KR20130041795A - 면역 크로마토그래피를 이용한 측정 방법, 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립 및 면역 크로마토그래피용 측정 시약 키트 - Google Patents

면역 크로마토그래피를 이용한 측정 방법, 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립 및 면역 크로마토그래피용 측정 시약 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종래보다도 간단한 조작으로 단시간에 정확한 혈중의 측정 대상물의 측정이 가능한 면역 크로마토그래피를 이용한 측정 방법, 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립, 및 면역 크로마토그래피용 시약 키트를 제공한다. 본 발명은 동일 측정 시료 중의 측정 대상물의 농도와 헤모글로빈의 농도를 면역 크로마토그래피에 의해 측정하고, 헤모글로빈의 측정값을 이용하여 측정 대상물의 측정값을 헤마토크리트 보정하는 면역 크로마토그래피에 의해 측정하는 방법, 및 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립 및 시약 키트를 제공한다.

Description

면역 크로마토그래피를 이용한 측정 방법, 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립 및 면역 크로마토그래피용 측정 시약 키트{MEASUREMENT METHOD USING IMMUNOCHROMATOGRAPHY, TEST STRIP FOR IMMUNOCHROMATOGRAPHY, AND MEASUREMENT REAGENT KIT FOR IMMUNOCHROMATOGRAPHY}
본 발명은 시료 중의 측정 대상물을 면역 크로마토그래피에 의해 측정하는 측정 방법, 시료 중의 측정 대상물을 면역 크로마토그래피에 의해 측정하기 위한 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립, 및 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립과 희석액을 포함하는 면역 크로마토그래피용 측정 시약 키트에 관한 것이다. 특히, 혈액 유래의 동일 시료 중의 헤모글로빈 농도 및 공존하는 제2 측정 대상물 농도를 면역 크로마토그래피를 이용하여 측정하고, 헤모글로빈의 측정값으로부터 구한 헤마토크리트값에 의해 제2 측정 대상물의 측정값을 보정하는 기술에 관한 것이다.
의료 분야, 의학 연구 분야 등에 있어서, 혈액 중의 특정 성분(혈청 알부민, 면역 글로불린, 간염 바이러스, 류마티스 인자, C 반응성 단백질 등)을 측정하는 것이 필요하게 되고, 이를 위해서 여러 가지 측정 방법이 개발되고 실시되고 있다. 그 중에서도 많이 채택되고 있는 방법은, 환자나 피험자로부터 혈액을 채취하고, 얻어진 혈액(이하, 전혈이라고 함)을 원심 분리하고, 상청(혈청 또는 혈장)을 얻고, 이것을 적당한 완충액에 의해 희석하고, 측정 대상물에 대하여 특이적으로 반응하는 항체를 이용하여 혈청 또는 혈장 중의 측정 대상물을 검출하는 면역학적 측정이 주류로 되어 있다. 이와 같은 방법에는, 정성 검사로서는 폴리클로날 항체를 이용한 일원 면역 확산법에 의한 방법이 있다. 또한, 정량 검사로서는 대표적인 것으로 라텍스 응집 면역 측정법이나 면역 비탁법 등이 있다.
최근에는 진료소나 작은 병원에서도 「환자를 진찰하고 있는 동안에 여러 가지 검사를 실시하고 싶다」라는 필요성이 커지고 있어, 종래의 외주 검사로부터 현장현시검사(Point of Care Testing; POCT)에 의한 검사가 행해지고 있다. 이와 같은 POCT 시약의 대표예로서는, 래터럴 플로우식 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립 등을 들 수 있다. POCT 영역에서는 혈액으로부터 혈장이나 혈청을 분리하는 조작이 번잡하고 숙련을 필요로 하기 때문에, 전혈을 이용한 검사가 요망되고 있다. 면역 크로마토그래피를 이용하여 전혈 시료 중의 측정 대상물을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 혈구 분리막을 배치 장착한 테스트 스트립을 이용한 방법 및 시약 및 키트가 개시되어 있다(특허문헌 1). 그러나, 이 방법에 의해 분리된 혈장을 이용하여 직접 샌드위치형 면역 반응을 원리로 하는 면역 크로마토그래피에 의해 측정하는 경우에 있어서, 측정 대상물이 과잉으로 존재하는 경우에는 「훅(hook) 현상」(「프로존(prozone) 현상」이라고도 함)이 발생하여 시료 중에 고농도의 측정 대상물이 존재함에도 불구하고 외관상의 저치화(低値化)가 발생한다는 문제가 있다. 그 때문에, 통상 소정의 측정 범위가 되도록 전혈을 용혈, 희석하여 측정하는 것이 행해지고 있다. 그러나, 이 경우 혈구 용적분만큼 측정 대상물의 농도가 희석되게 되어, 혈청이나 혈장 시료의 경우에 비해 측정값이 저치화하기 때문에, 헤마토크리트값(혈액 중에 차지하는 혈구의 용적 비율)을 이용하여 측정값을 보정할 필요가 있다. 또한, 이하, 헤마토크리트값(혈액 중에 차지하는 혈구의 용적 비율)을 이용하여 측정 대상물의 측정값을 보정하는 것을 간단히 헤마토크리트 보정이라고 하는 경우가 있다.
상기한 외관상 저치화의 문제에 대하여, 종래에는 건강한 보통사람에 있어서의 평균 헤마토크리트값으로부터 얻어지는 보정 계수를 일률적으로 곱하는 보정이 행해지고 있다. 그러나, 헤마토크리트값은 개개인에 따라 상이하며, 그 기준치는 남성에서 39 내지 52%, 여성에서는 35 내지 48%로 폭이 있다. 그 때문에, 일률적인 계수를 곱하는 보정에서는, 정확한 측정 대상물 농도는 얻어지지 않는다. 따라서, 정확한 헤마토크리트 보정을 행하고자 하면, 측정 대상물 농도를 측정한 동일한 시료를 이용하여 별도 측정한 헤마토크리트값으로 보정할 필요가 있다.
헤마토크리트값은, 종래 원심법에 의한 마이크로헤마토크리트법이나, 또는 자동 혈구 계수 장치를 이용하여 적혈구수와 평균 적혈구 용적으로부터 계산에 의해 구해지고 있다. 한편, 다른 방법으로서, 전혈의 측정 결과로부터 혈청 또는 혈장을 측정한 경우의 측정값으로 변환하는 측정으로서, 전혈 중의 헤모글로빈 농도(g/L)를 측정하고, 얻어진 헤모글로빈 농도를 약 3/10배한 수치를 헤마토크리트값(%)으로서 채택하고, 그 헤마토크리트값을 이용하여 전혈의 측정 결과로부터 혈청 또는 혈장을 측정한 경우의 측정값으로 변환하는 혈액 측정 결과의 변환 방법이 보고되어 있다(특허문헌 2). 그러나, 이 방법에서도, 면역 크로마토그래피에 의한 측정과는 별도의 방법에 의해 헤모글로빈 농도 및 헤마토크리트값을 구해야만 해서, 번잡하고 시간과 비용도 들어, POCT 영역에서의 검사 필요성을 만족시킬 수 있는 것이 아니다.
그 때문에, 면역 크로마토그래피에 의해 측정 대상물과 동시에 헤모글로빈을 측정하는 방법이 요구되지만, 전혈 중의 헤모글로빈 농도는 통상 수십g/L 내지 200g/L이며 매우 고농도로 존재하기 때문에, 통상의 샌드위치형 면역 측정법을 원리로 하는 측정 방법에서는 1만배 내지 10만배로 희석할 필요가 있다. 이 방법에서는, 1단계로 희석하기 위해서는 대량의 희석액이 필요하게 되어, 측정 정밀도도 나빠진다. 또한, 다단계 희석을 하는 방법에서는, POCT 영역의 검사 방법으로서는 실용성이 부족하다는 문제점이 있다. 이들 문제를 해결하기 위해서는, 전혈을 겨우 50배 내지 400배 정도의 용혈 희석 조작으로 측정할 수 있는 면역 크로마토그래피 측정이 요구된다.
국제 공개 2010/001598호 공보 일본 특허 공개 제2001-272403호 공보
예를 들면, C 반응성 단백질(C-reactive protein)(이하, 「CRP」라고 하는 경우도 있음)의 혈중 농도는, 건강한 보통사람에서 3mg/L 이하, 수술 후나 급성 세균 감염에서 35mg/L 정도까지, 중증의 외상자에서도 최대 1000mg/L 정도까지이다. 이에 대하여, 헤모글로빈의 혈중 농도는 통상 수십g/L 내지 200g/L로, CRP와는 약 50 내지 67000배의 농도차가 있으며, 면역 측정법을 이용하는 측정 대상물로서는 매우 고농도이다. 그 때문에, 샌드위치형 면역 크로마토그래피를 원리로 하는 측정 방법에서는, 양자를 측정하려고 는 경우, 측정 대상에 따라 시료의 희석률을 크게 변경할 필요가 있기 때문에 동일 시료(동일 희석 배율의 시료)로 측정하는 것은 매우 어렵다.
면역 측정법에 있어서의 측정 범위를 규정하는 가장 큰 요인은, 항원과 항체의 친화성(Avidity)이고, 그 외에는 이들의 결합 반응에 영향을 주는 여러 가지 환경 요인을 들 수 있다. 이 환경요인으로는 온도, 시간, pH, 이온 환경, 계면 활성제, 반응 촉진제 등 특유의 효과를 제공하는 약제의 첨가 등을 들 수 있다. 동일 시료 중의 CRP와 헤모글로빈의 농도를 동시에 측정하기 위해서는, 원리적으로는 상기한 현저한 농도차를 메우도록 친화성이 상이한 항체를 선별하고 환경 요인을 적정화함으로써 가능하게 할 수 있다. 그러나, 그와 같은 항체의 조합을 제조하고, 환경 요인을 적정화하는 것은 용이한 것은 아니다.
사실, 본 발명자들이 샌드위치형 면역 크로마토그래피에 의한 CRP와 헤모글로빈의 동시 측정을 검토한 당초, CRP 측정시에는 전혈을 50배 내지 200배로 희석하면 충분했던 것에 대하여, 헤모글로빈을 측정하기 위해서는 2000배 내지 100,000배의 희석이 필요하였다. 그 때문에, 지금까지는 CRP와 헤모글로빈을 동일한 희석 시료를 이용하여 측정하는 것은 불가능했었다.
본 발명의 목적은, 동일 시료 중의 측정 대상물과 헤모글로빈의 농도를 동일한 희석 시료를 이용하여 면역 크로마토그래피에 의해 측정하는 방법, 및 헤모글로빈의 측정값을 이용하여 측정 대상물의 측정값을 헤마토크리트 보정하는 방법을 제공하는 것에 있고, 또한 이들 방법에 이용되는 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립 및 시약 키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립에 있어서, 혈액을 100배 정도로 희석 용혈한 시료, 즉 시료 중의 헤모글로빈 농도가 헤모글로빈 측정의 최대 시그널값이 얻어지는 농도 이상의 농도 범위(이하, 프로존 현상 영역이라고 하는 경우도 있음)에 있어서도, 헤모글로빈 농도의 증가에 수반하여, 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립의 불용성 멤브레인 담체 상의 항헤모글로빈 항체를 고정화한 라인에 포착되는 금 콜로이드 표지체의 반사광 강도가 감소하는 현상을 이용하여 헤모글로빈의 정량이 가능한 것, 및 해당 희석 시료에서는 CRP도 측정 가능한 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
또한 「면역 크로마토그래피용 테스트 스트립」이란, 적어도 면역 크로마토그래피에 의한 측정에 필요한 불용성 멤브레인 담체를 포함하고, 필요에 따라 시약 성분이나 다른 멤브레인 등을 더 포함하는 것을 말한다.
즉, 본 발명은 이하의 구성을 갖는다.
(1) 제1 측정 대상물을 적어도 함유하는 시료를 이하의 공정 A를 갖는 면역 크로마토그래피에 의해 측정하는 측정 방법에 있어서, 시료 중의 제1 측정 대상물 농도를 제1 측정 대상물의 최대 시그널값이 얻어지는 농도 이상의 농도 범위(프로존 현상 영역)에서 측정하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
A. 이하의 1) 및 2)를 이용하는 경합 면역 크로마토그래피에 의해 시료 중의 제1 측정 대상물을 측정하는 공정.
1) 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트,
2) 제1 측정 대상물에 대한 제2 항체(여기서, 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이하지만, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일하거나 또는 제1 항체와 제2 항체가 동일한 경우를 포함함)가 고정화된 불용성 멤브레인 담체.
(2) 상기 (1) 기재의 측정 방법으로서, 공정 A는 이하의 3) 및 4)를 더 이용하는 것이며, 1)의 콘쥬게이트는 패드에 함유되어 콘쥬게이트 패드로 되고, 2)의 불용성 멤브레인 담체의 상류측에 배치되어 있는 측정 방법.
3) 콘쥬게이트 패드의 상류측에 위치하고 시료가 공급되는 샘플 패드,
4) 2)의 불용성 멤브레인 담체의 하류측에 위치하는 흡수 패드.
(3) 제1 측정 대상물이 헤모글로빈이고, 시료는 혈액을 헤모글로빈 측정의 최대 시그널값이 얻어지는 농도 이상의 농도 범위(프로존 현상 영역)로 희석되며 용혈된 것인 상기 (1) 또는 (2) 기재의 측정 방법.
(4) 제1 측정 대상물인 헤모글로빈 및 제2 측정 대상물을 적어도 함유하는 시료를 이하의 공정 A 내지 D를 갖는 면역 크로마토그래피에 의해 측정하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
A. 이하의 1) 및 2)를 이용하는 경합 면역 크로마토그래피에 의해 시료 중의 제1 측정 대상물을 측정하는 공정.
1) 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트,
2) 제1 측정 대상물에 대한 제2 항체(여기서, 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이하지만, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일하거나 또는 제1 항체와 제2 항체가 동일한 경우를 포함함)가 고정화된 불용성 멤브레인 담체.
B. 이하의 5) 및 6)을 이용하는 면역 크로마토그래피에 의해 시료 중의 제2 측정 대상물을 측정하는 공정.
5) 제2 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트,
6) 제2 측정 대상물에 대한 제2 항체(여기서, 제2 측정 대상물에 대한 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이하지만, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일하거나 또는 제1 항체와 제2 항체가 동일한 경우를 포함함)가 고정화된 불용성 멤브레인 담체.
C. 공정 A에서 얻어진 제1 측정 대상물의 측정값으로부터 시료의 헤마토크리트값을 구하는 공정.
D. 공정 B에서 얻어진 제2 측정 대상물의 측정값을 공정 C에서 얻어진 헤마토크리트값을 이용하여 보정하는 공정.
(5) 공정 A 및 공정 B는 동일한 불용성 멤브레인 담체를 이용한 공정인 상기 (4)에 기재된 측정 방법.
(6) 공정 A 및 공정 B는 동일한 유로 내에서 행해지는 상기 (5)에 기재된 측정 방법.
(7) 제2 측정 대상물이 CRP인 상기 (4) 내지 (6) 중 어느 한 항에 기재된 측정 방법.
(8) 제1 측정 대상물 및 제2 측정 대상물을 적어도 함유하는 시료를 면역 크로마토그래피에 의해 측정하기 위한 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립으로서, 이하의 E 및 F를 포함하는 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립.
E. 이하의 1) 및 2)를 포함하는 제1 측정 대상물 측정용 테스트 스트립.
1) 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트,
2) 제1 측정 대상물에 대한 제2 항체(여기서, 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이하지만, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일하거나 또는 제1 항체와 제2 항체가 동일한 경우를 포함함)가 고정화된 불용성 멤브레인 담체.
F. 이하의 5) 및 6)을 포함하는 제2 측정 대상물 측정용 테스트 스트립.
5) 제2 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트,
6) 제2 측정 대상물에 대한 제2 항체(여기서, 제2 측정 대상물에 대한 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이하지만, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일하거나 또는 제1 항체와 제2 항체가 동일한 경우를 포함함)가 고정화된 불용성 멤브레인 담체.
(9) E의 1) 및 F의 5)의 콘쥬게이트는 동일한 패드에 함유되어 콘쥬게이트 패드로 되어 있으며, E의 2) 및 F의 5)의 불용성 멤브레인 담체는 동일한 불용성 멤브레인 담체인 상기 (8)에 기재된 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립.
(10) E 및 F는 동일한 유로 내에 배치되어 있는 상기 (9)에 기재된 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립.
(11) 이하의 G 및 H를 더 포함하며, E의 1) 및 F의 5)의 콘쥬게이트는 패드에 함유되어 콘쥬게이트 패드로 되고, E의 2) 및 F의 6)의 불용성 멤브레인 담체의 상류측에 배치되어 있는 상기 (8) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립.
G. 콘쥬게이트 패드의 상류측에 위치하고 시료가 공급되는 샘플 패드,
H. E의 2) 및 F의 6)의 불용성 멤브레인 담체의 하류측에 위치하는 흡수 패드.
(12) 제1 측정 대상물이 헤모글로빈인 상기 (8) 내지 (11) 중 어느 한 항에 기재된 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립.
(13) 제2 측정 대상물이 CRP인 상기 (12)에 기재된 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립.
(14) 상기 (12) 또는 (13)에 기재된 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립과, 헤모글로빈을 용혈하고 희석하기 위한 희석액을 포함하는 면역 크로마토그래피용 측정 시약 키트.
(15) 제1 측정 대상물 및 제2 측정 대상물을 적어도 함유하는 시료를 이하의 공정 A 및 B를 갖는 면역 크로마토그래피에 의해 측정하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
A. 이하의 1) 및 2)를 이용하는 경합 면역 크로마토그래피에 의해 시료 중의 제1 측정 대상물을 측정하는 공정.
1) 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트,
2) 제1 측정 대상물에 대한 제2 항체(여기서, 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이하지만, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일하거나 또는 제1 항체와 제2 항체가 동일한 경우를 포함함)가 고정화된 불용성 멤브레인 담체.
B. 이하의 5) 및 6)을 이용하는 면역 크로마토그래피에 의해 시료 중의 제2 측정 대상물을 측정하는 공정.
5) 제2 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트,
6) 제2 측정 대상물에 대한 제2 항체(여기서, 제2 측정 대상물에 대한 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이하지만, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일하거나 또는 제1 항체와 제2 항체가 동일한 경우를 포함함)가 고정화된 불용성 멤브레인 담체.
(16) 제2 측정 대상물이 CRP인 상기 (15)에 기재된 측정 방법.
또한, 종래 정량에는 부적합하다고 생각되었던 프로존 현상 영역에서의 측정이 가능한 이유로서, 본 발명자들은, 아마도 100배 정도로 희석 용혈한 혈액 시료에서는 헤모글로빈 농도가 너무 높기 때문에, 항헤모글로빈 항체 고정화 금 콜로이드(콘쥬게이트)에 결합할 수 없는 유리 헤모글로빈이 생기고, 이 유리 헤모글로빈과 항헤모글로빈 항체 고정화 금 콜로이드-헤모글로빈 복합체가, 불용성 멤브레인 담체 상에 고정화된 항헤모글로빈 항체와 결합할 때에 경합함으로써 상기와 같은 현상이 발생하는 것으로 추측하였다.
본 발명에 의해, 고농도의 측정 대상물을 함유하는 시료이더라도, 상기 측정 대상물의 농도를 해당 측정 대상물의 측정계에서 최대 시그널값이 얻어지는 농도 이상의 농도 범위(프로존 현상 영역)에서 측정함으로써, 시료의 희석에 필요한 시간과 비용을 대폭 삭감할 수 있다.
또한, 본 발명을 혈액 중의 헤모글로빈의 측정에 적용함으로써, 동일 시료 중의 측정 대상물과 헤모글로빈의 농도를 동일 면역 크로마토그래피에 의해 측정하고, 그 헤모글로빈의 측정값로부터 측정 대상물의 측정값을 헤마토크리트 보정할 수 있는 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립 및 면역 크로마토그래피용 측정 시약 키트를 제공할 수 있기 때문에, 종래보다도 간단한 조작으로 단시간에 측정 대상물의 정확한 혈중 농도 측정이 가능하게 되어, POCT 검사 영역에 있어서의 사회적 요구에도 부응할 수 있다.
도 1은 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립의 모식 구조도이다.
도 2는 실시예 1의 헤모글로빈 측정의 결과이다.
도 3은 실시예 1의 CRP 측정에 있어서의 보정 곡선이다.
도 4는 실시예 1의 헤모글로빈 측정 라인의 반사광 강도와 헤마토크리트값의 관계를 나타낸 도면이다.
도 5는 실시예 1의 헤마토크리트 보정을 하지 않은 경우의 본 발명의 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립을 이용하여 얻어진 CRP 농도와, 시판의 CRP 측정 키트(세키스이메디칼사 제조, 「나노피아 CRP」)를 이용하여 얻어진 CRP 농도의 상관성을 나타낸 도면이다.
도 6은 실시예 1의 헤마토크리트 보정을 하여 얻어진 CRP 농도와, 시판의 CRP 측정 키트(세키스이메디칼사 제조, 「나노피아 CRP」)를 이용하여 얻어진 CRP 농도의 상관성을 나타낸 도면이다.
도 7은 실시예 1의 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립에서 얻어진 CRP 농도를 평균 헤마토크리트값을 44%로 하여 일률 보정을 한 경우의 CRP 농도와, 시판의 CRP 측정 키트(세키스이메디칼사 제조, 「나노피아 CRP」)를 이용하여 얻어진 CRP 농도의 상관성을 나타낸 도면이다.
도 8은 실시예 2의 헤모글로빈 측정 라인의 반사광 강도와 헤마토크리트값의 관계를 나타낸 도면이다.
도 9는 실시예 2의 CRP 측정에 있어서의 보정 곡선이다.
도 10은 실시예 2의 HCT 보정을 하지 않은 경우의 시판 CRP 측정 키트(나노피아 CRP)와 본 법의 상관성을 나타낸 도면이다.
도 11은 실시예 2의 HCT 보정을 한 경우의 시판 CRP 측정 키트(나노피아 CRP)와 본 법의 상관성을 나타낸 도면이다.
도 12는 Hb 측정에 대한 멤브레인의 모세관류 시간(capillary flow time)의 영향을 나타낸 도면이다.
본 발명의 실시 양태의 하나인 헤마토크리트 보정을 행하는 측정 방법에 관하여, 제2 측정 대상물이 CRP인 경우의 측정 방법을 예로 상세하게 기술한다. 이 경우, 제1 측정 대상물은 헤모글로빈이고, 제2 측정 대상물은 CRP이다.
본 발명의 측정 방법에 의해 CRP를 측정하는 경우, 혈액을 용혈시킴과 동시에, 면역 크로마토그래피를 원리로 하는 면역 측정법에 의해 CRP 및 헤모글로빈을 동시 측정 가능하도록 원하는 농도로 희석하여 시료로 한다.
본 발명의 측정 방법에 있어서의 시료 중의 헤모글로빈 농도는, 헤모글로빈 측정의 최대 시그널값이 얻어지는 농도 이상의 농도 범위(프로존 현상 영역)일 필요가 있다. 다시 말하면, 시료 중의 헤모글로빈의 농도는, 헤모글로빈 측정의 최대 시그널값이 얻어지는 농도 이상의 농도 범위(프로존 현상 영역)에 들어가도록 설정될 필요가 있다. 구체적으로는, 시료를 희석하는 배율을 적절하게 변경함으로써, 헤모글로빈 측정의 최대 시그널값이 얻어지는 농도 이상의 범위에 포함되도록 희석한다. 그 결과, 시료 중의 헤모글로빈 농도는, 헤모글로빈 측정의 최대 시그널값이 얻어지는 농도 이상이 되고, 헤모글로빈 농도에 반비례하여 검출 강도가 감소하는 정도로부터 헤모글로빈 농도가 구해지게 된다. 이러한 헤모글로빈 측정의 최대 시그널값이 얻어지는 농도는, 미리 예비 시험에 의해 구할 수 있다. 또는 시료의 종류(환자의 특성 등)로부터 예측되는 헤모글로빈 농도와 과거의 예비 시험 결과에 의해 미리 예측할 수도 있다. 구체적으로는, 혈액을 50배 내지 200배로 희석하고 용혈한 시료를 이용하여, 동일 시료 내의 CRP와 헤모글로빈을 면역 크로마토그래피에 의해 동시 측정하는 것이 가능하게 되었다. 바람직하게는 희석률을 100배로 하면, CRP의 측정 범위가 0.2 내지 20mg/mL가 되어 바람직하다.
본 발명의 측정 방법에 의해 CRP를 측정하는 경우, 상기 혈액을 희석하고 용혈한 시료를 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립의 샘플 패드에 적하하고, 헤모글로빈에 대한 항체인 항헤모글로빈 항체(헤모글로빈에 대한 제2 항체)가 불용성 멤브레인 담체에 고정화된 측정 부위(이하, 「헤모글로빈 측정 라인」이라고도 함)에서 헤모글로빈 농도를 측정하고, 그 측정값로부터 시료에 이용한 혈액의 헤마토크리트값을 구하는 공정을 포함한다. 구체적으로는, 헤모글로빈에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트, 헤모글로빈에 대한 제2 항체(여기서, 헤모글로빈에 대한 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이하지만, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일하거나, 또는 제1 항체와 제2 항체가 동일한 경우를 포함함)가 고정화된 불용성 멤브레인 담체를 이용하여 헤모글로빈 농도를 측정한다. 헤모글로빈 농도의 측정은, 헤모글로빈에 대한 제2 항체가 고정화된 불용성 멤브레인 담체 상의 헤모글로빈 측정 라인에 있어서의 시그널 변화량을 그대로 측정값로서 구하는 것일 수도 있고, 그 시그널 변화량으로부터 산출되는 헤모글로빈 농도일 수도 있다. 여기서, 본 발명의 측정 방법에 따르면, 시료 중의 헤모글로빈의 농도는 헤모글로빈 측정의 최대 시그널값이 얻어지는 농도 이상의 농도 범위(프로존 현상 영역)에서 측정되는 것이기 때문에, 헤모글로빈 농도에 반비례하여 흡광도 또는 반사광 강도가 감소하는 정도로부터 구해지게 된다.
또한, 측정된 헤모글로빈의 시그널 변화량 또는 농도값으로부터 헤마토크리트값을 구하는 방법은, 이들과 원심법 등의 공정법(公定法)에 의한 헤마토크리트값의 상관 관계식으로부터 산출할 수 있다.
또한, 상기 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립은, 헤모글로빈을 단독으로 측정하기 위한 것일 수도 있지만, CRP와 헤모글로빈의 동시 측정이 가능하도록 제작된 단일의 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립이면 더욱 바람직하다. 바람직한 형태로서는, 본 발명의 상기 (9) 또는 (10)에 기재된 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립이다.
본 발명의 측정 방법에 의해 CRP를 측정하는 경우, 상기 혈액을 희석하고 용혈한 시료를 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립의 샘플 패드에 적하하고, CRP에 대한 항체인 항CRP 항체(CRP에 대한 제2 항체)가 불용성 멤브레인 담체에 고정화된 측정 부위(이하, 「CRP 측정 라인」이라고도 함)에서 CRP 농도를 측정하는 공정을 포함한다. 구체적으로는, CRP에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트, CRP에 대한 제2 항체(여기서, CRP에 대한 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이하지만, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일하거나, 또는 제1 항체와 제2 항체가 동일한 경우를 포함함)가 고정화된 불용성 멤브레인 담체를 이용하여 CRP 농도를 측정한다. CRP 농도의 측정은, CRP에 대한 제2 항체가 고정화된 불용성 멤브레인 담체 상의 CRP 측정 라인에서의 시그널 변화량을 그대로 측정값로서 구하는 것일 수도 있고, 그 시그널 변화량으로부터 산출되는 CRP 농도일 수도 있다.
면역 크로마토그래피용 테스트 스트립의 샘플 패드 상에 대한 시료의 적하는, 통상 임상 검사 영역에서 이용되도록 일정량의 시료를 적하할 수 있는 방법이면 임의의 방법일 수도 있으며, 예를 들면 정량 피펫이나 일정량의 액적을 적하할 수 있는 스포이드일 수도 있다. 또한, 수동으로 적하할 수도 있고, 자동 조작할 수 있는 장치를 이용할 수도 있다.
표지체에서 유래하는 시그널을 측정하는 방법으로서는, 공지된 방법에 따라 행할 수 있으며, 예를 들면 표지체가 금 콜로이드인 경우에는 흡광도 또는 반사광 강도를 측정할 수 있다. 이 흡광도 또는 반사광 강도의 변화량을 기지 농도의 시료의 검량선에 외삽하여 CRP와 헤모글로빈의 농도를 동시에 산출할 수 있다.
본 발명의 측정 방법에 의해 CRP를 측정하는 경우, CRP 측정 라인에서 측정된 CRP 농도를, 테스트 스트립의 헤모글로빈 측정 라인에서 측정된 헤모글로빈의 값으로부터 산출된 헤마토크리트값으로 보정하는 공정을 포함한다. 헤마토크리트 보정에 의해 CRP를 산출하는 방법은, 통상 별도의 방법으로 구해진 헤마토크리트값으로 보정하는 경우와 마찬가지이며, 하기와 같이 산출된다.
Figure pct00001
이 헤모글로빈 농도에 반비례하여 반사광 강도가 감소하는 정도로부터 헤모글로빈 농도를 측정하는 방법을 이용하면 50배 내지 400배로 용혈, 희석한 시료로 헤모글로빈을 측정할 수 있기 때문에, 공존하는 제2 측정 대상물을 50배 내지 400배의 희석으로 측정할 수 있으면, 동일 시료를 이용하여 헤모글로빈 및 제2 측정 대상물의 면역 크로마토그래피에 의한 측정이 가능하다.
헤마토크리트 보정을 적용할 수 있는 「제2 측정 대상물」이란, 혈액(전혈)에 포함되는 성분으로서, 헤마토크리트 보정을 하지 않으면 정확한 측정값이 얻어지지 않는 물질을 가리킨다. 예를 들면, C 반응성 단백질(CRP), IgA, IgG, IgM 등의 염증 관계 마커; D 이량체 등의 피브린 분해 산물, 가용성 피브린, TAT(트롬빈-안티트롬빈 복합체), PIC(플라스민-플라스민인 억제제 복합체) 등의 응고·선용(fibrinolysis) 마커; 산화 LDL, BNP(뇌성 나트륨이뇨펩티드) 등의 순환 관련 마커; 아디포넥틴 등의 대사 관련 마커; CEA(암 태아성 항원), AFP(α-피토프로테인), CA19-9, CA125, PSA(전립선 특이 항원) 등의 종양 마커; HBV(B형 간염 바이러스), HCV(C형 간염 바이러스) 등의 감염증 관련 마커; 알레르겐 특이 IgE(면역 글로불린 E); 호르몬; 약물 등이 예시된다.
다음에, 본 발명의 헤마토크리트 보정의 기구를 갖는 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립 및 측정 시약 키트에 대하여 상세하게 기술한다.
(항체)
본 발명에 이용되는 측정 대상물에 대한 항체는, 측정 대상물에 대하여 특이적으로 반응하는 항체일 수 있으며, 이들을 제작하는 방법에 의해 전혀 한정되는 것은 아니고, 폴리클로날 항체일 수도 모노클로날 항체일 수도 있다. 예를 들면, 측정 대상물이 인간 CRP 또는 인간 헤모글로빈인 경우에는, 항인간 CRP 항체 또는 항인간 헤모글로빈 항체는, 각각 인간 CRP 또는 인간 헤모글로빈에 대하여 특이적으로 반응하는 항체일 수 있으며, 이들을 제작하는 방법에 의해 전혀 한정되는 것은 아니고, 폴리클로날 항체일 수도 모노클로날 항체일 수도 있다. 일반적으로 해당 항체를 생산하는 하이브리도마는, 쾰러(Kohler)와 밀스타인(Milstein)의 방법(문헌 [Nature, 제256권 495페이지 (1975년)] 참조)에 준하여 인간 CRP 또는 인간 헤모글로빈으로 면역한 동물의 비장 세포와 동종의 미엘로마 세포(골수종 세포)를 세포 융합하여 제작할 수 있다.
여기서, 이용되는 항체가 모노클로날 항체인 경우, 표지체에 고정화되는 항체(제1 항체)와 불용성 멤브레인 담체에 고정화되는 항체(제2 항체)의 관계는, 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이한 것이 이용되며, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일한 항체일 수도 있고, 제1 항체와 제2 항체가 동일한 항체일 수도 있다. 100배 정도로 희석하고 용혈한 혈액을 시료로 할 때에는, CRP 농도 2 내지 20mg/L에서 측정이 가능한 항체의 조합이 바람직하다. 예를 들면, CRP에 대한 항체의 조합으로서는, 표지체에 고정화되는 제1 항체로서 수탁번호 FERM BP-11344의 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체를 이용하고, 불용성 멤브레인 담체에 고정화되는 제2 항체로서 수탁번호 FERM BP-11345의 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체를 이용하는 것이 바람직하다. 또는, 본 발명자들이 인간 CRP 등을 항원으로 하여 후술하는 시험 방법에 의해 제작한 2개의 하이브리도마로부터 얻어지는 항인간 CRP 모노클로날 항체 #08210 및 #08209의 조합을 이용하는 것이 바람직하다.
또한 헤모글로빈에 대한 항체의 조합으로서는, 예를 들면 본원 발명자 등이 인간 헤모글로빈을 마우스에 면역하여 제작한 2개의 하이브리도마로부터 얻어지는 항인간 헤모글로빈 모노클로날 항체 #69202 및 #69209의 조합 외에, 시판의 항헤모글로빈 항체 중으로부터 적절하게 적당한 조합을 선택할 수도 있다.
(샘플 패드)
본 발명에 있어서 「샘플 패드」란, 시료가 공급되는 부위이며, 패드로 성형된 상태로 액체의 시료를 흡수하고 시료 중의 액체 성분과 측정 대상물을 통과시킬 수 있는 임의의 물질 및 형태를 포함한다. 샘플 패드에 적합한 재료의 구체예로서, 유리 섬유(glass fiber), 아크릴 섬유, 친수성 폴리에틸렌재, 건조지, 종이 펄프, 직물 등이 포함되는데, 이들에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 유리 섬유제 패드가 이용된다. 상기 샘플 패드에는 후술하는 콘쥬게이트 패드의 기능을 함께 갖게 할 수도 있다. 또한, 샘플 패드에는, 항체가 고정화된 불용성 멤브레인 담체에 있어서의 비특이적 반응(흡착)을 방지·억제하는 목적으로, 통상 사용되는 블로킹 시약을 포함시킬 수 있다. 상기 블로킹 시약으로서는, 예를 들면 NEO PROTEIN SAVER 세리신, 이뮤노블록TM, 애플리에 블록(Applie Block), SEA BLOCKTM/EIA/WB, 블로킹 원(Blocking One), BSA, 블로킹 펩티드 프래그먼트(Blocking Peptide Fragment), 스타팅 블록(Starting BlockTM)(PBS) 블로킹 버퍼(Blocking Buffer), 스마트 블록(Smart BlockTM), 헤테로블록(HeteroBlock) 등으로부터 반응계에 영향이 없는 것을 적절하게 선택 가능하다.
(표지체)
표지체로서는, 통상 면역 크로마토그래피에 있어서의 항체의 고정화 담체로서 알려져 있는 공지된 재료를 이용할 수 있다. 예를 들면, 금 콜로이드 입자, 백금 콜로이드 입자, 컬러 라텍스 입자, 자성 입자 등이 바람직하고, 특히 금 콜로이드 입자가 바람직하다.
금 콜로이드 입자의 입경은 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립의 감도에 크게 영향을 미치는 것으로 알려져 있는데, 본 발명에서 이용되는 금 콜로이드 입자의 입경으로서는 20 내지 60nm가 바람직하고, 특히 30 내지 45nm가 바람직하다. 금 콜로이드 입자는 일반적으로 알려져 있는 방법, 예를 들면 가열한 테트라클로로금(Ⅲ)산 수용액에 시트르산삼나트륨 수용액을 적하 교반함으로써 제조할 수 있다.
이하, 금 콜로이드 입자를 이용한 경우에 대하여 상세하게 기술한다.
(콘쥬게이트)
본 명세서에서는, 표지체로 항CRP 항체, 항헤모글로빈 항체, 컨트롤용 항체 등의 항체가 고정화된 것을「콘쥬게이트」라고 한다.
(표지체에 대한 항체의 감작)
측정 대상물에 대한 제1 항체의 금 콜로이드 입자에 대한 고정화, 예를 들면 CRP 또는 헤모글로빈에 대한 제1 항체의 금 콜로이드 입자에 대한 고정화는, 통상 물리 흡착에 의해 행한다. 물리 흡착에 의한 고정화는 완충액을 포함하는 계에서 행해지는데, 이때 항체 농도는 1μg/mL 내지 5μg/mL로 제조되는 것이 바람직하고, 완충액 및 pH는 2mmol/L 인산 완충액(pH 6 내지 7) 또는 2mmol/L 붕산 완충액(pH 8 내지 9)이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 2mmol/L 인산 완충액(pH 7.0)이다. 또한, 금 콜로이드 입자 상의 항체가 결합하고 있지 않은 영역은, 소 혈청 알부민(BSA) 등을 결합시켜 블로킹하는 것이 바람직하다. 이와 같이 하여 제작된 제1 항체가 금 콜로이드 입자 등의 표지체에 고정화된 콘쥬게이트는, 변성을 저지하기 위한 보존 시약 중에 분산되어 보존된다. 이 변성 저지제로서는, 소 혈청 알부민(BSA) 등의 단백질, 글리세린, 당 등이 이용된다.
(검출 시약)
본 발명에 있어서 「검출 시약」이란, 적어도 콘쥬게이트를 함유하는 용액이다.
검출 시약은, 콘쥬게이트를 안정한 상태로 유지하여, 시료와 혼합되었을 때에 콘쥬게이트에 고정화된 항체가 측정 대상물인 CRP, 헤모글로빈 등과 특이적으로 반응하는 것을 촉진하거나, 또는 콘쥬게이트를 신속 또한 효과적으로 용해, 유동화하는 목적으로, 예를 들면 1종류 이상의 안정화제, 용해 보조제 등을 포함할 수 있다. 상기 안정화제, 용해 보조제 등으로서는, 예를 들면 소 혈청 알부민(BSA), 수크로오스, 카제인, 아미노산류 등을 들 수 있다.
또한, 검출 시약은, 검출 감도의 향상을 목적으로 하여 필요에 따라 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린 등의 공지된 증감제를 포함할 수 있다.
또한, 검출 시약은 Ca2+ 이온의 킬레이트제인 EDTA나 EGTA 등도 포함할 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서 「검출」 또는 「측정」이라는 용어는, 측정 대상물, 예를 들면 CRP 또는 헤모글로빈의 존재의 증명 및/또는 정량 등을 포함하여 가장 광의로 해석할 필요가 있으며, 어떠한 의미에서도 한정적으로 해석하여서는 안된다.
(콘쥬게이트 패드)
본 발명에 있어서 「콘쥬게이트 패드」란, 상기한 측정 대상물과 특이적으로 반응하는 콘쥬게이트를 함유하는 검출 시약, 예를 들면 CRP 또는 헤모글로빈과 특이적으로 반응하는 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트를 함유하는 검출 시약을 내재하고, 시료가 상기 콘쥬게이트 패드를 통과할 때, 검출 시약 중의 콘쥬게이트와 CRP나 헤모글로빈 등의 측정 대상물이 복합체를 형성하는 기능을 갖는 부위를 말한다. 상기 콘쥬게이트 패드는, 그 단독으로 후술하는 불용성 멤브레인 담체에 접하도록 배치되어 있을 수도 있고, 또는 상기 샘플 패드와 접촉하여 배치되어, 모세관류에 의해 샘플 패드를 통과한 시료를 받아 들이고, 계속해서 상기 시료를 모세관류에 의해 상기 샘플 패드와는 상이한 면에서 접촉하는 별도의 패드(이후, 「3rd Pad」라 기술함)로 이송하도록 배치할 수도 있다. 또한, 콘쥬게이트 패드의 1종 이상의 부위의 선택이나, 선택된 부위를 불용성 멤브레인 담체, 샘플 패드, 3 rd Pad 등에 어떻게 배치할지는 적절히 변경 가능하다.
상기 콘쥬게이트 패드에 적합한 재료로서, 종이, 셀룰로오스 혼합물, 니트로셀룰로오스, 폴리에스테르, 아크릴로니트릴 공중합체, 유리 섬유(glass fiber), 레이온 등을 포함하는 부직 섬유를 들 수 있는데, 이들에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 유리 섬유제 부직포로 이루어지는 패드가 이용된다.
상기 콘쥬게이트 패드에는, 검정의 신뢰성을 담보하기 위한 「컨트롤 시약」, 예를 들면 표지체로 표지된 측정 시료 성분과 반응하지 않는 항체나 표지체로 표지된 KLH(열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌; keyhole limpet hemocyanin) 등의 고항원성 단백질 등이 포함될 수 있다. 이들 컨트롤 시약은, 시료 중에 존재할 가능성이 고려되지 않는 성분(물질)이며, 적절히 선택 가능하다. 또한, 상기 콘쥬게이트 패드는, 검출 시약을 안정한 상태로 유지하여, 콘쥬게이트가 시료와 접하였을 때에 CRP나 헤모글로빈 등의 측정 대상물과 특이적으로 반응하는 것을 촉진 또는 신속 또한 효과적으로 용해, 유동화하는 목적으로, 예를 들면 1종류 이상의 안정화제, 용해 보조제 등을 포함할 수 있다. 상기 안정화제, 용해 보조제 등으로서는, 예를 들면 소 혈청 알부민(BSA), 수크로오스, 카제인, 아미노산류 등을 들 수 있다. 특히, 항CRP 항체에서는 Ca2+ 이온 존재하와 비존재하에서 반응성이 크게 상이한 경우가 있고, 반응성을 제어하는 목적으로 콘쥬게이트 패드에는 적절하게 Ca2+ 이온의 킬레이트제인 EDTA나 EGTA 등을 함유시킬 수도 있고, 반대로 Ca2+ 이온을 첨가하는 목적으로 CaCl2 등의 칼슘염류를 첨가할 수도 있다.
(3rd Pad)
본 발명에 있어서 3rd Pad는, 시료나 검출 시약 중에 존재하는 성분 중, 측정 대상물(예를 들면 CRP 또는 헤모글로빈)의 측정에 불필요한 성분을 제거하고, 측정에 필요한 성분이 불용성 멤브레인 담체를 원활하게 전개할 수 있도록 하는 것을 목적으로 하여 배치시킬 수 있다. 예를 들면, 용혈시킨 혈액 시료 중에 존재하는 혈구나 불용성 혈구 파쇄물 등은, CRP 또는 헤모글로빈의 측정에 불필요한 성분으로서 제거하는 것이 바람직하다. 또한, 이 3rd Pad에는, 항원 항체 반응에 의해 생성하는 응집체 중, 불용성 멤브레인 담체로 이동하고 원활하게 전개할 수 없을 정도로 커진 응집체를 미리 제거한다는 부가적인 효과를 함께 갖게 하는 것도 가능하다. 3rd Pad로서는, 시료 중의 액체 성분과 측정 대상물을 통과시킬 수 있는 임의의 물질 및 형태도 포함한다. 예를 들면, 유리 섬유(glass fiber), 아크릴 섬유, 친수성 폴리에틸렌재, 건조지, 종이 펄프, 직물 등으로 이루어지는 패드를 들 수 있는데, 이들에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 혈구 분리막이나 이와 비슷한 막이 이용된다.
(불용성 멤브레인 담체)
본 발명에 있어서 불용성 멤브레인 담체(이하, 간단히 멤브레인이라고 기재하는 경우가 있음)로서는, 종래 공지된 것을 사용할 수 있고, 임의의 재질의 것을 사용할 수 있다. 멤브레인의 재질로서는, 예를 들면 폴리에틸렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 나일론류, 유리, 셀룰로오스나 셀룰로오스 유도체 등의 다당류, 또는 세라믹 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되지는 않는다. 구체적으로는 밀리포어사, 도요로시사, 와트만사 등으로부터 판매되고 있는 유리 섬유 여과지나 셀룰로오스 여과지 등을 들 수 있다.
불용성 멤브레인 담체에는, 측정 대상물을 측정하는 부위(측정 라인)에 측정 대상물에 대한 제2 항체가 고정화된다.
또한, 불용성 멤브레인 담체의 구멍 직경, 구조 등을 적절하게 선택함으로써, 금 콜로이드 입자 등의 표지체에 제1 항체(예를 들면 항CRP 항체)가 고정화된 콘쥬게이트와, 측정 대상물(예를 들면 CRP)과의 면역 복합체가, 멤브레인 중을 흐르는 속도를 제어하는 것이 가능하다. 면역 복합체가 멤브레인 중을 흐르는 속도의 제어에 의해, 멤브레인에 고정화된 측정 대상물에 대한 제2 항체에 결합하는 표지 항체량을 조절할 수 있기 때문에, 멤브레인의 구멍 직경이나 구조는 본 발명의 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립의 다른 구성 재료와의 조합을 고려하여 최적화하는 것이 바람직하다. 특히, 측정 대상물이 헤모글로빈과 같은 시료 중에 고농도로 존재하는 제1 측정 대상물인 경우, 콘쥬게이트에 결합하지 않은 헤모글로빈과, 헤모글로빈과 콘쥬게이트의 면역 복합체와의 경합 반응을 이용하여 헤모글로빈을 측정하는데, 이 헤모글로빈 측정에 있어서의 모세관류 시간은 후술하는 실시예와 같이 30초/cm 내지 60초/cm가 바람직하다. 바람직하게는 밀리포어사의 하이플로우 플러스(HiFlow Plus) SHF180 등이 이용된다.
(항체의 불용성 멤브레인 담체에 대한 고정화)
상기 불용성 멤브레인 담체에 측정 대상물(예를 들면 CRP 또는 헤모글로빈)에 대한 제2 항체를 고정화하는 방법은, 공지된 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들면, 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립이 플로우 스루식(flow-through format)인 경우, 제2 항체를 소정의 농도의 액으로 제조하고, 그 액을 일정량, 점 또는 + 등 특정한 심볼 형상으로 불용성 멤브레인 담체에 도포한다. 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립이 래터럴 플로우식(lateral-flow format)인 경우에는, 제2 항체를 소정 농도의 액으로 제조하고, 노즐로부터 일정한 속도로 토출하면서 수평 방향으로 이동시킬 수 있는 기구를 갖는 장치 등을 이용하여, 그 액을 라인 형상으로 불용성 멤브레인 담체에 도포함으로써 행해진다. 이 때, 제2 항체의 액 중의 농도는 0.1mg/mL 내지 5mg/mL이 바람직하고, 0.5mg/mL 내지 2mg/mL가 더욱 바람직하다. 또한, 제2 항체의 불용성 멤브레인 담체의 고정화량은, 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립이 플로우 스루식인 경우에는 불용성 멤브레인 담체에 적하하는 액량을 조절함으로써 최적화할 수 있고, 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립이 래터럴 플로우식인 경우에는 상기한 장치의 노즐로부터의 액의 토출 속도를 조절함으로써 최적화할 수 있다. 특히, 래터럴 플로우식의 경우, 0.5μL/cm 내지 2μL/cm가 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서 「플로우 스루식」이라고 하는 경우에는, 시료 등이 불용성 멤브레인 담체에 대하여 수직으로 통과하도록 전개하는 방식을 가리키고, 「래터럴 플로우식」이라고 하는 경우에는, 시료 등이 불용성 멤브레인 담체에 대하여 평행 방향으로 이동하도록 전개하는 방식을 가리킨다.
또한, 측정 대상물(예를 들면 CRP 또는 헤모글로빈)에 대한 제2 항체의 불용성 멤브레인 담체에 대한 도포 위치에 대해서는, 래터럴 플로우식의 경우, 콘쥬게이트 패드로부터 측정 대상물이나 측정 대상물과 콘쥬게이트가 결합한 면역 복합체 등이 모세관 현상에 의해 전개하고, 각각의 제2 항체가 도포된 측정 부위(측정 라인)를 차례로 통과하도록 배치될 수 있다. 예를 들면, 측정 대상물이 혈액 시료 중의 CRP와 헤모글로빈인 경우, 항CRP 항체가 도포된 CRP 측정 라인이 상류에 있고, 항헤모글로빈 항체가 도포된 헤모글로빈 측정 라인은 그의 하류에 위치하도록 배치하는 것이 바람직하다. 이때, 각각의 측정 라인 사이의 거리는 표지체의 시그널 검출이 가능하도록 충분한 거리를 두는 것이 바람직하다. 플로우 스루식의 경우에도, CRP 또는 헤모글로빈에 대한 제2 항체의 도포 위치는 표지체의 시그널 검출이 가능하도록 배치될 수 있다.
상기한 불용성 멤브레인 담체에 도포하는 항체액은, 통상 소정의 완충액을 이용하여 제조할 수 있다. 그 완충액의 종류로서는, 인산 완충액, 트리스 완충액, 굿 완충액 등 통상 사용되는 완충액을 들 수 있다. 완충액의 pH는 6.0 내지 9.5의 범위가 바람직하고, 6.5 내지 8.5가 보다 바람직하고, 7.0 내지 8.0이 더욱 바람직하다. 완충액에는, NaCl 등의 염류, 수크로오스 등의 안정제나 보존제, 프로클린 등의 방부제 등이 더 포함될 수도 있다. 염류는 NaCl 등과 같이 이온 강도의 조정을 위해서 포함시키는 것 외에, 수산화나트륨 등 완충액의 pH를 조정하는 공정에서 첨가하게 되는 것도 포함된다.
불용성 멤브레인 담체에 제2 항체를 고정화한 후, 또한 통상 사용되는 블로킹제를 용액 또는 증기상으로 하여 제2 항체가 고정화된 부위 이외를 피복하여 블로킹을 행할 수도 있다. 본 명세서에서는, 상기한 바와 같이 항체가 고정화된 불용성 멤브레인 담체를 「항체 고정화 멤브레인」이라고 하는 경우가 있다.
(흡수 패드)
본 발명에 있어서 흡수 패드란, 불용성 멤브레인 담체를 이동·통과한 시료를 흡수함으로써 시료의 전개를 제어하는, 액체 흡수성을 갖는 부위이다. 래터럴 플로우식에 있어서는, 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립의 최하류에 설치하면 되고, 플로우 스루식에 있어서는 예를 들면 항체 고정화 멤브레인의 하부에 설치하면 된다. 상기 흡수 패드로서는, 예를 들면 여과지를 사용할 수 있는데, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 와트만사의 740-E 등이 이용된다.
(면역 크로마토그래피용 테스트 스트립)
본 발명에 있어서 「면역 크로마토그래피용 테스트 스트립」(이하, 「테스트 스트립」이라고도 함)이란, 적어도 항체를 고정화한 불용성 멤브레인 담체를 포함하는 것일 수 있으며, 필요에 따라 시약 성분을 더 포함하는 것이나, 다른 멤브레인 등이 적절히 배치 장착된 것일 수 있다. 다른 멤브레인로서는, 샘플 패드, 콘쥬게이트 패드, 흡수 패드 등을 들 수 있다. 상기 테스트 스트립은 통상 플라스틱제 점착 시트와 같은 고상 지지체 상에 배열시킨다. 상기 고상 지지체를 시료의 모세관류를 방해하지 않는 물질로 구성하는 것은 물론, 접착제의 성분은 시료의 모세관류를 방해하지 않는 물질로 한다. 또한, 항체 고정화 멤브레인의 기계적 강도를 높이며 검정 중의 수분의 증발(건조)을 방지하는 목적으로 폴리에스테르 필름 등을 라미네이트 가공하는 것도 가능하다. 상기 테스트 스트립은, 테스트 스트립의 크기나 시료의 첨가 방법·위치, 항체 고정화 멤브레인에 있어서의 항체의 고정화 위치, 시그널의 검출 방법 등을 고려한 적당한 용기(하우징)에 저장·탑재하여 사용할 수 있으며, 이와 같이 저장·탑재된 상태를 「디바이스」라고 한다.
(동일한 테스트 스트립)
헤모글로빈 등의 제1 측정 대상물을 측정하기 위한 테스트 스트립과, CRP 등의 제2 측정 대상물을 측정하기 위한 테스트 스트립은, 동일한 테스트 스트립일 수도, 다른 별도의 테스트 스트립일 수도 있다. 즉, 동일한 테스트 스트립의 경우, 상기 테스트 스트립은, 전술한 바와 같이 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트 및 제2 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트를 함유시킨 동일한 콘쥬게이트 패드, 및 제1 측정 대상물에 대한 제2 항체 및 제2 측정 대상물에 대한 제2 항체를 고정화시킨 동일한 불용성 멤브레인 담체로 구성되게 된다. 그러나, 다른 별도의 테스트 스트립을 이용하는 경우, 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트를 함유시킨 콘쥬게이트 패드와, 제1 측정 대상물에 대한 제2 항체를 고정화시킨 불용성 멤브레인 담체로 구성되는 제1 측정 대상물 측정용 테스트 스트립과, 제2 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트를 함유시킨 콘쥬게이트 패드와, 제2 측정 대상물에 대한 제2 항체를 고정화시킨 불용성 멤브레인 담체로 구성되는 제2 측정 대상물 측정용 테스트 스트립을 이용하여 동일 시료의 측정을 행하게 된다. 동일한 테스트 스트립을 이용하는 쪽이 소형화할 수 있고 간이한 측정이 가능하지만, 별개의 테스트 스트립을 이용하는 경우에는 다른 복수의 측정 대상물과의 조합이 수시 가능하여 개개의 테스트 스트립의 범용성·사용 빈도가 높아지는 것으로 생각된다. 또한, 테스트 스트립은 별개이더라도, 동일한 하우징에 넣어 1개의 디바이스로 하는 것은 물론 가능하다.
본 발명의 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립은 C 반응성 단백질(CRP)의 측정에 바람직하게 이용된다(이하, 「CRP 측정용 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립」이라고도 함). CRP 측정용 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립은, 적어도 항CRP 모노클로날 항체 및 항헤모글로빈 항체를 고정화한 멤브레인, 및 항CRP 모노클로날 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트 및 항헤모글로빈 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트를 포함하는 것일 수 있으며, 그 외에 측정 조건, 시료에 따라 다른 시약이나 구성을 포함하는 경우가 있다.
본 명세서에 있어서 「불용성 멤브레인 담체」를 「고상」, 항원이나 항체를 불용성 멤브레인 담체에 물리적 또는 화학적으로 담지시키는 것 또는 담지시킨 상태를 「고정」, 「고정화」, 「고상화」, 「감작」, 「흡착」이라고 표현하는 경우가 있다.
(시료)
본 발명의 측정 방법에 있어서의 측정 대상이 되는 「시료」는 혈액(전혈 또는 그 용혈액)이다.
(희석액)
본 발명에서 이용되는 희석액은, 적혈구를 단시간에 충분히 용혈시키는 작용을 갖고, 헤모글로빈이나 CRP 등의 제2 측정 대상물의 측정계에 있어서의 항원 항체 반응을 현저히 저해하거나, 또는 반대로 현저히 반응을 촉진하여 표지체가 과응집하여 모세관 현상에 의한 전개 불량을 일으키거나, 항원 농도에 따른 항원 항체 반응의 시그널 검출이 불가능하게 되지 않으면, 임의의 조성의 희석액을 이용할 수도 있다. 이와 같은 작용을 갖는 희석액이란, 예를 들면 정제수, pH 6.0-10.0의 완충액을 들 수 있다. 완충액으로서는 10mmol/L 내지 20mmol/L의 것이 바람직하고, 예를 들면 10mmol/L 내지 20mmol/L 인산 완충액, 10mmol/L 내지 20mmol/L 트리스(Tris)-HCl 완충액, 10mmol/L 내지 20mmol/L 글리신-HCl 완충액 등을 들 수 있다. 또한, 용혈 작용을 증강하고 시료 등의 멤브레인에서의 전개 속도를 제어하는 목적으로, 이들 희석액에 계면 활성제를 첨가하는 것도 가능하다. 특히, 제2 측정 대상물의 일례인 CRP를 측정하는 계에 있어서는, 표지체에 고정화되는 제1 항체로서 수탁번호 FERM BP-11344의 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체를 이용하고, 불용성 멤브레인 담체에 고정화되는 제2 항체로서 수탁번호 FERM BP-11345의 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체를 이용할 때에는, 희석액에 화학식 CH3(CH2)nOSO3Na(n=5 내지 10)로 표시되는 알킬황산나트륨을 함유시킴으로써 측정 범위를 조절할 수 있다. 바람직하게는 헥실황산나트륨이나 옥틸황산나트륨 등을 희석액에 0.05 내지 0.3% 첨가함으로써, 바람직한 농도 반응 곡선이 얻어지기 때문에 보다 바람직하다. 이 때, 바람직한 희석 배율은 50배 내지 200배이다. 그 외, 희석액에 Ca2 + 이온의 킬레이트제인 EDTA나 EGTA 등을 함유시킬 수도 있다.
<실시예>
다음에, 제1 측정 대상물로서 헤모글로빈(이하, 「Hb」라고 표기하는 경우가 있음), 제2 측정 대상물로서 CRP를 측정하는 경우의 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
[실시예 1]
1) 항CRP 항체 감작 콘쥬게이트(항CRP 모노클로날 항체가 금 콜로이드 입자에 고정화된 콘쥬게이트) 및 항헤모글로빈 항체 감작 콘쥬게이트(항헤모글로빈 모노클로날 항체가 금 콜로이드 입자에 고정화된 콘쥬게이트)의 제작
항CRP 모노클로날 항체(Clone:FERM BP-11344)와 항헤모글로빈 모노클로날 항체(Clone:#69202)를 각각 이하와 같은 완충액 조건과 항체 농도로 제조하고, 1 OD/mL의 금 콜로이드 입자(입경 40nm) 용액 20mL에 대하여 각 1mL 첨가하고, 실온에서 10분간 교반하였다. 상기 금 콜로이드 입자-각 항체 혼합액에 대하여 10% 소 혈청 알부민(BSA) 수용액을 2mL 첨가하고, 다시 5분간 교반 후, 10℃에서 10,000rpm으로 45분간 원심하여 침전물(항CRP 항체 감작 콘쥬게이트, 항헤모글로빈 항체 감작 콘쥬게이트)을 얻었다. 얻어진 각 콘쥬게이트에 대하여 콘쥬게이트 딜루션 버퍼(Conjugate Dilution Buffer)(스크립스(Scripps)사 제조)를 1.2mL 첨가하여 콘쥬게이트를 현탁시켰다. 각 콘쥬게이트의 최대 흡수 파장에 있어서의 흡광도를 측정하였다.
ⅰ) FERM BP-11344(20μg/mL), 2mmol/L 인산 완충액 pH 7.0
ⅱ) #69202(80μg/mL), 2mmol/L 붕산 완충액 pH 9.0
2) 콘쥬게이트 패드의 제작
상기 1)에서 제작한 항CRP 항체 감작 콘쥬게이트를 20 OD/mL, 항헤모글로빈 항체 감작 콘쥬게이트를 10 OD/mL가 되도록, 1.33% 카제인, 4% 수크로오스 용액을 포함하는 20mmol/L 트리스 염산 완충액(pH 7.5)과 혼합하여 콘쥬게이트 용액을 제작하였다. 이것을 일정 부피의 유리 섬유제 패드(닛폰폴사, No.8964)에 상기 패드 부피의 1.2배 용량 스며들게 하였다. 드라이 오븐 내에서 70℃, 30분간 가온함으로써 건조시켜 콘쥬게이트 패드로 하였다. 또한, 필요에 따라 증감제 등의 첨가제를 첨가하는 경우에는, 상기 콘쥬게이트 용액에 필요량을 첨가한 후, 마찬가지의 조작을 행할 수 있다.
3) 항CRP 항체 및 항헤모글로빈 항체가 고정화된 불용성 멤브레인 담체(항체 고정화 멤브레인)의 제작
항CRP 모노클로날 항체(Clone:FERM BP-11345) 및 항헤모글로빈 모노클로날 항체(Clone:#69209)를 1mg/mL가 되도록, 2.5% 수크로오스를 포함하는 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.2)으로서 제조하고, 니트로셀룰로오스 멤브레인(밀리포어사 SHF180)의 짧은 변의 일단의 내측의 위치(CRP 측정 라인)에 항CRP 모노클로날 항체를, 약 5mm의 간격을 두고 외측(Hb 측정 라인)에 항헤모글로빈 모노클로날 항체를, 면역 크로마토그래피용 디스펜서 「XYZ3050」(바이오 도트(BIO DOT)사)을 이용하여 0.75μL/cm가 되도록 설정하고 라인 형상으로 도포하였다. 드라이 오븐 내에서 70℃, 45분 건조하여 항체 고정화 멤브레인으로 하였다.
4) 샘플 패드의 제작
24mmol/L NaCl, 0.5% 수크로오스 및 30mmol/L 에틸렌디아민테트라아세트산을 포함하는 20mmol/L 트리스 염산 완충액(pH 7.2)을, 일정 부피로 절단한 유리 섬유제 패드(린달(Lydall)사)에 상기 패드 부피의 1.15배 용량 스며들게 하였다. 드라이 오븐 내에서 70℃, 45분 건조하여 샘플 패드로 하였다.
5) 테스트 스트립의 제작
플라스틱제 점착 시트(a)에, 전개 상류부측에 항CRP 항체(c)의 도포부(CRP 측정 라인), 이어서 항헤모글로빈 항체(d)의 도포부(Hb 측정 라인)가 되도록 배치하고, 상기 3)에서 제작한 항체 고정화 멤브레인(b)를 부착하고, 또한 유리 섬유제 패드로 이루어지는 3rd Pad(i)를 장착하였다. 이어서, 상기 2)에서 제작한 콘쥬게이트 패드(e)를 배치 장착하고, 또한 이 콘쥬게이트 패드에 중첩되도록 상기 4)에서 제작한 샘플 패드(f)를 배치 장착하고, 반대측 단부에는 흡수 패드(g)를 배치 장착하였다. 또한, 마지막으로 항체 고정화 멤브레인 및 흡수 패드를 피복하도록 상면에 폴리에스테르 필름(h)를 배치 장착하고 라미네이트 가공하였다. 이와 같이 각 구성 요소를 중첩시킨 구조물로 절단하여 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립을 제작하였다. 상기 테스트 스트립은 검정시에 플라스틱제 전용 하우징(샘플 패드 상부에 형성된 샘플 공급창부 및 측정 라인 상부에 형성된 검출창부를 가짐, 도 1 중 도시 생략)에 저장·탑재하여 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스의 형태로 하였다. 도 1에 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립의 모식 구조도를 도시하였다.
6) 경합 반응을 이용한 경합 면역 크로마토그래피에 의한 헤모글로빈 측정(프로존 현상 영역에서의 헤모글로빈의 측정)
채혈에 동의를 얻은 건강한 보통사람 1명으로부터 EDTA-2Na 진공 채혈관을 이용하여 5mL의 혈액을 채취하였다. 이 혈액의 일부를 이용하여 마이크로헤마토크리트법으로 헤마토크리트값을 측정한 결과, 46%의 값이 얻어지고, 기준값 내의 시료인 것을 확인하였다. 상기한 5)에서 제작한 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스를 이용하고, 상기 혈액 시료를 0.1% 헥실황산나트륨, 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.2)으로 50배 내지 400배로 용혈, 희석하고, 각각 120μL를 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스의 샘플 공급창부에 적하하고, 면역 크로마토 리더 ICA-1000(하마마츠포토닉스사)을 이용하여, 5분 후에 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스의 검출창부로부터 Hb 측정 라인의 반사광 강도를 측정하였다. 그 결과, 도 2와 같이, 헤모글로빈 농도가 높아짐에 따라, 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립 상의 항헤모글로빈 항체가 고정화된 Hb 측정 라인에 포착되는 금 콜로이드 입자의 반사광 강도가 저하되는 오른쪽 아래로 내려가는 용량 반응 곡선이 얻어졌다.
7) CRP 측정의 보정 곡선의 제작
나노피아용 CRP 캘리브레이터 A(세키스이메디칼가부시키가이샤 제조)를 0.1% 헥실황산나트륨, 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.2)으로 100배로 희석하고, 그 120μL를 상기 5)에서 제작한 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스의 샘플 공급창부에 적하하고, 면역 크로마토 리더 ICA-1000(하마마츠포토닉스사)를 이용하여, 5분 후에 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스의 검출창부로부터 CRP 측정 라인의 반사광 강도를 측정하였다. 도 3에 CRP 농도 1.5 내지 420mg/L 범위의 보정 곡선을 나타냈다.
8) 마이크로헤마토크리트법에 의한 헤마토크리트값의 측정
채혈에 동의를 얻은 건강한 보통사람 22예로부터 EDTA-2Na 진공 채혈관을 이용하여 5mL씩 22예의 혈액 검체를 채취하였다. 각 혈액 검체의 일부를 헤마토크리트 모세관(드라몬트사 제조, CEN02-0019)에 채취하고, 전용 퍼티(헬릭스(HELIX)사 제조, 크리토실(CRITOSEAL), A422)로 모세관의 바닥을 봉입한 후, 모세관을 헤마토크리트 원심기(고쿠산(KOKUSAN)사 제조, H-1200F)로 실온, 12000rpm, 10분간 원심하고, 원심기 부속의 계측반을 이용하여 헤마토크리트값을 측정하였다.
9) 본 발명의 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립을 이용한 CRP 및 헤마토크리트값의 산출
상기 5)에서 제작한 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스를 이용하여 상기 22예의 혈액 검체의 CRP 농도와 헤모글로빈 농도를 측정하였다. 즉, 각 혈액 검체 2μL를 0.1% 헥실황산나트륨, 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.2)으로 100배로 희석하고, 용혈하고, 그 중 120μL를 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스의 샘플 공급창부에 적하하고, 면역 크로마토 리더 ICA-1000(하마마츠포토닉스사)을 이용하여, 5분 후에 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스의 검출창부로부터 CRP 측정 라인 및 Hb 측정 라인의 반사광 강도를 측정하였다. CRP 측정 라인의 반사광 강도를 도 3의 보정 곡선에 외삽하여 CRP 농도를 구하였다. 또한, Hb 측정 라인의 반사광 강도와 상기 8)에서 얻어진 헤마토크리트값의 관계식을 도 4에 나타냈다. 이 관계식을 이용하여 각 혈액 검체의 Hb 측정 라인의 반사광 강도로부터 헤마토크리트값을 산출하였다.
헤마토크리트값(%)(산출값)=(-0.0788)×(Hb 측정 라인의 반사광 강도)+68.585
10) 본 발명에 의한 헤마토크리트 보정
상기 9)에서 산출한 각 혈액 검체의 CRP 측정값을 상기 9)에서 산출한 헤마토크리트값에 의해 다음 식에 따라 헤마토크리트 보정하였다.
Figure pct00002
11) 본 발명의 헤마토크리트 보정의 효과의 확인
상기한 22예의 혈액 검체의 혈장 중의 CRP 농도를, 라텍스 응집 반응을 측정 원리로 하는 시판 키트(나노피아 CRP, 세키스이메디칼가부시키가이샤 제조)를 이용하여 측정하였다. 이 나노피아 CRP의 「CRP 측정값」에 대한, 상기 9)에서 산출된 CRP 농도「CRP 측정값(HCT 보정 없음)」와의 상관성을 도 5에 나타냈다. 또한, 나노피아 CRP에 의한 「CRP 측정값」에 대한, 상기 10)에서 산출된 헤마토크리트 보정 후의 CRP 농도「CRP 측정값(HCT 보정 있음, 즉 본 발명)」와의 상관성을 도 6에 나타냈다. 또한, 나노피아 CRP에 의한 「CRP 측정값」에 대한, 상기 9)에서 산출된 CRP 농도를 평균 헤마토크리트값(44%)에 의해 일률 보정한 CRP 농도「CRP 측정값(일률 보정)」와의 상관성을 도 7에 나타냈다.
헤마토크리트 보정을 하지 않은 「CRP 측정값(HCT 보정 있음)」의 경우, 시판 CRP 측정 키트로 측정된 CRP 측정값과의 상관 회귀식의 기울기는 약 0.73, R2는 약 0.965이었던(도 5) 것에 대하여, 본 발명의 헤마토크리트 보정을 한 「CRP 측정값(HCT 보정 있음)」의 경우에는, 기울기가 약 1.20, R2는 약 0.989가 되어, 라텍스 응집 반응에서 측정된 CRP 측정값과의 상관성의 향상이 인정되었다(도 6).
한편, 평균 헤마토크리트값에 의해 일률 보정을 한 「CRP 측정값(일률 보정)」의 경우에는, 상관 회귀식의 기울기가 약 0.73으로부터 1.30으로 커졌기 때문에, y절편도 약 -0.23으로부터 약 -0.41로 되어 0으로부터 괴리되었다(도 7).
이들 결과로부터, 동일 시료 중의 CRP와 헤모글로빈의 농도를 본 발명의 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립을 이용하여 동시에 측정하고, 시료 중의 헤모글로빈의 측정값과 헤마토크리트값의 상관 관계를 이용하여 CRP 측정값을 헤마토크리트 보정함으로써 보다 정확한 CRP 측정이 가능해지는 것이 나타났다.
시험예 1 항인간 CRP 모노클로날 항체의 제작 방법
상기 실시예 1에서 이용한 항인간 CRP 모노클로날 항체 이외의 조합으로서, 이하에 나타내는 방법에 의해 모노클로날 항체를 얻어 이들을 실시예 2, 3에 이용하였다.
1) 면역용 항원의 제조 방법
인간 CRP(라디오이뮤노어세이사 제조)를 완전 프로인트 항원 보강제(지브코(Gibco)사 제조)와 1:1로 혼합 후, 연결 시린지를 이용하여 에멀전을 제작하여 면역용 항원으로 하였다. 또한, 자원자로부터 채혈한 혈액의 적혈구 분획의 용혈액으로부터 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제한 정제 Hb를 마찬가지로 완전 프로인트 항원 보강제와 1:1로 혼합 후 에멀전을 제작하여 면역용 항원으로 하였다.
2) 면역 및 하이브리도마의 제작 방법
상기 면역용 항원을 수컷 BALB/c 마우스의 복강에 주입하였다(1마리당 50 내지 100μg). 이 조작(면역)을 2주일마다 2회 반복하였다. 면역 개시 5주일 후, 시험 채혈에서 높은 항체가가 확인된 마우스로부터 비장을 적출하고, 50%-PEG1450(시그마(Sigma)사 제조)을 이용하여 통상법에 의해 세포 융합을 행하였다. 미엘로마 세포는 SP2/O를 이용하였다. 얻어진 융합 세포는 비장 세포로서 2.5×106개/mL가 되도록 HAT, 15% 소 태아 혈청 및 10%의 BM-콘딤드(Condimed) H1 하이브리도마 클로닝 서플리먼트(Hybridoma Cloning Supplement)(로체(Roche)사 제조)를 포함하는 RPMI1640 배지에 현탁하고, 96웰 배양 플레이트에 0.2mL씩 분주하였다. 이것을 5% CO2 인큐베이터 중에서 37℃에서 배양하였다.
3) 모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 스크리닝
세포 융합 7 내지 10일 후에 배양 상청을 이용하여 통상법(문헌 [「도움이 되는 면역 실험법」, 1984년, 고단사 발행])에 따라 항원 고상화 ELISA를 행하고, 각 항원에 대하여 높은 반응성을 나타낸 웰을 양성 웰로서 선별하였다. 양성 웰 중의 세포는 24웰 플레이트에서 계대하였다.
4) 클로닝 및 모노클로날 항체 채취
상기한 스크리닝에서 선택한 하이브리도마를 한계 희석법으로 클로닝하여 각각의 하이브리도마를 얻었다. 이어서 각 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체를 채취하기 위해서, 2주일 전에 프리스탄 0.5mL를 복강 내에 주사해 둔 8주령의 수컷 BALB/c 마우스에게, 하이브리도마를 세포수 0.4 내지 1.3×106개의 양으로 복강 내에 투여하였다. 투여 후 1주일째부터 1일 걸러 복수를 채취하고, 원심 처리하여 상청을 얻었다. 상청을 등량의 흡착용 완충액(3mol/L NaCl, 1.5mol/L 글리신-NaOH 완충액, pH 8.5)과 혼화 후, 여과하였다. 상기 여과액을 흡착용 완충액으로 평형화한 프로테인 A 세팔로스 칼럼에 통과시키고, 여과액 중의 항체를 칼럼에 흡착시킨 후, 0.1mol/L 시트르산 완충액(pH 3.0)으로 용출시켰다. 상기 용출액을, 1mol/L 트리스-HCl 완충액(pH 9.0)으로 중화 후, PBS로 투석을 행하여 정제 항체를 채취하였다. 상기에서 얻어진 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체 중 CRP와의 반응성이 높은 2종의 항체를 #08209, #08210으로 하여 이하의 실시예에 이용하였다.
[실시예 2]
1) 항CRP 항체 감작 콘쥬게이트(항CRP 모노클로날 항체가 금 콜로이드 입자에 고정화된 콘쥬게이트) 및 항헤모글로빈 항체 감작 콘쥬게이트(항헤모글로빈 모노클로날 항체가 금 콜로이드 입자에 고정화된 콘쥬게이트)의 제작
항CRP 모노클로날 항체(Clone:#08210)와 항헤모글로빈 모노클로날 항체(Clone:#69202)를, 각각 이하와 같은 완충액 조건과 항체 농도로 제조하였다. CRP 모노클로날 항체(Clone:#08210)는 1 OD/mL의 금 콜로이드(입경 30nm) 용액 200mL에 대하여 항체 용액 10mL를 첨가하고, 항헤모글로빈 모노클로날 항체(Clone:#69202)는 1 OD/mL의 금 콜로이드(입경 40nm) 용액 200mL에 대하여 항체 용액 10mL를 첨가하고, 각각 실온에서 10분간 교반하였다. 상기 금 콜로이드 입자-항체 혼합액에 대하여 10% 소 혈청 알부민(BSA) 수용액을 20mL 첨가하고, 다시 5분간 교반 후, 10℃에서 10,000rpm으로 45분간 원심하여 침전물(항CRP 항체 감작 콘쥬게이트, 항헤모글로빈 항체 감작 콘쥬게이트)을 얻었다. 얻어진 각 콘쥬게이트에 대하여 콘쥬게이트 딜루션 버퍼(스크립스사 제조)를 12mL 첨가하여 콘쥬게이트를 현탁시켰다. 각 콘쥬게이트의 최대 흡수 파장에 있어서의 흡광도를 측정하였다.
ⅰ) #08210(20μg/mL), 2mmol/L 인산 완충액 pH 7.0
ⅱ) #69202(80μg/mL), 2mmol/L 붕산 완충액 pH 9.0
2) 콘쥬게이트 패드의 제작
상기 1)에서 제작한 항CRP 항체 감작 콘쥬게이트를 15 OD/mL, 항헤모글로빈 항체 감작 콘쥬게이트를 10 OD/mL가 되도록, 1.33% 카제인, 4% 수크로오스 용액을 포함하는 20mmol/L 트리스 염산 완충액(pH 7.5)과 혼합하여 콘쥬게이트 용액을 제작하였다. 이것을 일정 부피의 유리 섬유제 패드(닛폰폴사, No.8964)에 상기 패드 부피의 1.2배 용량 스며들게 하였다. 드라이 오븐 내에서 70℃, 30분간 가온함으로써 건조시켜 콘쥬게이트 패드로 하였다. 또한, 필요에 따라 증감제 등의 첨가제를 첨가하는 경우에는, 상기 콘쥬게이트 용액에 필요량을 첨가한 후, 동일한 조작을 행할 수 있다.
3) 항CRP 항체 및 항헤모글로빈 항체가 고정화된 불용성 멤브레인 담체(항체 고정화 멤브레인)의 제작
항CRP 항체로서 Clone FERM BP-11344를 이용하는 대신에 Clone #08210을 이용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 제작하였다.
4) 샘플 패드의 제작
실시예 1과 동일하게 제작하였다.
5) 테스트 스트립의 제작
항체 고정화 멤브레인로서 실시예 2에 있어서의 상기 3)의 항체 고정화 멤브레인을 이용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 제작하였다. 또한, 얻어진 테스트 스트립을 실시예 1과 동일하게 하여 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스의 형태로 하였다.
6) 헤마토크리트값(HCT값) 산출용 보정 곡선의 제작
총 헤모글로빈 측정용 인증 실용 표준 물질(JCCRM 622-1)을 이용하여 40.4g/L ,80.7g/L, 136.7g/L, 185.7g/L, 273.4g/L의 헤모글로빈 표준액을 제조하고, 각 농도의 표준액을 0.01% 트윈(Tween) 20, 10mmol/L 인산 완충액(pH7.2)으로 151배로 희석하였다. 각각 120μL를 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스의 샘플 공급창부에 적하하고, 면역 크로마토 리더 ICA-1000(하마마츠포토닉스사)을 이용하여, 5분 후에 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스의 검출창부로부터 Hb 측정 라인의 반사광 강도를 측정하였다. 각 표준액의 헤모글로빈 농도(g/L)를 2.9/10배한 HCT값(%)을 Y축으로, Hb 측정 라인의 반사광 강도를 X축으로 하여, HCT값 산출용 보정 곡선을 제작하였다(도 8).
7) CRP 측정의 보정 곡선의 제작
나노피아용 CRP 캘리브레이터 D(세키스이메디칼가부시키가이샤 제조)의 420mg/L 표준품을 0mg/L 표준품으로 희석하여 0, 3, 10, 30, 60, 120, 210, 420mg/L의 희석 계열을 제조하였다. 각각을 0.01% 트윈 20, 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.2)으로 151배로 희석하고, 그 중 120μL를 테스트 디바이스의 샘플 공급창부에 적하하고, 면역 크로마토 리더 ICA-1000(하마마츠포토닉스사)을 이용하여, 5분 후에 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스의 검출창부로부터 CRP 측정 라인의 반사광 강도를 측정하였다. 도 9에 CRP 농도 0 내지 420mg/L 범위의 보정 곡선을 나타낸다.
8) 본 발명의 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립을 이용한 CRP 및 HCT값의 산출
상기한 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스를 이용하여 채혈로 얻어진 200 검체의 측정을 실시하였다. 즉, 각 혈액 10μL를 0.01% 트윈 20, 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.2)으로 150배로 희석, 용혈하고, 그 중 120μL를 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스의 샘플 공급창부에 적하하고, 면역 크로마토 리더 ICA-1000(하마마츠포토닉스사)을 이용하여, 5분 후에 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스의 검출창부로부터 CRP 측정 라인 및 Hb 측정 라인의 반사광 강도를 측정하였다.
Hb 측정 라인의 반사광 강도를 도 8의 보정 곡선에 외삽하여 HCT값(%)을 구하고, CRP 측정 라인의 반사광 강도를 도 9의 보정 곡선에 외삽하여 CRP 농도를 구하였다. 또한, 다음 식에 의해 HCT 보정 후의 CRP 농도를 산출하였다.
Figure pct00003
9) 본 발명의 HCT 보정 효과의 확인
상기 200예의 혈액 검체의 혈장 중의 CRP 농도를, 라텍스 응집 반응을 측정 원리로 하는 시판 키트(나노피아 CRP, 세키스이메디칼가부시키가이샤 제조)를 이용하여 측정하였다.
나노피아 CRP의 「CRP 측정값」에 대한, 본 실시예의 상기 8)에서 산출된 HCT 보정 전의 CRP 농도「CRP 측정값(HCT 보정 없음)」와의 상관성을 도 10에 나타냈다. 또한, 나노피아 CRP에 의한 「CRP 측정값」에 대한, 본 실시예의 상기 8)에서 산출된 HCT 보정 후의 CRP 농도「CRP 측정값(HCT 보정 있음, 즉 본 발명)」와의 상관성을 도 11에 나타냈다.
헤마토크리트 보정을 하지 않은 「CRP 측정값(HTC 보정 없음)」의 경우, 시판 CRP 측정 키트와의 상관 회귀식의 기울기는 약 0.62, R2는 약 0.930이었던 것에 대하여, 본 발명의 헤마토크리트 보정을 한 「CRP 측정값(HTC 보정 있음)」의 경우에는, 기울기가 약 0.99, R2는 약 0.968이 되어 상관성의 향상이 인정되었다.
이들 결과로부터, 본 발명에 의한 동일 측정 시료 중의 CRP와 헤모글로빈의 농도를 면역 크로마토그래피용 시약을 이용하여 동시에 측정하고, 시료 중의 헤모글로빈의 측정값과 헤마토크리트값의 상관 관계를 이용하여 CRP 측정값을 헤마토크리트 보정함으로써 보다 정확한 CRP 측정이 가능해지는 것이 나타났다.
[실시예 3]
실시예 1의 1) 내지 5)에 있어서, 3)의 항체 고정화 멤브레인을 제작할 때, 항CRP 항체로서 Clone FERM BP-11345를 이용하는 것 대신에 Clone 08209를 이용하고, 멤브레인의 모세관류 시간을 19초/cm(SHF75), 30초/cm(SHF120, 45초/cm(SHF180), 60초/cm(SHF240)에 변화시킨 것 이외에는, 마찬가지로 행하여 4종류의 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스를 제작하였다.
총 헤모글로빈 측정용 인증 실용 표준 물질{JCCRM 622-1L(80.7g/L), 1mol/L(136.7g/L), 1H 185.7g/L)}을 0.01% 트윈 20, 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.2)으로 151배로 희석하고, 각각 120μL를 상기한 4종류의 면역 크로마토그래피용 테스트 디바이스의 샘플 공급창부에 적하하고, 면역 크로마토 리더 ICA-1000(하마마츠포토닉스사)을 이용하여, 5분 후에 디바이스의 검출창부로부터 Hb 측정 라인의 반사광 강도를 측정하였다. 각 표준액의 헤모글로빈 농도(g/L)를 2.9/10배한 HCT값(%)을 Y축으로, Hb 측정 라인의 반사광 강도를 X축으로 하여, HCT값 산출용 보정 곡선을 제작하였다(도 12).
멤브레인의 모세관류 시간이 작아져서 유속이 빨라짐에 따라, HCT값의 변화에 대한 반사광 강도 변화가 작아지는 것을 알았다. 모세관류 시간이 19초/cm까지 작아지면, HCT값이 변화하더라도 반사광 강도는 거의 변하지 않게 되었다. 이 결과는, 본 발명의 Hb 측정의 원리가 항Hb 항체와는 결합하고 있지 않은 유리 Hb와, 금 콜로이드 입자 상의 항Hb 항체에 결합한 Hb와의 경합 반응에 기초하는 것에 기인하고 있다고 생각된다. 아마도 유속이 빨라지면, 유리 Hb가 먼저 Hb 측정 라인에 도달하여 Hb 측정 라인 상의 항Hb 항체의 Hb 결합 부위를 다 메우는 것이라고 생각된다. 이들 결과로부터, 멤브레인의 모세관류 시간은 30초/cm 내지 60초/cm가 바람직한 것을 알 수 있었다.
(a) 플라스틱제 점착 시트
(b) 항체 고정화 멤브레인
(c) 항CRP 항체
(d) 항헤모글로빈 항체
(e) 콘쥬게이트 패드
(f) 샘플 패드
(g) 흡수 패드
(h) 폴리에스테르 필름
(i) 3rd Pad
<수탁번호>
FERM BP-11344
FERM BP-11345
[기탁 생물 재료에 대한 언급]
(1) FERM BP-11344(#08202 생산 하이브리도마)
가 해당 생물 재료를 기탁한 기탁 기관의 명칭 및 주소
독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터
일본 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츠오다이6
나 가의 기탁 기관에 생물 재료를 기탁한 날짜
2009년 11월 26일
다 가의 기탁 기관이 기탁에 대하여 붙인 수탁번호
FERM BP-11344
(2) FERM BP-11345(#08203 생산 하이브리도마)
가 해당 생물 재료를 기탁한 기탁 기관의 명칭 및 주소
독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터
일본 이바라키켕 츠쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츠오다이6
나 가의 기탁 기관에 생물 재료를 기탁한 날짜
2009년 11월 26일
다 가의 기탁 기관이 기탁에 대하여 붙인 수탁번호
FERM BP-11345
일본 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERMBP11344 20091126 일본 독립행정법인 산업기술종합 연구소 특허생물기탁센터 FERMBP11345 20091126

Claims (16)

  1. 제1 측정 대상물을 적어도 함유하는 시료를 이하의 공정 A를 갖는 면역 크로마토그래피에 의해 측정하는 측정 방법에 있어서, 시료 중의 제1 측정 대상물 농도를 제1 측정 대상물의 최대 시그널값이 얻어지는 농도 이상의 농도 범위(프로존(prozone) 현상 영역)에서 측정하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
    A. 이하의 1) 및 2)를 이용하는 경합 면역 크로마토그래피에 의해 시료 중의 제1 측정 대상물을 측정하는 공정
    1) 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트
    2) 제1 측정 대상물에 대한 제2 항체(여기서, 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이하지만, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일하거나 또는 제1 항체와 제2 항체가 동일한 경우를 포함함)가 고정화된 불용성 멤브레인 담체
  2. 제1항에 있어서, 공정 A는 이하의 3) 및 4)를 더 이용하는 것이며, 1)의 콘쥬게이트는 패드에 함유되어 콘쥬게이트 패드로 되고, 2)의 불용성 멤브레인 담체의 상류측에 배치되어 있는 측정 방법.
    3) 콘쥬게이트 패드의 상류측에 위치하고 시료가 공급되는 샘플 패드
    4) 2)의 불용성 멤브레인 담체의 하류측에 위치하는 흡수 패드
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 측정 대상물이 헤모글로빈이고, 시료는 혈액을 헤모글로빈 측정의 최대 시그널값이 얻어지는 농도 이상의 농도 범위(프로존 현상 영역)로 희석되며 용혈된 것인 측정 방법.
  4. 제1 측정 대상물인 헤모글로빈 및 제2 측정 대상물을 적어도 함유하는 시료를 이하의 공정 A 내지 D를 갖는 면역 크로마토그래피에 의해 측정하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
    A. 이하의 1) 및 2)를 이용하는 경합 면역 크로마토그래피에 의해 시료 중의 제1 측정 대상물을 측정하는 공정
    1) 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트
    2) 제1 측정 대상물에 대한 제2 항체(여기서, 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이하지만, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일하거나 또는 제1 항체와 제2 항체가 동일한 경우를 포함함)가 고정화된 불용성 멤브레인 담체
    B. 이하의 5) 및 6)을 이용하는 면역 크로마토그래피에 의해 시료 중의 제2 측정 대상물을 측정하는 공정
    5) 제2 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트
    6) 제2 측정 대상물에 대한 제2 항체(여기서, 제2 측정 대상물에 대한 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이하지만, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일하거나 또는 제1 항체와 제2 항체가 동일한 경우를 포함함)가 고정화된 불용성 멤브레인 담체
    C. 공정 A에서 얻어진 제1 측정 대상물의 측정값으로부터 시료의 헤마토크리트값을 구하는 공정
    D. 공정 B에서 얻어진 제2 측정 대상물의 측정값을 공정 C에서 얻어진 헤마토크리트값을 이용하여 보정하는 공정
  5. 제4항에 있어서, 공정 A 및 공정 B는 동일한 불용성 멤브레인 담체를 이용한 공정인 측정 방법.
  6. 제5항에 있어서, 공정 A 및 공정 B는 동일한 유로 내에서 행해지는 측정 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 측정 대상물이 C 반응성 단백질(CRP; C-reactive protein)인 측정 방법.
  8. 제1 측정 대상물 및 제2 측정 대상물을 적어도 함유하는 시료를 면역 크로마토그래피에 의해 측정하기 위한 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립으로서, 이하의 E 및 F를 포함하는 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립.
    E. 이하의 1) 및 2)를 포함하는 제1 측정 대상물 측정용 테스트 스트립
    1) 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트
    2) 제1 측정 대상물에 대한 제2 항체(여기서, 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이하지만, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일하거나 또는 제1 항체와 제2 항체가 동일한 경우를 포함함)가 고정화된 불용성 멤브레인 담체
    F. 이하의 5) 및 6)을 포함하는 제2 측정 대상물 측정용 테스트 스트립
    5) 제2 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트
    6) 제2 측정 대상물에 대한 제2 항체(여기서, 제2 측정 대상물에 대한 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이하지만, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일하거나 또는 제1 항체와 제2 항체가 동일한 경우를 포함함)가 고정화된 불용성 멤브레인 담체
  9. 제8항에 있어서, E의 1) 및 F의 5)의 콘쥬게이트는 동일한 패드에 함유되어 콘쥬게이트 패드로 되어 있으며, E의 2) 및 F의 6)의 불용성 멤브레인 담체는 동일한 불용성 멤브레인 담체인 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립.
  10. 제9항에 있어서, E 및 F는 동일한 유로 내에 배치되어 있는 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 이하의 G 및 H를 더 포함하며, E의 1) 및 F의 5)의 콘쥬게이트는 패드에 함유되어 콘쥬게이트 패드로 되고, E의 2) 및 F의 6)의 불용성 멤브레인 담체의 상류측에 배치되어 있는 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립.
    G. 콘쥬게이트 패드의 상류측에 위치하고 시료가 공급되는 샘플 패드
    H. E의 2) 및 F의 6)의 불용성 멤브레인 담체의 하류측에 위치하는 흡수 패드
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 측정 대상물이 헤모글로빈인 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립.
  13. 제12항에 있어서, 제2 측정 대상물이 C 반응성 단백질(CRP)인 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립.
  14. 제12항 또는 제13항에 기재된 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립과, 용혈하고 희석하기 위한 희석액을 포함하는 면역 크로마토그래피용 측정 시약 키트.
  15. 제1 측정 대상물 및 제2 측정 대상물을 적어도 함유하는 시료를 이하의 공정 A 및 B를 갖는 면역 크로마토그래피에 의해 측정하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
    A. 이하의 1) 및 2)를 이용하는 경합 면역 크로마토그래피에 의해 시료 중의 제1 측정 대상물을 측정하는 공정
    1) 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트
    2) 제1 측정 대상물에 대한 제2 항체(여기서, 제1 측정 대상물에 대한 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이하지만, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일하거나 또는 제1 항체와 제2 항체가 동일한 경우를 포함함)가 고정화된 불용성 멤브레인 담체
    B. 이하의 5) 및 6)을 이용하는 면역 크로마토그래피에 의해 시료 중의 제2 측정 대상물을 측정하는 공정
    5) 제2 측정 대상물에 대한 제1 항체가 표지체에 고정화된 콘쥬게이트
    6) 제2 측정 대상물에 대한 제2 항체(여기서, 제2 측정 대상물에 대한 제1 항체의 에피토프가 1가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 상이하지만, 제1 항체의 에피토프가 다가인 경우에는 제2 항체의 에피토프는 제1 항체와 동일하거나 또는 제1 항체와 제2 항체가 동일한 경우를 포함함)가 고정화된, A의 2)와 동일한 불용성 멤브레인 담체
  16. 제15항에 있어서, 제2 측정 대상물이 C 반응성 단백질(CRP)인 측정 방법.
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