MX2013009463A - Intercambiador de cation liquido. - Google Patents

Abstract

La invención es concerniente con un método para separar un compuesto orgánico que tiene una o más cargas positivas de una solución acuosa. El método consiste de las siguientes etapas: a) la solución acuosa que contiene el compuesto orgánico y una solución orgánica hidrofóbica que contiene un intercambiador de catión líquido hidrofóbico que tiene una o más cargas negativas y una carga total negativa son provistos b) la solución acuosa y la solución orgánica son traídas en contacto entre si y c) la solución orgánica es separada de la solución acuosa.

Description

INTERCAMBIADOR DE CATIÓN LÍQUIDO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente solicitud es concerniente con un método para separar un compuesto orgánico que tiene una o más cargas positivas de una solución acuosa que comprende las etapas de: (a) proveer la solución acuosa que contiene el compuesto orgánico y una solución orgánica hidrofóbica que comprende un intercambiador de catión liquido, en donde el intercambiador de catión liquido es hidrofóbico, (b) poner en contacto la solución acuosa y la solución orgánica y (c) separar la solución orgánica de la solución acuosa, en donde el compuesto orgánico es un compuesto de fórmula H3+—A-COOR1 y mezclas de reacción asociadas con el mismo.

Un problema fundamental en la producción biotecnológica de químicos finos a partir de materiales primas renovables que convencionalmente son sintetizados partiendo de combustibles fósiles, es transferir el producto . una vez obtenido, que esta comúnmente presente en una fase acuosa de gran volumen a una fase orgánica. Esta transferencia se lleva a cabo por una parte con el fin de concentrar un intermediario terminado o producto final y opcionalmente también para hacer el procesamiento sintético posible en etapas de reacción subsecuentes en solución orgánica y por otra parte mejorar el rendimiento de la reacción en la fase acuosa al separar el producto deseado o para hacer posible que la reacción se lleve a cabo a una escala técnicamente sensible. Como regla, la concentración térmica directa del producto, que esta frecuentemente presente en bajas concentraciones, de solución acuosa de gran volumen no es sensible.

La distribución de un compuesto en un sistema de dos fases que comprende una fase hidrofilica acuosa y una fase hidrofóbica orgánica, que son inmiscibles, depende decisivamente de las propiedades fisicoquímicas del compuesto particular. Mientras que compuestos con una alta proporción de o que consisten exclusivamente de hidrocarburo sin sustituir se acumulan principalmente en la fase hidrofóbica, los compuestos con una alta proporción de grupos polares tales como funcionalidades que contienen heteroátomos y especialmente compuestos con cargas están presentes principal o prácticamente de manera exclusiva en la fase acuosa, lo que impide la transferencia a una fase orgánica.

La distribución de un compuesto en el sistema de dos fases afirmado después del establecimiento del equilibrio es frecuentemente descrita con la ayuda de coeficientes de distribución, por ejemplo de acuerdo con la ecuación de Nernst Oí = Cfase 1/ Cfase2 , Un coeficiente de distribución especial es Kow, también llamado el valor P, que caracteriza el equilibrio de distribución de un compuesto entre un octanol y una fase acuosa : Kow = P — Coctanol/Cagua Un ejemplo de un compuesto orgánico cargado positivamente mucho en demanda industrialmente es ácido 12-aminolaurico (ALA) y derivado del mismo, especialmente el metil éster (ALAME) . ALA es un producto de partida importante en la producción de polímeros, por ejemplo para producción de sistemas de tuberías y nylon. Convencionalmente, el AL es producido partiendo de materias primas fósiles en un proceso con bajo rendimiento vía laurolactama, que es sintetizado mediante trimerización de butadieno, luego hidrogenación con formación de ciclododecano, luego oxidación a ciclododecano, reacción con hidroxilaurina y luego re-arreglo de Beckmann. Una ruta promisoria para la producción biotecnológica ALA o ALAME es descrito en DE10200710060705.

El arte previo enseña la producción de compuestos orgánicos cargados positivamente al poner en contacto una mezcla de reacción acuosa que comprende un agente biológico con una fase orgánica que comprende un solvente orgánico. Por ejemplo, DE10200710060705 describe la obtención del producto ALAME mediante agitación con acetato de etilo de una mezcla de reacción acuosa. Asano et al. (2008) describe la extracción de ALA con tolueno de una solución de reacción acuosa que comprende una enzima de síntesis de ALA.

El problema va a ser resuelto por la presente invención es por consiguiente desarrollar un método para separar positivamente compuestos orgánicos cargados, especialmente ácidos con ?-aminocarboxílicos, con por lo menos una carga positiva una mezcla de reacción acuosa en donde una posición del equilibrio de distribución entre la mezcla de reacción y una fase orgánica hidrofóbica usada como extrayente que es ventajosa como se pretende deseable, esto es, el equilibrio de distribución debe caer tan lejano como sea posible en el lado de la fase orgánica hidrofóbica.

Otro problema a ser resuelto por la invención consiste en desarrollar un método para separar compuestos orgánicos con por lo menos una carga positiva, especialmente ácidos ?-aminocarboxilicos de una solución acuosa que comprende un agente biológico utilizando una fase orgánica hidrofóbica como extrayente, en la cual el equilibrio de distribución está ubicado tan lejano como sea posible sobre el lado de la fase orgánica hidrofóbica.

Otro problema a ser resuelto por la invención consiste en desarrollar un método para separar compuestos orgánicos con por lo menos una carga positiva, especialmente ácidos ?-aminocarboxilicos de una solución acuosa utilizando una solución orgánica hidrofóbica como extrayente, que imparte o frena el crecimiento de microorganismos biotecnológicámente relevantes, especialmente Escherichia coli, tan poco como sea posible y/o reduce el número de células aptas de dividir y/o células viables y/o células con respiración activa y/o .células metabólica y sintéticamente activas tan poco como sea posible .

Finalmente, un problema a ser resuelto por la invención es idear un método para separar un compuesto orgánico con por lo menos una carga positiva, especialmente ácidos ?-aminocarboxilicos de una solución acuosa que comprende un agente biológico utilizando una fase orgánica hidrofóbica como extrayente, en el cual todas las propiedades que son decisivas para el rendimiento, el rendimiento global y practicabilidad rápida de un proceso de síntesis biotecnológica en el cual está basada, especialmente la toxicidad de la fase orgánica contra el agente biológica y la absorción del compuesto al extrayente orgánica son optimizados con respecto al rendimiento total o un avance más rápido o en el caso de un proceso continuo, la capacidad de uso del agente biológico tanto como sea posible, especialmente para el caso cuando el compuesto orgánico con por lo menos una carga positiva es el producto o un intermediario del proceso de síntesis, que es sintetizado con la participación de una actividad catalítica del agente biológico.

Estos y otros problemas son resueltos por la materia de la presente solicitud y especialmente también por la materia de las reivindicaciones independientes adjuntas, en donde las modalidades siguen de las reivindicaciones dependientes.

El problema a ser resuelto por la invención es resuelto en un primer aspecto por el método para separar un compuesto orgánico que tiene una o más cargas positivas de una solución acuosa que comprende las etapas de: a) proveer la solución acuosa que contiene el compuesto orgánico y una solución orgánica hidrofóbica, que contiene un intercambiador de catión liquido, en donde el intercambiador de catión liquido es hidrofóbico, b) poner en contacto la solución acuosa y la solución orgánica y c) separar la solución orgánica de la solución acuosa, en donde el compuesto orgánico es un compuesto de fórmula I .

NH3+-A-C00R1 (I), en donde R1 es hidrógeno, metilo, etilo o una carga negativa y A es un grupo alquileno lineal sin sustituir con por lo menos tres, preferiblemente por lo menos ocho átomos de carbono y En donde el intercambiador de cationes liquido es un ácido graso.

En una primera modalidad del primer aspecto, el problema es resuelto por el método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1, en donde la temperatura en la etapa (b) es de 28 a 70, preferiblemente 30 a 37°C.

En una segunda modalidad, que es también una modalidad de la primera modalidad del primer aspecto, el problema es resuelto por un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el pH en la etapa (b) es de 6 a 8, preferiblemente 6.2 a 7.2.

En una tercera modalidad, que es también una modalidad de la primera a segunda modalidad del primer aspecto, el problema es resuelto por un método en donde la proporción molar de intercambiador de catión liquido a compuesto orgánico es de por lo menos 1.

En una tercera modalidad, que es también una modalidad de la primera a tercera modalidad del primer aspecto, el problema es resuelto por un método en donde la proporción volumétrica de la solución orgánica a solución acuosa es de 1:10 a 10:1.

En una cuarta modalidad, que es también una modalidad de las primeras a tercera modalidad del primer aspecto, el problema es resuelto por un método en donde el intercambiador liquido es un ácido graso con más de 12, preferiblemente con 14 a 22, más preferiblemente 16 a 18 átomos de carbono.

En una quinta modalidad, que es también una modalidad de la primera a cuarta modalidad del primer aspecto, el problema es resuelto por un método en donde el intercambiador de catión liquido es un ácido graso insaturado, preferiblemente ácido oleico o ácido erucico.

En una sexta modalidad que es también una modalidad de la primera a quinta modalidad del primer aspecto, el problema es resuelto por un método en donde la solución acuosa comprende además un agente biológico con actividad catalítica .

En una séptima modalidad, que es también una modalidad de la primera a sexta modalidad del primer aspecto, el problema es resuelto por un método en donde el agente biológico es una célula, preferiblemente una célula bacteriana y la célula más preferiblemente tiene una alcano monooxigenasa recombinante, una transaminasa recombinante y de preferencia además por lo menos una enzima del grupo que comprende una alcohol deshidrogenasa, una alanina deshidrogenasa y el producto genético de AlkL o variantes de los mismos.

En una octava modalidad, que es también una modalidad de la primera a séptima modalidad en un aspecto, el problema es resuelto por un método en donde la presencia del compuesto orgánico tiene un efecto adverso sobre la actividad catalítica, preferiblemente en que el compuesto orgánico es un compuesto que es toxico a la célula.

En una novena modalidad, que es también una modalidad de la primera a octava modalidad del primer aspecto, el problema es resuelto por un método en donde la solución orgánica contiene además por lo menos un solvente orgánico, preferiblemente un ácido graso y/o un éster de ácido graso.

En una décima modalidad, que es también una modalidad de la primera a novena modalidad del primer aspecto, el problema es resuelto por el método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la solución orgánica comprende como intercambiador de catión liquido 20 a 80% en volumen, preferiblemente 25 a 75% en volumen de ácido oleico y como solvente metil éster de ácido láurico y el compuesto orgánico es metil éster de ácido 12-aminolaurico y una célula bacteriana está presente en la solución acuosa que tiene una alcano monooxigenasa recombinante, una transaminasa recombinante y además preferiblemente por lo menos una enzima del grupo que comprende una alcohol deshidrogenase, una alanina deshidrogenasa y el producto genético de AlkL o variantes de los mismos.

En un segundo aspecto, el problema a ser resuelto por la invención es resuelto por una mezcla de reacción que comprende una solución acuosa y una solución orgánica hidrofóbica, en donde la solución orgánica hidrofóbica comprende un ácido graso, preferiblemente un ácido graso con más de 12 átomos de carbono más preferiblemente un ácido graso insaturado como intercambiador de catión liquido y en donde la solución acuosa es un compuesto de fórmula (I) NH3+-A-COOR1 (I), en donde Rl es hidrógeno, metilo, etilo o una carga negativa y A es un grupo alquileno lineal sin sustituir con por lo menos tres, preferiblemente por lo menos ocho átomos de carbono.

En una modalidad del segundo aspecto, el problema a ser resuelto por la invención es resuelto por una mezcla de reacción de acuerdo con el primer aspecto, en donde la solución acuosa comprende además una célula que tiene una alcano monooxigenasa recombinante, una transaminasa recombinante y además de preferencia por lo menos una enzima del grupo que comprende una alcohol deshidrogenasa, una alanina deshidrogenasa y el producto genético de AlkL o variantes de los mismos.

Modalidades adicionales del segundo aspecto comprenden todas las modalidades del primer aspecto.

El problema a ser resuelto por la invención es resuelto en un cuarto aspecto por un método para separar un compuesto orgánico que tiene una o más cargas positivas de una solución acuosa, que comprende las etapas de a) proveer la solución acuosa que contiene el compues o orgánico y una solución orgánica hidrofóbica, que comprende un intercambiador de catión liquido, en donde el intercambiador catiónico liquido es hidrofóbico y en donde el intercambiador de catión liquido tiene una o más cargas negativos y una carga total negativa, b) poner en contacto la solución acuosa y la solución orgánica y c) separar la solución orgánica de la solución acuosa.

En una segunda modalidad del cuarto aspecto de la presente invención que también representa una modalidad de la primera modalidad de la presente invención, el método comprende la etapa de: d) laboreo de la solución orgánica, preferiblemente mediante retro lavado del compuesto orgánico a otra solución acuosa .

En una tercera modalidad del cuarto aspecto de la presente invención, que también representa una modalidad de la¦ primera a segunda modalidad de la presente invención, la temperatura en la etapa b) del método de acuerdo con la invención es de 28 a 60°C, preferiblemente 30 a 37°C .·: En una cuarta modalidad del cuarto aspecto de la presente invención, que también representa una modalidad de la primera a tercera modalidad de la presente invención, el pH en la etapa b) del método de acuerdo con la invención es de 3 a 8, preferiblemente 6 a 8, especialmente de preferencia 6.2 a 7.2.

En una quinta modalidad, del cuarto aspecto de la presente invención, que también representa una modalidad de la primera a cuarta modalidad de la presente invención, la proporción molar de intercambiador de catión liquido al compuesto orgánico en el método es de por lo menos uno.

En una sexta modalidad del cuarto aspecto de la presente invención, que también representa una modalidad de la primera a quinta modalidad de la presente invención, la proporción en volumen de solución orgánica a solución acuosa es de 1:10 a 10: 1.

En una séptima modalidad del cuarto aspecto de la presente invención, que también representa una modalidad de la primera a sexta modalidad de la presente invención, el compuesto orgánico tiene por lo menos un sustituyente cargado positivamente de fórmula (I) -N+R2R3R4 (I) o si por lo menos un sustituyente del grupo que comprende R2, R3 y R4 es hidrógeno, la forma sin protonár del mismo, en donde R2, R3 y R4 son seleccionados independientemente entre si del grupo que comprende hidrógeno, metilo, etilo, propilo, 2-propilo, butilo, t-butilo, pentilo, hexilo, bencilo,. hidroxilo, alquilo o alquenilo lineal o ramificado o cíclico sustituido o sin sustituir.

En una octava modalidad del cuarto aspecto de la presente invención, que también representa una modalidad de la primera a séptima modalidad de la presente invención, el compuesto orgánico tiene la fórmula (II) Z-A-N+R2R3R4 (II) o si por lo menos un sustituyente del grupo que comprende R2, R3 y R4 es hidrógeno, la forma protonar del mismo, en donde R2, R3 y R4 son seleccionados independientemente entre si del grupo que comprende hidrógeno, metilo, etilo, propilo, 2-propilo, butilo, t-butilo, pentilo, hexilo, bencilo, hidroxilo, alquilo o alquenilo lineal o ramificado o cíclico sustituido o sin sustituir, en donde A representa una cadena de hidrocarburos que comprende por lo menos tres átomos de carbono, preferiblemente como un grupo alquenilo sin sustituir y en donde Z es seleccionado del grupo que comprende - COOH, -C00R5, -COH, -CH20H y forma sin protonar de los mismos, en donde R5 es seleccionada del grupo que comprende hidrógeno, metilo, etilo, propilo, 2-propilo, butilo, t-butilo, pentilo, hexilo, bencilo, hidroxilo, alquilo o alquenilo lineal o ramificado o cíclico sustituido o sin sustituir.

En una novena modalidad de un cuarto aspecto de la presente invención, que también representa una modalidad de la primera a octava modalidad de la presente invención, el compuesto orgánico tiene la fórmula III NH3+-A-C00R] (III), o una forma sin protonar del mismo, en donde R1 es hidrógeno, metilo o etilo y A es un grupo alquileno lineal sin sustituir con por lo menos tres átomos de carbono.

En una décima modalidad de un cuarto aspecto de la presente invención, que también representa una modalidad de la primera a novena modalidad de la presente invención, el intercambiador de catión liquido tiene por lo menos un grupo alquilo o alquenilo con por lo menos seis átomos de carbono y un sustituyente terminal del grupo que comprende -COOH, OS02H, -0P0(0H)2- and -OPO(OH)0- y forma sin protonar de los mismos .

En una undécima modalidad del cuarto aspecto de la presente invención, que también representa una modalidad de la primera a decima modalidad de la presente invención, el intercambiado de catión liquido es un ácido graso insaturado, preferiblemente ácido oleico.

En una duodécima modalidad del cuarto aspecto :"dé la presente invención, que también representa una modalidad de la primera a undécima modalidad de la presente invención, la solución acuosa comprende además un agente biológico con actividad catalítica.

En una decimotercera modalidad del cuarto aspecto de la presente invención, que también representa una modalidad de la primera a duodécima modalidad de la presente invención, el agente biológico es una célula, preferiblemente' una célula bacteriana .

En una decimocuarta modalidad del cuarto aspecto de la presente invención, que también representa una modalidad de la primera a decimotercera modalidad de la presente invención, la presencia del compuesto orgánico tiene un efecto adverso sobre la actividad catalítica.

En una decimoquinta modalidad del cuarto aspecto de la presente invención, que también representa una modalidad- de la primera a decimocuarta modalidad de la presente invención, la solución orgánica contiene además un solvente orgánico, preferiblemente un ácido graso y/o un éster de ácido graso.

En una decimosexta modalidad del cuarto aspecto de la presente invención, que también representa una modalidad de la primera a decimoquinta modalidad de la presente invención, la solución orgánica comprende como intercambiador de catión liquido 20 a 80% en volumen, preferiblemente 25 a 55% en volumen de ácido oleico y metil éster de ácido láurico como solvente y el compuesto orgánico es metil éster de ácido 12-aminolaurico y en la solución acuosa una célula bacteriana está presente que tiene actividad catalítica involucrada en la síntesis de metil éster de ácido 12-aminolaurico .. , En un quinto aspecto, el problema a ser resuelto por la invención es resuelto por un bioreactor que comprende una solución acuosa que comprende un agente biológico y una solución orgánica hidrofóbica que comprende un intercambiador de catión liquido. En una modalidad preferida de la presente invención, el término "bioreactor" como es usado en la presente, significa cualquier recipiente en el cual microorganismos biotecnológicamente utilizables son cultivados en condiciones controladas y/o pueden ser usados para un proceso biotecnológico, preferiblemente la síntesis de un compuesto orgánico.

En una segunda modalidad del quinto aspecto, que es también una modalidad de la primera modalidad del tercer aspecto de la presente invención, el intercambiador de catión liquido es un ácido graso, preferiblemente ácido oleico.

En una tercera modalidad del quinto aspecto, que es también una modalidad de la segunda modalidad del tercer aspecto de la presente invención, la solución orgánica hidrofóbica comprende además un éster de ácido graso, preferiblemente metil éster de ácido láurico.

En una cuarta modalidad del quinto aspecto,: que es también una modalidad de la primera modalidad a tercera modalidad del tercer aspecto de la presente invención, la solución orgánica hidrofóbica comprende ácido oleico como intercambiador de catión y 25 a 75% en volumen de metil éster de ácido láurico como solvente.

En una quinta modalidad del quinto aspecto, qué es también una modalidad de la primera modalidad a cuarta modalidad del . tercer aspecto de la presente invención, el compuesto orgánico es un compuesto de acuerdo con una de las modalidades del primer aspecto de la invención.

En un sexto aspecto, el problema a ser resuelto por la presente invención es resuelto por un método para producir un compuesto orgánico con una o más cargas positivas, en donde el compuesto orgánico es tóxico a la células, gue comprende cultivar, en una solución acuosa, células involucradas en la síntesis del compuesto orgánico, preferiblemente células que catalizan por lo menos una etapa de la síntesis, en presencia de una solución orgánica hidrofóbica que comprende un intercambiador de catión liquido y opcionalmente un solvente orgánico.

En una segunda modalidad del sexto aspecto de la presente invención, el compuesto orgánico es ácido 12-aminolaurico o metil éster del mismo y el solvente orgánico es metil éster de ácido láurico. ¦¦ : Modalidades adicionales del cuarto, quinto y sexto aspecto comprenden todas las modalidades del primero y segundo aspecto de la presente invención.

Los inventores de la presente invención encontraron que la eficiencia de separación de un compuesto orgánico con una o más cargas positivas de una solución acuosa a una solución orgánica hidrofóbica puede sorprendentemente ser incrementada cuando dicha solución orgánica comprende un intercambiador de catión liquido. Sin desear estar limitados a alguna teoría, los inventores de la presente invención suponen que la carga negativa o las cargas negativas del intercambiador de catión líquido interactúa/interactúan iónicamente con una carga positiva o las varias cargas positivas de los compuestos orgánicos y que esta interacción conduce a un enmascaramiento de por lo menos una carga positiva, lo que incrementa la solubilidad de la fase orgánica.

En una modalidad preferida, el término "intercambiador de catión líquido", como se usa en la presente, significa ún compuesto que es soluble en un solvente orgánico hidrofóbico y debido a una o más cargas permanentes negativas es apto de entrar a una interacción con por lo menos un catión. Un intercambiador de catión líquido comprende comúnmente por lo menos una cadena de hidrocarburo saturada o insaturada, que puede ser lineal o ramificada y un grupo cargado negativo, por ejemplo un grupo carboxilo. En una modalidad preferida, el intercambiador iónico líquido es un ácido graso, en una modalidad más preferida es un ácido graso insaturado, por ejemplo ácido oleico. En una modalidad preferida el intercambiador iónico líquido es ácido bi (2-etilhexil ) fosfórico (también llamado DEHPA o D2EHPA) .

En una modalidad preferida, el intercambiador de ion líquido no solamente tiene una carga total negativa, sino aún ninguna carga positiva. En una modalidad preferida, el término, "carga total" del intercambiador iónico o de alguna otra molécula, como se usa en la presente, significa el total de las cargas de todos los grupos funcionales enlazados covalentemente a la molécula. Por ejemplo, a pH 7, el ácido láurico tiene una carga negativa como carga total,, sin consideración de la presencia de otras moléculas o contra iones tales como iones potasio que están presentes en la solución acuosa.

En una modalidad preferida de la presente invención, el término "contacto" como se usa en la presente, significa que dos fases están expuestas entre si directamente y en particular sin interponer una barrera física tal como una membrana. En el caso más simple el contacto se lleva a. cabo al poner las dos fases en el mismo recipiente y mezclarlas con untamente de manera apropiada, por ejemplo, mediante agitación .

En una modalidad preferida, el compuesto orgánico tiene una carga total positiva. En otra modalidad preferida, el compuesto orgánico no tiene cargas negativas. En una modalidad preferida, el compuesto orgánico es un ácido ?-amino carboxilico.

En una modalidad preferida, el término "tiene una carga" como se usa en la presente, significa que un compuesto así designado tiene una carga correspondiente en solución acuosa a pH 0 a 14, preferiblemente 2 a 12, 2 a 6, 8 a 12, 3 a 10, 6 a '8, mas preferiblemente a pH 7. En una modalidad preferida es una carga que está presente permanentemente. En otra modalidad preferida, el término "tiene una carga", como se usa en la presente, significa que el grupo o compuesto funcional correspondiente tiene a pH 7, principalmente la carga correspondiente, esto es, a por lo menos 50, mas preferiblemente 90 y aun mas preferiblemente 99%.

En una modalidad preferida de la invención, el término "que contiene" se comprenderá en el sentido de "que comprende", esto es, no concluyente. Una mezcla que contiene A puede en este sentido tener otros constituyentes además de ?. La formulación "una o más cargas" significa por lo menos una carga de la naturaleza correspondiente.

En una modalidad preferida, el término "hidrofóbico", como se usa en la presente, significa la propiedad de un liquido para formar, en presencia de una fase acuosa, su propia fase liquida claramente delimitada de la fase- acuosa. Puede ser una fase liquida continua o una emulsión. En otra modalidad preferida, el término "hidrofóbico" como s'e usa en la presente, significa la propiedad de un compuesto de no disolverse esencialmente en agua. Finalmente, en otra modalidad preferida, como se usa en la presente, el término será entendido en que un compuesto asi designado tiene un valor de P (J. Sangster, Octanol-Water Partition Coeffi.cients : Fundamentáis and Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John iley & Sons, Chichester, 1997), cuyo logaritmo común es mayor de 0, preferiblemente mayor de 0.5,. mas preferiblemente mayor de 1 y más preferiblemente mayor de 2.

En otra modalidad de la presente invención, el intercambiador de ion liquido no tiene o tiene solamente una acción tóxica moderada sobre microorganismos biotecnológicamente relevantes. El término "acción tóxica" como se usa en la presente, significa en una modalidad preferida de la invención la propiedad de un compuesto, cuando está en contacto con los microorganismos correspondientes, para disminuir su velocidad de crecimiento, para disminuir su actividad metabólica, para incrementar su consumo de energía, para disminuir su densidad óptica o el número de células viables y/o para conducir directamente a su muerte y lisis. En una modalidad preferida, por lo menos de estos efectos de un compuesto tóxico ya es obtenido a baja concentración, preferiblemente a una concentración de 1000, mas preferiblemente 100, aun mas preferiblemente 50 o 25 o más preferiblemente 5 mg/1. La persona experimentada en el arte sabe de numerosos métodos para uso de rutina, por medio de los cuales la toxicidad puede ser investigada. Estos incluyen por ejemplo medición de la respiración de microorganismos correspondientes por medio de electrodos de 02 o deposición comparativa de muestras de microorganismos y conteo subsecuente de unidades que forman colonias (CFU) . En una modalidad preferida, "acción tóxica moderada" significa que los microorganismos que están en una fase de crecimiento continúan creciendo y/o son metabólicamente activos en presencia del compuesto, pero a una extensión menor que para un testigo que es incubado en las mismas condiciones en ausencia del compuesto correspondiente y/o tienen una fase de retraso alargada.

El contacto de la solución acuosa y solución orgánica toman lugar en condiciones apropiadas y en particular por un periodo que es suficiente para la transferencia suficiente del compuesto orgánico de la fase acuosa a la fas orgánica, idealmente a un para el establecimiento del equilibrio correspondiente. Este periodo de tiempo y condiciones pueden ser determinadas por la persona experimentada en los experimentos de rutina del arte.

En una modalidad especialmente preferida, el compuesto orgánico que tiene una o más cargas positivas es un ácido graso aminado terminalmente, especialmente de preferencia ácido 12-aminolaurico o un áster del mismo o una mezcla de los dos compuestos. La persona experimentada en el arte apreciara que un éster de un ácido graso, puede, en presencia de un sistema biológico que comprende actividades de esterasa, estar parcialmente en forma del ' ácido correspondiente y en relación a esto los dos compuestos pueden ser considerados a aquella extensión como equivalentes. Asi, en una modalidad especialmente preferida, como se usa en la presente, los ácidos grasos o derivados de ácido graso también comprenden los esteres correspondientes, preferiblemente metil éster y viceversa.

En una modalidad especialmente preferida, el término "grupo alquileno" como se usa en la presente, significa un grupo de formula -(CH2)n~ esto es, un alcano con dos sustituyentes que son dejados abiertos y son preferiblemente terminales. Los dos sustituyentes pueden ser por ejemplo un grupo amina y un grupo carboxilo. En una modalidad preferida, n es de por lo menos 3, más preferiblemente por lo menos 6, más preferiblemente 11. En el caso de una "cadena de alquileno sustituida", por lo menos un átomo de hidrogeno es reemplazado con un sustituyente diferente de un átomo de hidrogeno o un residuo de alquilo, preferiblemente otro átomo tal como un átomo de hidrogeno. Sin embargo, en una modalidad especial, el término "grupo alquileno sin sustituir" como se usa en la presente, significa una cadena de hidrocarburo de fórmula -(CH2)n-, sin dicho sustituyente. : :': La temperatura en la etapa b) depende no solamente de las propiedades del intercambiador de catión liquido sino especialmente para el caso cuando el contacto de la solución acuosa y solución orgánica toma lugar a medida que la reacción procede, en la fase acuosa, también de los requerimientos de temperatura de cualesquier reacciones que toman lugar en la fase acuosa. Especialmente, para el caso cuando un agente biológico tal como una célula viviente es catalíticamente activa en la fase acuosa, la temperatura debe ser apropiada para mantener esta actividad. En una modalidad preferida, la temperatura en la etapa b) es de 0 a 100°C, más preferiblemente 20 a 80°C, 28 a 70°C, 30 a 37°C, 35 a 40°C.

El pH en la etapa b) debe también tomar en cuenta los requerimientos de cualesquier reacciones que toman lugar simultáneamente y la habilidad de eductos, productos, intermediarios o reactivos. En una modalidad preferida, el pH es de 3 a 8, más preferiblemente 6 a 8, aún más preferiblemente 6.2 a 7.2.

Con el fin de transferir el compuesto orgánico de la fase . acuosa a la fase orgánica tan completamente como sea posible, una cantidad suficiente del intercambiador de catión líquido es requerida. En una modalidad preferida de la presente invención, la proporción molar de intercambiador de catión líquido y compuesto orgánico en por lo menos una etapa sumada en un proceso continuo sobre el curso total de la reacción, es por lo menos 1, esto es, por lo menos una molécula de intercambiador de catión líquido es usada por molécula del compuesto orgánico. En una modalidad aún más preferida, la proporción es mayor que 2, 3, 5, 10, 15 o 20, preferiblemente 1.5 a 3.

La proporción volumétrica de la solución orgánica a la solución acuosa es, junto con la proporción molar del intercambiador de catión/compuesto orgánico, importante para un proceso eficiente. En una modalidad especial, es de 100:1 a 1:100, preferiblemente 20:1 a 1:20, más preferiblemente 10:1 a 1:10, 4:1 a 1:4, 3:1 a 1:3 o más preferiblemente 1:2 a 2:1.

En una modalidad preferida de la presente invención, un ácido graso es usado como un intercambiador de catión liquido. En una modalidad preferida de la presente invención, el término "ácido graso" como se usa en la presente, significa un ácido carboxilico, preferiblemente ácido alcanoico, con por lo menos 6, preferiblemente 8, más preferiblemente 10, más preferiblemente 12 átomos de carbono. En una modalidad preferida, son ácidos grasos lineales, en otra modalidad son ramificados. En una modalidad preferida son ácidos grasos saturados. En una modalidad especialmente preferida son insaturados. En otra modalidad preferida es un ácido graso lineal con por lo menos 12 átomos de carbono que comprende un doble enlace, preferiblemente en posición 9. En otra modalidad preferida es un ácido graso insaturado simple, en el cual el doble enlace está localizado en posición' 9 y/o 11. En otra modalidad preferida, el intercambiador de catión liquido es un ácido graso insaturado seleccionado del grupo que comprende ácido oleico, ácido palmitoleico y ácido gadoleico y ácido icosenoico. En la modalidad más preferido es ácido oleico. En una modalidad especialmente preferida es un ácido graso con 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 átomos de carbono, preferiblemente más de 12, más preferiblemente más de 14 átomos de carbono, aun mas preferiblemente con 14 a 28, 14 a 22, más preferiblemente 16 a 18 átomos de carbono.

En otra modalidad preferida, una mezcla de varios ácidos grasos es usada como intercambiador de ion liquido, por ejemplo en forma de aceite de soya o aceite de cardo. Esto comprende una hidrólisis preliminar si es necesario si los ácidos grasos están presentes como ésteres .

En una modalidad especialmente preferida de la presente invención, se usa una combinación de dos intercambiadores de catión líquidos, preferiblemente con por lo menos uno de ellos un ácido graso.

Una ventaja particular de la presente invención es la compatibilidad del método de acuerdo con la invención con procesos biotecnológicos y agentes biológicos usados en los mismos. En una modalidad particular de la presente invención, el término "agente biológico con actividad catalítica"'/ como se usa en la presente, significa un biocatalizador sintetizado por una célula en todas las etapas de purificación, de la célula entera a la molécula aislada. En una modalidad preferida es una célula que expresa enzimas con actividad catalítica. La célula puede ser un procarionte, incluyendo Archaea o un eucarionte, preferiblemente del grupo comprende Pseudomonas, Corynebacterium y E. coli. En una modalidad aún más preferida, el agente es una célula bacteriana, aún más preferiblemente una célula bacteriana gram-negativa, más preferiblemente E. coli. En otra modalidad preferida es una célula eucarióntica, más preferiblemente una célula de hongo, aún más preferiblemente una célula de levadura, más preferiblemente Saccharomyces o Candida, Pichia, especialmente Candida tropicalis. El término "célula" es usado en una modalidad especial en esta solicitud como equivalente e intercambiable con el término "microorganismo". Además, la célula puede ser una célula aislada o una mezcla de cultivos.

La célula usada como agente biológico puede ser viable o puede ser una preparación del mismo, por ejemplo una fracción de membrana o fracción citosolica o un extracto cruda de la célula.

Cuando el agente biológico es una molécula aislada en varias etapas de purificación, esta puede ser todas las moléculas activas catalíticas producidas por una célula. En una modalidad especialmente preferida, es una molécula gue comprende péptidos, polipéptidos, carbohidratos/ ácidos nucleicos o formas mezcladas dé los mismos. En una modalidad más preferida es un polipéptido catalíticamente activo. En otra modalidad preferida es una molécula inmovilizada.

Las funciones catalíticas requeridas para procesos biotecnológicos sintéticos son variadas. En una modalidad preferida, el término "actividad catalítica", como se usa en la presente, es una actividad sintética, esto es, la catálisis de reacción química que comprende la formación de por lo menos un nuevo enlace covalente. En otra modalidad preferida es una actividad de transporte, esto es, la actividad de una molécula para efectuar el transporte de otra molécula de un compartimiento a otro, por ejemplo la absorción de una sustancia del medio acuoso vía una membrana celular al interior de la célula.

En una modalidad especialmente preferida el agente biológico es una célula viviente, que es usada para catálisis en presencia del intercambiador de catión líquido, preferiblemente con el fin de sintetizar un compuesto orgánico con un o más cargas positivas, que es separado subsecuentemente o simultáneamente por medio del intercambiador líquido a una fase orgánica hidrofóbica.

En una modalidad especialmente preferida, la presencia del compuesto orgánico tiene un efecto adverso sobre la actividad catalítica. En una modalidad, esto puede disminuir la cantidad de actividad presente, que puede ser pesada en el sentido de una KM más baja de una enzima. En otra modalidad, la afinidad del agente que tiene actividad catalítica puede ser afectada en el sentido de una KM incrementada de una enzima. En otra modalidad, la especificidad de la actividad catalítica puede ser alterada, por ejemplo de tal manera que convierte preferiblemente una molécula de sustrato diferente de la deseada. En otra modalidad, el compuesto orgánico tiene una acción tóxica sobre una célula como agente biológico.

En otra modalidad, el compuesto orgánico es un compuesto orgánico que disminuye la disponibilidad de un co-sustrato o co-enzima esencial. Este puede ser el caso por ejemplo cuando el compuesto orgánico inhibe una reacción de regeneración correspondiente .

Además del intercambiador de catión líquido, la fase orgánica hidrofóbica puede contener además un solvente hidrofóbico. Esto puede servir para incrementar la capacidad de absorción de un intercambiador de catión líquido en la fase hidrofóbica y para impedir comportamiento indeseable, por ejemplo floculación. En una modalidad preferida, el solvente es un educto de una reacción que toma lugar en la solución acuosa, más preferiblemente el sustrato' dé una reacción enzima-catalizada que toma lugar en la-: solución acuosa. En una modalidad preferida es un éster de ácido graso. En una modalidad especialmente preferida, el solvente es un éster de ácido graso, preferiblemente metil éster de un ácido graso que sirve como intercambiador de catión líquido.

La proporción del solvente, si está presente, en la fase orgánica hidrofóbica es en una modalidad preferida de uno a 99% en volumen (% en volumen) .. En una modalidad preferida, la proporción del solvente es de 10 a 90, más preferiblemente 20 a 80, mas preferiblemente 25 a 75% en volumen.

En una modalidad más preferida del método, el compuesto orgánico es ácido 12-aminolaurico y/o metil éster de ácido 12-aminolaurico que estos son producidos en fase acuosa por una cepa recombinante de E. coli mediante oxidación producida de átomo de carbono terminal del metil éster de ácido láurico como se revela en DE10200710060705 y la fase hidrofóbica comprende 25 a 75% de ácido oleico como intercambiador de catión liquido disuelto en metil éster de ácido láurico como sustrato de reacción.

. La enseñanza de la presente invención puede ser llevada a cabo no solamente secuencias de aminoácido o ácido nucleico exactas de las macromoléculas biológicas descritas en la presente, sino también utilizando variantes de tales macromoléculas, que pueden ser obtenidas mediante cancelación, adición o sustitución de uno o más aminoácidos o ácidos nucleicos. En una modalidad preferida, el término "variante" de una secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos usada en lo siguiente como equivalente e intercambiable con el término "homólogo" como se usa en la presente, significa otra secuencia de ácido nucleico o secuencia de aminoácido, que con respecto a la secuencia de ácido nucleico o aminoácido tipo silvestre original correspondiente tiene una homología, usada en la presente como equivalente a identidad, de 70, 75, 80, -85, 90, 92, 94, 96, 98, 99% o un porcentaje más alto, en donde preferiblemente aminoácidos diferentes de los aminoácidos que forman el centro catalíticamente activo o aminoácidos esenciales para la estructura o plegado son cancelados o sustituidos o los últimos son solo sustituidos conservadoramente, por ejemplo un glutamato en lugar de un aspartato o una leucina en lugar de una valina. El arte previo describe algoritmos que pueden ser usados para calcular la extensión de homología de dos secuencias,. por ejemplo Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics , 3a edición. En otra modalidad preferida de la presente invención, la variante de una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos tiene de preferencia adicionalmente a la homología. de secuencia mencionada anteriormente, esencialmente la misma actividad enzimática de la molécula tipo silvestre o molécula original. Por ejemplo, una variante de un polipéptido enzimáticamente activo como proteasa tiene la misma o sustancialmente la misma actividad proteolítica como la enzima de polipéptido, esto es, la capacidad para catalizar la hidrólisis de un enlace de péptido. En una modalidad especial, el término "sustancialmente la misma actividad enzimática" significa una actividad con respecto a • los sustratos del polipéptido tipo silvestre, que está bien por encima de la actividad de fondo y/o difiere por menos de 3, preferiblemente 2, mas preferiblemente un orden de magnitµd de los valores de KM y/o Kcat que el polipéptido tipo silvestre tiene con respecto a los mismos sustratos. En otra modalidad preferida, el término "variante" de una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos comprende por lo menos una parte y/o fragmento activo de la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos. En otra modalidad preferida, el término "parte activa" domo se usa en la presente, significa una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácidos nucleicos que tiene una longitud más pequeña que la plena longitud de la secuencia de aminoácidos o codifica una longitud más pequeña que la plena longitud de la secuencia de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos o la secuencia de aminoácidos codificada con longitud más pequeña que la secuencia de aminoácidos tipo silvestre tiene sustancialmente la misma actividad enzimática como el polipéptido tipo silvestre o una variante del mismo, por ejemplo como alcohol deshidrogenasa, monooxigenasa o transaminasa . En una modalidad especial, el término "variante" de un ácido nucleico comprende un ácido nucleico cuya hebra complementaria, preferiblemente bajo condiciones severas, se enlaza al ácido nucleico tipo silvestre. La severidad de la reacción de hibridización püede ser determinada fácilmente por la persona experimentada en el arte y depende en general de la longitud de la sonda, la temperatura durante el lavado y la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para hibridización, mientras que las temperaturas más bajas son suficientes para muestras más cortas. Si la hibridización toma lugar en general depende de la habilidad del ADN desnaturalizado para recocerse a hebras complementarias que están presentes en sus alrededores y por supuesto debajo del punto de fusión. La severidad de la reacción de hibridización y condiciones correspondientes son descritas en detalle en Ausubel et al. 1995. En una modalidad preferida, el término "variante" de un ácido nucleico, como se usa en la presente, comprende cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica para la misma secuencia de aminoácidos como el ácido nucleico original o una variante de esta secuencia de aminoácidos en el contexto de la degeneración del código genético.

Polipéptidos apropiados que pueden ser usados' para la producción de compuestos orgánicos de fórmula (I), especialmente alcano monooxigenasas , AlkL, transaminasas, aldehido deshidrogenasa y alanina deshidrogenásas son descritos en el arte previo, por ejemplo en DE10200710060705, EP11004029 o en PCT/EP2011/05383 .

En la modalidad más preferida, la alcano monopxi'genasa es una alcano monooxigenasa del tipo AlkB. AlkB es un óxido reductasa del sistema de AlkBGT de Pseudomonas putida, que es conocida por su actividad hidroxilasa. Es dependiente de otros dos polipéptidos, AlkG y AlkT. AlkT es caracterizado como rubredoxina-reductasa FAD-dependiente, que transmite electrones de NADH a AlkG. AlkG es una rubredoxina, una proteina redox que contiene hierro, que funciona como donador de electrones directo para AlkB. En una modalidad preferida, el término "alcano monooxigenasa del tipo AlkB" como se usa en la presente, significa un alcano monooxigenasa membrana-enlazada. En otra modalidad preferida, el mismo término "alcano monooxigenasa del tipo AlkB" significa un polipéptido con una homología de secuencia preferiblemente incrementada por lo menos 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98 o 99% a la secuencia del AlkB de Pseudomonas putida Gpol (código de base de datos: CAB54050.1). En otra modalidad preferida, el término significa una monooxigenasa citocromo-independiente . En otra modalidad preferida, el término "alcano monooxigenasa del tipo AlkB 5" significa una monooxigenasa citocromo-independiente, que usa por lo menos una rubredoxina u homólogo como donador de electrones. En una modalidad especialmente preferida, el término significa una alcano monooxigenasa citocromo-independiente membrana-enlazada que incrementadamente de preferencia por lo menos 60, 70, 80, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98 o 99% de la secuencia de la' AlkB de Pseudomonas putida Gpol, que necesita como donador de electrones por lo menos AlkG (CAB54052.1) , pero preferiblemente la combinación de AlkT con la reductasa AlkT (CAB54063.1) , en donde AlkG y/o AlkT pueden también ser un homólogo del polipéptido respectivo. El término "secuencia" como se usa en la presente es concerniente con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido y/o la secuencia de ácidos nucleicos que lo codifica. En otra modalidad preferida, una "alcano monooxigenasa del tipo AlkB" como se usa en la presente, es un óxido reductasa citocromo-independiente, esto es, una óxido reductasa que no comprende citocromo como co-factor .

La presente invención es ilustrada adicionalmente por las siguientes figuras y ejemplos no limitantes, de los cuales elementos, modalidades, aspectos y ventajas adicionales de la presente invención se pueden encontrar.

La figura 1 muestra un experimento controlado para confirmar que LAME no tiene acción tóxica, investigada con una cepa W3110 de E. coli y en comparación con solución reguladora del pH de fosfato de potasio como testigo negativo .

La figura 2 muestra la viabilidad de la cepa W3110 de E. coli en forma del número de CFU que la cepa puede formar en ausencia de un intercalador de catión liquido y en presencia de varios intercambiadores de catión líquidos después de 0 horas, 4 horas y 24 horas.

La figura 3 muestra el efecto de usar un intercambiador de catión liquido sobre la toxicidad del cambio en el conteo de células vivas de una W3110 de E. coli en presencia de ALAME 0.2%, DEHPA ajustado con amoniaco ( "D2EHPNH3 2%") o una mezcla de DEHPA/LAME (2%/98%) ("D/L") en presencia de ALAME 0.2%.

La figura 4 muestra el efecto de varios intercambiadores de catión liquido sobre la OTR de la cepa E. coli que produce metil éster de ácido aminoláurico . El segmento fue llevado a cabo como se describe en el ejemplo 4.

La figura 5 muestra la influencia de varios intercambiadores de catión liquido sobre el rendimiento de metil éster de ácido aminoláurico producido por una cepa de E. coli con modificación genética apropiada. El excitamiento fue llevado a cabo como se describe en el ejemplo 4.

Ejemplo 1 : Investigación de la toxicidad del solvente LAME que es usado en composiciones con intercambiadores íe catión liquido Esta prueba demostró la toxicidad relativamente baja de LAME con respecto a microorganismos biotecnológicamente relevantes, que hace a LAME un solvente orgánico apropiado para el método de acuerdo con la invención. Antes de que la determinación de CFU pudiera ser emprendida, una placa de LB 10 g/1 de peptona de caseína, 5 g/1 de extracto de levadura, 10 g/L de NaCl) fue rayada con BW3110 de E. coli e incubada por 24 horas. En la tarde del siguiente día, un precultivo de es placa previamente rayada fue inoculado. Este precultivo tenía un volumen de 50 mi de medio de LB y fue incubado de la noche a la mañana por aproximadamente 16 horas. En el siguiente día, el precultivo con una OD60o de 0.2 fue inoculado en 200 mi de medio 9 (Na2HP04 6.79 g/1; KH2P04 3.0 g/1; NaCl 0.5 g/1; NH4C1 lg/1; solución de elementos en trazas 1 ml/1, pH 7.4. Solución de elementos en trazas: HC1 37% (=455.8 g/1) 36.50 g/1; MnCl2*7H20 1.91 g/1; ZnS04*7H20 1.87 g/1; Na-EDTA*2H20 (Titriplex III) 0.84 g/1; H3BO3 0.30 g/1; Na2Mo04*2H20 0.25 g/1; . CaCl2*2H20 4.70 g/1; FeS0 *7H20 17.80 g/1; CuCl2*2H20 0.15 g/1) con 3% de glucosa (w/v) e incubada por aproximadamente 20 horas. Después de incubación del cultivo principal, las células fueron cosechadas, centrifugadas a 5258 g y 4°C por 10 minutos y con una ODgoo de 30, fueron resuspendidos en 10 mi de solución reguladora del pH Kpi 50 mM a pH 7.4 (o solución del reguladora del pH 25 mM HEPES pH 7.4, cuando las determinaciones de CFU con' ALAME se llevaron a cabo) . Ambas soluciones reguladoras del pH ;;usadas contenían 5% de glucosa (p/v) . Luego, la suspensión bacteriana fue transferida a los matraces de agitación''- las soluciones de las sustancias respectivas fueron agregadas. Después de la mezcla mediante agitación del matraz, 100 µ? de la solución fueron extraídos por pipeta y puestas en 900 µ? de solución estéril preparada. Esto correspondió a la toma de muestras en el punto en el tiempo T0. Las mezclas fueron luego incubadas a 250 rpm y 30 °C. Las CFU fueron determinadas durante un periodo de 22 horas. Primero las muestras fueron tomadas a los puntos en el tiempo t0, t3, t6 y t22. Para algunas muestras, otro, punto en el tiempo de muestra ti.5 fue agregado y además otra serie de dilución adicional fue depositada con el fin de minimizar desviaciones.

La OD600 fue de 60. Las células fueron resuspendidas en 10 mi de solución reguladora del pH de Kpi y luego mezclada en el matraz con 5 mi de LAME al 98% (p/p) . Una etapa de por análisis fue depositada. El número de CFU/ml permaneció constante durante un período de 6 horas. Después de 22 horas, una caída en porcentaje en el conteo de células vivas de solo 30.3% fue registrado.

Ejemplo 2 : Pruebas comparativas en cuanto a toxicidad de varios intercambiadores de catión liquido a microorganismos biotecnológicamente relevantes Este ejemplo muestra la toxicidad más baja de ácidos grasos lineales en relación con otros intercambiadores de catión líquido tales como DEHPA y ácidos grasos ramificados y lineales saturados.

Primero, un precultivo que comprende 20 mi de medio LB en un matraz de deflector de 100 mi fue inoculado con un criocultivo de la cepa correspondiente. El cultivo fue cultivado de la noche a la mañana a 37°C con agitación a 200 rpm y fue usado en el siguiente día para inocular un cultivo principal idéntico a una OD de 0.2. Los cultivos principales (cada uno de 30 mi de medio de LB) fueron luego incubados adicionalmente bajo las mismas condiciones. A una OD de 04 a 0.5 el cultivo principal fue cubierto en cada caso con volúmenes iguales (30 mi) de solvente y fue luego incubado adicionalmente.

Para la determinación del número de CFU (unidades que forman colonias), en las siguientes pruebas muestras de 01 mi fueron tomadas y fueron diluidas en solución de NaCl al 0.9% estéril. Etapas de dilución apropiadas fueron depositadas sobre placas de LB-agar. Después de incubación a 34 °C de la noche a la mañana, las colonias que se habían formado fueron contadas y las CFU fueron determinadas.

Prueba 1 : Comparación de toxicidad entre DE2HPA y un ácido graso saturado como intercambiador catiónico liquido 50% de DEHPA o ácido láurico (15%), en c'adá caso disuelto en LAME y con cantidad equimolar o carga de 25% en mol con ALAME, como intercambiador de catión líquido, fue puesto en contacto con una cepa BL21 (DE3) de E.coli y la influencia de estos dos compuestos sobre la habilidad ,-de la cepa para formar colonias, expresadas en CFU, fue investigada. Se había demostrado en pruebas preliminares que el metil éster de ácido láurico, que debido a carga insuficiente no puede funcionar como intercambiador de catión líquido-es tolerado bien por las cepas usadas.

Tabla 1: Se puede ver que ambos intercambiadores de catión líquidos disminuyen el número de CFU considerablemente, pero cuando se usa ácido láurico, en contraste a DEHPA, algunas células viables están todavía presentes y el ácido graso saturado es por consiguiente preferido como intercambiador de catión líquido.

Prueba 2 : Comparación de toxicidad entre ácidos grasos saturados ramificados y varias cantidades de ácido oleico como intercambiador de catión liquido En este caso dos concentraciones diferentes de ácido oleico fueron usadas y el volumen fue ajustado al agregar la cantidad correspondiente de LAME (metil éster de ácido láurico ) .

Tabla 2: Se puede ver que el número de células viables cuando se usa el ácido oleico ácido graso insaturado j unto con LAME es consistentemente bastante más alta que cuando se usan ácidos grasos saturados ramificados .

Prueba 3 : Comparación de toxicidad entre ácidos grasos saturados lineales y ácidos grasos insaturados como intercambiador de catión liquido En este caso , varias cantidades de un ácido graso insaturado fueron comparadas con un ácido graso insaturado con respecto a su toxicidad cuando son usados como intercambiador de catión liquido. Debido a la solubilidad más baja del ácido graso ácido láurico insaturado, este fue usado en una cantidad más pequeña. Los volúmenes de los varios intercambiadores de catión fueron comparados con LAME. El número de CFU fue determinado al inicio después de 4.5 horas y después de 24 horas.

Como se puede ver de la figura 2, la adición del ácido graso saturado como intercambiador de catión liquido a un en concentración más baja que aquella del ácido graso insaturado efectúa una disminución en CFU, mientras que en el caso del ácido graso insaturado se registra un incremento de CFU.

En general, hay una disminución en toxicidad con los varios intercambiadores de catión liquido investigados en el siguiente orden: DEHPA > ácidos grasos saturados > ácidos grasos insaturados.

Ejemplo 3: Disminución de toxicidad de un compuesto] orgánico cargado positivamente mediante contacto con un intercambiador de catión liquido.

Esta prueba demuestra que por medio de la presencia de un intercambiador de catión liquido, la acción tóxica de un compuesto orgánico cargado positivamente en una fase acuosa, que es un caldo de fermentación, puede ser disminuido, a medida que este compuesto es extraído a la fase orgánica.

El procedimiento experimental básico correspondió a aquel del ejemplo 1.

Ya que ALAME al 0.2% (peso/volumen), disuelto en sistemas acuosos, tiene acción bactericida, esta prueba fue repetida en combinación con D2EHPNH3/LAME 2/98% (peso/peso) en el matraz de agitación, en donde D2EHPNH3 significa D2EHPA cargado cuantitativamente con amonio. Al usar el intercambiador de ion liquido, la transferencia de ALAME a la fase orgánica es mejorada, de tal manera que su concentración en la fase acuosa, en la cual las células están también ubicadas, disminuye. Con el fin de reducir la acción tóxica provocada por D2EHPA se usaron bajas concentraciones de D2EHPNH3 al 2% (peso/peso) .

La primera bacteria fue primero resuspendida en 5 mi (corresponde a la mitad del volumen de la solución reguladora del pH) . 5 mi adicionales de solución reguladora del pH opcionalmente con adición de ALAME al 0.4% (peso/vólumen) y luego opcionalmente con 5 mi de D2EHPNH3/LAME al 2/98% (peso/peso) fueron sometidos a vórtice por un minuto a 3000 rpm. Esta solución fue agregada a la suspensión bacteriana en el matraz de agitación y mezclada. Luego se llevó a cabo la primera toma de muestras.

La solución tenia una consistencia espumosa al inicio de las pruebas, pero esta había desparecido en la segunda toma de muestras en ambas pruebas. La abreviatura "DL" fue usada para D2EHPNH3 (D2EHPA amoniaco-cargado) /LAME al 2/98% (pes/pes) . Entre las tomas de muestras t0 y ti.5 horas, el conteo de CFU/ml se incrementó por 34.3%. De la toma de muestras (ti.5) hasta la última toma de muestras (t22) el conteo de CFU/ml disminuyo por 54.9%. En comparación con el análisis con D2EHPNH3/LAME al 2/98% (peso/pes) sin adición de ALAME al 0.2% (peso/volumen), el conteo de células viables después de 22 horas fue 4.5 veces más alto y a 3.4% no fue significativamente más bajo que el valor medio de los análisis de control en solución reguladora del pH HEPES (véase figura 4). En comparación con el análisis con ALAME al 0.2% (peso/volumen) en el matraz de agitación sin adición de una fase orgánica, el conteo de CFU/ml fue 2800 veces más alto .

Se puede ver que la presencia del intercambiador de catión liquido disminuye la toxicidad del compuesto cargado positivamente, encontrado en este caso del número de CFU restantes .

Ejemplo 4: Pruebas comparativas en cuanto a la toxicidad de varios intercambiadores de catión liquido versus un ácido ?-aminoláurico (ALA) y el microorganismo que produce metil éster (ALAME) La biotransformación del metil éster de ácido láurico al metil éster de ácido aminoláurico fue probada en el sistema de fermentación en paralelo de ocho veces de DasGip con varios intercambiadores iónicos.

Reactores de 1 1 fueron usados para la fermentación. Las sondas de pH fueron calibradas por medio de una calibración de dos puntos con solución estándar de pH 4.0 y pH 7.0. Los reactores fueron llenados con 300 mi de agua y fueron sometidos a autoclave por 20 minutos a 121°C para asegurar la esterilidad. Luego, las sondas de pO2 fueron polarizadas de la noche a la mañana (por al menos 6 horas) . En la siguiente mañana, el agua fue separada bajo el banco limpio y fue reemplazada con medio de alta densidad celular con 50 mg/1 de kanamicina y 34 mg/1 de cloranfenicol . Enseguida, las sondas de p02 fueron calibradas con una calibración de un solo punto (agitador: 600 rpm/gasificación : 10 sl/h de aire) y la alimentación, agente de corrección y las secciones de inducción-agente fueron limpiadas mediante Clean in Place. Para esto, las mangueras fueron enjuagadas con etanol al 70%, luego con NaOH 1 , luego con agua desionizada estéril y finalmente fueron llenadas con los medios respectivos.

El ALA y la cepa de BL21 de E. coli que produce ALAME (DE3) Tlr pBTIO pACYC : Duet [TAcv] fueron primero cultivados en crio cultivo en medio de LB (25 mi en un matraz de deflector de 100 mi) con 50 mg/L de kanamicina y 34 mg/1 de cloranfenicol de la noche a la mañana a 37 °C y 200 rpm por aproximadamente 18 horas. Luego, en cada caso 2 mi son inoculados en un medio de alta densidad celular (glucosa 15 g/1 (30 ml/1 de una solución concentrada de 500 g/1 sometida a autoclave separadamente con gS04*7H20 al 1% y NH4C1 al 2.2%), (NH4)2S04 1.76 g/1, K2HP04 19.08 g/1, KH2P04 12.5 g/1, extracto de levadura 6.66 g/1, citrato de trisodio dihidratado 11.2 g, solución de citrato de amonio hierro 17 ml/1 de una solución concentrada al 1% sometida a autoclave separadamente, solución de elementos en trazas de 5 ml/1 de una solución concentrada sometida a autoclave separadamente (HC1 (37%) 36.50 g/1, MnCl2*4H20 1.91 g/1, ZnS04*7H20 1.87 g/1, ácido etilendiaminatetraacético dihidratado 0.84 g/1, H3B03 0.30 g/1. Na2Mo04*2H20 0.25 g/1, CaCl2*2H20 4.70 g/1, FeS04*7H20 17.80 g/1, CuCl2*2H20 0.15 g/1)) (3 veces cada uno de 25 mi en un matraz deflector de 100 mi) con 50 mg/1 de kanamicina y 34 mg/1 de cloranfenicol e incubado a 37°C/200 rpm por 6 horas adicionales.

Los tres cultivos fueron combinados en un matraz de agitación y la densidad óptica fue determinada como 7.2. Para inocular los reactores a una densidad óptica de 0.1, en cada caso 4.2 mi fueron tomados en una jeringa de 5 mi y los reactores fueron inoculados mediante cánula a través de un septum.

Se usó el siguiente programa estándar: El experimento llevado a cabo puede ser dividido en dos fases, cultivo, en él cual las células van a alcanzar una densidad óptica especificada y la biotransformación subsecuente en la cual la expresión de los genes necesarios para los procesos biotecnológicos de producción de ALAME fue inducido. Los valores del pH fueron ajustados en un lado con amoniaco (12.5%) a pH 6.8. Durante el cultivo y biotransformación, el oxígeno disuelto (DO) en el cultivo fue controlado a 30% por medio de la velocidad giratoria del agitador y la velocidad de gasificación. La fermentación fue llevada a cabo como lote de alimentación, en donde el inicio de alimentación, 5 g/lh de alimentación de glucosa (500 g/1 de glucosa con MgS04*7H20 al 1% y NH4C1 al 2.2%), fue disparada por un pico de DO. Al inicio de la alimentación, la temperatura fue también disminuida de 37 °C a 30 °C. La expresión de transaminasa fue inducida dos horas después del inicio de la alimentación mediante la adición automática de IPTG (1 mM) . La inducción de alk-genes fue efectuada mediante adición manual de DCPK (0.025% v/v) 10 horas después del inicio de la alimentación. La densidad óptica de los caldos de cultivo fue determinada antes del inicio de la biotransformación .

La fase de biotransformación inicio 14 horas después del inicio de la alimentación. Para esto, 150 mi de una mezcla del metil éster de ácido láurico y el intercambiador iónico respectivo (10% en peso/peso) fueron agregados como lote al caldo de alimentación. El ácido di (2-etilhexil-) fosfórico (DEHPA) , ácido láurico, ácido oleico, ácido palmitico, ácido palmitoleico, ácido esteárico y una mezcla de ácidos grasos libres de la saponificación de aceite de cardo fueron usados como intercambiadores iónicos. Con el fin de hacer un grupo amino donador disponible para la transaminasa, 10.7 mi de una solución de alanina (125 g/L) fueron agregados al caldo de fermentación simultáneamente con la adición de la fase orgánica. Para la toma de muestras, 2 mi de caldo de fermentación fueron tomados del recipiente y una porción de estos fueron diluidos 1/20 en una mezcla de acetona-HCl (c(HCl) = 0.1 mol/L) y extraídas. Las muestras fueron tomadas de todos los 8 reactores 1.25 h, 3 h, 5 h, 20 h, 22 h y 25 h después del inicio de la biotransformación. La velocidad de transferencia de oxígeno (OTR) y la velocidad de transferencia de carbono (CTR) fueron determinadas durante la fermentación mediante el análisis del gas de escape en los sistemas de DasGip. La fermentación fue terminada 22 horas después del inicio de la biotransformación. : r.

La cuantificación de ALA, ALAME, DDS, DDSME, LS, LAME, HLS, HLSME, OLS y OLSME en las muestras de fermentación se llevó a cabo por medio de LC-ESI/MS2 con calibración externa para todos los analitos y usando el estándar interno de ácido aminoundecanoico (AUD) .

Se usó el siguiente equipo: Sistema de HPLC 1260 (Agilent; Bóblingen) con auto muestreador (G1367E) , bomba binaria (G1312B) y horno de columna (G1316A) .

Espectrómetro de masas TripelQuad 6410 (Agilent; Bóblingen) con fuente de ESI.

Columna de HPLC: Kinetex C18, 100 x 2.1 mm, tamaño de partícula: 2.6 µ??, tamaño de poro 100 Á (Phenomenex; Aschaffenburg) .

Pre columna: KrudKatcher Ultra HPLC filtro en línea; 0.5 µ?t? de profundidad de filtro y 0.004 mm de diámetro interior (Phenomenex; Aschaffenburg) .

Las muestras fueron preparadas mediante pipeteado de 1900 µL de solvente (mezcla de acetona/ HC1 0.1 N = 1:1) y 100 L de muestra a un recipiente de reacción de dos 2 mi. La mezcla fue sometida a vórtice por aproximadamente 10 segundos y luego centrifugada a aproximadamente 13000 rpm por 5 minutos. El sobrenadante claro fue removido con una' pipeta y fue analizado después de dilución apropiada con diluyente (80% (v/v) ACN, agua doblemente destilada al 20% (v/v) ,! + más ácido fórmico al 0.1%) . Se agregaron 100 µ?, de ISTD mediante pipeta por 900 L de muestra (10 iL a un volumen de muestra de 90 pL) . : .

La separación de HPLC fue llevada a cabo con lia. Columna y/o pre . columna mencionada anteriormente. El volumen de inyección fue de 0.7 µ?, la temperatura de columna 50°C y velocidad de flujo 0.6 ml/minuto. La fase móvil . consistió del eluyente A (ácido fórmico acuoso al 0.1% (v/v) ) y eluyente B (acetonitrilo con ácido fórmico al 0.1% (v/v)). Se usó el siguiente perfil de gradiente.

Tiempo [nrrín] Eluyente A [%] Eluyente B [%] 0 77 23 0.3 77 23 0.4 40 60 2.5 40 60 2.6 2 98 5.5 2 98 5.6 77 23 9 77 23 El análisis de ESI-MS2 se llevó a cabo en modó pósitivo con los siguientes parámetros de la fuente de ESI: ; Temperatura de gas 280°C ¡! : Flujo de gas 11 1/min ;· Presión del atomizador 50 libras/pulgada cuadrada · Voltaje del capilar 4000 V ; " ¦ r : La detección y la cuantificación de los compuestos individuales se llevó a cabo con los siguientes parámetros, en cada caso utilizando un producto iónico como califi<bador y uno como cuantificador Analito Ion precursor Ion producto Tiempo de [m/z] [m/z] residencia[ms] Energía de colisión [eV] DDSME 245.2 167.1 25 6 DDSME 245.2 149.1 50 8 HLSME 231.3 181.2 15 2 HLSME 231.3 163.2 25 5 DDS 231.2 213.2 50 0 DDS 231.2 149.1 25 9 ALAME 230.3 198.1 25 10 ALAME 230.3 163.2 15 10 OLSME 229.2 197.2 50 0 OLSME 229.2 161.1 25 5 HLS 217.2 181.2 35 0 HLS 217.2 163.1 20 4 OLS 215.2 161.2 25 0 Resultados : Si se usa DEHPA como intercambiador de catión como se describe en el arte previo inmediatamente después ; de la adición del compuesto al cultivo hay intrusión de la OTR. La curva cae a cero en un tiempo corto, lo que indi;ca que células metabólicamente activas ya no estén presentes, en el cultivo. DEHPA es asi altamente tóxico para las células.

Si se usa ácido láurico como intercambiador liquido en lugar de DEHPA, hay admitidamente también intrusión de la OTR, pero es menos pronunciada y en el curso de la siguientes 22 horas, las células se recuperan y muestran actividad metabólica incrementada. Asi, el ácido láurico es bastante menos tóxico que el DEHPA.

Resultados aún mucho mejores pueden ser observados cuando ácidos grasos saturados con cadenas de carbono más largas son usados. Si se usan ácido palmitico y ácido esteárico, la dimensión de la curva de OTR es mucho más poco profunda que cuando ácido láurico o a un DEHPA son usados. Se puede concluir de esto, estos ácidos grasos son bastante menos tóxicos.

El uso de ácidos grasos insaturados tales como ácido palmitoleico, aceite de cardo saponificado ; (contiene principalmente ácido linoleico) y ácido oleicó conduce sorprendentemente a resultados aún mejores. Estos' ácido grasos muestran, sorprendentemente, una toxicidad a A más baja que los ácidos grasos saturados.

Referencias : J. Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamental and. Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997.

Asano, Y . , Fukuta, Y . , Yoshida, Y . , y Komeda, H. (2008): The Screening, Characterisation, and Use of w-Laurolactam Hydrolase: A New Enzymatic Synthesis of 12-Aminolauric Acid, Biosc. Biotechn. Biochem. , 72 (8), 2141-2150.

DE10200710060705 (2007) : Células recombinants que producen ácidos ?-aminocarboxilicos o lactamas de los mismos.

F. M. Ausubel (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc.

A. M. Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics , 3a Edición.

Claims (1)

REIVINDICACIONES 1. Un método para separar un compuesto orgánico de una solución acuosa, caracterizado porque comprende las etapas de : a) proveer la solución acuosa que contiene el compuesto orgánico y una solución orgánica hidrofóbica que comprende un intercambiador de catión liquido, en donde el intercambiador de catión liquido es hidrofóbico, b) poner en contacto la solución acuosa y la solución orgánica y c) separar la solución orgánica de la solución acuosa, en donde el compuesto orgánico es un compuesto de formula I NH3+-A-COOR1 (I), en donde R1 es hidrógeno, metilo, etilo o una . carga negativa y A es un grupo alquileno lineal sin sustituir, con por lo menos tres, preferiblemente por lo menos oóho átomos de carbono, I . y en donde el intercambiador de catión liquido '· es un ácido graso. : 2. El método de acuerdo con la reivindióaciórt 1, caracterizado porque la temperatura en la etapa b) ¿s d;e 28 a 70, preferiblemente 30 a 37°C. ! : ! 3. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el pH en la etapa b) es de 6:a 8, preferiblemente 6.2 a 7.2. 4. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la proporción molar de intercambiador de catión liquido al compuesto orgánico es de por lo menos 1. 5. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la proporción en volumen de solución orgánica a solución acuosa es de 1:10 a 10:1. 6. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el intercambiador de catión liquido es un ácido graso con más de 12, preferiblemente con 14 a 22, mas preferiblemente 16 a 18 átomos de carbono., .7. El método de acuerdo con una de las reivindicáciones 1 a 6, caracterizado porque el intercambiador de :catión liquido es un ácido graso insaturado. Preferiblemente ácido oleico o ácido erúcico. 8. El método de acuerdo con una de las reivindicáciones 1 a 7, caracterizado porque la solución acuosa , comprende además un agente biológico con actividad catalítica. 9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque el agente biológico es una célula, preferiblemente una célula bacteriana y la célula; más preferiblemente tiene una alcano monooxigenasa recpmbinjante, una transaminasa recombinante y preferiblemente además · por lo menos una enzima del grupo que comprende una alcohol deshidrogenasa, una alanina deshidrogenasa y el producto genético de AlkL o variantes de los mismos. 10. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 9, caracterizado porque la presencia del compuesto orgánico tiene un efecto adverso sobre la actividad catalítica, preferiblemente entre el compuesto orgánico es un compuesto que es tóxico a la célula. 11. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones l a 10, caracterizado porque la solución orgánica contiene además por lo menos un solvente orgánico, preferiblemente un ácido graso y/o un éster de ácido graso. 12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque la solución orgánica comprendé como intercambiador de catión líquido 20 a 80% en volumen, preferiblemente 25 a 75% en volumen de ácido oleico y como solvente metil éster de ácido láurico y el compuesto orgánico es metil éster de ácido 12-amino láurico y una ¡"Célula bacteriana está presente en la solución acuosa, que. ti^n una alcano monooxigenasa recombinante, una tránsaminasa recombinantes y preferiblemente además por lo menos una enzima del grupo que comprende una alcohol deshidrogenasa, una alanina deshidrogenasa y el producto genético , de ;AlkL o variantes de los mismos. : ' 13. Una mezcla de reacción caracterizada porque comprende una solución acuosa y una solución orgánica hidrofóbica, caracterizada porque la solución orgánica hidrofóbica comprende un ácido graso, preferiblemente un ácido graso con más de 12 átomos de carbono, mas preferiblemente un ácido graso insaturado como intercambiador de catión liquido y en donde la solución acuosa es un compuesto de formula (I) NH3+-A-COOR1 (I), ! en donde R1 es hidrógeno, metilo, etilo o una; carga negativa y A es un grupo alquileno lineal sin sustituir con por lo menos tres, preferiblemente por lo menos ocho átomos de carbono.

1 . La mezcla de reacción de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque la solución acuosa comprende además una célula que tiene una alcano monooxigenasa recombinante, una transaminasa recombinante y preferiblemente además por lo menos una enzima del grupo que comprende un alcohol deshidrogenasa, una: álanina deshidrogenase y el producto genético de AlkL o variantes de los mismos.