KR20140016285A

KR20140016285A - 액체 양이온 교환제

Info

Publication number: KR20140016285A
Application number: KR1020137024031A
Authority: KR
Inventors: 프랑크 에르하르트; 토마스 하스; 마틴 루스; 다니엘 데미콜리; 마르쿠스 푀터; 안야 슈베르트; 얀 크리스토프 페퍼; 토마스 타케; 하랄트 해거; 안드레아스 페니크; 마리에-도미니크 프르지빌스키-프룬트
Original assignee: 에보니크 데구사 게엠베하
Priority date: 2011-02-16
Filing date: 2011-12-01
Publication date: 2014-02-07
Also published as: JP2014511263A; MX2013009463A; EP2489432A2; BR112013020912A2; CA2826414A1; ES2642237T3; US10071951B2; EP2489432B1; MX344165B; CN103459033B; SG192823A1; WO2012110126A1; RU2592287C2; BR112013020912B1; JP5936627B2; AU2011359126A1; US20140054224A1; US9315443B2; CN103459033A; CA2826414C

Abstract

본 발명은 하나 이상의 양전하를 갖는 유기 화합물을 수용액으로부터 제거하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 a) 유기 화합물을 함유하는 수용액, 및 하나 이상의 음전하 및 음성의 총전하를 갖는 소수성 액체 양이온 교환제를 함유하는 소수성 유기 용액을 제공하는 단계, b) 수용액과 유기 용액을 서로 접촉시키는 단계, 및 c) 유기 용액을 수용액으로부터 분리하는 단계로 이루어진다.

Description

액체 양이온 교환제 {LIQUID CATION EXCHANGER}

본 출원은 a) 유기 화합물을 함유하는 수용액, 및 소수성인 액체 양이온 교환제를 포함하는 소수성 유기 용액을 제공하는 단계, b) 수용액과 유기 용액을 접촉시키는 단계, 및 c) 유기 용액을 수용액으로부터 분리하는 단계를 포함하며, 여기서 유기 화합물은 화학식 NH₃ ⁺-A-COOR¹의 화합물인, 하나 이상의 양전하를 갖는 유기 화합물을 수용액 및 이와 관련된 반응 혼합물로부터 제거하는 방법에 관한 것이다.

통상적으로 화석 연료로부터 시작하여 합성된 재생가능한 원료로부터 시작되는 정제화학제품의 생물공학적 제조에서의 근본적인 문제는, 전형적으로 다량의 수성상 내에 존재하는 수득 생성물을 유기상으로 전달하는 것이다. 이러한 전달을, 한편으로는 완성된 중간체 또는 최종 생성물을 농축시키기 위해서 및 임의로 또한 후속 반응 단계에서 유기 용액에서의 합성적 가공을 가능하게 하기 위해서, 및 다른 한편으로는 원하는 생성물을 제거함으로써 수성상에서의 반응 수율을 개선하기 위해서 또는 반응을 기술적으로 합리적인 규모로 어쨌든간에 수행할 수 있도록 하기 위해서 수행한다. 대체로, 종종 낮은 농도로 존재하는 생성물을 다량의 수용액으로부터 직접 가열 농축시키는 것은 합리적이지 않다.

비혼화성인 수성 친수성 상 및 유기 소수성 상을 포함하는 2-상 시스템내에서의 화합물의 분배는 결정적으로 특정 화합물의 물리화학적 성질에 따라 달라진다. 치환되지 않은 탄화수소를 높은 비율로 갖거나 전적으로 이로만 이루어진 화합물은 주로 소수성 상 내에 축적되는 반면에, 헤테로원자-함유 관능기와 같은 극성기를 높은 비율로 갖는 화합물 및 매우 특히는 전하를 갖는 화합물은 주로 또는 사실상 전적으로 수성상에 존재하며, 이는 유기상으로의 전달에 방해가 된다.

평형의 달성 후의 상기 2-상 시스템 내에서의 화합물의 분배는 종종 예를 들어 네른스트식(Nernst equation)에 따른 분배계수에 의해 기술된다.

α = c_{상 1}/c_{상 2}

특정 분배계수는 P 값이라고도 불리는 K_ow이고, 이는 옥탄올과 수성상 사이의 화합물의 분배 평형을 특징짓는다:

K_ow = P = c_옥탄올/C_물

산업적으로 수요가 많은, 양으로 하전된 유기 화합물의 예는 12-아미노라우르산(ALA) 및 그의 유도체, 특히 메틸 에스테르(ALAME)이다. ALA는 중합체의 제조, 예를 들어 파이프라인 시스템 및 나일론의 제조에서 중요한 출발 물질이다. 통상적으로, ALA는 화석 원료로부터 시작하여, 부타디엔의 삼량체화 및 이어서 시클로도데칸의 형성이 수반된 수소화, 이어서 시클로도데칸온으로의 산화, 히드록시라우린과의 반응 및 이어서 베크만(Beckmann) 재배열에 의해 합성되는 라우로락탐을 통해, 공정에서 낮은 수율로 제조된다. ALA 또는 ALAME의 생물공학적 제조를 위한 유망한 경로는 DE10200710060705에 기술되어 있다.

종래 기술에는, 생물학적 작용제를 포함하는 수성 반응 혼합물을 유기 용매를 포함하는 유기상과 접촉시킴에 의한, 양으로 하전된 유기 화합물의 제조가 교시되어 있다. 예를 들어, DE10200710060705에는 생성물 ALAME를 에틸 아세테이트와 함께 진탕시킴으로써 수성 반응 혼합물로부터 수득함이 기술되어 있다. 아사노(Asano) 등(2008)은 ALA 합성 효소를 포함하는 반응 수용액으로부터 톨루엔을 사용하여 ALA를 추출함을 개시한다.

따라서 본 발명에 의해 해결되어야 하는 문제는, 하나 이상의 양전하를 갖는, 양으로 하전된 유기 화합물, 특히 ω-아미노카르복실산을 수성 반응 혼합물로부터 제거하는 방법을 개발하는 것이며, 여기서 가능한 한 유리한, 반응 혼합물과 추출제로서 사용되는 소수성 유기상 사이의 분배 평형의 위치가 바람직하고, 즉 분배 평형은 가능한 한 소수성 유기상 쪽에 있어야 한다.

본 발명에 의해 해결되어야 하는 또 다른 문제는, 하나 이상의 양전하를 갖는 유기 화합물, 특히 ω-아미노카르복실산을, 생물학적 작용제를 포함하는 수용액으로부터 추출제로서 소수성 유기상을 사용하여 제거하는 방법을 개발하는 것으로 이루어지며, 여기서 분배 평형은 가능한 한 소수성 유기상 쪽에 위치한다.

본 발명에 의해 해결되어야 하는 또 다른 문제는, 생물공학적으로 관련된 미생물, 특히 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 성장을 가능한 한 거의 없도록 방해 또는 둔화시키고/시키거나 분열할 수 있는 세포 및/또는 생존가능한 세포 및/또는 능동 호흡을 하는 세포 및/또는 대사적 및 합성적으로 활성인 세포의 개수를 가능한 한 적도록 감소시키는, 추출제로서 소수성 유기 용액을 사용하여 하나 이상의 양전하를 갖는 유기 화합물, 특히 ω-아미노카르복실산을 수용액으로부터 제거하는 방법을 개발하는 것으로 이루어진다.

마지막으로, 본 발명에 의해 해결되어야 하는 문제는 하나 이상의 양전하를 갖는 유기 화합물, 특히 ω-아미노카르복실산을, 생물학적 작용제를 포함하는 수용액으로부터 추출제로서 소수성 유기상을 사용하여 제거하는 방법을 수정하는 것이고, 여기서 기반이 되는 생물공학적 합성 공정의 수율, 총 회전율(turnover) 및 빠른 실행가능성에 있어서 결정적인 모든 성질, 특히 생물학적 작용제에 대한 유기상의 독성 및 유기 추출제로의 화합물의 흡수는, 총 수율 또는 보다 빠른 진행, 또는 연속 공정의 경우에, 특히 하나 이상의 양전하를 갖는 유기 화합물이 생물학적 작용제의 촉매 활성에 의해 합성되는 합성 공정의 생성물 또는 중간체인 경우에, 가능한 한 긴 시간 동안의 생물학적 작용제의 사용가능성에 대해 최적화된다.

상기 및 기타 문제는 본 출원의 특허대상 및 특히 또한 첨부된 특허청구범위의 독립항의 특허대상에 의해 해결되고, 여기서 실시양태는 종속항에 기술되어 있다.

본 발명에 의해 해결되어야 하는 문제는 제1 측면에서

a) 유기 화합물을 함유하는 수용액, 및 소수성인 액체 양이온 교환제를 포함하는 소수성 유기 용액을 제공하는 단계,

b) 수용액과 유기 용액을 접촉시키는 단계, 및

c) 유기 용액을 수용액으로부터 분리하는 단계

를 포함하며,

여기서 유기 화합물은 하기 화학식 I의 화합물이고, 액체 양이온 교환제는 지방산인, 하나 이상의 양전하를 갖는 유기 화합물을 수용액으로부터 제거하는 방법에 의해 해결된다:

<화학식 I>

NH₃ ⁺-A-COOR¹

상기 식에서, R¹은 수소, 메틸, 에틸 또는 음전하이고, A는 3개 이상, 바람직하게는 8개 이상의 탄소 원자를 갖는 치환되지 않은 선형 알킬렌기이다.

제1 측면의 제1 실시양태에서, 상기 문제는, 단계 b)에서의 온도가 28 내지 70℃, 바람직하게는 30 내지 37℃인 제1항에 따른 방법에 의해 해결된다.

또한 제1 측면의 제1 실시양태의 한 실시양태인 제2 실시양태에서, 상기 문제는, 단계 b)에서의 pH가 6 내지 8, 바람직하게는 6.2 내지 7.2인, 제1항 또는 제2항에 따른 방법에 의해 해결된다.

또한 제1 측면의 제1 내지 제2 실시양태 중 한 실시양태인 제3 실시양태에서, 상기 문제는, 액체 양이온 교환제 대 유기 화합물의 몰비가 1 이상인 방법에 의해 해결된다.

또한 제1 측면의 제1 내지 제3 실시양태 중 한 실시양태인 제3 실시양태에서, 상기 문제는, 유기 용액 대 수용액의 부피비가 1:10 내지 10:1인 방법에 의해 해결된다.

또한 제1 측면의 제1 내지 제3 실시양태 중 한 실시양태인 제4 실시양태에서, 상기 문제는, 액체 양이온 교환제가 12개 초과, 바람직하게는 14 내지 22개, 더욱 바람직하게는 16 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 지방산인 방법에 의해 해결된다.

또한 제1 측면의 제1 내지 제4 실시양태 중 한 실시양태인 제5 실시양태에서, 상기 문제는, 액체 양이온 교환제가 불포화 지방산, 바람직하게는 올레산 또는 에루스산인 방법에 의해 해결된다.

또한 제1 측면의 제1 내지 제5 실시양태 중 한 실시양태인 제6 실시양태에서, 상기 문제는, 수용액이 또한 촉매 활성을 갖는 생물학적 작용제를 포함하는 것인 방법에 의해 해결된다.

또한 제1 측면의 제1 내지 제6 실시양태 중 한 실시양태인 제7 실시양태에서, 상기 문제는, 생물학적 작용제가 세포, 바람직하게는 박테리아 세포이고, 세포가 더욱 바람직하게는 재조합 알칸 모노옥시게나제, 재조합 트랜스아미나제, 및 바람직하게는 또한 알콜 데히드로게나제, 알라닌 데히드로게나제 및 AlkL 유전자 생성물 또는 그의 변이체를 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 효소를 갖는 것인 방법에 의해 해결된다.

또한 제1 측면의 제1 내지 제7 실시양태 중 한 실시양태인 제8 실시양태에서, 상기 문제는, 바람직하게는 유기 화합물이 세포에 대해 독성인 화합물이라는 점에서, 유기 화합물의 존재가 촉매 활성에 악영향을 미치는 것인 방법에 의해 해결된다.

또한 제1 측면의 제1 내지 제8 실시양태 중 한 실시양태인 제9 실시양태에서, 상기 문제는, 유기 용액이 또한 하나 이상의 유기 용매, 바람직하게는 지방산 및/또는 지방산 에스테르를 함유하는 것인 방법에 의해 해결된다.

또한 제1 측면의 제1 내지 제9 실시양태 중 한 실시양태인 제10 실시양태에서, 상기 문제는, 유기 용액이 액체 양이온 교환제로서 20 내지 80 부피%, 바람직하게는 25 내지 75 부피%의 올레산, 및 용매로서 라우르산 메틸 에스테르를 포함하고, 유기 화합물이 12-아미노라우르산 메틸 에스테르이고, 재조합 알칸 모노옥시게나제, 재조합 트랜스아미나제, 및 바람직하게는 또한 알콜 데히드로게나제, 알라닌 데히드로게나제 및 AlkL 유전자 생성물 또는 그의 변이체를 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 효소를 갖는 박테리아 세포가 수용액 내에 존재하는 것인 제12항에 따른 방법에 의해 해결된다.

제2 측면에서, 본 발명에 의해 해결되어야 하는 문제는

수용액 및 소수성 유기 용액을 포함하며,

여기서 소수성 유기 용액은 액체 양이온 교환제로서 지방산, 바람직하게는 12개 초과의 탄소 원자를 갖는 지방산, 더욱 바람직하게는 불포화 지방산을 포함하고, 수용액은 하기 화학식 I의 화합물을 포함하는 것인, 반응 혼합물에 의해 해결된다:

<화학식 I>

NH₃ ⁺-A-COOR¹

제2 측면의 한 실시양태에서, 본 발명에 의해 해결되어야 하는 문제는, 수용액이 또한 재조합 알칸 모노옥시게나제, 재조합 트랜스아미나제, 및 바람직하게는 또한 알콜 데히드로게나제, 알라닌 데히드로게나제 및 AlkL 유전자 생성물 또는 그의 변이체를 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 효소를 갖는 세포를 포함하는, 제1 측면에 따른 반응 혼합물에 의해 해결된다.

제2 측면의 추가의 실시양태는 제1 측면의 모든 실시양태를 포함한다.

본 발명에 의해 해결되어야 할 문제는 제4 측면에서,

a) 유기 화합물을 함유하는 수용액, 및 하나 이상의 음전하 및 음성의 총전하를 갖는 소수성인 액체 양이온 교환제를 포함하는 소수성 유기 용액을 제공하는 단계,

b) 수용액과 유기 용액을 접촉시키는 단계, 및

c) 유기 용액을 수용액으로부터 분리하는 단계

를 포함하는, 하나 이상의 양전하를 갖는 유기 화합물을 수용액으로부터 제거하는 방법에 의해 해결된다.

또한 본 발명의 제1 실시양태의 한 실시양태인, 본 발명의 제4 측면의 제2 실시양태에서, 방법은

d) 바람직하게는 유기 화합물을 또 다른 수용액 내로 역세척함으로써, 유기 용액을 후처리하는 단계

를 포함한다.

또한 본 발명의 제1 내지 제2 실시양태 중 한 실시양태인, 본 발명의 제4 측면의 제3 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법의 단계 b)에서의 온도는 28 내지 70℃, 바람직하게는 30 내지 37℃이다.

또한 본 발명의 제1 내지 제3 실시양태 중 한 실시양태인, 본 발명의 제4 측면의 제4 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법의 단계 b)에서의 pH는 3 내지 8, 바람직하게는 6 내지 8, 특히 바람직하게는 6.2 내지 7.2이다.

또한 본 발명의 제1 내지 제4 실시양태 중 한 실시양태인, 본 발명의 제4 측면의 제5 실시양태에서, 이 방법에서 액체 양이온 교환제 대 유기 화합물의 몰비는 1 이상이다.

또한 본 발명의 제1 내지 제5 실시양태 중 한 실시양태인, 본 발명의 제4 측면의 제6 실시양태에서, 유기 용액 대 수용액의 부피비는 1:10 내지 10:1이다.

또한 본 발명의 제1 내지 제6 실시양태 중 한 실시양태인, 본 발명의 제4 측면의 제7 실시양태에서, 유기 화합물은 하나 이상의 양으로 하전된 하기 화학식 I의 치환기를 갖거나, R², R³ 및 R⁴를 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 치환기가 수소이면, 그의 양성자화되지 않은 형태를 갖는다:

<화학식 I>

-N⁺R²R³R⁴

상기 식에서, R², R³ 및 R⁴는 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 2-프로필, 부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 벤질, 히드록실, 치환되거나 치환되지 않은 및/또는 선형 또는 분지형 또는 시클릭 알킬 또는 알케닐을 포함하는 군으로부터 서로 독립적으로 선택된다.

또한 본 발명의 제1 내지 제7 실시양태 중 한 실시양태인, 본 발명의 제4 측면의 제8 실시양태에서, 유기 화합물은 하기 화학식 II를 갖거나, R², R³ 및 R⁴를 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 치환기가 수소이면, 그의 양성자화되지 않은 형태를 갖는다:

<화학식 II>

Z-A-N⁺R²R³R⁴

상기 식에서, R², R³ 및 R⁴는 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 2-프로필, 부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 벤질, 히드록실, 치환되거나 치환되지 않은 및/또는 선형 또는 분지형 또는 시클릭 알킬 또는 알케닐을 포함하는 군으로부터 서로 독립적으로 선택되고,

A는 3개 이상의 탄소 원자를 포함하는 탄화수소 쇄, 바람직하게는 치환되지 않은 알케닐기이고,

Z는 -COOH, -COOR⁵, -COH, -CH₂OH 및 그의 양성자화되지 않은 형태를 포함하는 군으로부터 선택되고, 여기서 R⁵는 수소, 메틸, 에틸, 프로필, 2-프로필, 부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 벤질, 히드록실, 치환되거나 치환되지 않은 및/또는 선형 또는 분지형 또는 시클릭 알킬 또는 알케닐을 포함하는 군으로부터 선택된다.

또한 본 발명의 제1 내지 제8 실시양태 중 한 실시양태인, 본 발명의 제4 측면의 제9 실시양태에서, 유기 화합물은 하기 화학식 III 또는 그의 양성자화되지 않은 형태를 갖는다:

<화학식 III>

NH₃ ⁺-A-COOR¹

상기 식에서, R¹은 수소, 메틸 또는 에틸이고, A는 3개 이상의 탄소 원자를 갖는 치환되지 않은 선형 알킬렌기이다.

또한 본 발명의 제1 내지 제9 실시양태 중 한 실시양태인, 본 발명의 제4 측면의 제10 실시양태에서, 액체 양이온 교환제는 6개 이상의 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 알킬 또는 알케닐기, 및 -COOH, -OSO₂H, -OPO(OH)₂- 및 -OPO(OH)O-를 포함하는 군으로부터의 말단 치환기 및 그의 양성자화되지 않은 형태를 갖는다.

또한 본 발명의 제1 내지 제10 실시양태 중 한 실시양태인, 본 발명의 제4 측면의 제11 실시양태에서, 액체 양이온 교환제는 불포화 지방산, 바람직하게는 올레산이다.

또한 본 발명의 제1 내지 제11 실시양태 중 한 실시양태인, 본 발명의 제4 측면의 제12 실시양태에서, 수용액은 촉매 활성을 갖는 생물학적 작용제를 추가로 포함한다.

또한 본 발명의 제1 내지 제12 실시양태 중 한 실시양태인, 본 발명의 제4 측면의 제13 실시양태에서, 생물학적 작용제는 세포, 바람직하게는 박테리아 세포이다.

또한 본 발명의 제1 내지 제13 실시양태 중 한 실시양태인, 본 발명의 제4 측면의 제14 실시양태에서, 유기 화합물의 존재는 촉매 활성에 악영향을 미친다.

또한 본 발명의 제1 내지 제14 실시양태 중 한 실시양태인, 본 발명의 제4 측면의 제15 실시양태에서, 유기 용액은 또한 하나 이상의 유기 용매, 바람직하게는 지방산 및/또는 지방산 에스테르를 함유한다.

또한 본 발명의 제1 내지 제15 실시양태 중 한 실시양태인, 본 발명의 제4 측면의 제16 실시양태에서, 유기 용액은 액체 양이온 교환제로서 20 내지 80 부피%, 바람직하게는 25 내지 75 부피%의 올레산, 및 용매로서 라우르산 메틸 에스테르를 포함하고, 유기 화합물은 12-아미노라우르산 메틸 에스테르이고, 수용액 내에는 12-아미노라우르산 메틸 에스테르의 합성에 관여하는 촉매 활성을 갖는 박테리아 세포가 존재한다.

제5 측면에서, 본 발명에 의해 해결되어야 하는 문제는, 생물학적 작용제를 포함하는 수용액 및 액체 양이온 교환제를 포함하는 소수성 유기 용액을 포함하는 생물반응기에 의해 해결된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, "생물반응기"라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 생물공학적으로 사용가능한 미생물을 제어된 조건 하에서 배양하고/하거나 생물공학적 공정, 바람직하게는 유기 화합물의 합성을 위해 사용할 수 있는 임의의 용기를 의미한다.

또한 본 발명의 제3 측면의 제1 실시양태의 한 실시양태인, 제5 측면의 제2 실시양태에서, 액체 양이온 교환제는 지방산, 바람직하게는 올레산이다.

또한 본 발명의 제3 측면의 제1 또는 제2 실시양태 중 한 실시양태인, 제5 측면의 제3 실시양태에서, 소수성 유기 용액은 또한 지방산 에스테르, 바람직하게는 라우르산 메틸 에스테르를 포함한다.

또한 본 발명의 제2 측면의 제1 내지 제3 실시양태 중 한 실시양태인, 제5 측면의 제4 실시양태에서, 소수성 유기 용액은 양이온 교환제로서 올레산 및 용매로서 25 내지 75 부피%의 라우르산 메틸 에스테르를 포함한다.

또한 본 발명의 제1 측면의 제1 내지 제4 실시양태 중 한 실시양태인 제5 실시양태에서, 유기 화합물은 본 발명의 제1 측면의 실시양태들 중 하나에 따른 화합물이다.

제6 측면에서, 본 발명에 의해 해결되어야 하는 문제는, 액체 양이온 교환제 및 임의로 유기 용매를 포함하는 소수성 유기 용액의 존재 하에서, 수용액에서, 유기 화합물의 합성에 관여하는 세포, 바람직하게는 합성의 하나 이상의 단계를 촉진시키는 세포를 배양함을 포함하는, 세포에 대해 독성인 하나 이상의 양전하를 갖는 유기 화합물의 제조 방법에 의해 해결된다.

본 발명의 제6 측면의 제2 실시양태에서, 유기 화합물은 12-아미노라우르산 또는 그의 메틸 에스테르이고, 유기 용매는 라우르산 메틸 에스테르이다.

제4, 제5 및 제6 측면의 추가의 실시양태는 본 발명의 제1 및 제2 측면의 모든 실시양태를 포함한다.

본 발명의 발명자들은, 놀랍게도, 유기 용액이 액체 양이온 교환제를 포함하는 경우에, 하나 이상의 양전하를 갖는 유기 화합물을 수용액으로부터 소수성 유기 용액 내로 제거하는 효율을 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 임의의 이론에 결부시키려는 것은 아니지만, 본 발명의 발명자들은 액체 양이온 교환제의 음전하 또는 음전하들이 유기 화합물의 하나의 양전하 또는 다수의 양전하들과 상호작용/이온적으로 상호작용하며 이러한 상호작용으로 인해 하나 이상의 양전하가 차폐되고, 이로써 유기상에서의 용해도가 증가한다고 추측한다.

바람직한 실시양태에서, "액체 양이온 교환제"라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 소수성 유기 용매에 용해성이고, 하나 이상의 음성 영구전하로 인해 하나 이상의 양이온과의 이온적 상호작용에 관여할 수 있는 화합물을 의미한다. 액체 양이온 교환제는 전형적으로 선형 또는 분지형일 수 있는 하나 이상의 포화 또는 불포화 탄화수소 쇄, 및 음으로 하전된 기, 예를 들어 카르복실기를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 액체 이온 교환제는 지방산이고, 더욱 바람직한 실시양태에서 이는 불포화 지방산, 예를 들어 올레산이다. 바람직한 실시양태에서 액체 이온 교환제는 디(2-에틸헥실)인산(DEHPA 또는 D2EHPA이라고도 불림)이다.

바람직한 실시양태에서, 액체 이온 교환제는 음성의 총전하를 가질 뿐만 아니라 심지어는 양전하를 갖지 않는다. 바람직한 실시양태에서 이온 교환제 또는 몇몇 기타 분자의 "총전하"라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 분자에 공유결합된 모든 관능기의 전하의 총합을 의미한다. 예를 들어, pH 7에서 라우르산은, 수용액 내에 존재하는 칼륨 이온 같은 상대이온 또는 기타 분자의 존재와 상관없이, 총전하로서 음전하를 갖는다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, "접촉"이라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 두 상들을, 특히 이들 사이에 막 같은 물리적 장벽이 없이, 서로 직접 노출시킴을 의미한다. 가장 단순한 경우에는, 두 상들을 동일한 용기에 넣고, 이들을 적합한 방식으로, 예를 들어 교반에 의해 서로 혼합함으로써, 접촉을 수행한다.

바람직한 실시양태에서, 유기 화합물은 양성의 총전하를 갖는다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 유기 화합물은 음전하를 갖지 않는다. 바람직한 실시양태에서 유기 화합물은 ω-아미노카르복실산이다.

바람직한 실시양태에서, "전하를 갖는다"라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 그렇게 지칭된 화합물이 수용액에서 pH 0 내지 14, 바람직하게는 2 내지 12, 2 내지 6, 8 내지 12, 3 내지 10, 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 7에서 상응하는 전하를 가짐을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 이는 영구적으로 존재하는 전하이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, "전하를 갖는다"라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 상응하는 관능기 또는 화합물이 pH 7에서 주로, 즉 50% 이상, 더욱 바람직하게는 90%, 더욱 더 바람직하게는 99%로, 상응하는 전하를 가짐을 의미한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, "함유"라는 용어는 "포함", 즉 단정적이지 않음이라는 의미로서 이해되어야 한다. A를 함유하는 혼합물은 이러한 의미에서는 A 외에도 기타 성분을 가질 수 있다. "하나 이상의 전하"라는 어구는 상응하는 본성을 갖는 하나 이상의 전하를 의미한다.

바람직한 실시양태에서, "소수성"이라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 수성상의 존재 하에서, 수성상으로부터 명확히 경계지워진 그 자체의 액체상을 형성하는 액체의 성질을 의미한다. 이는 연속 액체상 또는 유화액일 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, "소수성"이라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 본질적으로 물에 용해되지 않는 화합물의 성질을 의미한다. 마지막으로, 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 이 용어는 그렇게 지칭된 화합물이, 0 초과, 바람직하게는 0.5 초과, 더욱 바람직하게는 1 초과, 가장 바람직하게는 2 초과인 상용로그값을 갖는 P 값을 갖는다는 것으로 이해되어야 한다 (문헌 [J. Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997]).

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 액체 이온 교환제는 생물공학적으로 관련된 미생물에 대해 독성 작용을 하지 않거나 적당한 독성 작용만을 한다. "독성 작용"이라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상응하는 미생물과 접촉 시 그의 성장 속도를 감소시키고/시키거나 그의 대사적 활성을 감소시키고/시키거나 그의 에너지 소비를 증가시키고/시키거나 그의 광학 밀도 또는 생존가능한 세포의 개수를 감소시키고/시키거나 그의 사멸 및 용해를 직접 초래하는 화합물의 성질을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 독성 화합물의 이러한 효과들 중 하나 이상은 이미 낮은 농도에서, 바람직하게는 1000 ㎎/ℓ, 더욱 바람직하게는 100 ㎎/ℓ, 더욱 더 바람직하게는 50 내지 25 ㎎/ℓ, 가장 바람직하게는 5 ㎎/ℓ의 농도에서 달성된다. 해당 분야의 숙련자라면, 독성을 연구할 수 있는, 통상적으로 사용하기 위한 수많은 방법을 알고 있을 것이다. 이는 예를 들어 O₂ 전극을 사용한 상응하는 미생물의 호흡의 측정 또는 미생물 샘플의 비교 도말(plating-out) 및 후속되는 콜로니 형성 단위(CFU)의 계수를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, "적당한 독성 작용"은 성장 단계에 있는 미생물이 화합물의 존재 하에서 계속 성장하고/하거나 대사적으로 활성이지만, 그 정도가, 동일한 조건에서 상응하는 화합물의 부재 하에서 배양되는 대조군보다는 더 낮고/낮거나 더 오랜 유도기를 가짐을 의미한다.

수용액과 유기 용액의 접촉을, 적합한 조건에서, 특히 유기 화합물을 수성상으로부터 유기상 내로 충분히 전달하기에 충분한 기간 동안, 이상적으로는 상응하는 평형을 달성하기에 충분한 기간 동안 수행한다. 이러한 시간 기간 및 조건은 해당 분야의 숙련자에 의해 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.

특히 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 양전하를 갖는 유기 화합물은 말단에서 아민화된 지방산, 특히 바람직하게는 12-아미노라우르산 또는 그의 에스테르 또는 두 화합물들의 혼합물이다. 해당 분야의 숙련자라면, 지방산의 에스테르는, 에스테라제 활성을 포함하는 생물학적 시스템의 존재 하에서, 부분적으로는, 상응하는 산의 형태일 수 있고, 이와 관련해서 두 화합물들은 동등하게 간주되어야 한다는 것을 알 것이다. 따라서, 특히 바람직한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 지방산 또는 지방산 유도체는 상응하는 에스테르, 바람직하게는 메틸 에스테르를 포함할 수 있고 또한 그 반대도 그러하다.

특히 바람직한 실시양태에서 "알킬렌기"라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 화학식 -(CH₂)_n-의 기, 즉 개방된, 바람직하게는 말단에 있는 두 개의 치환기를 갖는 알칸을 의미한다. 두 개의 치환기는 예를 들어 아민기 및 카르복실기일 수 있다. 바람직한 실시양태에서 n은 3 이상, 더욱 바람직하게는 6 이상, 더욱 바람직하게는 11 이상이다. "치환된 알킬렌 쇄"의 경우에, 하나 이상의 수소 원자는 수소 원자가 아닌 치환기 또는 알킬 잔기, 바람직하게는 수소 원자와 같은 또 다른 원자로 대체된다. 그러나, 특정 실시양태에서 "치환되지 않은 알킬렌기"라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 상기 치환기를 갖지 않는 화학식 -(CH₂)_n-의 탄화수소 쇄를 의미한다.

단계 b)에서의 온도는 액체 양이온 교환제의 성질 뿐만 아니라, 특히 수용액과 유기 용액의 접촉이 수행되는 경우에, 반응이 수성상에서 진행되기 때문에, 수성상에서 일어나는 임의의 반응의 온도 요건에 따라서도 달라진다. 특히 살아있는 세포와 같은 생물학적 작용제가 수성상에서 촉매 활성인 경우에, 온도는 이러한 활성을 유지하기에 적합해야 한다. 바람직한 실시양태에서, 단계 b)에서의 온도는 0 내지 100℃, 더욱 바람직하게는 20 내지 80℃, 28 내지 70℃, 30 내지 37℃, 35 내지 40℃이다.

단계 b)에서의 pH의 경우에도, 동시적으로 일어나는 임의의 반응들의 요건, 추출물, 생성물, 중간체 또는 시약의 안정성을 고려해야 한다. 바람직한 실시양태에서 pH는 3 내지 8, 더욱 바람직하게는 6 내지 8, 더욱 더 바람직하게는 6.2 내지 7.2이다.

유기 화합물을 수성상으로부터 유기상 내로 가능한 한 완전히 전달하기 위해서, 충분한 양의 액체 양이온 교환제가 필요하다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 반응의 전체 과정에 걸친 연속 공정에서 합산된, 하나 이상의 단계에서 액체 양이온 교환제 대 유기 화합물의 몰비는 1 이상이고, 즉 유기 화합물의 분자 당 1 분자 이상의 액체 양이온 교환제가 사용된다. 더욱 더 바람직한 실시양태에서, 상기 비는 2, 3, 5, 10, 15 또는 20 초과, 바람직하게는 1.5 내지 3이다.

유기 용액 대 수용액의 부피비는, 양이온 교환제/유기 화합물 몰비와 함께, 효율적인 공정을 위해 중요하다. 특정 실시양태에서, 이는 100:1 내지 1:100, 바람직하게는 20:1 내지 1:20, 더욱 바람직하게는 10:1 내지 1:10, 4:1 내지 1:4, 3:1 내지 1:3 또는 가장 바람직하게는 1:2 내지 2:1이다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 지방산이 액체 양이온 교환제로서 사용된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, "지방산"이라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 6개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 더욱 바람직하게는 10개 이상, 가장 바람직하게는 12개 이상의 탄소 원자를 갖는 카르복실산, 바람직하게는 알칸산을 의미한다. 바람직한 실시양태에서 이는 선형 지방산, 또 다른 실시양태에서 이는 분지형이다. 바람직한 실시양태에서 이는 포화 지방산이다. 특히 바람직한 실시양태에서 이는 불포화된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서 이는 바람직하게는 9 번 위치에서 이중결합을 포함하는 12개 이상의 탄소 원자를 갖는 선형 지방산이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서 이는 이중결합이 9번 위치 및/또는 11번 위치에 위치한 단순 불포화 지방산이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서 액체 양이온 교환제는 올레산, 팔미톨산 및 가돌레산 및 이코세노산을 포함하는 군으로부터 선택된 불포화 지방산이다. 가장 바람직한 실시양태에서 이는 올레산이다. 특히 바람직한 실시양태에서 이는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개, 바람직하게는 12개 초과, 더욱 바람직하게는 14개 초과, 더욱 더 바람직하게는 14 내지 28개, 14 내지 22개, 가장 바람직하게는 16 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 지방산이다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 다양한 지방산의 혼합물이 액체 이온 교환제로서, 예를 들어 대두유 또는 공엉겅퀴유(globe thistle oil)의 형태로 사용된다. 이는 지방산이 에스테르로서 존재하는 경우 필요하다면 예비 가수분해를 포함한다.

본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 두 액체 양이온 교환제의 조합, 바람직하게는 이들 중 하나 이상이 지방산인 조합이 사용된다.

본 발명의 특정한 이점은 생물공학적 공정 및 여기에서 사용되는 생물학적 작용제와의 본 발명에 따른 방법의 상용성이다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, "촉매 활성을 갖는 생물학적 작용제"라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 전체 세포로부터 단리된 분자까지의, 모든 정제 단계에서의 세포에 의해 합성되는 생체촉매를 의미한다. 바람직한 실시양태에서 이는 촉매 활성을 갖는 효소를 발현하는 세포이다. 세포는 고세균을 포함하는 원핵생물, 또는 바람직하게는 슈도모나스(Pseudomonas), 코리네박테리움(Corynebacterium) 및 이. 콜라이(E. coli)를 포함하는 군으로부터의 진핵생물일 수 있다. 더욱 더 바람직한 실시양태에서, 제제는 박테리아 세포, 더욱 더 바람직하게는 그람 음성 박테리아 세포, 가장 바람직하게는 이. 콜라이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서 이는 진핵생물 세포, 더욱 바람직하게는 진균 세포, 더욱 더 바람직하게는 효모 세포, 가장 바람직하게는 사카로미세스(Saccharomyces) 또는 칸디다(Candida), 피키아(Pichia), 특히 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)이다. "세포"라는 용어는, 특정 실시양태에서, 본 출원에서는 "미생물"이라는 용어와 동등하고 호환가능하게 사용된다. 또한, 세포는 단리된 세포 또는 배양물의 혼합물일 수 있다.

생물학적 작용제로서 사용되는 세포는 생존가능한 것일 수 있거나, 이는 그의 제제, 예를 들어 세포막 분획 또는 세포질액 분획 또는 세포의 조질 추출물일 수 있다.

생물학적 작용제가 다양한 정제 단계에서의 단리된 분자인 경우에, 이는 세포에 의해 생성된 모든 촉매 활성 분자일 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이는 펩티드, 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산 또는 이들의 혼합된 형태를 포함하는 군으로부터의 분자이다. 보다 바람직한 실시양태에서 이는 촉매 활성 폴리펩티드이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서 이는 고정된 분자이다.

합성적 생물공학적 공정에서 요구되는 촉매 작용은 다양하다. 바람직한 실시양태에서, "촉매 활성"이라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 합성적 활성, 즉 하나 이상의 신규한 공유결합의 형성을 포함하는 화학 반응을 촉진하는 촉매작용이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서 이는 수송 활성, 즉 또 다른 분자를 한 구역으로부터 또 다른 구역으로 수송하는 분자의 능력, 예를 들어 물질을 수성 매체로부터 세포막을 통해 세포의 내부로 옮기는 능력이다.

특히 바람직한 실시양태에서, 생물학적 작용제는 살아있는 세포이고, 이는 액체 양이온 교환제의 존재 하에서, 바람직하게는 후속적으로 또는 동시적으로 액체 양이온 교환제에 의해 소수성 유기상 내로 제거되는 하나 이상의 양이온을 갖는 유기 화합물을 합성하기 위해서 촉매작용을 위해 사용된다.

특히 바람직한 실시양태에서 유기 화합물의 존재는 촉매 활성에 악영향을 미친다. 한 실시양태에서 이는 존재하는 활성의 양을 감소시킬 수 있고, 이는 효소의 보다 낮은 k_cat로서 표현될 수 있다. 또 다른 실시양태에서 촉매 활성을 갖는 제제의 친화성은 효소의 증가된 K_M라는 측면에서 영향받을 수 있다. 또 다른 실시양태에서 촉매 활성의 특이성은, 예를 들어, 이것이 원하는 것 외의 기질 분자를 바람직하게 전환시키도록 변경될 수 있다. 또 다른 실시양태에서 유기 화합물은 생물학적 작용제로서의 세포에 대해 독성 작용을 한다.

또 다른 실시양태에서 유기 화합물은 필수적인 공-기질 또는 공-효소의 유용성을 감소시키는 유기 화합물이다. 이는 예를 들어 유기 화합물이 상응하는 재생 반응을 억제하는 경우일 수 있다.

액체 양이온 교환제 외에도, 소수성 유기상은 또한 소수성 용매를 함유할 수 있다. 이는 소수성 상에서의 액체 양이온 교환제의 흡수능을 증가시키고 바람직하지 않은 거동, 예를 들어 응집을 방지하는 역할을 할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 용매는 수용액 내에서 일어나는 반응의 추출물, 가장 바람직하게는 수용액 내에서 일어나는 효소-촉진된 반응의 기질이다. 바람직한 실시양태에서, 이는 지방산 에스테르이다. 특히 바람직한 실시양태에서 용매는 액체 양이온 교환제로서의 역할을 하는 지방산의 지방산 에스테르, 바람직하게는 메틸 에스테르이다.

존재한다면 소수성 유기상 내에서의 용매의 비율은 바람직한 실시양태에서는 1 내지 99 부피%(vol%)이다. 바람직한 실시양태에서 용매의 비율은 10 내지 90 vol%, 더욱 바람직하게는 20 내지 80 vol%, 가장 바람직하게는 25 내지 75 vol%이다.

방법의 가장 바람직한 실시양태에서 유기 화합물은, DE10200710060705에 개시된 바와 같이, 이. 콜라이의 재조합 균주에 의해 라우르산 메틸 에스테르의 말단 탄소 원자의 점진적 산화에 의해 수성상 내에서 생성되는 12-아미노라우르산 및/또는 12-아미노라우르산 메틸 에스테르이고, 소수성 상은 반응 기질로서의 라우르산 메틸 에스테르 내에 용해된 액체 양이온 교환제로서의 25 내지 75%의 올레산을 포함한다.

본 발명의 교시를 본원에서 기술된 바로 그 생물학적 거대분자의 아미노산 또는 핵산 서열을 사용하여 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 하나 또는 하나 초과의 아미노산 또는 핵산의 결실, 부가 또는 치환에 의해 수득될 수 있는 상기 거대분자의 변이체를 사용하여 수행할 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 하기에서 "상동체"라는 용어와 동등하고 호환가능하게 사용되는 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 "변이체"라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 상응하는 원래의 야생형(wild-type) 핵산 또는 아미노산 서열에 대해, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98, 99% 또는 그 초과의%의, 본원에서 동일성과 동등하게 사용되는 상동성을 갖는 또 다른 핵산 또는 아미노산 서열을 의미하고, 여기서 바람직하게는 촉매 활성 중심을 형성하는 아미노산 이외의 아미노산 또는 구조 또는 접힘에 필수적인 아미노산은 결실 또는 치환되거나 후자는 단지 보존적으로 치환되고, 예를 들어 아스파르테이트 대신에 글루타메이트 또는 발린 대신에 류신이다. 종래 기술에는 두 서열들의 상동성 정도를 계산하는데 사용될 수 있는 알고리즘이 기술되어 있다(예를 들어 문헌 [Arthur Lesk(2008), Introduction to bioinformatics, 3^rd edition]). 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 아미노산 또는 핵산 서열의 변이체는, 바람직하게는 전술된 서열 상동성 외에도, 야생형 분자 또는 원래의 분자와 본질적으로 동일한 효소 활성을 갖는다. 예를 들어, 프로테아제로서 효소적으로 활성인 폴리펩티드의 변이체는 상기 폴리펩티드 효소와 동일하거나 실질적으로 동일한 단백질 가수분해 활성, 즉 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하는 능력을 갖는다. 특정 실시양태에서, "실질적으로 동일한 효소 활성"이라는 용어는, 기저 활성을 훨씬 상회하고/하거나 야생형 폴리펩티드가 동일한 기질에 대해 갖는 K_M 및/또는 k_cat 값의 1000 배 미만, 바람직하게는 100 배 미만, 더욱 바람직하게는 10 배 미만 만큼 상이한 야생형 폴리펩티드의 기질에 대한 활성을 의미한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서 핵산 또는 아미노산 서열의 "변이체"라는 용어는 핵산 또는 아미노산 서열의 하나 이상의 활성 부분/또는 절편을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서 "활성 부분"이라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 서열 또는 아미노산 서열의 전체 길이보다 더 작은 길이를 위한 코드의 전체 길이보다 더 작은 길이를 갖는 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 의미하고, 여기서 야생형 아미노산 서열보다 더 작은 길이를 갖는 아미노산 서열 또는 코딩된 아미노산 서열은 야생형 폴리펩티드 또는 그의 변이체, 예를 들어 알콜 데히드로게나제, 모노옥시게나제 또는 트랜스아미나제와 실질적으로 동일한 효소 활성을 갖는다. 특정 실시양태에서 핵산의 "변이체"라는 용어는, 바람직하게는 엄격한 조건 하에서 그의 상보적인 가닥이 야생형 핵산에 결합하는 핵산을 포함한다. 혼성화 반응의 엄격도는 해당 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 이는 일반적으로는 프로브의 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 달라진다. 일반적으로, 보다 긴 프로브는 보다 높은 혼성화 온도를 필요로 하는 반면에, 보다 짧은 샘플의 경우에는 보다 낮은 온도면 충분하다. 혼성화가 일어날지 어떨지는 일반적으로 변성된 DNA가 그의 주변 환경에, 실제로는 융점 미만에서 존재하는 상보적인 가닥 상에 어닐링하는(annellate) 능력에 따라 달라진다. 혼성화 반응 및 상응하는 조건의 엄격도는 아우수벨(Ausubel)등(1995)에 의해 상세하게 기술되어 있다. 바람직한 실시양태에서 핵산의 "변이체"라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자 코드의 퇴보(degeneracy)라는 맥락에서 원래의 핵산과 동일한 아미노산 서열 또는 이러한 아미노산 서열의 변이체를 코딩하는 임의의 핵산 서열을 포함한다.

화학식 I의 유기 화합물의 제조에 사용될 수 있는 적합한 폴리펩티드, 특히 알칸 모노옥시게나제, AlkL, 트랜스아미나제, 알데히드 데히드로게나제 및 알라닌 데히드로게나제는 종래 기술에서, 예를 들어 DE10200710060705, EP11004029 또는 PCT/EP2011/053834에 기술되어 있다.

가장 바람직한 실시양태에서 알칸 모노옥시게나제는 AlkB 형 알칸 모노옥시게나제이다. AlkB는 히드록실라제 활성으로 유명한, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로부터의 AlkBGT 시스템으로부터의 옥시도리덕타제이다. 이는 두 가지의 기타 폴리펩티드인 AlkG 및 AlkT에 의존한다. AlkT는 NADH로부터 AlkG로 전자를 전달하는 FAD-의존성 루브레독신(rubredoxin)-리덕타제로서 특징지워진다. AlkG는 루브레독신, 철-함유 레독스(redox) 단백질이고, 이는 AlkB를 위한 직접 전자 공여체로서 작용한다. 바람직한 실시양태에서 "AlkB 형 알칸 모노옥시게나제"라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 막-결합된 알칸 모노옥시게나제를 의미한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서 "AlkB 형 알칸 모노옥시게나제"라는 동일한 용어는 슈도모나스 푸티다 Gpo1의 AlkB의 서열(데이터베이스 코드: CAB54050.1)에 대해 점점 바람직하게는 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서 상기 용어는 시토크롬-비의존성 모노옥시게나제를 의미한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서 "AlkB 형 알칸 모노옥시게나제"라는 용어는 전자 공여체로서 하나 이상의 루브레독신 또는 상동체를 사용하는 시토크롬-비의존성 모노옥시게나제를 의미한다. 특히 바람직한 실시양태에서 상기 용어는 전자 공여체로서 적어도 AlkG를 필요로 하는 슈도모나스 푸티다 Gpo1의 AlkB의 서열(CAB54052.1), 그러나 바람직하게는 AlkG와 리덕타제 AlkT의 조합(CAB54063.1)(여기서 AlkG 및/또는 AlkT는 각각의 폴리펩티드의 상동체일 수도 있음)에 대해 점점 바람직하게는 60, 70, 80, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 막-결합된 시토크롬-비의존성 알칸 모노옥시게나제를 의미한다. "서열"이라는 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드의 아미노산 서열 및/또는 이를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서 "AlkB 형 알칸 모노옥시게나제"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 시토크롬-비의존성 옥시도리덕타제, 즉 시토크롬을 보조인자로서 포함하지 않는 옥시도리덕타제이다.

본 발명은 본 발명의 추가의 특징, 실시양태, 측면 및 이점을 제공할 수 있는 하기 도면 및 비제한적인 실시예에 의해 보다 상세하게 설명된다.

도 1은 이. 콜라이 W3110 균주를 사용하여 연구되고 음성 대조군으로서의 인산칼륨 완충제(Kpi)와 비교된, LAME가 독성 작용을 갖지 않음을 확증하기 위한 제어된 실험을 보여준다.
도 2는 0 시간, 4 시간 및 24 시간 후에 액체 양이온 교환제의 부재 하에서 및 다양한 액체 양이온 교환제의 존재 하에서 이. 콜라이 W3110 균주가 형성할 수 있는, CFU 수의 형태의 상기 균주의 생존력을 보여준다.
도 3은 ALAME 0.2%, 암모니아로써 조절된 DEHPA("D2EHPNH3 2%") 또는 ALAME 0.2%의 존재 하에서의 DEHPA/LAME 혼합물(2%/98%)("D/L")의 존재 하에서 이. 콜라이 W3110 균주의 살아있는 세포 수의 변화를 통해 독성에 대한 액체 양이온 교환제사용의 효과를 보여준다.
도 4는 아미노라우르산 메틸 에스테르를 생성하는 이. 콜라이 균주의 OTR에 대한 다양한 액체 양이온 교환제의 효과를 보여준다. 실험은 실시예 4에서 기술된 바와 같이 수행되었다.
도 5는 적합하게 유전자 변형된 이. 콜라이 균주에 의해 생성된 아미노라우르산 메틸 에스테르의 수율에 대한 다양한 액체 양이온 교환제의 영향을 보여준다. 실험은 실시예 4에서 기술된 바와 같이 수행되었다.

실시예 1: 액체 양이온 교환제를 갖는 조성물에서 사용되는 용매 LAME 의 독성의 연구

본 시험은 LAME로 하여금 본 발명에 따른 방법을 위한 적합한 유기 용매이도록 하는, 생물공학적으로 관련된 미생물에 대한 LAME의 비교적 낮은 독성을 보여주었다.

CFU의 결정을 수행하기 전에, LB 평판(10 g/ℓ 카제인으로부터의 펩톤, 5 g/ℓ 효모 추출물, 10 g/ℓ NaCl)에 이. 콜라이 BW3110을 획선도말하고 24 시간 동안 배양하였다. 그 다음날 저녁에, 이러한 미리 획선도말된 평판의 예비배양물(preculture)을 접종하였다. 이러한 예비배양물은 50 ㎖의 부피의 LB 배지를 가졌고 이를 약 16 시간 동안 밤새 배양하였다. 그 다음날에 0.2의 OD₆₀₀를 갖는 예비배양물을 3% 글루코스(w/v)와 함께 M9 배지 200 ㎖(Na₂HPO₄ 6.79 g/ℓ; KH₂PO₄ 3.0 g/ℓ; NaCl 0.5 g/ℓ; NH₄Cl 1 g/ℓ; 1 ㎖/ℓ 미량 원소 용액, pH 7.4. 미량 원소 용액: HCl 37%(=455.8 g/ℓ) 36.50 g/ℓ; MnCl₂*7H₂O 1.91 g/ℓ; ZnSO₄*7H₂O 1.87 g/ℓ; Na-EDTA*2H₂O(티트리플렉스(Titriplex III) 0.84 g/ℓ; H₃PO₃ 0.30 g/ℓ; Na₂MoO₄*2H₂O 0.25 g/ℓ; CaCl₂*2H₂O 4.70 g/ℓ; FeSO₄*7H₂O 17.80 g/ℓ; CuCl₂*2H₂O 0.15 g/ℓ)에 접종하고, 약 20 시간 동안 배양하였다. 주요 배양물을 배양한 후에, 세포를 수확하고, 5258 g 및 4℃에서 10 분 동안 원심분리하고, 30의 OD₆₀₀를 사용하여, pH 7.4에서 50 mM Kp_i 완충제 10 ㎖(또는 ALAME를 사용하여 CFU 결정을 수행하는 경우, 25 mM HEPES 완충제 pH 7.4)에 재현탁시켰다. 사용된 완충제 용액은 둘 다 5% 글루코스(w/v)를 함유하였다. 이어서 박테리아 현탁액을 진탕 플라스크에 옮기고 각각의 물질의 용액을 첨가하였다. 플라스크를 회전시킴으로써 혼합한 후에, 현탁액 100 ㎕를 피펫을 사용하여 뽑아내고 준비된 멸균 식염수 900 ㎕에 넣었다. 이는 시점 t₀에서의 샘플 채취에 상응하였다. 이어서 혼합물을 250 rpm 및 30℃에서 배양하였다. 22 시간에 걸쳐 CFU를 결정하였다. 우선 샘플을 시점 t₀, t₃, t₆ 및 t₂₂에서 채취하였다. 몇몇 혼합물의 경우에 또 다른 샘플 채취 시점 t_1.5를 추가하였고, 또한 편차를 최소화하기 위해서 또 다른 추가적인 일련의 희석물들을 도말하였다.

OD₆₀₀는 60이었다. 세포를 Kp_i 완충제 10 ㎖에 재현탁시키고, 이어서 플라스크에서 LAME 98%(w/w) 5 ㎖와 혼합하였다. 검정 시마다 하나의 단계의 희석물을 도말하였다. CFU/㎖ 수는 6 시간에 걸쳐 일정하게 유지되었다. 22 시간 후에, 정확히 30.3%의 살아있는 세포 수의% 감소율이 기록되었다.

실시예 2: 생물공학적으로 관련된 미생물에 대한 다양한 액체 양이온 교환제의 독성에 대한 비교 시험

본 실시예는 DEHPA 및 분지형 및 선형 포화 지방산과 같은 기타 액체 양이온 교환제에 비해 선형 지방산의 보다 낮은 독성을 보여준다.

우선 100 ㎖ 배플 플라스크에서 LB 배지 20 ㎖를 포함하는 예비배양물을 상응하는 균주의 저온배양물(cryoculture)과 함께 접종하였다. 배양물을 밤새 37℃에서 200 rpm에서 진탕하면서 배양하고 이를 사용하여 그 다음 날에 동일한 주요 배양물을 0.2의 OD로 접종하였다. 이어서 주요 배양물(각각 LB 배지 30 ㎖)을 동일한 조건 하에서 추가로 배양하였다. 0.4 내지 0.5의 OD에서, 주요 배양물을 각각의 경우에 동일한 부피(30 ㎖)의 용매로써 덮고 이어서 추가로 배양하였다.

CFU(콜로니 형성 단위) 수를 결정하기 위해서, 그 다음 시험에서 샘플 0.1 ㎖를 채취하고 멸균 0.9% NaCl 용액에 희석하였다. 적합한 단계의 희석물을 LB-아가 평판 상에 도말하였다. 34℃에서 밤새 배양한 후에, 형성된 콜로니를 계수하고 CFU를 결정하였다.

시험 1: 액체 양이온 교환제로서의 DE2HPA와 포화 지방산의 독성의 비교

액체 양이온 교환제로서, 각각의 경우에 LAME에 용해된 50% DEHPA 또는 라우르산(15%) 및 동몰의 또는 25 몰%의 담지율의 ALAME를 이. 콜라이 BL21(DE3) 균주와 접촉시키고, CFU로서 표현되는 균주의 콜로니 형성 능력에 대한 이러한 두 화합물의 영향을 연구하였다. 예비 시험에서 라우르산 메틸 에스테르는, 불충분한 담지율로 인해 액체 양이온 교환제로서 작용할 수 없기 때문에, 사용된 균주에 의해 잘 허용된다는 것이 밝혀졌다.

시험 번호	사용된 이. 콜라이 균주	사용된 액체 양이온 교환제	t = 0 시간에 비해 22 또는 24 시간 후 CFU 수
1a	이. 콜라이 BL21(DE3)	없음	244%
1b	이. 콜라이 BL21(DE3)	DEHPA	0%
1c	이. 콜라이 BL21(DE3)	라우르산	1.2%

액체 양이온 교환제는 둘 다 CFU 수를 상당히 감소시키지만, 라우르산이 사용된 경우에는, DEHPA와는 대조적으로, 몇몇 생존가능한 세포가 여전히 존재하고, 따라서 포화 지방산은 액체 양이온 교환제로서 바람직하다는 것을 알 수 있다.

시험 2: 액체 양이온 교환제로서의 분지형 포화 지방산과 다양한 양의 올레산의 독성의 비교

이 경우에는 두 가지의 상이한 농도의 올레산을 사용하였고 상응하는 양의 LAME(라우르산 메틸 에스테르)를 첨가함으로써 부피를 조절하였다.

시험 번호	사용된 이. 콜라이 균주	사용된 액체 양이온 교환제	t = 0 시간에 비해 22 또는 24 시간 후 CFU 수
2a	이. 콜라이 BL21(DE3)	이소노난산	0
2b	이. 콜라이 BL21(DE3)	2-에틸헥산산	0
2c	이. 콜라이 BL21(DE3)	LAME/25% 올레산	11%
2d	이. 콜라이 BL21(DE3)	LAME/75% 올레산	18%
2e	이. 콜라이 W3110	이소노난산	0
2f	이. 콜라이 W3110	2-에틸헥산산	0
2g	이. 콜라이 W3110	LAME/25% 올레산	29%
2h	이. 콜라이 W3110	LAME/75% 올레산	17%

생존가능한 세포의 수는, 불포화 지방산 올레산과 함께 LAME를 사용할 때가 분지형 포화 지방산을 사용할 때보다 항상 훨씬 더 높다는 것을 알 수 있다.

시험 3: 액체 양이온 교환제로서의 선형 포화 지방산과 불포화 지방산의 독성의 비교

이 경우에는 액체 양이온 교환제로서 사용될 때의 다양한 양의 불포화 지방산을 그의 독성에 대해 불포화 지방산과 비교하였다. 불포화 지방산 라우르산의 보다 낮은 용해도 때문에, 이를 보다 적은 양으로 사용하였다. 특정량의 다양한 양이온 교환제를 LAME과 비교하였다. 시작 시에, 4 시간 30 분 후에 및 24 시간 후에 CFU 수를 결정하였다.

도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 액체 양이온 교환제로서 포화 지방산을 첨가하면 심지어는 불포화 지방산보다 더 낮은 농도에서도 CFU가 감소하는 반면에, 불포화 지방산의 경우에는 CFU가 증가한 것으로 기록된다.

전반적으로, 연구된 다양한 액체 양이온 교환제에 의해 독성이 하기 순서로 감소한다: DEHPA > 포화 지방산 > 불포화 지방산

실시예 3: 액체 양이온 교환제와의 접촉에 의한, 양으로 하전된 유기 화합물의 독성의 감소

본 시험은 액체 양이온 교환제의 존재를 통해, 발효액인 수성상에서의 양으로 하전된 유기 화합물의 독성 작용은, 이러한 화합물이 유기상 내로 추출되기 때문에 감소될 수 있다는 것을 보여준다.

기본 실험 절차는 실시예 1의 것에 상응한다.

수성 시스템 내에 용해된 ALAME 0.2%(w/v)는 살박테리아 작용을 하기 때문에, 본 시험을 진탕 플라스크에서 D2EHPNH3/LAME 2/98%(w/w)를 사용하여 반복하였고, 여기서 D2EHPNH3는 암모늄이 정량적으로 담지된 D2EHPA를 의미한다. 액체 이온 교환제의 사용에 의해, ALAME의 유기상으로의 전달이 개선되므로, 세포가 존재하는 수성상에서의 그의 농도는 감소한다. D2EHPA에 의해 초래된 독성 작용을 감소시키기 위해서, 2%(w/w)의 낮은 농도의 D2EHPNH3를 사용하였다.

우선 박테리아를 5 ㎖(완충제 부피의 절반에 상응함)에 재현탁시켰다. 임의로 0.4%(w/v) ALAME 및 이어서 임의로 5 ㎖ D2EHPNH3/LAME 2/98%(w/w)를 첨가하면서, 추가의 5 ㎖의 완충제를 1 분 동안 3000 rpm에서 볼텍싱 하였다. 이러한 용액을 진탕 플라스크 내의 박테리아 현탁액에 첨가하고 혼합하였다. 이어서 제1 샘플 채취를 수행하였다.

용액은 시험의 시작 시에 발포성이었지만, 이는 두 시험에서 제2 샘플 채취에서 사라졌다. "D/L"이라는 약어는 D2EHPNH3(암모니아-담지된 D2EHPA)/LAME 2/98%(w/w)에 대해 사용되었다. t₀ 시간의 샘플 채취와 t₁ _.5 시간의 샘플 채취 사이에서, CFU/㎖ 수는 34.3% 만큼 증가하였다. 샘플 채취(t₁ _.5)로부터 최종 샘플 채취(t₂₂)까지, CFU/㎖ 수는 54.9% 만큼 감소하였다. ALAME 0.2%(w/v)의 첨가 없이 D2EHPNH3/LAME 2/98%(w/w)를 사용하는 검정에 비해, 22 시간 후의 생존가능한 세포 수는 HEPES 완충제에서의 대조용 검정의 평균값보다 4.5 배 더 크고 3.4%에서 훨씬 더 작지는 않았다(도 4를 참고). 유기상의 첨가 없이, 진탕 플라스크에서의 ALAME 0.2%(w/v)를 사용한 검정에 비해, CFU/㎖ 수는 2800 배 더 높았다.

액체 양이온 교환제의 존재로 인해, 이 경우 남은 CFU 수로부터 밝혀지는 양으로 하전된 화합물의 독성이 더 낮아진다는 것을 알 수 있다.

실시예 4: ω- 아미노라우르산 ( ALA ) 및 메틸 에스테르( ALAME )를 생성하는 미생물에 대한 다양한 액체 양이온 교환제의 독성의 비교 시험

라우르산 메틸 에스테르의 아미노라우르산 메틸 에스테르로의 생물변환을 다양한 이온 교환제를 사용하여 DasGip의 8-배 평행 발효 시스템에서 시험하였다.

1 ℓ 반응기를 발효에 사용하였다. pH 프로브를 pH 4.0 및 pH 7.0의 표준 용액을 사용하는 2-점 보정을 사용하여 보정하였다. 반응기에 물 300 ㎖를 채우고 20 분 동안 121℃에서 오토클레이빙하여 멸균을 보장하였다. 이어서 pO2 프로브를 밤새(6 시간 이상 동안) 분극화시켰다. 그 다음날 아침에, 클린벤치(clean bench)에서 물을 제거하고 50 ㎎/ℓ 카나마이신 및 34 ㎎/ℓ 클로람페니콜을 갖는 높은 세포 농도의 배지로 대체하였다. 이어서 pO2 프로브를 단일점 보정(교반기: 600 rpm/배기: 10 sL/h 공기)을 사용하여 보정하고, 공급물, 수정제 및 유도제 부분을 정치세척(Clean-in-Place)으로 세정하였다. 이를 위해, 호스를 70% 에탄올, 이어서 1 M NaOH, 및 이어서 멸균 탈이온수로써 헹구고, 마지막으로 각각의 배지를 채웠다.

ALA 및 ALAME를 생성하는 이. 콜라이 균주 BL21(DE3) T1r pBT10 pACYC: Duet[TAcv]를 우선 밤새 37℃에서 200 rpm에서 약 18 시간 동안 50 ㎎/ℓ 카나마이신 및 34 ㎎/ℓ 클로람페니콜을 갖는 LB 배지(100 ㎖ 배플 플라스크 내 25 ㎖)에서 저온배양물로부터 성장시켰다. 이어서 각각의 경우에 2 ㎖를, 50 ㎎/ℓ 카나마이신 및 34 ㎎/ℓ 클로람페니콜을 갖는 높은 세포 농도의 배지(글루코스 15 g/ℓ(1% MgSO₄*7H₂O 및 2.2% NH₄Cl을 갖는 30 ㎖/ℓ의 별도로 오토클레이빙된 500 g/ℓ 원액), (NH₄)₂SO₄ 1.76 g/ℓ, K₂HPO₄ 19.08 g/ℓ, KH₂PO₄ 12.5 g/ℓ, 효모 추출물 6.66 g/ℓ, 시트르산삼나트륨 이수화물 11.2 g, 17 ㎖/ℓ의 별도로 오토클레이빙된 1% 원액의 암모늄 아이언 시트레이트 용액, 5 ㎖/ℓ의 별도로 오토클레이빙된 원액의 미량 원소 용액(HCl(37%) 36.50 g/ℓ, MnCl₂*4H₂O 1.91 g/ℓ, ZnSO₄*7H₂O 1.87 g/ℓ, 에틸렌디아민테트라아세트산 이수화물 0.84 g/ℓ, H₃BO₃ 0.30 g/ℓ, Na₂MoO₄*2H₂O 0.25 g/ℓ, CaCl₂*2H₂O 4.70 g/ℓ, FeSO₄*7H₂O 17.80 g/ℓ, CuCl₂*2H₂O 0.15 g/ℓ))에 접종하고(100 ㎖ 배플 플라스크 내에 각각 25 ㎖씩 3번), 37℃/200 rpm에서 추가로 6 시간 동안 배양하였다.

3개의 배양물을 진탕 클라스크 내에서 합치고 광학밀도는 7.2로 결정되었다. 0.1의 광학밀도에서 반응기에 접종하기 위해, 각각의 경우에 4.2 ㎖를 5 ㎖ 주사기에 넣고 캐뉼라를 사용하여 격벽을 통해 반응기에 접종하였다.

하기 표준 프로그램을 사용하였다:

수행되는 실험은, 세포가 특정한 광학밀도에 도달되는 성장상, 및 ALAME의 제조를 위한 생물공학적 공정에 필요한 유전자의 발현이 유도되는 후속 생물변환상인 두 개의 상으로 구분될 수 있다. pH 값을 한편으로는 암모니아(12.5%)를 사용하여 pH 6.8로 조절하였다. 성장 및 생물변환 동안에, 배양물 내에 용해된 산소(DO)를 교반기 회전 속도 및 배기 속도를 사용하여 30%로 제어하였다. 발효를 공급 배치로서 수행하고, 여기서 공급의 시작인 5 g/ℓh 글루코스 공급(500 g/ℓ글루코스, 1% MgSO₄*7H₂O 및 2.2% NH₄Cl)은 DO 피크에 의해 촉발되었다. 공급 시작 시에, 온도를 또한 37℃로부터 30℃로 저하시켰다. IPTG(1 mM)를 자동식으로 첨가함으로써 공급을 시작한 지 2 시간 후에 트랜스아미나제의 발현을 유도하였다. 공급을 시작한 지 10 시간 후에 DCPK(0.025% v/v)를 수동식으로 첨가함으로써 alk-유전자의 유도를 수행하였다. 생물변환을 시작하기 전에 배양액의 광학밀도를 결정하였다.

공급을 시작한 지 14 시간 후에 생물변환상을 시작하였다. 이를 위해, 라우르산 메틸 에스테르와 각각의 이온 교환제(10% w/w)의 혼합물 150 ㎖를 배치로서 발효액에 첨가하였다. 디(2-에틸헥실-)인산(DEHPA), 라우르산, 올레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 스테아르산, 및 공엉겅퀴유의 비누화로부터 유래된 자유 지방산의 혼합물을 이온 교환제로서 사용하였다. 트랜스아미나제를 위해 이용가능한 아미노기 공여체를 만들기 위해서, 알라닌 용액 10.7 ㎖(125 g/ℓ)를 유기상의 첨가와 동시적으로 발효액에 첨가하였다. 샘플 채취를 위해, 발효액 2 ㎖를 용기로부터 채취하고, 그 일부를 아세톤-HCl 혼합물(c(HCl) = 0.1 mol/ℓ)에서 1/20으로 희석하고, 추출하였다. 샘플을 생물변환을 시작한 지 1 시간 15 분, 3 시간, 5 시간, 20 시간, 22 시간 및 25 시간 후에 모든 8개의 반응기로부터 채취하였다. 산소 전달 속도(OTR) 및 탄소 전달 속도(CTR)를 발효 동안에 DasGip 시스템 상에서 배기 기체 분석을 통해 결정하였다. 생물변환을 시작한 지 22 시간 후에 발효를 종결시켰다.

발효 샘플에서 ALA, ALAME, DDS, DDSME, LS, LAME, HLS, HLSME, OLS 및 OLSME의 정량화를, 내부 표준 아미노운데칸산(AUD)을 사용하여, 모든 분석물에 대해 외부 보정을 한 LC-ESI/MS²를 사용하여 수행하였다.

하기 장치를 사용하였다:

- 자동식 샘플 채취기(G1367E), 바이너리 펌프(G1312B) 및 칼럼 퍼니스(column furnace)(G1316A)를 갖는 HPLC 시스템 1260(아질런트(Agilent); 뵈블링겐)

- ESI 공급원을 갖는 트리펠쿠아드(TripelQuad) 6410 질량분석기(아질런트; 뵈블링겐)

- HPLC 칼럼: 키네텍스(Kinetex) C18, 100 × 2.1 ㎜, 입자크기: 2.6 ㎛, 기공 크기 100 Å(페노메넥스(Phenomenex); 아샤펜부르크)

- 프리칼럼(Precolumn): 크루드카처(KrudKatcher) 울트라 HPLC 인-라인 필터; 0.5 ㎛ 필터 깊이 및 0.004 ㎜ 내경(페노메넥스; 아샤펜부르크)

용매(아세톤/0.1 N HCl 혼합물 = 1:1) 1900 ㎕ 및 샘플 100 ㎕을 2 ㎖ 반응 용기에 피펫을 사용하여 넣음으로써 샘플을 제조하였다. 혼합물을 약 10 초 동안 볼텍싱 하고 이어서 약 13000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 등명한 상층액을 피펫을 사용하여 회수하고 희석제(80%(v/v) ACN, 20% 이중-증류된 물(v/v), + 0.1% 포름산)로써 적당하게 희석한 후에 분석하였다. 샘플 900 ㎕ 당 ISTD 100 ㎕를 피펫을 사용하여 첨가하였다(90 ㎕의 샘플 부피에서 10 ㎕).

전술된 칼럼 및/또는 프리칼럼을 사용하여 HPLC 분리를 수행하였다. 주입 부피는 0.7 ㎕였고, 칼럼 온도는 50℃이고, 유량은 0.6 ㎖/min이었다. 이동상은 용출제 A(0.1%(v/v) 수성 포름산) 및 용출제 B(아세토니트릴과 0.1%(v/v) 포름산)으로 이루어졌다. 하기 구배 프로필을 사용하였다:

ESI-MS² 분석을 양성 모드에서 ESI 공급원의 하기 변수를 사용하여 수행하였다:

- 기체 온도 280℃

- 기체 유동 11 ℓ/min

- 분무기 압력 50 psi

- 모세관 전압 4000 V

개별적인 화합물의 검출 및 정량화를 하기 변수를 사용하여, 각각의 경우에 정성화제로서의 하나의 생성물 이온 및 정량화제로서의 하나의 생성물 이온을 사용하여 수행하였다.

결과:

DEHPA를 종래 기술에서 기술된 바와 같이 양이온 교환제로서 사용하는 경우에, 화합물을 배양물에 첨가한 직후에는 OTR의 함몰이 있다. 곡선은 단시간 내에 0으로 강하하고, 이는 대사적으로 활성인 세포가 배양물 내에 더 이상 존재하지 않음을 나타낸다. 따라서 DEHPA는 세포에 매우 독성이다.

라우르산을 DEHPA 대신에 액체 양이온 교환제로서 사용하는 경우에, 분명히 OTR의 함몰이 있지만 그것은 덜 현저하고, 그 후 22 시간 동안에 세포는 회복하여 증가하는 대사적 활성을 나타낸다. 따라서 라우르산은 DEHPA보다 훨씬 덜 독성이다.

보다 긴 탄소 쇄를 갖는 포화 지방산을 사용하는 경우에는 훨씬 더 좋은 결과를 관찰할 수 있다. 팔미트산 및 스테아르산을 사용하는 경우에, OTR 곡선의 감소는 라우르산 또는 심지어는 DEHPA를 사용하는 경우에서보다 훨씬 더 작다. 이로부터 이러한 지방산은 훨씬 덜 독성이라고 결론지을 수 있다.

팔미톨레산, 비누화 공엉겅퀴유(주로 리놀레산을 함유함) 및 올레산과 같은 불포화 지방산을 사용하면, 놀랍게도 훨씬 더 좋은 결과가 초래된다. 이러한 지방산은, 놀랍게도, 포화 지방산보다 훨씬 더 낮은 독성을 나타낸다.

참고문헌:

Claims

a) 유기 화합물을 함유하는 수용액, 및 소수성인 액체 양이온 교환제를 포함하는 소수성 유기 용액을 제공하는 단계,
b) 수용액과 유기 용액을 접촉시키는 단계, 및
c) 유기 용액을 수용액으로부터 분리하는 단계
를 포함하며,
여기서 유기 화합물은 하기 화학식 I의 화합물이고, 액체 양이온 교환제는 지방산인, 유기 화합물을 수용액으로부터 제거하는 방법:
<화학식 I>
NH₃ ⁺-A-COOR¹
상기 식에서, R¹은 수소, 메틸, 에틸 또는 음전하이고, A는 3개 이상, 바람직하게는 8개 이상의 탄소 원자를 갖는 치환되지 않은 선형 알킬렌기이다.
제1항에 있어서, 단계 b)에서의 온도가 28 내지 70℃, 바람직하게는 30 내지 37℃인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 b)에서의 pH가 6 내지 8, 바람직하게는 6.2 내지 7.2인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 양이온 교환제 대 유기 화합물의 몰비가 1 이상인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용액 대 수용액의 부피비가 1:10 내지 10:1인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 양이온 교환제가 12개 초과, 바람직하게는 14 내지 22개, 더욱 바람직하게는 16 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 지방산인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 양이온 교환제가 불포화 지방산, 바람직하게는 올레산 또는 에루스산인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 수용액이 촉매 활성을 갖는 생물학적 작용제를 추가로 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 생물학적 작용제가 세포, 바람직하게는 박테리아 세포이고, 세포가 더욱 바람직하게는 재조합 알칸 모노옥시게나제, 재조합 트랜스아미나제, 및 바람직하게는 또한 알콜 데히드로게나제, 알라닌 데히드로게나제 및 AlkL 유전자 생성물 또는 그의 변이체를 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 효소를 갖는 것인 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 바람직하게는 유기 화합물이 세포에 대해 독성인 화합물이라는 점에서, 유기 화합물의 존재가 촉매 활성에 악영향을 미치는 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 용액이 또한 하나 이상의 유기 용매, 바람직하게는 지방산 및/또는 지방산 에스테르를 함유하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 유기 용액이 액체 양이온 교환제로서 20 내지 80 부피%, 바람직하게는 25 내지 75 부피%의 올레산, 및 용매로서 라우르산 메틸 에스테르를 포함하고, 유기 화합물이 12-아미노라우르산 메틸 에스테르이고, 재조합 알칸 모노옥시게나제, 재조합 트랜스아미나제, 및 바람직하게는 또한 알콜 데히드로게나제, 알라닌 데히드로게나제 및 AlkL 유전자 생성물 또는 그의 변이체를 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 효소를 갖는 박테리아 세포가 수용액 내에 존재하는 것인 방법.
수용액 및 소수성 유기 용액을 포함하며,
여기서 소수성 유기 용액은 액체 양이온 교환제로서 지방산, 바람직하게는 12개 초과의 탄소 원자를 갖는 지방산, 더욱 바람직하게는 불포화 지방산을 포함하고, 수용액은 하기 화학식 I의 화합물을 포함하는 것인, 반응 혼합물:
<화학식 I>
NH₃ ⁺-A-COOR¹
상기 식에서, R¹은 수소, 메틸, 에틸 또는 음전하이고, A는 3개 이상, 바람직하게는 8개 이상의 탄소 원자를 갖는 치환되지 않은 선형 알킬렌기이다.
제13항에 있어서, 수용액이 재조합 알칸 모노옥시게나제, 재조합 트랜스아미나제, 및 바람직하게는 또한 알콜 데히드로게나제, 알라닌 데히드로게나제 및 AlkL 유전자 생성물 또는 그의 변이체를 포함하는 군으로부터의 하나 이상의 효소를 갖는 세포를 추가로 포함하는 것인 반응 혼합물.