KR102414887B1 - 고정화된 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 친화성 태그 결합을 통해 유리 소재 상에 또는 유기 중합체 상에 고정화되어 있는 단백질을 포함하는 고정화된 단백질 소재에 관한 것이다. 유리 소재는 (하이브리드)조절된 다공성 유리와 같은 다공성 유리 소재일 수 있다. 또한, 본 발명은 화학 합성에서의 불균일 생체촉매로서의, 고정화된 효소 소재의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 유리 소재 또는 유기 중합체 상의 친화성 태그화된 단백질의 고정화 방법 및 유리 소재 또는 유기 중합체 상에 친화성 태그화된 단백질의 고정화에 의하여 친화성 태그화된 단백질의 정제 및 분리 방법에 관한 것이다.

Description

고정화된 단백질 및 이의 용도{IMMOBILIZED PROTEINS AND USE THEREOF}

본 발명은 친화성 태그 결합(affinity tag binding)을 통해 유리 소재 상에 또는 유기 중합체 상에 고정화되어 있는 단백질을 포함하는 고정화된 단백질 소재에 관한 것이다. 유리 소재는 (하이브리드)조절된 다공성 유리와 같이 다공성 유리 소재일 수 있다. 또한, 본 발명은 화학 합성에서의 불균일(heterogeneous) 생체촉매로서, 고정화된 효소 소재의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 유리 소재 또는 유기 중합체 상의 친화성 태그화된 단백질의 고정화 방법 및 유리 소재 또는 유기 중합체 상에 친화성 태그화된 단백질의 고정화에 의하여 친화성 태그화된 단백질의 정제 및 분리 방법에 관한 것이다.

단백질은 아미노산 잔기의 하나 또는 몇몇의 선형 사슬로 구성된 거대 생체 분자이다. 효소는 모든 살아 있는 세포의 대사에서 생체촉매로서 기능하는 단백질의 특정 그룹이다. 그러한 효소는 유기 분자를 상이한 분자로 변형시킬 수 있다. 각 특정 효소의 특이적 3차원 구조 때문에, 극소수의 유기 분자만이 변형이 일어날 수 있는 방식으로 효소의 작용 부위와 상호작용을 할 수 있다. 따라서, 효소는 보통 매우 선택적인 촉매이고, 합성유기 화학에서 촉매로서의 효소의 용도는 이러한 이유로 매우 매력적이다. 그러나 효소는 세포 환경을 위해 진화한 생물학적 분자이기 때문에, 이들은 다른 환경에 대해서는 종종 부적합하다. 유기 용매에서 사용할 때, 효소는 응집하고, 종종 풀리는(unfold)(즉, 변성) 경향이 있다. 따라서, 고체 지지체 상에 효소를 고정화하는 것과 이들을 이러한 고정화된 상태의 촉매로서 사용하는 것이 매력적이며, 이는 효소가 보통 견딜 수 없는 반응 조건을 허용할 수 있도록 효소의 안정성을 개선하고, 또한 반응 혼합물로부터의 분리 및 물질의 회복을 용이하게 하기 때문이다.

고체 지지체 상의 효소의 고정화는 여러 가지 상이한 기법 및 여러 가지 상이한 고체 지지체를 사용하여 수행되어 왔다. 문헌[Tischer and Wedekind, "Immobilized Enzymes: Methods and Applications", Topics in Current Chemistry, 1999, vol. 200, pp. 95-126; Brena and Batista-Viera, "Immobilization of Enzymes: A Literature Survey", Methods in Biotechnology: Immobilization of Enzymes and Cells, 2006, second edition, pp. 15-30].

고체 표면으로의 효소의 흡착은 효소 및 고체 지지체 사이의 바람직하지 않은 상호작용으로 이어질 수 있다. 실리카 나노 입자상으로의 단백질의 흡착은 효소의 불활성화를 야기할 수 있는 단백질의 2차 구조에서의 변화로 이어질 수 있다는 것이 입증되었다[문헌 Lundqvist et al., Langmuir 2004, vol. 20, pp. 10639-10647]. 따라서 고체 지지체가 고정화된 효소의 구조 및 활성을 방해하지 않는 것이 중요하다.

고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)는 Fe^{2 +}, Cu^{2 +}, Zn^{2 +}, Ni^{2 +} 및 Co²⁺와 같은 금속 이온에 있어서 단백질의 친화성에 기초한 단백질의 정제를 위한 기법이다. 금속 이온은 아가로스 겔 상에 고정화되며, 히스티딘-함유 단백질 및 시스테인-함유 단백질에 선택적으로 흡착할 수 있다[문헌 Porath et al., Nature 1975, vol. 258, pp. 598-599]. 이 기법의 개선된 버전은 융합된 폴리히스티딘 펩티드를 함유하는 재조합 단백질을 사용한다. 폴리히스티딘 펩티드는 단일 히스티딘 잔기보다 고정화된 금속 이온에 대해 더 높은 친화성을 갖기 때문에, 정제의 수준이 더 높게 달성될 수 있다[문헌 Hochuli et al., Nat. Biotechnol. 1988, vol. 6, pp. 1321-1325; Ljungquist et al., Eur. J. Biochem. 1989, vol. 186, pp. 563-569]. 이 기법이 단백질의 정제 및 분리를 위한 크로마토그래피 공정에 성공적으로 적용될 수 있을지라도, 겔-고정화된 효소는 유기 합성에서의 불균일 촉매로서는 덜 적합하다. 추가적으로, IMAC 기법은 수성 조건으로 주로 제한된다.

불균일 촉매를 제조하기 위한 시도로서, 친화성 태그 결합의 IMAC-계 법칙이 변형된 실리카 상의 폴리히스티딘-태그화된 효소의 고정화에 적용되어 왔다[문헌 Cassimjee et al., Biotechnol. Bioeng. 2008, vol. 99, pp. 712-716; Cassimjee et al.,Biotechnol. J. 2011, vol. 6, pp. 463-469]. 이는 칸디다 안타르크티카(Candida antarctica) 리파아제 B(CalB)에서 잘 작용하였으나, 다른 덜 안정한 효소가 실리카의 존재 시에, 특히 유기 용매 존재 시에 불성화됨이 발견되었다. 실리카 나노 입자가 단백질을 불안정화시키는 효과를 갖는다는 것이 문헌에 공지되어 있다[문헌 Lundqvist et al., Langmuir 2004, vol. 20, pp. 10639-10647].

조절된 다공성 유리(CPG)는 효소의 고정화를 위하여 사용되어 온 또 다른 소재이다. CPG는 보통 3-아미노프로필트리에톡시실란으로 처리되고, 그로 인하여, 가교제로서 글루타르알데히드를 사용하여, 효소의 표면상에 존재하는 라이신 잔기를 통해 아미노프로필-CPG에 효소가 결합할 수 있게 된다. 이는 종종 효소 활성의 부수되는 손실과 함께, CPG로의 효소의 비특이적 결합을 야기한다. 이 방법의 추가의 문제점은 CPG 상에 상이한 효소의 혼합물의 고정화를 회피하기 위하여, 고정화되기 위한 효소가 고정화 단계 이전에 다른 효소로부터 정제되어야 한다는 것이다.

또한, 유기티타네이트(US 4,632,904)를 사용하거나 다당류 층 및 1,1'-디카르보닐디이미다졸(문헌[Rogalski et al., J. Mol. Catal. B: Enzym. 1999, vol. 6, pp. 29-39])을 사용하는, CPG 상 효소의 고정화가 개시되어 있다.

문헌[Engstroem et al. (Angew. Chem. Int. Ed. 2013, vol. 52, pp. 14006-14010)]은 칸디다 안타르크티카 리파아제 B 및 나노팔라듐(nanopalladium) 종이 메조포러스(mesoporous) 실리카의 격실로 공동고정화(coimmobilized)되는 하이브리드 촉매를 개시한다.

화학 산업에서의 촉매로서의 효소의 용도(즉, 생체 촉매 반응)는 높은 지속성, 낮은 독성 폐기물 및 높은 비용 효율성을 달성하기 위한 열쇠이다. 그러나 효소의 고비용 및 고체 지지체 상에 효소를 고정화함에 따르는, 자주 관찰되는 활성의 손실이 이러한 개발의 장애물이다. 효소가 재사용되는 것을 허용할 수 있는, 효소 고정화를 위한 표준화되고 일반적으로 이용할 수 있는 공정이 매우 바람직할 것이다. 최근에 이루어진 발전에도 불구하고, 효소의 고정화에 의하여 불균일 촉매의 제조를 위한 일반화되고 단순한 방법은 여전히 없다. 따라서, 고체 지지체 상에 효소의 고정화를 위한 개선된 방법 및 수성 및 유기 반응 조건하에 유기 합성에 적용될 수 있는, 안정한 불균일 생체촉매에 대한 계속되는 요구가 있다.

도 1은 폴리히스티딘-태그화된 효소 및 킬레이트화된 금속으로서 Co^{2 +}를 사용하여, 아미노-(하이브리드) CPG로부터 고정화된 효소 CPG-소재의 제조를 도시한다. R 기는 적합한 링커이고, CPG 생산물 간에 다양할 수 있다. 2,4-디하이드록시페닐 잔기 및 폴리히스티딘-태그화된 효소로의 코발트 이온의 킬레이션은 도식적으로 도시되었다.
도 2는 폴리히스티딘-태그화된 효소, 킬레이트화된 금속으로서 Co^{2 +}, 금속 나노 입자로서 팔라듐을 사용하여, 아미노-(하이브리드) CPG로부터 CPG-소재를 함유하는 고정화된 효소 함유- 및 금속 나노 입자의 제조를 도시한다. R 기는 적합한 링커이고, CPG 생산물 간에 다양할 수 있다. CPG 소재로의 팔라듐 나노 입자의 결합 및 2,4-디하이드록시페닐 잔기 및 폴리히스티딘-태그화된 효소로의 코발트 이온의 킬레이션이 도식적으로 도시되었다.

놀랍게도, 친화성 태그 결합을 통해 다공성 유리 소재 상에 또는 다공성 유기 중합체 상에 단백질을 고정화함으로써, 고정화된 단백질의 안정성과 관련하여 개선된 특징을 갖고, 상기 단백질의 생물학적 기능이 유지되는, 고정화된 단백질 소재가 수득된다는 것이 발견되었다. 고정화된 효소의 제조는 생체촉매 작용에서 이들을 유용하게 만드는 높은 촉매 활성을 가짐이 발견되었다.

본 발명에 따르면, 친화성 태그를 함유하는 단백질은 다공성 유리 소재 또는 다공성 유기 중합체에 부착되는 친화성 매트릭스 상의 특정 기로 결합됨으로써 고정화된다. 매트릭스 상의 특정 기를 위한 친화성 태그의 높은 결합 친화성 때문에, 매트릭스로의 단백질의 결합은 강하고 매우 특이적이다. 따라서 본 발명은 효소와 같은, 단백질의 정제 및 고정화를 위한 일반 방법을 제공한다.

제1 측면에서, 본 발명은 담체 및 담체 상에 고정화된 하나 이상의 단백질을 포함하는 고정화된 단백질 소재에 관한 것이고, 상기 담체는 친화성 매트릭스가 부착되는 담체 소재를 포함하고, 상기 담체 소재는 하기 요소로 구성된 군으로부터 선택되고:

(a) 조절된 다공성 유리(CPG);

(b) 하이브리드 조절된 다공성 유리(하이브리드 CPG) 및

(c) 다공성 유기 중합체;

상기 하나 이상의 단백질은 친화성 태그를 함유하며, 친화성 매트릭스로의 특이적 친화성 결합을 통해 담체 상에 고정화된다.

친화성 태그를 통해 담체 상의 단백질의 고정화는 미리 정해진 위치상의 단백질의 특이적 결합의 장점을 제공한다. 그러나 동시에, 고정화 방법은 일반적으로 많은 상이한 단백질에 적용 가능하다. 본 발명에 사용되는 친화성 태그는 친화성을 갖는 매트릭스에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 태그일 수 있다. 친화성 결합은 예를 들어, 반 데르 발스 상호작용, 수소 결합, 이온 결합 또는 소수성 상호작용의 결과일 수 있다. 어떤 경우이든, 최소한 임의의 특정 조건이 친화성 태그를 매트릭스로부터 분리하기 위해 적용될 때까지, 친화성 결합은 친화성 태그 및 매트릭스가 서로 긴밀하게 결합된 채로 유지될 수 있도록 충분히 강해야 한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 친화성 매트릭스가 부착되는 담체 소재를 포함하는, 단백질의 고정화를 위한 담체에 관한 것이고, 상기 담체 소재는 하기 요소로 구성된 군으로부터 선택되고:

(a) 조절된 다공성 유리(CPG);

(b) 하이브리드 조절된 다공성 유리(하이브리드 CPG); 및

(c) 다공성 유기 중합체;

상기 단백질은 친화성 매트릭스로의 특이적 친화성 결합을 통해 담체 상에 고정화된다.

담체 상에 고정화되는 단백질은 친화성 태그를 함유하는 (재조합)단백질 또는 효소와 같이, 친화성 태그를 함유한 임의의 단백질일 수 있다. 바람직하게는, 단백질은 친화성 태그를 함유하는 효소이다. 태그는 담체에 부착되는 친화성 매트릭스를 위한 특이적 친화성을 가져야 하는 것으로 이해되어야 한다.

다수의 친화성 태그 및 상응하는 매트릭스는 당업계에 공지되어 있다. 본 발명에 있어 유용할 수 있는 친화성 태그의 예 및 매트릭스 상의 상응하는 기가 하기 표에 기재된다.

바람직한 실시양태에서, 단백질 상의 친화성 태그는 폴리히스티딘 태그이고, 담체에 부착된 친화성 매트릭스는 킬레이트화된 금속 이온을 함유한다. 킬레이트화된 금속 이온은 바람직하게는, Fe^{2 +}, Fe^{3 +}, Co^{2 +}, Ni^{2 +}, Cu^{2 +} 및 Zn^{2 +}으로 구성된 군으로부터 선택된 금속 이온이고, 더 바람직하게는, Fe^{3 +}, Ni^{2 +} 및 Co^{2 +}으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 킬레이트화된 금속 이온은 Co^{2 +}이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 킬레이트화된 금속 이온은 Fe³⁺이다.

킬레이트화된 금속 이온의 선택은 의도한 용도에 의존적일 수 있다. 예를 들어, 담체가 친화성 태그화된 단백질의 정제 및 분리를 위해 사용되는 경우라면, 담체로의 효소의 결합은 가역적이어야 한다. 이런 경우, 킬레이트화된 금속 이온은 Ni²⁺ 또는 Co^{2 +}인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 Co^{2 +}이다. 이들 금속 이온은 폴리히스티딘-태그화된 효소의 고정화를 위해 충분히 강하게 결합하지만, 이미다졸 또는 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA)를 함유하는 완충 용액으로의 처리와 같이, 특정한 조건이 적용될 때 고정화된 효소를 방출할 수도 있다.

불균일 생체 촉매 작용에서 고정화된 효소의 용도에 있어, 담체로의 효소의 강한 결합이 바람직하다. 이런 경우, 킬레이트화된 금속 이온이 Co^{2 +} 또는 Fe^{3 +}인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 Fe^{3 +}이며, 이것이 담체로의 폴리히스티딘 태그의 특히 강한 결합을 야기하기 때문이다. 실시예에서 증명된 바와 같이, 킬레이트화된 금속 이온으로서 Fe^{3 +}를 포함하는 고정화된 단백질 소재로부터 효소 또는 금속 이온의 침출은 거의 무시할만하다. 침출의 부재는 고정화된 단백질 소재(생체촉매)가 촉매량으로 사용될 수 있게 한다. 촉매량의 사용은 연속적인 유동 반응에서 특히 중요하다.

킬레이트화된 금속 이온으로서 Fe^{3 +}의 추가 장점은 이 금속이 비-독성이라는 것이다. 따라서, 이로부터 생산된 고정화된 단백질 소재는 예를 들어 음식 산업에 안전하게 적용될 수 있다.

친화성-태그화된 단백질용 매트릭스는 적합한 링커를 통해 담체의 표면에 부착된다. 조절된 다공성 유리(CPG)의 표면은 공유 결합을 통해 링커 분자에 부착될 수 있는, 자유 실란올(Si-OH) 기를 함유한다. 통상적으로, 표면은 이작용성 알킬 실란 링커 분자(이의 사슬 길이 및 구조는 다양할 수 있음)와 반응하고, 이는 실리콘 원자가 유리 표면 실란올 기와 공유적으로 결합되어서이고, 상기 실란의 말단 기는 알데하이드, 아민, 에폭시 기, 할로겐기 또는 카르복실산 유도체와 같은 관능기이다. 사용되야 하는 적합한 관능기는 CPG의 표면에 부착되는 매트릭스의 성질에 의존할 것이다. 적합한 링커를 통해 CPG의 표면으로 매트릭스를 부착하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

CPG는 크기-조절된 거대 공극 또는 중간 공극의 입자로서 제조될 수 있는, 튼튼하고 불활성인 유리 소재이다. CPG의 샤프 공극 크기 분포는 약 10 내지 300nm 직경의 공극 크기로 다양할 수 있다. 이는 입체 장애로 인한 문제 없이 우호적인 미세환경을 제공한다. 상호연결된 공극 구조는 낮은 용액 유동 저항을 야기하고 소재 내에서 반응물 및 생산물의 대량 전달을 촉진한다. CPG의 단단한 구조는 높은 처리양의 반응기 디자인 및 높은 유속에서의 선형 스케일 업에 적합한 견고하고, 비압축성인 매질을 제공한다. 소재는 용매 내에서 제한된 팽창을 보이고, 대부분의 유기 매질 및 pH 10 미만의 수성 환경에서 화학적으로 및 입체적으로 안정하다.

통상적인 CPG는 공극 크기와 역으로 관련된 리간드 적재 능력을 보인다. 따라서, 거대 공극 크기의 CPG 지지체는 더 작은 공극 크기의 CPG 지지체만큼 많은 단백질을 적재할 수 없다. 이는 부분적으로 공극 크기와 표면적 사이의 역관계 때문이며, 부분적으로, 규정된 표면적 유닛당 밀도, 대략 4.5μmol/m²를 갖는 관능기로서 역할을 하는 표면 접근성 실란올 기 때문이다. 통상적인 CPG는 입체적으로 방해를 받는 실란올 부위가 기능적 부착 지점으로서 역할을 할 수 없는, 비균일 실란올 분포를 보인다.

WO2009/005631에 기술된 바와 같이, 하이브리드 조절된 공극성 유리(하이브리드 CPG, 또는 HybCPG)는 CPG의 변이체로, CPG의 내부 표면 및 외부 표면이 가교된 유기 중합체의 대략 10nm 필름으로 코팅되어 있다. 하이브리드 CPG 상의 중합체성 코팅은 알데하이드, 아미노 기, 에폭시 기, 할로겐기, 카르복실 산 및 에스테르, 또는 이들의 혼합물과 같은, 매트릭스가 부착될 수 있는 관능기를 함유할 수 있다. 매트릭스를 적합한 관능기에 부착하는 방법은 당업계의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

하이브리드 CPG는 통상적인 CPG에 비하여 특정 장점을 제공한다. 중합체 코팅의 결과로서, 적재 및 공극 크기 사이의 의존성은 최소화될 수 있고, 작용 부위 사이의 공간은 더 정확하게, 그리고 균일하게 제어될 수 있다. 단백질 고정화를 위한 담체 재료로서 하이브리드 CPG는 추가의 혜택을 제공할 수 있고, 이는 중합체 코팅의 디자인이 주어진 적용을 위해 바람직하거나 요구되는 표면 특징을 제공하기 위해 변경될 수 있기 때문이다. 예를 들어, 폴리아크릴로나이트릴과 같은 균일한 중합체가 더 친수성인 담체 표면을 제공하는 반면에, 폴리스티렌과 같은 균일한 중합체는 더 소수성인 담체 표면을 제공한다. 둘 이상의 상이한 중합체의 혼합물을 사용함으로써, 공중합체성 코팅이 수득될 수 있고, 상기 담체 표면의 특징은 주어진 적용을 위하여 구체적으로 조절된다. 얇은 층 코팅은 유기 용매 내에서의 어느 정도의 미세 팽창을 허용하지만, 하이브리드 CPG 베드의 큰 규모의 팽창 또는 역압(back pressure)의 증가는 허용하지 않는다. 코팅은 pH 10 초과인 수성 환경 내에서의 하이브리드 CPG의 사용도 허용한다.

발명의 상세한 설명의 이하 부분 및 첨부된 청구항에 걸쳐서, 특별히 달리 언급하지 않는 한, CPG에 대한 임의의 언급은 (통상적인)CPG 및 하이브리드 CPG 양자를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

CPG 및 HybCPG 외에 다른 담체 소재는 높은 비용 효율성 또는 특정 공정 요구사항과 같은 이유로 바람직할 수 있다. 그러한 소재는 공극성 유기 중합체(플라스틱) 소재를 포함한다. 이들 중합체는 알데하이드, 아미노 기, 에폭시 기, 할로겐기, 카르복실산 또는 에스테르 또는 이들의 혼합물과 같은, 매트릭스가 부착될 수 있는 관능기로 관능화되어 있다. 매트릭스를 적합한 관능기에 부착하는 방법은 당업계의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 관능화된 플라스틱은 제한된 팽창을 갖는 공극성 입자로서 제조될 수 있다. 적합한 유기 중합체는 스티렌, 에틸렌, 프로필렌, 아크릴산, 메타크릴산, 메틸 아크릴레이트 및 메틸 메타크릴레이트와 같은 단량체에 기초한 것일 수 있다. 그러한 유기 중합체의 예는 관능화된 폴리에틸렌, 초고분자량 폴리에틸렌(UHMWPE), 고밀도 폴리에틸렌(HDPE), 폴리프로필렌(PP), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 및 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트 및 폴리(메틸 메타크릴레이트)를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 공극성 유기 중합체는 관능화된 폴리스티렌 또는 관능화된 폴리메타크릴레이트이다.

HybCPG 내 공극성 표면이 유기 중합체 자체이기 때문에, 여기에 기술된 친화성 태그화된 단백질의 HybCPG로의 부착은 공극성 유기 중합체 담체 사용의 가능성을 입증한다. 유기 중합체의 표면 특성이 사용될 수 있지만, HybCPG는 CPG의 비압축성 및 비팽창 성질을 주로 유지한다. CPG의 강도(rigidity)가 필요하지 않을 때, 단독의 유기 중합체가 더 좋은 선택이 되는 것이 타당하다. 따라서 친화성 태그 부착을 그러한 소재에 적용하는 방법이 여기에 설명된다.

CPG-고정화된 단백질 소재는 도 1에 나타낸 바와 같이, 아미노-CPG 또는 아미노-HybCPG로부터 출발하는, 단지 적은 수의 단계로 쉽게 제조될 수 있다. 예를 들어, GPG 소재는 2,4-디하이드록시아세토페논으로 처리될 수 있고, 이로써 페닐 기를 이민을 통해 CPG에 연결한다. 만약 바람직하다면, 이후에 이민 관능기는 예를 들어 수소화 붕소나트륨, 시아노수소화 붕소나트륨 또는 리튬 알루미늄 수소화물과 같은 적합한 환원제를 사용하여 상응하는 아민으로 환원될 수 있다. 이후, Co^{2 +} 또는 Fe^{3 +}와 같은 킬레이트화된 금속 이온이 각각 CoCl₂ 또는 FeCl₃의 수성 용액 내 소재의 현탁액에 의하여 도입될 수 있다. 건조 이후, 수득된 소재는 하나 이상의 폴리히스티딘-태그화된 단백질을 위한 결합 매트릭스로서 직접적으로 사용될 수 있다.

담체 소재가 유기 중합체인 고정화된 단백질 소재가 CPG 및 HybCPG에 대해 상기 기술된 것과 유사한 방식으로 제조될 수 있다.

Co^{2 +} 또는 Fe^{3 +}와 같은 금속 이온을 위한 폴리히스티딘 태그의 고친화성은 고정화 단계 이전에 용액의 대규모 정제의 필요성 없이 단백질을 함유하는 원액으로부터 폴리히스티딘 태그화된 단백질의 고정화가 수행될 수 있게 한다. 폴리히스티딘 태그를 함유하지 않는 유기 소재는 킬레이트화된 금속 이온에 단지 약하게 결합하거나, 또는, 전혀 결합하지 않고, 예를 들어 물 또는 완충된 수성 용액으로의 세척에 의하여 최종 고정화된 단백질 소재로부터 쉽게 제거될 것이다. 따라서, 폴리히스티딘-태그화된 단백질이 세포 내 과발현에 의하여 제조되는 경우, 단백질 고정화는 세포 용해물(cell lysate)로부터 직접적으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 폴리히스티딘-태그화된 단백질이 숙주 유기체에 의하여 분비되는 경우, 단백질 고정화가 세포 배양 상청액으로부터 직접적으로 수행될 수 있다.

따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 친화성 태그화된 단백질의 고정화 방법에 관한 것이다:

i) 친화성 매트릭스가 부착되는 담체 소재를 포함하는 담체 상에 친화성-태그화된 단백질을 고정화하는 단계로서, 상기 담체 소재는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 단계,

(a) 조절된 공극성 유리(CPG);

(b) 하이브리드 조절된 공극성 유리(하이브리드CPG); 및

(c) 공극성 유기 중합체; 및

ii) 물 또는 적합한 완충액(buffer)으로 고정화된 단백질 소재를 임의로 세척하는 단계.

추가의 측면에서, 본 발명은 고정화된 단백질 소재의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

i) 아미노 기를 함유한 담체 소재를 제공하는 단계로서, 상기 담체 소재는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 단계,

a) 조절된 공극성 유리(CPG);

b) 하이브리드 조절된 공극성 유리(하이브리드CPG); 및

c) 공극성 유기 중합체 ;

ii) 담체 소재를 2,4-디하이드록시페논과 반응시켜 디하이드록시페닐 기를 담체 소재에 연결하는 단계,

iii) 디하이드록시페닐 기 및 폴리히스티딘-태그화된 단백질에 결합이 가능한 금속 이온 간에 킬레이트 착체를 형성하는 단계 및

iv) 상기 금속 이온을 포함하는 담체 소재에 폴리히스티딘-태그화된 효소를 결합시키는 단계.

선택적으로, 상기 기술된 바와 같은 고정화된 단백질 소재의 제조 방법은 담체 소재에 전이 금속 나노 입자를 결합하는 것을 더 포함한다.

하나의 실시양태에서, 담체는 조절된 공극성 유리(CPG)이다. 또다른 실시양태에서, 담체는 하이브리드 조절된 공극성 유리(하이브리드CPG)이다. 또다른 실시양태에서, 담체는 다공성 유기 중합체이다.

바람직한 실시양태에서, 방법은 CPG 또는 하이브리드 CPG 상의 친화성 태그화된 단백질의 고정화를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 친화성 태그화된 단백질은 폴리히스티딘 태그화된 효소이고 친화성 매트릭스는 킬레이트화된 금속 이온을 함유한다. 더 바람직한 실시양태에서, 방법은 CPG 또는 하이브리드 CPG 상의 폴리히스티딘 태그화된 효소의 고정화를 포함하고, 상기 사용된 킬레이트화된 금속 이온은 Co^{2 +} 또는 Fe^{3 +}이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기술된 방법에 의해 수득 가능한 고정화된 단백질 소재를 제공한다.

결합 단백질의 분리는 표준 IMAC 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 결합 단백질은 예를 들어, pH를 낮춤으로써 또는 이미다졸 또는 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA)를 함유하는 완충 용액을 적용하는 것과 같은, 폴리히스티딘 기보다 킬레이트화된 금속 이온에 동등한 또는 더 높은 친화성을 갖는 경쟁 분자를 첨가함으로써 담체로부터 방출될 수 있다. 담체로부터 정제된 단백질의 분리 이후, 예를 들어 특정 단백질 분해효소와 같은 적합한 효소로 친화성 태그를 절단하는 당업계에 공지된 기법에 의해, 폴리히스티딘 태그는 필요시 단백질로부터 제거될 수 있고, 이에 의해 순수하고 태그가 결여된 단백질을 얻을 수 있다.

따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 친화성 태그화된 단백질의 정제 및 분리를 위한, 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:

i) 친화성 매트릭스가 부착되는 담체 소재를 포함하는 담체 상에 친화성 태그화된 단백질을 고정화하는 단계로서, 상기 담체 소재는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 단계:

(a) 조절된 공극성 유리(CPG);

(b) 하이브리드 조절된 공극성 유리(하이브리드 CPG); 및

(c) 공극성 유기 중합체;

ii) 선택적으로 물 또는 적절한 완충액으로 고정화된 단백질 소재를 세척하는 단계; 및

iii) 친화성 매트릭스로부터 정제된 단백질을 분리하는 단계.

적절한 완충액 내에서 고정화 단계가 수행될 수 있다. 필요시, 고정화된 단백질 소재는 고정화된 단백질 소재로부터 임의의 비결합 단백질 및 다른, 바람직하지 않은 화합물을 제거하기 위해 물 또는 적합한 완충액으로 이후에 세척될 수 있다. 친화성 매트릭스로부터 정제된 단백질의 분리는 특정 친화성 태그에 대해 적합한 조건을 적용함으로써 달성될 수 있다. 다양한 친화성 태그의 분리에 적합한 조건은 당업계에 공지되어 있다.

상기 방법은 iv) 정제된 단백질로부터 친화성 태그를 제거하는 단계의 추가 단계를 선택적으로 포함할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 CPG 또는 하이브리드 CPG 상에 친화성 태그화된 단백질의 정제 및 분리를 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 친화성 태그화된 단백질은 폴리히스티딘 태그화된 효소이고, 친화성 매트릭스는 킬레이트화된 금속 이온을 함유한다. 더 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 CPG 또는 하이브리드 CPG 상에 폴리히스티딘 태그화된 단백질의 정제 및 분리를 포함하고, 상기 사용된 킬레이트화된 금속 이온은 Co^{2 +}이다.

상기 언급된 것처럼, 만약 담체 상에 고정된 단백질이 효소라면, 이들은 화학 반응을 촉매할 수 있는 작용 부위를 함유한다. 이로써, 고정화된 효소 소재가 유기 합성에서 생체 촉매로서 잠재적으로 유용하다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어 합성 유기 변형에서, 불균일 생체 촉매로서 여기에 개시된 바와 같은 고정화된 효소 소재의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명에 따라 고정화된 단백질 소재를 제공하는 단계 및 담체 상에 고정화되는, 작용이 가능한 효소가 하나 이상의 기질과 접촉할 수 있도록 상기 고정화된 단백질 소재를 이동시키는 단계를 포함하는 효소-촉매화된 반응을 촉매화하는 방법을 추가로 제공한다.

여기에 기술된 바와 같이, 친화성 태그 결합을 통해 담체 상의 효소의 고정화는 사용된 효소의 안정성을 개선한다. 고정된 효소가 다양한 범위의 유기 용매와 마찬가지로 수성 조건을 견딜 수 있음이 발견되었다. 이는 자유, 비-고정화된 효소가 안정적일 수 없는 반응 조건 하에서 고정화된 효소 소재가 사용될 수 있게 한다. 또한, 고정화된 효소 소재는 자유, 비-고정화된 효소가 견딜 수 있는 것보다 광범위한 pH 범위에서도 사용될 수 있다.

효소가 거친(비정제) 제조로부터 결합될 때, 풍부한 효소로 구성된 고정화된 단백질 소재를 야기한다. 효소 방법의 천연 활성이 유지되기 때문에, 고정화된 제조는 초기, 비-고정화된 단백질 소재에 비하여 단백질 중량당 높은 촉매 활성을 보인다.

본 발명의 또 다른 장점은 고정화된 효소 소재가 쉽게 재활용될 수 있다는 것이다. 고정화된 효소 소재가 불균일 촉매이기 때문에, 소재는 여과에 의하여 반응 혼합물로부터 단순히 수집된다. 소재는 필요하면 소재의 정제 이후 추가 반응에서 이후에 재사용될 수 있다. 특히 고가이고/이거나 배양이 어려운 효소에 대하여, 고정화된 효소 소재의 재사용의 가능성은 중요한 측면이다.

담체 상에 고정화된 효소는 산화환원효소, 트랜스퍼라제, 가수분해효소, 리아제, 이소머라제 및 리가아제로서 작용하는 효소를 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 유기 합성 변형에서 생체 촉매로서 유용한 효소일 수 있다. 따라서, 고정화된 효소 소재는 임의의 유기 반응에서 비균일 생체촉매로서 사용될 수 있고, 상기 고정화된 효소는 특이적으로 반응을 촉매화할 수 있다. 그러한 생체 촉매성 반응의 예는 효소 산화 및 환원 반응, 효소 가수분해 반응 및 효소 이성질화 반응을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특히 유용한 생체 촉매성 반응은 거울이성질체 선택적 반응이다. 생체 촉매 반응의 구체적인 예는 리파아제로 알코올 또는 아민의 선택적인 아실화, ω-트랜스아미나아제로 트랜스아민화, CYP P450 또는 베이어-빌리거(Baeyer-Villiger) 모노산소첨가효소로 모노산소 첨가, 알코올 탈수소효소로 알코올의 산화 또는 케톤/알데하이드의 환원 및 모노아민 산화효소로 아민의 산화를 포함한다.

하나의 실시양태에서, 둘 이상의 상이한 효소가 담체 상으로 고정화될 수 있고, 각각의 상이한 효소는 상이한 반응을 촉매할 수 있다. 다단계 또는 캐스케이드 반응에서 불균일 생체 촉매로서 둘 이상의 상이한 고정화된 효소를 함유하는 소재를 사용하는 것이 가능할 수 있다. 그러한 캐스케이드 반응은 예를 들어, ω-트랜스아미나아제에 의한 트랜스아민 반응에 이은 리파아제에 의한 아실 반응과 같은, 둘 이상의 효소-활성화된 반응이 둘 이상의 연속 단계에서 기질 상에서 수행되는 반응(즉, 제1 효소를 위한 기질이 제2 효소를 위한 기질로 변형되는 반응 등)일 수 있다. 대안적으로, 그러한 캐스케이드 반응은 포름산 탈수소효소에 의해 소비된 NADH의 동시 재생으로 알코올 탈수소 효소에 의하여 케톤/알데하이드의 선택적인/특이적인 환원과 같은, 기질이 제1 효소에 의해 변형되고, 상기 제1 효소에 대한 공동-인자는 제2 효소에 의해 재생되는 반응일 수 있다.

둘 이상의 상이한 효소가 담체 상에 고정화될 때, 만약 상이한 효소가 폴리히스티딘 태그와 같은 동일한 친화성 태그를 함유하는 경우, 이는 편리하다. 킬레이트화 금속 이온에 대한 결합 친화성이 효소 각각에 대하여 동일하기 때문에, 상이한 효소는 담체에 동등하게 강한 결합을 할 것이다. 이론적으로, 따라서, 동일한 친화성 태그를 갖는 n개의 상이한 효소의 동등량을 사용할 때, 담체 상의 각 상이한 효소의 양은 1/n일 것이다(임의의 확산 효과는 고려하지 않음).

둘 이상의 상이한 고정화된 효소를 갖는 고정화된 단백질 소재를 사용하는 캐스케이드 반응에서, 상이한 효소는 촉매 활성에서 상이함을 보이고, 이는 더 높은 촉매 활성을 갖는 효소의 양에 비하여, 더 낮은 촉매 활성을 갖는 효소를 더 다량으로 고정화할 때 유리할 수 있다. 이는 속도-결정 단계를 가속하고, 반응 캐스케이드의 전체 속도를 증가시킬 것이다.

대안적으로, 캐스케이드 반응이 바람직한 비율의 하나 이상의 상이한 고정화된 효소 소재를 혼합함으로써 수행될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 효소-촉매화된 다단계 또는 캐스케이드 반응을 촉매화하는 방법을 제공한다. 이 측면에서, 방법은 본 발명에 따른 둘 이상의 고정화된 효소를 포함하는 고정화된 단백질 소재를 제공하는 단계 및 작용 가능한, 담체 상에 고정화된, 효소 상으로 하나 이상의 기질이 접촉하도록 상기 고정화된 단백질 소재를 이동시키는 단계를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 고정화된 효소 소재는 코발트, 니켈 또는 팔라듐과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, 전이 금속의 나노 입자와 같은 금속 나노입자를 추가로 포함한다. 금속 나노 입자를 포함하는 소재는 예를 들어 CoCl₂, NiCl₂, Li₂PdCl₄, PdCl₂ 또는 Pd(TFA)₂와 같은 금속 염의 적합한 양의 용액, 아세토니트릴 또는 물 또는 이의 혼합물 내에 아미노-CPG 또는 아미노-HybCPG를 침지함으로써 제조될 수 있다. 금속 이온은 이후에 나트륨 수화물, 수소화 붕소나트륨, 수소화 시아노붕소나트륨, 리튬 알루미늄 수화물 등과 같은 적합한 환원제의 과량의 추가에 의해 금속 나노입자로 환원된다. 2,4-디하이드록시아세토페논의 첨가시, 초기에 형성된 이민은 상응하는 아민으로 즉시 환원된다. 세척에 의한 환원제의 제거 이후, Co^{2 +}, Fe^{3 +} 또는 Ni^{2 +}와 같은 금속 이온은 각각 CoCl₂, FeCl₃ 또는 NiCl₂의 수성 용액 내에서 물질의 현탁에 의해 매트릭스 상에 킬레이트화된다. 건조 이후에, 수득된 물질은 하나 이상의 폴리히스티딘 태그화된 효소를 위한 매트릭스로서 직접적으로 사용될 수 있다. 도 2 참조.

이론에 제한되지 않는다고 했을 때, 금속 나노 입자는 CPG 소재 상의 아미노 기를 통해 CPG 소재에 결합하는 것으로 생각된다. 또한, 금속 이온의 환원에 의해 형성되는 금속 나노입자는 CPG 소재의 공극 내에 포획되기에 충분하도록 큰 크기이다.

고정화된 효소 및 금속 나노입자를 모두 함유하는 고정화된 단백질 소재는 조합된 효소-촉매화 반응 및 전이 금속-촉매화 반응 내에 불균일 생체 촉매로서 적용될 수 있다. 그러한 반응의 예는 역동적 속도론적 분할 반응(dynamic kinetic resolution reaction)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그러한 반응의 구체예는 첨부된 실시예에서 나타내지는 바와 같이, Pd 나노 입자에 의한 아민의 라세미화로써 아민의 역동적 속도론적 분할 이후 리파아제에 의한 아실화이다.

따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 조합된 효소-촉매화되고 전이 금속 촉매화된 반응을 촉매화하기 위한 방법을 제공한다. 이 측면에서, 방법은 본 발명에 따른 전이 금속 나노 입자를 추가로 포함하는 고정화된 단백질 소재를 제공하는 단계 및 작용 가능한, 담체 상에 고정된, 효소 및 전이 금속이 하나 이상의 기질과 접촉할 수 있도록 상기 고정화된 단백질 소재를 이동시키는 단계를 포함한다.

본원 명세서에 개시된 고정화된 단백질 소재의 실시예 및 상기 소재의 용도가 실험 섹션에 기술된다.

정의

용어 “친화성 태그”는 재조합 단백질에 부착되고, 매트릭스 상에 고정화된 특정 기에 결합할 수 있는, 유기 또는 유기금속성 분자, 단백질 단편 또는 다른 것과 같이 정의된 군을 지칭한다. 친화성 태그의 예로는 폴리히스티딘 태그, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 태그, 키틴 결합 단백질(CBP) 태그, 말토오스 결합 단백질(MBP) 태그, FLAG-태그, 아비딘 태그 또는 스트렙트아비딘 태그가 있다. 친화성 태그는 융합 태그로 지칭될 수도 있다.

여기서 사용되는, 용어 "친화성-태그화된 단백질"은 상기 정의된 친화성 태그가 목적 단백질에 추가된 것인 재조합 단백질을 지칭한다. 친화성-태그화된 단백질은 DNA 단편의 결찰 또는 PCR 기법과 같은, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다. 친화성-태그화된 단백질은 "융합-태그 단백질" 또는 "융합 단백질"로 지칭될 수도 있다.

용어 "폴리히스티딘 태그"는 단백질의 C- 또는 N-말단에 부착되는, 둘 이상의 히스티딘 잔기의 줄을 지칭한다. 폴리히스티딘 태그는 바람직하게는 여섯 개 이상의 히스티딘 잔기의 줄이다. 폴리히스티딘 태그에 대해 통상적으로 사용되는 다른 명칭은 폴리히스(polyHis) 태그, 히스티딘 태그, 헥사히스티딘 태그, 6xHis-태그 및 His₆ 태그, His-tag^TM이다. 용어 "폴리히스티딘-태그화된 효소"는 재조합 효소를 지칭하며, 목적 효소가 상기 정의된 폴리히스티딘 태그와 융합된 것이다.

여기에 사용된, 용어 "아미노-CPG"는 적합한 링커를 통해 아미노기로 관능화된 CPG 물질을 지칭한다. 여기에 사용된 용어 "아미노-HybCPG"는 중합체 코팅이 아미노 기를 함유하는 하이브리드 CPG 물질을 지칭한다.

본 발명은 어떠한 측면에서도, 본 발명을 제한하지 않는, 하기 실시예의 수단에 의해 더 기술된다. 모든 인용된 문서 및 참조문헌은 참조로써 본원 명세서에 통합된다.

약어

a_w 수분 활동도(water activity)

AlaDH 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 유래 알라닌 탈수소효소

CalA 칸디다 안타르크티카 리파아제 A(슈도자이마 안타르크티카(Pseudozyma antarctica) 리파아제 A로도 알려져 있음)

CalB 칸디다 안타르크티카 리파아제 B(슈도자이마 안타르크티카 리파아제 B로도 알려져 있음)

DCM 디클로로메탄

2,5-DKCMO 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 유래 2,5-디케토캄판 모노옥시게나아제

equiv. 당량

EtOAc 에틸 아세테이트

FMN 플라빈 모노뉴클레오티드

FRE 이 콜라이(E. coli) 유래 플라빈 환원 효소

GC 가스 크로마토그래피

HEPES 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄 술폰산

IPTG 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드

min 분

MOPS 3-(N-모르폴리노)프로판술폰 산

MTBE 메틸-삼차-부틸 에테르(또는 삼차-부틸 메틸 에테르)

NADH 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드(환원형)

PLP 피리독살 5-포스페이트

SDS-PAGE 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동

Tris 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄

ω-TA 크로모박테리움 비올라슘(Chromobacterium violaceum) 유래 ω-트랜스아미나아제

실험 방법

CPG 소재는 Prime Synthesis, Inc.(Aston, PA, USA)로부터 수득되었다. 하기 조절된 공극성 유리 소재는 실시예에 사용되었다:

ㆍ LCAA CPG는 장쇄 알킬 아민으로부터 유도체화된 CPG이다(CPG-0502-N12).

ㆍ Copoly-HybCPG-아민(이하에서 "HybCPG copo"로서도 지칭됨)은 1:1 아크릴로니트릴:비닐벤질 클로라이드로부터 형성된 공중합체로 코팅되고 시험관 내에서 가교 결합된 하이브리드 CPG이다.

ㆍVBC HybCPG-아민(이하에서 "HybCPG VBC"로서도 지칭됨)은 비닐벤질 클로라이드 단량체로부터 형성된 중합체로 코팅되고, 시험관 내에서 가교 결합된 하이브리드 CPG이다.

코팅의 (공)중합체는 WO 2009/005631에 기술된 바와 같이, 이-작용기성 아민으로 가교 결합되었다. 이후, 아미노 기는 나트륨 프탈이미드와의 반응에 의한 클로로-중합체 코팅상으로 도입된 후 하이드라진으로 탈프탈로일화되었다.

하기 공극성 유기 중합체는 실시예에 사용되었다:

"중간-팽창 폴리스티렌"(3-Prime LLC로부터 구매함, USA; Part Number 04-02-03-32), 아미노 관능화된 폴리스티렌 지지체. 공극 크기 ~1000Å (매우 광범위한 분포), 입자 크기 100μm, 아민 적재 222μmol/g.

"저-팽창 메타크릴레이트 공중합체"(SPRIN Technologies S.p.A.로부터 구매함, 이탈리아; Part number 1A02BN), 아미노 관능화된 메타크릴레이트 지지체. 공극 직경 알 수 없음, 입자 크기 100-300μm, 아민 적재 270μmol/g.

크로모박테리움 비올라슘 유래 과발현된 ω-트랜스아미나아제의 배양은 문헌[Cassimjee et al(ACS Catal. 2011, vol. 1, pp. 1051-1055)]에 기술된 대로 수행되었다. 과발현된 칸디다 안타르크티카 리파아제 A의 배양은 문헌[Sandstroem et al.(Protein Eng Des Sel. 2009, vol 22, pp. 413-420)]에 기술된 대로 수행되었다. 과발현된 칸디다 안타르크티카 리파아제 B 및 CalB Trp104Ala, 리파아제 B의 불안정한 변이체의 배양은 문헌[Engstroem et al. (Org. Biomol. Chem. 2011, vol. 9, pp. 81-82)]에 기술된 바와 같이 수행되었다. 슈도모나스 푸티다 유래 과발현된 2,5-디케토캄판 모노옥시게나아제의 배양은 문헌[Kadow et al.(AMB Express 2011,1:13)]에 기술된 바와 같이 수행되었다. 이 콜라이 유래 과발현된 플라빈 환원효소의 배양은 문헌[Kadow et al.(Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013, published online 5 November 2013)]에 기술된 바와 같이 수행되었다. 바실러스 섭틸리스 유래 과발현된 알라닌 탈수소효소의 배양은 문헌[Mutti et al. (Eur. J. Org. Chem. 2012, issue 5, pp. 1003-1007)]에 기술된 바와 같이 수행되었다. 부재 시, His₆-태그는 PCR에 의하여 유전자에 첨가되었다. 폴리히스티딘 태그화된 CalA 및 CalB는 문헌[Engstroem et al. (Org. Biomol. Chem. 2011, vol. 9, pp. 81-82)]에 기술된 바와 같은 과정에 따라 아큐렐(Accurel) 상에 고정화되었다.

실시예

실시예 1

폴리히스티딘 - 태그화된 효소의 고정화 및 정제를 위한 킬레이팅 CPG 담체의 제조

바람직한 유형의 아미노-CPG(5g)는 60분 동안 연속 교반으로 메탄올(200mL)에서 2,4-디히드록시 아세토페논(CPG의 아미노 관능성에 대해 1.5당량)으로 처리되었다. 형성된 이민은 60분 동안 연속 교반으로 수소화붕소 나트륨(4당량)의 연속적인 첨가로 환원되었다. 고체 물질은 여과되고, 포화된 수성 탄산나트륨 용액, 물 및 이어서 에탄올로 세정된 뒤, 2시간 동안 80℃에서 건조되었다. 이어서 입자는 CoCl₂(100mL)의 포화된 수성 용액 내에 침지되었다. 여과 및 물 및 에탄올로의 세정 이후, 입자는 2시간 동안 80℃에서 건조되었다. 상이한 킬레이팅 CPG 담체의 특성은 표 1에 나타내었다.

표1
킬레이팅 CPG 담체	공극성 1 (Å)	아미노 유도체화 3 ( μmol /g)	코발트(II) 적재 4 ( μmol /g)
LCAA CPG(Co2 +)	533	166	2.8
HybCPG VBC(Co2 +)	526 2	398	18.7
HybCPG copo(Co2 +)	590 2	360	25.5
1수은 포로시미터에 의해 측정됨. 2가교 결합된 중합체로 코팅하기 이전에 측정됨. HybCPG 의 접근 가능한 공극 직경이 코팅 이후 160-200Å까지 감소하였다. 3반응 1에 따른 효소-결합 CPG의 제조 이전의 질소 함량. 4결합 효소 없는 킬레이팅 CPG의 기초 분석.

킬레이트화된 금속 이온으로서 Fe^{3 +}를 함유한 담체가 상기 공정과 유사하게 제조되었으나, COCl₂ 대신 FeCl₃의 수성 용액을 사용하여 제조되었다.

실시예 2

폴리히스티딘 태그화된 효소의 고정화 및 정제를 위한 킬레이팅 공극성 폴리스티렌 및 폴리메타크릴레이트 담체의 제조

바람직한 유형의 세척된(물/에탄올 1:1, 400mL) 및 건조된(여과 이후 16시간 진공) 아미노 관능화된 공극성 유기 중합체 입자(2g)(하기 참조)가 60분 동안 연속 교반으로 메탄올(50mL) 중에서 2,4-디히드록시 아세토페논(플라스틱의 아미노 관능성에 대하여 1.5당량)으로 처리되었다. 형성된 이민은 60분 동안 연속 교반으로 수소화 붕소나트륨(4당량)의 순차적인 첨가에 의해 환원되었다. 고체 물질이 여과되었고, 포화된 수성 탄산나트륨 용액, 물 및 이어서 에탄올로 세정되었고, 16시간 동안 25℃에서 진공으로 건조되었다.

입자는 이어서 CoCl₂(100ml)의 포화된 수성 용액 내에 침지되었다. 여과 및 물 및 에탄올로의 세정 이후에, 입자는 16시간 동안 25℃에서 진공으로 건조되었다. 상이한 킬레이팅 공극성 플라스틱 담체의 특성은 표 2에 나타내었다.

표 2
킬레이팅 공극성 플라스틱 담체	아미노 유도체화 (제조사에 의해 언급됨, μmol/g)	코발트(II) 적재(기초 분석, μmol/g)
폴리스티렌(Co2 +)	222	67
폴리메타크릴레이트(Co2 +)	270	24

실시예 3

킬레이팅 담체 상에 폴리히스티딘 태그화된 효소의 고정화

CalA 또는 CalB를 함유하는 세포 배양 상청액이 완충화 없이 사용되었다. ω-TA의 세포 용해물은 HEPES 완충액(50mM, 500mM NaCl, pH 8.3)에서 세포 재현탁에 의해 제조되었다. 계면활성제(BugBuster™ 10X, Novagen)의 첨가 이후, 세포 찌꺼기가 원심분리기에 의하여 제거되었다. 킬레이팅 CPG 담체가 용해물 또는 상청물 내에 침지 후 오비탈 쉐이커(150rpm) 상에서 교반되었다. 고정화 동안 용액의 브래드포드 분석된 시료는 단백질 농도가 감소하기 시작할 때 결합의 완료 및 킬레이팅 CPG 담체의 포화인 것으로 확인되었다. 또한, 활성 분석이 여과에 의해 CPG 담체의 제거 이후 용액과 함께 수행되었다. 고정화된 제조물이 완충액(CalA 및 CalB에 대하여 MOPS(50mM, pH 7.4), ω-TA에 대하여 HEPES(상기 참조))으로 이어서 세정되고, 16시간 동안 진공하에서 건조되었다.

CPG 담체로부터 고정화된 효소의 추출은 용리 완충액(50mM 인산나트륨, 500mM 이미다졸, pH 7.5) 내에 입자를 침지하고, 그리고, 20분 동안 오비탈 쉐이커 상에서의 인큐베이션하는 것에 의해 수행되었다. 추출된 효소의 존재 및 순도는 SDS-PAGE에 의해 시각화되었고, His₆-태그화된 효소에 상응하는 밴드만 볼 수 있었다.

용매 내 ω-TA의 작용 부위 정량화는 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다[문헌Cassimjee et al., ACS Catal. 2011, vol. 1, pp. 1051-1055]. 용매 내 고정화된 ω-TA의 작용 부위 정량화는 1-페닐에틸아민(1mM, 1mL, MTBE a_w=0.6, 1mM 펜타데칸)에 ω-TA-CPG를 첨가함으로써 수행되었다. 반응 혼합물은 오비탈 쉐이커 (150rpm, 24시간, 22℃) 상에서 교반되었다. 용매의 수분활성은 수화물 염 쌍(Na₂HPO₄, 2H₂O/7H₂O)에 의해 세팅되었으나 ω-TA-CPG의 첨가 이후 또는 반응 동안 제어되지 않았다. 전환(conversion)은 내부 표준으로서 펜타데칸과 함께 GC에 의해 측정되었다(EtOAc에 200μL 시료, 아세트 무수화물 및 트리에틸아민 3방울, 22℃에서 8시간 인큐베이션).

완충액 내 고정화된 ω-TA의 작용 부위 정량화는 1-페닐에틸아민(1mM, 1mL, 50mM HEPES, pH 7.0)에 ω-TA-CPG를 첨가함으로써 수행되었다. 반응 혼합물은 오비탈 쉐이커 상에서 교반되었다(150rpm, 24시간, 22℃). 시료(400μL)는 수성 NaOH 용액(1%)로 처리되고, DCM으로 추출되고, 펜타데칸(1mM, EtOAc)의 첨가 이후 GC에 의해 분석되었다. 모든 경우에서 전환은 킬레이팅 CPG와의 블랭크 반응(효소가 결합하지 않음)과 비교되었다.

고정화 수율, 즉, 용해물로부터 제거된 활성 효소의 양에 대해 세척 이후 CPG 상에 유지된 활성 효소의 양은 작용 부위 정량화에 기초하여 99% 초과였다. 결과는 표 3에 나타내었다.

표 3
CPG 담체	고정화 수율 ( MTBE 내 활성 효소% )	MTBE 내 적재, 작용 부위(% w/w)	완충액 내 적재, 작용 부위 1 (% w/w)
LCAA CPG(Co2 +)	>99%	24	19
HybCPG VBC(Co2 +)	>99%	29	25
HybCPG copo(Co2 +)	>99%	21	13
1고정화 이후 PLP가 첨가되지 않음.

킬레이팅 공극성 폴리스티렌 및 폴리메타크릴레이트 담체 상의 폴리히스티딘 태그화된 효소(CalA 및 CalB)의 고정화는 CPG 담체에 대하여 상기에 기술된 바와 같이 수행되었다.

실시예 4

촉매로서 ω- TA - CPG의 사용

실시예 3에서 제조된 ω-TA-CPG는 페녹시-2-프로파논의 거울상이성질체 특이성 트랜스아미네이션 내에서 촉매로서 적용되었다:

20mg의 ω-TA-CPG가 100mM 라세미성 1-페닐에틸아민 및 50mM 2-페녹시프로파논을 갖는 3mL의 MTBE(a_w=0.6)의 용액에 첨가되었고, 반응 혼합물은 50℃에서 오비탈 쉐이킹(150rpm)으로 인큐베이션 되었다. 펜타데칸(50mM)이 내부 표준으로서 사용되었다. 1-페닐에틸아민의 전환 및 거울상 이성질체 과다 이후, 기록된 시점에서 시료(50mL)를 채취한 이후 카이랄 가스 크로마토그래피를 수행하였다. 시료는 상기 기술된 바와 같이 무수 아세트산 및 트리에틸 아민으로 유도체화되었다. 1-페녹시프로판-2-아민의 형성은 유도체화 없이 측정되었다. 결과는 표 4에 나타내었다.

실시예 4
효소	MTBE 내 활성 1 ( μmol /min/g CPG )	MTBE 내 활성 1 ( μmol /min/g 활성 효소)
ω-TA-LCAA CPG(Co2 +)	0.38	1.58
ω-TA-HybCPG VBC(Co2 +)	0.70	2.41
ω-TA-HybCPG copo(Co2 +)	0.06	0.29
1반응의 초기 속도

실시예 5

촉매로서 고정화된 CalA 및 CalB의 사용

실시예 3에서 제조된 CalA-CPGs, CalB-CPGs, CalB-폴리스티렌 및 CalB-폴리메타크릴레이트는 1-페닐에탄올의 거울상 이성질체 선택성 아실화에서 촉매로서 적용되었다(속도론적 분할):

리파아제가 촉매화 작용을 한 속도론적 분할 반응이 고정화된 효소(20 mg)를 10mM 1-페닐에탄올 및 100mM 비닐 부티레이트를 갖는 톨루엔(a_w=0.1)의 3mL의 용액에 첨가함으로써 수행되었고, 혼합물이 22℃(CalA 및 CalB에 대하여)에서 또는 50℃에서(CalB Trp104Ala에 대하여)오비탈 쉐이킹(200rpm)으로 인큐베이션 되었다. 펜타데칸(5mM)은 내부 표준으로서 사용되었다. 1-페닐에탄올 및 1-페닐에틸 부티레이트의 전환 및 거울상 이성질체성 과다는 기록된 시점에서 시료(50μL)를 채취함으로써 카이랄 GC에 의하여 측정되었다.

하기 반응이 비교를 위하여 포함되었다:

- 아큐렐^®상에 고정화된 CalB, 공극성 폴리프로필렌 분말.

- 비변형된 형태의 아미노-HybCPG copo 상에 고정화된 CalB(즉, 실시예 1에 따라 가공되지 않음).

에탄올 활성화된 아큐렐^®(아큐렐 MP1001, 입자 크기 <1000μm, Membrana GmbH, Wuppertal, 독일)상의 CalB(및 CalB Trp104Ala)의 고정화가 효소의 양(단백질 함량이 브래드포드 법에 의해 측정됨)에 대하여 50:1의 비율로 공극성 물질을 농축된 상청액에 첨가함으로써 수행되고, 8시간 이상 동안 인큐베이션되었다. 결과는 표 5에 나타내었다.

표 5
효소	벌크 밀도 1 (g/cm 3 )	E app	톨루엔 내 활성 2 (μmol/min/g)	톨루엔 내 벌크 볼륨 활성 ( μmol /min/ cm 3 )
CalB-LCAA CPG(Co2 +)	0.28	>300(R)	0.83	0.23
CalB-HybCPG VBC(Co2 +)	0.23	>300(R)	0.90	0.21
CalB-HybCPG copo(Co2 +)	0.245	>300(R)	1.08	0.26
CalB-아큐렐®	0.10	>300(R)	5.99	<0.603
CalB Trp104Ala-LCAA CPG(Co2 +)	0.28	n/a	n/d	n/d
CalB Trp104Ala-HybCPG VBC(Co2 +)	0.23	1.3(R)	0.19	0.04
CalB Trp104Ala-HybCPG copo(Co2 +)	0.245	1.0	0.04	0.01
CalB Trp104Ala-아큐렐®	0.10	7.1(R)	0.23	<0.023
CalB + 아미노-HybCPG copo4	0.245	>300(R)	0.36	0.083
CalA-LCAA CPG(Co2 +)	0.28	1.3(R)	16.18	4.53
CalB-폴리스티렌(Co2 +)	n/d	>300(R)	0.068	n/d
CalB-폴리메타크릴레이트(Co2 +)	n/d	>300(R)	0.174	n/d
1효소의 결합 이전 건조 담체. 21-페닐에탄올의 소비의 초기 속도. 3용매와의 접촉시 일어나는 팽창의 포함 없음. 4변형 없이 아미노-HybCPG copo가 사용되었다

실시예 6

3개의 상이한 효소의 캐스케이드- CPG("BV-캐스케이드-CPG")의 제조

2,5-DKCMO, FRE 및 AlaDH의 세포 용해물이 인산나트륨 완충액(50mM, 500mM NaCl, pH 7.5)에서의 세포 재현탁 및 BugBuster™ 10X의 첨가에 의해 제조되었다. 원심 분리 및 세포 찌꺼기 제거 이후에, 킬레이팅 Co^{2 +} CPG 담체가 3개의 세포 용해물의 동등한 부피의 혼합물로 침지되고, 오비탈 쉐이커(150rpm) 상에서 교반되었다. 고정화 동안 용액의 브래드포드 분석된 시료가 단백질 농도가 감소할 때 결합이 완료되고 CPG 담체가 포화된 것으로 확인되었다. 또한, 활성 분석이 여과에 의해 CPG의 제거 이후 용액과 함께 수행되었다. 고정화된 제조물은 이어서 인산 나트륨 완충액(상기 참조)에 의해 세정되고, 이어서 16시간 동안 진공하에서 건조되었다.

실시예 7

촉매로서 BV -캐스케이드- CPG를 사용한 효소 캐스케이드 반응

실시예 6에서 제조된 캐스케이드-CPG는 (+)-캠퍼의 베이어-빌리거 산화에서 촉매로서 적용되었다:

65mg BV-캐스케이드-CPG가 총 액체 부피 5.0mL를 갖는 인산 완충액(100mM, pH 7.5)과 2.0mM (+)-캠퍼, 5.0mM L-알라닌, 0.3mM FMN 및 0.5mM NADH의 반응 혼합물에 첨가되었다. 이어서 산소가 용해되었고(30초간 거품화), 관이 밀봉되고 혼합물이 22℃에서 오비탈 쉐이커(150rpm) 상에 인큐베이션 되었다. 시료(500μL)는 내부 표준으로서 에틸벤조에이트와 함께 EtOA로 추출되었고, GC에 의해 분석되었다. 전환은 3시간 뒤 측정되었다. 산소가 24시간 뒤 첨가되었고, 반응이 추가 3시간 동안 계속되었고, 그 후 전환이 다시 측정되었다(27시간).

세포 용해물로부터 자유(비-고정화된) 2,5-DKCMO, FRE 및 AlaDH를 사용하여 비교 반응도 수행되었다. 효소의 비율 및 양은 측정되지 않았다. 결과는 표 6에 나타내었다.

표 6
효소	3시간 뒤 전환	24시간 뒤 전환	27시간 뒤 전환 1
BV-캐스케이드-LCAA CPG(Co2 +)	<5%	<5%	<5%
BV-캐스케이드-HybCPG VBC(Co2 +)	63%	63%	88%
2,5-DKCMO, FRE, AlaDH(자유, 비고정화된 효소)	65%	65%	65%
124시간 뒤 산소의 재첨가

다상(Multi-phase) 반응이 5.0mL의 총 액체 부피의 160mM의 L-알라닌, 0.3mM의 FMN 및 0.5mM NADH와 인산 완충액(100mM, pH 7.5)의 반응 혼합물에 1.0g의 BV-캐스케이드-CPG를 첨가함으로써 수행되었다. (+)-캠퍼(100mM)를 갖는 5mL 시클로헥산이 제2 액체 상으로서 첨가되었다. 밀봉된 관이 수상(aqueous phase)에 연속적인 산소 첨가와 함께 22℃에서 오비탈 쉐이커(100rpm) 상에서 교반되었다. 유기 상으로부터 시료(50μL)가 기록된 시점에 채취되었고, 내부 표준으로서 에틸벤조에이트(EtOAc에서 2.0mM)의 첨가 이후 GC에 의해 분석되었다. 72시간 뒤 전환은 EtOAc(20mL)로 모든 성분의 추출 이후 측정되었다.

세포 용해물로부터 자유(비-고정화된) 2,5-DKCMO, FRE 및 AlaDH으로 비교 반응도 수행되었다. 효소의 비율 및 양은 측정되지 않았다. 결과는 표 7에 나타내었다.

표 7
효소	72시간 뒤 전환
BV-캐스케이드 -LCAA CPG(Co2 +)	<5%
BV-캐스케이드 -HybCPG VBC(Co2 +)	56%
2,5-DKCMO, FRE, AlaDH(자유, 비고정화된 효소)	<5%

실시예 8

CalB 및 Pd-나노입자로 캐스케이드- CPG("Pd-CalB-CPG")의 제조

아미노-CPG(5g)가 물(200mL)중의 Pd(TFA)₂(CPG의 아미노 관능성에 대한 0.5당량)의 용액에 침지되었고, 혼합물은 10분 동안 연속적으로 교반되었다. NaBH₄(7당량)이 이어서 첨가되었고 혼합물이 추가 30분 동안 교반되었다. 이어서 2,4-디히드록시아세토페논(0.5당량)이 첨가되었고, 이후 혼합물은 30분 동안 교반되었다. 고체 물질이 여과되고, 물로 완전히 세정되고, 이어서 CoCl₂의 포화 수성 용액(100mL) 내에 침지되었다. 여과 및 물로 세척 이후에, 고체 물질은 폴리히스티딘 태그화된 CalB(정제된 또는 상청액으로부터)의 용액에 침지되었고, 30분 동안 교반되었다. 고정화된 제조물은 이어서 여과되고, 완충액(20mM MOPS, pH 7.4)으로 세정되고, 이어서 16시간 동안 진공 하에서 건조되었다.

실시예 9

Pd- CalB - CPG를 사용한 캐스케이드 반응

실시예 8에서 제조된 물질은 1-페닐에틸아민의 거울상이성질체 선택적 아실화에서 촉매로서 적용되었다(역동적 속도론적 분할):

100mg의 Pd-CalB-CPG가 20mM 라세미성 1-페닐에틸아민 및 100mM 이소프로필 부티레이트를 함유하는 1mL 톨루엔의 용액 내에 침지되었다. 1mg NaBH₄가 첨가되었고, 반응 소낭이 밀봉되었다. 시스템은 24 내지 48시간 동안 오비탈 쉐이커(100-800rpm)상에서 연속 교반으로 65℃에서 인큐베이션 되었다. 기질 및 산물(예를 들어 (R)-N-(1-페닐에틸)부티르아미드)의 전환 및 거울상 이성질체 과다는 기록된 시점에서 시료를 채취함으로써 카이랄 GC에 의하여 측정되었다.

상의 분리, 잔여 아실 공여체 및 아민을 제거하기 위한, 1N HCl로 유기 상을 쉐이킹하는 3회 및 이어서 EtOAc로 세척 상의 역추출에 의하여 산물이 수득되었다. 조합된 유기 상을 진공 속에서 증발시켜 산물을 수득하고, 이는 플래시 크로마토그래피에 의해 추가적으로 정제되었다.

실시예 10

A. 금속 이온 침출의 측정

주어진 조건에서 담체로부터 침출되는 금속 이온의 양을 측정하기 위하여, CPG 및 HybCPG에 기반하며 Co^{2 +} 또는 Fe^{3 +}을 함유한 담체를 수성 완충액에서의 연장된 기간 동안 인큐베이션 시켰다.

Co^{2 +} 또는 Fe^{3 +}로 결합된 250mg의 LCAA CPG, HybCPG VBC 및 HybCPG copo의 각각은 실온에서 쉐이킹 테이블 상에서 72시간 동안 3mL의 수성 완충액(HEPES 20mM, pH 7.0) 내에서 인큐베이션 되었다.

Co^{2 +}의 양은 1부분의 NH₄SCN-용액(1.0M), 1부분의 HCl-용액(6.0M) 및 2부분의 아세톤과 함께 1부분의 인큐베이션된 용액을 혼합하여 측정하였다. 이 공정은 620nm에서 분광광도계에 의해 정량화되는, Co^{2 +}의 농도에 비례하는 청색으로 나타내어진다. 또한, 완충액 단독을 갖는 블랭크 시료가 시험되었다.

Fe^{3 +}의 양은 1부분의 NH₄SCN-용액(1.0M) 및 1부분의 HCl-용액(6.0M)과 함께 1부분의 인큐베이션된 용액을 혼합하는 것에 의해 측정하였다. 이 공정은 480nm에서 분광광도계에 의해 정량화되는, Fe^{3 +}의 농도에 비례하는 적색으로 나타내어진다. 또한, 완충액 단독을 갖는 블랭크 시료가 시험되었다.

인큐베이션된 담체 소재로부터 용액의 절반(1.5mL)을 제거한 이후에, 1.5mL의 6.0M HCl 용액이 첨가되었고, 소재는 1시간 동안 쉐이커 상에서 인큐베이션되었다. 이 공정은 효과적으로 모든 결합 금속 이온을 제거하였다. 이 인큐베이션된 용액의 1부분은 이어서 1부분 HCl-용액(3M) 및 1부분 NH₄SCN-용액(1.0M)과 함께 혼합되었다. Co^{2 +}이 정량화될 시료에 대하여, 2부분의 아세톤도 첨가되었다. Co^{2 +} 정량화를 위한 620nm에서의 흡광도 및 Fe^{3 +} 정량화를 위한 480nm에서의 흡광도가 기록되었다. 흡광도 측정에 기반하여, 금속 이온의 총량에 상응하는 값이 2개의 상이한 인큐베이션(처음에 pH 7.0이고, 이어서 3.0M HCl)에서 시험된 부피에 대하여 계산되었고, 제거된 부피에 대하여 보정되었다(제1 인큐베이션 이후 1.5mL). pH 7.0에서 침출된 금속 이온의 분획은 이로써 정량화될 수 있었다. 결과는 하기 표 8에 제시되었다.

표8
담체	pH 7.0에서 72시간 후 침출된 금속 이온( % )
LCAA CPG(Co2 +)	16
HybCPG VBC(Co2 +)	14
HybCPG copo(Co2 +)	7.0
LCAA CPG(Fe3 +)	1.5
HybCPG VBC(Fe3 +)	0.36
HybCPG copo(Fe3 +)	0.61

CPG 및 HybCPG 담체 소재에 결합한 Fe^{3 +}가 Co^{2 +}보다 침출을 적게 하는 경향이 있음이 확인되었다.

B. 효소 침출의 측정

주어진 조건에서 담체로부터 분리되는 효소의 양을 측정하기 위하여, CPG 또는 HybCPG 상의 ω-TA의 고정화된 제조물이 수성 완충액 내에서 연장된 기간 동안 인큐베이션 되었다.

효소가 Co^{2 +} 또는 Fe^{3 +}로 결합된 12-16mg의 ω-TA-LCAA CPG, ω-TA-HybCPG VBC 및 ω-TA-HybCPG copo 각각이 오비탈 쉐이커 상에서 1분 동안 4mL의 수성 완충액(HEPES 100mM, pH 7.0) 중에서 인큐베이션되었다. 이 시간 이후, 효소가 용액 내에서 검출되지 않았다. 이는 고정화된 물질의 침전 이후 1mL의 용액을 사용하는 활성 분석에 의해 측정되었다. 잔여 3mL를 갖는 제조물을 오비탈 쉐이커 상에서 24시간 동안 인큐베이션시켰고, 이후 제조물의 일부에서 용액 내 측정 가능한 양의 효소가 나타났다.

용액의 1mL를 채취하고, 1mL 분석 혼합물(동일한 완충액 내에 용해된 1-페닐에틸아민(10mM), 피루브산 나트륨(5mM) 및 PLP(1μM))을 첨가하고, 5분 동안 245nm에서 시간에 따른 흡광도 변화를 측정함으로써, 활성 분석이 수행되었다. 또한, 순수 완충액으로 블랭크 반응이 시험되었다. 이 파장에서, 트랜스아미네이션 반응으로부터의 생성물인 아세토페논의 형성이 12mM^-1cm^-1의 흡광 계수로 흡광도의 증가로서 모니터링될 수 있다[문헌Schaetzle et al., Anal. Chem. 2009, vol. 81, pp. 8244-8248]. 속도론적 상수가 공지되어 있기 때문에[문헌 Cassimjee et al., Org. Biomol. Chem. 2012, vol. 10, pp. 5466-5470], 침출된 효소의 양이 계산될 수 있다. 침출 실험 이전에, 고정화된 제조물 내 결합된 효소의 양이 작용 부위 정량화에 의해 측정되었다. 각 물질에 대하여 24시간 뒤 침출의 양은 표 9에 나타내었다.

표 9
물질	pH 7.0에서 24시간 후 침출된 효소( % )
ω-TA-LCAA CPG(Co2 +)	7.9
ω-TA-HybCPG VBC(Co2 +)	0.4
ω-TA-HybCPG copo(Co2 +)	n/d
ω-TA-LCAA CPG(Fe3 +)	3.4
ω-TA-HybCPG VBC(Fe3 +)	n/d
ω-TA-HybCPG copo(Fe3 +)	n/d

상기 값들은 시험된 조건에서 킬레이트화된 금속 이온으로서 Fe^{3 +}이 적은 효소 침출을 야기함을 나타낸다. 담체로서 HybCPG copo는 킬레이트화된 금속 이온으로서 Co^{2 +} 또는 Fe^{3 +}과 함께 선택된 조건에서 검출 가능한 효소 침출을 야기하지 않았다. 유리 표면을 갖는 LCAA CPG는 가장 높은 양의 효소 침출을 나타냈다. 이는 유리 표면에 결합하는 비특이적 효소의 결과일 수 있다.

실시예 11

HybCPG copo(Co ²⁺ )를 갖는 폴리히스티딘 태그화된 ω- TA의 정제

50μg/mL의 카나마이신의 첨가를 갖는 100mL 루리아-베르타니 배지 내에서 ω-TA의 펠릿화된 IPTG가 유도한 24시간 배양으로부터의 세포 용해물(5.0mL)이 BugBuster™의 사용에 의해 제조되었다. 초과량의 조효소(PLP)가 첨가되었고, 용액은 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션되었다. 이어서 초과량의 PLP(효소에 미결합)는, PD10 칼럼(2회)을 사용하여, 목적한 전효소(holoenzyme), 자연 단백질 및 다른 불순물을 함유하는 7.0mL의 용액의 HEPES 완충액(50mM, 500mM NaCl, pH 8.2(완충액 1))으로의 완충액 변화에 의해 제거되었다.

컬럼은 26μmol/g의 Co^{2 +}을 함유하는 204mg의 HybCPG copo(Co²⁺)로 충진되었다. 소재는 7.0mL의 완충액 1의 첨가에 의해 미리 습윤하게 하였고, 통과액은 제거되었다.

활성 전효소는 395nm, ε=8.1mM^-1cm^-1(문헌[Cassimjee et al., ACS Catal. 2011, vol. 1, pp. 1051-1055])에서 분광분석적으로 측정되었다. 후속 흡광도 측정에서, 용해물은 컬럼에 첨가되었고, 통과액이 수집되었다. 컬럼의 통과 이전 및 이후의 용해물의 이 파장에서의 흡광도 차이가 0.62로 측정되었다(모든 측정은 1.0cm 경로 길이로 수행되었다). 이는 컬럼 내에서 HybCPG copo(Co^{2 +}) 담체에 현재 결합된 29mg의 효소에 상응한다.

컬럼은 이어서 7mL의 완충액 1로 세척되었다. 블랭크로서의 완충액 1로, 흡광도가 0.11로 측정된 통과액이 수집되었다. 이는 컬럼으로부터 세척된 효소의 5mg에 상응하고, 아마도 비특이적으로 결합 또는 비결합 효소로 인한 것으로, 컬럼 내 24mg의 결합 효소를 남겼다.

컬럼 내 결합된 효소의 분리는 5.0mL의 트리스 완충액(50mM, 500mM 이미다졸, pH 7.5(완충액 2))의 적용에 의해 수행되었다. 통과액은 수집되었고, 조효소의 초과량이 다시 첨가되었다. 상기 기술한 바와 같이, 초과량의 PLP는 PD10 컬럼을 사용하여, 용해된 전효소를 갖는 7mL의 총 부피의 용액을 제공하는 완충액 1로의 완충액 변화에 의해 제거되었다. 흡광도는 0.465로 측정되었다. 이는 22mg의 정제된 효소 또는 92%의 수율에 상응한다. 용액은 숙주-세포 단백질에 의한 오염이 상당히 제거된 것으로 나타났고, 이는 SDS-PAGE에 의해 확인되었다.

Claims (33)

1. 담체 및 담체 상에 고정화된 하나 이상의 단백질을 포함하는 고정화된 단백질 소재로서, 상기 담체는 친화성 매트릭스가 부착되는 담체 소재를 포함하며, 상기 담체 소재는 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:
   (a) 조절된 다공성 유리(CPG); 및
   (b) 하이브리드 조절된 다공성 유리(하이브리드 CPG);
   상기 하나 이상의 단백질은 친화성 태그를 포함하고, 친화성 매트릭스에 특이적 친화성 결합을 통해 담체 상에 고정화되며, 상기 친화성 태그는 폴리히스티딘 태그이며, 상기 친화성 매트릭스는 킬레이트화된 금속 이온을 함유하는 것인, 고정화된 단백질 소재.
2. 제1항에 있어서, 상기 킬레이트화된 금속 이온이 Co²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, 또는 Fe³⁺인 고정화된 단백질 소재.
3. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 단백질이 효소인 고정화된 단백질 소재.
4. 제3항에 있어서, 2 이상의 고정화된 효소를 포함하는 고정화된 단백질 소재.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 추가로 금속 나노입자를 포함하는 고정화된 단백질 소재.
6. 제5항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 전이 금속 나노입자인 고정화된 단백질 소재.
7. 제5항에 있어서, 상기 금속 나노입자는 코발트, 니켈 및 팔라듐 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는 고정화된 단백질 소재.
8. 친화성 매트릭스가 부착되는 담체 소재를 제공하는 단계로서, 상기 담체 소재는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 단계:
   (a) 조절된 다공성 유리(CPG); 및
   (b) 하이브리드 조절된 다공성 유리(하이브리드CPG);
   및
   단백질을 친화성 매트릭스에 특이적 친화성 결합을 통해 담체 상에 고정시키는 단계로서, 상기 친화성 메트릭스는 킬레이트화된 금속 이온을 포함하는 것인 단계를 포함하는 단백질을 고정화하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 킬레이트화된 금속 이온은 Co²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, 또는 Fe³⁺인 단백질을 고정화하는 방법.
10. 고정화된 단백질 소재의 제조 방법으로서,
    i) 아미노 기를 함유하는 담체 소재를 제공하는 단계로서, 상기 담체 소재는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 단계:
    (a) 조절된 다공성 유리(CPG); 및
    (b) 하이브리드 조절된 다공성 유리(하이브리드CPG);
    ii) 담체 소재를 2,4-디하이드록시아세토페논과 반응시킴으로써 디히드록시페닐 기를 담체 소재에 연결시키는 단계;
    iii) 폴리히스티딘-태그화된 단백질의 결합을 가능하게 하는 금속 이온과 디히드록시페닐 기 사이의 킬레이트 착체를 형성하는 단계; 및
    iv) 폴리히스티딘-태그화된 효소를 상기 금속 이온을 포함하는 담체 소재에 결합시키는 단계;
    를 포함하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 담체 소재에 전이 금속 나노입자를 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
12. (a) 제3항에 따른 고정화된 효소 소재를 제공하는 단계, 및
    (b) 상기 고정화된 효소 소재를 하나 이상의 기질에 접촉하도록 이동시켜, 반응을 촉매하도록 하는 단계
    를 포함하는, 효소-촉매화 반응을 촉매하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 킬레이트화된 금속 이온이 Co²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, 또는 Fe³⁺인, 효소-촉매화 반응을 촉매하는 방법.
14. 제12항에 있어서, 2 이상의 상이한 효소들이 담체 상에 고정화되고, 상기 상이한 효소들이 각각 상이한 반응을 촉매할 수 있는 것인, 효소-촉매화 반응을 촉매하는 방법.
15. 제12항에 있어서, 상기 담체가 추가적으로 금속 나노입자를 포함하는, 효소-촉매화 반응을 촉매하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 금속 나노입자가 전이 금속 나노입자인, 효소-촉매화 반응을 촉매하는 방법.
17. 제15항에 있어서, 상기 금속 나노 입자는 코발트, 니켈 및 팔라듐 나노입자로 구성된 군으로부터 선택되는, 효소-촉매화 반응을 촉매하는 방법.
18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 효소-촉매화 반응이 수성 조건 하에서 수행되는, 효소-촉매화 반응을 촉매하는 방법.
19. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 효소-촉매화 반응이 유기 용매 중에서 수행되는, 효소-촉매화 반응을 촉매하는 방법.
20. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 효소-촉매화 반응이 연속적인 유동 반응인, 효소-촉매화 반응을 촉매하는 방법.
21. 제14항에 있어서, 효소-촉매화 반응이 캐스케이트 반응인, 효소-촉매화 반응을 촉매하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 제1 효소를 위한 기질이 제2 효소를 위한 기질로 변형되는 것인, 효소-촉매화 반응을 촉매하는 방법.
23. 제21항에 있어서, 기질이 제1 효소에 의해 변형되고, 제1 효소를 위한 공동-인자가 제2 효소에 의해 다시 생성되는 것인, 효소-촉매화 반응을 촉매하는 방법.
24. 제21항에 있어서, 전이 금속이 담체 상에 고정화되고, 상기 방법이 효소-촉매화 반응 및 전이 금속-촉매화 반응을 포함하는 다단계 반응인, 효소-촉매화 반응을 촉매하는 방법.
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