KR20150043271A - 생물약제학적 제제로부터 플로우 쓰루 모드로 단백질 응집물의 제거 - Google Patents

생물약제학적 제제로부터 플로우 쓰루 모드로 단백질 응집물의 제거 Download PDF

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Abstract

본 발명은 샘플로부터 단백질 응집물을 플로우 쓰루 모드로 제거하기 위한 신규 조성물과 방법을 제공한다.

Description

생물약제학적 제제로부터 플로우 쓰루 모드로 단백질 응집물의 제거{Removal of protein aggregaates from biopharmaceutical preparations in a flow-through mode}
관련 출원
본 출원은 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함되는, 2012년 3월 12일 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/609,533호 및 2012년 6월 29일 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/666,578호를 우선권 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 목적하는 생성물을 함유하는 생물약제학적 제제로부터 플로우 쓰루 모드(flow through mode)로 단백질 응집물을 제거하는 방법에 관한 것이다.
단백질 응집물은 목적하는 생성물, 예컨대 치료성 단백질 또는 항체 분자를 함유하는 생물약제학적 제제로부터 제거될 필요가 있는 중요한 불순물 중의 하나이다. 예를 들어, 단백질 응집물 및 기타 오염물질은 상기 생성물이 진단, 치료 또는 기타 적용에서 사용될 수 있기 전에 목적하는 생성물을 함유하는 생물약제학적 제제로부터 제거되어야 한다. 또한, 단백질 응집물은 하이브리도마 세포주로부터 수집된 항체 제제에서 흔히 발견되며, 의도하는 목적을 위해 항체 제제를 사용하기 전에 제거되어야 한다. 이는 치료 적용의 경우 및 식품의약청(Food and Drug Administration) 인가를 받아야 하는 경우에 특히 중요하다.
단백질 응집물의 제거는 흔히 단량체 분자인 생물약제학적 제제 중의 단백질 응집물과 목적하는 생성물 사이에 흔히 유사성이 있어 도전적일 수 있다. 당해 분야에는 생물약제학적 제제로부터 단백질 응집물을 제거하기 위한 다수의 상이한 방법, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피가 존재한다.
목적하는 생성물로부터 단백질 응집물을 분리하기 위한 몇 개의 결합 및 용출 크로마토그래피 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, 히드록시아파타이트는 단백질, 핵산뿐만 아니라 항체를 크로마토그래피 분리하는데 사용되어 왔다. 히드록시아파타이트 크로마토그래피에서, 상기 컬럼은 보통 평형화되며, 또 샘플은 낮은 농도의 포스페이트 완충액으로 적용되며 또 흡착된 단백질은 포스페이트 완충액의 농도 구배로 용출된다(참고: 예컨대 Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529(2000)). 그러나, 일부 경우에서, 연구자들은 히드록시아파타이트로부터 항체를 선택적으로 용출할 수 없거나 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피가 충분히 순수한 생성물을 초래하지 않는다는 것을 발견하였다(참고: 예컨대 Jungbauer, J. 크로마토그래피 476:257-268(1989); Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529(2000)).
또한, 시중에서 구입할 수 있는 크로마토그래피 수지인 세라믹 히드록시아파타이트(CHT)는 수지포맷으로 단백질 응집물의 제거에 약간 성공을 거두며 사용되어 왔으나(BIORAD CORP, 참고: 예컨대 미국 특허 공개번호 WO/2005/044856호), 이것은 일반적으로 값비싸고 또 단백질 응집물에 대한 낮은 결합용량을 나타낸다.
결합 및 용출 양이온 교환 크로마토그래피 방법은 때때로 응집물 제거를 위한 산업에 이용되는 것으로 기재되어 있지만(참고: 예컨대 미국 특허 번호 6,620,918호), 단량체 수율과 응집물 제거 간의 바람직하지 않은 균형이 이루어질 필요가 있음이 흔히 관찰된다. 모노클로날 항체 용액으로부터 응집물을 제거하는 방법에 대한 최근의 연구에서, 결합 및 용출 크로마토그래피 모드에 관하여 "양이온 교환 크로마토그래피가 응집물과 단량체를 분리하기 위한 유용한 방법일 수 있지만 고용량의 고수율을 얻는 단계를 개발하기는 어려울 수 있음"이 밝혀졌다. 참고: 예컨대 Aldington et al., J. Chrom. B, 848(2007) 64-78.
당해 분야에 공지된 결합 및 용출 방법 및 크기 배제 크로마토그래피 방법과 비교하여, 플로우 쓰루 모드(flow-through mode)의 단백질 정제는 더 우수한 경제성, 단순성, 시간 및 완충액 절약으로 인하여 더욱 바람직한 것으로 생각된다.
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 매질을 기본한 플로우 쓰루식 응집물 제거를 실시하기 위하여 종래 기술에서 여러가지 시도되었다(참고: 예를 들어 미국 특허 번호 7,427,659호). 그러나, HIC-기본한 분취(preparative) 분리는 일반적으로 어려운 공정 개발, 좁은 작용 윈도우(operating window), 및 완충액에 요구되는 고농도의 염으로 인하여 협소한 적용성을 갖는다.
약 분배 크로마토그래피(Weak Partitioning 크로마토그래피: WPC)는 생성물이 결합-용출 크로마토그래피 경우에서보다는 약하게 결합하지만 플로우 쓰루 크로마토그래피의 경우에서보다는 더 강하게 결합하는 다른 양태의 크로마토그래피 작업이다(참고: 예를 들어 미국 특허 번호 8,067,182호); 그러나, WPC는 또한 좁은 작용 윈도우 및 결합 및 용출 방법에 비하여 불순물 제거를 위한 더 낮은 결합용량을 비롯한 그와 관련된 특정 결점을 갖는다.
한편, 종래 기술에 기재된 플로우 쓰루 방법의 일부는 응집물에 결합하는 것으로 보고되어 있어, 목적하는 생성물에 관련된 결합 응집물에 대한 특이성이 낮은 것으로 보인다. 또한, 예를 들어, 이량체, 삼량체 및 사량체와 같은 저차(lower order) 단백질 응집물을 결합하는 높은 특이성을 나타내는 종래 기술의 방법은 알려져 있지 않은 것으로 보인다.
발명의 요약
본 발명은 생물약제학적 조성물 중의 단백질 응집물로부터 목적하는 생성물, 예를 들어, 치료성 항체 또는 단량체성 단백질을 생성하기 위한 신규하고 개선된 조성물뿐만 아니라 이러한 조성물을 사용하는 플로우 쓰루 방법을 제공한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 단량체성 단백질로부터 일반적으로 분리하기 어려운 예를 들어, 이량체, 삼량체 및 사량체와 같은 저차 단백질 응집물로부터 목적하는 단량체성 단백질을 분리하기에 특히 유용하다.
본 발명은 적어도 부분적으로는 목적 생성물(즉, 단량체 분자)에 비하여 단백질 응집물을 플로우 쓰루 모드로 표면에 결합시키는 선택성을 증가시키는 것을 기본으로 함으로써 목적 생성물로부터 단백질 응집물을 분리하는 것이다. 본 발명은 특정 밀도의 양이온 교환 결합기를 갖는 표면의 독특한 디자인에 의해 상술한 것을 달성하며, 그에 의해 단량체 분자에 비하여 다수의 단백질 응집물을 표면에 용이하게 결합시킬 수 있다.
본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 샘플을 약 1 내지 약 30 mM 밀도로 부착되어 있는 하나 이상의 양이온 교환 결합기를 포함하고, 단백질 응집물을 선택적으로 결합하는 고체 지지체와 접촉시킴으로써 단백질 응집물로부터 목적하는 단량체성 단백질을 분리하는 것을 포함하는, 샘플 중의 단백질 응집물로부터 목적하는 단량체성 단백질을 분리하는 플로우 쓰루 크로마토그래피 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용된 고체 지지체는 크로마토그래피 수지, 막, 다공성 모노리쓰(monolith), 직물 및 부직포로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 상기 고체 지지체는 크로마토그래피 수지 또는 다공성 비드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 고체 지지체는 다공성 폴리비닐에테르 중합체 비드이거나 또는 다공성 가교된 폴리메타크릴레이트 중합체 비드이다.
다양한 실시양태에서, 상기 크로마토그래피 수지 또는 다공성 비드는 약 50 미크론, 또는 약 10 내지 약 500 미크론 사이, 또는 약 20 내지 약 140 미크론 사이, 또는 약 30 내지 약 70 미크론의 평균 입자 크기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 고체 지지체는 크로마토그래피 수지 또는 다공성 비드로부터 선택되며, 이들의 평균 입자 크기는 약 10 미크론 내지 500 미크론 사이, 또는 20 내지 200 미크론 사이, 또는 20 내지 90 미크론 사이이다. 특정 실시양태에서, 크로마토그래피 수지 또는 다공성 비드는 약 50 미크론의 평균 입자 크기를 갖는다. 일반적으로, 선택성은 입자 크기 감소에 따라 향상할 수 있다. 당업자들은 평균 입자 크기는 특정 적용분야 또는 공정의 필요를 기본으로 하여 단백질 응집물 결합을 위한 선택성을 어느 정도 유지하면서 조절할 수 있음을 잘 알고 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 단백질 응집물은 예를 들어, 이량체, 삼량체 및 사량체와 같은 저차 단백질 응집물이다.
다른 실시양태에서, 상기 단백질 응집물은 예를 들어, 오량체 및 그 이상의 고차물과 같은 고차 단백질 응집물이다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용된 상기 양이온 교환기는 설폰산기(sulfonic group), 설페이트기, 포스폰산기(phosphonic group), 인산기(phosphoric group), 및 카복시기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 상기 단량체성 단백질은 항체이다. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이다. 다른 실시양태에서, 상기 단량체성 단백질은 재조합 단백질, 예를 들어, Fc-융합 단백질이다. 더 다른 실시양태에서, 상기 단량체성 단백질은 비-항체 분자이다.
본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 샘플을 약 1 내지 약 30 mM 밀도로 부착되어 있는 하나 이상의 양이온 교환 결합기를 포함하고, 단량체에 비하여 단백질 응집물을 약 10 더 큰 선택성으로 단백질 응집물을 결합하는 고체 지지체와 접촉시킴으로써 단백질 응집물로부터 목적하는 단백질을 분리하는 것을 포함하는, 샘플 중의 단백질 응집물로부터 목적하는 단량체성 단백질을 분리하는 플로우 쓰루 크로마토그래피 방법이 제공된다.
다른 실시양태에서,
(a) 목적하는 단백질 및 약 1 내지 약 20%의 단백질 응집물을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 상기 샘플을, 약 1 내지 약 30 mM 밀도로 부착되어 있는 하나 이상의 양이온 교환 결합기를 포함하는 고체 지지체와 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 샘플의 플로우 쓰루 유출물(effluent)을 수집하는 단계를 포함하며,
상기 유출물 중의 단백질 응집물의 농도는 (a)에서 응집물의 농도에 비하여 적어도 50% 정도 감소되는 것에 의해 샘플 중의 단백질 응집물의 농도를 감소시키는, 샘플 중의 단백질 응집물의 농도를 감소시키는 플로우 쓰루 크로마토그래피 방법이 제공된다.
본 발명의 방법에 따른 일부 실시양태에서, 유출물 중의 목적하는 단백질의 농도는 (a)에서 목적하는 단백질의 농도의 적어도 80%이다.
일부 실시양태에서, 상기 고체 지지체와 접촉된 응집물을 함유하는 샘플의 이온 도전성은 약 0.5 내지 약 10 mS/cm 범위 내이다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 목적하는 단백질(예컨대, 모노클로날 항체)를 정제하는 방법은 결합 및 용출 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 필요로 하지 않는다. 따라서, 이러한 방법은 용출 용액에 대한 염 부가의 필요성 및 뒤이은 희석 단계의 이용을 제거한다.
일부 실시양태에서, 도전성에서 증가를 필요로 하지 않는, 목적하는 단백질(예컨대, 모노클로날 항체)을 정제하는 방법이 제공된다. 따라서, 이러한 방법은 후속하는 플로우 쓰루 음이온 교환 단계를 실시하기 전에 도전성을 감소시키기 위하여 양이온 교환 단계 후의 희석을 필요로 하지 않는다.
양이온 교환기를 포함하고, 고체 지지체에 부착되어 있는 중합체도 본 발명에 포함된다.
일부 실시양태에서, 이러한 중합체는 다음 화학식 구조를 포함한다:
Figure pat00001
식 중에서, R1은 양이온 교환기이고; R2는 하전된 기를 함유하지 않는 지방족 또는 방향족 유기 잔기이며; R3은 2 이상의 중합체 사슬 사이의 하전되지 않은 지방족 또는 방향족 유기 링커이고; x, y, 및 z는 중합체 중의 각 단량체의 평균 몰 분획으로, y>x 이며; 또 기호 m은 유사한 중합체 사슬이 링커의 다른 말단에 부착되어 있는 것을 의미한다.
다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 중합체는 하기 화학식 구조를 포함한다:
Figure pat00002
식 중에서, x, y, 및 z는 중합체 중의 각 단량체의 평균 몰 분획으로, y>x 이며; 또 기호 m은 유사한 중합체 사슬이 링커의 다른 말단에 부착되어 있는 것을 의미한다.
더 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 중합체는 다음 화학식 구조를 포함하며, 상기 중합체는 공유 결합을 통하여 고체 지지체에 그라프트(grafted)된다:
Figure pat00003
식 중에서, R1은 양이온 교환기이고; R2는 하전된 기를 함유하지 않는 지방족 또는 방향족 유기 잔기이며; x 및 y는 중합체 중의 각 단량체의 평균 몰 분획으로, y>x임.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 중합체는 다음 화학식 구조를 포함하고 또 상기 중합체는 결합을 통하여 크로마토그래피 수지에 그라프트된다:
Figure pat00004
식 중에서, x 및 y는 중합체 중의 각 단량체의 평균 몰 분획으로, y>x임.
다양한 실시양태에서, 중합체는 고체 지지체에 부착되어 있다.
본 발명에 따른 다양한 실시양태에서, 목적 생성물을 함유하는 유출물은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 분리 방법에 처리되며, 상기 유출물은 20% 미만, 또는 15% 미만, 또는 10% 미만, 또는 5% 미만, 또는 2% 미만의 단백질 응집물을 함유한다.
본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및/또는 조성물은 하나 이상의 단백질 A 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 투석여과(diafiltration), 한외여과, 바이러스 제거 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피와 조합되어 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 조성물에 의해 선택적으로 제거되는 상기 단백질 응집물은 고분자량 응집물, 즉 단백질 오량체 및 그 이상의 고차물이다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 조성물에 의해 선택적으로 제거되는 상기 단백질 응집물은 단백질 이량체, 삼량체 및 사량체와 같은 저차 응집물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 양이온 교환 결합기를 포함하는 고체 지지체는 정제 공정의 플로우 쓰루 정제 공정 단계에 사용되며, 상기 플로우 쓰루 정제 공정 단계뿐만 아니라 전체 정제 공정은 연속적 방식으로 실시될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 상기 고체 지지체는 고체 지지체의 상류 및 하류 양쪽에서 다른 유형의 매질과 유체 소통되도록 연결될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 양이온 교환 결합기를 포함하는 고체 지지체는 상류에는 음이온 교환 크로마토그래피 매질에 연결되고 또 고체 지지체의 하류에는 바이러스 여과 매질에 연결된다. 특정 실시양태에서, 활성탄을 유통(플로우 쓰루)한 다음 음이온 교환 크로마토그래피 매질, 이어 하나 이상의 양이온 교환 결합기를 포함하는 고체 지지체를 통하고, 이어 바이러스 필터를 유통한다. 일부 실시양태에서, 정적 혼합기 및/또는 서지(surge) 탱크가 상기 음이온 교환 매질과 상기 하나 이상의 양이온 교환 결합기를 포함하는 고체 지지체 사이에 배치되어 pH 변화를 실시할 수 있다.
도 1은 당해 분야에 공지된 조성물과 비교하여 저 밀도의 양이온 교환 결합기를 갖는 조성물을 사용한 개선된 응집물 선택성의 개략도이다.
도 2a-2f는 본 발명에 의해 포함되는 다양한 조성물의 대표적인 화학식 구조를 도시한다. 도 2a-2d는 고체 지지체 상에 고정화된 가교된 중합체 구조를 도시하고; 도 2e-2h는 고체 지지체에 공유적으로 부착된 그라프트된(grafted) 중합체 구조를 도시한다. R1은 설폰산기, 설페이트기, 인산기, 포스폰산기 또는 카복시기와 같은 양이온 교환기이고; R2는 하전된 기를 함유하지 않는 지방족 또는 방향족 유기 잔기이며; R3은 2 이상의 중합체 사슬 사이의 하전되지 않은 지방족 또는 방향족 유기 링커이고; x, y, 및 z는 중합체 중의 각 단량체의 평균 몰 분획으로, y>x 이며; 또 기호 m은 유사한 중합체 사슬이 링커의 다른 말단에 부착되어 있는 것을 의미하며; R4는 NH 또는 0이고; R5는 -CH2-, -C2H4-, -C3H6-, -C(CH3)2-CH2-, -C6H4-와 같은 직쇄 또는 분기된 지방족 또는 방향족 기이며; R6은 중합체 사슬에 대한 NH, 0, 또는 S 링커를 함유하는 직쇄 또는 분기된 지방족 또는 방향족의 비하전된 기이고; 또 R7 및 R8은, 서로 독립해서, 하나 이상의 중성 지방족 및 방향족 유기 잔기를 함유하는 기로부터 선택되며 또 0, N, S, P, F, Cl, 등과 같은 헤테로원자를 함유할 수 있다.
도 3a는 Membrane 7, Membrane 8 또는 시중에서 입수가능한 막(Pall Mustang®S 막)을 함유하는 3개의 상이한 막 장치를 통과한 모노클로날 항체(MAb I) 분획의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석 결과를 나타내는 그래프이다. x-축 상에는 막 상의 MAb I의 총 로딩량을 g/L으로 나타내고, y-축 상에는 출발 농도와 비교한 MAb I 단량체의 상대적 농도(% 수율로 표시)를 나타낸다.
도 3b는 Membrane 7, Membrane 8 또는 시중에서 입수가능한 막(Pall Mustang®S 막)을 함유하는 3개의 상이한 막 장치를 통과한 모노클로날 항체(MAb I) 분획의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석 결과를 나타내는 그래프이다. x-축 상에는 막 상의 MAb I의 총 로딩량을 g/L으로 나타내고, y-축 상에는 출발 농도에 비교한 MAb I 이량체의 상대적 농도(% 수율로 표시)를 나타낸다. 관찰되는 바와 같이, 이량체 파과(break-through)는 Membrane 8 뿐만 아니라 Pall Mustang® S 막과 비교하여 Membrane 7의 경우에 현저하게 나중이었다.
도 3c는 Membrane 7, Membrane 8 또는 시중에서 입수가능한 막(Pall Mustang®S 막)을 함유하는 3개의 상이한 막 장치를 통과한 모노클로날 항체(MAb I) 분획의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석 결과를 나타내는 그래프이다. x-축 상에는 막 상의 MAb I의 총 로딩량을 g/L으로 나타내고, y-축 상에는 출발 농도에 비교한 MAb I 고분자량(HMW) 응집물의 상대적 농도(% 수율로 표시)를 나타낸다. 관찰되는 바와 같이, HMW 파과는 Membrane 8 뿐만 아니라 Pall Mustang® S 막과 비교하여 Membrane 7의 경우에 현저하게 나중이었다.
도 4a는 MAb 로딩량의 함수로 Membrane 7(흰색 삼각형으로 표시) 및 Membrane 8(흰색 사각형으로 표시)에 대한 항체 풀(풀)의 SEC에 의해 측정된 바와 같은 응집물 파과(y-축 우측에 도시)를 도시하는 그래프이다. Membrane 7(흑색 삼각형) 및 Membrane 8(흑색 사각형)에 대한 풀에서 단량체(즉, 목적 생성물) 수율도 또한 도시되어 있다.
도 4b는 MAb 로딩량의 함수로 2개의 별도 실시(제1 실시(run): 흰색 원형으로 표시; 제2 실시: 흰색 다이아몬드형으로 표시)에 있어서 Membrane 7에 대한 항체 풀의 응집물 파과(y-축 우측에 도시)를 도시하는 그래프이다. Membrane 7에 대한 풀에서 단량체 수율도 또한 도시되어 있다(제1 실시: 흑색 원형으로 표시; 제2 실시: 흑색 다이아몬드형으로 표시).
도 5는 MAb III 로딩량(x-축에 mg/mL로 표시)의 함수로서 Membrane 7에 대한 항체 풀에서 응집물 파과(y-축 우측에 도시)를 도시하는 그래프이다. Membrane 7(y-축 좌측에 표시)에 대한 풀에서 단량체 수율도 또한 도시되어 있다.
도 6a는 MAb I 단량체와 Membrane 8의 결합(흰색 사각형), 및 MAb I 응집물과 Membrane 8의 결합(흰색 삼각형), MAb I 단량체와 Membrane 7의 결합(흑색 사각형), 및 MAb I 응집물과 Membrane 7의 결합(흑색 삼각형)에 대한 NaCl 농도의 함수로서 pH 5.0에서 분배 계수를 도시하는 그래프이다.
도 6b는 MAb II 단량체와 Membrane 8의 결합(흰색 사각형), 및 MAb II 응집물과 Membrane 8의 결합(흰색 삼각형), MAb II 단량체와 Membrane 7의 결합(흑색 사각형), 및 MAb II 응집물과 Membrane 7의 결합(흑색 삼각형)에 대한 NaCl 농도의 함수로서 pH 5.0에서 분배 계수를 도시하는 그래프이다.
도 7은 pH 5.0에서 MAb I 및 MAb II와 Membrane 7 및 Membrane 8 각각의 결합에 대한 선택성 플럿을 도시하는 그래프이다. MAb I에 대한 Membrane 8의 선택성은 흰색 사각형으로 표시하고; MAb I에 대한 Membrane 7의 선택성은 흑색 사각형으로 표시하며; MAb II에 대한 Membrane 8의 선택성은 흰색 삼각형으로 표시하고; 또 MAb II에 대한 Membrane 7의 선택성은 흑색 삼각형으로 표시한다.
도 8은 10 및 15 g/L 응집물 로딩량에서 % 단량체를 나타내는 등고선도를 도시한다.
도 9는 5, 10 및 15 g/L 응집물 로딩량에서 최적 작용영역(region of operation)을 나타내는 등고선도를 도시한다. 최적인 것은 >88% 단량체 수율과 응집물이 총 단백질의 <2%를 이루는 것으로 정의된다. 회색 영역은 상기 기준을 만족시키지 않는다.
도 10은 바이러스 여과 장치의 처리량(throughput)에 대한 유속(flow rate)의 효과를 조사하기 위한 실험 결과를 도시하는 그래프이다. Y-축은 압력 강하(psi)를 나타내고 또 X-축은 바이러스 여과 장치의 처리량(kg/m2)을 나타낸다.
도 11은 본 명세서에 기재된 조성물을 이용하는 연결된 플로우 쓰루 정제 방법의 개략도이다. 활성탄 함유 장치가 음이온 교환 장치에 직접 연결된다. 상기 음이온 교환 장치로부터의 유출물은 정적 혼합기를 통과하며, 이때 수성 산이 부가되어 pH를 낮추며, 이어 본 발명에 따라 양이온 교환 플로우 쓰루 장치를 거치고, 또 바이러스 필터를 통과한다.
도 12는 음이온 교환 크로마토그래피 매질(ChromaSorbTM) 이후의 HCP 파과를 측정하기 위한 실험의 결과를 도시하는 그래프이다. X-축은 HCP 농도(ppm)를 나타내고 또 Y-축은 AEX 로딩량(kg/L)을 나타낸다.
도 13은 플로우 쓰루 정제 방법 단계에서 바이러스 여과 장치의 로딩량의 함수로서 MAb 응집물의 제거를 측정하는 실험의 결과를 도시하는 그래프이다. X-축은 바이러스 여과 로딩량(kg/m2)을 나타내고 또 Y-축은 바이러스 여과 후 샘플 중의 MAb 응집물의 %를 나타낸다.
도 14는 본 명세서에 기재된 바와 같이 양이온 교환 수지를 사용하여 누적 단백질 로딩량 함수로서 MAb 응집물의 제거를 나타내는 실험(로트 #12LPDZ119)의 결과를 도시하는 그래프이다. X-축은 누적 단백질 로딩량 mg/ml을 나타내고, 좌측 Y-축은 항체 MAb의 농도 mg/ml를 나타내며 또 우측 Y-축은 샘플 중의 MAb 응집물의 %를 나타낸다.
도 15는 본 명세서에 기재된 바와 같이 양이온 교환 수지를 사용하여 누적 단백질 로딩량 함수로서 MAb 응집물의 제거를 나타내는 실험(로트 # 12LPDZ128)의 결과를 도시하는 그래프이다. X-축은 누적 단백질 로딩량 mg/ml을 나타내고, 좌측 Y-축은 항체 MAb의 농도 mg/ml를 나타내며 또 우측 Y-축은 샘플 중의 MAb 응집물의 %를 나타낸다.
도 16은 본 명세서에 기재된 바와 같이 양이온 교환 수지를 사용하여 누적 단백질 로딩량 함수로서 MAb 응집물의 제거를 나타내는 실험(로트 # 12LPDZ129)의 결과를 도시하는 그래프이다. X-축은 누적 단백질 로딩량 mg/ml을 나타내고, 좌측 Y-축은 항체 MAb의 농도 mg/ml를 나타내며 또 우측 Y-축은 샘플 중의 MAb 응집물의 %를 나타낸다.
도 17은 pH 5 및 3분의 체류 시간에서 MAb5를 갖는 수지 로트 # 1712의 크로마토그램을 도시한다.
발명의 상세한 설명
일반적으로 목적하는 생성물인 단량체성 단백질로부터 단백질 응집물을 분리하기 위한 시도로서 몇몇 종래 기술의 결합 및 용출 방법뿐만 아니라 플로우 쓰루 방법이 기재되어 있다.
결합 및 용출 방법은 일반적으로 시간 소모적이고 비용이 많이 들어, 단량체성 단백질의 고수율을 유지하면서 응집물 및 특히 저차 응집물을 단량체성 단백질로부터 효과적으로 분리하기에는 성공적이지 못하는 것으로 보인다. 통상의 다공성 수지 및 막을 갖는 특정 양이온 교환 플로우 쓰루 방법도 또한 당해 분야에 기재되어 있다; 그러나, 이들은 응집물 결합용 매질의 낮은 용량(capacity), 이량체에 대한 낮은 선택성 및 흔히 목적 생성물, 즉 단량체성 단백질의 낮은 수율에 관련된 문제를 갖는 것으로 보인다(참고: 예를 들어 Liu et al., J. Chrom. A., 1218(2011), 6943-6952).
또한, 단백질을 분리하기 위하여 고체 지지체 상의 양이온 교환기를 적용하는 것으로 보이는 방법들이 종래 기술에 기재되어 있다. 참고: 예를 들어, 2개 모델 단백질의 가장 훌륭한 크로마토그래피 분해(resolution)를 갖기 위하여 고체 지지체 상에 고밀도의 양이온 교환기를 갖는 것을 논의하고 있는 Wu et al.(Effects of stationary phase ligand density on high-performance ion-exchange 크로마토그래피의 단백질, J. Chrom. 598(1992), 7-13). 그러나, 최근, 응집물 제거에 대한 양이온 교환 결합기 밀도의 효과가 특이적으로 조사되었다(참고: 예를 들어, Fogle et al., Effects of 수지 ligand density on yield and 불순물 clearance in preparative cation exchange 크로마토그래피. I. Mechanistic evaluation, J. Chrom. A.. 1225(2012), 62-69). 단량체성 및 고분자량 항체 형태의 분해는 결합기의 밀도에 대개 민감하지 않은 것으로 보고되었다.
WPC는 또한 불순물 제거용으로도 개시되어 있다(참고: 예를 들어, Suda et al., Comparison of agarose and dextran-grafted agarose strong ion exchangers for the separation의 단백질 aggreagates, J. Chrom. A, 1216: pp.5256-5264, 2009). 약 분배 크로마토그래피(weak partitioning 크로마토그래피: WPC)의 경우, 분배 계수, Kp,는 0.1 내지 20 범위이고; Kp > 20은 결합-용출 크로마토그래피와 연관되고 또 Kp < 0.1는 플로우 쓰루 크로마토그래피와 관련된다. WPC는 적어도 2개의 심각한 결점을 갖는다. 첫째는 플로우 쓰루 크로마토그래피와 결합-용출 크로마토그래피 사이이어야 하는 좁은 작용 영역(0.1< Kp < 20)(참고: 예를 들어, 미국 특허번호 8,067,182호). 상기 작용 영역 내에서, 효과적인 분리를 위하여 생성물과 불순물 사이의 선택성이 커야 한다. 전형적으로 이온 교환 매질의 경우, 생성물과 불순물 사이의 선택성은 Kp가 증가함에 따라서 증가하며, 결합-용출 조건하에서 최고 선택성을 갖는다. 둘째, 불순물에 대한 용량이 결합-용출 모드의 경우에서보다 낮은 점이다. 상기 Kp 값이 낮기 때문에, 불순물 농도가 생성물의 농도보다 더 낮은 전형적인 작업 조건하에서의 용량도 또한 낮을 것이다.
본 발명은 당해 분야에 기재된 다양한 방법과 비교하여 단백질 응집물 및 단량체성 단백질의 탁월한 분리를 달성할 수 있다. 종래 기술에 기재된 것과 구별되는 본 발명의 중요한 특징은 고체 지지체 상에서 저밀도의 양이온 교환기의 사용뿐만 아니라 저차 단백질 응집물, 예를 들어 크기 및 표면 특징 면에서 단량체와 밀접한 것으로 인하여 전형적으로 제거하기가 더 어려운 이량체, 삼량체 및 사량체를 제거하는 높은 특이성이다.
본 발명이 더욱 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위하여, 특정 용어를 먼저 정의한다. 부가적 정의는 상세한 설명을 통하여 설명한다.
1. 정의
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "크로마토그래피"는 생물약제학적 제제 중의 오염물 및/또는 단백질 응집물로부터 목적 생성물(예를 들어, 치료성 단백질 또는 항체)를 분리하는 임의 유형의 수법을 지칭한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "플로우 쓰루 방법", "플로우 쓰루 모드" 및 "플로우 쓰루 크로마토그래피"는 목적 생성물을 함유하는 생물약제학적 제제가 어떤 물질을 플로우 쓰루(flow through: 유통)하려는 생성물 분리 수법을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 목적 생성물은 상기 물질을 유통하며 또 바람직하지 않은 성분은 상기 물질에 결합한다. 특정 실시양태에서, 상기 물질은 특정 밀도(즉, 종래 기술의 조성물보다는 낮은)의 양이온 교환 결합기를 함유하며 또 단백질 응집물로부터 단량체성 단백질을 분리하기 위해 사용되며, 이때 상기 단량체성 단백질은 상기 물질을 유통(플로우 쓰루)하지만, 상기 단백질 응집물은 상기 물질에 결합된다.
용어 "친화성 크로마토그래피"는 표적 분자(예를 들어, 목적하는 Fc 영역 함유 단백질 또는 항체)가 표적 분자에 대하여 특이적인 리간드에 특이적으로 결합하는 단백질 분리 수법을 지칭한다. 이러한 리간드는 일반적으로 생체특이적 리간드라 칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 생체특이적 리간드(예를 들어, 단백질 A 또는 그의 기능적 변이체)는 적합한 크로마토그래피 매트릭스 물질에 공유적으로 부착되며 또 용액이 크로마토그래피 매트릭스와 접촉함에 따라서 용액 중의 표적 분자에 접근할 수 있다. 상기 표적 분자는 일반적으로 크로마토그래피 단계 중에 상기 생체특이적 리간드에 대하여 특이적인 결합 친화성을 보유하는 반면, 상기 혼합물 중의 다른 용질 및/또는 단백질은 상기 리간드에 눈에 띄게 반응하지 않거나 또는 특이적으로 반응하지 않는다. 상기 표적 분자를 고정화 리간드에 결합시키는 것은 오염성 단백질 및 불순물이 크로마토그래피 매트릭스를 통과하는 반면에 상기 표적 분자는 고상 물질 상의 고정화 리간드에 특이적으로 결합되어 유지된다. 특이적으로 결합된 표적 분자는 이어 적합한 조건(예를 들어, 낮은 pH, 높은 pH, 높은 염, 경쟁성 리간드 등)하에서 고정화 리간드로부터 활성 형태로 제거되며, 또 상기 크로마토그래피 컬럼을 용출 완충액으로 통과시켜 이전에는 컬럼 통과가 허용되었던 오염성 단백질 및 불순물을 실질적으로 제거하였다. 각 특이적 결합 단백질, 예를 들어 항체를 정제하기 위해 임의의 적합한 리간드가 이용될 수 있음을 알 수 있다. 본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 단백질 A는 Fc 영역 함유 표적 단백질에 대한 리간드로서 사용된다. 표적 분자(예를 들어, Fc-영역 함유 단백질)의 생체특이적 리간드(예를 들어, 단백질 A)로부터 용출하기 위한 조건은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 G 또는 단백질 L 또는 그의 기능적 변이체는 생체특이적 리간드로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 A와 같은 생체특이적 리간드를 적용하는 방법은 Fc-영역 함유 단백질에 대한 결합을 위해 pH 5-9 범위, 상기 생체특이적 리간드/표적 분자 콘쥬게이트를 세척하거나 재평형화한 다음, pH 약 4 또는 그 미만이고 적어도 하나의 염을 함유하는 완충액에 의한 용출을 이용한다.
본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 용어 "오염물", "불순물" 및 "부서러기"는 하나 이상의 외래 분자 또는 부적절한 분자로부터 분리될 목적 생성물을 함유하는 샘플에 존재할 수 있는 DNA, RNA, 하나 이상의 숙주 세포 단백질, 내독소, 지질, 단백질 응집물 및 하나 이상의 첨가제와 같은 생물학적 거대분자를 비롯한 외래 또는 부적절한 분자를 지칭한다. 또한, 이러한 오염물은 상기 분리 방법 이전에 생길 수 있는 단계에서 사용되는 임의 시약을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 목적 생성물을 함유하는 샘플로부터 단백질 응집물을 선택적으로 제거하기 위한 것이다.
용어 "면역글로불린," "Ig" 또는 "항체"(본 명세서에서는 상호교환적으로 사용됨)는 예를 들어 항원을 특이적으로 결합시키는 능력을 갖는 사슬간(interchain) 다이설피드(disulfide) 결합에 의해 안정화되는 2개의 중쇄(heavy chain) 및 2개의 경쇄(light chain)로 이루어지는 기본적으로 4개-폴리펩티드 사슬 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 용어 "단일사슬 면역글로불린" 또는 "단일사슬 항체"(본 명세서에서 상호교환적으로 사용됨)는 예를 들어 항원을 특이적으로 결합시키는 능력을 갖는 사슬간 펩티드 링커에 의해 안정화되는 1개 중쇄 및 1개 경쇄로 이루어진 2개-폴리펩티드 사슬 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 용어 "도메인"은 예를 들어 β-주름형 시트 및/또는 사슬간 다이설피드 결합에 의해 안정화된 펩티드 루프(예컨대 3 내지 4개 펩티드 루프 포함)를 포함하는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 구형 영역을 지칭한다. 도메인은 또한 "불변(constant)" 또는 "가변(variable)"으로도 지칭되는데, "불변" 도메인의 경우 다양한 클래스 멤버의 도메인 내에서 서열 변이의 상대적 결여를 기본으로 하거나, 또는 "가변" 도메인의 경우 다양한 클래스 멤버의 도메인 내에서 현저한 변이를 기본으로 한다. 항체 또는 폴리펩티드 "도메인"은 흔히 이 기술분야에서 항체 또는 폴리펩티드 "영역"으로 상호교환적으로 지칭된다. 항체 경쇄의 "불변" 도메인은 "경쇄 불변 영역", "경쇄 불변 도메인", "CL" 영역 또는 "CL" 도메인으로 상호교환적으로 지칭된다. 항체 중쇄의 "불변" 도메인은 "중쇄 불변 영역", "중쇄 불변 도메인", "CH" 영역 또는 "CH" 도메인으로 상호교환적으로 지칭된다. 항체 경쇄의 "가변" 도메인은 "경쇄 가변 영역", "경쇄 가변 도메인", "VL" 영역 또는 "VL" 도메인으로 상호교환적으로 지칭된다. 항체 중쇄의 "가변" 도메인은 "중쇄 가변 영역", "중쇄 가변 도메인", "VH" 영역 또는 "VH" 도메인으로 상호교환적으로 지칭된다.
면역글로불린 또는 항체는 모노클로날(monoclonal) 또는 폴리클로날(polyclonal)일 수 있고 또 단량체 형태 또는 중합체 형태로 존재할 수 있으며, 예를 들어 IgM 항체는 오량체 형태로 존재할 수 있고 및/또는 IgA 항체는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 존재할 수 있다. 용어 "단편"은 온전한 또는 완전한 항체 또는 항체 사슬에 비하여 더 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 사슬의 일부 또는 부분을 지칭한다. 단편은 온전한 또는 완전한 항체 또는 항체 사슬의 화학적 또는 효소적 처리를 통하여 얻을 수 있다. 단편은 또한 재조합 수단에 의해서도 얻을 수 있다.
용어 "항원 결합 단편"은 항원과 결합하거나 또는 항원 결합(즉, 특이적 결합)을 위해 완전(intact) 항체(즉, 이들이 유도되는 완전 항체)와 결쟁하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 부분을 지칭한다. 결합 단편은 재조합 DNA 수법에 의해, 또는 완전 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분해에 의해 생성될 수 있다. 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 사슬, 및 단일 사슬 항체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "생물약제학적 제제"는 목적 생성물(예를 들어, 보통 단량체인 치료성 단백질 또는 항체) 및 원하지 않는 성분, 예컨대 단백질 응집물(예를 들어, 상기 목적 생성물의 저차 단백질 응집물 및 고분자량 응집물)을 함유하는 조성물을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 또 다르게 나타내지 않는 한, 용어 "샘플"은 표적 분자를 함유하는 임의의 조성물 또는 혼합물을 지칭한다. 샘플은 생물학적 공급원 또는 기타 공급원으로부터 유도될 수 있다. 생물학적 공급원은 진핵생물 및 원핵생물 공급원, 예컨대, 식물과 동물 세포, 조직, 및 기관을 포함한다. 상기 샘플은 상기 표적 분자와 혼합되어 발견되는 희석제, 완충제, 세제 및 오염 종, 부서러기 등을 또한 포함할 수 있다. 상기 샘플은 "부분적으로 정제되거나" (즉, 여과 단계와 같은 하나 이상의 정제 단계에 처리되는) 또는 표적 분자를 생성하는 숙주 세포 또는 기관으로부터 얻을 수 있다(예를 들어, 상기 샘플은 수집된 세포액 배양액을 포함할 수 있다). 일부 실시양태에서, 샘플은 세포 배양 공급물이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 플로우 쓰루 정제 방법에 처리되는 샘플은 결합 및 용출 크로마토그래피 단계, 예를 들어, 단백질 A 친화성 크로마토그래피로부터의 용출액이다.
본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 용어 "단백질 응집물" 또는 "단백질 응집물들"은 목적 생성물, 예를 들어 치료성 단백질 또는 항체의 적어도 2개 분자의 결합을 지칭한다. 목적 생성물의 적어도 2개 분자의 결합은 비제한적으로 공유적, 비공유적, 디설피드 또는 비환원성 가교를 포함한 임의 수단에 의해 생길 수 있다.
응집물 농도는 당해 분야에 잘 공지되고 또 널리 수용되는 방법인 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용하여 단백질 샘플에서 측정될 수 있다(참고: 예를 들어, Gabrielson et al., J. Pharm. Sci., 96,(2007), 268-279). 다양한 분자량의 상기 종(species)의 상대적 농도는 UV 흡수를 이용하여 유출물에서 측정되는 한편, 상기 분획의 분자량은 컬럼 제조자의 지시를 따라서 계 검량을 실시하는 것에 의해 측정된다.
본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 용어 "이량체", "이량체들", "단백질 이량체" 또는 "단백질 이량체들"은 단백질 응집물의 저차 분획으로서, 2개 단량체 분자를 함유하는 응집물을 주로 포함하지만, 삼량체 및 사량체도 일부 함유할 수 있다. 상기 분획은 대개 주요 단량체 피크 이전에 SEC 크로마토그래피에서 제1 분해성 피크로서 즉시 관찰된다.
본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 용어 "고분자량 응집물" 또는 "HMW"는 단백질 응집물의 고차 분획, 즉 오량체 및 그 이상을 지칭한다. 상기 분획은 대개 이량체 피크 이전에 SEC 크로마토그래피에서 하나 이상의 피크로서 관찰된다.
본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 용어 "결합기" 또는 "리간드"는 단량체성 단백질 또는 단백질 응집물을 용액으로부터 유인할 수 있는, 고체 지지체(예를 들어, 다공성 표면) 상에 고정화된 특정 화학 구조를 지칭한다. 결합기로 단백질을 유인하는 것은 이온, 극성, 분산성, 소수성, 친화성, 금속 킬레이팅 또는 반데어발스를 비롯한 임의 유형일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "양이온 교환 결합기"는 음으로 하전된 결합기를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 결합기는 음으로 하전된 설포네이트 기이다.
용어 "고체 지지체"는 일반적으로 결합기가 부착되어 있는 임의 물질(다공성 또는 비다공성)을 지칭한다. 결합기를 고체 지지체 상에 부착시키는 것은 그라프팅의 경우에서와 같이 공유 결합을 통하여, 또는 코팅, 접착, 흡착 및 유사 메카니즘을 통하여 실시될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "밀도"는 고체 지지체 상에서 결합기 또는 리간드의 농도를 지칭하며, 일반적으로 리간드 농도 (몰)/다공성 매질의 L로서 표현된다. 널리 수용되는 이온 교환 리간드 밀도의 단위는 밀리당량/리터 또는 meq/L(meq/ml와 상응)이며, 이는 소정 부피의 매질 중에서 이온 교환가능한 기의 몰량에 상당한다. 단일 이온화 가능한 부분을 갖는 하전된 기의 경우, 리간드 밀도(meq/L)는 mmole/L, 또는 mM로 표시된 이들 기의 밀도와 동등하다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "선택성"은 이동상(mobile phase) 및 정지상(staionary phase) 사이의 2개 종의 분배 계수의 무차원 비율을 지칭한다. 분배 계수(Kp)는 비율 Q/C이며, 이때 Q 및 C는 결합된 및 자유 단백질 농도를 각각 나타낸다.
본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 용어 "공정 단계" 또는 "단위 작업"은 정제 방법으로 특정 결과를 초래하는 하나 이상의 방법 또는 장치의 이용을 지칭한다. 포함될 수 있는 공정 단계 또는 단위 작업의 예는, 비제한적으로, 청정화, 결합 및 용출 크로마토그래피, 바이러스 불활성화, 플로우 쓰루 정제 및 제제화를 포함한다. 공정 단계 또는 단위 작업의 각각은 하나 이상의 단계 또는 방법을 적용하여 공정 단계 또는 단위 작업의 목적하는 결과를 달성하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 청정화 단계 및/또는 상기 플로우 쓰루 정제 단계는 하나 이상의 단계 또는 방법 또는 장치를 적용하여 공정 단계 또는 단위 작업을 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 공정 단계 또는 단위 작업을 실시하기 위하여 이용되는 하나 이상의 장치는 단일 사용 장치이며 또 공정 중 다른 장치를 교체해야하거나 또는 공정을 중단할 필요없이 제거되거나 및/또는 교체될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "풀 탱크"는 일반적으로 공정 단계들 사이에 사용되며 공정 단계로부터 출력되는 전체 부피를 수집할 수 있는 크기/부피를 갖는 임의의 용기, 통(vessel), 저장기, 탱크 또는 백(bag)을 지칭한다. 풀 탱크는 공정 단계로부터 결과물(output) 전체 부피의 용액 상태를 유지하거나 또는 저장하거나 또는 조작하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 다양한 실시양태에서, 상기 공정들은 하나 이상의 풀 탱크를 사용할 필요성을 제거한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 공정은 하나 이상의 서지 탱크(surge tank)를 사용할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "서지 탱크"는 공정 단계 사이에 또는 공정 단계 내(예를 들어, 단일 공정 단계가 하나 이상의 단계를 포함할 때)에서 사용되는 임의의 용기 또는 통 또는 백을 지칭한다; 한 단계로부터의 결과물이 서지 탱크를 통과하여 다음 단계로 간다. 따라서, 서지 탱크는 한 단계로부터의 결과물의 전체 부피를 유지하거나 또는 수집하기 위한 것이 아니라는 점에서 풀 탱크와는 상이하다; 그러나 대신 한 단계로부터의 결과물이 다음으로 연속적으로 유동하여 가도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 한 공정 또는 시스템 중의 2개 공정 단계 사이에 또는 일개 공정 단계 내에서 사용된 서지 탱크의 부피는 공정 단계로부터 결과물의 전체 부피의 25% 이하이다. 다른 실시양태에서, 서지 탱크의 부피는 공정 단계로부터 결과물의 전체 부피의 10% 이하이다. 일부 다른 실시양태에서, 서지 탱크의 부피는, 표적 분자가 정제되려는 출발 물질을 구성하는, 바이오리액터 중의 세포 배양액의 전체 부피의 35% 미만, 또는 30% 미만, 또는 25% 미만, 또는 20% 미만, 또는 15% 미만, 또는 10% 미만이다.
본 명세서에 기재된 일부 실시양태에서, 서지 탱크는 본 명세서에 기재된 고체 지지체를 이용하는 단계의 상류에 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "연속 공정"은 1개 공정 단계로부터의 결과물이 공정 중의 다음 공정 단계로 중단없이 직접 흘러들어가도록 되어 있는 2 이상의 공정 단계(또는 단위 작용)를 포함하는, 표적 분자를 정제하기 위한 방법을 지칭하며, 2 이상의 공정 단계는 이들의 지속시간의 적어도 일부 동안 동시에 실시될 수 있다. 즉, 본 명세서에 기재된 바와 같은 연속 공정의 경우에서, 다음 공정 단계가 개시되기 전에는 공정 단계를 완성할 필요가 없지만, 샘플의 일부는 언제나 상기 공정 단계들을 통하여 이동하고 있다. 용어 "연속 공정"은 또한 공정 단계 내의 단계에 적용되며, 이 경우에서 복수 단계를 포함하는 공정 단계를 실시하는 동안, 상기 샘플은 공정 단계를 실시할 필요가 있는 복수의 단계를 통하여 연속적으로 흘러간다. 본 명세서에 기재된 공정 단계의 일개 예는 연속적 방식으로 실시되는 복수의 단계, 예컨대 플로우 쓰루 활성탄에 이어, 플로우 쓰루 AEX 매질, 이어 본 명세서에 기재된 고체 지지체를 이용하는 플로우 쓰루 CEX 매질에 이어, 플로우 쓰루 바이러스 여과를 포함하는 플로우 쓰루 정제 단계이다.
본 명세서에 사용된 용어 "음이온 교환 매트릭스"는 부착되어 있는 4급 아미노기와 같은 예를 들어 하나 이상의 양으로 하전된 리간드를 갖는 양으로 하전된 매트릭스를 지칭한다. 시중에서 구입할 수 있는 음이온 교환 수지는 DEAE 셀룰로오스, QAE SEPHADEXTM 및 FAST Q SEPHAROSETM (GE Healthcare 제조)를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 공정 및 시스템에서 사용될 수 있는 예시적 물질은 Fractogel® EMD TMAE, Fractogel® EMD TMAE highcap, Eshmuno® Q 및 Fractogel® EMD DEAE (EMD Millipore 제조)이다.
본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 용어 "활성 탄소" 또는 "활성탄"은 그의 기공 구조를 향상시키기 위한 공정에 처리된 탄소질 물질을 지칭한다. 활성탄은 아주 높은 표면적을 갖는 다공성 고체이다. 이들은 석탄, 나무, 코코넛 껍질, 너트껍질, 및 이탄을 비롯한 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 활성탄은 제어되는 분위기하에서 가열을 비롯한 물리적 활성화 또는 강산, 염기 또는 산화제를 사용한 화학적 활성화를 사용하여 상기 물질들로부터 생성될 수 있다. 상기 활성화 공정은 고표면적을 갖는 다공성 구조를 생성하며, 이는 불순물 제거에 대한 높은 능력을 활성탄에게 부여한다. 활성화 공정은 표면의 산도를 제어하도록 변형될 수 있다. 본 명세서에 기재된 일부 실시양태에서, 활성탄은 플로우 쓰루 정제 단계에 사용되며, 전형적으로 그 뒤로 결합 및 용출 크로마토그래피 단계 또는 바이러스 불활성화 단계가 오고, 이어 결합 및 용출 크로마토그래피 단계로 이어진다. 일부 실시양태에서, 활성탄은 셀룰로오스 매질 내에, 예를 들어, 컬럼 또는 기타 다른 적합한 장치에 혼입된다.
용어 "정적 혼합기"는 2개의 유체 물질, 전형적으로 액체를 혼합하기 위한 장치를 지칭한다. 상기 장치는 일반적으로 원통형(튜브) 하우징 내에 함유된 혼합기 요소(비이동성 요소)로 이루어진다. 전체 시스템 디자인은 2개의 유체 기류를 정적 혼합기로 전달하는 방법을 포함한다. 상기 기류가 혼합기를 통하여 이동함에 따라서, 비이동성 요소가 연속적으로 상기 물질을 혼합한다. 완전한 혼합은 유체의 특성, 튜브의 내부 직경, 혼합기 요소의 수 및 이들의 디자인 등을 비롯한 다수의 변수에 따라 달라진다. 본 명세서에 기재된 일부 실시양태에서, 하나 이상의 정적 혼합기가 본 명세서에 기재된 방법에 사용된다. 특정 실시양태에서, 정적 혼합기는 본 명세서에 기재된 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후 및 샘플을 양이온 교환 고체 지지체와 접촉시키기 전에 소망하는 용액 변화를 달성하기 위하여 사용된다.
II . 예시적 고체 지지체
본 발명은 목적하는 생성물인 단량체성 형태의 단백질보다 더 바람직하게 단백질 응집물을 결합하는, 부착된 특정 밀도의 결합기 또는 리간드를 갖는 고체 지지체를 제공한다. 어떠한 이론에 얽매이는 것은 아니나, 임의의 적합한 고체 지지체가 본 발명의 경우에 사용될 수 있을 것으로 생각된다. 예를 들어, 상기 고체 지지체는 다공성 또는 비다공성일 수 있거나 또는 모노리쓰 또는 막 형태와 같이 연속적일 수 있다. 상기 고체 지지체는 입자, 비드 또는 섬유 형태와 같이 불연속적일 수 있다. 어떤 경우(연속적 또는 비연속적)이든, 상기 고체 지지체의 중요한 특징은 이들이 높은 표면적, 기계적 통합성, 수성 환경에서 통합성, 및 결합기의 접근성을 보장하도록 유동 분포를 제공하는 능력을 갖는다.
예시적인 연속적 다공성 고체 지지체는 마이크로다공성 막을 포함하며, 즉 약 0.05 미크론 내지 10 미크론 사이의 기공 크기를 갖는다. 본 발명에 따른 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 다공성 막은 대칭 또는 비대칭 성질로 분류될 수 있고, 이는 막의 두께에 걸친, 또는 중공 섬유의 경우, 섬유의 마이크로다공성 벽에 걸친 기공 크기의 균일성을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대칭 막"은 막 단면에 걸쳐 실질적으로 균일한 기공 크기를 갖는 막을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "비대칭 막"은 평균 기공 크기가 막 단면에 걸쳐 일정하지 않은 막을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 비대칭 막의 경우에서, 기공 크기는 막 단면을 통한 위치 함수로서 균일하게 또는 불연속적으로 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비대칭 막은 일개 외부 표면 상의 기공 크기 대 대향하는 외부 표면 상의 기공 크기의 비율을 가질 수 있고, 이 비율은 실질적으로 1보다 크다.
다양한 물질로 제조된 다양한 마이크로다공성 막이 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 이러한 물질의 예는 다당류, 합성 및 반합성 중합체, 금속, 금속 산화물, 세라믹, 유리, 및 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 마이크로다공성 막을 제조하기 위해 이용될 수 있는 예시적인 중합체는, 비제한적으로, 치환되거나 또는 비치환된 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리메타크릴아미드, 폴리이미드, 폴리아크릴레이트, 폴리카보네이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리비닐 친수성 중합체, 폴리스티렌, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 공중합체 또는 스티렌 및 디비닐벤젠, 방향족 폴리술폰, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 퍼플루오르화된 열가소성 중합체, 폴리올레핀, 방향족 폴리아미드, 지방족 폴리아미드, 초고분자량 폴리에틸렌, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF), 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 폴리에스테르, 및 이들의 조합을 포함한다.
시중에서 구입할 수 있는 예시적인 마이크로다공성 막은 이엠디 밀리포어 코포레이션(미국 매사추세츠 빌레리카 소재)으로부터 입수가능한 Durapore® 및 Millipore Express®; 팔 코포레이션(미국 뉴욕 포트 워싱톤 소재)로부터 입수가능한 Supor®; 및 Sartopre® 및 사르토리우스 스테딤 바이오테크 에스.에이. (프랑스 오바그네 세덱스 소재)로부터 입수가능한 Sartobran®을 포함한다.
다른 예시적인 연속적 고체 지지체는 BIA 세파레이션(오스트리아 빌라흐 소재)으로부터 입수가능한 CIM® 모노리씩 물질과 같은 모노리쓰이다.
예시적인 불연속 고체 지지체는 다공성 크로마토그래피 비드를 포함한다. 당업자에 의해 용이하게 인식되는 바와 같이, 크로마토그래피 비드는 다당류, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 폴리스티레닉(polystyrenics), 비닐 에테르, 제어된 기공 유리, 세라믹 등과 같은 다양한 중합체 및 무기 물질로부터 제조될 수 있다.
시중에서 구입할 수 있는 예시적인 크로마토그래피 비드는 이엠디 밀리포어 코포레이션으로부터 입수가능한 CPG; GE 헬쓰케어 라이프 사이언시스 악티엔볼라게트로부터 입수가능한 Sepharose®; 및 라이프 테크놀로지스로부터 입수가능한 POROS®이다.
다른 예시적인 고체 지지체는 직조 및 부직 섬유 물질, 예컨대 섬유 매트 및 펠트뿐만 아니라 적합한 하우징, 예를 들어 크로마토그래피 컬럼, 일회용 플라스틱 하우징 등과 같은 적합한 하우징에 팩킹되는 섬유이다.
III . 예시적인 결합기
다양한 결합기 또는 리간드가 고체 지지체에 부착되어 본 명세서에 기재된 바와 같이 샘플로부터 단백질 응집물을 효과적으로 제거하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 결합기는 용액 중의 단백질 응집물을 유인하여 결합할 수 있어야 한다. 결합기에 단백질을 유인하는 것은 이온성(예를 들어 양이온성 교환기), 극성, 분산성, 소수성, 친화성, 금속 킬레이팅 또는 반 데어 발스(van der Waals)를 비롯한 임의 유형일 수 있다.
예시적인 이온성 결합기는, 비제한적으로, 설페이트, 설포네이트, 포스페이트, 포스포네이트, 카복실레이트; 일급, 이급, 삼급 아민 및 4급 암모늄; 헤테로시클릭 아민, 예컨대 피리딘, 피리미딘, 피리디늄, 피페라진 등을 포함한다.
극성기는 C-O, C=O, C-N, C=N, C=N, N-H, O-H, C-F, C-Cl, C-Br, C-S, S-H, S-0, S=O, C-P, P-0, P-0, P-H와 같은 극성화된 화학 결합을 포함하는 다양한 화학 성분을 포함한다. 예시적인 극성기는 카보닐, 카복실, 알코올, 티올, 아미드, 할라이드, 아민, 에스테르, 에테르, 티오에스테르 등이다.
소수성 결합기는 소수성 상호작용할 수 있다. 예시적인 소수성 기는 알킬, 시클로알킬, 할로알킬, 플루오로알킬, 아릴 등이다.
친화성 결합기는 표적 단백질과 고 특이적 상호작용을 제공하는 양식으로 몇 개의 결합 작용기의 배열이다. 예시적인 친화성 결합기는 단백질 A 및 단백질 G 및 도메인과 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 바람직한 결합기는 이온 기이다. 특정 실시양태에서, 결합기는 음으로 하전된 설포네이트 기이다. 일반적으로, 음으로 하전된 설포네이트 기는 몇 가지 이점을 갖는다. 예를 들어, 이들은 용액 중의 양으로 하전된 단백질을 결합하는 광범위한 적용성을 나타낸다; 화학이 저렴하고 용이하게 입수가능한 다수의 합성 제조 방법에 대하여 직접적으로 적용될 수 있다; 결합기와 단백질 사이의 상호작용이 잘 이해(참고: 예를 들어, Stein et al., J. Chrorn. B, 848(2007) 151-158)되며, 또 상기 상호작용은 용액 조건을 변경하는 것에 의해 용이하게 조작될 수 있고, 또 이러한 상호작용은 다른 상호작용으로부터 단리될 수 있다.
IV . 결합기를 고체 지지체에 부착하고 고체 지지체 상의 결합기의 밀도를 제 어하는 방법
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에서, 적합한 결합기는 고체 지지체에 결합되며, 상기 고체 지지체 상의 결합기의 밀도는 목적 생성물에 비하여 단백질 응집물에 대한 더 큰 결합용량을 제공하도록 제어된다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은, 종래 기술은 높은 결합기 밀도를 갖는 것이 바람직한 것으로 제시하고 있으나, 고체 지지체 상의 결합기의 더 낮은 밀도가 플로우 쓰루 모드로 단백질 응집물을 제거하는데 더욱 효과적이라는 놀랍고 예상치 못한 발견을 기본으로 한다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 예를 들어, 오량체 및 그보다 더 고차와 같은 고차 응집물과 비교하여 단백질의 단량체성 형태로부터 분리하기 일반적으로 더 어려운, 예를 들어, 이량체, 삼량체 및 사량체와 같은 저차 단백질 응집물을 플로우 쓰루 모드로 제거하는데 특히 효과적이다.
종래 기술에 공지되고 또 본 명세서에 기재된 다양한 방법이 본 명세서에 기재된 방법에 사용하기 위한 고체 지지체에 결합기 부착을 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 성공적인 부착 기준은 소망하는 결합기 밀도의 달성 및 결합기의 낮은 탈리율(즉, 결합기의 낮은 침출율)을 포함한다. 상기 결합기는 직접적으로 고체 지지체에 부착될 수 있거나, 또는 중합체 분자에 혼입되며, 이는 또한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 다르게는, 상기 결합기는 코팅과 고체 지지체 사이에 화학 결합을 형성하거나 또는 형성하지 않고 고체 지지체에 도포된 가교 코팅에 혼입될 수 있다.
결합기를 고체 지지체에 부착시키기 위한 다수의 방법이 공지되어 있다(참고: 예를 들어, Ulbricht, M., Advanced Functional Polymer Membranes, Polymer, 47, 2006, 2217-2262). 이들 방법은 비제한적으로, 결합기를 사용하여 적합한 커플링 화학을 통하여 고체 지지체의 직접적인 변형; 중합체성 분자의 흡착과 부착을 포함한다. 후자는 (중합체가 표면과의 반응 이전에 미리 제조되면) ~에 "그라프팅"되거나 또는 (중합반응이 표면 기를 사용하여 개시되면) ~로부터 그라프팅된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 고체 지지체의 표면 상의 결합기의 밀도를 제어하는 능력은 단백질 응집물 및 목적 생성물의 성공적인 분리를 달성하기 위하여 아주 중요하다. 몰/다공성 매질 L, 또는 M으로 표시되는 결합기의 밀도는 당해 기술자에게 공지된 방법을 이용하여 편리하게 측정될 수 있다. 예를 들어, 설폰산 기의 밀도는 리튬 이온 교환 분석을 이용하여 측정될 수 있다. 이 분석에서, 설폰산기의 수소는 리튬 이온과 충분히 교환되며, 물에 의해 헹구며, 리튬 이온은 진한 산 용액으로 세척되며, 또 산 세척 용액 중의 리튬 농도는 이온 크로마토그래피를 이용하여 측정된다.
단백질 크로마토그래피에서, 더 높은 밀도의 리간드(결합기)가 바람직한 것으로 기재되어 있고, 이는 일반적으로 더 높은 결합용량을 제공하기 때문이다(참고: 예를 들어, Fogle et al., J. Chrom. A, 1225(2012) 62-69). 대부분의 시중에서 구입할 수 있는 양이온 교환(CEX) 수지의 전형적인 리간드 밀도는 일가 리간드에 대하여 적어도 1.00 밀리당량/L, 또는 mM이다. 예를 들어, SP Sepharose Fast Flow 및 CM Sepharose Fast Flow(GE Healthcare로부터 입수가능)는 각각 180-250 mM 및 90-130 mM의 양이온 교환기 농도를 갖는 것으로 생성물 문헌에 수록되어 있다.
고체 지지체 상에서 결합기의 밀도를 제어하기 위해 사용될 수 있는 다수의 방법이 당해 분야에 존재한다. 결합기가 고체 지지체 상에 직접 부착되면, 그 밀도는 반응 길이, 촉매의 유형과 농도, 시약의 농도, 온도, 및 압력에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어 부분적 산화 또는 가수분해에 의해 고체 지지체의 표면 예비처리(활성화)가 필요하면, 예비처리의 정도는 그러한 예비처리된 표면에 부착될 결합기의 밀도를 제어할 것이다.
고체 지지체에 흡착되거나, 부착되거나, 그라프트되거나 또는 코팅되는 중합체 구조에 결합기가 혼입되면, 상기 결합기의 밀도는 상기 중합체 구조의 조성물에 의해 제어될 수 있다. 결합기의 제어된 밀도를 갖는 중합체 구조를 생성하기 위한 한가지 방법은 공중합반응이다. 즉 2개 이상의 상이한 단량체 유형을 단일 중합체 구조로 중합화한다. 결합기는 중합체 구조를 생성하기 위해 사용된 단량체 유형의 하나의 일부인 한편, 다른 중성 단량체는 결합기의 밀도를 감소시키기 위해 부가될 수 있다.
결합기를 포함하는 중합체를 생성하는데 사용된 단량체의 선택은 단량체의 반응성에 의해 결정된다. 중합체 조성물 상의 다양한 단량체 유형의 반응성 및 효과는 잘 연구되고 수록되어 있다(참고: 예를 들어, 중합체 Handbook, 3rd ed., John Wiley & Sons, 1989, p. II). 중합체의 조성물 및 그의 구조를 예상하는 단량체의 잘 인정되는 변수는 단량체의 반응성 비율이다(참고: 예를 들어, Odian, J., Principles of Polymerization, 4th ed., John Wiley & Sons, 2004, p. 466).
고체 지지체에 결합기를 부착하는 바람직한 방법은 결합기를 고체 지지체 상에 도포된 가교된 코팅에 혼입하는 제자리(in situ) 중합반응이다. 이 방법은 미국 특허 번호 4,944,879호 및 4,618,533호뿐만 아니라 미국 특허 공개 공보 번호 US2009/208784호에 기재되어 있다. 이 방법은 용이하게 실시될 수 있을 뿐만 아니라 경제적이다. 하전된 코팅은 하전된 아크릴 단량체, 예를 들어, 2-아크릴아미도-2-메틸프로판설폰산(AMPS)을 N,N'-메틸렌-비스-아크릴아미드(MBAM)와 같은 적합한 교차결합제와 공중합시키는 것에 의해 생성될 수 있다. 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 공개번호 US2009208784호는 고분자량 단백질 응집물의 제거를 위해 사용될 수 있고 또 나노다공성 바이러스 필터의 능력을 증가시키기 위해 사용될 수 있는 AMPS 및 MBAM의 혼합물에 의해 변형된 마이크로다공성 막을 개시한다. 그러나, 상술한 특허 공개는 단백질 응집물 및 특히 이량체, 삼량체, 사량체 등과 같은 저차 단백질 응집물을 선택적으로 제거하기 위하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 리간드 밀도를 제어하는 것을 논의하지 않는다.
하전된 결합 리간드의 밀도를 감소시키기 위하여 사용될 수 있는 중성 단량체는 예를 들어, 아크릴아미드, 히드록시프로필 아크릴레이트, 히드록시에틸 아크릴레이트, 및 히드록시에틸메타크릴레이트와 같은 아크릴, 메타크릴 및 아크릴아미드 단량체의 대 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 단량체는 디메틸아크릴아미드(DMAM)이다. AMPS 및 DMAM 단량체의 반응성(r1=0.162, r2=1.108)(참고: 예를 들어, Polymer Handbook, 3rd ed., John Wiley and Sons, 1989, p. II/156)은 이들 단량체를 포함하는 중합체는 개별 AMPS 단위에 의해 공간이 있는 폴리(DMAM)의 짧은 블록에 대한 경향을 가질 것이므로, 결합기의 밀도를 감소시킬 것이라고 예상한다. 반응 용액 중에서 DMAM 및 AMPS의 비율을 선택하는 것은 결합기의 밀도 제어를 달성하는데 중요한 방법이다.
고체 지지체에 코팅된 중합체를 함유하는 결합기의 대표적인 화학 구조는 도 2a에 도시한다. 이 중합체가 코팅되기 위해서는, 일반적으로 다른 중합체에 교차결합된다. 도 2a에서, R1은 설폰산기, 설페이트기, 인산기, 포스폰산기 또는 카복시기와 같은 양이온 교환기이고; R2는 하전된 기를 함유하지 않는 지방족 또는 방향족 유기 잔기이며; R3은 2 이상의 중합체 사슬 사이의 하전되지 않은 지방족 또는 방향족 유기 링커인 중합체 구조가 도시되어 있다.
도 2a에 도시된 중합체 구조에서, 중성 기("R2"로 표시)를 의미하는 y>x는 하전된 기("R1"로 표시)보다 더 큰 수로 존재한다. 여기서, x, y, 및 z는 중합체 중의 각 단량체의 평균 몰 분획으로서, 독립적으로 약 0.001 내지 0.999 범위이다. 기호 m은 교차결합제의 다른 단부에 부착된 유사한 중합체 사슬을 의미한다.
일부 실시양태에서, 결합기를 함유하는 중합체는 블록 공중합체이며, 이는 1개 유형의 단량체의 긴 스트링 또는 블록(예를 들어 중성 또는 하전된 결합기 함유)에 이어, 상이한 유형의 단량체의 긴 스트링 또는 블록(예를 들어, 제1 블록이 중성이면 하전되고 또 제1 블록이 하전되면 중성임)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 결합기를 함유하는 중합체는 임의 순서로 단량체를 함유한다.
더 다른 실시양태에서, 결합기를 함유하는 중합체는 교대 공중합체(alternating copolymer)이며, 각 단량체는 언제나 상이한 유형의 2개 단량체에 인접한다.
일부 실시양태에서, 결합기 함유 중합체의 대표적인 화학 구조는 도 2b에 도시되어 있고, 여기서 R4는 NH 또는 0이고; R5는 -CH2-, -C2H4-, -C3H6-, -C(CH3)2-CH2-, -C6H4-와 같은 직쇄 또는 분기된 지방족 또는 방향족 기이며; R6은 중합체 사슬에 대한 NH, 0, 또는 S 링커를 함유하는 직쇄 또는 분기된 지방족 또는 방향족 비하전된 기이다.
다른 실시양태에서, 결합기 함유 중합체의 대표적인 화학 구조는 도 2c에 도시되어 있다. R7 및 R8은, 서로 독립해서, 하나 이상의 중성 지방족 및 방향족 유기 잔기를 함유하는 기로부터 선택되며; 또 0, N, S, P, F, Cl, 등과 같은 헤테로원자를 함유할 수 있다.
더 다른 실시양태에서, 결합기 함유 중합체의 대표적인 구조는 도 2d에 도시되어 있다.
고체 지지체에 그라프팅된, 결합기 함유 중합체의 대표적인 화학 구조는 도 2e에 도시되어 있다. 상기 고체 지지체는 직사각형으로 도시된다. 도 2e에서, R1은 설폰산기, 설페이트기, 인산기, 포스폰산기 또는 카복시기와 같은 양이온 교환기이고; R2는 하전된 기를 함유하지 않는 지방족 또는 방향족 유기 잔기인 지방족 또는 방향족 유기 링커인 중합체 구조가 도시되어 있다. 도 2a에 도시된 중합체 구조에서, 중성 기("R2"로 표시)를 의미하는 y>x는 하전된 기("R1"로 표시)보다 더 큰 수로 존재한다.
일부 실시양태에서, 결합기를 함유하는 상기 그라프트 중합체는 블록 공중합체이며, 이는 1개 유형의 단량체의 긴 스트링 또는 블록(예를 들어 중성 또는 하전된 결합기 함유)에 이어, 상이한 유형의 단량체의 긴 스트링 또는 블록(예를 들어, 제1 블록이 중성이면 하전되고 또 제1 블록이 하전되면 중성임)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 결합기를 함유하는 중합체는 임의 순서로 단량체를 함유한다.
더 다른 실시양태에서, 결합기를 함유하는 중합체는 교대 공중합체이며, 각 단량체는 언제나 상이한 유형의 2개 단량체에 인접한다.
일부 실시양태에서, 결합기 함유 중합체의 대표적인 화학 구조는 도 2f에 도시되어 있고, 여기서 R4는 NH 또는 0이고; R5는 -CH2-, -C2H4-, -C3H6-, -C(CH3)2-CH2-, -C6H4-와 같은 직쇄 또는 분기된 지방족 또는 방향족 기이며; R6은 중합체 사슬에 대한 NH, 0, 또는 S 링커를 함유하는 직쇄 또는 분기된 지방족 또는 방향족 비하전된 기이다.
다른 실시양태에서, 결합기 함유 중합체의 대표적인 화학 구조는 도 2g에 도시되어 있다. R7 및 R8은, 서로 독립해서, 하나 이상의 중성 지방족 및 방향족 유기 잔기를 함유하는 기로부터 선택되며; 또 0, N, S, P, F, Cl, 등과 같은 헤테로원자를 함유할 수 있다.
더 다른 실시양태에서, 결합기 함유 중합체의 대표적인 구조는 도 2h에 도시되어 있다.
도 2b-2d 및 2f-2h 중의 설폰산기는 도시된 바와 같이 양성자화된 형태일 수 있을 뿐만 아니라 나트륨, 칼륨, 암모늄 등과 같은 적합한 대이온을 함유하는 염 형태일 수 있다.
IV . 본 명세서에 기재된 조성물을 혼입하는 장치
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 부착된 결합기를 갖는 고체 지지체는 장치에 혼입된다. 마이크로다공성 막과 같은 고체 지지체에 대하여 적합한 장치는 여과 카트리지, 캡슐, 및 포드(pods)를 포함한다. 예시적인 장치는 또한 참조에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 공개번호 US20100288690 Al호 및 US20080257814 Al호에 기재된 적층된 플레이트(stacked-plate) 여과 카트리지를 포함한다. 이들 장치의 경우에서, 고체 지지체는 중합체 하우징에 영구적으로 결합되며 또 상기 장치는 액체 도입구, 출구, 및 배기구를 갖고 또 보유된 액체의 부피를 최소화한다. 다른 예시적인 장치는 주름진(pleated) 필터 카트리지 및 나선식으로 권취된 필터 카트리지를 포함한다. 다른 예시적 장치는 크로마토그래피 컬럼이다. 크로마토그래피 컬럼은 유리, 금속, 세라믹 및 플라스틱과 같은 다수의 적합한 물질로부터 제조될 수 있다. 이들 컬럼은 최종 사용자에 의해 고체 지지체에 의해 팩킹되거나, 또는 제조자에 의해 미리 팩킹되어 팩킹된 상태로 최종 사용자에게 보내진다.
V. 본 명세서에 기재된 조성물 및 장치를 사용하는 방법
부착된 결합기(예를 들어, 양이온 교환 결합기)를 갖는 고체 지지체를 함유하는 장치는 단백질 응집물을 플로우 쓰루 모드로 제거하기 위해 사용될 수 있다. 분취 등급으로 분리하기 위하여 적용하기 전에, 상기 방법은 pH 및 도전성과 같은 적합한 용액 조건에 타당하게 개발되어야 하고 또 장치에 대한 단백질 부하 범위가 결정되어야 한다. 개발 및 타당화하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 실시된다. 이들은 보통 실시예에 설명된 Design of Experiments(DoE)를 포함한다.
상기 장치는 통상적으로 사용하기 전에 적절한 완충액을 사용하여 세정되고, 위생처리되고 또 평형화된다. 상기 단백질 용액은 소망하는 도전성 및 pH로 조정되며 또 이어 일정한 압력 또는 일정한 흐름에서 장치를 통하여 펌핑된다. 이 유출물을 수집하고 또 단백질 수율과 응집물 농도에 대해 분석한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 응집물 제거를 위한 장치는, 예를 들어, 참조에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 번호 7,118,675호에 기재된 바와 같이, 바이러스 입자의 크기를 기본한 제거를 확실하게 하도록 고안된 바이러스 여과 장치에 직접 연결된다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 장치를 사용한 플로우 쓰루 응집물 제거 단계는 단백질 정제 방법의 어느 위치에 배치될 수 있고, 예를 들어 항체 정제 방법에 배치될 수 있다. 하기 표 1은 밑줄로 표시된 하나 이상의 중간 단계로서 플로우 쓰루 응집물 제거를 혼입하는 단백질 정제 방법의 예를 나타낸다. 이들 방법의 다수의 변형이 이용될 수 있음을 알 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, "단백질 포획" 단계는 적어도 하기 2개 단계를 실시하는 것에 의해 청정화되거나 또는 청정화되지 않은 세포 배양액 샘플로부터 목적 단백질을 단리하는 것을 포함하는, 단백질 정제 방법 중의 단계를 지칭한다:
(i) 크로마토그래피 수지, 막, 모노리쓰, 직물 또는 부직 매질 상에 하나 이상의 목적 단백질의 흡착; 석출, 응집, 결정화, 용해성 소분자 또는 중합체 리간드에 대한 결합으로부터 선택된 어느 단계에 세포 배양액을 처리시키는 것에 의해 예를 들어 항체와 같은 목적 단백질을 포함하는 단백질 상을 얻는 단계; 및
(ii) 상기 단백질을 적합한 완충용액에 용출 또는 용해시키는 것에 의해 목적 단백질을 재구성하는 단계.
결합/용출 정제는 목적 단백질을 적합한 크로마토그래피 매질에 결합시키고, 결합 단백질을 경우에 따라 세척하며, 또 적절한 완충 용액으로 용출시키는 것으로 이루어지는 임의의 공정 단계이다.
플로우 쓰루 AEX 연마는 목적 단백질을 매질에 충분히 결합시키지 않고 적합한 AEX 크로마토그래피 매질을 통하여 목적 단백질의 용액을 흘려보내는 것으로 이루어지는 임의 공정 단계이다.
활성탄 플로우 쓰루는 참조에 의해 본 명세서에 포함된 계류중인 미국 가출원 번호 61/575,349호에 기재된 바와 같이 다양한 공정 관련 불순물을 제거하도록 고안된 임의의 정제 단계이다.
바이러스 여과는 바이러스 입자를 고도의 LRV로 보유하는 한편, 목적 단백질 거의 전부를 통과시키는 플랫 시트(flat sheet) 또는 중공 섬유 형태일 수 있는 다공성 막을 통한 단백질 용액의 유통으로 이루어진다.
단계 1 단계 2 단계 3 단계 4 단계 5
공정 A 항체
포획		 결합/용출
정제		 플로우 쓰로우
AEX 연마		 플로우 쓰로우
응집물
제거 		바이러스 여과
공정 B 항체
포획		 플로우 쓰로우
응집물
제거 		결합/용출
정제		 플로우 쓰로우
AEX 연마		 바이러스 여과
공정 C 항체
포획		 결합/용출
정제		 플로우 쓰로우
응집물
제거 		플로우 쓰로우
AEX 연마		 바이러스 여과
공정 D 플로우
쓰로우
응집물
제거 		항체
포획		 결합/용출
정제		 플로우 쓰로우
AEX 연마		 바이러스 여과
공정 E 항체
포획		 플로우 쓰로우
응집물
제거 		플로우 쓰로우
AEX 연마		 바이러스 여과
공정 F 항체
포획		 플로우 쓰로우
응집물
제거 		플로우 쓰로우
AEX 연마		 결합/용출
정제		 바이러스 여과
공정 G 항체
포획		 플로우 쓰로우
AEX 연마		 플로우 쓰로우
응집물
제거 		결합/용출
정제		 바이러스 여과
공정 H 항체
포획		 플로우 쓰로우
AEX 연마		 플로우 쓰로우
응집물
제거 		바이러스 여과
공정 I 항체
포획		 활성탄
플로우 쓰루		 플로우 쓰로우
AEX 연마		 플로우 쓰로우
응집물
제거 		바이러스 여과
상기 표 1에서, 항체 포획 단계뿐만 아니라 결합/용출 정제는 3개 모드로 동작될 수 있음을 알 수 있다: (1) 포획 매질에 표적 단백질을 로딩하고, 로딩을 중지한 다음 상기 매질을 세척하고 용출시키며 풀을 수집하는 뱃치 모드; (2) 로딩을 연속적으로 실시하고 예를 들어 3개 컬럼을 이용하는 연속적 다컬럼 크로마토그래피 과정의 경우에서 용출을 간헐적으로 실시하는 반-연속 모드; 및 (3) 로딩과 용출을 모두 연속적으로 실시하는 완전 연속 모드.
본 명세서에 기재된 플로우 쓰루 양이온 교환 고체 지지체와 함께 사용된 최적 유속은 고체 지지체의 응집물 제거 성능에 대하여 효과를 때때로 가질 수 있고 또 상기 고체 지지체가 바이러스 필터 상류에 위치하면, 바이러스 필터의 성능에 영향을 줄 수 있다. 상기 최적 유속은 목적 단백질 용액을 사용한 간단한 실험 세트로 용이하게 결정될 수 있다. 전형적은 유속은 약 0.05 내지 2 CV/min 범위에 속한다.
표 1에 기재된 일부 예시적 공정, 특히 공정 E, 공정 H, 및 공정 I는 용출 결합 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는 반면에, 본 명세서에 기재된 방법을 이용한 응집물 제거를 확실하게 한다. 결합 및 용출 양이온 교환 크로마토그래피 단계의 제거는 하류 정제 공정에 대하여 현저한 다수의 이점, 즉 공정 시간의 절약, 공정 실시의 간편함, 세정 및 세정 확인의 제거 등을 제공한다. 다른 강한 이점은 높은 도전성 용출을 제거하여 염 부가에 이은 이후의 희석없이 전체 하류 공정의 실시를 허용하는 것이다.
본 발명은 비제한적인 하기 실시예에 의해 예시된다. 상기 출원을 통하여 인용된 모든 참조문헌, 특허 및 공개 특허출원의 내용뿐만 아니라 도면은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
실시예
실시예 1. 양이온 교환( CEX ) 표면 변형 막의 제조
이 실험에서, 다양한 밀도의 결합기, 본 실시예의 경우에서는 이 경우에서는 음으로 하전된 설폰산 잔기를 이용하여 일련의 CEX 표면 변형 막을 제조하였다. 양이온 교환기의 밀도는 표면 변형 양이온에 사용된 반응성 용액의 제제에 의해 제어되었다. 낮은 밀도를 달성하기 위하여, 비하전 반응성 단량체, N,N-디메틸아크릴아미드가 상이한 양으로 부가되었다.
0 내지 4.8 중량%의 2-아크릴아미도-2-메틸프로판설폰산(AMPS), 0 내지 4.8 중량%의 N,N-디메틸아크릴아미드, 및 0.8 중량%의 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드를 함유하는 일련의 수용액을 제조하였다. 0.65 ㎛의 기공율 및 0.125 mm의 두께를 갖는 친수성 초고분자량 폴리에틸렌 막을 14 cm x 14 cm의 정사각형 조각으로 절단하고 각 조각을 상기 용액 중의 하나에 30초간 침지시켜 완전히 습윤시켰다. 과량의 용액을 제거하고, 상기 막을 불활성 분위기하에서 2 MRad의 전자빔 방사에 노출시켰다. 이어 상기 막을 탈이온수로 헹구고 또 공기 중에서 건조시켰다.
표 2는 제조된 CEX 표면 변형 막의 변이체를 수록한다. 리튬 이온 교환을 이용하여, 음이온기 밀도는 Membrane 8(DMAM 부가되지 않음)의 경우에 0.13 mmol/g 이었고 또 Membrane 7(1:1 AMPS:DMAM 중량기준)의 경우에 0.08 mmol/g이었고, 이들은 각각 34 및 21MM의 리간드 밀도에 상응한다.
실시예 2. 정적 능력 측정을 이용한 응집물 결합 선택성의 분석
이 실험에서, 실시예 1에서 다양한 밀도의 제조된 결합기를 갖는 CEX 막을 단백질 단량체 및 단백질 응집물을 결합하는 선택성에 대해 시험하였다.
약 15% 응집물을 함유하는, 부분적으로 정제된 모노클로날 항체(이후, MAb I이라 칭함)의 2 g/L 용액은 50 mM 아세트산 나트륨 완충액, pH 5.0에서 제조하였다. 14 mm 막 디스크를 아세테이트 완충액에 침지시킨 다음 0.5 mL의 항체 용액으로 옮겼다. 용액 바이얼을 15시간 동안 부드럽게 진탕시키고, 용액 중에 남겨진 분자량 종을 크기-배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 결과는 표 2에 나타낸다.
MAb의 일반적으로 낮은 수율은 막이 이 실험에서 낮은 용량으로 로딩된 것을 나타내지만, 변이체의 하나인 Membrane 7은 실질적으로 완전한 이량체 및 고분자량(HMW) 응집물의 제거를 나타내었다. 이는 강한 응집물 결합 선택성이 달성될 수 있음을 나타낸다.
Figure pat00005
실시예 3. 부분적으로 정제된 모노클로날 항체( MAND )에 대한 플로우 쓰루 모 드로 응집물 제거
대표적인 실험으로, 모노클로날 항체를 함유하는 샘플로부터 단백질 응집물을 플로우 쓰루 모드로 제거하기 위한 본 발명에 따른 막의 성공적인 사용을 나타내었다.
실시예 1로부터 얻은 Membrane 7을 전면 막 여과 면적 3.1 cm2 및 막 부피 0.2 mL를 갖는 배기되는 폴리프로필렌 장치내에서 밀봉시켰다. 상기 유형의 장치를 이후 "마이크로"장치라 칭한다. 4.5g/L로 정제된 MAb I를 pH 5.0, 50 mM 아세테이트 완충액에 투석시켰다. 생성물 물질(부분적으로 정제된 MAb I이라 칭함)을 ~3.0 mS/cm의 도전성을 갖는 pH 5, 50 mM 아세테이트 중의 5% 응집물을 1 g/L Mab I 농도로 희석시켰다. 상기 물질(약 80-100 mL)을 실시예 1로부터 얻은 Membrane 7 또는 8을 함유하는 0.2 mL 장치를 통과시키거나, 또는 Pall Mustang®S 막(매사추세츠 월탐에 소재하는 써모 피셔 사이언티픽 인코포레이션으로부터 구입할 수 있음)을 함유하는 0.18 mL Acrodisk 장치를 ~1 CV/분으로 통과시킨다. MAb를 통과하기 전에, 막 장치를 18 mΩ 물에 의해 습윤시키고 또 50 컬럼 부피(CV)의 50 mM 아세트산 나트륨, pH 5.0을 사용하여 평형화시켰다. 분석적 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용한 분석을 위해 MAb 용액의 플로우 쓰루를 수집하였다. 결과를 도 3a-3c에 도시한다. 실시예 1에서 확립된 바와 같이, Membrane 8에 비교하여 낮은 밀도의 AMPS 결합기를 갖는 Membrane 7은 응집물 결합에 대한 우수한 선택성을 제공함이 분명하다.
표 3은 약 20% 응집물 파과에서 측정된 3개 막의 응집물 결합용량을 요약한다. 나타낸 바와 같이, Membrane 7은 시중에서 구입할 수 있는 막, 예를 들어, Pall Mustang® S 막뿐만 아니라 Membrane 8과 비교하여 응집물 결합용량에서 거의 3배 증가를 나타낸다.
Figure pat00006
표 3. 약 20%의 이량체 파과에서 장치 로딩 및 결합용량
실시예 4. 부분적으로 정제된 모노클로날 항체( MAb II )에 대 대한 플로우 쓰 루 모드로 응집물 제거
다른 실험에서, 상이한 모노클로날 항체를 함유하는 샘플로부터 단백질 응집물의 제거에서 본 발명에 따른 막의 성공적인 사용을 나타낸다.
단백질 A 정제된 MAb II를 1M 트리스 염기를 사용하여 pH 5.0으로 조정하였고 또 5M NaCl 용액을 사용하여 3.4 mS/cm 도전성으로 조정하였다. 부분적으로 정제된 MAb II라 지칭되는 생성한 물질은 2.4% 응집물과 6 g/L 농도를 가졌다. 이 물질(약 18 mL)을 실시예 1로부터 얻은 Membrane 7 또는 Membrane 8을 함유하는 0.2 mL 장치를 통과시켰다. MAb를 막을 통과시키기 전에, 막은 18 mΩ 물에 의해 습윤시키고 또 50 컬럼 부피(CV)의 50 mM 아세트산 나트륨, pH 5.0으로 평형화시켰다. MAb 용액의 플로우 쓰루는 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용한 분석을 위해 수집하였다. 최초의 2개 분획은 각각 ~4.5 mL인 반면에, 나머지 10개 분획은 각각 0.85 mL이었다. MAb 처리 후, 상기 막을 20 CV의 50 mM 아세트산 나트륨, pH 5.0에 의해 세척하였다. 결합된 단백질은 50 mM 아세트산 나트륨, pH 5.0 + 1M NaCl을 사용하여 30 CV로 용출시켰다. 막 상에 로딩된 MAb II의 총량은 531 mg/ml이었다. MAb 단량체 수율은 플로우 쓰루 중의 단량체의 양 대 막을 통과한 총 단량체를 기본으로 하여 산출하였다.
도 4a에 도시된 바와 같이, ~13 g/L 응집물-로딩 이하의 Membrane 7의 파과 풀에서 매우 적은 응집물(풀 중의 <0.1%)이 보인 반면, 수집된 제1 분획에서도 Membrane 8의 경우에 응집물 파과가 관찰되며, 이는 Membrane 7에 대한 훨씬 더 우수한 응집물 용량을 나타낸다. Membrane 8의 경우에 파과 풀에서 응집물의 양은 0.8%이었다. 13 g/L의 응집물 로딩에서, 상기 단량체 수율은 Membrane 8 및 Membrane 7 각각에 대하여 93 및 86이었다. 수율은 약간 적지만, Membrane 7의 경우에서는 응집물 파과가 관찰되지 않았다. 나중의 응집물 파과는 더 높은 응집물 결합용량을 나타낸다. 이들 파과 곡선은 분취 규모 응집물 제거 방법 또는 장치의 디자인을 안내하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, Membrane 7을 함유하는 장치는 적어도 500 g/L로 로딩되어 <0.1% 응집물의 불량한 순도를 달성할 수 있다. 일반적으로, 단량체 수율을 증가시키고 또 공정과 관련된 전체적 비용을 절감하기 위하여 더 높은 로딩이 매우 바람직하다. 또한, 더 높은 로딩은 응집물 파과가 관찰될 때까지 로딩을 증가시키기거나 또는 용액 조건을 변형하는 것에 의해 달성될 수 있다. 플로우 쓰루 데이터는 응집물 제거를 위한 Membrane 7의 우수한 성능을 분명히 나타낸다.
도 4b는 2개의 상이한 로트의 Membrane 7을 사용하여 2개의 상이한 실시에 대한 파과 풀에서 단량체 수율 및 응집물 수준을 나타낸다. 실시(Run) 2는, 530 mg/ml인 실시 1과 비교하여, 700 mg/ml로 로딩되었다. 용액 조건(pH 및 도전성)은 양쪽 실시 모두 유사하지만, MAb 농도는 상이(실시 1: 6 g/L; 실시 2: 4.4 g/L)하였다. 풀에서 응집물의 양은 양쪽 실시에 대해 유사하였지만, 수율에서 약간 차이가 있었다(그러나, 수율에서의 차이는 MAID 농도를 측정하기 위해 사용된 분석 수법의 일반적 다변성에 기인할 수 있을 것으로 예상된다). 흥미로운 것은, 700 g/mL의 MAb 로딩에서도, 풀 중의 응집물의 양은 0.25%뿐(실시 2; 도 4b)이며, 이는 응집물에 대한 결합 용량이 > 15 g/L인 것을 나타낸다.
실시예 5. 부분적으로 정제된 모노클로날 항체( MAb III )를 함유하는 고 pH - 유도 응집물에 대한 플로우 쓰루 모드로 응집물 제거
다른 실험에서, 다른 모노클로날 항체, MAbIII를 함유하는 샘플로부터 단백질 응집물을 제거하는데 있어서 본 발명에 따른 막의 성공적인 사용을 나타낸다.
부분적으로 정제된 모노클로날 IgG 공급물(MAb III) 용액은 3.5 mS/cm 도전성을 갖는 pH 5, 50 mM 아세테이트 완충액에서 6 g/L으로 제조하였다. MAb III은 3.7% 전체 응집물(SEC-HPLC에 의해 측정됨)을 생성하기 위하여 높은 pH (11)로 미리 쇼크처리하였다. 여과 면적이 3.1 cm2 이고 부피가 0.2 mL인 마이크로여과 장치를 Membrane 7의 5개층을 이용하여 미리 성형하였다. MAb를 통과시키기 전에, 막을 18 mL 물에 의해 습윤시키고 또 50 컬럼 부피(CV)의 50 mM 아세트산 나트륨, pH 5.0에 의해 평형화시켰다. MAb 용액의 플로우 쓰루는 2.5 CV/min에서 였고 그 분획을 수집하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석에 사용하였다. 상기 막에 로딩된 MAb III의 총량은 930 mg/ml이었다. 플로우 쓰루 중의 단량체의 양 대 막을 통과한 전체 단량체의 양을 기준으로 하여 단량체 수율을 산출하였다.
MAb I 및 II에 대한 실시예 3과 4와 유사하게, Membrane 7은 도 5에 도시된 바와 같이, MAb III 응집물에 대하여 높은 선택성과 높은 결합 용량(>10 mg/mL)을 나타내었다.
실시예 6: 단백질 단량체 및 단백질 응집물의 정제
이 실험에서, 순수한 항체 단량체 및 응집물의 제제는 Membrane 7의 특징화를 위한 SEC를 사용하여 생성하였다.
단량체 및 응집물은 Sephacryl S-300 HR(GE Healthcare 제조) 수지를 사용하여 혼합물로부터 정제하였다. 4.5 mL의 상기 부분적으로 정제된 4.5-6 g/L의 MAb를 330 mL 컬럼을 통과시켰다. MAb 주입 이전에, 컬럼은 1 CV의 PBS에 의해 평형화시켰다. 2개의 용출 분획을 수집하였다: 응집물 및 단량체 분획. 상기 응집물 분획은 3000 MW 컷오프(cut off) 아미콘 UF 막을 이용하여 10x로 농축시키고 또 분석적 SEC를 이용하여 분석하였다. 상기 응집물 함량은 ~0.5 g/L 농도인 이들 분획에서 >70% 이었다.
실시예 7: 입체질량작용( steric mass action : SMA ) 모델 변수의 측정: 특징 적 전하(v) 및 SMA 평형 상수 (KSMA)
하기 실험은 본 발명에 따른 막에 대한 응집물 결합 선택성의 메카니즘을 도출하기 위하여 고안되었다. 입체질량작용(SMA) 모델(참고: 예를 들어, Brooks, C. A. and Cramer, S. M., Steric mass-action ion exchange: Displacement profiles and induced salt gradients. AIChE Journal, 38: pp. 1969-1978, 1992)을 이용하여, 표면(v)과의 응집물 상호작용의 수 및 단량체 및 응집물에 대한 친화성 상수(KSMA)를 측정하여, 표면에 대한 단량체와 응집물의 친화성을 반영하였다.
상기 SMA 모델은 비선형 이온교환 상호작용의 복잡성의 일부를 성공적으로 설명하기 위해 이용되고 있다. 상기 모델은 직접적인 단백질-리간드 상호작용으로 인하여 "상실된"(예를 들어, 또는 결합에 유용하지 않음)된 부위 및 단백질 입체장애로 인하여 입체적으로 "상실된" 부위를 모두 고려하는 것에 의해 단백질 분자에 이용할 수 없는 부위를 고려한다. 입체장애에 기인한 "상실된" 부위의 양은 결합된 단백질 농도에 비례하는 것으로 추정된다. 단일 성분 계에 대한 SMA 방정식은 다음과 같다:
Figure pat00007
식 중에서, Q 및 C는 각각 결합된 단백질 농도 및 유리 단백질 농도이고, K는 SMA 평형 결합 상수이며; v는 특징적 전하이고; σ는 입체 인자(steric factor)이며; Csalt는 유리 염 농도이고; Qsalt는 이온 교환에 유용한 결합된 염 농도이며; 또 A는 수지의 총 이온 용량(ionic capacity)이다. 특징적 전하는 이온성 상호작용을 통한 단백질에 의해 점유된 변형된 고체 지지체 상의 부위의 평균 갯수이고, 또 입체 인자는 흡착제에 결합시 단백질에 의해 입체적으로 장애되는 부위의 갯수이다.
흡착 등온선의 선형 영역의 경우(Q가 아주 작을 때), A >> (σ+ν)Q, 상기 방정식을 다음과 같이 근사치를 낼 수 있다:
Figure pat00008
용어 Q/C는 분배 계수(Kp)로 정의되고, 또 분배 계수의 비율은 선택성(S)으로 정의된다. 분배 계수를 결정하는 다른 방법은 선형 영역에서 흡착 등온선의 기울기를 계산하는 것에 의해서이다(예를 들어, 미국 특허번호 8,067,182호에 기재된 바와 같이).
일 실시양태에서, 0.2 mL 막 마이크로 장치(Membrane 7 또는 8 함유)는 물을 사용하여 습윤시키고, 또 20 CV(4 mL)의 50 mM 아세트산 나트륨, pH 5.0(완충액 A)에 의해 평형화시켰다. 100 ㎕의 정제된 단량체 또는 응집물(실시예에 기재된 정제 방법에 따라)을 0.5 g/L로 주입하였다. 결합된 단백질은 완충액 A 및 완충액 A + 500 mM NaCl의 20 CV 구배를 사용하여 용출시켰다. 등용매(isocratic) 실시에 대한 염 농도는 단백질 용출되는 염 농도(도전성) 범위를 기초로 하여 선택하였다. 상기 등용매 실시는 100 ㎕의 단백질을 막에 로딩하는 것에 의해 실시하였다. 용리 완충액은 완충액 A + 염(상기 기재한 바와 같이 단백질 용출 범위를 기본한 상이한 염 농도가 사용되었음)이었다. 용출 크로마토그램은 UV280 또는 UV230 시그널을 이용하여 모니터링하였고, 또 단백질 피크에서 보유 부피를 확인하였다. SMA 변수는 Pedersen, et al,(Pedersen, et. at., Whey proteins as a moldel system for chromatographic separation의 단백질s, J. Chrornatogr. B, 790: pp.161-173, 2003)에 기재된 바와 같은 등용매 용리 방법을 이용하여 결정하였다.
표 4는 Membrane 8 및 7에 대한 MAb I의 SMA 변수를 요약한다. 표 5는 Membrane 8 및 7에 대한 MAb II의 SMA 변수를 요약한다. KSMA는 Membrane 8 및 7 각각에 대하여 이온 용량(ionic capacity)을 34 및 21 mM으로 가정하여 결정하였다.
Figure pat00009
Figure pat00010
양쪽 MAb의 경우, 단량체 및 응집물의 특징적 양에서 차이가 Membrane 7의 경우에 더 높았고, 이는 단량체에 비하여 응집물의 경우에 더 많은 수의 상호작용이 있음을 나타낸다. 또한, 친화성(KSMA으로부터 볼수 있는 바와 같이)은 Membrane 8에 비하여 Membrane 7의 경우에 더 높다.
도 6a 및 6b에 도시된 바와 같이, 응집물에 대한 분배 계수(친화성의 측도)는 Membrane 8 및 7의 경우 모두에서 단량체에 대하여 관찰된 것에 비하여 더 높은 것이 관찰되었으므로, 단량체에 비하여 응집물에 대하여 더 강한 결합을 나타낸다. Membrane 8에 비하여 Membrane 7의 경우에서 상기 효과가 더 현저한 것으로 관찰되었고, 이는 응집물 제거에 대한 전자의 성능이 훨씬 더 우수한 것을 나타낸다.
도 7에 도시된 바와 같이, Membrane 7은 모든 염 농도에서 상이한 MAb(MAb I 및 MAB II)에 대하여 pH 5.0에서 Memberane 8보다 더 높은 선택성(S = 단량체의 Kp에 대한 응집물의 Kp의 비율)을 갖는다. 특히, 상기 선택성은 양쪽 막의 경우 모두에 염 농도 증가에 따라 증가한다. 또한, 흥미로운 것은 선택성 증가는 Memberane 8의 경우에서보다 Memberane 7의 경우에 훨씬 더 높은 것이며, 이는 더 낮은 결합기 밀도에서도 더 높은 선택성이 실현될 수 있음을 나타낸다. 또한 도 7에 도시된 바와 같이, 낮은 염 농도(또는 더 높은 선택성)에서도 최대 성능 효과(더 높은 단량체 수율 및 더 높은 응집물 제거)가 실현되었다.
실시예 7: Membrane 7에 대한 작동 윈도우의 측정
대표적인 실험으로서, DoE(실험 방법의 디자인)를 이용하여, 실제적 방법 윈도우, 즉 용액 pH, 이온 도전성 및 본 발명에 따른 막 상의 단백질 하중의 조합이 달성될 수 있음을 나타내었다. DoE 방법은 신뢰성있는 작동 조건을 확인하기 위하여 널리 인정되는 엔지니어링 도구이다(참고: 예를 들어, Anderson, M.J. and Whitcomb, P.J. 2010 Design of Experiments. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology. 1-22).
작동 윈도우를 결정하기 위하여 Membrane 7에 대하여 뱃치 모드로 3개 인자에 의한 DoE 방법을 이용한 중심 복합체 표면 반응을 실시하였다. 조사된 변수는 다음과 같았다: pH, 도전성 및 응집물 로딩량. 다양한 조건(표 5)에서 다양한 양의 부분적으로 정제된 MAb 1(0.5 - 2.1ML)를 13 ㎕의 막과 함께 20시간 동안 배양하였다. 상청액을 분석적 SEC를 이용하여 응집물 및 수율에 대하여 분석하였다.
Figure pat00011
표 6. 3개 인자의 실시 및 결과, 중심 복합체 표면 반응 DoE 방법
상기 DoE 연구는 수율 및 응집물 제거에 대한 막 성능을 결정하는데 있어 3개의 주요 동작 변수- 로딩량, pH 및 도전성을 강조하였고 또 소망하는 동작 윈도우를 정의하는 간단한 과정을 제시하였다. 결과는 도 8 및 9에 도시되어 있다.
실시예 8. 공급물 스트림 함유 열 유도 응집물을 사용한 항체 정제 동안 하 류 바이러스 필터의 보호에서 본 발명에 따른 막의 용도
본 실시예는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 양이온 교환기를 포함하는 막이 정제 방법에서 하류 바이러스 필터의 처리량을 성공적으로 증가시키기 위하여 사용될 수 있음을 나타낸다.
일반적으로, 항체 공급물을 예비처리하기 위한 표면 변형된 막은 바이러스 여과 이전에 사용될 수 있음이 이전에 보고되어 있다(참고: 예를 들어, 본 명세서에 참고문헌으로 포함되는, 미국 특허번호 7,118,675호 및 PCT 공개 번호 WO 2010098867호). 고 비용의 바이러스 여과로 인하여, 필터 처리량의 증가는 단백질 생성물의 최종 비용에 대하여 직접적인 영향을 미친다. 예를 들어, Viresolve® Prefilter 및 Viresolve® Pro Shield와 같은 이엠디 밀리포어 코포레이션으로부터 입수가능한 것을 비롯하여 바이러스 필터의 처리량을 증가시키기 위하여 다수의 시판품을 현재 시중에서 입수할 수 있다. 그러나, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 막은 현재 시중에서 입수가능한 종래 기술에 기재된 것과 비교하여 하류 바이러스 필터 보호에서 훨씬 더 우수하다.
바이러스 필터의 보호를 시험하기 위한 열 쇼크처리된 폴리클로날 IgG 공급물은 SeraCare Life Sciences (매사추세츠 밀포드 소재)로부터의 IgG, 인간 감마 글로불린 5% 용액, 카탈로그 # HS-475 IL을 pH 5, 50 mM 아세테이트에 8.1 또는 16.0 mS/cm(NaCl 사용)로 하기 과정에 의해 0.1 g/L로 제조하였다. 1리터의 0.1 g/L 용액(8.1 또는 16.0 mS/cm)을 170 rp메서 교반하면서 65℃로 설정된 항온 수조에서 1시간 동안 가열하여 온도에 도달하였다. 가열 및 교반으로부터 상기 용액 을 제거하고 3시간 동안 실온으로 닝각시킨 다음 4℃에서 철야로 냉장처리하였다. 다음 날 열 쇼크처리된 폴리클로날 IgG는 실온에 가온처리시켰다. 적절한 멸균 pH 및 도전성의 완충액(8.1 또는 16.0 mS/cm) 중에서 새로운 0.1 g/L 폴리클로날 IgG의 신선 용액을 제조하였다.
쇼크처리된 폴리클로날 IgG 스톡 용액 9 부피%를 사용하여 유통 시험에 대한 최종 용액은 0.1 g/L 폴리클로날 IgG 용액을 제조하였다. 최종 pH 및 도전성 조절은 10 M HCl, NaOH, 또는 4 M NaCl을 사용하여 실시하였다. 여과 면적 3.1 cm2의 마이크로 여과장치는 3층의 막을 사용하여 예비성형시켜서 Viresolve® Pro devices(이엠디 밀리포어 코포레이션 제조, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)와 1:1 비율의 시리즈에 넣었다. 양쪽 장치는 미리 습윤시켰고 또 배기되어 pH 5, 50 mM 아세테이트, 8.1 또는 16.0 mS/cm 완충액 만을 사용하여 공기를 제거하였다. 30 psi 일정 압력하에서, 15분간에 걸쳐 완충액 mL/분 처리량으로 초기 플럭스를 측정하여 초기 일정 플럭스 값을 결정하였다. 상기 공급물을 30 psi에서 열 쇼크처리된 폴리클로날 IgG 공급물로 바꾸어 측정하며 25% 초기 완충액 플럭스 만으로 플럭스가 분해될 때까지 시간에 대하여 플럿팅하였다. 열 쇼크처리된 폴리클로날 IgG의 총 처리량은 V75에서 L/m2로 측정하였고 또 폴리클로날 IGg/M2 막의 kg으로 전환하였다. 표 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, Membrane 7은 Membrane 8에 비하여 바이러스 제거 필터(부피 처리량 이상)에 대한 더 우수한 보호를 제공하였다.
Figure pat00012
실시예 9. 모노클로날 항체 공급 스트림을 사용한 하류 바이러스 필터의 보 호에서 본 발명에 따른 막의 용도
부분적으로 정제된 모노클로날 IgG 공급물(MAb 111) 용액은 pH 5, 50 mM 아세테이트 완충액에서 도전성 8.5 mS/cm(NaCl 부가 이용)으로 6 g/L으로 제조하였다. MAb III는 높은 pH(11)에서 미리 쇼크처리시켜 약 4% 전체 응집물(SEC-HPLC에 의해 측정)을 생성하였다. 여과 면적 3.1 cm2 의 마이크로 여과 장치는 3개층의 막을 사용하여 예비성형하였고 Viresolve®Pro 장치(이엠디 밀리포어 코포레이션 제조, 매사추세츠 빌레리카 소재)와 1:1 면적 비율로 넣었다. 양쪽 장치들은 미리 습윤시켰고 또 멸균 여과 완충액, pH 5, 50 mM 아세테이트, 8.5 mS/cm만을 사용하여 배기하여 공기를 제거하였다. 바이러스 막 또한 일정한 유속에서 10분간 예비콘디쇼닝처리하여 30 psi의 일정한 역압을 생성하였다. MAb III 용액은 상기 장치를 통하여 일정한 유량 200 L/(m2-h)으로 연속적으로 공급하고 또 역압 대 시간을 측정하였다. 전체 처리량 부피는 측정된 역압이 30 psi에 도달하는 종점에서 측정하였다. 30 psi 컷오프에서 처리량 L/m2은 막의 m2 당 MAb의 kg으로 전환하였다.
표 7로부터 알 수 있는 바와 같이, Membrane 7은 Membrane 8에 비하여 바이러스 제거 필터에 대한 더 우수한 보호(더 큰 부피의 처리량)를 제공하였다.
Figure pat00013
실시예 10. Membrane 7과 유체 소통하는 바이러스 필터의 성능에 대한 체류 시간의 효과
대표적 실험에서, 바이러스 여과성능에 대한 체류 시간의 효과를 조사하며, 상기 바이러스 필터는 플로우 쓰루 정제 방법에서 Membrane 7의 하류에 위치한다. Membrane 7을 함유하는 장치를 통한 낮은 유속 및 바이러스 여과 단계는 바이러스 필터의 더 높은 처리량을 초래함이 관찰된다.
막 면적이 3.1 cm2 이고 막 부피가 0.12 mL인 Membrane 7을 함유하는 3층 장치는, 막 면적이 3.1 cm2인 바이러스 여과 장치에 직렬로 연결된다. 20 mM 아세트산 나트륨, pH 5.0 완충액 중의 약 3 mg/mL의 폴리클로날 인간 lgG(Seracare)를 2개의 연결된 장치를 통하여 처리하였다. 이 실험은 2개의 별개의 유속, 100 및 200 LMH으로 실시하였다. 0.22 ㎛ 멸균 필터는 양이온 교환 크로마토그래피 장치와 바이러스 여과 장치 사이에 위치시킨다.
상이한 유속에서 상기 어셈블리에서의 압력을 측정하기 위한 압력 센서를 사용한다. 보통 약 50 psi의 압력은 바이러스 여과 막의 오염 또는 막힘을 나타낸다. 도 10에 도시한 바와 같이, 더 낮은 유속(즉, 100 LMH)에서 실험이 실시될 때, 샘플이 더 높은 유속(즉, 200 LMH)에서 가공될 때에 비하여 바이러스 여과 막을 통해 더 많은 샘플 부피가 가공(즉, 더 많은 처리량)될 수 있다. 이는 양이온 교환 크로마토그래피 장치에서 샘플의 더 긴 체류 시간에 기인할 수 있으며, 고분자량 IgG 응집물의 결합을 향상시킴으로써, 바이러스 필터의 조기 막힘을 방지할 수 있다.
실시예 11. 몇 개의 플로우 쓰루 불순물 제거 단계를 하나로 연결하기
이 대표적 실험에서는, 순도 및 수율 목적을 충족시키면서 몇 개의 불순물 제거 단계를 하나의 간단한 작업으로 연결하는 가능성을 나타낸다. 이것은 개별 장치, 즉 활성탄, 음이온 교환 크로마토그래피 장치(예를 들어, ChromaSorbTM), 인-라인 (in-line) 정적 혼합기 및/또는 pH 변화를 위한 서지 탱크, 본 명세서에 기재된 바와 같은 응집물 제거를 위한 양이온 교환 플로우 쓰루 장치 및 바이러스 제거 장치(예를 들어, Viresolve ® Pro)를 연결하는 것에 의해 실시된다.
셋업, 평형화 및 과정은 이하에 기재된다.
플로우 쓰루 정제 트레인은 5개의 주요 유닛 작업으로 이루어진다: 활성탄(전면에 임의의 심층(depth) 필터를 갖는), 음이온 교환 크로마토그래피 장치(예를 들어, ChromaSorb), 인-라인 정적 혼합기 및/또는 인-라인 pH 조절을 위한 서지 탱크, 응집물 제거를 위한 양이온 교환 플로우 쓰루 장치, 및 바이러스 여과 장치(예를 들어, Viresolve® Pro).
도 11은 이들 유닛 작업이 연결된 순서를 설명한다.
필요한 펌프, 압력, 도전성, 및 UV 센서는 부가적으로 포함될 수 있다.
모든 장치는 상이한 스테이션에서 개별적으로 습윤처리된 다음 조립된다. 상기 장치들은 습윤처리되고 또 제조자의 방법에 따라 예비처리된다. 간단히 말해, 심층 필터(AIHC 등급)는 100 L/m2의 물에 의해 세정된 다음 5 부피의 평형화 완충액 I(EBI; 1M 트리스-염기, pH 11에 의해 pH 7.5로 조절된 단백질 A 용출 완충액)에 의해 세정된다. 2.5 mL의 활성탄은 본 명세서에 참조에 의해 포함되는 동시계류중인 2011년 8월 19일 출원된 미국 특허 가출원번호 61/575,349호에 기재된 바와 같이 2.5 cm 옴니피트 컬럼에 팩킹하여 0.55 kg/L의 MAb 로딩량을 얻었다. 상기 컬럼을 10 CV 물에 의해 세척한 다음 pH가 pH 7.5로 안정화될 때까지 EB1로 평형화시켰다. 2개의 ChromaSorb 장치(0.2 및 0.12 mL)를 직렬로 연결하여 4.3 kg/L의 항체 로딩량을 얻었다. 상기 장치를 물을 사용하여 12.5 CV/min에서 적어도 10분간 습윤처리한 다음 5 DV EB1에 의해 습윤처리하였다. 12개 원소를 갖는 일회용 나선형 정적 혼합기(코플로 코포레이션 제조, 일리노이 캐리 소재)를 이용하여 인-라인 pH 조절을 실시하였다. Membrane 7을 함유하는 2개의 1.2 mL 장치를 병렬로 연결하여 응집물을 제거하여, 이들이 약 570 mg/mL의 항체로 로딩될 수 있었다.
이들을 10 DV의 물에 의해 습윤시킨 다음 5 DV 평형화 완충액 2(EB2; 1M 아세트산을 사용하여 pH 5.0으로 조절된 EB1)에 의해 습윤시켰다. 상기 장치들은 또한 5 DV(장치 부피)의 EB2 + 1M NaCl에 의해 처리된 다음 5 DV EB2에 의해 평형화되었다. 3.1 cm2 VireSolve® Pro 장치는 30 psi에서 가압된 물에 의해 적어도 10분 동안 습윤되었다. 유속이 3 연속 분 동안 일정하게 유지될 때까지 매분 유속을 모니터링하였다. 모든 장치가 습윤되고 평형화된 후, 이들은 상기 도에 도시된 바와 같이 연결되었다. EB1은 모든 압력치 및 pH 값이 안정화될 때까지 전체 시스템을 통하여 실시되었다. 평형화에 이어, 공급물(pH 7.5로 조절된 단백질 A 용출)을 상기 플로우 쓰루 트레인을 통과시켰다. 통과하는 동안, 샘플은 서지 탱크 이전 및 Viresolve ® Pro 이후에 수집되어 IgG 농도 및 불순물 수준(HCP, DNA, 누출된 PrA 및 응집물)에 대해 모니터링하였다. 공급물을 가공한 후, 시스템을 3 사부피(dead volumes)의 EB1에 의해 세척하여 장치 및 배관내에서 단백질을 회수하였다.
연결된 플로우 쓰루 방법에 대한 공급물은 뱃치 단백질 A 방법에서 생성된 MAb IV의 단백질 A 용출물이다. 이 MAb 중의 응집물의 천연 수준은 1%를 넘지 않으므로, 응집물의 수준을 증가시키기 위하여 특수한 과정이 개발되었다. 용액 pH를 수성 NaOH를 사용하여 부드럽게 교반하면서 11로 증가시키고, 또 1시간 동안 유지시켰다. 부드러운 교반하에 수성 HCl을 사용하여 pH를 pH 5로 서서히 낮추었다. 상기 pH 주기를 4회 이상 반복하였다. 응집물의 최종 수준은 약 5%로서, SEC에 의해 측정된 바와 같이 MAb IV 이량체 및 삼량체로 주로 이루어진다. 상기 공급물은 트리스-HCl 완충액, pH 7.5, 약 3 mS/cm 도전성으로 투석시켰다.
이 실시를 위해 가공된 MAb 공급물은 0.6 mL/min의 유속으로 13.5 mg/mL MAb IV 102 mL이다.
ChromaSorb 이후의 시간 함수로서 HCP 파과는 10 ppm의 상한 미만이다(도 12). 응집물은 CEX 장치에 의해 5%로부터 1.1%로 감소하였다(도 13). 연결된 방법의 MAb IV 수율은 92%이다. Viresolve® Pro 장치 상의 처리량은 >3.7 kg/m2이었다.
실시예 13-19는 막 대신 고체 지지체로서 양이온 교환 수지 또는 날개형 섬유(winged fibers)를 사용하여 응집물을 플로우 쓰루 모드로 제거하기 위한 조성물을 제조하는 용이성을 나타낸다.
실시예 13. AMPS / DMAM 그라프트된 공중합체를 사용하여 변형된 중합체성 강 양이온 교환(CEX) 수지의 제조
대표적 실험으로서, 음으로 하전된 설폰산 잔기인 결합기의 다양한 밀도를 갖는, 그라프트된 AMPS/DMAM 공중합체 표면(강한 CEX)을 갖는 일련의 양이온 교환(CEX) 수지를 제조하였다. 강한 양이온 교환기의 리간드 밀도 및 조성물은 표면 변형을 위해 사용된 반응성 용액의 조성에 의해 제어하였다. 강한 양이온 교환기의 밀도를 다양하게 하기 위하여, 하전된 및 비하전된 반응성 단량체, AMPS 및 DMAM을 다양한 몰비로 부가하였다.
기계적 교반기 및 적하 깔때기를 구비한 1000 mL의 삼구(three-necked) 플라스크는 830 mL의 소정 부피에 마킹하였다. 이 플라스크에서 8.25g의 수산화 나트륨을 429.34g의 탈이온수에 용해시켰다. 이 용액을 0℃로 냉각하고 또 13.68g의 AMPS를 교반하면서 몇 부분으로 서서히 부가하였다. 그 후, 26.22g의 DMAM을 부가하였다. 상기 용액의 pH 값은 65% 질산 및/또는 1M 수산화나트륨의 부가에 의해 6.0-7.0으로 조정하였다. 평균 입자 크기가 50 미크론인 400 mL의 침강된 중합체 베이스 비드 수지를, 서서히 교반(120 rpm)하면서, 상기 용액에 부가하였다. 이 반응 혼합물의 전체 부피는 탈이온수의 부가에 의해 830 mL(마킹된 바에 따라)로 조정하였다. 이 혼합물의 pH 값은 65% 질산의 부가에 의해 다시 pH 6.0 내지 7.0으로 조정하였다. 이 혼합물을 서서히 교반(120 rpm)하고 또 40℃로 가열하였다. 15 g의 탈이온수 중에 6.75g의 암모늄 세륨(IV) 니트레이트 및 2.96g의 65% 질산이 용해된 용액을 급격한 교반(220 rpm)하에서 신속하게 부가하였다. 이 반응 혼합물을 40℃에서 120 rpm으로 3시간 동안 교반하였다.
그 후, 이 반응 혼합물을 유리 프릿(기공율 P3) 상에 붓고 또 그 상청액을 흡입에 의해 제거하였다. 잔류하는 수지를 이하의 용액에 의해 연속적으로 세척하였다: 3 x 400mL 탈이온수; 10 x 400mL 1M 황산 + 0.2M 아스코르브산; 3 x 100mL 탈이온수; 10 x 400mL 뜨거운 탈이온수 (60℃); 2 x 400mL 탈이온수; 2 x 400mL 1M 수산화나트륨; 2 x 100mL 탈이온수; 탈이온수를 사용한 제2 세척 단계 동안, 25% 염산을 사용하여 pH를 6.5-7.0으로 조정하고; 2 x 400mL 70% 에탄올/30% 탈이온수; 2 x 100mL 탈이온수; 및 2 x 100mL 20% 에탄올/ 80% 탈이온수 + 150mM NaCl.
상기 세척 과정을 완료한 후, 상기 수지를 20% 에탄올, 80% 탈이온수 및 150mM NaCl의 용액 중에 1:1 (v/v) 현탁액으로 저장하였다.
표 9는 본 실시예에 따라 제조한 AMPS 및 DMAM의 다양한 몰비를 갖는 합성된 설폰산 함유 강한 CEX 수지를 수록한다.
본 실시예에 따라 제조된 합성된 CEX 수지
실시예 내부 로트 # DMAM 의 몰량
[ mol ] 		AMPS 의 몰량
[ mol ] 		DMAM / AMPS 의 몰비 이온
용량
[μ eq / mL ]
A 12LP-DZ105 0.30 0.075 4 32.5
B 12LP-DZ128 0.375 0.075 5 27.7
C 12LP-DZ129 0.45 0.075 6 24.7
D 12LP-DZ119 0.00 0.075 순수한 SO3 12.0
실시예 14. AMPS / DMAM 그라프트된 공중합체에 의해 변형된 중합체성 강한 양이온 교환(CEX) 수지를 사용하여 모노클로날 항체 공급물로부터 응집물 제거
수지 샘플 로트 # 12LPDZ119, 12LPDZ128, 및 12LPDZ129를 내부 직경 6.6 mm 의 Omnifit® 크로마토그래피 컬럼에 3 cm 층(bed) 높이로 팩킹하여 약 1 mL의 팩킹된 수지 층을 얻었다. AKTA Explorer 100(크로마토그래피 시스템)을 구비시키고 또 플로우 쓰루 크로마토그래피를 위한 컬럼을 스크리닝하기에 적절한 완충액으로 평형화하였다(표 10). 상기 수지 샘플 12LPDZ119, 12LPDZ128, 및 12LPDZ129를 함유하는 크로마토그래피 컬럼을 평형화 완충액과 함께 상기 크로마토그래피 시스템에 로딩하였다. 상기 공급물은 ProSep ® Ultra Plus Affinity Chromatography Media를 이용하여 정제된 IgG1(MAbB)이었고, 또 2M 트리스 염기를 사용하여 pH 5.0으로 조정하였다. 단백질 A 풀의 최종 MAbB 농도는 13.8 mg/mL이었고, 2.05% 응집된 생성물을 함유하였으며, 도전성은 약 3.5 mS/cm이었다. 상기 수지를 3분의 체류 시간과 414 mg/mL 로딩 밀도로 로딩하였다.
표 10: 수지 샘플 로트 # 12LPDZ119, 12LPDZ128, 및 12LPDZ129에 대한 크로마토그래피 실험을 실시하기 위한 방법
수지 12 LPDZ119 , 12 LPDZ128 , 및 12 LPDZ129 의 플로우 쓰루 크로마토그래피 스크리닝을 위한 방법
단계 용액 체류 시간 (분) 컬럼 부피
평형화 50 mM 아세트산 나트륨
pH 5 		3 8
로딩 50 mM 아세트산 나트륨
pH 5, 13.8 mg / mL mAbB 		3 30 (414 mg 단백질/mL 수지)
세척 50 mM 아세트산 나트륨 pH 5 3 10
스트립(strip) 50 mM 아세트산 나트륨 pH , 750 mM NaCl 3 5
제자리 세정 0.5 M NaOH 3 5
평형화 50 mM 아세트산 나트륨
pH 5 		3 5
플로우 쓰루는 2 mL 분획으로 수집하였고 또 NanoDrop 2000 분광광도계 상에서 전체 단백질 농도에 대해 에세이하며 또 응집물 함량은 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)에 의해 정량하였다. 응집물 정량 시험은 토소 바이오사이언스 TSKGel G3000SWXL, 7.8 mm x 30 cm, 5 ㎛ (카탈로그 # 08541) 컬럼에서 0.2M 인산 나트륨 pH 7.2의 평형화 완충액으로 실시하였다. 결과는 응집된 생성물에 비하여 훨씬 더 낮은 누적 단백질 로딩에서 mAbB 단량체성 단백질이 플로우 쓰루 분획에서 고농도로 수집됨을 나타낸다.
로트 # 12LPDZ119의 경우, 368.1 mg 또는 약 88.9%의 단백질이 누적 단백질 로딩 414 mg/mL에서 회수되었고, 응집물 수준은 플로우 쓰루 분획에서 2.05%에서 0.39%로 감소하였으며, 또 스트립(strip) 풀은 21.2% 응집물을 함유하며, 이는 상기 수지가 응집물을 선택적으로 유지하는 능력을 가짐을 제시한다.
로트 # 12LPDZ128의 경우, 357.9 mg 또는 약 86.4%의 단백질이 누적 단백질 로딩 414 mg/mL에서 회수되었고, 응집물 수준은 플로우 쓰루 분획에서 2.05%에서 0.52%로 감소하였으며, 또 스트립 풀은 13.4%의 응집물을 함유하며, 이는 상기 수지가 선택적으로 응집물을 유지하는 능력을 가짐을 제시한다.
로트 # 12LPDZ129의 경우, 359.9 mg 또는 약 86.9%의 단백질이 누적 단백질 로딩 414 mg/mL에서 회수되었고, 응집물 수준은 플로우 쓰루 분획에서 2.05%에서 0.39%로 감소하였으며, 또 스트립(strip) 풀은 16.8% 응집물을 함유하며, 이는 상기 수지가 응집물을 선택적으로 유지하는 능력을 가짐을 제시한다.
도 14는 로트 # 12LPDZ119에 대한 mAbB 단량체 및 응집물의 파과를 도시한다; 도 15는 로트 # 12LPDZ128에 대한 mAbB 단량체 및 응집물의 파과를 도시한다; 또 도 16은 로트 # 12LPDZ129에 대한 mAbB 단량체 및 응집물의 파과를 도시한다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 로트 # 12LPDZ119의 수지에 의해, 플로우 쓰루 분획에 수집된 MAbB 농도는 110 mg/mL 누적 단백질 로딩을 갖는 그의 원래 로딩 농도의 >90%에 도달한다. 반면에, 응집물 수준은 414 mg/mL 누적 단백질 로딩에서 원래 로딩 농도의 겨우 0.56% 또는 27.8%이었다. 이는 상기 수지가 높은 단백질 로딩에 대하여 응집된 종을 선택적으로 보유하면서, 단백질 단량체(MAb)는 그의 원래 초기 중량의 88.9% 정도 회수되도록 함을 알 수 있다.
도 15에 도시된 바와 같이, 로트 #12LPDZ128의 수지를 사용하면, 플로우 쓰루 분획에 수집된 mAbB 농도는 138 mg/mL 누적 단백질 로딩을 갖는 그의 원래 로딩 농도의 >90%에 도달한다. 반면에, 응집물 수준은 414 mg/mL 누적 단백질 로딩에서 원래 로딩 농도의 겨우 0.42% 또는 20.9% 이었다. 이는, 상기 수지가 높은 단백질 로딩에 대하여 응집된 종을 선택적으로 보유하면서 단백질 단량체는 전체 초기 중량의 86.4%로 회수되게 함을 보여준다.
도 16에 도시된 바와 같이, 로트 #12LPDZ129의 수지를 사용하면, 플로우 쓰루 분획에 수집된 mAbB 농도는 110 mg/mL 누적 단백질 로딩을 갖는 그의 원래 로딩 농도의 >90%에 도달한다. 반면에, 응집물 수준은 414 mg/mL 누적 단백질 로딩에서 원래 로딩 농도의 겨우 0.99% 또는 49.2% 이었다. 이는, 상기 수지가 높은 단백질 로딩에 대하여 응집된 종을 선택적으로 보유하면서 단백질 단량체는 전체 초기 중량의 86.9%로 회수되게 함을 보여준다.
실시예 15. AMPS / DMAM 그라프트된 공중합체에 의해 변형된 중합체성 강한 양이온 교환(CEX) 수지의 제조
250 mL의 유리 항아리에, Toyopearl HW75-F 크로마토그래피 수지의 64 ml의 습윤 케이크를 부가하였다. 이어, 115g의 5M 수산화나트륨, 18.75g의 황산 나트륨, 및 4mL의 알릴 글리시딜 에테르(AGE)를 수지 함유 항아리에 부가하였다. 상기 항아리를 50℃의 하이브리다이저(hybridizer)에 철야로 두고, 중간 속도로 회전시켰다. 다음 날, 수지를 소결된 유리 필터 어셈블리(이엠디 밀리포어 코포레이션 제조, 매사추세츠 빌레리카 소재)로 필터 여과시키고 또 그 습윤 케이크를 메탄올로 세척한 다음 탈이온수로 헹구었다. 유리 바이얼에, AGE 활성 수지의 10 mL 습윤 케이크를 부가하였다. 상기 유리 바이얼에, 0.2g의 암모늄 퍼설페이트, 0.3 g의 AMPS, 1.2g의 DMAM, 및 48g의 탈이온수를 부가하고 또 상기 바이얼을 16시간 동안 60℃로 가열하였다. 다음 날, 소결된 유리 필터 어셈블리(이엠디 밀리포어 코포레이션 제조, 매사추세츠 빌레리카 소재)로 필터 여과시키고 또 그 습윤 케이크를 메탄올과 탈이온수 용액으로 세척하며 또 상기 수지를 로트 # 1712로 라벨링하였다.
실시예 16. AMPS / DMAM 그라프트된 공중합체에 의해 변형된 중합체성 강 양 이온 교환(CEX) 수지를 사용한 모노클로날 항체 공급물로부터 다양한 체류 시간에서 응집물의 제거
실시예 14로부터 생성한 수지, 로트 # 1712를 내부 직경 6.6 mm를 갖는 Omnifit® 크로마토그래피 컬럼에 3 cm 층 높이로 팩킹하여 약 1 mL의 팩킹된 수지층을 얻었다. AKTA Explorer 100(크로마토그래피 시스템)을 구비하고 또 플로우 쓰루 크로마토그래피용 컬럼을 스크리닝하기 위하여 적합한 완충액에 의해 평형화시켰다(실시예 14와 유사). 상기 수지 샘플을 함유하는 크로마토그래피 컬럼은 평형화 완충액과 함께 크로마토그래피 시스템에 로딩하였다. 상기 공급물은 ProSep® Ultra Plus Affinity Chromatography Media를 사용하여 정제된 IgG1 (mAb5) 공급물이었고, 또 2M 트리스 염기를 사용하여 pH 5.0으로 조정하였다. 단백질 A 풀의 최종 농도는 4 mg/mL로 희석시켰고, 5.5% 응집된 생성물을 함유하였고, 또 약 3.2 mS/cm의 도전성을 가졌다. 상기 수지를 1, 3 또는 6분의 체류 시간 및 144 mg/mL의 로딩 밀도로 로딩하였다. 3분 체류 시간에 대한 스트립 피크 분획은 95.6%의 응집물을 함유하였고, 이는 응집된 종에 대한 높은 수준의 선택성을 나타낸다. 결과를 하기 표 11에 예시한다.
표 11은 6, 3 또는 1분의 체류 시간에서 pH 5.0에서 MAb5를 갖는 로트 #1712에 대한 단량체 및 응집물의 체류를 도시한다. 표 11에 나타낸 바와 같이, 평균적으로, 단량체 종은 모든 시험된 체류 시간에 있어서 응집된 종에 비하여 비교적 초기의 공급 농도에 가까운 농도에서 수집될 수 있고, 이는 선택성이 비교적 유동 속도에 무감각한 것을 제시한다.
플로우
쓰루 수집 		누적
단백질
로딩
밀도 		6, 3 또는 1분의
체류 시간의 평균 		6 분
체류 시간 		3 분
체류 시간 		1 분
체류 시간
분획 # (mg/mL) 플로우
쓰루 중의
% 단백질		 % 응집물 % 응집물 % 응집물
1 16 13.5 0.0% 0.0% 0.0%
2 32 94.3 0.0% 0.0% 0.0%
3 48 94.4 0.0% 0.0% 0.0%
4 64 95.2 0.0% 0.0% 0.0%
5 80 98.3 0.5% 0.0% 0.0%
6 96 100.0 0.7% 0.3% 0.0%
7 112 99.3 1.1% 0.9% 2.1%
8 128 100.0 2.3% 1.6% 2.8%
9 144 100.0 3.1% 3.6% 4.8%
도 17은 pH 5 및 3분 체류 시간에서 MAb5를 갖는 로트 # 1712의 크로마토그램을 도시한다. 도 17에 도시된 바와 같이, 생성물의 대부분은 플로우 쓰루에서 수집되었고 또 이것은 단백질 UV 미량의 비교적 신속한 파과에 의해 표시된다. 스트립 피크 크기는 일반적으로 로딩된 상태 및 전체 질량을 기본으로 다변하지만, 5.5% 응집물만을 가졌던 로딩 물질과 비교하여 95.6%에서 응집된 종이 비교적 풍부하였다.
실시예 17. 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 사용에 이어 크로마토그래피 수지를 사용한 모노클로날 항체의 정제
본 명세서에 기재된 대표적 실험으로서, 모노클로날 항체는 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 사용에 이어 본 발명에 따른 크로마토그래피 수지의 사용에 의해 정제되었다. 이 실험의 결과는 이 방법이 플로우 쓰루 모드로 실시되면, 도전성의 증가 또는 희석의 사용을 필요로 하지 않는다는 놀라운 발견을 나타낸다.
IgG1(MAb5)은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포의 세포 배양액에서 발현되었다. 이 세포 배양액은 심층 여과에 이어 멸균 여과의 2단계에 의해 청정화되었다. 0.5 mg/mL mAb5를 함유하는 청정화된 세포 배양액은 ProSep® Ultra Plus Affinity Chromatography Media (단백질 A)를 이용하여 먼저 정제하였다. 사용된 상기 단백질 A 크로마토그래피 용출 완충액은 100 mM 아세트산이었다. 상기 단백질 A 용출 풀은 2M 트리스 염기를 사용하여 pH 5.0으로 조정하였고 또 생성한 용액은 약 3.5 mS/cm의 도전성을 가졌다. 수지 로트 # 1712는 3분 체류 시간에서 본 명세서에 기재된 플로우 쓰루 모드로 실시하였고 또 플로우 쓰루 분획을 수집하고 또 소량의 등분량(aliquots)을 분석에 사용하였다.
플로우 쓰루 분획을 모으고, pH 7.5로 조정하며, 또 염-내인성 음이온 교환 막 흡착제이고 5 kg/L로 로딩된 ChromaSorb를 사용하거나 또는 음이온 교환 수지로서 150 mg/mL로 로딩된 Fractogel TMAE를 사용하여 플로우 쓰루 모드로 실시하였다. 상기 분획은 단백질 농도, 응집물 수준, 침출된 단백질 A, 및 중국 햄스터 난소 단백질(CHOP)에 대해 에세이하였다. 결과를 하기 표 12에 나타낸다.
Figure pat00014
전형적으로, 크로마토그래피 정제 공정은 전통적인 결합-및-용출 양이온 교환 크로마토그래피를 음이온 교환 크로마토그래피 이전의 단계로 포함하며 또 음이온 교환 플로우 쓰루 크로마토그리피에 적합한 수준으로 도전성을 감소시키기 위하여 희석 단계 또는 완충액 교환 단계를 더 필요로 한다. 그러나, 표 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 양이온 교환 매질을 사용한 본 명세서에 기재된 공정들은 동작을 위하여 도전성 증가를 필요로 하지 않으며, 또 따라서 정제 단계 이전에 희석 단계 또는 완충액 교환 단게를 필요로 하지 않는다.
실시예 18. AMPS / DMAM 그라프트된 공중합체에 의해 변형된 강 양이온 교 환(CEX) 날개형(winged) 섬유의 제조
대표적 실험으로서, 양이온 교환 날개형(winged) 섬유를 고체 지지체로서 사용하였다.
1L의 유리 항아리에, 20g의 건조 나일론 여러갈래(multi-lobed) 또는 날개형 섬유를 400 g의 4M 수산화나트륨, 24 g의 황산 나트륨, 및 160 mL의 알릴 글리시딜 에테르(AGE)와 조합하였다. 상기 항아리를 중간 속도로 회전시키면서 50℃에서 하이브리다이저에 철야로 두었다. 다음 날, 상기 섬유를 소결된 유리 필터 어셈블리를 여과시키고 또 섬유들을 메탄올로 세척하고 또 Milli-Q 물에 의해 헹구었다. 하루 뒤, 섬유를 물로 세척한 다음 메탄올로 세척한 다음 다시 물로 세척하고, 흡입하여 건조 케이크를 얻으며 진공 오븐중 50℃에서 하루 동안 건조시켰다. 생성한 샘플을 샘플 #1635로 표시하였다. 3개의 별개의 유리 바이얼에, 샘플 #1635, AGE 활성화된 섬유의 건조 케이크를 2 그램을 측량하고 그라프팅을 위한 부가적 변형을 위하여 유리 바이얼에 부가하였다. 이 유리 바이얼에, 암모늄 퍼설페이트, AMPS, DMAM, 및 탈이온수를 표 13에 규정된 양으로 부가하고 또 상기 바이얼을 16시간 동안 계속 회전하면서 60℃로 가열하였다. 그 다음 날, 섬유 샘플을 소결된 유리 필터 어셈블리를 여과시키고 또 습윤 케이크를 탈이온수 용액으로 세척하였다. 상기 섬유를 함유하는 바이얼을 로트 # 1635-1, 1635-2, 및 1635-5로 표시하였다. 이어, 로트 #1635-5를 작은 이온 용량에 대해 적정하여, 약 28 μ몰/mL인 것으로 밝혀졌다. 샘플 #1635-1 및 #1635-2는 28 μ몰/mL 미만의 작은 이온 용량을 갖는 것으로 추정되었다.
성분 #1635-1 #1635-2 #1635-5
섬유 (g) 2.0 2.0 2.0
암모늄 퍼설페이트 (g) 0.18 0.18 0.18
AMPS (g) 0.48 0.60 0.72
DMAM (g) 0.48 0.60 0.72
물 (g) 28.86 28.62 28.38
실시예 19: AMPS / DMAM 그라프트된 공중합체에 의해 변형된 강 양이온 교 환(CEX) 날개형 섬유를 사용한 모노클로날 항체 공급물로부터 응집물의 제거
실시예 17로부터 얻은 생성한 변형된 날개형 섬유, 로트 # 1635-1, #1635-2, #1635-5를 내부 직경 6.6 mm의 Omnifit® 크로마토그래피 컬럼에 층 높이 3 cm로 팩킹하여 약 1 mL의 팩킹된 섬유층을 얻었다. AKTA Explorer 100(크로마토그래피 시스템)을 구비하고 또 플로우 쓰루 크로마토그래피(실시예 13과 유사)용 컬럼을 스크리닝하기에 적절한 완충용액으로 평형화시켰다. 상기 날개형 섬유 샘플을 함유하는 크로마토그래피 컬럼은 평형화 완충액과 함께 크로마토그래피 시스템에 로딩하였다. 상기 공급물은 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였고, 또 2M 트리스 염기를 사용하여 pH 5.0으로 조정하였다. 단백질 A 풀의 최종 농도는 4 mg/mL이었고 또 5.5% 응집된 또는 HMW 생성물을 함유하였다. 섬유 로트 # 1635-1 및 로트 # 1635-2에 의해 팩킹된 컬럼을 64 mg/mL의 로딩 질량으로 로딩하고 또 섬유 로트 1635-5에 의해 팩킹된 컬럼은 80 mg/mL의 로딩 질량으로 로딩하였다. 결과를 하기 표 14에 나타낸다.
Figure pat00015
본 명세서는 참조에 의해 본 명세서에 포함되는 인용문헌의 가르침을 참조하면 가장 완전하게 이해될 것이다. 본 명세서 내의 실시양태는 본 발명에서 실시양태의 예시로서 제공되며 그 범위를 제한하는 것이 아니다. 당업자들은 다수의 다른 실시양태가 본 발명에 포함될 수 있음을 인식하고 있을 것이다. 모든 문헌 및 발명은 그 내용 전체로 참조에 의해 포함된다. 참조에 의해 포함된 것이 본 명세서와 상충되거나 또는 일치하지 않으면, 본 발명의 명세서가 이러한 것을 대체할 것이다. 본 명세서에서 참조문헌의 인용은 이러한 참조문헌이 본 발명에 대한 종래 기술로 인정하는 것은 아니다.
다르게 나타내지 않는 한, 성분, 세포 배양액, 처리 조건 등 특허청구범위를 비롯한 본 명세서에서 사용된 양을 나타내는 모든 숫자는 용어 "약"에 의해 모든 경우에서 변형될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 다르게 나타내지 않는 한, 숫자 변수는 근사치이며 또 본 발명에 의해 추구되는 소망하는 특성에 따라서 달라질 수 있다. 다르게 나타내지 않는 한, 일련의 원소 앞에 나오는 용어 "적어도"는 일련의 모든 원소를 지칭하는 것으로 이해된다. 당업자들은 통상의 실험 이외의 것을 이용하여, 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시양태에 대한 다수의 등가물을 얻을 수 있음을 인식하거나 확실하게 알 것이다. 이러한 등가물은 이하의 특허청구범위에 포함되는 것으로 이해된다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 많은 변형 및 변이는 본 발명의 정신과 범위로부터 벗어나지 않고 실시될 수 있다. 본 명세서에 기재된 특정 실시양태는 오로지 예로 제공된 것이고 어떠한 의미로든 제한을 의미하지 않는다. 본 명세서 및 실시예는 예시적인 것으로 간주되며, 본 발명의 참된 범위와 정신은 이하의 특허청구범위에 의해서 표시되는 것으로 한다.

Claims (5)

  1. 다음 화학식 구조를 포함하는 중합체:
    Figure pat00016

    식 중에서, R1은 양이온 교환기이고; R2는 하전된 기를 함유하지 않는 지방족 또는 방향족 유기 잔기이며; R3은 2 이상의 중합체 사슬 사이의 하전되지 않은 지방족 또는 방향족 유기 링커이고; x, y, 및 z는 중합체 중의 각 단량체의 평균 몰 분획으로, y>x 이며; 또 m은 링커의 다른 말단에 부착된 유사한 중합체 사슬을 나타냄.
  2. 하기 화학식 구조를 포함하는 중합체:
    Figure pat00017

    식 중에서, x, y, 및 z는 중합체 중의 각 단량체의 평균 몰 분획으로, y>x 이며; 또 m은 제2 중합체를 나타냄.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 중합체가 고체 지지체에 부착되는 중합체.
  4. 하기에 직사각형으로 나타낸 고체 지지체에 공유 결합제를 통하여 그라프트되는, 하기 화학식 구조를 포함하는 중합체:
    Figure pat00018

    식 중에서, R1은 양이온 교환기이고; R2는 하전된 기를 함유하지 않는 지방족 또는 방향족 유기 잔기이며; x 및 y는 y>x일 때 중합체 중의 각 단량체의 평균 몰 분획임.
  5. 2 이상의 단량체를 포함하고 또 결합을 통하여 크로마토그래피 수지에 그라프트되어 있는, 하기 화학 구조식을 포함하는 중합체:
    Figure pat00019

    식 중에서, x 및 y는 중합체 중의 각 단량체의 평균 몰 분획으로, y>x임.
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