KR20140123552A - 당 함량이 감소된 시럽 및 당 함량이 감소된 시럽을 제조하는 방법 - Google Patents

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KR20140123552A
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로히트 메데카
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테이트 앤드 라일 인그리디언츠 어메리카즈 엘엘씨
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Abstract

유리하게 저 점도를 갖는 당 함량이 감소된 시럽이 특정 유형의 알파 아밀라아제 효소를 사용한 전분 또는 전분성 물질의 가수분해에 의해 제조되며, 이는 낮은 DP1-2 및 낮은 DP11+ 함량을 갖는 사카라이드 분포를 유도한다. 시럽의 DP4 함량은 상기 언급된 알파 아밀라아제 효소와 조합된 말토테트라제닉 알파 아밀라아제 효소를 사용함으로써 유리하게는 증가될 수 있다. 시럽은 식품, 음료, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 관련 제품, 약제 및 화장 조성물의 생산에 유용하며, 고강도의 감미제와 조합되어 통상적인 옥수수 시럽에 대해 치환될 수 있는 조성물을 제공할 수 있다.

Description

당 함량이 감소된 시럽 및 당 함량이 감소된 시럽을 제조하는 방법 {REDUCED SUGAR SYRUPS AND METHODS OF MAKING REDUCED SUGAR SYRUPS}
본 발명은 식품, 음료, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 관련 제품 (animal health and nutrition) 및 화장품 성분으로서 유용한, 당 함량 및 점도가 비교적 낮은 시럽 및 이러한 시럽을 제조하는 방법에 관한 것이다.
당 함량이 높은 소비자 제품은 비만 및 관련된 건강 질환과의 이들의 알려진 관련성으로 인해 많은 비판을 받고 있다. 소비자는 제품의 성분 라벨에서 당 함량이 낮은 제품을 점점 더 찾고 있다. 라벨용으로, 당은 모노 또는 다이머 카보하이드레이트 (DP1-2, 여기서, DP는 "중합화 정도"임)로서 명확하게 규정된다. 낮은 당 함량 요구를 충족시키기 위해, 식품 회사들은 이들의 포뮬레이션의 당 함량을 감소시킬 성분 포뮬레이션을 활발히 조사하고 있다. 현재 시중의 옥수수 시럽의 당 함량은 95% 정도로 높을 수 있다 (HFCS); 전형적으로, 당 함량은 40% 내지 95% 범위이다. 63 덱스트로오스 당량 (DE) 옥수수 시럽 예컨대, Sweetose® 4300은 64-66%의 당 함량을 지닐 것이며, 말토오스 고함량 시럽은 당 함량 범위가 40-60% 범위일 수 있다. 이들 시럽은 현재 증량제, 감미제, 질감 개선제 (texture modifiers) 및 점도 조절제로서 사용되며, 식품 적용에서 수분 조절을 위해 사용된다. 벌킹 시럽 (bulking syrup)에 있어서, 점도는 중요한 물리적 특성이다. 옥수수 시럽에서 당 함량을 감소시키는 한 방법은 당을 더욱 고급의 카보하이드레이트 폴리머 (DP>11)로 대체시키는 것이다. 그러나 이는 이들 시럽의 총괄성 특히, 점도를 현저하게 변화시킬 수 있다. 점도에서의 변화는 식품의 미학적 가치에 악영향을 끼칠 수 있을 뿐만 아니라 특별한 제조 장치의 요구가 발생한다. 이러한 문제점들을 피하기 위해, 실질적으로 당 함량은 더 낮으나 63 DE 옥수수 시럽의 점도와는 유사한 점도를 갖는 옥수수 시럽이 요구된다.
일부 회사들은 현재 시럽의 당 함량을 감소시키기 위해 폴리올을 사용하고 있다. 그러나, 폴리올은 비용이 많이 발생할 수 있으며, 이들중 다수는 바람직하지 않은 위장관 부작용을 갖는다.
본 발명은 당 함량이 감소된 더 낮은 점도의 시럽을 제조하는 방법으로서, 전분 또는 전분성 물질을 가수분해하는데 효과적인 시간 동안 전분 또는 전분성 물질을 수성 매질중에서 제 1 알파 아밀라아제 효소와 접촉시켜, 약 10% 내지 약 25%의 DP1 + DP2 함량, 약 70% 내지 약 90%의 DP3-11 함량, 및 0% 내지 약 15%의 DP11+ 함량을 갖는 사카라이드 분포를 지닌 반응 생성물을 제공하는 것을 포함하며, 제 1 알파 아밀라아제 효소는 진뱅크 수탁 (GenBank Accession) 번호 제 AF504065호와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드의 효소적 활성 단편을 포함하는 아미노산 서열인 방법을 제공한다.
상기 언급된 방법은 하기 추가의 단계중 하나 이상을 포함할 수 있다: 반응 생성물을 여과하는 단계; 반응 생성물을 활성탄과 접촉시키는 단계; 반응 생성물을 이온 교환 수지와 접촉시키는 단계; 반응 생성물로부터 물을 제거하여 약 65% 내지 약 85%의 건조 고형물 함량을 달성하는 단계; 반응 생성물을 막을 이용한 한외여과로 처리하는 단계; 및/또는 반응 생성물을 하나 이상의 고강도 감미제와 조합시키는 단계. 일 구체예에서, 본 방법은 반응 생성물을 여과하는 단계, 반응 생성물을 활성탄 및 이온 교환 수지와 접촉시키는 단계, 및 반응 생성물로부터 물을 제거하여 약 65% 내지 약 85%의 건조 고형물 함량을 달성하는 단계의 추가의 단계들을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 방법은 전분 또는 전분성 물질이 제 1 알파 아밀라아제 효소 이외의 어떠한 다른 효소 또는 산과 접촉되지 않도록 수행된다.
상기 언급된 방법의 일 양태에서, 수성 매질은 초기에 약 5 내지 약 7의 pH를 갖는다. 접촉 단계는 예를 들어, 약 75℃ 내지 약 120℃의 온도에서 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 언급된 방법은 전분 또는 전분성 물질, 수성 매질 및 제 1 알파 아밀라아제 효소의 슬러리가 초기에 약 100℃ 내지 약 115℃의 제 1 온도에서 가열되고 예를 들어, 젯 쿠킹 (jet cooking)되고, 이어서 약 80℃ 내지 약 95℃의 제 2 온도에서 유지되도록 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 제 1 알파 아밀라아제 효소가 전분 또는 전분성 물질의 양의 0.01 내지 약 0.2 중량%의 양으로 상기 언급된 방법에 사용된다.
상기 방법에 사용된 전분은 옥수수 전분일 수 있다. 전분성 물질은 옥수수로부터 유래할 수 있다.
일 구체예에서, 수득된 반응 생성물의 DP11+ 함량은 0-5%일 수 있다. 사카라이드는 약 35% 이상의 DP4 함량을 가질 수 있다. 일 구체예에서, 사카라이드는 약 35% 이상의 DP4 함량을 가지며, DP5 내지 DP10 각각에 대해서 약 6% 미만의 함량을 갖는다.
일 구체예에서, 상기 언급된 방법에 의해 수득된 반응 생성물은, 반응 생성물의 건조 고형물 함량이 80%인 경우, 20℃에서 약 1500 poise 미만의 점도를 갖는다.
상기 언급된 방법은 전분 또는 전분성 물질이 말토테트라제닉 알파 아밀라아제와 추가로 접촉되는 단계를 포함할 수 있다 (즉, 제 1 알파 아밀라아제 효소 뿐만 아니라 말로테트라제닉 알파 아밀라아제와 접촉됨).
상기 언급된 방법의 일 구체예에서, 전분 또는 전분성 물질, 수성 매질 및 제 1 알파 아밀라아제 효소의 슬러리가 초기에 젯 쿠킹되어 액화된 전분 혼합물을 제공하고, 액화된 전분 혼합물은 후속하여 말토테트라제닉 알파 아밀라아제와 접촉된다. 제 1 알파 아밀라아제 효소는 말토테트라제닉 알파 아밀라아제와의 후속 접촉 동안 액화된 전분 혼합물중에 존재할 수 있다. 말토테트라제닉 알파 아밀라아제는 슈도모나스 사카로필라 말토테트라오히드롤리아제 (Pseudomonas saccharophila maltotetraohydrolyase)의 변이체일 수 있다. 말토테트라제닉 알파 아밀라아제는 WO 2010/132157에 기재된 SEQ ID NO.2의 아미노산 서열을 갖는 야생형 말토테트라오히드롤리아제의 변이체로서,
(i) G223E 아미노산 치환, 및
(ii) WO 2010/132157에 기재된 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열과 비교하여 24개 이하의 아미노산 결실, 부가, 삽입 또는 치환; 또는
(iii) WO 2010/132157에 기재된 SEQ ID NO.2의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 가지며,
알파-아밀라아제 활성을 갖는 변이체일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 전분 또는 전분성 물질은 말토테트라제닉 알파 아밀라아제, 예컨대, 슈도모나스 사카로필라 말토테트라오히드롤리아제의 변이체와 추가로 접촉된다 (즉, 전분 또는 전분성 물질은 제 1 알파 아밀라아제 효소 뿐만 아니라 말토테트라제닉 알파 아밀라아제와 접촉된다). 전분 또는 전분성 물질, 수성 매질 및 제 1 알파 아밀라아제 효소의 슬러리는 초기에 젯 쿠킹되어 액화된 전분 혼합물을 제공할 수 있으며, 이러한 액화된 전분 혼합물은 후속하여 말토테트라제닉 알파 아밀라아제와 접촉된다. 이러한 방식으로의 이들 상이한 효소의 조합물의 사용은, 생성 시럽중에 당 (DP1+2) 및 더욱 고급의 올리고사카라이드 (DP11+)의 형성을 감소시키거나 최소화시키면서 DP4의 함량을 증가시키거나 최대화시키는 것을 돕는 방식으로 전분 또는 전분성 물질의 가수분해를 달성한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 당 함량이 감소된 더 낮은 점도의 시럽을 제조하는 방법으로서,
(a) 전분 또는 전분성 물질을 수성 매질중에서 제 1 알파 아밀라아제 효소와 선택적으로 고전단 조건하에 예컨대, 젯 쿠킹하에 제 1 온도에서 접촉시켜 젤라틴화된 전분의 유체 매스를 제공하고;
(b) 약 10% 내지 약 25%의 DP1 + DP2 함량, 약 70% 내지 약 90%의 DP3-11 함량, 및 0% 내지 약 15%의 DP11+ 함량을 갖는 사카라이드 분포를 지니는 반응 생성물을 제공하기에 효과적인 시간 동안 제 2 온도에서 유체 매스를 유지시키고,
제 1 알파 아밀라아제 효소는 진뱅크 수탁 번호 제 AF504065호와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드의 효소적 활성 단편을 포함하는 아미노산 서열이며;
(c) 하나 이상의 정제 또는 처리 단계로 반응 생성물을 처리하여 당 함량이 감소된 더 낮은 점도의 시럽을 제공하는 것을 포함하며,
본 방법에 사용된 유일한 유형의 효소는 알파 아밀라아제인 방법을 제공한다.
단계 (a)는 예를 들어, 90℃ 또는 그 초과 또는 100℃ 또는 그 초과, 예를 들어, 약 100℃ 내지 약 115℃, 약 104℃ 내지 약 108℃, 또는 약 107℃ 내지 약 110℃의 온도에서 수행될 수 있다. 단계 (a)는 예를 들어, 약 2 내지 약 20분의 시간 동안 수행될 수 있다. 단계 (b)는 예를 들어, 약 80℃ 내지 약 100℃, 약 80℃ 내지 약 95℃, 또는 약 90℃ 내지 약 95℃의 온도 또는 90℃ 초과의 온도에서 수행될 수 있다. 단계 (b)는 예를 들어, 약 1.5 내지 약 5 시간, 약 2 내지 약 4 시간, 또는 약 3 시간의 시간 동안 수행될 수 있다. 제 2 온도는 제 1 온도 보다 더 낮을 수 있다.
본 발명은 또한 약 10% 내지 약 25%의 DP1 + DP2 함량, 약 70% 내지 약 90%의 DP3-11 함량, 및 0% 내지 약 15%의 DP11+ 함량을 제공하기 위한 사카라이드 분포를 지니는 사카라이드와 물을 포함하는 시럽에 관한 것이며, 여기서 시럽은 시럽의 건조 고형물 함량이 80%인 경우 20℃에서 약 1400 poise 이하의 점도를 갖는다. 일 양태에서, 사카라이드는 적어도 약 35%의 DP4 함량 및 DP5 내지 DP10 각각에 대해서는 약 6% 미만의 함량을 제공하기 위한 사카라이드 분포를 지닌다. 또 다른 양태에서, 사카라이드는 10% 이하 또는 5% 이하의 DP11+ 함량을 제공하기 위한 사카라이드 분포를 지닌다.
또한, 상기 언급된 시럽(들) 및 하나 이상의 식품, 음료, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 관련 제품, 약제 또는 화장품 성분을 포함하는 식품, 음료, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 관련 제품, 약제 또는 화장품이 본 발명에 의해 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태는 시럽(들) 및 하나 이상의 고강도 감미제를 포함하는 감미제 제품에 관한 것이다.
일 구체예에서, 물 및 사카라이드를 포함하는 시럽이 제공되며, 상기 사카라이드는 DP1 1-4%; DP2 10-15%; DP3 9-13%; DP4 7-11%; DP5 6-10%; DP6 13-19%; DP7 12-17%; DP8 4-7%; DP9 3-7%; DP10 2-6%; DP11 7-15%; DP11+ 0-4% (총 100%에 상응함)의 사카라이드 분포를 지닌다. 또 다른 구체예에서 상기 언급된 시럽 및 하나 이상의 식품, 음료, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 관련 제품, 약제 또는 화장품 성분을 포함하는 식품, 음료, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 관련 제품, 약제 또는 화장품이 제공된다. 추가의 또 다른 양태는 상기 언급된 시럽 및 하나 이상의 고강도 감미제를 포함하는 감미제 제품을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 식품, 음료, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 관련 제품, 약제 및 화장 조성물을 위한 당 함량이 감소된 더 낮은 점도의 시럽을 제조하는 방법으로서,
(a) 전분 또는 전분성 물질, 제 1 알파 아밀라아제 효소 및 수성 매질의 슬러리를 100℃ 내지 115℃의 제 1 온도에서 젯 쿠킹하고;
(b) 슬러리를 80℃ 내지 95℃의 제 2 온도에서 10% 내지 25%의 DP1 + DP2 함량, 70% 내지 90%의 DP3-11 함량, 및 0% 내지 15%의 DP11+ 함량을 갖는 사카라이드 분포를 지닌 반응 생성물을 제공하는데 효과적인 시간 동안 유지시키고,
제 1 알파 아밀라아제 효소는 진뱅크 수탁 번호 제 AF504065호와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드의 효소적 활성 단편을 포함하는 아미노산 서열이며;
(c) 하나 이상의 정제 또는 처리 단계로 반응 생성물을 처리하여 당 함량이 감소된 더 낮은 점도의 시럽을 제공하는 것을 포함하며,
본 방법에 사용된 유일한 유형의 효소가 알파 아밀라아제인 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 공정의 예시적인 구체예를 도식 형태로 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명
본원에 사용된 바와 같은 용어 "DPN"은 중합화 정도를 나타내며, 여기서, N은 사카라이드의 모노머 유닛 (즉, 글루코오스 또는 덱스트로오스 유닛)의 개수이며, 따라서, DPN은 사카라이드의 조성을 반영한다. 예를 들어, DP1은 모노사카라이드이며; DP2는 디사카라이드이며; DP1+2은 모노-사카라이드와 디-사카라이드의 전체이며; DP3-11은 DP3 내지 DP11의 전체이며; DP11+은 분자당 11개가 넘는 모노머 유닛을 함유하는 사카라이드들의 전체이다. DPN은 전체 사카라이드 건조 중량 기반 (dry weight basis)에 대한 개별 사카라이드의 중량%로서 나타낸다. 생성물의 DPN 조성은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 측정하였다. 샘플을 Milli-Q 물을 사용하여 약 5% 고형물로 희석하고, 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 20 마이크로리터의 샘플을 주입하였다. 굴절률 검출기에 결합된 실버 형의 스티렌 디비닐 벤젠 수지 기반 칼럼인 Bio-Rad HPX 42A 칼럼을 사용하여 분리를 달성하였다. 42A 칼럼은 HFCS를 분석하는데 사용된 칼럼 보다 더욱 약하게 가교된다. 더 낮은 가교는 수지에 개방 구조를 부여하며, 이는 더 높은 분자량의 구조물로 더욱 침투가능하게 한다. 수지상의 실버 카운터 이온과 당 상의 하이드록실 기 사이의 리간드-리간드 반응으로 결합된 것은 20분 미만의 진행 시간으로 DP12 까지의 분리를 가능하게 한다. 말토펜토오스를 초과하는 시중에서 입수가능한 순수한 당 기준물이 거의 존재하지 않기 때문에 정량은 반응 인자를 갖지 않는 면적율을 사용하여 수행하였다. 모든 이러한 당에 대한 굴절률 반응이 매우 유사할 것으로 예상된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "DS"는 컴퓨터 프로그램 Refractive Index Dry Substance (RI-DS)을 사용하여 측정된 바와 같은 물질의 건조 고형물 백분율을 나타낸다 (Standard Analytical Method E-54, Corn Refiners Association, 6th Edition, 1977, E-54, pp. 1-11).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "당"은 모노- 및/또는 디-사카라이드를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "시럽"은 사카라이드의 수용액을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "점도"는 유체의 유동에 대한 저항성을 나타낸다. 시럽의 점도는 전형적으로 온도 및 고형물 농도에 의해 영향을 받는다. 점도는 주어진 온도 및 주어진 % DS에서 poise (P) 또는 centipoise (cps)의 단위로 나타낸다.
본 발명의 시럽 제조 방법은 공급원료 또는 출발 물질로서 전분 또는 전분성 물질을 사용한다. 전분 또는 전분성 물질은 당해 기술분야에서 관행적으로 실시되는 임의의 많은 방법을 이용하여 많은 다양한 소스로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 전분 또는 전분성 물질은 옥수수 (예를 들어, 마치종 옥수수) 또는 또 다른 시리얼 공급원료 예컨대, 쌀, 밀, 보리, 귀리 또는 수수로부터 널리 공지된 습식-제분 및 건식-제분 기법을 통해 수득될 수 있다. 습식 제분에서, 옥수수 또는 기타 공급원료는 일정 기간 동안 담가둔 후, 분쇄하여 오일을 함유하는 싹을 다른 성분으로부터 분리할 수 있다. 싹 이외의 나머지 물질은 전분, 단백질 (예를 들어, 글루텐) 및 섬유를 포함하는 슬러리이며, 이들은 다양한 스트림으로 분리될 수 있다. 전분 스트림은 또한, 건식 제분 기법을 통해 옥수수 또는 다른 전분-풍부 공급원료로부터 수득될 수 있으며, 상기 기법은 또한 당해 기술분야에서 관행적으로 실시되는 것이다. 또한, 전분 스트림은 뿌리 또는 괴경 공급원료 예컨대, 감자 또는 카사바로부터 습식-제분 또는 건식-제분 공정을 통해 수득될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 이점은 전분 또는 전분성 물질이 단일의 특정 유형의 효소를 사용하여 본원에서 상기 기술된 바와 같이 바람직한 사카라이드 분포 및 점도를 갖는 생성물로 직접적으로 전환될 수 있다는 점이다. 즉, 본 발명의 일 구체예에서, 당 함량이 감소된 더 낮은 점도의 시럽을 제조하는 방법에 사용된 유일한 유형의 효소는 알파 아밀라아제이다 (비록 뒤에 더욱 상세히 설명될 것이지만, 두개의 상이한 알파 아밀라아제 효소가 본 발명의 일 구체예에서 사용될 수 있다). 이는 당 함량이 감소된 저 점도의 시럽을 제조하기 위해 두 단계가 요구되는 (예를 들어, 산 또는 제 1 유형의 효소를 사용한 1차 액화 단계 이어서, 제 2 유형의 효소를 사용한 2차 가수분해 단계) 당해 기술분야에서 이미 공지된 방법과 대비된다.
통상적으로, 알파-아밀라아제는 전분으로부터 발효성 당을 제조하기 위한 공정에 사용되며, 여기서 전분은 알파-아밀라아제로 처리되어 액화물 (liquefact)을 만들고, 이어서 후속하여 제 2 효소 즉, 글루코아밀라아제와 반응시켜 중간체 액화물을 발효성 당 (예를 들어, 글루코오스)으로 전환시킨다 (예를 들어, U.S. 특허 제 7,273,740 호, 제 7,666,633 호, 및 제 7,659,102호 참조). 그에 반해, 본 발명의 또 다른 이점은 적합한 조건하에 진뱅크 수탁 번호 제 AF504065호와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 갖는 알파 아밀라아제 또는 이들의 효소적 활성 단편을 포함하는 아미노산 서열을 사용하여 생성될 수 있는 액화물이 본 발명의 당 함량이 감소된 저 점도의 시럽의 생성에 직접 이용될 수 있다는 신규하고 예상치 못한 발견에 있다. 전분 또는 전분성 물질을 본원에 기술된 유형의 시럽으로 전환시키는데 단일 효소의 사용 능력은 제작 공정을 단순화시키며, 이에 의해 비용이 감소된다.
본 발명에 사용된 제 1 알파 아밀라아제 효소는 진뱅크 수탁 번호 제 AF504065호와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드의 효소적 활성 단편을 포함하는 아미노산 서열이다. 본 발명에서 이러한 용도에 적합한 알파 아밀라아제 효소는 당해분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, U.S. 특허 제 7,273,740호, 제 7,666,633호, 및 제 7,659,102호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 모든 면에서 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 이러한 알파 아밀라아제는 1000 내지 2000의 분자량 범위내에 집중된 사카라이드의 단봉형 분자량 프로파일을 갖는 액화 생성물을 생성할 수 있다. 상기 언급된 특허에서 SEQ ID No. 1은 본 발명을 실시하는데 유용한 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 기술한다. 이와 같이, 본 발명에서 제 1 알파 아밀라아제 효소로서 사용된 폴리펩티드는 U.S. 특허 제 7,273,740호, 제 7,666,633호, 및 제 7,659,102호에 기술된 바와 같은 SEQ ID No. 1과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드 또는 이들의 효소적 활성 단편일 수 있다. 상기 언급된 특허에서 SEQ ID No. 2는 본 발명을 실시하는데 유용한 폴리펩티드에 존재할 수 있는 아미노산 서열을 기술하고 있다. 이와 같이, 본 발명에서 제 1 알파 아밀라아제 효소로서 사용될 수 있는 폴리펩티드는 U.S. 특허 제 7,273,740호, 제 7,666,633호, 및 제 7,659,102호에 기술된 바와 같은 SEQ ID No. 2와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 또는 이들의 효소적 활성 단편을 포함할 수 있다. 요망에 따라, 제 1 알파 아밀라아제 효소는 적합한 지지체 상에 또는 적합한 매트릭스 내에 고정될 수 있다.
본 발명의 공정에 사용되는 제 1 알파 아밀라아제 효소의 양은 변화될 수 있으며, 요망되는 반응 속도 및 반응 조건 등에 따라 선택될 수 있으나, 일반적으로 반응되는 전분 또는 전분성 물질의 건조 중량을 기준으로 하여 약 0.01 내지 약 0.2% 또는 약 0.1 내지 약 0.2%의 범위내에 있을 것이다.
전분 또는 전분성 물질은 물과 조합되어 전형적으로 약 25 중량% 내지 약 40 중량% (예를 들어, 약 32 내지 약 35 중량%) 전분 또는 전분성 물질을 함유하는 슬러리를 형성할 수 있다. 수성 매질의 pH는 하나 이상의 산 또는 염기의 첨가에 의해 요망에 따라 조절될 수 있다. 전형적으로, 수성 매질의 pH는 어느 정도 산성 (즉, 약 산성) 내지 중성 예를 들어, 약 4 내지 약 7 (일 구체예에서, 약 5.5 내지 약 6)의 범위 내에 있는 것이 바람직할 것이다.
본 발명의 공정은 적어도 2개의 가열 스테이지를 사용하여 수행될 수 있으며, 1차 가열 스테이지에서, 전분 또는 전분성 물질의 수성 슬러리 및 제 1 알파 효소는 비교적 고온 (예를 들어, 100℃ 또는 그 초과)에서 비교적 짧은 기간 동안 가열되고, 후속하여 2차 가열 스테이지에서, 수성 슬러리는 1차 가열 스테이지보다 더 낮은 온도 (예를 들어, 80℃ 내지 95℃)에서 1차 가열 스테이지보다 더 긴 기간 동안 가열된다. 전분을 적어도 부분적으로 용해시키거나 젤라틴화시키는데 효과적인 조건하에서 1차 가열 스테이지를 수행하는 것이 종종 유리할 것이다. 예를 들어, 제 1 알파 아밀라아제 효소와 조합한 후, 슬러리는 먼저 고전단 쿠킹 단계로 처리될 수 있으며, 여기서 고전단이 전분에 적용되면서 슬러리는 비교적 고온 (예를 들어, 약 90℃ 또는 그 초과, 또는 약 95℃ 또는 그 초과, 또는 약 100℃ 또는 그 초과, 또는 약 105℃ 또는 그 초과, 그러나 전형적으로는, 약 115℃ 이하)에서 상대적으로 짧은 기간 (예를 들어, 약 2 내지 약 20분) 동안 가열된다. 고전단 쿠킹 단계는 가압하 즉, 대기압보다 높은 압력에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 5 kg/cm2 (예를 들어, 약 8 내지 약 11 kg/cm2)의 압력이 이용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 고전단 조건은 전분을 젤라틴화 (적어도 부분적으로 가용화) 시키기에 효과적이도록 선택된다. 젯 쿠킹 기법이 이용될 수 있으며, 여기서 슬러리는 좁은 오리피스 (orifice)를 통과하면서 고온 및 고압 (즉, 초대기압) 하에서 스팀과 혼합된다. 스팀의 양은 완전한 스팀 응축이 달성되도록 조절될 수 있거나, 대안적으로, 스팀의 양은 과량으로 존재할 수 있다. 스팀 압력은 예를 들어, 약 5 bar 내지 약 8 bar (절대)일 수 있다. 젯 쿠커를 통한 스팀의 통과 및 전분의 거의 즉각적인 가열로부터 유도된 강한 난류는 전분 과립의 파열 및 분해를 촉진한다. 슬러리의 점도는 고분자량 전분 사슬의 기계적 전단으로 인해 낮아진다. 이렇게 하여 전분 슬러리는 젤라틴화되고 묽게 될 수 있다.
예를 들어, 슬러리는 젯 쿠킹 단계에서 좁은 오리피스를 갖는 스팀 젯을 통해 펌핑되어 온도를 약 100℃ 내지 약 115℃ 사이 (예를 들어, 약 104℃ 내지 약 108℃ 또는 약 107℃ 내지 약 110℃)로 신속히 상승시킬 수 있다. 전분은 즉시 젤라틴화되고, 제 1 알파 아밀라아제의 존재로 인해, 효소에 의한 글리코시드 결합의 무작위적 가수분해를 통해 용이하게 펌핑되는 유체 매스로 부분적으로 탈중합된다. 일 구체예에서, 스팀 젯을 통해 통과한 후 전분 슬러리는 약 5 내지 약 8 분의 기간 동안 테일 라인 (tail line)에 머무를 수 있다. 그 후, 유체 매스는 용기 예컨대, 교반 탱크로 옮겨질 수 있으며, 여기서 전분과 제 1 알파 아밀라아제 효소와의 반응이 요망되는 사카라이드 분포가 달성될 때까지 제 2의 다소 더 낮은 온도 (예를 들어,약 80-95℃)에서 계속될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 유체 매스의 온도는 미생물 성장을 억제하기 위해 2차 가열 단계 동안 90℃ 초과로 유지된다. 전형적으로, 유체 매스의 pH는 2차 가열 단계로의 처리 전에 조절되거나 변경되지 않는다. 이러한 2차 가열 단계에서는, 전형적으로 고전단 조건 및 대기압 초과 압력이 이용되지 않는다. 예를 들어, 유체 매스를 낮은 전단 조건 및 대기 (주위) 압력하에서 교반할 수 있거나, 다르게는 혼합 또는 진탕시킬 수 있다. 일반적으로, 증가된 반응 시간은 더 높은 정도의 탈중합화를 유도할 것이며, 이는 더 낮은 함량의 DP11+ 사카라이드를 제공하며, 따라서, 생성 시럽의 점도를 감소시킨다. 이와 같이, 알파 아밀라아제 처리는 본 발명의 다양한 구체예에서, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 또는 약 0%의 DP11+ 함량을 제공하는데 효과적인 기간 동안 수행될 수 있다. 그러나, 또한 일반적으로 모노- 및 디-사카라이드 함량이 허용불가능하게 높아지기 전에 탈중합화를 중단하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 효소 가수분해 반응은 DP1+2 함량이 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 또는 25%에 도달하는 경우 중단될 수 있다. 2차 가열 단계에서 반응 시간은 일반적으로, 약 1.5 내지 약 5 시간 또는 약 2 내지 약 4 시간 또는 약 3 시간일 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 언급된 제 1 알파 아밀라아제 효소는 전분 (또는 전분성 물질) 및 전분 (또는 전분성 물질)의 젯 쿠킹에 의해 수득된 액화 생성물과 접촉되는 유일한 효소이다. 그러나, 또 다른 구체예에서, 전분 (또는 전분성 물질) 및/또는 액화 생성물은 추가적으로 하나 이상의 다른 효소와 접촉된다. 특히, 제 1 알파 아밀라아제 효소를 함유하는 액화 생성물은 말토테트라제닉 알파 아밀라아제와 같은 상이한 알파 아밀라아제 효소와 조합될 수 있으며, 이어서 요망되는 사카라이드 분포를 갖는 시럽이 달성될 때까지 추가로 반응될 수 있다. 따라서, 전분 (또는 전분성 물질), 수성 매질 및 제 1 알파 아밀라아제 효소의 슬러리가 초기에 고전단 고온 조건으로 처리되어 (예를 들어, 젯 쿠킹되어) 액화된 전분 혼합물을 제공하고, 이러한 액화된 전분 혼합물은 후속하여 말토테트라제닉 알파 아밀라아제와 접촉된다. 제 1 알파 아밀라아제 효소는 말토테트라제닉 알파 아밀라아제와의 후속 접촉 동안 액화된 전분 혼합물중에 존재할 수 있다. 말토테트라제닉 알파 아밀라아제 효소가 젯 쿠킹 동안 처리되는 고온을 견디기에 충분히 강하지 않은 경우, 액화 단계가 완료되고 액화 생성물의 온도가 말토테트라제닉 알파 아밀라아제의 활성이 시간에 걸쳐 높게 유지되는 (즉, 처리되는 열에 의해 현저하게 불활성화되지 않는) 온도 (예를 들어, 약 80℃ 미만)로 저하될 때까지, 이러한 효소를 전분과 조합시키는 것을 연기하는 것이 바람직할 것이다.
상기 언급된 구체예에서, 말토테트라제닉 알파 아밀라아제는 액화된 전분으로부터 고비율의 DP4 올리고사카라이드를 선택적으로 또는 우선적으로 생성하는 임의의 알파 아밀라아제일 수 있다. 이러한 말토테트라제닉 알파 아밀라아제는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 야생형 슈도모나스 사카로필라 말토테트라오히드롤리아제 또는 이의 변이체를 포함한다. 슈도모나스 사카로필라에 의해 발현된 말토테트라오히드롤리아제는 당해 기술분야에서 Amy3A, PSA, SAS, 또는 PS4로서 다양하게 불린다. 야생형 슈도모나스 사카로필라 말토테트라오히드롤리아제는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된 문헌 [Zhou et al., "Nucleotide sequence of the maltotetraohydrolase gene from Pseudomonas saccharophila," FEBS Lett. 255: 37-41 (1989)]에 기술된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 수탁 번호 제 X16732호로 지정되었다. 말토테트라제닉 알파 아밀라아제는 WO 2010/132157에 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열을 갖는 야생형 말토테트라오히드롤리아제의 변이체로서,
(i) G223E 아미노산 치환, 및
(ii) WO 2010/132157에 기재된 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열과 비교하여 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 이하의 추가적인 아미노산 결실, 부가, 삽입 또는 치환; 또는
(iii) WO 2010/132157에 기재된 SEQ ID NO.2의 아미노산 서열과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 가지며,
알파-아밀라아제 활성을 갖는 변이체일 수 있다.
이러한 변이체 말토테트라제닉 알파 아밀라아제는 WO 2010/118269 및 WO 2010/132157에 기술되어 있으며, 이들 각각은 다목적으로 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 적합한 말토테트라제닉 알파 아밀라아제는 시중의 공급원 예컨대, Danisco (Genencor)에 의해 상표명 Grindamyl® PowerFresh로 시판되는 특정한 효소 예를 들어, Grindamyl® PowerFresh 3001로부터 입수가능하다. 말토테트라제닉 알파 아밀라아제는 필요에 따라 적합한 지지체 상에 또는 적합한 매트릭스 내에 고정될 수 있다.
말토테트라제닉 알파 효소가 전분 또는 전분성 물질의 초기 젯 쿠킹으로부터 수득된 액화된 전분 혼합물과 추가적으로 접촉될 때, 혼합물의 pH는 전형적으로 약 4.5 내지 약 7의 범위내에 유지될 수 있다. 이러한 접촉 동안 온도는 예를 들어, 약 50 내지 약 70 ℃일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 반응 생성물 및 수득된 시럽은 하기 사카라이드 분포를 지닌다: DP1 1-4%; DP2 10-15%; DP3 9-13%; DP4 7-11%; DP5 6-10%; DP6 13-19%; DP7 12-17%; DP8 4-7%; DP9 3-7%; DP10 2-6%; DP11 7-15%; DP11+ 0-4%, 총 100%에 상응.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 반응 생성물 및 수득된 시럽은 하기 사카라이드 분포를 지닌다: DP1 2-6%; DP2 12-16%; DP3 12-16%; DP4 38-46%; DP5-DP10 각각 1-6%; DP11 2-10%; DP11+ 0-2%.
반응 생성물 및 시럽중에 존재하는 사카라이드의 다분산도 (Mw/Mn)는 전형적으로 비교적 낮으며 예를 들어, 약 2 이하 또는 약 1.8 이하 또는 약 1.6 이하이다.
사카라이드 분포는 당해 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 주기적으로 모니터링될 수 있으며, 추가의 가수분해는 예를 들어, 수성 매질의 pH를 효소가 더 이상 활성을 띠지 않는 수준 (예를 들어, 약 3 내지 약 4의 pH)으로 저하시키기에 효과적인 양의 산을 첨가하여 효소를 불활성화시킴으로써 중단될 수 있다.
이렇게 해서 수득된 반응 생성물은 하나 이상의 추가의 정제 또는 처리 단계로 처리되어 식품, 음료, 동물 사료, 또는 동물 건강 및 영양 관련 제품 성분으로서 사용하기에 적합한 시럽을 제공할 수 있다. 예를 들어, 반응 생성물은 필터 매질 예컨대, 규조토 등을 통해 여과되어 임의의 불용성 물질이 제거될 수 있고/거나 탈색제 예컨대, 이온 교환 수지 또는 활성탄 (전형적으로 반응 생성물을 탈색제로 패킹된 베드 또는 칼럼을 통해 통과시킴으로써)과 접촉될 수 있다. 의도된 최종 사용 용도에 따라, 생성물의 pH는 산 또는 염기의 첨가 또는 이온 교환 수지로의 처리에 의해 조절될 수 있다. 막 등을 이용한 한외여과가 필요에 따라 모노- 및 디-사카라이드의 함량을 추가로 감소시키기 위해 이용될 수 있다. 물은 증류 또는 기타 증발법에 의해 반응 생성물로부터 제거되어 요망되는 건조 고형물 함량 및 점도를 갖는 최종 시럽을 제공할 수 있다. 전형적으로, 시럽의 건조 고형물 함량은 유리하게는, 약 60 중량% 내지 약 85 중량%이다. 일반적으로, 실온 (20-25℃)에서 시럽이 투명하고 액상이 되는데 효과적인 양의 물을 포함하는 것이 유리할 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, 시럽은 건조되어 고체 제품 (예를 들어, 분말 형태)을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예의 개략적 예시이며, 여기서 전분의 슬러리는, 알파 아밀라아제의 존재하에 전분 슬러리를 젯 쿠킹한 후 더 낮은 온도에서 계속 반응시키는 것을 포함하는 공정에 의해 단일의 알파 아밀라아제 효소를 사용하여 당 함량이 감소된 더 낮은 점도의 시럽으로 전환된다. 산성화에 의한 효소의 불활성화 후, 반응 생성물을 여과하고 탄소 처리 및/또는 이온 교환으로 처리한 후 증발에 의해 농축하여 요망되는 건조 고형물 함량을 갖는 최종 시럽을 제공한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 시럽은 하기 점도 프로필을 나타낼 수 있다:
70% DS: 20℃에서 약 12 내지 약 22 poise, 30℃에서 약 5 내지 약 10 poise;
75% DS: 20℃에서 약 80 내지 약 110 poise, 30℃에서 약 30 내지 약 40 poise;
80% DS: 20℃에서 약 1000 내지 약 1500 poise, 30℃에서 약 250 내지 약 400 poise;
82% DS: 20℃에서 약 4000 내지 약 8000 poise, 30℃에서 약 1000 내지 약 1600 poise.
필요에 따라, 본 발명의 시럽은 임의의 적합한 수단 예컨대, 분무-건조에 의한 물의 완전한 또는 실질적으로 완전한 제거에 의해 건조 형태로 전환될 수 있다.
시럽의 당도는 필요에 따라, 천연 또는 합성 기원의 하나 이상의 고강도 감미제와 시럽을 조합시킴으로써 증가될 수 있다. 천연의 고강도 감미제는 예를 들어, 모그로사이드 (mogroside) 및 스테비올 글리코사이드 (steviol glycoside) (스테비아 (stevia))를 포함한다. 예시적인 합성의 고강도 감미제는 수크랄로오스, 사카린, 시클라메이트, 아세설팜 포타슘, 네오탐, 및 아스파르탐 등을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 소정량의 고강도 감미제가 시럽과 조합되어 비교적 고함량의 모노- 및 디-사카라이드를 갖는 통상적인 옥수수 시럽의 당도에 필적하는 지각 수준의 당도를 부여한다.
저함량의 폴리사카라이드 (DP11+)의 결과로서, 본 발명의 시럽은 유리하게는 해당 건조 고형물 함량에서 낮은 점도를 갖는다. 이는 시럽이 여전히 우수한 유동 특성을 가지면서 비교적 농축된 형태 (즉, 높은 DS 함량)로 제공될 수 있으며, 따라서 시럽을 다양한 식품재료에 포함시키는 것이 용이함을 의미한다. 본 발명의 높은 DS (낮은 수분) 함량 시럽의 추가의 이점은, 이러한 시럽이 필적하는 점도 및 DP1+2 함량의 통상적인 당 함량이 감소된 전분 가수분해물 시럽과 비교하여 향상된 미생물 안정성을 나타낼 것이라는 점이며, 상기 통상적인 시럽은 이들의 더 높은 DP11+ 폴리사카라이드 수준으로 인해 더 많은 물을 반드시 함유해야 한다.
본 발명의 시럽은 식품, 음료, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 관련 제품, 약제 및 화장품에 사용되어 이러한 제품의 물리적 특성에 최소한의 영향을 끼치고, 동시에 부분적으로 이러한 시럽의 더욱 용이해진 조작으로 인해 이러한 제품의 제작에 사용된 공정 및 장치에 최소한의 영향을 끼치면서, 이러한 제품의 당 함량을 감소시킬 수 있다. 시럽은 질감을 연화시키고/거나 볼륨을 주고/거나 증점시키고/거나 당의 결정화를 방지하고/거나 향미를 향상시키기 위해 식품 및 사료에 사용될 수 있다.
특히, 시럽은 당에 소량으로 존재하는 증량제로서 유용하다. 이는 통상적인 더욱 고급의 당 옥수수 시럽의 특성과 유사한 외형, 점도, 결정도, 구강촉감, 습윤성 및 기타 총괄성을 가질 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 시럽은 식품, 음료, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 관련 제품, 약제 및 화장품 등에서 통상적인 옥수수 시럽을 대신하여 대략적으로 동일한 중량 또는 부피를 기준으로 용이하게 치환될 수 있으며, 그래도 여전히 이러한 제품에서 당의 양을 효과적으로 감소시킬 것이다. 따라서, 시럽은 제품의 물리적 및 관능적 속성 (the physical and sensory attribute)을 현저하게 변화시키기 않으면서 제품의 당 함량을 저하시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 시럽의 한 이점은, 이들이 비교적 고 비율의 폴리사카라이드 (예를 들어, 11 보다 높은 DP를 갖는 사카라이드)를 함유하는 통상적인 시럽과 비교하여 향상된 (더 빠른) 건조 속도를 지닌다는 점이다.
본 발명에 의해 제공된 시럽은 식품, 음료, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 관련 제품, 약제 및 화장 조성물 특히, 당 함량이 감소된 제품 또는 저함량의 당 제품에 사용하기 적합하다. 비제한적 예로는 증량, 결합 및 코팅 성분; 착색제, 향미/방향제 및 고강도 감미제에 대한 담체; 분무 건조 부가물; 증량제, 보형제 (bodying agent) 및 분산제; 및 수분 보유 증진 성분 (습윤제)으로서의 이의 용도를 포함한다. 본원에 기술된 시럽을 사용하여 제조될 수 있는 제품의 예시적인 예로는 음료, 베이킹 제품, 과자류, 냉동 유제품, 육류, 아침식사용 시리얼, 유제품, 조미료, 스낵 바, 스프, 드레싱, 믹스 (mixes), 가공 식품, 유아식, 다이어트 제품 (diet preprations), 피넛 버터, 시럽, 감미제, 식품 코팅, 애완용 식품, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 제품, 건과일, 소스, 그레비 (gravies), 및 잼/젤리 등을 포함한다.
본 발명의 시럽은 예를 들어, 다양한 식품에서 수분막을 제공하는데 이용될 수 있다. 선택적으로 하나 이상의 추가적인 식품 성분과 혼합된 시럽이 식품상에 코팅 또는 층으로서 적용될 수 있으며, 이는 일단 건조되면, 식품 안으로의 또는 밖으로의 수분 전달을 지연시키는 것을 돕는다. 예를 들어, 본 시럽을 포함하는 글레이즈 (glaze) 또는 프로스팅 (frosting)과 같은 스윗 토핑은 베이킹된 제품 예컨대, 도넛, 스낵 바, 쿠키 또는 건조 시리얼 (예를 들어, 플레이크, 비스킷 또는 클러스터 형태) 등의 표면상에 형성될 수 있다. 건조된 스윗 토핑은 수분 막으로서 작용하며, 이에 의해 생성된 식품은 증가된 저장 수명을 지니며, 스윗 토핑의 외표면의 시간이 지남에 따라 끈적거리게 되는 (태키 (tacky)) 성향이 감소됨을 나타낸다. 건조된 스윗 토핑은 또한, 식품으로의 외부 수분의 침투를 저해할 수 있어, 식품이 수성 환경에 담겨질 경우 연장된 기간에 걸쳐 요망되는 수준의 바삭함 또는 아삭함을 유지하도록 허용한다. 또 다른 구체예에서, 시럽으로 이루어진 층은 두 개의 다른 층 (이중 한 층은 수분을 함유하며, 다른 층은 수분 함량이 더 낮음) 사이에 위치하도록 식품 내에 존재한다. 시럽-함유 층은 한 층으로부터 더 낮은 수분 함량 층으로 수분이 이동하는 것을 둔화시키거나 방지하는 것을 돕는다. 이는 식품이 저장될 때 더 낮은 수분 함량 층의 바삭함/아삭함을 유지시키는 작용을 한다.
실시예
실시예 1
4M NaOH를 사용하여 15 kg의 전분 슬러리 (35% DS 마치종 전분)을 pH 5.8로 조절하였다. 5.25 g의 Veretase® 효소 (Verenium Corporation) (0.1% w/w 전분 dsb)를 슬러리에 첨가하였다. 슬러리를 107℃에서 6-7분 잔류 시간으로 테일 파이프 (tail pipe)에서 젯 쿠킹하였다. 젯팅된 전분을 수집하고, 85-90℃로 유지된 둥근 바닥 플라스크에서 교반되게 하였다. 샘플을 시간에 걸쳐 사카라이드 분포 분석을 위해 수집하였다. 반응을 3시간 동안 수행한 후, pH를 3으로 저하시켜 반응을 중단하고 시럽을 냉각시켰다. 그 후, 시럽을 Celite® 필터 보조물을 통해 여과하고, 정제를 위해 활성탄 및 이온 교환 수지를 통해 통과시켰다. 그 후, 시럽을 80% DS로 증발시켰다.
표 1A는 다양한 시간 간격을 두고 취해진 반응 샘플의 사카라이드 분포를 나타낸다. 표 1B는 각 샘플에 대한 분자량 및 다분산도 데이타를 제공한다.
표 1A.
Figure pct00001

표 1B.
Figure pct00002

이렇게 하여 71% DS에서 수득된 시럽의 점도 프로파일은 표 2에 나타냈다 (SWEETOSE®4300 63 DE 통상적인 옥수수 시럽 (71% DS)과 비교).
표 2.
Figure pct00003

실시예 2
4M NaOH을 사용하여 15 kg의 전분 슬러리 (35% DS 마치종 전분)를 pH 5.3으로 조절하였다. 5.25 g의 Veretase® 효소 (0.1% w/w 전분 dsb)를 슬러리에 첨가하였다. 슬러리를 107℃에서 6-7분 체류 시간으로 테일 파이프에서 젯 쿠킹하였다. 젯팅된 전분을 수집하고, 85-90℃로 유지된 둥근 바닥 플라스크에서 교반되게 하였다. 샘플을 시간에 걸쳐 사카라이드 분포 분석을 위해 수집하였다. 반응을 3시간 동안 수행한 후, pH를 3으로 저하시켜 반응을 중단하고 시럽을 냉각시켰다. 그 후, 시럽을 Celite를 통해 여과시키고, 정제를 위해 활성탄 및 이온 교환 수지를 통해 통과시켰다. 그 후, 시럽을 80% DS로 증발시켰다.
표 3은 다양한 시간에 취해진 반응 샘플의 사카라이드 분포를 나타낸다.
표 3.
Figure pct00004

실시예 3
마치종 전분 (5.25 kg)을 9.75 kg 물과 혼합하여 35% DS 전분 슬러리를 제조하였다. 슬러리의 pH를 10% NaOH를 사용하여 5.9로 조절하였다. 5.25 g의 Veretase® 효소를 슬러리에 첨가하였다. 그 후, 슬러리를 350 mL/min의 속도로 107℃에서 젯 쿠킹하고, 이는 6-7분의 테일에서의 체류 시간을 부여한다. 액화물을 수집하고, 워터 배쓰에서 65℃로 냉각시켰다. 냉각 후, 10.5 g의 Grindamyl®PowerFresh 3001 효소 (Danisco)를 시럽에 첨가하였다. 반응 혼합물의 샘플을 다양한 시간 간격을 두고 수집하였다. 3 시간 후, pH를 4로 저하시켜 반응을 중단시켰다. 표 4a 및 4b는 다양한 시간에 취해진 반응 샘플의 사카라이드 분포를 나타낸다. 시간 "t=0"은 젯팅 (액화)이 완료되고, Grindamyl® 효소가 첨가되는 시간이다.
비교로서, 통상적인 열-안정성 알파 아밀라아제를 사용하여 전분 슬러리를 젯 쿠킹함으로써 제조된 전형적인 액화물 (예를 들어, 이봉 생성물 분포를 유도하는 액화물)을 Grindamyl® PowerFresh 3001 효소와 반응시킨 경우, 수득된 반응 생성물 (시럽)은 비교적 높은 함량의 DP4 사카라이드 (예를 들어, 40%를 약간 초과하는)를 갖는다. 그러나, 생성물은 또한, 더욱 고급의 올리고사카라이드를 높은 비율로 함유하며 (예를 들어, 약 30% 또는 그 초과의 DP11+), 이는 시럽의 점도에 악영향을 끼친다. 더욱 고급의 올리고사카라이드는 분명히 Grindamyl® PowerFresh 효소 또는 통상적인 알파 아밀라아제 효소에 의해 더욱 저급의 사카라이드로 효과적으로 가수분해되지 않는다. 더욱 고급의 올리고사카라이드는 실질적으로 시럽의 점도에 기여하며, 따라서, 시럽은 감소된 당 (DP1+2) 함량을 갖는다 하더라도, 더욱 고급의 DE 시럽을 효과적으로 대체하는데 사용될 수 없다.
표 4a.
Figure pct00005
표 4b.
Figure pct00006

Claims (31)

  1. 식품, 음료, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 관련 제품, 약제 및 화장 조성물을 위한 당 함량이 감소된 더 낮은 점도의 시럽을 제조하는 방법으로서,
    전분 또는 전분성 물질을 가수분해하는데 효과적인 시간 동안 수성 매질중에서 제 1 알파 아밀라아제 효소와 전분 또는 전분성 물질을 접촉시켜 약 10% 내지 약 25%의 DP1 + DP2 함량, 약 70% 내지 약 90%의 DP3-11 함량, 및 0% 내지 약 15%의 DP11+ 함량을 갖는 사카라이드 분포를 지니는 반응 생성물을 제공하는 것을 포함하며, 상기 제 1 알파 아밀라아제 효소는 진뱅크 수탁 (GenBank Accession) 번호 제 AF504065호와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 효소적 활성 단편을 포함하는 아미노산 서열인, 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 반응 생성물을 여과하는 추가 단계를 포함하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 반응 생성물을 활성탄과 접촉시키는 추가 단계를 포함하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 반응 생성물을 이온 교환 수지와 접촉시키는 추가 단계를 포함하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 반응 생성물로부터 물을 제거하여 약 65% 내지 약 85%의 건조 고형물 함량을 달성하는 추가 단계를 포함하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 반응 생성물을 여과하는 단계, 반응 생성물을 활성탄 및 이온 교환 수지와 접촉시키는 단계, 반응 생성물로부터 물을 제거하여 약 65% 내지 약 85%의 건조 고형물 함량을 달성하는 단계의 추가 단계들을 포함하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에 있어서, 반응 생성물을 막을 이용한 한외여과로 처리하는 추가 단계를 포함하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 있어서, 반응 생성물을 하나 이상의 고강도 감미제와 조합시키는 추가 단계를 포함하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중의 어느 한 항에 있어서, 전분 또는 전분성 물질이 제 1 알파 아밀라아제 효소 이외의 다른 어떠한 효소 또는 산과 접촉되지 않는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중의 어느 한 항에 있어서, 수성 매질의 초기 pH가 약 5 내지 약 7인 방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 있어서, 접촉이 약 75℃ 내지 약 120℃의 온도에서 수행되는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중의 어느 한 항에 있어서, 전분 또는 전분성 물질, 수성 매질 및 제 1 알파 아밀라아제 효소의 슬러리가 초기에 약 100℃ 내지 약 115℃의 제 1 온도에서 젯 쿠킹 (jet cook)된 후, 약 80℃ 내지 약 95℃의 제 2 온도에서 유지되는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중의 어느 한 항에 있어서, 제 1 알파 아밀라아제 효소가 전분 또는 전분성 물질의 양의 약 0.01 내지 약 0.2 중량%의 양으로 사용되는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중의 어느 한 항에 있어서, 전분이 옥수수 전분이거나, 전분성 물질이 옥수수로부터 유래된 것인 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 있어서, DP11+ 함량이 0-5%인 방법.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, 반응 생성물의 건조 고형물 함량이 80%인 경우, 반응 생성물의 점도가 20℃에서 약 1500 poise 미만인 방법.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중의 어느 한 항에 있어서, 전분 또는 전분성 물질이 말토테트라제닉 알파 아밀라아제와 추가적으로 접촉되는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중의 어느 한 항에 있어서, 전분 또는 전분성 물질, 수성 매질 및 제 1 알파 아밀라아제 효소의 슬러리가 초기에 젯 쿠킹되어 액화된 전분 혼합물을 제공하고, 이러한 액화된 전분 혼합물은 후속하여 말토테트라제닉 알파 아밀라아제와 접촉되는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 제 1 알파 아밀라아제 효소가 말토테트라제닉 알파 아밀라아제와의 후속 접촉 동안 액화된 전분 혼합물중에 존재하는 방법.
  20. 제 17항 내지 제 19항 중의 어느 한 항에 있어서, 말토테트라제닉 알파 아밀라아제가 슈도모나스 사카로필라 말토테트라오히드롤리아제 (Pseudomonas saccharophila maltotetraohydrolyase)의 변이체인 방법.
  21. 제 17항 내지 제 20항 중의 어느 한 항에 있어서, 말토테트라제닉 알파 아밀라아제가 WO 2010/132157에 기재된 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열을 갖는 야생형 말토테트라오히드롤리아제의 변이체로서,
    (i) G223E 아미노산 치환, 및
    (ii) WO 2010/132157에 기재된 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열과 비교하여 24개 이하의 아미노산 결실, 부가, 삽입 또는 치환; 또는
    (iii) WO 2010/132157에 기재된 SEQ ID NO.2의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 가지며, 알파-아밀라아제 활성을 갖는 변이체인 방법.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 있어서, 사카라이드가 약 35% 이상의 DP4 함량을 갖는 방법.
  23. 제 1항 내지 제 22항 중의 어느 한 항에 있어서, 사카라이드가 약 35% 이상의 DP4 함량 및 DP5 내지 DP10 각각에 대해서 약 6% 미만의 함량을 갖는 방법.
  24. 약 10% 내지 약 25%의 DP1 + DP2 함량, 약 70% 내지 약 90%의 DP3-11 함량, 및 0% 내지 약 5%의 DP11+ 함량을 제공하기 위한 사카라이드 분포를 갖는 사라카리드와 물을 포함하는 시럽으로서, 시럽의 건조 고형물 함량이 80%인 경우, 시럽의 점도가 20℃에서 약 1400 poise 이하인 시럽.
  25. 제 24항의 시럽 및 하나 이상의 식품, 음료, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 관련 제품, 약제, 또는 화장품 성분을 포함하는 식품, 음료, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 관련 제품, 약제 또는 화장품.
  26. 제 24항의 시럽 및 하나 이상의 고강도 감미제를 포함하는 감미제 제품.
  27. 총 100%에 상응하는 DP1 1-4%; DP2 10-15%; DP3 9-13%; DP4 7-11%; DP5 6-10%; DP6 13-19%; DP7 12-17%; DP8 4-7%; DP9 3-7%; DP10 2-6%; DP11 7-15%; DP11+ 0-4%의 사카라이드 분포를 갖는 사카라이드와 물을 포함하는 시럽.
  28. 제 27항의 시럽 및 하나 이상의 식품, 음료, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 관련 제품, 약제, 또는 화장품 성분을 포함하는 식품, 음료, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 관련 제품, 약제 또는 화장품.
  29. 제 27항의 시럽 및 하나 이상의 고강도 감미제를 포함하는 감미제 제품.
  30. 당 함량이 감소된 더 낮은 점도의 시럽을 제조하는 방법으로서,
    (a) 전분 또는 전분성 물질을 수성 매질중에서 제 1 알파 아밀라아제 효소와 선택적으로 고전단 조건하에 제 1 온도에서 접촉시켜 젤라틴화된 전분의 유체 매스를 제공하고;
    (b) 약 10% 내지 약 25%의 DP1 + DP2 함량, 약 70% 내지 약 90%의 DP3-11 함량, 및 0% 내지 약 15%의 DP11+ 함량을 갖는 사카라이드 분포를 지니는 반응 생성물을 제공하기에 효과적인 시간 동안 제 2 온도에서 유체 매스를 유지시키고,
    제 1 알파 아말리아제 효소는 진뱅크 수탁 번호 제 AF504065호와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 효소적 활성 단편을 포함하는 아미노산 서열이며;
    (c) 하나 이상의 정제 또는 처리 단계로 반응 생성물을 처리하여 당 함량이 감소된 더 낮은 점도의 시럽을 제공하는 것을 포함하며,
    상기 방법에 사용된 유일한 유형의 효소가 알파 아밀라아제인 방법.
  31. 식품, 음료, 동물 사료, 동물 건강 및 영양 관련 제품, 약제 및 화장 조성물을 위한 당 함량이 감소된 더 낮은 점도의 시럽을 제조하는 방법으로서,
    (a) 전분 또는 전분성 물질, 제 1 알파 아밀라아제 효소 및 수성 매질의 슬러리를 100℃ 내지 115℃의 제 1 온도에서 젯 쿠킹하고;
    (b) 슬러리를 80℃ 내지 95℃의 제 2 온도에서 10% 내지 25%의 DP1 + DP2 함량, 70% 내지 90%의 DP3-11 함량, 및 0% 내지 15%의 DP11+ 함량을 갖는 사카라이드 분포를 지닌 반응 생성물을 제공하는데 효과적인 시간 동안 유지시키고,
    제 1 알파 아밀라아제 효소는 진뱅크 수탁 번호 제 AF504065호와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성 또는 완전한 (100%) 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드의 효소적 활성 단편을 포함하는 아미노산 서열이며;
    (c) 하나 이상의 정제 또는 처리 단계로 반응 생성물을 처리하여 당 함량이 감소된 더 낮은 점도의 시럽을 제공하는 것을 포함하며,
    상기 방법에 사용된 유일한 유형의 효소가 알파 아밀라아제인 방법.
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