KR20140120808A - 면역 증강 활성 및 항종양 활성이 있는 감잎 유래 다당 분획물 및 이의 제조 방법 - Google Patents
면역 증강 활성 및 항종양 활성이 있는 감잎 유래 다당 분획물 및 이의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 면역 증강 활성 및 항종양 활성이 있는 감잎 유래 다당 분획물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar)은 60 내지 80 중량%, 우론산(uronic acid)은 18 내지 39 중량%, KDO(3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid) 유사 물질은 0.5 내지 10 중량% 인 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물인 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 감잎 유래 다당 분획물은 인터루킨-6, 12 및 TNF-α의 생성을 촉진하여 면역 기능을 증진시키고, 대식세포에 대해 뚜렷한 독성이 없으며, 자연살해세포의 활성을 증가시키며, 암세포의 전이를 억제하는 효능을 나타내는 바, 면역 증강용 또는 암 개선용 식품용 조성물, 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조에 효과적이다.
본 발명의 감잎 유래 다당 분획물은 인터루킨-6, 12 및 TNF-α의 생성을 촉진하여 면역 기능을 증진시키고, 대식세포에 대해 뚜렷한 독성이 없으며, 자연살해세포의 활성을 증가시키며, 암세포의 전이를 억제하는 효능을 나타내는 바, 면역 증강용 또는 암 개선용 식품용 조성물, 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조에 효과적이다.
Description
본 발명은 면역 증강 활성 및 항종양 활성이 있는 감잎 유래 다당 분획물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar)은 60 내지 80 중량%, 우론산(uronic acid)은 18 내지 39 중량%, KDO(3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid) 유사 물질은 0.5 내지 10 중량% 인 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물인 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
감잎에는 레몬의 20배 이상인 비타민C가 많이 함유되고 있어 건강차로 애용되고 있다. 감잎의 효능으로는 혈액 순환을 원활하게 하고, 혈관을 튼튼하게 하여, 괴혈병, 빈혈, 심장병, 동맥경화와 뇌출혈에 효과적이다. 그러나 지금까지 면역계에 미치는 영향에 대해서는 거의 연구가 이루어지지 않았다.
질병에 대해서 별다른 조치 없이 체내의 자연스러운 작용으로 이겨낼 수 있는 것이 인간의 자기 치유력이다. 현대사회에서 질병이 다양하게 늘어가는 데는 인간의 자기 치유력 저하에 그 원인이 있다. 그러나 현대사회인은 경미한 증상에도 약에 의존하려는 경향이 있어서 자기 치유력은 점차 약해질 수밖에 없는 실정이다.
면역은 나와 남을 구별하는 것이며, 면역력은 인체가 내-외부의 적으로부터 스스로를 지켜내기 위한 자위력이다. 세균, 바이러스 등의 외부의 적과 인체 내의 죽은 세포나 유전자복제로 탄생한 새로운 세포 중 비정상적인 세포인 내부의 적이 없어져야만 건강을 유지할 수 있는데 이러한 역할을 담당하는 것이 바로 '면역시스템'이다. 따라서 면역기능이 저하되면 질병에 쉽게 걸리는 것은 당연한 것이다. 그리고 노화와 더불어 면역기능도 함께 저하되는 것이 일반적이다.
면역 기능에 장애가 발생하는 문제점을 극복하기 위하여, 다양한 면역 기능 강화 치료제가 개발 및 사용되고 있다. 그러나 별도의 치료제를 장기간 복용할 경우, 개개인마다 면역력의 차이가 달라서 그 부작용의 문제점이 크다는 단점이 있다. 특히, 면역 질환은 치료보다 예방이 중요한데, 현재 시판되고 있는 치료제를 예방을 위하여 복용하기 어려운 것이 현실이다. 따라서 부작용 없는 천연 재료 치료제가 필요하다.
지금까지 밝혀진 천연물 유래의 면역계 활성화에 관여하는 물질들은 표고버섯(Lentinus edode)에서 분리한 lentinan과 구름버섯(Coliolus versicolar)에서 분리한 PSK(polysaccharide K) 등이 있다.
Macrophage는 세균이나 이물질을 탐식, 제거하는 과정에서 여러 가지 cytokine을 분비하여 면역현상을 조절하며, 항원에 대한 면역작용의 중추적인 역할을 하는 세포로서, 항원제시와 림프구의 비 특이적 면역작용에 관계하며, 종양세포에 대해서는 직접적인 상해활성을 나타낸다. 또한 TLR (tolllike receptor)에 반응하는 물질(LPS 혹은 천연물)은 macrophage를 활성화하여 T세포와 B 세포의 증식, 식균 작용을 위한 대식세포의 활성화, 미생물 감염에 대한 방어 등의 2차 면역반응을 조절할 수 있는 IL-1, IL-6, IL-10, IL-12 및 TNF-α와 같은 cytokine을 생산한다고 알려져 있다.
자연살해세포(NK cell)는 다양한 기전을 통해 암 세포나 바이러스에 감염된 세포를 직접적으로 공격하여 사멸시키는 기능을 가지며, 전체 림프구에서 5~10% 비율로 소량 존재하지만 정상 세포에서 돌연변이와 같은 이상이 감지되었을 때 가장 처음으로 방어하여 이를 제거하는 강력한 기능을 갖는다. 또한 다른 면역 세포의 기능 조절에도 매우 중요한 역할을 담당하여 선천면역 세포이면서도 획득면역 세포를 자극하여 더 강력한 방어 작용을 한다.
이에 본 발명자들은 감잎 유래 다당 분획물이 사이토카인(cytokine) 생성과 NK cell(Natural Killer cell, 자연살해세포), anti-metastatic effect(항 종양전이효과)의 활성을 촉진시키는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar)은 60 내지 80 중량%, 우론산(uronic acid)은 18 내지 39 중량%, KDO(3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid) 유사 물질은 0.5 내지 10 중량% 인 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 감잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계; 및 (b) 상기 효소 처리된 감잎 분말에서 분자량 3 내지 300 kDa 의 분획물을 회수하는 단계를 포함하는 상기 감잎 유래 다당 분획물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 감잎에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계; (b) 상기 효소 처리된 감잎에서 분자량 3 내지 300 kDa의 분획물을 회수하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 회수된 분획물에서 분자량 5 내지 30 kDa의 분획물을 회수하는 단계를 포함하는 감잎 유래 다당 분획물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar)은 60 내지 80 중량%, 우론산(uronic acid)은 18 내지 39 중량%, KDO(3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid) 유사 물질은 0.5 내지 10 중량% 인 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 감잎에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계; 및 (b) 상기 효소 처리된 감잎에서 분자량 3 내지 300 kDa 의 분획물을 회수하는 단계를 포함하는 감잎 유래 다당 분획물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 감잎에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계; (b) 상기 효소 처리된 감잎에서 분자량 3 내지 300 kDa의 분획물을 회수하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 회수된 분획물에서 분자량 5 내지 30 kDa의 분획물을 회수하는 단계를 포함하는 감잎 유래 다당 분획물 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar)은 60 내지 80 중량%, 우론산(uronic acid)은 18 내지 39 중량%, KDO(3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid) 유사 물질은 0.5 내지 10 중량% 인 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물을 제공한다.
본 발명에서 전체 다당 분획물은 중성 다당, 우론산, KDO 유사물질 및 단백질로 이루어져 있다.
상기 우론산은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어진 것을 특징으로 하고, 상기 KDO(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid) 유사물질은 DHA (3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 및 KDO 로 이루어진 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 중성 다당은 아라비노오스, 람노오스, 갈락토오스, 퓨코오스, 글루코오스 및 람노갈락투로난(Rhamnogalacturonan)-II 지표 다당류를 포함하는 것을 특징으로 한다.
더 바람직하게는 상기 중성 다당은 상기 감잎 유래 다당 분획물을 구성하는 전체 중성 다당 대비 아라비노오스 20 내지 40 mole%, 람노오스는 10 내지 40 mole%, 갈락토오스는 10 내지 40 mole%, 퓨코오스는 1 내지 10 mole%, 글루코오스는 1 내지 10 mole%, 람노갈락투로난-II 지표 다당류는 0.4 내지 26 mole% 인 다당을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 람노갈락투로난-II 지표 다당류는 상기 감잎 유래 다당 분획물을 구성하는 전체 중성 다당 대비 2-메틸퓨코오스는 0.1 내지 8 mole%, 2-메틸자일로스는 0.1 내지 8 mole%, 아피오스는 0.1 내지 5 mole%, 아세릭산은 0.1 내지 5 mole% 인 다당으로 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 감잎 유래 다당 분획물은 (a) 감잎에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계; 및 (b) 상기 효소 처리된 감잎에서 분자량 3 내지 300 kDa의 분획물을 회수하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되었다.
구체적으로 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물은 (a) 감잎에 펙틴 가수분수분해효소를 처리한다. 상기 감잎은 건조되지 않은 감잎이나 건조된 감잎일 수 있으며, 분쇄된 것 또는 분말화된 것을 사용할 수 있다.
(b) 상기 효소처리된 감잎에서 분자량 3 내지 300 kDa의 분획물을 회수한다.
Pectinase로 처리하여 얻은 감잎 유래 분획물을 한외여과하여 분자량 3kDa 미만의 것과 분자량 300 kDa 초과된 것을 제거하여 감잎 유래 조다당 분획물(PLE-0)을 수득하였다. 회수된 분획물(PLE-0)의 구성당을 기체 크로마토그래피로 분석한 결과, 전체 다당 대비 중성다당은 71.3 중량%, 우론산은 26.2 중량%, 단백질은 0.7 중량%, KDO 유사 물질은 1.8 중량%로 나왔고, 중성다당 성분을 분석한 결과, 전체 중성 다당 대비 2-메틸퓨코오스 1.6 mole%, 람노오스 15.6 mole%, 퓨코오스 2.4 mole%, 2-메틸자일로오스 2.0 mole%, 아라비노오스 26.3 mole%, 자일로오스 6.7 mole%, 아피오스 4.5 mole%, 아세릭산 1.4 mole%, 만노오스 2.1 mole%, 갈락토오스 32.3 mole%, 글루코오스 5.1 mole%로 나왔다. 상기 중성다당 중 2-메틸퓨코오스, 2-메틸자일로오스, 아피오스, 아세릭산은 람노갈락투로난(Rhamnogalacturonan)-II(RG-II) 지표물질이다. (실시예 <2-1> 및 [표 2] 참조). 또한 KDO 유사 물질인 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid(KDO) 및 3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaricacid (DHA)도 RG-II 의 지표 물질이다.
(c) 상기 (b) 단계에서 회수된 분획물에서 분자량 5 내지 30 kDa의 분획물을 다시 회수한다.
즉, 상기 (b) 단계에서 회수된 분획물을 한외여과하여 분자량 5 내지 30 kD의 분획물을 다시 회수하였다(PLE-II). 회수된 분획물(PLE-II)의 구성당을 기체 크로마토그래피로 분석한 결과, 전체 다당 대비 중성다당은 69.5 중량%, 우론산은 27.2 중량%, KDO 유사 물질은 3.3 중량%로 나왔고, 중성다당 성분을 분석한 결과, 전체 중성 다당 대비 2-메틸퓨코오스 4.0 mole%, 람노오스 27.9 mole%, 퓨코오스 4.9 mole%, 2-메틸자일로오스 4.7 mole%, 아라비노오스 28.2 mole%, 아피오스 2.9 mole%, 아세릭산 3.5 mole%, 만노오스 0.4 mole%, 갈락토오스 19.6 mole%, 글루코오스 3.9 mole%로 나왔다. 상기 중성다당 중 2-메틸퓨코오스, 2-메틸자일로오스, 아피오스, 아세릭산은 람노갈락투로난(Rhamnogalacturonan)-II(RG-II) 지표물질이다. (실시예 <2-1> 및 [표 2] 참조). 또한 KDO 유사 물질인 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid(KDO) 및 3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaricacid (DHA)도 RG-II 의 지표 물질이다.
펙틴물질(pectic substance)들은 고등식물의 1차 세포벽과 중엽(middle lamella)에 주로 존재하는 다당류로써 매우 복잡한 구조를 가지고 있다고 보고되어 있다. 펙틴은 전체 분자의 많은 부분이 homogalacturonan으로 구성되어 있지만(Kwon MH et al., Food Sci. Ind.;30:30-43,1997), 여기에 다양한 oligo- 및 polysaccharide로 분지된 rhamnogalacturonan(람노갈락투로난)-I(RG-I) 및 rhamnogalacturonan-II(RG-II)가 공유적으로 결합되어 있는 것으로 알려져 있다(Kim JM et al., Biochem. Bioph. Res. Co.;344:765-771,2006).
본 발명의 감잎 유래 다당 분획물은 면역 증강 활성을 갖는다.
본 발명의 감잎 유래 다당 분획물(PLE-II)의 사이토킨 생성 촉진능을 측정한 결과, IL(interleukin, 인터루킨)-6, IL-12 의 생성을 촉진함을 확인할 수 있다. IL-6의 경우 PLE-II는 4.0 ㎍/㎖이상 100 ㎍/㎖의 농도에서 양성대조군인 LPS (lipopolysaccharide)와 유사한 정도의 높은 생성능을 보였다. 열수추출물(PLW) 및 효소처리물로부터 얻은 조다당분획물(PLE-0)도 농도의존적으로 활성이 증가하는 양상을 보였지만 100 ㎍/㎖이하의 농도에서 IL-6 생산량은 PLE-II에 비해 훨씬 낮았다. 따라서 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물인 PLE-II 적은 양으로도 큰 효과를 보인다. IL-12는 20.0 ㎍/㎖ 농도까지는 농도 의존적으로 생성능이 증가하다가, 그 이상부터는 다소 감소하는 양상을 나타내었으나 전체적으로 PLW 및 PLE-0에 비해 높은 IL-12 발현량을 나타내었다. TNF-γ의 경우도 유사한 경향을 나타내어 100 ㎍/㎖ 까지 농도의존적인 발현량 증가를 나타내었다. (<실시예 4> 및 [도 3] 참조).
IL-6, IL-12, TNF-α는 대식세포에 의해 유도되는 대표적인 cytokine 으로 세균 감염에 따른 염증반응에 있어서 중추적인 역할을 하며, 염증 병소에서 그 양이 증가되는 것으로 알려져 있다. IL-6는 B세포 자극인자2(BSF2) 또는 인터페론 β2라고도 호칭된 사이토카인이다. IL-6는 B 림프구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자로서 발견되고(Hirano, T. et al., Nature, 324, 73-76, 1986), 그 후, 각종 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 사이토카인인 것이 명확해졌다(Akira, S. et al., Adv. in Immunology, 54, 1-78, 1993).
또한 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물의 대식세포에 대한 세포독성 테스트에서는 최대 농도인 200 ㎍/㎖ 에서도 유효한 독성이 관찰되지 않았다. (<실시예 3> 및 [도 2] 참조). 뿐만 아니라, 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물은 NK-cell(Natural killer cell, 자연살해세포)의 활성화에도 영향을 미친다. 자연살해세포의 활성화에 미치는 영향을 측정하기 위해 상기 다당 분획물을 2 mg/kg 농도로 mouse에 정맥 주사하고 비장을 분리하여, NK-cell을 조제하였으며 각 E/T 의 비율에 따라 암세포와 혼합한 후 NK-cell에 의한 암세포 치사 활성을 측정한 결과, E/T가 클수록 높은 활성을 보였고, 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물을 처리하지 않은 대조군 대비 약 26% 이상 암세포를 치사시키는 효과가 있었다. 상기 E/T는 Effect cell / Target cell 의 개수 또는 농도의 비율을 의미한다. 본 발명의 <실시예 5> 에서는 Effect cell로 비장세포(지라세포, splenocyte)를 사용하였고, Target cell로는 암세포인 YAC-1을 사용하였다([도 4] 참조).
아울러, NK cell의 활성화에 미치는 감잎 다당 분획물의 경구투여 효과를 규명하기 위해 10 및 100 μg/mouse 시료농도로 1일 1회 총 20일 동안 mouse에 경구투여한 후, mouse를 치사하여 얻어진 비장 유래 NK-cell을 이용하여 종양세포인 Yac-1 cell에 대한 치사능을 관찰하였다. PLW-0와 PLE-0의 NK cell 활성 효과는 E/T ratio에 의존적으로 종양세포에 대한 살해능을 나타내었다. E/T 비율 50:1을 기준으로 PLW-0의 경우 10, 100 μg의 투여농도에서 각각 19.1%, 21.0% 의치사율을 나타낸 반면 PLE-0 투여시에는 각각 20.9%, 22.7%의 치사율을 나타내어 효소처리와 분자량 분획에 의해 제조한 PLE-0의 치사율이 단순 열수추출 다당분획인 PLW-0에 비해 높은 치사율을 나타내었다. E/T 비율을 25:1, 100:1로 했을 때도 이와 유사한 경향이었다. 이로써 감잎 다당 분획물은 경구투여 시에도 종양세포에 대한 살해능을 가지는 NK cell의 활성화에 기여함을 확인할 수 있었다([도 6] 참조.)
대식세포(Macrophage)는 세균이나 이물질을 탐식, 제거하는 과정에서 여러 가지 사이토킨을 분비하여 면역현상을 조절하며, 항원에 대한 면역작용의 중추적인 역할을 한다. 항원 제시와 림프구의 비특이적 면역작용에 관계하며, 종양세포에 대해서는 직접적인 상해활성을 나타낸다.
자연살해세포(NK cell)는 다양한 기전을 통해 암 세포나 바이러스에 감염된 세포를 직접적으로 공격하여 사멸시키는 기능을 가지며, 전체 림프구에서 5~10% 비율로 소량 존재하지만 정상 세포에서 돌연변이와 같은 이상이 감지되었을 때 가장 처음으로 방어하여 이를 제거하는 강력한 기능을 갖는다. 또한 다른 면역 세포의 기능 조절에도 매우 중요한 역할을 담당하여 선천면역 세포이면서도 획득면역 세포를 자극하여 더 강력한 방어 작용을 한다. 정상인의 경우, 유전 및 환경적 요인으자연 살해 세포에 의해 1차적으로 제거된다.
본 발명의 감잎 유래 다당 분획물은 암 전이 억제 활성이 있는 것을 특징으로 한다.
종양이 타기관으로 전이될 때 감잎 유래 다당이 갖는 항전이 활성을 평가하기 위해 Colon 26-M3.1 carcinoma 세포주의 폐암전이 모델에서 in vivo 활성을 측정하였는데, 실험 결과 tumor control군에서는 평균 120 여개의 colony가 계수되었고, 이를 기준으로 감잎 유래 단순 열수추출 조다당 PLW-0, 효소처리 조다당 PLE-0와 효소처리 조다당 정제획분 PLE-II에서의 억제율을 계산하였을 때, 모든 농도에서 본 발명의 PLE-II 분획이 가장 우수한 활성을 보였다(실시예 6-1 및 도 5 참조). 특히 가장 작은 투여량인 10μg에서 다른 분획들보다도 현저히 우수한 효능을 보였고, 이로부터 적은 양으로도 더 큰 효과를 얻을 수 있다는 것을 알 수 있다.
또한, 효소처리 및 분자량에 따른 분획처리 전후 감잎 유래 다당의 항전이 활성을 비교해 본 결과 종양 투여 전에 시료를 6주령 female BALB/c mouse에 각각 10, 100 및 1,000 μg/mouse씩 종양투여 2일전에 정맥주사하거나 종양투여 전 20일간 1일 1회 10 μg/mouse 씩 경구 투여한 후, Colon 26M3.1 carcinoma를 정맥 주사하고 종양투여 14일 후 표적기관인 폐를 적출하여 전이된 종양 colony를 계수하여 평가하였다. 실험 결과, 정맥투여시에 시료를 투여하지 않은 대조군에 비해 10μg 투여시 PLW-0는 30.2% 수준의 항이전이활성을 나타낸 반면 PLE-0를 투여한 경우에는 이보다 2배 정도 높은 63.5%의 항전이효과를 나타내었으며 1,000 μg의 PLW-0를 투여한 실험군에서는 약 71.7%의 항전이 효과가 확인된 반면 동일농도에서 PLE-0를 투여한 결과, 약 87.7%의 높은 항전이 활성을 나타내었다. 이는 단순 열수추출 다당분획물에 비해 효소처리하여 얻은 조다당 분획의 항전이 효과가 현저히 증가됨을 나타내는 결과이었다. 감잎 유래 다당 분획물들을 경구 투여한 경우에도 열수추출다당분획물 투여군(PLW-0)의 전이 억제율은 47.1%인데 반해 효소처리 다당분획투여군(PLE-0)은 70% 수준의 높은 항전이 효과가 관찰되었다. (실시예 6-2 및 [도 7] 참조).
본 발명의 감잎 유래 다당 분획물은 사이토킨인 IL-6, IL-12, TNF-α를 촉진시키고, 대식세포에 대해 뚜렷한 독성이 없으며, 자연살해세포의 활성을 증가시켜 암 세포 살해능을 향상시키며, 종양세포의 전이를 억제하는 효능을 나타내는 바, 상기 다당 분획물은 면역 증강 활성 및 암 예방 또는 치료 효능이 있다.
따라서 본 발명은 상기 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 식품용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 암 예방 또는 개선용 식품용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 면역 증강은 생체 내 면역시스템의 면역 반응 또는 활성을 증가시키는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 식품용 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물과 면역증강의 효과 또는 암 예방, 치료 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품용 조성물 중 상기 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 100 중량%이다.
또한, 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 항암보조제를 제공한다. 상기 항암보조제는 항암제 치료 중에 면역증강 및 회복을 증진시키는 효과를 나타내는 보조제를 의미하는 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 면역력 저하로 인한 질환은 면역 기능이 떨어져서 정상인 보다 더 쉽게 걸리게 되는 질환 또는 면역 기능 저하로 인해 치료가 어려운 질환을 의미하는 것이다.
본 발명은 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 암은 좁게는 NK cell의 기능 약화로 인한 암을 의미한다. NK 세포는 초기에 발견되는 암세포를 없애주고, 직접 암세포를 공격하여 괴사 및 자살사를 유도하여 재발 및 전이를 방지해준다. 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물은 NK 세포의 암세포 살해능을 높여준다. 또한, 상기 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 더 좁은 범위로 암 전이 억제용 조성물일 수 있다. 본 발명의 감잎 유래 다당물은 항전이 활성을 보였다.
또한 상기 암은 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 림프종, 재생불량성 빈혈 및 혈액암로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역력 저하로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 본 발명의 다당 분획물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 다당 분획물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 다당 분획물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01 μg 내지 1,000 mg, 더욱 바람직하게는 0.1 μg 내지 100 mg, 가장 바람직하게는 1μg 내지 10mg 일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 다당 분획물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 다당 분획물을 면역증강제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 감잎 유래 다당 분획물이 활성화시키는 NK 세포는 바이러스에 감염된 세포나 종양세포 등에 대해서 강력한 면역작용을 나타내는 대표적인 자연면역(innate immunity) 세포로 알려져 있고(Roder JC, Pross HF, J Clin Immunol;2:249-63, 1982), 혈액암인 급성 림프성 백혈병, 골수성 백혈병의 치료에도 이용된다(FranRomagnet al. F1000 Medicine Reports;03:09,2011). 실제로 본 발명의 감잎 유래 다당 분획물을 처리한 NK 세포의 암 세포 살해능이 현저하게 증가하였다(<실시예 5> 참조).
IL-6는 B세포 자극인자2(BSF2) 또는 인터페론 β2라고도 호칭된 사이토카인이다. IL-6는 B 림프구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자로서 발견되고(Hirano, T. et al., Nature, 324, 73-76, 1986), 그 후, 각종 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 사이토카인인 것이 명확해졌다(Akira, S. et al., Adv. in Immunology, 54, 1-78, 1993). 또한 IL-6는 T 림프구계 세포의 성숙화를 유도하는 것이 보고되어 있으며 (Lotz, M. et al., J. Exp. Med. 167, 1253-1258, 1988), T cell이나 thymocytes에 co-stimulator로 작용을 하여 항암효과를 나타낸다고 알려져 있다(Kuby J. In 'Immunology' 2nd ed. 1994, Chap. 15. W.H. Freemn company. USA.)]
또한, IL-12는 NK cell 및 Th1 세포에 작용하여 INF-의 생산을 유도하게 됨으로서 세포성 면역의 유도에서 선천적인 NK cell 및 T 세포를 항원에 대항케 하는 effector form으로 분화하게 하는 작용이 있으므로 주로 Th1 성향의 세포성 면역계를 활성화시키는 작용이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 대식세포로부터 IL-12의 생산능은 항원에 대항하는 자연 및 획득 면역계의 활성화에 중요한 요소로 작용되는 cytokine으로 간주되고 있다(Dredge K. et al., Cancer Immunol. Immunother. 2002, 51, 521-531, 2002)]
한편, TNF-α는 특정 암세포에 대한 세포독성과 항 바이러스성 작용이 있고, 급성 및 만성 염증질환에서 일어나는 여러 가지 생체반응에도 중요한 역할을 한다고 알려져 있다 (Kuby J. In 'Immunology' 2nd ed. 1994, Chap. 15. W.H. Freemn company. USA.))
본 발명은 (a) 감잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계; 및 (b) 상기 효소 처리된 감잎 분말에서 분자량 3 내지 300 kDa 의 분획물을 회수하는 단계를 포함하는 면역 증강 활성이 있는 감잎 유래 다당 분획물 제조방법을 제공한다.
(a) 감잎에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계;
펙틴 가수분해 효소는 감잎 분말 중량 대비 1 내지 20% 만큼 첨가하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 5 내지 15% 이고, 가장 바람직하게는 10% 일 수 있다. 본 발명에서 감잎은 건조되지 않은 것 또는 건조된 것을 사용할 수 있으면, 분쇄된 것 또는 분말화 된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는 효소를 처리하는 상기 감잎 분말은 증류수로 5배 내지 15배(w/v) 정도로 현탁하여 사용할 수 있다. 상기 가수분해 효소 처리는 1 내지 5일 동안 처리하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 2 내지 4일 일 수 있다. 상기 (a) 단계는 효소 처리 후, 잔존 펙틴 가수분해 효소를 90 내지 110℃에서 10 내지 60분동안 가열하여 효소를 불활성화하는 공정을 추가로 포함한다. 상기 가열로 인해 가용성 다당성분의 용출을 증가시키며, 일부 불순물로 포함되어 있는 고분자 단백질을 변성, 침전시킴으로서 원심분리에 의한 다당 추출물 획득 및 순도를 증진시킨다.
또한 상기 (a) 단계는 효소 처리 전, 감잎 분말을 탈색하는 공정을 포함할 수 있다. 탈색하기 위한 용매로는 인체에 무해하여 그 사용이 허가된 탈색 용매라면 다 가능하다. 바람직하게는 에탄올, 아황산칼륨, 아황산나트륨, 이산화황, 과산화벤조 일 수 있고, 가장 바람직하게는 에탄올이다.
(b) 상기 효소 처리된 감잎에서 분자량이 3 내지 300 kDa인 분획물을 수득하는 단계;
(b) 단계는 상기 (a) 단계에서 효소처리 후 원심분리, 용매분획 또는 여과 등의 방법으로 잔사를 제거하여 얻은 다당 추출물로부터 분자량이 3 내지 300 kDa 인 분획물을 수득하는 단계로서, 수득하는 수단은 분자량을 기준으로 정제하는 당업계에 알려진 공정은 모두 가능하며, 바람직하게는 한외여과, 용매분획 또는 겔 여과 크로마토그래피이고, 가장 바람직하게는 한외여과이다. 최종 다당 분획물의 형태는 추출물, 농축물 또는 분말일 수 있다.
(c) 상기 회수된 분획물에서 분자량이 5 내지 30 kDa인 분획물을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 최종 다당 분획물에 50~100%의 탄소수 1 내지 4의 알코올을 첨가하여 저분자 물질 및 불순물을 제거하여 다당을 정제하는 단계를 추가로 실시할 수 있다.
본 발명의 감잎 유래 다당 분획물은 인터루킨-6, 12 및 TNF-α의 생성을 촉진하여 면역 기능을 증진시키고, 대식세포에 대해 뚜렷한 독성이 없으며, 자연살해세포의 활성을 증가시키며 암세포의 전이를 억제하는 효능을 나타내는 바, 면역 증강용 또는 암 개선용 식품용 조성물, 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조에 효과적이다.
도 1은 PLE-II의 HPLC 스펙트럼 결과이다.
도 2의 A는 PLE-II의 대식세포에 대한 독성 테스트 결과이다.(Cytotoxicity on macrophage (%) : 대식 세포의 생존율, concentration of sample (㎍/㎖) : 대식 세포에 처리한 PLE-II의 농도, Normal : PLE-II를 가하지 않은 대식세포 대조군)
도 2의 B는 PLE-II의 종양 세포에 대한 독성 테스트 결과이다.(Cytotoxcity on Colon 26- M3 .1 (%) : 종양 세포의 생존율, concentration of sample (㎍/㎖) : 종양 세포에 처리한 PLE-II의 농도, Normal : PLE-II를 가하지 않은 종양 세포 대조군)
도 3의 A는 PLE-II의 농도에 따른 사이토킨 IL-6의 생성 농도 측정 결과이다.
도 3의 B는 PLE-II의 농도에 따른 사이토킨 IL-12의 생성 농도 측정 결과이다.
도 3의 c는 PLE-II의 농도에 따른 사이토킨 TNF-α의 생성 농도 측정 결과이다.
도 4는 PLE-II 농도에 따른 NK cell 의 활성을 측정한 결과이다. (Lysis (%) - NK cell 의 세포 살해능, Dose of sample ( mg / Kg ) - PLE-II 처리농도, Control - PLE-II 처리 안한 대조군, 100:1, 50:1, 25:1 - E/T 비율)
도 5는 감잎 유래 다당 분획물의 암 전이 억제율을 나타낸다. (TC : Tumor control, 종양만을 접종한 대조군)
도 6은 PLW-0 및 PLE-0의 농도에 따른 NK cell 의 활성을 측정한 결과이다. (Dose of sample (mg/Kg) - PLW-0 및 PLE-0 처리농도, Normal - PLW-0 및 PLE-0를 처리 안한 대조군)
도 7의 (a)는 PLW-0 및 PLE-0의 정맥투여에 의한 암 전이 억제율을 나타낸다. (b)는 PLW-0 및 PLE-0의 경구투여에 의한 암 전이 억제율을 나타낸다. (Concentration of sample (μg/ mouse ) - PLW-0 및 PLE-0 처리농도)
도 2의 A는 PLE-II의 대식세포에 대한 독성 테스트 결과이다.(Cytotoxicity on macrophage (%) : 대식 세포의 생존율, concentration of sample (㎍/㎖) : 대식 세포에 처리한 PLE-II의 농도, Normal : PLE-II를 가하지 않은 대식세포 대조군)
도 2의 B는 PLE-II의 종양 세포에 대한 독성 테스트 결과이다.(Cytotoxcity on Colon 26- M3 .1 (%) : 종양 세포의 생존율, concentration of sample (㎍/㎖) : 종양 세포에 처리한 PLE-II의 농도, Normal : PLE-II를 가하지 않은 종양 세포 대조군)
도 3의 A는 PLE-II의 농도에 따른 사이토킨 IL-6의 생성 농도 측정 결과이다.
도 3의 B는 PLE-II의 농도에 따른 사이토킨 IL-12의 생성 농도 측정 결과이다.
도 3의 c는 PLE-II의 농도에 따른 사이토킨 TNF-α의 생성 농도 측정 결과이다.
도 4는 PLE-II 농도에 따른 NK cell 의 활성을 측정한 결과이다. (Lysis (%) - NK cell 의 세포 살해능, Dose of sample ( mg / Kg ) - PLE-II 처리농도, Control - PLE-II 처리 안한 대조군, 100:1, 50:1, 25:1 - E/T 비율)
도 5는 감잎 유래 다당 분획물의 암 전이 억제율을 나타낸다. (TC : Tumor control, 종양만을 접종한 대조군)
도 6은 PLW-0 및 PLE-0의 농도에 따른 NK cell 의 활성을 측정한 결과이다. (Dose of sample (mg/Kg) - PLW-0 및 PLE-0 처리농도, Normal - PLW-0 및 PLE-0를 처리 안한 대조군)
도 7의 (a)는 PLW-0 및 PLE-0의 정맥투여에 의한 암 전이 억제율을 나타낸다. (b)는 PLW-0 및 PLE-0의 경구투여에 의한 암 전이 억제율을 나타낸다. (Concentration of sample (μg/ mouse ) - PLW-0 및 PLE-0 처리농도)
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
감잎 유래 다당 분획물의 제조
<1-1> 비효소처리(열수추출) 조다당 분획물(PLW-0) 제조
감잎(persimmon leaf)은 ㈜백장생에서 시판하는 감잎(감잎, 경북영천)을 분말화하여 사용하였다. 90% ethanol을 건조분말 중량의 10배(w/v)가 되도록 건조분말에 첨가하여, 48시간 동안 교반시키고, 여과 및 건조 과정을 거쳐 탈색을 완료하였다.
상기 탈색 건조분말을 증류수(10배(w/v))에 현탁하여 100℃에서 3시간 동안 가열처리하였다. 열수추출액을 4℃, 6,500×g, 15분으로 원심분리 후, 상등액을 분리하여 상등액의 4배 부비(v/v)의 80% ethanol을 가하여 24시간 동안 정치하면서 다당을 침전시켰다. 침전된 다당에 투석(분자량 cut-off : 6,000~8,000)을 행하여 열수추출 조다당 분획물(PLW-0)을 얻었다.
<1-2> 효소처리 조다당 분획물(PLE-0) 및 활성 다당 분획물(PLE-II) 제조
탈색한 감잎 건조분말은 상기 실시예 <1-1>의 것과 동일한 것을 사용하였다.
탈색된 건조분말을 증류수 10배(w/v), pH 4에 현탁하여, pectinase(Rapidase C80MAX, 비전비이오켐)를 원료당 10%로 첨가한 후, 50℃ incubator에서 3일간 효소 처리한다. 그 후 상기 효소 처리 반응액을 101℃에서 30분 간 가열처리하여 가용성 다당의 추출 및 잔존 pectinase를 불활성화 시킨다.
효소 처리를 마친 상기 시료를 4℃, 6,500×g, 15분 원심분리하여 잔사를 제거하고, 한외 여과로 여과시켜, 분자량이 3kDa 이하인 미세한 물질들을 제거하여 효소처리 조다당 분획물(PLE-0)을 얻었다.
PLE-0에 한외여과를 2번 실행하여, 분자량이 5 ~ 30 kDa 인 다당 분획물(PLE-II)를 얻었다.
<실시예 2>
분획물의 당 성분 분석
<2-1> 구성당 분석
구성당 분석은 Albersheim 등의 방법을 일부 변형하여 가수분해 후 각 구성당을 alditol acetate로 유도체화 하여 GC(Gas Chromatography)를 이용하여 분석하였다. 다당 시료를 2 M TFA (trifluoroacetic acid) 중에서 121°C, 1.5시간 반응시켜 가수분해한 후, 그 가수분해물을 Dowex-1(acetate form)resin에 의해 중성당과 산성당으로 분리하였다. 1 mL의 1 M NH4OH(Ammoniasolution)에 용해하여 10 mg의 NaBH4로 4시간 환원시켰다. Acetic acid를 적당량 가하여 잔존 NaBH4를 제거한 후, methanol을 가하며 반복 건조함으로써 과량으로 가해진 acetic acid를 제거하여 각 구성당에 상당하는 alditol로 전환하였다. 이 후 각각의 alditol은 1 mL의 acetic anhydride를 가하여 121°C에서 30분 동안 반응시켜 alditol acetate로 전환시켰으며 이를 chloroform/H2O2상 용매계로 분리하여 추출하고, 추출물은 건조 후 소량의 acetone에 용해하여 GC 분석용 시료로 사용하였다. Alditol acetate 유도체의 GC분석 조건은 표 2와 같으며, 각 구성당의 mole%는 각 유도체의 peak면적, 분자량 및 FID(Flame ionization detector)에 대한 molecular response factor를 각각 산출하여 계산하였다.
| Apparatus | GC ACME 6100 (Young Lin Co. Ltd., Anyang, Korea) |
| Detector | Flame ionization detector(FID) (Young Lin Co. Ltd., Anyang, Korea) |
| Column | SP-2380 capillary column (Supelco, Bellefonte, USA) |
| Column size | 0.25 mm× 30 m, 0.2 m film thickness |
| Oven temp. | 60°C (1 min) 220°C (12 min) 250°C (15 min) 30°C/min 8°C/min |
| Injector temp. | 250°C |
| Detector temp. | 270°C |
| Carrier gas | N2(1.5mL/min) |
그 결과, PLE-II를 구성하는 것 중 주류는 Rhamnose, Arabinose, Galactose, Galacturonic acid, Glucuronic acid 이었고, 특이적으로 자연계에서 잘 관찰되지 않는 Rhamnogalacturonan II (RG-II)의 지표물질인 2-methylfucose, 2-methylxylose, apiose, aceric acid, 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid(KDO) 및 3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaricacid (DHA)등의 희귀 구성당을 포함하고 있었다([표 3] 참조).
| Chemical composition (%, 또는 중량%) | PLW-0 | PLE-0 | PLE-ll |
| Neutral sugar | 60.4 | 71.3 | 69.5 |
| Uronic acid | 38.3 | 26.2 | 27.2 |
| Protein | 0.0 | 0.7 | 0.0 |
| KDO - liked material | 1.3 | 1.8 | 3.3 |
| Component of neutral sugar( mole %) | |||
| 2- Mefuc | 0.3 | 1.6 | 4.0 |
| Rha | 7.1 | 15.6 | 27.9 |
| Fuc | 1.2 | 2.4 | 4.9 |
| 2- Mexyl | 0.5 | 2.0 | 4.7 |
| Ara | 33.6 | 26.3 | 28.2 |
| Xyl | 5.7 | 6.7 | 0.0 |
| Api | 3.9 | 4.5 | 2.9 |
| Aceric acid | 2.5 | 1.4 | 3.5 |
| Man | 1.2 | 2.1 | 0.4 |
| Gal | 28.5 | 32.3 | 19.6 |
| Glc | 15.5 | 5.1 | 3.9 |
상기 KDO-liked material은 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid(KDO) 및 3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaricacid (DHA)를 지칭하는 것이고, Uronic acid는 Galacturonic acid, Glucuronic acid를 지칭하는 것이다. 중성당을 구성하는 당들은 전체 중성 다당을 기준으로 성분의 함량을 표시한 것이다.
<2-2>
PLE
-
II
의 순도 검정
정제한 PLE-II의 순도를 HPLC를 통하여 확인하였다. 분석은 Asahipak GS-320+GS220(각 0.76×50cm, Asahi Chemical Industry Co., 일본)을 장착한 Shimadzu LC 6A를 사용하였고, 0.2M NaCl를 용매로 용출하였다.
결과는 [도 1]에 기재하였다. 상기 [도 1]에서 좌우대칭의 단일 peak를 나타내어 비교적 순수하게 정제되었음을 알 수 있고, 표준물질(pullulan series)을 이용한 분자량 측정 결과 감잎으로부터 정제된 PLE-II의 분자량은 18 kDa임을 확인하였다.
<
실시예
3>
PLE
-
II
의 독성 테스트
종양세포 및 비종양세포에 대한 시료의 세포독성 여부를 확인하기 위해, 비종양성 대식세포, 종양세포주인 Colon26-M3.1(RCB2657, Cell Bank, RIKEN Bioresource Center, Tsukuba, Japan)을 각각 1×104 cells/mL의 농도로 계수한 후 flatbottomed 96well microplate에 100 mL씩 분주하고 여러 농도로 조정된 감잎 유래 다당 분획물 시료(PLE-II)를 각 Well에 100 mL씩 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 3일간 배양하였다. 각 시료농도에 따른 세포 독성의 효과는 CCK8 (cell counting kit8, Dojindo Co. Ltd., Japan)를 5배 희석하여 well당 50 mL씩 가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 30~60분간 반응시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다(Hwang YC et al ., Korean J Food Sci Technol. 40 : 220-227, 2008 참조).
PLE-II를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 100으로 놓고 결과를 [도 2]에 기재하였다. [도 2]에서 macrophage 및 상기 종양 세포주에 대해서 PLE-II는 독성이 없다는 것을 확인할 수 있다.
<
실시예
4>
PLE
-
II
의 대식세포
사이토킨
생성
촉진능
BALB/c (암컷, 6 weeks) mouse의 복강에 5% thioglycollate medium 2 mL 주입하여 72시간 동안 유도된 macrophage를 회수하여 96 well culture plate에 2.25×105 cells/mL으로 조제된 macrophage 100 μL를 가한 후 농도별로 조제한 시료 100 μL를 첨가하고 37℃, 5% CO2배양기에서 24시간 배양하였다. 배양 종료 후 1,500 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하여 세포배양액 150 μL를 회수하고 상등액 중에 유도된 cytokine의 함량을 측정하였다.
Macrophage(대식세포)에 의해 생성된 사이토킨(cytokine)의 함량은 sandwich ELISA (enzymelinked immunosorbent assay)에 의해 분석하였다. 각 사이토킨의 항체는 coating buffer에 희석하여 flatbottomed 96well microplate에 coating한 후 4℃에서 12시간 방치하였다. Coating이 완료된 microplate는 washing buffer (PBS with 0.05% tween 20, PBST)를 이용하여 3차례 세척하고, assay diluent (PBS with 10% FBS or 2% skim milk) 200 mL를 가하여 1 시간 동안 방치하여 항체가 붙지 않은 well 표면을 blocking하였다. blocking 완료 후 각 well은 washing buffer를 이용하여 재차 3회 세척하고, 각 well에 연속 희석한 표준물질(recombinant mouse cytokine)과 면역세포배양액을 각각 50 mL씩 분주하였다. 이를 실온에서 2시간 동안 방치한 다음 washing buffer로 세척하고 detection antibody (in assay diluent) 100 mL를 처리하여 실온에서 1시간 방치한 후 재차 세척하였다. Enzyme reagent (avidinhorseradish peroxidase conjugate) 100 mL를 처리하여 실온에서 30분간 결합시킨 후 substrate solution [tetramethylbenzidine (TMB) and hydrogen peroxide] 100 mL를 가하여 암소에서 30분간 반응시킨 후 50 mL의 stop solution [(1 M H3PO4 or 2 N H2SO4)]을 처리하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다(Saike I et al., Vaccine 6: 238-244, 1988 참조).
감잎 유래 다당 시료의 직접적인 자극에 의한 대식세포의 cytokine 생산을 측정한 결과는 [도 3]에 기재하였다. [도 3]에서 PLE-II는 IL-6, IL-12, TNF-α의 생성을 촉진함을 확인할 수 있다.
IL-6의 경우 PLE-II는 4.0 ㎍/㎖이상 100 ㎍/㎖의 농도에서 양성대조군인 LPS (lipopolysaccharide)와 유사한 정도의 높은 생성능을 보였다. 단순 물추출물로부터의 조다당분획물(PLW) 및 효소처리물로부터 얻은 조다당분획물(PLE-0)도 농도의존적으로 활성이 증가하는 양상을 보였지만 100 ㎍/㎖이하의 농도에서 IL-6 생산량은 PLE-II에 비해 훨씬 낮았다. 따라서도 PLE-II는 PLW-0, PLE-0 보다도 적은 양으로 큰 효과를 볼 수 있다.
IL-12는 20.0 ㎍/㎖ 농도까지는 농도 의존적으로 생성능이 증가하다가, 그 이상부터는 다소 감소하는 양상을 나타내었으나 전체적으로 PLW 및 PLE-0에 비해 높은 IL-12 발현량을 나타내었다. TNF-α의 경우도 유사한 경향을 나타내어 100 ㎍/㎖ 까지 농도의존적인 발현량 증가를 나타내었다.
<
실시예
5>
감잎 유래 다당에 의한
NK
-
cell
의 암세포
살해능
<5-1>
PLE
-
II
가
NK
-
Cell
의 암세포
살해능에
주는 효과
감잎 유래 다당 분획물 시료를 BALB/c (암컷, 6 주령) mouse에 2 mg/kg(마우스 무게) 만큼 정맥주사하고 3일 후에 경추탈구 법으로 치사시켜 무균적으로 비장(spleen)을 적출하였다. PBS(phosphate buffered saline)용액 상에서 Stainless steel mash로 마쇄(100 mesh) 및 여과(200 mesh)하여 비장세포를 획득하였다. 0.2% NaCl 5 mL을 15 ~ 30 초 동안 가하여 혼입된 적혈구를 파괴하고 무혈청 배지로 2~3회 세척 후 세포수가 1×106 cells/mL가 되도록 조정하고 이를 effector cell로 사용하였다.
NKcell에 대한 감수성이 높은 종양세포 YAC1을 target cell로 하여 roundbottomed 96well microplate에 effector cell과 target cell의 비율(E/T ratio)이 100, 50, 25이 되도록 조정하여 가하였다. 37℃, 5% CO2 배양기에서 6시간 배양 후 effect cell의 살해능에 의해 target cell로부터 유리되는 lactate dehydrogenase(LDH)의 발생양을 Cytotox96 (Promega Madison, WI, USA)를 사용하여 측정하였다. NK cell의 종양세포 살해능은 다음 식에 의해 계산하였다(Mueller EA et al., J. Immunopharm. 19: 69-77, 1990 참조).
*
NK
cell
activity
(%)
= [(실험분비량자연분비량)/(최대분비량자연분비량)]×100
자연분비량 : effector cell 없을 때 targel cell로부터 유리되는 LDH 분비량
실험분비량 : effector cell 있을 때 targel cell로부터 유리되는 LDH 분비량
최대분비량 : Target cell을 10% triton X-100 으로 배양한 후 측정한 LDH 분비량
NK 세포 활성화에 대한 실험 결과는 [도 4]에 기재하였다. PLE-II를 처리하지 않은 대조군 대비 약 26% 이상 암세포를 치사시키는 효과가 있는 것을 확인할 수 있다.
<5-2>
PLE
-O가
NK
-
Cell
의 암세포
살해능에
주는 효과
6주령 BALB/c mouse에 감잎 유래 다당 분획물 시료를 10 및 100 μg/mouse/day의 농도로 1일 1회, 총 20일 동안 경구 투여하였다. 경구 투여 완료 후, 경추탈구법으로 희생하여 무균적으로 비장(spleen)을 적출하였다. Stainless steel mesh를 이용하여, PBS 상에서 마쇄(100 mesh) 및 여과(200 mesh)하고 림프구 세포를 획득하였다. 0.2% NaCl 5 ml을 15 내지 30초 동안 가하고 진탕하여, 혼합된 적혈구를 파괴하고 무혈청배지로 3회 세척 후 hemacytometer를 이용하여 세포수를 1×106cells/ml이 되도록 조정하고 이를 effector cell로 사용하였다. 마우스 NK cell에 대한 감수성이 높은 YAC-1 lymphoma 세포를 target cell로 하여 round-bottomed 96-well microplate (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, New Jersey USA)에 effector cell과 target cell의 비율(E/T ratio)이 25, 50, 100이 되도록 조정하여 가하였다. 37℃, 5% CO2배양기에서 18∼24시간 동안 배양 후 1,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 배양액 상등액 100ml을 회수하였다. NK cell의 세포독성 효과는 effector cell인 NK cell에 의하여 살해됨으로써 target cell로부터 배양상등액으로 유리된 lactate dehyfrogenase(LDH)를 LDH assay kit (Oxford)을 사용하여 측정하였다. NK cell의 종양세포 살해능은 상기 실시예 5-1의 식에 의해 계산하였다.
실험결과 PLE-0의 NK cell 자극활성의 결과는 [도 6]에 표시한 바와 같이 target cell (YAC1)에 대한 effect cell (splenocytes)의 비율(E/T ratio)에 의존적으로 종양세포에 대한 살해능을 나타냈다. 실험한 모든 E/T 비율에서 효소처리와 분자량 분획에 의해 제조한 PLE-0의 치사율이 단순 열수추출 다당분획인 PLW-0에 비해 높은 치사율을 나타내었다. 이로써 감잎 다당 분획물은 경구투여 시에도 종양세포에 대한 살해능을 가지는 NK cell의 활성화에 기여함을 확인할 수 있었다.
<
실시예
6>
감잎 유래 다당의 항전이 활성
<6-1>
PLE
-0 및
PLE
-
II
의 항전이 활성 효과
시료의 항전이 활성은 폐(lung)에 대한 고전이성 종양세포주인 Colon 26-M3.1을 이용한 실험동물 종양전이 모델을 이용하였다. 시료에 의한 종양전이 효과를 관찰하기 위해 Colon 26-M3.1 carcinoma cell을 4×104 cells/mouse의 수로 조정하여 6주령 female C57BL/6 mouse에 정맥 주사하였고, 시료는 종양 투여 2일전에 각 농도별로 정맥 주사하였다. 종양투여 14일 후 mouse를 경추탈구법으로 희생하고, 종양세포의 표적기관인 폐를 적출하여 Bouin's solution (Sigma)에서 전이된 종양을 고정, 염색한 후 전이된 종양 colony를 계수하였다. 시료에 의한 항종양전이 효과는 종양만을 접종한 대조군과 비교 산출하였다(Ha ES et.al., Arch Pharm Res. 27: 217-224 (2004), & Yoon TJ et.al., J. Ethnopharm. 93: 247-253 (2004) 참조).
실험 결과 tumor control군에서는 평균 120 여개의 colony가 계수되었고, 이를 기준으로 감잎 유래 단순 열수추출 조다당 PLW-0, 효소처리 조다당 PLE-0와 효소처리 조다당 정제획분 PLE-II에서의 억제율을 계산하였을 때 1000 /mouse 농도에서 시료를 투여하였던 모든 실험군에서 70% 이상의 높은 억제율을 확인하였고 그 결과는 [도 5]에 표시하였다.
상기 [도 5]에서 PLE-II가 82.2%의 가장 우수한 활성을 나타내고, 실험군 모두 저농도에서 고농도로 농도 의존적으로 억제율이 높아지는 것을 확인 할 수 있다. 특히, 10 /mouse의 저농도에서는 PLW-0 30.2% , PLE-0 53.5%, PLE-Ⅱ 64.2%의 활성을 나타냄으로써 PLW-0 보다 PLE-II에서 2배 이상의 더 강력한 항전이 활성을 나타내었다.
<6-2>
PLE
-0의 정맥투여 및 경구투여에 의한 항전이 활성 효과
6주령 C57BL/6 mouse에 시료를 10, 100 및 1000 μg/mouse/day의 농도로 종양투여 2일전에 정맥주사하거나 종양투여전 10 μg/mouse/day의 농도로 1일 1회, 총 20일 동안 경구 투여하였다. 시료의 정맥 또는 경구 투여 완료 후, Colon26-M3.1 carcinoma cell을 4×104cells/mouse의 수로 조정하여 정맥 주사하였고, 시료는 9일째까지 격일로 각 농도별로 경구 투여하였다. 종양투여 14일 후 mouse를 경추탈구법으로 희생하고, 종양세포의 표적기관인 폐를 적출하여 Bouin's solution (Sigma)에서 전이된 종양을 고정, 염색한 후 전이된 종양 colony를 계수하였다. 시료에 의한 항종양전이 효과는 종양만을 접종한 대조군과 비교 산출하였고, 그 결과는 [도 7]에 나타내었다.
실험결과 [도 7]의 (a)에서 PLW-0의 전이 억제율은 실험 결과, 정맥투여시에 시료를 투여하지 않은 대조군에 비해 10μg 투여시 PLW-0는 30.2% 수준의 항이전이활성을 나타낸 반면 PLE-0를 투여한 경우에는 이보다 2배 정도 높은 63.5%의 항전이 효과를 나타내었으며 1,000 μg의 PLW-0를 투여한 실험군에서는 약 71.7%의 항전이 효과가 확인된 반면 동일농도에서 PLE-0를 투여한 결과, 약 87.7%의 높은 항전이 활성을 나타내었다. 이는 단순 열수추출 다당분획물에 비해 효소처리하여 얻은 조다당 분획의 항전이 효과가 현저히 증가됨을 나타내는 결과이었다. 또한 실험결과 [도 7]의 (b)에서 감잎 유래 다당 분획물들을 경구 투여한 경우에도 열수추출다당분획물 투여군(PLW-0)의 전이 억제율은 47.1%인데 반해 효소처리 다당분획투여군(PLE-0)은 70% 수준의 높은 항전이 효과가 관찰되었다.
본 발명의 감잎 유래 다당 분획물은 인터루킨-6, 12 및 TNF-α의 생성을 촉진하여 면역 기능을 증진시키고, 대식세포에 대해 뚜렷한 독성이 없으며, 자연살해세포의 활성을 증가시키며 암세포의 전이를 억제하는 효능을 나타내는 바, 면역 증강용 또는 암 개선용 식품용 조성물, 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등을 제조할 수 있어, 산업상 이용가능성이 높다.
Claims (19)
- 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar)은 60 내지 80 중량%, 우론산(uronic acid)은 18 내지 39 중량%, KDO(3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid) 유사 물질은 0.5 내지 10 중량% 인 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물.
- 제1항에 있어서, 상기 우론산은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어진 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물.
- 제1항에 있어서, 상기 KDO 유사물질은 DHA (3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 및 KDO 로 이루어진 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물.
- 제1항에 있어서, 상기 중성 다당은 아라비노오스, 람노오스, 갈락토오스, 퓨코오스, 글루코오스 및 람노갈락투로난(Rhamnogalacturonan)-II 지표 다당류를 포함하는 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물.
- 제1항에 있어서, 상기 중성 다당은 상기 감잎 유래 다당 분획물을 구성하는 전체 중성 다당 대비 아라비노오스 20 내지 40 mole%, 람노오스는 10 내지 40 mole%, 갈락토오스는 10 내지 40 mole%, 퓨코오스는 1 내지 10 mole%, 글루코오스는 1 내지 10 mole%, 람노갈락투로난-II 지표 다당류는 0.4 내지 26 mole% 인 다당을 포함하는 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물.
- 제5항에 있어서, 상기 람노갈락투로난-II 지표 다당류는 상기 감잎 유래 다당 분획물을 구성하는 전체 중성 다당 대비 2-메틸퓨코오스는 0.1 내지 8 mole%, 2-메틸자일로스는 0.1 내지 8 mole%, 아피오스는 0.1 내지 5 mole%, 아세릭산은 0.1 내지 5 mole% 인 다당으로 구성되는 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물.
- 제1항에 있어서, 상기 다당 분획물은
(a) 감잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계; 및
(b) 상기 효소 처리된 감잎 분말에서 분자량 3 내지 300 kDa 의 분획물을 회수하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물.
- 제1항에 있어서, 상기 당 분획물은
(a) 감잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계;
(b) 상기 효소 처리된 감잎 분말에서 분자량 3 내지 300 kDa의 분획물을 회수하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 회수된 분획물에서 분자량 5 내지 30 kDa의 분획물을 회수하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물.
- 제1항에 있어서, 상기 감잎 유래 다당 분획물은 면역 증강 활성이 있는 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물.
- 제1항에 있어서, 상기 감잎 유래 다당 분획물은 암 전이 억제 활성이 있는 것을 특징으로 하는 감잎 유래 다당 분획물.
- 제1항의 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 건강기능식품 조성물.
- 제1항의 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 약학적 조성물.
- 제1항의 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 식품용 조성물.
- 제1항의 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 감기 및 만성피로로 이루어진 군에서 선택되는 면역력 저하로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항의 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 암은 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 림프종, 재생불량성 빈혈 및 혈액암로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제1항의 감잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 항암보조제.
- (a) 감잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계; 및
(b) 상기 효소 처리된 감잎 분말에서 분자량 3 내지 300 kDa의 분획물을 회수하는 단계를 포함하는 감잎 유래 다당 분획물 제조방법.
- (a) 감잎 분말에 펙틴 가수분해 효소를 처리 하는 단계;
(b) 상기 효소 처리된 감잎 분말에서 분자량 3 내지 300 kDa의 분획물을 회수하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 회수된 분획물에서 분자량 5 내지 30 kDa의 분획물을 회수하는 단계를 포함하는 감잎 유래 다당 분획물 제조방법.
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