KR20150131258A - 세포 배양 배지 및 항체 생산 방법 - Google Patents

세포 배양 배지 및 항체 생산 방법 Download PDF

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KR20150131258A
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Abstract

세포 배양 배지, 및 세포로부터 세포 배양 및 항체 생산을 위하여 상기 배지를 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 본원의 방법에 의해 생산된 항체 및 그의 단편을 포함하는 조성물이 또한 제공된다.

Description

세포 배양 배지 및 항체 생산 방법 {CELL CULTURE MEDIA AND METHODS OF ANTIBODY PRODUCTION}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2013년 3월 15일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/801,247을 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본원은 베바시주맙(bevacizumab) 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는데 사용하기 위한 세포 배양 배지, 및 이러한 배지를 베바시주맙 생산에 사용하는 방법 뿐만 아니라 본원에 제공된 방법에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편을 포함하는 조성물 및 키트에 관한 것이다.
세포 배양 제조 기술이 제약 제제에 사용하기 위한 단백질-기반 치료제, 예컨대 항체의 생산에 광범위하게 사용된다. 단백질-기반 산물, 예컨대 항체 산물을 상업적으로 생산하기 위해서는, 세포가 제조 요구 사항에 충족하는 단백질 산물을 충분히 생산하도록 세포 배양 파라미터를 최적화해야 한다. 그러나, 세포 배양 파라미터가 단백질 산물의 생산성을 개선시키기 위해 최적화되는 경우에는, 이러한 산물의 목적하는 품질 속성, 예컨대 글리코실화 프로파일, 응집체 수준, 전하 이질성, 및 아미노산 서열 완전성을 유지시키는 것이 또한 필요하다 [Li, et al., 2010, mAbs., 2(5):466-477].
"아바스틴(Avastin)®"으로서 공지되기도 한 베바시주맙은 시험관내 및 생체내 검정 시스템에서 혈관 내피 성장 인자와 결합하는 재조합 인간화 모노클로날 항체이고 (US 7227004; US 6884879; US 7060269; US 7169901; US 7297334), 암을 치료하는데 사용되며, 상기 항체는 새로운 혈관의 형성을 차단함으로써 종양 성장을 억제한다. 베바시주맙은 분자량이 대략 149,000 달톤이고, 글리코실화되며, 영양소 세포 배양 배지 중의 포유동물 세포 (차이니즈 햄스터 난소) 발현 시스템에서 생산된다.
베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 개선되고 비용 효율적인 방법이 바람직하다. 베바시주맙 또는 그의 단편의 허용되는 산물 품질 속성은 유지하면서도, 세포가 목적하는 양의 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산할 수 있게 해주는 성분을 포함하는 세포 배양 배지가 유익할 것이다. 대규모 양의 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는데 사용하기 위한 세포 배양 배지가 특히 유리할 것이다.
본원에 제공된 발명은 특히, 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하고, 임의로 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물을 포함하는 세포 배양 배지에서, 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 방법을 개시한다. 또한, 본원에 제공된 세포 배양 배지를 이용하여, 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)를 배양하는 방법이 제공된다. 추가로, 세포 배양물 중의 포유동물 세포로부터 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편의 양을 증강시키는 (예를 들어, 역가를 증강시키는) 세포 배양 배지 조성물 뿐만 아니라 본원에 기재된 방법에 의해 생산된, 베바시주맙 또는 그의 단편을 포함하는 조성물이 본원에 개시된다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 세포 배양 배지에서 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포 배양 배지는 구리, 인슐린 및 시스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함하고, 상기 세포는 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 것인, 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리 및 인슐린을 포함한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리 및 시스틴을 포함한다. 또한 또 다른 추가 실시양태에서, 세포 배양 배지는 인슐린 및 시스틴을 포함한다. 또한 또 다른 추가 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리, 인슐린 및 시스틴을 포함한다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 식물-유래 가수분해물, 동물-유래 가수분해물, 또는 식물-유래 가수분해물과 동물-유래 가수분해물 둘 다를 추가로 포함할 수 있다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 표 1에 열거된 농도들로부터 선택된 농도 하의 구리를 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 표 1에 열거된 농도들로부터 선택된 농도 하의 인슐린을 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 표 1에 열거된 농도들로부터 선택된 농도 하의 시스틴을 포함한다. 구리, 인슐린 및/또는 시스틴의 양, 예를 들어 표 1에 제공된 양의 어떠한 조합도, 마치 각각의 및 모든 조합 양이 구체적이고도 개별적으로 열거된 것처럼 동일하게 의도된다고 이해된다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 인슐린을 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L의 농도로 포함할 수 있다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 구리를 약 69.0 nM 내지 약 400.0 nM의 농도로 포함할 수 있다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 시스틴을 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM의 농도로 포함할 수 있다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 동물-유래 가수분해물을 약 5.6 g/L 내지 약 38.0 g/L의 농도로 포함할 수 있다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 식물-유래 가수분해물을 약 1.4 g/L 내지 약 6.2 g/L의 농도로 포함할 수 있다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 기초 세포 배양 배지이다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 공급 세포 배양 배지이다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 하나를 포함하는 기초 세포 배양 배지이며, 이러한 기초 세포 배양 배지는 인슐린, 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물 중 어느 하나 이상을 포함하는 공급 세포 배양 배지로 보충된다 (예를 들어, 세포 배양 주기의 개시 후 일정 기간, 예컨대 세포 배양 주기 중 1회 이상, 2회, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 6회 이상, 7회 이상 등 중 어느 하나의 기간에서 이루어진다). 또 다른 변형법에서, 공급 세포 배양 배지는 인슐린, 동물-유래 가수분해물, 식물-유래 가수분해물, 시스테인 및 시스틴 중 어느 하나 이상을 포함한다. 또 다른 변형법에서, 공급 세포 배양 배지는 인슐린, 동물-유래 가수분해물, 식물-유래 가수분해물 및 시스테인을 포함한다. 또 다른 변형법에서, 공급 세포 배양 배지는 인슐린, 동물-유래 가수분해물, 식물-유래 가수분해물 및 시스틴 중 어느 하나 이상을 포함한다. 공급 세포 배양 배지는 인슐린, 동물-유래 가수분해물, 식물-유래 가수분해물, 시스테인 및 시스틴 중 어느 하나 이상을 본원에 제공된 어느 양으로 포함할 수 있다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 인슐린을 포함하고, 상기 방법은 추가량의 인슐린을 (예를 들어, 예컨대 세포 배양 주기의 개시 후 일정 기간에 기초 세포 배양 배지에 도입된 공급 배지를 통하여) 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 배지 중의 인슐린을, 표 1에 열거된 농도들로부터 선택된 농도로 제공하는 양으로 첨가된다. 추가 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 1회 이상 세포 배양 배지에 첨가된다. 또 다른 추가 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 3회 이상 세포 배양 배지에 첨가된다. 또한 또 다른 추가 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 6회 이상 세포 배양 배지에 첨가된다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 5.6 mg/L 내지 약 66.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 첨가된다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 상기 방법은 추가량의 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물을 (예를 들어, 예컨대 세포 배양 주기의 개시 후 일정 기간에 기초 세포 배양 배지에 도입된 공급 배지를 통하여), 본원에 제공된 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양물에 첨가된 추가량의 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물은 세포 배양 배지 중의 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물을 표 1에 열거된 농도들로부터 선택된 농도로 제공하는 양으로 첨가된다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 상기 세포 (예를 들어, 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산할 수 있는 CHO 세포)는 약 28℃ 내지 약 37℃ 또는 약 31℃ 내지 약 37℃의 범위의 온도에서 배양할 수 있다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 베바시주맙 또는 그의 단편은 세포 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 상기 방법은 세포 배양물로부터 베바시주맙 또는 그의 단편을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특별한 변형법에서, 이와 같이 회수된 베바시주맙을 정제한다.
또한, 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물을 포함하고, 임의로 구리, 인슐린 및/또는 시스틴을 추가로 포함하는 세포 배양 배지에서, 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 이러한 한 측면에서, 동물-유래 가수분해물은 식물-유래 가수분해물 보다 더 많은 양으로 존재한다. 이러한 한 변형법에서, 동물-유래 가수분해물은 약 5.6 g/L 내지 약 38.0 g/L 또는 약 7.0 g/L 내지 약 35.0 g/L 또는 약 7.0 g/L 내지 약 25.0 g/L 또는 약 7.0 g/L 내지 약 15.0 g/L 또는 약 8.0 g/L 내지 약 12.0 g/L 또는 약 7.0 g/L 내지 약 11.0 g/L, 또는 약 5 g/L, 10 g/L, 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L, 35 g/L, 40 g/L, 45 g/L 또는 50 g/L 중 어느 하나, 또는 약 5 g/L, 6 g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 10 g/L, 11 g/L 또는 12 g/L 중 어느 하나, 또는 약 10 g/L의 농도로 세포 배양 배지 내에 존재한다. 또 다른 변형법에서, 식물-유래 가수분해물은 약 1.4 g/L 내지 약 6.2 g/L 또는 약 1.5 g/L 내지 약 5.5 g/L 또는 약 1.5 g/L 내지 약 4.5 g/L 또는 약 1.5 g/L 내지 약 3.5 g/L 또는 약 1.5 g/L 내지 약 2.5 g/L 또는 약 1.75 g/L 내지 약 2.75 g/L 또는 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L 또는 약 2.25 g/L 내지 약 2.75 g/L, 또는 약 1.75 g/L, 2.0 g/L, 2.25 g/L, 2.5 g/L, 3.0 g/L, 3.25, 3.5 g/L, 3.75 g/L 또는 4.0 g/L 중 어느 하나, 또는 약 2.0 g/L, 2.25 g/L, 2.5 g/L 또는 3.0 g/L 중 어느 하나, 또는 약 2.5 g/L의 농도로 세포 배양 배지 내에 존재한다. 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물의 각각의 및 모든 조합 양은, 마치 각각의 및 모든 조합이 구체적이고도 개별적으로 열거된 것처럼 동일하게 기재되는 것으로 이해된다.
일부 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법 중 어느 것에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편을 제공한다.
기타 측면에서, 본 발명은 (i) 본원에 기재된 방법 중 어느 것에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 또한, 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를, 구리, 인슐린 및 시스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 포유동물 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 추가 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리 및 인슐린을 포함한다. 또 다른 추가 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리 및 시스틴을 포함한다. 또한 또 다른 추가 실시양태에서, 세포 배양 배지는 인슐린 및 시스틴을 포함한다. 또한 또 다른 추가 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리, 인슐린 및 시스틴을 포함한다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 식물-유래 가수분해물, 동물-유래 가수분해물, 또는 식물-유래 가수분해물과 동물-유래 가수분해물 둘 다를 추가로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 인슐린을 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L의 농도로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 구리를 약 69.0 nM 내지 약 400.0 nM의 농도로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 시스틴을 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM의 농도로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 동물-유래 가수분해물을 약 5.6 g/L 내지 약 38.0 g/L의 농도로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 식물-유래 가수분해물을 약 1.4 g/L 내지 약 6.2 g/L의 농도로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 기초 세포 배양 배지이다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 공급 세포 배양 배지이다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 하나를 포함하는 기초 세포 배양 배지이며, 이러한 기초 세포 배양 배지는 인슐린, 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물 중 어느 하나 이상을 포함하는 공급 세포 배양 배지로 보충된다 (예를 들어, 세포 배양 주기의 개시 후 일정 기간, 예컨대 세포 배양 주기 중 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 6회 이상, 7회 이상 등 중 어느 하나의 기간에서 이루어진다). 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 인슐린을 포함하고, 상기 방법은 추가량의 인슐린을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 1회 이상 세포 배양 배지에 첨가된다. 또 다른 추가 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 3회 이상 세포 배양 배지에 첨가된다. 또한 또 다른 추가 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 6회 이상 세포 배양 배지에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 5.6 mg/L 내지 약 66.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 첨가된다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 상기 방법은 추가량의 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물을 (예를 들어, 예컨대 세포 배양 주기의 개시 후 일정 기간에 기초 세포 배양 배지에 도입된 공급 배지를 통하여), 본원에 제공된 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양물에 첨가된 추가량의 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물은 세포 배양 배지 중의 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물을, 표 1에 열거된 농도들로부터 선택된 농도로 제공하는 양으로 첨가된다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 상기 세포는 약 28℃ 내지 약 37℃ 또는 약 31℃ 내지 약 37℃의 범위의 온도에서 배양한다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 베바시주맙 또는 그의 단편은 세포 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 본원의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 세포의 성장기 동안에 세포 배양 배지와 접촉시킨다. 본원의 일부 실시양태에서, 상기 포유동물 세포는 세포의 생산기 동안에 세포 배양 배지와 접촉시킨다.
다른 측면에서, 본 발명은 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는데 사용하기 위한 세포 배양 배지를 보충시키기 위한 키트를 제공하며, 이러한 키트는 다음 성분 (i) 내지 (iii) 중 적어도 2가지를 포함한다: (i) 세포 배양 배지 중에 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L 인슐린을 제공하는 양의 인슐린; (ii) 세포 배양 배지 중에 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM 시스틴을 제공하는 양의 시스틴; 및 (iii) 세포 배양 배지 중에 약 25.0 nM 내지 약 400.0 nM 구리를 제공하는 양의 구리. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 식물-유래 가수분해물을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 상기 키트는 식물-유래 가수분해물을, 세포 배양 배지 중에 약 1.4 g/L 내지 약 6.2 g/L 식물-유래 가수분해물을 제공하는 양으로 포함한다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 상기 키트는 동물-유래 가수분해물을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 동물-유래 가수분해물을, 세포 배양 배지 중에 약 5.6 g/L 내지 약 38.0 g/L 동물-유래 가수분해물을 제공하는 양으로 포함한다. 키트는 추가로, 사용 지침서, 예컨대 세포 배양 배지를 보충시키는데 사용하기 위한 지침서를 함유할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는데 사용하기 위한 세포 배양 배지를 제공하며, 이러한 세포 배양 배지는 다음 성분 (i) 내지 (iii) 중 적어도 2가지를 포함한다: (i) 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L 인슐린; (ii) 약 25.0 nM 내지 약 400.0 nM 구리; 및 (iii) 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM 시스틴. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L 인슐린; 및 약 25.0 nM 내지 약 400.0 nM 구리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L 인슐린; 및 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM 시스틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 25.0 nM 내지 약 400.0 nM 구리; 및 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM 시스틴을 포함한다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 약 1.4 g/L 내지 약 6.2 g/L 식물-유래 가수분해물을 추가로 포함할 수 있다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 약 5.6 g/L 내지 약 38.0 g/L 동물-유래 가수분해물을 추가로 포함할 수 있다.
또한 또 다른 측면에서, 본 발명은 또한, (a) 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포; 및 (b) 본원에 제공된 어느 세포 배양 배지를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 베바시주맙 또는 그의 단편; 및 (b) 본원에 제공된 어느 세포 배양 배지를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가 실시양태에서, 베바시주맙 또는 그의 단편은 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포에 의해 상기 배지 내로 분비된다.
일부 측면에서, 또한, 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를, 인슐린, 구리 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물 세포로부터 베바시주맙 또는 그의 단편의 역가를 증강시키는 방법이 본원에 제공되며, 역가는 상기 포유동물 세포를, 인슐린, 구리 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하지 않은 세포 배양 배지에서 배양하는 것과 비교해서 증강된다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리 및 인슐린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리 및 시스틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 인슐린 및 시스틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리, 인슐린 및 시스틴을 포함한다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 식물-유래 가수분해물, 동물-유래 가수분해물, 또는 식물-유래 가수분해물과 동물-유래 가수분해물 둘 다를 추가로 포함할 수 있다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 인슐린을 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L의 농도로 포함할 수 있다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 구리를 약 69.0 nM 내지 약 400.0 nM의 농도로 포함할 수 있다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 시스틴을 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM의 농도로 포함할 수 있다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 동물-유래 가수분해물을 약 5.6 g/L 내지 약 38.0 g/L의 농도로 포함할 수 있다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 식물-유래 가수분해물을 약 1.4 g/L 내지 약 6.2 g/L의 농도로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 기초 세포 배양 배지이다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 공급 세포 배양 배지이다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 하나를 포함하는 기초 세포 배양 배지이며, 이러한 기초 세포 배양 배지는 인슐린, 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물 중 어느 하나 이상을 포함하는 공급 세포 배양 배지로 보충된다 (예를 들어, 세포 배양 주기의 개시 후 일정 기간, 예컨대 세포 배양 주기 중 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 6회 이상, 7회 이상 등 중 어느 하나의 기간에서 이루어진다). 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 인슐린을 포함하고, 상기 방법은 추가량의 인슐린을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 1회 이상 세포 배양 배지에 첨가된다. 또 다른 추가 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 3회 이상 세포 배양 배지에 첨가된다. 또한 또 다른 추가 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 6회 이상 세포 배양 배지에 첨가된다. 본원의 일부 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 5.6 mg/L 내지 약 66.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 첨가된다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 상기 방법은 추가량의 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물을 (예를 들어, 예컨대 세포 배양 주기의 개시 후 일정 기간에 기초 세포 배양 배지에 도입된 공급 배지를 통하여), 본원에 제공된 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양물에 첨가된 추가량의 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물은 세포 배양 배지 중의 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물을, 표 1에 열거된 농도들로부터 선택된 농도로 제공하는 양으로 첨가된다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 상기 세포는 약 28℃ 내지 약 37℃ 또는 약 31℃ 내지 약 37℃의 범위의 온도에서 배양할 수 있다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 베바시주맙 또는 그의 단편은 세포 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 상기 방법은 세포 배양물로부터 베바시주맙 또는 그의 단편을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가 측면에서, 이와 같이 회수된 베바시주맙 또는 그의 단편을 정제한다.
또 다른 측면에서, 본원의 발명은 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를, 인슐린, 구리 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양하는 방법을 제공하며, 베바시주맙 또는 그의 단편의 역가는 상기 포유동물 세포를, 인슐린, 구리 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 배양하는 것과 비교해서 증강된다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리 및 인슐린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리 및 시스틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 인슐린 및 시스틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리, 인슐린 및 시스틴을 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 식물-유래 가수분해물, 동물-유래 가수분해물, 또는 식물-유래 가수분해물과 동물-유래 가수분해물 둘 다를 추가로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 인슐린을 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L의 농도로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 구리를 약 69.0 nM 내지 약 400.0 nM의 농도로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 시스틴을 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM의 농도로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 동물-유래 가수분해물을 약 5.6 g/L 내지 약 38.0 g/L의 농도로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 식물-유래 가수분해물을 약 1.4 g/L 내지 약 6.2 g/L의 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 기초 세포 배양 배지이다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 공급 세포 배양 배지이다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 하나를 포함하는 기초 세포 배양 배지이며, 이러한 기초 세포 배양 배지는 인슐린, 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물 중 어느 하나 이상을 포함하는 공급 세포 배양 배지로 보충된다 (예를 들어, 세포 배양 주기의 개시 후 일정 기간, 예컨대 세포 배양 주기 중 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 6회 이상, 7회 이상 등 중 어느 하나의 기간에서 이루어진다). 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 인슐린을 포함할 수 있고, 상기 방법은 추가량의 인슐린을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 1회 이상 세포 배양 배지에 첨가된다. 또 다른 추가 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 3회 이상 세포 배양 배지에 첨가된다. 또한 또 다른 추가 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 6회 이상 세포 배양 배지에 첨가된다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 5.6 mg/L 내지 약 66.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 첨가된다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 상기 방법은 추가량의 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물을 (예를 들어, 예컨대 세포 배양 주기의 개시 후 일정 기간에 기초 세포 배양 배지에 도입된 공급 배지를 통하여), 본원에 제공된 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양물에 첨가된 추가량의 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물은 세포 배양 배지 중의 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물을, 표 1에 열거된 농도들로부터 선택된 농도로 제공하는 양으로 첨가된다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 상기 세포는 약 28℃ 내지 약 37℃ 또는 약 31℃ 내지 약 37℃의 범위, 예컨대 약 31℃, 33℃ 또는 35℃의 온도에서 배양한다. 상기 온도는 세포 배양 공정 내내, 예를 들어 약 28℃ 내지 약 37℃의 범위의 온도 내에서 다양할 수 있는 것으로 (상승 또는 강하) 이해된다. 한 측면에서, 상기 세포는 제1 기간 (예컨대, 약 1 내지 10일 또는 1 내지 8일 또는 1 내지 7일) 동안에 약 35℃의 제1 온도에서 배양하고, 제2 기간 (예컨대, 약 1 내지 5일 또는 1 내지 4일 또는 1 내지 3일 또는 1 내지 2일) 동안에 약 33℃의 제2 온도에서 배양하며, 제3 기간 (예컨대, 약 1 내지 5일 또는 1 내지 4일 또는 1 내지 3일 또는 1 내지 2일) 동안에 약 31℃의 제3 온도에서 배양한다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 베바시주맙 또는 그의 단편은 세포 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 세포 배양물로부터 베바시주맙 또는 그의 단편을 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 한 측면에서, 이와 같이 회수된 베바시주맙 또는 그의 단편을 정제한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 방법을 제공하며, 세포 배양 주기 내의 초기 세포 배양 배지는 약 69 nM 내지 약 1,000 nM의 농도의 구리, 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도의 인슐린, 및 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM의 농도의 시스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함하고, 상기 세포는 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산한다. 일부 실시양태에서, 상기 초기 세포 배양 배지는 (1) 구리 및 인슐린; (2) 구리 및 시스틴; (3) 인슐린 및 시스틴; 또는 (4) 구리, 인슐린 및 시스틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L의 농도의 인슐린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 약 10.0 mg/L 내지 약 20.0 mg/L의 농도의 인슐린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 약 10.0 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L 및 25 mg/L 중 어느 하나의 농도의 인슐린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 약 325 nM 내지 약 375 nM의 농도의 구리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 약 325 nM 내지 약 350 nM의 농도의 구리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 약 330 nM, 335 nM, 339 nM, 340 nM, 345 nM 및 350 nM 중 어느 하나의 농도의 구리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM의 농도의 시스틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 약 1.0 mM 내지 약 1.6 mM의 농도의 시스틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 약 1.0 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 mM, 1.5 mM 및 1.6 mM 중 어느 하나의 농도의 시스틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 약 6.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 농도의 동물-유래 가수분해물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 약 8.0 g/L 내지 약 12.0 g/L의 농도의 동물-유래 가수분해물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 약 9.0 g/L 내지 약 11.0 g/L의 농도의 동물-유래 가수분해물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 약 13 g/L의 농도의 동물-유래 가수분해물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 약 1.0 g/L 내지 약 10.0 g/L의 농도의 식물-유래 가수분해물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L의 농도의 식물-유래 가수분해물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 2.25 g/L 내지 약 2.75 g/L의 농도의 식물-유래 가수분해물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 약 2.5 g/L의 농도의 식물-유래 가수분해물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 동물-유래 가수분해물과 식물-유래 가수분해물 둘 다를 포함하며, 동물-유래 가수분해물이 식물-유래 가수분해물 보다 더 많은 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 인슐린을 포함하고, 상기 방법은 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 또는 6회 이상 세포 배양 배지에 첨가한다. 일부 실시양태에서, 매회 첨가된 인슐린은 약 5 mg/L 내지 약 25 mg/L이다. 일부 실시양태에서, 매회 첨가된 인슐린은 약 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L 및 25 mg/L 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 주기 동안 첨가된 인슐린의 누적량은 약 20 mg/L 내지 약 100 mg/L이다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 주기 동안 첨가된 인슐린의 누적량은 약 20 mg/L, 25 mg/L, 30 mg/L, 35 mg/L, 40 mg/L, 45 mg/L, 50 mg/L, 55 mg/L, 60 mg/L, 65 mg/L, 70 mg/L, 75 mg/L, 80 mg/L, 85 mg/L, 90 mg/L, 95 mg/L, 및 100 mg/L 중 어느 하나이다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 시스틴을 포함하고, 상기 방법은 추가량의 시스틴을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스틴은 세포 배양 배지 중에 약 0.1 mM 내지 약 1.5 mM 추가 시스틴을 제공하는 양으로 첨가된다. 일부 실시양태에서, 시스틴은 세포 배양 배지 중에 약 0.4 mM 내지 약 0.7 mM (예를 들어, 약 0.4 mM 내지 약 0.6 mM, 약 0.4 mM 내지 약 0.5 mM) 추가 시스틴을 제공하는 양으로 첨가된다. 일부 실시양태에서, 시스틴은 세포 배양 주기 동안 배치 공급으로 첨가된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 세포 배양 주기 동안 1개 이상의 배치 공급을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개의 배치 공급은 (예를 들어, 14-일 세포 배양 주기 중에) 제3일에 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 세포 배양 주기 동안 2개, 3개 또는 4개의 배치 공급을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (예를 들어, 14-일 세포 배양 주기 중에) 제3일에 제1 배치 공급을 포함하고 제6일에 제2 배치 공급을 포함한다. 일부 실시양태에서, 배치 공급 배지는 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 주기 동안, 상기 배지의 온도는 배양 시작 온도와 비교해서 약 2℃ 이상, 약 3℃ 이상, 약 4℃ 이상, 또는 약 5℃ 이상 감소된다. 일부 실시양태에서, 상기 배지의 온도는 세포 배양 주기 동안 1회 이상 또는 2회 이상 감소된다. 일부 실시양태에서, 상기 온도는 배양을 시작한 후 제8일 및 제10일에 감소된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 약 31℃ 내지 약 35℃의 범위의 온도에서 배양한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 제1 기간 동안에 약 35℃의 제1 온도에서 배양하고, 제2 기간 동안에 약 33℃의 제2 온도에서 배양하며, 제3 기간 동안에 약 31℃의 제3 온도에서 배양한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 약 7.0 내지 약 7.3의 pH를 갖는 배지에서 배양한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 약 10 mg/L 인슐린, 약 325 nM 내지 약 350 nM 구리, 및 약 1.3 mM 시스틴을 포함하는 초기 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계; (b) 제1 배치 공급과 인슐린 공급을 상기 세포 배양 배지에 제공하여, 배양을 시작한 후 제3일에 약 15 mg/L의 농도의 추가 인슐린을 제공하도록 하는 단계; 및 (c) 시스틴을 포함하는 제2 배치 공급을 상기 세포 배양 배지에 제공하여, 배양을 시작한 후 제6일에 약 0.4 mM 내지 약 0.7 mM의 농도의 추가 시스틴을 제공하도록 하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포는 약 35℃의 초기 온도에서 배양하고, 온도는 배양을 시작한 후 제8일에 약 33℃로 감소되고 제10일에 약 31℃로 추가로 감소된다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 주기는 14-일 세포 배양 주기이다. 일부 실시양태에서, 베바시주맙 또는 그의 단편은 세포 배양 배지 내로 분비된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 세포 배양물로부터 베바시주맙 또는 그의 단편을 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 것에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 상기 언급된 방법 중 어느 것에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본원에 기재된 각종 실시양태의 한 가지, 일부 또는 모든 특성을 조합하여 본 발명의 다른 실시양태를 형성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서는 통상의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있을 정도로 충분한 것으로 간주된다. 본원에 제시되고 기재된 것 이외의 본 발명의 각종 변형이 전술된 설명으로부터 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이는 첨부된 청구범위의 범위 내에 속한다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적상 그들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
도 1은 인슐린이 보충된 세포 배양 배지에서 배양된 베바시주맙 생산 CHO 세포로부터 항체 역가 수율 상의 증가를 보여주는 일련의 그래프이다. 도 1A 및 도 1B는 베바시주맙을 생산하는 CHO 세포의 14일 세포 배양 동안 평가된 6가지 상이한 세포 배양 프로토콜의 실험에서의 항체 역가를 도시한 것이다. 항체 생산은 역가 (mg/L)로서 표현된다. 도 1A는 제3일 하나의 배치 공급의 결과를 도시한 것이다. 도 1B는 제3일 하나의 배치 공급의 결과 및 제6일 제2 배치 공급의 결과를 도시한 것이다.
도 2는 세포 연령과의 관계로서 14일 세포 배양 주기 동안 1개 또는 2개의 배치 공급이 공급된 세포 배양물에 의한 항체 생산과 세포 바이오매스 축적에 대한 효과를 명확히 보여주는 일련의 그래프이다. 도 2A는 제3일 하나의 배치 공급이 공급되고 제6일 제2 배치 공급이 공급된 베바시주맙 생산 CHO 세포와 비교된 바와 같은, 제3일 하나의 배치 공급이 공급된 베바시주맙 생산 CHO 세포에서의 세포 바이오매스 축적을 도시한 것이다. 하나의 공급 공정에 대해서는 p < 0.004*이고; 2개의 공급 공정에 대해서는 p < 0.018*이다. 도 2B는 제3일 하나의 배치 공급이 공급되고 제6일 제2 배치 공급이 공급된 베바시주맙 생산 CHO 세포와 비교된 바와 같은, 제3일 하나의 배치 공급이 공급된 베바시주맙 생산 CHO 세포로부터의 항체 생산을 도시한 것이다. 하나의 공급 공정에 대해서는 p < 0.042*이고; 2개의 공급 공정에 대해서는 p < 0.82이다. *는 유의적 값을 표시한다. "1"은 제3일 하나의 배치 공급이 공급된 세포를 표시하고; "2"는 제3일 하나의 배치 공급이 공급되고 제6일 제2 배치 공급이 공급된 세포를 표시한다.
도 3은 신규 세포 배양 공정에서 성장된 베바시주맙 생산 CHO 세포로부터의 항체 수율 상의 증가를 명확히 보여주는 그래프이다. 프로토콜 1 (삼각형)은 프로토콜 2의 세포 배양 공정과 상이한 세포 배양 공정을 표시하고; 프로토콜 2 (다이아몬드)는 신규 세포 배양 공정을 표시한다.
베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 개선되고 비용 효율적인 방법이 제공된다. 베바시주맙 또는 그의 단편의 허용되는 산물 품질 속성은 유지하면서도, 세포가 목적하는 양의 베바시주맙 또는 그의 단편을 지속적으로 생산할 수 있게 해주는 성분을 포함하는 세포 배양 배지가 기재되어 있다. 본원에 제공된 세포 배양 배지는 대규모 양의 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는데 사용할 수 있다.
(i) 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 방법; (ii) 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 방법; 및 (iii) 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포로부터 베바시주맙 또는 그의 단편의 생산을 증강시키는 (예를 들어, 베바시주맙 또는 그의 단편의 역가 수율을 증강시키는) 방법을 포함한, 본원에 제공된 방법은 한 측면에서, 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하는 세포 배양 배지 (예컨대, 구리 및 인슐린을 포함하는 세포 배양 배지, 또는 구리 및 시스틴을 포함하는 세포 배양 배지, 또는 인슐린 및 시스틴을 포함하는 세포 배양 배지, 또는 구리, 인슐린 및 시스틴을 포함하는 세포 배양 배지)를 활용한다. 본원에 상세된 방법 중 어느 것에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편, 및 베바시주맙 또는 그의 단편을 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 한 측면에서, 본원에 상세된 방법 중 어느 것에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편은 베바시주맙 또는 그의 단편의 허용되는 산물 품질 속성, 예컨대 N-글리코실화 프로파일, 전하 이질성, 및 서열 완전성을 나타낸다. 특별한 변형법에서, 베바시주맙 또는 그의 단편의 산물 품질 속성은, 이들이 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하는 세포 배양 배지를 이용하지 않는 방법에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편과 실질적으로 유사한 경우에 허용된다. 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하는 세포 배양 배지 (예를 들어, (i) 구리 및 인슐린; (ii) 구리 및 시스틴; (iii) 인슐린 및 시스틴; 또는 (iv) 구리, 인슐린 및 시스틴을 포함하는 세포 배양 배지)가 또한 제공된다. 하나의 변형법에서, 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하는 세포 배양 배지는 인슐린, 구리 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 포유동물 세포를 배양하는 것과 비교해서, 상기 배지에서 배양된 포유동물 세포에 의한 베바시주맙 또는 그의 단편의 생산을 증강시킨다 (예를 들어, 베바시주맙 또는 그의 단편의 역가 수율을 증강시킨다). 또한, 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하는 세포 배양 배지 및 (i) 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포 및/또는 (ii) 베바시주맙 또는 그의 단편을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 본원에 제공된 세포 배양 배지 중 어느 것을 포함하는 배양 용기가 제공된다. 한 측면에서, 이러한 배양 용기는 대규모 배양 용기, 예컨대 세포 배양물로부터 대규모 양의 베바시주맙을 생산하는데 요구되는 바와 같이, 본원에 제공된 세포 배양 배지를 2리터 이상, 10리터 이상, 100리터 이상, 500리터 이상, 1,000리터 이상, 2,500리터 이상, 5,000리터 이상, 7,500리터 이상, 10,000리터 이상, 12,000리터 이상 함유할 수 있는 배양 용기이다. 따라서, 본원에 제공된 방법은 베바시주맙 또는 그의 단편을 대규모 생산하는데 사용할 수 있다.
I. 정의
용어 "베바시주맙"은 "rhuMAb VEGF" 또는 "아바스틴®"으로서 공지되기도 한, 문헌 [Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라서 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체를 지칭한다. 이는 인간 VEGF가 그의 수용체와 결합하는 것을 차단시키는 뮤린 항-인간 VEGF 모노클로날 항체 A.4.6.1로부터의 항원 결합성 상보성 결정 영역과 돌연변이된 인간 IgG1 프레임워크 영역을 포함한다. 대부분의 프레임워크 영역을 포함한, 베바시주맙의 아미노산 서열의 대략 93%가 인간 IgG1로부터 유래되고, 이 서열의 약 7%는 뮤린 항체 A4.6.1로부터 유래된다. 베바시주맙은 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생산된 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프와 결합된다. 베바시주맙 및 기타 인간화 항-VEGF 항체는 미국 특허 번호 6,884,879에 추가로 기재되어 있다.
용어 "배지" 및 "세포 배양 배지"는 세포를 성장시키거나 또는 유지시키는데 사용된 영양소 공급원을 지칭한다. 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 이러한 영양소 공급원은 성장 및/또는 생존을 위해 세포에 의해 요구되는 성분을 함유할 수 있거나 또는 세포 성장 및/또는 생존에 도움을 주는 성분을 함유할 수 있다. 비타민, 필수 또는 비필수 아미노산 (예를 들어, 시스테인 및 시스틴), 및 미량 원소 (예를 들어, 구리)가 배지 성분의 예들이다. 본원에 제공된 어떠한 배지도 인슐린, 식물 가수분해물 및 동물 가수분해물 중 어느 하나 이상으로 보충시킬 수도 있다.
세포를 "배양하는" 것은 특정 세포를, 이러한 세포의 생존 및/또는 성장 및/또는 증식에 적합한 조건 하에 세포 배양 배지와 접촉시키는 것을 지칭한다.
"배치 배양"은 세포 배양을 위한 모든 성분 (세포 및 모든 배양 영양소 포함)을 배양 공정의 시작시 배양 용기에 공급하는 배양을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "유가식 세포 배양"은 세포와 배양 배지를 초기에 배양 용기에 공급하고; 배양을 종결하기 전에 주기적 세포 및/또는 산물 수거를 수반하거나 수반하지 않으면서, 배양 공정 동안 추가 배양 영양소를 연속적으로 또는 개별적 증분으로 상기 배양물에 공급하는 배치 배양을 지칭한다.
"관류 배양"은, 예를 들어 여과, 피막화, 마이크로캐리어에 대한 고정 등에 의해 세포를 배양물 내에 구속시키고, 배양 배지를 연속적 또는 간헐적으로 도입하고 배양 용기로부터 제거하는 배양이다.
"배양 용기"는 세포를 배양하는데 사용된 용기를 지칭한다. 배양 용기는 이것이 세포를 배양하는데 유용하는 한은 어떠한 크기일 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "역가"는 세포 배양에 의해 생산된 재조합적으로 발현된 항체의 총 양을, 소정 양의 배지 부피로 나눈 것을 지칭한다. 역가는 전형적으로, 배지 1밀리리터 당 항체 밀리그램의 단위로 표현된다. 역가는 상대적 측정치, 예컨대 상이한 배양 조건 하에 단백질 산물을 수득하는 것과 비교해서 역가 상의 증가 비율 (%) 면에서 표현되거나 평가될 수 있다.
"핵산"은 모든 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하고, 이는 DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 모든 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다.
"단리된 핵산"은 그의 통상적인 상황으로부터 분리되거나 또는 그 상황의 외부에 있는, 비-자연 발생, 재조합 또는 자연 발생 서열을 의미하고 이를 포괄한다. 단리된 핵산 분자는 이것이 자연에서 발견되는 형태 또는 환경 이외의 것이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 그것이 자연 세포에 존재하는 바와 같은 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는 통상적으로 단백질을 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하며, 여기서는 예를 들어, 핵산 분자가 자연 세포의 염색체성 위치와 상이한 염색체성 위치 내에 있다.
"단리된" 단백질 (예를 들어, 단리된 항체)는 그의 자연 환경의 구성분으로 확인되어 이러한 자연 환경으로부터 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 단백질에 대한 조사, 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 수도 있는 물질인데, 이는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 단리된 단백질은 재조합 세포 내에서의 계내 단백질을 포함하며, 이는 이러한 단백질의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 단백질은 한 가지 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"정제된" 단백질 (예를 들어, 항체)은 이것이 그의 자연 환경 내에 존재하고/하거나 실험실 조건 하에 초기에 생산되고/되거나 합성되고/되거나 증폭되는 경우 보다 더 순수한 형태로 존재하도록, 단백질의 순도를 증가시킨 것을 의미한다. 순도는 상대적 용어이고, 반드시 절대적 순도를 의미하지는 않는다.
"오염물"은 목적하는 단백질 산물과 상이한 (예를 들어, 항체 산물과 상이한) 물질을 지칭한다. 오염물은 숙주 세포 물질, 예컨대 CHOP; 핵산; 목적 단백질의 변이체, 단편, 응집체 또는 유도체; 또 다른 폴리펩티드; 내독소; 바이러스성 오염물; 세포 배양 배지 성분 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원의 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중-특이적 항체 (예를 들어, 이중-특이적 항체), 및 항체 단편 (이들은 목적하는 생물학적 활성을 나타내야 한다)을 포괄한다. 항체는 인간, 인간화 및/또는 친화성 성숙될 수 있다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "완전 항체"는 다음에 정의된 바와 같은 항체 단편이 아니라, 그의 실질적으로 온전한 형태의 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 상기 용어는 특히, Fc 영역을 함유하는 중쇄를 수반한 항체를 지칭한다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게 그의 항원 결합성 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중-특이적 항체를 포함한다.
항체를 파파인 분해시키면, "Fab" 단편으로 불리우는 2개의 동일한 항원 결합성 단편 (각각은 단일 항원 결합 부위를 갖는다)과 잔류성 "Fc" 단편 (이의 명칭은 용이하게 결정화될 수 있는 그의 능력을 반영한다)이 생산된다. 펩신 처리하면, 2개의 항원 결합 부위를 갖고 있고 항원과 여전히 가교 결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생산된다. Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상 시스테인을 포함한 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수 개의 잔기를 첨가한다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하고 있는, Fab'에 대한 본원의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래에는, 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 기타 화학적 커플링물이 또한 공지되어 있다.
"Fv"는 완전한 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 2-쇄 Fv 종은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 비공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다. 단일 쇄 Fv (scFv) 종에서는, 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인을 가요성 펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결시켜, 이러한 경쇄와 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서의 것과 유사한 "이량체성" 구조로 연합될 수 있도록 한다. 이러한 입체 배치에서는, 각 가변 도메인의 3개의 HVR이 상호 작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6개의 HVR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여해 준다. 그러나, 전체 결합 부위 보다는 낮은 친화도이긴 하지만, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 특정 항원에 대해 특이적인 3개의 HVR 만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 지니고 있다.
"단일 쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 해주는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 관한 고찰은, 예를 들어 문헌 [Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994]을 참조할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단, 예를 들어 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수도 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 별개의 항체의 혼합물이 아니라 항체의 형질을 표시한다. 특정 실시양태에서, 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로, 표적과 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 표적-결합성 폴리펩티드 서열은 복수 개의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합성 폴리펩티드 서열을 선별하는 것을 포함하는 공정에 의해 수득하였다. 예를 들어, 이러한 선별 공정은 복수 개의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 독특한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 선별된 표적 결합성 서열을 추가로 변경시켜, 예를 들어 표적에 대한 친화성을 개선시키고, 표적 결합성 서열을 인간화시키며, 세포 배양물 중에서의 그의 생산을 개선시키며, 생체 내에서의 그의 면역원성을 감소시키고, 다중-특이적 항체를 창출시킬 수 있으며, 상기와 같이 변경된 표적 결합성 서열을 포함하는 항체 또한 본 발명의 모노클로날 항체이기도 하다는 것을 이해해야 한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 모노클로날 항체 제제의 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 유도된다. 모노클로날 항체 제제는 그의 특이성 이외에도, 전형적으로 기타 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않았다는 점에서 유리하다.
수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 표시하고, 특별한 어느 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용하고자 하는 모노클로날 항체는, 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975)]; [Hongo et al., Hybridoma, 14(3):253-260 (1995)]; [Harlow et al., Antibodies : A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술론 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol . Biol ., 222:581-597 (1991)]; [Sidhu et al., J. Mol . Biol . 338(2):299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol . Methods 284(1-2): 119-132 (2004)] 참조)을 포함한 각종 기술, 및 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 유전자 또는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; 문헌 [Jakobovits et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA 90: 2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol . 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016; 문헌 [Marks et al., Bio / Technology 10: 779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol . 14: 845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol . 14: 826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern . Rev . Immunol . 13: 65-93 (1995)] 참조)에 의해 만들 수 있다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하고/하거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 기술 중 어느 것을 이용하여 만든 아미노산 서열을 보유하고 있는 항체이다. 이러한 인간 항체의 정의에는 구체적으로, 비-인간 항원 결합성 잔기를 포함하는 인간화 항체가 배제된다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함한, 당해 분야에 공지된 각종 기술을 사용하여 생산할 수 있다 [Hoogenboom and Winter, J. Mol . Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol, 222:581 (1991)]. 다음 문헌에 기재된 방법 또한, 인간 모노클로날 항체를 제조하기 위해 이용 가능하다 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991); van Dijk and van de Winkel, Curr . Opin . Pharmacol., 5: 368-74 (2001)]. 인간 항체는 항원 시험감염에 반응하여 항체를 생산하도록 변형시켰지만, 그의 내인성 유전자좌는 무력화시킨 트랜스제닉 동물, 예를 들어 면역시킨 제노마우스 (예를 들어, XENOMOUSE™ 기술에 관한 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 참조)에 항원을 투여함으로써 제조할 수 있다. 또한, 예를 들어 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통하여 생성된 인간 항체에 관해서는 문헌 [Li et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 103:3557-3562 (2006)]을 참조할 수 있다.
본원에 사용된 경우의 용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 서열 내에 초가변적이고/이거나 구조적으로 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR 영역을 포함하며, VH에 3개가 있고 (H1, H2, H3), VL에 3개가 있다 (L1, L2, L3). 천연 항체에서는, H3 및 L3이 6개의 HVR 중 가장 다양성을 나타내고, H3이 특히, 항체에 대한 훌륭한 특이성을 부여하는데 있어서 독특한 역할을 하는 것으로 여겨진다 (예를 들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000)]; [Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)] 참조). 실제로, 중쇄로만 이루어진 자연 발생 낙타류 항체는 경쇄의 부재 하에서 기능적이고 안정적이다 (예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]; [Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)] 참조).
서술된 수의 HVR이 사용되고 있고 본원에 포괄된다. 카바트(Kabat) 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성에 근거한 것이며, 가장 흔히 사용되고 있다 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]. 코티아(Chothia)는 대신 구조적 루프의 위치를 지칭한다 [Chothia and Lesk J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987)]. AbM HVR은 카바트 HVR과 코티아 구조적 루프 간의 절충을 나타내고, 이는 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되고 있다. "콘택트(Contact)" HVR은 이용 가능한 복합체 결정 구조의 분석에 근거한 것이다. 이들 HVR 각각으로부터의 잔기가 다음에 제시된다:
Figure pct00001
HVR은 다음과 같은 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL 내의 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH 내의 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 이들 정의 각각에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 참조]에 따라서 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 HVR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링", 및 그의 변수들은 문헌 [Kabat et al., 상기 참조]에서의 항체 편집에서 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 사용하여, 실제적인 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축, 또는 이러한 FR 또는 HVR 내로의 삽입에 상응하는 몇 개 적거나 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 다음에 단일 아미노산 삽입물 (카바트에 따르는 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 다음에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따르는 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 정렬함으로써 소정의 항체에 대해 결정할 수 있다.
카바트 넘버링 시스템은 일반적으로, 가변 도메인 내의 특정 잔기 (대략적으로, 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭하는 경우에 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"는 일반적으로, 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 내의 특정 잔기를 지칭하는 경우에 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., 상기 참조]에 보고된 EU 인덱스). "카바트에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.
용어 "제약 제제"는 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 해줄 수 있는 형태로 존재하고, 상기 제제가 투여되는 대상체에 대해 허용 가능하지 않은 수준으로 독성인 추가 성분을 전혀 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제제는 멸균성이다.
"제약상 허용되는" 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용된 투여량 및 농도에서 이에 노출된 세포 또는 포유동물에게 무독성인 것이다 [Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA]. 종종, 생리학상 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학상 허용되는 담체의 예는 완충제, 예컨대 인산염, 시트레이트, 및 기타 유기 산; 항산화제 (아스코르브산 포함); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당 알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 및 플루로닉스(Pluronics)™를 포함한다.
"멸균성" 제제는 무균성이거나, 또는 살아있는 모든 미생물 및 그의 포자가 없거나 본질적으로 없다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같은, 단수 형태는 문맥상 달리 명백히 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "화합물"에 대한 언급은 임의로, 둘 이상의 상기 화합물 등의 조합을 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 실시양태는 이러한 측면 및 실시양태를 "포함하고", "이루어지고" 및 "본질적으로 이루어지는" 것을 포함한다.
본원의 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그러한 값 또는 파라미터 자체에 대해 지시되는 실시양태를 포함한다 (그리고 설명한다). 예를 들어, "약 X"을 참조로 한 설명은 "X"의 설명을 포함한다. 수치 범위는 그러한 범위를 규정하는 수를 포함한다.
본 발명의 측면 또는 실시양태가 마쿠쉬(Markush) 군 또는 대체물의 다른 군의 관점에서 기재되는 경우, 본 발명은 전체로서 열거된 전체 군 (개별적으로 이러한 군의 각 구성원 및 주요 군의 가능한 모든 아군 제외) 뿐만 아니라 군 구성원 중 하나 이상이 부재하는 주요 군을 포괄한다. 본 발명은 또한, 청구된 발명 내의 군 구성원 중 어느 것의 하나 이상을 명시적으로 배제하는 것을 예상한다.
II. 세포 배양 배지
본원에 제공된 세포 배양 배지는 본원에 상세된 바와 같은 방법 (예를 들어, 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 방법; 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 방법; 및/또는 예를 들어, 베바시주맙을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포로부터, 베바시주맙의 역가 수율을 증강시킴으로써, 베바시주맙 또는 그의 단편의 생산을 증강시키는 방법) 및 조성물 (예를 들어, 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하는 세포 배양 배지 및 (i) 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포 및/또는 (ii) 베바시주맙 또는 그의 단편을 포함하는 조성물)에 사용할 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 세포 배양 배지는 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 세포를 배양하는데 사용될 수 있는 성분 (예를 들어, 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지)을 포함하며, 상기 세포는 배지 성분 (예를 들어, 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지)의 존재 하에 배양되는 경우에, 목적하는 양 [이는 상기 배지 성분을 함유하지 않는 세포 배양 배지 (예를 들어, 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지를 함유하지 않는 세포 배양 배지)에서 배양된 세포에 의해 생산된 베바시주맙의 양 보다 더 많은 양일 수 있다]의 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산한다. 한 측면에서, 본원에 제공된 세포 배양 배지는 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 세포를 배양하는데 사용되는데, 상기 세포는 배지 성분 (예를 들어, 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지)의 존재 하에 배양되는 경우에, 목적하는 양 및 허용되는 품질 속성, 예컨대 허용되는 분자량을 가진 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산한다. 본원에 사용된 바와 같은, 베바시주맙의 "허용되는 품질 속성"은 베바시주맙의 규제 당국의 승인 또는 마케팅에 요구되는 화학적 및/또는 물리적 속성을 지칭할 수 있고, 특정 세포에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편의 배치의 로트간 일관성을 평가하는데 사용된 화학적 및/또는 물리적 속성일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 세포 배양 배지 성분 (예를 들어, 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지)은 베바시주맙을 생산하고 이들 성분을 함유하지 않는 세포 배양 배지 (구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지를 함유하지 않는 세포 배양 배지)에서 배양되는 세포와 비교되는 바와 같이, 베바시주맙을 더 많이 생산하는데 기여하는 (예를 들어, 더 높은 역가의 베바시주맙을 생산하는) 개선되거나 허용되는 품질 속성을 항체 생산 세포에 제공할 수 있는 것으로서 확인되었다. 특정의 확인된 배지 성분 (예를 들어, 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지)을 사용하여, 한 측면에서는 세포가 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 경우에 수득된 역가 보다 더 많은 역가인 허용되는 역가를, 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산할 수 있는 능력을 지닌 항체-생산 세포 (예를 들어, CHO 세포)에 제공할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 배양된 세포로부터 생산된 항체 (예를 들어, CHO 세포로부터 생산된 베바시주맙)의 "허용되는 역가"는 비-제한적 예로서, 상기 항체의 대규모 생산을 충족시키는데 요구되는 항체의 양, 또는 상기 항체 산물의 로트간 배치에 있어서의 일관성을 평가하는데 요구되는 항체의 양을 지칭할 수 있다. 본원에 제공된 세포 배양 배지는 상이한 배지에서 배양된 세포로부터 생산된 베바시주맙의 양과 비교해서, 베바시주맙을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포로부터 생산되는 베바시주맙의 양을 개선시킬 수 있다.
베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는데 사용하기 위한 세포를 배양하는데 사용하기 위한 세포 배양 배지가 제공되며, 이러한 세포 배양 배지는 (a) 구리; (b) 인슐린; (c) 시스틴; (d) 동물-유래 가수분해물; 및 (e) 식물-유래 가수분해물 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 성분 (a), (b), (c), (d) 및 (e) 중 2가지 또는 3가지 또는 4가지 또는 5가지를 포함한다. 본원에 제공된 세포 배양 배지는, 마치 각각의 및 모든 조합이 구체적이고도 개별적으로 열거되는 것처럼 동일하게 성분 (a), (b), (c), (d) 및 (e)의 어떠한 조합도 함유할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 성분 (a), (b), (c), (d) 및 (e) 중 3가지를 포함하는 세포 배양 배지는, 이들 성분 중 3가지 이상이 존재하는 한은 이 성분들의 어떠한 조합도 포함할 수 있는 것으로 이해된다 (예를 들어, 성분 (a), (b) 및 (c)를 포함하거나 성분 (a), (d) 및 (e)를 포함하거나 또는 성분 (c), (d) 및 (e)를 포함하는 세포 배양 배지가 고려된다). 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 세포 배양 배지는 성분 (a), (b), (c), (d) 및 (e)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 세포 배양 배지는 (a) 및 (b)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 세포 배양 배지는 (a) 및 (c)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 세포 배양 배지는 (b) 및 (c)를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 세포 배양 배지는 구리, 인슐린 및 시스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 배지 성분을 표 1에 기재된 바와 같은 양으로 함유한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 동물-유래 가수분해물을 표 1에 기재된 바와 같은 양으로 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포 배양 배지는 식물-유래 가수분해물을 표 1에 기재된 바와 같은 양으로 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 동물-유래 가수분해물과 식물-유래 가수분해물 둘 다를 표 1에 기재된 바와 같은 양으로 추가로 포함한다.
또한, 본원에 제공된 세포 배양 배지는 표 1의 세포 배양 배지 성분 중 어느 하나 이상 (구리, 인슐린, 시스틴, 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물 중 어느 하나 이상)을, 마치 성분들 및 양 각각의 및 모든 조합이 구체적이고도 개별적으로 열거되는 것처럼 동일하게, 표 1에 열거된 양 중 어느 양으로 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 하나의 변형법에서, 본원에 제공된 세포 배양 배지는 구리, 인슐린, 시스틴, 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물 중 2가지 또는 3가지 또는 4가지 또는 각각을, 마치 성분들 및 양 각각의 및 모든 조합이 구체적이고도 개별적으로 열거되는 것처럼 동일하게, 표 1에 열거된 양 중 어느 양으로 포함한다. 한 측면에서, 세포 배양 배지는 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지를 표 1에 열거된 양 중 어느 양으로 포함하고, 추가 변형법에서는 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물을 표 1에 열거된 양 중 어느 양으로 추가로 포함한다.
<표 1>
배지 성분의 예시적인 양
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
하나의 변형법에서, 인슐린은 세포 배양 배지 중에 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L 또는 약 5.0 mg/L 내지 약 80.0 mg/L 또는 약 5.0 mg/L 내지 약 60.0 mg/L 또는 약 5.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L 또는 약 5.0 mg/L 내지 약 40.0 mg/L 또는 약 5.0 mg/L 내지 약 30.0 mg/L 또는 약 5.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L 또는 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L 또는 약 10.0 mg/L 내지 약 30.0 mg/L 또는 약 15.0 mg/L 내지 약 20.0 mg/L 또는 약 5.0 mg/L 내지 약 15.0 mg/L 또는 약 6.0 mg/L 내지 약 12.0 mg/L 또는 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L 또는 약 8.0 mg/L 내지 약 10.0 mg/L의 농도, 또는 약 5.0 mg/L, 6.0 mg/L, 7.0 mg/L, 8.0 mg/L, 9.0 mg/L, 10.0 mg/L, 11.0 mg/L, 12.0 mg/L, 13.0 mg/L, 14.0 mg/L, 15.0 mg/L, 16.0 mg/L, 17.0 mg/L, 18.0 mg/L, 19.0 mg/L, 20.0 mg/L, 21.0 mg/L, 22.0 mg/L, 23.0 mg/L, 24.0 mg/L, 25.0 mg/L, 26.0 mg/L, 27.0 mg/L, 28.0 mg/L, 29.0 mg/L 또는 30.0 mg/L 중 어느 하나의 농도, 또는 약 7 mg/L, 8.0 mg/L, 9.0 mg/L, 10.0 mg/L 또는 11.0 mg/L 중 어느 하나의 농도로 존재한다.
하나의 변형법에서, 구리는 세포 배양 배지 중에 약 69.0 nM 내지 약 400.0 nM 또는 약 80 nM 내지 약 400 nM 또는 약 100 nM 내지 약 400 nM 또는 약 125 nM 내지 약 400 nM 또는 약 150 nM 내지 약 400 nM 또는 약 200 nM 내지 약 400 nM 또는 약 250 nM 내지 약 400 nM 또는 약 300 nM 내지 약 400 nM 또는 약 325 nM 내지 약 375 nM 또는 약 325 nM 내지 약 350 nM의 농도, 또는 약 100 nM, 125 nM, 150 nM, 175 nM, 200 nM, 225 nM, 250 nM, 275 nM, 300 nM, 325 nM, 350 nM, 375 nM 또는 400 nM 중 어느 하나의 농도, 또는 약 330 nM, 335 nM, 340 nM, 345 nM 또는 350 nM 중 어느 하나의 농도, 또는 약 335 nM, 336 nM, 337 nM, 338 nM, 339 nM 또는 400 nM의 농도, 또는 약 339 nM의 농도로 존재한다.
하나의 변형법에서, 시스틴은 세포 배양 배지 중에 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM 또는 약 0.8 mM 내지 약 2.0 mM 또는 약 0.8 mM 내지 약 1.75 mM 또는 약 0.8 mM 내지 약 1.5 mM 또는 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM 또는 약 1.0 mM 내지 약 1.5 mM 또는 약 1.2 mM 내지 약 1.4 mM의 농도, 또는 약 0.8 mM 또는 0.9 mM 또는 1.0 mM 또는 1.1 mM 또는 1.2 mM 또는 1.3 mM 또는 1.4 mM 또는 1.5 mM 중 어느 하나의 농도, 또는 약 1.1 mM, 1.3 mM 또는 1.5 mM 중 어느 하나의 농도, 또는 약 1.3 mM의 농도로 존재한다.
하나의 변형법에서, 동물-유래 가수분해물은 세포 배양 배지 중에 약 5.6 g/L 내지 약 38.0 g/L 또는 약 7.0 g/L 내지 약 35.0 g/L 또는 약 7.0 g/L 내지 약 25.0 g/L 또는 약 7.0 g/L 내지 약 15.0 g/L 또는 약 8.0 g/L 내지 약 12.0 g/L 또는 약 7.0 g/L 내지 약 11.0 g/L의 농도, 또는 약 5 g/L, 10 g/L, 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L, 35 g/L, 40 g/L, 45 g/L 또는 50 g/L 중 어느 하나, 또는 약 5 g/L, 6 g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 10 g/L, 11 g/L 또는 12 g/L 중 어느 하나, 또는 약 10 g/L의 농도로 존재한다.
하나의 변형법에서, 식물-유래 가수분해물은 세포 배양 배지 중에 약 1.4 g/L 내지 약 6.2 g/L 또는 약 1.5 g/L 내지 약 5.5 g/L 또는 약 1.5 g/L 내지 약 4.5 g/L 또는 약 1.5 g/L 내지 약 3.5 g/L 또는 약 1.5 g/L 내지 약 2.5 g/L 또는 약 1.75 g/L 내지 약 2.75 g/L 또는 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L 또는 약 2.25 g/L 내지 약 2.75 g/L의 농도, 또는 약 1.75 g/L, 2.0 g/L, 2.25 g/L, 2.5 g/L, 3.0 g/L, 3.25, 3.5 g/L, 3.75 g/L, 또는 4.0 g/L 중 어느 하나 또는 약 2.0 g/L, 2.25 g/L, 2.5 g/L 또는 3.0 g/L 중 어느 하나, 또는 약 2.5 g/L의 농도로 존재한다.
추가 변형법에서, 시스테인이 세포 배양 배지 중에 존재한다. 시스테인은 한 측면에서, 기초 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다 (예를 들어, 이러한 기초 세포 배양 배지를, 시스테인을 포함하는 공급 배지로 보충시킴으로써 첨가된다). 하나의 변형법에서, 세포 배양 배지는 시스테인 (이는 시스테인을 포함하는 공급 배지를 통하여 시스테인을 포함하지 않는 기초 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다)을 약 0.5 mM 내지 약 5.0 mM 또는 약 1.0 mM 내지 약 12.0 mM 또는 약 2.0 mM 내지 약 10.0 mM 또는 약 2.0 mM 내지 약 8.0 mM 또는 약 1.0 mM 내지 약 10.0 mM 또는 약 1.0 mM 내지 약 8.0 mM 또는 약 2.0 mM 내지 약 12.0 mM 또는 약 3.0 mM 내지 약 12.0 mM 또는 약 4.0 mM 내지 약 12.0 mM 또는 약 5.0 mM 내지 약 12.0 mM 또는 약 6.0 mM 내지 약 12.0 mM 또는 약 6.0 mM 내지 약 10.0 mM 또는 약 6.0 mM 내지 약 8.0 mM의 농도, 또는 약 0.5 mM, 0.8 mM, 1.0 mM, 1.5 mM, 2.0 mM, 2.5 mM, 5.0 mM, 5.5 mM, 6.0 mM, 6.5 mM, 7.0 mM, 7.5 mM, 8.0 mM¸ 8.5 mM 또는 9.0 mM 중 어느 하나의 농도로 포함한다. 한 측면에서, 시스테인은, 이러한 시스테인이 세포 배양 배지 중에 약 7.5 mM의 농도로 존재하는 양으로 기초 세포 배양 배지에 첨가된다 (이러한 첨가는 세포 배양 주기의 어느 시점일 수 있고, 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 양일 수 있다).
추가 변형법에서, 시스틴이 세포 배양 배지 중에 존재한다. 시스틴은 한 측면에서, 기초 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다 (예를 들어, 이미 시스틴을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있는 기초 세포 배양 배지를, 시스틴을 포함하는 공급 배지로 보충시킴으로써 첨가된다). 하나의 변형법에서, 세포 배양 배지는 시스틴 (이는 시스틴을 포함하는 공급 배지를 통하여 기초 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다)을 약 0.5 mM 내지 약 5.0 mM의 농도로, 예컨대 세포 배양 배지 중에 약 0.8 mM 시스틴을 제공하는 양으로 포함한다.
특정 실시양태에서 세포 배양 배지는 시스틴을 포함하지만, 시스테인은 없다.
세포 배양 배지 (예를 들어, 기초 세포 배양 배지)는 추가 세포 배양 배지 성분으로 추가로 보충될 수 있다 (예를 들어, 예컨대 공급 세포 배양 배지를 통하여 이루어진다). 한 측면에서, 추가 세포 배양 배지 성분은 인슐린을 포함한다. 또 다른 측면에서, 추가 세포 배양 배지 성분은 인슐린 및 시스테인을 포함한다. 본원에 제공된 세포 배양 배지는 특정 세포를 배양하는데 적합한 인슐린 및/또는 시스테인의 어느 양으로 보충시킬 수 있다. 한 측면에서, 인슐린은 세포 배양물 중에 약 15 mg/L 또는 약 25 mg/L의 인슐린 농도를 제공하는 양으로 세포 배양 배지에 첨가된다 (예를 들어, 세포 배양 주기의 하나 이상의 시점에서 기초 세포 배양 배지에 첨가된다). 한 측면에서, 인슐린은 세포 배양물 중에 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 인슐린의 농도를 제공하는 양으로 세포 배양 배지에 첨가된다 (예를 들어, 세포 배양 주기의 하나 이상의 시점에서 기초 세포 배양 배지에 첨가된다): 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L; 약 10.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L; 약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L; 약 10.0 mg/L 내지 약 35.0 mg/L; 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L; 약 5.0 mg/L 내지 약 80.0 mg/L; 약 5.0 mg/L 내지 약 60.0 mg/L; 약 5.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L; 약 5.0 mg/L 내지 약 30.0 mg/L; 약 5.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L; 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L; 약 10.0 mg/L 내지 약 30.0 mg/L; 약 15.0 mg/L 내지 약 20.0 mg/L; 약 5.0 mg/L 내지 약 15.0 mg/L; 약 6.0 mg/L 내지 약 12.0 mg/L; 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L; 약 8.0 mg/L 내지 약 10.0 mg/L; 약 5.0 mg/L, 6.0 mg/L, 7.0 mg/L, 8.0 mg/L, 9.0 mg/L, 10.0 mg/L, 11.0 mg/L, 12.0 mg/L, 13.0 mg/L, 14.0 mg/L, 15.0 mg/L, 16.0 mg/L, 17.0 mg/L, 18.0 mg/L, 19.0 mg/L, 20.0 mg/L, 21.0 mg/L, 22.0 mg/L, 23.0 mg/L, 24.0 mg/L, 25.0 mg/L, 26.0 mg/L, 27.0 mg/L, 28.0 mg/L, 29.0 mg/L 또는 30.0 mg/L 중 어느 하나; 약 7 mg/L, 8.0 mg/L, 9.0 mg/L, 10.0 mg/L 및 11.0 mg/L 중 어느 하나. 또 다른 측면에서, 시스테인은 세포 배양물 중에 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 시스테인의 농도를 제공하는 양으로 세포 배양 배지에 첨가된다 (예를 들어, 세포 배양 주기의 하나 이상의 시점에서 기초 세포 배양 배지에 첨가된다): 약 1.0 mM 내지 약 12.0 mM 또는 약 2.0 mM 내지 약 10.0 mM 또는 약 2.0 mM 내지 약 8.0 mM 또는 약 1.0 mM 내지 약 10.0 mM 또는 약 1.0 mM 내지 약 8.0 mM 또는 약 2.0 mM 내지 약 12.0 mM 또는 약 3.0 mM 내지 약 12.0 mM 또는 약 4.0 mM 내지 약 12.0 mM 또는 약 5.0 mM 내지 약 12.0 mM 또는 약 6.0 mM 내지 약 12.0 mM 또는 약 6.0 mM 내지 약 10.0 mM 또는 약 6.0 mM 내지 약 8.0 mM, 또는 약 5.0 mM, 5.5 mM¸ 6.0 mM, 6.5 mM, 7.0 mM, 7.5 mM, 8.0 mM, 8.5 mM 또는 9.0 mM 중 어느 하나. 또 다른 측면에서, 시스틴은 세포 배양물 중에 약 0.1 mM 내지 약 1.5 mM의 시스틴의 농도, 예컨대 약 0.2 mM의 시스틴의 농도를 제공하는 양으로 세포 배양 배지에 첨가된다 (예를 들어, 세포 배양 주기의 하나 이상의 시점에서 기초 세포 배양 배지에 첨가된다).
일부 측면에서, 본원에 제공된 세포 배양 배지는 약 5.0 mg/L 내지 약 14.0 mg/L, 약 5.5 mg/L 내지 약 13.0 mg/L, 약 6.0 mg/L 내지 약 12.0 mg/L, 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L, 약 8.0 mg/L 내지 약 10.0 mg/L, 또는 약 8.5 mg/L 내지 약 14.0 mg/L 인슐린을 포함한다. 인슐린을 포함하는 세포 배양 배지는 구리 및 시스틴 중 어느 하나 이상을 본원에 제공된 양으로 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 약 6.0 mg/L 내지 약 12.0 mg/L 인슐린을 포함하는 세포 배양 배지는 약 70 nM 내지 약 400 nM의 구리 및/또는 약 0.5 mM 내지 약 2.5 mM 시스틴을 추가로 포함할 수 있고, 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물, 예를 들어 동물-유래 가수분해물 약 5.5 g/L 내지 약 40.0 g/L 및/또는 식물-유래 가수분해물 약 1.5 g/L 내지 약 6.5 g/L를 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
다른 측면에서, 본원에 제공된 세포 배양 배지는 약 65 nM 내지 약 400 nM, 약 70 nM 내지 약 375 nM, 약 75 nM 내지 약 350 nM, 약 80 nM 내지 약 325 nM, 약 85 nM 내지 약 300 nM, 또는 약 90 nM 내지 약 275 nM 구리를 포함한다. 구리를 포함하는 세포 배양 배지는 인슐린 및 시스틴 중 어느 하나 이상을 본원에 제공된 양으로 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 약 85 nM 내지 약 300 nM 구리를 포함하는 세포 배양 배지는 약 0.8 mM 내지 약 1.75 mM의 시스틴 및/또는 약 8.0 mg/L 내지 약 12.0 mg/L 인슐린을 추가로 포함할 수 있고, 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물, 예를 들어 동물-유래 가수분해물 약 5.5 g/L 내지 약 40.0 g/L 및/또는 식물-유래 가수분해물 약 1.5 g/L 내지 약 6.5 g/L를 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 세포 배양 배지는 약 0.8 mM 내지 약 1.75 mM, 약 0.9 mM 내지 약 1.50 mM, 약 1.0 mM 내지 약 1.40 mM, 또는 약 1.0 mM 내지 약 1.30 mM 시스틴을 포함한다. 시스틴을 포함하는 세포 배양 배지는 인슐린 및 구리 중 어느 하나 이상을 본원에 제공된 양으로 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 약 0.8 mM 내지 약 1.75 mM 시스틴을 포함하는 세포 배양 배지는 약 70 nM 내지 약 375 nM의 구리 및/또는 약 8.0 mg/L 내지 약 12.0 mg/L 인슐린을 추가로 포함할 수 있고, 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물, 예를 들어 동물-유래 가수분해물 약 5.5 g/L 내지 약 40.0 g/L 및/또는 식물-유래 가수분해물 약 1.5 g/L 내지 약 6.5 g/L을 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 동물-유래 가수분해물을 표 1에 기재된 바와 같은 양으로 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포 배양 배지는 식물-유래 가수분해물을 표 1에 기재된 바와 같은 양으로 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 동물-유래 가수분해물과 식물-유래 가수분해물 둘 다를 표 1에 기재된 바와 같은 양으로 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 세포 배양 배지는 약 1.5 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 5.5 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 4.5 g/L, 또는 약 3.5 g/L 내지 약 4.0 g/L 식물-유래 가수분해물을 포함한다. 식물-유래 가수분해물을 포함하는 세포 배양 배지는 시스틴, 인슐린 및 구리 중 어느 하나 이상을 본원에 제공된 어느 양으로 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 약 0.8 mM 내지 약 1.75 mM 시스틴을 포함하는 세포 배양 배지는 약 70 nM 내지 약 375 nM의 구리 및/또는 약 8.0 mg/L 내지 약 12.0 mg/L 인슐린을 추가로 포함할 수 있고, 동물-유래 가수분해물, 예를 들어 동물-유래 가수분해물 약 6.0 g/L 내지 약 20.0 g/L를 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 세포 배양 배지는 약 6.0 g/L 내지 약 35.0 g/L, 약 7.0 g/L 내지 약 30.0 g/L, 약 8.0 g/L 내지 약 25.0 g/L, 약 9.0 g/L 내지 약 20 g/L, 또는 약 10.0 g/L 내지 약 15.0 g/L 동물-유래 가수분해물을 포함한다. 동물-유래 가수분해물을 포함하는 세포 배양 배지는 시스틴, 인슐린 및 구리 중 어느 하나 이상을 본원에 제공된 어느 양으로 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 약 0.8 mM 내지 약 1.75 mM 시스틴을 포함하는 세포 배양 배지는 약 70 nM 내지 약 375 nM의 구리 및/또는 약 8.0 mg/L 내지 약 12.0 mg/L 인슐린을 추가로 포함할 수 있고, 식물-유래 가수분해물, 예를 들어 식물-유래 가수분해물 약 1.5 g/L 내지 약 3.0 g/L를 추가로 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 약 0.9 mM 내지 약 1.5 mM 시스틴을 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 약 1.4 mg/L 내지 약 11.0 mg/L 인슐린 또는 약 1.44 mg/L 내지 약 66.0 mg/L 인슐린을 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 약 26.0 nM 내지 약 400.0 nM 구리를 포함한다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 다음으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함한다: (a) 약 69.0 nM 내지 약 400.0 nM 구리, (b) 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L 인슐린 또는 약 1.44 mg/L 내지 약 66 mg/L 인슐린, 및 (c) 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM 시스틴.
본원에 기재된 세포 배양 배지 성분 (예를 들어, 구리, 인슐린, 시스틴, 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물 중 어느 하나 이상을 포함하는 세포 배양 배지)은 당해 분야에 공지되어 있는 형태, 예컨대 그의 염, 수화물 또는 조합물로 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 세포 배양 배지 성분은 또한, 용액으로서, 추출물로서 또는 고체 형태로 세포 배양 배지에 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 구리는 CuSO4로서 세포 배양 배지에 제공된다. 비-제한적 예로서, 시스틴은 이나트륨 염 일수화물 분말로서 세포 배양 배지에 제공될 수 있다. 펩톤으로서 공지되기도 한 단백질 가수분해물은 전형적으로, 각종 생물학상 기반 출발 물질, 예컨대 동물 조직, 우유-유래된 생성물, 미생물 또는 식물을 효소적으로 분해시킴으로써 제조된다. 본원에 제공된 세포 배양 배지에 사용된 가수분해물은 식물 또는 동물로부터 유래될 수 있다 (예를 들어, 식물-유래 가수분해물 및/또는 동물-유래 가수분해물). 본원에 기재된 바와 같은 식물 가수분해물은 밀 글루텐, 옥수수, 곡류, 콩 또는 목화씨로부터 유래될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 바와 같은 동물 가수분해물은 소, 치킨, 염소, 말, 인간, 양, 돼지 또는 토끼, 또는 다른 동물로부터 유래될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
구리, 인슐린 및 시스틴 중 어느 2가지 이상을, 세포 배양에 적합한 조성물에서 조합하는 것을 포함하는, 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는데 사용하기 위한 세포 배양 배지를 제조하는 방법이 또한 제공된다. 한 측면에서, 상기 방법은 구리, 인슐린 및 시스틴 중 어느 2가지 이상을, 세포 배양에 적합한 조성물에 첨가하는 것을 포함하며, 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지는 상기 조성물에 순차적으로 또는 동시에 첨가할 수 있다. 추가 변형법에서, 구리, 인슐린 및 시스틴 중 어느 2가지 이상을 제1 기간에 세포 배양에 적합한 조성물에서 조합하는 단계를 포함하고; 특정 양의 인슐린을 제2 기간에, 예컨대 세포 배양 주기 중 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 6회 이상, 7회 이상 등으로 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는데 사용하기 위한 세포 배양 배지를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포 성장 주기는 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 또는 세포가 여전히 생존율을 유지하면서 세포 배양물 중에 잔존할 수 있는 일수이다. 세포 배양 배지를 제조하는 방법의 하나의 변형법에서, 시스틴은 세포 배양 배지 중에 약 0.9 mM 내지 약 1.5 mM 시스틴을 제공하는 양으로 첨가된다. 세포 배양 배지를 제조하는 방법의 또 다른 변형법에서, 인슐린은 세포 배양 배지 중에 약 1.4 mg/L 내지 약 11.0 mg/L 인슐린 또는 약 1.44 mg/L 내지 약 66.0 mg/L 인슐린을 제공하는 양으로 첨가된다. 세포 배양 배지를 제조하는 방법의 또 다른 변형법에서, 구리는 세포 배양 배지 중에 약 26.0 nM 내지 약 400.0 nM 구리를 제공하는 양으로 첨가된다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 다음으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 조합함으로써 제조된다: (a) 세포 배양 배지 중에 약 69.0 nM 내지 약 400.0 nM 구리를 제공하는 양의 구리, (b) 세포 배양 배지 중에 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L 또는 약 1.44 mg/L 내지 약 66 mg/L 인슐린을 제공하는 양의 인슐린, 및 (c) 세포 배양 배지 중에 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM 시스틴을 제공하는 양의 시스틴.
본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 기초 세포 배양 배지이다. 본원의 다른 실시양태에서, 세포 배양 배지는 공급 세포 배양 배지이다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 하나를 포함하는 기초 세포 배양 배지이며, 이러한 기초 세포 배양 배지는 인슐린, 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물 중 어느 하나 이상을 포함하는 공급 세포 배양 배지로 보충시킨다 (예를 들어, 세포 배양 주기의 시작 후 일정 기간, 예컨대 세포 배양 주기 중 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 6회 이상, 7회 이상 등 중 어느 하나의 기간에서 이루어진다).
본원에 제공된 개개의 배지 성분은 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하고/하거나 세포 배양물로부터 베바시주맙을 생산하는데 유리한 한 가지 이상의 특성을 초래하는 양으로 존재할 수 있다. 유리한 특성은 증가된 세포 생존율, 세포로부터 생산된 베바시주맙의 양의 증가 (예를 들어, 증강된 베바시주맙 역가) 및/또는 세포 배양물 중에서의 베바시주맙의 산화 감소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 제공된 세포 배양 배지의 유리한 특성은 또한, 베바시주맙 또는 그의 단편의 N-글리코실화 프로파일, 전하 이질성 및/또는 아미노산 서열 완전성은 유지하면서도, 세포에 의해 생산된 베바시주맙의 양 (예를 들어, 항체 역가)을 유지 또는 증강시키는 것을 포함할 수 있다. 이들 유리한 특성은 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 방법, 및 베바시주맙 또는 그의 단편을 본원에 기재된 바와 같은 세포 배양물에서 생산하는 방법에 적용 가능하다.
본원에 제공된 세포 배양 배지는 한 측면에서, 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 방법에 사용되는 경우에 한 가지 이상의 바람직한 산물 품질 속성 또는 유리한 특성을 초래한다. 하나의 변형법에서, 본원에 제공된 세포 배양 배지를 사용하면, 상이한 세포 배양 배지에서 베바시주맙을 생산하는 세포를 배양함으로써 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편의 양과 비교해서, 상기 세포에 의해 생산된 베바시주맙의 양이 증가된다 (예를 들어, 항체 역가가 증강된다).
통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에 상세된 세포 배양 배지는 세포 배양에 유용한 기타 성분 (예를 들어, 구리, 인슐린 및 시스틴 중 하나 이상, 및 임의의 펩톤 가수분해물 이외의 성분)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 추가 성분, 예컨대 아미노산 (예를 들어, 글루타민, 아르기닌 또는 아스파라긴), 비타민 (B 비타민, 예컨대 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B7, 비타민 B9 또는 비타민 B12 중 어느 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다), 미량 원소, 전이 금속 [니켈, 철 (예를 들어, 제2철 또는 제1철) 또는 아연을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다], 및 기타 배지 성분을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 본원에 제공된 어떠한 배지도 또한, 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 이온 (예컨대, 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오시드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 미량 원소 및 글루코스 또는 등가 에너지 공급원으로 보충시킬수 있다. 본원에 열거된 바와 같은 추가 세포 배양 배지 성분은 통상의 기술자에게 공지될 것인 적당한 농도로 세포 배양 배지에 포함될 수 있다.
III. 본 발명의 방법 및 용도
베바시주맙 또는 그의 단편의 생산에 사용된 세포를 배양하는 방법, 및 구리, 인슐린 및 시스틴 중 하나 이상을 포함하는 세포 배양 배지의 용도가 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를, 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 포유동물 세포를 배양하는 방법이 제공되며, 상기 세포 배양 배지는 추가로, 식물-유래 가수분해물, 동물-유래 가수분해물, 또는 식물-유래 가수분해물과 동물-유래 가수분해물 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 인슐린을 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 구리를 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 시스틴을 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 구리 및 시스틴을 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 구리 및 인슐린을 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지는 인슐린 및 시스틴을 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양 배지 중의 성분들의 양 (예를 들어, 구리, 인슐린, 시스틴, 식물-유래 가수분해물 및/또는 동물-유래 가수분해물의 양)은 표 1에 제공된 값으로부터 선택된 양이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 추가량의 인슐린을 상기 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 1회 이상, 3회 이상, 6회 이상 또는 12회 이상 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양물에 첨가된 추가량의 인슐린은 세포 배양 배지 중에 표 1로부터 선택된 농도, 예컨대 약 1 mg/L 내지 약 44 mg/L의 농도의 인슐린을 제공하는 양으로 첨가된다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 동물-유래 가수분해물, 식물-유래 가수분해물, 또는 동물-유래 가수분해물과 식물-유래 가수분해물 둘 다를 추가로 포함한다.
일부 다른 측면에서, 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를, 구리, 인슐린 및 시스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 세포를 배양하는 방법이 제공된다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 인슐린을 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L의 농도로 포함한다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리를 약 69.0 nM 내지 약 400.0 nM의 농도로 포함한다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 시스틴을 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM의 농도로 포함한다. 본원의 일부 실시양태에서 세포 배양 배지는 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L의 농도의 인슐린, 및 약 69.0 nM 내지 약 400.0 nM의 농도의 구리를 포함한다. 본원의 일부 실시양태에서 세포 배양 배지는 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L의 농도의 인슐린 및 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM의 농도의 시스틴을 포함한다. 본원의 일부 실시양태에서 세포 배양 배지는 약 69.0 nM 내지 약 400.0 nM의 농도의 구리 및 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM의 농도의 시스틴을 포함한다. 본원의 일부 실시양태에서 세포 배양 배지는 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L의 농도의 인슐린, 약 69.0 nM 내지 약 400.0 nM의 농도의 구리, 및 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM의 농도의 시스틴을 포함한다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 표 1로부터 선택된 양의 시스틴, 인슐린 및/또는 구리를 포함할 수 있다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 상기 방법은 추가량의 인슐린을 (예를 들어, 예컨대 세포 배양 주기의 개시 후 일정 기간에 기초 세포 배양 배지에 도입된 공급 배지를 통하여) 본원에 제공된 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 6회 이상, 9회 이상, 12회 이상 또는 14회 이상 첨가될 수 있다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양물에 첨가된 추가량의 인슐린은 세포 배양 배지 중에 표 1로부터 선택된 농도, 예컨대 5.6 mg/L 내지 약 66 mg/L의 농도의 인슐린을 제공하는 양으로 첨가된다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 동물-유래 가수분해물, 식물-유래 가수분해물, 또는 동물-유래 가수분해물과 식물-유래 가수분해물 둘 다를 추가로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 상기 방법은 추가량의 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물을 (예를 들어, 예컨대 세포 배양 주기의 개시 후 일정 기간에 기초 세포 배양 배지에 도입된 공급 배지를 통하여), 본원에 제공된 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양물에 첨가된 추가량의 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물은 세포 배양 배지 중에 표 1에 열거된 농도로부터 선택된 농도의 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물을 제공하는 양으로 첨가된다.
또 다른 측면에서, 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산할 수 있는 세포를, 구리, 인슐린 및 시스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 인슐린을 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L의 농도로 포함한다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 구리를 약 69.0 nM 내지 약 400.0 nM의 농도로 포함한다. 본원의 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 시스틴을 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM의 농도로 포함한다. 본원의 실시양태 중 어느 것에서, 세포 배양 배지는 시스틴, 인슐린 또는 구리를 표 1로부터 선택된 양으로 포함할 수 있다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 상기 방법은 추가량의 인슐린을 본원에 제공된 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 인슐린은 세포 배양에 적합한 어느 양으로 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 한 측면에서, 인슐린은 세포 배양 배지 중에 표 1에 열거된 농도들로부터 선택된 농도의 인슐린을 제공하는 양으로 세포 배양 배지에 첨가된다. 특별한 측면에서, 인슐린은 세포 배양 배지 중에 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 농도의 인슐린을 제공하는 양으로 세포 배양 배지에 첨가된다: 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L; 약 5.0 mg/L 내지 약 80.0 mg/L; 약 5.0 mg/L 내지 약 60.0 mg/L; 약 5.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L; 약 5.0 mg/L 내지 약 40.0 mg/L; 약 5.0 mg/L 내지 약 30.0 mg/L; 약 5.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L; 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L; 약 10.0 mg/L 내지 약 30.0 mg/L; 약 15.0 mg/L 내지 약 20.0 mg/L; 약 5.0 mg/L 내지 약 15.0 mg/L; 약 6.0 mg/L 내지 약 12.0 mg/L; 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L 및 약 8.0 mg/L 내지 약 10.0 mg/L. 또 다른 측면에서, 인슐린은 세포 배양 배지 중에 약 5.0 mg/L, 6.0 mg/L, 7.0 mg/L, 8.0 mg/L, 9.0 mg/L, 10.0 mg/L, 11.0 mg/L, 12.0 mg/L, 13.0 mg/L, 14.0 mg/L, 15.0 mg/L, 16.0 mg/L, 17.0 mg/L, 18.0 mg/L, 19.0 mg/L, 20.0 mg/L, 21.0 mg/L, 22.0 mg/L, 23.0 mg/L, 24.0 mg/L, 25.0 mg/L, 26.0 mg/L, 27.0 mg/L, 28.0 mg/L, 29.0 mg/L 또는 30.0 mg/L 중 어느 하나의 농도의 인슐린을 제공하는 양으로 세포 배양 배지에 첨가된다. 추가 측면에서, 인슐린은 세포 배양 배지 중에 약 7 mg/L, 8.0 mg/L, 9.0 mg/L, 10.0 mg/L 또는 11.0 mg/L 중 어느 하나의 농도의 인슐린을 제공하는 양으로 세포 배양 배지에 첨가된다. 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 어느 시점에서 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 인슐린은 20일 세포 배양 주기 동안 1 내지 20일 중 어느 하나 이상에서 (예를 들어, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일 또는 20일 중 어느 하나 이상에서) 첨가할 수 있다. 추가량의 인슐린을 첨가하는 경우, 이는 인슐린을 세포 배양 주기 동안 2회 이상 첨가하는 경우에 동일하거나 상이할 수 있는 어떠한 양으로도 첨가할 수 있다. 따라서, 14일 세포 배양 주기 동안, 인슐린은 1일 내지 14일 중 어느 하나 이상에서 (예를 들어, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일 중 어느 하나 이상에서), 인슐린을 세포 배양 주기 동안 2회 이상 첨가하는 경우에 동일하거나 상이할 수 있는 어떠한 양으로도 첨가할 수 있는 것으로 인지된다. 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 6회 이상, 9회 이상, 12회 이상 또는 14회 이상 첨가될 수 있다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양물에 첨가된 추가량의 인슐린은 세포 배양 배지 중에 표 1로부터 선택된 농도, 예컨대 5.6 mg/L 내지 약 66 mg/L의 농도의 인슐린을 제공하는 양으로 첨가된다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 동물-유래 가수분해물, 식물-유래 가수분해물, 또는 동물-유래 가수분해물과 식물-유래 가수분해물 둘 다를 추가로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 상기 방법은 추가량의 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물을 (예를 들어, 예컨대 세포 배양 주기의 개시 후 일정 기간에 기초 세포 배양 배지에 도입된 공급 배지를 통하여), 본원에 제공된 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양물에 첨가된 추가량의 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물은 세포 배양 배지 중에 표 1에 열거된 농도로부터 선택된 농도의 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물을 제공하는 양으로 첨가된다.
또 다른 측면에서, 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 베바시주맙 또는 그의 단편의 생산 방법이 본원에 제공되며, 세포 배양 주기 내의 초기 세포 배양 배지는 약 69 nM 내지 약 1,000 nM의 농도의 구리, 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도의 인슐린 및 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM의 농도의 시스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함하고, 상기 세포는 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 (1) 구리 및 인슐린; (2) 구리 및 시스틴; (3) 인슐린 및 시스틴; 또는 (4) 구리, 인슐린 및 시스틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 구리, 시스틴, 및/또는 인슐린을 표 1에 기재된 바와 같은 농도들로부터 선택된 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물을 표 1에 기재된 바와 같은 농도들로부터 선택된 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 인슐린을 포함하고, 상기 방법은 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 또는 6회 이상 세포 배양 배지에 첨가한다. 일부 실시양태에서, 매회 첨가된 인슐린은 약 5 mg/L 내지 약 25 mg/L (예를 들어, 약 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L 및 25 mg/L 중 어느 하나)이다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 주기 동안 첨가된 인슐린의 누적량은 약 20 mg/L 내지 약 100 mg/L (예를 들어, 약 20 mg/L, 25 mg/L, 30 mg/L, 35 mg/L, 40 mg/L, 45 mg/L, 50 mg/L, 55 mg/L, 60 mg/L, 65 mg/L, 70 mg/L, 75 mg/L, 80 mg/L, 85 mg/L, 90 mg/L, 95 mg/L, 및 100 mg/L 중 어느 하나)이다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 시스틴을 포함하고, 상기 방법은 추가량의 시스틴을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 시스틴은 세포 배양 배지 중에 약 0.1 mM 내지 약 1.5 mM 첨가 시스틴 (예를 들어, 세포 배양 배지 중에 약 0.1 mM, 약 0.2 mM, 약 0.3 mM, 약 0.4 mM, 약 0.5 mM, 약 0.6 mM, 약 0.7 mM, 약 1 mM, 또는 약 1.5 mM 첨가 시스틴)을 제공하는 양으로 첨가된다. 일부 실시양태에서, 시스틴은 세포 배양 주기 동안 배치 공급에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 세포 배양 주기 동안 1개 이상의 배치 공급 (예를 들어, 세포 배양 주기 동안 2개, 3개 또는 4개의 배치 공급)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 배치 공급 배지는 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물을 (예를 들어, 표 1에 기재된 바와 같은 농도들로부터 선택된 농도로) 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 주기 동안, 상기 배지의 온도는 배양을 시작할 때의 온도와 비교해서 약 2℃ 이상, 약 3℃ 이상, 약 4℃ 이상, 또는 약 5℃ 이상 감소된다. 일부 실시양태에서, 상기 배지의 온도는 세포 배양 주기 동안 1회 이상 또는 2회 이상 감소된다. 일부 실시양태에서, 상기 온도는 배양을 시작한 후 8일 및 제10일에 감소된다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 약 31℃ 내지 약 35℃의 범위의 온도에서 배양한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 제1 기간 동안에 약 35℃의 제1 온도에서 배양하고, 제2 기간 동안에 약 33℃의 제2 온도에서 배양하며, 제3 기간 동안에 약 31℃의 제3 온도에서 배양한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 약 7.0 내지 약 7.3의 pH를 갖는 배지에서 배양한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "초기 세포 배양 배지"는 세포 배양 주기를 시작할 때의 세포 배양 배지를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지는 세포를 기초 배지에 접종한 후의 세포 배양 배지이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "누적"은 세포 배양 주기 전반에 걸쳐 첨가된 특별한 성분(들) (세포 배양 주기를 시작할 때 첨가된 성분 및 그 후에 첨가된 성분 포함)의 총 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 누적량은 첨가 후 세포 배양 배지에서 측정되거나 계산된 바와 같은, 세포 배양 배지 내로 첨가된 성분(들)의 총 농도이다. 일부 실시양태에서, 상기 성분(들)은 농축된 성분(들)을 함유하는 공급 용액에 의해 세포 배양 배지 내로 첨가된다. 예를 들어, 초기 배양 배지가 10 mg/L 인슐린을 갖고 있고, 추가량의 인슐린 15 mg/L이 세포 배양 주기 동안 첨가되어 세포 배양 배지 중에서 15 mg/L의 증가를 달성하는 경우, 세포 배양 주기 동안 첨가된 인슐린의 누적량은 25 mg/L이다.
일부 실시양태에서, 세포 배양 주기는, 세포에 의해 발현된 폴리펩티드를 생산하기 위하여 세포를 기초 세포 배양 배지 내로 접종할 때부터 생산 기간이 끝날 때까지의 일정 기간을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 주기는 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상, 15일 이상, 16일 이상, 17일 이상, 18일 이상, 19일 이상, 20일 이상, 21일 이상, 22일 이상, 23일 이상, 또는 세포가 이러한 세포에 의해 발현된 폴리펩티드를 생산하기 위하여 여전히 생존할 수 있는 일수이다.
본원의 실시양태 중 일부에서, 상기 방법은 표 1에 열거된 성분들 중 하나 이상을 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 배양된 경우에 포유동물 세포가 생산하는 베바시주맙 또는 그의 단편의 양과 비교해서, 이러한 포유동물 세포에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편의 양을 증가시켜 준다. 일부 실시양태에서, 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양된 세포에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편의 양은 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 배양된 경우에 상기 세포에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편의 양과 비교해서 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이상 증가된다.
본원에 제공된 세포 배양 배지는 기초 세포 배양 배지로서 및/또는 공급 세포 배양 배지로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 세포 배양 배지는 세포의 성장기 동안 이러한 세포를 배양하는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 세포 배양 배지는 세포의 생산기 동안 이러한 세포를 배양하는 방법에 사용된다.
(i) 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 방법; (ii) 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는 방법; 및 (iii) 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포로부터 베바시주맙 또는 그의 단편의 생산을 증강시키는 (예를 들어, 베바시주맙 또는 그의 단편의 역가 수율을 증강시키는) 방법을 포함한, 본원에 상세된 방법 중 어느 것도 적합한 어떠한 규모로도 (예를 들어, 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 어떠한 규모로도) 수행될 수 있는 것으로 이해된다. 한 측면에서, 본원에 상세된 방법 중 어느 것도 베바시주맙 또는 그의 단편의 상업적 생산 범위에 상응하는 규모로 수행된다. 예를 들어, 하나의 변형법에서, 베바시주맙을 생산할 수 있는 세포는 본원에 제공된 세포 배양 배지에서 배양할 수 있으며, 이러한 배양은 베바시주맙의 상업적 배치를 보유할 수 있는 배양 용기, 예컨대 10,000 L 이상의 세포 배양물을 보유할 수 있는 배양 용기에서 일어난다 (예를 들어, 상기 방법은 한 측면에서, 10,000 L 이상의 세포 배양 규모, 예컨대 12,000 L 세포 배양 규모로 수행된다).
본원에 제공된 방법의 추가 실시양태에서, 베바시주맙 또는 그의 단편을 세포 배양물로부터 회수한다. 이와 같이 회수된 베바시주맙 또는 그의 단편을 포함하는 조성물은, 예를 들어 품질 속성을 평가하기 전에 1회 이상의 정제 단계를 수행할 수 있다. 추가 실시양태에서, 상기 조성물은 베바시주맙 또는 그의 단편, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이다.
기타 방법 및 세포 배양 배지가 전반에 걸쳐, 예컨대 발명의 간단한 요약 및 그 밖의 곳에 제공된다.
폴리펩티드 생산
본원에 상세된 세포 배양 배지는 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하기 위해 세포를 배양하는 방법에 사용될 수 있다. 이러한 배지는 배치 배양에 의해서든지, 유가식 배양에 의해서든지 아니면 관류 배양에 의해서든지 간에, 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산할 수 있는 세포를 배양하는 방법에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 베바시주맙 또는 그의 단편은 숙주 세포에 의해 상기 배지 내로 직접 분비된다. 또 다른 실시양태에서, 베바시주맙 또는 그의 단편은 이러한 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포의 용해에 의해 상기 배지 내로 방출된다.
숙주 세포에서 발현 가능한 베바시주맙 또는 그의 단편은 본 개시내용에 따라서 생산될 수 있고, 제공된 조성물에 존재할 수 있다.
세포 배양물에서 항체 및 그의 단편을 생산하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 세포 배양물에서 항체 (예를 들어, 완전한 항체, 항체 단편 및 다중-특이적 항체)를 생산하기 위한 비-제한적 예시 방법이 본원에 제공된다. 항체 (예를 들어, 베바시주맙)를 생산하기 위한 일반적으로 널리 이해되고 통상적으로 이용된 기술 및 과정에 관해서는, 문헌 ([Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012)]; [Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003)]; [Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002)]; [Current Protocols in Protein Science, (Horswill et al., 2006)]; [Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988)]; [Culture of Animal Cells : A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010)]; 그들의 전문이 모두 본원에 참조로 포함된다)을 참조할 수 있다.
세포 배양 및 항체 생산
일반적으로, 세포는 세포 성장, 유지 및/또는 항체 생산 중 어느 것을 증진시키는 하나 이상의 조건 하에 본원에 기재된 세포 배양 배지 중 어느 것과 조합 (접촉)한다. 세포를 배양하고 항체를 생산하는 방법은 이러한 세포와 세포 배양 배지를 함유하는 배양 용기 (생물 반응기)를 이용한다. 배양 용기는 세포를 배양하는데 적합한 모든 재료 (유리, 플라스틱 또는 금속 포함)로 구성될 수 있다. 전형적으로, 배양 용기는 1리터 이상일 것이고, 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000리터 또는 그 초과일 수 있다 (예를 들어, 12,000리터 용기). 한 측면에서, 배양 용기는 세포 배양물로부터 대규모 양의 베바시주맙을 생산하는데 요구되는 바와 같이, 본원에 제공된 세포 배양 배지를 2리터 이상, 10리터 이상, 100리터 이상, 500리터 이상, 1,000리터 이상, 2,500리터 이상, 5,000리터 이상, 7,500리터 이상, 10,000리터 이상, 12,000리터 이상 함유할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 베바시주맙 또는 그의 단편을 대규모로 생산하는데 사용될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선별된 숙주 세포를 이용하여 기존에 사용된 것이고, 이는 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 배양 공정 동안 조정될 수 있는 배양 조건은 pH 및 온도를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원의 실시양태 중 일부에서, pH는 7.0, 7.15, 7.2, 7.25, 7.30, 7.35, 7.4, 7.45, 또는 7.50 이상 8.0 이하이다. 본원에 제공된 세포 배양 배지 내로 접종될 수 있는 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포의 수는 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 약 1.0 x 106개 내지 약 2.0 x 106개 세포 (약 1.1 x 106개, 약 1.2 x 106개, 약 1.3 x 106개, 약 1.4 x 106개, 약 1.5 x 106개, 약 1.6 x 106개, 약 1.7 x 106개, 약 1.8 x 106개 또는 약 1.9 x 106개 세포 중 어느 것 포함)를 세포 배양 주기의 개시를 위해 본원에 제공된 배지에 접종할 수 있다. 한 측면에서, 본원에 제공된 세포 배양 배지 내로 접종될 수 있는 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포의 수는 약 1.2 x 106개 내지 약 1.8 x 106개 세포 또는 약 1.3 x 106개 내지 약 1.7 x 106개 세포 또는 약 1.5 x 106개 내지 약 1.7 x 106개 세포이다.
세포 배양물은 일반적으로, 이러한 세포 배양물의 생존, 성장 및 생존율 (유지)에 도움이 되는 조건 하에 초기 성장기에 유지시키다. 정확한 조건은 세포 유형, 세포가 유래되는 유기체, 및 발현된 항체 또는 그의 단편의 종류 및 형질에 따라서 다양할 것이다.
초기 성장기에서의 세포 배양물의 온도는 주로, 세포 배양물이 여전히 생존 가능한 온도 범위에 근거하여 선택될 것이다. 예를 들어, 초기 성장기 동안에 CHO 세포가 37℃에서 잘 성장한다. 일반적으로, 대부분의 포유동물 세포는 약 25℃ 내지 42℃의 범위 내에서 잘 성장한다. 바람직하게, 포유동물 세포는 약 35℃ 내지 40℃의 범위 내에서 잘 성장한다. 통상의 기술자는 세포의 필요성과 생산 요구 사항에 따라서 세포를 성장시키는 적당한 온도(들)를 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 초기 성장기의 온도는 단일의 일정 온도로 유지된다. 또 다른 실시양태에서, 초기 성장기의 온도는 일정 범위의 온도 내에서 유지된다. 예를 들어, 온도는 초기 성장기 동안 꾸준히 증가되거나 감소될 수 있다. 또 다른 한편, 온도는 초기 성장기 동안의 각종 시간에 별개의 양으로써 증가되거나 감소될 수 있다. 통상의 기술자는 단일 또는 다수의 온도가 사용되어야 하는지 그리고 온도가 꾸준히 조정되거나 별개의 양으로써 조정되어야 하는지를 결정할 수 있을 것이다.
세포는 초기 성장기 동안 더 많거나 더 적은 시간 동안 배양할 수 있다. 하나의 변형법에서, 세포는 방해받지 않고 성장하도록 허용된 경우에 궁극적으로 세포가 도달하게 될 최대 생존 세포 밀도의 소정 비율 (%)인 생존 세포 밀도를 달성하기에 충분한 일정 기간 동안 배양한다. 예를 들어, 세포는 최대 생존 세포 밀도의 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%의 목적하는 생존 세포 밀도를 달성하기에 충분한 일정 기간 동안 배양할 수 있다.
또 다른 실시양태에서 세포는 규정된 기간 동안 성장하도록 허용된다. 예를 들어, 세포 배양물의 출발 농도, 세포를 배양하는 온도, 및 세포의 고유 성장 속도에 따라서, 세포를 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일 또는 그 초과 동안 배양할 수 있다. 일부 경우에, 세포는 1개월 이상 동안 성장시킬 수 있다.
세포 배양물은 세포에 대한 영양소의 분산과 산소화를 증가시키기 위하여 초기 배양 기 동안 진탕시키거나 흔들 수 있다. 본 발명에 따라서, 통상의 기술자는 초기 성장기 동안 생물 반응기의 특정의 내부 조건 (pH, 온도, 산소화 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다)을 제어하거나 조절하는 것이 유익할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, pH는 적당한 양의 산 또는 염기를 공급함으로써 제어할 수 있고, 산소화는 당해 분야에 널리 공지되어 있는 살포 장치를 이용하여 제어할 수 있다.
초기 배양 단계는 성장기인데, 여기서는 재조합 세포의 성장을 증강시키도록 배치 세포 배양 조건을 변형시켜 시드 트레인을 생산한다. 성장기는 일반적으로, 세포가 일반적으로 신속하게 분할되는, 예를 들어 성장하는 지수적 성장기간을 지칭한다. 이러한 기 동안, 세포는 일정 기간, 통상적으로 1 내지 4일 동안, 예를 들어 1, 2, 3 또는 4일 동안, 및 세포 성장이 최적이 되는 조건 하에 배양된다. 숙주 세포에 대한 성장 주기의 결정은 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 특별한 숙주 세포에 대해 결정할 수 있다.
성장기에서, 본원에 제공된 기초 배양 배지 및 세포는 배양 용기에 배치식으로 공급될 수 있다. 배양 배지는 한 측면에서, 약 5% 미만 또는 1% 미만 또는 0.1% 미만 혈청, 및 식물 또는 동물로부터 유래된 기타 단백질 (예를 들어, 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물)을 함유한다. 일부 실시양태에서, 기초 배지는 동물-유래 또는 식물-유래 가수분해물을 포함하지 않는다. 그러나, 혈청 및 동물-유래 단백질을 필요에 따라 사용할 수 있다. 그들의 성장에 있어서 특별한 시점에, 세포는 생산기에서의 배양을 시작할 때 배양 배지를 접종하기 위한 접종물을 형성할 수 있다. 또 다른 한편, 생산기는 성장기와 연속적일 수 있다. 세포 성장기 다음에 일반적으로, 폴리펩티드 생산기 (예를 들어, 항체 생산기)가 온다.
폴리펩티드 생산기 동안, 세포 배양물은 이러한 세포 배양물의 생존 및 생존율에 도움이 되고 목적하는 폴리펩티드 (예를 들어, 베바시주맙 또는 그의 단편)의 발현에 적당한 제2 배양 조건 세트 (성장기와 비교된 바와 같음) 하에 유지시킬 수 있다. 예를 들어, 후속 생산기 동안, CHO 세포는 재조합 폴리펩티드를 25℃ 내지 35℃의 범위 내에서 잘 발현한다. 다수의 별개의 온도 이동을 이용하여, 세포 밀도 또는 생존율을 증가시키거나 또는 재조합 폴리펩티드의 발현을 증가시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드 생산을 증가시키는 (예를 들어, 베바시주맙 또는 그의 단편의 생산을 증가시키는) 방법은 폴리펩티드 생산기 동안 하나 이상의 온도 이동 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 하나 이상의 온도 이동 단계는 37℃에서 35℃로의 온도 이동, 35℃에서 33℃로의 온도 이동, 또는 33℃에서 31℃로의 온도 이동을 포함한다. 본원의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 온도 이동 단계는 제0일의 약 37℃에서 제1일의 35℃ 내지 제8일의 33℃ 및 제10일의 31℃로의 온도 이동을 포함한다. 본원의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 온도 이동 단계는 제0일의 약 37℃에서 제3일의 35℃ 내지 제8일의 33℃ 및 제10일의 31℃로의 온도 이동을 포함한다. 본원의 일부 실시양태에서, 하나 이상의 온도 이동 단계는 제0일의 약 37℃에서 제2.5일의 34℃로의 온도 이동을 포함한다.
세포는 목적하는 세포 밀도 또는 생산 역가에 도달할 때까지 후속 생산기에서 유지시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 세포는 재조합 폴리펩티드 (예를 들어, 베바시주맙 또는 그의 단편)의 역가가 최대에 도달할 때까지 후속 생산기에서 유지시킨다. 다른 실시양태에서, 배양물은 이 시점 이전에 수거할 수 있다. 예를 들어, 세포는 최대 생존 세포 밀도의 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%의 생존 세포 밀도를 달성하기에 충분한 일정 기간 동안 유지시킬 수 있다. 일부 경우에, 생존 세포 밀도가 최대에 도달할 수 있게 한 다음, 배양물을 수거하기 전에 생존 세포 밀도를 일부 수준으로 감소시킬 수 있게 하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 경우에, 후속 생산기 동안 세포 배양물을, 세포에 의해 고갈되거나 대사되었던 영양소 또는 기타 배지 성분으로 보충시키는 것이 유익하거나 필요할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양물을, 이러한 세포 배양물의 모니터링 동안에 고갈된 것으로 관찰된 영양소 또는 기타 배지 성분으로 보충시키는 것이 유리할 수도 있다. 또 다른 한편 또는 추가로, 세포 배양물을 후속 생산기 이전에 보충시키는 것이 유익하거나 필요할 수 있다. 비-제한적 예로서, 세포 배양물을 호르몬 및/또는 기타 성장 인자, 특별한 이온 (예컨대, 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제, 비타민, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 미량 원소 (통상적으로 극히 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 아미노산, 지질 또는 글루코스, 또는 기타 에너지 공급원으로 보충시키는 것이 유익하거나 필요할 수 있다. 한 측면에서, 기초 세포 배양물은 본원에 상세된 바와 같은 인슐린 및/또는 식물-유래 가수분해물 및/또는 동물-유래 가수분해물로 보충시킨다.
본원의 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 세포 생산기 동안 추가량의 인슐린을 세포 배양물 내로 보충시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 추가 15 mg/L의 인슐린을 세포 배양 주기의 생산기 당일에 세포 배양물에 첨가할 수 있다. 또 다른 예에서, 추가 5 mg/L의 인슐린을 세포 배양 주기의 생산기 동안 3회 이상 세포 배양물에 첨가할 수 있다. 또한 또 다른 예에서, 추가 5 mg/L의 인슐린을 세포 배양 주기의 생산기 동안 6회 이상 세포 배양물에 첨가할 수 있다. 세포 배양 주기는 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 또는 14일 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 주기는 20일 이하이다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 주기는 20일 이상이다. 일부 실시양태에서, 세포는 2회 이상의 세포 배양 주기 동안 배양할 수 있다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 상기 방법은 추가량의 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물을 (예를 들어, 예컨대 세포 배양 주기의 개시 후 일정 기간에 기초 세포 배양 배지에 도입된 공급 배지를 통하여), 본원에 제공된 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 세포 배양물에 첨가된 추가량의 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물은 세포 배양 배지 중에 표 1에 열거된 농도로부터 선택된 농도의 동물-유래 가수분해물 및 식물-유래 가수분해물을 제공하는 양으로 첨가된다.
항체 정제
베바시주맙 또는 그의 단편은 바람직하게, 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수되지만, 분비성 신호 없이 직접적으로 발현되는 경우에는 숙수 세포 용해물로부터 회수될 수도 있다.
상기 배양 배지 또는 용해물을 원심분리시켜 미립형 세포 부스러기를 제거할 수 있다. 그 후, 베바시주맙 또는 그의 단편을 오염성 가용성 단백질 및 폴리펩티드로부터 정제할 수 있으며, 다음 과정이 적합한 정제 과정을 예시한다: 면역친화 또는 이온 교환 칼럼 상에서의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예컨대 DEAE 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스 G-75를 이용한 겔 여과; 및 IgG와 같은 오염물을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 칼럼. 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF)와 같은 프로테아제 억제제가 또한, 정제 동안 단백질 분해적 분해를 억제하는데 유용할 수 있다. 통상의 기술자는 관심 항체 또는 그의 단편에 적합한 정제 방법을 위해서는, 재조합 세포 배양물에서의 발현시 항체 또는 그의 단편의 형질 상의 변화를 고려한 변형이 요구될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 항체 또는 그의 단편은 일반적으로, 크로마토그래피 기술 (예를 들어, 낮은 pH 용출 단계를 이용한 친화 크로마토그래피, 및 공정 불순물을 제거하기 위한 이온 교환 크로마토그래피)을 이용하여 정제할 수 있다. 정제된 베바시주맙 또는 그의 단편은 농축시켜, 농축된 단백질 조성물, 예를 들어 100 mg/mL 또는 125 mg/mL 또는 150 mg/mL 이상의 항체 농도, 또는 약 100 mg/mL 또는 125 mg/mL 또는 150 mg/mL의 농도를 갖는 것을 제공할 수 있다. 농축된 폴리펩티드 산물은 농축 조건 하에 허용 가능한 수준까지, 예를 들어 폴리펩티드가 용액 중에서 더 이상 가용성이지 않는 농도까지 농축될 수 있다. 약물 제제화를 위한 항체를 생산 및 정제하는 방법의 비-제한적 예는 그 전문이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Kelley, B. MAbs., 2009, 1(5):443-452]에 기재되어 있다.
IV. 제약 제제
본원에 제공된 세포 배양 배지와 하나 이상의 기타 성분, 예컨대 특정 세포 또는 목적 항체 또는 그의 단편 (즉, 베바시주맙 또는 그의 단편)을 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포는 상기 항체 또는 그의 단편을 세포 배양 동안 본 발명의 세포 배양 배지 내로 분비할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 포유동물 세포, 및 본원에 제공된 세포 배양 배지 (이 내로 베바시주맙 또는 그의 단편이 분비된다)를 포함할 수 있다. 베바시주맙 또는 그의 단편, 및 본원에 제공된 세포 배양 배지를 포함하는 조성물이 또한 고려된다. 본 발명의 일부 측면에서, 조성물은 (a) 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포; 및 (b) 본원에 제공된 바와 같은 세포 배양 배지를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 조성물은 (a) 베바시주맙 또는 그의 단편; 및 (b) 본원에 제공된 바와 같은 세포 배양 배지를 포함하며, 상기 항체 또는 그의 단편은 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 포유동물 세포에 의해 상기 배지 내로 분비된다. 다른 측면에서, 조성물은 (a) 베바시주맙 또는 그의 단편; 및 (b) 본원에 제공된 바와 같은 세포 배양 배지를 포함하며, 상기 베바시주맙 또는 그의 단편은 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 포유동물 세포의 용해에 의해 상기 배지 내로 방출된다. 상기 조성물의 포유동물 세포는 본원에 상세된 어느 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)일 수 있고, 조성물의 배지는 본원에 상세된 어느 배지, 예컨대 표 1에 상세된 바와 같은 하나 이상의 화합물을 포함하는 배지일 수 있다.
본원에 기재된 방법 중 어느 것에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편의 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)은 목적하는 순도를 갖는 베바시주맙 또는 그의 단편을 하나 이상의 임의의 제약상 허용되는 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여, 동결건조된 제제 또는 수성 용제의 형태로 제조된다. 제약상 허용되는 담체는 일반적으로, 이용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 이는 완충제; 항산화제; 보존제; 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질; 친수성 중합체; 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물; 킬레이트제; 당; 염 형성 반대-이온; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 제약 제제는 포유동물, 예컨대 인간에게 투여한다. 베바시주맙 또는 그의 단편의 제약 제제는 비경구, 폐내 및 비내를 포함하고, 경우에 따라 국소 치료를 위한 병변내 투여를 포함한, 적합한 어떠한 수단에 의해서도 투여할 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 부분적으로는 투여가 단기인지 만성인지에 따라서, 예를 들어 주사에 의한 적합한 모든 경로, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 바와 같은 항체-함유 제제가 특정 개체 내로의 주사, 예컨대 피하 주사 (예를 들어, 인간 내로의 피하 주사)에 적합할 수 있다. 생체내 투여에 사용될 제약 제제는 일반적으로 멸균성이다. 멸균성은, 예를 들어 멸균성 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행할 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 제약 제제)은 100 mg/mL, 125 mg/mL, 150 mg/mL, 200 mg/mL, 또는 250 mg/mL 이상의 농도, 또는 약 100 mg/mL, 약 125 mg/mL, 약 150 mg/mL, 약 175 mg/mL, 또는 약 200 mg/mL의 농도의 베바시주맙 또는 그의 단편을 포함한다. 다른 측면에서, 본원에 제공된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 제약 제제)은 1 mg/mL, 10 mg/mL, 25 mg/mL, 50 mg/mL, 또는 75 mg/mL 이상의 농도, 또는 약 1 mg/mL, 약 10 mg/mL, 약 25 mg/mL, 약 50 mg/mL, 또는 약 75 mg/mL의 농도의 베바시주맙 또는 그의 단편을 포함한다.
V. 제조 물품 및 키트
세포 배양 배지를 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지으로 보충시키기 위한 키트가 제공된다. 구리, 인슐린 및 시스틴 중 적어도 2가지는 표 1에 제공된 바와 같은 성분들의 농도를 제공하는 양으로 존재할 수 있다. 상기 키트는 재구성될 건조된 구성분을 함유할 수 있고, 또한 사용 지침서 (예를 들어, 배지를 키트 구성분으로 보충시키는데 사용하기 위한 지침서)를 함유할 수 있다. 상기 키트는 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는데 사용하기 위한 세포 배양 배지를 보충시키는데 적합한 양으로 본원에 제공된 구성분을 함유할 수 있다. 한 측면에서, 키트는 세포 배양 배지 중에 약 0.9 mM 내지 약 1.5 mM 시스틴을 제공하는 양의 시스틴을 포함한다. 본원의 일부 실시양태에서, 키트는 세포 배양 배지 중에 약 1.4 mg/L 내지 약 11 mg/L 인슐린을 제공하는 양의 인슐린을 추가로 포함한다. 본원의 일부 실시양태에서, 키트는 세포 배양 배지 중에 약 26 nM 내지 약 400 nM 구리를 제공하는 양의 구리를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 세포 배양 배지 중에 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L 인슐린을 제공하는 양의 인슐린, 세포 배양 배지 중에 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM 시스틴을 제공하는 양의 시스틴, 및 세포 배양 배지 중에 약 25.0 nM 내지 약 400.0 nM 구리를 제공하는 양의 구리로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 구성분을 포함한다.
본원의 측면 중 어느 것에서, 상기 키트는 동물-유래 가수분해물 또는 식물-유래 가수분해물, 또는 동물-유래 가수분해물과 식물-유래 가수분해물 둘 다를 추가로 포함할 수 있다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 키트는 세포 배양 배지 중에 약 1.4 g/L 내지 약 6.2 g/L 식물-유래 가수분해물을 제공하는 양의 식물-유래 가수분해물을 추가로 포함한다. 본원의 실시양태 중 일부에서, 키트는 세포 배양 배지 중에 약 5.6 g/L 내지 약 38.0 g/L 동물-유래 가수분해물을 제공하는 양의 동물-유래 가수분해물을 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 세포 배양 배지를 보유하고 있고 그의 사용 지침서를 임의로 제공하는 용기를 포함하는 제조 물품이 제공된다. 적합한 용기는, 예를 들어 병 및 봉지를 포함한다. 용기는 각종 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 세포 배양 배지를 보유하고 있고, 이러한 용기와 연합되거나 그 위의 표지는 사용에 대한 지시 (예를 들어, 세포를 배양하는데 사용하기 위함)를 표시할 수 있다. 제조 물품은 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 재료, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 및 사용 지침서를 수반한 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 상세된 방법에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편을 보유하고 있고 그의 사용 지침서를 임의로 제공하는 용기를 포함하는 제조 물품이 또한, 제공된다.
실시양태
본 발명의 각종 실시양태 및 측면이 본원 전반에 걸쳐 상세되어 있다. 실시양태는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
방법 1: 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포 배양 배지는 구리, 인슐린 및 시스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함하고, 상기 세포는 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 것인, 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 방법.
방법 2: 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를, 구리, 인슐린 및 시스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 포유동물 세포를 배양하는 방법.
방법 3: 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를, 인슐린, 구리 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 포유동물 세포로부터 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편의 양은, 인슐린, 구리 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 것과 비교해서 증강되는 것인, 상기 포유동물 세포로부터 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편의 양을 증강시키는 방법.
방법 4: 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를, 인슐린, 구리 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양하는 방법이며, 여기서 상기 포유동물 세포로부터 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편의 양은, 인슐린, 구리 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 것과 비교해서 증강되는 것인, 배양 방법.
방법 1 내지 4 중 어느 것의 경우에, 방법은 다음 특색 (i) 내지 (xviii) 또는 그의 부특색, 또는 특색 또는 부특색의 모든 조합 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다:
(i) 세포 배양 배지는 구리 및 인슐린을 포함한다.
(ii) 세포 배양 배지는 구리 및 시스틴을 포함한다.
(iii) 세포 배양 배지는 인슐린 및 시스틴을 포함한다.
(iv) 세포 배양 배지는 구리, 인슐린, 및 시스틴을 포함한다.
(v) 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (iv) 중 어느 것을 함유하는 배지 포함]는 식물-유래 가수분해물, 동물-유래 가수분해물, 또는 식물-유래 가수분해물과 동물-유래 가수분해물 둘 다를 추가로 포함한다.
(vi) 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (v) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]는 인슐린을 다음 중 어느 하나의 농도로 포함한다:
a. 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L
b. 약 10.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L
c. 약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L
d. 약 10.0 mg/L 내지 약 35.0 mg/L
e. 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L
f. 약 5.0 mg/L 내지 약 80.0 mg/L
g. 약 5.0 mg/L 내지 약 60.0 mg/L
h. 약 5.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L
i. 약 5.0 mg/L 내지 약 40.0 mg/L
j. 약 5.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L
k. 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L
l. 약 10.0 mg/L 내지 약 40.0 mg/L
m. 약 15.0 mg/L 내지 약 20.0 mg/L
n. 약 5.0 mg/L 내지 약 15.0 mg/L
o. 약 6.0 mg/L 내지 약 12.0 mg/L
p. 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L
q. 약 8.0 mg/L 내지 약 10.0 mg/L
r. 약 5.0 mg/L, 6.0 mg/L, 7.0 mg/L, 8.0 mg/L, 9.0 mg/L, 10.0 mg/L, 11.0 mg/L, 12.0 mg/L, 13.0 mg/L, 14.0 mg/L, 15.0 mg/L, 16.0 mg/L, 17.0 mg/L, 18.0 mg/L, 19.0 mg/L, 20.0 mg/L, 21.0 mg/L, 22.0 mg/L, 23.0 mg/L, 24.0 mg/L, 25.0 mg/L, 26.0 mg/L, 27.0 mg/L, 28.0 mg/L, 29.0 mg/L 또는 30.0 mg/L 또는 31.0 mg/L 또는 32 mg/L 또는 33 mg/L 또는 34 mg/L 또는 35 mg/L 또는 36 mg/L 또는 37 mg/L 또는 38 mg/L 또는 39 mg/L 또는 40 mg/L 중 어느 하나
s. 약 7 mg/L, 8.0 mg/L, 9.0 mg/L, 10.0 mg/L 또는 11.0 mg/L 중 어느 하나
t. 약 25 mg/L.
(vii) 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (vi) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]는 구리를 다음 중 어느 하나의 농도로 포함한다:
a. 약 69 nM 내지 약 1,000 nM
b. 약 69.0 nM 내지 약 400.0 nM
c. 약 80 nM 내지 약 400 nM.
d. 약 100 nM 내지 약 400 nM
e. 약 125 nM 내지 약 400 nM
f. 약 150 nM 내지 약 400 nM
g. 약 200 nM 내지 약 400 nM
h. 약 250 nM 내지 약 400 nM
i. 약 300 nM 내지 약 400 nM
j. 약 325 nM 내지 약 375 nM
k. 약 325 nM 내지 약 350 nM
l. 약 100 nM, 125 nM, 150 nM, 175 nM, 200 nM, 225 nM, 250 nM, 275 nM, 300 nM, 325 nM, 350 nM, 375 nM 또는 400 nM 중 어느 하나
m. 약 330 nM, 335 nM, 340 nM, 345 nM 또는 350 nM 중 어느 하나
n. 약 335 nM, 336 nM, 337 nM, 338 nM, 339 nM 또는 400 nM
o. 약 339 nM.
(viii) 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (vii) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]는 시스틴을 다음 중 어느 하나의 농도로 포함한다:
a. 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM
b. 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM
c. 약 0.8 mM 내지 약 2.0 mM
d. 약 0.8 mM 내지 약 1.75 mM
e. 약 0.8 mM 내지 약 1.6 mM
f. 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM
g. 약 1.0 mM 내지 약 1.6 mM
h. 약 1.2 mM 내지 약 1.4 mM
i. 약 0.8 mM 또는 0.9 mM 또는 1.0 mM 또는 1.1 mM 또는 1.2 mM 또는 1.3 mM 또는 1.4 mM 또는 1.5 mM 중 어느 하나
j. 약 1.1 mM, 1.3 mM 또는 1.5 mM 중 어느 하나.
(ix) 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (viii) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]는 동물-유래 가수분해물을 다음 중 어느 하나의 농도로 포함한다:
a. 약 6.0 g/L 내지 약 20.0 g/L
b. 약 5.6 g/L 내지 약 38.0 g/L
c. 약 7.0 g/L 내지 약 25.0 g/L
d. 약 7.0 g/L 내지 약 20.0 g/L
e. 약 7.0 g/L 내지 약 15.0 g/L
f. 약 8.0 g/L 내지 약 12.0 g/L
g. 약 9.0 g/L 내지 약 11.0 g/L
h. 약 7.0 g/L 내지 약 11.0 g/L
i. 약 5 g/L, 10 g/L, 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L, 35 g/L, 40 g/L, 45 g/L 또는 50 g/L 중 어느 하나
j. 약 5 g/L, 6 g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 10 g/L, 11 g/L, 또는 12 g/L 중 어느 하나
k. 약 10 g/L
l. 약 13 g/L.
(x) 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (ix) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]는 식물-유래 가수분해물을 다음 중 어느 하나의 농도로 포함한다:
a. 약 1.0 g/L 내지 약 10.0 g/L
b. 약 1.4 g/L 내지 약 11.0 g/L
c. 약 1.4 g/L 내지 약 6.2 g/L
d. 약 1.5 g/L 내지 약 5.5 g/L
e. 약 1.5 g/L 내지 약 4.5 g/L
f. 약 1.5 g/L 내지 약 3.5 g/L
g. 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L
h. 약 1.5 g/L 내지 약 2.5 g/L
i. 약 1.75 g/L 내지 약 2.75 g/L
j. 약 2.25 g/L 내지 약 2.75 g/L
k. 약 1.75 g/L, 2.0 g/L, 2.25 g/L, 2.5 g/L, 3.0 g/L, 3.25 g/L, 3.5 g/L, 3.75 g/L, 또는 4.0 g/L 중 어느 하나
l. 약 2.0 g/L, 2.25 g/L, 2.5 g/L 또는 3.0 g/L 중 어느 하나
m. 약 2.5 g/L
n. 약 3.1 g/L.
(xi) 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (x) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]는 동물-유래 가수분해물과 식물-유래 가수분해물 둘 다를 포함하고, 동물-유래 가수분해물이 식물-유래 가수분해물 보다 더 많은 양으로 존재한다.
(xii) 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (xi) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]는 인슐린을 포함하고; 상기 방법은 추가량의 인슐린을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 추가량의 인슐린은 (a) 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 1회 또는 3회 이상 또는 6회 이상 첨가될 수 있고, (b) 세포 배양 배지 중에 다음 중 어느 하나의 농도의 인슐린을 제공하는 양으로 첨가될 수 있다:
a. 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L
b. 약 10.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L
c. 약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L
d. 약 10.0 mg/L 내지 약 35.0 mg/L
e. 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L
f. 약 5.0 mg/L 내지 약 80.0 mg/L
g. 약 5.0 mg/L 내지 약 60.0 mg/L
h. 약 5.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L
i. 약 5.0 mg/L 내지 약 40.0 mg/L
j. 약 5.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L
k. 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L
l. 약 10.0 mg/L 내지 약 40.0 mg/L
m. 약 15.0 mg/L 내지 약 20.0 mg/L
n. 약 5.0 mg/L 내지 약 15.0 mg/L
o. 약 6.0 mg/L 내지 약 12.0 mg/L
p. 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L
q. 약 8.0 mg/L 내지 약 10.0 mg/L
r. 약 5.0 mg/L, 6.0 mg/L, 7.0 mg/L, 8.0 mg/L, 9.0 mg/L, 10.0 mg/L, 11.0 mg/L, 12.0 mg/L, 13.0 mg/L, 14.0 mg/L, 15.0 mg/L, 16.0 mg/L, 17.0 mg/L, 18.0 mg/L, 19.0 mg/L, 20.0 mg/L, 21.0 mg/L, 22.0 mg/L, 23.0 mg/L, 24.0 mg/L, 25.0 mg/L, 26.0 mg/L, 27.0 mg/L, 28.0 mg/L, 29.0 mg/L 또는 30.0 mg/L 또는 31.0 mg/L 또는 32 mg/L 또는 33 mg/L 또는 34 mg/L 또는 35 mg/L 또는 36 mg/L 또는 37 mg/L 또는 38 mg/L 또는 39 mg/L 또는 40 mg/L 중 어느 하나
s. 약 7 mg/L, 8.0 mg/L, 9.0 mg/L, 10.0 mg/L 또는 11.0 mg/L 중 어느 하나
t. 약 25 mg/L
u. 약 15 mg/L.
(xiii) 상기 방법은 시스테인을 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (xii) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]에 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 시스테인은 세포 배양 배지에 (a) 시스테인을 포함하지 않는 기초 배지에 첨가되는 배치 공급의 성분으로서 첨가될 수 있고/있거나 (b) 세포 배양 배지 중에 약 0.5 내지 약 5.0 mM 또는 약 0.5 내지 약 2.0 mM 또는 약 0.5 내지 약 2.0 mM의 농도 (예컨대, 0.8 mM의 농도) 또는 약 7.0 내지 약 8.0 mM의 농도 (예컨대, 약 7.5 mM의 농도)의 시스테인을 제공하는 양으로 첨가될 수 있다.
(xiv) 상기 방법은 시스틴을 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (xii) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]에 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 시스틴은 기초 배지에 첨가되는 배치 공급의 성분으로서 세포 배양 배지에 첨가될 수 있고 세포 배양 배지 중에 약 0.1 내지 약 1.5 mM의 농도 (예컨대, 0.2 mM의 농도)의 시스틴을 제공하는 양으로 첨가될 수 있다.
(xv) 상기 세포는 [예를 들어, 특색 (i) 내지 (xiv) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 갖는 배지를 포함한 어느 세포 배양 배지에서] 약 28℃ 내지 약 37℃ 또는 약 31℃ 내지 약 35℃의 범위의 온도에서 배양한다.
(xvi) 상기 세포는 [예를 들어, 특색 (i) 내지 (xiv) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 갖는 배지를 포함한 어느 세포 배양 배지에서] 제1 기간 동안에 약 35℃의 제1 온도에서 배양하고, 제2 기간 동안에 약 33℃의 제2 온도에서 배양하며, 제3 기간 동안에 약 31℃의 제3 온도에서 배양한다.
(xvii) 베바시주맙 또는 그의 단편이 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (xvi) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함] 내로 분비된다.
(xviii) 상기 방법은 세포 배양물 [특색 (i) 내지 (xvi) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]로부터 베바시주맙 또는 그의 단편을 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
또한, 방법 1 내지 4 중 어느 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본원에 제공된 어느 방법에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편이 본원에 제공되며, 상기 방법은 상기 특색 (i) 내지 (xviii) 또는 그의 부특색, 또는 전술된 것의 모든 조합 중 어느 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함할 수 있다.
또한, (i) 방법 1 내지 4 중 어느 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본원에 제공된 어느 방법 [이 방법은 상기 특색 (i) 내지 (xviii) 또는 그의 부특색, 또는 전술된 것의 모든 조합 중 어느 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함할 수 있다]에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는데 사용하기 위한 세포 배양 배지를 보충하기 위한 키트가 또한 제공되며, 이러한 키트는 다음 성분 (i) 내지 (iii) 중 적어도 2가지를 포함한다:
(i) 다음 중 어느 하나의 농도를 제공하는 양의 인슐린:
a. 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L
b. 약 10.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L
c. 약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L
d. 약 10.0 mg/L 내지 약 35.0 mg/L
e. 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L
f. 약 5.0 mg/L 내지 약 80.0 mg/L
g. 약 5.0 mg/L 내지 약 60.0 mg/L
h. 약 5.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L
i. 약 5.0 mg/L 내지 약 40.0 mg/L
j. 약 5.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L
k. 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L
l. 약 10.0 mg/L 내지 약 40.0 mg/L
m. 약 15.0 mg/L 내지 약 20.0 mg/L
n. 약 5.0 mg/L 내지 약 15.0 mg/L
o. 약 6.0 mg/L 내지 약 12.0 mg/L
p. 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L
q. 약 8.0 mg/L 내지 약 10.0 mg/L
r. 약 5.0 mg/L, 6.0 mg/L, 7.0 mg/L, 8.0 mg/L, 9.0 mg/L, 10.0 mg/L, 11.0 mg/L, 12.0 mg/L, 13.0 mg/L, 14.0 mg/L, 15.0 mg/L, 16.0 mg/L, 17.0 mg/L, 18.0 mg/L, 19.0 mg/L, 20.0 mg/L, 21.0 mg/L, 22.0 mg/L, 23.0 mg/L, 24.0 mg/L, 25.0 mg/L, 26.0 mg/L, 27.0 mg/L, 28.0 mg/L, 29.0 mg/L 또는 30.0 mg/L 또는 31.0 mg/L 또는 32 mg/L 또는 33 mg/L 또는 34 mg/L 또는 35 mg/L 또는 36 mg/L 또는 37 mg/L 또는 38 mg/L 또는 39 mg/L 또는 40 mg/L 중 어느 하나
s. 약 7 mg/L, 8.0 mg/L, 9.0 mg/L, 10.0 mg/L 또는 11.0 mg/L 중 어느 하나
t. 약 25 mg/L.
(ii) 다음 중 어느 하나의 농도를 제공하는 양의 시스틴:
a. 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM
b. 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM
c. 약 0.8 mM 내지 약 2.0 mM
d. 약 0.8 mM 내지 약 1.75 mM
e. 약 0.8 mM 내지 약 1.6 mM
f. 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM
g. 약 1.0 mM 내지 약 1.6 mM
h. 약 1.2 mM 내지 약 1.4 mM
i. 약 0.8 mM 또는 0.9 mM 또는 1.0 mM 또는 1.1 mM 또는 1.2 mM 또는 1.3 mM 또는 1.4 mM 또는 1.5 mM 중 어느 하나
j. 약 1.1 mM, 1.3 mM 또는 1.5 mM 중 어느 하나.
(iii) 다음 중 어느 하나의 농도의 구리:
a. 약 69.0 nM 내지 약 1,000.0 nM
b. 약 69.0 nM 내지 약 400.0 nM
c. 약 80 nM 내지 약 400 nM.
d. 약 100 nM 내지 약 400 nM
e. 약 125 nM 내지 약 400 nM
f. 약 150 nM 내지 약 400 nM
g. 약 200 nM 내지 약 400 nM
h. 약 250 nM 내지 약 400 nM
i. 약 300 nM 내지 약 400 nM
j. 약 325 nM 내지 약 375 nM
k. 약 325 nM 내지 약 350 nM
l. 약 100 nM, 125 nM, 150 nM, 175 nM, 200 nM, 225 nM, 250 nM, 275 nM, 300 nM, 325 nM, 350 nM, 375 nM 또는 400 nM 중 어느 하나
m. 약 330 nM, 335 nM, 340 nM, 345 nM 또는 350 nM 중 어느 하나
n. 약 335 nM, 336 nM, 337 nM, 338 nM, 339 nM 또는 400 nM
o. 약 339 nM.
키트는 다음 중 어느 하나 이상을 포함한, 기타 성분을 추가로 포함할 수 있다:
i. 예컨대, 다음 중 어느 하나의 농도를 제공하는 양의 동물-유래 가수분해물:
a. 약 6.0 g/L 내지 약 20.0 g/L
b. 약 5.6 g/L 내지 약 38.0 g/L
c. 약 7.0 g/L 내지 약 25.0 g/L
d. 약 7.0 g/L 내지 약 20.0 g/L
e. 약 7.0 g/L 내지 약 15.0 g/L
f. 약 8.0 g/L 내지 약 12.0 g/L
g. 약 9.0 g/L 내지 약 11.0 g/L
h. 약 7.0 g/L 내지 약 11.0 g/L
i. 약 5 g/L, 10 g/L, 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L, 35 g/L, 40 g/L, 45 g/L 또는 50 g/L 중 어느 하나
j. 약 5 g/L, 6 g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 10 g/L, 11 g/L, 또는 12 g/L 중 어느 하나
k. 약 10 g/L
l. 약 13 g/L.
ii. 예컨대, 다음 중 어느 하나의 농도를 제공하는 양의 식물-유래 가수분해물:
a. 약 1.0 g/L 내지 약 10.0 g/L
b. 약 1.4 g/L 내지 약 11.0 g/L
c. 약 1.4 g/L 내지 약 6.2 g/L
d. 약 1.5 g/L 내지 약 5.5 g/L
e. 약 1.5 g/L 내지 약 4.5 g/L
f. 약 1.5 g/L 내지 약 3.5 g/L
g. 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L
h. 약 1.5 g/L 내지 약 2.5 g/L
i. 약 1.75 g/L 내지 약 2.75 g/L
j. 약 2.25 g/L 내지 약 2.75 g/L
k. 약 1.75 g/L, 2.0 g/L, 2.25 g/L, 2.5 g/L, 3.0 g/L, 3.25 g/L, 3.5 g/L, 3.75 g/L, 또는 4.0 g/L 중 어느 하나
l. 약 2.0 g/L, 2.25 g/L, 2.5 g/L 또는 3.0 g/L 중 어느 하나
m. 약 2.5 g/L
n. 약 3.1 g/L.
베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는데 사용하기 위한 세포 배양 배지가 또한 제공되며, 이러한 세포 배양 배지는 다음 성분 (i) 내지 (iii) 중 적어도 2가지를 포함한다:
(i) 다음 중 어느 하나의 농도를 제공하는 양의 인슐린:
a. 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L
b. 약 10.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L
c. 약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L
d. 약 10.0 mg/L 내지 약 35.0 mg/L
e. 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L
f. 약 5.0 mg/L 내지 약 80.0 mg/L
g. 약 5.0 mg/L 내지 약 60.0 mg/L
h. 약 5.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L
i. 약 5.0 mg/L 내지 약 40.0 mg/L
j. 약 5.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L
k. 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L
l. 약 10.0 mg/L 내지 약 40.0 mg/L
m. 약 15.0 mg/L 내지 약 20.0 mg/L
n. 약 5.0 mg/L 내지 약 15.0 mg/L
o. 약 6.0 mg/L 내지 약 12.0 mg/L
p. 약 7.0 mg/L 내지 약 11.0 mg/L
q. 약 8.0 mg/L 내지 약 10.0 mg/L
r. 약 5.0 mg/L, 6.0 mg/L, 7.0 mg/L, 8.0 mg/L, 9.0 mg/L, 10.0 mg/L, 11.0 mg/L, 12.0 mg/L, 13.0 mg/L, 14.0 mg/L, 15.0 mg/L, 16.0 mg/L, 17.0 mg/L, 18.0 mg/L, 19.0 mg/L, 20.0 mg/L, 21.0 mg/L, 22.0 mg/L, 23.0 mg/L, 24.0 mg/L, 25.0 mg/L, 26.0 mg/L, 27.0 mg/L, 28.0 mg/L, 29.0 mg/L 또는 30.0 mg/L 또는 31.0 mg/L 또는 32 mg/L 또는 33 mg/L 또는 34 mg/L 또는 35 mg/L 또는 36 mg/L 또는 37 mg/L 또는 38 mg/L 또는 39 mg/L 또는 40 mg/L 중 어느 하나
s. 약 7 mg/L, 8.0 mg/L, 9.0 mg/L, 10.0 mg/L 또는 11.0 mg/L 중 어느 하나
t. 약 25 mg/L.
(ii) 다음 중 어느 하나의 농도를 제공하는 양의 시스틴:
a. 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM
b. 약 0.8 mM 내지 약 2.5 mM
c. 약 0.8 mM 내지 약 2.0 mM
d. 약 0.8 mM 내지 약 1.75 mM
e. 약 0.8 mM 내지 약 1.6 mM
f. 약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM
g. 약 1.0 mM 내지 약 1.6 mM
h. 약 1.2 mM 내지 약 1.4 mM
i. 약 0.8 mM 또는 0.9 mM 또는 1.0 mM 또는 1.1 mM 또는 1.2 mM 또는 1.3 mM 또는 1.4 mM 또는 1.5 mM 중 어느 하나
j. 약 1.1 mM, 1.3 mM 또는 1.5 mM 중 어느 하나.
(iii) 다음 중 어느 하나의 농도의 구리:
a. 약 69.0 nM 내지 약 1,000.0 nM
b. 약 69.0 nM 내지 약 400.0 nM
c. 약 80 nM 내지 약 400 nM.
d. 약 100 nM 내지 약 400 nM
e. 약 125 nM 내지 약 400 nM
f. 약 150 nM 내지 약 400 nM
g. 약 200 nM 내지 약 400 nM
h. 약 250 nM 내지 약 400 nM
i. 약 300 nM 내지 약 400 nM
j. 약 325 nM 내지 약 375 nM
k. 약 325 nM 내지 약 350 nM
l. 약 100 nM, 125 nM, 150 nM, 175 nM, 200 nM, 225 nM, 250 nM, 275 nM, 300 nM, 325 nM, 350 nM, 375 nM 또는 400 nM 중 어느 하나
m. 약 330 nM, 335 nM, 340 nM, 345 nM 또는 350 nM 중 어느 하나
n. 약 335 nM, 336 nM, 337 nM, 338 nM, 339 nM 또는 400 nM
o. 약 339 nM.
세포 배양 배지는 다음 중 어느 하나 이상을 포함한, 기타 성분을 포함할 수 있다:
1) 예컨대, 다음 중 어느 하나의 농도를 제공하는 양의 동물-유래 가수분해물:
a. 약 6.0 g/L 내지 약 20.0 g/L
b. 약 5.6 g/L 내지 약 25.0 g/L
c. 약 7.0 g/L 내지 약 25.0 g/L
d. 약 7.0 g/L 내지 약 20.0 g/L
e. 약 7.0 g/L 내지 약 15.0 g/L
f. 약 8.0 g/L 내지 약 12.0 g/L
g. 약 9.0 g/L 내지 약 11.0 g/L
h. 약 7.0 g/L 내지 약 11.0 g/L
i. 약 5 g/L, 10 g/L, 15 g/L, 20 g/L 또는 25 g/L 중 어느 하나
j. 약 5 g/L, 6 g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 10 g/L, 11 g/L, 또는 12 g/L 중 어느 하나
k. 약 10 g/L
l. 약 13 g/L.
2) 예컨대, 다음 중 어느 하나의 농도를 제공하는 양의 식물-유래 가수분해물:
a. 약 1.0 g/L 내지 약 10.0 g/L
b. 약 1.4 g/L 내지 약 11.0 g/L
c. 약 1.4 g/L 내지 약 6.2 g/L
d. 약 1.5 g/L 내지 약 5.5 g/L
e. 약 1.5 g/L 내지 약 4.5 g/L
f. 약 1.5 g/L 내지 약 3.5 g/L
g. 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L
h. 약 1.5 g/L 내지 약 2.5 g/L
i. 약 1.75 g/L 내지 약 2.75 g/L
j. 약 2.25 g/L 내지 약 2.75 g/L
k. 약 1.75 g/L, 2.0 g/L, 2.25 g/L, 2.5 g/L, 3.0 g/L, 3.25 g/L, 3.5 g/L, 3.75 g/L, 또는 4.0 g/L 중 어느 하나
l. 약 2.0 g/L, 2.25 g/L, 2.5 g/L 또는 3.0 g/L 중 어느 하나
m. 약 2.5 g/L
n. 약 3.1 g/L.
세포 배양 배지는 추가 세포 배양 배지 성분으로 추가로 보충시킬 수 있으며, 이러한 추가 세포 배양 배지 성분은, 예를 들어 인슐린 및/또는 시스테인, 예컨대 본원에 제공된 인슐린의 어느 농도 [본 실시양태에 열거된 농도 (예컨대, 15 mg/L) 포함]를 제공하는 양의 인슐린 및/또는 본원에 제공된 시스테인의 어느 농도 (예컨대, 0.8 mM) (본 실시양태에 열거된 농도 포함)를 제공하는 양의 시스테인을 포함할 수 있다.
세포 배양 배지는 추가 세포 배양 배지 성분으로 추가로 보충시킬 수 있으며, 이러한 추가 세포 배양 배지 성분은, 예를 들어 인슐린 및/또는 시스테인 및/또는 시스틴, 예컨대 본원에 제공된 인슐린의 어느 농도 [본 실시양태에 열거된 농도 (예컨대, 15 mg/L) 포함]를 제공하는 양의 인슐린 및/또는 본원에 제공된 시스테인의 어느 농도 (예컨대, 0.8 mM) (본 실시양태에 열거된 농도 포함)를 제공하는 양의 시스테인 및/또는 본원에 제공된 시스틴의 어느 농도 (예컨대, 0.2 mM) (본 실시양태에 열거된 농도 포함)를 제공하는 양의 시스틴을 포함할 수 있다.
또한, (a) 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포; 및 (b) 본원에 상세된 세포 배양 배지 (본 실시양태에 제공된 세포 배양 배지를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다)를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 추가로, (a) 베바시주맙 또는 그의 단편; 및 (b) 본원에 상세된 세포 배양 배지 (본 실시양태에 제공된 세포 배양 배지를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다)를 포함하는 조성물이 제공된다.
또한, 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 방법이 본원에 제공되며, 세포 배양 주기 내의 초기 세포 배양 배지는 약 69 nM 내지 약 1,000 nM의 농도의 구리, 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도의 인슐린, 및 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM의 농도의 시스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함하고, 상기 세포는 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산한다.
일부 실시양태에서, 제한 없이, 상기 방법은 다음 특색 (i) 내지 (xxiii) 또는 그의 부특색, 또는 특색 또는 부특색의 모든 조합 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다:
(i) 초기 세포 배양 배지는 구리 및 인슐린을 포함한다.
(ii) 초기 세포 배양 배지는 구리 및 시스틴을 포함한다.
(iii) 초기 세포 배양 배지는 인슐린 및 시스틴을 포함한다.
(iv) 초기 세포 배양 배지는 구리, 인슐린, 및 시스틴을 포함한다.
(v) 초기 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (iv) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]는 인슐린을 다음 중 어느 하나의 농도로 포함한다:
a. 약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L
b. 약 10.0 mg/L 내지 약 20.0 mg/L
c. 약 10.0 mg/L, 15.0 mg/L, 20.0 mg/L, 및 25.0 mg/L 중 어느 하나.
(vi) 초기 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (v) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]는 구리를 다음 중 어느 하나의 농도로 포함한다:
a. 약 325 nM 내지 약 375 nM
b. 약 325 nM 내지 약 350 nM
c. 약 330 nM, 335 nM, 339 nM, 340 nM, 345 nM 및 350 nM 중 어느 하나.
(vii) 초기 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (vi) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]는 시스틴을 다음 중 어느 하나의 농도로 포함한다:
a. 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM
b. 약 1.0 mM 내지 약 1.6 mM
c. 약 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM 1.4 mM, 1.5 mM 및 1.6 mM 중 어느 하나.
(viii) 초기 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (vii) 중 어느 것을 함유하는 배지 포함]는 식물-유래 가수분해물, 동물-유래 가수분해물, 또는 식물-유래 가수분해물과 동물-유래 가수분해물 둘 다를 추가로 포함한다.
(ix) 초기 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (viii) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]는 동물-유래 가수분해물을 다음 중 어느 하나의 농도로 포함한다:
a. 약 6.0 g/L 내지 약 20.0 g/L
b. 약 8.0 g/L 내지 약 12.0 g/L
c. 약 9.0 g/L 내지 약 11.0 g/L
d. 약 13 g/L.
(x) 초기 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (ix) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]는 식물-유래 가수분해물을 다음 중 어느 하나의 농도로 포함한다:
a. 약 1.0 g/L 내지 약 10.0 g/L
b. 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L
c. 약 2.25 g/L 내지 약 2.75 g/L
d. 약 2.5 g/L.
(xi) 초기 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (x) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]는 동물-유래 가수분해물과 식물-유래 가수분해물 둘 다를 포함하고, 동물-유래 가수분해물이 식물-유래 가수분해물 보다 더 많은 양으로 존재한다.
(xii) 초기 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (xi) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]는 인슐린을 포함하고; 상기 방법은 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하며; 임의로, a) 추가량의 인슐린은 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상 또는 6회 이상 첨가될 수 있고/있거나; b) 매회 첨가된 인슐린은 다음 중 어느 하나이고/이거나: 약 5.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L, 또는 약 5.0 mg/L, 10.0 mg/L, 15.0 mg/L, 20.0 mg/L, 및 25.0 mg/L 중 어느 하나; c) 세포 배양 주기 동안 첨가된 인슐린의 누적량이 다음 중 어느 하나이다: 약 20.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L, 또는 약 20.0 mg/L, 25.0 mg/L, 30 mg/L, 35 mg/L, 40 mg/L, 45 mg/L, 50 mg/L, 55 mg/L, 60 mg/L, 65 mg/L, 70 mg/L, 75 mg/L, 80 mg/L 및 85 mg/L 중 어느 하나.
(xiii) 초기 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (xii) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]는 시스틴을 포함하고; 상기 방법은 추가량의 시스틴을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하며; 임의로, a) 시스틴은 다음 중 어느 하나, 즉 세포 배양 배지 중에 약 0.1 mM 내지 약 1.5 mM 추가 시스틴을 제공하거나, 또는 세포 배양 배지 중에 약 0.4 mM 내지 약 0.7 mM (예를 들어, 약 0.4 mM 내지 약 0.6 mM, 약 0.4 mM 내지 약 0.5 mM) 첨가 시스틴를 제공하는 양으로 첨가되고/되거나; b) 시스틴은 세포 배양 주기 동안 배치 공급으로 첨가된다.
(xiv) 상기 방법은 다음 중 어느 하나, 즉 세포 배양 주기 동안 1개 이상의 배치 공급을 첨가하거나, 또는 세포 배양 주기 동안 2개, 3개 또는 4개의 배치 공급을 첨가하는 단계를 추가로 포함하고; 임의로, 이러한 배치 공급 배지는 식물-유래 가수분해물, 동물-유래 가수분해물, 또는 식물-유래 가수분해물과 동물-유래 가수분해물 둘 다를 포함할 수 있다.
(xv) 세포 배양 주기 동안, 상기 배지 [특색 (i) 내지 (xiv) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]의 온도는 배양을 시작할 때의 온도와 비교해서 2℃ 이상, 약 3℃ 이상, 약 4℃ 이상, 또는 약 5℃ 이상 감소된다.
(xvi) 세포 배양 주기 동안, 상기 배지 [특색 (i) 내지 (xv) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]의 온도를 a) 세포 배양 주기 동안 1회 이상 또는 2회 이상 감소되고/되거나; b) 상기 온도는 배양을 시작한 후 8일 및 제10일에 감소된다.
(xvii) 상기 세포는 [예를 들어, 특색 (i) 내지 (xvi) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 갖는 배지를 포함한 어느 세포 배양 배지 중에서] 약 31℃ 내지 약 35℃의 범위의 온도에서 배양한다.
(xviii) 상기 세포는 [예를 들어, 특색 (i) 내지 (xvii) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 갖는 배지를 포함한 어느 세포 배양 배지 중에서] 제1 기간 동안에 약 35℃의 제1 온도에서 배양하고, 제2 기간 동안에 약 33℃의 제2 온도에서 배양하며, 제3 기간 동안에 약 31℃의 제3 온도에서 배양한다.
(xix) 상기 세포는 약 7.0 내지 약 7.3의 pH를 갖는 배지 [예를 들어, 특색 (i) 내지 (xviii) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 갖는 배지를 포함한 어느 세포 배양 배지]에서 배양한다.
(xx) 상기 방법은 (a) 약 10 mg/L 인슐린, 약 325 nM 내지 약 350 nM 구리, 및 약 1.3 mM 시스틴을 포함하는 초기 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계; (b) 제1 배치 공급과 인슐린 공급을 상기 세포 배양 배지에 제공하여, 배양을 시작한 후 제3일에 약 15 mg/L의 농도의 추가 인슐린을 제공하도록 하는 단계; 및 (c) 시스틴을 포함하는 제2 배치 공급을 상기 세포 배양 배지에 제공하여, 배양을 시작한 후 제6일에 약 0.4 mM 내지 약 0.7 mM의 농도의 추가 시스틴을 제공하도록 하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포는 약 35℃의 초기 온도에서 배양하고, 온도는 배양을 시작한 후 제8일에 약 33℃로 감소되고 제10일에 약 31℃로 추가로 감소된다.
(xxi) 베바시주맙 또는 그의 단편이 세포 배양 배지 [특색 (i) 내지 (xx) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함] 내로 분비된다.
(xxii) 상기 방법은 세포 배양물 [특색 (i) 내지 (xxi) 중 어느 하나 이상 또는 모두를 함유하는 배지 포함]로부터 베바시주맙 또는 그의 단편을 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
(xxiii) 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포이다.
또한, 본원에 제공된 어느 방법에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편이 본원에 제공되며, 이 방법은 상기 특색 (i) 내지 (xxiii) 또는 그의 부특색, 또는 전술된 것의 모든 조합 중 어느 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함할 수 있다.
또한, (i) 본원에 제공된 어느 방법 [이 방법은 상기 특색 (i) 내지 (xxiii) 또는 그의 부특색, 또는 전술된 것의 모든 조합 중 어느 하나 이상 또는 모두를 추가로 포함할 수 있다]에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
다음 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1: 포유동물 세포주에 의해 생산된 베바시주맙의 양에 대한 세포 배양 배지 성분의 영향
베바시주맙을 생산하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 다양한 양의 인슐린을 함유하는 세포 배양 배지에서 배양하였고, 생산된 베바시주맙의 양에 대한 인슐린의 영향을 평가하였다. 베바시주맙의 생산은 339 nM 구리, 1% 동물 가수분해물 및 0.25% 식물 가수분해물을 함유하는 기초 배지에 세포를 접종함으로써 세포 배양물에서 개시하였고, 생물 반응기에서 14일 세포 배양 주기 경과에 따른 제3일에 배치 공급 배지를 첨가하였다. 대조군 세포 배양물의 기초 세포 배양 배지는 10 mg/L 미만의 인슐린으로 보충시켰고, 세포 배양 주기 동안 추가 인슐린을 전혀 제공하지 않았다. 2가지 대표적인 실험 사례 (사례 1 및 사례 2)에서, 기초 세포 배양 배지 중의 인슐린 수준은 10 mg/L이었다. 추가 인슐린을 세포 배양 주기 동안 3회 내지 6회 첨가하여, 14일 세포 배양 주기가 끝날 무렵 세포 배양 사례 1 및 세포 배양 사례 2에 25 mg/L 및 40 mg/L의 최종 양의 인슐린을 각각 제공하도록 하였다 (표 A). 상기 세포를 제1일에 37℃에서 배양하였고, 그 온도를 연속해서, 제1일에 35℃로, 제8일에는 33℃로, 및 제10일에는 31℃로 하향 이동시켰다. 역가 개선은 대조군과 비교해서 증가 %로써 정량화하였다. 세포 배양 주기 동안 인슐린의 총 첨가량이 10 mg/L 미만에서 25 mg/L 또는 40 mg/L로 되면, 대조군과 비교해서 각각 약 16% 또는 약 18%의 역가 개선이 야기되었다 (표 A).
<표 A>
예시적인 인슐린 첨가 프로토콜 및 결과
Figure pct00007
베바시주맙을 생산하는 CHO 세포를 상이한 공급원으로부터의 상이한 양의 가수분해물을 함유하는 세포 배양 배지에서 배양하였고, 생산된 베바시주맙의 양에 대한 특이적 가수분해물의 영향을 평가하였다. 2가지 대표적인 프로토콜에서, 베바시주맙의 생산은 339 nM 구리를 함유하는 기초 세포 배양 배지에 세포를 접종함으로써 세포 배양물에서 개시하였고, 생물 반응기에서 14일 세포 배양 주기 경과에 따른 제3일에 배치 공급 배지를 첨가하였다. 프로토콜 1에 대한 기초 세포 배양 배지는 식물-유래 가수분해물을 수반하지 않으면서 1% 동물-유래 가수분해물을 갖는 반면, 프로토콜 2는 0.75% 동물-유래 가수분해물을 0.25% 식물-유래 가수분해물과 조합하여 보충시킨 기초 세포 배양 배지를 갖는다 (표 B). 이러한 2개의 프로토콜에 의해 생산된 항체 역가를 분석한 결과, 프로토콜 2는 프로토콜 1을 이용하여 배양된 세포에 의해 생산된 베바시주맙의 양과 비교해서, 상기 세포로부터 생산된 베바시주맙의 양에 있어서 27% 증가를 제공한 것으로 입증되었다 (표 B).
<표 B>
예시적인 실험 프로토콜
Figure pct00008
실시예 2: 포유동물 세포주에 의해 생산된 베바시주맙의 양에 대한 세포 배양 배지 성분의 영향
베바시주맙을 생산하는 CHO 세포를 단량체 형태 (Cys, 시스테인) 또는 이량체 형태 (Cys-Cys, 시스틴)의 아미노산 시스테인을 수반한 기초 배지에서 배양하였다 (표 C). 베바시주맙의 생산은 339 nM 구리, 1% 동물 가수분해물 및 0.25% 식물 가수분해물을 함유하는 기초 배지에 세포를 접종함으로써 세포 배양물에서 개시하였고, 생물 반응기에서 14일 세포 배양 주기 경과에 따른 제3일에 배치 공급을 첨가하였다. 기초 배지 중의 인슐린 수준은 10 mg/L 미만 또는 10 mg/L의 농도였다. 실험적 세포 배양물 중 2개 (시스테인 + 인슐린 및 시스틴 + 인슐린)는 추가 인슐린을 세포 배양 주기 동안 3회 또는 6회 첨가하여, 25 mg/L 또는 40 mg/L의 최종 양을 제공하도록 하였다 (표 C). 상기 세포를 제1일에 37℃에서 배양하였고, 그 온도를 연속해서, 제1일에 35℃로, 제8일에는 33℃로, 및 제10일에는 31℃로 하향 이동시켰다. 역가 개선은 대조군과 비교해서 증가 %로써 정량화하였다. 시스테인 (Cys)을 시스틴 (Cys-Cys)으로 대체시키면, 대조군과 비교해서 역가가 11% 정도 개선되었다. 인슐린 첨가의 영향을 또한, 시스틴 (Cys-Cys)을 이용하여 만든 기초 배지에서 관찰하였다.
<표 C>
프로토콜 및 결과의 요약
Figure pct00009
실시예 3: 포유동물 세포주에 의해 생산된 베바시주맙의 양에 대한 인슐린 첨가의 영향
베바시주맙을 생산하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 다양한 양의 인슐린을 함유하는 세포 배양 배지에서 배양하였고, 생산된 베바시주맙의 양에 대한 인슐린 첨가의 영향을 평가하였다. 베바시주맙의 생산은 기초 배지에 세포를 접종함으로써 세포 배양물에서 개시하였다. 접종한 후, 배지 (즉, 초기 세포 배양 배지)는 300 nM 황산구리 (CuSO4), 1% 동물 가수분해물 및 0.25% 식물 가수분해물, 및 1.3 mM 시스틴을 함유하였다. 상기 배지는 또한, 접종 후 10 mg/L 또는 20 mg/L의 인슐린을 함유하였다 (표 D). 생물 반응기에서 14일 세포 배양 주기 경과에 따른 제3일에 배치 공급 배지를 첨가하거나 또는 2개의 배치 공급 배지를 첨가하였다 (하나의 배치 공급은 제3일에 첨가하였고 제2 배치 공급은 제6일에 첨가하였다). 일부 세포 배양물에 추가 인슐린을 세포 배양 주기 동안 1회 내지 6회 공급하여, 14일 세포 배양 주기가 끝날 무렵 25 mg/L 내지 85 mg/L의 누적량의 인슐린을 세포 배양물에 제공하도록 하였다 (표 D). 상기 세포를 제1일에 37℃에서 배양하였고, 그 온도를 연속해서, 제1일에 35℃로, 제8일에는 33℃로, 및 제10일에는 31℃로 하향 이동시켰다. 2가지 대표적인 실험에서 상이한 배양물 전반에 걸쳐 역가 개선을 비교하였는데, 그 결과, 25 mg/L의 누적량의 인슐린을 위해 제3일에 인슐린을 첨가한 초기 세포 배양 배지 중의 10 mg/L 인슐린이 가장 높은 역가 수율을 가져다준 것으로 결정되었다 [도 1A (하나의 배치 공급) 및 1B (2개의 배치 공급)]. 추가 인슐린이 보충되지 않은 초기 세포 배양 배지 중의 20 mg/mL 인슐린을 함유하는 세포 배양물은, 초기 세포 배양 배지 중의 10 mg/mL 인슐린을 갖는 배양물과 거의 동등한 수준의 역가 수율을 명확히 보여주었고; 세포 배양 주기 동안 첨가된 추가 인슐린은, 초기 세포 배양 배지 중의 인슐린이 역가 수율을 증가시키는데 중요한 요인이었다는 것을 표시한다 (표 D, 도 1A 및 1B).
<표 D>
예시적인 인슐린 첨가 프로토콜
Figure pct00010
실시예 4: 포유동물 세포주에 의해 생산된 베바시주맙의 양에 대한 추가의 배치 배지 공급의 영향
베바시주맙을 생산하는 CHO 세포의 4가지 상이한 샘플을 세포 배양 배지에서 배양하였고, 1개 또는 2개의 배치 배지 공급을 공급하여, 생산된 베바시주맙의 양에 대한 영향을 결정하였다. 베바시주맙의 생산은 기초 배지에 세포를 접종함으로써 세포 배양물에서 개시하였다. 접종한 후, 배지 (즉, 초기 세포 배양 배지)는 300 nM 황산구리 (CuSO4), 1% 동물 가수분해물 및 0.25% 식물 가수분해물, 및 1.3 mM 시스틴을 함유하였다. 하나의 프로토콜에서는, 생물 반응기에서 14일 세포 배양 주기 경과에 따른 제3일에 배치 공급 배지를 첨가하였다. 제2 프로토콜에서는, 생물 반응기에서 14일 세포 배양 주기 경과에 따른 제3일 및 제6일에 배치 공급 배지를 첨가하였다 (표 E). 제3일에 전달된 배치 공급 배지는 2.5% 동물 가수분해물 및 0.625% 식물 가수분해물을 함유하였고, 이를 125 ml/L의 부피로 세포 배양물 내로 첨가하였다. 제6일에 전달된 배치 공급 배지는 7.5 mM 시스테인 및 7.5 mM 시스틴을 함유하였고, 이를 90 ml/L의 부피로 세포 배양물 내로 첨가하였다. 따라서, 세포 배양물은 상기 공급 후에 시스틴 농도 상의 0.62 mM의 증가를 수반하였다. 상기 세포를 제1일에 37℃에서 배양하였고, 그 온도를 연속해서, 제1일에 35℃로, 제8일에는 33℃로, 및 제10일에는 31℃로 하향 이동시켰다. 제6일에 제2 공급을 받은 세포 배양물에서 역가 개선이 관찰되었는데, 1개 공급만을 공급한 배양물은 평균 역가를 명확히 보여주었고, 2개 공급 공정으로 인해, 0.3 g/L 이하의 역가 증가 (약 20% 역가 증가)가 초래되었다. 제14일 바이오매스 축적 (도 2A) 및 역가 (도 2B)의 측정은, 제6일의 제2 공급이 수율을 개선시켰고 이러한 제2 공급이 세포 연령이 더 높은 배양물 (여기서, 더 높은 성장과 초기의 생존율 감소가 관찰되었다)에 대해 더 유의적이었다는 것을 표시하였다.
<표 E>
예시적인 배치 공급 첨가 프로토콜
Figure pct00011
상기 언급된 결과를 분석한 결과, 베바시주맙을 생산하는 CHO 세포를 배양하는 새로운 공정의 개발이 제공되었다. 이러한 새로운 공정은 10 mg/L 인슐린을 함유하는 초기 세포 배양 배지를 사용하였을 뿐만 아니라 시스테인 대신 시스틴을 사용하였으며, 세포 배양 동안 제3일 및 제6일에 배치 공급을 사용하였고, 세포 배양 제3일에 인슐린을 첨가하였다 (표 F, 프로토콜 2). 이들 성분을 세포 배양 공정에 첨가하면, 역가가 약 60% 정도까지 증가하였다 (프로토콜 1과 비교된 바와 같은, 도 3 및 표 F, 프로토콜 2 참조).
<표 F>
새로운 세포 배양 공정
Figure pct00012

Claims (271)

  1. 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 세포 배양 배지는 구리, 인슐린 및 시스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함하고, 상기 세포는 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 것인, 베바시주맙 또는 그의 단편의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리 및 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리 및 시스틴을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린 및 시스틴을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리, 인슐린 및 시스틴을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물, 동물-유래 가수분해물, 또는 식물-유래 가수분해물과 동물-유래 가수분해물 둘 다를 추가로 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 35.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 25 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 69 nM 내지 약 1,000 nM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 325 nM 내지 약 375 nM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 325 nM 내지 약 350 nM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 330 nM, 335 nM, 339 nM, 340 nM, 345 nM 또는 350 nM 중 어느 하나의 농도로 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 339 nM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 시스틴을 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 시스틴을 약 1.0 mM 내지 약 1.6 mM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 시스틴을 약 1.2 mM 내지 약 1.4 mM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 시스틴을 약 1.3 mM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물을 약 6.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물을 약 8.0 g/L 내지 약 12.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물을 약 9.0 g/L 내지 약 11.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물을 약 13 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물을 약 1.0 g/L 내지 약 10.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물을 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물을 약 2.25 g/L 내지 약 2.75 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물을 약 3.1 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물과 식물-유래 가수분해물 둘 다를 포함하고, 동물-유래 가수분해물이 식물-유래 가수분해물 보다 더 많은 양으로 존재하는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 포함하고, 추가량의 인슐린을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 1회 첨가하는 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 3회 이상 첨가하는 것인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 6회 이상 첨가하는 것인 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  36. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  37. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  38. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 35.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  39. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  40. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 15 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.5 내지 약 2.0 mM 시스테인을 제공하는 양으로 시스테인을 첨가하는 것인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.8 mM 시스테인을 제공하는 양으로 시스테인을 첨가하는 것인 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 시스틴을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.1 내지 약 1.5 mM 시스틴을 제공하는 양으로 시스틴을 첨가하는 것인 방법.
  46. 제44항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.2 mM 시스틴을 제공하는 양으로 시스틴을 첨가하는 것인 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 약 28℃ 내지 약 37℃의 범위의 온도에서 배양하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 세포를 약 31℃ 내지 약 35℃의 범위의 온도에서 배양하는 것인 방법.
  49. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 제1 기간 동안에 약 35℃의 제1 온도에서 배양하고, 제2 기간 동안에 약 33℃의 제2 온도에서 배양하고, 제3 기간 동안에 약 31℃의 제3 온도에서 배양하는 것인 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 베바시주맙 또는 그의 단편이 세포 배양 배지 내로 분비되는 것인 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양물로부터 베바시주맙 또는 그의 단편을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편.
  53. (i) 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  54. 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를, 구리, 인슐린 및 시스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 포유동물 세포를 배양하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리 및 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  56. 제54항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리 및 시스틴을 포함하는 것인 방법.
  57. 제54항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린 및 시스틴을 포함하는 것인 방법.
  58. 제54항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리, 인슐린 및 시스틴을 포함하는 것인 방법.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물, 동물-유래 가수분해물, 또는 식물-유래 가수분해물과 동물-유래 가수분해물 둘 다를 추가로 포함하는 것인 방법.
  60. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  61. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  62. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  63. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 35.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  64. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  65. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 25 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  66. 제54항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 69 nM 내지 약 1,000 nM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  67. 제54항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 325 nM 내지 약 375 nM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  68. 제54항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 325 nM 내지 약 350 nM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  69. 제54항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 330 nM, 335 nM, 339 nM, 340 nM, 345 nM 또는 350 nM 중 어느 하나의 농도로 포함하는 것인 방법.
  70. 제54항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 339 nM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  71. 제54항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 시스틴을 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  72. 제54항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 시스틴을 약 1.0 mM 내지 약 1.6 mM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  73. 제54항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 시스틴을 약 1.2 mM 내지 약 1.4 mM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  74. 제54항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 시스틴을 약 1.3 mM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  75. 제54항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물을 약 6.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  76. 제54항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물을 약 8.0 g/L 내지 약 12.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  77. 제54항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물을 약 9.0 g/L 내지 약 11.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  78. 제54항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물을 약 13 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  79. 제54항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물을 약 1.0 g/L 내지 약 10.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  80. 제54항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물을 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  81. 제54항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물을 약 2.25 g/L 내지 약 2.75 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  82. 제54항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물을 약 3.1 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  83. 제54항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물과 식물-유래 가수분해물 둘 다를 포함하고, 동물-유래 가수분해물이 식물-유래 가수분해물 보다 더 많은 양으로 존재하는 것인 방법.
  84. 제54항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 포함하고, 추가량의 인슐린을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  85. 제84항에 있어서, 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 1회 첨가하는 것인 방법.
  86. 제84항에 있어서, 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 3회 이상 첨가하는 것인 방법.
  87. 제84항에 있어서, 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 6회 이상 첨가하는 것인 방법.
  88. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  89. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  90. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  91. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 35.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  92. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  93. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 15 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  94. 제54항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  95. 제94항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.5 내지 약 2.0 mM 시스테인을 제공하는 양으로 시스테인을 첨가하는 것인 방법.
  96. 제94항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.8 mM 시스테인을 제공하는 양으로 시스테인을 첨가하는 것인 방법.
  97. 제54항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 시스틴을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  98. 제97항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.1 내지 약 1.5 mM 시스틴을 제공하는 양으로 시스틴을 첨가하는 것인 방법.
  99. 제97항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.2 mM 시스틴을 제공하는 양으로 시스틴을 첨가하는 것인 방법.
  100. 제54항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물과 식물-유래 가수분해물 둘 다를 포함하고, 동물-유래 가수분해물이 식물-유래 가수분해물 보다 더 많은 양으로 존재하는 것인 방법.
  101. 제54항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 약 28℃ 내지 약 37℃의 범위의 온도에서 배양하는 것인 방법.
  102. 제101항에 있어서, 세포를 약 28℃ 내지 약 35℃의 범위의 온도에서 배양하는 것인 방법.
  103. 제54항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 제1 기간 동안에 약 35℃의 제1 온도에서 배양하고, 제2 기간 동안에 약 33℃의 제2 온도에서 배양하고, 제3 기간 동안에 약 31℃의 제3 온도에서 배양하는 것인 방법.
  104. 제54항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 베바시주맙 또는 그의 단편이 세포 배양 배지 내로 분비되는 것인 방법.
  105. 제54항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포를 이러한 세포의 성장기 동안 세포 배양 배지와 접촉시키는 것인 방법.
  106. 제54항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포를 이러한 세포의 생산기 동안 세포 배양 배지와 접촉시키는 것인 방법.
  107. 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는데 사용하기 위한 세포 배양 배지를 보충시키기 위한 키트이며, 다음 성분 (i) 내지 (iii): (i) 세포 배양 배지 중에 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L 인슐린을 제공하는 양의 인슐린; (ii) 세포 배양 배지 중에 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM 시스틴을 제공하는 양의 시스틴; 및 (iii) 세포 배양 배지 중에 약 69.0 nM 내지 약 1,000.0 nM 구리를 제공하는 양의 구리 중 적어도 2가지를 포함하는 키트.
  108. 제107항에 있어서, 식물-유래 가수분해물을 추가로 포함하는 키트.
  109. 제108항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 1.0 g/L 내지 약 10.0 g/L 식물-유래 가수분해물을 제공하는 양의 식물-유래 가수분해물을 포함하는 키트.
  110. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 동물-유래 가수분해물을 추가로 포함하는 키트.
  111. 제110항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 6.0 g/L 내지 약 20.0 g/L 동물-유래 가수분해물을 제공하는 양의 동물-유래 가수분해물을 포함하는 키트.
  112. 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 배양하는데 사용하기 위한 세포 배양 배지이며, 다음 성분 (i) 내지 (iii): (i) 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L 인슐린; (ii) 약 69.0 nM 내지 약 1,000.0 nM 구리; 및 (iii) 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하는 세포 배양 배지.
  113. 제112항에 있어서, (i) 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L 인슐린; 및 (ii) 약 69.0 nM 내지 약 1,000.0 nM 구리를 포함하는 세포 배양 배지.
  114. 제112항에 있어서, (i) 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L 인슐린; 및 (iii) 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM 시스틴을 포함하는 세포 배양 배지.
  115. 제112항에 있어서, (ii) 약 69.0 nM 내지 약 1,000.0 nM 구리; 및 (iii) 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM 시스틴을 포함하는 세포 배양 배지.
  116. 제112항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1.0 g/L 내지 약 10.0 g/L 식물-유래 가수분해물을 추가로 포함하는 세포 배양 배지.
  117. 제112항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 약 6.0 g/L 내지 약 20.0 g/L 동물-유래 가수분해물을 추가로 포함하는 세포 배양 배지.
  118. 제112항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서,
    약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L;
    약 10.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L;
    약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L;
    약 10.0 mg/L 내지 약 35.0 mg/L;
    약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L; 및
    약 10.0 mg/L
    로 이루어진 군으로부터 선택된 농도의 인슐린을 포함하는 세포 배양 배지.
  119. 제112항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서,
    약 69 nM 내지 약 1,000 nM;
    약 300 nM 내지 약 400 nM;
    약 325 nM 내지 약 375 nM;
    약 325 nM 내지 약 350 nM;
    약 330 nM, 335 nM, 339 nM, 340 nM, 345 nM 또는 350 nM 중 어느 하나; 및
    약 339 nM
    로 이루어진 군으로부터 선택된 농도의 구리를 포함하는 세포 배양 배지.
  120. 제112항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서,
    약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM;
    약 1.0 mM 내지 약 2.0 mM;
    약 1.0 mM 내지 약 1.6 mM;
    약 1.2 mM 내지 약 1.4 mM; 및
    약 1.3 mM
    로 이루어진 군으로부터 선택된 농도의 시스틴을 포함하는 세포 배양 배지.
  121. (a) 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포; 및 (b) 제112항 내지 제120항 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 배지를 포함하는 조성물.
  122. (a) 베바시주맙 또는 그의 단편; 및 (b) 제112항 내지 제120항 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 배지를 포함하는 조성물.
  123. 제122항에 있어서, 베바시주맙 또는 그의 단편이, 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포에 의해 상기 배지 내로 분비되는 것인 조성물.
  124. 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를, 인슐린, 구리 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 포유동물 세포로부터 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편의 양은, 인슐린, 구리 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 것과 비교해서 증강되는 것인, 상기 포유동물 세포로부터 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편의 양을 증강시키는 방법.
  125. 제124항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리 및 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  126. 제124항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리 및 시스틴을 포함하는 것인 방법.
  127. 제124항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린 및 시스틴을 포함하는 것인 방법.
  128. 제124항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리, 인슐린 및 시스틴을 포함하는 것인 방법.
  129. 제124항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물, 동물-유래 가수분해물, 또는 식물-유래 가수분해물과 동물-유래 가수분해물 둘 다를 추가로 포함하는 것인 방법.
  130. 제124항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  131. 제124항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  132. 제124항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  133. 제124항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 35.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  134. 제124항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  135. 제124항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 25.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  136. 제124항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 69 nM 내지 약 1,000 nM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  137. 제124항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 325 nM 내지 약 375 nM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  138. 제124항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 325 nM 내지 약 350 nM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  139. 제124항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 330 nM, 335 nM, 339 nM, 340 nM, 345 nM 또는 350 nM 중 어느 하나의 농도로 포함하는 것인 방법.
  140. 제124항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 339 nM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  141. 제124항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 시스틴을 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  142. 제124항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 시스틴을 약 1.0 mM 내지 약 1.6 mM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  143. 제124항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 시스틴을 약 1.2 mM 내지 약 1.4 mM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  144. 제124항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 시스틴을 약 1.3 mM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  145. 제124항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물을 약 6.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  146. 제124항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물을 약 8.0 g/L 내지 약 12.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  147. 제124항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물을 약 9.0 g/L 내지 약 11.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  148. 제124항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물을 약 13 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  149. 제124항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물을 약 1.0 g/L 내지 약 10.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  150. 제124항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물을 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  151. 제124항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물을 약 2.25 g/L 내지 약 2.75 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  152. 제124항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물을 약 3.1 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  153. 제124항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물과 식물-유래 가수분해물 둘 다를 포함하고, 동물-유래 가수분해물이 식물-유래 가수분해물 보다 더 많은 양으로 존재하는 것인 방법.
  154. 제124항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 포함하고, 추가량의 인슐린을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  155. 제154항에 있어서, 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 1회 첨가하는 것인 방법.
  156. 제154항에 있어서, 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 3회 이상 첨가하는 것인 방법.
  157. 제154항에 있어서, 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 6회 이상 첨가하는 것인 방법.
  158. 제154항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  159. 제154항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  160. 제154항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  161. 제154항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 35.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  162. 제154항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  163. 제154항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 15.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  164. 제124항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  165. 제164항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.5 내지 약 2.0 mM 시스테인을 제공하는 양으로 시스테인을 첨가하는 것인 방법.
  166. 제164항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.8 mM 시스테인을 제공하는 양으로 시스테인을 첨가하는 것인 방법.
  167. 제124항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 시스틴을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  168. 제167항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.1 내지 약 1.5 mM 시스틴을 제공하는 양으로 시스틴을 첨가하는 것인 방법.
  169. 제167항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.2 mM 시스틴을 제공하는 양으로 시스틴을 첨가하는 것인 방법.
  170. 제124항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 약 28℃ 내지 약 37℃의 범위의 온도에서 배양하는 것인 방법.
  171. 제170항에 있어서, 세포를 약 31℃ 내지 약 35℃의 범위의 온도에서 배양하는 것인 방법.
  172. 제124항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 제1 기간 동안에 약 35℃의 제1 온도에서 배양하고, 제2 기간 동안에 약 33℃의 제2 온도에서 배양하고, 제3 기간 동안에 약 31℃의 제3 온도에서 배양하는 것인 방법.
  173. 제124항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 베바시주맙 또는 그의 단편이 세포 배양 배지 내로 분비되는 것인 방법.
  174. 제124항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양물로부터 베바시주맙 또는 그의 단편을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  175. 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를, 인슐린, 구리 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하는 세포 배양 배지에서 배양하는 방법이며, 여기서 상기 포유동물 세포로부터 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편의 양은, 인슐린, 구리 및 시스틴 중 적어도 2가지를 포함하지 않는 세포 배양 배지에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 것과 비교해서 증강되는 것인, 배양 방법.
  176. 제175항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리 및 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  177. 제175항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리 및 시스틴을 포함하는 것인 방법.
  178. 제175항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린 및 시스틴을 포함하는 것인 방법.
  179. 제175항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리, 인슐린 및 시스틴을 포함하는 것인 방법.
  180. 제175항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물, 동물-유래 가수분해물, 또는 식물-유래 가수분해물과 동물-유래 가수분해물 둘 다를 추가로 포함하는 것인 방법.
  181. 제175항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  182. 제175항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  183. 제175항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  184. 제175항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 35.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  185. 제175항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  186. 제175항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 약 25.0 mg/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  187. 제175항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 69 nM 내지 약 1,000 nM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  188. 제175항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 325 nM 내지 약 375 nM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  189. 제175항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 325 nM 내지 약 350 nM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  190. 제175항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 330 nM, 335 nM, 339 nM, 340 nM, 345 nM 또는 350 nM 중 어느 하나의 농도로 포함하는 것인 방법.
  191. 제175항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 구리를 약 339 nM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  192. 제175항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 시스틴을 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  193. 제175항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 시스틴을 약 1.0 mM 내지 약 1.6 mM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  194. 제175항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 시스틴을 약 1.2 mM 내지 약 1.4 mM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  195. 제175항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 시스틴을 약 1.3 mM의 농도로 포함하는 것인 방법.
  196. 제175항 내지 제195항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물을 약 6.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  197. 제175항 내지 제195항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물을 약 8.0 g/L 내지 약 12.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  198. 제175항 내지 제195항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물을 약 9.0 g/L 내지 약 11.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  199. 제175항 내지 제195항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물을 약 13 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  200. 제175항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물을 약 1.0 g/L 내지 약 10.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  201. 제175항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물을 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  202. 제175항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물을 약 2.25 g/L 내지 약 2.75 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  203. 제175항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 식물-유래 가수분해물을 약 3.1 g/L의 농도로 포함하는 것인 방법.
  204. 제175항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물과 식물-유래 가수분해물 둘 다를 포함하고, 동물-유래 가수분해물이 식물-유래 가수분해물 보다 더 많은 양으로 존재하는 것인 방법.
  205. 제175항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 인슐린을 포함하고, 추가량의 인슐린을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  206. 제205항에 있어서, 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 1회 첨가하는 것인 방법.
  207. 제205항에 있어서, 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 3회 이상 첨가하는 것인 방법.
  208. 제205항에 있어서, 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 6회 이상 첨가하는 것인 방법.
  209. 제205항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  210. 제205항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  211. 제205항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  212. 제205항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 35.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  213. 제205항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 10.0 mg/L 내지 약 25.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  214. 제205항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지 중의 인슐린을 약 15.0 mg/L의 농도로 제공하는 양으로 추가량의 인슐린을 첨가하는 것인 방법.
  215. 제175항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  216. 제215항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.5 내지 약 2.0 mM 시스테인을 제공하는 양으로 시스테인을 첨가하는 것인 방법.
  217. 제215항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.8 mM 시스테인을 제공하는 양으로 시스테인을 첨가하는 것인 방법.
  218. 제175항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, 시스틴을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  219. 제218항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.1 내지 약 1.5 mM 시스틴을 제공하는 양으로 시스틴을 첨가하는 것인 방법.
  220. 제218항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.2 mM 시스틴을 제공하는 양으로 시스틴을 첨가하는 것인 방법.
  221. 제175항 내지 제220항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 약 28℃ 내지 약 37℃의 범위의 온도에서 배양하는 것인 방법.
  222. 제221항에 있어서, 세포를 약 31℃ 내지 약 35℃의 범위의 온도에서 배양하는 것인 방법.
  223. 제175항 내지 제220항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 제1 기간 동안에 약 35℃의 제1 온도에서 배양하고, 제2 기간 동안에 약 33℃의 제2 온도에서 배양하고, 제3 기간 동안에 약 31℃의 제3 온도에서 배양하는 것인 방법.
  224. 제175항 내지 제223항 중 어느 한 항에 있어서, 베바시주맙 또는 그의 단편이 세포 배양 배지 내로 분비되는 것인 방법.
  225. 제175항 내지 제223항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양물로부터 베바시주맙 또는 그의 단편을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  226. 베바시주맙 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 포유동물 세포를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 세포 배양 주기 내의 초기 세포 배양 배지는 약 69 nM 내지 약 1,000 nM의 농도의 구리, 약 1.0 mg/L 내지 약 100.0 mg/L의 농도의 인슐린, 및 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM의 농도의 시스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상의 성분을 포함하고, 상기 세포는 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 것인, 베바시주맙 또는 그의 단편을 생산하는 방법.
  227. 제226항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 (1) 구리 및 인슐린; (2) 구리 및 시스틴; (3) 인슐린 및 시스틴; 또는 (4) 구리, 인슐린 및 시스틴을 포함하는 것인 방법.
  228. 제226항 또는 제227항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 약 10.0 mg/L 내지 약 50.0 mg/L의 농도의 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  229. 제228항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 약 10.0 mg/L 내지 약 20.0 mg/L의 농도의 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  230. 제228항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 약 10.0 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L 및 25 mg/L 중 어느 하나의 농도의 인슐린을 포함하는 것인 방법.
  231. 제226항 내지 제230항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 약 325 nM 내지 약 375 nM의 농도의 구리를 포함하는 것인 방법.
  232. 제226항 내지 제230항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 약 325 nM 내지 약 350 nM의 농도의 구리를 포함하는 것인 방법.
  233. 제226항 내지 제230항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 약 330 nM, 335 nM, 339 nM, 340 nM, 345 nM 및 350 nM 중 어느 하나의 농도의 구리를 포함하는 것인 방법.
  234. 제226항 내지 제233항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 약 0.7 mM 내지 약 2.0 mM의 농도의 시스틴을 포함하는 것인 방법.
  235. 제226항 내지 제233항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 약 1.0 mM 내지 약 1.6 mM의 농도의 시스틴을 포함하는 것인 방법.
  236. 제226항 내지 제233항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 약 1.0 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 mM, 1.5 mM 및 1.6 mM 중 어느 하나의 농도의 시스틴을 포함하는 것인 방법.
  237. 제226항 내지 제236항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물을 포함하는 것인 방법.
  238. 제226항 내지 제236항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 약 6.0 g/L 내지 약 20.0 g/L의 농도의 동물-유래 가수분해물을 포함하는 것인 방법.
  239. 제226항 내지 제236항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 약 8.0 g/L 내지 약 12.0 g/L의 농도의 동물-유래 가수분해물을 포함하는 것인 방법.
  240. 제226항 내지 제236항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 약 9.0 g/L 내지 약 11.0 g/L의 농도의 동물-유래 가수분해물을 포함하는 것인 방법.
  241. 제226항 내지 제236항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 약 13 g/L의 농도의 동물-유래 가수분해물을 포함하는 것인 방법.
  242. 제226항 내지 제241항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 약 1.0 g/L 내지 약 10.0 g/L의 농도의 식물-유래 가수분해물을 포함하는 것인 방법.
  243. 제226항 내지 제242항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L의 농도의 식물-유래 가수분해물을 포함하는 것인 방법.
  244. 제226항 내지 제243항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 약 2.25 g/L 내지 약 2.75 g/L의 농도의 식물-유래 가수분해물을 포함하는 것인 방법.
  245. 제226항 내지 제244항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 약 2.5 g/L의 농도의 식물-유래 가수분해물을 포함하는 것인 방법.
  246. 제226항 내지 제245항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물-유래 가수분해물과 식물-유래 가수분해물 둘 다를 포함하고, 동물-유래 가수분해물이 식물-유래 가수분해물 보다 더 많은 양으로 존재하는 것인 방법.
  247. 제226항 내지 제246항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 인슐린을 포함하고, 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  248. 제247항에 있어서, 추가량의 인슐린을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상 또는 6회 이상 첨가하는 것인 방법.
  249. 제248항에 있어서, 매회 첨가된 인슐린이 약 5 mg/L 내지 약 25 mg/L인 방법.
  250. 제248항에 있어서, 매회 첨가된 인슐린이 약 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L 및 25 mg/L 중 어느 하나인 방법.
  251. 제248항 내지 제250항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 주기 동안 첨가된 인슐린의 누적량이 약 20 mg/L 내지 약 100 mg/L인 방법.
  252. 제251항에 있어서, 세포 배양 주기 동안 첨가된 인슐린의 누적량이 약 20 mg/L, 25 mg/L, 30 mg/L, 35 mg/L, 40 mg/L, 45 mg/L, 50 mg/L, 55 mg/L, 60 mg/L, 65 mg/L, 70 mg/L, 75 mg/L, 80 mg/L 및 85 mg/L 중 어느 하나인 방법.
  253. 제226항 내지 제252항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 세포 배양 배지가 시스틴을 포함하고, 추가량의 시스틴을 세포 배양 주기 동안 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  254. 제253항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.1 내지 약 1.5 mM 추가 시스틴을 제공하는 양으로 시스틴을 첨가하는 것인 방법.
  255. 제254항에 있어서, 세포 배양 배지 중에 약 0.4 내지 약 0.7 mM 추가 시스틴을 제공하는 양으로 시스틴을 첨가하는 것인 방법.
  256. 제253항 내지 제255항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 주기 동안 배치 공급으로 시스틴을 첨가하는 것인 방법.
  257. 제226항 내지 제256항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 주기 동안 1개 이상의 배치 공급을 추가로 포함하는 방법.
  258. 제257항에 있어서, 세포 배양 주기 동안 2개, 3개 또는 4개의 배치 공급을 포함하는 방법.
  259. 제257항 또는 제259항에 있어서, 배치 공급 배지가 동물-유래 가수분해물 및/또는 식물-유래 가수분해물을 포함하는 것인 방법.
  260. 제226항 내지 제259항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 주기 동안 배지의 온도를 배양 시작 온도와 비교해서 약 2℃ 이상, 약 3℃ 이상, 약 4℃ 이상, 또는 약 5℃ 이상 감소시키는 것인 방법.
  261. 제260항에 있어서, 세포 배양 주기 동안 배지의 온도를 1회 이상 또는 2회 이상 감소시키는 것인 방법.
  262. 제261항에 있어서, 배양을 시작한 후 제8일 및 제10일에 온도를 감소시키는 것인 방법.
  263. 제226항 내지 제262항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 약 31℃ 내지 약 35℃의 범위의 온도에서 배양하는 것인 방법.
  264. 제263항에 있어서, 세포를 제1 기간 동안에 약 35℃의 제1 온도에서 배양하고, 제2 기간 동안에 약 33℃의 제2 온도에서 배양하고, 제3 기간 동안에 약 31℃의 제3 온도에서 배양하는 것인 방법.
  265. 제226항 내지 제264항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 약 7.0 내지 약 7.3의 pH를 갖는 배지에서 배양하는 것인 방법.
  266. 제226항 내지 제265항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 약 10 mg/L 인슐린, 약 325 nM 내지 약 350 nM 구리, 및 약 1.3 mM 시스틴을 포함하는 초기 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계; (b) 제1 배치 공급과 인슐린 공급을 상기 세포 배양 배지에 제공하여, 배양을 시작한 후 제3일에 약 15 mg/L의 농도의 추가 인슐린을 제공하도록 하는 단계; 및 (c) 시스틴을 포함하는 제2 배치 공급을 상기 세포 배양 배지에 제공하여, 배양을 시작한 후 제6일에 약 0.4 mM 내지 약 0.7 mM의 농도의 추가 시스틴을 제공하도록 하는 단계를 포함하며, 여기서 세포를 약 35℃의 초기 온도에서 배양하고, 온도를 배양을 시작한 후 제8일에 약 33℃로 감소시키고 제10일에 약 31℃로 추가로 감소시키는 것인 방법.
  267. 제226항 내지 제266항 중 어느 한 항에 있어서, 베바시주맙 또는 그의 단편이 세포 배양 배지 내로 분비되는 것인 방법.
  268. 제226항 내지 제267항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양물로부터 베바시주맙 또는 그의 단편을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  269. 제226항 내지 제268항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포인 방법.
  270. 제226항 내지 제269항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편.
  271. (i) 제226항 내지 제269항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 베바시주맙 또는 그의 단편 및 (ii) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
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