BR112013020912B1 - Processo para remoção de um composto orgânico de uma solução aquosa, e mistura de reação - Google Patents

Abstract

processo para a remoção de um composto orgânico de uma solução aquosa e mistura de reação compreendendo uma solução aquosa e uma solução orgânica hidrófoba. a presente invenção refere-se a um processo para a remoção de um composto orgânico que apresenta uma ou mais cargas positivas de uma solução aquosa, compreendendo as etapas: a) preparação da solução aquosa contendo o composto orgânico e uma solução orgânica hidrófoba, que compreende um trocador de cátion líquido, em que o trocador de cátion líquido é hidrófobo, e em que o trocador de cátion líquido possui uma ou mais cargas negativas e uma carga total negativa, b ) pôr a solução aquosa em contato com a solução orgânica, e c) separação da solução orgânica da solução aquosa.

Description

[0001] A presente invenção se refere a um processo para aremoção de um composto orgânico que apresenta uma ou mais cargas positivas de uma solução aquosa, compreendendo as etapas: (a) preparação da solução aquosa contendo o composto orgânico e uma solução orgânica hidrófoba, que compreende um trocador de cátion líquido, sendo que o trocador de cátion líquido é hidrófobo, (b) pôr a solução aquosa em contato com a solução orgânica e (c) separação da solução orgânica da solução aquosa, sendo que no caso do composto orgânico se trata de um composto da fórmula NH3+- A-COOR1, bem como misturas de reação relacionadas.

[0002] Um problema fundamental na produção biotecnológica deprodutos químicos finos partindo de matérias-primas renováveis, que tradicionalmente são sintetizados partindo de combustíveis fósseis, consiste em converter o produto uma vez obtido, que está tipicamente presente em uma fase aquosa de grande volume, em uma fase orgânica. Essa conversão é efetuada, por um lado, para concentrar um produto intermediário ou final pronto e para permitir, opcionalmente, o processamento sintético em etapas de reação subsequentes em solução orgânica, por outro lado, para melhorar o rendimento da reação em fase aquosa através da remoção do produto desejado ou, de todo, permitir primeiramente o decurso da reação em um âmbito tecnicamente adequado. A concentração térmica direta do produto frequentemente presente em baixas concentrações da solução aquosa em grande volume, via de regra, não é adequada.

[0003] A distribuição de um composto em um sistema bifásicocompreende uma fase hidrófila, aquosa e uma fase hidrófoba, orgânica, que não se misturam, depende de forma significativa das propriedades físico-químicas do respectivo composto. Enquanto compostos com uma proporção elevada de hidrocarbonetos ou que consiste exclusivamente em hidrocarbonetos não substituídos se enriquecem preponderantemente na fase hidrófoba, o composto com uma proporção elevada de grupos polares, tais como funcionalidades contendo heteroátomos e de modo muito particular, compostos com cargas estão preponderantemente ou praticamente exclusivamente presentes na fase aquosa, o que dificulta uma conversão em uma fase orgânica.

[0004] A distribuição de um composto no sistema bifásicomencionado depois de ajustar o equilíbrio, é frequentemente descrita com auxílio de coeficientes de distribuição, por exemplo, de acordo com a equação de Nernstα = cfase 1/Cfase 2.

[0005] Um coeficiente de distribuição especial é Kow, tambémdesignado como valor P, que caracteriza o equilíbrio de distribuição de um composto entre uma fase de octanol e uma fase aquosa:Kow = P = Coctanol/Cágua

[0006] Um exemplo de um composto orgânico carregadopositivamente, industrialmente muito procurado representa o ácido 12- aminoláurico (ALS) e seus derivados, em particular, o éster metílico (ALSME). ALS é um produto de partida importante na produção de polímeros, por exemplo, para a preparação de sistemas de tubulações e nylon. Tradicionalmente, ALS é produzido partindo de matérias- primas fósseis em um processo com baixo rendimento através de laurinlactama, que é sintetizado através da trimerização de butadieno, subsequente hidrogenação com formação de ciclododecano, subsequente oxidação para ciclododecanona, reação com hidroxilaurina e subsequente rearranjo molecular de Beckmann. Um caminho promissor para a produção biotecnológica de ALS ou ALSME é descrito na DE 10200710060705.

[0007] O estado da técnica ensina a obtenção de compostosorgânicos carregados positivamente através do contato de uma mistura de reação aquosa compreendendo um agente biológico com uma fase orgânica compreendendo um solvente orgânico. Assim, a DE10200710060705 descreve, por exemplo, a obtenção do produto ALSME a partir de uma mistura de reação aquosa através de agitação com éster etílico de ácido acético. Asano e colaboradores (2008) publicam a extração de ALS com tolueno a partir de uma solução de reação aquosa compreendendo uma enzima que sintetiza ALS.

[0008] Por conseguinte, o objetivo que serve de base à presenteinvenção é desenvolver um processo para a remoção de compostos orgânicos carregados positivamente, particularmente ácidos w- aminocarboxílicos, com pelo menos uma carga positiva de uma mistura de reação aquosa, sendo desejada uma carga a mais vantajosa possível do equilíbrio de distribuição entre a mistura de reação e uma fase orgânica hidrófoba usada como agente de extração, isto é, o equilíbrio de distribuição deve, tanto quanto possível, estar do lado da fase orgânica hidrófoba.

[0009] Um outro objetivo que serve de base à invenção consisteem desenvolver um processo para a remoção de compostos orgânicos com pelo menos uma carga positiva, particularmente ácidos w- aminocarboxílicos, de uma solução aquosa compreendendo um agente biológico usando uma fase orgânica hidrófoba como agente de extração, no qual o equilíbrio de distribuição está, tanto quanto possível, do lado da fase orgânica hidrófoba.

[00010] Um outro objetivo que serve de base à invenção consiste em desenvolver um processo para a remoção de compostos orgânicos com pelo menos uma carga positiva, particularmente ácidos w- aminocarboxílicos, de uma solução aquosa usando uma solução orgânica hidrófoba como agente de extração, que prejudica o menos possível ou retarda o crescimento de micro-organismos biotecnologicamente relevantes, em particular, Escherichia coli e/ou nesse caso, reduz o menos possível o número de células capazes de divisão e/ou viáveis e/ou respiratoriamente ativas e/ou metabolicamente e sinteticamente ativas.

[00011] Finalmente, o objetivo que serve de base à invenção é descobrir um processo para a remoção de um composto orgânico com pelo menos uma carga positiva, particularmente ácidos w- aminocarboxílicos, de uma solução aquosa compreendendo um agente biológico usando uma fase orgânica hidrófoba como agente de extração, no qual a totalidade das propriedades decisivas para o rendimento, a conversão total e rápida viabilidade de um processo de síntese biotecnológico que serve de base, em particular, a toxicidade da fase orgânica em relação ao agente biológico e a absorção do composto no agente de extração orgânico, com respeito ao rendimento total ou um decurso mais rápido ou, no caso de um processo contínuo, é otimizada uma vida útil máxima do agente biológico, particularmente no caso, em que o composto orgânico com pelo menos uma carga positiva representa o produto ou um produto intermediário do processo de síntese, que é sintetizado com a participação de uma atividade catalítica do agente biológico.

[00012] Esse e outros objetivos são resolvidos pelo objetivo dopresente pedido e, em particular, também pelo objetivo das reivindicações independentes anexas, sendo que as formas de concretização resultam das sub-reivindicações.

[00013] O objetivo que serve de base à invenção é resolvido em um primeiro aspecto por um processo para a remoção de um composto orgânico que apresenta uma ou mais cargas positivas de uma solução aquosa, compreendendo as etapas (a) preparação da solução aquosa contendo o composto orgânico e de uma solução orgânica hidrófoba, que compreende um trocador de cátion líquido,sendo que o trocador de cátion líquido é hidrófobo,(b) pôr em contato a solução aquosa com a solução orgânica, e(c) separação da solução orgânica da solução aquosa, sendo que no caso do composto orgânico se trata de um composto da Fórmula INH3+-A-COOR1 (I),em que R1 é hidrogênio, metila, etila ou uma carga negativa e A é um gruo alquileno de cadeia linear, não substituído com pelo menos três, preferencialmente com pelo menos oito átomos de carbonoe sendo que no caso do trocador de cátion líquido, se trata de um ácido graxo.

[00014] Em uma primeira forma de concretização do primeiro aspecto, o problema é resolvido por um processo de acordo com uma das reivindicações 1, sendo que a temperatura na etapa (b) importa em 28 a 70, preferencialmente 30 a 37oC.

[00015] Em uma segunda forma de concretização, que é também uma forma de concretização da primeira forma de concretização do primeiro aspecto, o problema é resolvido por um processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 2, sendo que o valor de pH na etapa (b) importa em 6 a 8, preferencialmente 6,2 a 7,2.

[00016] Em uma terceira forma de concretização, que é também uma forma de concretização da primeira até a segunda forma de concretização do primeiro aspecto, o problema é resolvido por um processo, em que a razão de quantidade de material do trocador de cátion líquido para composto orgânico importa em pelo menos 1.

[00017] Em uma terceira forma de concretização, que é também uma forma de concretização da primeira até a terceira forma de concretização do primeiro aspecto, o problema é resolvido por um processo, em que a razão volumétrica da solução orgânica para a solução aquosa importa em 1:10 a 10:1.

[00018] Em uma quarta forma de concretização, que é também uma forma de concretização da primeira até a terceira forma de concretização do primeiro aspecto, o problema é resolvido por um processo, em que o trocador de cátion líquido é um ácido graxo com mais de 12, preferencialmente com 14 a 22, ainda mais preferencialmente, 16 a 18 átomos de carbono.

[00019] Em uma quinta forma de concretização, que é também uma forma de concretização da primeira até a quarta forma de concretização do primeiro aspecto, o problema é resolvido por um processo, em que o trocador de cátion líquido é um ácido graxo insaturado, preferencialmente ácido oleico ou ácido erúcico.

[00020] Em uma sexta forma de concretização, que é também uma forma de concretização da primeira até a quinta forma de concretização do primeiro aspecto, o problema é resolvido por um processo, em que a solução aquosa compreende, além disso, um agente biológico com atividade catalítica.

[00021] Em uma sétima forma de concretização, que é tambémuma forma de concretização da primeira até a sexta forma de concretização do primeiro aspecto, o problema é resolvido por um processo, em que o agente biológico apresenta uma célula, preferencialmente uma célula bacteriana e a célula de forma ainda mais preferida, é uma alcanomono-oxigenase recombinante, uma transaminase recombinante, bem como preferencialmente, além disso, pelo menos uma enzima do grupo, que compreende uma desidrogenase de álcool, uma desidrogenase de alanina e o produto gênica AlkL ou variantes desse.

[00022] Em uma oitava forma de concretização, que é também uma forma de concretização da primeira até a sétima forma de concretização do primeiro aspecto, o problema é resolvido por um processo, em que a presença do composto orgânico age de forma desvantajosa sobre a atividade catalítica, preferencialmente pelo fato, de que no caso do composto orgânico se trata de um composto tóxico para a célula.

[00023] Em uma nona forma de concretização, que é também uma forma de concretização da primeira até a oitava forma de concretização do primeiro aspecto, o problema é resolvido por um processo, em que a solução orgânica contém, além disso, pelo menos um solvente orgânico, preferencialmente um ácido graxo e/ou um éster de ácido graxo.

[00024] Em uma décima forma de concretização, que é também uma forma de concretização da primeira até a nona forma de concretização do primeiro aspecto, o problema é resolvido por um processo de acordo com a reivindicação 12, em que a solução orgânica compreende como trocador de cátion líquido, 20 a 80% em volume, preferencialmente 25 a 75% em volume, de ácido oleico e como solvente, éster metílico de ácido láurico e no caso do composto orgânico trata-se de éster metílico de ácido 12-aminoláurico e na solução aquosa está presente uma célula bacteriana, que apresenta uma alcanomono-oxigenase recombinante, uma transaminase recombinante, bem como preferencialmente, além disso, pelo menos uma enzima do grupo, que compreende uma desidrogenase de álcool, uma desidrogenase de alanina e o produto gênico AlkL ou suas variantes.

[00025] Em um segundo aspecto, o problema que serve de base à invenção é resolvido por uma mistura de reação compreendendo uma solução aquosa e uma solução orgânica hidrófoba,em que a solução orgânica hidrófoba compreende um ácido graxo, mais preferencialmente um ácido graxo com mais de 12 átomos de carbono, ainda mais preferencialmente um ácido graxo insaturado como trocador de cátion líquidoe em que no caso da solução aquosa se trata de um composto da Fórmula (I)NH3+-A-COOR1 (I)em que R1 é hidrogênio, metila, etila ou uma carga negativa e A é um grupo alquileno de cadeia linear, não substituído com pelo menos três, preferencialmente pelo menos oito átomos de carbono.

[00026] Em uma forma de concretização do segundo aspecto, o problema que serve de base à invenção é resolvido por uma mistura de reação de acordo com o primeiro aspecto, em que a solução aquosa compreende, além disso, uma célula, que apresenta uma alcanomono-oxigenase recombinante, uma transaminaserecombinante, bem como preferencialmente, além disso, pelo menos uma enzima do grupo, que compreende uma desidrogenase de álcool, uma desidrogenase de alanina e o produto gênico AlkL ou suas variantes.

[00027] Outras formas de concretização do segundo aspecto compreendem todas as formas de concretização do primeiro aspecto.

[00028] O objetivo que serve de base à invenção é resolvido em um quarto aspecto por um processo para a remoção de um composto orgânico, que apresenta uma ou mais cargas positivas, de uma solução, compreendendo as etapas:(a) preparação da solução aquosa contendo o composto orgânico e uma solução orgânica hidrófoba, que compreende um trocador de cátion líquido, sendo que o trocador de cátion líquido é hidrófobo e sendo que o trocador de cátion líquido apresenta uma ou mais cargas negativas e uma carga negativa total,(b) pôr em contato a solução aquosa com a solução orgânica, e(c) separação da solução orgânica da solução aquosa.

[00029] Em uma segunda forma de concretização do quarto aspecto da presente invenção, que representa também uma forma de concretização da primeira forma de concretização da presente invenção, o processo compreende a etapa:(d) processamento da solução orgânica, preferencialmente através de re-extração do composto orgânico em uma outra solução aquosa.

[00030] Em uma terceira forma de concretização do quarto aspecto da presente invenção, que representa também uma forma de concretização da primeira até a segunda forma de concretização da presente invenção, a temperatura na etapa (b) do processo de acordo com a invenção importa em 28 a 70oC, preferencialmente 30 a 37oC.

[00031] Em uma quarta forma de concretização do quarto aspecto da presente invenção, que representa também uma forma deconcretização da primeira até a terceira forma de concretização da presente invenção, o valor de pH na etapa (b) do processo de acordo com a invenção importa em 3 a 8, preferencialmente 6 a 8, de modo particularmente preferido, 6,2 a 7,2.

[00032] Em uma quinta forma de concretização do quarto aspecto da presente invenção, que representa também uma forma de concretização da primeira até a quarta forma de concretização da presente invenção, a razão da quantidade de material do trocador de cátion líquido para composto orgânico no processo importa em pelo menos 1.

[00033] Em uma sexta forma de concretização do quarto aspecto da presente invenção, que representa também uma forma de concretização da primeira até a quinta forma de concretização da presente invenção, a razão volumétrica da solução orgânica para a solução aquosa importa em 1:10 a 10:1.

[00034] Em uma sétima forma de concretização do quarto aspecto da presente invenção, que representa também uma forma de concretização da primeira até a sexta forma de concretização da presente invenção, o composto orgânico apresenta pelo menos um substituinte carregado positivamente da Fórmula (I)-N+R2R3R4 (I)ou, desde que pelo menos um substituinte do grupo compreendendo R2, R3 e R4 seja hidrogênio, apresenta a forma não protonizada desse,em que R2, R3 e R4 independentemente, são selecionados do grupo compreendendo hidrogênio, metila, etila, propila, 2-propila, butila, t-butila, pentila, hexila, benzila, hidroxila, alquila ou alquenila substituída ou não substituída e/ou de cadeia linear ou ramificada ou cíclica.

[00035] Em uma oitava forma de concretização do quarto aspecto da presente invenção, que representa também uma forma de concretização da primeira até a sétima forma de concretização da presente invenção, o composto orgânico apresenta a Fórmula (II)Z-A-N+R2R3R4 (II)ou, desde que pelo menos um substituinte do grupo compreendendo R2, R3 e R4 seja hidrogênio, apresenta a forma não protonizada desse,em que R2, R3 e R4 independentemente um do outro são selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, metila, etila, propila, 2-propila, butila, t-butila, pentila, hexila, benzila, hidroxila, alquila ou alquenila substituída ou não substituída e/ou de cadeia linear ou ramificada ou cíclica, em que A representa uma cadeia de hidrocarboneto compreendendo pelo menos três átomos de carbono, preferencialmente um grupo alquenila não substituídoe em que Z é selecionado do grupo, que compreende - COOH, -COOR5, -COH, -CH2OH e formas não protonizadas desse, em que R5 é selecionado do grupo compreendendohidrogênio, metila, etila, propila, 2-propila, butila, t-butila, pentila,hexila, benzila, hidroxila, alquila ou alquenila substituída ou não substituída e/ou de cadeia linear ou ramificada ou cíclica.

[00036] Em uma nona forma de concretização do quarto aspecto da presente invenção, que representa também uma forma deconcretização da primeira até a oitava forma de concretização da presente invenção, o composto orgânico apresenta a Fórmula III NH3+-A-COOR1 (III), ou uma forma não protonizada desse, em que R1 é hidrogênio, metila ou etila e A é um grupo alquileno de cadeia linear não substituído com pelo menos três átomos de carbono.

[00037] Em uma décima forma de concretização do quarto aspecto da presente invenção, que representa também uma forma de concretização da primeira até a nona forma de concretização da presente invenção, o trocador de cátion líquido apresenta pelo menos um grupo alquila ou alquenila com pelo menos seis átomos de carbono, bem como um substituinte em posição terminal do grupo, que compreende -COOH, -OSO2H, -OPO(OH)2- e -OPO(OH)O- e formas não protonizadas desse.

[00038] Em uma décima primeira forma de concretização do quarto aspecto da presente invenção, que representa também uma forma de concretização da primeira até a décima forma de concretização da presente invenção, o trocador de cátion líquido é um ácido graxo insaturado, preferencialmente ácido oleico.

[00039] Em uma décima segunda forma de concretização do quarto aspecto da presente invenção, que representa também uma forma de concretização da primeira até a décima-primeira forma de concretização da presente invenção, a solução aquosa compreende, além disso, um agente biológico com atividade catalítica.

[00040] Em uma décima terceira forma de concretização do quarto aspecto da presente invenção, que representa também uma forma de concretização da primeira até a décima-segunda forma de concretização da presente invenção, o agente biológico é uma célula, preferencialmente uma célula bacteriana.

[00041] Em uma décima quarta forma de concretização do quarto aspecto da presente invenção, que representa também uma forma de concretização da primeira até a décima-terceira forma de concretização da presente invenção, a presença do composto orgânico age de forma desvantajosa sobre a atividade catalítica.

[00042] Em uma décima quinta forma de concretização do quarto aspecto da presente invenção, que representa também uma forma de concretização da primeira até a décima-quarta forma de concretização da presente invenção, a solução orgânica contém, além disso, pelo menos um solvente orgânico, preferencialmente um ácido graxo e/ou um éster de ácido graxo.

[00043] Em uma décima sexta forma de concretização do quarto aspecto da presente invenção, que representa também uma forma de concretização da primeira até a décima-quinta forma de concretização da presente invenção, a solução orgânica compreende como trocador de cátion líquido, 20 a 80% em volume, preferencialmente 25 a 75% em volume, de ácido oleico e como solvente, éster metílico de ácido láurico e no caso do composto orgânico trata-se de éster metílico de ácido 12-aminoláurico e na solução aquosa está presente uma célula bacteriana, que apresenta uma atividade catalítica participante da síntese do éster metílico de ácido 12-aminoláurico.

[00044] Em um quinto aspecto, o objetivo que serve de base à invenção é resolvido por um biorreator compreendendo uma solução aquosa, compreendendo um agente biológico e uma solução orgânica hidrófoba compreendendo um trocador de cátion líquido. Em uma forma de concretização preferida da presente invenção, entende-se pelo termo "biorreator", tal como usado aqui, qualquer recipiente, no qual os micro-organismos biotecnologicamente úteis podem ser cultivados em condições controladas e/ou pode ser usado um processo biotecnológico, preferencialmente a síntese de um composto orgânico.

[00045] Em uma segunda forma de concretização do quinto aspecto, no caso da qual se trata também de uma forma de concretização da primeira forma de concretização do terceiro aspecto da presente invenção, o trocador de cátion líquido é um ácido graxo, preferencialmente ácido oleico.

[00046] Em uma terceira forma de concretização do quinto aspecto, no caso da qual se trata também de uma forma de concretização da primeira até a segunda forma de concretização do terceiro aspecto da presente invenção, a solução orgânica hidrófoba compreende, além disso, um éster de ácido graxo, preferencialmente de éster metílico de ácido láurico.

[00047] Em uma quarta forma de concretização do quinto aspecto, no caso da qual se trata também de uma forma de concretização da primeira até a terceira forma de concretização do segundo aspecto da presente invenção, a solução orgânica hidrófoba compreende como trocador de cátion líquido o ácido oleico e como solvente, 25 a 75% em volume, de éster metílico de ácido láurico.

[00048] Em uma quinta forma de concretização, no caso da qual se trata também de uma forma de concretização da primeira até a quarta forma de concretização do quinto aspecto da presente invenção, trata- se no caso do composto orgânico, de um composto de acordo com uma das formas de concretização do primeiro aspecto da invenção.

[00049] Em um sexto aspecto, o objetivo que serve de base à presente invenção é resolvido por um processo para a preparação de um composto orgânico com uma ou mais cargas positivas, em que o composto orgânico é tóxico para células, compreendendo o cultivo em uma solução aquosa de células participantes da síntese do composto orgânico, preferencialmente células, que catalisam pelo menos uma etapa da síntese, na presença de uma solução orgânica hidrófoba compreendendo um trocador de cátion líquido e opcionalmente um solvente orgânico.

[00050] Em uma segunda forma de concretização do sexto aspecto da presente invenção, no caso do composto orgânico trata-se de ácido 12-aminoláurico ou de éster metílico de ácido 12-aminoláurico, no caso do solvente orgânico, de éster metílico de ácido láurico.

[00051] Outras formas de concretização do quarto, quinto e sexto aspecto, compreendem todas as formas de concretização do primeiro e segundo aspecto da presente invenção.

[00052] Os inventores da presente invenção verificaram, que a eficiência da remoção de um composto orgânico com uma ou mais cargas positivas de uma solução aquosa para uma solução orgânica hidrófoba pode ser surpreendentemente aumentada, quando essa solução orgânica compreende um trocador de cátion líquido. Sem querer estar ligado a qualquer teoria, os inventores da presente invenção presumem, que a carga negativa ou as cargas negativas do trocador de cátion líquido interage/interagem ionicamente com uma carga positiva ou com as várias cargas positivas dos compostos orgânicos e que essa interação leva a uma mascaração de pelo menos um carga positiva, que aumenta a solubilidade na fase orgânica.

[00053] Em uma forma de concretização preferida, o termo"trocador de cátion líquido", tal como usado aqui, significa um composto solúvel em um solvente orgânico hidrófobo, que, devido a uma ou várias cargas negativas permanentes, é capaz de formar um efeito recíproco iônico com pelo menos um cátion. Tipicamente, um trocador de cátion líquido compreende pelo menos uma cadeia de hidrocarbonetos saturada ou insaturada, que pode ser de cadeia linear ou ramificada, bem como um grupo negativo carregado, por exemplo, um grupo carboxila. Em uma forma de concretização preferida, no caso do trocador de íons líquido, trata-se de um ácido graxo, em uma forma de concretização ainda preferida, de um ácido graxo insaturado, por exemplo, de ácido oleico. Em uma forma de concretização preferida, no caso do trocador de íons líquido, trata-se de ácido di(2- etil-hexil)fosfórico (designado também como DEHPA ou D2EHPA).

[00054] Em uma forma de concretização preferida, o trocador de íons líquido apresenta não apenas uma carga total negativa, mas sim, nenhuma carga positiva. Em uma forma de concretização preferida, deve ser entendido pelo termo "carga total" do trocador de íons ou de outra molécula, tal como usado aqui, a soma das cargas de todos os grupos funcionais ligados de forma covalente com a molécula. Por exemplo, o ácido láurico em pH 7 apresenta uma carga negativa como carga total, independente da presença de outras moléculas ou contraíons, tais como íons de potássio, que estão presentes na solução aquosa.

[00055] Em uma forma de concretização preferida da presente invenção, entende-se pelo termo "pôr em contato", tal como usado aqui, que duas fases são diretamente expostas uma à outra e, em particular, sem ligação intermediária de uma barreira física, tal como de uma membrana. O contato é efetuado no caso mais simples pelo fato, de que as duas fases são colocadas no mesmo recipiente e são misturadas uma com a outra de maneira adequada, por exemplo, através de agitação.

[00056] Em uma forma de concretização preferida, o composto orgânico apresenta uma carga positiva total. Em uma outra forma de concretização preferida, o composto orgânico não apresenta cargas negativas. Em uma forma de concretização preferida, no caso do composto orgânico trata-se de um ácido w-aminocarboxílico.

[00057] Em uma forma de concretização preferida, o termo "apresenta uma carga positiva", tal como usado aqui, significa que um composto designado dessa maneira apresenta uma carga correspondente em solução aquosa com pH 0 a 14, preferencialmente 2 a 12, 2 a 6, 8 a 12, 3 a 10, 6 a 8, mais preferencialmente, com pH 7. Em uma forma de concretização preferida, trata-se de uma carga permanentemente presente. Em uma outra forma de concretização preferida, o termo "apresenta uma carga", tal como usado aqui, significa que o grupo ou composto funcional correspondente com pH 7 está preponderantemente presente com a carga correspondente, isto é, em pelo menos 50, mais preferencialmente 90, ainda mais preferencialmente, 99%.

[00058] Em uma forma de concretização preferida da invenção, o termo "contendo" deve ser entendido no sentido de "compreendendo", isto é, não definitivo. Uma mistura contendo A pode apresentar, neste sentido, além de A, outros componentes. A formulação "uma ou mais cargas" significa pelo menos uma carga de natureza correspondente.

[00059] Em uma forma de concretização preferida, entende-se pelo termo "hidrófobo", tal como usado aqui, a propriedade de um líquido, em presença de uma fase aquosa, de formar uma fase líquida própria, claramente limitada pela fase aquosa. No caso da última, pode se tratar de uma fase líquida relacionada ou de uma emulsão. Em uma outra forma de concretização preferida entende-se com o termo "hidrófobo", tal como usado aqui, a propriedade de um composto, de não se dissolver essencialmente em água. Finalmente, o termo em uma outra forma de concretização preferida, tal como usado aqui, é entendido de modo tal, que o composto designado dessa maneira apresenta um valor P (J. Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997), cujo logaritmo decádico é maior de 0, mais preferencialmente, maior de 0,5, ainda mais preferencialmente, maior de 1 e mais preferencialmente, maior de 2.

[00060] Em uma outra forma de concretização da presenteinvenção, o trocador de íons líquido não apresenta ou apresenta apenas um efeito tóxico moderado sobre micro-organismos biotecnologicamente relevantes. Pelo termo "efeito tóxico", tal como usado aqui, entende-se em uma forma de concretização preferida da invenção, a propriedade de um composto, em contato com microorganismos correspondentes, de diminuir sua velocidade de crescimento, diminuir sua velocidade metabólica, aumentar seu consumo de energia, diminuir sua densidade ótica ou número de células capazes de crescer e/ou levar diretamente à sua morte e lise. Em uma outra forma de concretização preferida, pelo menos um desses efeitos em um composto tóxico é obtido já em baixa concentração, preferencialmente em uma concentração de 1000, mais preferencialmente 100, ainda mais preferencialmente 50 ou 25, mais preferencialmente, 5 mg/L. O técnico conhece inúmeros processos que podem ser rotineiramente aplicados, por meio dos quais a toxicidade pode ser pesquisada. Nesses incluem-se, por exemplo, a medição da respiração de micro-organismos correspondentes através de eletrodos de O2 ou o plaqueamento comparável de amostras de micro-organismos e a subsequente contagem das unidades formadoras de colônias (cfus). Em uma forma de concretização preferida, entende-se por um "efeito tóxico moderado", que microorganismos que se encontram em uma fase de crescimento continuam a crescer na presença do composto e/ou são metabolicamente ativos, contudo, em um grau menor do que em um controle, que é incubado nas mesmas condições na ausência do composto correspondente e/ou apresentam uma fase Lag prolongada.

[00061] O contato da solução aquosa e orgânica realiza-se em condições adequadas e, em particular, durante um espaço de tempo, que basta para a passagem do composto orgânico da fase aquosa para a fase orgânica, de maneira ideal, mesmo para o ajuste do equilíbrio correspondente. Esse tempo e condições podem ser determinados pelo técnico no âmbito de experimentações rotineiras.

[00062] Em uma forma de concretização particularmente preferida trata-se, no caso de um composto orgânico que apresenta uma ou mais cargas positivas, de um ácido graxo aminado em posição terminal, de modo particularmente preferido, de ácido 12-aminoláurico ou de um éster desse ou de uma mistura de ambos os compostos. O técnico reconhecerá, que um éster de um ácido graxo na presença de um sistema biológico compreendendo atividades de esterase pode estar parcialmente presente na forma de ácido correspondente e ambos os compostos nesse contexto devem ser considerados tanto quanto equivalentes. Portanto, os ácidos graxos ou derivados de ácidos graxos compreendem em uma forma de concretização particularmente preferida, tal como usada aqui, também os ésteres correspondentes, preferencialmente éster metílico e vice-versa.

[00063] Em uma forma de concretização particularmente preferida, no caso do termo "grupo alquileno", tal como usado aqui, trata-se de um grupo da Fórmula -(CH2)n-, isto é, de um alcano com dois substituintes deixados abertos, preferencialmente de substituintes em posição terminal. No caso dos dois substituintes, pode tratar-se, por exemplo, de um grupo amina e um grupo carbóxi. Em uma forma de concretização preferida, n importa em pelo menos 3, ainda mais preferencialmente, pelo menos 6, ainda mais preferencialmente, 11. Em uma "cadeia alquileno substituída" pelo menos um átomo de hidrogênio é substituído por um outro substituinte além de um átomo de hidrogênio ou um radical alquila, preferencialmente por um outro átomo além de um átomo de hidrogênio. Em uma forma deconcretização particular, o termo "grupo alquileno não substituído", tal como usado aqui, significa, ao contrário, uma cadeia dehidrocarboneto da Fórmula -(CH2)n- sem um tal substituinte.

[00064] A temperatura na etapa (b) não depende apenas das propriedades do trocador de cátion líquido, mas sim, em particular, no caso, do contato da solução aquosa e da orgânica se realizar no decurso da reação na fase aquosa, também das necessidades de temperatura de reações opcionalmente realizadas na fase aquosa. Em particular, no caso, de um agente biológico, tal como uma célula vivente ser cataliticamente ativa na fase aquosa, a temperatura para manter essa atividade deve ser adequada. Em uma forma de concretização preferida, a temperatura na etapa (b) importa em 0 a 100oC, mais preferencialmente 20 a 80oC, 28 a 70oC, 30 a 37oC, 35 a 40oC.

[00065] O valor do pH na etapa (b) também deve ter em conta as exigências de reações que opcionalmente decorrem ao mesmo tempo, a estabilidade de edutos, produtos, produtos intermediários ou agentes. Em uma forma de concretização preferida, o valor de pH importa em 3 a 8, mais preferencialmente em 6 a 8, ainda mais preferencialmente, 6,2 a 7,2.

[00066] Para converter o composto orgânico da fase aquosa o mais completamente possível na orgânica, é necessária uma quantidade satisfatória do trocador de cátion líquido. Em uma forma de concretização preferida da presente invenção, a razão quantitativa de substâncias do trocador de cátion líquido e composto orgânico em pelo menos uma etapa, em um processo contínuo somado a todo o decurso da reação importa em pelo menos 1, isto é, para cada molécula do composto orgânico utiliza-se pelo menos uma molécula de trocador de cátion líquido. Em uma forma de concretização ainda mais preferida, a razão é maior de 2, 3, 5, 10, 15 ou 20,preferencialmente 1,5 a 3.

[00067] A razão volumétrica da solução orgânica para solução aquosa é, juntamente com a razão quantitativa de substâncias trocador de cátion/composto orgânico, é significativa para um processo eficiente. Em uma forma de concretização particular, essa importa em 100:1 a 1:100, mais preferencialmente 20:1 a 1:20, ainda mais preferencialmente, 10:1 a 1:10, 4:1 até 1:4, 3:1 até 1:3 ou mais preferencialmente, 1:2 até 2:1.

[00068] Em uma forma de concretização preferida da presente invenção, um ácido graxo é usado como trocador de cátion líquido. Em uma forma de concretização preferida da presente invenção, entende- se pelo termo "ácido graxo", tal como usado aqui, um ácido carboxílico, preferencialmente ácido alcanóico, com pelo menos 6, preferencialmente 8, ainda mais preferencialmente 10, mais preferencialmente, com 12 átomos de carbono. Em uma forma de concretização preferida, trata-se de ácidos graxos saturados, em uma outra forma de concretização, de ramificados. Em uma forma de concretização preferida, trata-se de ácidos graxos saturados. Em uma forma de concretização particularmente preferida, trata-se de insaturados. Em outra forma de concretização preferida, trata-se de um ácido graxo de cadeia linear, com pelo menos 12 átomos de carbono, compreendendo uma ligação dupla, preferencialmente na posição 9. Em outra forma de concretização preferida, trata-se de um ácido graxo uma vez insaturado, no qual a ligação dupla se encontra na posição 9 e/ou 11. Em outra forma de concretização preferida, no caso do trocador de cátion líquido trata-se de um ácido graxo insaturado selecionado do grupo compreendendo ácido oleico, ácido palmitoleico e ácido gadoleico e ácido icosênico. Na forma de concretização mais preferida, trata-se de ácido oleico. Em uma forma de concretização particularmente preferida, trata-se de um ácido graxo com 6, 7, 8 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 átomos de carbono, preferencialmente com mais de 12, mais preferencialmente com mais de 14 átomos de carbono, mais preferencialmente com 14 a 28, 14 a 22, mais preferencialmente, 16 a 18 átomos de carbono.

[00069] Em uma outra forma de concretização preferida, utiliza-se como trocador de íons líquido uma mistura de diferentes ácidos graxos, tal como está presente, por exemplo, na forma de óleo de soja ou óleo de cardo de flores esféricas. A mistura compreende, se necessário, uma hidrólise prévia, caso os ácidos graxos estejam presentes como éster.

[00070] Em uma forma de concretização particularmente preferida da presente invenção, é usada uma combinação de dois trocadores de cátion líquidos, preferencialmente pelo menos um desses sendo ácido graxo.

[00071] Uma vantagem particular da presente invenção está na compatibilidade do processo de acordo com a invenção com processos biotecnológicos e de agentes biológicos usados nesse caso. Em uma forma de concretização particular da presente invenção, entende-se pelo termo "agente biológico com atividade catalítica", tal como usado aqui, um biocatalisador sintetizado por uma célula em todas as etapas de purificação, de toda a célula até a molécula isolada. Em uma forma de concretização preferida, trata-se de uma célula exprimindo enzimas com atividade catalítica. No caso da célula, pode se tratar de um procarionte, inclusive arqueanos ou de um eucarionte, preferencialmente do grupo compreendendo Pseudomonas, Corynebacterium e E. coli. Em uma forma de concretização ainda mais preferida, no caso do agente trata-se de uma célula bacteriana, ainda mais preferencialmente de uma célula bacteriana gram-negativa, mais preferencialmente de E. coli. Em outra forma de concretização preferida, trata-se de uma célula eucariôntica, mais preferencialmente de uma célula de fungo, ainda mais preferencialmente de uma célula de levedura, mais preferencialmente de Saccharomyces ou Cândida, Pichia, em particular, Cândida tropicalis. O termo "célula", e uma forma de concretização particular, é usado nesse pedido como sinônimo e intercambiável com o termo "micro-organismo". Além disso, no caso da célula, pode tratar-se de uma célula isolada ou de uma mistura de culturas.

[00072] A célula usada como agente biológico pode ser capaz de viver ou pode tratar-se de uma preparação dessa, por exemplo, de uma fração de membrana ou fração citosólica ou de um extrato bruto da célula.

[00073] Se no caso do agente biológico se trata de uma molécula isolada em diferentes estágios de purificação, então essa pode se tratar de todas as moléculas catalíticas ativas, preparadas por uma célula. Em uma forma de concretização particularmente preferida, trata-se de uma molécula do grupo compreendendo peptídeos, carboidratos, ácidos nucléicos ou formas mistas dessas. Ainda em uma forma de concretização mais preferida, trata-se de um polipeptídio cataliticamente ativo. Em outra forma de concretização preferida, trata-se de uma molécula imobilizada.

[00074] As funções catalíticas necessárias para processos biotecnológicos sintéticos são múltiplas. Em uma forma de concretização preferida, trata-se, no caso do termo "atividade catalítica", tal como usado aqui, de uma atividade sintética, isto é, da catálise de reações químicas compreendendo a formação de pelo menos uma nova ligação covalente. Em outra forma de concretização preferida, trata-se de uma atividade de transporte, isto é, da capacidade de uma molécula de realizar o transporte de uma outra molécula de um compartimento para um outro, por exemplo, a absorção de uma substância do meio aquoso através de uma membrana celular para o interior da célula.

[00075] Em uma forma de concretização particularmente preferida, no caso do agente biológico trata-se de uma célula vivente, que na presença do trocador de cátion líquido é usada para a catálise, preferencialmente, para sintetizar um composto orgânico com uma ou mais cargas positivas, que subsequentemente ou ao mesmo tempo, é removida por meio do trocador de cátion líquido, para a fase orgânica hidrófoba.

[00076] Em uma forma de concretização particularmente preferida, a presença do composto orgânico age de forma desvantajosa sobre a atividade catalítica. Em uma forma de concretização, essa pode reduzir a quantidade de atividade presente, que pode ser expressa no sentido de um kcat menor de uma enzima. Em outra forma de concretização, a afinidade do agente que apresenta a atividade catalítica pode ser referida no sentido de um KM elevado de uma enzima. Em outra forma de concretização, a especificidade da atividade catalítica pode ser modificada, por exemplo, de maneira que essa reage ou reage preferencialmente uma molécula de substrato diferente da desejada. Em outra forma de concretização, o composto orgânico apresenta um efeito tóxico sobre uma célula como agente biológico.

[00077] Em outra forma de concretização, no caso do composto orgânico trata-se de um composto orgânico, que reduz a disponibilidade de um cosubstrato ou uma coenzima essencial. Esse pode ser, por exemplo, o caso, se o composto orgânico inibe uma reação de regeneração correspondente.

[00078] Além do trocador de cátion líquido, a fase orgânica hidrófoba pode conter, ainda, um solvente hidrófobo. Esse pode servir para aumentar a capacidade de absorção de um trocador de cátion líquido na fase hidrófoba e impedir o comportamento indesejado, por exemplo, floculação. Em uma forma de concretização preferida, no caso do solvente trata-se de um eduto de uma reação que decorre na solução aquosa, mais preferencialmente do substrato de uma reação enzimo-catalítica que decorrer na solução aquosa. Em uma forma de concretização preferida, trata-se de um éster de ácido graxo. Em uma forma de concretização particularmente preferida, no caso do solvente trata-se de um éster de ácido graxo, preferencialmente de éster metílico de ácido graxo, de um ácido graxo, que serve como trocador de cátion líquido.

[00079] A proporção do solvente, desde que presente, na fase orgânica hidrófoba importa em uma forma de concretização preferida, 1 a 99 por cento em volume (% em volume). Em uma forma de concretização preferida, a proporção do solvente importa em 10 a 90, mais preferencialmente em 20 a 80, ainda mais preferencialmente, em 25 a 75% em volume.

[00080] Em uma forma de concretização mais preferida doprocesso, no caso do composto orgânico trata-se de ácido 12- aminoláurico e/ou de éster metílico de ácido 12-aminoláurico, que é preparado na fase aquosa por uma cepa de E. coli recombinante através de oxidação escalonada do átomo de carbono em posição terminal do éster metílico de ácido láurico, tal como é publicado na DE10200710060705 e a fase hidrófoba compreende 25 a 75% de ácido oleico como trocador de cátion líquido dissolvido em éster metílico de ácido láurico como substrato da reação.

[00081] O estudo da presente invenção pode ser citado não apenas com o emprego das sequências de aminoácido ou ácido nucléico exatas, mas sim, também com o emprego de variantes de tais macromoléculas, que podem ser obtidas através de deleção, adição ou substituição de um ou mais de um aminoácidos ou ácidos nucléicos. Na forma de concretização preferida, o termo "variante" significa uma sequência de ácido nucléico ou sequência de aminoácidos, a seguir, usado como sinônimo e intercambiável com o termo "homologon", tal como usado aqui, uma outra sequência de ácido nucléico ou de aminoácidos que, com respeito à respectiva sequência de ácido nucléico de tipo selvagem ou de aminoácidos original apresenta uma homologia, aqui usada como sinônimo com identidade, de 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98, 99% ou mais por centos, sendo que preferencialmente outros diferentes aminoácidos formadores do centro cataliticamente ativo ou aminoácidos essenciais para a estrutura ou dobramento são deletados ou substituídos ou os últimos são substituídos de forma meramente conservativa, por exemplo, um glutamato ao invés de um aspartato ou uma leucina ao invés de uma valina. O estado da técnica descreve algoritmos, que podem ser usados, para calcular a extensão da homologia de duas sequências, por exemplo, Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 3a edição. Em outra forma de concretização preferida da presente invenção, a variante de uma sequência de aminoácidos ou de ácido nucléico, preferencialmente adicionalmente à homologia de sequência mencionada acima, apresenta essencialmente a mesma atividade enzimática da molécula de tipo selvagem ou da molécula original. Por exemplo, uma variante de um polipeptídio enzimaticamente ativo como protease apresenta a mesma ou essencialmente a mesma atividade proteolítica como a enzima de polipeptídio, isto é, a capacidade de catalisar a hidrólise de uma ligação de peptídeo. Em uma forma de concretização particular, o termo "essencialmente a mesma atividade enzimática" significa uma atividade com respeito aos substratos do peptídeo de tipo selvagem, que se encontra nitidamente acima da atividade básica e/ou se distingue em menos de 3, mais preferencialmente 2, ainda mais preferencialmente em uma ordem de grandeza dos valores KM e/ou kcat, que apresenta o polipeptídio de tipo selvagem com respeito aos mesmos substratos. Em outra forma de concretização preferida, o termo "variante" de uma sequência de ácido nucléico ou de aminoácidos compreende pelo menos uma parte/ou fragmento da sequência de ácido nucléico ou de aminoácidos. Em outra forma de concretização preferida, o termo "parte ativa", tal como usado aqui, significa uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácido nucléico, que apresenta um comprimento menor do que o comprimento total da sequência de aminoácidos ou codifica um comprimento menor do que o total da sequência de aminoácidos, sendo que a sequência de aminoácidos ou a sequência de aminoácidos codificada com comprimento menor do que a sequência de aminoácidos do tipo selvagem apresenta essencialmente a mesma atividade enzimática do polipeptídio de tipo selvagem ou uma variante desse, por exemplo, como desidrogenase de álcool, mono-oxigenase ou transaminase. Em uma forma de concretização particular, o termo "variante" de um ácido nucléico compreende um ácido nucléico, cujo filamento complementar, preferencialmente em condições rigorosas, se liga ao ácido nucléico de tipo selvagem. O rigor da reação de hibridização pode ser facilmente determinada pelo técnico e depende geralmente do comprimento da sonda, das temperaturas durante o crescimento e da concentração salina. Em geral, sondas mais longas necessitam de temperaturas mais elevadas para hibridizar, ao contrário do que amostras mais curtas convivem com temperaturas mais baixas. Se a hibridização se realiza, depende geralmente da capacidade do DNA desnaturado, de anelar em filamentos complementares, que estão presentes em seu meio e, de fato, abaixo da temperatura de fusão. O rigor da reação de hibridização e respectivas condições são detalhadamente descritos em Ausubel e colaboradores 1995. Em uma forma de concretização preferida, o termo "variante" de um ácido nucléico compreende, tal como usado aqui, uma sequência de ácido nucléico arbitrária, que codifica a mesma sequência de aminoácidos de ácido nucléico original ou uma variante dessa sequência de aminoácidos no âmbito da degeneração do código genético.

[00082] Os polipeptídios adequados, que podem ser usados para a preparação de compostos orgânicos da Fórmula (I), em particular, alcanomono-oxigenases, AlkL, transaminases, desidrogenases de aldeído e desidrogenases de alanina, são descritos no estado da técnica, por exemplo, na DE10200710060705, na EP11004029 ou no PCT/EP2011/053834.

[00083] Na forma de concretização mais preferida, no caso da alcanomono-oxigenase trata-se de uma alcanomono-oxigenase do tipo AlkB. AlkB representa uma oxidoredutase do sistema AlkBGT de Pseudomonas putida, que é conhecida por sua atividade de hidroxilase. Essa depende de dois outros polipeptídios, AlkG e AlkT. AlkT é caracterizado como rubredoxin redutase dependente de FAD, que transmitem elétrons de NADH ao AlkG. AlkG é uma rubredoxina, uma proteína redox contendo ferro, que atua como doador de elétrons direto para AlkB. Em uma forma de concretização preferida, entende- se pelo termo "alcanomono-oxigenase do tipo alkB", tal como usado aqui, uma alcanomono-oxidase ligada à membrana. Em outra forma de concretização preferida, entende-se pelo mesmo termo "alcanomono- oxigenase do tipo alkB", um polipeptídio com uma homologia de sequência preferencialmente crescente de pelo menos 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98 ou 99% em relação à sequência do AlkB de Pseudomonas putida Gpo1 (código do banco de dados: CAB54050.1). Em outra forma de concretização preferida, entende-se pelo termo uma mono-oxigenase independente de citocromo. Em outra forma de concretização preferida, entende-se pelo termo "alcanomono- oxigenase do tipo alkB" 5 uma mono-oxigenase independente de citocromo, que utiliza pelo menos uma rubredoxina ou homologon como doador de elétrons. Em uma forma de concretização particularmente preferida, entende-se pelo termo, uma alcanomono- oxigenase independente de citocromo ligada à membrana, preferencialmente crescente de pelo menos 60, 70, 80, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98 ou 99% em relação à sequência do AlkB de Pseudomonas putida Gpo1, que como doador de elétrons necessita pelo menos AlkG (CAB54052.1), mas preferencialmente a combinação de AlkG com a redutase AlkT (CAB54063.1), sendo que no caso de alkG e/ou alkT se trata também de um homologon do respectivo polipeptídio. O termo "sequência", tão como usado aqui, pode se referir à sequência de aminoácidos de um polipeptídio e/ou à sequência de ácido nucléico que codifica para esse fim. Em outra forma de concretização preferida, no caso de uma "alcanomono-oxigenase do tipo alkB", tal como usado aqui, trata-se de uma oxidoredutase independente de citocromo, isto é, de uma oxidoredutase, que não compreende citocromo como cofator.

[00084] A presente invenção é ilustrada, além disso, pelas seguintes figuras e exemplos não restritivos, dos quais podem ser mostradas outras características, formas de concretização, aspectos e vantagens da presente invenção.

[00085] A Figura 1 mostra um experimento de controle para confirmar, que LSME não é tóxico, examinado com uma cepa de E. coli W3110 e em comparação com o tampão de fosfato de potássio (Kpi) como controle negativo.

[00086] A Figura 2 mostra a capacidade de vida da cepa E. coli W3110 na forma do número de cfus, que a cepa pode formar na ausência de um trocador de cátion líquido e na presença de diversos trocadores de cátion líquidos depois de 0 h, 4 h e 24 h.

[00087] A Figura 3 mostra o efeito do uso de um trocador de cátion líquido sobre a toxicidade com base na alteração do número de células viáveis de uma cepa de E. coli-W3110 na presença de ALSME 0,2%, DEHPA ajustado com amoníaco ("D2EHPNH3 2%") ou com uma mistura de DEHPA/LSME (2%/98%) ("D/L") na presença deALSME 0,2%.

[00088] A Figura 4 mostra o efeito de diversos trocadores de cátion líquidos sobre a OTR da cepa de E. coli produtora de éster metílico de ácido aminoláurico. O experimento foi realizado tal como descrito no exemplo 4.

[00089] A Figura 5 mostra a influência de diversos trocadores de cátion líquidos sobre o rendimento do éster metílico de ácido aminoláurico, que produz uma cepa de E. coli com modificação geneticamente adequada. O experimento foi realizado tal como descrito no exemplo 4.Exemplo 1: Pesquisa para a toxicidade do solvente LSME, que é usado em composições com trocadores de cátion líquidos.

[00090] Com esse ensaio foi mostrada a toxicidade relativamente baixa de LDME com respeito aos micro-organismos biotecnologicamente relevantes, que torna o LSME em um solvente orgânico adequado para o processo de acordo com a invenção.Antes de poder efetuar a determinação da cfu, uma placa LB (10 g/L de peptona a partir de caseína, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCl) foi riscada com E. coli BW3110 e incubada durante 24 horas. À noite do dia seguinte, uma pré-cultura dessa placa anteriormente riscada foi inoculada. Essa pré-cultura tinha um volume de 50 mL de meio LB e foi incubada durante a noite durante cerca de 16 horas. No dia seguinte, a pré-cultura foi reinoculada com uma OD600 de 0,2 em 200 mL de meio M9 (Na2HPO4 6,79 g/L; KH2PO4 3,0 g/L; NaCl 0,5 g/L; NH4Cl 1g/L; 1 mL/L de solução de oligoelementos, pH 7,4. Solução de oligoelementos: HCl 37% (=455,8 g/L) 36,50 g/L; MnCl2*7H2O 1,91 g/L; ZnSO4*7H2O 1,87 g/L; Na-EDTA*2H2O (Titriplex III) 0,84 g/L; H3BO3 0,30 g/L; Na2MoO4*2H2O 0,25 g/L; CaCl2*2H2O 4,70 g/L; FeSO4*7H2O 17,80 g/L; CuCl2*2H2O 0,15 g/L) com 3% de glicose e incubada durante cerca de 20 horas. Depois da incubação da cultura principal, as células foram colhidas, centrifugadas com 5258 g e 4oC durante 10 minutos e são novamente suspensas com uma OD600 de 30 em 10 mL de 50 mM de tampão Kpi em pH 7,4 (ou 25 mM de tampão hepes pH 7,4, caso tenham sido efetuadas determinações da cfu com ALSME). As duas soluções tampão usadas continham 5% de glicose. Em seguida, a suspensão de bactérias foi transferida para os balões de agitação e misturada com as respectivas soluções de substâncias. Depois de efetuada a mistura girando o balão, 100 μl da suspensão são retirados por pipetação e enchidos em 900 μl de salinas estéreis previamente introduzidas. Essas corresponderam à amostragem no momento t0. Em seguida, a incubação das preparações foi efetuada a 250 rotações por minuto e 30oC. AS CFU foram determinadas durante um período de 22 horas. As retiradas de amostras foram inicialmente realizadas nos momentos t0, t3, t6 e t22. Em algumas preparações acrescentou-se um outro momento de amostragem t1,5 e, além disso, uma outra série de diluições adicionais, para minimizar desvios.

[00091] A OD600 era de 60. As células foram novamente suspensas em 10 mL de tampão Kpi e, em seguida, misturadas no balão com 5 mL de LSME 98%. Uma etapa de diluição foi realizada para cada preparação e em seguida inoculadas em placas.. O número das cfu/mL permaneceu constante durante o período de 6 horas. Depois de 22 horas, foi registrada uma redução percentual do número de células viáveis de meramente 30,3%.Exemplo 2: Ensaios comparativos para a toxicidade de diversos trocadores de cátion líquidos em relação aos micro-organismos biotecnologicamente relevantes

[00092] Este exemplo mostra a baixa toxicidade de ácidos graxos não ramificados em relação a outros trocadores de cátion líquidos, tal como DEHPA, bem como ácidos graxos saturados ramificados e não ramificados.

[00093] Inicialmente, uma pré-cultura compreendendo 20 mL de meio LB foi inoculada em um Erlenmeyer de 100 mL com uma criocultura da respectiva cepa. A cultura foi cultivada durante a noite a 37oC e agitação com 200 rotações por minuto e utilizada no dia seguinte, para inocular uma mesma cultura principal em uma OD de 0,2. A seguir, a cultura principal (30 mL cada de meio L(B) ainda foi cultivada nas mesmas condições. Com uma OD de 0,4 a 0,5, a cultura principal foi sobreposta respectivamente com os mesmos volumes (30 mL) de solvente e, em seguida, ulteriormente cultivada.

[00094] Para a determinação do número das cfu (colony-forming units ou unidades formadoras de colônias) retiraram-se nos seguintes ensaios 0,1 m de amostras e essas foram diluídas em solução de NaCl a 0,9% estéril. Etapas de diluição adequadas foram inoculadas em placas de Agar LB. Depois da incubação a 34oC durante a noite, as colônias formadas foram contadas e as cfus foram determinadas.Ensaio 1: Comparação da toxicidade entre DE2HPA e um ácido graxo saturado como trocador de cátion líquido

[00095] 50% de DEHPA ou ácido láurico (15%), respectivamentedissolvidos em LSME e carregados de forma equimolar ou a 25% em mol com ALSME, foram postos em contato como trocadores de cátion líquidos com uma cepa de E. coli BL21 (DE3) e a influência desses dois compostos foi pesquisada para a capacidade da cepa de formar colônias, expressa em cfus. Em pré-ensaios foi possível mostrar, que o éster metílico de ácido láurico - que devido à falta de carga não pode agir como trocador de cátion líquido - é bem tolerado pelas cepas usadas.

[00096] Verifica-se, que os dois trocadores de cátion líquido diminuem nitidamente o número das cfus, quando é usado ácido láurico, ao contrário de DEHPA, mas ainda há algumas células viáveis e o ácido graxo saturado e, por isso, é dada preferência ao ácido graxo saturado como trocador de cátion líquido.Ensaio 2: Comparação da toxicidade entre ácidos graxos saturados ramificados e diferentes quantidades de ácido oleico como trocador de cátion líquido

[00097] Aqui, foram usadas duas diferentes concentrações de ácido oleico e o volume é ajustado através da adição da respectiva quantidade de LSME (éster metílico de ácido láurico).

[00098] Verifica-se, que o número de células viáveis quando éusado o ácido graxo insaturado ácido oleico juntamente com LSME é consistentemente nitidamente maior do que quando são usados ácidos graxos saturados ramificados.Ensaio 3: Comparação da toxicidade entre ácidos graxos saturados não ramificados e ácidos graxos insaturados como trocador de cátion líquido

[00099] Nesse caso, diversas quantidades de um ácido graxo insaturado foram comparadas com um ácido graxo insaturado com respeito à sua toxicidade quando usado como trocador de cátion líquido. Com base na menor solubilidade do ácido graxo insaturado ácido láurico, esse foi usado em menor quantidade. Os volumes dos diversos trocadores de cátion líquido foram comparados com LSME. O número das cfus foi determinado no início, depois de 4,5 horas e depois de 24 horas.

[000100] Tal como pode ser visto na Fig.2, a adição do ácido graxo saturado como trocador de cátion líquido mesmo em concentração menor do que a do ácido graxo insaturado causa uma redução das cfus, ao passo que no caso do ácido graxo insaturado, verifica-se um aumento das cfus.

[000101] Ao todo, verifica-se uma diminuição da toxicidade nos diversos trocadores de cátion líquido pesquisados na seguinte ordem: DEHPA > ácidos graxos saturados > ácidos graxos insaturados.Exemplo 3: Diminuição da toxicidade de um composto orgânico com carga positiva por meio do contato com um trocador de cátion líquido

[000102] Esse ensaio mostra, que através da presença de um trocador de cátion líquido, o efeito tóxico de um composto orgânico carregado positivamente em uma fase aquosa, na qual se trata de caldo de fermentação, pode ser reduzido, em que esse composto é extraído na fase orgânica.

[000103] O procedimento experimental básico correspondeu ao do exemplo 1.

[000104] Visto que ALSME 0,2%, dissolvido em sistemas aquosos, agiu como bactericida, esse ensaio foi efetuado em combinação com D2EHPNH3/LSME 2/98% outra vez no balão de agitação, nesse caso, D2EHPNH3 significa D2EHPA carregado quantitativamente com amônio. Através do emprego do trocador de íons líquido, a passagem de ALSME para a fase orgânica melhora, pelo que essa concentração na fase aquosa, na qual também se encontram as células, diminui. Para reduzir o efeito tóxico condicionado pelo D2EHPA, foram usadas concentrações reduzidas de 2% de D2EHPNH3.

[000105] Inicialmente, as bactérias foram novamente suspensas em 5 mL (corresponde à metade do volume do tampão). Mais 5 mL de tampão foram opcionalmente misturados com 0,4% de ALSME e, em seguida, opcionalmente centrifugados com 5 mL de D2EHPNH3/LSME 2/98% durante 1 minuto a 300 rotações por minuto. Essa solução foi acrescentada à suspensão de bactérias previamente introduzida no balão de agitação e misturada. Depois, foi realizada a primeira amostragem.

[000106] A solução tinha uma consistência espumosa no início dos ensaios, que, contudo, na segunda amostragem, tinha sumido nos dois ensaios. A abreviação "D/L" foi usada para D2EHPNH3 (D2EHPA)/LSME 2/98% carregado com amoníaco. Entre as retiradas de amostras t0 e t1,5 horas, o número das cfu/mL aumentou em 34,3%. Da amostragem (t1,5) até a última amostragem (t22) o número das cfu/mL diminuiu em 54,9%. Em comparação com a preparação com D2EHPNH3/LSME 2/98% sem adição de ALSME 0,2%, o número das células capazes de propagação depois de 22 horas era 4,5 vezes maior e com 3,4% não significativamente menor do que o valor médio das preparações de controle em tampão hepes (vide a figura 4). Em comparação com a preparação com ALSME 0,2% no balão de agitação, sem adição de uma fase orgânica, o número das cfu/mL era 2800 vezes maior.

[000107] Verifica-se, que a presença do trocador de cátion líquido reduz a toxicidade do composto carregado positivamente, aqui verificada pelo número das cfus remanescentes.Exemplo 4: Ensaios comparativos para a toxicidade de diversos trocadores de cátion líquido em relação a um ácido w- aminoláurico (ALS) e do micro-organismo produtor do éster metílico (ALSME)

[000108] A biotransformação de éster metílico de ácido láurico para éster metílico de ácido aminoláurico foi testada no sistema de fermentação paralela 8 vezes maior da DasGip com diversos trocadores de íons.

[000109] Para a fermentação foram usados reatores de 1 litro. As sondas de pH foram calibradas por meio de uma calibração de dois pontos com soluções medidoras de pH 4,0 e pH 7,0. Os reatores foram enchidos com 300 mL de água e autoclavados a 121oC durante 20 minutos, para assegurar a esterilidade. Em seguida, as sondas pO2 foram polarizadas durante a noite (pelo menos durante 6 horas). Na manhã seguinte, a água foi retirada sob a bancada limpa (clean bench) e substituída por meio de alta densidade celular com 50 mg/L de kanamicina e 34 mg/L de cloranfenicol. A seguir, as sondas pO2 foram calibradas com um calibrador de um ponto (agitador: 600 rotações por minuto/gaseificação: 10 sl/h de ar) e as vias de alimentação, agente corretivo e meio de indução foram purificadas por meio de limpeza no local (clean-in-place). Para isso, as mangueiras foram enxaguadas com 70% de etanol, em seguida, com NaOH 1 M, depois com água desmineralizada estéril e, por fim, enchidas com os respectivos meios.

[000110] A cepa de E. coli BL21 (DE3) T1r pBT10 pACYC:Duet[TAcv] produtora de ALS e ALSME foi inicialmente cultivada a partir da criocultura em meio LB (25 mL em um Erlenmeyer de 100 mL) com 50 mg/L de kanamicina e 34 mg/L de cloranfenicol durante a noite a 37oC e 200 rotações por minuto, por cerca de 18 horas. Em seguida, 2 mL cada de meio de alta densidade celular (glicose 15 g/L (30 mL/L de 500 g/L de uma solução padrão autoclavada separadamente com 1% MgSO4*7H2O e 2,2% NH4Cl), (NH4)2SO4 1,76 g/L, K2HPO4 19,08 g/L, KH2PO4 12,5 g/L, extrato de levedura 6,66 g/L, dihidrato de citrato trissódico 11,2 g, solução de citrato de ferro-amônio 17 mL/L de uma solução padrão a 1% autoclavada separadamente, solução de oligoelementos 5 mL/L de uma solução padrão autoclavada separadamente (HCl 37%) 26,50 g/L, MnCl2*4H2O 1,91 g/L, ZnSO4*7H2O 1,87 g/L, dihidrato de ácido etilenodiaminotetra-acético 0,84 g/L, H3BO3 0,30 g/L. Na2MoO4*2H2O 0,25 g/L, CaCl2*2H2O 4,70 g/L, FeSO4*7H2O 17,80 g/L, CuCl2*2H2O 0,15 g/L)) (3 vezes 25 mL cada em um Erlenmeyer de 100 mL) foi reinoculada com 50 mg/L de kanamicina e 34 mg/L de cloranfenicol e incubada a 37oC/200 rotações por minuto por mais 6 horas.

[000111] As 3 culturas foram combinadas em um balão de agitação e a densidade ótica foi determinada com 7,2. Para inocular os reatores com uma densidade ótica de 0,1, foram aplicados 4,2 mL cada em uma seringa de 5 mL e os reatores foram inoculados por meio de cânulas através de um septo.

[000112] Foi usado o seguinte programa padrão:

[000113] O experimento efetuad o pode ser desmembrado em duasfases, o cultivo, no qual as células devem obter uma determinada densidade ótica e a subsequente biotransformação, na qual a expressão do gene necessário para o processo biotecnológico para a produção de ALSME foi induzido. Os valores de pH foram regulados, por um lado, com amoníaco (12,5%) para pH 6,8. Durante o cultivo e biotransformação o oxigênio dissolvido (DO, dissolved oxygen) na cultura foi regulado através do número de rotações do agitador e taxa de gaseificação a 30%. A fermentação foi efetuada como mistura de alimentação, sendo que o início da alimentação, 5 g/L h de alimentação de glicose (500 g/L de glicose com 1% de MgSO4*7H2O e 2,2% de NH4Cl) foi desencadeado através de um pico de DO. Com o início da alimentação, a temperatura de 37oC também foi reduzida para 30oC. A expressão da transaminase foi induzida 2 horas depois do início da alimentação através da adição automática de IPTG (1 mM). A indução do gene alk foi realizada através da adição manual de DCPK (0,025%) 10 horas após o início da alimentação. Antes do início da biotransformação, determinou-se a densidade ótica dos caldos de cultura.

[000114] O início da fase de biotransformação foi realizada 14 horas depois do início da alimentação. Para esse fim, 150 mL de uma mistura de éster metílico de ácido láurico e do respectivo trocador de íons (10%) foram acrescentados como mistura ao caldo de fermentação. Como trocadores de íons foram usados o ácido di-(2-etil- hexil)fosfórico (DEHPA), ácido láurico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico e uma mistura de ácidos graxos livres da saponificação do óleo de cardo de flores esféricas. Por pôr um doador de grupos amino à disposição para a transaminase foram acrescentados ao mesmo tempo com a adição da fase orgânica, 10,7 mL de uma solução de alanina (125 g/L) ao caldo de fermentação. Para a amostragem, 2 mL do caldo de fermentação foram retirados da caldeira e uma parte desse, 1/20, foi diluída em uma mistura de acetona-HCl (c(HCl) = 0,1 mol/L) e extraída. Amostras foram retiradas de todos os 8 reatores em 1,25 h, 3 h, 5 h, 20 h, 22 h e 25 h após o início da biotransformação. As taxas de conversão para oxigênio (OTR = oxygen transfer rate) e carbono (CTR = carbon transfer rate) foram determinadas durante a fermentação através da análise de gases residuais nos sistemas DasGip. A fermentação foi concluída 22 horas após o início da biotransformação.

[000115] A quantificação de ALS, ALSME, DDS, DDSME, LS, LSME, HLS, HLSME, OLS e OLSME em amostras de fermentação foi realizada por meio de LC-ESI/MS2 com base em uma calibração externa para todos os analitos e com o emprego do padrão interno ácido aminoundecanóico (AUD).

[000116] Nesse caso, foram usados os seguintes aparelhos:• HPLC dispositivo 1260 (Agilent; Boblingen) com amostrador automático (G1367E), bomba binária (G1312(B) e forno de coluna (G1316A)• espectrômetro de massa TripelQuad 6410 (Agilent;Boblingen) com fonte ESI• coluna de HPLC: Kinetex C18, 100 x 2,1 mm, tamanho de partícula: 2,6 μm, tamanho do poro 100 Â (Phenomenex;Aschaffenburg)• pré-coluna: KrudKatcher Ultra HPLC filtro em linha; 0,5 μm de profundidade do filtro e 0,004 mm de diâmetro interno (Phenomenex; Aschaffenburg).

[000117] As amostras foram preparadas, em que 1900 μl de solvente (mistura de acetona/HCl 0,1 N = 1:1) e 100 μl de amostra foram pipetados para um recipiente de reação de 2 mL. A mistura foi centrifugada por cerca de 10 segundos e, em seguida, essa foi centrifugada a cerca de 13000 rotações por minuto durante 5 minutos. O sobrenadante transparente foi retirado com uma pipeta e analisada depois de respectiva diluição com diluente (80%) de ACN, 20% de H2O bidestilada + 0,1% de ácido fórmico). Para cada 900 μl de amostra foram acrescentados por pipetação 100 μl de ISTD (10 μl com um volume de amostra de 90 μl).

[000118] A separação de HPLC foi realizada com a coluna ou pré- coluna mencionada acima. O volume injetado importou em 0,7 μl, a temperatura da coluna, em 50oC, a taxa de vazão, 0,6 mL/min. A fase móvel consistiu em eluente A (a 0,1% de ácido fórmico aquoso) e eluente B (acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico). Foi utilizado o seguinte perfil de gradiente:

[000119] A análise ESI-MS2 foi realizada no modo positivo com os seguintes parâmetros da fonte ESI:• temperatura do gás 280oC• vazão do gás 11 l/min• pressão de nebulização 50 psi• tensão capilar 4000 V

[000120] A detecção e quantificação dos compostos individuais foi realizada com os seguintes parâmetros, sendo em cada caso utilizado um íon de produto como qualificador e um como quantificador:

Resultados:

[000121] Se o DEHPA, tal como descrito no estado da técnica, é usado como trocador de cátion líquido, então imediatamente após a adição do composto à cultura, ocorre uma rutura da OTR. A curva cai dentro de pouco tempo para 0, o que indica, que na cultura não há mais quaisquer células metabolicamente ativas. DEHPA age, portanto, como altamente tóxico sobre as células.

[000122] Se ao invés de DEHPA é usado ácido láurico como trocador de cátion líquido, então, de fato, ocorre igualmente uma rutura da OTR, contudo, essa não é tão forte e no decorrer das próximas 22 horas, as células se recompõem e mostram uma crescente atividade do metabolismo. Portanto, o ácido láurico é notadamente menos tóxico do que o DEHPA.

[000123] Resultados ainda mais evidentes podem ser observados quando são usados ácidos graxos saturados com cadeias de carbono mais longas. Usando ácido palmítico e ácido esteárico, a curva OTR cai nitidamente mais segura do que no caso do uso de ácido láurico ou mesmo de DEHPA. Disso pode ser concluído, que esses ácidos graxos agem de forma nitidamente menos tóxica.

[000124] O uso de ácidos graxos insaturados, tal como ácido palmitoleico, óleo de cardo de flores esféricas saponificado (contém principalmente ácido linólico) e ácido oleico levam surpreendentemente a resultados ainda evidentemente melhores. Esses ácidos graxos mostram, surpreendentemente, uma toxicidade ainda mais baixa do que os ácidos graxos saturados.Referências literárias:J. Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997Asano, Y., Fukuta, y., Yoshida, Y., and Komeda, H. (2008): The Screening, Characterisation, and Use of w-Laurolactam Hydrolase: A New Enzymatic Synthesis of 12-Aminolauric Acid, Biosc. Biotechn. Biochem., 72 (8), 2141-2150DE10200710060705 (2007): Células recombinantes,produtoras de ácidos w-aminocarboxílicos ou suas lactamasF. M. Ausubel (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc.A. M. Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics, 3a edição

Claims (12)

1. Processo para remoção de um composto orgânico de uma solução aquosa, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) prover a solução aquosa contendo o composto orgânico e uma solução orgânica hidrófoba, a qual compreende um trocador de cátion líquido,sendo que o trocador de cátion líquido é hidrófobo,(b) contatar a solução aquosa com a solução orgânica, e(c) separar a solução orgânica da solução aquosa,sendo que o composto orgânico é um composto da Fórmula (I)NH3+-A-COOR1 (I),na qualR1 é hidrogênio, metila, etila ou uma carga negativa, eA é um gruo alquileno de cadeia linear, não substituído, com pelo menos três, preferencialmente, com pelo menos oito átomos de carbono, esendo que o trocador de cátion líquido é um ácido graxo insaturado.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a temperatura na etapa (b) é de 28 a 70 oC, preferencialmente, 30 a 37oC.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o valor de pH na etapa (b) é de 6 a 8, preferencialmente, 6,2 a 7,2.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a razão molar do trocador de cátion líquido ao composto orgânico é pelo menos 1.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a razão volumétrica de solução orgânica à solução aquosa é de 1:10 a 10:1.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o trocador de cátion líquido é um ácido graxo apresentando mais de 12, preferencialmente, apresentando de 14 a 22, ainda mais preferencialmente, apresentando 16 a 18 átomos de carbono.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o trocador de cátion líquido é ácido oleico ou ácido erúcico.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa compreendeuma célula.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula bacteriana, e a célula mais preferencialmente inclui uma alcanomono-oxigenase recombinante, uma transaminase recombinante, e, preferencialmente, além disso, pelo menos uma enzima do grupo compreendendo uma desidrogenase de álcool, uma desidrogenase de alanina e o produto gênico de AlkL.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a solução orgânica contém adicionalmente pelo menos um solvente orgânico, preferencialmente, um ácido graxo e/ou um éster de ácido graxo.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a solução orgânica compreende:como trocador de cátion líquido, 20 a 80% em volume, preferencialmente, 25 a 75% em volume, de ácido oleico, ecomo solvente, éster metílico de ácido láurico, eo composto orgânico é 12-aminolaurato de metila, e uma célula bacteriana está presente na solução aquosa, incluindo uma alcanomono-oxigenase recombinante, uma transaminase recombinante, e, preferencialmente, além disso, pelo menos uma enzima do grupo, que compreende uma desidrogenase de álcool, uma desidrogenase de alanina e o produto gênico AlkL.

12. Mistura de reação, caracterizada pelo fato de que compreende:uma solução aquosa, obtida por um processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, euma solução orgânica hidrófoba,sendo que a solução orgânica hidrófoba compreende um ácido graxo, mais preferencialmente, um ácido graxo apresentando mais de 12 átomos de carbono, ainda mais preferencialmente, um ácido graxo insaturado como trocador de cátion líquido.

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