TW201402810A - 丙胺酸之需氧性製造方法或因消耗丙胺酸而產生之化合物的需氧性製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明關於解決本發明所根據之問題,在第一方面中,藉由丙胺酸之製造方法或因消耗丙胺酸而產生之化合物的製造方法解決,該方法包括(a)提供表現重組丙胺酸去氫酶或其變體之細胞,(b)在無機氮源存在下於水相之需氧性條件下培養該細胞,及(c)令該細胞與有機相接觸,其中該細胞為原核細胞或低等真核細胞。
Description
本發明關於一種丙胺酸之製造方法或因消耗丙胺酸而產生之化合物的製造方法,該方法包括(a)提供表現重組丙胺酸去氫酶或其變體之細胞,(b)在無機氮源存在下於水相之需氧性條件下培養該細胞,及(c)令該細胞與有機相接觸,其中該細胞為原核細胞或低等真核細胞。
除了作為蛋白質原胺基酸(即,為大量蛋白質之基本組分的胺基酸)之外,丙胺酸係用作生物技術方法及化學合成之廣泛使用的胺施體。在工業生物技術合成情況下,可將所需之丙胺酸以化學合成之丙胺酸形式或以酵母萃取物形式添加至生物合成活性細胞。然而,有鑒於成本方面及待從培養介質純化之產物的可能純度,更有利的是生物合成活性細胞本身產生充足量之所需丙胺酸。因此,對於可用於生物技術且連續產生儘可能大量之丙胺酸,因而可
用於在細胞內或外部之後續合成步驟的微生物極為關注。
先前技術教示當表現丙胺酸去氫酶之細胞維持在缺氧條件下時形成特別大量之丙胺酸("Production of L-alanine by metabolically engineered Escherichia coil" Appl Microbiol Biotechnol(2007),77:355-366)。然而,此等條件造成細胞生長顯著減少,代謝性能降低及昂貴基材(諸如葡萄糖)的代謝而形成不想要的主要代謝之副產物而損害整體方法之功效及產物產率。因此,若欲發展工業規模之經濟生物技術方法,則基本上在需氧性條件下進行該等方法。
在此背景之下,需要適於提高可用於在需氧性條件下生物技術相關細胞中之合成的丙胺酸之量的方法。
此外,需要在減少或可能的話僅隨意地或僅暫時需要添加丙胺酸之情況下生物技術製造ω-胺基羧酸類之方法,其中製造該ω-胺基羧酸所需之氮係以無機氮鹽形式提供;及/或需要以不添加丙胺酸之反應模式改善ω-胺基羧酸產率的方法。
該等及其他目的係藉由本申請案之主題,特別是藉由從獨立主張權項形成具體實例的附錄依附主張權項獲致。
在第一方面,為本發明基礎之問題係藉由丙胺酸之製造方法或因消耗丙胺酸而產生之化合物的製造方法而解決,該方法包括
a)提供表現重組丙胺酸去氫酶或其變體之細胞,b)在無機氮源存在下於水相之需氧性條件下培養該細胞,及c)令該細胞與有機相接觸,其中該細胞為原核細胞或低等真核細胞。
圖1顯示於存在及不存在如實施例1中所述的有機相之情況下,比較藉由四種大腸桿菌菌株之丙胺酸製造,該等大腸桿菌的相異之處在於兩種菌株表現。
在該第一方面的第一具體實例中,該問題係藉由其中該細胞包括含有編碼alkL多肽,較佳為戀臭假單孢菌AlkL(資料庫碼AJ245436)或其變體之序列的核酸,及/或alkL多肽或其變體的方法予以解決。
在亦為該第一具體實例之具體實例的第二具體實例中,該問題係藉由其中該alkL多肽或其變體為異源且較佳係過度表現的方法予以解決。
在亦為該第一至第二具體實例之具體實例的第三具體實例中,該問題係藉由其中步驟c)係藉由在有機相存在之下進行步驟b)來進行的方法予以解決。
在亦為該第一至第三具體實例之具體實例的第四具體實例中,該問題係藉由其中該有機相包含疏水性脂肪酸
酯,較佳為月桂酸甲酯的方法予以解決。
在亦為該第四具體實例之具體實例的第五具體實例中,該問題係藉由其中該有機相除了疏水性脂肪酸酯之外還包含疏水性脂肪酸的方法予以解決。
在亦為該第一至第五具體實例之具體實例的第六具體實例中,該問題係藉由其中該有機相包含至少一種選自未經取代、經取代、分支及未分支之烷類、環烷類、芳基類、雜芳基類、二烷基醚類、脂肪醇類、三酸甘油酯類及鹵烴所組成之群組之疏水性溶劑的方法予以解決。
在亦為該第六具體實例之具體實例的第七具體實例中,該問題係藉由其中該疏水性脂肪酸為未經取代之脂肪酸,較佳為油酸的方法予以解決。
在亦為該第一至第七具體實例之具體實例的第八具體實例中,該問題係藉由其中該細胞包括將丙胺酸辨識為基質之異源轉胺酶且該轉胺酶較佳係選自包含來自紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)ATCC 12472之ω-轉胺酶(資料庫碼NP_901695)及其變體之群組的方法予以解決。
在亦為該第一至第八具體實例之具體實例的第九具體實例中,該問題係藉由其中除了該異源轉胺酶以外,該細胞還包括一或多種單氧化酶,該一或多種單氧化酶單獨或依序催化脂肪酸或脂肪酸酯之氧化,以產生ω-側氧基-脂肪酸或ω-側氧基-脂肪酸酯的方法予以解決。
在亦為該第一至第九具體實例之具體實例的第十具體實例中,該問題係藉由其中該一或多種單氧化酶為異源,
且較佳係選自包含來自AlkB族之單氧化酶及來自CYP153族之細胞色素P450單氧化酶及其變體的方法予以解決。
在亦為該第一至第十具體實例之具體實例的第十一具體實例中,該問題係藉由其中該細胞為細菌細胞,尤其是大腸桿菌的方法予以解決。
在亦為該第一至第十一具體實例之具體實例的第十二具體實例中,該問題係藉由其中步驟c)費時至少60分鐘的方法予以解決。
在亦為該第一至第十二具體實例之具體實例的第十三具體實例中,該問題係藉由其中該水相包含低於10mM,較佳低於5mM,更佳甚至低於1mM之丙胺酸的方法予以解決。
在亦為該第一至第十三具體實例之具體實例的第十四具體實例中,該問題係藉由其中該有機相的量以水相及有機相之總體積計為至少5體積百分比,較佳超過20體積百分比的方法予以解決。
在第二方面,本發明所根據之問題係藉由使用表現異源丙胺酸去氫酶或其變體之細胞以在需氧性條件下於有機相存在下製造丙胺酸或製造因消耗丙胺酸而產生之化合物予以解決,其中該細胞為原核細胞或低等真核細胞,且其中該有機相較佳包含疏水性脂肪酸酯及疏水性脂肪酸,甚至更佳包含月桂酸甲酯及油酸。
在第三方面,本發明所根據之問題係藉由有機相用於
提高丙胺酸或因消耗丙胺酸而產生之化合物的產率之用途予以解決,該用途包括令產生丙胺酸或因消耗丙胺酸而產生之化合物的原核細胞或低等真核細胞與該有機相接觸,其中該有機相較佳包含疏水性脂肪酸酯及疏水性脂肪酸,甚至更佳包含月桂酸甲酯及油酸。
在該第一、第二、第三方面的另一具體實例中,該問題係藉由其中該細胞以至少0.5,更佳為至少1,又更佳為至少5,最佳為至少10之光學密度存在水溶液中的方法或用途予以解決。
在該第一、第二、第三方面的另一具體實例中,該問題係藉由其中該丙胺酸去氫酶為來自枯草桿菌(資料庫碼NP_391071)或其變體之丙胺酸去氫酶的方法或用途予以解決。
本發明人已發現,當令表現原核細胞之丙胺酸去氫酶的主體細胞與有機溶液接觸時,該細胞在需氧性條件下且在無機氮源存在下製造之丙胺酸意外地顯著提高。
本發明教示可用於改善所有生物技術方法,其包括藉由消耗丙胺酸製造產物(諸如細微化學物質),及當使用代謝活性細胞時,該代謝活性細胞於水性介質中培養以及產物之分離純化。在較佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭「細胞」應理解為意指具有代謝活性之活細胞,較佳為全細胞觸媒,其表現或甚至更佳為過度表現與所關注之產物的生物技術製造相關之活性形式的酶。該細胞可為原核生物(包括古菌)或真核生物,在原核生物情況下,較佳
係來自由假單孢菌屬、棒狀桿菌屬及大腸桿菌屬所組成之群組。在更佳具體實例中,該細胞為細菌細胞,更佳為革蘭氏陰性細菌細胞,最佳為大腸桿菌。在更佳具體實例中,該細胞為真核細胞,更佳為低等真核細胞或黴菌細胞,又更佳為酵母細胞,最佳為酵母菌屬或念珠菌屬、畢赤酵母菌屬,特別是熱帶念珠菌。特佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭「低等真核生物」意指與以含有包含不同細胞之組織的多細胞生物形式度過大部分壽命之高等真核生物相反,在其存在之所有階段中均為為單細胞的真核生物。在特殊具體實例中,本申請案中所使用之用辭「細胞」與用辭「微生物」同義且可互換。此外,該細胞係呈經單離細胞或不同細胞之混合物形式。
使用本發明教示的條件係存在水相,即水性培養或反應介質,其適於至少暫時維持或培養細胞。熟知本技術之人士熟悉大量適於維持或培養細胞(特別是生物技術上重要的細胞)的水性培養介質。該等水性培養介質不只包括完全介質,諸如LB介質;亦包括基礎培養介質,諸如M9介質及選擇性介質,例如具有高鹽濃度因此只能生長嗜鹽性或至少耐鹽生物之介質。在較佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭「水相」係理解為意指以水為基底之反應或培養介質,其基本上與疏水性溶劑不溶混,且就所有相關因素而言,特別是就pH、鹽含量及溫度方面而言,使得至少暫時維持或促進存在其中之細胞(較佳為微生物)活力,及該水性培養介質及該疏水性有機相二者在
生物技術可用生物的慣用培養溫度(較佳為25℃)下以液體形式存在。各種在生物技術上重要之細胞的溫度要求可見微生物學及分子生物學教科書,例如Fuchs/Schlegl,2008。在較佳具體實例中,於開始接觸時,水性培養介質之pH介於4至9,更佳係介於4.5至8.5,最佳係介於6.5與7.5。在更佳具體實例中,該溫度介於5與42℃之間,較佳介於15與40℃之間,最佳介於20與37℃之間。
本發明之教示提出該細胞表現重組丙胺酸去氫酶。在較佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭「丙胺酸去氫酶」應理解為意指催化丙酮酸鹽、氨及NADH或其鹽轉化成L-丙胺酸、水及NAD+的酶。該丙胺酸去氫酶較佳為細胞內丙胺酸去氫酶,更佳為細菌全細胞觸媒之重組細胞內丙胺酸去氫酶。在尤佳具體實例中,採用枯草桿菌之酶(資料庫碼NP_391071)或其變體形式。其他實例包含得自豆科植物根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)(資料庫碼YP_002975437)、巨桿菌(Bacillus megaterium)(資料庫碼YP_003565624)、莢膜光合菌(Rhodobacter capsulatus)(資料庫碼ADE84249.1)及枯草桿菌(資料庫碼NP_391071)的酶及其變體。
就進行丙胺酸合成而言,最基本的是存在充分量之起始材料,特別是無機氮源。在較佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭「無機氮源」應理解為意指包含銨或在細胞代謝中可轉化成銨之無機含氮鹽。實例包含氯化硝酸
鹽、磷酸銨、硫酸銨、氫氧化銨、磷酸銨、碳酸銨等。在較佳具體實例中,在介質中之銨濃度計為0.05至5,更佳為0.1至3,最佳為0.5至3g/l。根據本發明,較佳係藉由將充分量所談論之化合物添加至水相而對細胞提供無機氮源。
在較佳具體實例中,除了重組丙胺酸去氫酶以外,該細胞包括至少一種其他重組酶。在較佳具體實例中,此為將NAD(P)+還原成NAD(P)H之酶,例如CYP153族或AlkBGT族之細胞色素P450單氧化酶或醇去氫酶。因此,尤其有利的是使用其中NAD(P)+還原酶及胺基酸去氫酶轉化相同氧化還原輔因子(較佳為NAD(H)或NADP(H)的系統。NADP相依之丙胺酸去氫酶包含來自莢膜光合菌(資料庫碼ADE84249.1)之酶及其變體。NAD相依之丙胺酸去氫酶包含來自枯草桿菌亞種168菌株(Bacillus subtilis subsp.subtilis strain 168)(資料庫碼NP_391071)之丙胺酸去氫酶及其變體。
在尤佳具體實例中,單氧化酶為來自AlkB族之單氧化酶。AlkB為來自以羥化酶活性聞名之戀臭假單孢菌的AlkBGT系統之氧化還原酶。該活性取決於兩種其他多肽:AlkG及AlkT。AlkT之特徵係其為將來自NADH之電子轉移至AlkG的FAD相依之紅素氧化還原蛋白(rubredoxin)還原酶。AlkG為紅素氧化還原蛋白,其係一種作為AlkB之直接電子施體的含鐵之氧化還原蛋白質。在較佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭「來自alkB
族之單氧化酶」應理解為意指與膜相關之烷羥化酶。在更佳具體實例中,同一用辭「alkB型之烷羥化酶」應理解為意指對於來自戀臭假單孢菌Gpo1(資料庫碼:CAB54050.1,該資料庫碼及本文件中所使用的所有資料庫碼係來自2011年11月9日發佈之NCBI基因庫(Genbank)蛋白質資料庫)之AlkB序列具有提高的偏好(至少75、80、85、90、92、94、96、98或99%)之序列同源的多肽。本文內容中所使用之用辭「序列」可指多肽之胺基酸序列及/或編碼該多肽之核酸序列。
在尤佳具體實例中,單氧化酶為CYP153族之細胞色素P450單氧化酶。在較佳具體實例中,用辭「CYP153族之細胞色素P450單氧化酶」應理解為意指細胞溶質氧化酶,其為另外包含鐵氧化還原蛋白及鐵氧化還原蛋白還原酶之3-組分系統的一部分,該細胞溶質氧化酶具有烷結合位點且能羥化烷類。在尤佳具體實例中,其為具有至少80,較佳為90,最佳為95或99%與來自博庫島烷降解菌(Alcanivorax borkumensis)SK2(資料庫碼YP_691921)之CYP153族的細胞色素P450單氧化酶序列同一性之酶,或包含具有至少80,較佳為90,最佳為95或99%與來自博庫島烷降解菌SK2(資料庫碼YP_691921)之CYP153族的細胞色素P450單氧化酶序列同一性且另外具有烷羥化酶活性的酶。在較佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭「烷羥化酶活性」應理解為意指催化烷類或包含至少五個,較佳為十二個碳物質基團的未經取代之線型烷基基團
羥化之能力。在更佳具體實例中,用辭「來自CYP153族之細胞色素P450單氧化酶」應理解為意指非膜結合之氧化酶,其包含用於烷類、包含至少五個,較佳為十二個碳物質基團的未經取代之線型烷基基團或單羥化烷類的結合位點,且其多肽鏈包含結構組元LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN。在較佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭「來自CYP153族之細胞色素P450單氧化酶」為來自博庫島烷降解菌SK2(資料庫碼YP_691921)之CYP153族的細胞色素P450單氧化酶或變體,其較佳具有烷羥化酶活性。
使用來自CYP153族之細胞色素P450單氧化酶以羥化烷類係描述於先前技術,用於測定酶活性之酶分析以及表現及純化方法亦描述於先前技術(Scheps,D.、Malca,H.、Hoffmann,B.、Nestl,B.M及Hauer,B.(2011)Org.Biomol.Chem.,9,6727)。除了待氧化之烷或包含至少五個,較佳為十二個碳物質基團的未經取代之線型烷基基團以外,包含該酶之反應的基材包含氧及電子,該等基材係呈NADH形式轉移至氧化酶,較佳係經由其他兩種組分(鐵氧化還原蛋白及鐵氧化還原蛋白還原酶)轉移。Scheps等人(2011)及Roome,P.W.,Jr.、Philley,J.C.及Peterson(1983)於J.Biol.Chem.258,2593;Roome,P.W.及Peterson,J.A.(1988)於Arch.Biochem.Biophys.,266,41及Peterson,J.A.、Lorence,M.C.及Amarneh,B.(1990)於J.Biol.Chem,265,6066亦揭示用於獲得呈功能形式之鐵氧化還原蛋白及鐵氧化還原蛋白還原酶的方法。
通常,所選用之細胞將是能因消耗丙胺酸而製造具有特別利益之產物的細胞。就該目的而言尤其有利的是使用重組細胞。在較佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭「重組」應理解為意指被稱為重組且被引入「重組細胞」中之核酸分子於自然界中不以此形式存在,而是使用分子生物或化學合成方法產生之核酸分子,或被視為重組之細胞包含重組核酸分子或藉其編碼之多肽,特別是具有丙胺酸去氫酶活性之多肽。用於產生重組核酸分子及細胞的例行分子生物方法係描述於先前技術,例如Sambrook等人(1989)或Schlegl & Fuchs(2007)。
根據本發明,該細胞因消耗丙胺酸而製造具有特別利益的產物。該製造之較佳具體實例中,丙胺酸為在該製造任何一點的必要起始材料,例如製造含丙胺酸之多肽,此係與製造當中需要碳、氫及氧原子(諸如來自丙胺酸者,然而該等碳、氫及氧原子同樣可衍生自其他來源)之產物的製造相反。較佳地,合成所消耗或可消耗之丙胺酸的量超過所使用之能自然地製造且尤佳係限制重要產物之產率的該因子或至少一個因子的細胞之量。
此外,尤其有利的是該細胞過度表現丙胺酸去氫酶及/或至少一種其他酶。此可藉由將包含將酶編碼之核酸分子的媒介引入該細胞、藉由轉化或類似者,或藉由將酶編碼之核酸分子併入該細胞的基因組成(諸如染色體)而獲致。適用方法及可用於表現或過度表現核酸分子之媒介(例如pET或pGEX型之媒介),及適其表現之細胞
(Moffatt & Studier(1986),Rosenberg等人(1987)及Studier等人(1990),大量生物技術上重要類型之細胞,例如大腸桿菌。
本發明教示不只使用本文所述之生物巨分子之確切胺基酸或核酸序列(例如丙胺酸去氫酶)進行或應用於此(例如,藉由分離編碼催化β氧化之反應其中一者的酶之基因),亦使用或應用於可藉由耗乏、添加或取代一種或超過一種胺基酸或核酸所獲得之此等巨分子的變體。在較佳具體實例中,以下與用辭「同系物」同義且互換使用之用辭核酸序列或胺基酸序列之「變體」在本文內容中應理解為意指與對應之原始野生型核酸或胺基酸序列不同的核酸或胺基酸序列,其具有70、75、80、85、90、92、94、96、98、99%或更高百分比之同源(目前意思與同一性相同),其中較佳地,除了形成催化活性中心之胺基酸或對結構或摺疊而言基本的胺基酸以外之胺基酸係耗乏或經取代,或該等胺基酸僅少許地經取代,例如麩胺酸鹽代替天冬胺酸鹽,或白胺酸代替纈胺酸。先前技術描述可用以計算顏種序列之同源程度的演算法,例如Arthur Lesk(2008),Introduction to bioinformatics,第3版。在本發明另一更佳具體實例中,胺基酸或核酸序列之變體(較佳係除了上述序列同源以外)具有與野生型分子或原始分子基本上相同之酶活性。例如,酶活性蛋白酶多肽之變體具有與多肽酶相同或基本上相同之蛋白分解活性,即,催化肽鍵水解的能力。在特別之具體實例中,「基本上相同之酶
活性」意指關於野生型多肽之基材的活性,其明顯高於背景活性及/或與KM及/或kcat值(該等野生型多肽所展現的值相對於相同基材)相差少於3,更佳為2,又更佳為1個量級之基材的活性。
在更佳具體實例中,用辭核酸或胺基酸序列之「變體」包括該核酸或胺基酸序列的至少一個活性部分及/或片段。在更佳具體實例中,用辭「活性部分」意指具有小於該胺基酸序列全長的胺基酸序列或核酸序列及/或小於該胺基酸序列全長的編碼,其中該具有比野生型胺基酸序列更短之長度的胺基酸序列或經編碼胺基酸序列基本上具有與該野生型多肽或或其變體相同之酶活性,例如丙胺酸去氫酶。在特別之具體實例中,用辭核酸之「變體」包含較佳係在嚴格條件下互補鏈結合至野生型核酸。雜合反應(hybridization reaction)之嚴格性可容易由熟悉本技術之人士決定,且通常取決於探子(probe)長度、清洗溫度及鹽溫度。一般而言,較長探子需要較高雜合溫度,而較短探子在較低溫度下作用。雜合發生與否通常視變性DNA黏著(anneal)於其環境中存在之互補鏈以及在低於熔融溫度下進行此種作用的能力。雜合反應之嚴格性及對應條件係更詳細描述Ausubel等人之論文(1995)。熟知本技術之人士尤其可在教科書「The DIG System Users Guide for Filter Hybridization」(Boehringer Mannheim GmbH(德國曼海姆,1993))及Liebl等人之論文(International Journal of Systematic Bacteriology 41:255-260(1991))發現有關利用
雜合辨識DNA序列之資訊。在較佳具體實例中,雜合係在嚴格條件下發生,換言之,只產生探子與目標序列(即經該探子處理之多核苷酸)具有至少70%同一性之雜合。已知包括清洗步驟之雜合的嚴格性係受不同緩衝劑組成、溫度及鹽溫度影響或由其決定。通常,雜合反應係在與清洗步驟相比相對低嚴格性之下進行(Hybaid Hybridisation Guide,Hybaid Limited,Teddington,UK,1996)。例如,雜合反應可能使用約50℃至68℃溫度下之對應於5×SSC緩衝劑的緩衝劑。此處,探子亦可和與該探子之序列同一性低於70%的多核苷酸雜合。此種雜合較不安定,且在嚴格條件下藉由清洗移除。嚴格清洗條件可例如藉由在清洗緩衝劑中將鹽濃度降至2×SSC並隨意地稍後降至0.5×SSC(The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation,Boehringer Mannheim,德國曼海姆,1995)而獲致,其中為了提高偏好,溫度係設為約50℃至68℃,約52℃至68℃,約54℃至68℃,約56℃至68℃,約58℃至68℃,約60℃至68℃,約62℃至68℃,約64℃至68℃,約66℃至68℃。約64℃至68℃或約66℃至68℃之溫度範圍為佳。隨意地,可將鹽濃度降至對應於0.2×SSC或0.1×SSC之濃度。藉由將雜合溫度以約1至2℃之差距從50℃逐步提高至68℃,可分離多核苷酸片段,例如以提高序列偏好至與所使用核酸分子之序列至少70%或至少80%或至少90%,至少91%,至少92%,至少93%,至少94%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%或至少99%的同一
性。有關雜合的其他指示可在市面以呈「套組」(例如,DIG Easy Hyb,購自Roche Diagnostics GmbH,德國曼海姆,型錄編號1603558)形式獲得。在較佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭核酸之「變體」包含將相同胺基酸序列編碼為原始核酸之任何核酸序列或在該基因編碼之退化邊界內的該胺基酸序列之變體。
本發明方法之步驟c)涉及使水性培養介質與疏水性有機溶液接觸。在本發明較佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭「使之接觸」意指使水性培養介質與有機溶液直接接觸而不插入水性培養介質及/或疏水性有機溶劑無法克服的機械性障壁(例如無機膜)。例如,水性培養介質可提供於發酵槽,並將有機溶液添加至同一發酵槽之該培養介質,以使此二液體可混合。在較佳具體實例中,使之接觸係至少部分係藉由攪拌、藉由引入氣體或適於提高兩相之接觸的接觸面積之類似措施而達成。
在使之接觸期間,必須小心進行步驟c)充分長之期間及兩相具有充分大邊界面積以使細胞能與疏水相c)充分接觸。在較佳具體實例中,使之接觸係進行至少10、20、30、60分鐘或2、4、6、12、18或24小時。步驟c)可在步驟b)開始時立刻進行,即使之接觸係在培養期間完成,或可在步驟b)之前,即在步驟b)開始之前移除有機溶液,例如藉由傾析或離心及萃取來移除水相。
根據本發明教示,最基本的是步驟b)係在需氧性條件下進行。在較佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭
「需氧性條件」應理解為意指水相與分子氧(例如呈大氣形式)接觸,及較佳係不採取任何措施以減少該水相中之氧濃度,例如密封反應容器以防止與含氧環境空氣氣體交換。在尤佳具體實例中,氧(例如呈空氣形式)係例如藉由曝氣及攪拌而積極地引入水相中。
在某些基材之情況下,分子滲透至全細胞觸媒內部可限制所希望物質產生。在長鏈烷類及其衍生物之情況下,較佳係全細胞觸媒包括AlkL多肽。在較佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭「AlkL多肽」為超過230個鄰近胺基酸之長度中具有至少80,較佳為90,更佳為90%與戀臭假單孢菌AlkL(資料庫碼CAB69081)同一性,且較佳具有支援長鏈烷類進入細胞內部之能力的多肽。在另一具體實例中,本文內容中所使用之用辭「來自AlkL族之多肽」為位於革蘭氏陰性細菌之外膜且具有序列結構組元DXWAPAXQ(V/A)GXR(其中X為蛋白質原胺基酸)且較佳為戀臭假單孢菌AlkL(資料庫碼CAB69081)或其變體以外的多肽。AlkL族之成員的實例包括戀臭假單孢菌AlkL(資料庫碼CAB69081)、水油海洋桿菌VT8(Marinobacter aquaeolei VT8,資料庫碼YP_957722)、亞歷山大海洋柄菌HTCC2633(Oceanicaulis alexandrii HTCC2633,資料庫碼ZP_00953584)、深海錳氧化菌Mnl7-9(Marinobacter manganoxydans Mnl7-9,資料庫碼ZP_09158756)、柄桿菌屬K31(Caulobacter sp.K31,資料庫碼YP_001672217)、食油假單孢菌(資料庫碼Q00595)及其變體。
本發明方法可使用慣用疏水性有機溶劑進行,該等疏水性有機溶劑包括經取代及未經取代烷類、環烷類、環烯類、芳基類、脂肪酸類、脂肪酸酯類、醇類、雜環烷類、雜環烯類及雜芳基類,彼等在室溫下均為液態。熟知本技術之人士熟悉大量可用於製備疏水性有機溶液的溶劑。在較佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭「疏水性」應理解為意指呈液態且於液態水相存在下液體形成與該水相清楚區分之液相的性質。該清楚區分之液相可為連續液相或乳液。在更佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭「疏水性」應理解為意指化合物基本上不溶解於水的性質。最後,在本文內容中所使用之另外較佳具體實例中,該用辭應理解為意指具有十進制對數大於0,更佳為大於0.5,又更佳為大於1且最佳為大於2之P值的化合物(J.Sangster,Octanol-Water Partition Coefficients:Fundamentals and Physical Chemistry,Vol.2 of Wiley Series in Solution Chemistry,John Wiley & Sons,Chichester,1997)。較佳有機溶劑包括但不局限於包含下列者之群組:經取代及未經取代烷類、環烷類、環烯類、芳基類、脂肪酸類、脂肪酸酯類、醇類、雜環烷類、雜環烯類及雜芳基類,彼等在室溫下均為液態。疏水性有機溶液亦可為包含超過一種疏水性有機溶劑之混合物。亦適用者為若為溶劑混合物之一部分其本身不為液態但該溶劑混合物整體為液態之疏水性有機溶劑。
在特定環境下必須考慮的是大量溶劑對於代謝活性細
胞多少具有毒性。因此,若細胞必須維持其代謝活性至少一些時間,則必須使用該疏水性有機溶劑之適當中等毒性或無毒性濃度。在尤佳具體實例中,溶劑為具有至少八個,較佳為至少十二個碳原子之飽和或不飽和脂肪酸,例如月桂酸、油酸或芥子酸或其甲酯。在更佳具體實例中,溶劑為式CH3-(CH2)x-COOH之脂肪酸,其中x可為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或更大。在更佳具體實例中,其為具有一個雙鍵之不飽和脂肪酸,該雙鍵尤佳係位於第9位,尤佳為油酸。在其他尤佳具體實例中,溶劑為己酸。
若欲在需氧性條件下於有機相存在下長時間培養細胞,建議使用生物相容疏水性溶劑之有機相。更適於作為此種相者為飽和脂肪酸之甲酯與不飽和脂肪酸的混合物,尤其是月桂酸甲酯與油酸之混合物。當使用至少一種純形式為固態之脂肪酸時,本文內容中之體積比或重量比較佳為20至80最高達80至20,尤佳為為30至70最高達70至30,最佳為40至60最高達60至40。
疏水性有機溶液之體積應使得可容易分離有機相,在較佳具體實例中其數量為水性培養介質與疏水性有機溶液之總體積的2至98%,更佳為5至95%,又更佳為10至40%,最佳為20至30%。熟知本技術之人士熟悉大量從水相分離出有機相之方法,例如傾析、利用分液漏斗移除、離心等。
該方法可用於先氧化脂肪酸或其酯類且隨後胺化該產
物。適用於此目的之實例為如國際專利申請案WO 2009/077461中所述之酶系統。該情況下,代謝活性細胞為包括重組烷羥化酶及轉胺酶之細胞,其較佳係另外包括至少一種來自包含醇去氫酶、丙胺酸去氫酶及內醯胺水解酶之群組的酶。在較佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭「轉胺酶」應理解為意指催化α-胺基從施體分子(較佳為胺基酸)轉移至受體分子的酶。例如,可使用來自紫色色桿菌ATCC 12472(資料庫碼NP_901695)及其變體的轉胺酶。在較佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭「內醯胺水解酶」應理解為意指催化羧基與同一分子胺基之分子內縮合的酶。系統與適用之酶的實例係描述於EP11004029。
適用於本發明方法之細胞除單氧化酶之外亦可包括醇去氫酶或包括醇去氫酶代替單氧化酶。在較佳具體實例中,本文內容中所使用之用辭「醇去氫酶」應理解為意指將醛或酮分別氧化成對應之一級或二級醇的酶。實例包含來自自營脫氮菌(Ralstonia eutropha,ACB78191.1)、短毛乳酸桿菌(YP_795183.1)、克菲爾乳酸桿菌(ACF95832.1)、來自馬肝、來自硫化氫氧化菌(Paracoccus pantotrophus,ACB78182.1)及矢野口氏鞘脂菌(Sphingobium yanoikuyae,EU427523.1)及其個別之變體的醇去氫酶。
本發明另外藉由以下圖式及非限制實例進一步說明,從該等圖式及非限制實例可看出本發明之其他特徵、具體實例、方面及優點。
已在得自DASGIP之具有8個生物反應器的平行發酵系統中,針對W3110[alaDH_Bs]及W3110[alaDH_Bs-TA-aIkL]菌株研究於本發明特定條件下提高丙胺酸之生產。W3110[alaDH_Bs]為大腸桿菌W3110之菌株,其包含源自於DNA2.0且具有枯草桿菌丙胺酸去氫酶之基因的以pJ294為底質之質體。W3110[alaDH_Bs-TA-aIkL]為包含源自DNA2.0且具有上述丙胺酸去氫酶及轉胺酶之基因的以pJ281為底質之質體,及具有所述孔蛋白(porin alkL(PCT/EP2011/053834,DE102011110945)之基因的其他以pJ294為底質之質體的菌株。
使用1 l反應器進行發酵。利用兩點校正使用pH 4.0及pH 7.0之標準溶液校正pH探子。將該等反應器裝入300ml之飲用水並在121℃下高壓滅菌20分鐘以確保無菌。之後,使pO2探子在該DASGIP系統中極化一夜(至少6小時)。次日早晨,在清潔工作檯中移除水,並以補充100mg/l胺苄青黴素之300ml的高細胞密度介質置換。之後,以一點校正來校正該pO2探子(攪拌器:400rpm/通氣:10sl/h空氣),並利用原位清潔來清潔進料、修改劑及誘導體路徑。為此,以70%乙醇,然後以1M NaOH,然後無菌完全去礦物質水清洗該等管子,最後裝填個別介質。
從個別低溫培養物開始,產生丙胺酸之大腸桿菌菌株首先在補充100mg/l胺苄青黴素之LB介質(於100ml擋板燒瓶中,25ml)中於37℃及200rpm下生長一夜。然後,在各例中,將2ml培養物培養成高細胞密度介質(葡萄糖15g/l(補充1% MgSO4*7H2O及2.2% NH4Cl之30ml/l分開高壓滅菌之500g/l儲備原液)、(NH4)2SO4 1.76g/l、K2HPO4 19.08g/l、KH2PO4 12.5g/l、酵母萃取物6.66g/l、檸檬酸三鈉二水合物2.24g/l、檸檬酸鐵銨溶液17ml/l分開高壓滅菌之1%儲備原液、微量元素溶液5ml/l分開高壓滅菌之儲備原液(HCl(37%)36.50g/l、MnCl2*4H2O 1.91g/l、ZnSO4*7H2O 1.87g/l、乙二胺四乙酸二水合物0.84g/l、H3BO3 0.30g/l。Na2MoO4*2H2O 0.25g/l、CaCl2*2H2O 4.70g/l FeSO4*7H2O 17.80g/l、CuCl2*2H2O 0.15g/l))(每種菌株於100ml擋板燒瓶中,25ml)補充100mg/l胺苄青黴素並於37℃/200rpm下再培養5.5小時。
測定培養物在600nm下之的光學密度。為培養光學密度為0.1之反應器,將適當量之預培養物吸入無菌條件下之5ml注射器,並利用套管通過覆蓋一層70%乙醇之隔片培養。
使用以下標準程序:
該進行之實驗可分成兩階段,換言之,細胞於其間達到特定光學密度之生長階段,及在添加包含25%(w/w)月桂酸甲酯及75%(w/w)油酸之有機相之後的隨後藉由在表現期間所形成之酶產生丙胺酸的丙胺酸製造階段。使用不具有機相之對應實驗作為對照組。使用氨(12.5%)將pH值非線性調整成pH 6.8。在生長及生物轉化階段期間,經由攪拌器速度及通氣速率將培養物中溶解的氧(DO,溶解的氧)調節為30%。
發酵係以已經DO尖峰觸發之為5g/lh葡萄糖進料(補充1% MgSO4*7H2O及2.2% NH4Cl之500g/l葡萄糖)作為批料進行(開始進料)。於開始進料時,溫度亦從先前的37℃降至30℃。丙胺酸去氫酶(及其他重組引入之蛋白
質)的表現係在藉由自動添加IPTG(最終濃度1mM)而開始進料之後2小時誘發。在藉由有機相誘發之丙胺酸製造開始之前,測定培養液之光學密度。
丙胺酸之製造係於開始進料之後14小時開始。為此,添加150ml之月桂酸甲酯與油酸的混合物(工業級純度,90%)作為發酵液之批料。為具有可用於製造丙胺酸之充分銨離子,在添加有機物之前半小時將5ml之3M硫酸銨溶液添加至該發酵液。為了取樣,從反應器移出2ml之發酵液並立刻與驟冷溶液(40%(v/v)乙醇;0.8%(w/v)NaCl;-20℃)混合。之後,在0℃/5100rpm下將該等樣本離心10分鐘。丟棄上澄液,並將細胞片狀沈澱物懸浮於2ml之甲醇(-20℃)中。藉由該等樣本測定該等細胞內之丙胺酸濃度。
丙胺酸係利用HPLC/UV測量然後利用鄰苯二甲醛衍生而測定。測量該甲醇上澄液。最重要之層析參數係彙編於下表。
在添加有機物之前15分鐘以及在添加有機物之後2小時、3.5小時、20.5小時及22.5小時從所有反應器取得樣本。於發酵期間經由DASGIP系統的排氣分析測定氧之轉化率(OTR=氧轉移率)及碳之轉化率(CTR=二氧化碳轉移率)。發酵係在生物轉化開始之後23小時中止。停止攪拌器、通氣單元、溫度控制及pH控制,且使反應器靜止5至10分鐘。
在添加有機相之後,二者研究案例均揭露出所使用之細胞(具有或不具有AlkL表現)中丙胺酸濃度顯著提高。在不添加有機物的各對照實驗中,測得明顯較低之丙胺酸
濃度,且該等濃度顯示無提高傾向(見圖1)。
Claims (21)
- 一種丙胺酸之製造方法或因消耗丙胺酸而產生之化合物的製造方法,其包括a)提供表現重組丙胺酸去氫酶或其變體之細胞,b)在無機氮源存在下,於水相之需氧性條件下,培養該細胞,及c)令該細胞與有機相接觸,其中該細胞為原核細胞或低等真核細胞。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該細胞包括含有編碼alkL多肽,較佳為戀臭假單孢菌AlkL(資料庫碼AJ245436)或其變體之序列的核酸,及/或alkL多肽或其變體。
- 如申請專利範圍第2項之方法,其中該alkL多肽或其變體為異源,且較佳係過度表現。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中步驟c)係藉由在有機相存在之下,進行步驟b)來進行。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中該有機相包含疏水性脂肪酸酯,較佳為月桂酸甲酯。
- 如申請專利範圍第5項之方法,其中該有機相除了疏水性脂肪酸酯之外,還包含疏水性脂肪酸。
- 如申請專利範圍第6項之方法,其中該有機相包含至少一種選自下列所組成之群組之疏水性溶劑:未經取代、經取代、分支及未分支之烷類、環烷類、芳基類、雜 芳基類、二烷基醚類、脂肪醇類、三酸甘油酯類及鹵烴。
- 如申請專利範圍第6項之方法,其中該疏水性脂肪酸為不飽和脂肪酸,較佳為油酸。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中該細胞包括將丙胺酸辨識為基質之異源轉胺酶,且該轉胺酶較佳係選自包含來自紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)ATCC 12472之ω-轉胺酶(資料庫碼NP_901695)及其變體之群組。
- 如申請專利範圍第7項之方法,其中除了該異源轉胺酶以外,該細胞還包括一或多種單氧化酶,該一或多種單氧化酶單獨或依序催化脂肪酸或脂肪酸酯之氧化,以產生ω-側氧基-脂肪酸或ω-側氧基-脂肪酸酯。
- 如申請專利範圍第8項之方法,其中該一或多種單氧化酶為異源,且較佳係選自包含來自AlkB族之單氧化酶及來自CYP153族之細胞色素P450單氧化酶及其變體之群組。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中該細胞為細菌細胞,尤其是大腸桿菌。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中步驟c)費時至少60分鐘。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其中該水相包含低於10mM,較佳低於5mM,更佳甚至低於1mM之丙胺酸。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法,其 中該有機相的量以水相及有機相之總體積計為至少5體積百分比,較佳超過20體積百分比。
- 一種表現異源丙胺酸去氫酶或其變體之細胞的用途,其用於在需氧性條件下,於有機相存在下,製造丙胺酸或製造因消耗丙胺酸而產生之化合物,其中該細胞為原核細胞或低等真核細胞,且其中該有機相較佳包含疏水性脂肪酸酯及疏水性脂肪酸,甚至更佳包含月桂酸甲酯及油酸。
- 一種有機相之用途,其用於提高丙胺酸或因消耗丙胺酸而產生之化合物的產率,該用途包括令產生丙胺酸或因消耗丙胺酸而產生之化合物的原核細胞或低等真核細胞與該有機相接觸,其中該有機相較佳包含疏水性脂肪酸酯及疏水性脂肪酸,甚至更佳包含月桂酸甲酯及油酸。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該細胞以至少0.5,更佳為至少1,又更佳為至少5,最佳為至少10之光學密度存在水溶液中。
- 如申請專利範圍第16或17項之用途,其中該細胞以至少0.5,更佳為至少1,又更佳為至少5,最佳為至少10之光學密度存在水溶液中。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該丙胺酸去氫酶為來自枯草桿菌(資料庫碼NP_391071)或其變體之丙胺酸去氫酶。
- 如申請專利範圍第16或17項之用途,其中該丙胺酸去氫酶為來自枯草桿菌(資料庫碼NP_391071)或其變 體之丙胺酸去氫酶。
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