ES2958266T3 - Procedimiento para catalizar una reacción catalizada por enzimas - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un material proteico inmovilizado que comprende una proteína que está inmovilizada sobre un material de vidrio o polímero orgánico mediante unión de etiquetas por afinidad. El material de vidrio puede ser un material de vidrio poroso tal como vidrio (híbrido) de porosidad controlada. La invención también se refiere al uso de un material enzimático inmovilizado como biocatalizador heterogéneo en síntesis química. La invención se refiere además a un método para la inmovilización de proteínas marcadas por afinidad sobre un material de vidrio o polímero orgánico, y a un método para la purificación y aislamiento de proteínas marcadas por afinidad mediante la inmovilización de dichas proteínas sobre un material de vidrio o polímero orgánico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para catalizar una reacción catalizada por enzimas

Campo técnico

La invención se refiere a un procedimiento para catalizar una reacción catalizada por enzimas en síntesis química.

Técnica antecedente

Las proteínas son moléculas biológicas grandes compuestas de una o varias cadenas lineales de residuos de aminoácidos. Las enzimas son un grupo específico de proteínas que actúan como catalizadores biológicos en el metabolismo de todas las células vivas. Como tal, las enzimas son capaces de transformar moléculas orgánicas en diferentes moléculas. Debido a la estructura tridimensional específica de cada enzima particular, sólo muy pocas moléculas orgánicas interactuarán con el sitio activo de la enzima de tal manera que la transformación pueda llevarse a cabo. Por lo tanto, las enzimas son, usualmente, catalizadores altamente selectivos, y el uso de enzimas como catalizadores en la química orgánica sintética es, por esa razón, muy atractivo. Sin embargo, dado que las enzimas son moléculas biológicas evolucionadas para un entorno celular, frecuentemente, no son adecuadas para otros entornos. Cuando se usan en disolventes orgánicos, las enzimas tienden a añadirse y, frecuentemente, desplegarse (es decir, desnaturalizarse). Por lo tanto, es atractivo inmovilizar las enzimas en soporte sólido y usarlas como catalizadores en este estado inmovilizado, ya que esto puede mejorar la estabilidad de la enzima, permitir condiciones de reacción que, normalmente, la enzima no toleraría y, además, facilitar la separación de la mezcla de reacción y la recuperación del material.

La inmovilización de enzimas en el soporte sólido se ha logrado con el uso de diferentes técnicas y diferentes soportes sólidos (Tischer y Wedetype, “Immobilized Enzymes: Methods and Applications [Enzimas inmovilizadas: procedimientos y aplicaciones]”, Topics in Current Chemistry, 1999, vol. 200, págs. 95-126; Brena y Batista-Viera, “ Immobilization of Enzymes: A Literature Survey [Inmovilización de enzimas: un estudio de la literatura]”, Methods in Biotechnology: Inmovilization of Enzymes and Cells, 2006, segunda edición, págs. 15-30).

La adsorción de enzimas a superficies sólidas puede llevar a interacciones no deseadas entre la enzima y el soporte sólido. Se ha demostrado que la adsorción de proteínas sobre nanopartículas de sílice puede llevar a cambios en la estructura secundaria de la proteína, lo cual puede resultar en la desactivación de la enzima (Lundqvist et al., Langmuir 2004, vol. 20, págs. 10639-10647). Por lo tanto, es importante que el soporte sólido no interfiera con la estructura y la actividad de las enzimas inmovilizadas.

La cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC) es una técnica para la purificación de proteínas que se basa en la afinidad de las proteínas por los iones metálicos, tales como Fe2+, Cu2+, Zn2+, Ni2+ y Co2+. Los iones metálicos se inmovilizan en un gel de agarosa y pueden adsorber selectivamente proteínas que contengan histidina y cisteína (Porath et al., Nature 1975, vol. 258, págs. 598-599). Una versión mejorada de esta técnica usa proteínas recombinantes que contienen un péptido de polihistidina fusionado. Dado que el péptido de polihistidina tiene una afinidad mucho mayor por los iones metálicos inmovilizados que un solo residuo de histidina, el nivel de purificación que puede lograrse es mucho mayor (Hochuli et al., Nat. Biotechnol.

1988, vol. 6, págs. 1321-1325; Ljungquist et al., Eur. J. Biochem. 1989, vol. 186, págs. 563- 569). Aunque esta técnica puede ser aplicada exitosamente en procedimientos cromatográficos para la purificación y aislamiento de proteínas, las enzimas inmovilizadas en gel son menos adecuadas como catalizadores heterogéneos en la síntesis orgánica. Además, la técnica IMAC se limita, principalmente, a condiciones acuosas.

En intentos para preparar catalizadores heterogéneos, el principio basado en IMAC de unión de etiquetas de afinidad se ha aplicado a la inmovilización de enzimas etiquetadas con polihistidina en sílice modificado (Cassimjee et al., Biotechnol. Bioeng. 2008, vol. 99, págs. 712-716; Cassimjee et al., Biotechnol. J. 2011, vol. 6, págs. 463-469). Esto funcionó bien para la lipasa B deCandida antárctica(CalB), pero se descubrió que otras enzimas menos estables se desactivaron en presencia de sílice, especialmente en presencia de disolventes orgánicos. Se conoce en la literatura que las nanopartículas de sílice tienen un efecto desestabilizador en las proteínas (Lundqvist et al., Langmuir 2004, vol. 20, págs. 10639-10647).

El vidrio de porosidad controlada (CPG) es otro material que se ha usado para la inmovilización de enzimas. El CPG se trata, usualmente, con 3-aminopropiltrietoxisilano y, después de eso, se deja que las enzimas se unan al aminopropil-CPG a través de residuos de lisina presentes en la superficie de las enzimas, mediante el uso de glutaraldehído como agente de reticulación. Esto da lugar a una unión no específica de la enzima al CPG, frecuentemente, con pérdida concomitante de la actividad enzimática. Otro inconveniente de este procedimiento es que la enzima a inmovilizar se debe purificar a partir de otras enzimas antes de la etapa de inmovilización, con el fin de evitar la inmovilización de una mezcla de diferentes enzimas en el CPG.

También se ha divulgado la inmovilización de enzimas en el CPG con el uso de organotitanatos (US 4.632.904) o con el uso de capas de polisacárido y 1,1 '-dicarbonildiimidazol (Rogalski et al., J. Mol. Catal. B: Enzym. 1999, vol.

6, págs. 29-39).

Engstrom et al. (Angew. Chem. Int. Ed. 2013, vol. 52, págs. 14006-14010) divulgan un catalizador híbrido en el cual la lipasa B deCandida antárcticay una especie de nanopaladio se inmovilizan conjuntamente en los compartimentos de sílice mesoporosa.

Engelmark Cassimjee et al. (Chem. Commun. 2014, vol. 50, págs. 9134-9137) divulgan un procedimiento general de purificación e inmovilización de proteínas en un vidrio de porosidad controlada.

El uso de enzimas como catalizadores en la industria química, es decir, biocatálisis, es clave para lograr una mayor sostenibilidad, menos residuos tóxicos y una mayor rentabilidad. Sin embargo, los altos costos de las enzimas y la pérdida de actividad observada frecuentemente tras la inmovilización de la enzima en el soporte sólido, son obstáculos en este desarrollo. Sería sumamente deseable un procedimiento estandarizado y, generalmente, viable para la inmovilización de enzimas, lo cual permitiría volver a usar la enzima. A pesar del progreso realizado en los últimos años, aún no existe un procedimiento general y simple para la preparación de catalizadores heterogéneos mediante la inmovilización de enzimas. Por lo tanto, persiste la necesidad de procedimientos mejorados para la inmovilización de enzimas en un soporte sólido, y de biocatalizadores heterogéneos estables que puedan aplicarse en síntesis orgánica, tanto en condiciones de reacción acuosa como orgánica.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la preparación del material de CPG de enzima inmovilizada a partir de amino-(Hyb)CPG con el uso de la enzima etiquetada con polihistidina y Co2+ como el metal quelado. El grupo R es un enlazador adecuado y varía entre los productos de CPG. La quelación del ion cobalto al residuo 2,4-dihidroxifenilo y la enzima etiquetada con polihistidina se representa esquemáticamente.

La Figura 2 muestra la preparación de enzima inmovilizada y nanopartícula metálica que contiene material de CPG a partir de amino-(Hyb)CPG con el uso de la enzima etiquetada con polihistidina, Co2+ como el metal quelado y paladio como la nanopartícula metálica. El grupo R es un enlazador adecuado y varía entre los productos de CPG. Tanto la unión de las nanopartículas de paladio al material de<c>P<g>como la quelación del ion cobalto al residuo 2,4-dihidroxifenilo como la enzima etiquetada con polihistidina, se representan esquemáticamente.

Descripción detallada de la invención y la divulgación

La invención, en su sentido más amplio, se refiere a un procedimiento para catalizar una reacción catalizada por enzimas en síntesis química, de acuerdo con la reivindicación independiente 1. Se divulgan realizaciones adicionales de la invención en las reivindicaciones dependientes.

Sorprendentemente, se ha descubierto que, al inmovilizar proteínas en un material de vidrio poroso o un polímero orgánico poroso a través de la unión de etiquetas de afinidad, se obtiene un material proteico inmovilizado que tiene propiedades mejoradas con respecto a la estabilidad de las proteínas inmovilizadas, y en el que se mantiene la función biológica de las proteínas. Se descubrió que las preparaciones de enzimas inmovilizadas tienen una actividad catalítica alta, lo que las hace útiles en la biocatálisis. La presente invención se limita a realizaciones en las que el portador es un material de vidrio poroso. Los aspectos que hacen referencia a un material de vidrio poroso se describen para comprender la invención (pero no se reivindicanper se).

Una proteína que contenga una etiqueta de afinidad se inmoviliza al unirse a un grupo específico en una matriz de afinidad unida al material de vidrio poroso o al polímero orgánico poroso. Debido a la alta afinidad de unión de la etiqueta de afinidad para el grupo específico en la matriz, la unión de la proteína a la matriz es, a su vez, fuerte y altamente específica. Por lo tanto, la divulgación proporciona procedimientos generales para la purificación e inmovilización de proteínas, tales como enzimas.

En un primer aspecto (no reivindicado), la divulgación se refiere a un material proteico inmovilizado que comprende un portador y al menos una proteína inmovilizada en el portador, en el que el portador comprende un material portador al que se une una matriz de afinidad, eligiéndose dicho material portador del grupo que consiste en:

(a) vidrio de porosidad controlada (CPG);

(b) vidrio de porosidad controlada híbrido (CPG Híbrido); y

(c) un polímero orgánico poroso;

y en el que la al menos una proteína contiene una etiqueta de afinidad y está inmovilizada en el portador mediante unión por afinidad específica a la matriz de afinidad.

La inmovilización de proteínas en el portador por medio de una etiqueta de afinidad ofrece la ventaja de una unión específica de las proteínas en un sitio predefinido. Al mismo tiempo, sin embargo, el procedimiento de inmovilización puede aplicarse, generalmente, a muchas proteínas diferentes. La etiqueta de afinidad que se usa en la invención puede ser una etiqueta de polihistidina. La unión por afinidad puede ser el resultado de, p. ej., interacción de van der Waals, unión por hidrógeno, unión iónica o interacción hidrófoba. En cualquier caso, la unión por afinidad debe ser lo suficientemente fuerte como para permitir que la etiqueta de afinidad y la matriz permanezcan fuertemente unidas entre sí, al menos hasta que se apliquen ciertas condiciones específicas con el fin de disociar la etiqueta de afinidad de la matriz.

En otro aspecto (no reivindicado), la divulgación se refiere a un portador para la inmovilización de proteínas que comprende un material portador al que está unida una matriz de afinidad, eligiéndose dicho material portador del grupo que consiste en:

(a) vidrio de porosidad controlada (CPG);

(b) vidrio de porosidad controlada híbrido (CPG Híbrido); y

(c) un polímero orgánico poroso;

y en el que las proteínas se inmovilizan en el portador mediante unión por afinidad específica a la matriz de afinidad.

La proteína a inmovilizar en el portador es una enzima que contiene una etiqueta de afinidad. Debe entenderse que la etiqueta debe tener una afinidad específica por la matriz de afinidad unida al portador.

Varias etiquetas de afinidad y sus matrices correspondientes se conocen en la técnica. Ejemplos de etiquetas de afinidad se enumeran en la tabla a continuación:

La etiqueta de afinidad en la proteína es una etiqueta de polihistidina y la matriz de afinidad unida al portador contiene un ion metálico quelado. El ion metálico quelado es, preferentemente, un ion metálico seleccionado del grupo que consiste en Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+ y Zn2+ y, con mayor preferencia, se selecciona del grupo que consiste en Fe3+, Ni2+ y Co2+. En una realización preferente, el ion metálico quelado es Co2+. En otra realización preferente, el ion metálico quelado es Fe3+.

La elección del ion metálico quelado puede depender del uso previsto. Por ejemplo, si el portador se va a usar para la purificación y aislamiento de una proteína etiquetada por afinidad, la unión de la enzima al portador debe ser reversible. En tales casos, se prefiere que el ion metálico quelado sea Ni2+ o Co2+ y, con la máxima preferencia, Co2+. Estos iones metálicos se unen lo suficientemente fuerte para inmovilizar una enzima etiquetada con polihistidina, pero, además, son capaces de liberar la enzima inmovilizada cuando se aplican condiciones específicas, tales como el tratamiento con una solución tamponada que contenga imidazol o etilendiaminotetraacetato (EDTA).

Para el uso de enzimas inmovilizadas en biocatálisis heterogénea, es deseable una unión fuerte de la enzima al portador. En tales casos, se prefiere que el ion metálico quelado sea Co2+ o Fe3+ y, con la máxima preferencia, Fe3+, ya que esto da como resultado una unión particularmente fuerte de la etiqueta de polihistidina al portador. Como se demuestra en los ejemplos, la lixiviación o bien de la enzima o bien del ion metálico del material proteico inmovilizado que comprende Fe3+ como el ion metálico quelado, es casi insignificante. La ausencia de lixiviación permite que el material proteico inmovilizado (el biocatalizador) se use en cantidades catalíticas. El uso de cantidades catalíticas es particularmente importante en reacciones de flujo continuo.

Una ventaja adicional del Fe3+ como el ion metálico quelado es que este metal no es tóxico. Por lo tanto, el material proteico inmovilizado resultante se puede aplicar de manera segura, p. ej., en la industria alimenticia. La matriz para la proteína etiquetada por afinidad se une a la superficie del portador a través de un enlazador adecuado. La superficie del vidrio de porosidad controlada (CPG) contiene grupos silanol (Si-OH) libres que se pueden unir a una molécula enlazadora por medio de un enlace covalente. Típicamente, la superficie se hace reaccionar con una molécula bifuncional enlazadora de alquilsilano (cuya longitud de cadena y estructura pueden variar), mediante lo cual el átomo de silicio está unido covalentemente con los grupos silanol de la superficie vítrea, y en el que el grupo terminal del silano es un grupo funcional, tal como un aldehído, una amina, un grupo epoxi, un haluro o un derivado de ácido carboxílico. El grupo funcional adecuado que debe usarse dependerá de la naturaleza de la matriz que se ha de unir a la superficie del CPG. Los procedimientos para unir la matriz a la superficie del CPG a través de un enlazador adecuado son conocidos por el experto en la técnica.

El CPG es un material de vidrio robusto e inerte que se puede producir como partículas de macro o mesoporos de tamaño controlado. La distribución nítida del tamaño de poro del CPG puede variarse para tamaños de poro de diámetros de aproximadamente 10 a 300 nm. Esto proporciona un microentorno favorable sin complicaciones debido al impedimento estérico. La estructura de poros de interconexión da como resultado una baja resistencia al flujo de la solución y facilita por todo el material la transferencia de masa de reactivos y productos. La estructura rígida del CPG proporciona un medio resistente no comprimible, adecuado para diseños de reactores de alta productividad y aumento lineal a un alto rendimiento de flujo. El material muestra cierta hinchazón en disolventes, y es química y dimensionalmente estable en la mayoría de los medios orgánicos y entornos acuosos a un pH menor de 10.

El CPG convencional muestra una capacidad de carga de ligandos inversamente relacionada a su tamaño de poro. Por lo tanto, un soporte de CPG de un tamaño de poro grande no puede cargarse con tanta proteína como un soporte de CPG de un tamaño de poro más pequeño. Esto se debe, parcialmente, a la relación inversa entre el tamaño de poro y el área superficial y, parcialmente, debido a grupos silanol accesibles en la superficie que sirven como entidades de funcionalización que tienen una densidad definida por unidad de área superficial, aproximadamente 4,5 μmol/m2. El CPG convencional muestra una distribución no uniforme de silanol en el que los sitios con impedimento estérico del silanol pueden no servir como puntos de unión funcional.

El vidrio de porosidad controlada híbrido (CPG híbrido o HybCPG) es una variante de CPG, en la que las superficies interior y exterior del CPG se revisten con una película de aproximadamente 10 nm de un polímero orgánico reticulado, como se describe en el documento de patente WO 2009/005631. El revestimiento polimérico en el CPG híbrido puede contener grupos funcionales, tales como aldehídos, grupos amino, grupos epoxi, haluros, ácidos carboxílicos y ésteres, o mezclas de estos, a los cuales puede unirse una matriz. Los procedimientos para unir una matriz a un grupo funcional adecuado son conocidos para los expertos en la técnica.

El CPG híbrido ofrece ciertas ventajas sobre el CPG convencional. Como resultado del revestimiento polimérico, la dependencia entre la carga y el tamaño de poro puede minimizarse y la separación entre sitios de funcionalización puede controlarse con mayor precisión y uniformidad. El CPG híbrido como material portador para la inmovilización de proteínas puede ofrecer beneficios adicionales, ya que el diseño del revestimiento polimérico puede adaptarse con el fin de proporcionar características de superficie deseadas o requeridas para una aplicación dada. Por ejemplo, un polímero homogéneo tal como poliestireno, producirá una superficie portadora más hidrófoba, mientras que un polímero homogéneo tal como poliacrilonitrilo, producirá una superficie portadora más hidrófila. Al usar mezclas de dos o más polímeros distintos, se puede obtener un revestimiento copolimérico, en el que las características de la superficie portadora se adaptan específicamente a una aplicación dada. Los revestimientos de capa delgada permiten cierto grado de hinchamiento microscópico en disolventes orgánicos, pero sin la expansión en volumen del lecho del CPG híbrido o un aumento en la contrapresión. Los revestimientos permiten, además, el uso de CPG híbrido en entornos acuosos por encima del pH 10.

A lo largo del resto de la descripción y de las reivindicaciones adjuntas, debe interpretarse que cualquier referencia al CPG incluye tanto el CPG (convencional) como el CPG híbrido, a menos que se indique específicamente de cualquier otra manera.

Otros materiales portadores, además del CPG y el HybCPG, pueden ser deseables debido a razones tales como mayor rentabilidad o requisitos específicos del proceso. Tales materiales incluyen materiales de polímeros orgánicos porosos (plásticos). Estos polímeros se funcionalizan con grupos funcionales, tales como aldehídos, grupos amino, grupos epoxi, haluros, ésteres o ácidos carboxílicos, o mezclas de estos, a los cuales puede unirse una matriz. Los procedimientos para unir una matriz a un grupo funcional adecuado son conocidos para los expertos en la técnica. Los plásticos funcionalizados pueden producirse como partículas porosas con hinchamiento limitado. Los polímeros orgánicos adecuados pueden basarse en monómeros, tales como estireno, etileno, propileno, ácido acrílico, ácido metacrílico, acrilato de metilo y metacrilato de metilo. Ejemplos de tales polímeros orgánicos incluyen polietileno funcionalizado, polietileno de peso molecular ultra alto (UHMWPE), polietileno de alta densidad (HDPE), polipropileno (PP), politetrafluoetileno (PTFE) y fluoruro de polivinilideno (PVDF), poliestireno, polimetacrilato y poli(metacrilato de metilo). En una realización preferente, el polímero orgánico poroso es poliestireno funcionalizado o polimetacrilato funcionalizado.

La unión de proteínas etiquetadas por afinidad al HybCPG descritas en la presente memoria, demuestra la posibilidad de usar portadores de polímeros orgánicos porosos, ya que la superficie porosa en el HybCPG es un polímero orgánicoper se.El HybCPG mantiene, en gran medida, la naturaleza incompresible y no hinchable del CPG mientras que puedan usarse las propiedades superficiales de los polímeros orgánicos. Cuando no se necesite la rigidez del CPG, es plausible que el polímero orgánico por sí solo sea una mejor elección. Por lo tanto, en la presente memoria se demuestra el procedimiento para aplicar una unión de etiqueta de afinidad a tales materiales.

El material proteico inmovilizado con CPG se puede producir fácilmente en solo unas pocas etapas, comenzando a partir de o bien amino-CPG o bien amino-HybCPG, como se indica en la Figura 1. Por ejemplo, los materiales de CPG pueden ser tratados con 2,4-dihidroxiacetofenona, para así enlazar el grupo fenilo al CPG mediante una imina. Si se desea, la funcionalidad imina puede, después de eso, reducirse a la amina correspondiente mediante el uso de un agente reductor adecuado, tal como, p. ej., borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio o hidruro de litio y aluminio. Un ion metálico quelado, tal como Co2+ o Fe3+, puede introducirse posteriormente mediante la suspensión del material en una solución acuosa de CoCh o FeCh, respectivamente. Después del secado, el material obtenido puede usarse directamente como matriz aglutinante para una o más proteínas etiquetadas con polihistidina.

Un material proteico inmovilizado, en el que el material portador sea un polímero orgánico, se puede producir de manera similar a la descrita anteriormente para CPG y HybCPG.

La alta afinidad de la etiqueta de polihistidina con los iones metálicos, tales como Co2+ o Fe3+, permite que la inmovilización de las proteínas etiquetadas con polihistidina se realice a partir de soluciones crudas que contengan las proteínas, sin necesidad de una purificación extensa de la solución antes de la etapa de inmovilización. El material orgánico que no contenga una etiqueta de polihistidina se unirá a los iones metálicos quelados solo débilmente, o nada en absoluto, y se eliminará fácilmente del material proteico inmovilizado final mediante el lavado con, p. ej., agua o soluciones acuosas tamponadas. Por lo tanto, si la proteína etiquetada con olihistidina se prepara mediante sobreexpresión intracelular, la inmovilización de proteínas puede realizarse directamente a partir del lisado celular. Alternativamente, si la proteína etiquetada con polihistidina se segrega por el organismo huésped, la inmovilización de proteínas puede realizarse directamente a partir del sobrenadante del cultivo celular.

Por lo tanto, en otro aspecto (no reivindicado), la divulgación se refiere a un procedimiento para la inmovilización de una proteína etiquetada por afinidad, que comprende las etapas de:

i) inmovilizar la proteína etiquetada por afinidad en un portador que comprende un material portador al cual se une una matriz de afinidad, seleccionándose dicho material portador del grupo que consiste en:

(a) vidrio de porosidad controlada (CPG);

(b) vidrio de porosidad controlada híbrido (CPG híbrido); y

(c) polímeros orgánicos porosos; y

ii) lavar, opcionalmente, el material proteico inmovilizado con agua o un tampón adecuado.

En aún otro aspecto adicional (no reivindicado), la divulgación proporciona un procedimiento para preparar un material proteico inmovilizado, comprendiendo dicho procedimiento:

i) proporcionar un material portador que contenga grupos amino, seleccionándose dicho material portador del grupo que consiste en:

(a) vidrio de porosidad controlada (CPG);

(b) vidrio de porosidad controlada híbrido (CPG híbrido); y

(c) un polímero orgánico poroso;

ii) hacer reaccionar el material portador con 2,4-dihidroxiacetofenona, enlazando así un grupo dihidroxifenilo al material portador;

iii) formar un complejo quelato entre el grupo dihidroxifenilo y un ion metálico capaz de unir una proteína etiquetada con polihistidina; y

iv) unir una enzima etiquetada con polihistidina al material portador que comprenda dicho ion metálico. Opcionalmente, el procedimiento para la preparación de un material proteico inmovilizado, como se describió anteriormente, además comprende unir una nanopartícula de metal de transición al material portador.

En una realización de la invención, el portador es vidrio de porosidad controlada (CPG). En otra realización de la invención, el portador es vidrio de porosidad controlada híbrido (CPG Híbrido).

La disociación de la proteína unida puede lograrse mediante el uso de procedimientos estándar de IMAC. La proteína unida puede, por ejemplo, liberarse del portador mediante la reducción del pH o mediante la adición de una molécula competitiva que tenga una afinidad igual o mayor por los iones metálicos quelados que el grupo de polihistidina, tal como mediante la aplicación de una solución tamponada que contenga imidazol o etilendiaminotetraacetato (EDTA). Después de la disociación de las proteínas purificadas del portador, la etiqueta de polihistidina puede eliminarse de las proteínas, de ser necesario, mediante técnicas conocidas en la técnica, p. ej., mediante la escisión de la etiqueta de afinidad con una enzima adecuada, tal como una proteasa específica, obteniendo, de esta manera, la proteína pura y sin etiqueta.

Por lo tanto, en aún otro aspecto (no reivindicado), la divulgación se refiere a un procedimiento para la purificación y aislamiento de una proteína etiquetada por afinidad, que comprende las etapas de:

i) inmovilizar una proteína etiquetada por afinidad en un portador que comprende un material portador al cual se une una matriz de afinidad, seleccionándose dicho material portador del grupo que consiste en:

(a) vidrio de porosidad controlada (CPG);

(b) vidrio de porosidad controlada híbrido (CPG híbrido); y

(c) polímeros orgánicos porosos;

ii) lavar, opcionalmente, el material proteico inmovilizado con agua o un tampón adecuado; y

iii) disociar la proteína purificada de la matriz de afinidad.

La etapa de inmovilización se puede realizar en un tampón adecuado. De ser necesario, después de eso, el material proteico inmovilizado se puede lavar con agua o con un tampón adecuado, con el fin de eliminar cualquier proteína no unida y otros compuestos no deseados del material proteico inmovilizado. La disociación de la proteína purificada de la matriz de afinidad puede lograrse mediante la aplicación de condiciones adecuadas para la etiqueta de afinidad específica. Las condiciones adecuadas para la disociación de las diferentes etiquetas de afinidad se conocen en la técnica. El procedimiento puede comprender, opcionalmente, la etapa adicional de iv) eliminar la etiqueta de afinidad de la proteína purificada.

Si las proteínas inmovilizadas en el portador, como se describió anteriormente, son enzimas, contienen un sitio activo capaz de catalizar una reacción química. Como tal, el material enzimático inmovilizado es potencialmente útil como catalizador biológico en la síntesis orgánica. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere al uso de un material enzimático inmovilizado, como se divulga en la presente memoria, como catalizador biológico heterogéneo, por ejemplo, en transformaciones orgánicas sintéticas. La invención proporciona, además, un procedimiento para catalizar una reacción catalizada por enzimas, que comprende proporcionar un material proteico inmovilizado de acuerdo con la invención, y poner en contacto dicho material proteico inmovilizado con por lo menos un sustrato sobre el cual una enzima, que se inmoviliza en el portador, tenga la capacidad de actuar.

La inmovilización de enzimas en el portador a través de la unión de etiquetas de afinidad, tal como se divulga en la presente memoria, mejora la estabilidad de las enzimas usadas. Se ha descubierto que las enzimas inmovilizadas toleran tanto las condiciones acuosas como también una variedad de distintos disolventes orgánicos. Esto permite que los materiales enzimáticos inmovilizados se utilicen en condiciones de reacción en las cuales las enzimas libres no inmovilizadas no habrían sido estables. Es posible que el material enzimático inmovilizado se pueda usar, además, en un intervalo de pH más amplio que el que las enzimas libres no inmovilizadas tolerarían.

Cuando la enzima se une a partir de una preparación cruda (no purificada), el material proteico inmovilizado resultante consiste en una enzima enriquecida. Dado que se retiene la actividad natural del procedimiento enzimático, la preparación inmovilizada muestra una mayor actividad catalítica por masa proteica que el material proteico no inmovilizado inicial.

Otra ventaja de la presente invención es que el material enzimático inmovilizado se puede reciclar fácilmente. Dado que el material enzimático inmovilizado es un catalizador heterogéneo, el material puede simplemente recogerse por filtración de la mezcla de reacción. Después de eso, el material puede reutilizarse en una reacción adicional, de ser necesario, después de la purificación del material. Especialmente para enzimas que sean costosas y/o difíciles de cultivar, la posibilidad de reciclar el material enzimático inmovilizado es un aspecto importante.

La enzima inmovilizada en el portador puede ser cualquier enzima útil como catalizador biológico en transformaciones sintéticas orgánicas que incluyan, pero no se limiten a, enzimas que actúen como oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Por lo tanto, los materiales enzimáticos inmovilizados se pueden usar como biocatalizadores heterogéneos en cualquier reacción orgánica, en la que la enzima inmovilizada es capaz de catalizar específicamente la reacción. Ejemplos de dichas reacciones biocatalíticas incluyen, pero no se limitan a, reacciones de oxidación y reducción enzimática, reacciones de hidrólisis enzimática y reacciones de isomerización enzimática. Las reacciones biocatalíticas particularmente útiles son reacciones enantioselectivas. Ejemplos específicos de reacciones biocatalíticas incluyen acilaciones selectivas de alcoholes o aminas con lipasa, transaminaciones con w-transaminasa, monooxigenaciones con CYP P450 o monooxigenasa Baeyer-Villiger, oxidaciones de alcoholes o reducciones de cetonas/aldehídos con alcohol deshidrogenasa y oxidaciones de aminas con monoamina oxidasa.

En una realización, dos o más diferentes enzimas pueden inmovilizarse en el portador, en el que cada una de las diferentes enzimas puede catalizar una reacción diferente. Después, puede ser posible usar el material que contenga dos o más diferentes enzimas inmovilizadas como biocatalizador heterogéneo en una reacción en cascada o de múltiples etapas. Tal reacción en cascada puede ser, por ejemplo, una reacción en la que dos o más reacciones catalizadas por enzimas se realicen en un sustrato en dos o más etapas subsiguientes (es decir, una reacción en la que un sustrato para una primera enzima se transforme en un sustrato para una segunda enzima, y así sucesivamente), tal como una reacción de transaminación por una w-transaminasa seguida de una reacción de acilación por una lipasa. Alternativamente, tal reacción en cascada puede ser una reacción en la que un sustrato se transforme por medio de una primera enzima, y en la que un cofactor para la primera enzima se regenere por medio de una segunda enzima, tal como la reducción selectiva/específica de una cetona/aldehído por medio de alcohol deshidrogenasa con la regeneración concomitante de NADH consumido por medio de formiato deshidrogenasa.

Cuando dos o más enzimas diferentes se inmovilizan en el portador, es conveniente que las diferentes enzimas contengan la misma etiqueta de afinidad, tal como una etiqueta de polihistidina. Dado que la afinidad de unión por el ion de metal quelante es igual para cada una de las enzimas, las diferentes enzimas se unirán con la misma fuerza al portador. Teóricamente, por lo tanto, cuando se usen cantidades iguales dendiferentes enzimas que tengan la misma etiqueta de afinidad, la cantidad de cada enzima diferente en el portador será 1/n (sin tener en cuenta ningún efecto de difusión).

Para las reacciones en cascada con el uso de un material proteico inmovilizado con dos o más enzimas inmovilizadas diferentes, y en las que las diferentes enzimas muestren una diferencia en actividad catalítica, puede ser ventajoso inmovilizar cantidades mayores de la enzima o enzimas que tengan menor actividad catalítica, en comparación con la cantidad de enzimas que tengan la mayor actividad catalítica. Esto acelerará la etapa que determina la velocidad y aumentará la velocidad total de la cascada de reacción.

Alternativamente, las reacciones en cascada se pueden realizar al mezclar uno o más materiales enzimáticos inmovilizados diferentes en las proporciones deseadas.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para catalizar una reacción en cascada o de múltiples etapas catalizadas por enzimas. En este aspecto, el procedimiento comprende proporcionar un material proteico inmovilizado que comprenda dos o más enzimas inmovilizadas, de acuerdo con la invención, y poner en contacto dicho material proteico inmovilizado con por lo menos un sustrato sobre el cual las enzimas, que se inmovilizan en el portador, tengan la capacidad de actuar.

El material enzimático inmovilizado puede comprender adicionalmente nanopartículas metálicas, tales como nanopartículas de metales de transición, tales como, pero sin limitarse a, cobalto, níquel o paladio. El material que comprende nanopartículas metálicas puede prepararse, por ejemplo, al sumergir amino-CPG o amino-HybCPG en una solución de una cantidad adecuada de sal metálica, tal como CoCh, NiCh, Li2PdCh, PdCh o Pd(TFA)2, en acetonitrilo o agua, o en mezclas de estos. Después de eso, los iones metálicos se reducen a nanopartículas metálicas mediante la adición de un exceso de agente reductor adecuado, tal como hidruro de sodio, borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, hidruro de litio y aluminio y lo similar. Después de la adición de 2,4-dihidroxi-acetofenona, la imina inicialmente formada se reduce inmediatamente a la amina correspondiente. Después de eliminar el agente reductor mediante lavado, un ion metálico, tal como Co2+, Fe3+ o Ni2+, a continuación, se quela en la matriz mediante la suspensión del material en una solución acuosa de CoCh, FeCl3 o NiCl2, respectivamente. Después del secado, el material obtenido puede usarse directamente como matriz para una o más enzimas etiquetadas con polihistidina; véase la Figura 2.

Aunque sin querer ceñirse a la teoría, se cree que las nanopartículas metálicas se unen al material de CPG a través de los grupos amino en el material de CPG. También se puede concebir que las nanopartículas metálicas, formadas mediante la reducción de los iones metálicos, sean de un tamaño lo suficientemente grande como para quedar atrapadas en los poros del material de CPG.

El material proteico inmovilizado que contenga tanto enzima inmovilizada como nanopartículas metálicas, se puede aplicar como biocatalizador heterogéneo en reacciones combinadas catalizadas por enzimas y metales de transición. Ejemplos de tales reacciones incluyen, pero no se limitan a, reacciones de resolución cinética dinámica. Un ejemplo específico de tales reacciones es la resolución cinética dinámica de aminas mediante la racemización de la amina mediante nanopartículas de Pd seguida por la acilación con lipasa, como se muestra en los ejemplos adjuntos.

Por lo tanto, en aún otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para catalizar una reacción combinada catalizada por enzimas y catalizada por metales de transición. En este aspecto, el procedimiento comprende proporcionar un material proteico inmovilizado que comprende, adicionalmente, nanopartículas de metales de transición, de acuerdo con la invención, y poner en contacto dicho material proteico inmovilizado con al menos un sustrato sobre el cual una enzima y un metal de transición, que se inmovilizan en el portador, sean capaces de actuar.

Ejemplos del material proteico inmovilizado descrito en la presente memoria y el uso de dicho material, se describen en la sección experimental.

Definiciones

El término “etiqueta de afinidad” se refiere a un grupo definido, tal como una molécula orgánica u organometálica, fragmento de proteína u otro, que esté unido a una proteína recombinante y que sea capaz de unirse a un grupo específico inmovilizado en una matriz. Ejemplos de etiquetas de afinidad son una etiqueta de polihistidina, una etiqueta de glutatión S-transferasa (GST), una etiqueta de proteína de unión a quitina (CBP), una etiqueta de proteína de unión a maltosa (MBP), una etiqueta FLAG, una etiqueta avidina o una etiqueta de estreptavidina. Las etiquetas de afinidad pueden denominarse, además, etiquetas de fusión.

Como se usa en la presente memoria, el término “proteína etiquetada por afinidad” se refiere a una proteína recombinante, en la que una etiqueta de afinidad, como se definió anteriormente, se añadió a la proteína diana. Las proteínas etiquetadas por afinidad pueden prepararse mediante tecnología de ADN recombinante con el uso de procedimientos conocidos en la técnica, tales como ligación de fragmentos de ADN o mediante técnicas de PCR. Las proteínas etiquetadas por afinidad pueden denominarse, además, “proteínas de etiqueta de fusión” o “proteínas de fusión”.

El término “etiqueta de polihistidina” se refiere a una cadena de al menos dos residuos de histidina, que se une al terminal C o N de una proteína. La etiqueta de polihistidina es, preferentemente, una cadena de al menos seis residuos de histidina. Otras denominaciones usadas comúnmente para una etiqueta de polihistidina son, etiqueta de polyHis, etiqueta de histidina, etiqueta de hexahistidina, etiqueta de 6xHis y etiqueta de His6, así como Histag™.

El término “enzima etiquetada con polihistidina” se refiere a una enzima recombinante, en la que la enzima diana se fusiona con una etiqueta de polihistidina, como se definió anteriormente.

Como se usa en la presente memoria, el término “amino-CPG” se refiere a un material de CPG que se funcionaliza con un grupo amino a través de un enlazador adecuado. El término “amino-HybCPG”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un material de CPG híbrido, en el que el revestimiento polimérico contiene grupos amino.

La invención se ilustra además por medio de los siguientes ejemplos, que no limitan la invención en ningún sentido.

Abreviaturas

aw actividad acuosa

AlaDH alanina deshidrogenasa deB. subtilis

CalA lipasa A deCandida Antarctica(también conocida como lipasa A dePseudozyma antarctica) CalB lipasa B deCandida Antarctica(también conocida como lipasa B dePseudozyma antarctica) DCM diclorometano

2,5-DKCMO 2,5-dicetocanfano monooxigenasa dePseudomonas putida

equiv. equivalente(s)

EtOAc acetato de etilo

FMN mononucleótido de flavina

FRE flavina reductasa deE. coli

GC cromatografía de gases

HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico

IPTG isopropil-p-D-tiogalactopiranósido

min minuto(s)

MOPS ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico

MTBE metil terc-butil éter (o terc-butil metil éter)

NADH dinucleótido de nicotinamida y adenina (forma reducida)

PLP piridoxal 5-fosfato

SDS-PAGE dodecilsulfato de sodio electroforesis en gel de poliacrilamida

Tris tris(hidroximetil)aminometano

w-TA w-transaminasa deChromobacterium violaceum

Procedimientos experimentales

Los materiales de CPG se obtuvieron de Prime Synthesis, Inc., (Aston, PA, EE. UU.). Los siguientes materiales de vidrio de porosidad controlada se usaron en los ejemplos:

• LCAA CPG es un CPG derivado con alquilaminas de cadena larga (CPG-0502-N12).

• Copoli-HybCPG-amina (en lo que sigue, también denominado “HybCPG copo”) es un CPG híbrido revestido con un copolímero formado a partir de 1:1 de acrilonitrilo:cloruro de vinilbencilo y reticuladoin situ.

• VBC HybCPG-amina (en lo que sigue, también denominado “HybCPG VBC”) es un CPG híbrido revestido con un polímero formado a partir de monómeros de cloruro de vinilbencilo y reticuladoin situ.

Los (co)polímeros de los revestimientos se reticulan con una amina bifuncional, como se describe en el documento de patente WO 2009/005631. Después de eso, los grupos amino se introducen en los revestimientos de cloro-polímero mediante reacción con ftalimida sódica seguida de desftaloilación con hidrazina.

Los siguientes polímeros orgánicos porosos se usaron en los ejemplos:

• “Mid-Swell Polystyrene” (adquirido de 3-Prime LLC, EE. UU.; Número de artículo 04-02-03-32), un soporte de poliestireno funcionalizado con amino. Tamaño de poro ~1000 A (distribución muy amplia), tamaño de partícula 100 μm, carga de amina 222 μmol/g.

• “Low-Swell Methacrylate Copolymer” (adquirido de SPRIN Technologies S.p.A., Italia; Número de artículo 1A02BN), un soporte de metacrilato funcionalizado con aminos. Diámetro de poro desconocido, tamaño de partícula 100-300 μm, carga de amina 270 μmol/g.

El cultivo de w-transaminasa sobreexpresada a partir deChromobacterium violaceumse realizó como se describe en Cassimjee et al. (ACS Catal. 2011, vol. 1, págs. 1051-1055). El cultivo de lipasa A deCandida Antárcticasobreexpresada se realizó como se describe en Sandstrom et al. (Protein Eng Des Sel. 2009, vol. 22, págs. 413- 420). El cultivo de lipasa B deCandida Antarcticasobreexpresada y CalB Trp104Ala, una variante inestable de lipasa B, se realizó como se describe en Engstrom et al. (Org. Biomol. Chem. 2011, vol. 9, págs. 81 82). El cultivo de 2,5-dicetocanfano monooxigenasa sobreexpresada a partir dePseudomonas putidase realizó como se describe en Kadow et al. (AMB Express 2011, 1:13). El cultivo de flavina reductasa sobreexpresada a partir deE. colise realizó como se describe en Kadow et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013, publicada en línea el 5 de noviembre de 2013). El cultivo de alanina deshidrogenasa sobreexpresada a partir deB. subtilisse realizó como se describe en Mutti et al. (Eur. J. Org. Chem. 2012, vol. 5, págs. 1003-1007). Cuando estaba ausente, se añadió una etiqueta de His6 a los genes mediante PCR. CalA y CalB etiquetadas con polihistidina se inmovilizaron en Accurel según los procedimientos descritos en Engstrom et al. (Org. Biomol. Chem. 2011, vol. 9, págs. 8.- 82).

Ejemplos

Los ejemplos cubren portadores de vidrio de porosidad controlada y portadores de polímero orgánico poroso. Solo el primero constituye la invención. Los últimos se divulgan (pero no se reivindicanper se)para una comprensión completa de la invención reivindicada.

Ejemplo 1

Preparación de portadores de CPG quelantes para la inmovilización y purificación de enzimas etiquetadas con polihistidina

Se trató el amino-CPG (5 g) del tipo deseado con 2,4-dihidroxi acetofenona (1,5 equiv. a las funcionalidades amino del CPG) en metanol (200 ml) con agitación continua durante 60 min. La imina formada se redujo por adición secuencial de borohidruro sódico (4 equiv.) con agitación continua durante 60 min. El material sólido se filtró, se enjuagó con solución de carbonato de sodio acuosa saturada, agua y, después, etanol y, después, se secó a 80 °C durante 2 h. Después, las partículas se sumergieron en una solución acuosa saturada de CoCh (100 ml). Después de la filtración y el enjuague con agua y etanol, las partículas se secaron a 80 °C durante 2 h.

Las propiedades de los diferentes portadores de CPG quelantes se muestran en la Tabla 1.

Los portadores que contienen Fe3+ como el ion metálico quelado, se prepararon de manera similar al procedimiento mencionado anteriormente, pero usando una solución acuosa de FeCh en lugar de CoCh.

Ejemplo 2

Preparación de portadores de poliestireno poroso quelante y polimetacrilato para la inmovilización y purificación de enzimas etiquetadas con polihistidina

Se trataron partículas poliméricas orgánicas porosas (2 g) con grupos funcionales amino lavadas (agua/etanol 1:1, 400 ml) y secadas (al vacío 16 h después de la filtración) del tipo deseado (véase más adelante), con 2,4-dihidroxiacetofenona (1,5 equiv. a las funcionalidades amino del plástico) en metanol (50 ml) con agitación continua durante 60 min. La imina formada se redujo por adición secuencial de borohidruro sódico (4 equiv.) con agitación continua durante 60 min. El material sólido se filtró, se enjuagó con solución acuosa saturada de carbonato de sodio, agua y, después, etanol y, después, se secó al vacío a 25 °C durante 16 h.

Después, las partículas se sumergieron en una solución acuosa saturada de CoCh (100 ml). Después de la filtración y el enjuague con agua y etanol, las partículas se secaron al vacío a 25 °C durante 16 h. Las propiedades de los diferentes portadores plásticos porosos quelantes se muestran en la Tabla 2.

Ejemplo 3

Inmovilización de enzimas etiquetadas con polihistidina en portadores quelantes

Los sobrenadantes del cultivo celular que contienen CalA o CalB se usaron sin tamponado. Los lisados celulares de w-TA se prepararon por resuspensión celular en un tampón HEPES (50 mM, NaCl 500 mM, pH 8,3). Después de la adición de detergentes (BugBuster™ 10X, Novagen), los restos celulares se eliminaron por centrifugación. El portador de CPG quelante se sumergió en los lisados o sobrenadantes seguido de agitación en un agitador orbital (150 rpm). Las muestras de las soluciones analizadas por Bradford durante la inmovilización, confirmaron la finalización de la unión y saturación del portador de CPG quelante a medida que la concentración proteica se apoderaba de disminuir. Los ensayos de actividad se realizaron, además, con las soluciones después de eliminar el portador de CPG por filtración. Después, las preparaciones inmovilizadas se enjuagaron con tampón (MOPS (50 mM, pH 7,4) para CalA y CalB; HEPES (véase más arriba) para w-TA) y se secaron al vacío durante 16 h. La extracción de la enzima inmovilizada del portador de CPG se realizó mediante la inmersión de las partículas en un tampón de elución (fosfato sódico 50 mM, imidazol 500 mM, pH 7,5) e incubación en un agitador orbital durante 20 min. La presencia y pureza de las enzimas extraídas se visualizaron mediante SDS-PAGE; solo las bandas correspondientes a las enzimas etiquetadas con His6 fueron visibles.

La cuantificación del sitio activo de w-TA en disolvente se realizó como se describió anteriormente (Cassimjee et al., ACS Catal. 2011, vol. 1, págs. 1051-1055). La cuantificación del sitio activo de w-TA inmovilizada en disolvente se realizó mediante la adición de w-TA-CPG a 1 -feniletilamina (1 mM, 1 ml, MTBE aw = 0,6, pentadecano 1 mM). La mezcla de reacción se agitó en un agitador orbital (150 rpm, 24 h, 22 °C). La actividad de agua del disolvente se fijó por pares de hidrato de sal (Na2HPO4, 2H2O/7H2O) pero no se controló después de la adición del w-TA-CPG o durante la reacción. Las conversiones se midieron por GC (muestras de 200 j l a EtOAc, 3 gotas de anhídrido acético y trietilamina, 8 h de incubación a 22 °C), con pentadecano como estándar interno. La cuantificación del sitio activo de w-TA inmovilizada en tampón se realizó mediante la adición de w-TA-CPG a 1-feniletilamina (1 mM, 1 ml, HEPES 50 mM, pH 7,0). La mezcla de reacción se agitó en un agitador orbital (150 rpm, 24 h, 22 °C). Las muestras (400 jl) se trataron con solución acuosa de NaOH (1%), se extrajeron con DCM y se analizaron por GC después de la adición de pentadecano (1 mM, EtOAc). Las conversiones se compararon, en todos los casos, con las reacciones en blanco con el CPG quelante (sin unión enzimática).

El rendimiento de inmovilización, es decir, la cantidad de enzima activa eliminada del lisado con respecto a la cantidad de enzima activa retenida en el CPG después del lavado, fue mayor del 99% basado en la cuantificación del sitio activo. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

La inmovilización de enzimas etiquetadas con polihistidina (CalA y CalB) en portadores porosos quelantes de poliestireno y polimetacrilato se realizó como se describió anteriormente para portadores de CPG.

Ejemplo 4

Uso de w-TA-CPG como catalizador

Las w-TA-CPG preparadas en el Ejemplo 3 se aplicaron como catalizadores en la transaminación enantioespecífica de fenoxi-2-propanona:

20 mg de w-TA-CPG se añadieron a una solución de 3 ml de MTBE (aw = 0,6) con 1-feniletilamina racémica 100 mM y 2-fenoxipropanona 50 mM, y la mezcla de reacción se incubó con agitación orbital (150 rpm) a 50 °C. Se usó pentadecano (50 mM) como estándar interno. La conversión y el exceso enantiomérico de 1-feniletilamina fue seguido de cromatografía quiral gaseosa después de tomar las muestras (50 jl) en puntos de tiempo registrados; las muestras se derivaron con anhídrido acético y trietilamina, como se describió anteriormente. La formación de 1-fenoxipropan-2-amina se midió sin derivación. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Ejemplo 5

Uso de CalA y CalB inmovilizadas como catalizadores

Las CalA-CPG, CalB-CPG, CalB-poliestireno y CalB-polimetacrilato preparadas en el Ejemplo 3 se aplicaron como catalizadores en la acilación enantioselectiva de 1 -feniletanol (una resolución cinética):

Las reacciones de resolución cinética catalizada por lipasa se realizaron mediante la adición de la enzima inmovilizada (20 mg) a una solución de 3 ml de tolueno (aw = 0,1) con 1-feniletanol 10 mM y butirato de vinilo 100 mM, y la mezcla se incubó con agitación orbital (200 rpm) a 22 °C (para CalA y CalB) o 50 °C (para CalB Trp104Ala). Se usó pentadecano (5 mM) como estándar interno. La conversión y el exceso enantiomérico de 1-feniletanol y 1 -feniletil butirato se midieron por GC quiral al tomar muestras (50 jl) en puntos de tiempo registrados.

Se incluyeron las siguientes reacciones para la comparación:

- CalB inmovilizada en Accurel®, un polvo poroso de polipropileno.

- CalB inmovilizada en amino-HybCPG copo en forma no modificada (es decir, no procesada según el Ejemplo 1).

La inmovilización de CalB (y CalB Trp104Ala) en Accurel® activado con etanol (Accurel MP1001, tamaño de partícula < 1000 μm, Membrana GmbH, Wuppertal, Alemania) se realizó mediante la adición del material poroso al sobrenadante concentrado en una relación de 50:1 a la cantidad de enzima (el contenido proteico se midió por el procedimiento Bradford), seguido de incubación durante al menos ocho horas. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Ejemplo 6

Preparación de cascada-CPG con tres enzimas diferentes (“BV-cascada-CPG”)

Los lisados celulares de 2,5-DKCMO, FRE y AlaDH se prepararon mediante la resuspensión celular en tampón de fosfato sódico (50 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5) y la adición de BugBuster™ 10X. Después de la centrifugación y de la eliminación de restos celulares, el portador de Co2+ quelante se sumergió en una mezcla de volúmenes iguales de los tres lisados celulares, seguido de agitación en un agitador orbital (150 rpm). Las muestras de las soluciones analizadas por Bradford durante la inmovilización, confirmaron la finalización de la unión y saturación del portador de CPG a medida que la concentración proteica se apoderaba de disminuir. Además, se realizaron ensayos de actividad con las soluciones después de eliminar el CPG mediante filtración. Después, las preparaciones inmovilizadas se enjuagaron con tampón de fosfato sódico (véase más arriba) y, después, se secaron al vacío durante 16 h.

Ejemplo 7

Reacción enzimática en cascada con el uso de BV-cascada-CPG como catalizadores

Las cascada-CPG preparadas en el Ejemplo 6 se aplicaron como catalizadores en la oxidación de Baeyer-VÍNiger de (+)-alcanfor:

Se añadieron 65 mg de BV-cascada-CPG a una mezcla de reacción de tampón de fosfato (100 mM, pH 7,5) con (+)-alcanfor 2,0 mM, L-alanina 5,0 mM, FMN 0,3 mM y NADH 0,5 mM con un volumen de líquido total de 5,0 ml. Después, se disolvió oxígeno (burbujeando durante 30 s) seguido del sellado del recipiente; la mezcla se incubó en un agitador orbital (150 rpm) a 22 °C. Las muestras (500 jl) se extrajeron a EtOAc con etilbenzoato como estándar interno y se analizaron por GC. La conversión se midió después de 3 horas. Se añadió oxígeno después de 24 horas se dejó que la reacción continuara durante 3 horas más, después de lo cual se midió nuevamente la conversión (27 h).

Se realizó, además, una reacción comparativa con 2,5-DKCMO, FRE y AlaDH (a partir de lisados celulares) libres (no inmovilizadas). Las proporciones y cantidades de las enzimas no se midieron. Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Las reacciones de múltiples fases se realizaron al añadir 1,0 g de BV-cascada-CPG a una mezcla de reacción de tampón de fosfato (100 mM, pH 7,5) con L-alanina 160 mM, FMN 0,3 mM y NADH 0,5 mM con un volumen de líquido total de 5,0 ml. 5 ml de ciclohexano con (+)-alcanfor (100 mM) se añadió después como segunda fase líquida. El recipiente sellado se agitó en un agitador orbital (100 rpm) a 22 °C con la adición de oxígeno continuo a la fase acuosa. Las muestras (50 jl) de la fase orgánica se tomaron en puntos de tiempo registrados y se analizaron por GC después de la adición de benzoato de etilo (2,0 mM en EtOAc) como estándar interno. La conversión después de 72 h se midió después de la extracción de todos los componentes con EtOAc (20 ml). Se realizó, además, una reacción comparativa con 2,5-DKCMO, FRE y AlaDH (a partir de lisados celulares) libres (no inmovilizadas). Las proporciones y cantidades de las enzimas no se midieron. Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Ejemplo 8

Preparación de cascada-CPG con CalB y nanopartículas de Pd (“Pd-CalB-CPG”)

Se sumergió amino-CPG (5 g) en una solución de Pd(TFA)2(0,5 equiv. a las funcionalidades amino del CPG) en agua (200 ml) y la mezcla se agitó continuamente durante 10 min. Se añadió después NaBH4 (7 equiv.) y la mezcla se agitó durante unos 30 min adicionales. Después, se añadió 2,4-dihidroxiacetofenona (0,5 equiv.), después de lo cual la mezcla se agitó durante 30 min. El material sólido se filtró y se enjuagó a fondo con agua y, después, se sumergió en una solución acuosa saturada de CoCl2 (100 ml). Después de la filtración y el lavado con agua, el material sólido se sumergió en una solución de CalB etiquetada con polihistidina (purificada o a partir del sobrenadante) y se agitó durante 30 min. Después, la preparación inmovilizada se filtró, se enjuagó con tampón (MOPS 20 mM, pH 7,4) y, después de eso, se secó al vacío durante 16 h.

Ejemplo 9

Reacción en cascada con el uso de Pd-CalB-CPG

El material preparado en el Ejemplo 8 se aplicó como catalizador en la acilación enantioselectiva de 1-feniletilamina (una resolución cinética dinámica):

Se sumergieron 100 mg del Pd-CalB-CPG en una solución de 1,0 ml de tolueno que contenía 1 -feniletilamina racémica 20 mM y butirato de isopropilo 100 mM. Se añadió 1 mg de NaBH4 y se selló la vesícula de reacción. El sistema se incubó a 65 °C con agitación continua en un agitador orbital (100-800 rpm) durante 24 a 48 h. La conversión y el exceso enantiomérico del sustrato y el producto (p. ej., (R)-N-(1-feniletil)butiramida) se midieron por GC quiral al tomar muestras en puntos de tiempo registrados.

El producto se obtiene por separación de las fases, agitación de la fase orgánica con 1 N de HCl (tres veces) con el fin de eliminar el donante acilo residual y la amina y, después, extracción posterior de las fases de lavado con EtOAc. Se evaporan al vacío las fases orgánicas combinadas, para obtener el producto, que se purifica adicionalmente mediante cromatografía instantánea.

Ejemplo 10

A. Determinación de la lixiviación de iones metálicos

Para determinar la cantidad de ion metálico que se lixivia del portador en condiciones dadas, los portadores basados en CPG y HybCPG y que contenían o bien Co2+ o bien Fe3+, se sometieron a incubación prolongada en tampón acuoso.

Se sometieron 250 mg de cada uno de LCAA CPG, HybCPG VBC y HybCPG copo, con o bien Co2+ o bien Fe3+ unidos, a incubación en 3 ml de tampón acuoso (HEPES 20 mM, pH 7,0) durante 72 h en una mesa agitadora a temperatura ambiente.

La cantidad de Co2+ se midió mezclando una parte de la solución incubada con una parte de solución de NH4SCN (1,0 M), una parte de solución de HCl (6,0 M) y dos partes de acetona. Este procedimiento revela un color azul proporcional a la concentración de Co2+, la cual se cuantificó mediante espectrofotometría a 620 nm. Se sometió a prueba, además, una muestra en blanco con el tampón solo.

La cantidad de Fe3+ se midió al mezclar una parte de la solución incubada con una parte de solución de NH4SCN (1,0 M) y una parte de solución de HCl (6,0 M). Este procedimiento revela un color rojo proporcional a la concentración de Fe3+, la cual se cuantificó mediante espectrofotometría a 480 nm. Se sometió a prueba, además, una muestra en blanco con el tampón solo.

Después de eliminar la mitad de las soluciones (1,5 ml) de los materiales portadores incubados, se añadieron 1,5 ml de solución de HCl 6,0 M y los materiales se incubaron en el agitador durante 1 h; este procedimiento desorbe eficazmente todos los iones metálicos unidos. Después, una parte de esta solución incubada se mezcló con una parte de solución de HCl (3 M) y una parte de solución de NH4SCN (1,0 M). A las muestras en las cuales se cuantificó Co2+, se añadieron, además, dos partes de acetona. Se registró la absorbancia a 620 nm para la cuantificación de Co2+ y a 480 nm para la cuantificación de Fe3+. En base a las mediciones de absorbancia, se calcularon para los volúmenes probados los valores correspondientes a la cantidad total de iones metálicos en las dos incubaciones diferentes (primero a pH 7,0 y, después, en HCl 3,0 M) y se corrigieron para el volumen eliminado (1,5 ml después de la primera incubación). De esta manera, se podría cuantificar la fracción de iones metálicos lixiviados a pH 7,0. Los resultados se presentan en la Tabla 8, a continuación.

Puede observarse que Fe3+ unido a material portador de CPG y HybCPG es menos propenso a lixiviarse que Co2+.

B. Determinación de la lixiviación enzimática

Para determinar la cantidad de enzima que se disocia del portador en condiciones dadas, las preparaciones inmovilizadas de w-TA en CPG o HybCPG se sometieron a incubación prolongada en tampón acuoso.

Se incubaron 12-16 mg de cada uno de w-TA-LCAA CPG, w-TA-HybCPG VBC y w-TA-HybCPG copo, en el que la enzima se une por o bien Co2+ o bien Fe3+, en 4 ml de tampón acuoso (HEPES 100 mM, pH 7,0) durante 1 min en un agitador orbital. Tras este tiempo, no pudo detectarse enzima en la solución. Esto se midió mediante ensayo de actividad, en el cual se usó 1 ml de la solución después de la sedimentación del material inmovilizado. Las preparaciones con los 3 ml restantes se incubaron durante 24 h en el agitador orbital, después de lo cual algunas de las preparaciones mostraron en la solución cantidades medibles de enzima.

El ensayo de actividad se realizó tomando 1 ml de la solución, añadiendo 1 ml de mezcla de ensayo (1-feniletilamina (10 mM), piruvato sódico (5 mM) y PLP (1 j M), disuelto en el mismo tampón), y midiendo el cambio de absorbancia en el tiempo a 245 nm durante 5 min. Se sometió a prueba, además, una reacción en blanco con tampón puro. A esta longitud de onda, la formación de acetofenona, un producto a partir de la reacción de transaminación, puede monitorearse como un aumento de la absorbancia con un coeficiente de extinción de 12 mM'1 cm'1 (Schatzle et al., Anal. Chem. 2009, vol. 81, págs. 8244-8248). Dado que se conocen las constantes cinéticas (Cassimjee et al., Org. Biomol. Chem. 2012, vol. 10, págs. 5466-5470), se puede calcular la cantidad de enzima lixiviada. Antes del experimento de lixiviación, la cantidad de enzima unida en las preparaciones inmovilizadas se midió mediante cuantificación de sitio activo. La cantidad de lixiviación después de 24 h para cada material se muestra en la Tabla 9.

Los valores muestran que, en las condiciones ensayadas, Fe3+ como ion metálico quelado da como resultado menos lixiviación enzimática. HybCPG copo como el portador no resultó en ninguna lixiviación enzimática detectable en las condiciones seleccionadas con o bien Co2+ o bien Fe3+ como ion metálico quelado. LCAA CPG, que tiene una superficie de vidrio, dio la mayor cantidad de lixiviación enzimática. Esto puede ser el resultado de una unión enzimática no específica a la superficie del vidrio.

Ejemplo 11

Purificación de w-TA etiquetada con polihistidina con HybCPG copo (Co2+)

Se preparó lisado celular (5,0 ml) a partir de un cultivo de 24 h de w-TA inducido por IPTG granulado en 100 ml de medio Luria-Bertani con la adición de 50 |jg/ml de kanamicina, mediante el uso de BugBuster™. Se añadió un exceso de coenzima (PLP) y la solución se incubó a 37 °C durante 1 h. Después, el exceso de PLP (no unido por la enzima) se eliminó mediante cambio de tampón, mediante el uso de una columna PD10 (dos rondas), a un tampón HEPES (50 mM, NaCl 500 mM, pH 8,2 (Tampón 1)), que dio 7,0 ml de solución que contenía la holoenzima diana, proteínas nativas y otras impurezas.

Se llenó una columna con 204 mg de HybCPG copo (Co2+) que contenía 26 μmol/g de Co2+. El material se humedeció previamente mediante la adición de 7,0 ml de Tampón 1, y el flujo pasante se descartó.

La holoenzima activa se midió espectrofotométricamente a 395 nm, £ = 8,1 mM'1 cirr1 (Cassimjee et al., ACS Catal. 2011, vol. 1, págs. 1051-1055). Tras la medición de la absorbancia, se añadió el lisado a la columna, y se recolectó el flujo pasante. La diferencia de absorbancia a esta longitud de onda del lisado antes y después de pasar a través de la columna se midió a 0,62 (todas las mediciones se realizaron con una longitud de trayecto de 1,0 cm). Esto corresponde a 29 mg de enzima, ahora unida al portador de HybCPG copo (Co2+) en la columna. Después, la columna se lavó con 7,0 ml de Tampón 1. El flujo pasante se recolectó, del cual la absorbancia se midió a 0,11, con el Tampón 1 como blanco. Esto corresponde a 5 mg de enzima que se eliminó por lavado de la columna, debido presumiblemente a la enzima unida o no unida de manera no específica, dejando 24 mg de enzima unida en la columna.

La disociación de la enzima unida en la columna se realizó mediante la aplicación de 5,0 ml de tampón Tris (50 mM, imidazol 500 mM, pH 7,5 (Tampón 2). Se recolectó el flujo pasante y se añadió nuevamente un exceso de coenzima. Como se describió anteriormente, el exceso de PLP se eliminó por cambio de tampón, mediante el uso de una columna PD10, al Tampón 1, lo que dio un volumen total de 7,0 ml de solución con holoenzima disuelta. Se midió la absorbancia a 0,465. Esto corresponde a 22 mg de enzima purificada, o un rendimiento del 92%. La solución parecía significativamente libre de contaminar la proteína de la célula huésped, lo cual también se confirmó mediante SDS-PAGE.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para catalizar una reacción catalizada por enzimas en síntesis química, que comprende:

(a) proporcionar un portador y al menos una enzima inmovilizada en el portador,

en el que el portador es vidrio de porosidad controlada (CPG) o vidrio de porosidad controlada híbrido (CPG híbrido) al cual se une una matriz de afinidad que contiene un ion metálico quelado, en el que la al menos una enzima contiene una etiqueta de polihistidina y se inmoviliza en el portador a través de la unión por afinidad específica entre la etiqueta de polihistidina y el ion metálico quelado; y

(b) poner la enzima inmovilizada en contacto con al menos un sustrato, catalizando de esta manera la reacción.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la matriz de afinidad se une a la superficie del portador a través de un enlazador.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el portador es vidrio de porosidad controlada (CPG).

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el portador es vidrio de porosidad controlada (CPG) híbrido.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el ion metálico quelado se selecciona del grupo que consiste en Fe2+, Co2+, Ni2+, Cu2+ y Zn2+.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dos o más diferentes enzimas se inmovilizan en el portador, y en el que cada una de las diferentes enzimas es capaz de catalizar una reacción diferente.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el portador comprende adicionalmente nanopartículas metálicas.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación7, en el que las dichas nanopartículas metálicas son nanopartículas de metales de transición.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que las nanopartículas metálicas se seleccionan del grupo que consiste en nanopartículas de cobalto, níquel y paladio.

10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la reacción catalizada por enzimas se realiza en condiciones acuosas.

11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la reacción catalizada por enzimas se realiza en un disolvente orgánico.

12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la reacción catalizada por enzimas es una reacción de flujo continuo.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la reacción catalizada por enzimas es una reacción en cascada.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que un sustrato para una primera enzima se transforma en un sustrato para una segunda enzima.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que un sustrato se transforma mediante una primera enzima y en el que un cofactor para la primera enzima se regenera mediante una segunda enzima.

16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que un metal de transición se inmoviliza en el portador, y en el que el procedimiento es una reacción de múltiples etapas que comprende una reacción catalizada por enzimas y una reacción catalizada por metales de transición.