KR20140049972A

KR20140049972A - 핵산의 검출 방법 및 그 방법에 사용하는 디바이스, 키트

Info

Publication number: KR20140049972A
Application number: KR1020137023530A
Authority: KR
Inventors: 시게히코 미야모토; 준 도모노; 고지 다카하시; 소타로 사노; 다카아키 지키하라
Original assignee: 가부시키가이샤 가네카
Priority date: 2011-03-04
Filing date: 2012-03-05
Publication date: 2014-04-28
Also published as: US9476836B2; KR101904787B1; EP2682480B1; WO2012121225A1; SG10201601638QA; JP5977228B2; US20160209332A1; CN103403190B; SG193315A1; CN103403190A; US9273174B2; EP2682480A1; US20140058043A1; EP2682480A4; JPWO2012121225A1

Abstract

본 발명의 과제는, 증폭 핵산의 분석에 있어서 문제로 되고 있는, 비용이나 조작성, 샘플의 컨테미네이션이나 오염의 방지이다. 본 발명은, 핵산을 함유하는 시료와 핵산의 검출 시약을 폐쇄계 내에서 혼합한다. 그때, 핵산은 동일 폐쇄계 내에서 증폭 후, 개방되지 않고 검출 시약과 혼합된다. 그를 위한 수단으로서, 예를 들면 코팅재 등에 의해 검출 시약이 차폐된 디바이스가 사용된다.

Description

핵산의 검출 방법 및 그 방법에 사용하는 디바이스, 키트{NUCLEIC ACID DETECTION METHOD, AND DEVICE AND KIT FOR USE IN SAME}

본 발명은, 핵산의 검출 방법, 및 그 방법에 사용하는 디바이스, 키트에 관한 것이다.

조직, 혈액, 타액, 오줌 등의 생체 시료를 사용한 유전자 임상 검사, 식품이나 식물 등의 유전자 분석을 행할 때에는, 표적 핵산을 효율적으로 분석하기 위하여 PCR(polymerase chain reaction)법, LAMP(loop-mediated isothermal amplification)법 등의 핵산 증폭법이 이용되고 있다. 이들 방법은, 미량의 타깃을 검출하는데 유효하다. 그러나, 증폭 반응 후의 핵산을 함유하는 용액은, 회수해서 다른 검출 조작으로 옮길 필요가 있고, 그때에 반응 용기를 개방할 필요가 있기 때문에, 핵산을 함유하는 샘플이 외부로 비산하거나 다른 반응액이 혼입하여 의양성(擬陽性)의 결과가 나오거나 할 우려가 있다. 또한, 증폭 핵산의 검출에는 특수한 장치나 숙련된 검사 기술이 요구된다. 그 때문에 임상 검사나 베드사이드 등, 시료의 채취 현장에서의 검사는 보급되어 있지 않으며, 검사는 수탁 센터나 전문 연구 기관에서의 실시로 한정되어 있는 것이 실상이다.

증폭 핵산의 검출법으로서는, 증폭 반응 후의 용액을 아가로스 전기 영동으로 분리 후, 형광성 인터칼레이터로 염색하여, 특이적인 형광을 관찰하는 방법이 가장 일반적으로 사용되고 있다(비특허문헌 1). 그러나, 형광으로 검출하기 위해서는, 프라이머나 인터칼레이터 등의 고가인 화합물, 및 UV 조사 장치 등의 여기 장치나 겔 촬영 장치 등의 고가인 기기를 필요로 한다. 또한, 증폭 핵산의 전기 영동은, 장시간의 영동 공정을 필요로 한다.

핵산 증폭 방법으로서, LAMP법은, 반응에 온도 사이클이 필요없고, 등온에서 진행하며, PCR법과 비교해서 증폭량이 많다는 이점이 있다. 특히, 형광에 의하지 않고 LAMP법의 증폭 핵산을 검출하는 방법으로서, 반응의 부생성물인 피로인산이 불용성의 마그네슘염을 발생시키는 것을 이용한, 백탁의 검출이나, 형광 금속 지시약에 의한 반응액 중의 마그네슘 농도 변화의 검출이 알려져 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 2). 그러나, 이들 검출 방법에 있어서도, 증폭의 유무를 확실하게 시인(視認)할 수는 없기 때문에, 탁도계나 UV 조사 장치 등의 기계를 필요로 하는 것이 실정이다.

이상의 문제를 해결하기 위하여, 지금까지 몇 가지 시도가 이루어져 왔다. 예를 들면, 핵산의 증폭과 검출을 단일의 용기 중에서 행할 수 있는 디바이스가 보고되어 있다(특허문헌 2). 그러나, 고가인 표지 프라이머를 사용하며, 검출 시약을 별도 첨가할 필요가 있는 등, 수고가 드는 것이었다. 혹은, 미리 건조시킨 핵산 증폭 시약을 용기에 첨가해 둠으로써, 조작을 간편화하고, 또한 폐쇄계에서 핵산 증폭을 행할 수 있는 디바이스도 보고되어 있다(특허문헌 3). 그러나, 검출 시에는 반응 용기를 개방할 필요가 있어, 검출까지를 일관해서 폐쇄계에서 행할 수는 없었다.

일본국 특허 제4683811호 일본국 특개2003-38161호 공보 일본국 특개2009-201458호 공보

Molecular Cloning second edition, vol. 1, 6.15(1989) Nature Protocols, vol. 3, No. 5, p877-882(2008)

본 발명은, 핵산 증폭법에 의해 증폭된 핵산을, 가시광에서, 반응 종료 후 즉시 용기 내에서 검출 가능한 핵산 검출법, 및 핵산의 증폭으로부터 검출까지를, 용기의 폐쇄계를 개방하지 않고 행할 수 있는 검출용 디바이스를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자는 예의 검토한 결과, 가시광에서 핵산을 검출하기 위한 시약을 폐쇄계로 되는 반응 용기나 그 뚜껑에 미리 투입해 둠으로써, 핵산 증폭 후의 용액에 반응 용기를 개방하지 않고 녹여 넣기 때문에, 샘플의 비산이나 오염을 방지할 수 있어, 핵산의 증폭을 간편 또한 단시간에 가시광에서 검출이 가능해지는 것을 찾아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은, 핵산과 검출 시약을 폐쇄계 내에서 접촉시키는 공정, 및 핵산 및/또는 검출 시약의 정색(呈色)을 가시광에서 판정하는 공정을 포함하는 핵산의 검출 방법에 관한 것이다.

상기 접촉 공정의 전 또는 후에, 핵산을 증폭하는 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다.

검출 시약이 고체인 것이 바람직하다.

검출 시약이 류코형 색소를 함유하는 것이 바람직하다.

류코형 색소가 트리아릴메탄계 색소인 것이 바람직하다.

트리아릴메탄계 색소가, 크리스탈 바이올렛 또는 겐티아나 바이올렛인 것이 바람직하다.

검출 시약이 구핵제(求核劑) 및/또는 안정화제를 함유하는 것이 바람직하다.

구핵제가, 수소화붕소나트륨, 시안화수소화붕소나트륨, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 차아황산나트륨, 피로아황산칼륨, 티오황산나트륨, 글루타티온, 아스코르브산, 2-메르캅토에탄올, DL-디티오트레이톨, 1-티오글리세롤, 시스테인, 트리부틸포스핀, 아미노에탄티올, 및 트리스2-카르복시에틸포스핀으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 구핵제인 것이 바람직하다.

안정화제가, α시클로덱스트린, β시클로덱스트린, γ시클로덱스트린, 및 아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 안정화제인 것이 바람직하다.

핵산의 증폭이 LAMP법에 의해 행해지는 것이 바람직하다. LAMP법에서 피로인산 제거 효소를 사용하는 것이 바람직하다. 피로인산 제거 효소가 내열성의 피로포스파타제인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은, 검출 시약을 유지하는 검출 시약 유지부, 및 상기 시약 유지부를 구비한 뚜껑부 및/또는 반응 용기를 갖는 핵산 검출용 디바이스 또는 키트에 관한 것이다.

뚜껑부 및/또는 반응 용기가 핵산 증폭 시약을 더 유지하는 것이 바람직하다.

검출 시약이 코팅재로 핵산으로부터 차폐되어 있는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은, 상기한 핵산 검출용 디바이스 또는 키트를 갖는 장치에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 핵산의 증폭으로부터 가시광에서의 검출까지를 간편하게 또한 폐쇄계 내에서 일관해서 행할 수 있어, 샘플의 비산이나 오염 등도 방지할 수 있다.

도 1은 (a) : 검출 디바이스(뚜껑형-돌출 타입 I)의 개략도. (b) : (a)를 개구부측에서 본 개략도. (c) : (a)를 (b)에서 나타낸 X-X'에서 절단하여, 개구부를 위로 해서 옆에서 본 개략도.
도 2는 (a) : 검출 디바이스(뚜껑형-돌출 타입 Ⅱ)의 개략도. (b) : (a)를 개구부측에서 본 개략도. (c) : (a)를 (b)에서 나타낸 X-X'에서 절단하여, 개구부를 위로 해서 옆에서 본 개략도.
도 3은 (a) : 검출 디바이스(뚜껑형-오목 타입)의 개략도. (b) : (a)를 개구부측에서 본 개략도. (c) : (a)를 (b)에서 나타낸 X-X'에서 절단하여, 개구부를 위로 해서 옆에서 본 개략도.
도 4는 검출 디바이스(뚜껑형-일시 차폐 타입)를, 개구부를 위로 해서 옆에서 본 개략도.
도 5는 도 1의 검출 디바이스(뚜껑형-돌출 타입 I)를 연결시킨 디바이스의 개략도.
도 6은 도 1 내지 도 5에서 나타낸 검출 디바이스(뚜껑형)를 사용한 핵산 검출 공정을 나타낸 도면.
도 7은 검출 디바이스(뚜껑형-반응 용기 일체형)의 개략도.
도 8은 도 7에서 나타낸 검출 디바이스(뚜껑형-반응 용기 일체형)를 사용한 핵산 검출 공정을 나타낸 도면.
도 9는 (a) : 검출 디바이스(반응 용기형 I)의 개략도. (b) : (a)를 (a)에서 나타낸 Y-Y'에서 절단하여, 옆에서 본 시약 유지부의 개략도. (c)∼(d) : (a)의 아형(亞型) 검출 디바이스(반응 용기형 Ⅱ)를 (b)와 마찬가지로 옆에서 본 시약 유지부의 개략도.
도 10은 검출 디바이스(반응 용기형-일시 차폐 타입)의 시약 유지부의 개략도.
도 11은 도 10에서 나타낸 검출 디바이스(반응 용기형-일시 차폐 타입)를 사용한 핵산 검출 공정을 나타낸 도면.
도 12는 검출 디바이스(뚜껑형)를 사용한 핵산 검출 공정을 나타낸 도면.
도 13은 검출 디바이스(반응 용기형)를 사용한 핵산 검출 공정을 나타낸 도면.
도 14는 검출 시약을 사용했을 경우의 LAMP 반응액의 파장 590㎚에 있어서의 흡광도의 경시적(經時的) 변화를 나타낸 도면.

이하, 본 발명을 상세히 기재한다.

본 발명은, 핵산과 검출 시약을 폐쇄계 내에서 접촉시키는 공정, 및 핵산 및/또는 검출 시약의 정색을 가시광에서 판정하는 공정을 포함하는 핵산의 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서의 핵산이란, 핵산 증폭법에 의해 얻어진 증폭 핵산, 이본쇄(二本鎖) DNA, 이본쇄 RNA, DNA와 RNA의 하이브리드쇄, 및 PNA 등의 인공 핵산의 이본쇄가 포함되지만, 일본쇄(一本鎖) 핵산이어도 된다. 예를 들면, 일본쇄 RNA를 역전사 효소에 의해 DNA로 역전사하고, 이 DNA를 주형(鑄型)으로 해서 이본쇄 핵산을 증폭하면, 간접적으로 RNA를 검출할 수 있기 때문이다.

핵산은, 시료에 함유되어 있는 것이어도 된다. 시료에는, 핵산 증폭법에 의해 얻어진 증폭 핵산, 핵산을 함유하는 생체 성분, 예를 들면 미생물이나 동물 세포, 식물 세포로부터의 추출액, 혹은 식품으로부터의 추출액이 포함된다. 생체 성분으로부터 추출된 DNA나 플라스미드 DNA도 포함된다.

핵산과 검출 시약의 접촉은, 핵산 및/또는 검출 시약을 정색시키는 것이면 된다. 예를 들면, 핵산을 함유하는 용액과 액체의 검출 시약을 혼합시켜도 되고, 핵산을 함유하는 용액과 개체의 검출 시약을 접촉시켜도 된다.

폐쇄계란, 핵산의 증폭 및 검출의 각 공정 사이에서 핵산을 함유하는 시료의 첨가나 제거가 행해지지 않고, 일관해서 폐쇄된 계를 의미한다. 단, 완전한 기밀(機密) 상태일 필요는 없으며, 예를 들면 용기 내에서 핵산과 검출 시약을 접촉시키기 위하여 용기를 상하 반전 등 했을 경우에, 핵산이나 검출 시약이 누출하지 않으면, 본 발명에 있어서의 폐쇄계에 해당한다. 폐쇄계 내에서 핵산과 검출 시약을 접촉시킴에 의해, 다른 핵산끼리의 혼입에 의한 오검출이나 핵산의 비산에 의한 오염을 방지할 수 있다. 접촉 공정의 전 또는 후에, 핵산을 증폭하는 공정을 더 포함할 경우에는, 당해 증폭 공정, 접촉 공정, 및 가시광에서 판정하는 공정을 폐쇄계에서 행함에 의해, 감도가 높은 증폭 방법을 이용한 경우에도, 오검출이나 오염을 방지하고, 신속하게 가시광에서 판정할 수 있다.

핵산 및/또는 검출 시약의 정색을 가시광에서 판정하는 공정에서는, 핵산과 검출 시약의 접촉에 의해 발생한 물질을, 자외선과 같은 가시광이 아닌 광(光)을 조사하지 않고, 일반적인 실험실에 있어서의 조명과 같은 가시광 하에서 관찰하여, 핵산의 존재를 판정한다. 가시광이면, 자외선 조사하는 경우와 같이 특별한 장치는 필요하지 않아, 간편하게 관찰할 수 있다.

정색의 가시광에서의 판정은 목시(目視)에 의해 행할 수 있다. 색소와 핵산이 결합한 경우의 정색의 변화, 핵산과 결합해 있지 않은 색소의 정색의 변화를, 가시광에서 목시로 관찰하여, 색소의 정색의 유무에 의거해서, 핵산의 존재의 유무를 확인할 수 있다.

여기에서, 정색의 변화로서, 가시광 하에서 색의 종류가 변화하는 것(가시광 파장), 또는 색의 농담이 변화하는 것(반사율) 등을 들 수 있지만, 가시광에서 판정할 수 있는 것이면 이들로 한정되지 않는다. 색의 종류의 변화로서는, 예를 들면 적자색(赤紫色)으로부터 수색(水色)으로의 변화, 및 황색으로부터 적자색으로의 변화를 들 수 있다.

또한, 정색의 가시광에서의 판정은, 시료 용액의 가시광 영역의 흡광도를 측정함에 의해서도 행할 수 있다. 판정을 목시에 의해 행할지 흡광도를 측정할지에 관계없이, 핵산과 검출 시약에 조사하는 광, 및 관찰하는 광의 파장은, 모두 가시광의 파장이다. 가시광의 파장은 380㎚∼800㎚인 것이 바람직하며, 400㎚∼780㎚인 것이 보다 바람직하고, 450㎚∼750㎚인 것이 더 바람직하다. 측정 파장은 가시광의 파장의 범위 내에서, 사용하는 색소에 따라 적의(適宜) 설정하면 된다. 또한, 흡광도 측정에 의해, 시료 중의 핵산 농도를 정량하는 것도 가능하다.

그 외, 색소와 핵산에 의한 불용성의 침전물이 발생할 경우, 필터나 멤브레인을 사용해서, 또는 원심분리에 의해 침전물을 회수하여, 침전물의 양으로부터 핵산의 양을 판단하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서, 핵산 검출 후의 착색한 검체액을 다른 분자 생물학적인 조작에 그대로 사용하는 것도 가능하다. 그러한 분자 생물학적인 조작에는, 제한 효소 반응, 시퀀스 반응, PCR과 같은 효소 반응이나, 전기 영동에 의한 확인 조작 등이 포함된다.

핵산과 검출 시약의 접촉 공정의 전 또는 후에, 핵산을 증폭하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 핵산의 증폭은, PCR법으로 대표되는 핵산 배열을 증폭시키는 수법이면 되며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 핵산 배열을 증폭시키는 수법으로서는, 예를 들면 PCR법 이외에, LCR(Ligase Chain Reaction)법, SDA(Strand Displacement Amplification)법, RCA(Rolling Circle Amplification)법, CPT(Cycling Probe Technology)법, Q-Beta Replicase Amplification Technology법, ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acids)법, LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplificaton of DNA)법, NASBA(Nucleic acid Sequence-based Amplification method)법, 및 TMA(Transcription mediated amplification method)법 등의 공지의 방법을 예시할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

Q-Beta Replicase Amplification Technology법, RCA법, NASBA법, SDA법, TMA법, LAMP법, ICAN법 등은 일정 온도에서 증폭 반응을 행하는 방법이며, 그 외의 PCR법이나 LCR법 등은 온도 사이클링으로 증폭 반응을 행하는 것이다.

또한, RNA를 역전사 효소 등에 의해 DNA로 역전사하고, 이 DNA를 주형으로 해서 이본쇄 핵산을 증폭하면, 간접적으로 RNA를 검출하는 것도 가능해진다.

핵산 증폭 방법으로서 LAMP법을 사용한 경우, 반응에 온도 사이클이 불필요하여 간편하며, 증폭 핵산량이 많다는 메리트가 있다. 또한, LAMP법에 있어서 반응 효율을 향상시키는 목적으로 피로인산 제거 효소의 존재 하에서 증폭 반응을 행하는 것도 가능하다. 피로인산 제거 효소로서는, 피로인산을 모노인산으로 분해하는 피로포스파타제나, 피로인산과 아데노신5'-포스포린산을 결합하는 ATP 설푸릴라제(sulfurylase)를 들 수 있다. 본 발명에서는, 특히, 내열성의 피로포스파타제가 바람직하다.

검출 시약이란, 핵산의 검출 시약이며, 핵산에 결합하는 색소를 함유한다. 일본쇄 핵산에 결합한 색소 및 핵산과 결합해 있지 않은 색소와 우선적으로 반응하는 물질을 더 함유하고 있어도 된다.

색소란, 가시광의 흡수에 의해 정색하는 물질을 가리킨다. 핵산에 결합하는 색소로서는, 핵산에 결합할 수 있으면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 트리페닐메탄계 색소, 티아진계 색소, 옥사진계 색소, 아진계 색소, 페나진계 색소, 잔텐계 색소, 페난트리듐계 색소, 아조계 색소, 락톤계 색소, 설톤계 색소, 인디고이드계 색소, 시아닌계 색소, 옥소놀계 색소, 스티릴계 색소, 폴리피린계 색소, 티오잔텐계 색소, 스쿠아릴륨계 색소, 크로코늄계 색소, 아줄레늄계 색소, 디티올금속염계 색소, 나프토퀴논계 색소, 안트라퀴논계 색소, 인도페놀계 색소, 쿠마린계 색소, 케토쿠마린계 색소, 피릴륨염계 색소, 티오피릴륨 염계 색소, 티아졸계 색소, 퀴놀린계 색소, 벤조페논계 색소, 티오벤조페논계 색소 및 이들의 혼합물을 들 수 있다.

바람직하게는 트리페닐메탄계 색소, 티아진계 색소, 옥사진계 색소, 아진계 색소, 페나진계 색소, 잔텐계 색소, 페난트리듐계 색소, 아조계 색소, 인디고이드계 색소, 락톤계 색소, 설톤계 색소 및 이들의 혼합물이다.

트리페닐메탄계 색소로서는, 예를 들면 메틸 그린, 말라카이트 그린, 크리스탈 바이올렛, 파라로자닐린, 겐티아나 바이올렛B, 겐티아나 바이올렛R, 나이트 블루, 빅토리아 블루B, 빅토리아 블루R, 빅토리아 블루4R, 빅토리아 블루BO, 로졸산, 푹신, 산성 푹신, 염기성 푹신, 뉴 푹신, 브로모티몰 블루, 브로모크레졸 그린 페놀프탈레인, 브로모페놀 블루, 페이턴트 블루 바이올렛, 페놀 레드, 피그먼트 블루1, 피그먼트 바이올렛3, 벤질 바이올렛, 펜타메틸파라로자닐린, 패스트 그린FCF, 에틸 바이올렛, 그린S, 로즈 아닐린, 애시드 블루7, 아줄 블루G, 솔로크롬 시아닌R, 애시드 블루147, 라이트 그린SF 옐로, 라이트 그린SF, 에틸 그린, 아닐린 블루, 메틸 바이올렛, 크롬 바이올렛CG를 들 수 있다.

티아진계 색소로서는, 예를 들면 톨루이딘 블루O, 메틸렌 블루, 티오닌, 아줄A, 티올C를 들 수 있다.

옥사진계 색소로서는, 예를 들면 브릴리언트크레실 블루, 나일 블루, 갈로시아닌, 베이직 블루3을 들 수 있다.

아진계 색소로서는, 예를 들면 아닐린 블랙, 아세틸렌 블랙 등을 들 수 있다.

페나진계 색소로서는, 예를 들면 뉴트럴 레드, 야누스 그린B, 베이직 레드2, 사프라닌B를 들 수 있다.

잔텐계 색소로서는, 예를 들면 플루오레세인, 로다민, 피로닌Y를 들 수 있다.

페난트리듐계 색소로서는, 예를 들면 에티듐 브로마이드를 들 수 있다.

아조 색소로서는, 예를 들면 비스마르크 브라운, 뉴 콕신, 베이직 레드29을 들 수 있다. 인디고이드계 색소로서는, 예를 들면 인디고카민 등을 들 수 있다.

검체에의 검출 시약의 첨가량은, 정색을 가시광에서 판정할 수 있으면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 통상 10% 이하이며, 바람직하게는 1% 이하이고, 더 바람직하게는 0.1% 이하이다.

이들 색소 중에서도, 핵산과의 결합에 의해 색조가 변화하는 성질을 가지며, 또한 구조 변화에 따라 색조가 변화하는 성질을 갖고 있는 것이 바람직하지만, 어느 한쪽만을 갖고 있어도 된다. 또한, 이들 색소는 1종으로도 사용할 수 있고, 2종 이상을 조합시켜도 사용할 수 있다.

핵산과의 결합에 의해 색조가 변화하는 성질을 갖는 색소로서는, 예를 들면 톨루이딘 블루O나 메틸 그린, 브릴리언트크레실 블루, 겐티아나 바이올렛B, 빅토리아 블루B 등을 들 수 있다. 구체적으로는 톨루이딘 블루O는 이본쇄 핵산이 존재하지 않는 경우에는 진한 감색(紺色)이지만, 핵산과 결합함으로써 수색으로 변화하고, 메틸 그린은 핵산이 존재하지 않는 경우에는 수색이지만, 핵산과 결합함으로써 청록색으로 변화한다. 또한, 브릴리언트크레실 블루는 핵산이 존재하지 않는 경우에는 진한 청색이지만, 핵산과 결합함으로써 청록색으로 변화한다.

한편, 구조 변화에 따라 색조가 변화하는 색소로서는, 프로톤화 상태의 차이나 산화 환원 상태의 차이 등으로 다른 색조로 변화하는 pH 응답성 색소나 산화 환원 응답성 색소 등을 들 수 있다. 구조 변화에는 공액 구조의 변화나, 치환기의 도입이나 변환, 프로톤화 상태의 차이 등이 포함된다.

pH 응답성 색소란, pH 지시약 등에 보이는, 용액 중의 수소 이온 농도(pH)에 따라 색조를 바꾸는 색소를 의미한다. 이들 중에는, 산성으로부터 알칼리성으로 함으로써, 페놀프탈레인과 같이 무색으로부터 적자(赤紫)로 변화하는 것이나, 메틸 오렌지와 같이 적색으로부터 등색(橙色)으로 변화하는 것이 포함된다.

산화 환원 응답성 색소란, 예를 들면 산염기 지시약이나 산화 환원 지시약에 사용되는 색소를 들 수 있으며, 산화 상태와 환원 상태에서 색조가 변화하는 색소를 의미한다. 예를 들면, 메틸렌 블루나 메틸 그린은 산화형에서는 청색을 나타내지만, 환원형에서는 무색으로 된다. 한편, 톨루이딘 블루O는 산화형에서는 청색을 나타내지만, 환원형에서는 적자색을 나타낸다.

구조 변화에 따라 색조가 변화하는 성질을 갖는 색소를 사용한 경우, 이본쇄 핵산에 결합한 색소와 비교해서, 일본쇄 핵산에 결합한 색소 및 핵산과 결합해 있지 않은 색소와 우선적으로 반응하는 물질을 첨가하는 공정을 추가함으로써, 핵산의 유무에 따른 색조의 콘트라스트를 증강하여 가시광에 의한 검출을 용이하게 하는 것이 가능하다. 즉, 이본쇄 핵산과 결합한 색소에 유래하는 색조 이외를 변화시키거나, 또는 없애서 무색으로 함으로써, 이본쇄 핵산의 유무에 따른 색조의 콘트라스트가 증강된다. 상기 공정에 의해, 이본쇄 핵산과 결합은 하지만, 이본쇄 핵산과의 결합에 의한 색조의 변화가 적은, 혹은 결합은 하지만 색조의 변화가 전혀 없는 색소를 사용하는 경우에도, 색소가 pH 응답성 혹은 산화 환원 응답성을 갖고 있으면, 이본쇄 핵산 증폭의 판정이 가능해진다.

예를 들면, 메틸 그린은 이본쇄 핵산과 결합했을 때의 색조의 변화를 목시로 판별하기 어렵다. 그러나, 일본쇄 핵산과 결합한 메틸 그린 및 핵산과 결합해 있지 않은 메틸 그린과 우선적으로 반응하는 물질을 첨가함으로써, 이본쇄 핵산과 결합해 있지 않은 메틸 그린 유래의 수색을 없앨 수 있다. 이 방법에 의해, 착색되어 있는 경우에는 이본쇄 핵산이 존재하고, 무색의 경우에는 이본쇄 핵산이 존재하지 않는다는 것과 같이, 핵산의 유무를 용이하게 판정하는 것이 가능해진다.

다른 하나의 예로서, 톨루이딘 블루O는 이본쇄 핵산과 결합하면, 진한 감색으로부터 청색으로 변화된다. 또한, 일본쇄 핵산과 결합한 톨루이딘 블루O, 및 핵산과 결합해 있지 않은 톨루이딘 블루O와 우선적으로 반응하는 물질을 첨가함으로써, 이본쇄 핵산과 결합해 있지 않은 톨루이딘 블루 유래의 진한 감색을 적자색으로 변화시켜, 청색의 경우에는 이본쇄 핵산이 존재하고, 적자색의 경우에는 이본쇄 핵산이 존재하지 않는다는 것과 같이, 핵산의 유무를 용이하게 판정하는 것이 가능해진다.

또한 다른 하나의 예로서, 겐티아나 바이올렛B는 이본쇄 핵산과 결합했을 때의 색조의 변화를 목시로 판별하기 어렵다. 그러나, 일본쇄 핵산과 결합한 겐티아나 바이올렛B, 및 핵산과 결합해 있지 않은 겐티아나 바이올렛B와 우선적으로 반응하는 물질을 첨가함으로써, 이본쇄 핵산과 결합해 있지 않은 겐티아나 바이올렛B 유래의 청자색(靑紫色)을 없앨 수 있어, 청자색의 경우에는 이본쇄 핵산이 존재하고, 무색의 경우에는 이본쇄 핵산이 존재하지 않는다는 것과 같이, 핵산의 유무를 용이하게 판정하는 것이 가능해진다.

또한 다른 하나의 예로서, 빅토리아 블루B는 중성 용액 중에서는 이본쇄 핵산과 결합했을 때의 색조의 변화를 판별하기 어렵다. 그러나, 중성 이상의 알칼리 영역의 pH 환경 하에서는 이본쇄 핵산과 결합해 있지 않은 빅토리아 블루B 유래의 청색이 옅은 적색으로 변화하므로, 청색의 경우에는 이본쇄 핵산이 존재하고, 옅은 적색의 경우에는 이본쇄 핵산이 존재하지 않는다는 것과 같이, 핵산의 유무를 용이하게 판정하는 것이 가능해진다.

본 공정에 의해 색조의 콘트라스트의 증강 효과를 얻고자 할 경우, 사용하는 색소는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 이본쇄 핵산과 결합하지 않은 경우에, 색소의 구조 변화에 의존해서 정색이 유색으로부터 무색으로, 또는 무색으로부터 유색으로 변화하는 색소이어도 된다. 또한, 예를 들면 청색으로부터 적색으로라는 것과 같이, 색조가 변화하는 색소이어도 된다. 이 중에서도, 핵산의 유무의 판정이 용이하다는 이유에서, 색소의 구조 변화에 의존해서 정색이 유색으로부터 무색으로, 또는 무색으로부터 유색으로 변화하는 색소인 것이 바람직하다.

일본쇄 핵산에 결합한 색소, 및 핵산과 결합해 있지 않은 색소와 우선적으로 반응하는 물질은, 색소의 구조를 변화하여 정색을 변화시키는 물질인 것이 바람직하며, 예를 들면 구핵제, 산화제, 환원제, 산, 염기, pH 완충제를 들 수 있다.

산화 환원 응답성 색소를 사용할 때에는, 일본쇄 핵산에 결합한 색소, 및 핵산과 결합해 있지 않은 색소와 우선적으로 반응해서 색조를 변화시키는 물질로서, 산화제, 및 환원제 등을 들 수 있다.

상기 산화제는, 산화 작용을 갖는 것이면 특별히 제한은 없지만, 과산화수소, 과망간산칼륨, 염소산칼륨, 이크롬산칼륨, 브롬산나트륨, 브롬산칼륨, 할로겐, 진한 황산, 질산, 차아염소산나트륨, 이산화염소, 클로라민, 사산화오스뮴, 디메틸설폭시드, 메타클로로과벤조산 등이 함유된다.

마찬가지로 환원제는, 환원 작용을 갖는 것이면 특별히 제한은 없지만, 수소화붕소나트륨, 시안화수소화붕소나트륨, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 차아황산나트륨, 피로아황산칼륨, 티오황산나트륨, 글루타티온, 아스코르브산, 2-메르캅토에탄올, DL-디티오트레이톨, 1-티오글리세롤, 시스테인, 트리부틸포스핀, 아미노에탄티올, 트리스2-카르복시에틸포스핀, 및 그 유도체 등이 함유된다.

또한, pH 응답성 색소를 사용할 때에는, 일본쇄 핵산에 결합한 색소 및 핵산과 결합해 있지 않은 색소와 우선적으로 반응해서 색조를 변화시키는 물질로서, 산, 및 염기를 사용할 수 있다.

산으로서는, 염산, 황산, 질산 등의 무기산이나 아세트산, 포름산, 옥살산, 시트르산, 젖산 등의 유기산이 호적(好適)하게 사용되지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 염산, 황산, 아세트산, 시트르산이며, 특히 바람직하게는 염산, 아세트산이다.

염기로서는, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산수소나트륨, 탄산칼륨, 암모니아, 트리에틸아민 등이 호적하게 사용되지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산수소나트륨이며, 특히 바람직하게는 수산화나트륨, 탄산수소나트륨이다.

구핵제로서는, 예를 들면 아황산나트륨 등의 아황산 이온 함유물, 아황산수소나트륨 등의 아황산수소 이온 함유물, 질산나트륨 등의 질산 이온 함유물, 아질산나트륨 등의 아질산 이온 함유물, 나트륨시아니드 등의 시아니드 이온 함유물, 할로겐화물 이온, 질소 구핵제, 황 구핵제, 알칼리 금속 알콕시드, 알칼리 금속 수산화물, 하이드라이드 구핵제 등의 구핵제가 사용 가능하다.

상기한 「할로겐화물 이온」으로서는, 예를 들면 불화물 이온, 염화물 이온, 브롬화물 이온, 요오드화물 이온 등을 들 수 있다.

상기한 「질소 구핵제」로서는, 예를 들면 암모니아, 메틸아민, n-프로필아민, 디메틸아민, 벤질아민, N-메틸벤질아민, 아닐린, n-헵틸아민, 1-아미노데칸, 1,3-디아미노프로판 등의 아민계 구핵제; 아세틸아미드 등의 아미드계 구핵제; 디아세틸이미드, 디포밀이미드, 프탈이미드, 프탈이미드의 금속염 등의 이미드계 구핵제; 벤젠설포닐아미드, p-니트로벤젠설포닐아미드, o-니트로벤젠설포닐아미드, m-니트로벤젠설포닐아미드, p-톨루엔설포닐아미드 등의 설포닐아미드계 구핵제 등을 들 수 있다.

상기한 「황 구핵제」로서는, 예를 들면 티올, 디설피드, 또는 티오요소를 들 수 있다.

상기한 「알칼리 금속 알콕시드」로서는, 예를 들면 나트륨메톡시드, 나트륨에톡시드, 칼륨제3급부톡시드 등을 들 수 있다.

상기한 「알칼리 금속 수산화물」로서는, 예를 들면 수산화나트륨, 수산화칼륨 등을 들 수 있다.

상기한 「하이드라이드 구핵제 」란, 구핵제로서 수소 공여할 수 있는 시약을 의미하며, 예를 들면 트리아세톡시히드로붕산나트륨, 수소화붕소나트륨, 테트라히드로붕산리튬, 피리딘보란 착물, 테트라히드로퓨란보란 착물, 2-피콜린보란 착물, 황화디메틸-보란착물, 시아노수소화붕소나트륨, 수소화트리에틸붕소리튬, 수소화리튬알루미늄, Red-Al〔수소화비스(2-메톡시에톡시)알루미늄나트륨〕, L-Selectride〔수소화트리(sec-부틸)붕소리튬〕, K-Selectride〔수소화트리(sec-부틸)붕소칼륨〕, DIBAL-H(수소화디이소부틸알루미늄) 등을 들 수 있다.

구핵제로서는, 구체적으로는, 수소화붕소나트륨, 시안화수소화붕소나트륨, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 차아황산나트륨, 피로아황산칼륨, 티오황산나트륨, 글루타티온, 아스코르브산, 2-메르캅토에탄올, DL-디티오트레이톨, 1-티오글리세롤, 시스테인, 트리부틸포스핀, 아미노에탄티올, 및 트리스2-카르복시에틸포스핀으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 구핵제가 바람직하다.

또한, 일본쇄 핵산에 결합한 색소 및 핵산과 결합해 있지 않은 색소와 우선적으로 반응해서 색조를 변화시키는 물질로서 pH 완충제를 사용하여, 검체의 pH 변화에 의해 색조를 변화시킬 수도 있다.

pH 완충제로서는, 검체의 pH를 변화시키는 것이면 특별히 한정되지 않지만, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Tris, Bicine, TAPS, CHES, CAPSO, CAPS 등의 굿(Good) 완충액, 글리신, 인산, 프탈산, 시트르산, 바르비투르산, 숙신산, 시트르산, 아세트산, 탄산이 호적하게 사용된다.

일본쇄 핵산에 결합한 색소 및 핵산과 결합해 있지 않은 색소와 우선적으로 반응해서 색조를 변화시키는 물질의 구체적인 첨가량은, 색소 및 상기 물질의 종류에 따라 변하므로 일률적으로 정할 수는 없지만, 당업자가, 가시광에서의 판정이 가장 용이해지는 첨가량을 실험적으로 결정할 수 있다. 예를 들면, 색소와 반응하는 물질의 양은, 색소량의 1000몰당량 이하가 바람직하며, 100몰당량 이하가 보다 바람직하다.

본 발명의 방법에 의해 핵산 증폭 산물을 검출할 경우에는, 색소, 및 일본쇄 핵산에 결합한 색소 및 핵산과 결합해 있지 않은 색소와 우선적으로 반응하는 물질을 첨가해서 콘트라스트를 증강해도 된다. 또한, 당해 색소를 미리 첨가한 상태에서 증폭 반응을 행하고, 반응 후에 폐쇄 공간에서 본 발명의 검출 디바이스를 사용해서, 일본쇄 핵산에 결합한 색소 및 핵산과 결합해 있지 않은 색소와 우선적으로 반응하는 물질을 첨가하여, 콘트라스트를 증강하는 것도 가능하다.

또한, 일본쇄 핵산에 결합한 색소 및 핵산과 결합해 있지 않은 색소와 우선적으로 반응하는 물질은 1종만으로도 사용할 수 있고, 2종 이상 조합시켜도 사용할 수 있다. 또한, 일본쇄 핵산에 결합한 색소 및 핵산과 결합해 있지 않은 색소와 우선적으로 반응하는 물질이, 핵산을 함유하는 검체에 당초부터 함유될 경우에는, 색소와의 반응 공정만으로도 핵산 검출이 가능하다.

또한, 색소, 및 일본쇄 핵산에 결합한 색소 및 핵산과 결합해 있지 않은 색소와 우선적으로 반응하는 물질은 혼합한 상태에서 사용하는 것도 가능하다.

검출 시약은, 류코형 색소를 함유하는 것이어도 된다. 류코형 색소란, 무색 또는 옅은 색의 색소이며, 현색제(顯色劑)와의 반응이나, 광 등의 물리 자극에 의해 그 구조를 변화하여 정색을 나타내는 색소를 의미한다. 류코형 색소의 현색제로서는, 산화제나 알코올 등이 알려져 있지만, 본 발명의 검출 방법에서는, 다중쇄 핵산이 현색제로서 기능한다.

류코형 색소로서는, 핵산과의 상호 작용에 의해 실질적으로 정색하는 성질을 갖는 색소이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 트리아릴메탄계 색소, 잔텐계 색소, 퀴놀린계 색소, 페노티아진계 색소, 페녹사진계 색소 및 이들의 혼합물을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 핵산 검출에 사용 가능한 류코형 색소로서는, 트리아릴메탄계 색소, 페노티아진계 색소, 페녹사진계 색소를 들 수 있으며, 이 중 트리아릴메탄계 색소를 사용하는 것이 바람직하다.

트리아릴메탄계 색소의 구체예로서, 메틸 그린, 말라카이트 그린, 크리스탈 바이올렛, 파라로자닐린, 겐티아나 바이올렛B, 겐티아나 바이올렛R, 나이트 블루, 빅토리아 블루B, 빅토리아 블루R, 퀴놀린계의 4-(p-디메틸아미노스티릴)퀴놀린을 들 수 있다. 이 중, 크리스탈 바이올렛, 및 겐티아나 바이올렛B의 류코형 유도체가 보다 바람직하다. 또, 류코형 색소로서 겐티아나 바이올렛을 사용할 경우에는, 비공액형의 겐티아나 바이올렛만이, 본 발명에 있어서의 류코형 색소에 해당한다. 구핵제와는 별개로 핵산과 접촉하는, 공액형의 겐티아나 바이올렛은, 류코형 색소에는 해당하지 않는다.

페노티아진계 색소의 구체예로서, 페노티아진, 벤조일류코메틸렌 블루를 들 수 있다.

페녹사진계 색소의 구체예로서, 페녹사진 등의 류코형 유도체를 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 류코형 색소는 발색형 색소로부터 변환하는 것도 가능하다. 발색형 색소란, 류코형 색소에 현색제를 반응시켰을 때의 발색 상태에 있는 색소를 의미한다. 예를 들면, 트리아릴메탄계의 발색형 색소에 구핵제를 반응시킴으로써, 류코형 색소로 변환할 수 있다. 이 경우, 단일의 트리아릴메탄계 색소를 사용해도, 사용하는 구핵제를 바꾸면, 다른 구조를 갖는 류코형 색소가 얻어진다.

증폭된 핵산을 류코형 색소를 사용해서 검출할 때에는, 핵산 증폭 반응 전의 반응액에 류코형 색소를 첨가해 두는 것이 바람직하지만, 핵산 증폭 반응 후의 반응액에 혼합해도 된다.

또한, 핵산 증폭을 행하는 검체에 류코형 색소를 단독으로 첨가해도 되고, 류코형 색소와 안정화제의 혼합물을 첨가하는 것도 가능하다. 안정화제란, 류코형 색소가 발색하는 것을 방지하는 화합물을 의미하며, 예를 들면 아민, 티올 화합물, α시클로덱스트린, β시클로덱스트린, γ시클로덱스트린 등의 포접(包接) 화합물, 아스코르브산 등의 산화 방지제 등을 들 수 있지만, 발색을 방지할 수 있으면 이들로 한정되지 않는다. 안정화제는 단독으로 첨가해도 되고, 복수를 조합시켜서 첨가해도 된다.

또한, 류코형 색소를 직접 다중쇄 핵산에 첨가하는 것이 아닌, 발색형 색소를 구핵제 등으로 처리하여 류코형 색소로 변경 후, 검체에 첨가해도 되고, 발색형 색소와 구핵제의 혼합물을 검체에 첨가해도 된다. 예를 들면, 크리스탈 바이올렛과 아황산나트륨을 혼합해서 류코형으로 변환 후, 이 혼합물을 사용해서 다중쇄 핵산을 검출 가능하다. 발색형 색소와 구핵제 등의 발색형을 류코형으로 변환하는 약제의 혼합액의 사용은, 류코형 색소가 불안정하고 단리(單離) 곤란한 경우에 특히 유효하다.

검출 시약은 고체이어도 된다. 검출 시약이 고체라는 것은, 검출에 사용하는 시약이 열풍, 진공, 증기, 배럴, 스핀, 흡인 등의 수법으로 수분을 날림에 의해 고화되어 있는 것을 의미하고, 핸들링의 용이함에서 메리트를 갖는 것도 있다. 검출 시약에 액체를 사용하면 차폐 등에 곤란이 따르는 경우도 있기 때문이다.

검출 시약은 코팅재로 핵산으로부터 차폐되어 있어도 된다. 핵산으로부터 차폐되어 있다는 것은, 검출 시약이 일시적으로 핵산을 함유하는 시료 등으로부터 차폐되어 있는 상태를 의미한다. 핵산 검출 시에 열이나 압력 등의 물리적 자극에 의해 검출 시약이 핵산에 노출됨으로써, 핵산과 검출 시약이 접촉하여, 정색을 발생시키는 것이 가능해진다.

또, 코팅재로서는, 검출 시약을 일시적으로 차폐할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜 등의 폴리머 수지, 파라핀 등의 유지, 아가로스, 젤란검, 카라기난, 잔탄검, 클러스터 덱스트린, 히알루론산 등의 당류, 젤라틴이나 콜라겐 등의 단백질 등을 들 수 있다.

본 발명은, 또한 검출 시약을 유지하는 검출 시약 유지부, 및 상기 시약 유지부를 구비한 뚜껑부 및/또는 반응 용기를 갖는, 핵산 검출용 디바이스 또는 키트에 관한 것이다.

검출 디바이스를 구성하는 뚜껑부 및/또는 반응 용기는 폐쇄계를 형성할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없다. 예를 들면 반응 용기의 개구부를 밀폐하는 뚜껑부와, 반응 용기의 상부와 뚜껑부를 결합하는 접합부를, 일체로 성형하여 이루어지는 것(뚜껑형-반응 용기 일체형 검출 디바이스 및 반응 용기형 검출 디바이스), 혹은 반응 용기의 뚜껑부(뚜껑형 검출 디바이스)를 들 수 있다.

반응 용기는, 액체를 유지할 수 있고, 뚜껑 등으로 밀폐 가능한 것이면 형태에 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 PCR이나 유전자 조작 등에서 사용되는 튜브형, 플레이트형, 필름형, 칩형이어도 되고, 시판의 것을 사용하는 것도 가능하다. 반응 용기의 구경, 크기나 두께 등은, 핵산의 증폭 반응 등의 기구, 혹은 사용하는 장치의 크기에 맞춰서 적의 조정해도 된다. 또한, 반응 용기는 단독으로 사용해도 되지만, 복수 개, 예를 들면 4개, 8개, 12개 등, 복수 개가 연결되어 있어도 된다.

뚜껑부는, 대응하는 반응 용기의 개구부를 밀폐할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없으며, 압입해서 밀폐할 수 있는 타입의 것, 씰, 필름, 스크류 캡 등을 들 수 있고, 시판의 것을 사용하는 것도 가능하다.

뚜껑부는, 반응 용기의 개구부에 적합하며, 개구부의 주연(周緣)보다 아래쪽으로 이어지는 튜브의 내벽면에 대하여 호적한 밀폐성이 얻어지도록 형성된 통 형상의 씰부와, 이 통 형상의 씰부의 단부에 외주 전체에 걸쳐서 형성되며, 상기 반응 용기의 가장자리부와 치밀하게 맞닿고, 그것에 대하여 호적하게 밀폐하여, 폐쇄계가 얻어지도록 형성된 외주부를 갖는 것이 바람직하다. 통 형상의 씰부는, 반응 튜브의 개구부와 접합시켰을 때에 밀착성이 높아지도록 디자인되는 것이 바람직하다.

뚜껑부나 반응 용기의 재질은, 특별히 제한되지 않지만, 플라스틱제인 것이 바람직하다. 플라스틱은 사출 성형 등의 공지 관용의 방법에 의해, 튜브 용기를 성형할 수 있으며, 저렴하게 대량 생산할 수 있다. 플라스틱으로서, 예를 들면 폴리에틸렌계 수지, 폴리프로필렌계 수지, 그 외 폴리올레핀계 수지, 폴리에스테르계 수지, 불소계 수지, 실리콘계 수지 등을 들 수 있다.

검출 시약 유지부는, 뚜껑부 및/또는 반응 용기의 내측에 고정되며, 핵산을 검출하기 위한 검출 시약을 유지한다. 검출 시약 유지부는, 뚜껑부와 반응 용기의 어느 한쪽에 고정되어 있어도 되고, 양쪽에 고정되어 있어도 된다. 또한, 반응 용기와 뚜껑부에 있어서의, 검출 시약 유지부의 고정 위치는, 핵산 용액에 접촉할 수 있을 수 있는 위치이면 특별히 제한은 없으며, 사용하는 반응 용기나 뚜껑부의 구조에 맞춰서, 적의 조정되는 것이 바람직하다.

뚜껑부 및/또는 반응 용기는, 핵산 증폭 시약을 유지하는 것이 바람직하다. 핵산 증폭 시약으로서는, LAMP법이나 PCR법 등의 핵산 증폭에 사용되는 시약을 들 수 있다. 예를 들면, 뚜껑부에 검출 시약을 유지하고, 반응 용기에 PCR 시약(폴리머라제 등)을 유지한다는 것과 같이, 검출 시약과 핵산 증폭 시약을 다른 위치에 유지하는 것도 가능하다.

검출 시약 유지부는, 검출 시에 폐쇄계 내에서 핵산과 검출 시약을 접촉할 수 있으면, 어떠한 형상으로 형성되어 있어도 된다. 예를 들면, 뚜껑부 또는 반응 용기의 형상을 바꿈으로써 시약을 유지하기 위한 구조를 마련하는 것을 들 수 있으며, 그 경우, 반응 용기 또는 뚜껑부의 내벽으로부터 튜브 용기 내부를 향해서 돌출해서 형성되는 경우(돌출 타입), 혹은, 내벽으로부터 내벽 내부를 향해서 오목부가 형성되어 있는 경우(오목 타입) 등을 들 수 있다. 또한, 형상을 변화시키지 않은 플랫(flat)한 표면을 갖는 타입도 들 수 있다. 또한, 반응 용기 또는 뚜껑부에 검출 시약을 일시적으로 차폐하는 구조(일시 차폐 타입)를 마련하는 것도 가능하며, 이 경우, 열 등의 물리적 자극에 의해 차폐를 해제하여, 검출 시약을 핵산과 접촉시킬 수 있다. 또한 필터, 여과지, 캅셀, 링 등, 뚜껑부나 반응 용기 이외의 재료에 검출 시약을 유지시키는 것도 가능하다.

돌출 타입이란, 뚜껑부 또는 반응 용기의 내벽면으로부터 내부를 향해서 검출 시약 유지부가 돌출한 것이다. 돌출부의 수는, 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 1, 혹은 2개 배치되어 있는 것이 바람직하다. 또한 돌출 타입의 위에서 본 형태는, 특별히 제한은 없지만 바람직하게는 원형이며, 뚜껑부 또는 반응 용기의 횡단면으로부터 본 형상은, 예를 들면 스트립(strip) 형상, 용기 내부를 향해서 돌출한 선단이 뾰족한 삼각형상, 선단이 평평한 사다리꼴 형상, 선단이 둥그스름한 돔 형상, 혹은 선단이 용기 내벽을 향해서 잘록한 오목면 형상 등을 들 수 있다. 또한, 뚜껑부 또는 반응 용기의 내부를 분할하는 구조를 취하는 것도 가능하다. 검출 시약 유지부의 크기는 사용하는 뚜껑부나 반응 용기의 구조에 맞춰서, 적의 조정되는 것이 바람직하다.

오목 타입이란, 뚜껑부 또는 반응 용기의 내벽 위에 검출 시약 유지부로서 오목부를 형성시킨 것이다. 오목부의 수는 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 1, 혹은 2개 배치되어 있는 것이 바람직하다. 또한 오목 타입의 위에서 본 형태는, 특별히 제한은 없지만 바람직하게는 원형이며, 뚜껑부 또는 반응 용기의 횡단면으로부터 보았을 때, 예를 들면 스트립 형상, 용기 내부를 향해서 돌출한 선단이 뾰족한 삼각형상, 선단이 평평한 사다리꼴 형상, 선단이 둥그스름한 돔 형상, 혹은 선단이 용기 내벽을 향해서 잘록한 오목면 형상 등을 들 수 있다. 또한 이 오목 타입은 상술한 돌출 타입과 조합시켜서 이용하는 것도 가능하다.

검출 시약 유지부의 형상, 크기나 수는, 뚜껑부나 반응 용기의 제조의 용이함과 함께, 건조 시약의 접착의 용이함이나, 시약을 용기 내에서 건조·고형화시켰을 때의 요철 형상에의 채워넣기(charging) 용이함, 끼워지기 용이함 등을 다양하게 고려해서 결정된다.

일시 차폐 타입은, 뚜껑부, 또는 반응 용기에, 검출 시약을 일시적으로 핵산으로부터 차폐하는 구조를 갖는다. 차폐하기 위한 구조는, 검출 시약을 일시적으로 차폐할 수 있으면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜 등의 폴리머 수지, 파라핀 등의 유지, 아가로스, 젤란검, 카라기난, 잔탄검, 클러스터 덱스트린, 히알루론산 등의 당류, 젤라틴이나 콜라겐 등의 단백질 등을 코팅재로서 사용하는 구조를 들 수 있다. 핵산 검출 이전에는 검출 시약을 핵산으로부터 차폐하고, 핵산 검출 시에 열 등의 물리적 자극에 의해 검출 시약을 핵산에 노출시켜, 핵산과 접촉시키는 구조를 들 수 있다. 또, 이 일시 차폐 타입은 상기한 돌출 타입 또는 오목 타입의 구조와 조합시킨 시약 유지부로 하는 것도 가능하고, 또한 뚜껑부나 반응 용기에 그들 구조를 가지지 않는 것이어도 설치할 수 있다.

이하, 도면을 참조해서 본 발명의 검출 디바이스의 몇 가지 형태를 설명한다.

도 1에, 뚜껑형-돌출 타입 I인 검출 디바이스의 외관(a), (a)의 개구부측에서 본 평면도(b), 및 (b)의 X-X'선을 따라 절단한 종단면도(c)를 나타낸다. 뚜껑형-돌출 타입 I은 저부(1), 개구부(2)와 통 형상의 몸통부(3) 및 시약 유지부(4)를 형성하는 벽부(5)로 이루어진다. 몸통부는 반응 용기에 삽입할 때의 밀폐성이 높아지도록 저부로부터 개구부에 걸쳐서 지름이 넓어져 있으며, 그 높이는 반응 용기의 길이 이하인 것이 바람직하다. 또한, 검출 시약 유지부의 형상은, 검출 시약을 유지할 수 있는 구조이면 특별히 제한은 없지만, 상술한 바와 같이 예를 들면 스트립 형상, 반응 용기 내부를 향해서 돌출한 선단이 뾰족한 삼각형상, 선단이 평평한 사다리꼴 형상, 선단이 둥그스름한 돔 형상, 혹은 선단이 용기 내벽을 향해서 잘록한 오목면 형상 등을 들 수 있다. 벽부나 지름은 검출 시약을 유지할 수 있는 높이이면 특별히 제한은 없지만, 길이는 몸통부의 길이 이하, 지름은 개구부의 지름 이하가 바람직하다.

도 2에, 뚜껑형-돌출 타입 Ⅱ인 검출 디바이스의 외관(a), (a)의 개구부측에서 본 평면도(b), 및 (b)의 X-X'선을 따라 절단한 종단면도(c)를 나타낸다. 뚜껑형-돌출 타입 Ⅱ은 도 1의 뚜껑형-돌출 타입 I과 같이, 바닥, 개구부, 몸통부 및 시약 유지부를 형성하는 벽부로 이루어진다. 단, 시약 유지부는 뚜껑형-돌출 타입 I과는 달리, 벽부(5)는 몸통부 내부를 적어도 2분할하도록 마련되어 있으며, 그 높이는 검출 시약을 유지할 수 있는 높이이면 특별히 제한은 없지만, 몸통부의 길이 이하인 것이 바람직하다.

도 3에, 뚜껑형-오목 타입인 검출 디바이스의 외관(a), (a)의 개구부측에서 본 평면도(b), 및 (b)의 X-X'선을 따라 절단한 종단면도(c)를 나타낸다. 뚜껑형-오목 타입은 도 1∼2에 나타낸 검출 디바이스와 같이, 저부, 개구부, 몸통부 및 시약 유지부를 형성하는 벽부로 이루어진다. 시약 유지부(4)는 개구부로부터 저부를 향해서 오목부를 형성하고 있으며, 그 깊이나 지름은 검출 시약을 유지할 수 있는 길이이면 특별히 제한은 없지만, 깊이는 바닥의 두께 이하인 것이 바람직하고, 지름은 개구부의 길이 이하인 것이 바람직하다.

또한, 시약 유지부의 돌출 타입과 오목 타입을 조합시킨 시약 유지부를 갖는 뚜껑형 검출 디바이스도 제작 가능하다.

도 4에, 뚜껑형-일시 차폐 타입인 검출 디바이스의 단면도를 나타낸다. 이 경우, 검출 시약은 코팅재에 의해 코팅되어 있다. 또한, 일시 차폐 타입의 시약 유지는 돌출 타입이나 오목 타입과 조합시켜서 형성시키는 것도 가능하다.

도 7에, 뚜껑형-돌출 타입 I인 검출 디바이스의 외관을 나타낸다. 도 1∼도 3에서는 반응 용기와는 독립한, 뚜껑부로 이루어지는 검출 디바이스를 나타냈지만, 도 7과 같이 시약 유지부를 갖는 뚜껑부와 반응 용기가 일체화한 것이어도 된다. 이 일체형을 연결할 수도 있고, 연결했을 경우에는 복수 검체의 동시 병행 처리가 간편해진다.

도 9에, 반응 용기형 I인 검출 디바이스의 외관(a), (a)의 Y-Y'선을 따라 절단한 종단면도(b), 오목 타입의 시약 유지부를 갖는 반응 용기형 디바이스의 종단면도(c), 및 돌출 타입의 시약 유지부를 갖는 반응 용기형 디바이스의 종단면도(d)을 나타낸다. 오목 타입(c)은 반응 용기의 바닥 방향을 향해서 오목부를 형성하고 있으며, 그 깊이나 지름은 검출 시약을 유지할 수 있는 길이이면 특별히 제한은 없지만, 깊이는 반응 용기 두께 이하, 지름은 반응 용기의 바닥의 지름 이하인 것이 바람직하다. 또한 돌출 타입(d)은 반응 용기의 개구면 방향을 향해서 벽부가 형성되며, 검출 시약을 유지할 수 있는 높이이면 특별히 제한은 없지만, 반응 용기의 길이 이하인 것이 바람직하다.

도 10에, 반응 용기형-일시 차폐 타입인 검출 디바이스의 단면도를 나타낸다. 이 경우, 검출 시약은 반응 용기의 플랫한 내면의 시약 유지부에 상기한 코팅재에 의해 코팅되어 있다. 또한 일시 차폐 타입의 시약 유지는 돌출 타입이나 오목 타입과 조합시켜서 형성시키는 것도 가능하다.

검출 디바이스는, 1개로 사용하는 것도 가능하고, 연결부를 개재하여 2개 이상 연결한 상태로 사용하는 것도 가능하다. 연결할 경우, 복수의 핵산 증폭 반응을 병행해서 행한 후의 증폭 산물의 검출을 간편하게 할 수 있다. 연결하는 개수는, 사용의 상황에 따라 자유롭게 선택하는 것이 가능하며, 일례로서는, 도 5에, 도 1의 검출 디바이스의 뚜껑부를 8개 연결한 뚜껑형 검출 디바이스의 외관을 나타내고 있다. 연결부는, 복수의 뚜껑부끼리, 접합부끼리, 반응 용기끼리, 혹은 그들의 조합을 연결하도록 형성되어 있지만, 바람직하게는 뚜껑부끼리, 혹은 반응 용기끼리를 연결하도록 형성되어 이루어지는 것이 바람직하다. 이때 연결부는, 반응 용기의 개구부에 마련된 가장자리부에서 연결하도록 형성되어도 되고, 혹은 반응 용기의 통 형상의 몸통부에서 연결하도록 형성되어 있어도 된다.

시약 유지부에의 검출 시약, 색소, 및 수식 물질의 고정화는 이하의 방법으로 행한다. 또, 수식 물질은, 검출 시약에 함유되는 색소 이외의 성분이며, 구핵제의 외에, 안정화제, 및 코팅제 등을 의미한다. 구핵제로서는, 콘트라스트 증강을 위한 산화제, 환원제, 산, 염기, pH 완충제, 또는 발색형 색소를 류코형으로 변환하는 물질을 들 수 있다.

우선, 수식 물질을 용매에 녹인 용액을 시약 유지부에 첨가하고, 건조시켜 고정한다. 건조 방법은 특별히 한정되지 않으며, 풍건이나 가열, 감압 건조 등이 적응 가능하고, 이들 방법을 조합시켜서 실시할 수도 있다. 또, 이때의 용매는 수식 물질을 용해할 수 있는 것이면 되며, 예를 들면 물, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올 등을 들 수 있다. 또한, 이것에 건조 후의 수식 물질의 박리나 탈락을 방지하는 목적으로 폴리머 등의 기재를 첨가할 수도 있으며, 예를 들면 폴리비닐알코올 등을 첨가해도 된다. 이때의 폴리머 등의 기재의 양은, 건조 시에 핵산의 정색을 확인할 수 있는 양으로 조정할 수 있으며, 바람직하게는 0.1㎎ 이하이고, 더 바람직하게는 0.01㎎ 이하이다. 또한 점성을 가진 액상의 졸, 고체로 된 겔로 하여 유지시킬 수도 있다. 또한, 건조 후의 수식 물질의 용해성을 향상시키는 목적으로, 용해 보조제 등을 첨가해도 되며, 예를 들면 TritonX-100이나 Tween20 등의 계면활성제나 시클로덱스트린, β-글루칸 등을 들 수 있다. 이때의 수식 물질량은, 건조 시에 핵산의 정색을 확인할 수 있는 양으로 조정할 수 있으며, 예를 들면 색소량의 1000몰당량 이하가 바람직하고, 100몰당량 이하가 보다 바람직하다.

또, 핵산을 함유하는 용액에 수식 물질이 함유되어 있는 경우에는 색소만을 고정하는 경우도 있다. 또한 수식 물질과 색소의 고정 순번에 제한은 없다. 또한 수식 물질 용액과 색소 용액의 혼합액을 사용하여, 한번에 고정하는 것도 가능하다.

일시 차폐 타입의 시약 유지부를 갖는 검출 디바이스를 제작할 때의 코팅은 이하의 방법으로 행한다.

우선, 상술한 코팅재를 용융하여, 건조 후의 검출 시약 위에 첨가하고, 냉각해서 고정한다. 또는, 코팅재를 용매에 용해하여, 건조 후의 검출 시약 위에 첨가하고, 건조에 의해 고정한다. 이때의 코팅재는 검출 시약을 안정하게 커버할 수 있고, 가열 등의 물리적 처리에 의해 검출 시약을 방출 가능하면 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 고형 파라핀, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 아가로스·젤란검·카라기난·잔탄검·히알루론산 등이며, 바람직하게는 파라핀, 폴리비닐알코올이다.

또, 이 시약 유지부에는, 검출 시약과 함께 핵산 증폭에 필요한 각종 시약을 유지시켜도 된다. 각종 시약에는 상술한 핵산 증폭법을 행하기 위한 목적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머, DNA 폴리머라제, 핵산 증폭 반응에 사용되는 완충액이나 제한 효소 등이 포함된다. 이 경우, 검출 시약과 증폭용 시약은 뚜껑부와 반응 용기 별개로 유지시킬 수 있으며, 또한 시약 유지부의 벽부나 일시 차폐 타입으로 각각을 차폐할 수도 있다.

다음으로, 도면을 참조하여, 검출 디바이스를 사용한 핵산 검출법에 대하여 설명한다.

도 6은, 뚜껑형 검출 디바이스(a)를 사용한 핵산 검출 공정을 나타내고 있다. 핵산 용액 또는 핵산 증폭 반응액을 반응 용기에 첨가하고, 검출 시약을 유지한 검출 디바이스로 뚜껑을 덮은 후(b), 필요에 따라 핵산 증폭 반응 등의 반응을 행한다(c). 그 후, 검출 디바이스를 상하 반전시키는 등 하여, 검출 시약과 핵산을 함유하는 용액을 접촉시키고, 시약을 핵산 용액에 용해시켜, 핵산을 착색한다(d) 및 (e). 그때, 보텍스 등의 교반 처리를 행함으로써 효율적으로 용해시키는 것도 가능하다. 또한, 손바닥 사이즈의 초소형 PCR 장치를 사용해서 PCR 반응을 행했을 경우, 증폭 반응 후에 장치 자체를 거꾸로 함으로써, 반응 용액과 검출 시약을 접촉시켜, 검출하는 것도 가능하다.

도 8은, 뚜껑형-반응 용기 일체형 검출 디바이스(a)를 사용한 핵산 검출 공정을 나타내고 있다. 검출 시약을 유지한 검출 디바이스에 핵산 용액 또는 핵산 증폭 반응액을 첨가하여 뚜껑을 덮는다(b). 그 후에는, 상술한 뚜껑형 검출 디바이스와 같은 처리를 행한다.

도 11은, 일시 차폐 타입의 시약 유지부를 갖는 반응 용기형 검출 디바이스(a)를 사용한 공정을 나타내고 있다. 핵산 용액 또는 핵산 증폭 반응액을 검출 시약을 유지한 반응 용기에 첨가한 후(b), 뚜껑을 덮는다. 필요에 따라 핵산 증폭 반응 등의 반응을 행한 후(c), 가열 등의 처리에 의해 코팅재 내의 검출 시약을 핵산 용액에 용해시킨다. 이때의 가열 온도는, 코팅재가 물리적으로 변화하여 검출 시약이 핵산 용액과 접촉할 수 있으면 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 40℃ 이상이며, 더 바람직하게는 60℃ 이상이다.

도 12는, 뚜껑형 검출 디바이스(a)를 사용한 핵산 검출 공정을 나타내고 있다. 용기 내에서 증폭 반응액을 조제하고(b), 검출 시약을 유지한 뚜껑을 덮은 후(c), 검출 디바이스를 상하 반전시키는 등 해서, 검출 시약과 반응액을 접촉시켜, 시약을 용해시킨다(d). 그때, 보텍스 등의 교반 처리를 행함으로써 효율적으로 용해시키는 것도 가능하다. 그 후, 원심기 등을 사용해서 스핀 다운을 행하여, 뚜껑부에 부착된 용액을 용기 내에 모아, 증폭 반응을 행한다.

도 13은, 반응 용기형 검출 디바이스(a)를 사용한 공정을 나타내고 있다. 증폭 반응 용액을 용기 내에서 조제하고, 반응 용기 내에 유지한 검출 시약을 용해시킨다(b). 또는, 다른 용기 내에서 조제한 반응 용액을, 검출 디바이스에 첨가해도 된다. 그 후, 열사이클 등에 의해 증폭 반응을 행한다.

다음으로 도 6, 8, 11, 12 및 13의 공정(e) 이후의 가시광에서의 검출 공정에 대하여 기술한다.

공정(e)에서의 반응에 의해 발생한 물질을 가시광 하에서 관찰하여, 핵산의 존재를 가시광에서 판정할 때에는, 자외선과 같은 가시광이 아닌 광을 조사하지 않고, 일반적인 실험실에 있어서의 조명과 같은 가시광 하에서 관찰한다. 가시광이면, 자외선 조사하는 경우와 같이 특별한 장치는 필요하지 않아, 간편히 관찰할 수 있다.

또, 당해 검출 디바이스를 사용하면 도 6, 8, 11, 12 및 13의 (c) 내지 (e) 및 검출 공정을 전자동으로 행할 수 있다. 전자동이란, 본 발명의 검출 디바이스로 반응과 검출 단계를 자동으로 행하는 공정을 포함하는 것을 나타낸다.

예를 들면 도 6의 뚜껑형 검출 디바이스 및 도 8의 뚜껑형-반응 용기 일체형 검출 디바이스에서는, 핵산 용액 또는 핵산 증폭 반응액을 검출 시약을 유지한 반응 용기에 첨가한 후(b), 뚜껑을 덮는다. 이것 이후의 공정은 온도 조절을 할 수 있고, 필요하면 진동이나 진탕, 반응 용기의 반전을 할 수 있는 장치를 사용해서 자동으로 실시할 수 있다. 필요에 따라 핵산 증폭 반응 등의 반응을 행한 후(c), 검출 디바이스를 진탕이나 반전 등을 함에 의해, 뚜껑부의 검출 시약과 핵산을 함유하는 용액을 접촉시켜, 착색시킬 수 있다. 또한 필요에 따라 장치에 도입된 가시광에 의해 착색의 유무나 착색도를 계측, 경우에 따라서는 그 데이터를 해석할 수 있다.

도 11의 일시 차폐 타입의 시약 유지부를 갖는 반응 용기형 검출 디바이스를 사용한 공정에 있어서, 핵산 용액 또는 핵산 증폭 반응액을 검출 시약을 유지한 반응 용기에 첨가한 후(b), 뚜껑을 덮는다. 이것 이후의 공정은 상술한 장치로 자동으로 실시한다. 필요에 따라 핵산 증폭 반응 등의 반응을 행한 후(c), 가열 등의 처리에 의해 코팅재 내의 검출 시약을 핵산 용액에 용해시켜서 착색시킬 수 있다. 또한 필요에 따라 가시광에 의해 착색의 유무나 착색도를 계측할 수 있다.

본 발명에는, 상술한 가시광에서의 검출용 디바이스와, 시약이나 기구 등을 조합시킨 키트도 포함된다. 키트란, 상술한 검출 디바이스에 더하여, 각종 시약이나 기구 등을 구비한 형태를 가리킨다. 각종 시약에는 상술한 핵산 증폭법을 행하기 위한 목적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머, DNA 폴리머라제, 핵산 증폭 반응에 사용되는 완충액이나 증폭한 핵산을 처리하기 위한 제한 효소, 시퀀스용의 시약 등이 포함된다. 또한 항원, 항체, 색소, 효소, 기질 등을 사용함에 의해, 본 발명의 키트를 면역 반응이나 생화학 반응의 측정, 면역 형광법에 의한 미량 검출에도 사용할 수 있다.

본 발명에는, 상기한 가시광에서의 검출용 디바이스 또는 키트를 갖는 장치도 포함된다. 장치는, 검체를 자동적으로 처리하여 염기 배열 등을 해석하는 장치이며, 본 발명의 검출 디바이스를 포함하는 장치이다. 핵산 정제 장치나 핵산 증폭 장치에 본 발명의 가시광에서의 검출용 디바이스를 도입해서 핵산의 유무를 판정하거나, DNA 자동 해석 장치에 도입함에 의해, PCR로 증폭·라벨된 샘플만을 선별해서 해석을 행하는 등, 조작의 확실성 향상을 기대할 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1)

(i) 뚜껑형-오목 타입의 시약 유지부를 가진 뚜껑형 검출 디바이스의 제작

회전 줄을 사용해서, 0.2㎖의 PCR용 튜브(아이비스사제)의 뚜껑부의 내측에 직경 0.5㎜의 오목부를 2개소 제작하여, 시약 유지부로 했다. 한쪽의 시약 유지부에, 색소 용액(0.2% 겐티아나 바이올렛B의 에탄올 용액)을, 다른 쪽에 환원제 용액(3.2% 아황산나트륨/1% 폴리비닐알코올 수용액)을 각각 1㎕ 첨가 후, 감압 하 건조함으로써, 핵산 검출 시약을 유지한 반응 용기로 했다.

(ⅱ) PCR 증폭 산물의 검출

주형으로서 pUC19(다카라바이오사제)를 사용하여, PCR 증폭에 의해 약 330 염기쌍이 증폭하도록 이하의 프라이머F : 5'-GGAAACAGCTATGACCATGA-3' 및 프라이머R : 5'-CTATGCGGCATCAGAGCAG-3'을 설계했다.

프라이머F와 프라이머R을 각 15pmol과, 10ng의 pUC19를 실시예 1에서 제작한 반응 용기에 넣어, ExTaq PCR 키트(다카라바이오사제)의 설명서에 따라, 50㎕의 PCR 반응액을 조제했다. 그 후, 튜브를 서멀사이클러(GeneAmp PCR System(어플라이드 바이오 시스템사제))에 세트하고, 95℃에서 5분간 열처리 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초의 사이클을 35회 행하고, 목적의 약 330bp의 증폭을 행하여, 포지티브 컨트롤로 했다. 또한, ExTaq DNA 폴리머라제를 첨가하지 않고 같은 반응을 행하여, 네가티브 컨트롤로 했다.

PCR 반응 후의 용기를 전도(傳倒) 혼화(混和)하여, 반응 용액으로 뚜껑부의 검출 시약을 용해 후, 반응 용액의 색조를 목시로 확인했다. 그 결과, 네가티브 컨트롤은 무색이었던 것에 대하여, 포지티브 컨트롤은 청색의 정색을 나타내어, 반응 용기의 뚜껑을 개폐하지 않고 핵산 증폭의 유무를 확인하는 것이 가능했다.

(ⅲ) AMP법 증폭 산물의 검출

「Loopamp(R) 살모넬라 검출 시약 키트」(에이켄가가쿠사제)을 사용하여, 상기 공정(i)에서 제작한 반응 용기 내에 LAMP법에 의한 핵산 증폭 반응액을 조제했다. 10㎕의 컨트롤 DNA Sal과 40㎕의 마스터 믹스(리액션 믹스. Sal과 Bst DNA 폴리머라제를 용량비로 20:1의 비율로 별도 혼합한 것)를 혼합하고, 65℃에서 1시간 반응 후, 85℃에서 20분 더 반응함으로써, 핵산이 증폭된 반응액(포지티브 컨트롤)을 조제했다. 또한, 10㎕의 증류수와 40㎕의 리액션 믹스. Sal을 혼합하고, 65℃에서 1시간 반응 후, 85℃에서 20분 더 반응함으로써, 핵산이 증폭되어 있지 않은 반응액(네가티브 컨트롤)을 조제했다.

반응 후의 용기를 전도 혼화하여, 반응 용액으로 뚜껑부의 검출 시약을 용해 후, 반응 용액의 색조를 목시로 확인했다. 그 결과, 네가티브 컨트롤은 무색이었던 것에 대하여, 포지티브 컨트롤은 청색의 정색을 나타냈다. 이것으로부터 반응 용기의 뚜껑을 개폐하지 않고 핵산 증폭의 유무를 확인하는 것이 가능한 것을 확인할 수 있었다.

(실시예 2)

(i) 오목 타입의 시약 유지부를 가진 반응 용기형 검출 디바이스의 제작

회전 줄을 사용해서, 0.2㎖의 PCR용 튜브(아이비스사제)의 뚜껑부의 내측에 직경 0.5㎜의 오목부를 1개소 제작하여, 시약 유지부로 했다. 시약 유지부에 환원제 용액(3.2% 아황산나트륨/1% 폴리비닐알코올 수용액)을 1㎕ 첨가 후, 감압 건조했다. 색소 용액(0.2% 겐티아나 바이올렛B의 에탄올 용액) 1㎕를, 시약 유지부에 더 첨가 후, 감압 건조함으로써 핵산 검출 시약을 유지한 반응 용기로 했다.

(ⅱ) PCR 및 LAMP법 증폭 산물의 검출

상기 공정(i)에서 제작한 반응 용기를 사용한 이외에는, 실시예 1의 공정(ⅱ)∼(ⅲ)과 같은 방법으로, PCR 증폭 산물 및 LAMP법 증폭 산물을 조제했다. 반응 후의 용기를 전도 혼화하여, 반응 용액으로 뚜껑부의 검출 시약을 용해 후, 반응 용액의 색조를 목시로 확인했다. 그 결과, PCR 및 LAMP법에 의한 핵산 증폭 산물이 있는 경우만, 반응 용액은 청색으로 착색하여, 증폭의 유무를 용이하게 목시로 확인하는 것이 가능했다.

(실시예 3)

회전 줄을 사용해서, 0.2㎖의 PCR용 튜브(아이비스사제)의 뚜껑부의 내측에 직경 0.5㎜의 오목부를 1개소 제작하여, 시약 유지부로 했다. 시약 유지부에 핵산 검출 시약(0.1% 겐티아나 바이올렛B/0.8% 아황산나트륨/0.75% β시클로덱스트린/35% 이소프로판올)을 2㎕ 첨가 후, 감압 건조함으로써 핵산 검출 시약을 유지한 반응 용기로 했다.

(ⅱ) PCR 및 LAMP법 증폭 산물의 검출

(실시예 4)

(i) 일시 차폐 타입의 시약 유지부를 가진 뚜껑형 검출 디바이스의 제작

회전 줄을 사용해서, 0.2㎖의 PCR용 튜브(아이비스사제)의 뚜껑부의 내측에 직경 0.5㎜의 오목부를 2개소 제작하여, 시약 유지부로 했다. 한쪽의 오목부에, 색소 용액(0.2% 겐티아나 바이올렛B의 에탄올 용액)을, 다른 쪽에 환원제 용액(3.2% 아황산나트륨/1% 폴리비닐알코올 수용액)을 각각 1㎕ 첨가 후, 감압 하 건조했다. 다음으로, 용융한 파라핀 왁스(융점 70℃∼80℃)를 그 위에 적하하고, 냉각 고화함으로써, 뚜껑부의 검출 시약에 파라핀 코팅을 실시한 반응 용기를 제작했다.

(ⅱ) LAMP법 증폭 산물의 검출

상기 공정(i)에서 제작한 반응 용기를 사용해서, 실시예 1의 공정(ⅲ)과 같은 방법으로 LAMP법 반응액(포지티브 컨트롤, 네가티브 컨트롤)을 제작했다. 그 후, 각각의 샘플을 65℃에서 1시간 반응 후, 85℃에서 20분 더 반응했다. 반응 종료 후, 뚜껑부를 98℃에서 1분간 가온하여, 파라핀을 용해했다. 다음으로, 반응 용기를 전도 혼화하여, 반응 용액으로 뚜껑부의 검출 시약을 용해 후의 반응 용액의 색조를 목시로 확인했다. 그 결과, 네가티브 컨트롤은 무색이었던 것에 대하여, 포지티브 컨트롤은 청색의 정색을 나타냈다. 이것으로부터 반응 용기의 뚜껑을 개폐하지 않고 핵산 증폭의 유무를 확인하는 것이 가능한 것을 확인할 수 있었다.

(실시예 5)

(i) 일시 차폐 타입의 시약 유지부를 가진 반응 용기형 검출 디바이스의 제작

0.2㎖의 PCR용 튜브(아이비스사제)의 본체 저부에 환원제 용액(3.2% 아황산나트륨/1% 폴리비닐알코올 수용액)을 1㎕ 첨가 후, 감압 건조했다. 색소 용액(0.2% 겐티아나 바이올렛B의 에탄올 용액) 1㎕를, 시약 유지부에 더 첨가 후, 감압 건조했다. 다음으로, 용융한 파라핀 왁스(융점 70℃∼80℃)를 적하하고, 냉각 고화함으로써, 파라핀 코팅을 실시한 반응 용기를 제작했다.

(ⅱ) LAMP법 증폭 산물의 검출

상기 공정(i)에서 제작한 반응 용기를 사용해서, 실시예 1의 공정(ⅲ)과 같은 방법으로 LAMP법 반응액(포지티브 컨트롤, 네가티브 컨트롤)을 제작했다. 그 후, 각각의 샘플을 65℃에서 1시간 반응 후, 85℃에서 20분 더 반응했다. 또, 이 65℃와 85℃의 처리는 동일한 장치를 사용해서 프로그래밍에 의해 자동으로 행했다. 반응 후의 반응 용액의 착색을 관찰한 바, 네가티브 컨트롤은 무색이었던 것에 대하여, 포지티브 컨트롤은 청색의 정색을 나타내고 있어, LAMP법에 의한 핵산 증폭의 유무를 뚜껑의 개폐를 하지 않고, 용이하게 목시로 확인하는 것이 가능했다.

(실시예 6)

(i) 핵산 검출 시약을 유지한 플레이트 씰의 제작

96웰 PCR 플레이트용의 플레이트 씰(서모피셔사이언티픽사제)의 각 웰의 중심부에 상당하는 위치에, 환원제 용액(3.2% 아황산나트륨/1% 폴리비닐알코올 수용액)을 각 1㎕ 첨가 후, 감압 건조했다. 색소 용액(0.2% 겐티아나 바이올렛B의 에탄올 용액)을 각 1㎕ 더 첨가 후, 감압 건조했다.

(ⅱ) PCR 증폭 산물의 검출

96웰 PCR 플레이트와 상기 공정(i)의 플레이트 씰을 이용한 것 이외, 실시예 1의 공정(ⅱ)과 같은 방법으로, PCR 반응액을 조제했다.

PCR 반응 후의 플레이트를 전도 혼화하여, 반응 용액으로 뚜껑부의 검출 시약을 용해 후, 반응 용액의 색조를 목시로 확인했다. 그 결과, 네가티브 컨트롤은 무색이었던 것에 대하여, 포지티브 컨트롤은 청색의 정색을 나타내어, 반응 용기의 뚜껑을 개폐하지 않고 핵산 증폭의 유무를 확인하는 것이 가능했다.

(실시예 7)

(i) 일시 차폐 타입의 시약 유지부를 가진 반응 용기형 검출 디바이스의 제작(PCR 시약)

0.2㎖의 PCR용 튜브(아이비스사제)의 반응 용기 저부에 실시예 1의 공정(i)에서 사용한 PCR용의 시약(주형의 pUC19을 제외함)을 첨가하여, 감압 건조했다. 다음으로, 용융한 파라핀 왁스(융점 70℃∼80℃)를 적하하고, 냉각 고화함으로써, 건조 PCR 시약을 파라핀 코팅으로 커버를 실시한 반응 용기를 제작했다. 또한 그 뚜껑부에 환원제 용액(3.2% 아황산나트륨/1% 폴리비닐알코올 수용액)을 1㎕ 첨가 후, 감압 건조했다. 그 위에 색소 용액(0.2% 겐티아나 바이올렛B의 에탄올 용액) 1㎕를 더 첨가 후, 감압 건조했다. 다음으로, 용융한 파라핀 왁스(융점 70℃∼80℃)를 그 위에 적하하고, 냉각 고화함으로써, 뚜껑부의 검출 시약에 파라핀 코팅을 실시한 반응 용기를 제작했다. 결과, 반응 용기에는 파라핀 코팅된 PCR 시약, 뚜껑부에는 파라핀 코팅된 검출 시약을 유지시킨 검출 디바이스를 제작했다.

(ⅱ) PCR 증폭 산물의 검출

상기 공정(i)에서 제작한 반응 용기에 pUC19을 함유하는 50㎕의 수용액을 첨가하여, 실시예 1의 공정(ⅱ)과 같은 방법으로 증폭 반응을 실시했다. PCR 반응 후의 용기를 전도 혼화하여, 반응 용액으로 뚜껑부의 검출 시약을 용해 후, 반응 용액의 색조를 목시로 확인했다. 그 결과, 네가티브 컨트롤은 무색이었던 것에 대하여, 포지티브 컨트롤은 청색의 정색을 나타내어, 반응 용기의 뚜껑을 개폐하지 않고 핵산 증폭의 유무를 확인하는 것이 가능했다.

(실시예 8) 시판 튜브를 사용한 뚜껑형 검출 디바이스의 제작

(i) 0.2㎖의 뚜껑부가 둥그스름한 PCR 튜브 돔 캡(왓슨사제)의 뚜껑부의 바닥에 환원제 용액(3.2% 아황산나트륨/1% 폴리비닐알코올 수용액)을 1㎕ 첨가 후, 감압 건조했다. 색소 용액(0.2% 겐티아나 바이올렛B의 에탄올 용액) 1㎕를, 시약 유지부에 더 첨가 후, 감압 건조했다. 다음으로, 용융한 파라핀 왁스(융점 70℃∼80℃)를 적하하고, 냉각 고화함으로써, 파라핀 코팅을 실시한 반응 용기를 제작했다.

(ⅱ) LAMP법 증폭 산물의 검출

(실시예 9)

8줄의 PCR용 튜브(아이비스사제)의 뚜껑부에 핵산 검출 시약(0.068% 겐티아나 바이올렛B/0.4% 아황산나트륨/0.24% β시클로덱스트린/1.2% 폴리비닐알코올(중합도500)/1.2% 클러스터 덱스트린/20% 에탄올)을 5㎕ 첨가 후, 감압 건조했다.

(ⅱ) LAMP법 증폭 산물의 검출

(실시예 10)

8줄의 PCR용 튜브의 뚜껑(아이비스사제)에 핵산 검출 시약(0.1% 겐티아나 바이올렛B/2% 아황산나트륨/1.2% β시클로덱스트린/40% 에탄올)을 1㎕ 첨가 후, 감압 건조했다. 다음으로, 2%의 폴리비닐알코올(중합도 1000)의 40% 에탄올 용액을 그 위에 적하하고, 감압 건조함으로써, 뚜껑부의 검출 시약에 폴리비닐알코올 코팅을 실시한 반응 용기를 제작했다.

8줄의 PCR용 튜브(아이비스사제)의 반응 용기 저부에 실시예 1의 공정(ⅲ)에서 사용한 LAMP용의 마스터 믹스(리액션 믹스. Sal과 Bst DNA 폴리머라제를 용량비로 20:1의 비율로 혼합한 것)을 첨가하여, 감압 건조했다. 결과, 반응 용기에는 LAMP 시약, 뚜껑부에는 폴리비닐알코올 코팅된 검출 시약을 유지시킨 8줄형의 검출 디바이스를 제작했다.

(ⅱ) LAMP법 증폭 산물의 검출

(실시예 11)

LAMP법의 검출

「Loopamp DNA 증폭 시약 키트」(에이켄가가쿠사제)을 사용하여, 첨부의 프로토콜을 일부 개변해서, 다음과 같이 LAMP법에 의한 핵산 증폭 반응액을 조제했다. 0.2㎖의 마이크로 튜브에, 12.5㎕의 리액션 믹스, 2.5㎕의 프라이머 믹스, 1㎕의 Bst DNA 폴리머라제, 6㎕의 증류수, 및 1㎕의 핵산 검출 시약(0.1% 겐티아나 바이올렛B, 2.1% 아황산나트륨, 1.5% β시클로덱스트린)을 가했다. 양성 컨트롤로서 2㎕의 포지티브 컨트롤 DNA를, 음성 컨트롤로서 2㎕의 증류수를 더 첨가해서 전량을 25㎕로 했다. 반응액을 보텍스에 의해 잘 혼합하고, 스핀 다운을 행했다. 마이크로 튜브를 63℃에서 60분 인큐베이트하여 증폭 반응을 행한 후, 80℃에서 5분간 인큐베이트하고 반응을 정지했다.

증폭 반응 후의 용액의 색조를 목시로 확인한 결과, 음성 컨트롤은 거의 무색이었던 것에 대하여, 양성 컨트롤은 청색의 정색을 나타냈다. 이것으로부터, 본 검출 시약은 LAMP법의 반응 시에, 반응액 중에 공존해도 반응을 크게 저해하지 않고, 반응 종료 후의 용액을 관찰하는 것만으로 핵산 증폭의 유무를 판별 가능한 것을 확인할 수 있었다.

(실시예 12)

피로포스파타제를 첨가한 LAMP법의 검출

피로포스파타제에 의해 증폭 반응의 부생성물인 피로인산의 생성을 억제한 핵산 증폭 반응으로서, 실시예 11의 리액션 믹스 대신에 「Isothermal Master Mix」(OptiGene사제)를 사용해서 LAMP법의 반응액을 조제했다. 양성 컨트롤, 음성 컨트롤을 63℃에서 30분 인큐베이트하여 증폭 반응을 행한 후, 80℃에서 5분간 인큐베이트하고 반응을 정지했다.

증폭 반응 후의 용액의 색조를 목시로 확인한 결과, 음성 컨트롤은 거의 무색이었던 것에 대하여, 양성 컨트롤은 청색의 정색을 나타냈다. 또한, 피로포스파타제에 의해 피로인산을 분해함으로써 반응성이 향상하여, 착색에 요하는 시간을 단축하는 것이 가능했다.

(실시예 13)

뚜껑형 검출 디바이스의 제작과 LAMP 반응의 검출

회전 줄을 사용해서, 0.2㎖의 PCR용 튜브(아이비스사제)의 뚜껑부의 내측에 직경 0.5㎜의 오목부를 제작하여, 시약 유지부로 했다. 시약 유지부에 검출 시약(0.1% 겐티아나 바이올렛B, 2.1% 아황산나트륨, 1.5% β시클로덱스트린)을 1㎕ 첨가 후, 감압 하 건조함으로써, 핵산 검출 시약을 유지한 반응 용기로 했다.

이 반응 용기를 사용해서, 검출 시약을 첨가하는 이외는 실시예 11과 같은 방법으로 LAMP 반응 용액을 조제했다. 반응 용기를 전도 혼화함으로써, 반응액과 시약 유지부에 유지한 검출 시약을 접촉시켜서, 완전히 용해했다. 스핀 다운을 행한 후, 반응 용기를 63℃에서 60분 인큐베이트하여 증폭 반응을 행한 후, 80℃에서 5분간 인큐베이트하고 반응을 정지했다.

증폭 반응 후의 용액의 색조를 목시로 확인한 결과, 음성 컨트롤은 거의 무색이었던 것에 대하여, 양성 컨트롤은 청색의 정색을 나타냈다.

(실시예 14)

(i) 뚜껑형 검출 디바이스의 제작

LAMP법의 반응 시약(14mM dNTPs, 4μM FIP, 4μM BIP, 0.5μM F3, 0.5μM B3, 40U Bst DNA 폴리머라제)을 조제했다. 조제한 반응 시약을 0.2㎖의 PCR용 튜브(아이비스사제)의 본체부에 10㎕씩 분주(分注)했다. 동일한 튜브의 뚜껑부의 내측에 검출 시약(0.1% 겐티아나 바이올렛B, 2.1% 아황산나트륨, 1.5% β시클로덱스트린, 0.15% 아스코르브산)을 1㎕씩 분주했다. 분주한 반응 시약과 검출 시약을 감압 하 건조함으로써, LAMP 반응 시약과 검출 시약을 유지한 반응 용기로 했다.

(ⅱ) 반응 용기형 검출 디바이스의 제작

상기 공정(i)의 반응 시약과 검출 시약을 미리 혼합한 용액 10㎕를, PCR용 튜브의 본체부에 분주하고, 감압 하 건조함으로써 LAMP 반응 시약과 검출 시약을 유지한 반응 용기로 했다.

(ⅲ) LAMP법의 검출

상기 공정(i)∼(ⅱ)에서 제작한 반응 용기 내에, 완충액(20mM Tris-HCl(pH 8.8), 10mM 염화칼륨, 10mM 황산암모늄, 8mM 황산마그네슘, 0.1% Tween20)을 가함으로써 LAMP 반응 용액으로 하여, M13mp18DNA를 100카피/튜브로 되도록 가한 것을 양성 컨트롤, 첨가하고 있지 않은 것을 음성 컨트롤로 했다. 반응 용액을 전도 혼화함으로써 잘 혼합하고, 스핀 다운한 후, 63℃에서 60분간 LAMP 반응을 행했다.

어느 반응 용기를 사용한 경우에도, 양성 컨트롤만이 착색하여, 표적의 유전자를 검출하는 것이 가능했다.

(실시예 15)

LAMP 반응에 의한 흡광도의 경시적 변화(리얼타임 측정)

반응 용기로서 석영 셀(광로(光路) 길이 1㎝)을 사용하여, 이하와 같이 LAMP 반응액을 조제했다. 50㎕의 리액션 믹스, 10㎕의 프라이머 믹스, 4㎕의 Bst DNA 폴리머라제, 1㎕의 피로포스파타제, 30㎕의 증류수, 및 4㎕의 핵산 검출 시약(0.1% 겐티아나 바이올렛B, 2.1% 아황산나트륨, 1.5% β시클로덱스트린)을 석영 셀에 가하여 잘 교반했다. 양성 컨트롤로서 1㎕의 포지티브 컨트롤 DNA를, 음성 컨트롤로서 1㎕의 증류수를 더 첨가해서 전량을 100㎕로 했다. 석영 셀을 63℃에서 60분 가온하고, 그 동안, 경시적으로 590㎚의 흡광도를 측정했다. 또한, 백그라운드값으로서, 증류수에 검출 시약만을 첨가해서 같은 측정을 행했다.

도 14에 백그라운드값을 뺀 각각의 결과를 나타낸다. 그 결과, 음성 컨트롤에서는 흡광도에 변화가 보이지 않았지만, 양성 컨트롤에서는 약 10분부터 흡광도의 상승이 보이고, 약 25분에서 플래토우(plateau)에 도달했다. 이상의 결과로부터, 본 검출 시약의 흡광도를 경시적으로 관찰함에 의해, LAMP 반응에 의한 핵산 증폭을 모니터링할 수 있는 것이 명확해졌다.

1 : 저부(底部)
2 : 몸통부
3 : 개구부
4 : 검출 시약 유지부
5 : 벽부

SEQUENCE LISTING <110> KANEKA CORPORATION <120> NUCLEIC ACID DETECTION METHOD, AND DEVICE AND KIT FOR USE IN SAME <130> B110029WO01 <150> JP2011-048183 <151> 2011-03-04 <150> JP2011-174105 <151> 2011-08-09 <150> JP2012-026491 <151> 2012-02-09 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer F <400> 1 ggaaacagct atgaccatga 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer R <400> 2 ctatgcggca tcagagcag 19

Claims

핵산과 검출 시약을 폐쇄계 내에서 접촉시키는 공정, 및
핵산 및/또는 검출 시약의 정색(呈色)을 가시광에서 판정하는 공정을 포함하는 핵산의 검출 방법.
제1항에 있어서,
상기 접촉 공정의 전 또는 후에, 핵산을 증폭하는 공정을 더 포함하는 핵산의 검출 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
검출 시약이 고체인 핵산의 검출 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
검출 시약이 류코형 색소를 함유하는 핵산의 검출 방법.
제4항에 있어서,
류코형 색소가 트리아릴메탄계 색소인 핵산의 검출 방법.
제5항에 있어서,
트리아릴메탄계 색소가, 크리스탈 바이올렛 또는 겐티아나 바이올렛인 핵산의 검출 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
검출 시약이 구핵제(求核劑) 및/또는 안정화제를 함유하는 핵산의 검출 방법.
제7항에 있어서,
구핵제가, 수소화붕소나트륨, 시안화수소화붕소나트륨, 아황산수소나트륨, 아황산나트륨, 차아황산나트륨, 피로아황산칼륨, 티오황산나트륨, 글루타티온, 아스코르브산, 2-메르캅토에탄올, DL-디티오트레이톨, 1-티오글리세롤, 시스테인, 트리부틸포스핀, 아미노에탄티올, 및 트리스2-카르복시에틸포스핀으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 구핵제인 핵산의 검출 방법.
제7항에 있어서,
안정화제가, α시클로덱스트린, β시클로덱스트린, γ시클로덱스트린, 및 아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 안정화제인 핵산의 검출 방법.
제2항에 있어서,
핵산의 증폭이 LAMP법에 의해 행해지는 핵산의 검출 방법.
제10항에 있어서,
LAMP법에서 피로인산 제거 효소를 사용하는 핵산의 검출 방법.
제11항에 있어서,
피로인산 제거 효소가 내열성의 피로포스파타제인 핵산의 검출 방법.
검출 시약을 유지하는 검출 시약 유지부, 및 상기 검출 시약 유지부를 구비한 뚜껑부 및/또는 반응 용기를 갖는 핵산 검출용 디바이스 또는 키트.
제13항에 있어서,
뚜껑부 및/또는 반응 용기가 핵산 증폭 시약을 더 유지하는 핵산 검출용 디바이스 또는 키트.
제13항 또는 제14항에 있어서,
검출 시약이 코팅재로 핵산으로부터 차폐되어 있는 핵산 검출용 디바이스 또는 키트.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 검출용 디바이스 또는 키트를 갖는 장치.