CN103361389B - 丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的好氧生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过下述方法解决的作为本发明基础的问题：在第一方面，一种用于生产丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的方法，所述方法包括：（a）提供表达重组丙氨酸脱氢酶或其变体的细胞，（b）在有无机氮源存在下，在好氧条件下，在水相中培养所述细胞，和（c）使所述细胞与有机相接触，其中所述细胞是原核细胞或低等真核细胞。

Description

丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的好氧生产方法
技术领域
本发明涉及一种用于生产丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的方法，所述方法包括：（a）提供表达重组丙氨酸脱氢酶或其变体的细胞，（b）在有无机氮源存在下，在好氧条件下，在水相中培养所述细胞，和（c）使所述细胞与有机相接触，其中所述细胞是原核细胞或低等真核细胞。
背景技术
除了用作蛋白形成氨基酸,即作为大量蛋白质的必需组分的氨基酸以外，丙氨酸还被用作在生物技术工艺和化学合成中广泛使用的胺供体。就工业生物技术合成而言，可以以化学合成的丙氨酸的形式或以酵母浸出物的形式，将需要的丙氨酸加给具有生物合成活性的细胞。但是，考虑到成本方面和可能要从培养基中纯化的产物的纯度，更有利的是，具有生物合成活性的细胞本身会足量地生产需要的丙氨酸。因此，对可以用于生物技术中的微生物存在极大的兴趣：所述微生物连续地生产尽可能多的量的丙氨酸，所述丙氨酸然后可用于在细胞内部或外部的后续合成步骤。
现有技术教导，当在厌氧条件下维持表达丙氨酸脱氢酶的细胞时，形成特别大量的丙氨酸（“Production of L-alanine by metabolically engineered Escherichia coli”Appl Microbiol Biotechnol (2007), 77:355-366）。但是，这样的条件会造成显著减少的细胞生长、降低的代谢性能和昂贵底物（诸如葡萄糖）的代谢，形成初级代谢的不希望的副产物，从而损害整个工艺的效率和产物收率。因此，如果要在工业规模开发经济的生物技术工艺，必须在好氧条件下实现这些工艺。
在该背景下，需要适合用于在好氧条件下增加在生物技术上的有关细胞中可提供用于合成的丙氨酸的量的方法。
此外，需要用于经生物技术生产ω-氨基羧酸的方法，所述方法具有减少的丙氨酸添加，或者尽可能仅任选地添加丙氨酸或仅暂时需要添加丙氨酸，其中生产ω-氨基羧酸所需的氮以无机氮盐的形式提供，和/或需要其中以不添加丙氨酸的反应模式提高ω-氨基羧酸收率的方法。
发明内容
这些和其它目的由本申请的主题实现，且具体地，也由所附独立权利要求的主题实现，其中实施方案源自从属权利要求。
在第一方面，下述方法解决了作为本发明的基础的问题：一种用于生产丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的方法，所述方法包括：
a) 提供表达重组丙氨酸脱氢酶或其变体的细胞，
b) 在有无机氮源存在下，在好氧条件下，在水相中培养所述细胞，和
c) 使所述细胞与有机相接触，
其中所述细胞是原核细胞或低等真核细胞。
在第一方面的第一个实施方案中，一种方法解决了所述问题，其中所述细胞包括：一种核酸，所述核酸包含编码alkL多肽,优选恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）AlkL（数据库代码AJ245436）或其变体的序列和/或所述alkL多肽或其变体。
在第二个实施方案（其也是第一个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述alkL多肽或其变体是异源的，且优选地过表达。
在第三个实施方案（其也是第一个至第二个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中通过在有机相存在下进行步骤b），实现步骤c）。
在第四个实施方案（其也是第一个至第三个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述有机相包含疏水脂肪酸酯，优选月桂酸甲酯。
在第五个实施方案（其也是第四个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述有机相除了包含疏水脂肪酸酯以外还包含疏水脂肪酸。
在第六个实施方案（其也是第一个至第五个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述有机相包含至少一种选自下述的疏水溶剂：未被取代的、被取代的、支链的和非支链链的烷烃、环烷烃、含芳基化合物、含杂芳基化合物、二烷基醚、脂肪醇、甘油三酯和卤代烃。
在第七个实施方案（其也是第六个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述疏水脂肪酸是不饱和脂肪酸，优选油酸。
在第八个实施方案（其也是第一个至第七个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述细胞包括异源转氨酶，所述转氨酶识别丙氨酸作为底物，且所述转氨酶优选地选自：得自青紫色素杆菌（Chromobacterium violaceum）ATCC 12472的ω-转氨酶（数据库代码NP_901695）及其变体。
在第九个实施方案（其也是第一个至第八个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述细胞除了包括异源转氨酶以外，还包括一种或超过一种单加氧酶，所述单加氧酶单独地或依次地催化脂肪酸或脂肪酸酯的氧化，以生成ω-氧代-脂肪酸或ω-氧代-脂肪酸酯。
在第十个实施方案（其也是第一个至第九个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述一种或超过一种单加氧酶是异源的，且优选地选自：来自AlkB家族的单加氧酶和来自CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶及其变体。
在第十一个实施方案（其也是第一个至第十个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述细胞是细菌细胞，优选大肠杆菌。
在第十二个实施方案（其也是第一个至第十一个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中步骤c）进行至少60分钟。
在第十三个实施方案（其也是第一个至第十二个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述水相包含小于10 mM、优选地小于5 mM、更优选地甚至小于1 mM丙氨酸。
在第十四个实施方案（其也是第一个至第十三个实施方案的一个实施方案）中，一种方法解决了所述问题，其中所述有机相占水相和有机相的总体积的至少5体积%，优选地超过20体积%。
在第二方面，如下解决了作为本发明的基础的问题：在有机相存在下在好氧条件下使用表达异源丙氨酸脱氢酶或其变体的细胞来生产丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物，其中所述细胞是原核细胞或低等真核细胞，且其中所述有机相优选地包含疏水脂肪酸酯和疏水脂肪酸，甚至更优选月桂酸甲酯和油酸。
在第三方面，如下解决了作为本发明的基础的问题：使用有机相来增加丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的收率，其中包括，使生产丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的原核细胞或低等真核细胞与所述有机相接触，其中所述有机相优选地包含疏水脂肪酸酯和疏水脂肪酸，甚至更优选月桂酸甲酯和油酸。
在第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，一种方法或用途解决了所述问题，其中所述细胞以至少0.5、更优选至少1、甚至更优选至少5、最优选至少10的光密度存在于水溶液中。
在第一、第二或第三方面的另一个实施方案中，一种方法或用途解决了所述问题，其中所述丙氨酸脱氢酶是得自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的丙氨酸脱氢酶（数据库代码NP_391071）或其变体。
发明人已经发现，当使表达丙氨酸-脱氢酶的原核宿主细胞与有机溶液接触时，会令人惊奇地显著增加所述细胞在好氧条件下和在有无机氮源存在下的丙氨酸生产量。
本发明的教导可以用于改善所有这样的生物技术工艺：其包括消耗丙氨酸来生产产物诸如精细化学品，并且当使用代谢活性细胞时，其包括在水性培养基中培养所述细胞和对产物进行后处理。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述“细胞”应当理解为是指，具有代谢活性的活细胞，优选全细胞催化剂，其表达或甚至更优选地过表达与目标产物的生物技术生产有关的活性形式的酶。所述细胞可以是原核生物（包括古细菌）或真核生物，其中原核生物优选地来自下述属：假单胞菌属、棒杆菌属和埃希氏菌属。在甚至更优选的实施方案中，所述细胞是细菌细胞，更优选革兰氏阴性细菌细胞，最优选大肠杆菌（E. coli）。在另一个优选的实施方案中，所述细胞是真核细胞，更优选低等真核细胞或真菌细胞，甚至更优选酵母细胞，最优选酵母菌属（Saccharomyces）或假丝酵母属（Candida）、毕赤酵母属（Pichia），特别是热带假丝酵母（Candida tropicalis）。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述“低等真核生物”是指在它的所有生存时期中都是单细胞的真核生物，与此不同的是，高等真核生物在它们的生命的大部分时期中呈多细胞生物的形式，其含有包含分化细胞的组织。在特定实施方案中，表述“细胞”在本申请中与表述“微生物”同义地且可互换地使用。此外，所述细胞可以是分离的细胞或不同细胞的混合物。
使用本发明的教导的一个先决条件是，存在水相，即水性的培养或反应介质，其适用于至少暂时地维持或培养所述细胞。本领域技术人员熟知大量适用于维持或培养细胞、特别是在生物技术上重要的细胞的水性培养基。这些不仅包括完全培养基诸如LB培养基，而且包括基本培养基诸如M9培养基和选择性培养基，例如具有高盐浓度且因此仅允许嗜盐或至少耐盐生物生长的那些培养基。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述“水相”应当理解为是指与疏水溶剂是基本上不混溶的基于水的反应或培养介质，其在所有有关因素方面（特别是pH、盐含量和温度）允许至少暂时地维持或促进存在于其中的细胞、优选微生物的生存力，并且所述水性培养基和所述疏水有机相在生物技术上有用生物的常规培养温度（优选在25℃）以液体形式存在。各种在生物技术上重要的细胞的温度要求，可以参见微生物学和分子生物学的教科书，例如Fuchs/Schlegl, 2008。在一个优选的实施方案中，在发生接触的时间点，所述水性培养基的pH是在4-9之间，更优选在4.5-8.5之间，最优选在6.5-7.5之间。在另一个优选的实施方案中，所述温度是在5-42℃之间，更优选在15-40℃之间，最优选在20-37℃之间。
本发明的教导提供了所述细胞表达重组丙氨酸脱氢酶。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述“丙氨酸脱氢酶”应当理解为是指这样的酶：其催化丙酮酸、氨和NADH或它们的盐转化成L-丙氨酸、水和NAD+。所述丙氨酸脱氢酶优选地是细胞内丙氨酸脱氢酶，甚至更优选细菌全细胞催化剂的重组细胞内丙氨酸脱氢酶。在一个特别优选的实施方案中，它是得自枯草芽孢杆菌的酶（数据库代码NP_391071）或其变体。其它实例包含得自豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）（数据库代码YP_002975437）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）（数据库代码YP_003565624）、荚膜红杆菌（Rhodobacter capsulatus）（数据库代码ADE84249.1）和枯草芽孢杆菌（数据库代码NP_391071）的酶及其变体。
对于丙氨酸合成，必须存在足量的原料，特别是无机氮源。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述“无机氮源”应当理解为是指无机的含氮盐，其包含铵或可以在细胞的代谢中转化成铵。例子包括氯化铵、硝酸铵、硫酸铵、氢氧化铵、磷酸铵、碳酸铵等。在一个优选的实施方案中，所述培养基中的铵浓度为0.05-5 g/l，更优选0.1-3 g/l，最优选0.5-3 g/l。根据本发明，优选的是，通过将足量的相应化合物加入水相中，给所述细胞提供无机氮源。
在一个优选的实施方案中，所述细胞包括除了重组丙氨酸脱氢酶以外的至少一种其它重组酶。在一个优选的实施方案中，这是将NAD(P)+ 还原为NAD(P)H的酶，例如CYP153家族或AlkBGT家族的细胞色素P450单加氧酶的单加氧酶，或醇脱氢酶。因此，特别有利的是，使用这样的系统：其中NAD(P)+还原酶和氨基酸脱氢酶转化相同的氧化还原辅因子，优选NAD(H)或NADP(H)。NADP依赖性的丙氨酸脱氢酶包括得自荚膜红杆菌的酶（数据库代码ADE84249.1）及其变体。NAD依赖性的丙氨酸脱氢酶包括得自枯草芽孢杆菌枯草亚种168菌株（Bacillus subtilis subsp. subtilis strain 168）的丙氨酸脱氢酶（数据库代码NP_391071）及其变体。
在一个特别优选的实施方案中，所述单加氧酶是来自AlkB家族的单加氧酶。AlkB是得自恶臭假单胞菌的AlkBGT系统的氧化还原酶，已知它的羟化酶活性。该活性依赖于另外2种多肽AlkG和AlkT。AlkT被表征为FAD依赖性的红素氧还蛋白-还原酶，其将电子从NADH转移至AlkG。AlkG是一种红素氧还蛋白，即一种充当AlkB的直接电子供体的含铁的氧化还原蛋白。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述“来自alkB家族的单加氧酶”应当理解为是指与膜相关的烷烃羟化酶。在另一个优选的实施方案中，相同的表述“alkB类型的烷烃羟化酶”应当理解为是指这样的多肽：其与得自恶臭假单胞菌Gpo1的AlkB（数据库代码: CAB54050.1，该数据库代码和在本文件中使用的所有其它数据库代码来自在2011年11月9日可得到的NCBI公开的Genbank蛋白数据库）的序列具有至少75、80、85、90、92、94、96、98或99%的序列同源性，越高越好。在本文中使用的表述“序列”可以表示，多肽的氨基酸序列和/或编码多肽的核酸序列。
在一个特别优选的实施方案中，所述单加氧酶是CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶。在一个优选的实施方案中，表述“CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”应当理解为是指这样的细胞溶质氧化酶：其是3-组分系统的一部分，所述3-组分系统另外包含铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶，所述细胞溶质氧化酶具有烷烃结合位点且能够羟基化烷烃。在一个特别优选的实施方案中，它是这样的酶：其与得自泊库岛食烷菌（Alcanivorax borkumensis）SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶（数据库代码YP_691921）具有至少80%、优选90%、最优选95%或99%序列同一性，或者包含与得自泊库岛食烷菌SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶（数据库代码YP_691921）具有至少80%、优选90%、最优选95%或99%序列同一性的多肽序列且另外具有烷烃羟化酶活性。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述“烷烃羟化酶活性”应当理解为是指，催化烷烃或包含至少5个、优选12个碳质残基的未被取代的直链烷基残基的羟基化的能力。在另一个优选的实施方案中，表述“得自CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”应当理解为是指这样的非膜结合的氧化酶：其包含烷烃、未被取代的直链烷基残基（其包含至少5个、优选12个碳质残基）、或单羟基化的烷烃的结合位点，且其多肽链包含基序LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的“得自CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”是得自泊库岛食烷菌SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶（数据库代码YP_691921）或变体，其优选地具有烷烃羟化酶活性。
在现有技术中描述了来自CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶用于羟基化烷烃的用途，以及用于测定酶活性的酶测定法、表达和纯化方法（Scheps, D., Malca, H.,Hoffmann, B., Nestl, B. M,和Hauer, B. (2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727）。除了要氧化的烷烃或包含至少5个、优选12个碳质残基的未被取代的直链烷基残基以外，构成（umfassend）酶反应的底物包含氧和电子，所述电子以NADH的形式转移至氧化酶，优选地经由其它2种组分：铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶。Scheps等人. (2011)和Roome, P. W.,Jr., Philley, J. C., 和Peterson (1983) J. Biol. Chem. 258, 2593, Roome, P.W.,和Peterson, J. A. (1988), Arch. Biochem. Biophys., 266, 41和Peterson, J. A.,Lorence, M. C., 和Amarneh, B. (1990) J. Biol. Chem, 265, 6066也公开了用于得到功能形式的铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的方法。
通常，选择的细胞是能够通过消耗丙氨酸来生产特别感兴趣的产物的细胞。对于该目的而言特别有利的是，使用重组细胞。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述“重组”应当理解为是指，被称作重组体且被引入“重组细胞”中的核酸分子在自然界中不以该形式存在，而是使用分子生物学或化学合成方法产生的核酸分子，或者称作重组体的细胞包含重组核酸分子或由其编码的多肽，特别是具有丙氨酸脱氢酶活性的多肽。在现有技术中，例如在Sambrook等人. （1989）或Schlegl & Fuchs（2007）中，描述了用于制备重组核酸分子和细胞的常规分子生物学方法。
根据本发明，所述细胞通过消耗来生产特别感兴趣的产物。在一个优选的实施方案中，丙氨酸作为在任意生产阶段的原料对其生产来说是不可缺少的，例如用于生产含丙氨酸的多肽，这不同于用于生产这样的产物：其生产需要碳、氢和氧原子（诸如来自丙氨酸的那些所需要的），但是所述原子同样可以源自其它来源。优选地，合成消耗的或合成可消耗的丙氨酸的量超过采用的细胞能够天然地生产且特别优选地是所述或至少一种限制目标产物的收率的因子的量。
此外，特别有利的是，细胞过表达丙氨酸脱氢酶和/或至少一种其它酶。这可以如下实现：通过向细胞中以转化或类似的方法引入包含编码所述酶的核酸分子的载体，或通过向细胞的基因组成（例如染色体）中掺入编码所述酶的核酸分子。对于大量在生物技术上重要的细胞类型，例如大肠杆菌来说，已知可用于表达或过表达核酸分子的合适方法和载体，例如pET或pGEX类型的载体，和适合用于它们表达的细胞（Moffatt & Studier (1986),Rosenberg等人. (1987)和Studier等人. (1990)）。
本发明的教导不仅可以如下实现：使用或应用于本文描述的生物大分子（例如丙氨酸脱氢酶）的精确氨基酸或核酸序列，例如通过敲除编码酶的基因，所述酶催化β氧化反应之一，而且也可以使用或应用于这样的大分子的变体，所述变体可以通过一个或超过一个氨基酸或核酸的删除、添加或置换而得到。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述核酸序列或氨基酸序列的“变体”（其在下文中与表述“同系物”同义地且可互换地使用）应当理解为是指，与对应的原始野生型核酸或氨基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或更高百分比的同源性（这里其含义与同一性相同）的不同核酸或氨基酸序列，其中优选地，除了形成催化活性中心的那些氨基酸以外的氨基酸或者对于结构或折叠必需的氨基酸被删除或置换，或者它们仅被保守地置换，例如用谷氨酸替代天冬氨酸，或用亮氨酸替代缬氨酸。现有技术描述了可以用于计算2个序列的同源性程度的算法，例如Arthur Lesk（2008）, Introduction to bioinformatics, 第3版。在本发明的另一个更优选的实施方案中，优选地除了前述序列同源性以外，氨基酸或核酸序列的变体还具有基本上相同的野生型分子或原始分子的酶活性。例如，酶活性的蛋白酶多肽的变体具有与所述多肽酶相同的或基本上相同的蛋白水解活性，即催化肽键水解的能力。在一个具体实施方案中，术语“基本上相同的酶活性”是指，对野生型多肽的底物的活性明显高于背景活性，和/或与KM和/或kcat值相差小于3个、更优选2个、甚至更优选1个数量级，所述值是野生型多肽对相同底物表现出的值。在另一个优选的实施方案中，表述核酸或氨基酸序列的“变体”包括所述核酸或氨基酸序列的至少一个活性部分/或片段。在另一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述“活性部分”是指这样的氨基酸序列或核酸序列：其小于全长的氨基酸序列，和/或编码小于全长的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列或所述编码的氨基酸序列的长度短于野生型氨基酸序列，基本上具有与野生型多肽或其变体（例如丙氨酸脱氢酶）相同的酶活性。在一个具体实施方案中，表述核酸的“变体”包括这样的核酸：其互补链优选地在严谨条件与野生型核酸结合。杂交反应的严谨性可以由本领域技术人员容易地确定，且通常取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度。一般而言，较长的探针需要较高的杂交温度，而较短的探针在较低的温度就足够了。一般而言，杂交是否发生取决于变性DNA与存在于它的环境中的互补链对合的能力，以及甚至在解链温度以下的能力。在Ausubel等人. 1995中更详细地描述了杂交反应的严谨性和对应的条件。本领域技术人员尤其可以在得自BoehringerMannheim GmbH（德国曼海姆, 1993）的教科书“The DIG System Users Guide for FilterHybridization”中和在Liebl等人（International Journal of SystematicBacteriology 41: 255-260 (1991)）中发现借助于杂交来鉴别DNA序列的信息。在一个优选的实施方案中，所述杂交发生在严谨条件下，换而言之，仅产生杂合体，其中探针（Sonde）和靶序列（即用探针处理的多核苷酸）具有至少70%同一性。已知的是，通过改变缓冲液组成、温度和盐浓度，会影响或决定包括洗涤步骤在内的杂交的严谨性。一般而言，与洗涤步骤相比，杂交反应在相对较低的严谨性下进行（Hybaid Hybridisation Guide, HybaidLimited, Teddington, UK, 1996）。例如，就杂交反应而言，可以采用与5x SSC缓冲液相对应的缓冲液，在50℃至68℃的温度。在这里，探针还可以与这样的多核苷酸杂交：所述多核苷酸与所述探针的序列具有小于70%同一性。这样的杂合体具有更低的稳定性，且通过在严谨条件下洗涤来除去。可以如下实现严谨的洗涤条件，例如，通过将洗涤缓冲液中的盐浓度降低至2x SSC，并任选地随后降低至0.5x SSC（The DIG System User’s Guide forFilter Hybridisation, Boehringer Mannheim, 德国曼海姆, 1995），其中按照递增的优选次序，设定约50℃–68℃、约52℃–68℃、约54℃–68℃、约56℃–68℃、约58℃–68℃、约60℃–68℃、约62℃–68℃、约64℃–68℃、约66℃–68℃的温度。约64℃–68℃或约66℃–68℃的温度范围是优选的。任选地，可以降低盐浓度至与0.2 x SSC或0.1 x SSC相对应的浓度。通过以约1–2℃的步长使杂交温度从50℃逐步增加至68℃，可以分离多核苷酸片段，例如，按照递增的优选次序，所述多核苷酸片段与采用的核酸分子的序列具有至少70%、或至少80%、或至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。关于杂交的其它说明可以在市场上以“试剂盒”的形式得到（例如DIG EasyHyb，其得自Roche Diagnostics GmbH, 德国曼海姆, 目录号1603558）。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述核酸的“变体”包含这样的任意核酸序列：其编码与原始核酸相同的氨基酸序列，或者在遗传密码的简并性范围内编码该氨基酸序列的变体。
根据本发明的方法的步骤c）包括：使水性培养基与疏水有机溶液接触。在本发明的一个优选实施方案中，在本文中使用的表述“使……接触”是指，在没有水性培养基和/或疏水有机溶液不可克服的机械屏障（例如无机膜）干涉下，使水性培养基和有机溶液直接接触。例如，可以在发酵罐中提供水性培养基，并将有机溶液加入相同发酵罐中的培养基中，使得2种液体可以混合。在一个优选的实施方案中，至少部分地通过搅拌、通过引入气体或适用于增加两相之间的接触面积的类似措施来实现所述接触。
在接触过程中，必须注意的是，进行步骤c）足够长的时间，并且两相之间具有足够大的界面面积，使得细胞能够与疏水相充分接触c）。在一个优选的实施方案中，所述接触进行至少10分钟、20分钟、30分钟、60分钟或2小时、4小时、6小时、12小时、18小时或24小时。步骤c）可以在步骤b）开始时立即进行，即在培养过程中实现接触，或它可以在步骤b）之前，即在步骤b）开始之前除去有机溶液，例如通过倾析或离心和萃取而除去水相。
根据本发明的教导的要点是，在好氧条件下进行步骤b）。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的“好氧条件”应当理解为是指，水相与分子氧（例如以大气空气的形式）接触，并且优选地不采取降低水相中的氧浓度的措施，所述措施例如密封反应容器以阻止与含氧环境空气的气体交换。在一个特别优选的实施方案中，将氧（例如以空气的形式）主动地引入水相中，例如通过通气和搅拌。
在有些底物的情况下，分子向全细胞催化剂内部的渗透可以限制期望的物质的生产。在长链烷烃及其衍生物的情况下，优选的是，全细胞催化剂包括alkL多肽。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的“alkL多肽”是这样的多肽：其在230个连续氨基酸的长度范围内，与恶臭假单胞菌AlkL（数据库代码CAB69081）具有至少80%、优选90%、更优选90%序列同一性，且其优选地具有支持长链烷烃输入细胞内部的能力。在另一个实施方案中，在本文中使用的“来自AlkL家族的多肽”是这样的多肽：其位于革兰氏阴性细菌的外膜中，且其具有序列基序DXWAPAXQ(V/A)GXR，其中X是蛋白形成氨基酸，且其优选地另外是恶臭假单胞菌AlkL（数据库代码CAB69081）或其变体。AlkL家族的成员的例子包括恶臭假单胞菌AlkL（数据库代码CAB69081）、水油海杆菌（Marinobacter aquaeolei）VT8（数据库代码YP_957722）、亚历山大海洋柄菌（Oceanicaulis alexandrii）HTCC2633（数据库代码ZP_00953584）、Marinobacter manganoxydans MnI7-9（数据库代码ZP_09158756）、柄杆菌（Caulobactersp.）K31（数据库代码YP_001672217）、食油假单胞菌（Pseudomonas oleovorans）（数据库代码Q00595）及其变体。
根据本发明的方法可以使用常规疏水有机溶剂来实现，所述有机溶剂包含在室温为液体的取代的和未被取代的烷烃、环烷烃、环烯烃、含芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、杂环烷烃、杂环烯烃和含杂芳基化合物。本领域技术人员熟知大量可以用于制备疏水有机溶液的溶剂。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述“疏水的”应当理解为是指，在液体状态和在有液体水相存在下，液体的形成单独液相的性质，所述单独液相与水相清楚地分离。清楚分离的液相可以是连续的液相或乳剂。在另一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述“疏水的”应当理解为是指，化合物的基本上不溶于水的性质。最后，在另一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述“疏水的”应当理解为是指，以此方式提及的化合物具有这样的P值（J. Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Wiley Series in Solution Chemistry的第2卷, John Wiley& Sons, Chichester, 1997）：其十进位对数大于0，更优选地大于0.5，甚至更优选地大于1，最优选地大于2。优选的有机溶剂包括、但不限于选自下述的溶剂：在室温为液体的取代的和未被取代的烷烃、环烷烃、环烯烃、含芳基化合物、脂肪酸、脂肪酸酯、醇、杂环烷烃、杂环烯烃和含杂芳基化合物。所述疏水有机溶液也可以是包含超过一种疏水有机溶剂的混合物。其本身不是液体的疏水有机溶剂也是合适的，只要它们是其全部都为液体的溶剂混合物的一部分，则其全部成为液体。
在某些情况下必须考虑到的是，大量溶剂对代谢活性细胞具有或多或少的毒性效应。因此，如果所述细胞要保留它的代谢活性至少一段时间，那么必须使用合适的适度毒性或无毒性浓度的疏水有机溶剂。在一个特别优选的实施方案中，所述溶剂是具有至少8个、优选至少12个碳原子的饱和或不饱和脂肪酸，例如月桂酸、油酸或芥酸或它们的甲酯。在另一个优选的实施方案中，所述溶剂是式CH3–(CH2)x–COOH的脂肪酸，其中x可以是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或更大。在另一个优选的实施方案中，它是具有一个双键（特别优选地在9位）的不饱和脂肪酸，特别优选油酸。在另一个特别优选的实施方案中，所述溶剂是己酸。
如果要在有机相存在下在好氧条件下长时间培养细胞，推荐使用生物相容的疏水溶剂的有机相。优选地，饱和脂肪酸的甲酯与不饱和脂肪酸的混合物，特别是月桂酸甲酯和油酸的混合物，适合用作这样的相。在该情况下，体积比，或者在使用至少一种其纯形式为固体的脂肪酸的情况下的重量比，优选地是20:80至80:20，特别优选30:70至70:30，最优选40:60至60:40。
疏水有机溶液的体积应当使得，所述有机相可以容易地分离并在一个优选的实施方案中，它占水性培养基和疏水有机溶液的总体积的2-98%，更优选5-95%，甚至更优选10-40%，最优选20-30%。本领域技术人员熟知大量用于从水相中分离出有机相的方法，例如倾析、借助于分液漏斗除去、离心等。
所述方法可以用于首先氧化脂肪酸或它们的酯，随后将产物胺化。适用于该目的的例如是，在国际专利申请WO 2009/077461中描述的酶系统。在该情况下，所述代谢活性细胞是这样的细胞：其包括重组烷烃羟化酶和转氨酶，且优选地另外包括至少一种选自醇脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和内酰胺水解酶的酶。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述“转氨酶”应当理解为是指这样的酶：其催化α-氨基从供体分子（优选地是氨基酸）转移至受体分子。例如，可以使用得自青紫色素杆菌ATCC 12472的转氨酶（数据库代码NP_901695）及其变体。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述“内酰胺水解酶”应当理解为是指这样的酶：其催化相同分子的羧基与胺基的分子内缩合。在EP11004029中描述了示例性系统和合适的酶。
除了单加氧酶以外，或者作为单加氧酶的替代，适用于根据本发明的方法的细胞还可以具有醇脱氢酶。在一个优选的实施方案中，在本文中使用的表述“醇脱氢酶”应当理解为是指这样的酶：其将醛或酮分别氧化成对应的伯醇或叔醇。例子包括得自富养产碱菌（Ralstonia eutropha）（ACB78191.1）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）（YP_795183.1）、高加索酸奶乳杆菌（Lactobacillus kefiri）（ACF95832.1）、马肝、泛养副球菌（Paracoccus pantotrophus）（ACB78182.1）和矢野口鞘氨醇杆菌（Sphingobium yanoikuyae）（EU427523.1）的醇脱氢酶和它们各自的变体。
附图说明和具体实施方式
图1对比显示了4个大肠杆菌菌株的丙氨酸生产，所述菌株的差别在于，2个菌株在有和没有有机相存在下表达AlkL，如实施例1所述。
下述附图和非限制性实施例进一步解释了本发明，从所述附图和实施例可以看出本发明的其它特征、实施方案、方面和优点。
实施例：与在有和没有有机相存在下相比，具有或没有AlkL表达的大肠杆菌全细胞催化剂的丙氨酸生产
已经在得自DASGIP的具有8个生物反应器的并联发酵系统中，在本发明的特定条件下使用菌株W3110 [alaDH_Bs]和W3110 [alaDH_Bs-TA-alkL]研究了增加的丙氨酸生产。W3110 [alaDH_Bs]是包含基于pJ294的质粒的大肠杆菌菌株W3110，所述质粒最初来自DNA2.0，含有枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶基因。W3110 [alaDH_Bs-TA-alkL]是包含基于pJ281的质粒和另一个基于pJ294的质粒的菌株，所述基于pJ281的质粒最初也来自DNA2.0，含有上述的丙氨酸脱氢酶和转氨酶的基因，所述基于pJ294的质粒含有描述的孔蛋白alkL（PCT/EP2011/053834, DE102011110945）的基因。
使用1 l反应器进行发酵。使用pH 4.0和pH 7.0的标准溶液，借助于两点校准来校准pH探头。给反应器装入300 ml饮用水，并在121℃高压灭菌20 min以确保无菌度。此后，在DASGIP系统中将pO2探头极化过夜（至少6 h）。在第二天早晨，在洁净台中取出水，并用300ml补充了100 mg/l氨苄西林的高细胞密度培养基替换。此后，用单点校准来校准pO2探头（搅拌器：400 rpm /通气: 10 sl/h空气），并借助于原位清洁技术来清洁补料路径、调节剂路径和诱导物路径。为此目的，用70% 乙醇、然后用1 M NaOH、再用无菌的完全脱矿质水冲洗所述管道，最后装入各种培养基。
从各种冷冻培养物开始，首先在补充了100 mg/l氨苄西林的LB培养基（25 ml，在100 ml带有挡板的烧瓶中）中在37℃和200 rpm培养生产丙氨酸的大肠杆菌菌株过夜（大约18 h）。此后，在每种情况下，将2 ml培养物接种进补充了100 mg/l氨苄西林的高细胞密度培养基（葡萄糖15 g/l (30 ml/l的单独高压灭菌的500 g/l储备溶液，其补充了1% MgSO4*7H2O和2.2% NH4Cl), (NH4)2SO4 1.76 g/l, K2HPO4 19.08 g/l, KH2PO4 12.5 g/l, 酵母浸出物6.66 g/l, 二水合柠檬酸三钠2.24 g/l, 柠檬酸铁铵溶液17 ml/l的单独高压灭菌的1% 储备溶液, 痕量元素溶液5 ml/l的单独高压灭菌的储备溶液(HCl (37%) 36.50 g/l,MnCl2*4H2O 1.91 g/l, ZnSO4*7H2O 1.87 g/l, 二水合乙二胺四乙酸0.84 g/l, H3BO3 0.30 g/l. Na2MoO4*2H2O 0.25 g/l, CaCl2*2H2O 4.70 g/l, FeSO4*7H2O 17.80 g/l,CuCl2*2H2O 0.15 g/l)）（每个菌株25 ml，在100 ml带有挡板的烧瓶中）中，并在37℃/200rpm培养另外5.5 h。
测定培养物在600 nm的光密度。为了以0.1的光密度接种反应器，在无菌条件下将适当量的预培养物吸入5 ml注射器中，并借助于插管通过用70%乙醇覆盖的隔膜给反应器接种。
使用下述的标准程序：
进行的实验可以分成2个阶段，即生长期（在这期间，要使细胞达到某种光密度）和随后的丙氨酸生产期，在这期间，在加入由25% （w/w）月桂酸甲酯和75% （w/w）油酸组成的有机相以后，由在表达过程中形成的酶生产丙氨酸。使用不含有机相的对应实验作为对照。使用氨（12.5%），单向地调节pH值至pH 6.8。在生长期和生物转化期中，通过搅拌器速度和通气速率调节培养物中的溶解氧（DO, 溶解氧）在30%。
进行补料分批发酵，其中由DO峰触发补料开始，即5 g/lh葡萄糖补料（500 g/l葡萄糖，补充了1% MgSO4*7H2O和2.2% NH4Cl）。在补料开始时，温度也从以前的37℃下降至30℃。在补料开始以后2 h，通过自动加入IPTG（终浓度1 mM）来诱导丙氨酸脱氢酶（和其它重组引入的蛋白）的表达。在由有机相诱导的丙氨酸生产开始之前，测定培养液的光密度。
在补料开始以后14 h，开始生产丙氨酸。为此目的，将150 ml月桂酸甲酯和油酸（工业级纯度，90%）的混合物作为一批加入发酵液中。为了具有足够的铵离子可用于生产丙氨酸，在加入有机物之前半小时，将5 ml 3 M硫酸铵溶液加入发酵液中。就取样而言，从反应器中取出2 ml发酵液，并立即与淬灭溶液（40% (v/v) 乙醇; 0.8% (w/v) NaCl;-20℃）混合。此后，将样品在0℃/5100 rpm离心10 min。抛弃上清液，将细胞沉淀物（Pellet）再悬浮于2 ml甲醇中（-20℃）。借助于这些样品，测定细胞内的丙氨酸浓度。
在用邻酞醛衍生化以后，借助于HPLC/UV测量来测定丙氨酸。测量甲醇上清液。最重要的色谱参数收录在下文表格中。
柱 Luna 5u C8, 100 A, 150 X 4.60 mm, Phenomenex
HPLC装置 Agilent 1200
流动相（Laufmittle）A 每1 l双蒸馏水2.5 ml醋酸（100%），用氢氧化钠溶液调节pH至pH 6.0
流动相B 甲醇
柱温度 40℃
流速 1 ml/min
梯度 0.0-1 min: 30.0% B, 1.0-17.0 min: 90.0% B, 17-19.5 min: 90.0% B, 19.6-20.5 min:30.0% B
检测器 DAD, 334 nm
衍生化/注射体积 借助于注射器程序自动化衍生化，使1µl样品与9µl衍生化试剂反应；衍生化试剂的组成：将10g/l邻酞醛溶解在硼酸盐缓冲液（0.4 mol/l）中，加入巯基乙醇（5 ml/l）和甲醇（100 ml/l）
校准 外部校准，测量范围50-2000 mg/l，5-点校准，在样品系列之前和之后校准，在2个校准系列中取平均值，二次回归
在加入有机物之前15分钟和加入有机物之后2 h、3.5 h、20.5 h和22.5 h，从所有反应器中取出样品。通过在DASGIP系统处的尾气分析，确定发酵过程中氧的转化率（OTR =氧转化率）和碳的转化率（CTR = 二氧化碳转化率）。在生物转化开始以后23 h，终止发酵。停止搅拌器、通气装置、温度控制和pH控制，将反应器静置5-10分钟。
结果：
在加入有机相以后，在两个研究案例中揭示了使用的细胞中的丙氨酸浓度的显著增加，有或没有AlkL表达。在没有加入有机物的对比实验中，分别测得显著更低的丙氨酸浓度，并且这些浓度没有表现出增加的趋势（参见图1）。

Claims (34)

1.用于生产丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的方法，所述方法包括：
a)提供表达重组丙氨酸脱氢酶的细胞，
b)在有无机氮源存在下，在好氧条件下，在水相中培养所述细胞，和
c)使所述细胞与有机相接触，
其中所述细胞是原核细胞或低等真核细胞，和其中所述有机相包含疏水脂肪酸和疏水脂肪酸酯。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞包括：一种核酸，所述核酸包含编码alkL多肽的序列，和/或所述alkL多肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述alkL多肽是异源的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机相包含至少一种选自下述的疏水溶剂：未被取代的、被取代的、支链的和非支链的烷烃、环烷烃、含芳基化合物、含杂芳基化合物、二烷基醚、脂肪醇、甘油三酯和卤代烃。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水脂肪酸是不饱和脂肪酸。
6.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述细胞包括异源转氨酶，所述转氨酶识别丙氨酸作为底物，且所述转氨酶选自：得自青紫色素杆菌ATCC 12472的ω-转氨酶。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞除了包括异源转氨酶以外，还包括一种或超过一种单加氧酶，所述单加氧酶单独地或依次地催化脂肪酸或脂肪酸酯的氧化，以生成ω-氧代-脂肪酸或ω-氧代-脂肪酸酯。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述一种或超过一种单加氧酶是异源的，且选自：来自AlkB家族的单加氧酶和来自CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶。
9.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述细胞是细菌细胞。
10.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中步骤c)进行至少60分钟。
11.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述水相包含小于10mM的丙氨酸。
12.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述有机相占水相和有机相的总体积的至少5体积％。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞包括：一种核酸，所述核酸包含恶臭假单胞菌AlkL。
14.根据权利要求2所述的方法，其中所述alkL多肽过表达。
15.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述有机相包含月桂酸甲酯。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水脂肪酸是油酸。
17.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述细胞是大肠杆菌。
18.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述水相包含小于5mM的丙氨酸。
19.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述水相包含小于1mM的丙氨酸。
20.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述有机相占水相和有机相的总体积的超过20体积％。
21.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述细胞以至少0.5的光密度存在于水溶液中。
22.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述细胞以至少1的光密度存在于水溶液中。
23.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述细胞以至少5的光密度存在于水溶液中。
24.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述细胞以至少10的光密度存在于水溶液中。
25.根据权利要求1-3中之一所述的方法，其中所述丙氨酸脱氢酶是得自枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶。
26.表达异源丙氨酸脱氢酶的细胞用于在有机相存在下在好氧条件下生产丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的用途，其中所述细胞是原核细胞或低等真核细胞，且其中所述有机相包含疏水脂肪酸酯和疏水脂肪酸。
27.根据权利要求26所述的用途，其中所述有机相包含月桂酸甲酯和油酸。
28.有机相用于增加丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的收率的用途，其中包括，使生产丙氨酸或消耗丙氨酸所产生的化合物的原核细胞或低等真核细胞与所述有机相接触，其中所述有机相包含疏水脂肪酸酯和疏水脂肪酸。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述有机相包含月桂酸甲酯和油酸。
30.根据权利要求26-29中之一所述的用途，其中所述细胞以至少0.5的光密度存在于水溶液中。
31.根据权利要求26-29中之一所述的用途，其中所述细胞以至少1的光密度存在于水溶液中。
32.根据权利要求26-29中之一所述的用途，其中所述细胞以至少5的光密度存在于水溶液中。
33.根据权利要求26-29中之一所述的用途，其中所述细胞以至少10的光密度存在于水溶液中。
34.根据权利要求26-29中之一所述的用途，其中所述丙氨酸脱氢酶是得自枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶。
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