JP6534161B2 - 固定化タンパク質及びその使用 - Google Patents
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Description
(a)制御多孔性ガラス(CPG);
(b)ハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG);及び
(c)多孔質有機ポリマー
からなる群から選択され、少なくとも1つのタンパク質がアフィニティタグを含有し、アフィニティマトリックスとの特異的アフィニティ結合を介して担体上に固定化されている固定化タンパク質材料に関する。
(a)制御多孔性ガラス(CPG);
(b)ハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG);及び
(c)多孔質有機ポリマー
からなる群から選択され、タンパク質が、アフィニティマトリックスとの特異的アフィニティ結合を介して担体上に固定化される担体に関する。
i)アフィニティマトリックスが付着している担体材料を含む担体上にアフィニティタグ付きタンパク質を固定化する工程であって、前記担体材料が、
(a)制御多孔性ガラス(CPG);
(b)ハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG);及び
(c)多孔質有機ポリマー
からなる群から選択される工程;並びに
ii)任意選択で、固定化タンパク質材料を水又は適切な緩衝液で洗浄する工程
を含む方法に関する。
i)アミノ基を含有する担体材料を用意する工程であって、前記担体材料が、
(a)制御多孔性ガラス(CPG);
(b)ハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG);及び
(c)多孔質有機ポリマー
からなる群から選択される工程;
ii)担体材料を2.4-ジヒドロキシアセトフェノンと反応させ、それにより、ジヒドロキシフェニル基を担体材料に連結する工程;
iii)ポリヒスチジンタグ付きタンパク質に結合する能力があるキレート複合体を、ジヒドロキシフェニル基と金属イオンとの間で形成する工程;並びに
iv)前記金属イオンを含む担体材料に、ポリヒスチジンタグ付き酵素を結合させる工程
を含む方法を提供する。
i)アフィニティマトリックスが付着している担体材料を含む担体上にアフィニティタグ付きタンパク質を固定化する工程であって、前記担体材料が、
(a)制御多孔性ガラス(CPG);
(b)ハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG);及び
(c)多孔質有機ポリマー
からなる群から選択される工程;
ii)任意選択で、固定化タンパク質材料を水又は適切な緩衝液で洗浄する工程;並びに
iii)精製タンパク質をアフィニティマトリックスから解離させる工程
を含む方法に関する。
用語「アフィニティタグ」は、組換えタンパク質に付着し、かつマトリックス上に固定化された特定の基と結合することができる、有機又は有機金属分子、タンパク質断片等の限定された基を指す。アフィニティタグの例は、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)タグ、キチン結合タンパク質(CBP)タグ、マルトース結合タンパク質(MBP)タグ、FLAGタグ、アビジンタグ、又はストレプトアビジンタグである。アフィニティタグはまた、融合タグと呼ばれる場合もある。
aw 水分活性
AlaDH 枯草菌(B. subtilis)由来のアラニンデヒドロゲナーゼ
CalA カンジダ・アンタルクティカリパーゼA(別名シュードジマ・アンタルクティカ(Pseudozyma antarctica)リパーゼA)
CalB カンジダ・アンタルクティカリパーゼB(別名シュードジマ・アンタルクティカリパーゼB)
DCM ジクロロメタン
2,5-DKCMO シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)由来2,5-ジケトカンファン
equiv. 当量
EtOAc 酢酸エチル
FMN フラビンモノヌクレオチド
FRE 大腸菌(E. coli)由来フラビンリダクターゼ
GC ガスクロマトグラフィー
HEPES 4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸
IPTG イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド
min 分
MOPS 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸
MTBE メチルtert-ブチルエーテル(又はtert-ブチルメチルエーテル)
NADH ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(還元型)
PLP ピリドキサール5-リン酸
SDS-PAGE ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
Tris トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
ω-TA クロモバクテリウム・ビオラセウム(Chromobacterium violaceum)由来ω-トランスアミナーゼ
CPG材料をPrime Synthesis, Inc. (Aston、PA、USA)から入手した。以下の制御多孔性ガラス材料を実施例に用いた:
・LCAA CPGは、長鎖アルキルアミンで誘導体化されたCPGである(CPG-0502-N12)。
・コポリ-HybCPGアミン(以下においては、「HybCPGコポ」とも呼ばれる)は、インサイチュで1:1アクリロニトリル:塩化ビニルベンジルから形成され、かつ架橋されたコポリマーでコーティングされたハイブリッドCPGである。
・VBC HybCPG-アミン(以下において、「HybCPG VBC」とも呼ばれる)は、インサイチュで塩化ビニルベンジルモノマーから形成され、かつ架橋されたポリマーでコーティングされたハイブリッドCPGである。
コーティング剤の(コ)ポリマーは、WO 2009/005631に記載されているように、二官能性アミンで架橋されている。その後、アミン基は、フタルイミドナトリウムとの反応、続いてヒドラジンでの脱フタロイルにより、クロロポリマーコーティング剤上へ導入される。
・「中膨張度ポリスチレン」(3-Prime LLC、USAから購入;部品番号04-02-03-32)、アミノ官能化ポリスチレン支持体。ポアサイズ約1000Å(非常に広い分布)、粒子サイズ100μm、アミン負荷222μmol/g
・「低膨張度メタクリレートコポリマー」(SPRIN Technologies S.p.A.、Italyから購入;部品番号1A02BN)、アミン官能化メタクリレート支持体。ポア直径不明、粒子サイズ100〜300μm、アミン負荷270μmol/g。
ポリヒスチジンタグ付き酵素の固定化及び精製のためのキレートCPG担体の調製
所望のタイプのアミノ-CPG(5g)を、メタノール(200mL)中2,4-ジヒドロキシアセトフェノン(CPGのアミノ官能基の1.5当量)で、連続撹拌しながら60分間、処理した。形成されたイミンを、水素化ホウ素ナトリウム(4当量)の逐次添加により、連続撹拌しながら60分間、還元した。この固体材料を濾過し、飽和炭酸ナトリウム水溶液、水、その後、エタノールですすぎ、その後、80℃で2時間、乾燥させた。その後、この粒子を、CoCl2の飽和水溶液(100mL)中に浸漬した。濾過、並びに水及びエタノールでのすすぎ後、この粒子を80℃で2時間、乾燥させた。異なるキレートCPG担体の性質を表1に示す。
ポリヒスチジンタグ付き酵素の固定化及び精製のためのキレート多孔質ポリスチレン及びポリメタクリレート担体の調製
洗浄し(水/エタノール1:1、400mL)、かつ乾燥させた(濾過後、減圧16時間)、所望のタイプ(下記参照)のアミノ官能化多孔質有機ポリマー粒子(2g)を、メタノール(50mL)中2,4-ジヒドロキシアセトフェノン(プラスチックのアミノ官能基の1.5当量)で、連続撹拌しながら60分間、処理した。形成されたイミンを、水素化ホウ素ナトリウム(4当量)の逐次添加により、連続撹拌しながら60分間、還元した。この固体材料を濾過し、飽和炭酸ナトリウム水溶液、水、その後、エタノールですすぎ、その後、25℃で16時間、減圧中、乾燥させた。
ポリヒスチジンタグ付き酵素のキレート担体上への固定化
CalA又はCalBを含有する細胞培養上清を、緩衝化せずに用いた。ω-TAの細胞可溶化物を、HEPES緩衝液(50mM、500mM NaCl、pH8.3)中に細胞を再懸濁することによりにより調製した。界面活性剤(BugBuster(商標)10X、Novagen)の添加後、細胞片を遠心分離により除去した。キレートCPG担体を、その可溶化物又は上清中に浸漬し、続いて、オービタルシェーカー(150rpm)上で撹拌した。固定化中、溶液のブラッドフォード分析される試料によって、タンパク質濃度の減少が止まったら、キレートCPG担体の結合及び飽和の完了が確認された。活性アッセイもまた、CPG担体の濾過による除去後、溶液に実施した。その後、固定化調製物を、緩衝液(CalA及びCalBについてはMOPS(50mM、pH7.4);ω-TAについてはHEPES(上記参照))ですすぎ、減圧下で16時間、乾燥させた。
ω-TA-CPGの触媒としての使用
実施例3において調製されたω-TA-CPGを、フェノキシ-2-プロパノンのエナンチオ特異的アミノ基転移における触媒として適用した:
固定化CalA及びCalBの触媒としての使用
実施例3において調製されたCalA-CPG、CalB-CPG、CalB-ポリスチレン、及びCalB-ポリメタクリレートを、1-フェニルエタノールのエナンチオ選択的アシル化における触媒として適用した(速度論的分割):
- Accurel(登録商標)(多孔質ポリプロピレン粉末)上に固定化されたCalB
- 非修飾型(すなわち、実施例1に従って処理されていない)のアミノ-HybCPGコポ上に固定化されたCalB
3つの異なる酵素を含むカスケード-CPG(「BV-カスケード-CPG」)の調製
2,5-DKCMO、FRE、及びAlaDHの細胞可溶化物を、リン酸ナトリウム緩衝液(50mM、500mM NaCl、pH7.5)中での細胞再懸濁、及びBugBuster(商標)10Xの添加により調製した。遠心分離し細胞片を除去した後、キレートCo2+ CPG担体を、同体積の3つの細胞可溶化物の混合物中に浸漬し、続いて、オービタルシェーカー(150rpm)上で撹拌した。固定化中、溶液のブラッドフォード分析される試料によって、タンパク質濃度の減少が止まったら、CPG担体の結合及び飽和の完了が確認された。活性アッセイもまた、CPGの濾過による除去後、溶液に実施した。その後、固定化調製物を、リン酸ナトリウム緩衝液(上記参照)ですすぎ、その後、減圧下で16時間、乾燥させた。
触媒としてBV-カスケード-CPGを用いる酵素的カスケード反応
実施例6において調製されたカスケード-CPGを、(+)-カンファーのBaeyer-Villiger酸化における触媒として適用した:
CalB及びPd-ナノ粒子を含むカスケード-CPG(「Pd-CalB-CPG」)の調製
アミノ-CPG(5g)を、水(200mL)中Pd(TFA)2(CPGのアミノ官能基の0.5当量)の溶液中に浸漬し、この混合物を、連続して10分間、撹拌した。その後、NaBH4(7当量)を加え、この混合物を更に30分間、撹拌した。その後、2,4-ジヒドロキシアセトフェノン(0.5当量)を加え、その後、この混合物を30分間、撹拌した。この固体材料を濾過し、水で入念にすすぎ、その後、CoCl2の飽和水溶液(100mL)中に浸漬した。濾過及び水での洗浄後、固体材料を、(精製された、又は上清由来の)ポリヒスチジンタグ付きCalBの溶液中に浸漬し、30分間、撹拌した。その後、その固定化調製物を濾過し、緩衝液(20mM MOPS、pH7.4)ですすぎ、その後、減圧下で16時間、乾燥させた。
Pd-CalB-CPGを用いるカスケード反応
実施例8において調製された材料を、1-フェニルエチルアミンのエナンチオ選択的アシル化(速度論的分割)における触媒として適用した:
A.金属イオン浸出の決定
所定の条件において担体から浸出する金属イオンの量を決定するために、CPG及びHybCPGに基づき、かつCo2+か又はFe3+のいずれかを含有する担体を、水性緩衝液中での長時間のインキュベーションに供した。
所定の条件において担体から解離する酵素の量を決定するために、CPG又はHybCPG上のω-TAの固定化調製物を、水性緩衝液中での長時間のインキュベーションに供した。
ポリヒスチジンタグ付きω-TAのHybCPGコポ(Co2+)での精製
50μg/mLカナマイシンを添加した100mL Luria-Bertani培地中でのω-TAのペレット化IPTG誘導化24時間培養からの細胞可溶化物(5.0mL)を、BugBuster(商標)の使用によって調製した。過剰量の補酵素(PLP)を加え、溶液を、37℃で1時間、インキュベートした。その後、過剰な(酵素によって結合されていない)PLPは、PD10カラムを用いてHEPES緩衝液(50mM、500mM NaCl、pH8.2(緩衝液1))に緩衝液交換(2ラウンド)することによって除去し、標的ホロ酵素、天然タンパク質、及び他の不純物を含有する7.0mLの溶液が得られた。
Claims (24)
- 担体、及び該担体上に固定化された少なくとも1つのタンパク質を含む固定化タンパク質材料であって、前記担体が、アフィニティマトリックスが付着している担体材料を含み、前記担体材料が、
(a)制御多孔性ガラス(CPG);及び
(b)ハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG);
からなる群から選択され、
前記少なくとも1つのタンパク質が、アフィニティタグを含有し、前記アフィニティマトリックスに対する特異的アフィニティ結合を介して前記担体上に固定化されており、前記アフィニティタグがポリヒスチジンタグであり、前記アフィニティマトリックスがキレートされた金属イオンを含有する、固定化タンパク質材料。 - 前記担体材料が制御多孔性ガラス(CPG)である、請求項1に記載の固定化タンパク質材料。
- 前記担体材料がハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG)である、請求項1に記載の固定化タンパク質材料。
- 前記キレートされた金属イオンがCo2+である、請求項1から3のいずれか一項に記載の固定化タンパク質材料。
- 前記キレートされた金属イオンがFe3+である、請求項1から3のいずれか一項に記載の固定化タンパク質材料。
- 前記少なくとも1つのタンパク質が酵素である、請求項1から5のいずれか一項に記載の固定化タンパク質材料。
- 2つ以上の固定化酵素を含む、請求項6に記載の固定化タンパク質材料。
- 金属ナノ粒子を更に含む、請求項6又は7に記載の固定化タンパク質材料。
- 前記金属ナノ粒子が遷移金属ナノ粒子である、請求項8に記載の固定化タンパク質材料。
- 前記金属ナノ粒子が、コバルト、ニッケル、及びパラジウムのナノ粒子からなる群から選択される、請求項8又は9に記載の固定化タンパク質材料。
- タンパク質の固定化のための担体の使用であって、前記担体が、アフィニティマトリックスが付着している担体材料を含み、前記担体材料が、
(a)制御多孔性ガラス(CPG);及び
(b)ハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG);
からなる群から選択され、前記タンパク質が前記アフィニティマトリックスに対する特異的アフィニティ結合を介して前記担体上に固定化されており、前記アフィニティマトリックスがキレートされた金属イオンを含有する、使用。 - 前記担体材料が制御多孔性ガラス(CPG)である、請求項11に記載の使用。
- 前記担体材料がハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG)である、請求項11に記載の使用。
- 前記キレートされた金属イオンがCo2+である、請求項11から13のいずれか一項に記載の使用。
- 前記キレートされた金属イオンがFe3+である、請求項11から13のいずれか一項に記載の使用。
- 固定化タンパク質材料の調製のための方法であって、
i) アミノ基を含有する担体材料を用意する工程であって、前記担体材料が、
(a)制御多孔性ガラス(CPG);及び
(b)ハイブリッド制御多孔性ガラス(ハイブリッドCPG);
からなる群から選択される工程;
ii) 前記担体材料を2.4-ジヒドロキシアセトフェノンと反応させ、それにより、ジヒドロキシフェニル基を前記担体材料に連結する工程;
iii) ポリヒスチジンタグ付きタンパク質に結合する能力があるキレート複合体を、ジヒドロキシフェニル基と金属イオンとの間で形成する工程;並びに
iv) 前記金属イオンを含む担体材料に、ポリヒスチジンタグ付き酵素を結合させる工程
を含む方法。 - 請求項16に記載の方法により得られる固定化タンパク質材料。
- 遷移金属ナノ粒子を前記担体材料と結合させる工程を更に含む、請求項16に記載の方法。
- 請求項18に記載の方法により得られる固定化タンパク質材料。
- 不均一触媒としての、請求項6から10、17、及び19のいずれか一項に記載の固定化タンパク質材料の使用。
- 多段階又はカスケード反応における不均一触媒としての、請求項7から10、17、及び19のいずれか一項に記載の固定化タンパク質材料の使用。
- 酵素触媒反応を触媒するための方法であって、請求項6から10、17、及び19のいずれか一項に記載の固定化タンパク質材料を用意する工程、及び前記固定化タンパク質材料を少なくとも1つの基質と接触させて、これにより、前記担体材料上に固定化されている酵素が作用可能にする工程を含む、方法。
- 酵素触媒される多段階又はカスケード反応を触媒するための方法であって、請求項7から10及び19のいずれか一項に記載の固定化タンパク質材料を用意する工程、及び前記固定化タンパク質材料を少なくとも1つの基質と接触させて、これにより、前記担体材料上に固定化されている酵素を作用可能にする工程を含む、方法。
- 酵素触媒反応と遷移金属触媒反応が組み合わされた反応を触媒するための方法であって、請求項8から10及び19のいずれか一項に記載の固定化タンパク質材料を用意する工程、並びに前記固定化タンパク質材料を少なくとも1つの基質と接触させて、これにより、前記担体材料上に固定化されている酵素及び遷移金属を作用可能にする工程を含む、方法。
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