CN109022413A - 一种单胺氧化酶a微反应器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物筛选技术领域，公开了一种单胺氧化酶A微反应器及其制备方法和应用。将含氨基的磁性纳米材料与戊二醛溶液混合进行活化反应，得到活化磁性纳米材料，然后与溶解有单胺氧化酶A的吡啶溶液混合进行固定化反应，反应完成后固液分离，弃上清液，得到单胺氧化酶A微反应器。本发明的单胺氧化酶A微反应器可应用于天然产物中抗抑郁活性成分的筛选。具有操作简便、自动化程度高的优点，而且能够实现高通量筛选。

Description

一种单胺氧化酶A微反应器及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物筛选技术领域，具体涉及一种单胺氧化酶A微反应器及其制备方法和应用。
背景技术
单胺氧化酶A(Monoamine oxidase A,MAOA)是一种与线粒体外膜结合的黄素酶，广泛存在于各种组织中[H.G.Brunner,et al.American Journal of Human Genetics,1993,52,578.]。在人类中，MAOA在脑中单胺类物质的氧化脱氨中起着重要作用，包括5-羟色胺，多巴胺，去甲肾上腺素等神经递质[S.M.Shelke,et al.Bioorganic&MedicinalChemistry Letters,2011,21(8):2419-2424.]，并且在人类抑郁情绪和有抑郁行为的啮齿动物模型中检测到前额叶皮质和前扣带皮层中MAOA水平升高[J.H.Meyer,et al.Archivesof General psychiatry,2009,66(12):1304-1312；J.H.Meyer,et al.Archives ofGeneral psychiatry,2010,67(15):468-474.]。MAOA抑制剂可有效用于抑郁等精神障碍的治疗[H.Checkoway,et al.Neurology,1998,50(5):1458-1461.]。尽管一些已经引入到临床的抗抑郁药物是有效的，但其副作用和高毒性，包括肝毒性和嗜睡等，大大限制了其治疗效果[J.Sarko,et al.Emergency Medicine Clinics of North America,2000,18(4):637-654；M.I.Lucena,et al.Expert Opinion on Drug Safety,2003,2(3):249-262.]。因此，有必要开发具有良好治疗效果和较低副作用的新型MAOA抑制剂作为临床治疗抑郁症的潜在药物。
天然产物是宝贵的资源，含有丰富的生物活性化合物和悠久的历史临床实践。近30年来全世界推出的1562个小分子新化合物中，有75％来源于天然产物，因此，从天然产物中筛选酶抑制剂可能是发现新药的有效方法[J.F.Zhu,et al.Talanta,2016,165:508-515.]。然而天然活性成分发现的常规方法始于从植物药物提取物中分离和鉴定纯化合物，然后对分离的化合物进行后续生物测定[Y.Zhang,et al.Analytica Chimica Acta,2013,777(5):49-56.]。不幸的是分离程序通常是操作复杂，耗时且成本高。而且目前的MAOA抑制剂筛选方法，例如荧光法[H.M.Guang,et al.Acta Pharmacologica Sinica,2010,27(6):760-766.]和分光光度法[K.Zhi,et al.Iranian Journal of Pharmaceutical ResearchIjpr,2016,15(1):131-139.]，必须先从天然产物中拿到一定数量的化合物分子，才能够进一步测试其单胺氧化酶A抑制活性。此外，分光光度法需要大量酶并且效率低，荧光测定法也存在高成本和操作繁琐等缺点；而且这些筛选方法通常以游离酶为测试对象，由于无法回收再利用，对目标酶造成了极大的浪费。尤其是上述方法只能针对单一化合物进行筛选，对于天然产物等复杂体系中活性化合物的筛选束手无策。因此急需开发操作简单、筛选效率高、灵敏性好的新型MAOA抑制剂筛选方法，用于直接从天然产物中筛选和鉴定酶抑制剂。
配体垂钓法是在亲和色谱理论的指导下，运用固定化酶技术，建立起来的复杂体系筛选策略[R.J.Zhuo,et al.Molecules,2016,21(11):1516.]。简言之就是基于活性配体与药物靶点之间的相互作用，将活性配体从复杂的样品体系中筛选出来，一般由靶标固定化、配体垂钓、配体洗脱、HPLC-MS分析四个部分组成。配体垂钓实施的核心是固定化酶技术，是实现复杂体系中目标活性配体的快速筛选的关键。因此结合有效的技术手段，采用恰当的筛选策略，开发新型的抗抑郁筛选方法非常重要。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种单胺氧化酶A微反应器的制备方法。本发明方法通过将表面含有氨基的磁性纳米材料使用戊二醛活化后，其表面的醛基与单胺氧化酶A的氨基端经共价交联反应，实现单胺氧化酶A的固定化，制备单胺氧化酶A微反应器。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的单胺氧化酶A微反应器。
本发明的再一目的在于提供上述单胺氧化酶A微反应器在抗抑郁药物筛选中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种单胺氧化酶A微反应器的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)将含氨基的磁性纳米材料与戊二醛溶液混合进行活化反应，得到活化磁性纳米材料；
(2)将步骤(1)所得活化磁性纳米材料与溶解有单胺氧化酶A的吡啶溶液混合进行固定化反应，反应完成后固液分离，弃上清液，得到单胺氧化酶A微反应器。
优选地，所述含氨基的磁性纳米材料通过如下方法制备得到：
将氨基磁珠分散液(可商业购买的原料)经磁分离器固液分离，弃去上清液，得到含氨基的磁性纳米材料。
优选地，步骤(1)中所述含氨基的磁性纳米材料在进行活化反应前先使用吡啶溶液清洗。
优选地，步骤(1)中所述戊二醛溶液是指用10mM吡啶溶液配制的戊二醛溶液，其中戊二醛的浓度为5％(v/v)。
优选地，步骤(1)中所述活化反应的温度为4℃，反应时间为0.5～3h。
优选地，步骤(2)中所述固定化反应中单胺氧化酶A与活化磁性纳米材料的质量比为1:(10～100)。
优选地，步骤(2)中所述固定化反应的温度为4℃，反应时间3～16h。
优选地，步骤(2)中所得单胺氧化酶A微反应器进一步使用Tris-HCl缓冲液清洗，对固定化反应后的剩余活性醛基进行封端处理。
一种单胺氧化酶A微反应器，通过上述方法制备得到。
上述单胺氧化酶A微反应器在抗抑郁药物筛选中的应用。
优选地，所述应用步骤如下：将单胺氧化酶A微反应器与待筛选的溶液体系混合反应，固液分离，先用磷酸缓冲溶液洗脱与单胺氧化酶A微反应器结合的非特异性结合组分，然后用100％的甲醇溶液洗脱与单胺氧化酶A微反应器结合的特异性吸附组分，得到抗抑郁药物成分。
优选地，所述待筛选的溶液体系是指以含二甲基亚砜(DMSO)的磷酸缓冲液溶解的天然产物溶液体系。
优选地，所述混合反应的温度为37℃，反应时间为0.2～1h。
相对于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：
(1)新型筛选工具。传统以单胺氧化酶A为靶标的抗抑郁药物筛选常采用单一化合物与游离酶一一受试的方式。而本发明基于磁性纳米材料构建的单胺氧化酶A微反应器，不仅能够克服游离酶使用次数少造成的浪费，同时也把筛选范围从单一化合物扩大到了天然产物等复杂体系中。
(2)新型的筛选方法。传统的天然产物的筛选，多以活性追踪分离为主，需不断提取分离获得目标化合物。而本发明在亲和筛选策略的指导下，基于单胺氧化酶A微反应器，构建了复杂体系抗抑郁成分筛选方法，实现了天然产物中抗抑郁活性成分的筛选。该方法不仅操作简单、自动化程度高，而且能够实现高通量筛选。
(3)扩展能力强、推广价值大。本发明的创新性尝试不仅为筛选以单胺氧化酶A为靶标的新型抗抑郁药物提供了更多的选择，同时也为构建新型的抗抑郁药物筛选策略提供了新的思路。
附图说明
图1为实施例中FITC标记的单胺氧化酶A微反应器的荧光表征图。
图2为实施例中获得的单胺氧化酶A微反应器经酶动力学系统评估结果；(A)米氏常数测试拟合双倒数曲线图，(B)托洛沙酮量效关系曲线图。
图3为由实施例中获得的单胺氧化酶A微反应器筛选托洛沙酮、醋丁洛尔及普萘洛尔构成的标准混合物验证结果图。
图4为由实施例中获得的单胺氧化酶A微反应器对延胡索乙酸乙酯提取物中抗抑郁活性成分的筛选结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
本实施例单胺氧化酶A微反应器的制备：
(1)取氨基磁珠分散液(Mag NH2,2μm,10mg/mL,BcMagTM)8mg置于2mL离心管中，经磁分离器固液分离，弃上清液，得到磁性纳米微球，然后经吡啶溶液(10mM,pH＝6.0)清洗三次后静置待用。
(2)用10mM吡啶溶液配制浓度为5％(v/v)的戊二醛溶液，与步骤(1)清洗后的磁性纳米微球混合后置于混悬器，于4℃的层析柜中活化反应3小时，反应完成后用吡啶溶液清洗三次，得到活化磁性纳米微球，静置待用。
(3)取20μL单胺氧化酶A溶液(5mg/mL)，置于2mL离心管中，加入480μL的吡啶溶液(10mM,pH＝6.0)混合待用；向步骤(2)所得活化磁性纳米微球中加入500μL含有0.1mg单胺氧化酶A的吡啶溶液均匀混合后，置于混悬器，于4℃层析柜中经固定化反应16小时，反应产物经磁分离器固液分离，取固体产物保存于2mL离心管中，使用Tris-HCl(100mM,pH＝7.0)清洗三次，分别经磁分离弃去上清液，得到单胺氧化酶A微反应器，经1mL磷酸缓冲液溶液(100mM,pH＝7.4)清洗三次，将清洗后的单胺氧化酶A微反应器加入到1mL磷酸缓冲溶液中并于4℃冰箱中保存待用。
一、本实施例所得单胺氧化酶A微反应器的酶固定化效果测试：
使用异硫氰酸荧光素标记蛋白质，用于蛋白质的定位及荧光成像表征。本测试在单胺氧化酶A固定化之前，首先对单胺氧化酶A进行异硫氰酸荧光素(FITC)标记处理，在磷酸盐缓冲液(1M，pH＝7.5)中FITC与单胺氧化酶A按摩尔比为10:1混合，在4℃下孵育1h。然后将步骤(3)中500μL含有0.1mg单胺氧化酶A的吡啶溶液替换为500μL含有0.1mg经FITC标记的单胺氧化酶A的溶液，得到FITC标记的单胺氧化酶A微反应器。然后经LSCM 880META激光共聚焦显微镜表征。
所得FITC标记的单胺氧化酶A微反应器经激光共聚焦显微镜成像结果如图1所示。由图1结果可知，在FITC的激发光照射下，被FITC标记的单胺氧化酶A微反应器发出绿色荧光，表明FITC标记的单胺氧化酶A成功键合到磁性纳米微球表面。
二、本实施例所得单胺氧化酶A微反应器经酶反应动力学基本参数，考察酶固定化后的活性保持情况：
米氏常数(Km)是酶促反应动力学的一个重要考察指标，是酶的特征性常数，常用以评价酶的亲和力及活力表现。磷酸缓冲溶液(100mM,pH＝7.4)稀释特异性底物犬尿胺至下述浓度：2μM，3μM，5μM，10μM，20μM，30μM；上述样品分别与经优化制备获得的单胺氧化酶A反应器在37℃下反应20min，经磁分离后收集上清液，经HPLC-UV测定酶解产物4-羟基喹啉的峰面积，根据双倒数曲线法，数据经由Origin 8.5进行线性拟合，经拟合曲线方程计算单胺氧化酶A微反应器的Km。拟合的双倒数曲线方程如图2(A)所示，根据双倒数法，经拟合方程，计算得单胺氧化酶A微反应器的米氏常数为188mM。
托洛沙酮(上市的单胺氧化酶A抑制剂)的半数抑制浓度(IC50)被用于评测该酶反应器的抑制动力学水平。使用磷酸缓冲溶液分别配制一系列不同浓度的托洛沙酮(0.3μM，0.5μM，1μM，3μM，5μM，10μM，30μM，50μM，100μM，300μM)及含有30μM底物犬尿胺的反应溶液；取单胺氧化酶A微反应器与上述溶液在37℃下反应20min，所有样品经磁分离器固液分离，收集上清过滤，经HPLC-UV测定酶解产物4-羟基喹啉的峰面积，由Origin 8.5拟合量效曲线，由曲线拟合数据可知托洛沙酮的IC50。如图2(B)结果所示，经软件拟合结果可知托洛沙酮的半数抑制浓度(IC50)为5.53±0.19μM。
通过酶反应动力学基本参数的考察，本发明所得单胺氧化酶A微反应器表现出了对底物具有较好的亲和力且有良好的酶解能力，同时对抑制成分也保持相对较好的敏感性，以上结果为本发明单胺氧化酶A微反应器应用于抗抑郁药物的筛选打下了坚实基础。
三、本实施例所得单胺氧化酶A微反应器为抗抑郁药物筛选工具，考察其用于复杂体系中抗抑郁药物筛选的有效性：
以托洛沙酮(阳性对照)、醋丁洛尔及普萘洛尔(阴性对照)组成的混合体系考察天然产物中抗抑郁活性成分筛选模型。用磷酸缓冲溶液(100mM，pH＝7.4)配制托洛沙酮，醋丁洛尔及普萘洛尔的混合溶液，体系化合物浓度均为0.1mM,混合溶液作为上样溶液(loading)命名为S0，待用。取1mL混合溶液与8mg的单胺氧化酶A微反应器在37℃下反应20min，经磁分离器固液分离，收集上清液命名为S1，待用。酶反应器经1mL的磷酸缓冲液分别清洗三次，分别经磁分离收集上清液，依据先后顺序分别命名为S2，S3，S4，待用。随后，单胺氧化酶A微反应器分别经100％的甲醇溶液(1mL)清洗两次，磁分离器分别固液分离后，收集上清液，依据先后顺序命名为S5，S6，待用。所有溶液经过滤后，准确取300μL，置于小瓶，待测。
以上测试样品具体测试方法如下：
运行系统：Dionex UltimateTM3000RSLC；
固定相：XTerra MS C18column(250mm×4.6mm,5μm,Waters)色谱柱；
运行溶液及梯度：流动相A(H2O+0.1％PA)，流动相B(ACN)。0-15min，20-60％B；
流速：1mL/min；
紫外检测：254nm；
进样量：10μL。
如图3所示，标准化合物组成的混合体系与单胺氧化酶A微反应器共孵育后，反应后上清液(supernatant)中的各成分含量较上样溶液(loading)有所减少，说明各成分与单胺氧化酶A均有一定的相互作用；为有效排除酶反应器的非特异性吸附，单胺氧化酶A微反应器经磷酸缓冲溶液分别清洗三次(S2-S4)，由结果可知，混合体系中的阴性对照：醋丁洛尔(acebutolol)及普萘洛尔(propranolol)仅在S2-S4中出现，证明了磷酸缓冲溶液能够有效去除酶反应器的非特异性吸附；而随着用甲醇的洗脱，托洛沙酮(toloxatone)作为混合体系中的单胺氧化酶A特异性结合配体被不断洗脱下来(S5-S6)，说明甲醇能够对单胺氧化酶A起到变性洗脱的作用；同时托洛沙酮与单胺氧化酶A作用后，经不同强度的溶液洗脱，仍有一定含量与靶点特异性结合，也证明了固定化后的单胺氧化酶A器仍具备识别特异性配体的能力。以上结果均证明基于单胺氧化酶A微反应器开发的复杂体系筛选模型的有效性，有望用于天然产物中单胺氧化酶A特异性结合配体的筛选。
四、本实施例所得单胺氧化酶A微反应器为抗抑郁药物筛选工具，用于抗抑郁药物的筛选：
含2vt.％DMSO的磷酸缓冲溶液(100mM,pH＝7.4)溶解延胡索乙酸乙酯提取物(2mg/mL)，取1mL溶液为上样溶液(loading)命名S0，待用。取1mL上述溶液与8mg的单胺氧化酶A微反应器在37℃下反应20min，经磁分离器固液分离，收集上清液命名为S1，待用。酶反应器经1mL的磷酸缓冲液分别清洗三次，分别经磁分离收集上清液，依据先后顺序分别命名为S2，S3，S4，待用。随后，单胺氧化酶A微反应器分别经100％的甲醇溶液(1mL)清洗两次，磁分离器分别固液分离后，收集上清液，依据先后顺序命名为S5，S6，待用。所有溶液经过滤后，准确取300μL,置于小瓶，待测。
以上测试样品具体测试方法如下：
运行系统：Shimadzu LC20AD串联AB SCIEX X500R Q-TOF-MS/MS；
固定相：XTerra MS C18column(250mm×4.6mm,5μm,Waters)色谱柱；
运行溶液及梯度：流动相A(H2O+0.1％AA，氨水调pH至5)，流动相B(ACN)。0-5min，20％B；5-40min，20％-28％B；40-45min，28％-64％B；
流速：0.8mL/min；
进样量：10μL。
测试结果如图4所示，延胡索乙酸乙酯层在与单胺氧化酶A特异性结合的洗脱溶液(S5-S6)中出现了七个亲和配体，这七个化合物可以被甲醇洗脱下来，在诸多化合物分子存在的复杂体系中仍能够被特异性识别，证明了亲和配体的垂钓筛选的高选择性及高通量。以上均证明了本发明制备的单胺氧化酶A器能成功应用于抗抑郁药物的筛选。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种单胺氧化酶A微反应器的制备方法，其特征在于包括如下制备步骤：
(1)将含氨基的磁性纳米材料与戊二醛溶液混合进行活化反应，得到活化磁性纳米材料；
(2)将步骤(1)所得活化磁性纳米材料与溶解有单胺氧化酶A的吡啶溶液混合进行固定化反应，反应完成后固液分离，弃上清液，得到单胺氧化酶A微反应器。
2.根据权利要求1所述的一种单胺氧化酶A微反应器的制备方法，其特征在于所述含氨基的磁性纳米材料通过如下方法制备得到：
将氨基磁珠分散液经磁分离器固液分离，弃去上清液，得到含氨基的磁性纳米材料。
3.根据权利要求1所述的一种单胺氧化酶A微反应器的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述戊二醛溶液是指用10mM吡啶溶液配制的戊二醛溶液，其中戊二醛的体积浓度为5％；所述活化反应的温度为4℃，反应时间为0.5～3h。
4.根据权利要求1所述的一种单胺氧化酶A微反应器的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述固定化反应中单胺氧化酶A与活化磁性纳米材料的质量比为1:(10～100)；所述固定化反应的温度为4℃，反应时间3～16h。
5.根据权利要求1所述的一种单胺氧化酶A微反应器的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所得单胺氧化酶A微反应器进一步使用Tris-HCl缓冲液清洗，对固定化反应后的剩余活性醛基进行封端处理。
6.一种单胺氧化酶A微反应器，其特征在于：通过权利要求1～5任一项所述的方法制备得到。
7.权利要求6所述的一种单胺氧化酶A微反应器在抗抑郁药物筛选中的应用。
8.根据权利要求7所述的一种单胺氧化酶A微反应器在抗抑郁药物筛选中的应用，其特征在于所述应用步骤如下：将单胺氧化酶A微反应器与待筛选的溶液体系混合反应，固液分离，先用磷酸缓冲溶液洗脱与单胺氧化酶A微反应器结合的非特异性结合组分，然后用100％的甲醇溶液洗脱与单胺氧化酶A微反应器结合的特异性吸附组分，得到抗抑郁药物成分。
9.根据权利要求8所述的一种单胺氧化酶A微反应器在抗抑郁药物筛选中的应用，其特征在于：所述待筛选的溶液体系是指以含二甲基亚砜的磷酸缓冲液溶解的天然产物溶液体系。
10.根据权利要求8所述的一种单胺氧化酶A微反应器在抗抑郁药物筛选中的应用，其特征在于：所述混合反应的温度为37℃，反应时间为0.2～1h。
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