 대한 언급은 각각 언급된 수보다 큰 또는 작은 임의의 수를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1 초과의 언급은 2, 3, 4, 5, 6 등 및 그 이상을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 모든 수치 값 또는 범위는 문맥상 다르게 명백히 언급되지 않는 한 이러한 범위내의 값 및 정수의 소수 및 이러한 범위내의 정수의 소수를 포함한다. 따라서, 설명하자면, 수치 범위에 대한 언급 예컨대, 백분율 범위 예컨대, 1-10은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10은 물론, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 등등 및 기타 등등을 포함한다. 따라서, 1-50의 범위에 대한 언급은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 등등, 50을 포함하는 50 이하는 물론, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 등, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 등등, 및 기타 등등을 포함한다.
일련 범위에 대한 언급은 일련내의 다양한 범위의 경계 값과 조합되는 범위를 포함한다. 따라서, 설명하자면, 11-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1,000, 1,000-1,500, 1,500-2,000, 2,000-2,500, 2,500-3,000, 3,000-3,500, 3,500-4,000, 4,000-4,500, 4,500-5,000, 5,500-6,000, 6,000-7,000, 7,000-8,000, 또는 8,000-9,000의 일련의 범위에 대한 언급은 10-50, 50-100, 100-1,000, 1,000-3,000, 2,000-4,000, 등등의 범위를 포함한다.
본 발명은 일반적으로, 많은 구체예 및 양태를 기술하기 위해 긍정의 언어를 사용하여 본원에서 기술하였다. 또한, 본 발명은 특히, 특정 내용 예컨대, 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜 또는 절차가 전체적으로 또는 부분적으로 배재된 구체예를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구체예 또는 양태에서, 재료 및/또는 방법 단계가 배제된다. 따라서, 본 발명은 본 발명이 무엇을 포함하지 않는지에 대해 본원에서 일반적으로 표현되지 않았지만, 그럼에도 불구하고, 본 발명에 명확하게 배제되지 않은 양태들은 본원에 기재된 것이다.
본 발명의 많은 구체예가 기술되어 있다. 그렇지만, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 당업자는 다양한 용도 및 조건에 맞춰 본 발명을 다양하게 변화 및 변경시킬 수 있다. 따라서, 하기 실시예는 설명을 위한 것이며, 청구된 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
본 실시예는 항-AAV 중화 항체 (NAb) 검정의 수행을 평가하는 다양한 연구의 개요를 나타낸다. 이러한 검정은 AAV 벡터-매개된 유전자 전이 연구에 등록하기 전에 대상체를 스크리닝하는 것을 물론, AAV 벡터-매개된 유전자 전이 요법 및 후속-AAV 벡터-매개된 유전자 전이 요법 동안 항-AAV 중화 항체의 존재 또는 양을 모니터링하는데 사용될 수 있다.
상당 부분의 성인 군집은 전형적으로 유아기 동안 호흡기의 감염을 통해 야생형 AAV에 노출되었다 (Calcedo, 2011). 따라서, 많은 사람들이 벡터와 상호-반응하는 AAV에 대한 NAb를 보유한다. 초기 임상 연구 (Manno et al. 2006)는 벡터가 순환을 통해 전달되는 경우 심지어 보통 역가의 NAb도 형질도입을 차단하는 것으로 보임을 입증하였다. 인간외 영장류에서의 다른 연구는 벡터가 순환을 통해 전달되는 경우 1:5 만큼 낮은 NAb 역가도 간의 형질도입을 완전히 차담함을 입증하였다 (Jiang et al., Blood 2006; Scallan, Blood 2006). 이러한 검정의 목적은 본 연구에 참여하기 위해 참석한 대상체에서 NAb 역가를 측정하는 것이다; >1:5의 사전-존재 역가를 갖는 사람은 연구에 참여하기 위한 후보자가 못된다.
이러한 연구는 리포터 유전자를 발현하는 AAV 벡터를 사용한 세포-기반 검정법을 사용한다. 평가 혈청은 벡터와 혼합되고 루시퍼라제 발현 수준은 혈청에 노출되지 않은 대조군 샘플에서의 수준과 비교된다. 중화 역가는 세포 및 벡터는 지니나 혈청은 없는 웰과 비교하여 리포터 유전자 (예를 들어, 루시퍼라제) 발현의 50% 또는 그 초과의 억제를 유도하는 혈청의 가장 높은 희석물로서 규정되며, 그러나, 이는 본 문헌에서 범위로서 보고된다; 예를 들어, 샘플의 1:3.1 희석에서 50% 또는 그 초과의 억제가 관찰되는 경우, 역가는 1:3.1 내지 1:10의 범위로서 보고된다.
3개의 변수가 검정 정밀성 및 정확성에 영향을 끼칠 수 있다. 이들은 검정 결과에 대한 세포 계대 수, 오퍼레이터 변동성 및 평가 혈청 및 FACT의 냉동-해동 순환을 갖는 결과물의 안정성의 효과이다. 평가를 위한 혈청 샘플은 일반적으로 드라이 아이스 상에서 냉동된걸 얻으며, -80℃에서 저장되며, 처음 해동시에 평가된다. 반복 검정은 냉동-해동의 추가적인 순환 후 수행될 수 있다.
실시예 2
본 실시예는 본원에 기술된 연구에 사용된 특정 재료 및 장치의 설명을 포함한다.
재료: 평가 샘플, 대상체 공급원은 혈청 또는 혈장이며 (혈장은 항-응고제로서 헤파린을 함유하지 않아야 함); PBS (인산염 완충 염수), 멸균, Ca++ 및 Mg++ 비함유, 인비트로겐 (Invitrogen) 14190-136 또는 동등물; DMEM (둘베코 변형된 이글 배지), 인비트로겐 11965-084, 또는 동등물; FBS (소태 혈청), 하이클론 (Hyclone) SH30070.03IR, 또는 동등물; 페니실린/스트렙토마이신, 인비트로겐 15140-122, 또는 동등물; L-글루타민, 200 mM, 인비트로겐 25030-156, 또는 동등물; cDMEM: 완전 DMEM (10% FBS, 1x 페니실린/스트렙토마이신, 1x L-글루타민); Ad-E4를 안정하게 발현하는 인간 배아 신장 세포 (2V6.11 세포, ATCC 번호: CRL- 2784, 하기 계대 # 26); 트립신-EDTA (0.25% 트립신과 EDTA 4Na) 1X, 인비트로겐 25200-056, 또는 동등물; 표준으로서 루시퍼라제 플라스미드를 사용하여 돗-블롯(dot-blot) 하이브리드화에 의해 역가측정된, 1의 비율을 갖는 벡터 게놈 (vg)에 대한 캡시드를 지닌 밀도-구배 정제된 AAV-루시퍼라제; 50 ul 분취물 중에 냉동 보관된 대조군 FACT 혈장 (조지 킹 바이오메디칼 (George King Biomedical) Cat# 0020-1, 로트 번호 D9d1); 1㎍/mL 농도로 100% 에탄올 중에 재구성된 포나스테론 A, 인비트로겐 H101-01; 500 mL 필터링 시스템, 0.22㎛, 밀리포어 SCGPU05RE; 96-웰 넓적 바닥 조직 배양 플레이트 코닝(Corning) 3595; 혈청학용 피펫, 5, 10, 25 mL; 50mL 원심분리/원뿔 튜브, 코닝 430290; 시약 저장소, 코스타르 (Costar) 4870; 12-채널 멀티-채널 피페터 1-10㎕; 12-채널 멀티-채널 피페터 20-200㎕; P-20, P-200 및 P-1000 라이닌 피페트만 (Rainin Pipetman); 피펫 팁스 (Pipet Tips); 에펜도르프 튜브 (Eppendorf tube); 12-채널 저장소, 코스타르 4877; 피펫 에이드 (Pipette Aid), 드럼몬드(Drummond) 4-000-100 또는 동등물; 보텍스 혼합기 (Vortex mixer); 생세포 계수를 위한 트립판 블루 (Trypan Blue) (시그마(Sigma) T8154 또는 동등물); 레닐라 루시퍼라제 검정 키트, 프로메가(Promega), 카탈로그 #E2820; 마이크로소프트 엑셀 소프트웨어.
장치: 37℃ 및 5% CO2에서의 인큐베이터; 바이오로지컬 세이프티 캐비넷 (Biological Safety Cabinet); 혈구계수기 (Hemacytometer), 레이셔트 브라이트-라인 (Reichert Bright-Line), 피셔(Fisher)# 02-671-5, 또는 동등물; 도립 현미경; 냉동기, -80℃; 냉장기, 2-8℃; 인큐베이터, 37℃; 분석 저울; 베리타스 마이크로플레이트 루미노미터(Veritas microplate luminometer), 터너 바이오시스템즈(Turner Biosystems); 및 쉐이커.
실시예 3
본 실시예는 항-AAV 항체를 검출하고/거나 정량화하는 예시적 방법의 설명을 포함한다.
2V6.11 세포 (아데노바이러스로부터의 E4 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형된 HEK-293 세포)는 AAV-루시퍼라제 벡터 단독으로 또는 희석 범위에서 혈청과 혼합된 벡터로 형질도입하였다. 24 시간 후, 루시퍼라제 발현을 루미노미터를 사용하여 검출하였다. 세포를 이들 연구 및 관례적 검정을 위해 동일한 방식으로 조작하였다.
삼중으로 진행된 결과는 벡터 단독 (대조군)으로부터의 측정값과 비교하여 루시퍼라제 발현이 벡터 단독에 대한 발현의 50% 또는 그 미만이 되는 혈청 희석을 결정하였다. 이러한 검정은 리포터 유전자로서 lacZ보다는 루시퍼라제 리포터 유전자를 이용하는데, 왜냐하면 이것이 낮은 억제 수준에서 더욱 민감하기 때문이다.
진행 성공 평가에 대한 기준은 하기를 포함한다:
1. 대조군 혈장 (풀링된 인간 혈장, FACT)은 AAV8 벡터에 있어서는 1:100 내지 1:316 및 AAV2 벡터에 있어서는 1:1000 내지 1:3160의 측정값을 나타내었다.
2. 세포를 지니나 벡터와 혈청을 갖지 않는 웰은 허용가능한 낮은 측정값을 제공하였다.
3. 세포와 벡터를 지니나 혈청을 갖지 않는 웰은 허용가능한 측정값을 제공하였다.
벡터가 순환을 통해 전달되는 프로토콜에 있어서, 낮거나 (<1:5) 검출불가능한 역가는 전형적으로 연구에 포함시키기에 바람직하다. 이러한 이유로, 이러한 범위의 모든 결과는 반복 수행으로 확인된다.
검정의 분석간 변동성을 낮은-내지-음성 내지 높은 범위의 항-AAV8 NAb 역가를 갖는 미국에 거주하는 중증 혈우병에 걸린 성인으로부터 얻은 9개 인간 혈청 샘플 세트에서 추정하였다. 양성 대조군 FACT 혈장 (로트 # D9d1)을 이들 연구에 포함시켰다. FACT는 적어도 30명의 인간 도너로부터의 정상적인 인간 혈장 샘플의 상업적으로 이용가능한 풀(pool)이다. 풀링된 군집내에는 높은 역가 AAV 항체를 갖는 개체가 존재할 것이며, 이는 본 검정에서 양성으로서 나타날 것이다. 양성 대조군으로서의 혈장 이용은 허용가능한데, 혈청 및 혈장이 항체와 유사한 수준을 갖기 때문이다. 하나의 단일 로트의 FACT 혈장이 본 연구에 사용되었다.
더욱 상세하게는, 시약 및 샘플을 제조하였다: ≥ 2 x 1011 vg/mL 농도의 AAV-CBS-레닐라 벡터 및 -80℃에서 저장된 분취물. 대조군 혈장 FACT에 있어서, 샘플을 30분 동안 56℃에서 열-불활성화시키고, -80℃에서 분취물을 저장하였다. 평가 샘플에 있어서, 샘플 (혈청 또는 혈장)을 30분 동안 56℃에서 열-불활성화시키고, -80℃에서 분취물을 저장하였다. 루시퍼라제 세포용해 및 검정 완충제에 있어서, 레닐라 루시퍼라제 시스템에서의 시약을 제조업자에 따라 제조하고 사용하였다. 희석 혈청에 있어서, 소태 혈청을 30분 동안 560℃에서 열-불활성화시키고, 실온으로 냉각하고 0.22μM 필터를 통해 여과하였다. 분취물을 -80℃에서 저장하였다.
더욱 상세하게는, 절차에 있어서, ATCC (cat. No. CRL-2784)를 통해 획득한 낮은 계대 (#2) 2V6.11 세포를 대략 2분 동안 37℃ 수조에서 해동하고, 이어서 10% FBS, 1% Pen/Strep, 및 1% 글루타민을 갖는 DMEM으로 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 T-75 세포 배양 플라스크에 플레이팅시키고, 2일 동안 배양하고, 트립신화시키고, 이어서 T-75 플라스크에서 2회 더 많은 계대를 위해 재플레이팅하였다. 이어서, 세포를 트립신화시키고, 세척하고 계수하고, cDMEM 중에 1 x 105 세포/mL로 희석하고, 포나스테론 A를 1ug /mL의 최종 농도로 첨가하고, 웰 당 20,000 밀도로 96-웰 플레이트 상에 시딩하였다. 세포를 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였으며, 약 70-80% 컨플루언시를 나타내야 한다.
평가 샘플 및 대조군 혈장 샘플의 희석물 시리즈를 희석-플레이트 (96-웰 U-바닥 조직 배양 플레이트)에서 제조하였다. 희석제로서 FBS를 사용하여 FACT 대조군 혈장의 3.1-배 (1/2-log)의 연속 희석물을 제조하였다. 희석 범위는 FACT 혈장에 의존적이다. 전형적으로 1:10 내지 1:3160의 적어도 6회의 연속 희석이 권장된다.
희석제로서 FBS를 사용하여 평가 샘플의 3.1-배 연속 희석물을 제조하였다. 희석 범위는 샘플에 의존적이다: 기준 (투여전) 샘플에 있어서는 1:1 내지 1:316, AAV 투여 후 샘플에 있어서는 1:10 및 그 초과의 희석이 권장된다.
희석 플레이트로부터 18μL의 상기 희석물을 제 2의 96-웰 검정전 플레이트에 옮겼다. DMEM에서 8x 107-2 x 109vg/mL로 AAV 루시퍼라제 벡터를 희석함으로써 작업 농도의 AAV 루시퍼라제 벡터를 제조하였다 - cDMEM 또는 소 혈청을 함유하는 임의의 희석제는 사용하지 않는다. 0.5 mL 희석된 벡터 용적이 하나의 전체 검정 플레이트에 충분하였다.
희석된 평가 및 대조군 샘플과 벡터의 혼합물을 제조하여 '중화된' 샘플을 생성하였다. 희석된 벡터를 12-채널 저장소로 옮겼다. 저장소로부터 희석된 벡터 18μL를 검정전 플레이트의 평가 및 대조군 샘플의 18μL 희석물 각각에 옮겼다. 벡터만 존재하는 대조군 ("V+FBS")에 있어서는 18μL의 희석된 벡터를 18μL의 FBS와 혼합하였다. "블랭크"로서 검정정 플레이트의 하나의 웰에 18 μL의 FBS를 첨가하였다. 검정전 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 7.5 μL의 '중화된' 평가 샘플 희석물, '중화된' 대조군 혈장 희석물, V+FBS 대조군 및 블랭크 FBS를 검정 플레이트에 삼중으로 옮겼다. 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 검정 플레이트를 밤새 인큐베이션하였다.
루시퍼라제 활성의 세포 용해 및 측정에 있어서, 15 또는 50 mL 원뿔형 튜브에서 충분한 세포용해 완충제 (5 mL는 하나의 플레이트에 충분함) 및 기술된 바와 같이 15 또는 50 mL 원뿔형 튜브에서 충분한 검정 완충제 (7 mL가 하나의 플레이트에 충분함)를 제조하였다. 형질도입 후 20 내지 24시간에서 PBS로 1회 세포를 세척하였다. 다중-채널 피펫을 사용하여 세포-배양 상청액을 흡입하였다. 세포-단일층이 흩뜨려지지 않도록 조심하면서 200 μL의 PBS를 세포에 첨가하였다. 세척물을 흡입하고, 웰 당 40 μL의 세포용해 완충제를 첨가하고, 실온에서 15분 동안 플레이트를 인큐베이션하였다.
루미노미터를 돌리고, 검정 완충제를 설계된 영역에 로딩하고, 인젝터를 프라이밍시키고, 세포 플레이트를 로딩하였다 (프로메가 루시퍼라제 프로토콜). 루시퍼라제 활성을 측정하고, 엑셀에 측정값을 모두 저장하였다. 루미노미터에 대한 변수: 통합 시간, 2초, 마지막 작업과 이러한 주입 사이의 지연 시간: 0초, 주입 용적: 50ul, 주입 속도: 333ul/sec, 주입과 측정 사이의 지연 시간: 1초.
항-AAV 중화 항체 역가의 계산에 있어서, 엑셀 시트에서 삼중 웰로부터의 평균 미가공 루시퍼라제-블랭크 값을 계산하고 루시퍼라제 발현%를 결정하였다:
루시퍼라제 발현 % = [(평가 샘플 루시퍼라제 측정값 - 블랭크) / (V-FBS 루시퍼라제 측정값 - 블랭크)] x 100.
루시퍼라제 억제 % = 100 - 루시퍼라제 발현%
샘플의 중화 역가는 루시퍼라제 발현의 50% 또는 그 초과의 억제를 유도하는 가장 높은 희석으로서 결정된다. NAb 역가는 희석 범위로서 보고된다. 예를 들어, 50% 또는 그 초과의 억제가 샘플의 1:10 희석에서 관찰되는 경우, 역가는 1:10 내지 1:31의 범위로서 보고된다.
오퍼레이터 변동: 오퍼레이터 변동성은 상이한 날에 인간 혈청 샘플의 동일한 세트에 대해 오퍼레이터 1 및 2에 의해 수행된 다중 AAV NAb 측정 결과를 기반으로 하여 평가하였다. 오퍼레이터에게는 샘플 번호를 알려주지 않았다.
오퍼레이터 1은 다른 날에 9개 혈청 샘플에 대한 NAb 검정을 6회 수행하였다. FACT 혈장을 6일의 다른 날에 총 18회 평가하였다.
오퍼레이터 2는 다른 날에 9개 혈청 샘플에 대한 NAb 검정을 5회 수행하였다. FACT 혈장을 5일의 다른 날에 총 15회 평가하였다.
세포 계대 수를 기록하고 결과 분석에 이용하였다. 마지막으로, 샘플 조작에 관계된 항-AAV NAb에서의 변화를 평가하기 위해 다수의 냉동-해동 순환 후 FACT 혈장의 항-AAV8 NAb 역가를 결정하였다.
표 1: 검정 플레이트 레이아웃:
Figure pct00002
샘플 희석은 괄호 안에 나타내었다. 최대 시그널 웰은 샘플 희석제 만으로 인큐베이션된 바이러스를 함유한다. 배경 웰은 단지 희석제만 함유한다. 최대 3개의 알려지지 않은 샘플을 96 웰 플레이트에서 평가하였다. 여기서 나타낸 검정 플레이트 레이아웃은 검정 수행 동안 사용된 것과 동일하다.
실시예 4
본 실시예는 항-AAV 항체를 검출하고/거나 정량하기 위한 검정 결과의 설명을 포함한다.
세포 계대 수의 함수로서의 시그널 강도: 총 33개 플레이트에 시딩하고, 본 연구에서 AAV NAb 평가에 사용하였다. 최대 및 최소 리포터 시그널 강도를 세포 계수 수의 함수로서 측정하였다.
최대 리포터 유전자 시그널 (최대 시그널)의 감소가 증가하는 수의 세포 계대에서 관찰되었으며 (도 1a), 이는 검정 결과에 영향을 끼치는 것으로 여겨지지 않으며, 즉 NAb 역가는 25개 이하 계대의 세포 계대 수에 상관없이 검정된 샘플에 있어서 동일하였으며, 모든 검정은 성공적인 검정 요건을 충족시켰다. 본 검정에 사용된 세포는 절대 25회 넘게 계대되지 않았음을 주목하라. NAb 검정 목적에 있어서, 세포는 25 또는 그 미만의 계대이어야 한다.
배경 시그널 또한 세포 계대 수와 함께 감소하였다 (도 1b). 그러나, 세포 계대 1-12 vs. 13-25에 대한 평균 시그널은 통계학적으로 상이하지 않았다.
오퍼레이터 변동성: 이들 검정에 사용된 FACT 혈장의 특정 로트의 AAV NAb 역가는 수개월의 과정에 걸쳐 실험실에서 정례적으로 평가되었으며, AAV8 벡터에 있어서 1:100-1:316이다. 평균 값으로부터 ≥ 또는 ≤ 1/2 log의 NAb 역가는 거절되었다. 거절된 수행의 조사에 대한 표준 접근 방법은, 시약 어느 것도 만료되지 않았으며, 루미노미터를 포함하는 주요 장치가 현재까지 유지됨을 확인하는 것이다. 실험은 범위 밖의 검정에 있어서 특정 원인이 좀처럼 발견되지 않았음을 나타낸다: 이는 아마도 세포-기반 검정의 고유의 변동성을 반영하는 것으로 보인다.
오퍼레이터 1: 오퍼레이터 1 (표 2a)에 의해 수행된 결정 세트에서, FACT 대조군 혈장의 항-AAV8 NAb 역가는 6개의 별도의 연구에서 18회 측정되었다.
ㆍ16/18회 FACT 혈장은 1:100-1:316의 역가를 제공하였다;
ㆍ1/18회 (플레이트 2, 4일) 역가는 1/2 log 미만으로 측정되었으며 1:31.6-1:100이며, 이는 검정 진행의 거부를 초래하였다;
ㆍ1/18회 (플레이트 3, 6일) 역가는 1/2 log 초과로 측정되었으며, 1:316-1:1000이며, 이는 검정 진행의 거부를 초래하였다.
표 2a: FACT 혈장 샘플에서 항-AAV 역가 (오퍼레이터 1)
Figure pct00003
총 9개의 인간 혈청 샘플을 6일의 다른 날에 항-AAV8 NAb에 대해 평가하였다. 결과는 표 2b에 요약되어 있다. 회색 영역은 FACT 혈장 대조군 NAb 역가가 역사적 범위와 상이하기 때문에 분석으로부터 배제된 검정 진행을 나타낸다.
역가 간의 변동성은 샘플 1, 2, 3, 5 및 7에 있어서 관찰되지 않았으며, 이는 모든 평가 일에 네거티브 (<1:1)를 기록하였다. 샘플 4 및 9에 있어서, 대략 1 log 변동이 5일 평가 일에 걸쳐 관찰되었으며, 역가는 각각 <1:1 내지 1:3.1-1:10 및 1:3.1-1:10 내지 1:31.6-1:100 범위이다. 샘플 6에 있어서, 1/2 log 변동이 관찰되었다; 이 샘플은 5일을 제외한 모든 평가 일에 네거티브를 기록하였으며, 5일에서는 1:1-3.1을 기록하였다. 역가에서 1/2 log 변동이 또한 샘플 8에 있어서 관찰되었으며, 역가는 1:316-1:1000 내지 1:1000-1:3160 범위이다.
각 샘플은 샘플 9를 제외하고는 연구 적격성에 대한 임계 초과 또는 미만을 일관되게 기록하였으며, 샘플 9는 1-4일에는 임계 초과를 기록하였으며 (부적격) 5일에는 임계 미만을 기록하였다 (적격).
표 2b: 인간 혈청 샘플에서 항-AAV 역가 (오퍼레이터 1)
Figure pct00004
샘플 1-3은 플레이트 1이며; 샘플 4-6은 플레이트 2이며; 샘플 7-9는 플레이트 3이다.
오퍼레이터 2: 오퍼레이터 2에 의해 수행된 연구의 일부에서 (표 3a), FACT 대조군 혈장의 항-AAV8 NAb 역가를 5개의 별도의 실험으로 15회 측정하였다.
ㆍ13/15회 FACT 혈장은 1:100-1:316의 역가를 제공하였다;
ㆍ1/15회 (플레이트 3, 3일) 역가는 1/2 log 초과로 측정되었으며, 1:316-1:1000이며, 검정 진행의 거부를 초래하였다.
ㆍ1/15회 (플레이트 3, 5일) 역가는 1/2 log 초과로 측정되었으며, 1:31.6-1:100이며, 검정 진행의 거부를 초래하였다.
표 3a: FACT 혈장 샘플에서 항-AAV 역가 (오퍼레이터 2)
Figure pct00005
총 9개의 인간 혈청 샘플을 5일의 다른 날에 항-AAV8 NAb에 대해 평가하였다. 결과는 표 3b에 요약하였다. 회색 영역은 FACT 혈장 대조군 NAb 역가가 역사적 범위와 상이하기 때문에 분석으로부터 배제된 검정 진행을 나타낸다.
네거티브 항-AAV8 NAb 역가 (<1:1)를 갖는 샘플 1, 2, 3, 5, 6 및 1:1-1:3.1의 역가를 갖는 샘플 4는 모든 5일의 평가일에 걸쳐 동일한 역가를 일관되게 제공하였다. 더 높은 역가 샘플인 샘플 8 및 9 또한 평가 일에 걸쳐 일관되었다; 샘플 8은 1:100-1:316을 기록하고, 샘플 9는 1:10-1:31.6을 기록하였다. 샘플 7은 2일을 제외한 모든 평가 일에 네거티브 (<1:1)를 기록하였으며, 2일에는 1:1-1:3.1, 1/2 log 변동을 기록하였다.
각 샘플은 연구 적격성에 대한 임계 초과 또는 미만을 일관되게 기록하였다.
표 3b: 인간 혈청 샘플에서 항-AAV 역가 (오퍼레이터 2)
Figure pct00006
샘플 1-3은 플레이트 1이며; 샘플 4-6은 플레이트 2이며; 샘플 7-9는 플레이트 3이다.
오퍼레이터 간의 변동성: 오퍼레이터 1 및 2에 의해 측정된 바와 같은 각 샘플에 대한 평균 AAV NAb 역가는 표 4 및 도 2에 제시하였다. 기록된 역가 범위의 상호간의 더 낮은 값을 사용하여 평균을 계산하였다. 예를 들어, 해당 진행에서 샘플에 대한 역가가 1:3.1-1:10으로서 보고되는 경우, 3.1의 값을 평균을 계산하는데 사용하였다. <1:1로서 보고된 역가에 있어서는, 0의 값을 사용하였다.
오퍼레이터 간의 변동성은 샘플 1, 2, 3, 4 또는 5에 대해서 관찰되지 않았다. 일부 오퍼레이터 간의 변동성이 샘플 6, 7, 8 및 9에 있어서 관찰되었으나, 오퍼레이터 평균 간의 차이는 어떠한 샘플에 있어서도 1 log를 초과하지 않았다. 평균 FACT 역가는 오퍼레이터 간에 실제로 동일하였으며, 단지 0.01 log만큼만 상이하다 (평균 FACT 역가의 계산은, FACT 역가는 이의 역사적 범위와 상이한 거부된 진행을 포함함).
표 4: 오퍼레이터 1 및 2에 있어서 평균 역가 및 표준 편차
Figure pct00007
냉동-해동 순환의 효과: AAV NAb 역가에 대한 반복된 냉동-해동 순환의 효과를 FACT 혈장 파지티브 대조군에 대해 평가하였다. 샘플을 냉동-해동 순환을 6회 이하로 처리하고 (37℃에서 해동하고, -80℃에서 중간에 저장하면서 에탄올/드라이 아이스 배쓰에서 냉동시킴), 항-AAV8 NAb 역가를 측정하였다. 평가를 2회 반복하였다. 평가 샘플을 또한 -80℃에서 저장하였으나, 얼음 (0℃)에서 해동되었음을 주목하라. 냉동-해동 평가 결과를 표 5에 요약하였다. 6번 이하의 냉동-해동 순환 후 AAV NAb 역가에서의 변동은 측정되지 않았다.
표 5: FACT 대조군 혈장의 항-AAV8 NAb 역가에 대한 냉동-해동의 효과
Figure pct00008
실시예 5
본 실시예는 AAV 항체 검정을 기반으로 한 결론의 설명을 포함한다.
NAb 검정에 사용된 세포의 초기 해동으로부터의 25회 계대 내에서, 루시퍼라제 시그널의 최대 시그널의 현저한 감소가 관찰되었다. 그러나, 이러한 감소는 평가 결과에 영향을 끼치는 것으로 보여지지 않으며, 즉 AAV NAb 역가는 25회 이하 계대의 세포 계대 수와 무관하게 검정된 샘플에 있어서 동일하였으며, 모든 검정은 성공적 검정에 대한 요건을 충족시켰다.
냉동-해동의 6회 순환은 검정에서 평가된 대조군 혈장 샘플의 NAb 역가에 영향을 끼치지 않았다. 이러한 검정에 사용된 대조군 혈장은 수령시 분취하고 냉동되었으며, 해동된 분취물은 재냉동하지 않았다.
NAb 역가에서의 제한된 변동성이 동일한 세트의 샘플에 대한 수개의 측정에 걸쳐 관찰되었다 (검정 간 변동성). 더 높은 변동성이 중간 내지 높은 NAb 역가를 갖는 샘플에 대해 측정된 반면, 더 낮은 변동성이 낮은-역가 NAb 샘플에서 관찰되었다.
유사하게는, NAb 역가에서의 더 높은 변동성이 중간 내지 높은 NAb 역가를 갖는 샘플에 있어서 오퍼레이터 간에 관찰된 반면 (오퍼레이터 간 변동성), 더 낮은 변동성이 낮은-역가 NAb 샘플에서 관찰되었다.
본 AAV-매개된 유전자 전이 시험에 포함시키기 위한 NAb 역가 임계가 <1:5임을 고려하면, 불분명한 결과가 단지 샘플 9에 대해서만 관찰되었으며, 이러한 샘플 9는 7/8 평가 진행에서 >1:5를 기록하였으며 (본 연구에 등록시키기에 부적격), 1/8 진행에서 <1:5를 기록하였다 (본 연구에 등록시키기에 적격). 이것이 실제 대상 샘플이라면, <1:5의 역가는 신속한 반복 평가를 가질 것이다.
이들 결과는 NAb 검정이 인간 혈청 (또는 혈장) 샘플에서 항-AAV NAb 역가를 측정하는데 신뢰할만한 평가임을 나타낸다. 이러한 검정은 AAV 유전자 전이 시험에 등록하기 전에 낮은 항-AAV 역가를 갖는 대상체를 확인하고/거나 AAV-매개된 유전자 전이 동안 또는 후에 AAV 역가를 모니터링하는데 이용될 수 있다.

Claims (70)

  1. 리포터 전이유전자(transgene)를 포함하는 재조합 AAV 벡터 서열로서, 리포터 전이유전자는 (a) 단일-가닥 또는 자기-상보성 게놈을 포함하며, (b) 하나 이상의 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결되며, (c) 하나 이상의 측면인접(flanking) 요소에 의해 측면인접되는 재조합 AAV 벡터 서열.
  2. 리포터 전이유전자를 포함하며 감염성 재조합 AAV 입자를 포함하는 재조합 AAV 벡터로서, 리포터 전이유전자는 (a) 단일-가닥 또는 자기-상보성 게놈을 포함하며, (b) 하나 이상의 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결되며, (c) 하나 이상의 측면인접 요소에 의해 측면인접되는 재조합 AAV 벡터.
  3. AAV에 결합하는 항체를 분석하거나 검출하거나 측정하기 위한 방법으로서,
    (a) 재조합 벡터를 캡시드화하는 감염성 재조합 AAV 입자를 제공하는 단계로서, (i) 벡터가 리포터 전이유전자를 포함하며, (ii) 리포터 전이유전자는 단일-가닥 또는 자기-상보성 게놈을 포함하며, (iii) 리포터 전이유전자는 하나 이상의 발현 조절 요소에 작동가능하게 연결되며 하나 이상의 측면인접 요소에 의해 측면인접되는, 단계;
    (b) AAV에 결합하는 항체를 분석하거나 검출하기 위한 대상체로부터 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
    (c) 상기 감염성 재조합 AAV 입자로 감염될 수 있는 세포를 제공하는 단계;
    (d) (a)의 감염성 재조합 AAV 입자와 (b)의 생물학적 샘플을 접촉시키거나 인큐베이션하여 반응 생성물 (M)을 생성하는 단계;
    (e) (c)의 세포와 생성 혼합물 (M)을 (a)의 감염성 재조합 AAV 입자가 감염되고 상기 세포에서 리포터 전이유전자를 발현할 수 있는 조건하에서 접촉시키는 단계;
    (f) 리포터 전이유전자의 발현을 측정하는 단계; 및
    (g) (f)의 상기 리포터 전이유전자 발현을 대조군의 리포터 전이유전자와 비교하여 AAV에 결합하는 항체를 분석하거나 검출하거나 측정하는 단계로서, 상기 대조군은 (i) AAV에 결합하는 항체가 결여되어 있거나 (ii) AAV에 결합하는 소정량의 항체를 갖는 음성 (-) 대조군인, 단계를 포함하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 세포가 포유동물 세포를 포함하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 세포가 AAV 복제 및/또는 게놈 통합을 위한 헬퍼 작용부를 엔코딩하는 핵산 서열을 제공하는 방법.
  6. 제 3항에 있어서, 세포는 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74, 또는 Rh10, 또는 임의의 상기 AAV 혈청형의 하이브리드 또는 키메라의 VP1, VP2 또는 VP3 서열과 90% 또는 그 초과로 동일한 VP1, VIP2 또는 VIP3 서열을 포함하는 AAV 입자로 감염될 수 있는 방법.
  7. 제 3항에 있어서, 세포가 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74, 또는 Rh10, 또는 임의의 상기 AAV 혈청형의 하이브리드 또는 키메라로 감염될 수 있는 방법.
  8. 제 3항에 있어서, 세포가 포유동물 세포를 포함하는 방법.
  9. 제 3항에 있어서, 세포가 HEK-293, CHO, BHK, MDCK, 10T1/2, WEHI 세포, COS, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, WI38, MRC5, A549, HT1080, 293, B-50, 3T3, NIH3T3, HepG2, Saos-2, Huh7, HER, HEK, HEL, 또는 HeLa 세포를 포함하는 방법.
  10. 제 3항에 있어서, 세포가 AAV E4 유전자를 발현하는 방법.
  11. 제 3항에 있어서, 세포가 2V6.11 세포를 포함하는 방법.
  12. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 리포터 전이유전자가 효소, 비색, 형광, 발광, 화학발광, 또는 전기화학 시그널을 제공하는 단백질을 엔코딩하는 AAV 벡터 또는 방법.
  13. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법으로서, 리포터 전이유전자가 루시퍼라제 유전자를 포함하는 AAV 벡터 또는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 루시퍼라제 유전자가 레닐라 루시퍼라제 또는 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 포함하는 방법.
  15. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 리포터 전이유전자가 β-갈락토시다제 유전자, β-글루코로니다제 유전자, 또는 클로람페니콜 트랜스퍼라제 유전자를 포함하는 AAV 벡터 또는 방법.
  16. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 리포터 전이유전자가 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP) 또는 알칼리성 포스파타제를 엔코딩하는 AAV 벡터 또는 방법.
  17. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 재조합 벡터가 AAV 벡터를 포함하는 AAV 벡터 또는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, AAV 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74, 또는 Rh10 벡터, 또는 임의의 상기 AAV 벡터의 하이브리드 또는 키메라를 포함하는 AAV 벡터 또는 방법.
  19. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 발현 조절 요소가 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터 및/또는 인핸서 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터 또는 방법.
  20. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 발현 조절 요소가 사이토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 프로모터/인핸서, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터/인핸서, SV40 프로모터, 디하이드로엽산환원효소 (DHFR) 프로모터, 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, 또는 신장 인자-1 알파 (EF1-알파) 프로모터를 포함하는 AAV 벡터 또는 방법.
  21. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 리포터 전이유전자가 단일 가닥 게놈인 AAV 벡터 또는 방법.
  22. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 리포터 전이유전자가 자기-상보성 게놈인 AAV 벡터 또는 방법.
  23. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 측면인접 요소(들)가 하나 이상의 AAV 역방향 말단 반복부 서열 (ITR)을 포함하는 AVV 벡터 또는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 리포터 전이유전자가 하나 이상의 5' 및/또는 3' AAV ITR 사이에 위치하는 방법.
  25. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 자기-상보성 리포터 전이유전자 게놈이 이중 가닥 역방향 반복부 서열 구조를 포함하는 AVV 벡터 또는 방법.
  26. 제 1항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 측면인접 요소(들)가 AAV Rep 단백질에 의해 처리되지 않은 돌연변이된 또는 변종의 AAV ITR을 포함하는 AVV 벡터 또는 방법.
  27. 제 1항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 측면인접 요소(들)가 감염성 재조합 AAV 입자에서 자기-상보성 리포터 전이유전자 게놈의 이중 가닥 역방향 반복부 서열 구조로의 형성을 허용하거나 촉진하는 돌연변이된 또는 변종의 AAV ITR을 포함하는 AVV 벡터 또는 방법.
  28. 제 27항 또는 제 28항에 있어서, 돌연변이된, 변형된 또는 변종의 AAV ITR이 결실된 D 서열, 및/또는 돌연변이된, 변형된 또는 변종의 말단 결정 부위 (TRS) 서열을 갖는 AAV 벡터 또는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 돌연변이된, 변형된 또는 변종의 말단 결정 부위 (TRS) 서열이 CGGTTG를 포함하는 AAV 벡터 또는 방법.
  30. 제 27항 또는 제 28항에 있어서, 돌연변이된 또는 변종의 AAV ITR이 리포터 전이유전자의 자기-상보성 서열 사이에 위치하는 AAV 벡터 또는 방법.
  31. 제 27항 또는 제 28항에 있어서, 돌연변이된 또는 변종의 AAV ITR이 결실된 AAV2 게놈 서열의 뉴클레오티드 122-144에 상응하는 뉴클레오티드를 갖는 AAV2 ITR을 포함하는 AAV 벡터 또는 방법.
  32. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 재조합 벡터가 AAV의 제 1 역방향 말단 반복부(ITR); 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터; 리포터 전이유전자; 폴리아데닐화 시그널; 및 선택적으로 AAV의 제 2 ITR을 포함하는 AAV 벡터 또는 방법.
  33. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 재조합 벡터가 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터의 다운스트림에 리포터 전이유전자의 삽입을 허용하는 제한 부위, 및 제한 부위의 다운스트림에서 전사후 조절 요소를 포함하며; 프로모터, 제한 부위 및 전사후 조절 요소는 5' AAV ITR의 다운스트림 및 선택적인 3' AAV ITR의 업스트림에 위치하는 AAV 벡터 또는 방법.
  34. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 감염성 재조합 AAV 입자가 영장류를 감염시키는 AAV 혈청형을 포함하는 AAV 벡터 또는 방법.
  35. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 감염성 재조합 AAV 입자가 인간 또는 레서스 원숭이를 감염시키는 AAV 혈청형을 포함하는 AAV 벡터 또는 방법.
  36. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 감염성 재조합 AAV 입자가 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74, 또는 Rh10, 또는 임의의 상기 AAV 혈청형의 하이브리드 또는 키메라의 VP1, VP2 또는 VP3 서열과 90% 또는 그 초과로 동일한 VP1, VP2 또는 VP3 서열을 포함하는 AAV 벡터 또는 방법.
  37. 제 1항 또는 제 2항의 AAV 벡터 또는 제 2항의 방법에 있어서, 감염성 재조합 AAV 입자가 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74, 또는 Rh10, 또는 임의의 상기 AAV 혈청형의 하이브리드 또는 키메라를 포함하는 AAV 벡터 또는 방법.
  38. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 생물학적 샘플이 영장류 샘플을 포함하는 방법.
  39. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈청을 포함하는 방법.
  40. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈장을 포함하는 방법.
  41. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 생물학적 샘플이 인간 혈청 또는 인간 혈장을 포함하는 방법.
  42. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
  43. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  44. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 대상체가 단백질의 불충분한 발현 또는 활성으로 인한 질병으로부터 고통받는 대상체인 방법.
  45. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 대상체가 이상, 비정상적 또는 바람직하지 않은 단백질의 발현 또는 활성으로 인한 질병으로부터 고통받는 대상체인 방법.
  46. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 대상체가 유전 질환으로부터 고통받은 대상체인 방법.
  47. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 대상체가 유전자 대체 또는 보충 요법에 대한 후보자인 방법.
  48. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 대상체가 유전자 넉다운 또는 넉아웃 요법에 대한 후보자인 방법.
  49. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 대상체가 폐 질환 (예를 들어, 낭성 섬유증), 출혈성 질환 (예를 들어, 억제제 함유 또는 비함유 혈우병 A 또는 혈우병 B), 지중해빈혈, 혈액 질환 (예를 들어, 빈혈), 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 증근위축측삭경화증 (ALS), 간질, 라이소좀 축적병, 구리 또는 철 축적병 (예를 들어, 윌슨병 또는 멘케스병) 라이소좀 산 리파제 결핍증, 신경성 또는 신경퇴행성 질환, 암, 타입 1 또는 타입 2 당뇨병, 고셰병, 헐러병, 아데노신 데아미나제 결핍증, 대사 결함 (예를 들어, 글리코겐 축적병), 망막 변성증 (예컨대, RPE65 결핍증, 범맥락막위축, 및 기타 안구 질환), 고형 기관 질환 (예를 들어, 뇌, 간, 신장, 심장), 또는 감염성 바이러스 (예를 들어, B형 및 C형 간염, HIV, 등), 박테리아 또는 진균류 질환으로부터 고통받는 대상체인 방법.
  50. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, (-) 대조군과 비교한 (f)의 리포터 전이유전자 발현을 기반으로 하여 생물학적 샘플에서 AAV에 결합하는 항체의 양을 계산하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  51. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 생물학적 샘플에서 AAV에 결합하는 항체의 양을 상기 대상체와 관련된 리포터에 입력하거나 포함시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  52. 제 2항 또는 제 2항에 있어서, 생물학적 샘플에서 AAV에 결합하는 항체의 양을 데이터베이스에 입력하여 상기 대상체와 관계된 데이터베이스 엔트리를 생성시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  53. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 분석되거나 검출된 항체가 AAV 캡시드 단백질에 결합하는 방법.
  54. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 분석되거나 검출된 항체가 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74, 또는 Rh10, 또는 임의의 상기 AAV 혈청형의 하이브리드 또는 키메라에 결합하는 방법.
  55. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 소정량의 항체가 AAV 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh74, 또는 Rh10, 또는 임의의 상기 AAV 혈청형의 하이브리드 또는 키메라에 결합하는 방법.
  56. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 생물학적 샘플이 (a)의 감염성 재조합 AAV 입자와 접촉되거나 인큐베이션되기 전에 희석되는 방법.
  57. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 생물학적 샘플의 복수의 희석물이 분석되는 방법.
  58. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 복수의 다양한 희석비의 생물학적 샘플이 분석되는 방법.
  59. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 생물학적 샘플이 (a)의 감염성 재조합 AAV 입자와 접촉되거나 인큐베이션되기 전에 1:1 내지 1:500으로 희석되는 방법.
  60. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 생물학적 샘플이 (a)의 감염성 재조합 AAV 입자와 접촉되거나 인큐베이션되기 전에 1:500 내지 1:5000으로 희석되는 방법.
  61. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개의 상이한 희석비의 생물학적 샘플이 분석되는 방법.
  62. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 세포가 6-48 시간의 기간 동안 생성 혼합물 (d)와 접촉되는 방법.
  63. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 세포가 12-36 시간의 기간 동안 생성 혼합물 (d)와 접촉되는 방법.
  64. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 세포가 20-30 시간의 기간 동안 생성 혼합물 (d)와 접촉되는 방법.
  65. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 세포가 약 24 시간의 기간 동안 생성 혼합물 (d)와 접촉되는 방법.
  66. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 세포가 리포터 전이유전자의 발현을 측정하기 전에 용해되는 방법.
  67. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 생물학적 샘플이 열 불활성화된 샘플인 방법.
  68. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 생물학적 샘플이 약 15분 내지 1시간 이하의 기간 동안 섭씨 약 50-70 도에서 열 불활성화된 샘플인 방법.
  69. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 생물학적 샘플이 약 30분의 기간 동안 섭씨 약 56 도에서 열 불활성화된 샘플인 방법.
  70. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 방법이 시험관내에서 수행되는 방법.

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