JP5768070B2 - フロースルー式での生物製剤からのタンパク質凝集体の除去 - Google Patents

Description

本出願は、それぞれがその全体として参照により本明細書に組み込まれる２０１２年３月１２日に出願した米国仮特許出願第６１／６０９，５３３号および２０１２年６月２９日に出願した米国仮特許出願第６１／６６６，５７８号の優先権の利益を主張するものである。

本発明は、フロースルー式で対象の生成物を含有する生物製剤からタンパク質凝集体を除去する方法に関する。

タンパク質凝集体は、対象の生成物、例えば、治療用タンパク質または抗体分子を含有する生物製剤から除去する必要がある重要な不純物の１つである。例えば、タンパク質凝集体および他の混入物質は、生成物を診断、治療または他の応用に使用することができる前に対象の生成物を含有する生物製剤から除去しなければならない。さらに、タンパク質凝集体は、ハイブリドーマ細胞系から収集した抗体製剤においてもしばしば見出され、その意図した目的のための抗体製剤の使用の前に除去されなければならない。これは、治療応用の場合に、また食品医薬品局の承認を得るために特に重要である。

タンパク質凝集体としばしば単量体分子である生物製剤中の対象の生成物との物理的および化学的性質の間にしばしば類似性があるので、タンパク質凝集体の除去は、困難なものであり得る。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを包含する生物製剤からのタンパク質凝集体の除去のための多種の方法が当技術分野に存在する。

対象の生成物からのタンパク質凝集体の分離のためのいくつかの結合および溶出クロマトグラフィー方法が公知である。例えば、ヒドロキシアパタイトは、タンパク質、核酸並びに抗体のクロマトグラフィー分離に用いられている。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいて、カラムを通常平衡化し、試料を低濃度のリン酸緩衝液に加え、次に吸着されたタンパク質をリン酸緩衝液の濃度勾配下で溶出させる（例えば、Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７３巻、５２２−５２９頁（２０００年）参照）。しかし、いくつかの事例において、研究者らは、ヒドロキシアパタイトから抗体を選択的に溶出することができず、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが十分に純粋な生成物をもたらさないことを見出した（例えば、Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４７６巻、２５７−２６８頁（１９８９年）；Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７３巻、５２２−５２９頁（２０００年）参照）。

さらに、市販のクロマトグラフィー樹脂であるセラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）が樹脂の形態でのタンパク質凝集体の除去のために使用されてある程度の成功をおさめた（ＢＩＯＲＡＤ ＣＯＲＰ、例えば、米国特許公開番号ＷＯ／２００５／０４４８５６も参照）が、それは、一般的に高価であり、タンパク質凝集体に対する低い結合能を示す。

結合および溶出陽イオン交換クロマトグラフィー方法も記載され、これは、凝集体の除去のために時折産業に用いられている（例えば、米国特許第６，６２０，９１８号参照）が、単量体の収率と凝集体の除去との好ましくない相殺を行う必要があることがしばしば認められる。モノクローナル抗体の溶液からの凝集体の除去方法の最近のレビューにおいて、結合および溶出クロマトグラフィー式に関して、「陽イオン交換クロマトグラフィーは、凝集体と単量体を分離する有用な方法であり得るが、高生産能力を有する高収率ステップを開発することは困難であり得る」ことが指摘された。例えば、Ａｌｄｉｎｇｔｏｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ、８４８巻（２００７年）、６４−７８頁を参照のこと。

結合および溶出方法および当技術分野で公知のサイズ排除クロマトグラフィー方法と比べて、フロースルー式でのタンパク質精製は、より良好な経済的側面、単純さ、時間および緩衝液の節約のため、より望ましいとみなされている。

従来技術において疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）媒体に基づくフロースルー凝集体除去を実施する試みがなされた（例えば、米国特許第７，４２７，６５９号参照）。しかし、ＨＩＣに基づく分取法は、一般的に困難なプロセス開発、狭い操作ウインドウおよび緩衝液に要求される高い塩濃度のため、狭い適用可能性を有する。

弱分配クロマトグラフィー（ＷＰＣ）は、他の方式のクロマトグラフィー操作であり、生成物の結合が結合および溶出クロマトグラフィーの場合より弱いが、フロースルークロマトグラフィーの場合より強い（例えば、米国特許第８，０６７，１８２号参照）。しかし、ＷＰＣは、結合および溶出方法と比較して不純物除去に関する狭い操作ウインドウおよびより低い結合能力を包含する関連する特定の欠点も有する。

国際公開第２００５／０４４８５６号 米国特許第６，６２０，９１８号明細書 米国特許第７，４２７，６５９号明細書 米国特許第８，０６７，１８２号明細書

Ｇｉｏｖａｎｎｉｎｉ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７３巻、５２２−５２９頁（２０００年） Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４７６巻、２５７−２６８頁（１９８９年） Ａｌｄｉｎｇｔｏｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ、８４８巻（２００７年）、６４−７８頁

従来技術において記載されたフロースルー方法の一部のものは凝集体に結合すると報告されたが、対象の生成物と比べた凝集体への結合の特異性は、低いと思われる。さらに、例えば、二量体、三量体および四量体などの低次のタンパク質凝集体への結合の高い特異性を示す従来技術における公知の方法は存在しないと思われる。

（発明の要旨）
本発明は、生物医薬組成物中のタンパク質凝集体から対象の生成物、例えば、治療用抗体または単量体タンパク質を分離するための新規且つ改善された組成物並びにそのような組成物を用いるフロースルー方法を提供する。本明細書で述べる組成物および方法は、例えば、単量体タンパク質から分離することが一般的に困難である、二量体、三量体および四量体などの低次のタンパク質凝集体から対象の単量体タンパク質を分離するのに特に有用である。

本発明は、フロースルー式で対象の生成物（すなわち、単量体分子）と比べて表面へのタンパク質凝集体の結合の選択性を高め、それにより対象の生成物からタンパク質凝集体を分離することに少なくとも部分的に基づいている。本発明は、特定の密度の陽イオン交換結合基を有する表面の固有の設計と、それにより、単量体分子と比較して、より多数のタンパク質凝集体が表面に結合することを促進することにより、これを達成することができる。

本発明によるいくつかの実施形態において、試料中のタンパク質凝集体から対象の単量体タンパク質を分離するフロースルークロマトグラフィー方法であって、試料を、約１−約３０ｍＭの密度で１つまたは複数の陽イオン交換結合基が結合した固体担体と接触させるステップを含み、固体担体は、タンパク質凝集体に選択的に結合し、それにより、タンパク質凝集体から対象の単量体タンパク質を分離する、フロースルークロマトグラフィー方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明による方法に用いる固体担体は、クロマトグラフィー樹脂、膜、多孔性モノリス、織布および不織布から選択される。

いくつかの実施形態において、固体担体は、クロマトグラフィー樹脂または多孔質ビーズを含む。

いくつかの実施形態において、固体担体は、多孔質ポリビニルエーテルポリマービーズまたは多孔質架橋ポリメタクリレートポリマービーズである。

様々な実施形態において、クロマトグラフィー樹脂または多孔質ビーズは、約５０ミクロン、約１０から約５００ミクロン、または約２０から約１４０ミクロン、または約３０から約７０ミクロンの平均粒径を含む。

いくつかの実施形態において、固体担体は、平均粒径が１０ミクロンから５００ミクロン、または２０から２００ミクロン、または２０から９０ミクロンである、クロマトグラフィー樹脂または多孔質ビーズから選択される。特定の実施形態において、クロマトグラフィー樹脂または多孔質ビーズは、約５０ミクロンの平均粒径を有する。一般的に、選択性は、粒径を減少させることにより改善し得る。当業者は、平均粒径は、個別の応用またはプロセスの必要に基づいてタンパク質凝集体を結合するためにあるレベルを選択的に維持しながら調節することができることを理解すると思われる。

いくつかの実施形態において、タンパク質凝集体は、例えば、二量体、三量体および四量体などの低次のタンパク質凝集体である。

他の実施形態において、タンパク質凝集体は、例えば、五量体および高次のものなどの高次のタンパク質凝集体である。

いくつかの実施形態において、本発明による方法に用いる陽イオン交換基は、スルホン酸基、硫酸基、ホスホン酸基、リン酸基およびカルボキシル基からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、単量体タンパク質は、抗体である。特定の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。他の実施形態において、単量体タンパク質は、組換えタンパク質、例えば、Ｆｃ融合タンパク質である。さらに他の実施形態において、単量体タンパク質は、非抗体分子である。

本発明によるいくつかの実施形態において、試料中のタンパク質凝集体から対象の単量体タンパク質を分離するフロースルークロマトグラフィー方法であって、試料を、約１−約３０ｍＭの密度で１つまたは複数の陽イオン交換結合基が結合した固体担体と接触させるステップを含み、固体担体は、単量体と比べて約１０を超える選択性でタンパク質凝集体に結合して、それにより、タンパク質凝集体から対象のタンパク質を分離する、フロースルークロマトグラフィー方法を提供する。

他の実施形態において、試料中のタンパク質凝集体の濃度を低下させるフロースルークロマトグラフィー方法であって、（ａ）対象のタンパク質および約１−約２０％のタンパク質凝集体を含む試料を用意するステップと、（ｂ）試料を、約１−約３０ｍＭの密度で１つまたは複数の陽イオン交換結合基が結合した固体担体と接触させるステップと、（ｃ）試料のフロースルー流出物を収集するステップとを含み、流出物中のタンパク質凝集体の濃度を（ａ）における凝集体の濃度と比べて少なくとも５０％低下させ、それにより、試料中のタンパク質凝集体の濃度を低下させる、フロースルークロマトグラフィー方法を提供する。

本発明の方法によるいくつかの実施形態において、流出物中の対象のタンパク質の濃度は、（ａ）における対象のタンパク質の濃度の少なくとも８０％である。

いくつかの実施形態において、前記固体担体と接触させる凝集体を含有する試料のイオン伝導度は、約０．５−約１０ｍＳ／ｃｍの範囲内にある。

いくつかの実施形態において、本明細書で述べる対象のタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）の精製のためのプロセスは、結合および溶出陽イオン交換クロマトグラフィーステップを必要としない。したがって、そのようなプロセスは、溶出溶液への塩の添加および後の希釈ステップの使用の必要をなくすものである。

いくつかの実施形態において、伝導度の増加を必要としない、対象のタンパク質（例えば、モノクローナル抗体）の精製のためのプロセスを提供する。したがって、そのようなプロセスは、後のフロースルー陰イオン交換ステップを実施する前に伝導度を低下させるために陽イオン交換ステップ後の希釈を必要としない。

固体担体上に結合されている、陽イオン交換基を含むポリマーも本発明により含まれる。

いくつかの実施形態において、そのようなポリマーは、以下の化学構造を含む。

ここで、Ｒ^１は、陽イオン交換基であり、Ｒ^２は、荷電基を含まない任意の脂肪族または芳香族有機残基であり、Ｒ^３は、２つ以上のポリマー鎖間の任意の非荷電脂肪族または芳香族有機リンカーであり、ｘ、ｙおよびｚは、ポリマー中の各モノマーの平均モル分率であり、ｙ＞ｘであり、記号ｍは、リンカーの他端に結合している類似のポリマー鎖を示す。

他の実施形態において、本発明によるポリマーは、以下の化学構造を含む。

ここで、ｘ、ｙおよびｚは、ポリマー中の各モノマーの平均モル分率であり、ｙ＞ｘであり、記号ｍは、リンカーの他端に結合している類似のポリマー鎖を示す。

さらに他の実施形態において、本発明によるポリマーは、ポリマーが固体担体上に共有結合によりグラフトされている、以下の化学構造を含む。

ここで、Ｒ^１は、陽イオン交換基であり、Ｒ^２は、荷電基を含まない任意の脂肪族または芳香族有機残基であり、ｘおよびｙは、ポリマー中の各モノマーの平均モル分率であり、ｙ＞ｘである。

いくつかの実施形態において、本発明によるポリマーは、以下の化学構造を含む。

ここで、ｘおよびｙは、ポリマー中の各モノマーの平均モル分率であり、ｙ＞ｘであり、ポリマーは、クロマトグラフィー樹脂上に結合によりグラフトされている。

様々な実施形態において、ポリマーは、固体担体に結合されている。

本発明による様々な実施形態において、対象の生成物を含有する流出物を１つまたは複数の分離方法に供し、ここで、流出物は、２０％未満、または１５％未満、または１０％未満、または５％未満、または２％未満のタンパク質凝集体を含有する。

本発明によるいくつかの実施形態において、本発明の方法および／または組成物は、プロテインＡクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、限外ろ過、ウイルス除去ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび／または陽イオン交換クロマトグラフィーの１つまたは複数のものと組み合わせて用いることができる。

いくつかの実施形態において、本明細書で述べる組成物により選択的に除去されるタンパク質凝集体は、より高い分子量の凝集体、すなわち、タンパク質五量体および高次のものである。

いくつかの実施形態において、本明細書で述べる組成物により選択的に除去されるタンパク質凝集体は、タンパク質二量体、三量体および四量体などの低次の凝集体種を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書で述べる１つまたは複数の陽イオン交換結合基を含む固体担体は、精製プロセスにおけるフロースルー精製プロセスステップに用い、ここで、フロースルー精製プロセスステップ並びに全精製プロセスは、連続式で行うことができる。

いくつかの実施形態において、本明細書で述べる固体担体は、固体担体の上流および下流の他の種類の媒体と流体連通した状態で接続されている。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書で述べるような１つまたは複数の陽イオン交換結合基を含む固体担体は、上流の陰イオン交換クロマトグラフィー媒体および固体担体から下流のウイルスろ過媒体と接続されている。特定の実施形態において、試料は、活性炭に、続いて陰イオン交換クロマトグラフィー媒体に、続いて１つまたは複数の陽イオン交換結合基を含む固体担体に、続いてウイルスフィルターに流れる。いくつかの実施形態において、ｐＨの変更を行うために、スタティックミキサーおよび／またはサージタンクを陰イオン交換媒体と１つまたは複数の陽イオン交換結合基を含む固体担体との間に配置する。

当技術分野で公知の組成物と比較して低密度の陽イオン交換結合基を有する組成物を用いた凝集体選択性の向上の概略図である。 本発明により含まれる種々の組成物の代表的な化学構造を示す図である。固体担体上に固定化した架橋ポリマー構造を示す図である。 本発明により含まれる種々の組成物の代表的な化学構造を示す図である。固体担体上に固定化した架橋ポリマー構造を示す図である。 本発明により含まれる種々の組成物の代表的な化学構造を示す図である。固体担体上に固定化した架橋ポリマー構造を示す図である。 本発明により含まれる種々の組成物の代表的な化学構造を示す図である。固体担体上に固定化した架橋ポリマー構造を示す図である。 本発明により含まれる種々の組成物の代表的な化学構造を示す図である。固体担体上に共有結合したグラフトポリマー構造を示す図である。Ｒ^１は、例えば、スルホン酸、硫酸、リン酸、ホスホン酸またはカルボキシル基などの陽イオン交換基であり、Ｒ^２は、荷電基を含まない任意の脂肪族または芳香族有機残基であり、Ｒ^３は、任意の２つ以上のポリマー鎖間の任意の非荷電脂肪族または芳香族有機リンカーであり、ｘ、ｙおよびｚは、ポリマー中の各モノマーの平均モル分率であり、ｙ＞ｘであり、記号ｍは、リンカーの他端に結合している類似のポリマー鎖を示し、Ｒ^４は、ＮＨまたはＯであり、Ｒ^５は、−ＣＨ_２−、−Ｃ_２Ｈ_４−、−Ｃ_３Ｈ_６−、−Ｃ（ＣＨ_３）_２−ＣＨ_２−、−Ｃ_６Ｈ_４−などの線状または分枝脂肪族または芳香族基であり、Ｒ^６は、ポリマー鎖へのＮＨ、ＯまたはＳリンカーを含有する線状または分枝脂肪族または芳香族非荷電基であり、Ｒ^７およびＲ^８は、１つまたは複数の中性脂肪族および芳香族有機残基からなる群から独立に選択され、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｆ、Ｃｌおよび同類のものなどのヘテロ原子を含有していてもよい。 本発明により含まれる種々の組成物の代表的な化学構造を示す図である。固体担体上に共有結合したグラフトポリマー構造を示す図である。Ｒ^１は、例えば、スルホン酸、硫酸、リン酸、ホスホン酸またはカルボキシル基などの陽イオン交換基であり、Ｒ^２は、荷電基を含まない任意の脂肪族または芳香族有機残基であり、Ｒ^３は、任意の２つ以上のポリマー鎖間の任意の非荷電脂肪族または芳香族有機リンカーであり、ｘ、ｙおよびｚは、ポリマー中の各モノマーの平均モル分率であり、ｙ＞ｘであり、記号ｍは、リンカーの他端に結合している類似のポリマー鎖を示し、Ｒ^４は、ＮＨまたはＯであり、Ｒ^５は、−ＣＨ_２−、−Ｃ_２Ｈ_４−、−Ｃ_３Ｈ_６−、−Ｃ（ＣＨ_３）_２−ＣＨ_２−、−Ｃ_６Ｈ_４−などの線状または分枝脂肪族または芳香族基であり、Ｒ^６は、ポリマー鎖へのＮＨ、ＯまたはＳリンカーを含有する線状または分枝脂肪族または芳香族非荷電基であり、Ｒ^７およびＲ^８は、１つまたは複数の中性脂肪族および芳香族有機残基からなる群から独立に選択され、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｆ、Ｃｌおよび同類のものなどのヘテロ原子を含有していてもよい。 固体担体上に共有結合したグラフトポリマー構造を示す図である。Ｒ^１は、例えば、スルホン酸、硫酸、リン酸、ホスホン酸またはカルボキシル基などの陽イオン交換基であり、Ｒ^２は、荷電基を含まない任意の脂肪族または芳香族有機残基であり、Ｒ^３は、任意の２つ以上のポリマー鎖間の任意の非荷電脂肪族または芳香族有機リンカーであり、ｘ、ｙおよびｚは、ポリマー中の各モノマーの平均モル分率であり、ｙ＞ｘであり、記号ｍは、リンカーの他端に結合している類似のポリマー鎖を示し、Ｒ^４は、ＮＨまたはＯであり、Ｒ^５は、−ＣＨ_２−、−Ｃ_２Ｈ_４−、−Ｃ_３Ｈ_６−、−Ｃ（ＣＨ_３）_２−ＣＨ_２−、−Ｃ_６Ｈ_４−などの線状または分枝脂肪族または芳香族基であり、Ｒ^６は、ポリマー鎖へのＮＨ、ＯまたはＳリンカーを含有する線状または分枝脂肪族または芳香族非荷電基であり、Ｒ^７およびＲ^８は、１つまたは複数の中性脂肪族および芳香族有機残基からなる群から独立に選択され、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｆ、Ｃｌおよび同類のものなどのヘテロ原子を含有していてもよい。 固体担体上に共有結合したグラフトポリマー構造を示す図である。Ｒ^１は、例えば、スルホン酸、硫酸、リン酸、ホスホン酸またはカルボキシル基などの陽イオン交換基であり、Ｒ^２は、荷電基を含まない任意の脂肪族または芳香族有機残基であり、Ｒ^３は、任意の２つ以上のポリマー鎖間の任意の非荷電脂肪族または芳香族有機リンカーであり、ｘ、ｙおよびｚは、ポリマー中の各モノマーの平均モル分率であり、ｙ＞ｘであり、記号ｍは、リンカーの他端に結合している類似のポリマー鎖を示し、Ｒ^４は、ＮＨまたはＯであり、Ｒ^５は、−ＣＨ_２−、−Ｃ_２Ｈ_４−、−Ｃ_３Ｈ_６−、−Ｃ（ＣＨ_３）_２−ＣＨ_２−、−Ｃ_６Ｈ_４−などの線状または分枝脂肪族または芳香族基であり、Ｒ^６は、ポリマー鎖へのＮＨ、ＯまたはＳリンカーを含有する線状または分枝脂肪族または芳香族非荷電基であり、Ｒ^７およびＲ^８は、１つまたは複数の中性脂肪族および芳香族有機残基からなる群から独立に選択され、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｆ、Ｃｌおよび同類のものなどのヘテロ原子を含有していてもよい。 膜７、膜８または市販の膜（Ｐａｌｌ Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜）を含有する３種の膜装置を通過したモノクローナル抗体（ＭＡｂＩ）の割合のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析の結果を示すグラフである。ｘ軸上に、膜へのＭＡｂＩの総負荷をｇ／Ｌ単位で示し、ｙ軸上に、出発濃度と比較したＭＡｂＩ単量体の相対的濃度（収率％により表す）を示す。 膜７、膜８またはＰａｌｌ Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜を含む３種の膜装置を通過したＭＡｂＩの割合のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析の結果を示すグラフである。ｘ軸上に、膜へのＭＡｂＩの総負荷をｇ／Ｌ単位で示し、ｙ軸上に、出発濃度と比較したＭＡｂＩ二量体の相対的濃度（収率％により表す）を示す。観測されたように、二量体の破過は、膜７について膜８並びにＰａｌｌ Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜と比較して著しく遅い。 膜７、膜８またはＰａｌｌ Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜を含む３種の膜装置を通過したＭＡｂＩの割合のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析の結果を示すグラフである。ｘ軸上に、膜へのＭＡｂＩの総負荷をｇ／Ｌ単位で示し、ｙ軸上に、出発濃度と比較したＭＡｂＩ高分子量（ＨＭＷ）凝集体の相対的濃度（収率）を示す。観測されたように、ＨＭＷの破過は、膜７について膜８並びにＰａｌｌ Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜と比較して著しく遅い。 ＭＡｂ負荷の関数として膜７（白三角として示す）および膜８（白四角として示す）における抗体プールのＳＥＣにより測定した凝集体破過（右ｙ軸上に示す）を示すグラフである。膜７（黒三角として示す）および膜８（黒四角として示す）におけるプールにおける単量体（すなわち、対象の生成物）の収率も示す。 ＭＡｂ負荷の関数としての２回の別個の実験（実験１：白丸により示す；実験２：白ひし形により示す）での膜７における抗体プールの凝集体破過（右ｙ軸上に示す）を示すグラフである。膜７における抗体プールにおける単量体の収率（実験１：黒丸により示す；実験２：黒ひし形により示す）も示す。 ＭＡｂＩＩＩ負荷（ｍｇ／ｍＬとしてｘ軸に示す）の関数としての膜７における抗体プールの凝集体破過（右ｙ軸上に示す）を示すグラフである。膜７におけるプールにおける単量体の収率（左ｙ軸上に示す）も示す。 膜８へのＭＡｂＩ単量体（白四角）および膜８へのＭＡｂＩ凝集体（白三角）、膜７へのＭＡｂＩ単量体（黒四角）および膜７へのＭＡｂＩ凝集体（黒三角）の結合のＮａＣｌ濃度の関数としてのｐＨ５．０における分配係数を示すグラフである。 膜８へのＭＡｂＩＩ単量体（白四角）および膜８へのＭＡｂＩＩ凝集体（白三角）、膜７へのＭＡｂＩＩ単量体（黒四角）および膜７へのＭＡｂＩＩ凝集体（黒三角）の結合のＮａＣｌ濃度の関数としてのｐＨ５．０における分配係数を示すグラフである。 ｐＨ５．０におけるそれぞれ膜７および８へのＭＡｂＩおよびＭＡｂＩＩの結合の選択性プロットを示すグラフである。ＭＡｂＩに対する膜８の選択性を白四角により示し、ＭＡｂＩに対する膜７の選択性を黒四角により示し、ＭＡｂＩＩに対する膜８の選択性を白三角により示し、ＭＡｂＩＩに対する膜７の選択性を黒三角により示す。 １０および１５ｇ／Ｌ凝集体負荷における単量体百分率を示す等高線図である。 ５、１０および１５ｇ／Ｌ凝集体負荷における最適操作領域（白で示す）を示す等高線図である。最適は、単量体の収率が８８％を超え、凝集体が総タンパク質の２％未満を占めることと定義した。灰色の領域は、これらの基準を満たさない。 ウイルスろ過装置の処理量に対する流量の影響を検討するための実験の結果を示すグラフである。Ｙ軸は圧力降下（ｐｓｉ）を示し、Ｘ軸はウイルスろ過装置の処理量（ｋｇ／ｍ^２）を示す。 本明細書で述べた組成物を用いる接続（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）フロースルー精製プロセスの概略図である。活性炭含有装置が陰イオン交換装置に直接接続されている。陰イオン交換装置からの流出物は、スタティックミキサーに通り、そこで水性酸が加えられて、ｐＨを低下させ、次いで、本発明による陽イオン交換フロースルー装置およびウイルスフィルターを通過する。 陰イオン交換クロマトグラフィー媒体（ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標））後のＨＣＰ破過を測定するための実験の結果を示すグラフである。Ｘ軸はＨＣＰ濃度（ｐｐｍ）を示し、Ｙ軸はＡＥＸ負荷（ｋｇ／Ｌ）を示す。 フロースルー精製プロセスステップにおけるウイルスろ過装置の負荷の関数としてのＭＡｂ凝集体の除去を測定するための実験の結果を示すグラフである。Ｘ軸はウイルスろ過負荷（ｋｇ／ｍ^２）を示し、Ｙ軸はウイルスろ過後の試料中のＭＡｂ凝集体の百分率を示す。 本明細書で述べた陽イオン交換樹脂（ロット＃１２ＬＰＤＺ１１９）を用いた、累積タンパク質負荷の関数としてのＭＡｂ凝集体の除去を示すための実験の結果を示すグラフである。Ｘ軸はｍｇ／ｍｌ単位の累積タンパク質負荷を示し、左Ｙ軸はｍｇ／ｍｌ単位の抗体ＭＡｂの濃度を示し、右Ｙ軸は試料中のＭＡｂ凝集体の百分率を示す。 本明細書で述べた陽イオン交換樹脂（ロット＃１２ＬＰＤＺ１２８）を用いた、累積タンパク質負荷の関数としてのＭＡｂ凝集体の除去を示すための実験の結果を示すグラフである。Ｘ軸はｍｇ／ｍｌ単位の累積タンパク質負荷を示し、左Ｙ軸はｍｇ／ｍｌ単位の抗体ＭＡｂの濃度を示し、右Ｙ軸は試料中のＭＡｂ凝集体の百分率を示す。 本明細書で述べた陽イオン交換樹脂（ロット＃１２ＬＰＤＺ１２９）を用いた、累積タンパク質負荷の関数としてのＭＡｂ凝集体の除去を示すための実験の結果を示すグラフである。Ｘ軸はｍｇ／ｍｌ単位の累積タンパク質負荷を示し、左Ｙ軸はｍｇ／ｍｌ単位の抗体ＭＡｂの濃度を示し、右Ｙ軸は試料中のＭＡｂ凝集体の百分率を示す。 ｐＨ５および滞留時間３分におけるＭＡｂ５を含む樹脂ロット＃１７１２のクロマトグラムを示す図である。

一般的に対象の生成物である、単量体タンパク質からタンパク質凝集体を分離する目的で、いくつかの従来技術の結合および溶出方法並びにフロースルー方法が報告されている。

結合および溶出方法は、一般的に時間のかかるものであり、相当のプロセス開発を必要とし、単量体タンパク質の高い収率を維持しながら単量体タンパク質から凝集体、特に低次の凝集体を効果的に分離することに時として成功しない。従来の多孔質樹脂および膜の両方を用いた、特定の陽イオン交換フロースルー方法が当技術分野で記載された。しかし、それらは、凝集体を結合する媒体の低い能力、二量体に対する低い選択性および対象の生成物、すなわち、単量体タンパク質のしばしば低い収率による問題を有すると思われる（例えば、Ｌｉｕら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ．、１２１８巻（２０１１）、６９４３−６９５２頁参照）。

さらに、タンパク質を分離するために固体担体上の陽イオン交換基を用いると思われる方法が従来技術において記載された。例えば、２つのモデルタンパク質の最善のクロマトグラフィー分解能を得るために固体担体上に高密度の陽イオン交換基を有することを述べている、Ｗｕら（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ ｌｉｇａｎｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｎ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．、５９８巻（１９９２年）、７−１３頁）を参照のこと。しかし、最近、凝集体除去に対する陽イオン交換結合基密度の効果が具体的に検討された（例えば、Ｆｏｇｌｅら、Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｅｓｉｎ ｌｉｇａｎｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｎ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｉｍｐｕｒｉｔｙ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｉ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ．、１２２５巻（２０１２年）、６２−６９頁参照）。単量体および高分子量抗体形の分解能は、結合基の密度に対して著しく非感受性であることが報告された。

不純物除去を用いるためのＷＰＣも記載された（例えば、Ｓｕｄａら、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｇａｒｏｓｅ ａｎｄ ｄｅｘｔｒａｎ−ｇｒａｆｔｅｄ ａｇａｒｏｓｅ ｓｔｒｏｎｇ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ．、１２１６巻、５２５６−５２６４頁、２００９年参照）。弱分配クロマトグラフィー（ＷＰＣ）の場合、分配係数Ｋｐは、０．１−２０の範囲にあり、Ｋｐ＞２０は、結合および溶出クロマトグラフィーに関連し、Ｋｐ＜０．１は、フロースルークロマトグラフィーに関連する。ＷＰＣには、少なくとも２つの深刻な欠点がある。第一は、フロースルークロマトグラフィーと結合溶出クロマトグラフィーとの間になければならない、狭い操作領域（０．１＜Ｋｐ＜２０）である（例えば、米国特許第８，０６７，１８２号参照）。この操作領域内では、効率的な分離のために生成物と不純物との間の選択性は、大きくなければならない。一般的にイオン交換媒体について、生成物と不純物との間の選択性は、Ｋｐが増加するにつれて増加し、結合および溶出条件下で選択性が最高である。第二は、不純物に対する容量は、結合および溶出モードの場合より低い。Ｋｐ値がより低いので、不純物濃度が生成物の濃度より小さい一般的な操作条件下で容量が低い。

本発明は、当技術分野で記載された様々な方法と比較して、タンパク質凝集体と単量体タンパク質の優れた分離を達成することができる。従来技術において記載されたものと本発明の重要な差異は、固体担体上の低密度の陽イオン交換基の使用並びに単量体とサイズおよび表面特性が近いために除去することが一般的により困難である低次のタンパク質凝集体、例えば、二量体、三量体および四量体の除去の高い特異性である。

本発明をより容易に理解することができるために、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明を通して示す。

Ｉ．定義
「クロマトグラフィー」という用語は、本明細書で用いているように、生物製剤における混入物質および／またはタンパク質凝集体から対象の生成物（例えば、治療用タンパク質または抗体）を分離するあらゆる種類の技術を意味する。

「フロースループロセス」、「フロースルー式」および「フロースルークロマトグラフィー」という用語は、本明細書において同義で用い、対象の生成物を含有する生物製剤が材料をフロースルーすることを意図する生成物分離技術を意味する。いくつかの実施形態において、対象の生成物が材料を流れ、望ましくない物質が材料に結合する。特定の実施形態において、材料は、特定の密度の陽イオン交換結合基（すなわち、従来技術の組成物より低い）を含有し、タンパク質凝集体から単量体タンパク質を分離するために用いられ、この場合、単量体タンパク質が材料を流れるが、タンパク質凝集体が材料に結合する。

「アフィニティークロマトグラフィー」という用語は、標的分子（例えば、Ｆｃ領域を含有する対象のタンパク質または抗体）が標的分子に対して特異的であるリガンドに特異的に結合するタンパク質分離技術を意味する。そのようなリガンドは、一般的に生物特異的リガンドと呼ばれる。いくつかの実施形態において、生物特異的リガンド（例えば、プロテインＡまたはこれらの機能変異体）は、適切なクロマトグラフィーマトリックス材料に共有結合しており、溶液がクロマトグラフィーマトリックスと接触するとき、溶液中の標的分子に接近できる。標的分子は、一般的にクロマトグラフィーステップ中に生物特異的リガンドに対するその特異的結合親和性を保持しているが、他の溶質および／または混合物中のタンパク質は、感知できるほどにまたは特異的にリガンドに結合することはない。固定化リガンドへの標的分子の結合により、混在タンパク質および不純物がクロマトグラフィーマトリックスを通過するが、標的分子は、固相材料上の固定化リガンドに特異的に結合したままである。次いで、特異的に結合した標的分子は、適切な条件（例えば、低ｐＨ、高ｐＨ、高塩、競合リガンド等）のもとでその活性形で固定化リガンドから除去し、以前にカラムを通過させた混在タンパク質および不純物を実質的に含まない溶出緩衝液とともにクロマトグラフィーカラムに通す。任意の適切なリガンドは、その各特異的結合タンパク質、例えば、抗体を精製するために用いることができることは理解される。本発明によるいくつかの実施形態において、プロテインＡを、Ｆｃ領域を含有する標的タンパク質のリガンドとして用いる。標的分子（例えば、Ｆｃ領域含有タンパク質）の生物特異的リガンド（例えば、プロテインＡ）からの溶出のための条件は、当業者により容易に決定することができる。いくつかの実施形態において、プロテインＧまたはプロテインＬまたはこれらの機能変異体を生物特異的リガンドとして用いることができる。いくつかの実施形態において、プロテインＡなどの生物特異的リガンドを用いるプロセスは、Ｆｃ領域含有タンパク質への結合のために５−９のｐＨ範囲を用い、その後、生物特異的リガンド／標的分子結合体を洗浄または再平衡化し、その後、それを少なくとも１つの塩を含有する約４または４以下のｐＨを有する緩衝液で溶出する。

本明細書で同義に用いる「混入物質」、「不純物」および「デブリ」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの生物学的巨大分子、１つまたは複数の宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、脂質、タンパク質凝集体を包含する、任意の外来または好ましくない分子並びに１つまたは複数の外来または好ましくない分子から分離される対象の生成物を含有する試料中に存在し得る１つまたは複数の添加物を意味する。さらに、そのような混入物質は、分離プロセスの前に行われ得るステップに用いられる任意の試薬を包含し得る。特定の実施形態において、本明細書で述べる組成物および方法は、対象の生成物を含有する試料からタンパク質凝集体を選択的に除去することを意図する。

「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」または「抗体」（本明細書で同義に用いる）という用語は、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる基本的４ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を意味し、前記鎖は、例えば、抗原に特異的に結合する能力を有する鎖間ジスルフィド結合により安定化される。「単鎖免疫グロブリン」または「単鎖抗体」（本明細書で同義に用いる）という用語は、重および軽鎖からなる２ポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を意味し、前記鎖は、例えば、抗原に特異的に結合する能力を有する鎖間ペプチドリンカーにより安定化される。「ドメイン」という用語は、例えば、βひだ状シートおよび／または鎖内ジスルフィド結合により安定化されたペプチドループを含む（例えば、３−４ペプチドループを含む）重または軽鎖ポリペプチドの球状領域を意味する。ドメインはさらに、「定常」ドメインの場合の種々のクラスメンバーのドメイン内の配列の変化の相対的欠如または「可変」ドメインの場合の種々のクラスメンバーのドメイン内の著しい変化に基づいて、本明細書において「定常」または「可変」を意味する。抗体またはポリペプチド「ドメイン」は、しばしば当技術分野で同義に抗体またはポリペプチド「領域」を意味する。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインと同義に意味する。抗体重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと同義に意味する。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインと同義に意味する。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域または「ＶＨ」ドメインと同義に意味する。

免疫グロブリンまたは抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、単量体または多量体で存在する、例えば、五量体で存在するＩｇＭ抗体および／または単量体、二量体若しくは多量体で存在するＩｇＡ抗体であり得る。「断片」という用語は、そのまままたは完全な抗体または抗体鎖より少数のアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部または一部分を意味する。断片は、もとのままのまたは完全な抗体または抗体鎖の化学または酵素処理により得ることができる。断片は、組換え手段によっても得ることができる。具体例としての断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｃおよび／またはＦｖ断片などを包含する。

「抗原結合断片」という用語は、抗原に結合するまたは抗原結合（すなわち、特異的結合）についてもとのままの抗体（すなわち、それらが得られたもとのままの抗体）と競合する免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド部分を意味する。結合断片は、組換えＤＮＡ技術により、またはもとのままの免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的切断により生産することができる。結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖および単鎖抗体を包含する。

「生物製剤」という用語は、本明細書で用いているように、対象の生成物（例えば、通常単量体である、治療用タンパク質または抗体）並びにタンパク質凝集体（例えば、低次タンパク質凝集体および対象の生成物の高分子量凝集体）などの不要な成分を含有する任意の組成物を意味する。

特に断らない限り、本明細書で用いている「試料」という用語は、標的分子を含有する任意の組成物または混合物を意味する。試料は、生物源または他の源から得ることができる。生物源は、植物および動物細胞、組織および器官などの真核生物および原核生物源を包含する。試料は、標的分子と混合された状態で見出される希釈剤、緩衝剤、界面活性剤並びに混入種、デブリおよび同類のものも包含し得る。試料は、「部分的に精製する」ことができ（すなわち、ろ過ステップなどの１つまたは複数の精製ステップにかける）、または標的分子を産生する宿主細胞若しくは生物から直接得ることができる（例えば、試料は、収集細胞培養液を含み得る）。いくつかの実施形態において、試料は細胞培養原料である。いくつかの実施形態において、本明細書で述べるフロースルー精製プロセスにかける試料は、結合および溶出クロマトグラフィーステップ、例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーからの溶出液である。

「タンパク質凝集体」または「複数のタンパク質凝集体」という用語は、本明細書で同義に用いているように、対象の生成物、例えば、治療用タンパク質または抗体の少なくとも２つの分子の会合を意味する。対象の生成物の少なくとも２つの分子の会合は、共有結合、非共有結合、ジスルフィドまたは非還元性架橋を包含するが、これらに限定されない任意の手段により生じ得る。

凝集体濃度は、当技術分野で周知であり、広く受け入れられている方法である、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いてタンパク質試料中で測定することができる（例えば、Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、９６巻、（２００７年）、２６８−２７９頁参照）。種々の分子量の種の相対濃度は、ＵＶ吸光度を用いて溶出物中で測定し、一方、画分の分子量は、カラム製造業者の指示に従ってシステム校正を行うことにより決定する。

「二量体」、「二量体（複数）」、「タンパク質二量体」または「タンパク質二量体（複数）」という用語は、本明細書で同義に用いているように、２つの単量体分子を含有する凝集体から主としてなるが、若干の三量体および四量体も含有し得るタンパク質凝集体の低次画分を意味する。この画分は、主単量体ピークの直前のＳＥＣクロマトグラムにおける第１の分解可能ピークとして通常観測される。

「高分子量凝集体」または「ＨＭＷ」という用語は、本明細書で同義に用いているように、タンパク質凝集体の高次画分、すなわち、五量体およびそれ以上のものを意味する。この画分は、二量体ピークの前のＳＥＣクロマトグラムにおける１つまたは複数のピークとして通常観測される。

「結合基」または「リガンド」という用語は、本明細書で同義に用いているように、溶液から単量体タンパク質またはタンパク質凝集体を引きつけることができる、固体担体（例えば、多孔性表面）上に固定化された特異的な化学構造を意味する。結合基に対するタンパク質の引力は、イオン性、極性、分散性、疎水性、親和性、金属キレート化またはファンデルワールスを包含する任意の種類のものであり得る。

「陽イオン交換結合基」という用語は、本明細書で用いているように、負に荷電した結合基を意味する。特定の実施形態において、結合基は、負に荷電したスルホン酸基である。

「固体担体」という用語は、一般的に結合基が結合している任意の材料（多孔性または非多孔性）を意味する。固体担体への結合基の結合は、グラフティングの場合のような共有結合によるもの、またはコーティング、付着、吸着および同様な機構によるものであり得る。本明細書で述べる方法および組成物に用いる固体担体の例は、膜、多孔性ビーズ、翼状繊維（ｗｉｎｇｅｄ ｆｉｂｅｒｓ）、モノリスおよび樹脂を包含するが、これらに限定されない。

「密度」という用語は、本明細書で用いているように、多孔質媒体１リットル当たりのリガンドのモル数の濃度として一般的に表される、固体担体上の結合基またはリガンドの濃度を意味する。イオン交換リガンド密度の広く受け入れられている単位は、１リットル当たりのミリ当量またはｍｅｑ／Ｌ（μｅｑ／ｍＬに相当する）であり、これは、媒体の所定の容積中のイオン交換性基のモル量に相当する。単一イオン化部分を有する荷電基については、ｍｅｑ／Ｌ単位のリガンド密度は、ｍｍｏｌ／ＬまたはｍＭ単位で表されるこれらの基の密度に相当することとなる。

「選択性」という用語は、本明細書で用いているように、移動相と固定相との間の２つの種の分配係数の無次元の比率を意味する。分配係数（Ｋｐ）は、Ｑ／Ｃ比であり、ここで、ＱおよびＣは、それぞれ結合および遊離タンパク質濃度である。

「プロセスステップ」または「単位操作」という用語は、本明細書で同義に用いているように、精製プロセスにおける特定の結果を達成するための１つまたは複数の方法または装置の使用を意味する。用いることができるプロセスステップまたは単位操作の例は、清澄化、結合および溶出クロマトグラフィー、ウイルス不活化、フロースルー精製および配合（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を包含するが、これらに限定されない。プロセスステップまたは単位操作のそれぞれは、プロセスステップまたは単位操作の意図する結果を達成するために複数のステップまたは方法または装置を使用し得ることが理解される。例えば、いくつかの実施形態において、清澄化ステップおよび／またはフロースルー精製ステップは、当該プロセスステップまたは単位操作を達成するために複数のステップまたは方法または装置を使用し得る。いくつかの実施形態において、プロセスステップまたは単位操作を実施するために用いられる１つまたは複数の装置は、１回使用装置であり、プロセスにおける任意の他の装置を交換するまたはプロセスの稼働を停止する必要なしに、除去および／または交換することができる。

本明細書で用いているように、「プールタンク」という用語は、一般的にプロセスステップの間で使用され、プロセスステップからの生産物の全容積の収集を可能にするサイズ／容積を有する、任意のコンテナ、容器、貯蔵容器、タンクまたはバッグを意味する。プールタンクは、プロセスステップからの産出物の全容積を保持し、または貯蔵し、またはその溶液の状態を操作するために用いることができる。本発明による種々の実施形態において、プロセスは、１つまたは複数のプールタンクを使用する必要性を除去する。

いくつかの実施形態において、本明細書で述べるプロセスは、１つまたは複数のサージタンクを使用し得る。

「サージタンク」という用語は、本明細書で用いているように、プロセスステップ間またはプロセスステップ内（例えば、単一プロセスステップが複数のステップを含む場合）で用いる任意のコンテナまたは容器またはバッグを意味し、１つのステップからの産出物は、次のステップにおけるサージタンクに流入する。したがって、サージタンクは、ステップからの産出物の全容積を保持または収集することを意図するものではなく、代わりに１つのステップから次への産出物の連続的な流れを可能にする点がプールタンクと異なっている。いくつかの実施形態において、本明細書で述べるプロセスまたはシステムにおける２つのプロセスステップ間またはプロセスステップ内で用いるサージタンクの容積は、プロセスステップからの産出物の全容積の２５％以下である。他の実施形態において、サージタンクの容積は、プロセスステップからの産出物の全容積の１０％以下である。いくつかの他の実施形態において、サージタンクの容積は、標的分子が精製される出発物質を構成する、バイオリアクター中の細胞培養の全容積の３５％未満、または３０％未満、または２５％未満、または２０％未満、または１５％未満、または１０％未満である。

本明細書で述べるいくつかの実施形態において、サージタンクは、本明細書で述べる固体担体を用いるステップの上流で用いる。

「連続プロセス」という用語は、本明細書で用いているように、１つのプロセスステップからの産出物がプロセスにおける次のプロセスステップに中断することなく直接流入するように、２つ以上のプロセスステップ（または単位操作）を包含する、標的分子を精製するプロセスを意味し、ここで、２つ以上のプロセスステップは、それらの継続時間の少なくとも一部にわたって同時に実施することができる。言い換えれば、連続プロセスの場合、本明細書で用いているように、次のプロセスステップの前にプロセスを完了する必要はなく、試料の一部が常にプロセスステップに通っている。「連続プロセス」という用語は、プロセスステップ内のステップにも適用され、その場合、複数のステップを包含するプロセスステップの実施中に、試料は、当プロセスステップを実施するために必要である複数のステップに連続的に流れる。本明細書で述べるそのようなプロセスステップの１例は、連続的に実施される複数のステップを含むフロースルー精製ステップ、例えば、フロースルー活性炭、続くフロースルーＡＥＸ媒体、続く本明細書で述べる固体担体を用いるフロースルーＣＥＸ媒体、続くフロースルーウイルスろ過である。

「陰イオン交換マトリックス」という用語は、例えば、第四級アミノ基などのこれに結合する１つまたは複数の正に荷電したリガンドを有する、正に荷電したマトリックスを意味するために本明細書で用いる。市販の陰イオン交換樹脂は、ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥ ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）およびＦＡＳＴ Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を包含する。本明細書で述べるプロセスおよびシステムに用いることができる他の具体例としての材料は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ ｈｉｇｈｃａｐ、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＱおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＤＥＡＥ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）である。

「活性炭（ａｃｔｉｖｅ ｃａｒｂｏｎ）」または「活性炭（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ）」という用語は、本明細書で同義に用いているように、その細孔構造を向上させるためのプロセスにかけた炭素質材料を意味する。活性炭は、非常に高い表面積を有する多孔質固体である。それらは、石炭、木材、やし殻、堅果の殻および泥炭を包含する様々な源から得ることができる。活性炭は、制御された雰囲気下での加熱に伴って生ずる物理的活性化または強酸、塩基若しくは酸化剤を用いた化学的活性化を用いてこれらの材料から製造することができる。活性化プロセスは、活性炭に不純物の除去の高い能力をもたらす高表面積を有する細孔構造を製造する。活性化プロセスは、表面の酸性度を制御するように修正することができる。本明細書で述べるいくつかの実施形態において、活性炭は、一般的に、結合および溶出クロマトグラフィーステップに続くまたは次に結合および溶出クロマトグラフィーステップに続くウイルス不活化ステップに続く、フロースルー精製ステップに用いられる。いくつかの実施形態において、活性炭は、例えば、カラムまたはある種の他の適切な装置中のセルロース媒体内に組み込まれている。

「スタティックミキサー」という用語は、２つの流体物質、一般的に液体を混合するための装置を意味する。この装置は、一般的に円筒状（管）ハウジングに含有される混合要素（非可動要素）からなる。全体的なシステム設計は、流体の２つの流れをスタティックミキサー内に供給する方法を組み込んでいる。流れが混合器に通るとき、非可動要素が物質を連続的に混合する。完全な混合は、流体の特性、管の内径、混合要素の数およびそれらの設計等の多くの変数に依存する。本明細書で述べるいくつかの実施形態において、１つまたは複数のスタティックミキサーを明細書で述べるプロセスに用いる。特定の実施形態において、スタティックミキサーは、本明細書で述べるように、陰イオン交換クロマトグラフィーの後、試料を陽イオン交換固体担体と接触させる前に、所望の溶液の変化を達成するために用いられる。

ＩＩ．具体例としての固体担体
本発明は、通常対象の生成物であるタンパク質の単量体より有利にタンパク質凝集体に結合する、固体担体に結合した特定の密度の結合基またはリガンドを有する固体担体を提供する。理論により拘束されることを望むものでないが、任意の適切な固体担体を本発明の場合に用いることができることが考えられる。例えば、固体担体は、多孔性若しくは非多孔性であり得、または、モノリス若しくは膜の形態などの連続性であり得る。固体担体はまた、粒子、ビーズまたは繊維の形態などの不連続性であり得る。いずれの場合（連続性または不連続性）においても、固体担体の重要な特徴は、それらが高表面積、機械的完全性、水性環境における完全性および結合基の接近可能性を保証するための流速分布をもたらす能力を有することである。

具体例としての連続性多孔質固体担体は、すなわち、約０．０５ミクロンから１０ミクロンの孔径を有する微細孔膜を包含する。本発明による組成物および方法に用いることができる多孔質膜は、膜の厚さにわたるまたは中空繊維の場合には繊維の微細孔壁にわたる孔径の均一性に関連して、対称性または非対称性に分類することができる。本明細書で用いているように、「対称性膜」という用語は、膜の断面にわたり実質的に均一な孔径を有する膜を意味する。本明細書で用いているように、「非対称性膜」という用語は、平均孔径が膜の断面にわたり一定でない膜を意味する。いくつかの実施形態において、非対称性膜の場合、孔径は、一様にまたは膜の断面全域の位置の関数として不連続的に変化し得る。いくつかの実施形態において、非対称性膜は、１つの外表面における孔径と反対側の外表面における孔径との実質的に１より大きい比率を有し得る。

様々な材料製の様々な微細孔膜を本明細書で述べる組成物および方法に用いることができる。そのような材料の例としては、多糖、合成および半合成ポリマー、金属、金属酸化物、セラミック、ガラスおよびそれらの組合せなどがある。

本明細書で述べる組成物および方法に用いることができる微細孔膜を製造するのに用いることができる具体例としてのポリマーは、置換または非置換ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリメタクリルアミド、ポリイミド、ポリアクリレート、ポリカーボネート、ポリメタクリレート、ポリビニル親水性ポリマー、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、コポリマーまたはスチレンおよびジビニルベンゼン、芳香族ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、過フッ化熱可塑性ポリマー、ポリオレフィン、芳香族ポリアミド、脂肪族ポリアミド、超高分子量ポリエチレン、二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエステル並びにそれらの組合せを包含するが、これらに限定されない。

具体例としての市販の微細孔膜は、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）から入手できるＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．（Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）から入手できるＳｕｐｏｒ（登録商標）、並びにＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓ．Ａ．（Ａｕｂａｇｎｅ Ｃｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手できるＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）およびＳａｒｔｏｂｒａｎ（登録商標）である。

他の具体例としての連続固体担体は、ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（Ｖｉｌｌａｃｈ、Ａｕｓｔｒｉａ）から入手できるＣＩＭ（登録商標）モノリス材料などのモノリスである。

具体例としての不連続固体担体は、多孔質クロマトグラフィービーズを包含する。当業者により容易に認識されるように、クロマトグラフィービーズは、多糖、アクリレート、メタクリレート、ポリスチレニクス、ビニルエーテル、制御多孔ガラス、セラミックおよび同類のもののような多種多様なポリマーおよび無機材料から製造することができる。

具体例としての市販のクロマトグラフィービーズは、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．製のＣＰＧ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ製のＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＰＯＲＯＳ（登録商標）である。

他の具体例としての固体担体は、繊維マットおよびフェルトなどの織および不織布材料、並びに適切なハウジング、例えば、クロマトグラフィーカラム、ディスポーザブルプラスチックハウジングおよび同類のものに充填された繊維である。具体例としての固体担体は、翼状繊維も含む。

ＩＩＩ．具体例としての結合基
多種多様の結合基またはリガンドを固体担体に結合させ、本明細書で述べたように、試料からのタンパク質凝集体の効果的な除去のために用いることができる。一般的に、結合基は、溶液中のタンパク質凝集体を引きつけ、結合することができるべきである。結合基に対するタンパク質の引力は、イオン性（例えば、陽イオン交換基）、極性、分散性、疎水性、親和性、金属キレート化またはファンデルワールスを包含する任意の種類のものであり得る。

具体例としてのイオン性結合基は、硫酸、スルホン酸、リン酸、ホスホン酸、カルボン酸、第一級、第二級、第三級アミンおよび第四級アンモニウム、ピリジン、ピリミジン、ピリジニウム、ピペラジンおよび同類のものなどのヘテロ環式アミンを包含するが、これらに限定されない。

極性基は、Ｃ−Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ−Ｎ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ≡Ｎ、Ｎ−Ｈ、Ｏ−Ｈ、Ｃ−Ｆ、Ｃ−Ｃｌ、Ｃ−Ｂｒ、Ｃ−Ｓ、Ｓ−Ｈ、Ｓ−Ｏ、Ｓ＝Ｏ、Ｃ−Ｐ、Ｐ−Ｏ、Ｐ＝Ｏ、Ｐ−Ｈのような分極性化学結合を含む様々な化学物質を包含する。具体例としての極性基は、カルボニル、カルボキシル、アルコール、チオール、アミド、ハロゲン化物、アミン、エステル、エーテル、チオエーテルおよび同類のものである。

疎水性結合基は、疎水性相互作用の能力がある。具体例としての疎水性基は、アルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、フルオロアルキル、アリールおよび同類のものである。

親和性結合基は、標的タンパク質との高度に特異的な相互作用を一致してもたらすいくつかの結合官能基の配列である。具体例としての親和性結合基は、プロテインＡおよびプロテインＧおよびドメインおよびそれらの変異体を包含する。

いくつかの実施形態において、好ましい結合基は、イオン性基である。特定の実施形態において、結合基は、負に荷電したスルホン酸基である。一般的に、負に荷電したスルホン酸基は、いくつかの利点を有する。例えば、それらは、溶液中の正に荷電したタンパク質に結合する広い適用可能性を示す；化学は、容易に利用できる多くの合成製造方法により、費用がかからず、簡単である；結合基とタンパク質との相互作用は、十分に理解されている（例えば、Ｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ、８４８巻（２００７年）、１５１−１５８頁）、並びに相互作用は、溶液の状態を変化させることにより容易に操作することができる、およびそのような相互作用は、他の相互作用から分離することができる。

ＩＶ．結合基を固体担体に結合させ、固体担体上の結合基の密度を制御する方法
本明細書で述べる組成物および方法において、適切な結合基を固体担体に結合させ、対象の生成物と比べてタンパク質凝集体に結合するより大きい能力を提供するように、固体担体上の結合基の密度を制御する。

本明細書で述べる組成物および方法は、従来技術が高密度の結合基を有することが望ましいことを示唆しているように思われるにもかかわらず、固体担体上のより低密度の結合基がフロースルー式でのタンパク質凝集体の除去においてより効果的であるという驚くべき且つ予期しない発見に基づいている。本明細書で述べる組成物および方法は、例えば、五量体およびより高次のものなどの高次凝集体と比較してタンパク質の単量体から分離するのが一般的により困難である、例えば、二量体、三量体および四量体などの低次タンパク質凝集体のフロースルー式での除去において特に効果的である。

当技術分野で公知の様々な方法および本明細書で述べるものは、本明細書で述べる方法に用いる固体担体に結合基を結合させるために用いることができる。一般的に、結合の成功の基準は、所望の結合基密度および結合基の脱離の低い率（すなわち、結合基の低い浸出）の達成を包含する。結合基は、固体担体に直接結合させることができ、またはポリマー分子に組み込むことができ、それを次に、固体担体に結合させることができる。或いは、結合基は、コーティングと固体担体の間の化学結合の形成を伴うまたは伴わない状態で、固体担体上に施された架橋コーティングに組み込むことができる。

固体担体に結合基を結合させるための多くの方法が当技術分野で公知である（例えば、Ｕｌｂｒｉｃｈｔ Ｍ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、Ｐｏｌｙｍｅｒ、４７巻、２００６年、２２１７−２２６２頁参照）。これらの方法は、適切なカップリング化学による結合基による固体担体の直接修飾、ポリマー分子の吸着および結合を包含するが、これらに限定されない。後者は、「への」グラフティング（表面との反応の前にポリマーがあらかじめ調製されている場合）および「からの」グラフティング（表面基を用いて重合が開始される場合）により達成することができる。

本明細書で述べたように、固体担体の表面上の結合基の密度を制御する能力は、タンパク質凝集体と対象の生成物の良好な分離を達成するために極めて重要である。ｍｏｌｅ／Ｌ多孔性媒体、またはＭで表される結合基の密度は、当技術分野で公知の方法を用いて好都合に測定することができる。例えば、スルホン酸基の密度は、リチウムイオン交換分析を用いて測定することができる。この分析において、スルホン酸基の水素をリチウムイオンと完全に交換し、水で洗浄し、その後リチウムイオンを濃酸溶液中で洗い落とし、酸洗い溶液中のリチウム濃度をイオンクロマトグラフィーを用いて測定する。

タンパク質クロマトグラフィーにおいて、より高い密度のリガンド（結合基）が通常望ましいものであった。その理由は、一般的にそれがより高い結合能力を提供するからである（例えば、Ｆｏｇｌｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ．、１２２５巻（２０１２年）、６２−６９頁参照）。大部分の市販の陽イオン交換（ＣＥＸ）樹脂の一般的なリガンド密度は、一価リガンドについて少なくとも１００ミリ当量／Ｌ、またはｍＭである。例えば、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗおよびＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（両方がＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手できる）は、製品文献にそれぞれ１８０−２５０ｍＭおよび９０−１３０ｍＭの陽イオン交換基濃度を有することが示されている。

固体担体上の結合基の密度を制御するために用いることができる多くの方法が当技術分野に存在する。結合基を固体担体上に直接結合させる場合、密度は、反応の時間の長さ、触媒の種類および濃度、試薬の濃度、温度並びに圧力により制御することができる。例えば、部分酸化または加水分解による、固体担体の表面の前処理（活性化）が必要である場合、前処理の程度によっても、そのような前処理済み表面に結合する結合基の密度が制御される。

結合基を、固体担体上に吸着、付着、グラフトまたはコーティングされるポリマー構造に組み込む場合、結合基の密度は、当ポリマー構造の組成により制御することができる。制御された密度の結合基を有するポリマー構造を構築する１つのアプローチは、共重合、すなわち、単一ポリマー構造内への２種以上の単量体の重合である。結合基は、ポリマー構造を構築するために用いる単量体の種類の１つの一部であってよいが、他の中性単量体を加えて、結合基の密度を低下させることができる。

結合基を含むポリマーを構築する際に用いる単量体の選択は、単量体の反応性によって決定づけられる。様々な種類の単量体の反応性およびポリマー組成に対する影響は、十分に研究され、実証されている（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９８９年、ＩＩ頁参照）。ポリマーの組成およびその構造を予測するモノマーの十分に受け入れられているパラメーターは、単量体の反応性比である（例えば、Ｏｄｉａｎ、Ｊ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、２００４年、４６６頁参照）。

固体担体に結合基を結合させる好ましい方法は、固体担体上に施される架橋コーティングに結合基を組み込む原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）重合反応である。この方法は、米国特許第４，９４４，８７９号および第４，６１８，５３３号並びに公開済み米国特許公開番号ＵＳ２００９／２０８７８４に開示されている。この方法は、経済的であるだけでなく、容易でもある。荷電コーティングは、荷電アクリル単量体、例えば、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）をＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド（ＭＢＡＭ）などの適切な架橋剤と共重合することにより構築することができる。参照により本明細書にその全体として組み込まれる、米国特許公開番号ＵＳ２００９２０８７８４は、高分子量タンパク質凝集体の除去のためおよびナノ細孔ウイルスフィルターの容量を増大させるために用いることができるＡＭＰＳおよびＭＢＡＭの混合物で修飾された微細孔膜を開示している。しかし、前述の特許公開は、タンパク質凝集体および特に、二量体、三量体、四量体等の低次タンパク質凝集体の選択的除去を達成するための本明細書で述べたようなリガンド密度を制御することを述べていない。

荷電結合リガンドの密度を低下させるために用いることができる中性単量体は、例えば、アクリルアミド、アクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリル酸ヒドロキシエチルおよびメタクリル酸ヒドロキシエチルなどのアクリル、メタクリルおよびアクリルアミド単量体の大群から選択することができる。好ましい単量体は、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＭ）である。ＡＭＰＳおよびＤＭＡＭ単量体の反応性の比（ｒ_１＝０．１６２、ｒ_２＝１．１０８）（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９８９年、ＩＩ／１５６頁参照）は、これらの単量体を包含するポリマーが、ポリ（ＤＭＡＭ）の短いブロックが個々のＡＭＰＳ単位によって間隔をあけられ、それにより、結合基の密度を低下させる傾向を有することを予測する。したがって、反応溶液中のＤＭＡＭとＡＭＰＳの比を選択することは、結合基の密度の制御を達成するための重要な方法である。

固体担体上に被覆される、結合基含有ポリマーの代表的な化学構造を図２Ａに示す。ポリマーを被覆するために、それを一般的に他のポリマーに架橋させる。図２Ａに、Ｒ^１が例えば、スルホン酸、硫酸、リン酸、ホスホン酸またはカルボキシル基などの陽イオン交換基を含有する脂肪族または芳香族有機残基であり、Ｒ^２が荷電基を含まない脂肪族または芳香族有機残基であり、Ｒ^３が２つ以上の任意のポリマー鎖間の非荷電脂肪族または芳香族有機リンカーであるポリマー構造を示す。

図２Ａに示すポリマー構造において、ｙ＞ｘであり、これは、中性基（「Ｒ^２」によって表される）が荷電基（「Ｒ^１」によって表される）より大きい数で存在することを意味する。ここで、ｘ、ｙおよびｚは、ポリマー中の各単量体の平均モル分率であり、独立に約０．００１−０．９９９の範囲にある。記号ｍは、架橋剤の他端に結合している類似のポリマー鎖を単に示す。

いくつかの実施形態において、結合基を含有するポリマーは、１つの種類の単量体（例えば、中性または荷電結合基を含有する）の長い連なりまたはブロックとそれに続く異なる種類の単量体（例えば、第１のブロックが中性である場合には荷電、第１のブロックが荷電されている場合には中性）の長い連なりまたはブロックを包含することを意味する、ブロックコポリマーである。

他の実施形態において、結合基を含有するポリマーは、単量体をランダムな順序で含有する。

さらに他の実施形態において、結合基を含むポリマーは、各単量体がいずれかの側の異なる種類の２つの単量体に常に隣接している、交互コポリマーである。

いくつかの実施形態において、結合基を含有するポリマーの代表的な化学構造を図２Ｂに示し、図中、Ｒ^４は、ＮＨまたはＯであり、Ｒ^５は、−ＣＨ_２−、−Ｃ_２Ｈ_４−、−Ｃ_３Ｈ_６−、−Ｃ（ＣＨ_３）_２−ＣＨ_２−、−Ｃ_６Ｈ_４−および−Ｃ_６Ｈ_４−のような線状若しくは分枝脂肪族または芳香族基であり、Ｒ^６は、ポリマー鎖へのＮＨ、ＯまたはＳリンカーを含む線状若しくは分枝脂肪族または芳香族非荷電基である。

他の実施形態において、結合基を含有するポリマーの代表的な化学構造を図２Ｃに示す。Ｒ^７およびＲ^８は、１つまたは複数の中性脂肪族および芳香族有機残基を含有する群から独立に選択され、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｆ、Ｃｌおよび他のものなどのヘテロ原子を含有してもよい。

さらに他の実施形態において、結合基を含有するポリマーの代表的な構造を図２Ｄに示す。

固体担体にグラフトされている、結合基を含有するポリマーの他の代表的な化学構造を図２Ｅに示す。固体担体を長方形として示す。図２Ｅに、Ｒ^１が例えば、スルホン酸、硫酸、リン酸、ホスホン酸またはカルボキシル基などの陽イオン交換基を含有する任意の脂肪族または芳香族有機残基であり、Ｒ^２が荷電基を含有しない任意の脂肪族または芳香族有機残基であるポリマー構造を示す。図２Ｅに示すポリマー構造において、ｙ＞ｘであり、これは、中性基（「Ｒ^２」によって表される）が荷電基（「Ｒ^１」によって表される）より大きい数で存在することを意味する。

いくつかの実施形態において、結合基を含有するグラフトポリマーは、１つの種類の単量体（例えば、中性または荷電結合基を含有する）の長い連なりまたはブロックとそれに続く異なる種類の単量体（例えば、第１のブロックが中性である場合には荷電、第１のブロックが荷電されている場合には中性）の長い連なりまたはブロックを包含することを意味する、ブロックコポリマーである。

他の実施形態において、結合基を含有するポリマーは、単量体をランダムな順序で含有する。

他の実施形態において、結合基を含有するポリマーは、各単量体が異なる種類の２つの単量体に常に隣接している、交互コポリマーである。

いくつかの実施形態において、結合基を含有するポリマーの代表的な化学構造を図２Ｆに示し、図中、Ｒ^４は、ＮＨまたはＯであり、Ｒ^５は、−ＣＨ_２−、−Ｃ_２Ｈ_４−、−Ｃ_３Ｈ_６−、−Ｃ（ＣＨ_３）_２−ＣＨ_２−、−Ｃ_６Ｈ_４−および−Ｃ_６Ｈ_４−のような線状若しくは分枝脂肪族または芳香族基であり、Ｒ^６は、ポリマー鎖へのＮＨ、ＯまたはＳリンカーを含有する線状若しくは分枝脂肪族または芳香族非荷電基である。

他の実施形態において、結合基を含有するポリマーの代表的な化学構造を図２Ｇに示す。Ｒ^７およびＲ^８は、１つまたは複数の中性脂肪族および芳香族有機残基を含有する群から独立に選択され、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ、Ｆ、Ｃｌおよび他のものなどのヘテロ原子を含有してもよい。

さらに他の実施形態において、結合基を含有するポリマーの代表的な構造を図２Ｈに示す。

図２Ｂ−２Ｄおよび２Ｆ−２Ｈにおけるスルホン酸基は、示すようにプロトン化された形並びにナトリウム、カリウム、アンモニウムおよび同類のものなどの適切な対イオンを含有する塩の形であり得る。

ＩＶ．本明細書で述べる組成物を組み込む装置
いくつかの実施形態において、本明細書で述べたように、結合基が結合した固体担体を装置に組み込む。微細孔膜などの固体担体用の適切な装置は、ろ過カートリッジ、カプセルおよびポッドを包含する。具体例としての装置は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開番号ＵＳ２０１００２８８６９０Ａ１およびＵＳ２００８０２５７８１４Ａ１に開示された積層プレートろ過カートリッジも包含する。これらの装置の場合、固体担体がポリマーハウジングに永久的に結合され、装置は、液体入口、出口および通気開口部を有し、保持される液体の容積をさらに最小限にする。他の具体例としての装置は、ひだ状フィルターカートリッジおよびらせん状フィルターカートリッジを包含する。さらに他の具体例としての装置は、クロマトグラフィーカラムである。クロマトグラフィーカラムは、ガラス、金属、セラミックおよびプラスチックなどの多くの適切な材料から製造することができる。これらのカラムは、最終使用者により固体担体を充填することができ、または製造業者によりあらかじめ充填され、充填された状態で最終使用者に輸送することもできる。

Ｖ．本明細書で述べる組成物および装置を使用する方法
結合基（例えば、陽イオン交換結合基）が結合した固体担体を含む装置は、フロースルー式でのタンパク質凝集体の除去のために用いることができる。分取規模に分離の適用の前に、プロセスを開発し、ｐＨおよび伝導度などの溶液条件について開発およびバリデートしなければならず、装置へのタンパク質負荷の範囲を決定しなければならない。プロセス開発およびバリデーションの方法は、産業界において広く公知であり、日常的に実施されている。それらは、本明細書における実施例に示す実験計画（ＤｏＥ）アプローチを通常含む。

装置は、一般的に使用前に洗い流し、消毒し、適切な緩衝液と平衡化する。タンパク質溶液は、望ましい伝導度およびｐＨに調整し、その後、一定圧力または一定流量でポンプにより装置に通す。流出物を収集し、タンパク質収率および凝集体濃度について分析する。

いくつかの実施形態において、凝集体除去のための装置は、本明細書で述べるように、例えば、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，１１８，６７５号に教示されているようにウイルス粒子のサイズに基づく除去を保証するために設計されているウイルスろ過装置に直接接続する。

本明細書で述べる組成物および装置を用いるフロースルー凝集体除去ステップは、タンパク質精製プロセス、例えば、抗体精製プロセスにおいてどこにでも配置することができる。表１に肉太文字で強調されている、１つまたは複数の中間ステップとしてフロースルー凝集体除去を組み込んでいるタンパク質精製プロセスの例を示す。これらのプロセスの多くの変形形態を用いることができることが理解される。

「タンパク質捕捉」ステップは、本明細書で述べるように、少なくとも以下の２つのステップを実施することにより清澄化または非清澄化細胞培養液試料から対象のタンパク質を単離することを含むタンパク質精製プロセスにおけるステップを意味する：（ｉ）クロマトグラフィー樹脂、膜、モノリス、織または不織媒体上への対象のタンパク質の吸着；沈殿、凝集、結晶化、可溶性小分子またはポリマーリガンドへの結合の１つまたは複数から選択されるステップに細胞培養液を供し、それにより、例えば、抗体などの対象のタンパク質を含むタンパク質相を得るステップ；および（ｉｉ）溶出または適切な緩衝液中へのタンパク質の溶解により対象のタンパク質を再構成するステップ。

結合および溶出精製は、対象のタンパク質を適切なクロマトグラフィー媒体に結合させるステップと、結合タンパク質を場合によって洗浄し、それを適切な緩衝液で溶出するステップとからなる任意選択プロセスステップである。

フロースルーＡＥＸポリシング（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）は、対象のタンパク質の媒体への著しい結合を伴わずに対象のタンパク質の溶液を適切なＡＥＸクロマトグラフィー媒体に流すステップからなる任意選択プロセスステップである。

活性炭フロースルーは、参照により本明細書に組み込まれる同時係属仮特許出願第６１／５７５，３４９号に記載されているような、様々なプロセス関連不純物を除去するために設計された任意選択の精製ステップである。

ウイルスろ過は、ウイルス粒子を高度のＬＲＶに保持するが、実質的にすべての対象のタンパク質が通過するフラットシートまたは中空繊維の形であり得る多孔質膜にタンパク質溶液を流すステップからなる。

上の表１において、抗体捕捉並びに結合／溶出精製のステップは、次の３つの方式のいずれかで操作することができると理解される：（１）回分式、捕捉媒体に標的タンパク質を装入し、装入を止め、媒体を洗浄し、溶出し、プールを収集する；（２）半連続式、装入を連続的に行い、溶出を間欠的に行う。例えば、２つ、３つまたはそれ以上のカラムを用いる連続多カラムクロマトグラフィー操作の場合；（３）完全な連続式、装入と溶出の両方を連続的に行う。

本明細書で述べるフロースルー陽イオン交換固体担体について用いる最適の流量は、固体担体の凝集体除去性能に時として影響を及ぼすことがあり得、また固体担体がウイルスフィルターの上流に配置されている場合、ウイルスフィルターの性能にも影響を及ぼすことがあり得る。最適の流量は、対象のタンパク質溶液を用いる一連の簡単な実験で容易に決定することができる。一般的な流量は、約０．０５−１０ＣＶ／ｍｉｎの範囲内にある。

表１に示すいくつかの具体例としてのプロセス、特にプロセスＥ、プロセスＨおよびプロセスＩは、本明細書で述べる方法を用いる凝集体除去を保証するが、結合および溶出陽イオン交換クロマトグラフィーステップを含まない。結合および溶出陽イオン交換クロマトグラフィーステップが除外されることにより、下流の精製プロセスに対して多くの重要な利点、すなわち、プロセス所要時間の節約、プロセス開発の単純化、浄化および浄化バリデーションの除外等がもたらされる。他の顕著な利点は、高伝導度溶出の除外であり、それにより、塩の添加なしに、ひいては後の希釈なしに全下流プロセスの実施が可能となる。

本発明は、限定的であると解釈すべきでない以下の実施例によりさらに説明する。本明細書を通して引用したすべての参考文献、特許および公開特許出願並びに図は、参照により本明細書に組み込まれる。

［実施例１］
陽イオン交換（ＣＥＸ）表面修飾膜の調製
この実験では、各種の密度の結合基を有する一連のＣＥＸ表面修飾膜を調製したが、結合基はこの場合、負に荷電したスルホン酸残基である。陽イオン交換基の密度は、表面修飾に用いた反応性溶液の配合（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）により制御した。より低い密度を達成するために、非荷電反応性単量体Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドを種々の量で加えた。

０−４．８重量％の範囲の２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）、０−４．８重量％の範囲のＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、および０．８重量％のＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを含有する一連の水溶液を調製した。０．６５ｕｍの孔径評定および０．１２５ｍｍの厚さを有する親水性超高分子量ポリエチレン膜を１４ｃｍ×１４ｃｍの正方形断片に切断し、各断片を溶液の１つに３０秒間沈めて、完全な濡れを確保した。過剰な溶液を除去し、膜を不活性雰囲気下で２ＭＲａｄの電子線照射に曝露した。その後、膜を脱イオン水ですすぎ、風乾した。

表２に調製したＣＥＸ表面修飾膜の変形形態を示す。リチウムイオン交換を用いて、陰イオン基密度が膜８（ＤＭＡＭ無添加）について０．１３ｍｍｏｌ／ｇ、膜７（１：１ＡＭＰＳ：ＤＭＡＭ重量）について０．０８ｍｍｏｌ／ｇであったことが確認され、これらは、それぞれ３４および２１ｍＭのリガンド密度に対応している。

［実施例２］
静的容量測定を用いた凝集体結合選択性の分析
この実験では、実施例１で調製した様々な密度の結合基を有するＣＥＸ膜を、タンパク質単量体およびタンパク質凝集体に結合するそれらの選択性について試験した。

約１５％の凝集体を含有する、ＭＡｂＩと呼ぶ部分的に精製したモノクローナル抗体の２ｇ／Ｌ溶液を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０に溶解して調製した。１４ｍｍの膜ディスクを酢酸緩衝液に前浸漬し、次に０．５ｍＬの抗体溶液に移した。溶液バイアルを１５時間にわたって緩やかに振とうし、溶液中に残った分子量種をサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。結果を表２に示す。

ＭＡｂの一般的に低い収率は、この実験において膜に容量以下で負荷されたことを示すが、変形形態の１つである膜７は、二量体および高分子量（ＨＭＷ）凝集体の事実上完全な除去を示した。このことは、強い凝集体結合選択性を達成することができることを示す。

［実施例３］
部分的に精製したモノクローナル抗体（ＭＡｂＩ）のフロースルー式での凝集体の除去
代表的な実験において、フロースルー式でモノクローナル抗体を含有する試料からのタンパク質凝集体を除去するための本発明による膜の良好な使用が実証された。

実施例１の膜７の５つの層を排出口付きポリプロプレン装置に封じ込め、前面膜ろ過面積を３．１ｃｍ^２、膜容積を０．２ｍＬとした。この種の装置を以下で「マイクロ」装置と呼ぶ。４．５ｇ／Ｌの精製ＭＡｂＩをｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸緩衝液中に透析した。得られた物質は、部分的に精製したＭＡｂＩと呼び、これを約３．０ｍＳ／ｃｍの伝導度を有するｐＨ５の５０ｍＭ酢酸で５％凝集体を含む１ｇ／Ｌ ＭＡｂＩの濃度に希釈した。次いで、物質（約８０−１００ｍＬ）を実施例１の膜７若しくは８を含有する０．２ｍＬ装置、またはＰａｌｌ Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡから市販されている）を含有する０．１８ｍＬ Ａｃｒｏｄｉｓｋ装置に約１ＣＶ／ｍｉｎで通した。Ｍａｂを通す前に、膜装置を１８ｍΩ水で濡らし、５０カラム容積（ＣＶ）の５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で平衡化した。ＭＡｂ溶液のフロースルー物質を分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いた分析のために収集した。結果を図３Ａ−３Ｃに示す。実施例１で立証されたように膜８と比較して低い密度のＡＭＰＳ結合基を有する膜７が凝集体に結合する優れた選択性を示すことは、明らかである。

表３に約２０％凝集体破過で測定した３種の膜の凝集体結合能を要約する。示したように、膜７は、市販の膜、例えば、Ｐａｌｌ Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ膜並びに膜８と比べて凝集体結合能のほぼ３倍の増加を示す。

［実施例４］
部分的に精製したモノクローナル抗体（ＭＡｂＩＩ）のフロースルー式での凝集体の除去
他の実験において、異なるモノクローナル抗体を含有する試料からのタンパク質凝集体の除去における本発明による膜の良好な使用を実証する。

プロテインＡ精製ＭＡｂＩＩを１Ｍトリス塩基を用いてｐＨ５．０に、５Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いて３．４ｍＳ／ｃｍの伝導度に調整した。部分的に精製したＭａｂＩＩと呼ぶ、得られた物質は、６ｇ／Ｌの濃度を有し、２．４％の凝集体を含んでいた。次いで、物質（約１８ｍＬ）を実施例１の膜７若しくは８を含有する０．２ｍＬ装置に通した。Ｍａｂを膜に通す前に、膜を１８ｍΩ水で濡らし、５０カラム容積（ＣＶ）の５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で平衡化した。ＭＡｂ溶液のフロースルー物質を分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いた分析のために収集した。最初の２画分は、それぞれ約４．５ｍＬであったが、残りの１０画分は、それぞれ０．８５ｍＬであった。ＭＡｂ処理の後、膜を２０ＣＶの５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で洗浄した。結合タンパク質を５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０＋１Ｍ ＮａＣｌを用いて３０ＣＶで溶出した。膜に負荷したＭＡｂＩＩの総量は、５３１ｍｇ／ｍｌであった。ＭＡｂ単量体収率は、フロースルー物質中の単量体の量と膜を通過した全単量体との比較に基づいて計算した。

図４Ａに示すように、約１３ｇ／Ｌまでの凝集体負荷で膜７の破過プールに非常にわずかな凝集体（プール中０．１％未満）が認められたが、膜８については凝集体破過が収集された最初の画分においてさえ認められ、膜７の優れた凝集体結合能が示唆される。膜８の破過プール中の凝集体の量は、０．８％であった。約１３ｇ／Ｌの凝集体負荷において、単量体収率は、膜８および膜７でそれぞれ９３および８６であった。収率はわずかに低かったが、凝集体の破過は、膜７については認められなかった。凝集体のより遅い破過は、より高い凝集体結合能の兆候である。これらの破過曲線は、分取規模の凝集体除去プロセスまたは装置の指針とするために用いることができる。例えば、膜７を含有する装置は、０．１％未満の凝集体のプール純度を達成するために少なくとも５００ｇ／Ｌまで負荷することができる。一般的に、単量体の収率を増加させ、プロセスに関連する総費用を低減するために、より高い負荷が非常に望ましい。さらに、より高い収率は、凝集体の破過が認められるまで負荷を増加させることまたは溶液の状態を変化させることにより達成することができる。フロースルーデータは、凝集体の除去に関する膜７の優れた性能を明確に示している。

図４Ｂに膜７の２種のロットを用いた２回の異なる実験における破過プール中の単量体収率および凝集体レベルを示す。実験２では５３０ｍｇ／ｍｌの実験１と比べて７００ｍｇ／ｍｌまで負荷した。溶液の状態（ｐＨおよび伝導度）は、両実験で同様であったが、ＭＡｂ濃度は、異なっていた（実験１：６ｇ／Ｌ；実験２：４．４ｇ／Ｌ）。プール中の凝集体の量は、両実験で同様であったが、収率の多少の差があった（しかし、収率の差は、ＭＡｂ濃度を測定するために用いた分析技術の一般的な変動に起因する可能性がある）。興味深いことに、７００ｇ／ｍＬのＭＡｂ負荷においてさえ、プール中の凝集体の量は０．２５％にすぎず（実験２；図４Ｂ）、これにより、凝集体に対する結合能が１５ｇ／Ｌを超えることがわかる。

［実施例５］
高ｐＨ誘導凝集体を含有する部分的に精製したモノクローナル抗体（ＭａｂＩＩＩ）のフロースルー式での凝集体の除去
他の実験において、さらに他のモノクローナル抗体ＭＡｂＩＩＩを含有する試料からのタンパク質凝集体の除去における本発明による膜の良好な使用を実証する。

部分的に精製したモノクローナルＩｇＧ原料（ＭＡｂＩＩＩ）の溶液を、３．５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有するｐＨ５の５０ｍＭ酢酸緩衝液に６ｇ／Ｌに溶解して調製した。３．１ｃｍ^２のろ過面積および０．２ｍｌの容積を有するマイクロろ過装置を５層の膜７を用いて前成形した。Ｍａｂ溶液を通す前に、膜を１８ｍΩ水で濡らし、５０カラム容積（ＣＶ）の５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で平衡化した。ＭＡｂ溶液の流速は、２．５ＣＶ／ｍｉｎであり、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いた分析のために画分を収集した。膜上に負荷したＭＡｂＩＩＩの総量は、９３０ｍｇ／ｍｌであった。単量体収率は、フロースルー物質中の単量体の量と膜を通過した全単量体との比較に基づいて計算した。

ＭＡｂＩおよびＩＩについての実施例３および４と同様に、膜７は、図５に示すようにＭＡｂＩＩＩ凝集体に対して高い選択性および高い結合能（＞１０ｍｇ／ｍＬ）を示した。

［実施例６］
タンパク質単量体およびタンパク質凝集体の精製
この実験において、膜７のさらなる特徴付けのために純抗体単量体および凝集体の製剤を分取ＳＥＣを用いて得た。

単量体および凝集体は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ＨＲ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）樹脂を用いて混合物から精製した。４．５ｍＬの部分的に精製した４．５−６ｇ／ＬのＭＡｂを３３０ｍＬカラムに通した。ＭＡｂの注入の前に、カラムを１カラム容積（ＣＶ）のＰＢＳで平衡化した。２つの溶出画分、すなわち、凝集体および単量体画分を収集した。凝集体画分は、３０００ＭＷカットオフＡｍｉｃｏｎ ＵＦ膜を用いて１０倍に濃縮し、分析ＳＥＣを用いて分析した。凝集体含量は、約０．５ｇ／Ｌの濃度を有するこれらの画分中７０％を超えていた。

［実施例７］
立体質量作用（ＳＭＡ）モデルパラメーター：特性電荷（ｖ）およびＳＭＡ平衡定数（Ｋ_ＳＭＡ）の測定
以下の実験は、本発明による膜について観測された凝集体結合選択性のメカニズムを解釈するためにデザインした。立体質量作用（ＳＭＡ）モデル（例えば、Ｂｒｏｏｋｓ Ｃ．Ａ．およびＣｒａｍｅｒ Ｓ．Ｍ．、Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｎｅｎｔ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓａｌｔ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ、ＡＩＣｈＥ Ｊｏｕｒｎａｌ、３８巻、１９６９−１９７８頁、１９９２年参照）を用いて、表面との凝集体相互作用の数（ｖ）並びに表面に対する単量体および凝集体の親和性を反映する、単量体および凝集体の親和定数（Ｋ_ＳＭＡ）を測定した。

ＳＭＡモデルを用いて非線型性イオン交換相互作用の複雑性の一部を説明するのに成功した。モデルは、直接的なタンパク質−リガンド相互作用に起因して「失われる」（例えば、または結合に利用できない）部位およびタンパク質障害に起因して立体的に「失われる」部位の両方を考慮することによって、タンパク質分子に利用できない部位を考慮に入れている。立体障害に起因して「失われた」部位の量は、結合タンパク質濃度に比例すると仮定する。単一成分系のＳＭＡ式は、以下によって与えられる。

ここで、ＱおよびＣは、それぞれ結合および遊離タンパク質濃度である。Ｋは、ＳＭＡ平衡会合定数であり、ｖは、特性電荷であり、σは、立体因子であり、Ｃ_ｓａｌｔは、遊離塩濃度であり、Ｑ_ｓａｌｔは、イオン交換に利用できる結合塩濃度であり、Λは、樹脂の総イオン容量である。特性電荷は、イオン性相互作用によりタンパク質により占有された修飾固体担体上の部位の平均数であり、立体因子は、吸着剤への結合時にタンパク質により立体的に障害される部位の数である。

吸着等温式の線型領域（Ｑが非常に小さい場合）については、Λ＞＞（σ＋ｖ）Ｑであり、我々は上式を以下に近似することができる。

項Ｑ／Ｃは、分配係数（Ｋ_ｐ）と定義され、分配係数の比は、選択性（Ｓ）と定義される。分配係数の決定の代替方法は、線型領域における吸着等温式の勾配を計算することによるものである（例えば、米国特許第８，０６７，１８２号に記載されている）。

１つの実験において、０．２ｍＬ膜マイクロ装置（膜７または８を含有する）を水を用いて濡らし、２０ＣＶ（４ｍＬ）の５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０（緩衝液Ａ）で平衡化した。１００μｌの０．５ｇ／Ｌ精製単量体または凝集体（実施例に記載の精製プロセスによる）を注入した。結合タンパク質を緩衝液Ａおよび緩衝液Ａ＋５００ｍＭ ＮａＣｌの２０ＣＶ勾配を用いて溶出した。無勾配ランのための塩濃度は、タンパク質が溶出する塩濃度（伝導度）範囲に基づいて選択した。無勾配ランは、１００μｌのタンパク質を膜上に負荷することにより実施した。ランニングバッファーは、緩衝液Ａ＋塩（上述のように用いられるタンパク質溶出範囲に基づく種々の塩濃度）であった。溶出クロマトグラムは、ＵＶ２８０またはＵＶ２３０シグナルを用いてモニターし、タンパク質ピークでの保持容量を記録した。ＳＭＡパラメーターは、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｗｈｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ、７９０巻、１６１−１７３頁、２００３年）に記載されているような無勾配溶出方法を用いて測定した。

表４に膜８および７におけるＭＡｂＩのＳＭＡパラメーターを要約する。表４に膜８および７におけるＭＡｂＩＩのＳＭＡパラメーターを要約する。Ｋ_ＳＭＡは、それぞれ膜８および７のイオン容量を３４および２１ｍＭと仮定して求めた。７８％の膜気孔率を用いた。

両ＭＡｂについて、単量体および凝集体の特性電荷の差が膜７についてより高いことが認められ、単量体より凝集体で多数の相互作用が示唆される。さらに、親和性（Ｋ_ＳＭＡからわかるように）が膜８より膜７に対して高い。

図６Ａおよび６Ｂに示すように、凝集体の分配係数（親和性の尺度）が膜８および７の両方の場合に単量体について観測されたものより高いことが認められ、それにより、単量体より凝集体に対する強い結合が示唆される。その効果が膜７の場合に膜８と比べてより顕著であることも認められ、凝集体除去に関する前者の優れた性能が実証されている。

図７に示すように、膜７は、すべての塩濃度においてｐＨ５．０で２種のＭＡｂ（ＭＡｂＩおよびＭＡＢＩＩ）に対して膜８より高い選択性（Ｓ＝凝集体のＫｐと単量体のＫｐとの比）を有する。特に、選択性は、両膜について塩濃度が低下するにつれて増加する。そして、興味深いことに、選択性の増加は、膜８より膜７ではるかに高く、結合基のより低い密度でさえより高い選択性を実現できたことがわかる。また、図７に示すように、最大の性能の恩恵（より高い単量体収率およびより高い凝集体除去）がより低い塩濃度（またはより高い選択性）でさえも実現された。

［実施例８］
膜７の操作ウインドウの決定
代表的な実験において、実験計画法（ＤｏＥ）アプローチを用いて、実際的なプロセスウインドウ、すなわち、溶液ｐＨ、イオン伝導度および本発明による膜上へのタンパク質負荷の組合せを達成することができることが示された。実験計画法（ＤｏＥ）アプローチは、信頼できる操作条件を明らかにするための広く受け入れられたエンジニアリングツールである（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｍ．Ｊ．およびＷｈｉｔｃｏｍｂ Ｐ．Ｊ．、２０１０ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１−２２頁参照）。

操作ウインドウを決定するために３要因を用いたＤｏＥアプローチを用いた中心複合応答局面を実施した。検討したパラメーターは、ｐＨ、伝導度および凝集体負荷であった。様々な量の部分的に精製したＮＡｂＩ（０．５−２．１ｍＬ）を様々な条件（表５）で１３μｌの膜とともに２０時間インキュベートした。次いで、上清を分析ＳＥＣを用いて凝集体および収率について分析した。

このＤｏＥ試験により、収率および凝集体除去に関する膜性能を測定するうえでの３つの重要な操作パラメーター、すなわち、負荷、ｐＨおよび伝導度が強調され、所望の操作ウインドウを定義する簡単な手順が示唆された。結果を図８および９にプロットする。

［実施例９］
熱誘導凝集体を含有する原料流を用いた抗体精製時の下流ウイルスフィルターの保護における本発明による膜の使用
この実施例では、本明細書で述べる１つまたは複数の陽イオン交換基を含む膜を良好に用いて、精製プロセスにおける下流ウイルスフィルターの処理量を増加させることができることを示す。

一般的に、抗体原料を前処理するための表面修飾膜をウイルスろ過の前に用いることができることが以前に報告された（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１１８，６７５号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１００９８８６７参照）。ウイルスろ過の費用は高いため、フィルターの処理量の増加は、タンパク質製品の最終価格に直接的な影響を及ぼす。ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できるもの、例えば、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）ＰｒｅｆｉｌｔｅｒおよびＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ Ｓｈｉｅｌｄを包含するウイルスフィルターの処理量を特に増加させるための多くの市販製品が現在販売されている。しかし、本明細書で示すように、本発明による膜は、従来技術で記載または現在市販されているものと比較して、下流ウイルスフィルターを保護する点がはるかに優れている。

ウイルスフィルターの保護の試験用の熱ショックポリクローナルＩｇＧ原料は、以下の手順により、ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）製のＩｇＧ（８．１または１６．０ｍＳ／ｃｍ（ＮａＣｌを用いた）のｐＨ５、５０ｍＭ酢酸塩中ヒトガンマグロブリン５％溶液、カタログ番号ＨＳ−４７５−１Ｌ）を用いて０．１ｇ／Ｌで調製した。１リットルの０．１ｇ／Ｌ溶液（８．１または１６．０ｍＳ／ｃｍの）を６５°セ氏に設定した恒温水浴中で達温後１時間にわたって加熱しながら１７０ｒｐｍで撹拌した。溶液を熱および撹拌から除去し、３時間にわたって室温に冷却し、次いで４℃で一夜冷蔵した。翌日、熱ショックポリクローナルＩｇＧを室温まで加温した。適切な無菌化ろ過済みｐＨおよび伝導度緩衝液（８．１または１６．０ｍＳ／ｃｍ）中０．１ｇ／ＬポリクローナルＩｇＧの新鮮な溶液を調製した。

処理量試験用の最終溶液は、９容量％の熱ショックポリクローナルＩｇＧ保存溶液および新たに調製した０．１ｇ／ＬポリクローナルＩｇＧ溶液を用いて調製した。最終ｐＨおよび伝導度の調整は、１０Ｍ ＨＣｌ、ＮａＯＨまたは４Ｍ ＮａＣｌを用いて行った。３．１ｃｍ^２のろ過面積を有するマイクロろ過装置を３層の膜を用いて前成形し、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ装置（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）と１：１の面積比で直列に配置した。両装置を緩衝液のみ（ｐＨ５、５０ｍＭ酢酸塩、８．１または１６．０ｍＳ／ｃｍ）を用いてあらかじめ濡らし、排出して空気を除去した。３０ｐｓｉの一定圧力下で、緩衝液ｍＬ／ｍｉｎ単位の処理量の初期の流束を１５分間の期間にわたり質量により測定して、初期の定流束値を求めた。原料を３０ｐｓｉの熱ショックポリクローナルＩｇＧ原料に切り替え、流束が初期の緩衝液のみの流束の２５％に減衰するまで、体積処理量を測定し、時間に対してプロットした。熱ショックポリクローナルＩｇＧの総処理量をＶ７５においてＬ／ｍ^２単位で測定し、ポリクローナルＩｇＧのｋｇ／ｍ^２膜に換算した。表７からわかるように、膜７は、ウイルス除去フィルターに対して膜８より優れた保護（より大きい体積処理量）を提供した。

［実施例１０］
モノクローナル抗体原料流を用いた下流ウイルスフィルターの保護における本発明による膜の使用
部分的に精製したモノクローナルＩｇＧ原料（ＭＡｂＩＩＩ）の溶液は、８．５ｍＳ／ｃｍ（添加ＮａＣｌを用いた）の伝導度を有するｐＨ５、５０ｍＭ酢酸緩衝液中６ｇ／Ｌに調製した。ＭＡｂＩＩＩは、高ｐＨ（１１）であらかじめショックを加えて、約４％の総凝集体（ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより測定）を発生させた。３．１ｃｍ^２のろ過面積を有するマイクロろ過装置を３層の膜を用いて前成形し、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ装置（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）と１：１の面積比で直列に配置した。両装置を無菌化ろ過済み緩衝液のみ（ｐＨ５、５０ｍＭ酢酸塩、８．５ｍＳ／ｃｍ）を用いてあらかじめ濡らし、排出して空気を除去した。ウイルス膜も３０ｐｓｉの一定背圧を発生させた一定流量で１０分間前処理した。次いで、ＭＡｂＩＩＩ溶液を直列の装置に２００Ｌ／（ｍ^２−時間）の定流量で供給し、背圧対時間を測定した。実測背圧が３０ｐｓｉに到達したエンドポイントで総体積処理量を測定した。３０ｐｓｉカットオフにおけるＬ／ｍ^２処理量を膜１ｍ^２当たりのＭＡｂのｋｇ量に換算した。

下の表８からわかるように、膜７は、ウイルス除去フィルターに対して膜８より優れた保護（より大きい体積処理量）をもたらした。

［実施例１１］
膜７と流体連通しているウイルスフィルターの性能に対する滞留時間の影響
この代表的な実験において、ウイルスろ過の性能に対する滞留時間の影響を検討する。ここで、ウイルスフィルターは、フロースルー精製プロセスにおける膜７の下流に配置されている。膜７を含有する装置およびウイルスろ過ステップへのより低い流速がウイルスフィルターのより高い処理量をもたらすことが認められる。

膜面積３．１ｃｍ^２および膜容積０．１２ｍＬを有する膜７を含有する３層装置を３．１ｃｍ^２の膜面積を有するウイルスろ過装置に直列に接続する。２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０緩衝液中約３ｍｇ／ｍＬのポリクローナルヒトＩｇＧ（Ｓｅｒａｃａｒｅ）を２つの接続した装置により処理する。実験は、２種の別個の流速１００および２００ＬＭＨで実施する。０．２２μｍ無菌化フィルターを陽イオン交換クロマトグラフィー装置とウイルスろ過装置との間に配置する。

種々の流量におけるアセンブリを通しての圧力を測定するために圧力センサーを用いる。通常、約５０ｐｓｉの圧力は、ウイルスろ過膜の汚染または閉塞の兆候である。図１０に示すように、実験をより低い流速（すなわち、１００ＬＭＨ）で実施する場合、試料をより高い流速（すなわち、２００ＬＭＨ）で処理する場合と比べて、より多くの試料容積をウイルスろ過膜により処理することができる（すなわち、より高い処理量）。これは、高分子量ＩｇＧ凝集体の結合の改善をもたらし、それにより、ウイルスフィルターの早期の閉塞を予防し得る、陽イオン交換クロマトグラフィー装置における試料のより長い滞留時間に起因すると思われる。

［実施例１２］
いくつかのフロースルー不純物除去ステップを１つに接続する
この代表的な実験において、純度および収率目標を満たしながら、いくつかの不純物除去ステップを１つの簡単な操作に接続する実現可能性を示す。これは、個々の装置、すなわち、活性炭、陰イオン交換クロマトグラフィー装置（例えば、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標））、ｐＨ変更用インラインスタティックミキサーおよび／またはサージタンク、本明細書で述べる凝集体除去用陽イオン交換フロースルー装置並びにウイルス除去装置（例えば、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ）を接続することによって行う。

据付け、平衡化および手順は、以下に述べる。

フロースルー精製トレインは、５つの主要な単位操作、すなわち、活性炭（前面に任意選択のデプスフィルター付き）、陰イオン交換クロマトグラフィー装置（例えば、ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ）、インラインｐＨ調整用インラインスタティックミキサーおよび／またはサージタンク、凝集体除去用陽イオン交換フロースルー装置並びにウイルスろ過装置（例えば、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ）からなる。

図１１にこれらの単位操作を接続する順序を示す。

必要なポンプ、圧力、伝導度およびＵＶセンサーをさらに包含することができる。

すべての装置は、異なるステーションで個別に濡らし、次いで組み立てる。装置は、製造業者のプロトコールに従って濡らし、前処理する。手短に述べると、デプスフィルター（ＡＩＨＣグレード）を１００Ｌ／ｍ^２の水と続いて５容積の平衡化緩衝液１（ＥＢ１；１Ｍトリス塩基ｐＨ１１でｐＨ７．５に調整したプロテインＡ溶出緩衝液）で洗い流す。０．５５ｋｇ／ＬのＭＡｂ負荷を得るために、参照により本明細書に組み込まれる２０１１年８月１９日に出願した同時係属米国仮特許出願第６１／５７５，３４９号に記載のように２．５ｍＬの活性炭を２．５ｃｍ Ｏｍｎｉｆｉｔカラムに充填する。カラムを１０ＣＶの水で洗い流し、次いでｐＨがｐＨ７．５に安定化するまで、ＥＢ１で平衡化する。４．３ｋｇ／Ｌの抗体負荷を得るために２つのＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ装置（０．２および０．１２ｍＬ）を直列に接続する。装置を水で１２．５ＣＶ／ｍｉｎで少なくとも１０分間、その後、５ＤＶのＥＢ１で濡らす。１２のエレメントを有するディスポーザブルらせん状スタティックミキサー（Ｋｏｆｌｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｙ、ＩＬ）を用いてインラインｐＨ調整を行う。膜７を含有する２つの１．２ｍＬ装置を並列に接続して凝集体を除去する。したがって、それらは、約５７０ｍｇ／ｍＬの抗体まで負荷することができる。

それらを１０ＤＶの水と続いて５ＤＶの平衡化緩衝液２（ＥＢ２；１Ｍ酢酸を用いてｐＨ５．０に調整したＥＢ１）で濡らす。装置を５ＤＶ（装置容積）のＥＢ２＋１Ｍ ＮａＣｌでさらに処理し、次いで、５ＤＶのＥＢ２で平衡化する。３．１ｃｍ^２のＶｉｒｅＳｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ装置を３０ｐｓｉに加圧した水で少なくとも１０分間濡らす。次いで、流速が連続３分間一定になるまで、流速を１分毎にモニターする。すべての装置が濡れ、平衡化した後、上記の図に示すようにそれらを接続する。すべての圧力表示およびｐＨ表示が安定化するまで、ＥＢ１を全系に流す。平衡化の後、原料（ｐＨ７．５に調整したプロテインＡ溶出液）をフロースルートレインに通す。ラン中、ＩｇＧ濃度および不純物レベル（ＨＣＰ、ＤＮＡ、浸出ＰｒＡおよび凝集体）をモニターするために試料をサージタンクの前およびＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏの後で採取する。原料を処理した後、システムを３死容積のＥＢ１で洗い流して、装置内および配管内のタンパク質を回収する。

接続フロースループロセスの原料は、回分式プロテインＡプロセスで生成したＭＡｂＩＶのプロテインＡ溶出液である。このＭＡｂ中の凝集体の自然レベルは１％を超えず、そのため、凝集体のレベルを増加させるための特殊な処置を開発した。緩やかに撹拌しながら水性ＮａＯＨで溶液のｐＨを１１に上昇させ、１時間保持した。次に緩やかに撹拌しながら水性ＨＣｌでｐＨを徐々にｐＨ５に低下させた。ｐＨサイクルをさらに４回反復した。凝集体の最終レベルは、ＳＥＣにより測定したとき、約５％であり、主としてＭＡｂＩＶ二量体および三量体からなっている。次いで、原料をｐＨ７．５、伝導度が約３ｍＳ／ｃｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液中に透析した。

このランで処理したＭＡｂ原料は、０．６ｍＬ／ｍｉｎの流速の１０２ｍＬの１３．５ｍｇ／ｍＬ ＭＡｂＩＶである。

ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ後の装置負荷の関数としてのＨＣＰ破過は、１０ｐｐｍの上限を下回っている（図１２）。凝集体は、ＣＥＸ装置により５％から１．１％に減少する（図１３）。接続プロセスのＭＡｂＩＶの収率は、９２％である。Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）Ｐｒｏ装置における処理量は、＞３．７ｋｇ／ｍ^２であった。

実施例１３−１９は、陽イオン交換樹脂または膜の代わりの固体担体としての翼状繊維を用いてフロースルー式で凝集体を除去するための組成物を製造する実現可能性を実証している。

［実施例１３］
ＡＭＰＳ／ＤＭＡＭグラフトコポリマーで修飾したポリマー強陽イオン交換（ＣＥＸ）樹脂の調製
この代表的な実験において、グラフトＡＭＰＳ／ＤＭＡＭコポリマー表面を有し、負に荷電したスルホン酸残基である各種密度の結合基を有する一連の陽イオン交換（ＣＥＸ）樹脂（強ＣＥＸ）を調製した。強陽イオン交換基のリガンド密度および組成は、表面の修飾に用いた反応性溶液の組成により制御した。強陽イオン交換基の密度を変化させるために、ＡＭＰＳおよびＤＭＡＭを様々なモル比で添加した。

機械的攪拌機および滴下漏斗を備えた１０００ｍＬ三頚フラスコに８３０ｍＬの規定の容積に印しを付ける。このフラスコ中で、８．２５ｇの水酸化ナトリウムを４２９．３４ｇの脱イオン水に溶解する。溶液を０℃に冷却し、撹拌しながら１３．６８ｇのＡＭＰＳを数回に分けて徐々に加える。その後、２６．２２ｇのＤＭＡＭを加える。６５％硝酸および／または１Ｍ水酸化ナトリウムの添加により、溶液のｐＨ値を６．０−７．０に調整する。５０ミクロンの平均粒径を有する４００ｍＬの沈降性ポリマーベースのビーズ樹脂を緩やかに撹拌しながら（１２０ｒｐｍ）溶液に加える。反応混合物の総容積は、脱イオン水の添加により８３０ｍＬに調節する（印しに従って）。混合物のｐＨ値を６５％硝酸の添加により再び６．０−７．０のｐＨに調整する。混合物を緩やかに撹拌し（１２０ｒｐｍ）、４０℃に加熱する。６．７５ｇの硝酸アンモニウムセリウム（ＩＶ）および２．９６ｇの６５％硝酸の１５ｇの脱イオン水中溶液を激しい撹拌（２２０ｒｐｍ）のもとで速やかに加える。次いで、反応混合物を４０℃で１２０ｒｐｍで３時間撹拌する。

その後、反応混合物をガラスフリット（多孔度Ｐ３）上に注ぎ、上清を吸引により除去する。残留樹脂を次の溶液で連続的に洗浄する：３ｘ４００ｍＬ脱イオン水、１０ｘ４００ｍＬ １Ｍ硫酸＋０．２Ｍアスコルビン酸、３ｘ１００ｍＬ脱イオン水、１０ｘ４００ｍＬ熱脱イオン水（６０℃）、２ｘ４００ｍＬ脱イオン水、２ｘ４００ｍＬ １Ｍ水酸化ナトリウム、２ｘ１００ｍＬ脱イオン水（脱イオン水による２回目の洗浄ステップ中に２５％塩酸でｐＨを６．５−７．０に調整する）、２ｘ４００ｍＬ ７０％エタノール／３０％脱イオン水、２ｘ１００ｍＬ脱イオン水および２ｘ１００ｍＬ ２０％エタノール／８０％脱イオン水＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ。

上記の洗浄操作を完了した後、樹脂を２０％エタノール、８０％脱イオン水および１５０ｍＭ ＮａＣｌの溶液中１：１（ｖ／ｖ）懸濁液として保存する。

表９にこの実施例に従って調製した各種モル比のＡＭＰＳおよびＤＭＡＭを有する合成スルホン酸含有強ＣＥＸ樹脂を示す。

［実施例１４］
ＡＭＰＳ／ＤＭＡＭグラフトコポリマーで修飾したポリマー強陽イオン交換（ＣＥＸ）樹脂を用いたモノクローナル抗体原料からの凝集体の除去
樹脂試料ロット番号１２ＬＰＤＺ１１９、１２ＬＰＤＺ１２８および１２ＬＰＤＺ１２９を６．６ｍｍの内径を有するＯｍｎｉｆｉｔ（登録商標）クロマトグラフィーカラムに３ｃｍの層高まで充填して、約１ｍＬの充填樹脂層を得た。ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００（クロマトグラフィーシステム）を装着し、フロースルークロマトグラフィーについてこれらのカラムをスクリーニングするのに適する緩衝液で平衡化した（表１０）。樹脂試料１２ＬＰＤＺ１１９、１２ＬＰＤＺ１２８および１２ＬＰＤＺ１２９を含有するクロマトグラフィーカラムを平衡化緩衝液を有するクロマトグラフィーシステム上に装着した。原料は、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓアフィニティークロマトグラフィー媒体を用いて精製し、２Ｍトリス塩基でｐＨ５．０に調整したＩｇＧ１（ＭＡｂＢ）であった。プロテインＡプールの最終ＭＡｂＢ濃度は、１３．８ｍｇ／ｍＬであり、２．０５％の凝集生成物を含有し、伝導度は、約３．５ｍＳ／ｃｍであった。樹脂に３分の滞留時間で、４１４ｍｇ／ｍＬの負荷密度まで負荷した。

フロースルー物質を２ｍＬ画分で収集し、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計で総タンパク質濃度について分析し、凝集体含量をサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により定量した。凝集体定量試験は、０．２Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７．２の平衡化緩衝液を用いてＴｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、７．８ｍｍｘ３０ｃｍ、５μｍ（カタログ番号０８５４１）カラムで実施した。結果は、ｍＡｂＢ単量体タンパク質が凝集生成物より比較的にはるかに低い累積タンパク質負荷でフロースルー画分に高濃度で収集されることを示している。

ロット＃１２ＬＰＤＺ１１９については、４１４ｍｇ／ｍＬの累積タンパク質負荷で３６８．１ｍｇまたは約８８．９％のタンパク質が回収され、凝集体レベルは、２．０５％からフロースルー画分における０．３９％に低下し、ストリッププールは、２１．２％の凝集体を含有しており、凝集体を選択的に保持する樹脂の能力が示唆される。

ロット＃１２ＬＰＤＺ１２８については、４１４ｍｇ／ｍＬの累積タンパク質負荷で３５７．９ｍｇまたは約８６．４％のタンパク質が回収され、凝集体レベルは、２．０５％からフロースルー画分における０．１４％に低下し、ストリッププールは、１３．４％の凝集体を含有しており、凝集体を選択的に保持する樹脂の能力が示唆される。

ロット＃１２ＬＰＤＺ１２９については、４１４ｍｇ／ｍＬの累積タンパク質負荷で３５９．９ｍｇまたは約８６．９％のタンパク質が回収され、凝集体レベルは、２．０５％からフロースルー画分における０．５２％に低下し、ストリッププールは、１６．８％の凝集体を含んでおり、凝集体を選択的に保持する樹脂の能力が示唆される。

図１４にロット＃１２ＬＰＤＺ１１９についてのｍＡｂＢ単量体および凝集体の破過を示し、図１５にロット＃１２ＬＰＤＺ１２８についてのＭＡｂＢ単量体および凝集体の破過を示し、図１６にロット番号１２ＬＰＤＺ１２９についてのＭＡｂＢ単量体および凝集体の破過を示す。

図１４に示すように、ロット＃１２ＬＰＤＺ１１９の樹脂について、フロースルー画分に収集されたＭＡｂＢの濃度は、１１０ｍｇ／ｍＬの累積タンパク質負荷によりその最初の負荷濃度の９０％を超える値に達する。これに反して、凝集体レベルは、４１４ｍｇ／ｍＬの累積タンパク質負荷でわずか０．５６％または最初の負荷濃度の２７．８％であった。これにより、樹脂が、タンパク質単量体（ＭＡｂ）がその総初期質量の８８．９％で回収されることを可能にすると同時に凝集種を高タンパク質負荷に選択的に保持することが示唆される。

図１５に示すように、ロット＃１２ＬＰＤＺ１２８の樹脂について、フロースルー画分に収集されたｍＡｂＢの濃度は、１３８ｍｇ／ｍＬの累積タンパク質負荷によりその最初の負荷濃度の９０％を超える値に達する。これに反して、凝集体レベルは、４１４ｍｇ／ｍＬの累積タンパク質負荷でわずか０．４２％または最初の負荷濃度の２０．９％であった。これにより、樹脂が、タンパク質単量体がその総初期質量の８６．４％で回収されることを可能にすると同時に凝集種を高タンパク質負荷に選択的に保持することが示唆される。

図１６に示すように、ロット＃１２ＬＰＤＺ１２９の樹脂について、フロースルー画分に収集されたｍＡｂＢの濃度は、１１０ｍｇ／ｍＬの累積タンパク質負荷によりその最初の負荷濃度の９０％を超える値に達する。これに反して、凝集体レベルは、４１４ｍｇ／ｍＬの累積タンパク質負荷でわずか０．９９％または最初の負荷濃度の４９．２％であった。これにより、樹脂が、タンパク質単量体がその総初期質量の８６．９％で回収されることを可能にすると同時に凝集種を高タンパク質負荷に選択的に保持することが示唆される。

［実施例１５］
ＡＭＰＳ／ＤＭＡＭグラフトコポリマーで修飾したポリマー強陽イオン交換（ＣＥＸ）樹脂の調製
２５０ｍＬガラスジャー中に、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ７５−Ｆクロマトグラフィー樹脂の６４ｍｌ湿潤ケーキを加えた。次に、１１５ｇの５Ｍ水酸化ナトリウム、１８．７５ｇの硫酸ナトリウムおよび４ｍＬのアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）を樹脂を含有するジャーに加えた。次いで、ジャーを５０℃のハイブリダイザー中に入れ中速度で一夜回転させた。翌日、樹脂を焼結ガラスフィルターアセンブリ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）でろ過排液し、湿潤ケーキをメタノールで洗浄し、次いで、脱イオン水ですすいだ。ガラスバイアル中に、ＡＧＥ活性化樹脂の１０ｍＬの湿潤ケーキを加えた。ガラスバイアルに、０．２ｇの過硫酸アンモニウム、０．３ｇのＡＭＰＳ、１．２ｇのＤＭＡＭおよび４８ｇの脱イオン水を加え、バイアルを６０℃に１６時間加熱した。翌日、樹脂を焼結ガラスフィルターアセンブリ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）でろ過排液し、湿潤ケーキをメタノールおよび脱イオン水の溶液で洗浄し、樹脂をロット＃１７１２とラベル表示した。

［実施例１６］
ＡＭＰＳ／ＤＭＡＭグラフトコポリマーで修飾したポリマー強陽イオン交換（ＣＥＸ）樹脂を用いたモノクローナル抗体原料からの種々の滞留時間での凝集体の除去
実施例１４からの得られた樹脂ロット＃１７１２を６．６ｍｍの内径を有するＯｍｎｉｆｉｔ（登録商標）クロマトグラフィーカラムに３ｃｍの層高まで充填して、約１ｍＬの充填樹脂層を得た。ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００（クロマトグラフィーシステム）を装着し、フロースルークロマトグラフィーについてこれらのカラムをスクリーニングするのに適する緩衝液で平衡化した（実施例１４と同様）。樹脂試料を含有するクロマトグラフィーカラムを平衡化緩衝液を含むクロマトグラフィーシステム上に装着した。原料は、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓアフィニティークロマトグラフィー媒体を用いて精製し、２Ｍトリス塩基でｐＨ５．０に調整したＩｇＧ１（ｍＡｂ５）原料であった。プロテインＡプールの最終濃度を４ｍｇ／ｍＬに希釈し、５．５％の凝集生成物を含有し、伝導度は、約３．２ｍＳ／ｃｍであった。樹脂に１、３または６分の滞留時間で、１４４ｍｇ／ｍＬの負荷密度まで負荷した。３分の滞留時間のストリップピーク画分は、９５．６％の凝集体を含有しており、凝集種に対する高いレベルの選択性が示唆される。結果を下の表１１に示す。

表１１にｐＨ５．０における６、３または１分の滞留時間でのＭＡｂ５を含むロット＃１７１２における単量体および凝集体の保持を示す。表１１に示すように、大抵は、試験したすべての滞留時間について単量体種を凝集種と比較して比較的早期に原料濃度に近い濃度で収集することができ、これは、選択性が流速に対して比較的に鈍感であることを示唆するものである。

図１７にｐＨ５および３分の滞留時間におけるＭＡｂ５を含むロット番号１７１２のクロマトグラムを示す。図１７に示すように、生成物の大部分がフロースルーで収集され、これは、タンパク質のＵＶトレースの比較的に速やかな破過によって示されている。ストリップピークサイズは、一般的に条件および負荷された総質量によって異なるが、わずか５．５％の凝集体を有する負荷材料と比較して、９５．６％と凝集体種に比較的富んでいた。

［実施例１７］
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用い、その後、クロマトグラフィー樹脂を用いたモノクローナル抗体の精製
本明細書で述べる代表的な実験において、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用い、その後、本発明によるクロマトグラフィー樹脂を用いて、モノクローナル抗体を精製した。この実験の結果は、フロースルー式で行う場合に、本方法が伝導度の増加または希釈の使用を必要としなかったという予期しない所見を示すものである。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の細胞培養においてＩｇＧ１（ＭＡｂ５）を発現させた。細胞培養は、２段階デプスろ過とそれに続く無菌化ろ過により清澄化した。０．５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ５を含有する清澄化細胞培養をＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓアフィニティークロマトグラフィー媒体（プロテインＡ）を用いて最初に精製した。用いたプロテインＡクロマトグラフィー溶出緩衝液は、１００ｍＭ酢酸であった。プロテインＡ溶出プールを２Ｍトリス塩基を用いてｐＨを５．０に調整し、得られた溶液は、約３．５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有していた。樹脂ロット番号１７１２は、３分の滞留時間で本明細書で述べた方法によりフロースルー式で操作し、フロースルー画分を収集し、小分割量を分析のために留保した。

フロースルー画分をプールし、ｐＨ７．５に調整し、塩耐性陰イオン交換膜吸着剤であり、５ｋｇ／Ｌに負荷したＣｈｒｏｍａＳｏｒｂまたは陰イオン交換樹脂であり、１５０ｍｇ／ｍＬに負荷したＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥのいずれかを用いてフロースルー式で流した。各画分についてタンパク質濃度、凝集体レベル、浸出プロテインＡおよびチャイニーズハムスター卵巣タンパク質（ＣＨＯＰ）を分析した。結果を下の表１２に示す。

一般的に、クロマトグラフィー精製プロセスは、陰イオン交換クロマトグラフィーの前のステップとして伝統的な結合および溶出陽イオン交換クロマトグラフィーを含み、伝導度を陰イオン交換フロースルークロマトグラフィーに適するレベルに低下させるために希釈ステップまたは緩衝液交換ステップをさらに必要とする。しかし、表１２に示すように、本発明による陽イオン交換媒体を用いる本明細書で述べたプロセスは、機能するために伝導度の増加を必要とせず、したがって、精製ステップの前の希釈ステップまたは緩衝液交換ステップを必要としない。

［実施例１８］
ＡＭＰＳ／ＤＭＡＭグラフトコポリマーで修飾した強陽イオン交換（ＣＥＸ）翼状繊維の調製
この代表的な実験において、陽イオン交換翼状繊維を固体担体として用いた。

１Ｌガラスジャー中で、２０ｇの乾燥ナイロン多葉状または翼状繊維を４００ｇの４Ｍ水酸化ナトリウム、２４ｇの硫酸ナトリウムおよび１６０ｍＬのアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）と混合した。次いで、ジャーを５０℃のハイブリダイザー中に入れ中速度で一夜回転させた。翌日、繊維を焼結ガラスフィルターアセンブリでろ過し、次いで、繊維をメタノールで洗浄し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水ですすいだ。一日後、繊維を水で、続いてメタノールで、次いで再び水で洗浄し、吸引して乾燥ケーキとし、真空オーブン中で５０℃で１日間乾燥した。得られた試料を試料＃１６３５とラベル表示した。３つの別個のガラスバイアルにおいて、試料＃１６３５の２ｇ乾燥ケーキ（ＡＧＥ活性化繊維）を秤取し、グラフトによるさらなる修飾のためにガラスバイアルに加えた。ガラスバイアルに、過硫酸アンモニウム、ＡＭＰＳ、ＤＭＡＭおよび脱イオン水を表１３に指定した量で加え、バイアルを連続的に回転しながら６０℃に１６時間加熱した。翌日、繊維試料を焼結ガラスフィルターアセンブリでろ過し、湿潤ケーキを脱イオン水の溶液で洗浄した。繊維を含むバイアルをロット＃１６３５−１、１６３５−２および１６３５−５とラベル表示した。次に、ロット＃１６３５−５は、約２８μｍｏｌ／ｍＬであることが認められた小イオン容量のために滴定した。次いで、試料＃１６３５−１および１６３５−２も２８μｍｏｌ／ｍＬ未満の小イオン容量を有していたことが推測された。

［実施例１９］
ＡＭＰＳ／ＤＭＡＭグラフトコポリマーで修飾した強陽イオン交換（ＣＥＸ）翼状繊維を用いたモノクローナル抗体原料からの凝集体の除去
実施例１７から得られた修飾翼状繊維ロット＃１６３５−１、＃１６３５−２および＃１６３５−５を６．６ｍｍの内径を有するＯｍｎｉｆｉｔ（登録商標）クロマトグラフィーカラムに３ｃｍの層高まで充填して、約１ｍＬの充填繊維層を得た。ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００（クロマトグラフィーシステム）を装着し、フロースルークロマトグラフィーについてこれらのカラムをスクリーニングするのに適する緩衝液で平衡化した（実施例１３と同様）。翼状繊維試料を含有するクロマトグラフィーカラムを平衡化緩衝液を含むクロマトグラフィーシステム上に装着した。原料は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、２Ｍトリス塩基でｐＨ５．０に調整したＩｇＧ１（ｍＡｂ５）原料であった。プロテインＡプールの最終濃度は、４ｍｇ／ｍＬであり、５．５％の凝集またはＨＭＷ生成物を含有していた。繊維ロット＃１６３５−１およびロット＃１６３５−２を充填したカラムに６４ｍｇ／ｍＬの質量負荷まで負荷し、繊維ロット１６３５−５を充填したカラムに８０ｍｇ／ｍＬの質量負荷まで負荷した。結果を下の表１４に示す。

本明細書は、参照により組み込まれる、本明細書内で引用した参考文献の教示に照らして最も十分に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明における実施形態の実例を提供するものであり、その範囲を限定するものと解釈すべきでない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明により含まれることを容易に認識する。すべての刊行物および発明は、参照によりそれらの全体として組み込まれる。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾または不整合である限りにおいて、本明細書は、任意のそのような資料に優先する。本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行技術であることを容認するものではない。

特に示さない限り、特許請求の範囲を包含する本明細書で用いた成分、細胞培養の量を表すすべての数、処理条件などは、すべての事例において「約」という語により修飾されると理解すべきである。したがって、特に反対の明示がない限り、数値パラメーターは、近似であり、本発明により得ようとする所望の特性によって変化し得る。特に示さない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という語は、該系列におけるすべての要素を指すと理解すべきである。当業者は、本明細書で述べた本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識する、または常用の域を出ない実験を用いて確認することができる。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲によって含まれるものとする。

当業者には明らかなように、本発明の多くの変更および変形は、その精神および範囲から逸脱することなく、行うことができる。本明細書で述べた特定の実施形態は、例としてのみ記載するものであって、限定的であることを意味するものでない。明細書および実施例は、例示的なものとしてのみみなすものとし、本発明の真の範囲および精神は、以下の特許請求の範囲によって示される。

Claims (7)

1. プロテインＡ溶出液中の標的分子の純度を増加させるためのフロースルー方法であって、
   （ａ）プロテインＡクロマトグラフィーカラムから回収された溶出液を、２つ以上の単量体を含むポリマーであって、クロマトグラフィー樹脂または多孔質ビーズ上にリンカーによりグラフトされており、以下の化学構造：
   

   

   
   ［化学構造中、ｘおよびｙは、ポリマー中の各モノマーの平均モル分率であり、ｙ＞ｘである。］
   を含むポリマーと接触させるステップ、および
   （ｂ）標的分子を含むステップ（ａ）からのフロースルー試料を得るステップ
   を含み、フロースルー試料中の凝集体のレベルがプロテインＡ溶出液中の凝集体のレベルより低く、それにより、標的分子の純度を増加させる、フロースルー方法。
2. 約１０ｍＳ／ｃｍ以下のイオン伝導度で実施するプロテインＡ溶出液からの標的分子を精製するためのフロースルー方法。
3. 標的分子がモノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の方法。
4. クロマトグラフィー樹脂または多孔質ビーズが約１０−約５００ミクロンの平均粒径を含む、請求項１に記載の方法。
5. クロマトグラフィー樹脂または多孔質ビーズが約２０−約１４０ミクロンの平均粒径を含む、請求項１に記載の方法。
6. クロマトグラフィー樹脂または多孔質ビーズが約３０−約７５ミクロンの平均粒径を含む、請求項１に記載の方法。
7. クロマトグラフィー樹脂または多孔質ビーズが約５０ミクロンの平均粒径を含む、請求項１に記載の方法。

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