KR20130113325A - 화장품 및 의약품 적용의 사용에 적합한 국소 투여된, 피부-침투성 글리코사미노글리칸 제형 - Google Patents

화장품 및 의약품 적용의 사용에 적합한 국소 투여된, 피부-침투성 글리코사미노글리칸 제형 Download PDF

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Abstract

본 발명은 변형된 글리코사미노글리칸을 피부 장벽을 통해 피부의 표피 및 진피층으로 침투를 용이하게 하고, 이에 의해 주사의 필요없이 히알루로난과 같은 글리코사미노글리칸의 진피 투여를 허여하는 국소적 글리코사미노글리칸 조성물, 특히 히알루로난 조성물에 관한 것이다. 표피 및 진피층으로 이들의 히알루로난의 전달 능력을 통해, 본 제형은 진피 회춘(dermal rejuvenation), 향상 (enhancement), 히알루로난 보충(replenishment), 및 보호 치료(protection therapy)의 사용에 적합하다. 또한, 글리코사미노글리칸 조성물은 피부 장벽을 통해 의약품, 폴리펩티드, 단백질 및 유사한 크기의 생체고분자(biomacromolecules)를 포함하는 화장품학적으로 및 약학적으로 활성 성분의 진피 및 경피 전달을 용이하게 하는 전달 장치로 유용하다.

Description

화장품 및 의약품 적용의 사용에 적합한 국소 투여된, 피부-침투성 글리코사미노글리칸 제형{Topically administered, skin-penetrating glycosaminoglycan formulations suitable for use in cosmetic and pharmaceutical applications}
본 발명은 1 내지 10%의 이당류 단량체 단위에 지질 성분의 공유결합을 통해 변형된 글리코사미노글리칸을 피부 장벽을 통해 피부의 표피 및 진피층으로 침투를 용이하게 하고, 이에 의해 주사의 필요없이 글리코사미노글리칸의 진피 투여를 허여하는 국소적 글리코사미노글리칸 제형에 관한 것이다. 특히, 표피 및 진피층으로 이들의 히알루로난의 전달 능력을 통해, 국소 전달 히알루로난보다 더 오랜시간 동안 피부에서 유지된다. 따라서, 본 제형은 진피 회춘(dermal rejuvenation), 향상 (enhancement), 히알루로난 보충(replenishment), 및 보호 치료(protection therapy)의 사용에 적합하다. 또한, 조성물은 피부 장벽을 통해 이들의 통과를 용이하게 하는 폴리펩티드, 단백질 및 기타 유사한 크기의 생체고분자 (biomacromolecules)를 포함하는 치료 화합물에 대한 전달 장치로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 제한 시약으로서 활성화제의 사용에 의해 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합 정도를 조절하는 조성물의 제조방법을 제공한다.
얼굴 노화 과정은 명백한 피부 볼륨과 탄력 톤 모두 손실되는 일련의 예견 가능한 일들로 발생한다. 콜라겐의 감소를 포함한 많은 요인의 결과로 인한 피부의 볼륨 감소는 근육과 피부의 근막의 기초가 되는 피하 지방의 퇴화를 초래하고, 코 옆주름을 제공하고, 턱 라인의 개념을 감소시키며 피부를 거칠게 만든다. 피부의 탄력 톤의 감소는 축 늘어지고 얼굴 조직의 쳐짐을 초래한다. 이러한 효과에 대응하기 위해서, 회춘 과정은 치료된 피부가 원래의 모습이 될 수 있도록 볼륨의 감소와 조직 톤 모두 고치기 위해 노력한다. 이러한 과정은 콜라겐 주사와 같은 조직 충전제, 또는 "리프트(lift)" 수술로 팽팽하게 하는 것, 개별적으로 또는 혼합하여 사용되는 또 다른 선택이 포함될 수 있다.
콜라겐, 히알루로난(hyaluronan) 및 히록시아파타이트(hydroxyapatite)와 같은 많은 잠재적 조직 충전제는 일반적으로 사용 가능하다. 그러나, 이러한 충전제는 주사를 통해 투여되고, 오직 일시적인 효과를 제공하며, 콜라겐, 히알루로난의 경우 종종 12개월 이상 연장하는 것을 실패할 수 있다. 2-5년 지속 가능한 히드록시아파타이트와 1-3년 지속 가능한 자가 지방이식과 같은 장기적인 해결법은 얼굴 볼륨의 손실과 쳐짐을 개선하고, 얼굴 피부의 더 ?은 모습을 복원하기 위해서 피하의 피하지방세포를 사용한다.1,2,3 일주일까지 지속할 수 있는 주사 치료의 후 영향은 붓기, 홍조, 통증, 타박상 및 부드러움을 포함할 수 있다. 또한, 이 치료는 다수의 주사를 통한 숙련된 작용이 요구되며, 주입 부위에 감염의 위험을 가지고 다닌다.
각질형성세포(Keratinocytes)는 아마도 피부에 젊은 외형을 제공하는데 가장 중요한 세포 유형이다. 따라서, 그들은 피부 보습에 필수적이고, 특히 UV 방사선과 같은 환경적 요인에 다른 세포 유형보다 더 빈번히 노출되기 때문에 노화 영향을 받기 쉽다. 또한, 최근의 증거는 유전적으로 결정된 각질형성세포 요인들 또한 내인성 노화 과정의 원인일 수 있다. 각질형성세포는 섬유아세포와 다른 피부 세포의 건강/기능에 영향을 미치는 측분비인자(paracrine factor)를 생성하기 때문에, 각질형성세포의 기능에 해로운 요인들은 또한 피부 세포 기능에 해롭다.
히알루론산염 및 히알루론산으로 알려진 히알루로난은 크고, 음전하를 띈 글리코사미노글리칸 다당류로서, 몸의 도처에 존재하고, 특히 피부에 다량 존재한다.4 표피의 각질형성세포와 진피의 섬유아세포와 같은 세포를 둘러싸고 있는 콜라겐과 다른 단백질 또한 포함하는 세포외 기질에 보관된 부분으로써 존재하는 히알루로난은 진피와 표피층 모두에서 풍부하다.5 비록 젊은 피부는 각질형성세포 층과 진피층 모두에서 주변 세포의 히알루로난이 풍부하지만, 진피층에서 보다 각질형성세포 층으로부터의 히알루로난의 감소가 더 현저하게 노화 피부의 두 층에서 그 양은 감소된다.6
젊은 피부에서, 히알루로난은 각질형성세포를 효율적으로 표피에 집어넣고, 섬유 아세포를 캡슐(세포껍질(cell coat))과 같은 젤리의 진피로 집어넣는다. 이것은 세포에 젊어 보이는 피부의 전형적인 콜라겐과 엘라스틴 생성을 촉진하는 충분한 성장과 영양 요인을 제공한다. 세포 캡슐이나 껍질의 주요 구성 요소인 히알루로난 뿐만아니라, 세포 단백질 및 콜라겐, 프로테오글리칸(PG), 예를 들어 TSG-6 및 기타 글리코사미노글리칸과 같은 다른 물질도 발견되었다. 히알루로난의 3차원 구조는 스스로 얽힐 수 있기 때문에 세포주위에서 메트릭스를 조립하기 위한 이상적인 주형을 제공할 수 있는, 긴 선형사슬을 감지할 수 있는 고분자량인 얕은 나선구조이다. 이러한 캡슐 또는 케이스에 넣기는 일반적으로 히알루로난과 CD44, RHAMM, LYVE 1 기타 세포 수용체의 결합을 통해 세포 주위에서 유지되어 진다. 피부가 노화됨에 따라, 노화된 피부의 탈수 및 쳐짐 현상으로 인해, 진피의 섬유 아세포 및 각질형성세포의 히알루로난 캡슐을 유지하는 능력은 줄어든다.5,7 또한, 피부가 과도한 UV 방사(볕에 탄)로 인해 외상을 입었을 때, 피부에서의 히알루로난 손상의 증가 및 증가된 히알루로난 손상 물질을 초래하여 진피에서 세포에 의한 히알루로난 생성은 감소된다.
히알루로난 캡슐은 세포를 수화 및 보호하는 구조적 메트릭스 단백질뿐만 아니라, 최적의 대사 및 세포의 분화 상태를 유지하기 위한 필수요소인 영양제, 사이토카인, 호르몬 및 성장인자를 포함한다. 메트릭스 형성을 제공하는 능력은 ?은 피부로 촉진하기 위해 히알루로난을 사용하는 기본적인 주요 요인이다. 이차 요인은 혈관 공급으로부터 영양의 확산 및 피부의 탄력성에 영향을 미치는 히알루로난의 점성-탄성(visco-elastic) 특성이다. 전체적으로 이러한 효과는 전형적인 젊은 피부의 결 및 부드러움을 제공한다. 3차 요인은 히알루로난을 공격 및 조각낼 수 있는 UVA/B 방사에 노출된 후에 생성되는 활성산소에 대한 표적을 제공하여 ROS-유도된 손상으로부터 다른 세포인자를 보호하는 세포 주위의 히알루로난의 능력이다. 최종 요인은 각질형성세포 및 섬유아세포에서의 히알루로난의 직접적인 생물학적 효과와 관련된다. 히알루로난은 각질형성세포의 증식과 분화 모두를 촉진시킨다. 예를 들면, 레티노산(retinoic acid)과 같은 인자는 각질형성세포의 분화를 향상시키고, 또한 세포 주의의 히알루로난 껍질을 증가시킨다. 또한, in vitro 또는 in vivo로 각질형성세포에 추가된 히알루로난은 각질형성세포 층의 두께를 촉진시키고, CD44에 의한 각질형성세포 분화 및 케라틴 발현을 향샹시킨다.5 또한, 히알루로난은 높은 수준의 콜라겐 I을 생산하고 고유의 수축성 특성을 가지고 둘 다 주름 형성을 촉진하는 진피 세포인 근섬유아세포로의 전이-분화를 차단함으로써 섬유아세포 분화에 영향을 미친다.
시간이 지남에 따라, 히알루로난 껍질은 감소되고, 노화 과정의 일환으로써 점점 더 세포에 의해 이동하게 된다. 이 감소는 시간이 지남에 따라 발생하는 어느 정도의 산소 유리 라디칼의 쌓임과 일반적으로 조절되는 히알루로난 껍질을 부수거나 조각내는 히알루로니다제의 방출을 촉진하는 발달상의 프로그램(예를 들어, 노화)의 변화 때문이다. 그 결과로 인한 조각은 세포의 리소자임에 의한 히알루로난 껍질의 분해 및 파괴를 초래하는 세포의 흡수 기관을 자극한다. 노화된 피부, 특히 각질형성세포로부터 점점 더 감소될 뿐만 아니라, 히알루로난은 젊은 시절에 UVA/UVB 방사선 노출, 스테로이드의 사용 또는 염증에 의한 결과로 생긴 주름진 피부 부위로부터 대폭 감소되었다.5,6,8,9
히알루로난 수용체 CD44는 각질형성세포 및 피부의 다른 세포에 구성요소로 발현되고, "세포 껍질(cell coats)"로 알려진 층에서 세포 주위의 히알루로난의 유지 및 피부의 적합한 히알루로난 대사에 필수적인 것으로 여겨진다. CD44 수용체는 노화 과정 및 UV 방사선 또는 질병/피부 위축을 일으키는 요인과 같은 노화 요소에 노출되는 동안 피부로부터 손실된다.5,9 히알루로난 수용체와 반대로, 보통은 정상 피부에서 많이 발현되지 않는 RHAMM은 UVA/B 및 다른 상처주는 요인에 노출되면 이것의 발현은 증가된다. RHAMM은 히알루로난을 억제/대사시키는 CD44의 능력을 촉진하는 것으로 생각된다. 비-필수적인 것, TSG-6와 같은 세포외 히알루로난 결합 단백질 또한 진피세포를 둘러싸는 히알루로난 세포 껍질의 생성 및 유지에 중요하다.13
비록 히알루로난이 젊은 피부의 소유로 회복하는데 있어 조직 충전제로서 사용하기 위한 이상적인 특징을 가지고 있다고 알려져 있지만, 일반적으로 피부의 표면 위 보다 피부 장벽 아래에서 그 효과를 생산하는 오직 사용 가능한 물질은 얼굴 주름을 부드럽게 하고 입술과 같은 얼굴 부위의 볼륨을 높이기 위해 주입되는 히알루로난의 교차 결합된 형태이다. 히알루로난의 교차 결합은 주입 주위에서 이의 유지를 향상시키지만, 이러한 주입은 영구적이지 않고, 만약 젊어지게 하는 효과를 보존하기 위해서는 규칙적으로(6-12개월) 반복해야 한다. 그러나, 그 자체로 히알루로난의 교차결합은 히알루로난의 껍질에 의해 세포의 케이스에 넣기 위한 필수적인 중요 특성인 세포 표면 수용체 단백질에 결합하는 이것의 능력을 줄이기 위한 것이라고 여겨진다. 직면한 더 어려운 점은 자리잡는 것 또는 피부 아래에 균일하도록 주입된 히알루로난을 "매끄럽게(smooth)" 하는 어려움을 포함한다. 따라서, 주사 가능한 히알루로난의 사용은 아마도 효과적인 일시적 충전제로서 역할을 할 수 있지만, 이것은 세포-코팅 효과를 제공하는 천연 히알루로난과 같은 방식으로 작용할 수는 없다. 교차 결합된 주사 가능한 히알루로난 충전제의 감소는 아마도 히알루로난의 자원으로서 채울 수 있지만, 히알루로난의 유지는 알려진 진피 세포의 표면의 히알루로난 수용체의 감소와 피부 내에서 히알루로난 감소의 높은 비율 때문에 예상하지 못하였다.
교차 결합된 히알루로난을 포함하는 주사 가능한 충전제는 오직 주름 또는 코입주름 부위에 투여되기 때문에, 이러한 치료는 인접한 부위에 감소된 히알루로난 수준을 보충함으로써 피부를 "회춘(rejuvenate)" 시키기 위해서는 채울 수 없다. 대신, 주입 가능한 치료는 침체된 부위를 채움으로써 젊어진 외형을 제공한다. 그 결과, 주사 가능한 진피의 충전제를 통한 치료는 치료되지 않은 부위의 인접한 부위의 새로운 주름 생성의 방지 또는 지연에 도움이 되지 못하며, 히알루로난 결핍의 기초적인 문제를 해결하지 못하고, 그 결과 피부의 수분이 감소한다.
피부에서 이것의 자연적 존재 및 노화, UV 방사선(볕에 탐 및 광노화) 동안에 이것의 감소 및 다른 피부 외상 때문에, 히알루로난은 주사 가능한 충전제로서 이것의 사용하기 위해서 또한 많은 피부 생성물을 포함한다. 국소적으로 적용된 히알루로난은 각질형성세포의 바깥층을 감싸고 있는 세라미드/케라틴의 소수성 층을 통해 통과를 획득해야만 한다. 그러나, 히알루로난은 다가음이온(polyanion)이기 때문에, 이것은 효율적으로 피부의 각질형성세포 층을 횡단할 것으로 기대되지 않는다. 따라서, 국소 히알루로난은 표면 치료를 유지하거나(예를 들어, 기존의 히알루로난 함유 피부 크림) 또는 만약 피부로의 상당한 침투를 원할 경우, 주사되어야 한다(예를 들면, 교차 결합된 히알루로난이 주입되는 주름의 치료).
히알루로난의 특정 분자 무게는 어느 정도 피부 장벽을 통과할 수 있다는 것이 본 발명이 속한 기술 분야에 보고되어 있다. Brown et al.14는 알려진 침투 촉진제 폴리에틸렌 글리콜 및 벤질 알콜과 함께 제조된 250 및 400 kDa의 분자량을 가진 히알루로난은 피부 장벽을 통과함을 나타낸다. 몇몇 다른 보고들은 40-400 kDa 히알루로난을 포함하는 것으로 보고된 정의되지 않은 조각들이 마우스 및 인간의 피부를 통과할 수 있다고 나타내었지만,5 이것은 또한 400 kDa 이상의 본래의 히알루로난을 국소적으로 투여할 때, 피부를 통과할 수 없음을 나타낸다.5,15 또한, Brown et al.은 히알루로난이 피부 장벽을 통과할 수 있었다고 증명할 수 있었지만, 피부에 투입되는 히알루로난의 비율은 낮았고 히알루로난은 빠르게 혈액으로 지나갔고 빠른 감소를 나타낸 것 또한 분명하였다. Kaya et al.,5는 또한 국소적으로 적용된 히알루로난은 표피층에서 형편없이 유지되고, 진피층에서의 유지는 일시적이었으며, 투여된 히알루로난은 진피 세포 및 각질형성세포에 의해 이동됨을 증명하였다. 따라서, 단지 세포 장벽을 통한 히알루로난의 통과를 가능하게 하는 것은 반드시 유용한 효과를 제공하지 않을 것이다. 많은 사용을 위해서, 히알루로난에 대한 효과를 관찰하기 위해서 연장된 체류 시간 또한 필요하다. 이것은 Schultz et al.에 의해 국소 투여를 통한 히알루로난을 전달하기 위해 경피성 담체의 사용에 의해 강조되어졌다(US 4,808,576). 비록 이러한 적용은 피부장벽을 통한 히알루로난의 통과를 촉진하는데 성공적일지라도, 히알루로난은 피부 내에서 유지되지 않지만 대신 관절과 힘줄의 통과는 계속된다. 또한, 경피성 담체, 그 중 가장 효과적인 것인 DMSO는 일반적으로 장시간 사용과 호환되지 않는다.
Schwach-Abdellaoui과 Malle (WO 2008/000260)은 보습 및 항-주름 특성을 포함하는 두 분자량 조각의 히알루로난을 가지는 조성물을 설명한다. 첫째, 낮은 분자량 조각(50 kDa)은 피부 장벽을 통과할 수 있도록 명시되어 있다. 반면 둘째, 더 높은 분자량 조각(300 kDa)은 피부의 표면에서 우선적으로 축적함으로써 피부 거침이 줄어들 때 이것의 더 뚜렷한 효과를 제공하는 것이 명시되어 있다. 화장품 제조에 전형적인 히알루로난의 이러한 사용은 세안을 할 때 물에 수용성의 히알루로난이 제거되기 때문에 수명이 짧은 외부 충전제에 의존한다. Brown et al.와 관련하여 명시된 바와 같이, 피부 장벽을 통과할 수 있는 히알루로난의 비율은 낮으며, 피부 장벽을 통과할 수 있는 것은 피부 그 자체 내에서의 유지율이 낮다. 그 결과, 국소적으로 적용되는 히알루로난에 의존하기 보다, 현재 메조테라피 (mesotheraphy)16와 같은 바이오회춘(biorejuvenation) 과정은 단독 또는 다른 활성 성분과 함께 주입, 비-교차 결합된 히알루로난을 이용한다.
따라서, 주사를 필요로 하지 않고 피부장벽을 통해 히알루로난의 더 높은 분자량 조각을 전달하는 방법을 개발하는 분야가 필요하다. 더 높은 분자량 히알루로난 조각(예를 들어, >100 kDa)은 더 바이오탄성력(bioresilient)이 있고, 피부에서 본래 발견되는 더 높은 분자량 히알루로난 조각과 더 모방할 수 있을 것으로 기대된다. 히알루로난 조각은 최근에 상처를 회복하고 정상 피부의 생리기능에 치료적 효과를 가졌다고 밝혀졌다. 비록 이러한 조각은 더 높은 분자량 히알루로난 보다 피부를 더 잘 침투하지만, 이들은 피부의 세포외 구획에서 유지되지 않는다.
현재까지, 히알루로난의 많은 예시와 다양한 목적을 위해 지질의 결합을 통해 변형된 다른 글리코사미노글리칸이 있다. Sakurai et al. (US 5,464,942)은 히알루로난을 포함한 하나의 지질 측쇄가 글리코사미노글리칸의 말단 위치 또는 하나의 무작위 내부 위치에 첨가된 지질화 글리코사미노글리칸의 제조를 설명한다. 이러한 조성물은 암세포가 혈관내피세포 및 그들의 세포외 메트릭스에 부착하는 것을 억제할 수 있다고 진술하였다.
Yerushalmi et al. (WO 2006/050246)는 난용성 약물의 표적 약물 전달에 사용하기 위한 히알루로난을 포함하는 미립자 지질화 글리코사미노글리칸 담체의 제조에 대해 설명한다. 지질화 후, 변형된 글리코사미노글리칸은 바깥표면 위에 글리코사미노글리칸의 친수성 부분이 있고, 소수성의 지질 부분이 보호된 내부 표면 내에 자리잡음으로써 구를 형성하는 자기-조립이 명시되어 있다. Margarlit 및 Peer (WO 03/015755)에 의해서 유사한 자기-조립된 나노구(nanospheres) 및 미세구 (microspheres)는 또한 히알루론산, 나노입자(결합된 부위의 ~20%를 차지하는) 또는 극미립자(결합된 부위의 ~33%를 차지하는)에 결합하는 인지질의 양에 의존적으로 형성될 수 있는 것이 기술되었다.
피부를 통한 히알루로난의 통과의 어려움을 강조한 Scott (EP 0295 092 B l)은 국소 적용을 위해 7 내지 50 단당류 단위를 포함하는 히알루론산 조각의 제조를 서술한다. 피부 장벽을 통한 침투는 제형을 위한 활성 촉진제의 첨가, 전달 매개자로서 포스파티딜콜린으로부터 형성된 리포좀의 이용 또는 배터리로 작동되는 이온도입 패치의 이용을 통해 도움이 된다. 그러나, 바람직하게는 7 내지 25 단당류 단위(약 1,300-4,700Da) 히알루로난의 선택된 범위로 언급된 피부장벽을 통해 히알루로난을 전달하는 어려움 때문에, 이러한 제형은 피부 장벽을 통한 더 높은 분자량의 통과에 적당하지 않을 수 있다.
Delia Valle과 Romeo (US 4,851 ,521)은 화장품 및 조직 충전제 뿐만 아니라 필름 및 실의 제조를 포함하는 다양한 적용으로 사용하기 위한 히알루론산의 에스터의 제조를 서술한다. 비록 적용의 다양성에 대해 제시되어 있지만, 변형된 히알루로난 조성물은 히알루로난을 피부 장벽을 통과해 수송할 수 있다는 것을 제공하는 어떠한 교시도 없다. 대신, 피하 및 내피의 투여는 제시되었다.
일반적으로, 분자량이 700 Da을 초과하면 표피의 장벽을 통한 물질의 확산은 급격히 줄어든다. 비록 Pinsky (WO 2009/086504)은 낮은 분자량 콜라겐 조각(8.5 kDa) 및 임의의 히알루로난을 피부로 전달하기 위해서 리포좀을 이용한 피부 보호 조성물을 설명했지만, 더 큰 분자량 콜라겐 및 엘라스틴 뿐만 아니라, 치료적으로 유용한 펩티드 및 단백질, 특히 이러한 리포좀의 사용 및 제조가 필요하지 않다면, 진피로의 전달을 허여하기 위한 방법에 대한 필요는 남아있다. 비록 이것의 높은 생물학적 이용도, 긴 작용의 기간 및 무통의 적용 때문에 경피 전달이 개발을 위한 매력적인 방법이지만, 이것은 침투를 막는 피부 장벽의 유효성 및 장기간 적용을 방해하는 지역 자극에 의해 방해가 된다고 언급한 Antosava et al.17에 의해 펩티드 및 단백질에 대해 경피 전달을 포함하는 표피 전달 기술이 최근에 검토되었다.
비록 피부장벽을 넘어 히알루로난을 전송하는 인지질 기반의 리포좀의 이용에 관한 기술된 보고가 있지만, 이들의 사용과 대부분 명백한 보관에 있어 안정성의 부족과 관련된 많은 문제들이 있다. 또한, 인지질 기반의 리포좀은 화장품으로의 제조에 사용되기 위해 필요한 규모의 제조와 정제에 드는 비용 비싸다.
히알루로난을 포함하는 국소적으로 적용되는 화장료 조성물의 특허 문헌에 있어서 피부장벽을 통한 표피층 및 진피층으로의 히알루로난의 통과를 촉진하는 것에 대해 진술하는 많은 보고에도 불구하고, 이러한 장해성을 만족시키는 상업적으로 이용가능한 화장품 생성물은 없다. 특히, 현재 효과적으로 더 높은 분자량 히알루로난(>250,000 Da)의 충분한 양을 피부 내에서 히알루로난의 유지를 허여하는 국소적 화장품 제형을 이용하여 피부의 표피 및 진피 층으로 전달하기 위한 실행 가능한 방법은 없다. 오히려, 화장품을 목적으로 한, 새로운 충전제 생산물의 개발에 대한 요구는 Hyal-System™와 같은 직접적으로 주사하는 히알루로난 충전제 또는 피부 표면에 일시적으로 존재하는 표면 충전제로의 히알루로난의 사용으로 남아있다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 주사, 리포좀 또는 기타 침투 촉진제 (penetration enhancers)의 사용을 필요로 하지 않고, 변형된 히알루로난을 피부 장벽을 통해 피부의 표피 및 진피층으로 통과시키는 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 피부노화의 징후 및 피부 위축의 다양한 형태에 대한 진피 향상, 히알루로난 보충 및/또는 보호 치료의 사용에 적합한 변형된 히알루로난 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 흉터의 감소에 사용하기에 적합한 변형된 히알루로난 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 히알루로난 보유에 필요할 것으로 생각되고, 노화되고 손상된 피부에서 감소될 것으로 알려진 CD44 및 RHAMM과 같은 히알루로난 수용체의 감소(depletion) 또는 결여(absence)에도 불구하고 진피 세포의 세포외 껍질 (extracellular coats)에서 히알루로난 보유 정도를 증가시킬 수 있는 변형된 히알루로난 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 피부 장벽을 통해 화장품학적으로 및 약학적으로 활성 치료 물질을 전달하는 국소 투여된 담체로서 사용될 수 있는 변형된 히알루로난 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 피부 장벽을 통해 단백질, 폴리펩티드 및 기타 큰 생체고분자 (700 Da 내지 약 400-500 kDa의 분자량)를 국소적으로 전달하는데 사용될 수 있는 변형된 히알루로난 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 피부 내 글리코사미노글리칸의 수준을 보충하고, 히알루로난 모방체로서 작용하고, 화장품학적으로 및 치료적으로 활성 물질을 전달하고, 및 폴리펩티드, 단백질 및 기타 큰 생체분자를 전달하는데 사용하기 위해 피부 장벽을 침투할 수 있는 변형된 글리코사미노글리칸 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 활성화제가 제한 시약으로 사용되어 글리코사미노글리칸에 공유결합된 지질의 양을 조절하는 것을 특징으로 하는, 상기 기재된 변형된 글리코사미노글리칸 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 및 다른 목적은 하기 발명의 개요, 발명 및 실시예의 논의로부터 인식할 것이다.
발명의 개요
본 발명 내에서, 조성물은 피부 장벽을 통해 변형된 히알루로난의 국소 전달을 가능하게 하여 주입할 수 있는 히알루로난-계 충전제로 전달하는 대안 방법을 제공한다. 진피 전달을 용이하게 함으로써, 본 발명의 조성물은 조성물이 적용되는 피부의 감소된 영역을 통하여 히알로난의 보충을 허여하여, 주사의 필요없이 주름 출현의 감소의 결과인 피부에 젊어지는 효과를 제공한다.
또한, 본 발명은 젊은 세포와 관련된 세포(세포 껍질) 주위의 미세환경의 제조, 회복, 또는 보충 방법을 제공하고, 이로써 노화된 외형을 젊게 향상시키고 손상된 외형을 회복하여 피부에 외상을 입힌다.
또한, 본 발명은 약 1 내지 약 15%의 이당류 단량체 단위에 인지질, 글리세로인지질(glycerophospholipid), 글리코지질, 스테로이드, 스핑고지질, 글리코스핑고지질, 및 지방산을 포함하는 양친매성(amphipathic) 지질 성분의 공유결합의 형성을 통해 변형된 히알루로난 및 기타 글리코사미노글리칸을 포함하는 조성물을 제공하고, 이로써 이러한 변형 방법과 함께 변형된 글리코사미노글리칸의 진피 침투를 허여하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 피부 장벽을 통해 변형된 히알루로난을 통과시킬 수 있는 히알루로난에 공유결합된 인지질을 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 진피 향상, 히알루로난 보충 및/또는 보호(예를 들어, 노화 또는 위축성 피부에 대한 수분 층) 치료의 사용에 적합한 피부 장벽을 교차할 수 있는 무독성 변형된 히알루로난을 제공한다.
또한, 본 발명은 치료 물질, 예를 들어, 염증을 억제하고, 피부의 매끄러움 (smoothness) 및 부드러움(softness)을 향상시키고, 상처 회복을 빠르게 하는 프로스타글란딘; 이들의 다른 기능 중 세포 성장을 조절할 수 있는 펩페두신(지질 꼬리를 갖는 아미노산을 함유하는 치료 물질); 피부 내 히알루로난의 분해의 감소를 보조하는 히알루로니다제 저해제; 항-주름 효과를 갖는 것을 설명하는 RHAMM 저해제; 및 보툴리눔 독소, 예를 들어, 타입 A (BOTOX™), 콜라겐, 엘라스틴, 또는 히알루로난 생성효소(hyaluronan synthase)와 같은 기타 펩티드, 펩티드 모방체 및 단백질의 진피 및 경피 전달에 유용한 변형된 히알루로난의 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 피부 내 히알루로난의 수준을 향상시키는 방법을 제공하고, 이로써 표피 및 진피 세포 주위의 더 "젊은(youthful)" 미세환경을 만들고, 세포 기능의 제어 (예를 들어, 진피 세포에 의한 콜라겐 및 엘라스틴 생성; 흉터 타입 콜라겐 I을 생성하고, 진피를 수축하고 주름의 형성에 기여하는 것으로 생각되는 근섬유아세포(myofibroblast)로 진피 섬유아세포의 교차분화 (transdifferentiation)의 차단; 및 진피 세포 기능을 촉진시키는 사이토카인 및 성장인자를 생성하기 위해 각질형성세포(keratinocytes)의 활성화), 각질형성세포의 다층화/증식, 산소 자유 라디칼에 대한 보호, 및 피부의 젊은 외형을 전체적으로 향상시키는 수분 유지를 가져온다.
또한, 본 발명은 UVA/B 조사에 노출, 노화, 화학요법, 방사선 요법 또는 스테로이드 사용으로 인해 흉터, 튼살(stretchmarks), 화상 수축, 섬유증 병변 (fibrotic lesions), 로사시아(rosacea), 피부염(dermatitis) 및 피부 위축의 출현을 감소시키기 위해 피부의 국소 적용에 적합한 변형된 히알루로난을 포함하는 무독성 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 피부의 박테리아 및 바이러스 감염에 대해 보호하고 각질형성세포에 의해 큰 상처(예를 들어, 화상)의 빠른 회복을 촉진시키기 위해 선천성 면역계(innate immune system)를 자극하는 피부의 국소 적용에 적합한 변형된 히알루로난 단편을 포함하는 무독성 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 표피 장벽을 횡단할 수 있으며 이로써 상처 회복의 재생 타입을 향상시키고, 신생혈관형성(angiogenesis)을 촉진하여 손상되지 않으나 면역 반응 따위가 제대로 발휘되지 못하는 피부(예를 들어, 흡연가의 피부)의 외형을 향상시키는데 적합한 무독성 변형된 히알루로난 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 히알루로난에 대해 상기 기재된 바와 같이 이들의 다당류 또는 프로테오글리칸에서 황산 더마탄(dermatan sulfate), 황산 케라틴 및 황산 콘드로이틴과 같은 기타 변형된 글리코사미노글리칸을 통과시킬 수 있는 조성물을 제공한다. 이해될 것처럼, 사용될 글리코사미노글리칸의 선택은 영향받을 치료에 의존할 것이다.
또한, 본 발명은 주름 출현의 감소에서 화장료 적용의 사용을 위해, 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 폴리펩티드의 진피 통과를 허여하는 변형된 히알루로난 또는 기타 글리코사미노글리칸을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 첫 번째 측면에서, 약 1~15%의 반복 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 통해 변형된 글리코사미노글리칸을 포함하는 글리코사미노글리칸 조성물을 제공하고;
여기서 변형될 글리코사미노글리칸은 히알루로난, 히알루로난 유도체, 헥소사민에 결합된 우론산(uronic acid) 또는 헥소오스(hexose)의 반복 이당류 단위로 구성된 다당류, 또는 이의 유도체이며;
변형될 글리코사미노글리칸은 약 2 kDa 내지 2,500 kDa 범위의 분자량을 가지며;
지질 성분은 글리코사미노글리칸에 지질의 공유결합을 허여하는 이의 극성 머리-기 위에 작용기를 함유하면, 하나 이상의 자연적으로 발생하거나 또는 합성적으로 유도된 지방산, 글리세로지질, 인지질, 스핑고지질, 스테롤 지질, 프레놀 지질, 또는 이의 유도체를 포함하며; 및
변형된 글리코사미노글리칸은 거기에 적용되었을 때 피부 장벽 또는 점막을 침투할 수 있으며,
변형된 글리코사미노글리칸은 글리코사미노글리칸이 지질 성분과 반응하여 형성된다.
이러한 측면에서, 글리코사미노글리칸은 바람직하게는 약 1~12%의 반복 이당류 단량체 단위; 더 바람직하게는 약 1~10%의 반복 이당류 단량체 단위; 더욱 더 바람직하게는 약 1~7.5%의 반복 이당류 단량체 단위; 및 가장 바람직하게는 약 2~6%의 반복 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 통해 변형된다. 본 발명의 예시된 조성물은 약 5.5% 또는 약 6%의 반복 이당류 단량체 단위가 변형된 것을 포함한다. 변형될 글리코사미노글리칸은 바람직하게는 약 50 kDa 내지 약 2,500 kDa; 더 바람직하게는 약 100 kDa 내지 약 2,000 kDa; 더욱 더 바람직하게는 약 350 kDa 내지 약 1,500 kDa; 및 가장 바람직하게는 약 500 kDa 내지 약 1,500 kDa 범위의 분자량을 가진다. 변형될 글리코사미노글리칸은 바람직하게는 히알루로난 또는 히알루로난 유도체이고; 더 바람직하게는 글리코사미노글리칸은 히알루로난이다. 바람직하게는, 지질 성분은 이의 극성 머리-기 위에 아미노 기를 함유하고 글리코사미노글리칸의 카복실산 기에 아미드 결합을 통해 글리코사미노글리칸에 공유결합하며; 더 바람직하게는 지질 성분은 하나 이상의 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜세린을 포함하고; 가장 바람직하게는 지질 성분은 하나 이상의 포스파티딜에탄올아민을 포함한다. 바람직하게는, 변형된 글리코사미노글리칸은 피부 장벽을 침투할 수 있다. 더 바람직하게는, 변형된 글리코사미노글리칸은 진피에 전달되었을 때, 변형되지 않은 글리코사미노글리칸 보다 피부 내에서 더 오래 거주하고; 가장 바람직하게는 이 글리코사미노글리칸 히알루로난이다.
본 발명의 두 번째 측면에서, 하나 이상의 화장품학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 함께 혼합한 글리코사미노글리칸 조성물을 포함하는 피부 또는 점막의 적용에 적합한 제제를 제공하며,
여기서 글리코사미노글리칸 조성물은 1~15%의 반복 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 통해 변형된 글리코사미노글리칸을 포함하며;
글리코사미노글리칸은 히알루로난, 히알루로난 유도체, 헥소사민에 결합된 우론산 또는 헥소오스의 반복 이당류 단위로 구성된 다당류, 또는 이의 유도체를 포함하며;
변형될 글리코사미노글리칸은 약 2 kDa 내지 2,500 kDa 범위의 분자량을 가지며;
지질 성분은 글리코사미노글리칸에 지질의 공유결합을 허여하는 이의 극성 머리기 위에 작용기를 함유하면, 하나 이상의 자연적으로 발생하거나 또는 합성적으로 유도된 지방산, 글리세로지질, 인지질, 스핑고지질, 스테롤 지질, 프레놀 지질, 또는 이의 유도체를 포함하며; 및
변형된 글리코사미노글리칸은 거기에 적용되었을 때 피부 장벽 또는 점막을 침투할 수 있으며,
변형된 글리코사미노글리칸은 글리코사미노글리칸이 지질 성분과 반응하여 형성된다.
이러한 측면에서, 글리코사미노글리칸은 바람직하게는 약 1~12%의 반복 이당류 단량체 단위; 더 바람직하게는 약 1~10%의 반복 이당류 단량체 단위; 더욱 더 바람직하게는 약 1~7.5%의 반복 이당류 단량체 단위; 및 가장 바람직하게는 약 2~6%의 반복 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 통해 변형된다. 본 발명의 예시된 조성물은 약 5.5% 또는 약 6%의 반복 이당류 단량체 단위가 변형된 것을 포함한다. 변형될 글리코사미노글리칸은 바람직하게는 약 50 kDa 내지 약 2,500 kDa; 더 바람직하게는 약 100 kDa 내지 약 2,000 kDa; 더욱 더 바람직하게는 약 350 kDa 내지 약 1,500 kDa; 및 가장 바람직하게는 약 500 kDa 내지 약 1,500 kDa 범위의 분자량을 가진다. 변형될 글리코사미노글리칸은 바람직하게는 히알루로난 또는 히알루로난 유도체이고; 더 바람직하게는 글리코사미노글리칸은 히알루로난이다. 바람직하게는, 지질 성분은 이의 극성 머리-기 위에 아미노 기를 함유하고 글리코사미노글리칸의 카복실산 기에 아미드 결합을 통해 글리코사미노글리칸에 공유결합하며; 더 바람직하게는 지질 성분은 하나 이상의 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜세린을 포함하고; 가장 바람직하게는 지질 성분은 하나 이상의 포스파티딜에탄올아민을 포함한다. 바람직하게는, 변형된 글리코사미노글리칸은 피부 장벽을 침투할 수 있다. 더 바람직하게는, 변형된 글리코사미노글리칸은 진피에 전달되었을 때, 변형되지 않은 글리코사미노글리칸 보다 피부 내에서 더 오래 거주한다.
본 발명의 이러한 측면의 제제는 글리코사미노글리칸 조성물에 의해 피부 장벽 또는 점막을 횡단하여; 바람직하게는 피부 장벽을 횡단하여 수송되는 하나 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 추가 성분들 중 본 발명의 이러한 측면에서 간주될 수 있는 성분은 항-산화제, 비타민, 정유, UV-차단제, 또는 기타 영양제가 포함되며, 이들의 적용이 피부의 건강 또는 외형에 유익한 효과를 제공하는 것으로 알려져 있다.
또한, 하나 이상의 추가 성분들 중 본 발명의 이러한 측면에서 간주될 수 있는 성분은 염증, 피부암 또는 피부 장벽을 통해 전달된 피부병의 치료에 적합한 의약품; 바람직하게는 프로스타글란딘과 같은 치료제를 포함한다.
또한, 하나 이상의 추가 성분들 중 본 발명의 이러한 측면에서 간주될 수 있는 성분은 단백질, 펩티드, 펩티드 모방체, 펩두신, 폴리뉴클레오티드, 또는 기타 생체분자를 포함하고; 바람직하게는 이들 하나 이상의 성분은 700 Da 및 500 kDa 사이의 분자량을 가진다. 피부 장벽을 횡단하여 전달된 추가 성분은 콜라겐 또는 엘라스틴을 포함할 수 있다. 추가로, 하나 이상의 추가 성분은 단백질; 바람직하게는 피부 장벽을 횡단하여 전달된 보툴리눔 독소; 더 바람직하게는 보툴리눔 독소 타입 A일 수 있다. 더 바람직한 피부 장벽을 횡단하여 전달될 단백질은 히알루로난 생성효소이다. 또한, 하나 이상의 추가 성분은 펩두신을 포함할 수 있다.
또한, 하나 이상의 추가 성분들 중 본 발명의 이러한 측면에서 간주될 수 있는 성분은 피부 장벽을 횡단하여 전달된 히알루로니다제 저해제 또는 피부 장벽을 횡단하여 전달된 RHAMM 저해제를 포함한다.
본 발명의 세 번째 측면에서, 피부에 자연적으로 존재하는 글리코사미노글리칸의 수준을 보충하는 상기 첫 번째 측면의 글리코사미노글리칸 조성물의 용도를 제공하고, 바람직하게는 이 글리코사미노글리칸은 히알루로난이다. 이러한 측면은 피부 수분의 수준 증가, 피부 노화의 징후 감소, 피부 위축의 출현 또는 예방의 전환, 피부 흉터의 출현 또는 예방의 전환, 광선 각화증(actinic keratinoses)과 관련된 염증의 감소, 신생혈관형성의 촉진(예를 들어, 상처 회복의 재생 또는 손상되지 않으나 면역 반응 따위가 제대로 발휘되지 못하는 피부의 외형을 향상), 및 피부 외상의 효과를 감소시키는 주름 출현의 감소에서 조성물의 용도를 포함한다. 간주될 수 있는 피부 외상의 효과 중 흉터, 튼살, 화상 수축, 섬유증 병변, 로사시아, 피부염 및 피부 위축의 출현 감소가 있다. 이들 외상의 원인 중 효과는 UV 조사, 화상, 의약품의 국소 투여, 및 스테로이드의 사용이다.
본 발명의 네 번째 측면에서, 화장품학적으로 및 치료적으로 활성 성분의 진피 또는 경피 전달로서 상기 첫 번째 측면의 글리코사미노글리칸 조성물의 용도를 제공한다. 화장품학적으로 및 치료적으로 활성 성분 중 본 발명의 이러한 측면에 따라 전달될 수 있는 성분은 히알루로니다제 저해제, RHAMM 저해제, 콜라겐, 또는 엘라스틴이다. 또한, 화장품학적으로 및 치료적으로 활성 성분 중 본 발명의 이러한 측면에 따라 전달될 수 있는 성분은 단백질, 펩티드, 펩티드 모방체, 펩두신, 폴리뉴클레오티드, 또는 기타 생체분자를 포함하고; 바람직하게는 단백질의 전달이다. 단백질의 타입 중 바람직한 전달될 수 있는 단백질은 보툴리눔 독소(바람직하게는 보툴리눔 독소 타입 A) 및 히알루로난 생성효소이다. 또한, 화장품학적으로 및 치료적으로 활성 성분 중 본 발명의 이러한 측면에 따라 전달될 수 있는 성분은 항염증제(예를 들어, 프로스타글란딘)와 같은 의약품일 수 있다. 바람직하게는, 의약품의 진피 전달이다. 이들 중 바람직한 진피 전달을 위한 용도는 피부 염증, 피부암, 피부 알러지, 또는 기타 피부병의 치료; 가장 바람직하게는 피부암의 치료에 유용한 의약품의 전달을 포함한다.
본 발명의 다섯 번째 측면에서, 하기 단계를 포함하는 본 발명의 상기 첫 번째 측면의 글리코사미노글리칸 조성물의 제조방법을 제공한다:
변형될 글리코사미노글리칸을 활성화제로 처리하여 글리코사미노글리칸과 지질 성분의 공유결합을 용이하게 하는 단계;
활성화된 글리코사미노글리칸과 지질 성분을 혼합하는 단계; 및
활성화된 글리코사미노글리칸과 지질 성분을 반응시켜 글리코사미노글리칸에 지질 성분을 공유결합시키는 단계,
여기서, 활성화제는 반응에서 제한 시약이고, 약 1 내지 약 15%의 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 용이하게 하는데 충분한 양을 가한다.
이러한 측면에서, 활성화제는 바람직하게는 약 1~12%의 이당류 단량체 단위; 더 바람직하게는 약 1~10%의 이당류 단량체 단위; 더욱 더 바람직하게는 약 1~7.5%의 이당류 단량체 단위; 및 가장 바람직하게는 약 2~6%의 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 용이하게 하는데 충분한 양을 가한다. 본 발명의 예시된 조성물은 약 5.5% 또는 약 6%의 반복 이당류 단량체 단위가 변형된 것을 포함한다.
본 발명의 이러한 측면에 따르면, 형성될 공유결합은 글리코사미노글리칸의 카복실 기와 극성 머리 기 위에 아민 작용기를 함유하는 지질 성분 사이의 아미드 결합이 바람직하다. 바람직하게는, 활성화제는 카보디이미드이고, 더 바람직하게는, 카보디이미드는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드이다.
본 발명의 이러한 측면에 따르면, 바람직한 변형될 글리코사미노글리칸은 히알루로난이다.
본 발명의 이러한 측면에 따르면, 지질 성분은 하나 이상의 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜세린을 포함하는 것이 바람직하고; 더 바람직하게는, 지질 성분은 하나 이상의 포스파티딜에탄올아민을 포함한다.
따라서, 하나의 측면에서, 큰 히알루로난이 큰(>10kDa) 단백질과 함께 피부로의 침투를 촉진시키는 발명은 이러한 적용에 포함된다.
작용의 어떠한 이론에 의해 구속되지 않고, 발명자는 본 명세서에 기재된 히알루로난-인지질 제형이 수용체 독립된 방법으로 피부 주위의 히알루로난 막의 형성을 촉진시키고 리포좀/나노입자 형성을 막는다고 생각한다.
세포막으로 이의 직접 통합 및 이의 비-미립자 특성(예를 들어, 리포좀 또는 나노입자가 아님)의 결과로서, 세포에 의해 식균 작용(endocytic) 또는 세포흡음 (pinocytic) 흡수의 검출/촉진 및 이의 빠른 파괴를 벗어난다. 이의 도피는 손상되지 않은(intact) 히알루로난-인지질로서 피부 내에 거주 시간이 증가한다.
하기의 도는 본 발명의 다양한 측면 및 바람직하고 대안적인 실시예를 설명한다.
도 1은 본 발명의 히알루로난-포스파티딜에탄올아민 결합체(HA-PE-1)의 적용 후, 변형되지 않은 히알루로난 및 인산염완충액 대조군과 비교하여, 증가한 히알루로난 세포 껍질을 나타내는 인간 진피 섬유아세포의 현미경 사진이다. 대표적인 히알루로난 세포 껍질은 각 영상에서 화살표로 나타내었다.
도 2는 세포 껍질을 가지는 인간 섬유아세포의 백분율에 대해 처리되지 않은 세포에 히알루로난 단독으로 처리된 섬유아세포와 비교하여, 본 발명의 변형된 히알루로난 조성물(HA-PE-1)의 효과를 나타내는 도이다.
도 3은 히알루로난 세포 껍질의 크기에 대해 변형되지 않은 히알루로난을 처리한 세포와 비교하여, 본 발명의 변형된 히알루로난 조성물(HA-PE-1)의 효과를 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명의 히알루로난-포스파티딜에탄올아민 결합체(HA-PE-1), 변형되지 않은 히알루로난 및 완충액(대조군)으로 처리한 후, 히알루로난 껍질을 가지는 히알루로난 수용체(RHAMM-/-, CD44-/- 또는 RHAMM-/-: CD44-/-) 없이 유전자 변형된 마우스 배아 섬유아세포의 수의 차이를 나타내는 도이다. 처리된 섬유아세포로부터의 대표 현미경 사진은 도 5에 나타내었다.
도 5는 본 발명의 히알루로난-포스파티딜에탄올아민 결합체(HA-PE-1), 변형되지 않은 히알루로난 및 완충액(대조군)으로 처리한 후, 히알루로난 껍질을 가지는 히알루로난 수용체(RHAMM-/-, CD44-/- 또는 RHAMM-/-: CD44-/-) 없이 유전자 변형된 마우스 배아 섬유아세포의 대표 현미경 사진이다.
도 6은 본 발명의 변형된 히알루로난 조성물이 함께 사용했을 때 SKL 카탈라제의 효과를 향상시키는 것을 입증하는, SKL 카탈라제, 히알루로난-포스파티딜에탄올아민 결합체(HA-PE-1) 및 SKL 카탈라제와 HA-PE-1의 조합으로 처리된 인간 섬유아세포의 현미경 사진이다.
도 7은 본 발명의 히알루로난-포스파티딜에탄올아민 결합체(HA-PE-1)를 4일 동안 처리하여 국소 적용 후 본 발명의 조성물의 피부장벽을 침투하는 능력을 나타내는 마우스로부터의 피부의 현미경 사진이다. 영상 71(GA-PE-1) 및 73(대조군)은 "["로 표시된 각질생성세포와 함께 20X 확대에서 피부층을 설명한다. 영상 72(처리군) 및 74(대조군)은 화살표로 강조된 대표적인 각질생성세포와 함께 40X 확대에서 피부층을 설명한다.
도 8은 본 발명의 히알루로난-포스파티딜에탄올아민 결합체(HA-PE-1)를 포함하는 크림의 처리 4일 후에 마우스의 피부장벽을 침투하고 각질형성세포 층에서 유지되는 능력을 정량화한 그래프이다. 이 그래프는 도 7에 나타낸 현미경 사진을 정량화한다.
도 9는 4일 동안 처리 후 본 발명의 히알루로난-포스파티딜에탄올아민 결합체(HA-PE-1), 히알루로난과 레시틴의 혼합물(HA+PE), 또는 히알루로난 단독으로 식이요법한 마우스의 피부를 비교한 현미경 사진이다. 각 영상에서 각질형성세포 층은 화살표로 나타내었다. 또한, 4일째에 처리 중단 후, 7일 째에 얻은 피부 샘플의 현미경 사진을 나타내었다.
도 10은 히알루로난과 레시틴의 혼합물(HA+PE) 및 히알루로난 단독 처리된 마우스와 비교하여, 마우스의 피부에 침투할 수 있는 본 발명의 히알루로난-포스파티딜에탄올아민 결합체(HA-PE-1)의 양을 정량화한 그래프이다. 이 그래프는 도 9에 나타낸 현미경 사진을 정량화한다.
도 11은 본 발명의 변형된 히알루로난 조성물의 적용이 적용 부위에 표피 내에서 국부적으로 남아있는 것을 설명하는 현미경 사진이다. 히알루로난 단독 적용은 표피에서 히알루로난의 어떠한 축척도 초래하지 못한다. 적용 가장자리는 화살표로, 적용 부위는 파선 화살표로 나타내었다.
도 12는 도 11의 마우스 피부에서 본 발명의 히알루로난을 처리 및 처리하지 않는 부위의 수준을 정량화한 그래프이다.
도 13은 본 발명의 히알루로난 조성물(HA-PE-2)은 피부 장벽을 침투할 수 있고, RHAMM 히알루로난 수용체(RHAMM-/- 마우스)가 없는 마우스 교배에서 표피 내에서 결합할 수 있는 것을 나타내는 현미경 사진 및 정량화한 그래프이다. 각 영상에서 각질형성세포 층은 화살표로 나타내었다.
도 14는 본 발명의 히알루로난 조성물(HA-PE-2)은 피부 장벽을 침투할 수 있고, RHAMM 또는 CD44 히알루로난 수용체(RHAMM-/-:CD44-/- 마우스)가 없는 마우스 교배에서 표피 내에서 결합할 수 있는 것을 나타내는 현미경 사진 및 정량화한 그래프이다. 각 영상에서 각질형성세포 층은 화살표로 나타내었다.
도 15는 본 발명의 히알루로난-포스파티딜에탄올아민-결합체(HA-PE-2) 및 종래의 기술을 이용하여 제조된 미립자 지질화 글리코사미노글리칸의 현미경 사진이다.
도 16은 마우스에 국소 적용 후, 본 발명의 히알루로난-포스파티딜에탄올아민 결합체(HA-PE-2)의 피부 장벽을 통한 84kDa 단백질(GST-표시된 RHAMM) 및 26 KDa 단백질(GST)을 전달하는 능력을 설명하는 현미경 사진이다. 각질형성세포 층은 "∧"로 나타내었고, 밑에 있는 근육 층은 화살표로 나타내었다.
도 17은 마우스에 본 발명의 히알루로난-포스파티딜에탄올아민-결합체 (HA-PE-2)의 국소 적용 후, 피부 장벽을 통한 GST-RHAMM, 84KDa 단백질의 전달에 대한 도 16의 현미경 사진을 정량화한 그래프이다.
본 발명은 국소 투여 후에 피부 장벽을 통해 변형된 글리코사미노글리칸을 통과시킬 수 있는 조성물을 제공하고, 이로써 이들을 화장품학적으로 및 약학적으로 활성 치료제의 진피 및 경피 전달을 위한 비히클로서 화장료 제형의 사용에 적합하게 제조한다. 이러한 글리코사미노글리칸 조성물은 피부 장벽을 통해 이의 통과를 용이하게 하기 위해 글리코사미노글리칸에 충분한 친유성을 제공하기 위해 약 1 내지 약 15%의 이당류 단량체 단위로 결합 정도를 제한하고, 동시에 이의 글리코사미노글리칸 특성의 유지, 특히 이의 세포 상호작용을 허여함으로써 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 통해 형성된다. 결합 정도는 바람직하게는 약 1~12%; 더 바람직하게는 약 1~10%; 더욱 더 바람직하게는 약 1~7.5%; 및 더욱 더 바람직하게는 약 2~6%, 예를 들어 약 5.5% 및 약 6%의 이당류 단량체 단위이다. 지질 성분을 도입하기 위한 하나의 효과적인 방식은 이의 당류 잔기 위의 글리코사미노글리칸을 통해 위치해 있는 카복실산 기의 결합을 통해서이다. 본 조성물의 제조에서 글리코사미노글리칸에 지질 성분이 결합된 경우, 사용된 이용할 수 있는 결합 위치의 백분율을 고려하는 것이 중요하다.
Margarlit 및 Peer (WO 03/015755)에 의한 가르침 대로, 20~30%의 이용할 수 있는 결합 위치에서 포스파티딜에탄올아민의 공유결합은 불용 또는 난용성 화합물에 대한 담체로서 작용할 수 있는 미립자 나노구(nanospheres) 또는 미세구 (microspheres)를 형성하기 위해 자기 조립하는 조성물을 제공한다. 따라서, 이러한 바람직하지 않은 미립자 구조의 형성을 피하기 위해, 본 발명의 조성물을 제조할 때 더 낮은 결합 정도를 사용하는 것이 필요함을 확인하였다.
본 발명의 변형된 글리코사미노글리칸 조성물을 제조할 경우, 지질 성분은 어느 알려진 방법을 이용하여 글리코사미노글리칸에 공유결합될 수 있으며, 예를 들어, 현존하는 작용기(예를 들어, 카복실산 및 히드록시) 또는 비차폐된 작용기(예를 들어, N-아세틸 기의 부분 가수분해를 통해 일차 아민 제공)에 결합을 포함할 수 있다. 어떠한 형태의 공유결합이 글리코사미노글리칸 및 지질 성분 사이에 사용될 수 있을 지라도, 일반적으로 결합은 체내에서 가수분해될 수 있는 것, 예를 들어 아미드 및 에스터 결합이 바람직하고, 그래서 변형된 글리코사미노글리칸은 이의 자연 형태로 되돌아갈 수 있고, 따라서 피부에 자연적으로 존재하는 글리코사미노글리칸과 지질이 사용되는 경우 이의 최종 생체흡수(bioresorption)를 용이하게 하고 독성 및/또는 알러지 반응을 감소시킨다.
비록 기타 글리코사미노글리칸, 특히 부분적 N-탈아세틸화 히알루로난을 포함하는 히알루로난 유도체가 사용될 수 있을지라도, 본 발명의 글리코사미노글리칸 조성물은 바람직하게는 히알루로난을 이용하여 제조된다. 비록 히알루로난을 제외한 자연적으로 발생하는 글리코사미노글리칸이 단백질에 결합될 지라도, 본 발명의 문맥에서 용어 글리코사미노글리칸은 글리코사미노글리칸의 다당류의 일부를 나타낸다. 본 발명의 조성물에서 사용에 적합한 글리코사미노글리칸은 하기 기재된 크기 필요조건을 충족시키는 우론산 또는 헥소오스로 구성된 반복 이당류 단위로 주로 구성된 어느 길고(long) 가지없는(unbranched) 다당류를 포함한다.
히알루로난은 피부에 높은 수준으로 존재하고, 본 발명의 조성물이 단백질 및 유사한 크기의 생체고분자를 포함하는 화장품 및 의약품 치료제에 대한 전달 장치로서 사용된 경우, 치료 영역에서 치료제의 전달 및 히알루로난 세포막의 향상을 포함하는 이중 효과를 얻을 수 있다. 이러한 이중 효과는, 예를 들어 진피 히알루로난의 수준을 감소시키는 것으로 알려진 글루코코르티코이드의 국소 처리와 함께 관찰될 수 있는 것처럼, 치료제의 국소 전달이 미리 적용 위치에서 피부 손상과 관련있을 때 특히 유리할 수 있다.18 피부에서 기타 자연적으로 발생하는 글리코사미노글리칸(예를 들어, 황산 헤파린, 황산 더마틴, 황산 케라틴, 또는 황산 콘드로이틴)에 비해 히알루로난의 사용에 대한 선호의 추가 이유는 박테리아를 이용하여 생합성 방법을 통해 높은 (>100 Da) 분자량으로 접근이 용이하고, 따라서 동물 자원의 이의 독립적 공급을 하고, 그 결과 동물-유래 물질과 관련된 알러지성 문제를 줄여주는 경향이 있다.
본 발명에서 사용된 글리코사미노글리칸은 일반적으로 약 50 kDa 내지 약 2,500 kDa; 바람직하게는 약 100 kDa 내지 약 2,000 kDa의 분자량을 가질 것이다. 더욱 바람직하게는 글리코사미노글리칸은 약 350 kDa - 1,500 kDa, 및 가장 바람직하게는 약 500 kDa - 1,500 kDa의 분자량을 가진다. 그러나, 단편 히알루로난이 천연 히알루로난보다 더 생리활성적이고 약 2 내지 약 100 kDa의 범위에 있을 수 있기 때문에, 선천 면역(innate immunity), 신생혈관생성 및 상처의 재포장 (resurfacing)과 같은 상처에서 특정 의약 용도의 경우, 최적의 히알루로난 크기는 더 작다.
본 조성물의 지질 성분은 하나 이상의 지질, 바람직하게는 지방산, 글리세로지질, 인지질, 스핑고지질, 스테롤 지질 및 프레놀 지질의 종류로부터 선택된 것으로 구성될 수 있다. 비록 지질 성분이 글리코사미노글리칸에 공유결합된 것이 본 발명의 필요조건일지라도, 본 발명의 조성물은 지질화 글리코사미노글리칸과 공유결합되지 않은 추가 지질도 포함할 수 있다.
글리코사미노글리칸의 변형에서 주어진 지질의 사용을 위한 필요조건만 이의 극성 머리 기를 통해 글리코사미노글리칸에 공유결합될 능력을 가지는 것이다. 치료될 인간 또는 동물에 자연적으로 존재하는 지질의 사용이 선호될 지라도, 이들의 지질-특성이 유지되면 자연적으로 발생하는 지질의 유도체화된 형태 또한 사용될 수 있다. 이러한 유도체화는 지질의 극성 미리 기 위의 이용할 수 있는 작용기가 글리코사미노글리칸에 지질의 결합을 허여하지 않을 때 필요할 수 있다. 유도체화된 지질의 예는 글리코사미노글리칸에 지질의 결합을 용이하게 하기 위해 예를 들어 지질의 극성 머리 기에 일차 아민의 부가를 통해 변형된 것을 포함한다. 이 부분의 친유성 특성이 보존되면, 추가 예는 지질의 친수성 꼬리의 변형을 포함한다. 추가적으로, 필요하다면 글리코사미노글리칸에 결합을 용이하게 하기 위해 추가 유도체화와 함께 자연적으로 발생하는 지질의 입체이성질체 또한 사용될 수 있다. 지질에 어느 필요한 변형을 수행하는 방법은 기술분야의 숙련된 자에게 잘 알려져 있다.
일반적으로, 어느 지방산 단독 또는 지방산 군의 일부로서 또는 기타 지질은 선호되는 12 이상의 탄소 원자를 갖는 것과 함께 본 발명의 조성물에 사용될 수 있으며, 포화, 단일불포화 및 다중불포화 지방산을 포함한다. 비록 인간에서 자연적으로 발생하는 지방산의 사용이 선호될지라도, 이러한 선호는 조성물의 생체흡수의 관점에서 피부 장벽을 통과하는 이들의 능력보다는 독성 및/또는 알러지 부작용에 대한 이들의 더 낮은 잠재력이다. 바람직하게는, 지방산은 단독 또는 12-24 탄소 원자를 함유하는 더 큰 지질의 성분으로서 사용된다. 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있는 단독 또는 더 큰 지질의 일부로서 지방산의 비-제한적인 예는 하기와 같다: 미리스틱(12:0, 테트라데카노익), 팔미틱(16:0, 헥사데카노익), 스테아릭 (18:0, 옥타데카노익), 아라키딕(20:0, 에이코사노익), 및 베헤닉(22:0, 도코사노익) 포화 지방산; 팔미톨레익(16:l(n-7), cis-9-헥사데세노익), 페트로셀리닉(18: l(n-12), cis-6-옥타데세노익), 올레익(18:l(n-9), cis-옥타데세노익, cis-박세닉 (18:l(n-7), cis-11-옥타데세노익), 에루식(erucic) (22:l (n-9), cis-13-도코세노익 단일불포화 지방산; 및 리놀레익(18:2(n-6), 9,12-옥타데카디에노익), γ-리놀레닉(18:3(n-6), 6,9,12-옥타데카트리에노익), α-리놀레닉(18:3(n-3), 9,12,15-옥타트리에노익), 아라키도닉(20:4(n-6), 5,8,11,14,17-에이코사테트라에노익), EPA (20:5(n-3), 5,8,11,14,17-에이코사펜타에노익), 및 DHA(22:6(n-3), 4,7,10,13,16,19-도카사헥사에노익) 다중불포화 산. 이들의 천연 형태로 사용된 것 이외에, 상기 지방산은 산 머리 기를 알콜 또는 아민, 이탈기(leaving group)로서 더 유도체화된 알콜, 또는 이탈기로 전환함으로써 글리코사미노글리칸에 공유 또는 비공유 결합을 더 용이하게 하기 위해 변형될 수 있다. 또한, 지방산은 짧은 스페이서를 가하여 유도체화될 수 있으며, 예를 들어, 2-아미노에탄올, 에틸렌 글리콜 또는 바람직한 작용기를 갖는 기타 에탄올 유도체와 함께 에스터의 형성일 수 있다. 이러한 변형된 지방산을 제조하기 위해 필요한 모든 화학은 유기 합성에서 숙련된 화학자에 의해 통상적이고 알려진 것으로 생각된다. 명백해야되는 바와 같이, 필수 지방산, 즉 아라키돈산, 리놀레산 및 리놀렌산과 같은 인간 조직에서는 생성되지 않고 식사를 통해 얻어야 하는 지방산, 및 EPA 및 DHA와 같은 이들의 대사산물의 사용은, 특히 본 발명에서 이들의 기능 이외에 본 발명의 조성물이 생분해되는 것처럼 피부 장벽을 통해 히알루로난의 전달에서 이들의 사용 후 식사로부터 별도로 이런 영양물질의 추가 자원을 제공한다. 필수 지방산의 사용은 더 큰 지질의 일부로서, 또는 지질화 글리코사미노글리칸에 공유결합되지 않으나 지질화 글리코사미노글리칸에 의해 대신 진피 또는 경피 전달되는 보조 지질로서, 자체일 수 있다. 또한, 유도체화된 지방산의 지질 특성을 유지한다면 치환기를 갖는 또는 탄소 사슬을 따라 가지를 낸 지방산 유도체는 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에서 더 유용한 지방산은 10 내지 30 탄소 원자를 갖는 가지 사슬(branched chain) 지방산을 포함한다. 가지는 포화 또는 불포화 지방산 사슬을 따라 어느 위치에서 치환된 하나 이상의 메틸기를 포함할 수 있고, 또는 더 큰 알킬기를 포함할 수 있다. 기타 유용한 지방산은 지방산 백본 또는 말단 위치를 따라 하나 이상의 지방족 고리(alicyclic ring)를 갖는 것을 포함한다. 또한, 더 유용한 지방산은 히드록시 지방산을 포함하고, 여기서 히드록시는 카복실산 (α- 및 β-히드록시 지방산)의 2개의 탄소 내에 있다. 또한, 히드록시 지방산의 α- 및 β-히드록시 기는 에테르 또는 에스터의 형성을 통해 더 유도체화되어 지질에 두 번째 지방산 사슬을 부가할 수 있고, 이에 의해 이의 친유성 특성을 증가시킨다.
또한, 지방산의 전술한 논의는 지질이 지방산 성분을 함유하는 하기 타입의 지질에서 이의 사용을 적용한다.
지방산의 사용 이외에, 본 발명에서 사용에 적합한 지질도 지방산의 아미드 유사체인 지방 아미드를 포함한다. 바람직한 지방 아미드는 원하는 경우, 지방산이 2-아미노에탄올과 함께 처리되어 아미드로 전환되며, 이로써 더 변형될 수 있는 알콜을 제공하는 것이다. 유사하게, 지방 아미드는 1,2-디아미노에탄과 같은 디아민을 이용하여 형성될 수 있으며, 이로써 글리코사미노글리칸에 결합을 용이하게 하기 위한 일차 아민을 제공한다. 또한, 적당한 지방 아미드는 지방산과 아미노산을 이용하여 형성될 수 있고, 원하는 경우, 더 유도체화될 수 있다.
바람직한 지방 아미드는 항-염증 및 항암 특성을 나타내는 것으로 알려진 아난다미드, N-아라키도노일글리신, 및 염증 치료에 사용될 수 있는 N-팔미토일에탄올아미드를 포함한다. 특히 치료 효과를 갖는 이러한 지방 아미드의 사용은 예를 들어 피부 장벽을 통해 글리코사미노글리칸의 수송을 용이하게 하고 체내에서 지질화 글리코사미노글리칸으로부터 가수분해 후에 이들의 알려진 치료 효과를 제공하는 이중 효과의 지원을 가능하게 한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 글리세로지질은 모노- 및 디아실글리세로지질을 포함한다. 바람직한 글리세로지질은 모노- 및 디아실글리세롤 및 글리코실글리세롤이다. 더 바람직한 글리세로지질은 상기 언급한 바람직한 기로부터 선택된 지방산을 갖는 글리세로지질이다. 또한, 트리아실글리세롤 및 기타 지질의 생합성에서 중간체로 작용할 수 있는 글리세로지질이 바람직하다; 그러나 이러한 선호는 피부 장벽의 침투를 용이하게 하는 이들의 능력보다는 본 발명의 지질화 글리코사미노글리칸으로부터 가수분해에 더 영향을 제공하는 이들의 능력을 기초로 한다. 원한다면 글리코사미노글리칸과 함께 결합 형성의 타입에 따라, 글리세로지질도 스페이서의 사용을 통해 더 유도체화되거나 또는 직접 유도체화되어 일차 아미노 기를 제공하여 글리코사미노글리칸의 카복실산 기와 함께 아미드 형성을 허여할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 사용에 적합한 인지질은 포스파티딜에탄올아민(세팔린 (cephalins)), 포스파티딜세린, 포스파티딜-L-트레오닌, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산(phosphatidic acids), 비포스파티딜글리세롤(카디오리핀(cardiolipins)), 및 포스포 당지질(phosphoglycolipids)을 포함한다. 인지질 중 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨 및 포스파티딜세린이 바람직하다. 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜세린이 더 바람직하다. 포스파티딜에탄올아민이 가장 바람직하다. 피부 침투를 용이하게 하기 보다는 생체흡수의 이유 때문에 자연적으로 발생하는 인지질이 바람직하나, 비-자연적으로 발생하는 인지질도 사용될 수 있다. 비-자연적으로 발생하는 인지질은 포스파티딜콜린과 같은 글리코사미노글리칸에 결합이 적합하지 않은 인지질의 유도체화된 버전인 인지질을 포함하고, 여기서 유도체화는 글리코사미노글리칸에 지질의 공유결합을 가능하게 하는 작용기를 제공한다. 이들의 전통적인 디아실 형태 이외에, 적당한 인지질도 에테르 인지질, 예를 들어, 알킬아실 인지질 및 알케닐아실 인지질을 포함할 수 있다. 또한, 지방산 사슬 중 하나가 가수분해되어 모노아실, 모노알킬 또는 모노알케닐 인지질을 얻는 상기 인지질 중 어느 리소인지질(lysophospholipids)이 본 발명에서 사용에 적합하다. 또한, 글리코사미노글리칸에 인지질의 공유결합을 향상시키거나 또는 방해하지 않는다면, 적당한 인지질은 이들의 머리 기에서 변형될 수 있다.
본 발명의 조성물에서 사용에 적합한 스핑고지질은 스핑고신 및 기타 스핑고이드 베이스, 세라미드, 세라미드 인지질, 및 글리코스핑고지질 (glycosphingolipids)을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 세라미드 인지질은 세라미드가 포스페이트 기에 결합된 스핑고미엘린(sphingomyelin) 이외의 스핑고지질을 나타내고, 세라미드 포스포릴에탄올아민, 세라미드 포스포릴글리세롤, 세라미드 이노시톨, 및 유사한 종류와 같은 스핑고지질을 포함한다. 또한, 스핑고지질로서 또는 세라미드, 세라미드 인지질, 스핑고미엘린, 글리코스핑고지질, 또는 기타 스핑고지질의 성분으로서 단독으로 사용하기 위한 적당한 스핑고이드 베이스는 다양한 탄소 사슬(길이, 불포화, 히드록실화(hydroxylation))을 가지나, 바람직하게는 14-24 탄소 원자를 갖는 스핑고이드 베이스의 유사체를 포함할 수 있다. 스핑고지질로서 또는 세라미드, 세라미드 인지질, 글리코스핑고지질, 또는 기타 스핑고지질의 성분으로서 단독으로 사용하기 위한 바람직한 스핑고이드 베이스는 스핑고신 (d18:1, d18:l△4t, 4E-d18:l, 또는 이의 cis 이성질체: d18:l△4c, 4Z-d18:1), 디히드로스핑고신(d18:0, 스핑가닌(sphinganine)), 파이토스핑고신(t18:0), 및 데히드로파이토스핑고신(dehydrophytosphingosine) (t18:l, t18:l△8t, 8E-t18:l, 또는 이의 cis 이성질체: t18:l△8c, 8Z-t18:l), 및 에이코사스핑고신(eicosasphingosine) (d20:l, 4E-d20:l, d20:l△4t)을 포함한다. 상기 기재된 지질의 종류에 대해, 스핑고지질 중 자연적으로 발생하는 것이 바람직하다. 바람직한 타입의 스핑고지질은 세라미드 포스포릴에탄올아민, 세라미드 포스포릴이노시톨, 및 모노글리코스핑고지질을 포함한다. 또한, 적당한 스핑고지질은 에탄올아민, 세린 또는 기타 적당한 기가 세라미드에 직접적으로 결합된 것을 포함할 수 있다. 기타 바람직한 스핑고지질은 포스포릴에탄올아민, 포스포릴세린, 포스포노에탄올아민, 세린 또는 에탄올아민을 포함하기 위해 당(sugar) 기에 변형된 글리코스핑고지질을 포함한다. 스핑고지질은 자연에서 상기 기재된 것과 같은 글리세롤-계 지질보다 다른 지방산을 갖는 것으로 알려져 있기 때문에, 스핑고지질에서 바람직한 지방산은 상기 제공된 지방산의 일반적인 설명과 다를 수 있다. 따라서, 스핑고지질의 경우, 바람직한 지방산은 28 탄소까지 가질 수 있고, 짝수 또는 홀수의 탄소수를 가질 수 있다. 포화, 단일불포화, 또는 다중불포화일 수 있는 이들 지방산 중, 포화 또는 단일불포화인 16-24 탄소를 갖는 것이 바람직하다.
상기 기재된 포스파티드산-계 인지질 및 스핑고지질 이외에, 본 발명의 조성물은 또한 포스포닐에탄올아민 및 포스포닐-1-히드록시-2-아미노에탄과 같은 포스포노지질 유사체를 이용할 수 있고; 바람직하게는 포스포노지질은 포스포닐에탄올아민이다.
세라미드는 피부의 천연 성분이기 때문에, 나이 또는 질환으로 이들의 감소는 피부 탈수(dehadration), 주름/처짐(sagging), 및 질환 민감성(susceptibility to disease)을 가져오고, 피부에서 세라미드로 가수분해될 수 있는 세라미드 및 세라미드-계 지질의 사용은 이중 효과를 제공한다. 본 발명의 조성물에서 피부 내에서 세라미드로 가수분해될 수 있는 세라미드-계 지질의 사용은 조성물의 분해로 세라미드 수준의 보충에 도움이 되는 자원을 제공할 뿐만 아니라 피부 장벽을 통해 히알루로난의 전달을 도와준다.
본 발명의 조성물에서 사용에 적합한 스테롤 지질은 7β-히드록시콜레스테롤 또는 4β-히드록시콜레스테롤과 같은 알킬 사슬보다는 A 또는 B 고리의 콜레스테롤이 산화된 스테롤과 옥시스테롤을 포함한다. A 또는 B 고리의 콜레스테롤 골격 (skeleton)이 환원된 형태, 즉 탈히드록실화된다면, 알킬 측쇄가 히드록실화되고 임의로 아민으로 전환된 옥시스테롤도 사용에 적합하다. 카복실산으로 산화된 일차 히드록시 기를 갖는 옥시스테롤은, 특히 2-아미노에탄올과 함께 에스터화 할 때 글리코사미노글리칸에 결합을 용이하게 하는 말단 아미노 기를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 스테롤은 일반적으로 포유동물에서 발견되는 것 이외에, 식물-계 스테롤(파이토스테롤)과 같은 다른 유래의 스테롤도 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있다. 유용한 파이토스테롤은 캄페스테롤(campesterol), 시토스테롤(sitosterol), 브라시카스테롤(brassicasterol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 아베나스테롤 (avenasterol)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 스테롤은 상기 스테롤 또는 옥시스테롤 중 A-고리의 3-히드록시 치환기 또는 어느 알킬 측쇄의 히드록시 치환기에 2-아미노에탄올, 이노시톨, 세린, 글리코시드, 포스포릴에탄올아민, 포스포닐에탄올아민, 포스포릴세린, 포스포릴이노시톨, 포스포릴글리코시드, 또는 포스포닐에탄올아민을 가하여 유도체화될 수 있다. 추가적으로, 에스터는 글리코사미노글리칸에 결합을 용이하게 하는 아미노 기를 제공하기 위해 아미노산과 함께 형성될 수 있다.
7-데히드로콜레스테롤(7-dehydrocholesterol)은 피부의 표피층으로 이의 침투 후에 UV 노출로 비타민 D3(콜레칼시페롤(cholecalciferol))로 전환하는 부가적 효과를 제공할 수 있다. 대안적으로, 콜레칼시페롤, 또는 이의 전구체 프로비타민 D3는 지질로서 직접적으로 사용될 수 있다. 또한, 유사한 효과는 UV 조사로 7-데히드로시토스테롤로부터 제조된 에르고스테롤(ergosterol), 비오스테롤(viosterol) 또는 에르고칼시페롤(ergocalciferol) (비타민 D2), 또는 시토칼시페롤(비타민 D5)의 사용을 통해 얻어질 수 있다. 그 결과, (가수분해할 수 있는 결합이 생리적 조건에서 지질의 방출을 허여하도록 사용된다면) 본 발명의 글리코사미노글리칸을 변형시키는데 사용된 지질 성분은, 변형된 글리코사미노글리칸이 체내에서 저하되는 바와 같이 생물학적으로 중요한 지질에 대해 전달 비히클 역할을 할 수 있다. 상기 중 어느 것이 본 발명의 조성물에서 지질로서 사용된다면, 기타 지질에 대하여 사용된 양은 글리코사미노글리칸으로부터 이의 가수분해 후 원하는 비타민 D 보충 양에 따라 변할 수 있다.
스테롤-유래 비타민 D 이외에, 본 발명의 조성물은 비타민 A 및 E와 같은 기타 지용성 비타민, 및 기타 토코페롤, 토코트리엔올, 레티노산(retinoic acid), 돌리콜 및 글리코사미노글리칸에 결합을 용이하게 하는 작용기를 갖는 폴리프레놀을 포함하는 프레놀 지질도 이용할 수 있다. 또한, 이러한 지질은 이용할 수 있는 히드록시 치환기에 2-아미노에탄올, 이노시톨, 세린, 글리코시드, 포스포릴에탄올아민, 포스포닐에탄올아민, 포스포릴세린, 포스포릴이노시톨, 포스포릴글리코시드, 또는 2-아미노에탄올, 세린, 포스포릴에탄올아민, 또는 포스포닐에탄올아민으로 유도체화된 글리코시드를 가하여 더 유도체화될 수 있다. 추가적으로, 에스터는 글리코사미노글리칸에 결합을 용이하게 하는 아미노 기를 제공하기 위해 아미노산과 함께 형성될 수 있다. 글리코사미노글리칸으로부터 이의 절단(cleavage) 후 생물학적 반응을 제공할 수 있는 어느 지질의 사용의 경우, 어느 제제에서 사용된 양은 제공될 바람직한 지질의 양에 의해 결정될 것이다. 또한, 스테롤의 생합성에 사용된 파네실 파이로포스페이트(farnesyl pyrophosphate) 및 프레스쿠알렌 디포스페이트 (presqualene diphosphate)와 같은 프레놀의 디포스페이트 유도체가 유용하다. 바람직한 프레놀 지질은 비타민 A 뿐만 아니라 피부 장벽을 통과한 후 추가적으로 항산화제로 작용할 수 있는 토코페롤(비타민 E 포함) 및 토코트리엔올을 포함하고, 또는 더 바람직하게는 표피의 지질 외층에 기여하는 것으로 알려진 파네솔 (farnesol) 지질뿐만 아니라, 피부에서 콜라겐 생성을 자극하는 것으로 알려진 이의 산화된 형태인 레티노산을 포함한다. 자연적으로 발생하든지 또는 본 발명의 조성물을 통해 제공되든지, 피부에서 항산화제의 존재는 히알루로난의 분해를 막는데 더 도울 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 지질 중 인간에서 자연적으로 발생하는 것이 가장 바람직하나, 이러한 선호는 피부 장벽을 통해 글리코사미노글리칸의 침투를 용이하게 하는 이들의 능력보다는 용이하게 생체흡수하는 이들의 능력, 및 독성 및/또는 알러지 부작용에 대한 이들의 더 낮은 잠재력을 기초로 한다. 본 발명의 조성물은 화장료 및 치료 용도를 의미하고, 따라서 지질이 체내에서 서서히 가수분해되는 것 같이, 조성물은 유의한 독성을 나타내지 않는 것이 바람직하다. 그 결과, 특정 지질을 사용하기 전에, 시험을 수행하여 특정 지질이 독성 효과, 알러지-타입 반응, 또는 피부 내에 방출될 때 자극(irritation)과 관련되는지를 결정할 수 있다. 본 발명의 조성물에서 유용한 다수의 지질은 인간에서 생물학적 효과를 가지는 것으로 알려져 있기 때문에, 사용된 어느 특정 지질의 양은 조성물의 사용을 위해 어느 평가기준 설정(benchmarks set)에 따라 이러한 효과를 이용하거나 또는 피하도록 변형될 수 있다.
지질 종류 중 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고신, 세라미드, 및 세라미드-계 지질로 이루어진 군으로부터 선택된 인지질 또는 스핑고지질이 더 바람직하다. 포스파티딜에탄올아민의 사용이 가장 바람직하다.
하나의 타입의 지질의 부가를 통해 변형된 글리코사미노글리칸 이외에, 본 발명의 글리코사미노글리칸 조성물도 둘 이상의 다른 타입의 지질을 부가한 것을 포함한다. 이것은 친유성 꼬리 부분에서 다른 지방산을 갖는 포스파티딜에탄올아민의 부가, 또는 포스파티딜에탄올아민 및 세라미드-계 지질, 즉 동일한 글리코사미노글리칸에 결합된 지질의 다른 종류의 부가를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 글리코사미노글리칸에 공유결합될 지질은 글리코사미노글리칸의 단당류에 존재하는 카복실산 기와 함께 아미드 형성을 용이하게 하는 일차 아미노 기를 가진다. 대안적으로, 기타 바람직한 종류의 지질은 글리코사미노글리칸의 카복시 기와 함께 에스터 결합을 형성할 수 있는 히드록시 기, 또는 (부분적으로 탈아세틸화된 또는 아세틸화되지 않은 글리코사미노글리칸의 일부로 존재하는) 글리코사미노글리칸의 히드록시와 함께 에스터 결합, 또는 글리코사미노글리칸의 아미노 기와 함께 아미드 결합을 혈성하는 카복실산 기를 가질 수 있다. 상기 논의된 글리코사미노글리칸에 지질의 바람직한 형태의 결합 이외에, 결합은 숙련된 자에게 알려진 기타 알려진 방법에 의해 이루어질 수 있으나, 이들 형태는 덜 바람직하다.
바람직한 결합은 글리코사미노글리칸의 카복실산 기와 아미드 결합을 통한 지질의 아미노 기 사이에서 형성된다. 이러한 결합은 유사한 공유결합된 지질/글리코사미노글리칸 시스템에 대해 기술분야에서 가르침대로 카보디이미드 방법을 이용하여 쉽게 형성될 수 있다(예를 들어, Sakurai et al. in US 5,464,942, Yerushalmi et al. in WO 2006/050246, or Margarlit and Peer in WO 03/015755). 비록 이들이 사용될 수 있을지라도, 본 발명의 제제에서 이 카보디이미드 방법의 적용과 기술분야에서 이전에 사용된 것의 주요 차이점은, 원하는 경우, 결합제의 적은 양을 이용하고 유기용매의 사용이 필요하지 않는 간단한 방법에 달려있다. 유기 용매의 부재, 또는 감소된 양의 수용액에서 결합제의 적은 양을 이용하여 커플링 반응을 수행하여 지질 부분을 글리코사미노글리칸에 결합하는 정도를 한정하고, 이에 의해 최종 생성물에 존재할 수 있는 잠재적으로 알러지 성분의 양을 감소(예를 들어, 결합 반응으로부터 링커 및 부산물의 분해)시킬 뿐만 아니라, 더 높은 (>20% 치환율) 원하지 않은 미립자 나노구 및 미세구의 형성을 방해한다고 생각된다.
실시예 2 및 실시예 3에서 히알루로난에 대해 더 예시된 바와 같이, 아미드 결합의 형성을 통해 지질화 글리코사미노글리칸의 제조에 사용된 간단한 일반적 과정은 하기 단계를 포함한다:
(i) 글리코사미노글리칸을 함유하는 수용액을 지질 또는 지질-함유 혼합물(물 또는 수-혼화성 반-혼화성 용매(water-miscible semi-miscible solvent)에 녹은)과 혼합, 임의로 가열하여 혼합하는 단계;
(ii) 지질 결합의 양을 조절하는 제한 시약의 양으로 결합제, 예를 들어 카보디이미드를 가하는 단계; 및
(iii) 30분 내지 3시간 동안 혼합하여 커플링하는 단계.
하기 실시예에서 사용된 방법에서, 아미드 형성을 용이하게 하는 결합제 카보디이미드는 제한 시약으로, 각 사슬에 결합될 지질 분자의 바람직한 백분율을 기초로 한 양이다. 지질 결합 정도가 사용된 결합제의 양에 의해 조절될 정도로, 지질은 일반적으로 사용된 링커의 몰 과잉(molar excess), 바람직하게는 대량 과잉 (large excess)의 양으로 가해진다. 따라서, 사용된 결합제의 양은 글리코사미노글리칸에 공유 결합될 지질의 이론적 최대 양을 나타낸다. 그 결과, 주어진 제제에서 글리코사미노글리칸에 결합될 수 있는 지질의 최대 양을 더 정확하게 조절하기 위해 본 발명의 조성물을 제조하는 경우, 최근에 구입, 신선하게 정제 및/또는 최근에 분석된 결합제를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 조성물이 피부에 적용될 경우, 유기용매의 사용을 줄이거나 또는 제거할 뿐만 아니라 시약에서 제한 시약으로서 아미드 형성에 사용하기 위한 결합 시약, 예를 들어 카보디이미드의 사용은 알러지 반응에 대한 잠재력을 감소시키는데 유용할 수 있다. 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 결합 후, 원하는 경우, 잔류 결합제, 분해 산물, 및/또는 결합 반응으로부터 부산물을 제거하기 위해 어느 알맞은 방법을 이용하여 제조된 조성물을 임의로 정제할 수 있다. 결합된 조성물의 정제는 본 발명의 조성물의 국소 적용에 대한 예상된 낮은 잠재력의 알러지 반응을 더 감소시키는 것으로 예상된다. 원하는 경우, 정제된 조성물은 추가 지질-결합 단계에서 하나 이상의 지질과 더 반응하여 다른 방법에 의해 글리코사미노글리칸에 결합된 다중 지질 및/또는 지질을 갖는 변형된 글리코사미노글리칸을 제공할 수 있다. 또한, 피부 장벽을 통해 조성물의 수송을 돕기 위해 추가적으로 비공유 결합된 지질을 포함하는 조성물을 제조하는 것이 바람직할 수 있다.
글리코사미노글리칸의 당류 단위에 존재하는 카복실산 기를 지질과 결합시키는 대안 방법은 US 4,851,521의 della Valle에 의한 가르침과 유사한 방법을 포함하는 어느 전통적인 에스터 형성 방법을 이용하여 에스터 결합의 형성을 포함할 수 있다. 이 방법의 적용은 지질의 친수성 부분에 이탈기, 예를 들어 에스터를 형성하기 위해 글리코사미노글리칸의 카복실레이트 기의 산소를 대체할 수 있는 아이오도를 함유하는 유도체화된 지질의 사용에 적합할 것이다. 이전에 논의된 카보디이미드 아미드 결합의 사용에 관하여, della Valle의 방법의 주요 변형은 사용된 글리코사미노글리칸 대 지질의 비율을 포함한다.
상기 방법 이외에, 어느 기타 적당한 방법을 사용하여 글리코사미노글리칸에 지질 성분을 공유결합할 수 있다. 적당한 방법은 글리코사미노글리칸의 이용할 수 있는 작용기, 지질의 이용할 수 있는 작용기, 및 형성되기를 원하는 공유 결합의 타입을 기초로 결정된다.
본 발명의 조성물은 (1) 글리코사미노글리칸에 공유 결합된 지질의 단일 타입; (2) 글리코사미노글리칸에 결합된 다중 타입의 지질, 즉 조성물은 글리코사미노글리칸이 이것에 결합된 다중 타입의 지질을 가질 정도로 하나 이상의 반응에서 다중 지질을 이용하여 제조된다; (3) 지질화 글리코사미노글리칸의 혼합물, 즉 지질 A에 결합된 글리코사미노글리칸, 지질 B에 결합된 글리코사미노글리칸 등을 함유하는 혼합물; 또는 (4) 하나 이상 타입의 글리코사미노글리칸의 사용;을 이용하여 제조될 수 있다.
비록 본 발명의 바람직한 측면이 히알루로로난의 사용에 관한 것일지라도, 하기에 예시된 바와 같이, 유사한 제형도 유사한 방법으로 기타 글리코사미노글리칸을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 조성물은 하기 히알루로로난이 글리코사미노글리칸으로 사용된 경우를 포함하여 많은 다른 적용에 사용될 수 있다:
(a) 화장품으로서, 히알루로난 세포 코팅의 보충을 위해 히알루로난을 제공하여 표피 및 진피 피부 세포를 회춘. 이러한 층에서 히알루로난의 증가된 수준의 존재에 대한 결과는 세포 수준에서 피부층에 대해 재수화(rehydrating) 효과, 및 더 젊어보이는 피부의 외형을 생성하는 세포에 대한 "역노화(reverse aging)" 효과이다. 이러한 재수화 효과를 통해, 조성물은 젊은 피부의 광도(luminosity) 및 이슬 맺힘(dewiness) 특성을 보충하기 위해서 뿐만 아니라, 주름의 출현을 감소시키기 위한 치료로 사용될 수 있다.
(b) 피부 침투제/보유 시스템으로서, 국소적으로 적용될 경우 변형된 히알루로난은 피부 장벽을 침투할 수 있고 내재하는 히알루로난보다 피부 내에 더 긴 반감기를 갖는다, 즉, 본 발명의 조성물은 자연적으로 발생하는 히알루로난보다 더 느리게 피부층 내에서 분해된다.
(c) 흉터의 감소에서, 암 환자에서 관찰될 수 있는 것처럼, 피부 위축, 즉 면역 문제 또는 스테로이드 사용으로 인한 피부 위축에 걸린 환자에 대한 피부 재-성장을 촉진시켜, 일반적인 흉터 제거, 예를 들어 일반적인 흉터, 셀룰라이트-관련된 흉터, 튼살 등 뿐만 아니라 수술 후 흉터의 감소.
(d) 광선 각화증(actinic keratinoses)의 치료에서, 광선 각화증과 관련된 염증의 감소, 및 추가 UVA/B 손상으로부터 손상된 피부의 보호. 또한, 변형된 히알루로난 조성물은 광선 각화증에 의해 영향받은 각질형성세포 층의 증식을 감소시키는 생리활성제를 전달하기 위해 제형화될 수 있다.
(e) 전달 시스템으로서, 단백질, 폴리펩티드, 또는 기타 유사한-크기의 생체고분자는 피부 장벽을 통해 국소적으로 전달될 수 있다.
(f) 약물 전달 시스템으로서, 약학적으로 활성 성분은 이의 진피 전달을 용이하게 하기 위해 본 발명의 지질화 히알루로난 조성물과 혼합된다. 이러한 시스템은 약학적 성분 및 히알루로난을 진피적으로 전달하는 이중 효과를 제공할 것이고; 약물의 진피 전달 후, 시스템의 히알루로난 일부는, 상기 기재된 바와 같이, 진피 및 표피 세포에 대한 회춘제로 작용할 것이다. 본 발명의 약물 전달 시스템에 대한 특정 치료 용도는 하기의 것을 포함한다:
1. 염증성 질환, 암, 피부 재생/상처 회복, 화학적 화상 및 열화상의 치료에 사용하기 위한 표적 간질세포결핍(stromal cell deficiencies);
2. 피부암의 치료;
3. 여드름, 접촉성 피부염, 건선 및 습진과 같은 피부병의 치료;
4. 흉터의 감소 및 조직 재생의 촉진을 통한 피부 질환(skin ailments) 손상의 치료; 및
5. 주사가 어려운 관절염, 특히 손발가락(digits)의 치료.
따라서, 본 발명의 조성물은 화장품, 의약품(예를 들어, 히알루로난이 유익하다고 알려진 화상 및 기타 질병의 치료), 점막의 윤활제, 및 제약의 국소 미세환경 약물 전달 시스템으로서 사용될 수 있다. 화장품 적용은 주름 출현의 감소, 피부의 젊은 외형의 향상, 피부 내 콜라겐 생성의 증가, 노화된 또는 건조 피부의 재수화, 피부의 영양제의 증가, 및 광선 각화증과 관련된 부스럼의 치료를 포함한다. 약물 전달의 적용은 관절염의 전신 또는 국소 치료를 위한 NSAIDs와 같은 약물의 국소 투여, 피부암의 전신 또는 국소 치료를 위한 화학요법, 및 에스트로겐, 니코틴, 또는 기타 물질의 투여를 위한 패취의 대용품으로 또는 패취의 일부로서 적용을 포함한다(예를 들어, 본 발명의 조성물은 패취에 끼워넣고(embedded) 피부에 적용되어 시간이 지나면서 점진적인 흡수를 허여함). 바람직한 비-화장품 적용은 전신 치료에 반대로 국소쪽으로 향하고, 이에 의해 약물의 전신 노출을 최소화하고 결과적으로 전신 노출로 인한 부작용의 크기를 감소시킨다.
또한, 본 발명의 조성물은 줄기세포를 이끌어 조직 회복의 촉진(히알루로난은 줄기세포를 이끈다고 알려짐), 아폽토시스로부터 내재하는 줄기세포의 보호(히알루로난은 줄기세포를 보호한다고 알려짐) 및 흉터의 감소(피부에서 높은 히알루로난 수준은 섬유증 회복(fibrotic repair)을 감소시킴)에 의해 조직 공학에 관련된 적용에서 사용될 수 있다. 또한, 신경통로에 대해 필수적으로 방해물(road block) 역할을 하는 섬유증 때문에 뇌졸중 또는 머리 손상 후 신경세포가 이의 원래 트랙을 따라 재-성장하지 않기 때문에, 흉터의 감소에서 본 발명의 조성물의 사용은 마비(paralysis)로부터 회복에 도움을 주는 것으로 예상된다. 따라서, 섬유증 흉터의 감소는 섬유증 조직 주위를 배회하고 이의 원래 경로를 회복할 수 없는 신경세포의 양의 감소를 이끌 것이고, 이에 의해 감소하거나 일시적이 되어, 이것은 마비를 형성한다.
또한, 히알루로난과 밀접한 관련이 있는, 히알루로로난을 제외한 글리코사미노글리칸, 특히 황산 콘드로이틴을 이용한 조성물은 하기를 포함하는 많은 다른 적용에 사용될 수 있다:
(a) 화장품으로서, 수분 보유 및/또는 히알루로난 대신 세포 표면에 결합하기 위한 피부 능력을 향상시킬 수 있는 글리코사미노글리칸을 제공하여 표피 및 진피 피부 세포 회춘.
(b) 피부 침투제/보유 시스템으로서, 국소적으로 적용될 경우 글리코사미노글리칸이 피부 장벽을 침투할 수 있다.
(c) 전달 시스템으로서, 단백질, 폴리펩티드, 또는 기타 유사한-크기의 큰 생체고분자는 피부 장벽을 통해 국소적으로 전달될 수 있다.
(d) 약물 전달 시스템으로서, 약학적으로 활성 성분은 이의 진피 전달을 용이하게 하기 위해 본 발명의 지질화 히알루로난 조성물과 혼합된다.
본 발명의 약물 전달 시스템에 대한 특정 치료 용도는 하기의 것을 포함한다:
1. 염증성 질환, 암, 피부 재생/상처 회복, 화학적 화상 및 열화상의 치료에 사용하기 위한 표적 간질세포결핍;
2. 피부암;
3. 접촉성 피부염, 건선 및 습진과 같은 피부병;
4. 흉터의 감소 및 조직 재생의 촉진을 통한 피부 질환 손상; 및
5. 주사가 어려운 관절염, 특히 손발가락.
임의로 가해진 치료적으로 활성 물질의 전달을 포함하는 글리코사미노글리칸 조성물의 사용은 주로 피부-관련 질병의 치료 쪽으로 향한다. 그러나, 임의로 가해진 치료적으로 활성 물질이 피부 장벽을 통해 이의 전달 후 전신 순환으로 들어가기 위해 표피 및 진피 층을 통해 이동할 수 있는 경우, 조성물은 경피 전달을 제공하기 위해 더 일반적으로 시스템으로서 사용될 수 있다.
비록 본 발명의 조성물의 일차 사용이 국소적으로 적용된 제형일지라도, 본 발명의 적용은 피하, 피내(intradermal), 또는 기타 형태의 주사 후 히알루로난 및 히알루로난 약물-전달 시스템의 침전을 용이하게 할 뿐만 아니라 글리코사미노글리칸 및 약물(변형된 히알루로난이 약물전달시스템으로 작용함)의 경구 흡수를 용이하게 하는 것을 포함한다.
피부 장벽을 침투하는 이들의 능력에 덧붙여, 본 명세서에 기재된 조성물도 점막의 침투를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있으며, 따라서 이러한 부가 경로에 의해 어느 임의로 가해진 치료 물질 뿐만 아니라 글리코사미노글리칸의 전달을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 구강(buccal), 식도(esophageal), 위(gastric), 장(intestinal), 코(nasal), 후각(olfactory), 경구 (oral), 기관지(bronchial), 자궁(uterine), 또는 음경 점막(penile mucosa)의 적용에 적합한 제형에 사용될 수도 있다. 추가적으로, 본 발명의 조성물은 주사의 필요없이, 연고, 안약 또는 기타 적당한 제형의 국소 적용을 통해 내부 눈(inner eye)에 지질화 글리코사미노글리칸 및/또는 추가 치료제를 전달하기 위해 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 화장품 및/또는 의약품의 제조에서 숙련된 자에게 알려진 어느 방법에 따라 바람직한 적용 방법에 적합한 제형의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 다수의 다른 책 중 Remington : The Science and Practice of Pharmacy or Cosmetic and Toiletry Formulations에 기재된다. 바람직한 제형은 크림, 연고, 겔, 로션, 또는 페이스트와 같은 피부에 국소적으로 적용될 수 있는 것을 포함한다. 추가적으로, 본 발명의 조성물은 약물 또는 단백질과 같은 약물의 경피 전달을 위해 일반적으로 사용된 패취에서, 자체 또는 치료 물질에 대해 전달 비히클로서 사용될 수도 있다.
표준 방법 및 부형제를 이용한 제형의 제조 이외에, 본 발명의 조성물은 어느 추가 또는 특별한 침투 촉진제의 부가 없이 시판되는 표준 화장료 크림과 혼합될 수도 있다. 또한, 표준 타입의 화장료 크림으로 투여될 때 본 조성물의 피부에 침투하는 능력은, 피부의 표면 수분을 잃는 능력을 막거나 또는 감소시켜 피부 장벽 침투를 용이하게 하기 위해, 랩, 불침투성 플라스틱 필름 또는 기타 타입의 장벽과 같은 부가 수분 장벽의 사용을 필요로 하지 않는다.
또한, 본 발명의 글리코사미노글리칸 조성물을 함유하는 제형은, 자연적으로 존재하거나 또는 본 발명의 조성물의 일부로서 전달되는지, 히알루로난 및 기타 글리코사미노글리칸의 분해를 막는데 돕기 위해 항산화제와 같은 부가 성분을 포함할 수 있다. 또한, 제형은 비타민, 정유 및 기타 영양제를 포함할 수 있으며, 이들의 적용이 피부의 건강 및/또는 외형에 유익한 효과를 제공하는 것으로 알려져 있다. 추가적으로, 제형은 태닝 로션 및 썬스크린에서 국소적으로 발견되는 것과 같은 피부에 대한 UV 조사의 손상 효과를 감소 또는 막기 위해 성분을 혼합할 수도 있다.
발명 내의 이해와 제조를 돕기 위하여, 하기 예증적이고 비-제한적인 실시예를 제공한다. 하기 기재된 실시예에서, CD44-/- 마우스는 Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine)로부터 얻었으며, RHAMM-/- 마우스는 Charles River Laboratories로부터 얻은 C57-BL6 야생형 마우스를 이용하여 Tolg et al.19에 의해 기재된 방법에 따라 사내에서 개발하였고, CD44-/-:RHAMM-/- 마우스는 Tolg et al.20에 의해 기재된 방법에 따라 사내에서 개발하였다. 또한, 세포는 Tolg et al.에 기재된 방법을 이용하여 얻었다.
실시예 1. 비공유 결합된 히알루로난 - 포스파티딜에탄올아민 결합체( HA + PE )의 제조
조합된(비-공유결합된) 히알루로난-포스파티딜에탄올아민의 복합체(HA+PE)는 히알루로난 수용액(78.5 mL, 12mg/mL; Baxyl®, Cogent Solutions Group, Lexington, KY, USA)과 이소프로판올(10mL)(혼합 촉진 위함) 내 대두 레시틴 (78.5mL; 13% 포스파티딜에탄올아민 함유하는 Soya Lecithin GT Non-GM IP; Imperial-Oel-Import)을 실온에서 30분 동안 혼합기에서 혼합하여 제조되었다. 그 다음, 이 혼합물을 실시예 4의 발명의 결합된 조성물에 기재된 대로 국소 크림 제조에 사용하기 전에 4℃에서 48시간 동안 배양하였다.
본 명세서에 기재된 이 실시예 및 다른 실시예에서 사용된 레시틴은 15% 포스파티딜콜린, 13% 포스파티딜에탄올아민, 10% 포스파티딜이노시톨, 19% 기타 지질, 5% 탄수화물, 및 38% 콩기름을 함유한다. 이런 인지질들은 주로 소수성 부분인 C14-C22 지방산, 주로 스테아르산과 팔미트산, 소량의 올레산, 팔미톨레산 및 미리스트산을 함유한다.
본 발명의 범위를 넘어서는 이 비-공유결합된 물질은 피부 장벽을 침투하기 위한 본 발명의 조성물의 능력에 대해 공유 결합의 효과를 증명하기 위한 비교 목적에서 하기의 몇몇 실시예에서 사용되었다.
또한, 실험들은 ~350kDa 히알루로난으로 제조된 유사한 비-공유결합 결합체를 이용하여 수행되었지만, 상기 기재된 ~500kDa 결합체와 비교할 경우 결과에 있어서 차이가 없었다.
실시예 2. 결합된 히알루로난 - 포스파티딜에탄올아민 결합체( HA - PE -1)의 제조
공유 결합된 히알루로난-포스파티딜에탄올아민 결합체(HA-PE-1)는 히알루로난 용액(5mL, 10mg/mL 탈이온수, 50mg; ~350kDa (Life Core, MN, USA), ~1.3 x 10-4mol -CO2H 기)과 포스파티딜에탄올아민(PE)(250mg; Sigma-Aldrich®, cat no.60648; 500mg assayed at ~50%)을 핸드블렌더로 빠르게 교반하여 예비-혼합(pre-mixing)하여 준비하였다. 히알루로난에 포스파티딜에탄올아민을 가하기 전에, 먼저 클로로포름(0.5mL)에 녹이고, 증발시킨 다음, 이소프로판올(0.5mL)으로 대체하고 핸드 바이브레이팅 프로브(hand vibration probe)로 현탁액(suspension)을 이동시켰다. EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)(1.2mg, 7.7 x 10-6mol; 120mg EDC가 포함된 10μL의 신선하게 제조된 스톡용액(stock solution)을 탈이온수(1mL)에 녹였다)를 가하고 30분 동안 완전히 혼합한 후, 실온에서 2시간 동안 두었다.
HA-PE-1은 세포분석법(실시예 5, 실시예 6, 실시예 7, 및 실시예 8)에 사용하였다.
결합 시약으로 사용된 EDC의 양과 신선하게 제조된 EDC(상기 사용된 것처럼) 용액이 거의 정량적 결합을 허여할 것이라는 기대를 기초로 하여, 실시예 2의 예상되는 결합 정도는 ~6%(최대치)의 이당류 단위의 히알루로난은 공유결합된 포스파티딜에탄올아민 그룹과 함께 변형될 것이다. EDC가 이전에 물에 노출되었던 경우, 결합 효율은 감소될 것으로 예상된다.
실시예 3. 결합된 히알루로난 - 포스파티딜에탄올아민 결합체( HA - PE -2)의 제조
실시예 2에서 처럼 순수한 포스파티딜에탄올아민 이외에, 포스파티딜에탄올아민이 함유된 지질의 혼합물도 사용될 수 있다. 예를 들어, 액상 대두 레시틴 (Soya Lecithin GT Non-GM IP, Imperial-Oel-Import)은 거의 15% 포스파티딜콜린, 13% 포스파티딜에탄올아민, 10% 포스파티딜이노시톨, 19%의 기타 인지질과 지질, 5%의 탄수화물, 및 38%의 콩기름을 함유한다. 이것은 대략 테이블스푼(14.79mL) 당 330mg의 포스파티딜에탄올아민(결합제로서 EDC를 이용하여 대량으로 반응이 예상된 지질)이다.
정제되지 않은 액상 대두레시틴(78.5mL; Soya Lecithin GT Non-GM IP, Imperial-Oel-Import)을 히알루로난(78.5mL, 12mg/mL, 942mg, ~2.5 x 10-3mol -CO2H groups; 500-2, 500kDa, polydisperse Baxyl Ha, Cogent Solutions Group, Lexington, KY) 및 이소프로판올(10mL)과 핸드 블렌더를 통해 실온에서 10-15분 동안 빠르게 교반하여 혼합하였다. EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminoprophy)carbodiimide)(22mg, 1.4 x 10-4mol; 1mL의 차가운 탈이온수 내 220mg EDC의 신선하게 제조된 저장용액 100μL)를 가하고, 10-15분을 더 섞은 후, 실온에서 2시간 동안 두었다. 대안적으로, 반응의 규모가 EDC의 질량을 정확히 측정하는 것이 가능하다면, EDC를 직접 가하여 즉, 저장 용액의 제조없이, 조성물을 제조할 수 있다. 얻어진 HA-PE-2는 4℃에서 보관하였고, 마우스(실시예 9, 실시예 10, 실시예 11, 및 실시예 13 참조) 및 인간(실시예 14, 실시예 15, 실시예 16, 실시예 17, 실시예 18, 및 실시예 19 참조) 연구에 사용하기 위해 더 이상의 정제없이 화장료 제형의 제제에 사용하였다(실시예 4 참조).
결합 시약으로 사용된 EDC의 양과 신선하게 제조된 EDC(상기 사용된 것처럼) 용액이 거의 정량적 결합을 허여할 것이라는 기대를 기초로 하여, 실시예 3의 예상되는 결합 정도는 ~5.5%(최대치)의 이당류 단위의 히알루로난은 공유결합된 포스파티딜에탄올아민 그룹과 함께 변형될 것이다. EDC가 이전에 물에 노출되었던 경우, 결합 효율은 감소될 것으로 예상된다.
실시예 4. 국소 크림의 제조
실시예 2 또는 실시예 3에서 제조된 변형된 히알루로난의 국소 크림은 국소 적용을 위한 화장품 또는 의약 크림의 제조에 대해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 작딩힌 과정에 의헤 제조될 수 있다. 하기 기제된 제제는 비-제한적인 예로 보아야 한다.
실시예 3에서 얻은 겔(HA-PE-2)은 시판되는 베이스 크림 (NIVEA Creme; 성분: 물, 광유(mineral oil), 미세결정질 왁스, 글리세린, 라놀린알콜, 파라핀, 판테놀, 데실올레에이트, 옥틸도데칸올, 알루미늄스테아레이트, 시트르산, 황산마그네슘, 스테아르산마그네슘, 메틸클로로이소티아졸리논, 향 (fragrance))과 혼합기에서 1:1 (v/v) 비율로 혼합 후. 사용 전까지 4℃에서 보관하였다. 이 저장 온도는 크림에 추가적인 첨가물의 부족 때문에 예방 수단으로 사용되었다. 예를 들어, 히알루로난의 잠재적인 분해를 방지하기 위한 항미생물제는 이들 제형에 대해 제한하여 볼 수 없어야 한다.
대안적인 베이스 크림, 예를 들어 OIL OF OLAY®(OLAY® Classic Moisturizing Creme; 성분: 물, 글리세린, 세틸 알콜, 바셀린(petrolatum), 시클로펜타실옥산, 스테아릴 알콜, 이소프로필 팔미테이트, 디메티콘 (dimethicone), PEG-100 스테아레이트, 스테아르산, 수산화나트륨, DMDM 하이단토인, 아이오도프로필 부틸카바메이트, EDTA, 향(fragrance), 이산화 티탄, Red 4) 또는 L'OREAL®(진피 전문 주름방지 및 노화방지 크림; 성분: 물, 시클로펜타실옥산, 수소화 폴리이소부텐(hydrogenated polyisobutene), 세틸 알콜, 글리세린, 글리세릴스테아레이트glcerylstearate), PEG-40 스테아레이트, 미리스틸미리스테이트, 에틸헥실팔미테이트, 쉐어버터(butyro-spermum parkii butter), 소르비탄 트리스테아레이트, 글리신 대두 단백질, 메틸파라벤, 디아졸리디닐우레아(diazolidinylurea), 토코페릴아세테이트, 아크릴레이트 공중합체, 프로필파라벤, 리모넨, 디소듐 EDTA, 히드록시시트로넬랄, 리날롤(linalool), 벤질알콜, 벤질 벤조에이트, 부틸페닐메틸프로피온알, 구아노신, 알파-이소메틸이오논(alpha-isomethylionone), 시트랄, 유게놀, 클로르페네신, 소듐 데히드로아세테이트(sodium dehydroacetate). 향(fragrance), FIL K29371/2)을 사용한다. 하기 실시예에서 변형된 히알루로난의 생물활성 또는 효과에 어떠한 차이도 없었다.
상기, 또는 기타, 시중에서 구할 수 있는 크림의 사용 이외에, 적당한 국소용 제형은 통상적으로 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 향수 또는 어느 기타 화장품, 피부 또는 의학적 특성이든 아니든, 변형된 글리코사미노글리칸 이외에, 기타 성분들도 제제에 가할 수 있다.
실시예 5. 변형된 히알루로난(HA-PE-1)은 인간 피부 섬유아세포에 증가된 세포껍질을 형성한다.
본 조성물의 적합성은 인간 피부의 생검펀치(punch biopsy)로부터 성장한 배양된 피부 섬유아세포를 에워싸는(encase/surround) 능력을 측정하여 평가하였다. 생검펀치는 살균된 조직배양접시(35 x 10 mm)에서 하였고, 작은 조각이 되도록 작은(예를 들어, 19G) 무균바늘로 잘랐다. 조각들은 조직 조각의 부착력을 촉진하기 위해 조직배양접시 바닥에서 잠시(예를 들어, 10분을 넘어서는 안된다) 건조시켰다. 그 다음, 10% FCS(fatal calf serum)로 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagles Medium)을 조심스럽게 가하고, 배양물을 5% CO2로 보충된 37℃의 젖은 배양기에서 대략 일주일 동안 두었다. 밖에서 외식편(explant)으로 키운 섬유아세포들을 살균된 0.025% 트립신/EDTA 혼합물 조건에서 조직배양접시로부터 제거하고, 조심스럽게 3분간 1.1x g로 돌렸다. 그 다음에 트립신을 제거하고 1:5로 희석한 신선하고 살균된 조직배양접시에 ~50,000/웰(24웰 플레이트)의 밀도로 세포를 넣고 10% FCS(fetal calf serum)이 보충된 1mL DMEM을 넣고 유리커버슬립을 덮고 5% CO2 대기에 두었다. 18시간 이후, 세포들을 히알루로난 용액(500μg/mL, 350kDa) 또는 변형된 히알루로난(HA-PE-1)(25μg/mL)에 1시간 동안 노출시켰다. 30-40nm 형광 노란 폴리스티렌 나노구(nanospheres)(Corpuscular Inc., Cold Spring, NY)를 웰에 가하고, 부착세포 위에 37℃에서 30분 동안 놓았다. 그 다음, 배양세포를 신선하게 제조된 파라포름알데히드에 고정시켰고, 속이빈 웰(hollow well)이 있는 유리슬라이드에 고정시켰다. 세포는 호프만 옵틱(Hoffman Optics)과 에피-형광(epi-fluorescence)이 장착된 도립 현미경(Nikon Eclipse TE300)으로 사진을 찍었다(도 1 참조). 히알루로난 껍질을 검출하기 위한 다른 방법으로는, 하기 실시예 7에서 사용된, 파라포름알데히드-고정된 양(paraformaldehyde-fixed sheep) 성숙 적혈구 (erythrocytes)를 웰에 가하고 상기와 같이 결정하였다. 이 방법에 의해 나타난 세포 껍질은 상기 호프만 옵틱(Hoffman optics)을 이용한 도립 현미경(Nikon)으로 사진을 찍었다(도 5 참조).
도 1에 나타난 영상에서, 영상에 화살표로 표시된 작은 형광구슬은 껍질에 의해 제외되기 때문에, 히알루로난 세포 껍질은 어두운 공간에서 관찰된다. 이들은 형광 구슬로 전부 덮여 있으므로, 이 분석방법에 의하여 껍질 없는 세포는 검출될 수 없다. 도 1에 나타난 바와 같이, 배양배지에 히알루로난 단독(영상 12)의 첨가는 PBS 대조군(영상 11)에 비해 히알루로난 껍질의 크기에 대해 약간의 추가적 효과가 있었다. 또한 배양배지(도 13)에 HA-PE-1의 첨가는 세포 주위로 형광 구슬의 배제에 의해 할로 효과(halo effect)가 만들어지는 것이 발견되어 명백히 히알루로난 껍질이 증가하는 결과가 되었다.
실시예 6. 히알루로난 껍질과 히알루로난 껍질 크기를 갖는 세포의 비율에 대한 변형된 히알루로난(HA-PE-1)의 효과
실시예 2에 따라 제조된, 변형된 히알루로난(HA-PE-1) 또는 히알루로난 단독 (350kDa; 식염수 내 10mg/mL 저장용액)을 늙은 인간의 섬유아세포에 농도를 증가 (0-100μg/mL)시키며 가하였다. 히알루로난 껍질(도 2 참조)이 나타난 세포의 비율은 히알루로난을 단독 넣었을 때와 대조적으로 HA-PE-1의 농도와 함께 증가하였다. 변형되지 않은 히알루로난을 단독 첨가한 경우에는 히알루로난 껍질을 가진 세포가 더 적었고, 껍질을 가진 세포의 비율은 10μg/mL에서 평탄영역에 이르렀다. 그에 반해서, 변형된 히알루로난(HA-PE-1)의 첨가는 히알루로난 껍질을 가진 세포의 비율이 양에 의존적으로 증가하게 돼서 껍질을 가진 세포의 비율은 50μg/mL HA-PE-1 보다 100μg/mL HA-PE-1의 존재 시 유의하게 많았다(Student's "t"test, p<0.01). 모든 농도에서, HA-PE-1의 첨가는 변형되지 않은 히알루로난 단독의 첨가보다 히알루로난 껍질을 가진 세포에서 유의하게 많았다(Student's "t"test, p<0.0001).
변형된 히알루로난(HA-PE-1; 50μg/mL) 대 히알루로난 단독(50μg/mL)의 첨가가 세포의 세포껍질 영역에 미치는 영향을 영상 분석(Elements 3.1, Nikon)을 이용하여 정량화하였다. 이들 농도에서, 변형된 히알루로난(HA-PE-1)의 적용은 HA 단독에 비해 평균적으로 히알루로난 껍질의 크기/세포가 유의하게 증가하였다 (Student's "t"test, p<0.05)(도 3 참조). 값들은 10개 샘플에 대한 평균 및 S.E.M이다.
실시예 7. 변형된 히알루로난(HA-PE-1)이 히알루로난 수용체 없이 마우스 배아 섬유아세포를 감싸는 능력.
히알루로난은 보통 CD44, RHAMM, LYVE-1 및 Toll-유사 수용체 2,4와 같은 히알루로난 수용체와 함께 상호작용을 통해 세포에 결합한다. 마우스의 배아 섬유아세포는 CD44와 RHAMM을 선택적으로 발현하는데, 히알루로난에 결합하고 히알루로난 껍질을 생산하는 이들 세포의 능력은 두 수용체에 기인한다.
마우스의 배아 섬유아세포는 CD44-/-, RHAMM-/-와 CD44-/-:RHAMM-/-배아로부터 분리되었다(14일). 즉, 각각 CD44, RHAMM, 및 CD44와 RHAMM 히알루로난 수용체가 없는 배아 및 불멸의 클론(immortalized clones)을 한계희석법(limiting dilution)으로 얻었다. 실시예 2에 따라 제조된 변형된 히알루로난(HA-PE-1) 또는 히알루로난 단독을 실시예 5에에 기재된 바와 같이 배양 배지에 가하였다. 형광 나노구(nanospheres)를 이용하여 시각화된 실시예 5와는 달리, 히알루로난 세포 껍질은 고정된 양 적혈구를 사용하여 시각화 하였다. 그것은 입자로 작용하고 세포가 히알루로난 껍질을 형성하는 접시 바닥으로부터 배제되며, 에피형광 (epifluorescence) 보다는 호프만 옵틱(Hoffman optics)을 사용하여 관찰된다. 껍질을 형성하지 않는 세포는 적혈구 아래에 파묻혀서 검출조건 하에서 보이지 않는다. 적혈구가 적은 부분은 히알루로난 껍질을 함유한 마우스 배아 섬유아세포를 함유하는 세포를 나타낸다. 도 4의 그래프에서 얻어진 값들은 각 처리와 유전형의 10개 샘플에 대한 평균과 S.E.M.이다.
도 5에서 관찰된 바와 같이, 변형된 히알루로난(HA-PE-1)(영상 51(RHAMM-/- 세포), 52(CD44-/- 세포), 53(RHAMM-/-:CD44-/- 세포))을 첨가한 경우는, 히알루로난 단독(영상 54(RHAMM-/- 세포), 55(CD44-/- 세포), 56(RHAMM-/-:CD44-/- 세포))으로 처리된 세포에 비해 히알루로난 껍질의 크기와 히알루로난 껍질을 함유하는 세포수 모두 증가하였다. 가장 일반적인 두 가지 히알루로난 수용체인 CC44 또는 RHAMM 수용체 중 하나 또는 둘 다 없어도 히알루로난 껍질을 갖는 세포 수에는 큰 영향이 없기 때문에(영상 51(RHAMM-/- 세포), 52(CD44-/- 세포), 53(RHAMM-/-:CD44-/- 세포), 및 도 4 참조), 본 발명의 변형된 히알루로난(HA-PE-1)의 능력은 섬유아세포에 일반적인 히알루로난 수용체의 발현에 의존하지 않는 것으로 보인다. 또한, 변형된 히알루로난(HA-PE-1)의 적용은 식염수(영상은 나타내지 않았으며, 결과는 도 4에 포함) 또는 히알루로난(500μg/mL; 350kDa)에 비해 모든 유전자형에서 히알루로난 껍질을 가진 세포의 비율이 상당히 증가하였다(Student's "t" test, p<0.001).
상기 생체 외 실험(실시예 5, 실시예 6, 실시예 7)은 공유 결합된 히알루로난 인지질 유도체(예를 들어, HA-PE-1)은 변형되지 않은 히알루로난보다 세포껍질을 더 잘 만들 수 있다는 것을 나타낸다. HA-PE-1이 히알루로난 수용체가 발현되지 않은 마우스의 배아 섬유아세포에 결합하는 능력은, 본 발명의 변형된 히알루로난이 세포막과 관련된 히알루로난 수용체와 상호작용이 필요 없다는 것을 암시하며, 즉시 세포막의 인지질 층으로 이의 지질 꼬리가 삽입되는 것으로 예상된다. 이들이 세포에 의해 발현된 경우, 이것은 변형된 히알루로난과 히알루로난 수용체의 결합을 배제하지 않는다. CD44와 RHAMM의 발현이 부족한 세포에서 관찰된 큰 세포껍질은 변형된 히알루로난-세포의 상호작용이 안정하다는 것을 더 암시한다.
실시예 8. 변형된 히알루로난 조성물을 갖는 SKL - 카탈라제 기능의 향상
SKL-카탈라제는 변형되지 않은 내인성(endogenous) 카탈라제 보다 세포 내에서 ROS(reactive oxygen species)의 감소가 더욱 효과적인 유전자 변형 효소이다. 카탈라제는 노화의 원인인 ROS에 의한 독성을 감소시키는데 필수적이다. SKL-카탈라제의 하나의 기능은 ROS에서 기인한 히알루로난의 분쇄를 감소시킨다. 본 발명의 조성물의 사용을 통해, 본 명세서에 기재된 포스파티딜에탄올아민-히알루로난 결합체는 SKL-카탈라제의 기능을 향상시킬 수 있다는 것을 밝혀내었다.
카탈라제 재조합 단백질(인간 적혈구, 10μg/mL, Sigma)은 세포 내로 들어가기 위해 SKL에서 유도되었다.21 결과 SKL-카탈라제는 HA-PE-1와 혼합하고, 노화된 인간 섬유아세포의 배양물에 가하였다. 결과 영상(도 6 참조)은 실시예 2의 히알루로난-포스파티딜에탄올아민 결합체(HA-PE-1)와 SKL-카탈라제(영상 63)로 처리된 세포의 경우, SKL-카탈라제(영상 61) 또는 HA-PE-1(영상 62)을 단독으로 가하였을 때 보다 세포 껍질이 더 커졌음을 나타낸다. 이런 결과는 본 발명의 히알루로난 조성물이 증가된 세포 껍질 크기의 관찰을 기초로 하여 SKL-카탈라제의 ROS 생산물에 대한 효과를 강화시키는 것을 나타낸다. 이런 결과는 본 발명의 히알루로난 유도체가 다양한 단백질을 포획할 수 있으며 세포 표면에서 유지될 수 있다는 것을 암시하고, 이것은 분자의 그물-타입(net-type) 메커니즘을 통해 작용하는 본 발명의 조성물과도 일치한다.
하기의 실시예(실시예 9, 실시예 10, 실시예 11, 및 실시예 12)는 본 발명의 조성물이 국소 투여 후 마우스에서 피부 장벽을 횡단할 수 있다는 것을 설명한다. 이 모델은 본 발명의 조성물이 인간의 피부 장벽을 유사하게 통과하는 능력을 알맞게 예측하는데 충분하다고 생각된다.
실시예 9. 마우스에 HA - PE -2의 국소 적용
HA-PE-2(실시예 3에 기재된 대로 제조)는 실시예 4에 기재된 대로 NIVEA 크림으로 제형화(1:1v/v)되었다. 크림을 9월령의 암컷 마우스(BL6 strain, 40 x 30 mm 면적의 면도된 피부)의 면도된 등에 4일 동안 매일 한 번씩 발랐다. 대두 레시틴(1:1)과 혼합된 베이스 크림을 대조군으로 하였다. 5일째 날, 마우스를 안락사 시키고, 처리된 피부를 8mm 생검 펀치(biopsy punch)로 얻었고, 신선하게 제조된 4% 파라포름알데히드/인산염완충식염수로 고정하였다. 고정된 조직을 파라핀으로 처리하고, 절단하고, Echelon® kit(히알루로난 ELISA 실험 키트, Echelon)를 사용하여 염색하였다. HA-PA-2가 처리된 피부의 각질형성세포는 단지 크림만 적용한 피부의 각질형성세포보다 히알루로난에 대해 더 어둡게 염색되었고(p<0.00001, Student's "t" test), 대조군 마우스에서보다 더 두꺼운 진피층을 가졌다. 히알루로난 염색의 밀도는 영상 분석을 이용하여 정량화하였다(Elements 3.1, Nikon). 도 7은 처리군(영상 71 및 72)과 대조군(영상 73 및 74)의 피부 조각의 영상을 제공한다. 각질형성세포에서 히알루로난 존재의 증가는 도 8의 첨부된 그래프에 나타난 바와 같이, 영상의 픽셀 밀도(pixel density)의 계산으로 입증되었다. 마우스의 진피 밑에 있는 층(underlying dermal layer)은 HA-PE를 처리한 동물과 대조군 동물 모두 높은 수준의 히알루로난을 함유하였다(도 8 참조). 이러한 결과는 본 발명의 변형된 히알루로난이 피부 장벽을 침투하고, 적어도 진피 각질형성세포 층에 결합한 것을 나타낸다. 얻어진 값들은 각각 처리된 4마리 마우스들에 대한 평균과 S.E.M이다.
실시예 10. HA - PE2 및 히알루로난의 마우스의 피부 장벽 침투 능력 비교
실시예 3에 기재된 대로 제조된 HA-PE2, 실시예 3에 제시된 레시틴의 지질과 혼합하나 공유결합되지 않은 히알루로난(실시예 1 참조), 및 히알루로난 단독(추가 인지질 없음)을, 실시예 4에 기재된 바와 같이, 각각 NIVEA Creme 화장품 베이스 크림(1:1, v/v)으로 제형화하였다. 상기 크림을 9-월령 암컷 BL6 야생형 마우스의 면도된 등(0.18g HA-PE-2/적용, 40×30 mm 면도된 면적)에 4일 동안 하루에 한 번씩 적용하였다. 이 시간 이후, 하나의 동물군을 안락사시키고, 실시예 9에 기재된 과정에 따라 진행하였다. 두 번째 동물군은 2일 동안 추가적인 처리 없이 남겨두었고, 7일에 안락사시키고, 실시예 9에 기재된 대로 실험 절차를 진행하였다. 도 9의 영상 및 피부 장벽을 침투할 수 있는 히알루로난의 양을 정량화한 수반한 그래프(도 10)는 HA-PE-2(영상 91)로 처리된 마우스에서 히알루로난 및 포스파티딜에탄올아민의 혼합물(영상 92), 또는 히알루로난 단독으로 처리한 마우스(영상 93)보다 히알루로난이 현저히 더 강하게 염색되었음을 보여준다. HA-PE-2를 처리한 군과 비교할 때, 상기의 두 개의 처리군 에서, 피부 장벽을 침투하는 히알루로난의 무시할 수 있는 양을 보여준다(student`s "t" test, p<0.000001). 처리를 중단한 후, HA-PE-2로 처리된 마우스에서 히알루로난 염색이 감소됨을 보여줌에 따라 각질형성세포에 존재하는 히알루로난의 양은 서서히 감소하였다(영상 94 및 도 10 참조). 예상한 바와 같이, 다른 마우스에서 염색한 히알루로난의 양(영상 95 및 96, 및 도 10 참조)은 무시할 만한 정도로 남아있었다.
이러한 결과는, 화장품 베이스 크림에서, 히알루로난 및 대두 레시틴(포스파티딜에탄올아민을 포함하는)에 존재하는 지질의 혼합물, 또는 히알루로난 단독의 사용에 비해, 피부 장벽을 침투하는 본 발명의 변형된 히알루로난 조성물의 능력을 향상시킴을 나타낸다. 더욱 중요하게, 실시예 5에서 설명된 바와 같이, 세포와 관련된 본 발명의 변형된 히알루로난 조성물의 증가된 능력에 따라, 피부 장벽을 침투할 수 있는 변형된 히알루로난은 각질형성세포 층 내에 보유된다. Brown et al.14 는 유사한 크기의 히알루로난 조각들이 피부 장벽을 통해 통과하지만, 이러한 히알루로난은 쉽게 순환계에 들어가서, 체내로부터 제거된다고 이미 보고되었다. 유사한 논문으로 Kaya et al.,5 이 보고되었고, 상기 논문에서 50-400kDa 히알루로난은 표피세포를 횡단할 수 있고, 각질형성세포의 벽의 두께를 증가시킬 수 있다고 보고하고 있다. 그러나, 적용된 히알루로난(태그된 히알루로난을 이용한)은 진피세포 내에 보유되지 않고, 빠르게 피부로부터 사라지고, 기능적 효과를 위해 세포에서 CD44의 발현이 필요하다. 본 결과는, 변형되지 않은 히알루로난에 의한 피부 침투가 일어나는 경우, 히알루로난은 피부에 적당한 정도로 유지되지 않고, 피부에서 히알루로난의 수준을 보충할 수 있는 방법으로 작용되지 않는다는 것을 더 확인한다.
피부에서 내인성 히알루로난의 양이 위치에 따라 변할 수 있기 때문에, 처리된 피부와 대조 피부의 히알루로난 염색을 평가하기 위해 내부적 대조(internal control)를 디자인하였고, 처리된 군과 처리되지 않은 피부 영역 사이의 차이점을 확인하기 위한 대조 세포를 개발하였다. 상기 기재된 바와 같이, HA-PE-2 및 대조 크림(히알루로난 단독)을 마우스의 면도된 등에 적용하였다. 처리한 부분을 표시하였고(처리되지 않은 부근의 털은 Nair™로 제거하였고, 처리한 부분과 비처리 부분을 포함하도록 펀치(Punche)를 나열하였다; 조직 펀치(punch)를 작은 조직 바스켓 (tissue basket)에 배치하여 실험과정에서 올바른 위치에 조직을 유지시켰고, 조직학적 표시 펜으로 표시하였다), 그리고 상기 기재된 바와 같이(실시예 9), 조직을 배양하고 과정을 진행하였다. 결과로 나타난 샘플은 단독으로 처리하였을 때, 염색의 명백한 오차가 관찰되지 않은 것으로 나타난다(영상 111)(도 11 참조, 적용 가장자리는 파선으로 표현된 적용 영역의 화살표를 나타낸다.), 만일 적용된 히알루로난의 어느 침투/보유가 적용 영역에서 발생하면 매우 작음을 확인하였다. 반대로, 뚜렷한 염색의 가장자리는 피부의 처리되지 않은 부위와 비교하여 처리된 부위에서 현저하게 높게 나타났고 (student's "t" test, p<0.000001), HA-PE2를 적용한 가장자리에서 관찰되었다(영상 112), 도 12에서 수반되는 그래프에 의하여 정량화된 바와 같이, 이러한 결과는 본 발명의 변형된 히알루로난이 적용 부근의 표피 내에 침투되고 축적됨을 확인하였고, 이러한 결과는 본래의 적용된 부위에 계속 남아 있는 것을 암시한다.
실시예 11. 히알루로난 수용체가 없는 마우스에서 HA - PE -2를 이용한 히알루로난 세포 껍질의 대체
HA-PE-2(상기 기재된 대로 제조된, HA-PE-2 0.18g)를 포함하는 크림을 9 월령 암컷 RHAMM-/-마우스들(RHAMM 히알루로난 수용체가 없으나 CD44 히알루로난 수용체를 발현하는 마우스)의 면도된 등에 4일 동안 매일 발라주었다(40x30mm 잘린 패치). 마우스들을 처리 5일 후 안락사시켰으며, 실시예 9에 기재된 바와 같이 처리된 피부를 수확하였다. 베이스 크림 단독을 바른 마우스를 대조군으로 사용하였다. 도 13, 영상 131과 132, 및 수반된 그래프에서 보는 바와 같이, HA-PE-2가 처리된 표피(영상 131)는 무시할 만한 히알루로난 수준(student's "t" test, p<0.000001)을 나타낸 대조 피부(영상 132)보다 상당히 큰 정도로 히알루로난을 보유하였다. 나타난 수치들은 4마리 마우스의 평균과 표준오차이다.
또한, HA-PE-2는 상기 기재된 바와 같이 9 월령 암컷 CD44-/-:RHAMM-/- 마우스(CD44와 RHAMM 모두 히알루로난 수용체가 발현되지 않았다; Tolg 등에 의해 기재된 바와 같이 개발됨)의 면도된 등에 발라주었고 유사한 대조군을 사용하였다. 도 14, 영상 141과 142, 및 수반된 그래프에서 보는 바와 같이, 처리된 피부(영상 141)의 경우 대조 피부(영상 142)에 비해 표피층에 상당히 더 많은 히알루로난이 축적되었다. 나타난 수치들은 4마리 마우스의 평균과 표준오차이다. 이것은 본 발명의 변형된 히알루로난 조성물이 각질형성세포(keratinocyte)와 결합하기 위하여 히알루로난 수용체(CD44와 RHAMM가 피부에서 주요한 수용체로 사용된다.)가 필요하지 않다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는, 세포막으로 삽입하는 포스파티딜에탄올아민의 알려진 능력을 포함하여, 히알루로난 수용체의 도움 없이 변형된 히알루로난이 직접 세포막으로 끼워넣는다는 것을 가리킨다. RHAMM-/-(CD44+)마우스(도 13)의 표피층과 히알루로난 수용체 음성(CD44-/-:RHAMM-/-) 마우스(도 14)의 표피층에서 내인성 히알루로난과 HA-PE-2의 표피층 착색을 비교하면, 양쪽 내인성 히알루로난 (영상 132와 142)의 착색과 뒤따르는 HA-PE-2(영상 131와 141) 처리된 표피의 착색은 양쪽 히알루로난 수용체가 없을 때보다 CD44가 발현되었을 때 더 크다. 이런 결과는 양쪽 내인성과 히알루로난-포스파티딜에탄올아민 결합체(HA-PE-2) 껍질이 CD44 수용체의 존재에 의해서 안정화되며, 이는 배양세포 내의 촉진용 내인성 히알루로난 껍질에서 CD44 수용체가 관여한다는 알려진 사실과 일치된다는 것을 암시한다.
실시예 12. WO 2003/015755에 기재된 미립자 포스파티딜에탄올아민 - 히알루로 난 물질을 가진 본 발명의 조성물 비교
미립자 (나노구와 미세구) 포스파티딜에탄올아민-히알루로난 결합체는 WO 2003/015755에 Margalit에 의해 기재된 방법론을 이용하여 제조되었다. 비커를 대두 레시틴(soya lecithin) 2ml로 코팅하였다. 히알루로난(2mL, 12mg/mL, 6.3x10-5mol-CO2H 기; 500-2500kDa 다분산계, Baxyl™, Cogent Solutions Group)은 pH 4.5로 낮추어 활성화시킨 다음, EDC(2.5mg, 1.6x10-5mol; 신선하게 제조된 저장용액으로부터)를 가하고, 이렇게 활성화된 히알루로난을 레시틴이 덮인 비커에 추가하고, 탈이온수(1mL)를 첨가하고 NaOH로 pH를 8.6으로 조정하였다. 결과 혼합물을 37℃에서 배양하고 하룻밤 동안 흔들었다. 그 후 pH를 7.2로 조정하고, 혼합물을 10분 동안 초음파처리하고 미립자 물질을 분리시키기 위해 40℃에서 40분 동안 1.2x105 g force로 2번 원심분리 하였다. 사용된 신선하게 제조된 EDC 저장용액의 양을 기초로 하여, 포스파티딜에탄올아민과 히알루로난 사이의 예상되는 이론적 결합의 최대치는 ~25%일 것으로 예상된다. 얻어진 물질을 슬라이드 글라스에 바로 가하였고, 본 발명에 기재된 대로 동일한 방법으로 크림 베이스와 혼합하였다. 이후에 이것은 슬라이드 글라스에 적용하였다.
Margalit가 쓴 특허문헌에서 이전에 설명되었던 방법론을 이용하여 제조된 미립자 시료는, 본 발명의 조성물과 비교될 수 있다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 히알루로난-포스파티딜 에탄올아민 결합체(HA-PE-2)를 준비해둔 슬라이드 글라스에 직접 적용하였고, 실시예 4 (NIVEA Creme 베이스 크림)에 기재된 바와 같이, 베이스 크림과 1:1로 혼합하여 슬라이드 글라스에 적용하였다. 모든 시료를 커버 글라스에 덮었고, 40X Hoffman optics를 가진 Nikon TE300 도립현미경으로 관찰하여, 도 15에서 재생산된 이미지를 얻었다. WO 2003/015755에서 Margalit가 설명한 방법론에 따라 제조된 미립자 조성물의 소낭성(veisular) 또는 입자성(particulate nature)은 영상 153(직접 적용)과 154(크림 제제)에서 분명하게 관찰된다. 그러나, 영상 151과 152에서 보는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 유사하게 자기-조립된 물질의 존재를 나타내는 것을 실패한다.
본 발명은 히알루로난의 양이 부족한 피부에 보충할 수 있도록, 피부 표피층과 진피층에 히알루로난의 전달을 위한 수송수단으로서 주로 적용된다.
실시예 2 또는 실시예 3에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 변형된 히알루로난의 제조 후, 기술분야에서 알려진 과정과 절차에 따라 제형을 제조되거나, 실시예 4에서 설명한 바와 같이 상업적 사용 또는 기타 저장 화장품 크림의 사용을 통하여 제조될 수 있다. 본 발명의 변형된 히알루로난 조성물이 포함할 뿐 아니라, 제형 또한 예를 들어, 비타민, 아미노산, 조효소(coenzymes), β-글루칸, 폴리뉴클레오티드, 라디칼 스캐빈저, 성장인자, 에스트로겐, 및 지방세포화 인자와 같은 피부 외형에 활기를 되찾아 주는데 도움을 준다고 알려져 있는 것을 포함하여, 상업적 피부 크림에서 흔히 발견되는 것과 같은 기타 화장품학적으로 활성 성분을 포함할 수 있다. 또한, 제형은 히알루로난이 피부에서 분해되는 속도를 줄이기 위하여 히알루로니다아제 억제제를 첨가하거나23 노화과정에서 잃는 피하의 지방세포 생성을 유도한다고 입증되어 있는 RHAMM 억제제를 첨가한다.22 추가적으로, 제형은 약학적으로 활성 성분, 특히 피부암, 접촉성 피부염, 건선, 및 습진과 같은 피부병을 치료하기 위해 사용되는 활성 성분을 포함할 수 있다. 결과적으로, 본 발명은 피하 또는 피내에 투여하는 주사를 필요로 하거나 경구 또는 정맥에 제형의 전신투여를 통하기 보다는 의약품의 전달을 위한 국한되고, 국소적 치료를 가능하게 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 측면에서, 유도체화된 글리코사미노글리칸을 피부 장벽을 횡단하여 단백질을 이동시키는데 사용될 수 있다. 이 수송 능력은 예기치 않은 것이며, 내부 근육뿐만 아니라 적어도 피부의 표피와 진피 층에 작은 것(700Da)부터 큰 (400-500kDa) 단백질의 표적화된 전달을 가능하게 하기 충분하다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 일련의 압출의 필요성을 제거함으로써, 국소 도포를 통해 Botox™와 같은 화장용으로 중요한 큰 단백질의 추가적인 공급에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 피부로 단백질을 전달하는 능력은, 또한 히알루로니다제와 RHAMM 억제제와 같은 치료적 단백질; 인터페론, 또는 항염증성 단백질/사이토카인; 항체, 재조합 단백질, 단백질 단편, 펩티드와 같은 항 피부암 치료; 펩티드/단백질을 이용한 예방접종의 국소 투여를 허여하고, 이에 의해 약물 투여의 전신 또는 주사 경로를 통하기 보다는 국부적 부분에 처리하는 것이 전신 치료에 흔히 나타나는 부작용을 없애거나 줄일 수 있다고 기대된다. 또한, 본 발명의 조성물은 히알루로난 생성효소와 같은 피부 내에서 히알루로난의 생성을 돕는 효소(emzymes)의 전달에 사용될 수 있다. 또한, DNA, RNA 또는 cDNA와 같은 다른 큰 분자들은 이 방법으로 국소 투여가 가능하다.
지질화 글리코사미노글리칸의 사용이 이전에 단백질 전달 장치로서의 사용으로 기재된 바 있지만(예를 들어, WO 03/015755에서 Margalit와 Peer), 이 실시예들은 자기-조립된 미립자 구조 내에서 단백질을 포획하는 것을 포함한다. 본 발명의 조성물의 작용, 및 상기 실시예에서 설명한 대로 오늘날 행해지는 실험의 결과를 기초로 하여, 기술분야에서 알려진 단백질 전달의 이전의 설명과는 다르게, 본 명세서에 기재된 조성물들은 조직화된 방법으로 자기-조립된 것으로 보이지 않기 때문에 캡슐화(encapsulation) 메커니즘에 의존하지 않는다고 생각한다. 좀 더 자세히 말하면, 본 발명의 조성물은 지질화 글리코사미노글리칸 주위와 단백질 내부의 조직화 되어 있지 않고 엉킨 메커니즘으로 피부 장벽을 통하여 단백질의 전달을 가능하게 한다고 생각한다. 진피 단백질 전달을 제공하는 본 발명의 능력은 하기의 실시예에서 기재된다.
실시예 13. 변형된 글리코사미노글리칸(HA-PE-2)을 이용하여 피부 장벽을 통한 RHAMM 단백질의 수송
실시예 4에서 설명한 바와 같은 방식으로 NIVEA Creme 베이스 크림에서 murine GST-RHAMM(1 mg/mL의 저장용액으로부터 35μg), 84kDa 태그된 단백질, 또는 murine GST(26kDa) 단독으로(3 mg/mL 저장용액으로부터 35μg) HA-PE-2(0.18g)과 혼합하였다. NIVEA Creme 베이스 크림에서 단백질과 히알루로난의 제제를 대조군으로 사용하였다. 0.18g의 처리 크림(35μg의 단백질을 포함)과 대조 크림을 9-월령 암컷 BL6 야생형 마우스의 면도된 등의 40x30mm 영역에 5일 동안 매일 발라주었다. 그리고 6일째 되는 날 마우스를 안락사시켰다. 8mm 펀치생검을 이용하여 피부 패치를 채취하고, 신선하게 제조된 4% 파라포름알데히드에서 조직을 고정시킨 다음, 파라핀으로 처리하였다. 8μm 절편을 생체조직에 수직으로 잘랐고, 그 절편을 염소에서 제조된, 항-GST 항체를 사용하여 GST로 염색하였다. 결합된 항체를 비오티닐화된 염소의 항-토끼 항체, 스트렙타비딘-호스 래디쉬 퍼옥시다제 및 Dab를 사용하여 시각화하였으며, 이것은 항-GST 항체가 슬라이드에 결합되었을 때 갈색으로 염색되었다. 또한, 피부가 보통 GST를 발현하지 않기 때문에, RHAMM 항체보다는 GST가 GST-RHAMM을 검출하는데 사용되었다. 시료의 시각화(도 16 참조)는 GST-RHAMM가 본 발명의 조성물로 전달될 때 마우스의 피부 장벽을 통하여 옮겨지고 내부 근육층으로 옮겨진다는 것을 나타낸다(영상 161). 반면, GST-RHAMM은 변형되지 않은 히알루로난(영상 163)을 함유하는 대조군 시료의 각질형성세포(keratinocyte)층에서 거의 검출하지 못하였다. 각질형성세포층과 내부 근육층에 모두 도달하는 GST-RHAMM의 상대적인 양은 도 17에 첨부된 그래프에서 정량화하였으며, 이것은 5마리 마우스의 평균값을 나타낸다. 유사한 결과는 더 작은 GST 단백질(26kDa)에서 관찰되었다(도 16, 영상 162, HA-PE-2와 함께 전달, 및 164, 변형되지 않은 히알루로난과 함께 전달).
앞서, 단백질의 경피 전달은 침투 촉진제의 사용과 함께 10,000 Da보다 낮게 제한될 것이라고 여겨진다. 리포좀과 같은 단백질 및 펩티드, 알콜, DMSO, 모노테르펜, 및 지방산 에스터와 같은 증강제, 피부침투의 증가를 위한 프로드럭의 물리적 변형 및 물리적 방법의 사용(예를 들어, 에탄올-물 수화, 바깥쪽의 각질형성세포층의 벗기기(stripping)) 및 화학적 전달 수단(예를 들어, 피부의 전기적 및 열적 처리)의 국소 및 경피 전달을 촉진하기 위하여 고안된 방법의 긴 리스트는, 경피 전달의 어려움과 효율적인 전달 방법의 필요성을 모두 입증한다. 이러한 방법들은, 특히 Sugino 등24, Skountzou와 Kang,25 및 Antosova 등17에 의해 기재된다. 따라서, 본 발명의 조성물을 이용한 단백질 전달 방법은 피부 장벽을 통해 단백질의 전달 능력에서 유의한 개선을 나타낸다. 어느 글루코사미노글리칸이 피부 장벽을 통해 단백질 또는/및 기타 약학적으로 또는 화장품학적으로 바람직한 물질을 담체로 작용하기 위하여 본 발명에 따라 변형되는데 반하여, 글리코사미노글리칸으로 히알루로닌의 사용은 일반적으로 피부에 자연적으로 존재하며 고분자량에서도 쉽게 사용할 수 있기 때문에 선호된다.
또한, 피부 장벽을 횡단하여 단백질을 전달하는 용도 이외에도, 본 발명의 글리코사미노글리칸 조성물은 피부 장벽을 횡단하여 기타 생체고분자를 전달하는 데에도 사용될 수 있다. 기타 생체고분자는 폴리펩티드(효소 포함), 프로테오글리칸, 탄수화물/다당류, 핵산 사슬, 단백질과 펩티드 치료법, 안티센스 치료법, 생물 활성 인공 고분자, 생물 활성 지질 고분자를 포함한다.
비록 실시예 13에서 피부 장벽을 횡단하여 수송된 단백질이 84kDA이나, 이는 크기를 제한하는 것으로 생각되지 않는다(RHAMM은 이량체가 되거나 삼량체가 되는것으로 알려져 있고, 역시 자가 결합을 하는 GST는 자기 스스로와 RHAMM의 결합을 촉진한다; 따라서 수송된 단백질의 실제 크기는 225kDa(GST-RHAMM 삼량체)까지 된다.). 그리고 본 발명의 화장품 적용에 관심있는 단백질인 Botox™(150kDa)와 크기의 유사성 및 이의 이용도 때문에 선택되었다. 적합한 생체고분자의 선택에서 주요 제한요인은 크기보다는, 본 발명의 글리코사미노글리칸 조성물에 의해 형성된다고 알려져 있는 분자 그물 안에서 얽히는 능력일 것이라 예상된다. 따라서, 증가하는 크기를 가진, 실질적으로 선형인 생체고분자(예를 들어, 콜라겐 단편)은 유사한 크기의 비선형인 생체고분자(예를 들어, 단백질)와 같이 더 큰 규모로 쉽게 이동하지 않을 것이라 예상된다.
본 발명의 범위를 제한하지 않은 하기의 실시예는, 다양한 피부-관련 병에 직면한 인간을 대상으로 하는 국소 치료에 사용될 때 상기 기재된 변형된 히알루로난(HA-PE-2)의 유효성을 입증한다.
실시예 14. 주름 치료
손의 피부는 다른 곳의 피부에 피해 일반적으로 빨리 노화된다. 이는 사이토카인과 성장인자를 피부 섬유아세포에 공급하는 중요한 역할을 하는 피하의 지방층이 부족 때문이다. 손의 피부는 또한 얼굴 피부와 같은 다른 곳에 비해 더 얇다.
59세 여성의 손을 실시예 4에 따라 제조된, NIVEA Creme 베이스 크림과 혼합된 2.5mL의 HA-PE-2으로 10일 동안 하루에 203번 매일 도포하였다. 처리기간이 시작되기 전에, 손의 피부는 작은 섬유증 흉터 또는 주름이 있고, 건조하고/비늘로 뒤덮인 외형을 가지고 있었다. 처리 후에, 손의 피부는 더욱 빛나고, 건조하고 비늘로 뒤덮인 외형은 사라졌으며, 섬유증 흉터는 현저히 감소하였다. 처리가 중단된 2주 동안, 처리된 부위는 다시 건조한 외형으로 복귀되었다. 그러나 작은 흉터는 다시 나타나지 않았다.
실시예 15. 광선 각화증과 관련된 염증의 치료
이전에 광선 각화증 병변을 액체 질소로 치료 받았던 피험자는 실험예 4에 따른 NIVEA Creme 베이스 크림과 혼합한 크림을 함유하는 HA-PE-2를 처리받았다. 처리는 ~2.5mL의 크림을 그의 두피에 하루 한번 7-10일 동안 도포하는 것이며, 뒤따르는 처리는 병변을 없애기 위하여 질소로 후처리 하였다. 치료하는 도중 염증은 강하게 감소하였으며, 병변을 제거하였던 피부과 전문의가 제공한 피부 크림과 비교하였을 때 처리된 병변의 치료율이 증가하였다. 이러한 결과는 자연적이거나 고분자량의 히알루로난이 항염증 특성을 가진다는 증거와 일치하고, 이는 피부 내에서 자연적으로 발생하는 히알루로난의 기능 중 하나이다.
실시예 16. 건조한 얼굴 피부의 치료
여드름이 나기 쉬운 25세 여성에게 전신성 트레티노인 A 섭취법을 시행하였다. 염소처리 된 수영장에서 매일 수영하는 것을 함께 한 이 처리는, 극도로 건조하고 아픈 얼굴 피부, 특히 입 주변이 갈라지고 얇게 벗겨지는 결과를 가져왔다. 졌다. 피험자에게 일주일 동안, 실시예 4에 따라 제조된 Olay™ 베이스 크림의 오일에서 혼합된 HA-PE-2로 처리하였다. 치료기간이 끝나갈 때쯤, 얼굴 피부의 건조한 외형과 관련된 고통이 사라졌다. 이 처리는 근본적인 여드름에는 긍정적이거나 부정적인 어떠한 영향도 없었다.
실시예 17. 흉터피부의 치료
몇 년간의 비올라 연주로 인해 어깨에 섬유증 흉터가 있는 전문 음악가가 실시예4 에 따라 제조된, HA-PE-2를 함유하는 크림을 30일 동안 매일 한번씩 흉터 피부에 ~2.5mL의 크림을 문지르면서 도포하였다. 치료기간이 끝나갈 때쯤, 몇 년 동안이나 존재하였던 흉터가 사라졌다.
실시예 18. 손가락에 갈라진 피부의 치료
손가락에 갈라진 피부를 가진 많은 음악가들(첼로, 바이올린, 비올라, 피아노 연주)들은 실시예 4에 따라 제조된 HA-PE-2를 함유하는 조성물로 처리받았다. 현악기 연주자들은 건조하고 추운 날씨에서 악기를 연주하는 동안 활의 frog에 대한 압력 때문에, 겨울날씨에 특히 엄지손가락이 갈라진다. 피아노 연주자들, 특히 나이가 많은 연주자들은 손가락 끝 피부에 갈라짐이 자주 생긴다. 이는 연습하는 동안 손가락 끝에 힘이 가해지기 때문이다.
세 명의 현악기 연주자들과 2명의 피아니스트는 (실시예 4에 따라 제조된) NIVEA Creme 베이스 크림과 HA-PE-2로 제조된 크림(~1mL)을 갈라진 손가락 끝에 도포하였다. 그리고 3-4일 안에 갈라진 피부가 사라지는 결과가 나왔다. 과거, 실시예 4에서 사용된 NIVEA Creme 베이스 크림을 포함하는 다른 크림들의 사용시에는 갈라진 피부의 치료 효과를 보지 못했었다.
실시예 19. 뒤꿈치에 갈라진 피부의 치료
나이가 들어감에 따라, 뒤꿈치 피부는 두꺼워지고 갈라지기 쉬워지는 것이 보통이고, 춥고 건조한 겨울철에는 특히 그렇다. 55-65세의 심각하게 갈라져 걷는 동안 고통을 야기하는 뒤꿈치를 가지고 있는 3명은 실시예 4에 따라 제조된, NIVEA Creme 베이스 크림과 함께 HA-PE-2가 들어있는 크림을 5-7일 동안 매일 저녁 뒤꿈치에 도포하였다. 그들 각자는 2-3일 내에 고통 없이 걸을 수 있는 것을 포함하여 자신의 상태가 나아지고 있다는 것을 알았다. 치료의 중단 후, 치료 효과가 5~7일 이내에 사라졌다. 2-3일 동안 크림을 재도포하면 각자의 갈라짐과 고통의 강도가 다시 감소하였다. 베이스 크림을 단독으로 사용하는 것은 누구에게도 완화를 가져다 주지 못하였다.
실시예 20. 얼굴피부의 치료
3명에게 실시예 4에 따라 제조된, NIVEA Creme 베이스 크림과 함께 HA-PE-2를 함유하는 크림을 얼굴 피부에 하루 1-2번씩 도포하였다. 처리를 시작하고 1주 내에, 피부 광도가 증가하고 매끄러워진 것이 관찰되었다. 이 기간 동안 피부는 촉촉함이 증가되었고 (추운 온도 때문에 피부가 더 건조하게 되는 겨울에 도포되었다.) 눈가의 잔주름이 사라졌다. 1개월간 지속된 처리 후, 처음에 관찰된 효과들은 향상되었고, 피부는 더 두꺼운 외형을 가지고, 특히 눈 주위와 입 주변의 주름이 사라졌다. 처리 기간이 끝난 다음, 처리된 부위는 건조한 전의 상태로 되돌아갔고, 눈과 입 주변의 주름들은 점차 다시 생겨났다.
많은 변화가 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 상기 기재된 실시예로 만들어질 수 있는 바와 같이, 본 명세서에 함유된 모든 물질은 발명을 예시적인 것으로 설명하고 이에 제한되지 않는다.
전술한 설명 내에 참조된 문헌은 하기와 같다:
HBdocs - 10282653vl
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Claims (104)

1~15%의 반복 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 통해 변형된 글리코사미노글리칸을 포함하는 글리코사미노글리칸 조성물로서;
여기서 변형될 글리코사미노글리칸은 히알루로난, 히알루로난 유도체, 헥소사민에 결합된 우론산(uronic acid) 또는 헥소오스(hexose)의 반복 이당류 단위로 구성된 다당류, 또는 이의 유도체이며;
변형될 글리코사미노글리칸은 2 kDa 내지 2,500 kDa 범위의 분자량을 가지며;
지질 성분은 글리코사미노글리칸에 지질의 공유결합을 허여하는 이의 극성 머리-기 위에 작용기를 함유하면, 하나 이상의 자연적으로 발생하거나 또는 합성적으로 유도된 지방산, 글리세로지질, 인지질, 스핑고지질, 스테롤 지질, 프레놀 지질, 또는 이의 유도체를 포함하며; 및
변형된 글리코사미노글리칸은 거기에 적용되었을 때 피부 장벽 또는 점막을 침투할 수 있으며,
변형된 글리코사미노글리칸은 글리코사미노글리칸이 지질 성분과 반응하여 형성되는, 글리코사미노글리칸 조성물.
제 1항에 있어서, 글리코사미노글리칸은 1~12%의 반복 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 통해 변형된 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물.
제 1항에 있어서, 글리코사미노글리칸은 1~10%의 반복 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 통해 변형된 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물.
제 1항에 있어서, 글리코사미노글리칸은 1~7.5%의 반복 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 통해 변형된 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물.
제 1항에 있어서, 글리코사미노글리칸은 2~6%의 반복 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 통해 변형된 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 변형될 글리코사미노글리칸은 50 kDa 내지 2,500 kDa 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코사미노글리칸은 100 kDa 내지 2,000 kDa 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코사미노글리칸은 350 kDa 내지 1,500 kDa 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코사미노글리칸은 500 kDa 내지 1,500 kDa 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물.
제 1항 또는 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 변형될 글리코사미노글리칸은 히알루로난 또는 히알루로난 유도체인 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물.
제 10항에 있어서, 변형될 글리코사미노글리칸은 히알루로난인 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 성분은 이의 극성 머리-기 위에 아미노 기를 함유하고 글리코사미노글리칸의 카복실산 기에 아미드 결합을 통해 글리코사미노글리칸에 공유결합된 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 성분은 하나 이상의 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜세린을 포함하는, 글리코사미노글리칸 조성물.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 성분은 하나 이상의 포스파티딜에탄올아민을 포함하는, 글리코사미노글리칸 조성물.
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 글리코사미노글리칸은 피부 장벽을 침투할 수 있는 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 글리코사미노글리칸은 진피에 전달되었을 때, 변형되지 않은 글리코사미노글리칸 보다 피부 내에서 더 오래 거주하는 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물.
제 16항에 있어서, 변형될 글리코사미노글리칸은 히알루로난인 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물.
하나 이상의 화장품학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체와 함께 혼합한 글리코사미노글리칸 조성물을 포함하는 피부 또는 점막의 적용에 적합한 제제로서,
여기서 글리코사미노글리칸 조성물은 1~15%의 반복 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 통해 변형된 글리코사미노글리칸을 포함하며;
글리코사미노글리칸은 히알루로난, 히알루로난 유도체, 헥소사민에 결합된 우론산 또는 헥소오스의 반복 이당류 단위로 구성된 다당류, 또는 이의 유도체를 포함하며;
변형될 글리코사미노글리칸은 2 kDa 내지 2,500 kDa 범위의 분자량을 가지며;
지질 성분은 글리코사미노글리칸에 지질의 공유결합을 허여하는 이의 극성 머리기 위에 작용기를 함유하면, 하나 이상의 자연적으로 발생하거나 또는 합성적으로 유도된 지방산, 글리세로지질, 인지질, 스핑고지질, 스테롤 지질, 프레놀 지질, 또는 이의 유도체를 포함하며; 및
변형된 글리코사미노글리칸은 거기에 적용되었을 때 피부 장벽 또는 점막을 침투할 수 있으며,
변형된 글리코사미노글리칸은 글리코사미노글리칸이 지질 성분과 반응하여 형성되는, 제제.
제 18항에 있어서, 글리코사미노글리칸은 1~12%의 반복 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 통해 변형된 것을 특징으로 하는, 제제.
제 18항에 있어서, 글리코사미노글리칸은 1~10%의 반복 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 통해 변형된 것을 특징으로 하는, 제제.
제 18항에 있어서, 글리코사미노글리칸은 1~7.5%의 반복 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 통해 변형된 것을 특징으로 하는, 제제.
제 18항에 있어서, 글리코사미노글리칸은 2~6%의 반복 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 통해 변형된 것을 특징으로 하는, 제제.
제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 변형될 글리코사미노글리칸은 50 kDa 내지 2,500 kDa 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 제제.
제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 변형될 글리코사미노글리칸은 100 kDa 내지 2,000 kDa 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 제제.
제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 변형될 글리코사미노글리칸은 350 kDa 내지 1,500 kDa 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 제제.
제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 변형될 글리코사미노글리칸은 500 kDa 내지 1,500 kDa 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 제제.
제 18항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코사미노글리칸은 히알루로난 또는 히알루로난 유도체인 것을 특징으로 하는, 제제.
제 27항에 있어서, 글리코사미노글리칸은 히알루로난인 것을 특징으로 하는, 제제.
제 18항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 성분은 이의 극성 머리-기 위에 아미노 기를 함유하고 글리코사미노글리칸의 카복실산 기에 아미드 결합을 통해 글리코사미노글리칸에 공유결합된 것을 특징으로 하는, 제제.
제 18항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 성분은 하나 이상의 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜세린을 포함하는, 제제.
제 18항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 성분은 포스파티딜에탄올아민을 포함하는, 제제.
제 18항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 피부 장벽을 통해 변형된 글리코사미노글리칸의 전달에 적합한 것을 특징으로 하는, 제제.
제 18항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 글리코사미노글리칸은 진피에 전달되었을 때, 변형되지 않은 글리코사미노글리칸 보다 피부 내에서 더 오래 거주하는 것을 특징으로 하는, 제제.
제 18항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코사미노글리칸 조성물에 의해 피부 장벽 또는 점막을 횡단하여 수송되는 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는 제제.
제 34항에 있어서, 하나 이상의 추가 성분은 피부 장벽을 횡단하여 수송되는 제제.
제 35항에 있어서, 하나 이상의 추가 성분은 항-산화제, 비타민, 정유, UV-차단제, 또는 기타 영양제를 포함하며, 이들의 적용이 피부의 건강 또는 외형에 유익한 효과를 제공하는 것으로 알려진 것을 특징으로 하는, 제제.
제 34항 또는 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가 성분은 의약품인 것을 특징으로 하는, 제제.
제 37항에 있어서, 하나 이상의 추가 성분은 염증, 피부암 또는 피부 장벽을 통해 전달된 피부병의 치료에 적합한 치료제를 포함하는, 제제.
제 38항에 있어서, 하나 이상의 추가 성분은 피부암의 치료에 적합한 것을 특징으로 하는, 제제.
제 38항에 있어서, 하나 이상의 추가 성분은 피부병의 치료에 적합한 것을 특징으로 하는, 제제.
제 37항에 있어서, 하나 이상의 추가 성분은 항염증제를 포함하는, 제제.
제 37항에 있어서, 하나 이상의 추가 성분은 프로스타글란딘을 포함하는, 제제.
제 34항 또는 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가 성분은 단백질, 펩티드, 펩티드 모방체, 펩두신, 폴리뉴클레오티드, 또는 기타 생체분자를 포함하는, 제제.
제 43항에 있어서, 하나 이상의 추가 성분은 700 Da 및 500 kDa 사이의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 제제.
제 43항 또는 제 44항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가 성분은 피부 장벽을 횡단하여 전달된 콜라겐을 포함하는, 제제.
제 43항 또는 제 44항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가 성분은 피부 장벽을 횡단하여 전달된 엘라스틴을 포함하는, 제제.
제 44항에 있어서, 하나 이상의 추가 성분은 단백질을 포함하는, 제제.
제 47항에 있어서, 단백질은 피부 장벽을 횡단하여 전달된 보툴리눔 독소를 포함하는, 제제.
제 48항에 있어서, 단백질은 보툴리눔 독소 타입 A인 것을 특징으로 하는, 제제.
제 47항에 있어서, 히알루로난 생성효소는 피부 장벽을 횡단하여 전달된 것을 특징으로 하는, 제제.
제 44항에 있어서, 하나 이상의 추가 성분은 펩두신을 포함하는, 제제.
제 34항에 있어서, 하나 이상의 추가 성분은 피부 장벽을 횡단하여 전달된 히알루로니다제 저해제를 포함하는, 제제.
제 34항에 있어서, 하나 이상의 추가 성분은 피부 장벽을 횡단하여 전달된 RHAMM 저해제를 포함하는, 제제.
피부에 자연적으로 존재하는 글리코사미노글리칸의 수준을 보충하는 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따른 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 54항에 있어서, 글리코사미노글리칸은 히알루로난인 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 55항에 있어서, 주름 출현의 감소인 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 55항에 있어서, 피부 수화의 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 55항에 있어서, 피부 노화의 징후를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 55항에 있어서, 피부 위축의 출현 또는 예방의 전환을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 55항에 있어서, 피부 흉터의 출현의 전환을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 55항에 있어서, 광선 각화증(actinic keratinoses)과 관련된 염증의 감소를 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 55항에 있어서, 신생혈관형성의 촉진을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 62항에 있어서, 상처 회복의 재생을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 62항에 있어서, 손상되지 않으나 면역 반응 따위가 제대로 발휘되지 못하는 피부의 외형을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 55항에 있어서, 피부 외상의 효과를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 65항에 있어서, 흉터, 튼살, 화상 수축, 섬유증 병변, 로사시아, 피부염 또는 피부 위축의 출현을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 65항에 있어서, 피부 외상은 UV 조사의 결과인 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 65항에 있어서, 피부 외상은 화상의 결과인 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 65항에 있어서, 피부 외상은 의약품의 국소 투여에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 65항에 있어서, 피부 외상은 스테로이드의 사용에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 65항에 있어서, 피부 외상은 섬유증 병변인 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
화장품학적으로 및 치료적으로 활성 성분의 진피 또는 경피 전달로서 사용하기 위한 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따른 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 72항에 있어서, 히알루로니다제 저해제의 진피 전달을 위한, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 72항에 있어서, RHAMM 저해제의 진피 전달을 위한, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 72항에 있어서, 콜라겐의 진피 전달을 위한, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 72항에 있어서, 엘라스틴의 진피 전달을 위한, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 72항에 있어서, 단백질, 펩티드, 펩티드 모방체, 펩두신, 폴리뉴클레오티드, 또는 기타 생체분자의 전달을 위한, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 77항에 있어서, 단백질의 진피 전달을 위한, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 78항에 있어서, 보툴리눔 독소의 전달을 위한, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 79항에 있어서, 보툴리눔 독소 타입 A의 전달을 위한, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 78항에 있어서, 히알루로난 생성효소의 전달을 위한, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 77항에 있어서, 펩두신의 전달을 위한, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 72항에 있어서, 의약품의 전달을 위한, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 83항에 있어서, 항염증제의 전달을 위한, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 83항에 있어서, 프로스타글란딘의 전달을 위한, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 83항에 있어서, 의약품의 진피 전달을 위한, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 86항에 있어서, 피부 염증, 피부암, 피부 알러지, 또는 기타 피부병의 치료에 유용한 의약품의 전달을 위한, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
제 87항에 있어서, 피부암의 치료를 위한, 글리코사미노글리칸 조성물의 용도.
하기 단계를 포함하는 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 한에 기재된 글리코사미노글리칸 조성물의 제조방법:
변형될 글리코사미노글리칸을 활성화제로 처리하여 글리코사미노글리칸과 지질 성분의 공유결합을 용이하게 하는 단계;
활성화된 글리코사미노글리칸과 지질 성분을 혼합하는 단계; 및
활성화된 글리코사미노글리칸과 지질 성분을 반응시켜 글리코사미노글리칸에 지질 성분을 공유결합시키는 단계,
여기서, 활성화제는 반응에서 제한 시약이고, 1 내지 15%의 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 용이하게 하는데 충분한 양을 가하는 것을 특징으로 하는, 글리코사미노글리칸 조성물의 제조방법.
제 89항에 있어서, 활성화제는 1 내지 12%의 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 용이하게 하는데 충분한 양을 가하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 89항에 있어서, 활성화제는 1 내지 10%의 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 용이하게 하는데 충분한 양을 가하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 89항에 있어서, 활성화제는 1 내지 7.5%의 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 용이하게 하는데 충분한 양을 가하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 89항에 있어서, 활성화제는 2 내지 6%의 이당류 단량체 단위의 글리코사미노글리칸에 지질 성분의 공유결합을 용이하게 하는데 충분한 양을 가하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 89항 내지 제 93항 중 어느 한 항에 있어서, 형성될 공유결합은 글리코사미노글리칸의 카복실 기와 극성 머리 기 위에 아민 작용기를 함유하는 지질 성분 사이의 아미드 결합인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 89항 내지 제 94항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화제는 카보디이미드인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 95항에 있어서, 카보디이미드는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 89항 내지 제 96항 중 어느 한 항에 있어서, 변형될 글리코사미노글리칸은 히알루로난인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 89항 내지 제 97항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 성분은 하나 이상의 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜세린을 포함하는, 방법.
제 89항 내지 제 97항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 성분은 하나 이상의 포스파티딜에탄올아민을 포함하는, 방법.
제 1항에 있어서, 변형된 글리코사미노글리칸은 비-미립자 히알루로난-인지질인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 100항에 있어서, 비-미립자 히알루로난-인지질은 손상되지 않은(intact) 히알루로난-인지질로서 피부 내에서 증가된 거주 시간을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 100항 또는 제 101항 중 어느 한 항에 있어서, 비-미립자 히알루로난-인지질은 손상되지 않은 히알루로난-인지질로서 피부 내에서 증가된 거주 시간을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 102항에 있어서, 용도는 화장품인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 102항에 있어서, 용도는 의약품인 것을 특징으로 하는, 방법.
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