BR112016017398B1 - Material de enzima imobilizado, uso de um carreador, e, métodos para preparação de um material de enzima imobilizado e para catalisação de uma reação - Google Patents

Abstract

MATERIAL DE PROTEÍNA IMOBILIZADO, CARREADOR, MÉTODOS PARA PREPARAÇÃO DE UM MATERIAL DE PROTEÍNA IMOBILIZADO E PARA CATALISAÇÃO DE UM REAÇÃO, E, USO DO MATERIAL DE PROTEÍNA IMOBILIZADO. A invenção refere-se a um material de proteína imobilizado que compreende uma proteína que é imobilizada em um material vítreo ou polímero orgânico através da ligação por rótulo de afinidade. O material vítreo pode ser um material vítreo poroso, tal como vidro de porosidade controlada (híbrido). A invenção também refere-se ao uso de um material de enzima imobilizado como um biocatalisador heterogêneo na síntese química. A invenção ainda refere-se a um método para a imobilização de proteína rotuladas por afinidade em um material vítreo ou polímero orgânico e a um método para a purificação e isolamento de proteínas rotuladas por afinidade pela imobilização de tais proteínas em um material vítreo ou polímero orgânico.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] A invenção refere-se a um material de proteína imobilizado que compreende uma proteína que é imobilizada em um material vítreo ou polímero orgânico através do rótulo de afinidade. O material vítreo pode ser um material vítreo poroso, tal como vidro de porosidade controlada (híbrido). A invenção também refere-se ao uso de um material de enzima imobilizado como um biocatalisador heterogêneo na síntese química. A invenção ainda refere-se a um método para a imobilização de proteínas rotuladas por afinidade em um material vítreo ou polímero orgânico e a um método para a purificação e isolamento de proteínas rotuladas por afinidade pela imobilização de tais proteínas em um material vítreo ou polímero orgânico.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[0002] As proteínas são moléculas biológicas grandes feitas de uma a diversas cadeias lineares de resíduos de aminoácido. As enzimas são um grupo específico que serve como catalisadores biológicos no metabolismo de todas as células viventes. Como tais, as enzimas são capazes de transformar as moléculas orgânicas em moléculas diferentes. Por causa da estrutura tridimensional específica de cada enzima particular, apenas algumas poucas moléculas orgânicas interagirão com o local ativo da enzima de uma tal maneira que a transformação possa acontecer. Portanto, as enzimas são, usualmente, catalisadores altamente seletivos e o uso de enzimas como o catalisador na química orgânica sintética é, por essa razão, muito atraente. Entretanto, visto que as enzimas são moléculas biológicas desenvolvidas para um ambiente celular, estas são frequentemente inadequada para outros ambientes. Quando usadas em solventes orgânicos, as enzimas tendem a agregar e frequentemente desdobrar (isto é, desnaturar). Portanto, é atrativo imobilizar as enzimas em suporte sólido e usá-las como catalisador neste estado imobilizado, quando este pode melhorar a estabilidade da enzima, permitir as condições de reação que a enzima normalmente não toleraria e, além disso, facilita a separação da mistura de reação e recuperação do material.

[003] A imobilização das enzimas em suporte sólido foi realizada usando-se técnicas diferentes e suportes sólidos diferentes (Tischer and Wedekind, "Immobilized Enzymes: Methods and Applications", Topics in Current Chemistry, 1999, vol. 200, pp. 95-126; Brena and Batista-Viera, "Immobilization of Enzymes: A Literature Survey", Methods in Biotechnology: Immobilization of Enzymes and Cells, 2006, segunda edição, pp. 15-30).

[004] A adsorção de enzima nas superfícies sólidas pode levar às interações indesejadas entre a enzima e o suporte sólido. Foi mostrado que a adsorção de proteína em nanopartículas de sílica pode levar às mudanças na estrutura secundária da proteína, que pode resultar na desativação da enzima (Lundqvist et al., Langmuir 2004, vol. 20, pp. 10639-10647). Portanto, é importante que o suporte sólido não interfira com a estrutura e a atividade de enzimas imobilizadas.

[005] A cromatografia de afinidade de íon metálico (IMAC) é uma técnica para a purificação de proteínas que é fundamentada na afinidade de proteínas para os íons metálicos, tais como Fe2+, Cu2+, Zn2+, Ni2+ e Co2+. Os íons metálicos são imobilizados e um gel de agarose e podem absorver seletivamente as proteínas contendo histidina e cisteína (Porath et al., Nature 1975, vol. 258, pp. 598-599). Uma versão melhorada desta técnica usa proteínas recombinantes contendo um peptídeo de poli-histidina fundido. Como peptídeo de poli-histidina tem uma afinidade muito maior para os íons metálicos imobilizados do que um resíduo de histidina simples, o nível de purificação que pode ser atingido é muito maior (Hochuli et al., Nat. Biotechnol. 1988, vol. 6, pp. 1321-1325; Ljungquist et al., Eur. J. Biochem. 1989, vol. 186, pp. 563-569). Embora esta técnica possa ser aplicada de maneira bem-sucedida em procedimentos cromatográficos para a purificação e isolamento de proteínas, as enzimas imobilizadas por gel são menos adequadas como catalisadores heterogêneos na síntese orgânica. A técnica IMAC é, além disso, primariamente restrita às condições aquosas.

[006] Nas tentativas de preparar catalisadores heterogêneos, o princípio fundamentado em IMAC de ligação por rótulo de afinidade foi aplicado à imobilização de enzimas rotuladas por histidina em sílica modificada (Cassimjee et al., Biotechnol. Bioeng. 2008, vol. 99, pp. 712-716; Cassimjee et al., Biotechnol. J. 2011, vol. 6, pp. 463-469). Isto trabalhou bem para a lipase B de Candida antarctica (CalB), mas outras enzimas menos estáveis foram observadas serem desativadas na presença de sílica, especialmente na presença de solventes orgânicos. É conhecido na literatura que as nanopartículas de sílica têm um efeito de desestabilização nas proteínas (Lundqvist et al., Langmuir 2004, vol. 20, pp. 10639-10647).

[007] O vidro de porosidade controlada (CPG) é um outro material que foi usado para a imobilização de enzimas. O CPG é usualmente tratado com 3-aminopropiltrietoxissilano e as enzimas são, a seguir, deixadas ligar à aminopropil-CPG através dos resíduos de lisina presentes na superfície da enzima, usando-se glutaraldeído como um agente de reticulação. Isto resulta em uma ligação não específica da enzima ao CPG, frequentemente com a perda concomitante da atividade enzimática. Uma outra desvantagem deste método é que a enzima a ser imobilizada deve ser purificada a partir de outras enzimas antes da etapa de imobilização, a fim de evitar a imobilização de uma mistura de enzimas diferentes no CPG.

[008] A imobilização de enzimas em CPG usando-se organotitanatos (US 4,632,904) ou usando-se camadas de polissacarídeo e 1,1'- dicarbonildiimidazol (Rogalski et al., J. Mol. Catal. B: Enzym. 1999, vol. 6, pp. 29-39) também foi descrita.

[009] Engstrom et al. (Angew. Chem. Int. Ed. 2013, vol. 52, pp. 14006-14010) divulga um catalisador híbrido em que a lipase B de Candida antarctica e uma espécie de nanopaládio são co-imobilizadas nos compartimentos de sílica mesoporosa.

[0010] O uso de enzimas como catalisadores na indústria química, isto é, biocatálise, é chave para atingir a sustentabilidade mais alta, resíduos menos tóxico e eficiência de custo mais alta. Entretanto, os custos altos das enzimas e a perda frequentemente observada de atividade na imobilização da enzima em suporte sólido são obstáculos neste desenvolvimento. Um procedimento padronizado e geralmente trabalhável para a imobilização de enzima, que deve permitir que a enzima seja reutilizada, deve ser altamente desejável. A despeito do progresso feito em anos recentes, ainda não existe método geral e simples para a preparação de catalisadores heterogêneos pela imobilização de enzimas. Portanto, existe uma necessidade contínua quanto a métodos melhorados para a imobilização de enzimas em um suporte sólido e para biocatalisadores heterogêneos estáveis que podem ser aplicados na síntese orgânica sob condições de reação tanto aquosas quanto orgânicas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0011] A Figura 1 mostra a preparação de material CPG de enzima imobilizada de amino-(Hyb)CPG, usando-se a enzima rotulada por poli- histidina e Co2+ como o metal quelado. O grupo R é um ligante adequado e varia entre os produtos de CPG. A quelação do íon de cobalto ao resíduo de 2,4-di-hidroxifenila e a enzima rotulada por poli-histidina é esquematicamente descrita.

[0012] A Figura 2 mostra a preparação de material de CPG contendo nanopartícula de enzima e metal imobilizado de amino-(Hyb)CPG, usando-se enzima rotulada por poli-histidina, Co2+ como o metal quelado e como o paládio metálico. O grupo R é um ligante adequado e varia entre os produtos de CPG. Tanto a ligação das nanopartículas de paládio ao material CPG quanto à quelação do íon de cobalto ao resíduo de 2,4-di-hidroxifenila e a enzima rotulada por poli-histidina são descritos esquematicamente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0013] Foi surpreendentemente descoberto que imobilizando-se as proteínas em um material vítreo poroso ou um polímero orgânico poroso através da ligação por rótulo de afinidade, um material de proteína imobilizado é obtido tendo propriedades melhoradas com respeito à estabilidade das proteínas imobilizadas e em que a função biológica das proteínas é mantida. As preparações de enzimas imobilizadas foram observadas ter uma atividade catalítica alta, que a tornam úteis na biocatálise.

[0014] De acordo com a invenção, uma proteína contendo um rótulo de afinidade é imobilizada por ser ligada a um grupo específico em uma matriz de afinidade ligada ao material vítreo poroso ou o polímero orgânico poroso. Porque a afinidade de ligação alta do rótulo de afinidade para o grupo específico na matriz, a ligação da proteína à matriz é tanto forte quanto altamente específica. Desta maneira, a invenção fornece métodos gerais para a purificação e imobilização de proteínas, tais como enzimas.

[0015] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um material de proteína imobilizado que compreende um carreador e pelo menos uma proteína imobilizada no carreador, em que o carreador compreende um material carreador ao qual uma matriz de afinidade é ligada, o dito material carreador sendo escolhido do grupo que consiste de: (a) vidro de porosidade controlada (CPG); (b) vidro de porosidade controlada híbrido (CPG Híbrido) e (c) um polímero orgânico poroso; e em que pelo menos uma proteína contém um rótulo de afinidade e é imobilizada no carreador através da ligação de afinidade específica à matriz de afinidade.

[0016] A imobilização de proteínas no carreador por intermédio de um rótulo de afinidade oferece a vantagem de uma ligação específica das proteínas em um local predefinido. Ao mesmo tempo, entretanto, o método de imobilização é geralmente aplicável a muitas proteínas diferentes. O rótulo de afinidade que é usado na invenção pode ser qualquer rótulo que é capaz de ligar-se especificamente a uma matriz para a qual esta tem afinidade. A ligação por afinidade pode ser o resultado de, por exemplo, interação de van der Waals, ligação de hidrogênio, ligação iônica ou interação hidrofóbica. Em qualquer caso, a ligação por afinidade deve ser forte o bastante para deixar o rótulo de afinidade e a matriz para permanecer firmemente ligado um ao outro pelo menos até certas condições específicas serem aplicadas a fim de dissociar o rótulo de afinidade a partir da matriz.

[0017] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um carreador para a imobilização de proteínas, que compreende um material carreador ao qual uma matriz de afinidade é ligada, o dito material carreador sendo escolhido do grupo que consiste de: (a) vidro de porosidade controlada (CPG); (b) vidro de porosidade controlada híbrido (CPG Híbrido) e (c) um polímero orgânico poroso; e em que as proteínas são imobilizadas no carreador através da ligação de afinidade específica à matriz de afinidade.

[0018] A proteína a ser imobilizada no carreador pode ser qualquer proteína contendo um rótulo de afinidade, tal como uma proteína (recombinante) ou enzima contendo um rótulo de afinidade. Preferivelmente, a proteína é uma enzima contendo um rótulo de afinidade. Deve ser entendido que o rótulo deve ter afinidade específica quanto à matriz de afinidade ligada ao carreador.

[0019] Diversos rótulos de afinidade e matrizes correspondentes são conhecidos na técnica. Os exemplos de rótulos de afinidade que podem ser úteis na invenção e os grupos correspondentes na matriz são listados na tabela abaixo:

[0020] Em uma modalidade preferida, o rótulo de afinidade na proteína é um rótulo de poli-histidina e a matriz de afinidade ligada ao carreador contém um íon de metal quelado. O íon de metal quelado é preferivelmente um íon metálico selecionado do grupo que consiste de Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+ e Zn2+ e é mais preferivelmente selecionado do grupo que consiste de Fe3+, Ni2+ e Co2+. Em uma modalidade preferida, o íon de metal quelado é Co2+. Em uma outra modalidade preferida, o íon de metal quelado é Fe3+

[0021] A escolha do íon de metal quelado pode ser dependente do uso pretendido. Por exemplo, se o carreador deve ser usado para a purificação e isolamento de uma proteína rotulada por afinidade, a ligação da enzima ao carreador deve ser reversível. Em tais casos, é preferido que o íon de metal quelado é Ni2+ ou Co2+ e mais preferivelmente Co2+. Estes íons de metal ligam-se forte o bastante para imobilizar a enzima rotulada por poli-histidina, mas também são capazes de liberar a enzima imobilizada quando as condições específicas são aplicadas, tais como tratamento com uma solução tamponada contendo imidazol ou etilenodiaminotetraacetato (EDTA).

[0022] Par ao uso de enzimas imobilizadas em biocatálise heterogênea, uma ligação forte da enzima ao carreador é desejável. Em tais casos, é preferido que o íon de metal quelado é Co2+ ou Fe3+ e mais preferivelmente Fe3+, visto que isto resulta em ligação particularmente forte do rótulo de poli-histidina ao carreador. Como é demonstrado nos exemplos, a lixiviação de enzima ou íon metálico de material de proteína imobilizada que compreende Fe3+ como o íon de metal quelado é quase negligível. A ausência da lixiviação permite que o material de proteína imobilizado (o biocatalisador) deve ser usado em quantidades catalíticas. O uso de quantidades catalíticas é particularmente importante em reações de fluxo contínuo.

[0023] Uma outra vantagem de Fe3+ como o íon de metal quelado é que este metal não é tóxico. A proteína imobilizada resultante, portanto, pode ser seguramente aplicada, por exemplo, na indústria alimentícia.

[0024] A matriz para a proteína rotulada por afinidade é ligada à superfície do carreador através de um ligante apropriado. A superfície do vidro de porosidade controlada (CPG) contém grupos de silanol livre (Si- OH), que pode ser ligado a uma molécula ligante por intermédio de uma ligação covalente. Tipicamente, a superfície é reagida com uma molécula ligante de alquil silano bifuncional (a estrutura e o comprimento da cadeia que pode variar), pelo qual o átomo de silício é covalentemente ligado com os grupos de silanol da superfície de vidro e em que o grupo terminal do silano é um grupo funcional, tal como um aldeído, uma amina, um grupo epóxi, um haleto ou um derivado de ácido carboxílico. O grupo funcional apropriado que deve ser usado dependerá da natureza da matriz a ser ligada à superfície do CPG. Os métodos para a ligação da matriz à superfície do CPG através de um ligante apropriado são conhecidos pela pessoa habilitada na técnica.

[0025] O CPG é um material vítreo robusto e inerte que pode ser produzido como partículas de macro ou meso-poros de tamanho controlado. A distribuição de tamanho de poro nítida de CPG pode ser variada para tamanhos de poro de cerca de 10 a 300 nm de diâmetros. Isto fornece um microambiente favorável sem complicações devido ao impedimento estérico. A interconexão da estrutura porosa resulta na resistência do fluxo de solução baixa e facilita a transferência de massa de reagentes e produtos por todo o material. A estrutura rígida de CPG fornece um meio não compressível adequado para projetos de reator de alto rendimento e classificação linear em taxas de fluxo altas.

[0026] O material apresenta dilatação limitada em solventes e é dimensionável de maneira química e dimensional na maioria de meios orgânicos e ambientes aquosos em pH abaixo de 10.

[0027] O CPG convencional apresenta uma capacidade de carreamento de ligando que é inversamente relacionado com seu tamanho de poro. Desta maneira, um suporte de CPG de um tamanho de poro grande não pode ser carregado com tanta proteína como um suporte de CPG de um tamanho de poro menor. Isto ocorre parcialmente devido à relação inversa entre o tamanho de poro e a área de superfície e, parcialmente, devido à grupos silanol acessíveis de superfície que serve como porções de funcionalização tendo uma densidade definida por unidade de área de superfície, aproximadamente de 4,5 µmol/m2. O CPG convencional apresenta uma distribuição de silanol não uniforme onde os locais de silanol estericamente impedidos podem não servir como pontos de ligação funcionais.

[0028] O vidro de porosidade controlada híbrido (CPG Híbrido ou HybCPG) é uma variante de CPG em que as superfícies interiores e exteriores do CPG são revestidas com aproximadamente 10 nm de película de um polímero orgânico reticulado, como é descrito no WO 2009/005631. O revestimento polimérico no CPG Híbrido pode conter grupos funcionais, tais como aldeídos, grupos amino, grupos epóxi, haletos, ácidos carboxílicos e ésteres ou misturas destes, ao qual uma matriz pode ser ligada. Os métodos para ligar uma matriz a um grupo funcional apropriado são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

[0029] O CPG Híbrido oferece certas vantagens sobre o CPG convencional. Como um resultado do revestimento de polímero, a dependência entre o carreamento e o tamanho de poro pode ser minimizada e o espaçamento entre os locais de funcionalização podem ser controlados de maneira mais precisa e uniforme. CPG Híbrido como o material carreador para a imobilização de proteína pode oferecer benefícios adicionais, porque o projeto do revestimento polimérico pode ser adaptado a fim de fornecer características de superfície que são desejadas ou requeridas para uma dada aplicação. Por exemplo, um polímero homogêneo, tal como poliestireno produzirá uma superfície carreadora mais hidrofóbica, enquanto um polímero homogêneo, tal como poliacrilonitrila produzirá uma superfície carreadora mais hidrofílica. Usando-se misturas de dois ou mais polímeros diferentes, um revestimento copolimérico pode ser obtido, em que, as características da superfície carreadora são especificamente adaptadas para uma dada aplicação. Os revestimentos de camada fina permitem algum grau de dilatação microscópica em solventes orgânicos, mas sem expansão de massa do leito de CPG Híbrido ou um aumento na retropressão. Os revestimentos também permitem o uso de CPG Híbrido em ambientes aquosos acima do pH 10.

[0030] Por todo o remanescente do relatório descritivo e reivindicações anexas, qualquer referência a CPG deve ser interpretada como incluindo tanto CPG (convencional) quanto CPG Híbrido, a não ser que especificamente indicado de outra maneira.

[0031] Outros materiais carreadores que não CPG e HybCPG podem ser desejados devido a razões, tais como eficiência de custo mais alto ou requerimentos de processo específico. Tais materiais incluem materiais de polímero orgânico poroso (plástico). Estes polímeros são funcionalizados cm grupos funcionais, tais como aldeídos, grupos amino, grupos epóxi, haletos, ácidos carboxílicos ou ésteres ou misturas destes, aos quais uma matriz pode ser ligada. Os métodos para a ligação de uma matriz a um grupo funcional apropriado são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Os plásticos funcionalizados podem ser produzidos como partículas porosas com dilatação limitada. Os polímeros orgânicos adequados podem ser fundamentados em monômeros, tais como estireno, etileno, propileno, ácido acrílico, ácido metacrílico, acrilato de metila e metacrilato de metila. Os exemplos de tais polímeros orgânicos incluem polietileno funcionalizado, polietileno de peso molecular ultra-alto (UHMWPE), polietileno de alta densidade (HDPE), polipropileno (PP), politetrafluoroetileno (PTFE) e fluoreto de polivinilideno (PVDF), poliestireno, polimetacrilato e poli(metacrilato de metila). Em uma modalidade preferida, o polímero orgânico poroso é poliestireno funcionalizado ou polimetacrilato funcionalizado.

[0032] A ligação de proteínas rotuladas por afinidade ao HybCPG descrito aqui demonstra a possibilidade de usar carreadores poliméricos orgânicos porosos, visto que a superfície porosa em HybCPG é um polímero orgânico per se. HybCPG mantém grandemente a incompressibilidade e natureza não expansível de CPG enquanto as propriedades de superfície de polímeros orgânicos podem ser utilizadas. Quando a rigidez de CPG não é necessária é plausível que o polímero orgânico sozinho é uma escolha melhor. O método de aplicar uma ligação por rótulo de afinidade a tais materiais é, portanto, demonstrado aqui.

[0033] O material de proteína imobilizado por pode ser facilmente produzido apenas em algumas etapas, começando do amino-CPG ou amino- HybCPG, como resumido na Figura 1. Por exemplo, os materiais de CPG podem ser tratados com 2,4-di-hidroxiacetofenona, desse modo, ligando o grupo fenila ao CPG por intermédio de uma imina. Se desejado, a funcionalidade imina pode ser a seguir reduzida à amina correspondente usando-se um agente de redução apropriado, tal como, por exemplo, boroidreto de sódio, cianoboroidreto de sódio ou hidreto de lítio alumínio. Um íon metálico quelado, tal como Co2+ ou Fe3+, pode ser subsequentemente introduzido pela suspensão do material em uma solução aquosa de CoCl2 ou FeCl3, respectivamente. Após a secagem, o material obtido pode ser diretamente usado como uma matriz de ligação para uma ou mais proteínas rotuladas por poli-histidinas

[0034] Um material de proteína imobilizado em que o material carreador é um polímero orgânico pode ser produzido de uma maneira similar como descrito acima para CPG e HybCPG.

[0035] A afinidade alta do rótulo de poli-histidina para íons metálicos, tais como Co2+ ou Fe3+ permite que a imobilização de proteína rotulada por poli-histidinas seja realizada a partir de soluções brutas contendo as proteínas sem a necessidade de purificação extensiva da solução antes da etapa de imobilização. O material orgânico que não contém um rótulo de poli-histidina ligar-se-á aos íons metálicos quelados apenas fracamente ou não em todos e será facilmente removido das proteínas imobilizadas finais por lavagem, por exemplo, com água ou soluções aquosas tamponadas. Desta maneira, se a proteína rotulada por poli-histidina for preparada por superexpressão intracelular, a imobilização de proteína pode ser realizada diretamente do lisado celular. Alternativamente, se a proteína rotulada por poli-histidina for secretada pelo organismo hospedeiro, a imobilização de proteína pode ser realizada diretamente a partir do sobrenadante de cultura celular.

[0036] Desta maneira, em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para a imobilização de uma proteína rotulada por afinidade, que compreende as etapas de i) imobilizar a proteína rotulada por afinidade em um carreador que compreende um material carreador ao qual uma matriz de afinidade é ligada, o dito material carreador sendo escolhido do grupo que consiste de: (a) vidro de porosidade controlada (CPG); (b) vidro de porosidade controlada híbrido (CPG Híbrido) e (c) polímeros orgânicos porosos e ii) opcionalmente lavar o material de proteína imobilizado com água ou um tampão apropriado.

[0037] Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece um método para a preparação de um material de proteína imobilizado, o dito método compreendendo: i) fornecer um material carreador contendo grupos amino, o dito material carreador sendo escolhido do grupo que consiste de: (a) vidro de porosidade controlada (CPG); (b) vidro de porosidade controlada híbrido (CPG Híbrido) e (c) um polímero orgânico poroso; ii) reagir o material carreador com 2,4-di-hidroxiacetofenona, desse modo, ligando um grupo di-hidroxifenila ao material carreador; iii) formar um complexo de quelato entre o grupo di- hidroxifenila e um íon metálico capaz de ligar uma proteína rotulada por poli- histidina e iv) ligar uma enzima rotulada por poli-histidina ao material carreador que compreende o dito íon metálico.

[0038] Opcionalmente, o método para a preparação de um material de proteína imobilizado como descrito acima ainda compreende ligar uma nanopartícula de metal de transição ao material carreador.

[0039] Em uma modalidade, o carreador é vidro de porosidade controlada (CPG). Em uma outra modalidade, o carreador é vidro de porosidade controlada híbrido (CPG Híbrido). Ainda, em uma outra modalidade, o carreador é um polímero orgânico poroso.

[0040] Em uma modalidade preferida, o método compreende a imobilização de proteínas rotuladas por afinidade em CPG ou CPG Híbrido. Em uma outra modalidade preferida, a proteína rotulada por afinidade é uma enzima rotulada por poli-histidina e a matriz de afinidade contém um íon de metal quelado. Em uma modalidade mais preferida, o método compreende a imobilização de enzimas rotuladas por poli-histidina em CPG ou CPG Híbrido, em que o íon metálico quelado usado é Co2+ ou Fe3+

[0041] Em um outro aspecto, a invenção fornece um material de proteína imobilizado obtenível pelo método como descrito acima.

[0042] A dissociação da proteína ligada pode ser atingida usando-se métodos IMAC padrão. A proteína ligada pode ser, por exemplo, liberada do carreador pela diminuição do pH ou pela adição de uma molécula competitiva tendo afinidade igual ou maior para os íons metálicos quelados que não o grupo poli-histidina, tal como pela aplicação de uma solução tamponada contendo imidazol ou etilenodiaminotetraacetato (EDTA). Após a dissociação das proteínas purificadas a partir do carreador, o rótulo de poli-histidina pode ser removido das proteínas, se necessário, por técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, pela clivagem do rótulo de afinidade com uma enzima apropriada, tal como uma protease específica, desse modo, obtendo a proteína pura e sem rótulo.

[0043] Desta maneira, ainda em um outro aspecto, a invenção refere- se a um método para a purificação e isolamento de uma proteína rotulada por afinidade, que compreende as etapas de i) imobilizar uma proteína rotulada por afinidade em um carreador que compreende um material carreador ao qual uma matriz de afinidade é ligada, o dito material carreador sendo escolhido do grupo que consiste de: (a) vidro de porosidade controlada (CPG); (b) vidro de porosidade controlada híbrido (CPG Híbrido) e (c) polímeros orgânicos porosos; ii) opcionalmente lavar o material de proteína imobilizado com água ou um tampão apropriado e iii) dissociar a proteína purificada da matriz de afinidade.

[0044] A etapa de imobilização pode ser realizada em um tampão apropriado. Se necessário, o material de proteína imobilizado pode ser lavado depois com água ou um tampão apropriado a fim de remover quaisquer proteínas não ligadas e outras, compostos indesejados a partir do material de proteína imobilizado. A dissociação da proteína purificada da matriz de afinidade pode ser atingida pela aplicação das condições que são apropriadas para um rótulo de afinidade particular. As condições apropriadas para a dissociação dos rótulos de afinidade diferentes são conhecidas na técnica.

[0045] O método pode compreender opcionalmente a etapa adicional de iv) removendo o rótulo de afinidade a partir da proteína purificada.

[0046] Em uma modalidade preferida, o método compreende a purificação e isolamento das proteínas alvejadas por afinidade no CPG ou CPG Híbrido. Em uma outra modalidade preferida, a proteína rotulada por afinidade é uma enzima rotulada por poli-histidina e uma matriz de afinidade que contém um íon de metal quelado. Em uma modalidade mais preferida, o método compreende a purificação e isolamento da enzima rotulada por poli- histidinas no CPG ou CPG Híbrido, em que o íon metálico quelado usado é Co".

[0047] Se as proteínas imobilizadas no carreador, como descrito acima, são enzimas, estas contêm um local ativo que é capaz de catalisar uma reação química. Tal como, o material de enzima imobilizado é potencialmente útil como um biocatalisador na síntese orgânica. Portanto, em um outro aspecto, a invenção refere-se ao uso de um material de enzima imobilizado como descrito neste como um biocatalisador heterogêneo, por exemplo nas transformações orgânicas sintéticas. A invenção ainda fornece um método para catalisar uma reação catalisada por enzima, que compreende fornecer um material de proteína imobilizado de acordo com a invenção e colocando o dito material de proteína imobilizado em contato com pelo menos um substrato em que uma enzima, que é imobilizada no carreador, é capaz de atuar.

[0048] A imobilização das enzimas no carreador através da ligação por rótulo de afinidade, como descrito neste, melhora a estabilidade das enzimas usadas. Foi observado que as enzimas imobilizadas toleram ambas as condições aquosas bem como uma faixa de solventes orgânicos diferentes. Estes permitem os materiais de enzimas imobilizados serem usados nas condições de reação sob o qual as enzimas não imobilizadas livres não seriam estáveis. É possível que o material de enzima imobilizado também pode ser usado em uma faixa de pH mais ampla do que as enzimas não imobilizadas livres seriam toleradas.

[0049] Quando a enzima é ligada a partir de uma preparação bruta (não purificada), o material de proteína imobilizado resultante consiste da enzima enriquecida. Visto que a atividade natural do método de enzima é retida, a preparação imobilizada apresenta uma atividade catalítica maior por massa de proteína do que o material de proteína não imobilizado inicial.

[0050] Outra vantagem da presente invenção é que o material de enzima imobilizado facilmente pode ser reciclado. Visto que o material de enzima imobilizado é um catalisador heterogêneo, o material pode ser simplesmente coletado a partir da mistura de reação por filtração. O material pode ser reutilizado em seguida em uma reação adicional, se necessário após a purificação do material. Especialmente para as enzimas que são caras e/ou difíceis de cultivar, a possibilidade da reciclagem do material de enzima imobilizado é um aspecto importante.

[0051] A enzima que é imobilizada no carreador pode ser qualquer enzima que é útil como um biocatalisador nas transformações sintéticas orgânicas, incluindo, mas não limitado a, enzimas que atuam como oxidorredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases. Deste modo, os materiais de enzima imobilizados podem ser usados como biocatalisadores heterogêneos em qualquer reação orgânica em que a enzima imobilizada é capaz de catalisar especificamente a reação. Os exemplos de tais reações biocatalíticas incluem, mas não são limitadas a, oxidação enzimática e reações de redução, reações de hidrólise enzimática e reações de isomerização enzimática. Particularmente as reações biocatalíticas úteis são reações enantiosseletivas. Os exemplos específicos das reações biocatalíticas incluem acilações seletivas de álcoois ou aminas com lipase, transaminações com o-transaminase, monooxigenações com CYP P450 ou monooxigenase Baeyer-Villiger, oxidações de álcoois ou reduções de cetonas/aldeídos com desidrogenases de álcool e oxidações de aminas com monoamina oxidase.

[0052] Em uma modalidade, duas ou mais enzimas diferentes podem ser imobilizadas em um carreador, em que cada uma das enzimas diferentes é capaz de catalisar uma reação diferente. Então pode ser possível usar o material contendo duas ou mais enzimas imobilizadas diferentes como um biocatalisador heterogêneo em uma reação de etapa múltipla ou cascata. Uma tal reação de cascata pode ser por exemplo uma reação em que duas ou mais reações catalisadas por enzima são realizadas em um substrato em duas ou mais etapas subsequentes (isto é, uma reação em que um substrato para uma primeira enzima é transformado em um substrato para uma segunda enzima e assim por diante), tal como uma reação de transaminação por um o- transaminase seguido por uma reação de acilação pela lipase. Alternativamente, uma tal reação de cascata pode ser uma reação em que um substrato é transformado por uma primeira enzima e em que um cofator para a primeira enzima é regenerado por uma segunda enzima, tal como a redução seletiva/específica de uma cetona/aldeído pela desidrogenase de álcool com a regeneração concomitante de NADH consumido pela desidrogenase de formato.

[0053] Quando duas ou mais enzimas diferentes são imobilizadas em um carreador, é conveniente se as enzimas diferentes contenham o mesmo rótulo de afinidade, tal como um rótulo de poli-histidina. Como a afinidade de ligação para o íon metálico de quelação é igual para cada uma das enzimas, as enzimas diferentes ligarão fortes igualmente ao carreador. Teoricamente, portanto, quando o uso das quantidades iguais de enzimas diferentes n tendo o mesmo rótulo de afinidade, a quantidade de cada enzima diferente no carreador será 1/n (não levando e conta quaisquer efeitos de difusão).

[0054] Para as reações de cascata usando um material de proteína imobilizado com duas ou mais enzimas imobilizadas diferentes e em que as enzimas diferentes mostram uma diferença na atividade catalítica, esta pode ser vantajosa para imobilizar quantidades maiores das enzimas tendo atividade catalítica menor, em comparação a quantidade da enzima tendo a atividade catalítica maior. Isto acelerará a etapa de determinação de taxa e aumenta a taxa total da cascata de reação.

[0055] Alternativamente, as reações de cascata podem ser realizadas pela mistura de um ou mais materiais de enzima imobilizados diferentes nas razões desejadas.

[0056] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para catalisar uma reação de etapas múltiplas ou em cascata catalisada por enzima. Neste aspecto, o método compreende fornecer um material de proteína imobilizado que compreende duas ou mais enzimas imobilizadas, de acordo com a invenção e colocando o dito material de proteína imobilizado em contato com pelo menos um substrato em que as enzimas, que são imobilizadas no carreador, são capazes de atuar.

[0057] Em outra modalidade, o material de enzima imobilizado adicionalmente compreende nanopartículas metálicas, tais como nanopartículas de metais de transição, tal como, mas não limitado a, cobalto, níquel ou paládio. O material que compreende nanopartículas metálicas pode ser por exemplo preparado pela imersão de um amino-CPG ou amino- HybCPG em uma solução de uma quantidade apropriada de sal metálico, tal como CoCl2, NiCl2, Li2PdCl4, PdCl2 ou Pd(TFA)2, em acetonitrila ou água, ou nas misturas destes. Os íons metálicos são em seguida reduzidos as nanopartículas metálicas pela adição de um excesso de agente de redução apropriado, tal como hidreto de sódio, boroidreto de sódio, cianoboroidreto de sódio, hidreto de alumínio de lítio e outros. Na adição de 2,4-di-hidroxi- acetofenona, a imina inicialmente formada é imediatamente reduzida a amina correspondente. Após remoção do agente de redução por lavagem, um íon metálico, tal como Co2+, Fe3+ ou Ni2+, é então quelado na matriz por suspensão do material em uma solução aquosa de CoCl2, FeCl3 ou NiCl2, respectivamente. Após secagem, o material obtido pode ser diretamente usado como uma matriz para uma ou mais enzimas rotuladas por poli-histidina; ver figura 2.

[0058] Enquanto não deseja-se estar ligado por teoria, acredita-se que as nanopartículas metálicas ligam-se ao material CPG através dos grupos amino no material CPG. Também é concebível que as nanopartículas metálicas, formadas pela redução dos íons metálicos, são de um tamanho maior o suficiente para serem aprisionados nos poros do material CPG.

[0059] O material de proteína imobilizado contendo tanto enzima imobilizada quanto nanopartículas metálicas pode ser aplicado como um biocatalisador heterogêneo nas reações de enzima combinada e catalisada por metal de transição. Os exemplos de tais reações incluem, mas não são limitados a, reações de resolução cinéticas dinâmicas. Um exemplo específico de tais reações é a resolução cinética dinâmica de aminas pela racemização da amina pelas nanopartículas Pd seguidas pela acilação com lipase, como mostrado nos exemplos anexos.

[0060] Deste modo, já em outro aspecto, a invenção fornece um método para catalisar uma reação catalisada por enzima combinada e catalisada por metal de transição. Neste aspecto o método compreende fornecer um material de proteína imobilizado que adicionalmente compreende as nanopartículas metálicas de transição, de acordo com a invenção e colocando o dito material de proteína imobilizado em contato com pelo menos um substrato em que uma enzima e um metal de transição, que são imobilizados no carreador, são capazes de atuar.

[0061] Os exemplos do material de proteína imobilizado descritos neste e o uso de tal material são descritos na seção experimental.

Definições

[0062] O termo "rótulo de afinidade" refere-se a um grupo definido, tal como uma molécula orgânica ou organometálica, fragmento de proteína ou outro, que é ligado a uma proteína recombinante e que é capaz de ligar-se a um grupo específico imobilizado em uma matriz. Os exemplos dos rótulos de afinidade são um rótulo de poli-histidina, um rótulo de glutationa S- transferase (GST), uma proteína de ligação de quitina (CBP), um rótulo de proteína de ligação de maltose (MBP), um rótulo de FLAG, um rótulo de avidina ou um rótulo de estreptavidina. Os rótulos de afinidade também são referidos como rótulo de fusão.

[0063] Como usado neste, o termo "proteína rotulada por afinidade" refere-se a uma proteína recombinante em que um rótulo de afinidade, como definido acima, foi adicionado a proteína alvo. As proteínas alvejadas por afinidade podem ser preparadas pela tecnologia de DNA recombinante usando métodos conhecidos na técnica, tal como pela ligação de fragmentos de DNA ou pelas técnicas de PCR. As proteínas alvejadas por afinidade também podem ser referidas como "proteínas de rótulo de fusão" ou "proteínas de fusão".

[0064] O termo "rótulo de poli-histidina" refere-se a um filamento de pelo menos dois resíduos de histidina, que é ligado ao terminal C ou N da proteína. O rótulo de poli-histidina é preferivelmente um filamento de pelo menos seis resíduos de histidina. Outros nomes comumente usados para um rótulo de poli-histidina são rótulo polyHis, rótulo de histidina, rótulo de hexa- histidina, rótulo de 6xHis e rótulo de His6, bem como His-tagTM.

[0065] O termo "enzima rotulada por poli-histidina" refere-se a uma enzima recombinante em que a enzima alvo é fundida com um rótulo de poli- histidina como definido acima.

[0066] Como usado neste, o termo "amino-CPG" refere-se a um material CPG que é funcionalizado com um grupo amino através de um ligante apropriado. O termo "amino-HybCPG" como usado neste refere-se a um material CPG Híbrido em que o revestimento de polímero contém grupos amino.

[0067] A invenção ainda é ilustrada por meios dos seguintes exemplos, que não limitam a invenção em qualquer aspecto. Todos os documentos e referências citados acima são incorporados neste por referência. Abreviações Aw atividade da água AlaDH alanina desidrogenase de B. subtilis CalA Lipase A de Candida Antarctica (também conhecida como lipase A de Pseudozyma antarctica) CalB Lipase B de Candida Antarctica (também conhecida como lipase B de Pseudozyma antarctica) DCM diclorometano 2,5-DKCMO 2,5-dicetocanfano monooxigenase de Pseudomonas putida equiv. equivalente(s) EtOAc acetato de etila FMN mononucleotídeo de flavina FRE flavina redutase de E. coli GC cromatografia a gás HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)piperazino-1-etanossulfônico IPTG isopropil-p-D-tiogalactopiranosídeo min minuto(s) MOPS ácido 3-(N-morfolino)propanassulfônico MTBE éter metil terc-butílico (ou éter terc-butil metílico) NADH nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma reduzida) PLP 5-fosfato de piridoxal SDS-PAGE eletroforese em gel de sulfato de dodecila sódico poliacrilamida Tris tris(hidroximetil)aminometano co-TA o-transaminase da Chromobacterium violaceum Métodos experimentais

[0068] Os materiais de CPG foram obtidos da Prime Synthesis, Inc., (Aston, PA, USA). Os seguintes materiais de vidro de porosidade controlada foram usados nos exemplos: • LCAA CPG é um CPG derivado com alquilaminas de cadeia longa (CPG-0502-N12). • Copoli-HybCPG-amina (a seguir também referido como "HybCPG copo") é um CPG híbrido revestido com um copolímero formado de 1:1 acrilonitrila:cloreto de vinilbenzila e reticulado in situ. • VBC HybCPG-amina (a seguir também referido como "HybCPG VBC") é um CPG Híbrido revestido com um polímero formado de monômeros de cloreto de vinilbenzila e reticulado in situ.

[0069] Os (co-)polímeros dos revestimentos são reticulados com uma amina bi-funcional, como descrito no WO 2009/005631. Os grupos amino são a seguir introduzidos nos revestimentos de cloro-polímero pela reação com ftalimida sódica seguido pela desftaloilação com hidrazina.

[0070] Os seguintes polímeros orgânicos porosos foram usados nos exemplos: • "Poliestireno de dilatação média" (adquirido da 3-Prime LLC, USA; Número da peça 04-02-03-32), um suporte funcionalizado de amino poliestireno. Tamanho de Poro 1000 Â (distribuição muito ampla), tamanho de partícula 100 µm, carregamento de amina 222 µmol/g. • "copolímero de metacrilato de dilatação baixa" (adquirido da SPRIN Technologies S.p.A., Itália; Número da peça 1A02BN), um suporte de metacrilato funcionalizado com amino. Diâmetro de poro desconhecido, tamanho de partícula 100 a 300 µm, carregamento de amina 270 µmol/g.

[0071] O cultivo de w-transaminase de Chromobacterium violaceum foi realizado como descrito em Cassimjee et al. (ACS Catal. 2011, vol. 1, pp. 1051-1055). O cultivo de lipase A de Candida Antarctica superexpressada foi realizada como descrito em Sandstrom et al. (Protein Eng Des Sel. 2009, vol 22, pp. 413-420). O cultivo de lipase B de Candida Antarctica superexpressada e CalB Trp104Ala, uma variante instável de lipase B, foi realizado como descrito em Engstrom et al. (Org. Biomol. Chem. 2011, vol. 9, pp. 81-82). O cultivo de 2,5-dicetocanfano monooxigenase de Pseudomonas putida foi realizado como descrito em Kadow et al. (AM B Express 2011,1:13). O cultivo de flavina redutase superexpressada de E. coli foi realizado como descrito em Kadow et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013, publicado online em 5 de novembro de 2013). O cultivo de alanina desidrogenase alanina superexpressada de B. subtilis foi realizado como descrito em Mutti et al. (Eur. J. Org. Chem. 2012, edição 5, pp. 1003-1007). Quando ausente, um His6-tag foi adicionado aos genes por PCR. CalA e CalB rotulado com poli-histidina imobilizado em Accurel de acordo com os procedimentos como descrito em Engstrom et al. (Org. Biomol. Chem. 2011, vol. 9, pp. 81-82).

EXEMPLOS Exemplo 1 Preparação de carreadores CPG de quelação para imobilização e purificação das enzimas rotuladas por poli-histidina

[0072] Amino-CPG (5 g) do tipo desejado foi tratado com 2,4-di- hidróxi acetofenona (1,5 equiv. as funcionalidades de amino de CPG) em metanol (200 mL) com agitação contínua por 60 min. A imina formada foi reduzida pela adição sequencial do boroidreto de sódio (4 equiv.) com agitação contínua por 60 min. O material sólido foi filtrado, enxaguado com solução de carbonato de sódio aquoso saturado, água e então etanol e então secado a 80°C por 2 h. As partículas foram então submetidas a imersão em uma solução aquosa saturada de CoCl2 (100 mL). Após filtração e enxague com água e etanol, as partículas foram secadas a 80°C por 2 h. As propriedades dos carreadores CPG de quelação diferentes são mostrados na Tabela 1.

[0073] Os carreadores contendo Fe3+ como o íon metálico quelado foram preparados similares ao procedimento acima, mas usando uma solução aquosa de FeCl3 em vez de CoCl2.

Exemplo 2 Preparação da quelação de carreadores de poliestireno e polimetacrilato porosos para imobilização e purificação das enzimas rotuladas por poli- histidina

[0074] As partículas de polímero orgânico porosas funcionalizadas por amino lavadas (água/etanol 1:1, 400 mL) e secadas (vácuo 16 h após filtração) (2 g) do tipo desejado (ver abaixo) foi tratado com 2,4-di-hidróxi acetofenona (1,5 equiv. as funcionalidades de amino de plástico) em metanol (50 mL) com agitação contínua por 60 min. A imina formada foi reduzida pela adição sequencial do boroidreto de sódio (4 equiv.) com agitação contínua por 60 min. O material sólido foi filtrado, enxaguado com solução de carbonato de sódio aquoso saturado, água e então etanol e então secado em vácuo a 25°C por 16 h.

[0075] As partículas foram então submetidas a imersão em uma solução aquosa saturada de CoCl2 (100 mL). Após filtração e enxague com água e etanol, as partículas foram secadas em vácuo a 25°C por 16 h. As propriedades dos carreadores de plástico porosos de quelação diferentes são mostrados na Tabela 2.

Exemplo 3 Imobilização das enzimas rotuladas por poli-histidina nos carreadores de quelação

[0076] Os sobrenadantes de cultura celular contendo CalA ou CalB foram usados sem tamponação. Os lisados celulares de o-TA foram preparados pela resuspensão celular no tampão de HEPES (50 mM, 500 mM de NaCl, pH 8,3). Após adição de detergentes (BugBusterTM 10X, Novagen), os escombros celulares foram removidos por centrifugação. O carreador CPG de quelação foi submetido a imersão nos lisados ou sobrenadantes seguido pela agitação em uma agitação orbital (150 rpm). As amostras analisadas Bradford das soluções durante a imobilização confirmam a finalização da ligação e saturação do CPG de carreador de quelação como a concentração de proteína capturada para a redução. Os ensaios de atividade também foram realizados com as soluções após a remoção do carreador CPG pela filtração. As preparações imobilizadas foram então enxaguadas com tampão (MOPS (50 mM, pH 7,4) por CalA e CalB; HEPES (ver acima) por o-TA) e secados sob vácuo por 16 h.

[0077] A extração da enzima imobilizada a partir do carreador CPG foi realizada pela imersão das partículas no tampão de elução (50 mM de fosfato de sódio, 500 mM de imidazol, pH 7,5) e incubação em uma agitação orbital por 20 min. A presença e pureza das enzimas extraídas foram visualizadas por SDS-PAGE; apenas faixas correspondentes as enzimas rotuladas por His6 foram visíveis.

[0078] A quantificação de local ativo de o-TA no solvente foi realizada como previamente descrita (Cassimjee et al., ACS Catal. 2011, vol. 1, pp. 1051-1055). A quantificação de local ativo de o-TA imobilizado no solvente foi realizada pela adição de o-TA-CPG a 1-feniletilamina (1 mM, 1 mL, MTBE aW= 0,6, 1 mM de pentadecano). A mistura de reação foi agitada em uma agitação orbital (150 rpm, 24 h, 22°C). A atividade de água do solvente foi ajustada pelos pares de hidrato de sal (Na2HPO4, 2H2O/7H2O) mas não controlada após adição de o-TA-CPG ou durante a reação. As conversões foram medidas pela GC (200 µL das amostras a EtOAc, 3 gotas de anidrido acético e trietilamina, 8 h incubação a 22°C), com pentadecano como padrão interno.

[0079] A quantificação de local ativo de o-TA imobilizado no tampão foi realizada pela adição de o-TA-CPG a 1-feniletilamina (1 mM, 1 mL, 50 mM de HEPES, pH 7,0). A mistura de reação foi agitada em uma agitação orbital (150 rpm, 24 h, 22°C). As amostras (400 µL) foram tratadas com solução NaOH aquosa (1%), extraídas com DCM e analisadas por GC após adição de pentadecano (1 mM, EtOAc). As conversões foram em todos os casos comparadas as reações em branco com o CPG de quelação (nenhuma ligação de enzima).

[0080] O rendimento de imobilização, isto é a quantidade da enzima ativa removida a partir do lisado versus a quantidade da enzima ativa retida no CPG após lavagem, foi mais do que 99% com base na quantificação de local ativo. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

[0081] A imobilização das enzimas rotuladas por poli-histidina (CalA e CalB) na quelação dos carreadores de poliestireno e polimetacrilato porosos foi realizada como descrito acima pelos carreadores CPG.

Exemplo 4 Uso de w-TA-CPGs como catalisador

[0082] Os o-TA-CPGs preparados no Exemplo 3 foram aplicados como catalisadores na transaminação enantioespecífico de fenóxi-2- propanona:

[0083] 20 mg de o-TA-CPG foi adicionado a uma solução de 3 mL de MTBE (aW= 0,6) com 100 mM de 1-feniletilamina racêmica e 50 mM de 2-fenoxipropanona e a mistura de reação foi incubada com agitação orbital (150 rpm) a 50°C. Pentadecano (50 mM) foi usado como um padrão interno. A conversão e excesso enantiomérico de 1-feniletilamina foram seguidos pela cromatografia de gás quiral após a retirada das amostras (50 µL) nos pontos de tempo registrados; as amostras foram derivatizadas com anidrido acético e trietil amina como descrito acima. A formação de 1-fenoxipropan-2-amina foi medida sem derivatização. Os resultados são mostrados na Tabela 4. Tabela 4

Exemplo 5 Uso de CalA e CalB imobilizados como catalisadores

[0084] Os CalA-CPGs, CalB-CPGs, CalB-poliestireno e CalB- polimetacrilato preparado no Exemplo 3 foram aplicados como catalisadores na acilação enantioseletiva de 1-feniletanol (uma resolução cinética):

[0085] As reações da resolução cinética catalisadas por Lipase foram realizadas pela adição da enzima imobilizada (20 mg) a uma solução de 3 mL de tolueno (aw=0,1) com 10 mM de 1-feniletanol e 100 mM de butirato de vinila e a mistura foi incubada com agitação orbital (200 rpm) a 22°C (por CalA e CalB) ou 50°C (por CalB Trp104Ala). Pentadecano (5 mM) foi usado como um padrão interno. A conversão e excesso enantiomérico de 1- feniletanol e butirato de 1-feniletila foram medidos por GC quiral para retirada das amostras (50 µL) nos pontos de tempo registrados.

[0086] As seguintes reações foram incluídas pela comparação: - CalB imobilizado em Accurel®, um pó de polipropileno poroso. - CalB imobilizado em amino-HybCPG copo na forma não modificada (isto é não processado de acordo com o Exemplo 1).

[0087] A imobilização de CalB (e CalB Trp104Ala) em etanol ativado Accurel® (Accurel MP1001, tamanho de partícula <1000 µm, Membrana GmbH, Wuppertal, Alemanha) foi realizada pela adição do material poroso ao sobrenadante concentrado em uma razão de 50:1 a uma quantidade de enzima (teor de proteína foi medido pelo método Bradford), seguido pela incubação por pelo menos oito horas. Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Exemplo 6 Preparação de cascata-CPG com três enzimas diferentes ("BV-cascata- CPG")

[0088] Os lisados celulares de 2,5-DKCMO, FRE e AlaDH foram preparados pela resuspensão celular em tampão de fosfato de sódio (50 mM, 500 mM de NaCl, pH 7,5) e adição de BugBusterTM 10X. Após centrifugação e remoção dos escombros celulares, o carreador Co2+ CPG de quelação foi submetido a imersão em uma mistura dos volumes iguais de três lisados celulares, seguido pela agitação em uma agitação orbital (150 rpm). As amostras das soluções analisadas Bradford durante a imobilização confirmada a finalização da ligação e saturação do carreador CPG como a concentração de proteína capturada para a redução. Os ensaios de atividade também foram realizados com as soluções após a remoção de CPG pela filtração. As preparações imobilizadas foram então enxaguadas com tampão de fosfato de sódio (ver acima) e então secadas sob vácuo por 16 h.

Exemplo 7 Reação de cascata enzimática usando BV-cascata-CPGs como catalisadores

[0089] As cascatas-CPGs preparadas no Exemplo 6 foram aplicadas como catalisadores na oxidação Baeyer-Villiger de (+)-cânfora:

[0090] 65 mg de BV-cascata-CPG foi adicionado a uma mistura de reação de tampão de fosfato (100 mM, pH 7,5) com 2,0 mM (+)-cascata, 5,0 mM de L-alanina, 0,3 mM de FMN e 0,5 mM de NADH com um volume líquido total de 5,0 mL. O oxigênio foi então dissolvido (borbulhamento por 30 s) seguido pela selagem do recipiente; a mistura foi incubada em uma agitação orbital (150 rpm) a 22°C. As amostras (500 µL) foram extraídas a EtOAc com benzoato de etila como padrão interno e analisadas por GC. A conversão foi medida após 3 horas. O oxigênio foi adicionado após 24 horas e a reação foi deixada continuar por 3 horas adicionais, após o qual a conversão foi medida novamente (27 h).

[0091] Uma reação comparativa com 2,5-DKCMO, FRE e AlaDH livres (não imobilizado) (de lisados celulares) também foi realizada. As proporções e quantidades das enzimas não foram medidas. Os resultados são mostrados na Tabela 6.

[0092] As reações de fase múltipla foram realizadas pela adição de 1,0 g de BV-cascata-CPG a uma mistura de reação de tampão de fosfato (100 mM, pH 7,5) com 160 mM de L-alanina, 0,3 mM de FMN e 0,5 mM de NADH com um volume líquido total de 5,0 mL. 5 mL de ciclo-hexano com (+)-cascata (100 mM) foi então adicionado como uma segunda fase líquida. O recipiente selado foi agitado em uma agitação orbital (100 rpm) a 22°C com adição de oxigênio contínuo a fase aquosa. As amostras (50 µL) da fase orgânica foram retiradas nos pontos de tempo registrados e analisadas por GC após adição de benzoato de etila (2,0 mM em EtOAc) como padrão interno. A conversão após 72 h foi medida após extração de todos os componentes com EtOAc (20 mL).

[0093] Uma reação comparativa com 2,5-DKCMO, FRE e AlaDH livres (não imobilizado) (de lisados celulares) também foi realizada. As proporções e quantidades das enzimas não foram medidas. Os resultados são mostrados na Tabela 7.

Exemplo 8 Preparação de cascata-CPG com nanopartículas CalB e Pd ("Pd-CalB- CPG")

[0094] Amino-CPG (5 g) foi submetido a imersão em uma solução de Pd(TFA)2 (0,5 equiv. como funcionalidades de amino de CPG) em água (200 mL) e a mistura foi continuamente agitada por 10 min. NaBH4 (7 equiv.) foi então adicionado e a mistura foi agitada por 30 minutos adicionais.

[0095] 2,4-Di-hidroxiacetofenona (0,5 equiv.) foi então adicionado, após o qual a mistura foi agitada por 30 min. O material sólido foi filtrado e enxaguado por toda parte com água e então submetido a imersão em uma solução aquosa saturada de CoCl2 (100 mL). Após filtração e lavagem com água, o material sólido foi submetido a imersão em uma solução de CalB rotulado por poli-histidina (purificado ou de sobrenadante) e agitado por 30 min. A preparação imobilizada foi então filtrada, enxaguada com tampão (20 mM de MOPS, pH 7,4) e depois secada sob vácuo por 16 h.

Exemplo 9 Reação de cascata usando Pd-CalB-CPGs

[0096] O material preparado no Exemplo 8 foi aplicado como um catalisador na acilação enantioseletiva de 1-feniletilamina (uma resolução cinética dinâmica):

[0097] 100 mg de Pd-CalB-CPG foi submetido a imersão em uma solução de 1,0 mL de tolueno contendo 20 mM de 1-feniletilamina racêmica e 100 mM de butirato de isopropila. 1 mg de NaBH4 foi adicionado e uma cavidade de reação foi selada. O sistema foi incubado a 65°C com agitação contínua em uma agitação orbital (100-800 rpm) por 24 a 48 h. A conversão e excesso enantiomérico do substrato e produto (por exemplo (R)-N-(1- feniletil)butiramida) foram medidos pelo GC quiral para retirada das amostras nos pontos de tempo registrados.

[0098] O produto é obtido pela separação das fases, a agitação da fase orgânica com 1 N de HCl (três vezes) a fim de remover o doador de acila residual e amina e então extração novamente das fases de lavagem com EtOAc. As fases orgânicas combinadas são evaporadas a vácuo para produzir o produto, que ainda é purificado pela cromatografia cintilante.

Exemplo 10 A. Determinação de lixiviação de íon metálico

[0099] Para determinar a quantidade de íon metálico que lixivia a partir do carreador nas dadas condições, os carreadores com base em HybCPG e contendo Co2+ ou Fe3+ foram submetidos a incubação prolongada no tampão aquoso.

[00100] 250 mg cada de LCAA CPG, HybCPG VBC e HybCPG copo, com ligação de Co2+ ou Fe3+ foram submetidos a incubação em 3 mL de tampão aquoso (HEPES 20 mM, pH 7,0) por 72 h em uma mesa de agitação em temperatura ambiente.

[00101] A quantidade de Co2+ foi medida pela mistura de uma parte da solução incubada com uma parte da solução NH4SCN (1,0 M), uma parte da solução HCl (6,0 M) e duas partes de acetona. Este procedimento revela uma cor azul proporcional à concentração de Co2+, que foi quantificada pela espectrofotometria a 620 nm. Uma amostra em branco com o tampão apenas também foi testada.

[00102] A quantidade de Fe3+ foi medida pela mistura de uma parte da solução incubada com uma parte da solução NH4SCN (1,0 M) e uma parte da solução HCl (6,0 M). Este procedimento revela uma cor vermelha proporcional a concentração de Fe3+, que foi quantificada pela espectrofotometria a 480 nm. Uma amostra em branco com o tampão apenas também foi testada.

[00103] Após remoção de uma metade das soluções (1,5 mL) dos carreadores de material incubado, 1,5 mL de solução de 6,0 M de HCl foi adicionada e os materiais foram incubados no agitador por 1 h; este procedimento efetivamente dessorve todas as ligações nos metálicos. Uma parte desta solução incubada foi então misturada com uma parte da solução de HCl (3 M) e uma parte da solução de NH4SCN (1,0 M). As amostras onde Co2+ foi quantificado, duas partes de acetona também foram adicionadas. A absorbância a 620 nm para quantificação Co2+ e a 480 nm pela quantificação Fe3+ foi registrada. Com base nas medições de absorbância, os valores correspondentes da quantidade total nos metálicos foram calculados pelos volumes testados nas duas incubações diferentes (primeiro no pH 7,0 e então em 3,0 M de HCl) e corrigidos pelo volume removido (1,5 mL após a primeira incubação). A fração de lixiviado em metálicos no pH 7,0 deve ser, portanto, quantificado. Os resultados são apresentados na Tabela 8 abaixo. Tabela 8

[00104] Pode ser visto que a ligação Fe3+ ao carreador de material CPG e HybCPG é menos propenso a lixiviação do que Co2+. B. Determinação da lixiviação de enzima

[00105] Para determinar a quantidade de enzima que dissocia-se do carreador em dadas condições, preparações imobilizadas de (.o-TA em CPG ou HybCPG foram submetidas a incubação prolongada no tampão aquoso.

[00106] 12-16 mg cada de o-TA-LCAA CPG, o-TA-HybCPG VBC e o-TA-HybCPG copo, em que a enzima é ligada por Co" ou Fe3+, foram incubados em 4 mL de tampão aquoso (HEPES 100 mM, pH 7,0) para 1 min em uma agitação orbital. Após este período, nenhuma enzima deve ser detectada na solução. Este foi medido pelo ensaio de atividade, em que 1 mL da solução foi usado após sedimentação do material imobilizado. As preparações com 3 mL remanescente foram incubadas por 24 h na agitação orbital, após o qual algumas das preparações apresentam quantidades medidas de enzima na solução.

[00107] O ensaio de atividade foi realizado pela retirada de 1 mL da solução, adicionando 1 mL de mistura de ensaio (1-feniletilamina (10 mM), piruvato de sódio (5 mM) e PLP (1 pM), dissolvido no mesmo tampão) e medindo a mudança de absorbância no tempo total a 245 nm por 5 min. Uma reação em branco com tampão puro também foi testada. Neste comprimento de onda a formação de acetofenona, um produto de reação de transaminação, pode ser monitorado como um aumento da absorbância com um coeficiente de 12 mM-1cm-l (Schatzle et al., Anal. Chem. 2009, vol. 81, pp. 8244-8248). Visto que as constantes cinéticas são conhecidas (Cassimjee et al., Org. Biomol. Chem. 2012, vol. 10, pp. 5466-5470), a quantidade da enzima lixiviada pode ser calculada. Antes do experimento de lixiviação, a quantidade da enzima ligada nas preparações imobilizadas foi medida pela quantificação de local ativo. A quantidade de lixiviação após 24 h para cada material é mostrada na Tabela 9.

[00108] Os valores mostram que nas condições testadas, Fe3+ como íon metálico quelado resulta em lixiviação de enzima menor. IybCPG copo como o carreador não resulta em qualquer lixiviação de enzima detectada nas condições de escolha com Co2+ ou Fe3+ como íon metálico quelado. LCAA CPG, que tem uma superfície de vidro, dá a quantidade maior de lixiviação de enzima. Este pode ser o resultado da ligação de enzima não específica a superfície de vidro.

Exemplo 11 Purificação do w-TA rotulado por poli-histidina com HybCPG copo (Co2+)

[00109] O lisado celular (5,0 mL) do IPTG granulado induzido por 24 h de cultivo de o-TA em 100 mL de meio Luria-Bertani com adição de 50 µg/mL de canamicina foi preparado pelo uso de BugBusterTM Um excesso de coenzima (PLP) foi adicionado e a solução foi incubada a 37°C por 1 h. O excesso de PLP (não ligado pela enzima) foi então removido pela mudança do tampão, usando uma coluna PD10 (dois ciclos), a um tampão de HEPES (50 mM, 500 mM de NaCl, pH 8,2 (tampão 1)), que dá 7,0 mL da solução contendo o holoenzima alvo, proteínas naturais e outras impurezas.

[00110] Uma coluna foi enchida com 204 mg de HybCPG copo (Co2+) contendo 26 µmol/g Co2+. O material foi pré-umidificado pela adição de 7,0 mL de tampão 1 e o fluxo direto foi descartado.

[00111] O holoenzima ativo é espectrofotometricamente medido a 395 nm, e=8,1 mM-1cm-l (Cassimjee et al., ACS Catal. 2011, vol. 1, pp. 10511055). Seguindo a medição de absorbância, o lisado foi adicionado à coluna e o fluxo direto foi coletado. A diferença da absorbância neste comprimento de onda do lisado antes e após a passagem através da coluna foi medida a 0,62 (todas as medições realizadas com 1,0 cm de comprimento de caminho). Este corresponde a 29 mg de enzima, agora ligado ao carreador HybCPG copo (Co2+) na coluna.

[00112] A coluna foi então lavada com 7,0 mL de tampão 1. O fluxo direto foi coletado do qual a absorbância foi medida a 0,11, com tampão 1 como em branco. Este corresponde a 5 mg de enzima que foi lavada novamente a partir da coluna, presumidamente devido a ligação não específica ou enzima não ligada, deixando 24 mg de enzima ligada na coluna.

[00113] A dissociação da enzima ligada na coluna foi realizada pela aplicação de 5,0 mL de tampão Tris (50 mM, 500 mM de imidazol, pH 7,5 (tampão 2)). O fluxo direto foi coletado e um excesso de coenzima foi novamente adicionada. Como descrito acima, o excesso PLP foi removido pela mudança de tampão, usando uma coluna PD10, ao tampão 1, dando um volume total de 7,0 mL de solução com holoenzima dissolvida. A absorbância foi medida a 0,465. Este corresponde a 22 mg de enzima purificada, ou um rendimento de 92%. A solução pareceu significantemente livre de contaminação da proteína de célula hospedeira, que também foi confirmada por SDS-PAGE.

Claims (30)

1. Material de enzima imobilizado, caracterizadopelo fato de que compreende um carreador e pelo menos uma enzima imobilizada no carreador, em que o carreador compreende um material carreador ao qual uma matriz de afinidade é ligada, o dito material carreador sendo escolhido do grupo que consiste de: (a) vidro de porosidade controlada (CPG) tendo um tamanho de poro de 10 a 300 nm; e (b) vidro de porosidade controlada híbrido (CPG Híbrido) tendo um tamanho de poro de 10 a 300 nm e em que o CPG é revestido com uma película de um polímero orgânico reticulado; e em que pelo menos uma enzima contém um rótulo de afinidade e é imobilizada no carreador através da ligação de afinidade específica à matriz de afinidade, e em que o rótulo de afinidade é um rótulo de poli-histidina e em que a matriz de afinidade contém um íon de metal quelado.

2. Material de enzima imobilizado de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o material carreador é vidro de porosidade controlada (CPG).

3. Material de enzima imobilizado de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o material carreador é vidro de porosidade controlada híbrido (CPG Híbrido).

4. Material de enzima imobilizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de que o íon de metal quelado é Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+ ou Zn2+.

5. Material de enzima imobilizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadopelo fato de que compreende duas ou mais enzimas imobilizadas.

6. Material de enzima imobilizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende em adição nanopartículas metálicas.

7. Material de enzima imobilizado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as ditas nanopartículas metálicas são nanopartículas metálicas de transição.

8. Material de enzima imobilizado de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que as nanopartículas metálicas são selecionadas do grupo que consiste de nanopartículas de cobalto, níquel e paládio.

9. Uso de um carreador, caracterizado pelo fato de que compreende um material carreador ao qual uma matriz de afinidade é ligada, o dito material carreador sendo escolhido do grupo que consiste de: (a) vidro de porosidade controlada (CPG) tendo um tamanho de poro de 10 a 300 nm; (b) vidro de porosidade controlada híbrido (CPG Híbrido) tendo um tamanho de poro de 10 a 300 nm e em que o CPG é revestido com uma película de um polímero orgânico reticulado; para a imobilização de enzimas, e em que as enzimas são imobilizadas no carreador através da ligação de afinidade específica à matriz de afinidade, e em que a matriz de afinidade contém um íon de metal quelado.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o material carreador é vidro de porosidade controlada (CPG).

11. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o material carreador é vidro de porosidade controlada híbrido (CPG Híbrido).

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o íon de metal quelado é Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+ ou Zn2+.

13. Método para preparação de um material de enzima imobilizado, caracterizadopelo fato de que o dito método compreende: i) fornecer um material carreador contendo grupos amino, o dito material carreador sendo escolhido do grupo que consiste de: (a) vidro de porosidade controlada (CPG) tendo um tamanho de poro de 10 a 300 nm; (b) vidro de porosidade controlada híbrido (CPG Híbrido) tendo um tamanho de poro de 10 a 300 nm e em que o CPG é revestido com uma película de um polímero orgânico reticulado; ii) reagir o material carreador com 2,4-di-hidroxiacetofenona, desse modo, ligando um grupo di-hidroxifenila ao material carreador; iii) formar um complexo de quelato entre o grupo di- hidroxifenila e um íon metálico capaz de ligar uma enzima rotulada por poli- histidina; e iv) ligar uma enzima rotulada por poli-histidina ao material carreador que compreende o dito íon metálico.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende ligar uma nanopartícula de metal de transição ao material carreador.

15. Método para catalisação de uma reação catalisada por enzima, caracterizadopelo fato de que compreende (a) fornecer um material de enzima imobilizado como definido na reivindicação 1, e (b) colocar o dito material de enzima imobilizado em contato com pelo menos um substrato, assim catalisando a reação.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o carreador é vidro de porosidade controlada (CPG).

17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o carreador é vidro de porosidade controlada híbrido (CPG).

18. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o íon de metal quelado é Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Cu2+ ou Zn2+.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que duas ou mais enzimas diferentes são imobilizadas no carreador, e em que cada uma das enzimas diferentes é capaz de catalisar uma reação diferente.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o carreador compreende adicionalmente nanopartículas de metal.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que as ditas nanopartículas de metal são nanopartículas de metal de transição.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que as nanopartículas de metal são selecionadas do grupo que consiste em nanopartículas de cobalto, níquel e paládio.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, caracterizado pelo fato de que a reação catalisada por enzima é realizada em condições aquosas.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, caracterizado pelo fato de que a reação catalisada por enzima é realizada em um solvente orgânico.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 24, caracterizado pelo fato de que a reação catalisada por enzima é uma reação de fluxo contínuo.

26. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a reação catalisada por enzima é uma reação em cascata.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que um substrato para uma primeira enzima é transformado em um substrato para uma segunda enzima.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que um substrato é transformado por uma primeira enzima e em que um co-fator para a primeira enzima é regenerado por uma segunda enzima.

29. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que um metal de transição é imobilizado no carreador, e em que o método é uma reação de várias etapas compreendendo uma reação catalisada por enzima e uma reação catalisada por metal de transição.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 30, caracterizado pelo fato de que pelo menos um substrato é convertido em um produto na reação catalisada por enzima.