KR20120123621A

KR20120123621A - 신경성장인자 길항제의 투여에 의한 골암 통증의 치료방법

Info

Publication number: KR20120123621A
Application number: KR1020127028119A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 엘. 셸톤; 패트릭 윌리암 맨티
Original assignee: 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타; 리나트 뉴로사이언스 코프.
Priority date: 2004-04-07
Filing date: 2005-04-07
Publication date: 2012-11-08
Also published as: US20090252744A1; US7425329B2; CA2562024A1; CA2562024C; ATE456580T1; JP5706853B2; EP2206728B9; EP2206728B1; ES2665758T9; NO20180735A1; DK2206728T3; RU2389509C2; AU2005243247A1; IL178226A; BRPI0508390B1; US20110243961A1; DK1732949T3; DE602005019144D1; JP2012229238A; US8226951B2

Abstract

본 발명은 신경성장인자(NGF)의 길항제를 투여함으로써 골 전이와 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증을 예방하거나 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. NGF 길항제는 hNGF와 결합할 수 있는 항-NGF(예를 들면, 항-hNGF)일 수 있다.

Description

신경성장인자 길항제의 투여에 의한 골암 통증의 치료방법{METHODS FOR TREATING BONE CANCER PAIN BY ADMINISTERING A NERVE GROWTH FACTOR ANTAGONIST}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2004년 10월 19일 출원된 가출원 제60/620,654호 및 2004년 4월 7일 출원된 가출원 제60/560,781호의 우선권을 주장하며, 이들 모두를 본원에서 그 전체로서 참고 인용한다.

정부 후원 연구 또는 개발에 관한 사항

본 발명은 미국 국립보건원(National Institute of Health) 승인 5R37-NS23970-16, 5R01-DA11986-05 및 1R01-NS048021-01A1 하의 미국 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 일정 권리를 가질 수 있다.

본 발명은 골암 통증의 예방, 개선 또는 치료를 위한 신경성장인자(NGF) 길항제의 사용에 관한 것이다.

신경성장인자(NGF)는 최초로 동정된 뉴로트로핀이고, 말초 및 중추 뉴런의 발생 및 생존에서의 그 역할은 잘 특성화되었다. NGF는 말초 교감 및 배아 감각 뉴런 및 기초 전뇌 콜린작용성 뉴런의 발생에 중요한 생존 및 유지 인자인 것으로 나타났다(Smeyne, et al., Nature 368:246-249 (1994); Crowley, et al., Cell 76:1001-1011 (1994)). NGF는 감각 뉴런 내의 뉴로펩티드의 발현을 상향조절하고(Lindsay, et al., Nature 337:362-364 (1989)), 그 활성은 종양 괴사 인자 수용체 패밀리의 다른 구성원과 구조적으로 연관된 두 가지 상이한 막-결합 수용체, TrkA 티로신 키나제 수용체 및 p75 수용체를 통하여 매개된다(Chao, et al., Science 232:518-521 (1986)).

이것의 신경계에서의 효과뿐만 아니라, NGF는 신경계 외의 과정에 더욱더 관련되었다. 예를 들면, NGF는 레트의 혈관 투과성을 개선시키고(Otten, et al., Eur J Pharmacol. 106:199-201 (1984)), T 세포 및 B 세포 면역 반응을 개선시키며(Otten, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10059-10063 (1989)), 림프구 분화 및 비만세포 증식을 유도하고 지방세포로부터 가용성 생물학적 신호의 분비를 유도하는 것(Matsuda, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6508-6512 (1988); Pearce, et al., J. Physiol. 372:379-393 (1986); Bischoff, et al., Blood 79:2662-2669 (1992); Horigome, et al., J. Biol. Chem. 268:14881-14887(1993))으로 나타났다. 외생적으로 첨가된 NGF는 이들 효과 모두를 가질 수 있는 것으로 나타났지만, 내인성 NGF가 생체 내에서 임의의 이러한 과정에서 중요하다는 것은 거의 나타나지 않았다(Torcia, et al., Cell. 85(3):345-56 (1996)). 따라서, 만약 있다면, 내인성 NGF의 생활성을 저해하는 효과가 무엇이 될 수 있는지는 분명하지 않다.

NGF는 비만세포(Leon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3739-3743 (1994)), B 림프구(Torcia, et al., Cell 85:345-356 (1996), 각질형성세포(Di Marco, et al., J. Biol. Chem. 268:22838-22846)), 평활근세포(Ueyama, et al., J Hypertens. 11:1061-1065 (1993)), 섬유아세포(Lindholm, et al., Eur. J. Neurosci. 2:795-801 (1990)), 기관지 상피세포(Kassel, et al., Clin, Exp. Allergy 31:1432-40 (2001)), 신장 혈관 사이 세포(Steiner, et al., Am. J. Physiol. 261:F792-798 (1991)) 및 골격근 근관(Schwartz, et al., J Photochem, Photobiol. B 66:195-200 (2002))을 포함한 다수의 세포 유형에서 생성된다. NGF 수용체는 신경계 외부의 다양한 세포 유형에서 발견되었다. 예를 들면, TrkA는 사람 단핵구, T 및 B 림프구 및 비만세포에서 발견되었다.

증가된 NGF 수준과 다양한 염증 상태 사이의 연관성은 일부 동물 모델뿐만 아니라 사람 환자에서도 관찰되었다. 이것은 전신홍반성루프스(Bracci-Laudiero, et al., Neuroreport 4:563-565 (1993)), 다발성 경화증(Bracci-Laudiero, et al., Neurosci. Lett. 147:9-12 (1992)), 건선(Raychaudhuri, et al., Acta Derm. l'enereol. 78:84-86(1998)), 관절염(Falcimi, et al., Ann. Rheum. Dis. 55:745-748(1996)), 간질성 방광염(Okragly, et al., J. Urology 161:438-441(1991)), 천식(Braun, et al, Eur. Jlmmunol. 28:3240-3251(1998)), 췌장염 및 전립선염을 포함한다.

일관되게, 말초 조직에서 NGF의 상승된 수준은 염증과 연관되며 많은 형태의 관절염에서 관찰되었다. 류마티스 관절염에 걸린 환자의 활액막은 높은 수준의 NGF를 발현하는 반면, 염증이 없는 활액막에서는 NGF가 검출되지 않았다고 보고되었다(Aloe, et al., Arch. Rheum. 35:351-355(1992)). 유사한 결과가 류마티스 관절염을 실험적으로 유발시킨 래트에서 나타났다(Aloe, et al., Clin. Exp. Rheumatol. 10:203-204 (1992); Halliday et al., Neurochem. Res. 23:919-22 (1998)). NGF의 상승된 수준은 비만세포 수의 증가와 함께 관절염에 걸린 트랜스제닉 마우스에서 보고되었다(Aloe, et al., Int. J. Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspects 15:139-143(1993)).

외인성 NGF를 사용한 치료는 통증 및 통증 감수성의 증가를 가져온다. 이것은 NGF의 주사가 동물 모델(Lewin et al., J. Neurosci. 13:2136-2148 (1993); Amann, et al., Pain 64,323-329 (1996); Andreev, et al., Pain 63, 109-115 (1995))과 사람(Dyck, et al., Neurology 48, 501-505 (1997); Petty, et al., Annals Neurol.36, 244-246 (1994))에서 통증 및 통증 민감성의 현저한 증가를 가져온다는 사실에 의하여 예시된다. NGF는 뉴로트로핀 BDNF를 유도시키고(Apfel, et al., Mol. Cell. Neurosci. 7(2), 134-142(1996); Michael, et al., J.Neurosci 17, 8476-8490(1997)), 이어서 척수에서의 통증 신호 프로세싱을 변화시키며(Hains, et al., Neurosci Lett. 320(3), 125-8(2002); Miletic, et al., Neurosci Lett. 319(3), 137-40(2002); Thompson, et al., Proc Natl Acad Sci USA 96(14), 7714-8(1999)), 감각 뉴런 및 척수에 있는 다른 통증-전달 뉴런의 말초 및 중추 연결에 변화를 유도하고(Lewin, et al., European Journal of Neuroscience 6, 1903-1912(1994); Thompson, et al., Pain 62,219-231(1995)), 축삭 성장에 변화를 유도하며(Lindsay, RM, J Neurosci 8(7), 2394-405(1988)), 브라디키닌 수용체 발현을 유도하고(Peterson, et al., Neuroscience 83:161-168(1998)), 이온 채널과 같은 신경 활성화 및 전도를 초래하는 유전자의 발현에 변화를 유도하며(Boettger, et al., Brain 125(Pt 2), 252-63(2002); Kerr, et al., Neuroreport 12(14), 3077-8(2001); Gould, et al., Brain Res 854(1-2), 19-29(2000), Fjell et al., J. Neurophysiol. 81:803-810 (1999)), 통증 관련 수용체 TRPV1의 효능을 강화시키고(Chuang, et al., Nature 411(6840), 957-62(2001), Shu and Mendell, Neurosci. Lett. 274:159-162 (1999)), 근육에 병리학적 변화를 야기하는 것(Foster, et al., J Pathol 197(2), 245-55(2002))을 포함하는 복합 메커니즘에 의하여 작용하는 것으로 보인다. 이들 변화의 대부분은 통증 전달 감각 뉴런에서 직접 발생하며 수반된 염증에는 의존하지 않는 것이 분명하다. 또한, NGF에 반응한다고 알려진, 통증 감각이나 민감성의 변화에 관련될 수 있는 두 가지 이상의 다른 세포 유형이 있다. 이들 중 첫 번째인 비만세포는 탈과립화로 NGF에 반응하거나(Yan, et al., Clin. Sci. (Lond) 80:565-569(1991)), 다른 연구에서는 매개자 생성을 야기하거나 증가시키고, 또는 다른 제제와 협력하여 분비한다(Pearce and Thompson, J. Physiol. 372:379-393(1986), Kawamoto et al., J. Immunol. 168:6412-6419(2002))고 보고되었다. NGF 매개 통증 반응이 적어도 다소는 비만세포에 의하여 매개된다는 것이 래트에서 분명히 나타났으며(Lewin, et al., Eur. J Neurosci. 6:1903-1912(1994), Woolf, et al., J. Neurosci. 16:2716-2723 (1996)), 이것의 잠재적 관련성은 사람에서도 여전히 나타나고 있다. 또한, 일차 교감 뉴런도 NGF에 반응하며 통증 신호전달에도 연관된다고 알려져 있다(Aley, et al., Neuroscience 71:1083-1090 (1996)). 교감신경분포의 제거는 NGF를 통한 치료에 대한 반응에서 통상 보여지는 통각과민을 조절하는 것이 분명하다(Woolf, et al., J. Neurosci 16:2716-2723(1996)).

다양한 유형의 통증을 치료하기 위한 항-NGF 항체와 같은 NGF 길항제의 사용이 개시되었다. 예를 들면, 미국 특허출원 제10/682,331호, 제10/682,638호, 제10/682,332호(공보 제2004/0131615호), 제10/783,730호(공보 제2004/0253244호), 제10/745,775호(공보 제2004/0237124호), 제10/791,162호; PCT/US03/32089호(WO 04/032870호); PCT/US03/32083호(WO 2005/000194호); PCT/US03/32113호; PCT/US2004/05162호(WO 04/073653호); PCT/US03/41252호(WO 04/058184호)를 참조하라.

골암 통증은 사람의 경우 일차적 골 종양 또는 보다 통상적으로 골 전이(예를 들면, 유방암, 전립선암 및 폐암)로부터 발생할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Luger et al., Pain 99:397-406 (2002))을 참조하라. 골암 통증의 마우스 모델은 개발되었는데, 골암 통증의 이 모델은 중간 정도 내지 고도의 골암 통증이 있는 사람에서 관찰되는 통증을 반영한다. 문헌(Luger et al., Pain 99:397-406 (2002); Clohisy et al., Clinical Orthopaedics and Related Research 415S:S279-S288 (2003); Schwei et al., J. Neruosci. 19:10886-10897 (1999); Honore et al., Nat. Med. 6:521-529 (2000))을 참조하라. Honore et al. 및 Schwei et al.의 논문은 척수에서 관찰된 변화의 신경화학적 신호 및 골암 보유 동물의 DRG는, 이 모델에서 종래의 염증 및 신경병증성 통증 상태와 유사한 이 생화학적 신호의 성분이 있는 것처럼 보인다 하더라도, 유일하며, 전형적인 염증 통증 또는 전형적인 신경병증성 통증과는 구별가능하다고 보고한다(Honore et al. Neuroscience 98:585-598 (2000); Schwei et al. J. Neruosci. 19:10886-10897 (1999); Luger et al., Pain 99:397-406 (2002)).

특허출원 및 공보를 포함한, 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체로 참고 인용한다.

발명의 개요

본 발명은 항-NGF 항체와 같은 NGF의 길항제가 골 전이와 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증을 치료하는 데 효과적이라는 발견에 기초한다. 이 치료는 본 명세서에 설명된 골 전이와 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증의 하나 이상의 양태를 다룬다.

한 양태에서, 본 발명은 신경성장인자(NGF)의 길항제를 투여함으로써 골 전이("골 전이 통증"이라고도 함)와 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증을 예방 또는 치료하는 방법을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NSAID와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제 및 NSAID와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제와 병용 투여되지 않는다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NSAID와 병용 투여되지 않는다.

다른 양태에서, 본 발명은 골 전이와 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증의 발생률의 감소, 골 전이와 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증의 개선, 골 전이와 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증의 완화; 및/또는 개인에서 골 전이와 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증의 발전 또는 진행의 지연 방법을 제공하며, 상기 방법은 NGF 길항제의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NSAID와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제 및 NSAID와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제와 병용 투여되지 않는다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NSAID와 병용 투여되지 않는다.

일부 구체예에서, 골암 통증은 골에서 유래된 암에서 비롯된다. 일부 구체예에서, 골암 통증은 골육종에서 비롯된다. 일부 구체예에서, 골암 통증은 골에 전이된 암에서 비롯된다. 일부 구체예에서, 골 전이는 골에 전이된 전립선암이다. 일부 구체예에서, 골 전이는 골에 전이된 유방암이다. 일부 구체예에서, 골 전이는 골에 전이된 폐암이다. 일부 구체예에서, 골 전이는 골에 전이된 육종이다. 일부 구체예에서, 골 전이는 골에 전이된 신장암이다. 일부 구체예에서, 치료되는 암 통증은 경증 내지 중간이다. 일부 구체예에서, 치료되는 암 통증은 중간 내지 중증이다. 일부 구체예에서, 치료되는 암 통증은 중증이다.

본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 NGF 길항제는 NGF 생물학적 활성을 직접적 또는 간접적으로 감소시킬 수 있는 임의의 제제이다. 일부 구체예에서, NGF 길항제(예를 들면, 항체)는 NGF와 결합(물리적으로 상호작용), NGF 수용체(예를 들면, TrkA 수용체 및/또는 p75)에 결합, 및/또는 다운스트림 NGF 수용체 신호전달을 감소(저해 및/또는 차단)시킨다(예를 들면, 키나제 신호전달의 억제제). 따라서, 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NGF와 결합(물리적으로 상호작용)한다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 NGF 수용체(예를 들면, TrkA 수용체 및/또는 p75)에 결합한다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 다운스트림 NGF 수용체 신호전달(예를 들면, 키나제 신호전달의 억제제)을 감소(저해 및/또는 차단)시킨다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 NGF 합성 및/또는 분비를 억제(감소)한다. 또 다른 구체예에서, NGF 길항제는 TrkA 면역부착소이다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NGF(예를 들면, hNGF)와 결합하고, 연관된 뉴로트로핀, 예를 들면 NT-3, NT4/5, 및/또는 BDNF에 유의성있게 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체, NGF에 대한 안티-센스 분자(NGF를 코딩하는 핵산에 대한 안티-센스 분자를 포함), NGF 수용체(예를 들면, TrkA 및/또는 p75)에 대한 안티-센스 분자(NGF 수용체를 코딩하는 핵산에 대한 안티-센스 분자를 포함), NGF 억제성 화합물, NGF 구조 유사체, NGF와 결합하는 TrkA 및/또는 p75 수용체의 우성-음성 돌연변이, 항-TrkA 항체, 항-p75 항체 및 키나제 억제제 중 어느 하나 이상으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 사람화된다(예를 들면, 본원에 설명된 항체 E3). 일부 구체예에서, 항-NGF 항체는 (본원에 설명된 바와 같은) 항체 E3이다. 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 항체 E3의 하나 이상의 CDR을 포함한다(예를 들면, E3의 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 일부 구체예에서는 6개 전부의 CDR). 다른 구체예에서, 항체는 사람의 것이다. 일부 구체예에서, 항체는 E3의 중쇄로부터 3개의 CDR을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 E3의 경쇄로부터 3개의 CDR을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 표 1에 나타낸 중쇄 가변영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 표 2에 나타낸 경쇄 가변영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 표 1에 나타낸 중쇄 가변영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:1) 및 표 2에 나타낸 경쇄 가변영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체는 면역학적으로 불활성인 영역, 예를 들면 보체 매개 용해를 유발하지 않거나 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하지 않는 불변영역과 같은 변형된 불변영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 불변영역은 문헌(Eur. J. Immunol. (1999)29:2613-2624; PCT 출원 PCT/GB99/01441호; 및/또는 영국 특허출원 제9809951.8호)에 기재된 바와 같이 변형된다.

일부 구체예에서, NGF 길항제는 NGF에 결합한다. 또 다른 구체예에서, NGF 길항제는 NGF(예를 들면, 사람 NGF)와 특이적으로 결합하는 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항체는 마우스 모노클론 항체인 Mab 911, MAb 912 및 MAb 938 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 항체와 동일한 NGF 에피토프 6과 필수적으로 결합한다(Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000) 참조). 일부 구체예에서, NGF 항체는 trkA 수용체와 결합한다. NGF 길항제는 hNGF와 결합, hNGF와 사람 TrkA(hTrkA)의 결합의 효과적 억제 및/또는 사람 TrkA 수용체의 활성화를 효과적으로 억제할 수 있는 항-사람 NGF(항-hNGF) 모노클론 항체일 수 있다.

NGF(예를 들면, hNGF)에 대한 항-NGF 항체의 결합 친화성은 약 0.10 nM 내지 약 1.0 nM, 약 0.10 nM 내지 약 0.80 nM, 약 0.15 nM 내지 약 0.75 nM 및 약 0.18 nM 내지 약 0.72 nM일 수 있다. 한 구체예에서, 결합 친화성은 약 2 pM 내지 22 pM이다. 일부 구체예에서, 결합 친화성은 약 10 nM이다. 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 10 nM 미만이다. 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 0.1 nM 또는 약 0.07 nM이다. 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 0.1 nM 미만, 또는 약 0.07 nM 미만이다. 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 또는 약 50 pM 중 어느 하나 내지는 약 2 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM, 또는 약 40 pM 중 어느 하나이다. 일부 구체예에서, 결합 친화성은 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 또는 약 50 pM 중 어느 하나이거나, 또는 약 50 pM 미만이다. 일부 구체예에서, 결합 친화성은 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 또는 약 50 pM 중 어느 하나 미만이다. 또 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 2 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM, 약 40 pM, 또는 약 40 pM 이상이다. 당업계에 잘 공지된 바와 같이, 결합 친화성은 K_D 또는 해리상수로 표현될 수 있으며, 결합 친화성의 증가는 K_D의 감소에 상응한다. 사람 NGF에 대한 항-NGF 마우스 모노클론 항체 911(Hongo et al., Hybridoma 19:215-227(2000))의 결합 친화성은 약 10 nM이고, 사람 NGF에 대한 사람화 항-NGF 항체 E3(본원에 설명된)의 결합 친화성은 약 0.07 nM이다. 항체 911 및 E3의 결합 친화성은 이들의 Fab 단편을 사용하여 측정하였다.

NGF 길항제는 개인이 골에 전이된 골암 또는 암으로 진단받기 전에, 동안, 및/또는 후에 투여될 수 있다. NGF 길항제의 투여는 경구, 정맥내, 피하, 동맥내, 근육내, 심장내, 척수내, 흉부내, 복강내, 심실내, 설하 및/또는 경피적 방식을 포함한 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해서 행해질 수 있다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체이며, 정맥내, 피하, 흡입, 동맥내, 근육내, 심장내, 심실내 및 복강내 수단 중 하나 이상에 의하여 투여된다. 투여는 전신성, 예를 들면 정맥내 수단에 의한 것이거나, 또는 국부적일 수 있다.

일부 구체예에서, NGF 길항제는 약 0.1 내지 10 mg/kg 체중의 용량으로 투여되고, 다른 구체예에서, NGF 길항제는 약 0.3 내지 2.0 mg/kg 체중의 용량으로 투여된다.

다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제와 조합하여 신경성장인자(NGF) 길항제의 유효량을 포함하는 골 전이와 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제과 병용 투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NSAID와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제 또는 NSAID와 병용 투여되지 않는다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NGF 분자와 특이적으로 결합하는 항체이다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 본원에 설명된 임의의 길항제이다.

다른 양태에서, 본 발명은 본원에 설명된 방법 중 어떤 것에서 사용하기 위한 키트를 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 키트는 약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 본원에 설명된 NGF 길항제 중 어떤 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 본원에 설명된 방법 중 어떤 것에서 NGF 길항제의 사용을 위한 설명서를 더 포함한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 항-NGF 모노클론 항체와 같은 NGF 길항제의 치료적 유효량의 생체내 투여가 골 전이와 연관된 골암을 포함한 골암 통증을 치료하기 위해 사용될 수 있다는 발견에 기초한다. 본 발명은 항-NGF 길항제 항체의 투여가 진행성 및 움직임 유발 골암 통증을 감소시키는 데 현저히 효과적인 마우스 골암 모델에서의 발견에 기초한다.

본 발명은 항-NGF 항체와 같은 NGF 길항제, 예를 들면 항-사람 NGF(항-hNGF) 모노클론 항체의 유효량을 투여함으로써 개체(사람 및 비-사람 모두)의 골 이식과 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증을 예방하거나 치료하는 방법을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NSAID와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제와 병용 투여되지 않는다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NSAID와 병용 투여되지 않는다.

다른 양태에서, 본 발명은 개체에 NGF 길항제의 유효량을 투여하는 것을 포함한, 골 전이와 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증의 발전의 개선, 지연 및/또는 진행의 예방 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NSAID와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제와 병용 투여되지 않는다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NSAID와 병용 투여되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 제공된 방법 중 어떤 방법에 사용하기 위한, 항-NGF 항체와 같은 NGF 길항제, 예를 들면 항-NGF 모노클론 항체를 포함한, 골 전이와 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증 치료용 조성물 및 키트를 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 항-NGF 항체는 NGF와 TrkA 및/또는 p75 수용체(들)의 결합을 효과적으로 억제하고/거나 NGF의 그것의 TrkA 및/또는 p75 수용체(들)의 활성화를 효과적으로 억제할 수 있다.

일반적 기술

달리 지적하지 않으면, 본 발명의 실시에는 본 분야의 기술에 속한 분자생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기술들을 사용한다. 그러한 기술들은 예를 들면 아래의 문헌들에 충분히 설명된다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판(Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook(J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture(R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures(A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.); Handbook of Experimental Immunology(D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction,(Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology(J.E. Coligan et al., eds.,1991); Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons, 1999); Immunobiology(C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies(P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach(D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach(P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual(E. Harlow and D. Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies(M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

정의

"항체"(복수형태로 사용되기도 한다)는 면역글로불린 분자의 가변영역에 위치한 적어도 하나의 항원인식부위를 통해 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본 명세서에 설명된 이 용어는 완전한 폴리클론 또는 모노클론 항체뿐만 아니라 이들의 단편(예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단쇄(ScFv), 이들의 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 사람화된 항체, 키메라 항체, 디아체, 선형 항체, 단쇄 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 2-특이적 항체) 및 필요한 특이성의 항원인식부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구조를 포함한다. 항체는 IgG, IgA 또는 IgM(또는 이들의 하위-부류)와 같은 임의의 부류의 항체 및 임의의 특정 부류에 속하지 않는 항체를 포함한다. 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라서 면역글로불린은 상이한 부류에 배정될 수 있다. 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 5개 주요 부류로 나눠지며, 이들 중 일부는 하위-부류(동형), 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라고 칭해진다. 면역글로불린의 상이한 부류들의 서브유닛 구조 및 3차원 입체형상은 잘 공지되어 있다.

"모노클론 항체"는 동종성 항체 집단을 말하며, 모노클론 항체는 항원의 선택적 결합에 관련된 아미노산(천연발생 및 비-천연발생)으로 구성된다. 모노클론 항체 집단은 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해서만 지정된다. 용어 "모노클론 항체"는 완전한 모노클론 항체 및 전체 길이 모노클론 항체뿐만 아니라 이들의 단편(예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단쇄(ScFv), 이들의 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 사람화된 모노클론 항체, 키메라 모노클론 항체 및 항원과 결합하는데 필요한 특이성과 능력을 갖는 항원인식부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구조를 포함한다. 항체의 공급원이나 그것이 제조된 방식(예를 들면, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 형질전환 동물 등에 의한)에 관하여 제한하는 것을 의도하지 않는다.

본원에 사용된 용어 "신경성장인자" 및 "NGF"는 신경성장인자 및 NGF 활성의 적어도 일부를 보유한 이들의 변이체를 말한다. 본원에 사용된 NGF는 사람, 개과, 고양이과, 말과 또는 소과를 포함하는 모든 포유동물 종들의 천연 서열 NGF를 포함한다.

"NGF 수용체"는 NGF에 의하여 결합되거나 또는 활성화되는 폴리펩티드를 말한다. NGF 수용체는, 한정하는 것은 아니지만, 사람, 개과, 고양이과, 말과, 영장류 또는 소과를 포함하는 임의의 포유동물 종들의 TrkA 수용체 및 p75 수용체를 포함한다.

"NGF 길항제"는 NGF 신호전달, 예를 들면 NGF와 수용체의 결합 및/또는 NGF에 대한 세포 반응의 유도에 의하여 매개되는 다운스트림 경로를 포함하는, NGF 생물학적 활성을 차단, 억제 또는 감소(현저한 것을 포함)시키는 임의의 분자를 말한다. 용어 "길항제"는 임의의 생물학적 작용의 특이적 메커니즘도 내포하지 않으며, 직접적이든 간접적이든, 또는 NGF, 그것의 수용체, 또는 다른 메커니즘을 통한 상호작용이든 아니든, NGF와의 모든 가능한 약리학적, 생리학적 및 생화학적 상호작용 및 여러 가지 상이한, 그리고 화학적으로 다른 조성물들에 의하여 달성될 수 있는 결과를 명백히 포함하고 포괄하는 것으로 간주한다. 전형적인 NGF 길항제는, 한정하는 것은 아니지만, 항-NGF 항체, NGF에 대한 안티-센스 분자(NGF를 코딩하는 핵산에 대한 안티-센스 분자를 포함), NGF 억제성 화합물, NGF 구조 유사체, NGF와 결합하는 TrkA 수용체의 우성-음성 돌연변이, TrkA 면역부착소, 항-TrkA 항체, 항-p75 항체 및 키나제 억제제를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해서, 용어 "길항제"는 이전에 확인된 용어, 표제 그리고 NGF 자체, NGF 생물학적 활성(한정하는 것은 아니지만, 골 전이와 연관된 암 통증의 임의의 양태를 매개하는 그것의 능력을 포함) 또는 생물학적 활성의 결과가 어떤 의미 있는 정도로 실질적으로 무효화, 감소 또는 중화되는 기능적 상태와 특징들을 모두 포함하는 것으로 명백히 이해될 것이다. 일부 구체예에서, NGF 길항제(예를 들면, 항체)는 NGF와 결합(물리적 상호작용)하고, NGF 수용체(예를 들면, TrkA 수용체 및/또는 p75 수용체)와 결합하며, 다운스트림 NGF 수용체 신호전달을 감소(저해 및/또는 차단)시키고/거나 NGF 합성, 생성 또는 분비를 억제(감소)한다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 NGF와 결합하며 TrkA 수용체 다이머화 및/또는 TrkA 자기인산화를 방지한다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 NGF 합성 및/또는 생성(방출)을 억제 또는 감소시킨다. NGF 길항제 유형의 예들이 본원에 제공된다.

본원에 사용된 "항-NGF 항체"는 NGF와 결합해서 NGF 생물학적 활성 및/또는 NGF 신호전달에 의하여 매개되는 다운스트림 경로를 억제할 수 있는 항체를 말한다.

"TrkA 면역부착소"는 TrkA 수용체의 단편, 예를 들면 TrkA 수용체의 세포외 도메인과 면역글로불린 서열을 포함하는 가용성 키메라 분자를 말하며 이것은 TrkA 수용체의 결합 특이성을 유지하고 있다.

NGF의 "생물학적 활성"은 일반적으로 NGF 수용체에 결합하고/거나 NGF 수용체 신호전달 경로를 활성화하는 능력을 말한다. 생물학적 활성은, 한정하는 것은 아니지만, NGF 수용체(예를 들면, p75 및/또는 TrkA)와 결합하는 능력; TrkA 수용체 다이머화 및/또는 자기인산화를 촉진하는 능력; NGF 수용체 신호전달 경로를 활성화하는 능력; 세포 분화, 증식, 생존, 성장 및 신경 형태학, 시냅스 형성, 시냅스 기능, 신경전달물질 및/또는 뉴로펩티드 분비 및 손상 후 재생의 변화를 포함하여(뉴런의 경우, 말초 및 중추 뉴런을 포함) 세포 생리학에 다른 변화를 촉진하는 능력; 및 골 전이와 연관된 암 통증을 매개하는 능력 중 임의의 하나 이상을 포함한다.

본원에 사용된 "치료"는 유리한 또는 바라는 임상적 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해서, 한정하는 것은 아니지만, 유리한 또는 바라는 임상적 결과는 중증의 완화를 포함하는 통증의 임의의 양태의 개선, 골암 통증의 임의의 양태(통증 지속기간의 단축 및/또는 통증 민감성 또는 감각의 감소)를 포함하는 골암 통증(예를 들면, 골 이식과 연관된 암 통증)과 연관된 하나 이상의 증상의 개선 중 하나 이상을 포함한다.

"유효량"은 통증의 개선 또는 감소를 포함하는 유리한 또는 바라는 임상적 결과에 영향을 미치는 데 충분한 양이다. 본 발명의 목적을 위해서, NGF 길항제의 유효량은 골 이식과 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증의 치료, 개선, 통증 강도의 감소 또는 통증의 예방을 위한 충분한 양이다. 일부 구체예에서, "유효량"은 진행 통증 및/또는 파고드는 통증(보행 통증 및 접촉-유발 통증을 포함)의 통증을 감소시킬 수 있고, 그것은 암이 골에 전이되기 전에, 동안 및/또는 후에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, "유효량"은 골 전이와 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증의 진전을 지연시키는데 충분한 양이다.

통증의 "발생 감소"는 중증(이런 상태에 일반적으로 사용되는 다른 약물 및/또는 치료법(예를 들면, 이들에 대한 노출)의 필요 및/또는 양의 감소를 포함할 수 있다), 지속기간 및/또는 빈도(예를 들면, 개체에서 골 이식과 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증까지의 시간의 지연 또는 증가를 포함)의 감소 중 어떤 것을 의미한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 개체는 치료에 대한 그들의 반응에 있어서 다양할 수 있으며, 예를 들면 "개체에서 골 이식과 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증의 발생을 감소시키는 방법"은 약물의 투여가 특정 개체에서 통증 발생의 감소를 일으킬 수 있을 것이라는 합리적인 예상에 기초하여 본원에서 설명한 NGF 길항제를 투여하는 것을 반영한다.

골암 통증(예를 들면, 골 이식과 연관된 암 통증) 또는 골암 통증의 하나 이상의 증상의 "개선"은 NGF 길항제를 투여하지 않았을 때와 비교하여 골암 통증의 하나 이상의 증상의 경감 또는 개선을 의미한다. 또한, "개선"은 증상의 지속기간의 단축이나 감소를 포함한다.

골암 통증(예를 들면, 골 이식과 연관된 암 통증) 또는 골암 통증의 하나 이상의 증상의 "완화"는 본 발명에 따르는 NGF 길항제로 치료된 개체 또는 개체의 집단에서 골암 통증의 하나 이상의 바람직하지 않은 임상적 징후의 범위의 축소를 의미한다.

본원에 사용된 골 이식과 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증의 "지연"은 골 이식과 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증 진행의 유예, 방해, 늦춰짐, 저지, 안정 및/또는 연기를 의미한다. 이런 지연은 병력 및/또는 치료될 개체에 따라서 다양한 길이의 시간일 수 있다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 충분한 또는 현저한 지연은 개체가 골 이식과 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증을 발생시키지 않는다는 점에서 사실상 예방을 포함할 수 있다. 증상의 진전을 "지연"시키는 방법은, 이 방법을 사용하지 않았을 때와 비교했을 때, 주어진 시간 프레임 내에 증상이 발생할 가능성을 감소시키고/거나 주어진 시간 프레임 내에 증상의 범위를 감소시키는 방법이다. 그러한 비교는 통상적으로 통계적으로 유의한 결과를 가져오기에 충분한 수의 피험자를 사용한 임상연구를 기초로 한다.

골 이식과 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증의 "진전" 또는 "진행"은 장애의 초기 징후 및/또는 뒤이은 진행을 의미한다. 골 이식과 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증의 진전은 당업계에 잘 공지된 표준 임상기술을 사용하여 검출가능하며 평가할 수 있다. 그러나, 진전은 또한 검출할 수 없는 진행을 말하기도 한다. 본 발명의 목적을 위해서, 진전 또는 진행은 증상의 생물학적 경과과정을 말한다. "진전"은 발생, 재발 및 개시를 포함한다. 본원에 사용된 골암 통증(예를 들면, 골 이식과 연관된 암 통증)의 "개시" 또는 "발생"은 초기 개시 및/또는 재발을 포함한다.

본원에 사용된 "병용 투여"는 동시 투여 및/또는 상이한 시간의 투여를 포함한다. 또한, 병용 투여는 공동 제형으로 투여(즉, NGF 길항제 및 제제는 동일한 조성물로 존재한다) 또는 별개의 조성물로 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 병용 투여는 제제 및 NGF 길항제가 개체에 투여되는 어떤 환경이 동시 및/또는 개별적으로 발생할 수 있는 것을 포함하는 것을 의미한다. 본원에서 더 논의되는 바와 같이, NGF 길항제 및 제제는 상이한 투여 빈도 또는 간격으로 투여될 수 있다고 이해된다. 예를 들면, 항-NGF 항체를 매주 투여할 수 있는 반면, 제제를 더 자주 투여할 수 있다. NGF 길항제 및 제제를 투여의 동일한 경로 또는 투여의 상이한 경로를 사용하여 투여할 수 있다.

용어 "아편양 진통제"는 모르핀 유사 작용을 지닌 천연 또는 합성의 모든 약물을 말한다. 합성 및 반-합성 아편양 진통제는 화합물 페난트렌; 페닐헵틸아민; 페닐피페리딘; 모르피난; 및 벤조모르판의 5가지 화학적 부류의 유도체이며, 이들 모두는 상기 용어의 범주 내에 있다. 대표적인 아편양 진통제는 코데인, 디히드록코데인, 디아세틸모르핀, 히드로코돈, 히드로모르폰, 레보르판올, 옥시모르폰, 알페타닐, 부프레노르핀, 부토르판올, 펜타닐, 수펜타닐, 메페리딘, 메타돈, 날부핀, 프로폭시펜 및 펜타조신 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.

용어 "NSAID"는 비-스테로이드성 항-염증 화합물을 말한다. NSAID는 사이클로옥시게나제를 억제하는 이들의 능력에 의하여 분류된다. 사이클로옥시게나제 1 및 사이클로옥시게나제 2는 사이클로옥시게나제의 두 가지 주요 이소형태이고, 가장 표준 NSAID는 두 동형의 억제제와 혼합된다. 가장 표준 NSAID는 하기 5가지 구조적 카테고리 중 하나에 해당한다: (1) 프로피온산 유도체, 예를 들면 이부프로펜, 나프록센, 나프록신, 디클로페낙 및 케토프로펜; (2) 아세트산 유도체, 예를 들면 톨메틴 및 슬린닥; (3) 페남산 유도체, 예를 들면 메페남산 및 메클로페남산; (4) 비페닐카르복실산 유도체, 예를 들면 디플루니살 및 플루페니살; 및 (5) 옥시캄, 예를 들면 피록심, 수독시캄 및 이속시캄.

사이클로옥시게나제를 선택적으로 억제하는 NSAID의 다른 부류는 개시되었다. Cox-2 억제제는 예를 들면 미국 특허 제5,616,601호; 제5,604,260호; 제5,593,994호; 제5,550,142호; 제5,536,752호; 제5,521,213호; 제5,475,995호; 제5,639,780호; 제5,604,253호; 제5,552,422호; 제5,510,368호; 제5,436,265호; 제5,409,944호; 및 제5,130,311호에 기재되었고, 이들 모두를 본원에서 참고 인용한다. 특정한 대표적 COX-2 억제제는 셀레콕십(SC-58635), DUP-697, 플로술리드(CGP-28238), 멜록시캄, 6-메톡시-2 나프틸아세트산(6-MNA), 로페콕십, MK-966, 나부메톤(6-MNA의 전구약물), 니메술리드, NS-398, SC-5766, SC-58215, T-614; 또는 이들의 조합을 포함한다.

"개체"는 포유동물, 더 바람직하게는 사람이다. 포유동물은, 한정하는 것은 아니지만, 사육용 동물, 경기용 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함한다.

발명의 방법

본원에 설명된 모든 방법들과 관련하여, NGF 길항제에 대한 언급은 이들 제제 중 하나 이상을 포함하는 조성물도 포함한다. 이들 조성물은 본 분야에 잘 공지된 완충액을 포함한 약학적으로 허용되는 부형제(담체)와 같은 적합한 부형제를 더 포함할 수 있다. 본 발명은 단독으로 또는 다른 종래의 치료 방법과 병용하여 사용될 수 있다.

골 이식과 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증을 예방하거나 치료하기 위한 방법

본 발명은 개체, 사람 및 비-사람 모두에서의 골 이식과 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증의 치료, 진전의 지연 및/또는 예방에 유용하다. 골암을 가진 개체의 삶의 질이 개선될 수 있다.

골로의 암 전이는 네트 골 형성 또는 네트 골 파괴와 연관될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 네트 골 형성(조골 활성)과 연관된 골암 통증의 치료, 예를 들면 골로의 전립선암 전이의 통증의 치료에 사용된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 네트 골 파괴(골용해성 활성)와 연관된 골암 통증의 치료, 예를 들면 골로의 육종 전이의 통증의 치료에 사용된다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 NGF 길항제, 예를 들면 항-NGF 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 개체에서의 골 전이와 연관된 골 통증을 포함한 골암 통증의 치료 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NSAID와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제 및/또는 NSAID와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, 통증의 완화를 위해서 투여된 아편양 진통제 및/또는 NSAID의 양은 NGF 길항제의 부재시에 투여된 양에 비해서 감소된다. 아편양 진통제 및/또는 NSAID에 기인한 부작용은 이들이 NGF 길항제와 병용 투여될 때 감소되거나 제거될 수 있다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제와 병용 투여되지 않는다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 NSAID와 병용 투여되지 않는다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제 및/또는 NSAID와 병용 투여되지 않는다.

다른 양태에서, 본 발명은 골 이식과 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증의 예방, 개선 및/또는 그것의 진전 또는 진행을 예방하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NSAID와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제 및/또는 NSAID와 병용 투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제와 병용 투여되지 않는다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 NSAID와 병용 투여되지 않는다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제 및/또는 NSAID와 병용 투여되지 않는다.

골 이식과 연관된 암 통증과 같은 골암 통증의 치료 또는 예방에 관하여 본원에 일반적으로 언급되었지만, NGF 길항제는 골암 통증의 증가된 위험이 있는 사건 또는 조건(들) 전에 투여될 수 있음이 인정된다.

NGF 길항제는 골암의 다른 요법, 예를 들면 방사선 및 화학요법과 연계하여 투여할 수 있다. 또한, NGF 길항제는 골암 통증에 사용되는 다른 진통제와 연계하여 투여할 수 있다. 이들 진통제의 예는 비스포스포네이트(예를 들면, 알렌드로네이트), 가바펜틴 및 방사선이다. 골암 통증 완화를 위하여 투여되는 이들 진통제의 양은 NGF 길항제의 부제시에 투여되는 양에 비해서 감소될 수 있다. 이들 진통제에 기인한 부작용은 이들이 NGF 길항제와 병용 투여될 때 감소되거나 제거될 수 있다.

통증의 진단 또는 평가는 당업계에 잘 구축되어 있다. 평가는 객관적 측정, 예를 들면 자극에 대한 반응, 얼굴 표정 등과 같은 행동의 관찰에 기초하여 수행할 수 있다. 또한, 평가는 주관적 측정, 예를 들면 다양한 통증 스케일을 사용한 통증의 환자 특성화에 기초할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Katz et al., Surg Clin North Am. (1999) 79(2):231-52; Caraceni et al., J Pain Symptom Manage (2002) 23(3):239-55)을 참조하라.

NGF 길항제

본 발명의 방법은 NGF 신호전달, 예를 들면, NGF와 수용체의 결합 및/또는 NGF에 대한 세포 반응의 유도에 의하여 매개되는 다운스트림 경로를 포함하는, NGF 생물학적 활성을 차단, 억제 또는 감소(현저한 것을 포함)시키는 임의의 분자를 말하는 "NGF" 길항제를 사용한다. 용어 "길항제"는 어떤 생물학적 작용의 특이적 메커니즘도 내포하지 않으며, NGF와의 모든 가능한 약리학적, 생리학적 및 생화학적 상호작용 및 여러 가지 상이한, 그리고 화학적으로 다른 조성물들에 의하여 달성될 수 있는 결과를 명백히 포함하고 포괄하는 것으로 간주한다. 한정하는 것은 아니지만, 대표적인 NGF 길항제는 항-NGF 항체, NGF에 대한 안티-센스 분자(NGF를 코딩하는 핵산에 대한 안티-센스 분자를 포함), NGF 수용체(예를 들면, TrkA 수용체 및/또는 p75 수용체)에 대한 안티-센스 분자(TrkA 및/또는 p75를 코딩하는 핵산에 대한 안티-센스 분자를 포함), NGF 억제성 화합물, NGF 구조 유사체, NGF와 결합하는 TrkA 수용체의 우성-음성 돌연변이, TrkA 면역부착소, 항-TrkA 항체, NGF와 결합하는 p75 수용체의 우성-음성 돌연변이, 항-p75 항체 및 키나제 억제제를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해서, 용어 "길항제"는 이전에 확인된 용어, 표제, 그리고 NGF 자체, NGF 생물학적 활성(한정하는 것은 아니지만, 골 이식과 연관된 암 통증의 임의의 양태를 매개하는 이것의 능력을 포함) 또는 생물학적 활성의 결과가 어떤 의미 있는 정도로 실질적으로 무효화, 감소 또는 중화되는 기능적 상태와 특징들을 모두 포함하는 것으로 명백히 이해될 것이다. 일부 구체예에서, NGF 길항제(예를 들면, 항체)는 NGF와 결합(물리적으로 상호작용)하고, NGF 수용체(예를 들면, TrkA 수용체 및/또는 p75 수용체)와 결합하고/거나 다운스트림 NGF 수용체 신호전달을 감소(저해 및/또는 차단)시킨다. 따라서, 일부 구체예에서 NGF 길항제는 NGF와 결합(물리적으로 상호작용)한다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NGF와 결합하는 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 PCT WO 2004/026329호에 기재된 펩티드 또는 변형된 펩티드(예를 들면, Fc 도메인과 융합된 펩티드와 결합하는 NGF)이다. 다른 구체예에서 NGF 길항제는 NGF 수용체(예를 들면, trkA 수용체 및/또는 p75)와 결합한다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 다운스트림 NGF 수용체 신호전달을 감소(저해 및/또는 차단)시킨다(예를 들면, 키나제 신호전달의 억제제 및 다운스트림 신호전달 연속단계의 억제제). 다른 구체예에서, NGF 길항제는 NGF 합성 및/또는 분비를 억제(감소)한다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 TrkA 면역부착소가 아닌(즉, TrkA 면역부착소 이외의 다른) NGF 길항제이다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체 이외의 다른 것이다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 TrkA 면역부착소 이외의 다른 것이며, 항-NGF 항체 이외의 다른 것이다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NGF(예를 들면, hNGF)와 결합하고, NT-3, NT4/5 및/또는 BDNF와 같은 연관된 뉴로트로핀과는 유의할 만하게 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 역면역반응과 관련되지 않는다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 사람화된다(예를 들면, 본원에서 설명한 항체 E3). 일부 구체예에서, 항-NGF 항체는 항체 E3(본원에 설명된 바와 같은)이다. 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 항체 E3의 하나 이상의 CDR을 포함한다(예를 들면, E3의 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 일부 구체예에서는 6개 CDR 전부). 다른 구체예에서, 항체는 사람의 것이다. 일부 구체예에서, 항체는 WO 2005/019266호에 기재된 사람 항-NGF 중화 항체다. 또 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 표 1에 나타낸 중쇄 가변영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:1) 및 표 2에 나타낸 경쇄 가변영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체는 면역학적으로 불활성인 영역, 예를 들면 보체 매개 용해를 유발하지 않거나 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하지 않는 불변영역과 같은 변형된 불변영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 불변영역은 Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; PCT 출원 PCT/GB99/01441호; 및/또는 영국 특허출원 제9809951.8호에 기재된 바와 같이 변형된다.

항-NGF 항체

본 발명의 일부 구체예에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체를 포함한다. 항-NGF 항체는 하기 특징들 중 하나 이상을 나타내야 한다: (a) NGF와 결합하여 NGF 생물학적 활성 및/또는 NGF 신호전달 기능에 의하여 매개되는 다운스트림 경로를 억제한다; (b) 골 이식과 연관된 암 통증을 포함한 골암 통증의 임의의 양태를 예방, 개선 또는 치료한다; (c) NGF 수용체 활성화(TrkA 수용체 다이머화 및/또는 자기인산화를 포함)를 차단 또는 감소시킨다; (d) NGF 클리어런스를 증가시킨다; (e) NGF 합성, 생성 또는 분비를 억제(감소)한다.

항-NGF 항체는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 PCT 공보 WO 01/78698호, WO 01/64247호, 미국 특허 제5,844,092호, 제5,877,016호 및 제6,153,189호; Hongo et al., Hybridoma, 19:215-227 (2000); Cell. Molec. Biol. 13:559-568(1993); GenBank 기탁번호 U39608, U39609, L17078 또는 L17077를 참조하라.

일부 구체예에서, 항-NGF 항체는 항체 "E3"로 명명된 사람화된 마우스 항-NGF 모노클론 항체이며, 이것은 돌연변이 A330P331 내지 S330S331(야생형 IgG2a 서열을 참조하여 넘버링한 아미노산; Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624 참조)를 함유하는 사람 중쇄 IgG2a 불변영역; 사람 경쇄 카파 불변영역; 및 표 1과 2에 나타낸 중쇄 및 경쇄 가변영역을 포함한다.

[표 1]

[표 2]

중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역을 코딩하는 하기 폴리뉴클레오티드가 2003년 1월 8일자로 ATCC에 기탁되었다.

벡터 Eb.911.3E는 표 2에 나타낸 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 벡터 Eb.pur.911.3E는 표 2에 나타낸 경쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, 벡터 Db.911.3E는 표 1에 나타낸 중쇄 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 또한, 이들 폴리뉴클레오티드는 불변 도메인을 코딩한다.

CDR을 결정하기 위한 적어도 2가지의 기술이 있다: (1) 교차-종 서열 변이에 기초한 접근법(즉, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, 메릴랜드주 베데스다 소재)); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법(Chothia et al. (1989) Nature 342:877; Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). 본 원에 사용된 바와 같이, CDR은 임의의 접근법 또는 두 접근법의 조합을 통하여 한정된 CDR을 말할 수 있다.

다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 항체 E3의 하나 이상의 CDR을 포함한다(예를 들면, E3로부터의 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 일부 구체예에서는 6개 CDR 전부). CDR 영역의 결정은 본 분야의 범위 내이다. CDR(들)은 Kabat, Chothia 또는 Kabat과 Chothia의 조합일 수 있다.

본 발명에서 유용한 항체는 모노클론 항체, 폴리클론 항체, 항체 단편(예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 2-특이적 항체, 헤테로콘쥬게이트 항체, 단쇄(ScFv), 이들의 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 사람화된 항체, 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합 변형 항체를 포함하는 필요한 특이성을 갖는 항원인식부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구조를 포함한다. 항체는 쥐과, 래트, 사람 또는 어떤 다른 기원일 수 있다(키메라 또는 사람화된 항체를 포함). 본 발명의 목적을 위해서, 항체는 NGF 및/또는 NGF 신호전달 기능에 의해 매개되는 다운스트림 경로를 억제하는 방식으로 NGF와 반응한다. 한 구체예에서, 항체는 사람 NGF 상의 하나 이상의 에피토프를 인식하는 사람 항체이다. 다른 구체예에서, 항체는 사람 NGF 상의 하나 이상의 에피토프를 인식하는 마우스 또는 래트 항체이다. 다른 구체예에서, 항체는 영장류, 개과, 고양이과, 말과 및 소과로 구성되는 군 중에서 선택된 NGF 상의 하나 이상의 에피토프를 인식한다. 다른 구체예에서, 항체는 면역학적으로 불활성인 영역, 예를 들면 보체 매개 용해를 유발하지 않거나 또는 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하지 않는 불변영역과 같은 변형된 불변영역을 포함한다. ADCC 활성은 미국 특허 제5,500,362호에 개시된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 다른 구체예에서, 불변영역은 문헌(Eur. J. Immunol.(1999)29:2613-2624; PCT 출원 PCT/GB99/01441호; 및/또는 영국 특허출원 제9809951.8호)에 기재된 바와 같이 변형된다.

NGF(예를 들면, hNGF)에 대한 항-NGF 항체의 결합 친화성은 약 0.10 내지 약 0.80 nM, 약 0.15 내지 약 0.75 nM 및 약 0.18 nM 내지 약 0.72 nM일 수 있다. 한 구체예에서, 결합 친화성은 약 2 pM 내지 22 pM이다. 일부 구체예에서, 결합 친화성은 약 10 nM이다. 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 10 nM 미만이다. 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 0.1 nM 또는 약 0.07 nM이다. 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 0.1 nM 미만, 또는 약 0.07 nM 미만이다. 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM 또는 약 50 pM 중 어느 하나 내지는 약 2 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM, 또는 약 40 pM 중 어느 하나이다. 일부 구체예에서, 결합 친화성은 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM 또는 약 50 pM 중 어느 하나이거나, 또는 약 50 pM 미만이다. 일부 구체예에서, 결합 친화성은 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 또는 약 50 pM 중 어느 하나 미만이다. 또 다른 구체예에서, 결합 친화성은 약 2 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM, 약 40 pM, 또는 약 40 pM 이상이다.

NGF에 대한 결합 친화성을 측정하는 한 방식은 항체의 1-작용성 Fab 단편의 결합친화성을 측정하는 것이다. 1-작용성 Fab 단편을 얻기 위해 항체(예를 들면, IgG)는 파파인을 사용하여 절단되거나 재조합 발현될 수 있다. 항체의 항-NGF Fab 단편의 친화성은 표면 플라즈몬 공명(BlAcore3000^TM 표면 플라즈몬 공명(SPR) 시스템, BIAcore, INC, 뉴저지 피스카웨이 소재)에 의해 측정될 수 있다. CM5 칩은 공급자의 지시에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이니드 염산염(EDC)과 N-히드록시숙신아미드(NHS)로 활성화될 수 있다. 사람 NGF(또는 임의의 다른 NGF)는 10 mM 아세트산 나트륨 pH 4.0으로 희석되고 0.005 mg/mL의 농도로 활성화된 칩에 주입될 수 있다. 개별 칩 채널을 가로질러 다양한 유속을 사용하여 두 가지 범위의 항원 밀도가 달성된다: 상세한 키네틱 연구를 위한 100-200 반응 단위(RU) 및 스크리닝 분석을 위한 500-600 RU. 칩은 에탄올아민으로 차단될 수 있다. 재생 연구는 피어스 용리 완충액(제품번호 21004, Pierce Biotechnology, 일리노이주 록포드 소재)과 4 M NaCl의 혼합물(2:1)이 200회 주사에 걸쳐 칩 상의 hNGF 활성을 유지하면서 결합된 Fab를 제거한다는 것을 나타낸다. HBS-EP 완충액(0.O1 M HEPES, pH 7.4, 0.15 NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)은 BIAcore 분석용 러닝 완충액으로 사용된다. 정제된 Fab 샘플의 연속 희석물(0.1-1Ox 추정된 K_D)을 100 ㎕/분으로 1분 동안 주사하고 2시간까지의 해리시간을 허락한다. Fab 단백질의 농도는 표준으로 기지 농도(아미노산 분석에 의하여 측정)의 Fab를 사용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE에 의하여 측정한다. BIA 평가 프로그램을 사용하여 데이타를 1:1 랑뮈르 결합 모델(Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110)에 적용함으로써 키네틱 결합속도(K_on)와 해리속도(K_off)를 얻는다. 평형해리상수(K_D) 값은 K_off/K_on으로서 계산된다. 이 프로토콜은 사람 NGF, 다른 척추동물(일부 구체예에서, 포유동물)의 NGF(예를 들면, 마우스 NGF, 래트 NGF, 영장류 NGF)를 포함하는 임의의 NGF에 대한 항체의 결합 친화성을 측정하는 데 사용하기에 적합할 뿐만 아니라 관련된 뉴로트로핀 NT3, NT4/5 및/또는 BDNF 같은 다른 뉴로트로핀과 함께 사용하는데도 적합하다.

일부 구체예에서, 항체는 사람 NGF와 결합하고, 다른 척추동물 종들(일부 구체예에서, 포유동물)로부터의 NGF와는 유의하게 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, 항체는 사람 NGF와 결합할 뿐만 아니라 다른 척추동물 종들(일부 구체예에서, 포유동물)로부터의 하나 이상의 NGF와 결합한다. 또 다른 구체예에서, 항체는 NGF와 결합하고, 다른 뉴로트로핀(예를 들면, 관련된 뉴로트로핀 NT3, NT4/5 및/또는 BDNF)과는 유의하게 교차반응하지 않는다. 일부 구체예에서, 항체는 NGF 뿐만 아니라 적어도 하나의 다른 뉴로트로핀과 결합한다. 일부 구체예에서, 항체는 말이나 개와 같은 포유동물 종의 NGF와 결합하지만, 다른 포유동물 종으로부터의 NGF와는 유의하게 결합하지 않는다.

에피토프(들)은 연속적이거나 또는 비연속적일 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 문헌(Hongo et al., Hybridoma, 19:215-227(2000))에 설명된 MAb 911, MAb 912 및 MAb 938로 구성된 군 중에서 선택된 항체와 동일한 hNGF 에피토프와 필수적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 항체는 MAb 911과 동일한 hNGF 에피토프와 필수적으로 결합한다(Hongo et al., 상기 참조). 예를 들면, 에피토프는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: hNGF의 가변영역 1(아미노산 23-35)안의 잔기 K32, K34 및 E35; hNGF의 가변영역 4(아미노산 81-88)안의 잔기 F79 및 T81; 가변영역 4안의 잔기 H84 및 K88; hNGF의 가변영역 5(아미노산 94-98)와 hNGF의 C-말단(아미노산 111-118) 사이의 잔기 R103; hNGF의 전-가변영역 1(아미노산 10-23)안의 잔기 E11; hNGF의 가변영역 2(아미노산 40-49)와 hNGF의 가변영역 3(아미노산 59-66) 사이의 Y52; hNGF의 C-말단 안의 잔기 L112 및 S113; hNGF의 가변영역 3안의 잔기 R59 및 R69; 또는 hNGF의 전-가변영역 1안의 잔기 V18, V20 및 G23. 뿐만 아니라, 에피토프는 가변영역 1, 가변영역 3, 가변영역 4, 가변영역 5, N-말단 영역 및/또는 hNGF의 C-말단 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항체는 hNGF의 잔기 R103의 용매 접근성을 현저히 감소시킨다. 상기 설명한 에피토프는 사람 NGF에 관한 것이지만, 당업자는 사람 NGF의 구조를 다른 종들의 NGF와 정렬하고 이들 에피토프에 대한 대응물일 가능성을 확인할 수 있다는 것이 이해된다.

한 양태에서, NGF를 억제할 수 있는 항체(예를 들면, 사람, 사람화, 마우스, 키메라)는 NGF의 전체 길이 또는 부분 서열을 발현하는 면역원을 사용하여 만들어질 수 있다. 다른 양태에서, NGF를 과발현하는 세포를 포함하는 면역원이 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 면역원의 다른 예는 전체 길이 NGF를 함유하는 NGF 단백질 또는 이 NGF 단백질의 일부이다.

항-NGF 항체는 본 분야에 공지된 어떤 방법에 의해 만들어질 수 있다. 숙주 동물의 면역화 경로 및 일정은 대체로 항체 자극 및 생성에 대한 확립된 종래의 기술에 따르고 있으며 이는 본원에서 더 설명한다. 사람 및 마우스 항체의 생성에 대한 일반적인 기술은 당업계에 공지되어 있으며 본원에서 설명한다.

사람을 포함하는 임의의 포유동물 피험자 또는 이들로부터의 항체 생성 세포는 사람을 포함하는 포유동물의 하이브리도마 세포주의 생성을 위한 토대로서 사용하기 위해 조작될 수 있음이 고려된다. 통상적으로, 숙주 동물은 본원에 설명된 것을 포함하는 양의 면역원을 사용하여 복강내, 근육내, 경구, 피하, 족저내 및/또는 피내로 접종된다.

하이브리도마는 (Kohler, B. 및 Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497)의 또는 (Buck, D. W. et al., In Vitro, 18:377-381(1982))에 의해 변형된 일반적인 체세포 혼성화 기술을 사용하여 림프구 및 불멸화된 골수종 세포로부터 제조할 수 있다. 한정하는 것은 아니지만, X63-Ag8.653 및 Salk Institute, Cell Distribution Center(미국 캘리포니아 샌프란시스코 소재)의 것들을 포함하는 입수가능한 골수종 세포를 혼성화에 사용할 수 있다. 일반적으로, 이 기술은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 푸소겐을 사용하거나 또는 당업자에게 잘 공지된 전기적 수단에 의해서 골수종 세포와 림프양 세포를 융합하는 것을 포함한다. 융합 후, 세포를 융합 배지로부터 분리하고, 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT)과 같은 선택적 성장 배지에서 성장시켜 혼성화되지 않은 모세포를 제거한다. 혈청으로 보충되든 그렇지 않든 여기 설명된 배지 중 어느 것도 모노클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하는 데 사용될 수 있다. 세포융합기술에 대한 다른 대안으로서 EBV 불멸화 B 세포를 사용하여 본 발명의 항-NGF 모노클론 항체를 생성할 수 있다. 하이브리도마는 확장되고 서브클로닝되며, 원한다면 상청액이 종래의 면역분석 과정(예를 들면, 방사성면역분석, 효소면역분석 또는 형광면역분석)에 의하여 항-면역원 활성에 대하여 분석된다.

항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 모든 유도체, NGF에 특이적인 모노클론 항체를 생성하는 모 하이브리도마의 자손 세포 또는 이들의 부분을 포함한다.

그러한 항체를 생성하는 하이브리도마는 공지의 과정에 의해 시험관내 또는 생체내에서 성장할 수 있다. 모노클론 항체는 원한다면 황산암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피 및 초미세여과와 같은 종래의 면역글로불린 정제 과정에 의하여 배양 배지 또는 체액으로부터 분리될 수 있다. 원하지 않는 활성이 만일 존재한다면, 예를 들면 고체상 부착된 면역원으로 만들어진 흡착제 위에서 제조를 수행하고 원하는 항체를 면역원 밖으로 용리시키거나 방출함에 의하여 제거할 수 있다. 2-작용성 또는 유도화제, 예를 들면 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 콘쥬게이션), N-히드록시숙신이미드(리신 잔기를 통하여), 글리타르알데히드, 무수숙신산, SOCl2 또는 R1N=C=NR(여기서 R 및 R1은 상이한 알킬기이다)를 사용한, 사람 NGF, 또는 면역화될 종들에 있는 면역원성인 단백질, 예를 들면 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 콩 트립신 억제제에 콘쥬게이트된 표적 아미노산 서열을 함유하는 단편을 갖는 숙주 동물의 면역화로 항체(예를 들면, 모노클론 항체) 집단을 얻을 수 있다.

원한다면, 관심대상의 항-NGF 항체(모노클론 또는 폴리클론)는 시퀀싱될 수 있고, 그 후 폴리뉴클레오티드 서열은 발현이나 증식용 벡터로 클로닝될 수 있다. 관심대상의 항체를 코딩하는 서열은 숙주세포의 벡터 안에 유지될 수 있고, 그 후 숙주세포는 앞으로의 사용을 위해서 증량되고 냉동될 수 있다. 대안으로서, 폴리뉴클레오티드 서열은 항체를 "사람화"하거나 친화성이나 항체의 다른 특징들을 개선하기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다. 예를 들면, 항체를 임상 시험 및 사람의 치료에 사용하는 경우, 면역반응을 피하기 위해서 불변영역을 사람 불변영역과 더 유사하게 조작할 수 있다. NGF에 대한 더 큰 친화성과 NGF를 억제하는데 있어서의 더 큰 효능을 얻기 위해서 항체 서열을 유전적으로 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 변화는 항-NGF 항체에 대해 만들어질 수 있으며 NGF에 대한 그것의 결합능력을 그대로 유지한다 것은 당업자에게 자명할 것이다.

일반적으로, "사람화된" 항체는 비-사람 종들의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래된 항원결합부위 및 사람 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한 분자의 나머지 면역글로불린 구조를 가지고 있는 분자를 말한다. 항원결합부위는 불변 도메인 상에서 융합된 완전한 가변 도메인이나, 또는 가변 도메인 내의 적합한 프레임워크 영역 상에서 그래프트된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원결합부위는 야생형이거나, 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있는데, 예를 들면 사람 면역글로불린과 더욱 근접하게 닮도록 변형될 수 있다. 사람화된 항체의 일부 형태는 모든 CDR 서열을 보유한다(예를 들면, 마우스 항체로부터의 6개의 CDR을 전부 함유하는 사람화된 마우스 항체). 사람화된 항체의 다른 형태는 원 항체에 관하여 변형된 1개 이상의 CDR(1, 2, 3, 4, 5, 6개)를 가진다. 일부 예에서, 프레임워크 영역(FR) 잔기 또는 사람 면역글로불린의 다른 잔기는 상응하는 비-사람 잔기로 대체된다. 또한, 사람화된 항체는 수용자 항체나 제공자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다.

모노클론 항체를 사람화하는 4개의 일반적 단계가 있다: (1) 출발 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 예상 아미노산 서열을 결정하는 단계, (2) 사람화된 항체의 설계, 즉 사람화 과정 동안 사용할 항체 프레임워크 영역을 결정하는 단계, (3) 실제 사람화 방법/기술 단계, (4) 사람화된 항체의 트랜스펙션 및 발현 단계. 예를 들면, 미국 특허 제4,816,567호; 제5,807,715호; 제5,866,692호; 제6,331,415호; 제5,530,101호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,585,089호; 제6,180,370호 및 제6,548,640호를 참조하라.

설치류 또는 변형된 설치류 V 영역과 사람 불변 도메인과 융합된 이들의 관련된 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 키메라 항체를 포함하여, 비-사람 면역글로불린으로부터 유래된 항원결합부위를 포함하는 많은 "사람화된" 항체 분자가 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌(Winter et al. Nature 349:293-299 (1991), Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. J lmmunol. 138:4534-4538 (1987), 및 Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583 (1987))을 참조하라. 다른 참고문헌은 적합한 사람 항체 불변 도메인과 융합하기 전에 사람의 지지 프레임워크 영역(FR)으로 그래프트된 설치류 CDR을 설명한다. 예를 들면, 문헌( Riechmann et al. Nature, 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988) 및 Jones et al. Nature 321:522-525 (1986))을 참조하라. 다른 참고문헌은 재조합으로 덧붙인 설치류 프레임워크 영역에 의하여 지지된 설치류 CDR을 설명한다. 예를 들면, 유럽특허공보 제0519596호를 참조하라. 이들 "사람화된" 분자는 사람 수용자에 있는 이들 부분의 지속기간 및 치료 적용의 효능을 제한하는 설치류 항-사람 항체 분자에 대한 원하지 않는 면역반응을 최소화하도록 설계된다. 예를 들면, 항체 불변영역은 그것이 면역학적으로 불활성이도록(예를 들면, 보체 용해를 유발하지 않도록) 조작될 수 있다. 예를 들면, PCT 공보 PCT/GB99/01441호; 영국 특허출원 제9809951.8호를 참조하라. 또한, 이용할 수 있는 항체 사람화의 다른 방법들은 문헌(Daugherty et al. Nucl. Acids Res. 19:2471-2476(1991)) 및 미국 특허 제6,180,377호; 제6,054,297호; 제5,997,867호; 제5,866,692호; 제6,210,671호; 및 제6,350,861호; 그리고 PCT 공보 WO01/27160호에 개시되어 있다. 또한, 사람화는 친화성 성숙을 포함할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허출원 제10/745,775호 및 PCT/US03/41252호를 참조하라.

또 다른 대안으로서, 특이적 사람 면역글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 입수가능한 마우스를 사용하여 완전한 사람 항체를 얻을 수 있다. 또한, 더 바람직하거나(예를 들면, 완전한 사람 항체) 또는 더 많은 설치류 면역반응을 생성하도록 설계된 형질전환 동물을 사람화 또는 사람 항체의 발생을 위하여 사용할 수 있다. 그러한 기술의 예들은 Abgenix, Inc.(캘리포니아주 프레몬트 소재)사의 Xenomouse^TM 및 Medarex, Inc.(뉴저지주 프린스톤 소재)사의 HuMAb-Mouse

및 TC Mouse^TM이다.

대안으로서, 항체는 본 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 재조합으로 제조하여 발현시킬 수 있다. 다른 대안으로서, 항체는 파지 디스플레이 기술에 의하여 재조합으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,565,332호; 제5,580,717호; 제5,733,743호; 및 제6,265,150호; 및 문헌(Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994))을 참조하라. 대안적으로, 파지 디스플레이 기술(McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990))을 사용하여 비면역화된 제공자의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관 내에서 사람 항체 및 항체 단편들을 생성할 수 있다. 이 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자가 M13 또는 fd와 같은 사상형 박테리오파지의 메이저 또는 마이너 코트 단백질 유전자로 인-프레임 클로닝되고, 파지 입자의 표면상에 기능적 항체 단편으로 디스플레이된다. 사상형 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 사본을 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 또한 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선택을 가져온다. 따라서, 파지는 B 세포 특성 중의 일부를 의태한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있는데, 예를 들면, 문헌(Johnson Kevin S. and Chiswell, David J. Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993))을 참조하라. V-유전자 조각의 일부 공급원은 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌(Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991))은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 적은 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체들의 다양한 어레이를 분리하였다. 비면역화된 사람 제공자의 V 유전자 레퍼토리가 구성될 수 있으며, 항원(자기-항원을 포함)의 다양한 어레이에 대한 항체는 문헌(Mark et al., J Mol. Biol. 222:581-597 (1991) 또는 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993))에 설명된 기술에 따라서 본질적으로 분리될 수 있다. 자연적 면역반응에서, 항체 유전자는 높은 비율로 돌연변이를 축적한다(체세포 과돌연변이). 도입된 변화의 일부는 더 높은 친화성을 부여하고, 고친화성 표면 면역글로불린을 디스플레이하는 B 세포가 우선적으로 복제되어 후속 항원 도전 동안 분화된다. 이런 자연적 과정은 "사슬 셔플링"으로 알려진 기술을 사용하여 모방할 수 있다(Marks, et al., Biol Techrzol. 10:779-783 (1992)). 이 방법에서, 파지 디스플레이에 의해 얻어진 "일차" 사람 항체의 친화성은 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 비면역화된 제공자로부터 얻어진 V 도메인 유전자의 천연 발생 변이체(레퍼토리들)의 레퍼토리로 연속적으로 대체함으로서 개선될 수 있다. 이 기술은 pM 내지 nM 범위의 친화성을 갖는 항체 및 항체 단편의 생성을 허용한다. 매우 많은 파지 항체 레퍼토리("모든 라이브러리의 어머니"라고도 함)를 제조하기 위한 전략은 문헌(Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993))에 의하여 설명되었다. 또한, 유전자 셔플링을 사용하여 설치류 항체로부터 사람 항체를 유도할 수 있으며, 여기서 사람 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화성 및 특이성을 가진다. "에피토프 임프린팅"이라고도 하는 이 방법에 따르면, 파지 디스플레이 기술에 의해 얻어진 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자는 사람 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되며, 이로써 설치류-사람 키메라가 만들어진다. 항원에 대한 선택은 기능적 항원결합부위를 복원할 수 있는 사람 가변영역의 분리를 가져오는데, 즉 에피토프가 파트너의 선택을 좌우한다(임프린트). 남아 있는 설치류 V 도메인을 대체하기 위해서 이 과정이 반복될 때 사람 항체가 얻어진다(PCT 공보 WO 93/06213호, 1993년 4월 1일 공개 참조). 종래의 CDR 그래프팅에 의한 설치류 항체의 사람화와 달리, 이 기술은 설치류 기원의 프레임워크나 CDR 잔기를 갖지 않는 완벽한 사람 항체를 제공한다.

상기 논의는 사람화된 항체에 속하지만, 논의된 일반적인 원리는, 예를 들면 개, 고양이, 영장류, 말 및 소에서 사용하는 주문제작 항체에 적용할 수 있음이 자명하다. 더 나아가, 본원에 설명된 항체를 사람화하는 하나 이상의 양태는, 예를 들면 CDR 그래프팅, 프레임워크 돌연변이 및 CDR 돌연변이와 조합될 수 있음이 자명하다.

항체는 먼저 숙주 동물로부터 항체 및 항체 생성 세포를 분리한 다음 유전자 서열을 얻고 이 유전자 서열을 사용하여 숙주 세포(예를 들면, CHO 세포)에서 재조합으로 항체를 발현시킴으로서 재조합으로 제조할 수 있다. 사용할 수 있는 다른 방법은 식물(예를 들면, 담배) 또는 트랜스제닉 밀크에서 항체 서열을 발현시키는 것이다. 식물이나 밀크에서 재조합으로 항체를 발현시키는 방법은 개시되어 있다. 예를 들면, 문헌(Peeters, et al., Vaccine 19:2756 (2001); Lonberg, N. 및 D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65 (1995); 및 Pollock, et al., Immunol Methods 231:147 (1999))을 참조하라. 항체의 유도체, 예를 들면 사람화된 항체, 단쇄 항체 등을 제조하는 방법이 당업계에 공지되어 있다.

또한, 면역분석 및 형광 활성화 세포 분리(FACS)와 같은 유세포분석 분리 기술을 사용하여 NGF에 특이적인 항체를 분리할 수 있다.

항체는 많은 상이한 캐리어에 결합될 수 있다. 캐리어는 활성 및/또는 불활성일 수 있다. 잘 공지된 캐리어의 예는 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 유리, 천연 및 변형 셀룰로스, 폴리아클릴아미드, 아가로스 및 마그네타이트를 포함한다. 캐리어의 성질은 본 발명의 목적에 맞게 가용성이거나 불용성일 수 있다. 당업자는 항체를 결합시키기 위한 다른 적합한 캐리어를 알고 있거나, 또는 일상적 실험을 사용하여 그러한 것을 확인할 수 있을 것이다.

모노클론 항체를 코딩하는 DNA는 종래의 과정(예를 들면, 모노클론 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써)을 사용하여 용이하게 분리되고 서열화된다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 사용된다. 일단 분리되면, DNA는 발현 벡터(예를 들면, PCT 공보 WO 87/04462호에 개시된 발현 벡터) 내에 넣어진 다음 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 대장균(E. coli) 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 트랜스펙션되어 재조합 숙주 세포에서 모노클론 항체의 합성이 얻어진다. 예를 들면, PCT 공보 WO 87/04462호를 참조하라. 또한, DNA는, 예를 들면 상동성 쥐과 서열 대신에 사람 중쇄 및 경쇄 불변 도메인의 코딩 서열로 치환함으로써(Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984)), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합시킴으로써 변형될 수 있다. 이 방식으로, 본원의 항-NGF 모노클론 항체의 결합특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.

항-NGF 항체는 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 특성화될 수 있다. 예를 들면, 한 방법은 그것이 결합하는 에피토프를 확인하는 것, 또는 "에피토프 맵핑"이다. 단백질 상의 에피토프의 위치를 맵핑하거나 특성화하기 위한 본 분야에 공지된 많은 방법이 있으며, 이들은 항체-항원 복합체 결정 구조의 용해, 경쟁 분석, 유전자 단편 발현 분석 및 합성 펩티드-기초 분석을 포함하며, 이들은 예를 들면, Harlow 및 Lane의 Using Antibodies, a Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 뉴욕주 콜드 스프링 하버, 1999년)의 11장에 설명된다. 추가적 예로서, 에피토프 맵핑을 사용하여 항-NGF 항체가 결합하는 서열을 결정할 수도 있다. 에피토프 맵핑은 다양한 공급원, 예를 들면 Pepscan Systems(네덜란드 피에이치 렐리스타드 8219 에델헤르트베그 15 소재)로부터 상업적으로 입수가능하다. 에피토프는 선형 에피토프, 즉 아미노산의 단일 스트레치에 함유된 에피토프이거나, 또는 반드시 단일 스트레치(일차 구조 선형 서열)에 함유되지 않을 수도 있는 아미노산의 3차원 상호작용에 의하여 형성된 입체구조적 에피토프일 수 있다. 다양한 길이(예를 들면, 적어도 4-6개 아미노산 길이)의 펩티드는 분리되거나 합성(예를 들면, 재조합에 의해서)될 수 있으며, 항-NGF 항체와의 결합 분석에 사용될 수 있다. 다른 예에서, 항-NGF 항체가 결합하는 에피토프는 NGF 서열로부터 유래된 중복 펩티드를 사용하여 체계적으로 스크리닝하고 항-NGF 항체에 의한 결합을 측정하는데서 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 분석에 따르면, NGF를 코딩하는 오픈리딩프레임은 무작위적으로 또는 특이적 유전자 구성물에 의하여 단편화되고, 시험하고자 하는 항체를 갖는 NGF의 발현된 단편의 반응성이 결정된다. 유전자 단편은, 예를 들면 PCR에 의하여 제조된 다음, 방사능 아미노산의 존재하에 시험관내에서 전사 및 단백질로 번역될 수 있다. 그 후, 항체와 방사능 표지된 NGF 단편의 결합은 면역침전 및 겔 전기영동에 의하여 측정된다. 또한, 어떤 에피토프는 파지 입자(파지 라이브러리)의 표면상에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 큰 라이브러리를 사용하여 확인될 수 있다. 대안적으로, 중복 펩티드 단편의 한정된 라이브러리는 간단한 결합 분석으로 시험 항체와의 결합에 대해 시험될 수 있다. 추가적 예로서, 항원 결합 도메인의 돌연변이생성, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이생성은 에피토프 결합에 필요한, 충분한 및/또는 필수적인 잔기를 확인하기 위해서 수행될 수 있다. 예를 들면, 도메인 스와핑 실험은 NGF 폴리펩티드의 다양한 단편이, 밀접하게 관련되지만 항원적으로는 별개인 단백질(예를 들면, 뉴로트로핀 단백질 패밀리의 또 다른 구성원)로부터의 서열로 대체된(스와핑된) 돌연변이 NGF를 사용하여 수행될 수 있다. 항체와 돌연변이 NGF의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정한 NGF 단편의 중요성이 평가될 수 있다.

항-NGF 항체를 특성화하는 데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 동일한 항원과 결합한다고 알려진 다른 항체, 즉 NGF에 대한 다양한 단편들과 경쟁 분석을 사용하는 것이며, 이로써 항-NGF-항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정할 수 있다. 경쟁 분석은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 본 발명에서 경쟁 분석에 사용될 수 있는 항체의 예는 문헌(Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000))에 설명된 MAb 911, 912, 938을 포함한다.

다른 NGF 길항제

항-NGF 항체 이외의 다른 NGF 길항제를 사용할 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, NGF 길항제는 기능적 NGF의 발현을 차단 또는 감소시킬 수 있는 적어도 하나의 안티-센스 분자이다. NGF의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있으며 공개적으로 이용할 수 있는 데이타베이스로부터 쉽게 입수가능하다. 예를 들면, 문헌(Borsani et al., Nuc. Acids Res. 1990, 18, 4020; Accession Number NM 002506; Ullrich et al., Nature 303:821-825 (1983))을 참조하라. 다른 폴리뉴클레오티드와의 교차-반응 없이 NGF mRNA와 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제조하는 것이 일반적이다. 전형적인 표적화 부위는, 한정하는 것은 아니지만, 개시 코돈, 5' 조절 영역, 코딩 서열 및 3' 미번역 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 100 뉴클레오티드 길이, 약 15 내지 50 뉴클레오티드 길이, 약 18 내지 25 뉴클레오티드 길이, 또는 그 이상의 길이이다. 올리고뉴클레오티드는 당업계에 잘 공지된, 포스포로티오에이트 결합 및 2'-O 당 변형과 같은 백본 변형을 포함할 수 있다. 전형적인 안티센스 분자는 미국 공보 제20010046959호에 기재된 NGF 안티센스 분자를 포함한다(http://www.rna-tec.com/repair.htm. 참조).

다른 구체예에서, NGF 길항제는 기능적 NGF 수용체(예를 들면, TrkA 및/또는 p75)의 발현을 차단 또는 감소시킬 수 있는 적어도 하나의 안티-센스 분자를 포함한다. Woolf et al. J. Neuroscie (2001) 21(3):1047-55; Taglialetela et al., J Neurochem (1996) 66(5):1826-35. TrkA 및 p75의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있으며, 공개적으로 이용할 수 있는 데이타베이스로부터 쉽게 입수가능하다.

대안적으로, NGF 발현 및/또는 분비 및/또는 NGF 수용체 발현은 유전자 녹다운, 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, RNAi, 또는 리보자임, 당업계에 잘 공지된 방법들을 사용하여 감소될 수 있다. 다음의 사이트를 참조하라.

http://www.macalester.edu/?montgomery/RNAi.html

http://pub32.ezboard.com/fmorpholinosfrm19.showMessage?topicID=6.topic;

http://www.highveld.com/ribozyme.html.

다른 구체예에서, NGF 길항제는 적어도 하나의 NGF 억제성 화합물을 포함한다. 본원에 사용된 "NGF 억제성 화합물"은 NGF 생물학적 활성을 직접적 또는 간접적으로 감소, 억제, 중화 또는 제거하는 항-NGF 항체 이외의 다른 화합물을 말한다. NGF 억제성 화합물은 하기 특징들 중 어느 하나 이상을 나타내야 한다: (a) NGF와 결합하고, NGF 생물학적 활성 또는 NGF 신호전달 기능에 의해 매개된 다운스트림 경로를 억제한다; (b) 골 전이와 연관된 암 통증을 포함하는 골암 통증의 임의의 양태를 예방, 개선 또는 치료한다; (c) NGF 수용체 활성화(TrkA 수용체 다이머화 및/또는 자기인산화를 포함)를 차단 또는 감소시킨다; (d) NGF 클리어런스를 증가시킨다; (e) NGF 합성, 생성 또는 분비를 억제(감소)한다. 대표적인 NGF 억제성 화합물은 미국 특허공보 제20010046959호에 설명된 소분자 NGF 억제제; PCT 공보 WO 00/69829호에 설명된 p75와 결합하는 NGF를 억제하는 화합물 및 문헌(Colquhoun et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 310(2):505-11 (2004))에 설명된 PD90780[7-(벤졸릴아미노)-4,9-디히드로-4-메틸-9-옥소-피라졸로[5,1-b]퀴나졸린-2-카르복실산]; PCT 공보 WO 98/17278에 설명된 TrkA 및/또는 p75와 결합하는 NGF를 억제하는 화합물을 포함한다. NGF 억제성 화합물의 추가적 예는 PCT 공보 WO 02/17914호 및 WO 02/20479, 그리고 미국 특허 제5,342,942호; 제6,127,401호; 및 제6,359,130호에 설명된 화합물을 포함한다. 또 다른 대표적인 NGF 억제성 화합물은 NGF의 경쟁 억제제인 화합물이다. 미국 특허 제6,291,247호를 참조하라. 또한, 당업자는 다른 소분자 NGF 억제성 화합물을 제조할 수 있다.

일부 구체예에서, NGF 억제성 화합물은 NGF와 결합한다. 대표적인 표적화(결합) 부위는, 한정하는 것은 아니지만, TrkA 수용체 및/또는 p75 수용체와 결합하는 NGF 부분, 및 수용체-결합 영역에 인접해 있고 수용체-결합 부분의 정확한 3차원 모양을 일부 가져오는 NGF 부분들을 포함한다. 다른 구체예에서, NGF 억제성 화합물은 NGF 수용체(예를 들면, TrkA 및/또는 p75)와 결합하고 NGF 생물학적 활성을 억제한다. 대표적인 표적화 부위는 NGF와 결합하는 TrkA 및/또는 p75의 이들 부분들을 포함한다.

소분자를 포함하는 구체예에서, 소분자는 100 내지 20,000 달톤, 500 내지 15,000 달톤 또는 1000 내지 10,000 달톤 중 임의의 분자량을 가질 수 있다. 소분자의 라이브러리는 상업적으로 입수가능하다. 소분자는 흡입, 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 경막내, 심실내, 경구, 장관내, 비경구, 비강내 또는 피내를 포함하는 당업계에 공지된 임의의 수단을 사용하여 투여될 수 있다. 대체로, 본 발명에 따른 NGF 길항제가 소분자일 때, 그것은 1회 내지 3회 이상의 용량으로 나누어져 환자의 체중 kg 당 0.1 내지 300 mg의 비율로 투여될 것이다. 정상 체중의 성인 환자의 경우, 용량당 1 mg 내지 5 g의 용량 범위가 투여될 수 있다.

다른 구체예에서, NGF 길항제는 적어도 하나의 NGF 구조 유사체를 포함한다. 본 발명에서 "NGF 구조 유사체"는 NGF의 구조의 일부와 유사한 3-차원 구조를 가지며, 시험관내 또는 생체내에서 생리학적인 조건하에 NGF 수용체와 결합하는 화합물을 말하고, 이 경우 결합은 NGF 생물학적 활성을 적어도 부분적으로 억제한다. 한 구체예에서, NGF 구조 유사체는 TrkA 및/또는 p75 수용체와 결합한다. 대표적인 NGF 구조 유사체는, 한정하는 것은 아니지만, PCT 공보 WO 97/15593호에 설명된 2-고리 펩티드; 미국 특허 제6,291,247호에 설명된 2-고리 펩티드; 미국 특허 제 6,017,878호에 설명된 고리 화합물; 및 PCT 공보 WO 89/09225호에 설명된 NGF-유도 펩티드를 포함한다. 또한, 적합한 NGF 구조 유사체는, 예를 들면 PCT 공보 WO 98/06048호에 설명된 방법에 의하여, NGF-수용체의 분자 모델링을 통하여 설계 및 합성될 수 있다. NGF 구조 유사체는 모노머이거나, 또는 개선된 친화성 및 생물학적 효과를 얻기 위해서 동일한 또는 상이한 구조들의 어떤 바람직한 조합의 형태로 다이머/올리고머일 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 TrkA 수용체 및/또는 p75 수용체의 적어도 하나의 우성-음성 돌연변이를 포함하는 NGF 길항제를 제공한다. 당업자는, 예를 들면 TrkA 수용체의 우성-음성 돌연변이를 제조할 수 있고, 이로써 이 수용체는 NGF와 결합하게 됨으로써 NGF를 포획하는 "싱크"로서 작용하게 된다. 그러나, 우성-음성 돌연변이는 NGF와의 결합시 TrkA 수용체의 정상적인 생활성을 갖지 않을 것이다. 대표적인 우성-음성 돌연변이는, 한정하는 것은 아니지만, 참고문헌(Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 10884; Eide et al., J. Neurosci. 1996, 16, 3123; Liu et al., J Neurosci 1997, 17, 8749; Klein et al., Cell 1990, 61, 647; Valenzuela et al., Neuron 1993, 10, 963; Tsoulfas et al., Neuron 1993, 10, 975; 및 Lamballe et al., EMBOJ 1993, 12, 3083)에 설명된 돌연변이들을 포함하고, 이들 각각은 본원에 그 전체가 참고인용된다. 우성-음성 돌연변이는 단백질 형태나 발현 벡터의 형태로 투여될 수 있으며, 이로써 우성-음성 돌연변이, 예를 들면 돌연변이 TrKA 수용체는 생체내에서 발현된다. 단백질 또는 발현 벡터는 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 경막내, 심실내, 경구, 장관내, 비경구, 비강내, 피내, 또는 흡입에 의한 것과 같은 당업계에 공지된 임의의 수단을 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터의 투여는 국부 또는 전신 투여를 포함하며, 이들은 주사, 경구 투여, 입자 총 또는 카테터 투여 및 국소 투여를 포함한다. 당업자는 생체내에서 외인성 단백질의 발현을 얻기 위한 발현 벡터의 투여에 익숙하다. 예를 들면, 미국 특허 제6,436,908호; 제6,413,942호; 및 제6,376,471호를 참조하라.

또한, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 또는 서브게놈 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물의 표적 전달을 사용할 수 있다. 수용체-매개 DNA 전달 기술은, 예를 들면 문헌(Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer(J.A. Wolff ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J BioL Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338)에 설명된다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물은 유전자 치료 프로토콜에서의 국소 투여에 대하여 약 100 ng 내지 200 mg의 범위로 투여된다. 일부 구체예에서, 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 ㎍ 내지 2 mg, 약 5 ㎍ 내지 약 500 ㎍ 및 약 20 ㎍ 내지 100 ㎍의 DNA 농도, 또는 그 이상의 농도가 유전자 치료 프로토콜 동안 사용될 수 있다. 본 발명의 치료 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 전달할 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스 기원이거나 비-바이러스 기원일 수 있다(대체로, Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; 및 Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148 참조하라). 그러한 코딩 서열의 발현은 내생 포유동물 또는 이종성 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하여 유도될 수 있다. 코딩 서열의 발현은 지속적이거나 조절될 수 있다.

원하는 폴리뉴클레오티드의 전달 및 원하는 세포에서의 발현을 위한 바이러스계 벡터는 당업계에 잘 공지되어 있다. 대표적인 바이러스계 비히클은, 한정하는 것은 아니지만, 재조합 레트로바이러스(예를 들면, PCT 공보 WO 90/07936호; WO 94/03622호; WO 93/25698호; WO 93/25234호; WO 93/11230호; WO 93/10218호; WO 91/02805호; 미국 특허 제5,219,740호 및 제4,777,127호; 영국 특허 제2,200,651호; 및 유럽 특허 제0 345 242호 참조), 알파바이러스계 벡터(예를 들면, 신드비스 바이러스 벡터, 셈리키 포레스트 바이러스(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버 바이러스(ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532), 및 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터(예를 들면, PCT 공보 WO 94/12649호, WO 93/03769호; WO 93/19191호; WO 94/28938호; WO 95/11984호 및 WO 95/00655호 참조)를 포함한다. 또한, 문헌(Curiel, Hum. GeneTher.(1992) 3:147)에 설명된 죽은 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 사용될 수 있다.

또한, 비-바이러스 전달 비히클 및 방법을 사용할 수 있으며, 이들은 한정하는 것은 아니지만, 죽은 아데노바이러스에만 연결되거나 또는 연결되지 않은 다가양이온 응축된 DNA(예를 들면, Curiel, Hum. Gene Ther.(1992) 3:147 참조); 리간드-결합 DNA(예를 들면, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985 참조); 진핵세포 전달 비히클 세포(예를 들면, 미국 특허 제5,814,482호; PCT 공보 WO 95/07994호; WO 96/17072호; WO 95/30763호; 및 WO 97/42338호 참조) 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합을 포함한다. 또한, 네이키드 DNA를 사용할 수 있다. 대표적인 네이키드 DNA는 PCT 공보 WO 90/11092호 및 미국 특허 제5,580,859호에 설명된다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포좀은 미국 특허 제5,422,120호; PCT 공보 WO 95/13796호; WO 94/23697호; WO 91/14445호; 및 유럽 특허 제052496호에 설명된다. 추가적 접근법은 문헌(Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411 및 Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581)에 설명된다.

또한, 발현 벡터가 본원에 설명된 단백질-기제 NGF 길항제(예를 들면, 항-NGF 항체, TrkA 면역접합체 등) 중 임의 것의 직접 발현에 사용될 수 있다는 것은 분명하다. 예를 들면, NGF 및/또는 NGF 생물학적 활성을 차단(부분적 차단에서 완벽한 차단까지)할 수 있는 다른 TrkA 수용체 단편은 당업계에 공지되어 있다.

다른 구체예에서, NGF 길항제는 적어도 하나의 TrkA 면역접합체를 포함한다. 본원에 사용된 TrkA 면역접합체는 TrkA 수용체의 세포외 도메인 및 면역글로불린 서열을 포함하는 가용성 키메라 분자를 말하며, 이것은 TrkA 수용체의 결합 특이성을 보유하고(실질적으로 TrkA 수용체의 결합 특이성을 보유한다), NGF와 결합할 수 있다.

TrkA 면역접합체는 당업계에 공지되어 있으며, NGF와 TrkA 수용체의 결합을 차단하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 미국특허 제6,153,189호를 참조하라. Brennan et al.은 수술 후 통증에 대한 래트 모델에서 TrkA 면역접합체의 투여를 보고하고 있다. 문헌(Society for Neuroscience Abstracts 24 (1-2) 880 (1998))을 참조하라. 한 구체예에서, TrkA 면역접합체는 NGF와 결합할 수 있는 TrkA 세포외 도메인에서 유래한 TrkA 수용체 아미노산 서열(또는 그것의 일부분)(일부 구체예에서, TrkA 수용체의 결합 특이성을 실질적으로 보유하는 아미노산 서열)과 면역글로불린 서열의 융합체를 포함한다. 일부 구체예에서, TrkA 수용체는 사람 TrkA 수용체 서열이고, 융합체는 면역글로불린 불변 도메인 서열을 가진다. 다른 구체예에서, 면역글로불린 불변 도메인 서열은 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 서열이다. 다른 구체예에서, 2개의 TrkA 수용체-면역글로불린 중쇄 융합체의 결합(예를 들면, 이황화 결합(들)에 의한 공유 결합에 의하여)은 호모다이머 면역글로불린 유사 구조를 가져온다. 또한, 면역글로불린 경쇄는 이황화-결합 다이머의 TrkA 수용체-면역글로불린 키메라 중 하나 또는 둘 다에 결합될 수 있으며, 그 결과 호모트라이머 또는 호모테트라머 구조가 만들어진다. 적합한 TrkA 면역접합체의 예는 미국특허 제6,153,189호에 설명된 것들을 포함한다.

또 다른 구체예에서, NGF 길항제는 TrkA 수용체 및/또는 다운스트림 신호전달과 NGF의 물리적 상호작용을 차단, 억제, 변경 및/또는 감소시킬 수 있는 하나 이상의 항-TrkA 항체를 포함하며, 이로써 NGF 생물학적 활성이 감소 및/또는 차단된다. 항-TrkA 항체는 당업계에 공지되어 있다. 전형적인 항-TrkA 항체는 PCT 공보 WO 97/21732호, WO 00/73344호, WO 02/15924호 및 미국 공보 제20010046959호에 설명된 것들을 포함한다.

다른 구체예에서, NGF 길항제는 p75 수용체 및/또는 다운스트림 신호전달과 NGF의 물리적 상호작용을 차단, 억제 및/또는 감소시킬 수 있는 하나 이상의 항-p75 항체를 포함하며, 이로써 NGF 생물학적 활성이 감소 및/또는 차단된다.

다른 구체예에서, NGF 길항제는 TrkA 및/또는 p75 수용체 활성과 관련된 하류 키나제 신호전달를 저해할 수 있는 하나 이상의 키나제 저해제를 포함한다. 대표적인 키나제 저해제는 K252a 또는 K252b이며, 이들은 당업계에 공지되어 있고 문헌(Knusel et al., J. Neurochem. 59:715-722 (1992); Knusel et al., J. Neurochemistry 57:955-962 (1991); Koizumi et al., J. Neuroscience 8:715-721 (1988); Hirata et al., Chemical Abstracts 111:728, XP00204135, 초록 및 Collective Chemical Substance Index, 12판, p.34237, c.3(5-7), 55-60, 66-69), p.34238, c.1(41-44), c.2(25-27, 32-33), p.3423, c.3(48-50, 52-53) 참조; 및 미국 특허 제6,306,849호)에 설명된다.

임상학자들이 하고자 한다면 많은 다른 카테고리의 NGF 길항제가 확인될 것으로 예상된다.

NGF 길항제의 확인

당업계에 공지된 방법을 사용하여 항-NGF 항체 및 다른 NGF 길항제들이 확인하거나 특성화할 수 있으며, 이로써 NGF 생물학적 활성의 감소, 개선, 또는 중화를 검출 및/또는 측정한다. PCT WO 04/065560호에 설명된 방법을 사용할 수 있다. 또 다른 방법, 예를 들면, 미국 특허 제5,766,863호 및 제5,891,650호에 설명된 키나제 수용체 활성화(KIRA) 분석을 사용하여 NGF 길항제를 확인할 수도 있다. 이 ELISA-타입 분석은, 수용체 단백질 티로신 키나제(이후 "rPTK"), 예를 들면 TrkA 수용체의 키나제 도메인의 자기인산화를 측정함으로써 키나제 활성화의 정량적 또는 정성적 측정에 적합할 뿐만 아니라, 선택된 rPTK, 예를 들면 TrkA의 잠재적인 길항제의 확인 및 특성화에도 적합하다. 분석 제 1 단계는 키나제 수용체, 예를 들면 TrkA 수용체의 키나제 도메인의 인산화를 포함하는데, 여기서 수용체는 진핵세포의 세포막에 존재한다. 수용체는 내인성 수용체이거나, 수용체 또는 수용체 구성물을 코딩하는 핵산일 수 있고, 세포로 형질전환될 수 있다. 통상적으로, 제 1 고체상(예를 들면, 제 1 분석 플레이트의 웰)은 그러한 세포(통상 포유동물 세포주)의 실질적으로 균질한 집단으로 코팅되어 세포가 고체상에 부착된다. 주로 세포는 부착성이므로 제 1 고체상에 자연적으로 부착한다. 만일 "수용체 구성물"이 사용된다면, 그것은 대개 키나제 수용체와 플래그 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 플래그 폴리펩티드는, 본 분석의 ELISA 파트에서 포획제, 주로 포획 항체에 의해 인식된다. 그 다음, 후보 항-NGF 항체 또는 다른 NGF 길항제와 같은 분석물질이 NGF와 함께 세포가 부착된 웰에 첨가되며, 이로써 티로신 키나제 수용체(예를 들면 TrkA 수용체)가 NGF 및 분석물질에 노출된다(또는 접촉된다). 이 분석은 항체의 리간드 NGF에 의해 TrkA의 활성화를 저해하는 항체(또는 다른 NGF 길항제)의 확인을 가능하게 한다. NGF 및 분석물질에의 노출에 이어서, 용해 완충제(이것은 용해 세제를 함유한다)를 사용하여 부드럽게 교반하여 부착된 세포를 용해시켜 세포 용해물을 방출시키는데, 이것은 세포 용해물의 농축이나 정화할 필요 없이 본 분석의 ELISA 파트에 직접 사용될 수 있다.

이와 같이 제조된 세포 용해물은 본 분석의 ELISA 단계에 사용되도록 준비된다. ELISA 단계의 제 1 단계로서, 제 2 고체상(통상 ELISA 마이크로타이터 플레이트의 웰)이 티로신 키나제 수용체에, 또는 수용체 구성물의 경우에는 플랙 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 포획제(주로 포획 항체)로 코팅된다. 제 2 고체상의 코팅은 포획제가 제 2 고체상에 부착되도록 수행된다. 포획제는 일반적으로 모노클론 항체이지만, 본원 실시예에 설명된 대로 폴리클론 항체도 사용될 수 있다. 그 다음, 얻어진 세포 용해물은 부착된 포획제에 노출되거나 접촉되어, 수용체 또는 수용체 구성물이 제 2 고체상에 부착된다(또는 포획된다). 그 다음, 세척 단계를 수행하여 결합되지 않은 세포 용해물을 제거하여, 포획된 수용체 또는 수용체 구성물만 남긴다. 그 다음, 부착된 또는 포획된 수용체 또는 수용체 구성물은, 티로신 키나제 수용체의 인산화된 티로신 잔기를 확인하는 항-포스포티로신 항체에 노출되거나 접촉된다. 한 구체예에서, 항-포스포티로신 항체는 비-방사성 착색 시약의 색 변화를 촉매하는 효소와 (직접적 또는 간접적으로) 콘쥬게이트된다. 따라서, 수용체의 인산화는 이어지는 착색 시약의 색 변화에 의하여 측정할 수 있다. 효소는 항-포스포티로신 항체와 직접 결합될 수 있거나, 또는 콘쥬게이트 분자(예를 들면, 바이오틴)가 항-포스포티로신 항체에 콘쥬게이트될 수 있고, 그 다음 효소가 콘쥬게이트 분자에 의하여 항-포스포티로신 항체에 결합될 수 있다. 마지막으로, 항-포스포티로신 항체와 포획된 수용체 또는 수용체 구성물의 결합이, 예를 들면 착색 시약의 색 변화에 의해 측정된다.

또한, NGF 길항제는, 후보 제제를 NGF와 함께 인큐베이션하고, 다음 특징들 중 어느 한 가지 이상을 모니터링함으로써 확인할 수 있다: (a) NGF와의 결합 및 NGF 생물학적 활성 및/또는 NGF 신호전달 기능에 의해 매개된 다운스트림 경로의 저해; (b) 골 전이와 연관된 암 통증을 포함하는 골암 통증의 어떤 양태의 예방, 개선 또는 치료; (c) NGF 수용체 활성화(TrkA 수용체 다이머화 및/또는 자기인산화를 포함)의 차단 또는 감소; (d) NGF의 클리어런스 증가; (e) NGF 합성, 생성 또는 방출의 저해(감소). 일부 구체예에서, NGF 길항제는 후보 제제를 NGF와 함께 인큐베이션하고, 결합 및 그에 따른 NGF의 생물학적 활성의 감소 또는 중화를 모니터링함으로써 확인할 수 있다. 결합 분석은 정제된 NGF 폴리펩티드(들), 또는 NGF 폴리펩티드(들)를 자연적으로 발현하거나, 또는 발현하도록 트랜스펙션된 세포를 사용하여 수행할 수 있다. 한 구체예에서, 결합 분석은 경쟁 결합 분석이며, 이 경우 NGF 결합에 대한 공지된 NGF 길항제와 경쟁하는 후보 항체의 능력이 평가된다. 분석은 ELISA 포맷을 포함하여 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 후보 제제를 NGF와 함께 인큐베이션하고, 그에 따른 TrkA 수용체 다이머화 및/또는 자기인산화의 저해를 모니터링함으로써 확인한다.

초기 확인에 이어서, 표적 생물학적 활성을 시험한다고 알려진 생물학적검정에 의해서 후보 항-NGF 길항제의 활성을 더 확인하고 정제할 수 있다. 대안적으로, 생물학적검정은 후보를 직접 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, NGF는 반응성 세포에서의 형태학적으로 인식가능한 많은 변화를 촉진한다. 한정하는 것은 아니지만, 이들은 PC12 세포의 분화 촉진 및 이들 세포로부터 신경돌기의 성장 증진(Greene 및 Tischler, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73:2424-2428 (1976); Urfer et al., Biochem. 36:4775-4781 (1997); Tsoulfas et al., Neuron 10:975-990 (1993)), 반응성 감각 및 교감 신경절의 체외이식편으로부터 신경돌기의 생성 촉진(Levi-Montalcini, R. 및 Angeletti, P. Nerve growth factor. Physiol. Rev. 48, 534-569, 1968) 및 배아 배근 신경절, 삼차 신경절 또는 교감 신경절 뉴런과 같은 NGF 의존성 뉴런의 생존 촉진(예를 들면, Chun & Patterson, Dev. Biol. 75:705-711, (1977); Buchman & Davies, Development 118:989-1001, (1993))을 포함한다. 이와 같이, NGF 생물학적 활성의 저해에 대한 분석은 NGF 반응성 세포를 NGF 및 분석물질, 예를 들면 후보 항-NGF 항체 또는 후보 NGF 길항제와 함께 배양하는 것을 필요로 한다. 적합한 시간 후 세포 반응이 분석될 것이다(세포 분화, 신경돌기 생성 또는 세포 생존).

또한, NGF의 생물학적 활성을 차단하거나 중화하는 후보 NGF 길항제의 능력은, 래트 배아 배근 신경절 생존 생물학적검정에서 NGF 매개 생존을 저해하는 후보 제제의 능력을 모니터링함으로써 평가될 수 있는데, 이것은 문헌(Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000))에 설명된다.

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 조성물

본 발명의 방법에서 사용되는 조성물은 유효량의 NGF 길항제(예를 들면, 항-NGF 항체)를 포함하고, 일부 구체예에서는 약학적으로 허용되는 부형제를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 본원에 설명된 방법 중 임의의 것에서 사용하기 위한 것이다. 또한, 그러한 조성물의 예와 조제 방법은 앞선 단락 및 하기에 설명된다. 한 구체예에서, 조성물은 NGF 길항제를 포함한다. 다른 구체예에서, 조성물은 하나 이상의 NGF 길항제를 포함한다. 다른 구체예에서, 조성물은, NGF와 결합하는(물리적으로 상호작용하는) 길항제(예를 들면, 항체), NGF 수용체(예를 들면, TrkA 및/또는 p75 수용체)와 결합하는 길항제 및 다운스트림 NGF 수용체 신호전달을 감소(방해 및/또는 차단)시키는 길항제 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 NGF 길항제를 포함한다. 다른 구체예에서, 조성물은 TrkA 면역접합체가 아닌 어떤 NGF 길항제(즉, TrkA 면역접합체 이외의 다른 것)을 포함한다. 다른 구체예에서, 조성물은 항-NGF 항체 이외의 다른 것인 임의의 NGF 길항제를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 TrkA 면역접합체 이외의 다른 것이고 항-NGF 항체 이외의 다른 것인 임의의 NGF 길항제를 포함한다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 NGF 합성, 생성 또는 방출을 저해(감소)한다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NGF와 결합하며, 관련된 뉴로트로핀(예를 들면, NT3, NT4/5 및/또는 BDNF)과 유의하게는 교차반응하지 않는다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 유해한 면역반응과 관련되지 않는다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는, 항-NGF 항체, NGF에 관한 항-센스 분자(NGF를 코딩하는 핵산에 관한 항-센스 분자를 포함), NGF 수용체(예를 들면, TrkA 및/또는 p75)와 관한 항-센스 분자, NGF 억제성 화합물, NGF 구조 유사체, NGF와 결합하는 TrkA 수용체의 우성-음성 돌연변이, TrkA 면역접합체, 항-TrkA 항체, 항-p75 항체 및 키나제 저해제로 구성되는 군에서 선택된다. 다른 구체예에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체이다. 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 사람 NGF를 인식한다. 일부 구체예에서, 항-NGF 항체는 사람의 것이다. 또 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 사람화된다(예를 들면, 본원에 설명된 항체 E3). 또 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 항체-매개 용해 또는 ADCC와 같은 원치 않거나 바람직하지 않은 면역반응을 개시하지 않는 불변영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 항-NGF 항체는 항체 E3의 CDR(들) 중 하나 이상(예를 들면, E3의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 일부 구체예에서는 6개의 CDR 전부)을 포함한다.

조성물은 하나 이상의 NGF 길항제를 포함할 수 있다는 것이 이해된다. 예를 들면, 조성물은, NGF 길항제의 어떤 한 부류에 속한 하나 이상의 구성원(예를 들면, NGF의 상이한 에피토프들을 인식하는 항-NGF 항체들의 혼합물)을 포함할 수 있을 뿐만 아니라, NGF 길항제의 상이한 부류에 속한 구성원(예를 들면, 항-NGF 항체 및 NGF 억제성 화합물)을 포함할 수도 있다. 다른 대표적인 조성물은 동일한 에피토프(들), NGF의 상이한 에피토프에 결합하는 상이한 종의 항-NGF 항체, 또는 상이한 NGF 억제성 화합물을 인식하는 하나 이상의 항-NGF 항체를 포함한다.

본 발명에서 사용되는 조성물은, 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제를 더 포함할 수 있다(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20판 (2000), Lippincott Williams 및 Wilkins 편저, K. E. Hoover). 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산 등의 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들면, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 이하의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염-형성 반대-이온; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온계 계면활성제, 예를 들면 TWEEN^TM, PLURONICS^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 부형제는 본원에 더 설명된다.

또한, NGF 길항제 및 그 조성물은 이 제제의 효능을 증진 및/또는 보완하는 작용을 하는 다른 제제와 함께 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 다른 제제는 아편양 진통제이다. 일부 구체예에서, 다른 제제는 NSAID이다. 일부 구체예에서, 이들 제제는 아편양 진통제가 아니다. 일부 구체예에서 이들 제제는 NSAID가 아니다.

키트

또한, 본 발명은 본 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 NGF 길항제(예를 들면 본원에 설명된 사람화된 항체 E3와 같은 항체)를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함하고, 일부 구체예에서는 여기 설명된 본 발명의 방법 중 임의의 것에 따라서 사용하기 위한 설명서를 더 포함한다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 본원에 설명된 임의의 NGF 길항제이다. 또 다른 구체예에서, 키트는 TrkA 면역접합체가 아닌 NGF 길항제(즉, TrkA 면역접합체 이외의 다른 것)를 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 항-NGF- 항체 이외의 다른 것인 NGF 길항제를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 키트는 TrkA 면역접합체 이외의 다른 것이고 항-NGF 항체 이외의 다른 것인 어떤 NGF 길항제를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 항-NGF 항체(예를 들면, 본원에 설명된 항체 E3)를 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 항체 E3의 CDR(들) 중 하나 이상(예를 들면, E3의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR 전부)을 포함하는 항-NGF 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 아편양 진통제를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 NSAID를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 아편양 진통제를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 키트는 NSAID를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 포함된 설명서는, 본원에 설명된 방법 중 어느 것에 따라서, 골 전이와 연관된 암 통증을 포함하는 골암 통증을 치료, 개선 또는 예방하기 위한 NGF 길항제의 투여에 대한 설명을 포함한다. 키트는 개체가 골 전이와 연관된 암 통증을 포함하는 골암 통증을 가지는지의 여부 또는 개체가 골 전이와 연관된 암 통증을 포함하는 골암 통증의 위험이 있는지의 여부를 확인하는 것에 기초하여, 치료에 적합한 개체를 선택하는 것에 대한 설명을 더 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 설명서는 골 전이와 연관된 암 통증을 포함하는 골암 통증을 치료, 예방 및/또는 개선하기 위한 NGF 길항제의 투여에 대한 설명을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 설명서는 골 전이와 연관된 암 통증을 포함하는 골암 통증의 위험이 있는 개체에게 NGF 길항체를 투여하는 것에 대한 설명을 포함한다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제와 병용투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NSAID와 병용투여된다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제와 병용투여되지 않는다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NSIAD와 병용투여되지 않는다.

NGF 길항제의 사용에 관한 설명서는 일반적으로 투여량, 투약 스케줄 및 의도된 치료에 적당한 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 포장(예를 들면, 다수-용량 포장) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 제공되는 설명서는 전형적으로 라벨이나 포장 삽입물(예를 들면, 키트에 포함되는 종이 시트) 상의 서면 설명서이지만, 기계-판독가능한 설명서(예를 들면, 자기 또는 광학 저장 디스크에 기록된 설명서)도 허용된다.

라벨 또는 포장 삽입물은, 조성물이 골 전이와 연관된 암 통증을 포함하는 골암 통증을 개료, 개선 및/또는 예방하기 위해 사용된다는 것을 지시한다. 설명서는 본원에 설명된 방법 중 임의의 것을 실시하기 위해 제공될 수 있다.

본 발명의 키트는 적합하게 포장되어 있다. 한정하는 것은 아니지만, 적합한 포장은 바이알, 바틀, 자르, 유연한 포장(예를 들면, 밀봉 마일라 또는 비닐봉지) 등을 포함한다. 또 고려되는 것은 흡입기, 비강 투여장치(예를 들면, 분무기) 또는 미니펌프와 같은 주입장치 등과 함께 사용하기 위한 포장이다. 키트는 멸균 접근 포트(예를 들면, 용기는 피하 주사바늘에 의해 뚫리는 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다)를 가질 수 있다. 또한, 용기는 멸균 접근 포트(예를 들면, 용기는 피하 주사바늘에 의해 뚫리는 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다)를 가질 수 있다. 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 항-NGF 항체와 같은 NGF 길항제이다. 용기는 제 2의 제약학적 활성제를 더 포함할 수 있다.

키트는 선택적으로 완충제 및 설명 정보와 같은 추가 성분을 제공할 수 있다. 통상, 키트는 용기 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물(들)을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 상기 설명된 키트 내용물을 포함하는 제조된 물품을 제공한다. 일부 구체예에서, 키트는 골 전이와 연관된 암 통증을 포함하는 골암 통증을 치료하기 위한 용도를 지시하는 정보를 갖는 NGF 길항제(예를 들면, 항-NGF 항체)를 포함한다.

NGF 길항제의 투여 및 치료 평가

NGF 길항제는 임의의 적합한 경로에 의하여 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들면, NGF 길항제는 경구, 정맥내, 설하, 피하, 동맥내, 활막내, 소포내(예를 들면, 방광을 거쳐), 근육내, 심장내, 흉강내, 복강내, 뇌실내, 설하, 흡입, 좌약, 및 경피 경로에 의해 투여될 수 있다. 이들은 경구적으로, 예를 들면 본 분야에 승인된 과정에 의하여 제조된 정제, 구내정, 캡슐, 엘리시르, 현탁액, 시럽, 와퍼, 롤리팝, 츄잉검 등의 형태로 투여될 수 있다. 본원에 설명된 실시예는 이용가능한 기술을 예시하는 것이며 제한하는 것이 아니라는 것이 당업자에게 분명해야 한다.

따라서, 일부 구체예에서, 항-NGF 항체와 같은 NGF 길항제는, 예를 들면, 볼루스로서, 또는 어떤 시간 기간에 걸친 연속 주입에 의한 정맥내 투여, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활맥내, 경막내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의한 것과 같은 공지된 방법에 따라서 개체에게 투여된다. 액체 제제에 적당한 제트 분무기 및 초음파 분무기를 포함하는 상업적으로 이용가능한 분무기는 투여에 유용하다. 액체 제제를 직접 분무할 수 있고, 동결건조 가루를 복원한 다음 분무할 수 있다. 대안적으로, NGF 길항제는 플루오로카본 제제 및 용량계량식 흡입기를 사용하여 에어로졸화될 수 있거나, 동결건조되고 분쇄된 가루로서 흡입될 수 있다.

한 구체예에서, NGF 길항제는 부위-특이적 또는 표적 국부적 전달 기술에 의해 투여된다. 부위-특이적 또는 표적 국부적 전달 기술의 예는, NGF 길항제의 다양한 삽입형 저장원, 또는 국부 전달 카테테르, 예를 들면 주입 카테테르, 내재 카테테르, 또는 바늘 카테테르, 합성 이식물, 외부 싸개, 션트 및 스탠트 또는 다른 삽입 장치, 부위 특이적 캐리어, 직접 주사, 또는 직접 도포를 포함한다. 예를 들면, PCT 공보 WO 00/53211호 및 미국특허 제5,981,568호를 참조하라.

다양한 NGF 길항제(예를 들면, 항-NGF 항체) 제제는 투여에 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 순수한 상태로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체를 포함하고, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제제를 포함하여 다양한 제제일 수 있다. 약학적으로 허용되는 제제는 당업계에 공지되어 있으며, 약동학적으로 효과적인 물질의 투여를 용이하게 하는 상대적으로 불활성인 물질이다. 예를 들면, 부형제는 형태나 일관성을 제공하거나, 또는 희석제로서 작용할 수 있다. 한정하는 것은 아니지만, 적합한 부형제는 안정제, 습윤제 및 유화제, 삼투농도를 변화시키는 염, 캡슐화제, 완충제 및 피부 침투 증진제를 포함한다. 비경구 및 경구 약물 전달에 알맞은 부형제 및 제제는 문헌(Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20판, Mack Publishing (2000))에 제시된다.

일부 구체예에서, 이들 제제는 주사(예를 들면, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등)에 의한 투여에 알맞게 조제된다. 따라서, 이들 제제는 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액 등과 같은 약학적으로 허용되는 비히클과 조합될 수 있다. 특정한 투약 섭생, 즉, 용량, 타이밍 및 반복은 특정한 개체 및 이 개체의 병력에 의존할 것이다.

항-NGF 항체는, 주사(예를 들면, 복강내, 정맥내, 피하, 근육내 등)에 의한 것을 포함하여 임의의 적합한 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 또, 항-NGF 항체는 본원에 설명된 바와 같이 흡입에 의해 투여될 수도 있다. 일반적으로, 항-NGF 항체의 투여를 위해서, 초기의 후보 투여량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라서 약 0.1 ㎍/kg 내지 3 ㎍/kg 내지 30 ㎍/kg 내지 300 ㎍/kg 내지 3 mg/kg, 내지 30 mg/kg 내지 100 mg/kg 이상 중 어느 범위일 것이다. 상태에 따라서 며칠 또는 그 이상에 걸친 반복적 투여를 위해서는, 골 전이와 연관된 암 통증을 감소시킬 수 있는 정도로 증상의 원하는 억제가 일어나거나 또는 충분한 치료 수준이 달성될 때까지 치료를 지속한다. 전형적인 투약 섭생은 약 2 mg/kg의 초기 용량을 투여한 후, 항-NGF 항체를 매주 약 1 mg/kg의 유지 용량으로 투여하거나, 또는 약 1 mg/kg의 유지 용량을 격주로 투여한다. 그러나, 의사가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라서 다른 투약 섭생이 유용할 수 있다. 예를 들면, 1주당 1-4회의 투약이 고려된다. 일부 구체예에서, 약 3 ㎍/kg 내지 약 2 mg/kg(예를 들면, 약 3 ㎍/kg, 약 10 ㎍/kg, 약 30 ㎍/kg, 약 100 ㎍/kg, 약 300 ㎍/kg, 약 1 mg/kg 및 약 2 mg/kg) 범위의 투여량이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 투약 빈도는 매주, 2주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다 또는 10주마다 1회; 또는 매달, 2달마다, 또는 3달마다 또는 그 이상의 간격으로 1회이다. 이 치료법의 진행은 종래의 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터링된다. 투약 섭생(사용되는 NGF 길항제(들)을 포함하여)은 시간에 따라 변할 수 있다.

일반적으로 그것이 항체가 아닌 경우, NGF 길항제는 (일부 구체예에서) 1 내지 3회 용량으로 나누어서, 또는 본원에 개시된 대로, 환자 체중 kg 당 약 0.1 내지 300 mg의 비율로 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 정상 체중을 가진 성인 환자에 대해서, 약 0.3 내지 5.00 mg/kg 범위의 용량이 투여될 수 있다. 특정한 투약 섭생, 즉, 용량, 타이밍 및 반복은 특정한 개체 및 그 개체의 병력, 그리고 각 제제의 특성(예를 들면, 제제의 반감기 및 당업계에 잘 알려진 다른 고려사항들)에 의존할 것이다.

본 발명의 목적을 위해서, NGF 길항제의 적합한 투여량은 사용되는 NGF 길항제(들)(또는 이들의 조성물), 치료될 통증의 유형 및 심한 정도, 제제가 예방 목적 또는 치료 목적을 위해 투여되는지의 여부, 선행한 치료법, 환자의 임상 병력 및 제제에 대한 반응 및 주치의의 결정에 의존할 것이다. 통상적으로 임상의는 원하는 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 항-NGF 항체와 같은 NGF 길항제를 투여할 것이다.

일반적으로, 반감기와 같은 경험적인 고려사항이 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들면, 사람 면역 시스템과 양립할 수 있는 항체, 예를 들면 사람화된 항체나 완전 사람 항체를 사용하여, 항체의 반감기를 연장하고 항체가 숙주의 면역 시스템에 의해 공격받는 것을 방지할 수 있다. 투여 빈도는 치료 진행과정에 따라 결정되고 조정될 수 있고, 반드시 그런 것은 아니지만, 일반적으로는 통증의 치료 및/또는 억제 및/또는 개선 및/또는 지연에 기초한다. 대안적으로, 항-NGF 항체의 지속적 연속 방출 제제가 적합할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치는 당업계에 공지되어 있다.

한 구체예에서, NGF 길항제의 투여량은 1회 이상의 NGF 길항제(예를 들면, 항체) 투여(들)을 제공받은 적이 있는 개체에서 경험적으로 결정될 수 있다. 개체는 NGF-길항제, 예를 들면 항-NGF 항체를 점점 증가하는 투여량으로 제공받는다. NGF 길항제의 효능을 평가하기 위해서 통증의 지표는 추적될 수 있다.

본 발명의 방법에 따른 NGF 길항제의 투여는, 예를 들면 수용자의 생리학적 상태, 투여 목적이 치료적인지 예방적인지의 여부 및 숙련된 의사에게 알려진 다른 요인들에 따라서 연속적 또는 간헐적일 수 있다. NGF 길항제의 투여는(예를 들면, 만일 NGF 길항제가 항-NGF 항체라면) 필수적으로 미리 선택된 시간 기간에 걸쳐 연속적일 수 있거나, 또는 간격을 두어 연속하여, 예를 들면, 통증 발생 전에, 중에, 또는 후에; 통증 발생 전에; 통증 발생 중에; 통증 발생 전과 후에; 통증 발생 중에 및 후에; 통증 발생 전에 및 중에; 또는 통증 발생 전에, 중에 그리고 후에 이루어질 수 있다. 투여는 암이 뼈로 전이되기 전에, 전이되는 동안에 및/또는 전이된 후에 투여될 수 있고, 골 전이와 연관된 암 통증을 일으킬 가능성이 있는 임의의 다른 사건 전에, 중에 및/또는 후에 투여될 수 있다.

일부 구체예에서, 하나 이상의 NGF 길항제, 예를 들면 항체가 존재할 수 있다. 항체는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상의 상이한 NGF 길항제가 존재할 수 있다. 일반적으로, 이들 NGF 길항제는 서로 해로운 영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 가진다. 또한, NGF 길항제는 이 제제의 효능을 증진 및/또는 보완하는 작용을 하는 다른 제제와 함께 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 아편양 진통제와 병용투여되지 않는다. 일부 구체예에서, NGF 길항제는 NSAID와 병용투여되지 않는다.

본 발명에 따라서 사용되는 NGF 길항제(예를 들면, 항체)의 치료적 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 항체를, 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로, 선택적으로 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제(Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20판, Mack Publishing (2000))와 혼합함으로써 저장에 알맞게 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산 등의 완충제; 염화나트륨과 같은 염; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들면, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들면 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들면 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염-형성 반대-이온; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온계 계면활성제, 예를 들면 TWEEN^TM, PLURONICS^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다.

NGF 길항제(예를 들면, 항체)를 함유하는 리포솜이, 당업계에 공지된, 예를 들면 문헌(Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호)에 설명된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증진된 리포솜은 미국 특허 제5,013,556호에 개시된다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 액체 조성물을 사용한 역상 증발법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 정해진 공극 크기를 갖는 필터를 통해 압출되며, 이로써 원하는 직경의 리포솜을 얻는다.

또한, 활성 성분은 예를 들면 액적형성 기술 또는 계면중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 콜로이드상 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-파티클 및 나노캡슐) 또는 마이크로에멀젼 내에 각각 있는, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포착될 수 있다. 그러한 기술은 문헌(Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20판, Mack Publishing (2000))에 개시된다.

지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 모양을 가진 물건, 예를 들면 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜), 폴리아세티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-변성 에틸렌-비닐 아세테이트, 변성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면 LUPRON DEPOT^TM(락트산-글리콜산 공중합체와 로이프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로스피어), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.

생체 내 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이것은, 예를 들면 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 바로 달성된다. 일반적으로 치료적 항-NGF 항체 조성물은 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들면 피하 주사바늘에 의해 뚫리는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 넣는다.

본 발명에 따른 조성물은 정제, 알약, 캡슐, 가루, 과립, 용액 또는 현탁액과 같은 단위 제형 또는 좌약, 경구용, 비경구용 또는 직장 투여용, 또는 흡입 또는 통기법에 의한 투여용 단위 제형일 수 있다.

정제와 같은 고체 조성물의 제조를 위해서, 주 활성 성분을 약학적 담체, 예를 들면 옥수수 녹말, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 디칼슘 포스페이트 또는 검과 같은 종래의 정제화 성분, 및 다른 약학적 희석제, 예를 들면 물과 혼합하여, 본 발명의 화합물, 또는 그것의 약학적으로 허용되는 비-독성 염의 균질한 혼합물을 함유하는 고체 예비조제 조성물을 형성한다. 이들 예비조제 조성물이 균질하다고 말하는 경우, 그것은 활성 성분이 조성물 전체에 균일하게 분산되어, 조성물이 정제, 알약 및 캡슐과 같은 동일하게 효과적인 단위 제형으로 용이하게 세분될 수 있다는 것을 의미한다. 그 다음, 이 고체 예비조제 조성물이 본 발명의 활성 성분의 0.1 내지 약 500 mg을 함유하는 상기 설명된 유형의 단위 제형으로 세분된다. 신규한 조성물의 정제 또는 알약은 코팅될 수 있거나, 그렇지 않으면 연장된 작용의 이점을 제공하는 제형을 제공하도록 화합될 수 있다. 예를 들면, 정제 또는 알약은 외부 투약 성분과 내부 투약 성분을 포함할 수 있는데, 외부 투약 성분이 내부 투약 성분을 감싸고 있는 형태이다. 이 두 성분은 장 층에 의해 분리될 수 있고, 위에서의 붕괴를 방지하고, 내부 성분이 손상되지 않고 십이지장을 지나가거나 방출이 지연되도록 허용한다. 그러한 장 층 또는 코팅에는 다양한 재료가 사용될 수 있으며, 그러한 재료는 많은 중합체 산 및 중합체 산과 셸락, 세틸알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 재료의 혼합물을 포함한다.

적합한 표면활성제, 특히 비이온계 제제, 예를 들면, 폴리옥시에틸렌소르비탄(예를 들면, Tween^TM 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄(예를 들면, Span^TM 20, 40, 60, 80 또는 85)가 포함될 수 있다. 표면활성제를 갖는 조성물은 편리하게 0.05 내지 5%의 표면활성제를 포함할 것이고, 0.1 내지 2.5%일 수도 있다. 다른 성분들, 예를 들면 만니톨 또는 다른 약학적으로 허용되는 비히클이 필요하다면 첨가될 수 있다는 것이 인정될 것이다.

적합한 에멀젼은 Intralipid^TM, Liposyn^TM, Infonutrol^TM, Lipofundin^TM 및 Lipiphysan^TM과 같은 상업적으로 이용가능한 유성 에멀젼을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 미리 혼합된 에멀젼 조성물에 용해될 수 있거나, 또는 대안적으로 활성 성분이 오일(예를 들면, 대두유, 홍화유, 면실유, 참깨유, 옥수수유, 또는 아몬드유)에 용해되고, 인지질(예를 들면, 달걀 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과 혼합시에 에멀젼이 형성된다. 에멀젼의 강장도를 조정하기 위해서 다른 성분들, 예를 들면 글리세롤 또는 글루코스가 첨가될 수 있다는 것이 인정될 것이다. 통상적으로 적합한 에멀젼은 20% 이하의 오일, 예를 들면 5 내지 20%의 오일을 함유할 것이다. 유성 에멀젼은 0.1 내지 1.0 ㎛, 특히 0.1 내지 0.5 ㎛의 기름 방울을 포함할 수 있고, 5.5 내지 8.0 범위의 pH를 가진다.

에멀젼 조성물은 신경성장인자 길항제와 Intralipid^TM 또는 그것의 성분(대두유, 달걀 인지질, 글리세롤 및 물)을 혼합하여 제조된 것들일 수 있다.

흡입 또는 통기법에 알맞은 조성물은 약학적으로 허용되는 수성 또는 유기 용매, 또는 이들의 혼합물에 용해된 용액 및 현탁액 및 가루를 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 제시된 바와 같은 약학적으로 허용되는 적합한 부형제를 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 국소 또는 전신적 효과에 적당한 경구 또는 비강 호흡기 경로에 의해 투여된다. 바람직하게 멸균된 약학적으로 허용되는 용매에 용해된 조성물은 기체를 사용하여 분무될 수 있다. 분무되는 용액은 분무장치로부터 직접 호흡되거나, 또는 분무장치가 페이스 마스크, 텐트 또는 간헐적 양압 호흡기에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 가루 조성물은, 적합한 방식으로 제제를 전달하는 장치로부터, 바람직하게는 경구적으로 또는 비강적으로 투여될 수 있다.

치료 효능은 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다.

도 1은 육종 주사 후 10일 및 14일에 2분의 관찰 시간 동안 무의식적 방어자세(guarding) 및 무의식적 위축(flinching)에 의하여 평가한 진행 통증(ongoing pain)을 나타낸 그래프이다. "미투약(naive)"은 어떤 주사도 하지 않은 동물을 말한다. "샴(Sham) + 비히클"은 대퇴골 골수 공간으로 α-최소 필수 배지를 주사하고 그 후 식염수를 주사한 동물을 말한다. "Sarc + 비히클"는 대퇴골 골수 공간으로 육종을 주사하고 그 후 식염수를 주사한 동물을 말한다. "Sarc + 항-NGF"는 대퇴골 골수 공간으로 육종을 주사하고 그 후 항-NGF 항체 911을 주사한 동물을 말한다.
도 2는 육종 주사 후 10일 및 14일에 사지 사용(limb use) 및 강압적 보행 방어자세(로타로드)에 의하여 평가한 보행 통증을 나타낸 그래프이다. "미투약"은 어떤 주사도 하지 않은 동물을 말한다. "샴 + 비히클"은 대퇴골 골수 공간으로 α-최소 필수 배지를 주사하고 그 후 식염수를 주사한 동물을 말한다. "Sarc + 비히클"는 대퇴골 골수 공간으로 육종을 주사하고 그 후 식염수를 주사한 동물을 말한다. "Sarc + 항-NGF"는 대퇴골 골수 공간으로 육종을 주사하고 그 후 항-NGF 항체 911을 주사한 동물을 말한다.
도 3은 육종 주사 후 10일 및 14일에 2분의 관찰 기간 동안 촉진(palpation)-유도 방어자세 및 촉진-유도 위축에 의하여 평가한 접촉-유발 통증을 나타낸 그래프이다. "미투약"은 어떤 주사도 하지 않은 동물을 말한다. "샴 + 비히클"은 대퇴골 골수 공간으로 α-최소 필수 배지를 주사하고 그 후 식염수를 주사한 동물을 말한다. "Sarc + 비히클"는 대퇴골 골수 공간으로 육종을 주사하고 그 후 식염수를 주사한 동물을 말한다. "Sarc + 항-NGF"는 대퇴골 골수 공간으로 육종을 주사하고 그 후 항-NGF 항체 911을 주사한 동물을 말한다.
도 4는 항-NGF 항체는 종양 주사 후 14일에 뼈의 질병 진행에 어떤 영향도 미치지 않는다는 것을 입증하는 사진을 나타낸다. 비히클(샴 + 비히클)로 나타낸 샴 동물(n=8)은 (a) 및 (d)에 나타내고; 비히클(육종 + 비히클)로 나타낸 육종 (GFP 트랜스팩션된) 주사된 동물(n=8)은 (b) 및 (e)에 나타내며; 항-NGF 항체(육종 + 항-NGF)로 나타낸 육종(GFP 트랜스팩션된) 주사된 동물(n=8)은 (c) 및 (f)에 나타낸다. 도 4a 4b 및 4c는 골 파괴의 존재 또는 부재를 나타내는 방사선 사진이다. 도 4d 4e 및 4f는 항-GFP 항체로 면역염색한 것을 나타내는 사진이다.
도 5는 항-NGF 항체 치료가 피부의 감각 신경자극전달에 관찰가능한 효과를 보이지 않는다는 것을 입증하는 사진을 나타낸다. 육종 주사(a, b) 및 미투약(c, d) 마우스의 뒷발 피부를 무수초 펩티드 작용성 감각 신경 섬유를 표지하는 뉴로펩티드 칼시토닌 유전자 연관 펩티드(CGRP)에 대하여 면역염색하였다. 육종 주사 및 비히클 처치(a n=3)한 마우스, 육종 주사 및 항-NGF 항체 처치(b, n=8)한 마우스, 미투약 및 비히클 처치(c, n=8)한 마우스 및 미투약 및 항-NGF 항체 처치(d, n=8)한 마우스의 뒷발 피부 샘플의 CGRP의 면역염색을 나타낸다. 스케일 바: 50 ㎛.
도 6은 항-NGF 처치가 골암 통증을 완화시켰다는 것을 입증하는 그래프를 나타낸다. 2분의 관찰 시간 동안 육종 주사된 사지의 방어자세에 소요된 시간 및 무의식적 위축의 수는 육종 세포를 좌 대퇴골에 주사 및 제한한 후 8, 10, 12 및 14일 진행하는 통증의 척도로 사용되었다(a, b). 움직임-유발 통증의 매개변수는 2분의 관찰 시간 동안 방어자세에 소요된 시간 및 위축의 수, 그 후 육종 주사한 대퇴골의 정상적 무독성 촉진의 정량화를 포함하였다. "#"는 P < 0.05 대 샴 + 비히클을 나타내고; "*"은 P < 0.05 대 육종 + 비히클을 나타낸다.
도 7은 항-NGF 처치가 기준선 열 또는 기계적 역치에 어떤 영향도 미치지 않았고, 골암 통증을 감소하는 데 모르핀(MS) 보다 더 큰 효능을 보였다는 것을 입증하는 그래프를 나타낸다. 도 7a 및 7b는 미투약 마우스에서 항-NGF 처치(10 mg/kg, 복막내, 매 5일)의 기계적 자극의 50% 역치에 의하여 측정한 열 자극 및 기계적 민감성(b, 미투약 + 비히클 n=8, 미투약 + 항-NGF n=8)에 대하여 발 후퇴의 잠복에 의하여 측정한 열 민감성(a, 미투약 + 비히클의 경우 n=8, 미투약 + 항-NGF의 경우 n=8)을 나타낸다. 도 7c 및 7d는 2분의 관찰 시간 동안 무의식적 방어자세(c)를 측정함으로써 평가된 진행 통증 행동 및 2분의 관찰 시간 동안 방어자세에 소요된 시간(d), 그 후 말단 대퇴골의 정상적 무독성 촉진을 측정함으로써 평가된 움직임- 유발 통증을 나타낸다. 미투약, 샴 및 비히클 처치, 육종 주사 및 비히클 처치, 육종 주사 및 모르핀(n=8, 10 mg/kg 복막내 테스트 전 15분 투여) 처치, 육종 주사 및 모르핀(n=8, 30 mg/kg 복막내 테스트 전 15분 투여) 처치 그리고 육종 주사 및 항-NGF 항체(n=8,10 mg/kg, 매 5일, 복막내 종양 주사 후 6일부터 14일까지 투여) 처치 마우스의 무의식적 방어자세(c) 및 촉진-유도 방어자세(d)의 수치를 나타낸다. 에러 바는 S.E.M을 나타낸다. "#"는 P < 0.05 대 샴 + 비히클(n=8)을 나타내고; "*"은 P < 0.05 대 육종 + 비히클을 나타내며; "+"은 P < 0.05 대 육종 + 모르핀을 나타낸다.
도 8은 항-NGF 길항제 항체를 통한 처치는 종양 보유 동물의 배근 신경절(DRG)에서 신경화학적 변화 및 대식세포 침윤을 감소시켰다는 것을 입증하는 사진을 나타낸다. 도 8a 및 8b는 종양 이식 후 14일에 비히클 처치(a, n=8) 및 항-NGF 처치(b, n=8)한 종양 보유 동물의 동측 L2 DRG에서 활성화 전사 인자-3(ATF-3)의 면역형광 염색을 나타낸다. 아래 패널은 비히클 처치(c, n=7) 및 항-NGF 항체 처치(d, n=7)한 종양 보유 동물의 동측 DRG 내의 손상된 감각 뉴런 주변에 활성화되고 침윤하는 대식세포의 밀도를 나타내는 CD-68의 면역형광 염색을 나타낸다.
도 9는 중추 민감화와 연관된 신경화학적 변화가 항-NGF의 투여에 의하여 약화되었다는 것을 입증하는 현미경 사진을 나타낸다. 도 9A 및 9B는 육종 처치 및 비히클 처치 마우스(A, n=9) 및 육종 주사 및 항-NGF 항체 처치 마우스(B, n=4)의 척수의 배측각에서의 다이노르핀의 면역염색을 나타낸다. 도 9C 및 9D는 육종 주사 및 비히클 처치한 마우스(C, n=4) 및 육종 주사 및 항-NGF 항체 처치한 마우스(D, n=4), 그 후 종양 보유 사지의 정상적 무독성 촉진에서 척수의 c-Fos 발현 뉴런의 대표적 공초점 이미지를 나타낸다. 스케일 바: A와 B는 150 μm; C와 D는 200 μm.
도 10은 항-NGF 치료가 전립선암 유도 골암 통증을 약화시켰다는 것을 입증하는 그래프를 나타낸다. 항-NGF 처치(10 mg/kg, 복막내, 종양 주사 후 7일, 12일 및 17일에 투여)는 질병 진행에 걸쳐서 종양 주사 후 7일에 시작한 진행중인 골암 통증 행동을 약화시켰다. 2분의 관찰 시간 동안 ACE-1 주사한 대퇴골에서 방어자세에 소요된 시간 및 무의식적 위축의 수는 진행 통증의 수치로 사용되었다(A, B). 항-NGF(채워진 사각형)는 ACE-1 + 비히클(빈 사각형)에 비해서 종양 주사 동물에서 진행 통증 행동을 감소시켰고, 모든 매개변수(원)에 대하여 9일에 샴 수준에 가깝게 감소되었다. 샴 + 비히클 동물에서 방어자세 및 위축은 질병 진행을 거친 ACE-1 + 비히클 동물과는 현저히 달랐다. 항-NGF 처치는 열 자극에 대한 발 후퇴의 잠복 또는 기계적 자극의 역치의 증가에 의하여 측정한 기초 열 또는 기계적 반응에 어떤 영향도 미치지 않았다(C, D). 항-NGF 처치는 10 mg/kg 또는 30 mg/kg 모르핀(복막내, 테스트 전 15분)보다 19일에 진행 통증 행동의 더 큰 감소를 초래하였다. 움직임-유발 통증은 2분 관찰 시간 동안 방어자세에 소요된 시간 및 위축의 수, 이어서 ACE-1 주사 대퇴골의 정상적 무독성 촉진의 정량화에 의하여 측정하였다(G, H). 에러 바는 S.E.M.을 나타낸다. 도 10A-F의 경우, "#"는 P < 0.05 대 샴 + 비히클을 나타내고; "*"은 P < 0.05 대 ACE-1 + 비히클을 나타내며; "+"은 P < 0.05 대 ACE-1 + 모르핀을 나타낸다. 도 10G 및 10H의 경우, "*"은 P < 0.01 대 샴을 나타내고; "#"는 P < 0.01 대 ACE-1 + 비히클을 나타낸다.
도 11은 항-NGF 항체 처치는 종양 부하 또는 종양-유도 골 개조에 어떤 영향도 미치지 않았다는 것을 입증하는 사진이다. 비히클을 투여한 샴 동물 (A)는 19일에 방사선사진이나 조직학적으로(H&E)(D) 명백한 골 파괴를 보여주지 않았지만, ACE-1 + 비히클 동물(B, E) 및 ACE-1 + 항-NGF 동물(C, F)는 방사선학적 및 조직학적으로 시험했을 때 현저한 종양 성장 및 골 개조를 나타내었다. H=조혈세포; T=종양; WB=ACE-1 유도 골 형성; 스케일 바 = 1.5 mm.
도 12는 항-NGF 요법은 종양 유도 파골세포생성을 현저히 감소시키지 않았다는 것을 입증하는 이미지이다. 샴 + 비히클(A), ACE-1 + 비히클(B) 및 ACE-1 + 항-NGF(C)의 TRAP 염색 이미지는 증식이 샴 + 비히클 및 미투약 + 비히클 동물에 비해서 항-NGF 처치 동물과 비히클 처치 동물의 골간 척수내 부위의 mm² 당 파골세포의 수의 증가로 종양 유도 골 개조의 영역과 함께 이 모델에서 발생하였다는 것을 설명한다. 항-NGF 처치 동물(C)를 비히클 처치 동물(B)와 비교했을 때, 종양 전반에 종양/골계면 또는 대식세포를 따라서 파골세포의 조직학적 모양에는 관찰가능한 차이는 없었다. 샴 + 비히클(A) 동물은 미투약 동물과 현저히 다르지 않은 파골세포 수와 형태 및 대식세포를 나타내었다. 화살표=파골세포; 화살머리=대식세포; MB=광물화된 골; H=조혈세포; T=종양; 스케일 바: 50 μm.
도 13은 항-NGF 요법은 대퇴골의 칼시토닌 유전자 연관 펩티드 면역반응(CGRP-IR) 감각 섬유의 밀도에 영향을 미치지 않았다는 것을 입증하는 사진이다. ACE-1 + 비히클(A) 동물과 ACE-1 + 항-NGF(B) 동물 사이의 CGRP-IR 섬유의 면역형광의 수준 또는 밀도에 관찰가능한 차이는 없었다. 또한, 항-NGR 요법을 통한 CGRP-IR의 유지가 있었음을 주목해야 한다. T=종양; 스케일 바: 50 μm.
도 14는 뒷발 피부의 칼시토닌 유전자 연관 펩티드 면역반응(CGRP-IR) 감각 섬유의 밀도에 영향을 미치지 않았다는 것을 입증하는 사진이다. 미투약 + 비히클(A) 마우스와 미투약 + 항-NGF(B) 마우스 사이에 피부의 CGRP-IR 섬유의 면역형광의 수준 또는 밀도에 관찰가능한 차이는 없었다. 유사하게도, ACE-1 + 비히클(C) 동물과 ACE-1 + 항-NGF(D) 동물 간에 CGRP-IR 신경 섬유의 면역형광의 수준 또는 밀도에 차이는 없었다. 또한, 미투약과 ACE-1 주사 마우스(A, B 대 C, D) 간에 CGRP-IR 신경 섬유의 차이가 없었음을 주목해야 한다. 스케일 바: 50 μm.

설명을 위해 하기 실시예가 제공되지만 본 발명을 제한하지는 않는다.

실시예 1

항-NGF 모노클론 항체는 골 전이와 연관된 암 통증을 치료하는데 효과적이다

본 발명자들은 항-NGF 항체 911을 포함하는 치료의 효능을 평가하기 위해 쥐과 골암 통증 모델을 사용하였다(마우스 모노클론 항체; Hongo, et al., Hybridoma 19: 215-227 (2000) 참조). 골암 통증의 이 쥐과 모델은 마우스 대퇴골로 골 용해성 육종 세포를 골수내 주사함으로써 발생시키고 이어서 바늘 구멍을 치과용 아말감으로 채워서 종양을 뼈로 국한시킨다. 문헌(Schwei et al., J. Neuroscience 19: 10886-10897 (1999); 및 Luger et al., Pain 99:397-406 (2002))을 참조하라. 실험은 성숙한 수컷 C3H/HeJ 마우스에서 수행하였다(Jackson Laboratories, 메인주 바 하버 소재). 0일에, 펜토바르비탈 나트륨(50 mg/kg, 복막내(i.p.))으로 일반적인 마취를 도입한 후 관절 절개술을 수행하였다. 바늘을 골수 공간으로 삽입하여 육종 세포를 위한 경로를 생성하였다. 이어서, 공기압 고속 핸드피스를 사용하여 저기압을 만들었다. 미투약 동물(n=5) 외에, 샴 동물(n=5)은 대퇴골의 골수내 공간으로 α-최소 필수 배지(20 ㎕, Sigma, 미주리주 세인트 루이스 소재)의 주사로 생성시키는 반면(샴이라고 칭함), 육종 동물(테스트된 각 조건에서 n=5)은 10⁵2472 골 용해성 육종 세포를 함유하는 배지(20 ㎕, ATCC, 메릴랜드주 로크빌 소재)로 주사한다(육종 또는 sarc라고 칭함). 모든 동물에 대하여, 주사 부위를 치과용 아말감 플러그로 밀봉하여 세포를 국한시키거나 골수내 공간으로 배지를 주사한 다음 멸균수(저장액)로 세척하였다. 마지막으로, 상처 클립으로 절개를 봉합하였다. 행동에 관한 테스트를 방해하지 않기 위해 5일에 클립을 제거하였다. 육종-주사된 동물의 두 번째 군은 6일 및 13일에 항-NGF(10 mg/kg, 복막내)로 처리하였다.

행동에 관한 분석. 종양 이식 후 10일 및 14일에 동물을 통증-관련 행동에 대하여 테스트하였다. 다음의 테스트를 사용하여 동물을 행동에 관하여 테스트하였다: 진행 통증(무의식적 방어자세 및 위축); 보행 통증(사지 사용 및 로타로드(rotarod)) 및 움직임-유발 통증(촉진(palpation)-유발 방어자세 및 촉진-유발 위축). 동물을 철망 바닥으로 된 투명한 플라스틱 관찰 상자에 두고 30분의 기간 동안 익숙해지도록 하였다. 환경 적응 후, 무의식적 방어자세, 무의식적 위축, 개방 지면에서 정상 보행 중에 사지의 사용 및 강압적 보행 중 방어자세를 평가하였다. 촉진-유도 방어자세 및 위축을 육종- 및 샴-주사된 동물에서 대퇴골 말단의 정상적인 비독성 촉진 2분 후에 측정하였다.

무의식적 위축의 수 및 자극에 대한 행동으로서 대표적인 방어자세에 소비하는 시간을 2분 관찰 기간 동안 동시에 기록하였다. 방어자세는 보행 중에 뒷발을 위로 올린 시간으로서 정의하였으며, 위축은 동물이 사지를 위로 올리고 있는 횟수였다.

무의식적 보행 중 정상적 사지 사용은 5 내지 0의 스케일로 기록하였다: (5) 정상 사용, 및 (0) 사지 사용의 완전한 결여.

강압적 보행의 방어자세는 로타로드(Columbus Instruments, 오하이오주 콜럼버스 소재)를 사용하여 결정하였다. 로타로드 기계는 회전 막대를 가지며 속도, 가속 및 민감성 제어 장치를 구비하고 있다. 동물을 4 배속, 8.0 가속 및 2.5 민감성을 갖는 막대 위에 두었다. 강압적인 보행 방어자세는 5-0의 스케일로 등급을 매겼다: (5) 정상 사용 및 (0) 사용의 완전한 결여.

2분 동안 매초 동물에서 대퇴골 말단의 정상적 비독성 촉진을 행한 후, 동물을 관찰 상자에 두고 이들의 촉진-유도 방어자세 및 촉진-유도 위축을 추가 2분 동안 관찰하였다.

항-NGF 항체에 의한 치료. 6일 및 13일에, 육종-주사된 동물에 10 mg/kg으로 항-NGF 항체 911을 복막내(i.p.) 주사하거나(sarc + 항-NGF, n=5), 또는 육종- 및 샴-주사된 동물에 식염수로 주사하였다(복막내)(샴 + 비히클 또는 sar + 비히클, 각 조건에 있어서 n=5). 모든 동물을 10일 및 14일에 행동에 관하여 분석하였다.

진행 통증 행동의 평가. 도 1에서 나타낸 바와 같이, 육종-주사된 동물(식염수와 함께 투여됨)은 샴-주사된 동물(식염수와 함께 투여됨)과 비교하여 무의식적 방어자세 및 무의식적 위축(둘 다 p < 0.05, ANOVA)으로 평가되는 바와 같이 진행 통증 행동을 발생시켰다. 또한, 도 1은 항-NGF 항체 911의 복막내 투여가 육종-주사된 마우스(p < 0.05, ANOVA, 무의식적 방어자세 및 무의식적 위축 모두에 대한 것)에 식염수를 투여한 것과 비교하여 육종 이식 후 10일 및 14일에 육종-주사된 마우스에서 무의식적 방어자세 및 무의식적 위축을 현저히 감소시켰음을 보여준다. 이들 결과는 항-NGF 항체 911이 육종-주사된 마우스에서 진행 통증을 감소시켰음을 나타낸다.

보행 통증 행동의 평가. 도 2에서 나타낸 바와 같이, 육종-주사된 동물(식염수와 함께 투여됨)은 샴-주사된 동물(식염수와 함께 투여됨)과 비교하여 사지 사용 및 강압적 보행 방어자세(로타로드)(둘다 p < 0.05, ANOVA)로서 평가되는 바와 같이 보행 통증 행동을 발달시켰다. 또한, 도 2는 항-NGF 항체 911의 투여가 육종-주사된 마우스(p < 0.05, ANOVA, 무의식적 방어자세 및 무의식적 위축 모두에 대한 것)에 식염수를 투여한 것과 비교하여 육종 이식 10일 및 14일에 육종-주사된 마우스에서 (정상에 더 가까운) 사지 이용 점수 및 강압적 보행 방어자세 점수를 현저히 증가시켰다. 이들 결과는 항-NGF 항체 911이 육종-주사된 마우스에서 보행 통증을 감소시켰음을 나타낸다.

접촉-유발 통증 행동의 평가. 도 3에서 나타낸 바와 같이, 육종-주사된 동물(식염수와 함께 투여됨)은 샴-주사된 동물(식염수와 함께 투여됨)과 비교하여 촉진으로 유도된 방어자세 및 촉진으로 유도된 위축(둘 다 p < 0.05, ANOVA)으로 평가되는 바와 같이 접촉-유발 통증 행동을 발생시켰다. 또한, 도 3은 항-NGF 항체 911의 복막내 투여가 육종-주사된 마우스(p < 0.05, ANOVA, 촉진-유도 방어자세 및 촉진-유도 위축 모두에 대하여)에 식염수를 투여하는 것과 비교하여 육종 이식 10일 및 14일 후 육종-주사된 마우스에서 촉진-유도 방어자세 및 촉진-유도 위축을 현저히 감소시켰음을 보여준다. 이 결과들은 항-NGF 항체 911이 육종-주사된 마우스에서 접촉-유발 통증을 감소시켰음을 나타낸다.

실시예 2

항-NGF 모노클론 항체는 골암 통증을 치료하는데 효과적이며 배근 신경절 및 척수에서 말초 및 중추 민감화와 관련된 몇몇 신경화학적 변화를 감소시킨다

방법

동물. 실험은 20-25 g 중량의 총 158 마리의 성인 수컷 C3H/HeJ 마우스(Jackson Laboratories, 메인주 바 하버 소재)에서 수행하였다. 마우스를 12 시간 교대의 광주기 및 암주기로 22℃에서 유지되는 가압증기멸균된 케이지 안에서 특정 병원균 부재(SPF) 하에 국립 보건원(National Institutes of Health) 지침에 따라 사육하였으며 임의로 가압증기멸균된 먹이와 물을 제공하였다.

종양 세포의 배양 및 주사. 골 용해성 쥐과 육종 세포를 입수하고(NCTC 2472, ATCC, 메릴랜드주 로크빌 소재), 녹색 형광 단백질(GFP)로 트렌스펙션하였으며 문헌(Sabino et al., Cancer Res. 62:7343-9 (2002))에서 전술한 바와 같이 유지시켰다.

종양 세포의 주입은 전술한 바와 같이 수행하였다. Honore et al., Nat. Med. 6:521-8 (2000); Honore et al., Neuroscience 98:585-598 (2000); Luger et al., CancerResearch 61:4038-4047 (2001). 간단히 말하면, 펜토바르비탈 나트륨(50 mg/kg, 복막내(i.p.))으로 일반적인 마취를 유도한 후 관절 절개술을 수행하여 대퇴골 말단의 관절구를 노출시켰다. 행크 완충 멸균 식염수(HBSS, Sigma Chemical Co., 미주리주 세인트 루이스 소재; 20 ㎕; 샴, n=40) 또는 10⁵ 골 용해성 쥐과 육종 세포를 함유하는 배지(20 ㎕, NCTC 2472, ATCC, 메릴랜드주 로크빌 소재; 육종, n=90)를 마우스 대퇴골의 골수내 공간으로 주사하고 주사 부위를 치과용 아말감(Dentsply, 델라웨어주 밀포드 소재)으로 밀봉한 다음, 멸균 여과액으로 세척한다. 14일 종점이 사용되었는데, 이것은 종양이 골에 여전히 국한되며, 암-관련 통증 행동의 최대 표현이 존재하며, 말초 및 중추 민감화의 신경화학적 마커의 발현에 있어서 최대의 변화가 존재하는 시점이기 때문이다. 미투약 동물은 행동적, 신경화학적 또는 조직학적으로 두드러지게 상이하지 않았으므로, 샴 동물이 신경화학적 변화 및 골 조직학의 대조군 분석을 위해 사용되었다.

항-NGF 항체에 의한 치료. 통증 관련 행동, 신경화학적 변화, 종양 성장 및 골 파괴에 있어서 항-NGF 항체 치료의 효과를 평가하기 위해, 항-NGF 항체(mAb 911, (Hongo, et al., Hybridoma 19: 215-227 (2000))에 기재됨)를 관찰 가능한 골 파괴가 시작되는 때인 투여 후 6일에 투여를 시작하였고(10 mg/kg/5일 마다, 복막내) 현저한 골 파괴 및 통증 행동이 관찰되는 때인 투여 14일 후에 종결하였다. 본 연구에서 사용된 투여량은 미투약 마우스에서 통각 감퇴와 같은 부작용을 유발하였다. 마우스의 일반적 건강 상태를 모니터링하기 위해, 실험의 처음과 마지막에 중량을 기록하였다.

마우스를 주1회 멸균 식염수(샴 + 비히클: n=28; 육종 + 비히클; 1.4 ㎕/g/5일 마다, 복막내) 또는 항-NGF 항체(샴 + 항-NGF; n=4; 육종 + 항-NGF: n=23, 10 mg/kg/5일 마다, 복막내)를 제공받는 처리 군으로 무작위 배치하였다. 황산 모르핀에 대한 항-NGF 항체의 행동적 비교를 위해, 행동 테스트 15분 전에 소정량의 모르핀을 제공하였다(미투약: n=6; 샴 + 비히클: n=8; 육종 + 비히클: n=8; 육종 + 항-NGF: n=8; 육종 + 모르핀 10 mg/kg, 복막내: n=8; 육종 + 모르핀 30 mg/kg, 복막내: n=8). 열 및 물리적 힘에 의한 민감화 테스트 및 뒷발 피부 신경 분포를 평가하기 위해, 마우스를 2주 동안 주1회 멸균 식염수(미투약 + 비히클: n=11) 또는 항-NGF 항체(미투약 동물 + 항-NGF: n=11, 10 mg/kg/5일 마다, 복막내)를 제공받는 2개의 치료군으로 나누었다.

항-NGF 항체의 특성화. NGF 길항제 항체(mAb 911)는 Trk A 및 p75 NGF 수용체에 대한 NGF의 결합을 차단하고 Trk A 자기인산화를 억제하며 배근 신경절 감각 뉴런의 NGF-의존성 생존을 차단하는데 효과적이다. Hongo, et al.,Hybridoma 19:215-227 (2000).

안락사 및 조직의 가공처리. 마우스를 종양 주사 14일 후에 희생시키고 조직을 전술한 바와 같이 척수, 배근 신경절(DRG) 그리고 뒷발 피부에 대한 면역조직화학적 분석을 위해 가공 처리하였다. Honore et al., Nat. Med. 6:521-8 (2000); Luger et al., Cancer Research 61:4038-4047 (2001). 간단히 말해서, 마우스는 c-Fos 발현의 유도를 위해 안락사 1.5시간 전에 주사된 무릎에 정상적으로 비독성 물리적 자극을 받았다. Honore et al., Neuroscience 98:585-598 (2000); Hunt et al., Nature 328:632-634 (1987). 이 조작 후, 마우스를 CO₂로 안락사시키고 12 ml 0.1 M 인산염 완충 식염수(PBS)로 심장내 관류시키고 25 ml 4% 포름알데히드/12.5% 피크르산 용액을 관류시켰다.

척수 단편(L2-L4), DRG(L1-L5) 및 발바닥 피부를 떼어내어 관류 고정액에 후-고정시키고 24시간 동안 30% 수크로스에 냉동보존하였다. 두께가 60 μm인 연속의 냉동된 척수 및 피부 단편을 활주형 마이크로톰 상에서 절단하고, PBS에 모아 부동성 단편으로 가공 처리하였다. 두께가 15 μm인 연속의 DRG 단편을 저온유지장치 위에서 절단하고 가공처리를 위해 젤라틴 코팅된 슬라이드 위에서 해동시켰다.

단편으로 나눈 후, DRG, 척수 및 발바닥 피부 단편을 잠깐 동안 PBS에 헹군 다음 1시간 동안 차단 용액(PBS 중 3% 정상 당나귀 혈청(NDS) 0.3% Triton X-100)에서 인큐베이션한 후 1차 항체에서 밤새 인큐베이션하였다. 척수 단편을 c-Fos 단백질(1:2000, Oncogene Research, 캘리포니아주 샌디에고 소재) 및 다이노르핀(폴리클론 돼지쥐 항-다이노르핀, 1:1,000, Neuromics, 미네소타주 미네아폴리스 소재)에 대하여 면역염색하였다. DRG 단편을 전사 인자 3(ATF-3)(폴리클론 래빗 항-ATF-3, 1:500, Santa Cruz Biotechnologies, 캘리포니아주 산타크루즈 소재) 및 CD68(ED-1; 폴리클론 래트 항-CD68, 1:5,000, Serotec, 노스캐롤라이나주 랄리 소재)을 활성화하기 위해 면역염색하였다. 피부 단편을 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP)(1:15,000; Sigma, 미주리주 세인트 루이스 소재), 티로신 수산화효소(TOH)(폴리클론 래빗 항-TOH, 1:2,000, Chemicon, 캘리포니아주 테미큘라 소재) 및 신경 미세섬유 H(클론 RT97)(폴리클론 래빗 항-RT-97, 1:2,500, Chemicon, 캘리포니아주 테미큘라 소재)에 대하여 면역염색하였다.

1차 항체에서 인큐베이션한 후, 단편을 잠시 동안 PBS에서 헹군 다음 3시간 동안 2차 항체 용액에서 인큐베이션하였다. Cy3 또는 비오틴에 결합된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재)를 각각 1:600 또는 1:500에서 사용하였다. 비오틴에 결합된 2차 항체를 검출하기 위해, 2차 인큐베이션 후에 단편을 PBS에 헹구고 45분 동안 Cy3 결합된 스트렙타비딘(1:4000; Jackson ImmunoResearch)에서 인큐베이션하였다. 1차 항체의 특이성을 확인하기 위해, 대조군은 1차 항체를 누락하거나 대응하는 합성 펩티드로 사전 흡수를 포함하였다. 면역염색 과정 후에, 척수 및 발바닥 피부 단편을 젤라틴 코팅된 슬라이드 위에 고정시켰다. 그 후, 피부, 척수 및 DRG의 고정된 단편을 알콜 기울기(70, 90, 100%)로 탈수시키고, 자일렌에서 정화하고 커버슬립을 DPX(Fluka, 스위스)로 고정시켰다.

방사성 물질에 의한 조사 후, 14일에, 우측(내부 대조군) 및 좌측(종양-함유) 대퇴골을 4℃에서 밤새 피크르산 및 4% 포르말린에서 고정시키고 14일 이상 10% EDTA(Sigma., 미주리주 세인트루이스 소재)에서 석회질을 제거한다. 이어서 골을 파라핀 속에 끼워 두었다. 두께가 5 μm인 대퇴골 단편을 외측면에서 절단하고 타르타르산-저항성 산성 포스파타제(TRAP) 및 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여 정상 골수, 종양, 파골세포 및 대식세포의 조직학적 특징을 시각화하였다. 형광 현미경을 사용하여 육종 세포를 시각화하기 위해, 두께 5 μm의 대퇴골 단편을 녹색 형광 단백질(GFP)(래빗 항-GFP, 1:6,000, Molecular Probes, 오레곤주 유진 소재)에 대하여 향하게 된 항체로 염색하였다. 문헌(Sevcik et al., Pain 111:169-80 (2004))에서 전술한 바와 같이, TSA-플러스 시아닌 3 시스템(PerkinElmer Life Sciences, Inc., 메사추세츠주 보스턴 소재)을 사용하여 GFP 염색을 수행하였다.

샴 및 암에 걸린 대퇴골의 면역조직화학적 분석은 칼슘제거되고, 파라핀에 끼워둔 14 μm의 연속 단편에서 수행하였다. 티라민 신호 증폭(TSA) 시스템 (Perkin Elmer life Sciences, 메사추세츠주 보스턴 소재)을 사용하여 Cy3 표지 항체를 증폭하였다. 내인성 퍼옥시다제는 1시간 동안 2% 과산화수소에서 상기 단편들을 인큐베이션함으로써 켄칭시켰다. 이어서 단편을 10분 동안 PBS로 3번 헹구고 1시간 동안 TSA 차단 완충액에서 블로킹시켰다. 1차 항혈청을 차단 완충액 제거시 첨가하고 밤새 실온에서 인큐베이션 하였다. 1차 구심성 무수초 및 얇은 수초 감각 신경 섬유를 폴리클론 래빗 항-칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP)(1:15,000; Sigma)에 대하여 향하게 된 항체를 사용하여 표지하였다. 단편을 10분 동안 TSA 완충액에 3회 헹군 다음 스트렙타비딘 HRP(1:4,000)에서 45분 인큐베이션하였다. 그 다음, 단편들을 10분 동안 TSA 세척 완충액으로 3회 헹구었다. CY3-결합된 티라민(1:600)을 7분 동안 대퇴골에 적용하고, TSA 세척 완충액으로 2회 및 PBS로 1회 세척하였다. 마지막으로, 단편을 공기 건조시키고, 알콜 기울기(70, 90 및 100%)를 이용하여 탈수시키고, 자일렌에서 정화하고 DPX(Fluka)로 고정시켰다.

골의 방사선 촬영 및 파골세포 및 대식세포 증식 분석. 골 파괴를 최적으로 평가하기 위해 해부된 대퇴골의 방사선 사진(Faxitron X-ray Corp., 일리노이주 휠링 소재)을 14일 시점에 얻었다. 영상은 Kodak Min-R 2000 유방촬영술 필름(Eastman Kodak Co., 뉴욕주 로체스터 소재; exposure settings: 7 초, 21 kVp) 상에서 캡쳐하였다. 종양으로 유도된 대퇴골 파괴의 범위는 0 내지 5 스케일(0, 파괴의 흔적이 없는 정상 골 및 5, 전체 두께 양측 피질 골 손실)을 사용하는 5 배율로 전체 골 영상의 외측면에서 방사선으로 평가하였다. Honore et al., Nat. Med. 6:521-8 (2000); Honore et al., Neuroscience 98:585-598 (2000); Luger et al., Cancer Research 61:4038-4047 (2001).

파골세포 및 종양 관련 대식세포(TMS) 증식은 전술한 바와 같이 TRAP 염색된 대퇴골 단편 상에서 TRAP+ 파골세포 또는 TAM의 수를 정량함으로써 결정하였다. Honore et al., Nat. Med. 6:521-8 (2000); Honore et al., Neuroscience 98:585-598 (2000). 간단히 말해서, TAM은 종양 덩어리 전반에 무작위로 그리고 다양한 크기로 분포되어 있는 TRAP+ 세포로서 TRAP로 염색된 대퇴골 단편 상에서 파골세포로부터 조직학적으로 분화된다. 골 내에서 대식세포는 세포를 자극하는 종양 방출 인자로 인하여 활성화되며, 이들 활성화된 TAM의 세포 구심성은 매우 불규칙한 표면, 다중 라멜리포듐 및 포식세포 액포로서 특징 지워진다. 파골세포는 세포 출현 TRAP+를 나타내는 세포로서 조직학적으로 분화되며 골 흡수의 영역과 밀접하게 관련된다. 이들 세포는 다핵으로 이루어져 있으며 피질 및 섬유주 골과 함께 발견된다. 결과는 각각 mm 당 파골세포 또는 mm²당 TAM의 평균 수로서 표현된다.

종양 성장의 정량화. GFP-발현 육종 세포를 함유하는 대퇴골을 SPOT 이미지 캡쳐 소프트웨어(Diagnostic Instruments, 미시간주 스터링 하이츠 소재)를 이용하는 SPOT II 디지털 카메라를 구비한 Nikon E600 형광 현미경 상에서 황색 515 nm 길이 통과 방출 필터를 사용하여 조영하였다. 골수내 공간의 총 면적 및 종양이 차지하는 골수내 공간의 백분율을 Image Pro Plus v3.0 소프트웨어(Media Cybernetics, 메릴랜드주 실버 스프링 소재)를 사용하여 계산하였다. Sabino et al., Cancer Res. 62:7343-9 (2002); Sevcik et al., Pain 111:169-80 (2004). GFP로 트렌스펙션된 육종 세포의 종양 특징, 예를 들면 성장율, 골 재흡수율 및 골암 관련 통증 행동을 유도하는 능력은 트렌스펙션되지 않은 육종 세포와 일시적으로, 행동적으로 그리고 물리적으로 동일하였다. Sabino et al., Cancer Res. 62:7343-9 (2002).

골 내 감각 섬유의 정량화. 감각 신경 섬유의 수는 전술한 바와 같이 결정하였다. Mach et al., Neuroscience 113:155-66 (2002). 간단히 말해서, 3개의 골 영역(근위, 말단 및 골간) 및 3개의 골 조직(골막, 광물화 골 및 골수)에서 CGRP 양성 섬유의 수를 정량하였다. 길이가 30 μm 이상인 신경 섬유만을 분석에 포함시켰다. 각 동물당 6개의 단편을 분석하고, 계수된 섬유를 총 골 면적당 섬유로서 표현하였다.

척수, 배근 신경절 및 뒷발 피부의 정량화. 형광으로 표지된 척수, DRG 및 피부 조직 단편을 MRC 1024 공초점 현미경 조영 시스템(Bio-Rad, 펜실베니아주 필라델피아 소재), 또는 SPOT 이미지 캡쳐 소프트웨어를 포함하는 올림푸스 BX-60 형광 현미경 상 SPOT II 디지털 카메라(Diagnostic Instruments, Inc.)를 사용하여 분석하였다.

활성화 전사 인자 3(ATF-3)을 발현하는 DRG 뉴런의 수를 1 cm² 접안 렌즈 격자와 함께 200 배율로 계수하였다. 뉴런(소, 중 및 대)의 총 수는 표지된 뉴런 세포체 및 비표지된 뉴런 세포체 모두를 계수하여 결정하였고(비표지된 세포체는 로다민 또는 FITC 필터를 통해 조사될 수 있는 배경 표지를 보임) 결과는 STF-3-면역반응성(IR)을 나타내는 뉴런의 총 수의 백분율로서 표현되었다. 뉴런 세포체를 두 배로 계수하는 것을 방지하기 위해, 각 마커에 대하여 모두 4번째 연속 단편 상에서 계수를 수행하였다. DRG 내 활성화 또는 침윤 대식세포를 정량하기 위해, SPOT 카메라 그레이 스케일 이미지를 각 동물마다 최소 4개의 동측성 및 대측성 DRG 단편 상에서 얻었으며 Image Pro Plus 버전 3.0 소프트웨어(Media Cybernetics)를 사용하여 분석하였다. 각 이미지에 대하여, 감각 뉴런 세포체(말초 신경 제외)만을 함유하는 DRG의 영역의 윤곽을 그렸다. 모니터를 보는 동안, 그레이 수준 밀도의 상급 및 하급 역치를 설정하여 특이적 CD68-IR 세포 프로파일만을 윤곽으로 나타낸 DRG에 있는 배경과 구별하였다. 세포 프로파일의 수는 각 단편마다 자동으로 계산하였다. SPOT 카메라 결과를 Image Pro Plus에서 눈금을 정하여 얻은 이미지 내에 각각 윤곽으로 나타낸 영역의 실제 부위를 결정할 수 있다. CD68-IR 세포 프로파일에 대한 단편 값 및 윤곽으로 나타낸 이미지를 각각의 동물에 대하여 합하였고 결과를 각 단위 영역(mm²)에 대한 CD68-IR 세포 프로파일의 총 수로서 나타내었다.

정량은 이들 척수 단편이 L1-L3 DRG로부터 현저한 구심성 투입을 받기 때문에 요추 수준 L2-L4의 척수 단편에서 수행하였는데, 이는 마우스 대퇴골에 구심성 투입을 제공하는 주요한 신경절이다. Edoff et al., Cell & Tissue Research 299:193-200 (2000); Molander C,J. Comp. Neurol. 260:246-255 (1987); Puigdellivol-Sanchez A et al., the Anatomical Record 260:180-188 (2000); Puigdellivol-Sanchez A et al., Neurosci. Lett. 251:169-172 (1998). 다이노르핀에 대한 척수 단편의 정량은 각 동물당 4개의 무작위로 선택된 L2-L4 관상 척수 단편으로부터 얻었다. 척수 층 III-VI 내 다이노르핀-IR 뉴런의 수는 100 배율로 계수하였으며 각 동물 당 60 μm L2-L4 단편마다 뉴런의 평균 수로서 나타내었다. c-Fos-IR 뉴런의 수는 각 동물당 8개의 무작위로 선택된 L3/L4 관상 척수 단편 내 후각의 척추각 III-VI에서 계수하였다. c-Fos-IR을 고려하여, 핵 프로파일의 면역 형광성 역치는 조직 단편의 평균 배경 면역 형광성 수준을 3배로 하였다. 결과는 척수 단편 당 c-Fos-IR 뉴런의 평균 수로서 제공된다.

표피 신경 분포의 정량은 각 동물당 4개의 무작위로 선택된 뒷발 발바닥 피부 단편에서 수행하였다. CGRP, TOH 및 RT97-IR 신경 섬유의 총 수는 200x 배율로 계수하였다. 단지 하나의 표피내 섬유만을 계수하고 동일한 섬유에서 여러 개의 가지를 계수하지 않기 위해 계수 규칙을 확립하였다. McCarthy et al., Neurology 45:1848-55 (1995). 정량된 모든 단편 내 표피의 총 길이는 1 cm² 접안 렌즈 격자를 사용하여 측정하였다. 길이가 적어도 25 μm이고, 외부 표피로 투입한 신경 섬유만을 계수하였다. 결과는 각 동물당 mm 길이 마다 표피내 신경 섬유의 평균 수로서 제공된다.

행동 분석. 마우스를 10일 및 14일에 골암 통증 관련 행동에 대하여 분석한 후 통증 행동이 항-NGF 치료의 효능을 평가하기에 상당히 명백한 때 샴 또는 종양 주사를 하였다. 항-NGF 치료를 모르핀(Baxter, Deerfield, IL; 10 mg/kg, 복막내) 치료와 비교하였으며 동물이 약물 행동의 치료적 창 내에서 테스트되는 것을 확실시하기 위해 행동 테스트 15분 전에 투여하였다. Hasselstrom et al., Pharmacology & Toxicology 79:40-6 (1996).

또한, 마우스를 8, 10, 12 및 14일에 테스트한 다음 질병의 진행에 따른 통증 관련 행동을 경감시키는데 있어서 항-NGF 치료(10 mg/kg/5일 마다, 복막내)의 효능을 평가하기 위해 종양 또는 샴 주사하였다. 동물을 2분의 기간에 걸쳐서 관찰하였으며 촉진-유발 골암 통증 행동을 전술한 바와 같이 분석하였다. Luger et al., Pain 99:397-406 (2002); Sabino et al., Cancer Res. 62:7343-9 (2002); Sabino et al., International Journal of Cancer 104:550-558 (2003). 간단히 말해서, 뒷발 위축의 수 및 방어자세를 취하는 시간을 진행 통증의 측정치로서 기록하였으며, 이들 측정치는 그들의 종양-보유 사지를 보호하거나 정지시키는 골암을 갖는 임상적 세팅에서의 환자를 반영한다. 본 모델에서, 주사된 사지의 촉진으로 인한 움직임-유발 통증을 앞에서 확인한 테스트를 사용하여 평가하였다. Luger et al., Cancer Research 61:4038-4047 (2001); Sabino et al., International J. of Cancer 104:550-558 (2003); Sevcik et al., Pain 111:169-80 (2004). 촉진-유발 통증 행동은 동물이 관찰 전 2시간 동안 종양- 또는 샴-주사된 사지에 정상적으로 비독성 촉진을 받은 곳에서 조사하였다. Luger et al., Cancer Research 61:4038-4047 (2001); Sevcik et al., Pain 111: 169-80 (2004). 마우스를 2분 동안 모니터링하였고, 위축의 수 및 방어자세를 취하는 시간을 기록하였다. 촉진-유발 행동 테스트는 골암에 걸린 환자가 통증을 경험한 다음 정상적으로 종양-함유 사지의 비독성 움직임을 경험한 때 임상적 상태를 반영하도록 개발되었다.

15분 가속 기간 후에, 미투약 및 미투약 + 항-NGF 동물에서 열 및 기계적 민감성을 측정하여 정상 통증 역치 반응이 항-NGF 처리로 변화되는지 여부를 평가하였다. 열 민감성은 Thermal Paw Stimulator(University of California, San Diego, 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 사용하여 측정하였다. 미투약 동물은 열이 개시되고 약 9초 후에 뒷발을 위로 올림으로써 열에 대하여 반응하도록 방사열의 강도를 조절하였다. Choi et al., Life Sci. 73:471-85 (2003). 마우스가 각 실험 사이에 회복하도록 5분을 허용하였다. 단일 실험은 각 뒷발 당 4개의 측정치로 이루어졌으며, 장기간의 잠복기를 보냈으며 나머지의 3개의 측정치를 평균내었다. 앞서 확인한 방법을 사용하여 기계적 민감성을 측정하였다. Chaplan et al., J. Neuroscience Methods 53:55-63 (1994). Von Frey 필라멘트(Stoelting Co., 일리노이주 우드데일 소재)를 동물의 뒷발에 적용시키고, 후퇴 역치는 힘의 0.2 내지 15.1 그램 당량의 자극 강도를 증가 및 감소시킴으로써 결정하였다. 양성 반응은 발이 빠르게 뒤로 물러나는지 여부를 나타냈다.

2472 세포주 내 NGF의 mRNA 수준의 RT PCR 분석. 3개의 마우스 조직 샘플 또는 2472 육종 세포로부터의 전체 RNA는 RNeasy 마이크로 키트(Qiagen)을 사용하여 제조업자의 설명에 따라 제조하였으며, RNA는 Ribogreen 시약(Molecular Probes)을 사용하여 정량하였다. 2 단계 RT-PCR을 TaqMan Gold RT-PCR 키트(Applied Biosystems)을 사용하여 수행하였다. RNA는 무작위의 헥사머를 사용하여 역전사되었으며, cDNA는 NGF(muNGF-187F: GGGCTGGATGGCATGCT (SEQ ID NO:3), muNGF-256R: GCGTCCTTGGCAAAACCTT (SEQ ID NO:4), muNGF-208T: CCAAGCTCACCTCAGTGTCTGGGCC (SEQ ID NO:5))에 대해 특이적인 프라이머/프로브 세트를 사용하여 증폭시켰다. 샘플을 RT 수준에서 2번 분석하였으며 총 RNA 투입으로 정상화하였다.

통계적 분석. SPSS 버전 11 컴퓨터 통계 패키지(SPSS, 일리노이주 시카고 소재)를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 혼합형 결과 선형 회귀 모델링을 사용하여 반복 측정 데이타를 분석하였으며, 이는 상이한 시간 간격에서 측정된 피험체에 적응시킬 수 있으며, 고정 및 시간 변화의 공변 모두를 포함하고, 변화의 각각의 비율을 평가할 수 있다. 각각의 독립적 결과 변수를 가변 조건의 비-매개 분석을 사용하여 군에 따라 비교하였다(Kruskal-Wallis). 유의한 Kruskal-Wallis 분석을 한 다음 Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 짝을 이룬 군들 간의 비-매개변수 사후 검정 비교를 행하였다. 결과는 P < 0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 여겨진다. 모든 경우에, 조사자에게 각 동물의 실험적 상태를 숨기고 실험하였다.

결과

항-NGF 투여는 골에서 질병 진행이나 대식세포 침윤에 영향을 미치지 않았다. 골 파괴, 파골세포 증식 및 종양 성장에 있어서 항-NGF 치료의 효과는 종양 투여 14일 후에 조사하였다. 샴-주사된 마우스는 방사성 TRAP 및 H&E/GFP 분석에 의해 평가한 바와 같이, 각각 육종- 주사된 마우스와 비교하여, 현저한 골 파괴(골 점수 0.9±0.4; 도 4a), 파골세포 증식(4.6±0.4 파골세포/mm) 또는 종양 성장(도 4d)를 보이지 않았다. 육종 + 비히클 마우스에서, 다초점 방사선 투과(골 점수 3.5±0.2; 도 4b)에 의해 관찰되고 특성화되는 바와 같이 광범위한 골 파괴가 존재하였으며, 파골세포의 수(4.0±0.7 파골세포/mm) 및 종양의 수에서의 현저한 증가가 골수내 공간을 완전하게 채웠다(골수내 공간의 100±0.0%; 도 4e). 종양 주사 6 내지 14일 후 항-NGF를 포함하는 종양 함유 마우스의 치료는 육종 + 비히클 동물과 비교하여 골 흡수(3.1±0.6; 도 4c)의 현저한 변화, 육종으로 인한 파골세포 증식 (3.5±0.1 파골세포/mm) 또는 종양 성장(골수내 공간의 98.0±0.9%; 도 4f)에 있어서의 감소를 가져오지 않았다.

종양 주사 14일 후에, 육종 + 비히클 마우스는 샴 + 비히클 대조군 마우스(0.0±0.0 TAM/mm²)와 비교하여 TAM(39.8±12.6 TAM/mm²)의 상향 조절을 나타내었다. 육종-주사된 마우스(29.5+7.3 TAM/mm²)의 항-NGF 치료는 육종 + 비히클 마우스에서 나타낸 바와 같이 이 TAM 침윤을 현저히 변화시키지 않았다.

항-NGF 치료는 골 또는 피부 감각 또는 교감 신경 분포에 관찰가능한 영향을 미치지 않았다. 얇은 수초 또는 무수초 감각 신경 섬유를 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP)에 대하여 유도된 항체로 표지하였다. CGRP-IR 신경 섬유를 미투약 + 비히클(12.2±0.3 섬유/mm) 및 미투약 + 항-NGF(13.0±0.8 섬유/mm) 동물 모두의 전체 골(골막, 광물화 골 및 골수)에서 발견하였다.

얇은 수초 또는 무수초 감각 신경 섬유(CGRP-IR), 큰 수초 감각 섬유(RT97-IR) 및 노르아드레날린 교감 신경 섬유(TOH-IR)를 각각 CGRP, RT-97 및 TOH에 대하여 향하게 된 항체에 의해 뒷발 발바닥 피부에서 분석하였다. 육종 + 비히클(12.0±0.8 섬유/mm) 및 육종 + 항-NGF(12.5±0.6 섬유/mm) 뒷발 피부 샘플(도 5a 및 5b) 내 CGRP 양성 섬유의 강도 또는 밀도 간에 현저한 차이가 없었다. 이와 유사하게, 미투약 + 비히클(도 5c, n=8) 마우스 및 미투약 + 항-NGF(도 5d, n=8) 마우스 간 CGRP 양성 섬유의 강도 또는 밀도에 있어서 차이가 없었다. 육종-주사 및 미투약 마우스(a,b 대 c,d)에서 CGRP을 발현시키는 신경 섬유의 수적인 변화가 없었다. 또한, RT97 양성 및 TOH 양성 섬유의 밀도 및 강도에 있어서의 차이는 육종 + 비히클(7.3±0.7 RT97+섬유/mm; 3.1±0.7 TOH+ 섬유/mm) 및 육종 + 항-NGF 처리된(7.3±0.7 RT97 + 섬유/mm; 3.6±0.7 TOH+ 섬유/mm) 동물에서도 검출 불가하였다. 이와 유사하게, 미투약 + 비히클(12.5±0.5 섬유/mm) 및 미투약 + 항-NGF(11.9±0.7 섬유/mm) 뒷발 피부 샘플 내 CGRP 양성 섬유의 강도 또는 밀도 간에 현저한 차이가 없었다(도 5c 및 5d). 또한, RT97 양성 및 TOH 양성 섬유의 밀도 및 강도에 있어서의 차이는 미투약 + 비히클(10.4±0.4 RT97+ 섬유/mm; 3.4±0.4 TOH+섬유/mm) 및 미투약 + 항-NGF 처리된(11.9±0.7 RT97+ 섬유/mm; 3.0±0.8 TOH+ 섬유/mm) 동물에서 검출 불가하였다. 육종 + 비히클 및 육종 + 항-NGF에 대한 미투약 + 비히클 및 미투약 + 항-NGF 동물의 피부 샘플 내 CGRP, RT97 또는 TOH 양성 섬유의 강도 또는 밀도 간에 현저한 관찰가능한 차이는 없었다.

항-NGF 항체 요법은 골암 통증 행동을 현저히 감소시켰다. 육종 + 비히클 마우스는 샴 + 비히클 대조군과 비교하여 방어자세를 취하는 시간을 보다 많이 소비하였음을 증명하였다(도 6a). 추가적으로, 육종 + 비히클 마우스는 샴 + 비히클 대조군(도 6b)과 비교하여 위축의 증가된 수를 나타냈다. 육종-주사된 마우스 내 항-NGF의 투여(6 내지 14일)는 육종 + 비히클 마우스와 비교하여 무의식적 방어자세를 현저히 약화시켰다(도 6a). 또한, 항-NGF 치료는 육종-주사된 마우스에서의 무의식적 위축을 현저히 감소시켰다(도 6b).

움직임-유발 통증은 촉진으로 인한 반응을 측정함으로써 분석하였다. 육종 + 비히클 마우스는 샴 + 비히클 대조군과 비교하여 촉진 후 방어자세에 소비하는 시간을 보다 많이 보였다(도 6c). 또한, 육종 + 비히클 마우스는 샴 + 비히클 대조군과 비교하여 촉진 후 위축의 증가된 수를 보였다(도 6d). 육종-주사된 마우스 내 항-NGF 치료는 촉진-유발 방어자세(도 6c) 및 촉진-유발 위축(도 6d) 모두를 현저하게 감소시켰다. 예비 연구에서, 현저한 행동상의 차이점이나 부작용이 비히클 또는 항-NGF를 수용한 샴-수술 동물 간에 관찰되지 않았다.

도 6은 종양 주사(삼각형) 6 내지 14일에 항-NGF 치료(n=8)는 육종 + 비히클(n=8)(사각형)과 비교하여 10, 12 및 14일에 진행 및 촉진으로 유발된 통증 행동을 현저히 감소시켰고, 모든 매개 변수(다이아몬드)에 대하여 10일에 샴 수준으로 현저히 감소되었음을 나타낸다. 모든 시점에, 샴 + 비히클(n=8)은 육종 + 비히클과 매우 상이하다. 따라서, 항-NGF 치료(10 mg/kg, 복막내, 5일 마다)는 질병의 진행에 걸쳐서 진행 및 움직임으로 유발된 골암 통증 행동 모두를 약화시켰다.

항-NGF 치료는 기준선 열 또는 기계적 역치에 영향을 미치지 않았으며 골암 통증을 감소시킴에 있어서 모르핀의 효능에 필적하였다. 열 자극에 대한 발 후퇴의 잠복기의 현저한 증가 또는 정상 통증 역치와 비교하여 항-NGF 투여와 함께 기계적 자극의 역치의 증가가 없었다. 항-NGF 치료는 미투약 + 비히클과 비교하여 정상 열 반응(도 7a) 또는 미투약 + 비히클과 비교하여 정상 기계적 자극(도 7b)에 어떠한 영향도 미치지 않았다.

골암 관련 행동을 감소시킴에 있어서 항-NGF 항체에 대한 황산 모르핀(MS)의 효능을 비교하기 위해 동물을 테스트하였다. 10일 및 14일의 행동 평가는 육종 + 비히클 동물이 샴 + 비히클 동물과 비교하여 통계적으로 보다 장시간의 방어자세(도 7c) 및 주사된 사지의 촉진(도 7d)에 반응하는 증가된 시간의 방어자세를 보였음을 나타냈다. 항-NGF(10 mg/kg/매 5일, 복막내) 또는 황산 모르핀(10 mg/kg, 또는 30 mg/kg 복막내)으로의 치료는 육종 + 비히클 마우스와 비교하여, 종양 주사 10일 및 14일 후(도 7c, 7d) 진행 및 움직임 유발 방어자세 행동 모두를 현저히 감소시켰다. 항-NGF 치료는 10 mg/kg 또는 30 mg/kg(P < 0.05 대 육종 + 항-NGF)의 모르핀 투여량과 비교하여 보다 효과적으로 골암 관련 통증 행동을 유의적으로 약화시켰다.

항-NGF 치료 조절된 말초 변화는 DRG 내 골암에 의해 유도되었다. ATF-CREB 패밀리에 속하는 활성화 전사 인자-3(ATF-3)는 말초 신경 손상의 모델에서 상향 조절되는 것으로 이미 나타났다. Tsujino et al., Molecular & Cellular Neurosciences 15:170-82 (2000). 이 상향 조절은 감각 및 운동 뉴런 세포체에서 발견되며 표지 손상된 뉴런으로 알려져 있다. 샴 + 비히클(L2 발현된 ATF-3 내 총 뉴런의 1.6±0.5%)과 비교하여 육종-주사된 대퇴골(L2 발현된 ATF-3에서 총 뉴런의 14.0±5.9%; 도 8a)에 대한 L2 DRG 동측의 ATF-3-IR 뉴런의 백분율의 현저한 증가가 있었다. 항-NGF로의 치료는 종양 주사 14일 후에 ATF-3(L2 발현된 ATF-3 내 총 뉴런의 2.6±1.0%; 도 8b)의 발현을 유의적으로 약화시켰다.

대식세포 침윤은 말초 신경 손상으로 인하여 상향 조절되는 것으로 보였다. Abbadie et al., Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 100:7947-52 (2003); Myers et al., Exp. Neurol. 141:94-101 (1996); Tofaris et al.,J Neurosci. 22:6696-703 (2002). 활성화 조직 대식세포에 의해 발현된 리소좀 단백질인, CD68(ED-1)에 대하여 향하게 된 항체는 육종-주사된 마우스 내 대식세포 침윤을 평가하는데 사용하였다. 샴 + 비히클(80.6±6.0 세포 프로파일/L2 동측 DRG)과 비교하여 육종 + 비히클 마우스(119.6±12.1 세포 프로파일/L2 동측 DRG; 도 8c)의 동측 DRG 내 CD68-IR 뉴런의 수적인 면에서 상향 조절되었다. 항-NGF 치료는 육종-주사된 마우스 내 동측 DRG(92.0±9.9 세포 프로파일/L2 동측 DRG; 도 8d)에서 CD68-IR 뉴런의 상향 조절을 현저히 감소시켰으며, 이것은 종양 함유 동물의 동측 L2 DRG 내 활성화 및 침윤 대식세포의 수적인 현저한 감소를 나타낸다.

항-NGF 치료 조절된 중추 변화는 척수 내 골암에 의해 유도되었다. 다이노르핀의 발현은 만성 통증의 지속과 연관되는 것으로 나타났다. Vanderah et al., Pain 92:5-9 (2001). 또한, 다이노르핀 발현은 몇몇 영구적인 통증 상태에서 척수의 후각에서 상향 조절되는 것으로 나타났다. Iadarola, et al., Brain Res. 455:205-212 (1988); Noguchi et al., Molecular Brain Research 10:227-233 (1991); Schwei et al., J. Neurosci. 19:10886-97 (1999). 샴 + 비히클 마우스에서, 소량의 뉴런은 깊은 척수 층(2.3±1.1 dyn-IR 뉴런/L3/L4 단편)에서 다이노르핀을 발현하였다. 이와 반대로, 육종 + 비히클 마우스는 다이노르핀-IR 뉴런(6.0±0.5 dyn-IR 뉴런/L3/L4 단편; 도 9A)을 유의적으로 더 발현하였다. 항-NGF 치료는 육종-주사된 마우스 내 다이노르핀 발현(2.0±0.6 dyn-IR 뉴런/L3/L4 단편; 도 9B)의 상향 조절을 유의적으로 감소시켰다.

즉각적 초기 유전자 활성화는 항-NGF 치료에 의해 예방되었다. 깊은 후각(척추각 III-VI) 내 c-Fos의 발현은 육종으로 유도된 골암 통증 상태에서 중추 민감화의 마커로서 이용되었다. Honore et al., Nat. Med. 6:521-8 (2000); Honore et al., Neuroscience 98:585-598 (2000); Luger et al., Cancer Research 61:4038-4047 (2001); Schwei etal., J. Neurosci. 19:10886-97 (1999). 샴-수술 동물의 정상, 비독성 촉진은 깊은 척추각 내 c-Fos의 최소 발현을 가져왔다. Sabino et al., Cancer Res. 62:7343-9 (2002). 골암 상태에서, 육종 + 비히클 마우스는 c-Fos-IR 뉴런(27.7±4.9; cFos-IR 뉴런/L3/L4 단편; 도 9C)의 증가된 수를 보였으며 항-NGF를 포함하는 치료는 이 발현을 유의적으로 감소시켰다(11.1±1.9; cFos-IR 뉴런/L3/L4 단편; 도 9D).

RT PCR 결과. 육종 종양 세포가 NGF의 가능한 공급원이었는지 여부를 확인하기 위해, 배양액에서 성장한 2472 세포를 RT-PCR에 의해 NGF mRNA 수준에 대하여 평가하였다. 이들 수준은 비정상적으로 높은 외분비 NGF의 공급원인, 수컷 마우스 침샘에서의 NGF mRNA 수준뿐만 아니라, 마우스의 몇몇 정상 조직들과 비교하였다. 하기 표 3에서 나타낸 바와 같이, 시험관 내 육종 2472 세포는 용이하게 검출가능한 NGF mRNA를 함유하였다. 이 수준은 홍체와 같이 고 수준의 NGF mRNA를 발현하는 정상 조직으로부터 획득한 NGF mRNA 수준의 범위 내이다. Shelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 81:7951-5 (1984). 그러나, 이 수준은 수컷 마우스 침샘에 존재하는 NGF mRNA 수준 이하의 몇 가지 등급의 규모이다.

[표 3]

실시예 3

쥐과 모델 내 골암 통증을 치료하는데 있어서 항-NGF 모노클론 항체의 효과는 조골세포 전립선 종양 세포를 대퇴골에 골수내 주사함으로써 발전되었다

방법

골암 통증의 쥐과 전립선 모델. 골암 통증의 쥐과 전립선 모델을 사용하여 항-NGF 항체 911(마우스 모노클론 항체; Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000) 참조)을 포함하는 치료의 효능을 평가하였다. 조골세포 개과(canine) 암종(ACE-1, Dr. Thomas J. Rosol로부터 기증받음, Ohio State Univeristy) 세포를 유지시켰으며 종양 세포의 주사를 전술한 바와 같이 수행하였다. Sabino et al., Cancer Res. 62:7343-7349, 2002; Honore et al., Nature Medicine 6:521-528, 2000; Honore et al., Prog. Brain Res. 129:389-397, 2000; Luger et al., Cancer Research 61:4038-4047, 2001. 간단히 말해서, ACE-1 세포를 37℃ 및 5% CO₂의 배지에서 성장시켰다. 세포를 T75 플라스크(7.5 cm²)에서 성장시키고 매주 2번씩, 80-90% 컨플루언시로 계대 배양하였다. 단지 3 내지 11 계대만을 이 연구에서 사용하였다. 0일에, 펜토바르비탈 나트륨(50 mg/kg, 복막내)을 이용한 일반적인 마취를 유도한 후에, 관절 절개술을 수행하여 대퇴골 말단의 관절구를 노출시켰다. 행크 완충 멸균 식염수(HBSS, Sigma Chemical Co., 미주리주 세인트 루이스 소재; 20 ㎕; 샴, n=7) 또는 10⁵조골세포 개 ACE-1 세포(20 ㎕, ACE-1, n=60)를 함유하는 배지를 마우스 대퇴골의 골수내 공간으로 주사하고 주사 부위를 치과용 아말감(Dentsply, 델라웨어주 밀포드 소재)으로 밀봉한 다음, 멸균 여과수로 세척하였다. 실험은 20-32g 중량인 총 89마리의 8-10 주령 어른 수컷 무흉선 누드 마우스(Harlan Laboratories, 위스콘신주 매디슨 소재)에서 수행하였다. 마우스를 12 시간 교대의 광주기 및 암주기로 22℃에서 유지되는 가압증기멸균된 케이지 안에서 특정 병원균 부재(SPF) 하에 국립 보건원 지침에 따라 사육하였으며 임의로 가압증기멸균된 먹이와 물을 제공하였다.

주사 후 19일 종점을 사용하였으며, 이는 종양이 여전히 뼈에 국한되어 있고, 암 관련 통증 행동 및 종양으로 인한 골 개조가 최대로 존재하는 시점이기 때문이다. 샴 동물을 행동 실험 및 골 조직학/면역조직화학의 대조군 분석을 위해 사용하였으며, 이는 미투약 동물이 종양 주사 9일 후 행동 면에서 샴과 두드러지게 상이하지 않았기 때문이다.

항-NGF 항체 또는 모르핀에 의한 치료. 종양 주사 후 7, 12, 및 17일에, ACE-1 주사된 동물을 10 mg/kg(ACE-1 + 항-NGF, n=9)으로 항-NGF 항체와 함께 복막내로(i.p.) 주사하였으며; ACE-1-주사된 동물을 식염수(ACE-1 + 비히클, n=21; 1.4 ㎕/kg)와 함께 주사(복막내)하였으며; 샴-주사된 동물을 식염수(샴 + 비히클, n=7)와 함께 주사(복막내)하였다. 모든 동물은 7일과 19일 사이에 행동에 관하여 분석하였다.

황산 모르핀에 대한 항-NGF 항체의 행동적 비교를 위해, 마우스에 행동 테스트 15분 전에 미량의 모르핀을 제공하였다(미투약: n=6; 샴: n=7; ACE-1 + 비히클: n=7; ACE-1 + 항-NGF: n=7; ACE-1 + 모르핀 10 mg/kg, 피하: n=8; ACE-1 + 모르핀 30 mg/kg, 피하: n=8). 열 및 기계적 민감성 테스트와 뒷발 피부 신경 분포의 평가를 위해, 미투약 마우스를 멸균 식염수(미투약 + 비히클: n=8) 또는 항-NGF 항체 (미투약 + 항-NGF: n=8, 10 mg/kg, 복막내)를 수용하는 2개의 치료군으로 나누었다.

행동적 분석. 동물을 종양 이식 또는 샴 주사 전 및 후 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19일에 통증 관련 행동에 관하여 테스트하였다. 동물을 하기 테스트를 사용하여 행동적으로 테스트하였다: 진행 통증(무의식적 방어자세 및 위축) 및 움직임-유발 통증(촉진-유발 방어자세 및 촉진-유발 위축). 동물을 철망 바닥으로 된 투명한 플라스틱 관찰 상자에 두고 30분 동안 익숙해지도록 하였다. 환경 적응 후, 무의식적 방어자세 및 무의식적 위축을 평가하였다. 촉진-유도 방어자세 및 위축을 ACE-1 및 샴-주사된 동물 내 대퇴골 말단의 정상 비독성 촉진 2분 후에 측정하였다. 이들 테스트를 실시예 1 및 2에서 설명한 바와 같이 수행하였다.

안락사 및 조직의 가공 처리. 마우스를 종양-주사 후 19일에 희생시키고 조직을 전술한 바와 같이 대퇴골 및 뒷발 피부의 면역조직화학적 분석을 위해 가공 처리하였다. Honore et al., Prog. Brain Res. 129:389-397, 2000; Honore et al., Nat. Med. 6:521-8 (2000); Luger et al., Cancer Research 61:4038-4047 (2001). 마우스를 CO₂로 안락사시키고 12 ml 0.1 M 인산 완충 식염수(PBS)로 심장 내로 관류시킨 다음 25 ml 4% 포름알데히드/12.5% 피크르산 용액으로 관류시켰다.

뒷발 발바닥 피부를 제거하고, 관류 고정액에 후-고정시키고, 24시간 동안 30% 수크로스에 냉동보존하였다. 두께가 60 μm인 연속의 피부 단편을 활주형 마이크로톰 상에서 절단하고, PBS에 모으고, 부동성 단편으로 가공 처리하였다. 단편으로 나눈 후, 발바닥 피부 단편을 잠깐 동안 PBS에 헹군 다음 1시간 동안 차단 용액(PBS 중 3% 정상 당나귀 혈청(NDS) 0.3% Triton X-100)에서 인큐베이션한 후 1차 항체에서 밤새 인큐베이션하였다. 피부 단편을 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP) (1:15,000; Sigma, 미주리주 세인트루이스 소재), 티로신 수산화효소(TOH)(폴리클론 래빗 항-TOH, 1:2,000, Chemicon, 캘리포니아주 테메큘라 소재) 및 신경 미세섬유 H(클론 RT97)(폴리클론 래빗 항-RT-97, 1:2,500, Chemicon, 캘리포니아주 테메큘라 소재)에 대하여 면역 염색하였다.

1차 항체에서 인큐베이션한 후, 단편을 잠시 동안 PBS에서 헹군 다음 3시간 동안 2차 항체 용액에서 인큐베이션하였다. Cy3 또는 비오틴에 결합된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재)를 각각 1:600 또는 1:500으로 사용하였다. 비오틴에 결합된 2차 항체를 검출하기 위해, 단편을 PBS에 헹구고 45분 동안 Cy3 결합된 스트렙타비딘(1:4000; Jackson ImmunoResearch)에서 인큐베이션하였다. 1차 항체의 특이성을 확인하기 위해, 대조군은 1차 항체의 누락 또는 상응하는 합성 펩티드로에 의한 사전 흡수를 포함하였다. 면역 염색 과정 이후에, 발바닥 피부 단편을 젤라틴 코팅된 슬라이드 위에 고정시켰다. 그 후, 고정된 단편을 알콜 기울기(70, 90, 100%)에서 탈수시키고, 자일렌에서 정화하고 커버슬립을 DPX(Fluka, 스위스)로 고정시켰다.

방사성 물질에 의한 조사 후, 종양 주사 19일 후에, 우측(내부 대조군) 및 좌측(종양-함유) 대퇴골을 4℃에서 밤새 피크르산 및 4% 포르말린에 고정시키고 14일 이상 10% EDTA(Sigma)에서 칼슘을 제거한다. 이어서 골을 파라핀 속에 끼워 두었다. 두께가 5 μm인 대퇴골 단편을 외측면에서 절단하고 타르타르산-저항성 산성 포스파타제(TRAP) 및 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여 정상 골수, 종양, 파골세포, 조골세포 및 대식세포(Ms)의 조직학적 특징을 시각화하였다.

샴 및 암에 걸린 대퇴골의 면역조직화학적 분석은 칼슘 제거되고, 파라핀에 끼워둔 14 μm의 연속 단편에서 수행하였다. 내인성 퍼옥시다제를 1시간 동안 2% 과산화수소에서 상기 단편들을 인큐베이션함으로써 켄칭시켰다. 이어서 단편을 10분 동안 PBS로 3회 헹구고 1시간 동안 TSA 차단 완충액(TSA-Plus Cyanine 3 System, PerkinElmer Life Science, Inc., 메사추세츠주 보스턴 소재)에서 차단시켰다. 1차 항혈청을 차단 완충액 제거시 첨가하고 밤새 실온에서 인큐베이션하였다. 1차 구심성 무수초 및 얇은 수초 감각 신경 섬유를 폴리클론 래빗 항-칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP)(1:15,000; Sigma)에 대하여 향하게 된 항체를 사용하여 표지하였다. 단편을 10분 동안 TSA 세척 완충액에 3회 헹군 다음 스트렙타비딘 HRP(1:4,000)에서 45분 인큐베이션하였다. 그 후, 단편들을 10분 동안 TSA 세척 완충액으로 3회 헹구었다. TSA-플러스 시아닌 3 시스템으로부터의 CY3-콘쥬게이션된 티라민(1:600)을 7분 동안 대퇴골에 적용시키고, TSA 세척 완충액으로 2회 및 PBS로 1회 세척하였다. 마지막으로, 단편을 공기 건조시키고, 알콜 기울기(70, 90, 및 100%)를 통하여 탈수시키고, 자일렌에서 정화하고 DPX(Fluka)로 고정시켰다.

골의 방사선 분석. 해부된 대퇴골의 방사선 사진(Faxitron X-ray Corp., 일리노이주 휠링 소재)은 19일 시점에 획득하여 골 형성 및 파괴를 평가하였다. 영상은 Kodak Min-R 2000 유방 조영술 필름(Eastman Kodak Co., 뉴욕주 로체스터 소재; 노출 세팅: 7초, 21 kVp) 상에서 캡쳐하였다. 골밀도의 분석은 5 배율로 전체 골 영상의 외측면에서 방사선을 이용하여 종양으로 인한 골 개조의 범위를 평가하는 데 사용하였다. 종양 및 비종양 함유 대퇴골(미투약 + 비히클, 샴 + 비히클, ACE-1+ 비히클, 및 ACE-1 + 항-NGF의 경우 n=8)을 전술한 프로토콜과 유사한 방식으로 'ImageJ (Research Services Branch, National Institute of Mental Health, 메릴랜드주 베데스다 소재)'를 사용하여 분석하였다. Corey et al., Prostate 52:20-33, 2002. 간단히 말해서, 공백의 방사선 필름 및 표준 단계 정제(Eastman Kodak Co.)는 눈금 측정 곡선을 개발하는 데 사용되었다. ImageJ를 사용하여 광학 밀도를 측정하고 후속하여 다음과 같이 전파로 전환시켰다: 전파=1/(antilog₁₀[광학 밀도]). 주어진 데이타를 음성 영상으로부터 결정하였으므로, 전파는 골밀도의 직접적 표현이다. 부포화 대퇴골 방사선 사진 및 판독을 캡쳐하기 위해 사용된 HP ScanJet 7400c 스캐너를 각 대퇴골로부터 중복 기록하였다. 결과는 표준화 전파 평균±SE로서 나타낸다.

조골세포, 파골세포 및 대식세포의 조직학적 분석, 종양 성장 및 골 개조. 조골세포 증식은 미투약 동물, 샴-주사 및 종양 함유 마우스에 대하여 전체 골간 골수내 공간을 통해 대퇴골 및 피질 골 내에 함유된 종양 유도된 새로운 골 형성의 부위와 직접 접촉하는 조골세포의 수를 정량함으로써 분석하였다. 골간 골수내 공간은 근위 말단 섬유주로부터 말단 근위 섬유주에 이르도록 분포하는 것으로 정의되었으며 우세한 활성 골 개조가 이 부위에서 발생하기 때문에 정량을 위해 선택되었다. 조골세포는 새롭게 진행된 골 매트릭스와 직접 접촉하는 세포들로 확인되며 전형적인 입방형 또는 원주형 상피층에 배열되고 고배율로(200배 이상) 확인가능한 얇은 가공 처리를 통해 서로 연결된다. 결과는 미투약, 샴-주사, 종양 함유 마우스에 대하여 골간 골수내 공간의 조골세포/mm²의 수로서 나타낸다. 파골세포 증식은 전술한 바와 같이 TRAP 염색된 대퇴골 단편 상에서 미투약, 샴-주사 및 ACE-1-주사된 마우스에 대하여 골/종양 경계면 및 정상 골수/골 경계면에서 TRAP+파골세포의 수를 정량함으로써 결정하였다. Honore et al., Nat. Med. 6:521-528 (2000). 간단히 말해서, 파골세포는 TRAP+로서 나타내는 조직학적으로 분화된 세포이며 이것은 골흡수의 영역과 밀접히 관련된다. 이들 세포는 다핵성이며 피질 및 섬유주 골과 함께 흡수공(Howship's lacunae)에서 발견된다. Fawcett, D. W.; A Textbook of Histology. In: D. Dreibelbis (ed.), Bone, 11판, pp. 211-213. Philadelphia, PA: W.B. Saunders Company, 1986. 대식세포(Ms) 증식은 광물화 골의 내골 표면과 관련되지 않은 종양 및 정상 골수를 통하여 분포되어 있는 TRAP+세포의 수를 정량함으써 결정하였다. 골에서의 대식세포는 세포를 자극하는 종양 방출 인자로 인하여 활성화되며, 이들 활성화 Ms의 세포 외관은 매우 불규칙한 표면, 라멜리포듐 및 포식세포 액포로서 특징 지워진다. 결과는 각각 골간 골수내 공간의 파골세포/mm² 또는 Ms/mm²의 평균 수로서 표현된다.

ACE-1 세포를 함유하는 대퇴골은 SPOT 영상 캡쳐 소프트웨어(Diagnostic Instruments, 미시간주 스터링 하이츠 소재)를 이용하는 SPOT II 디지탈 카메라를 구비한 Nikon E600 형광 현미경 상에서 일반 광학 현미경(bright field microscopy)을 사용하여 검시하였다. 골수내 공간의 총 영역 및 종양, 골 형성 및 잔여 조혈 세포가 차지하는 골수내 공간의 백분율은 Image Pro Plus v3.0 소프트웨어(Media Cybernetics, 메릴랜드주 실버 스프링 소재)를 사용하여 계산하였다. Sabino et al., Cancer Res. 62:7343-7349, 2002; Sevcik et al., Pain 111:169-180, 2004. 골 형성은 종양 성장을 정량화하기 위해 사용된 동일한 H&E 염색 대퇴골 단편을 사용하여 분석하였다. 대퇴골 단편은 극성화 빛 아래서 검시하여 무층뼈 및 층판뼈 형성의 영역을 확인하였다. 무층뼈 형성의 영역은 SPOTII 디지탈 카메라로 영상화하였으며 Image Pro Plus v3.0 소프트웨어를 사용하여 정량하였다. 결과는 총 골수내 부위의 백분율로서 종양, 종양으로 인한 골 형성 및 잔여 조혈세포의 부위로서 나타낸다.

골 및 피부에서 감각 섬유의 정량. 감각 신경 섬유의 수를 전술한 바와 같이 결정하였다. Mach et al., Neuroscience 113:155-166, 2002. 간단히 말해서, 20배 대물렌즈를 구비한 MRC01924 공초점 영상 시스템(Bio-Rad, 캘리포니아주 리치몬드 소재)를 사용하여 3개의 골 영역(근위, 말단 및 골간) 및 3개의 골 조직(골막, 광물화 골 및 골수)에서 CGRP 양성 섬유의 수를 정량하였다. 신경 섬유 계수는 올림푸스 BH-2 형광-설치 현미경으로 각 마우스당 6개의 대퇴골 단편을 조사함으로써 수행하였다. 길이가 30 μm 이상인 신경 섬유만을 분석에 포함시켰다. 각각의 골의 총 표면적(mm²)을 측정하기 위해, 본 발명자들은 동일한 대퇴골 단편을 분석하여 이로부터 신경 섬유 계수를 하였다. SPOTII 디지털 카메라 및 Image Pro Plus v. 3.0 소프트웨어를 사용하여 총 얻은 대퇴골 단편의 디지털 영상 위에서 총 골 부위를 측정하였다. 결과는 총 골 부위당 계수한 섬유의 수로서 나타낸다.

상피 신경 분포 밀도의 정량은 각 마우스당 4개의 무작위 선택된 발바닥 뒷발 피부 단편 상에서 수행하였다. CGRP, TOH 및 RT97-IR 신경 섬유의 총 수는 200 배율에서 계수하였다. 단지 하나의 표피 내 섬유만을 계수하고 동일한 섬유의 다수의 가지를 계수하지 않기 위해 계수 규칙을 확립하였다. McCarthy et al., Neurology 45:1848-55 (1995). 정량된 모든 단편 내 표피의 총 길이는 1 cm² 접안 렌즈 격자를 사용하여 측정하였다. 길이가 적어도 30 μm이고, 외부 표피로 투입한 신경 섬유만을 계수하였다. 결과는 각 동물당 mm 길이 마다 표피 내 신경 섬유의 평균 수로서 제공된다.

ACE-1 세포에서 NGF의 mRNA 수준의 RT PCR 분석. 개 뇌 또는 개 접립선 종양 세포 ACE-1으로부터의 총 RNA는 RNeasy 마이크로 키트(Qiagen)를 사용하여 제조업자의 설명에 따라 제조하였으며, RNA를 Ribogreen 시약(Molecular Probes)을 사용하여 정량하였다. 2 단계 RT-PCR은 TaqMan Gold RT-PCR 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다. RNA는 무작위 헥사머를 사용하여 역전사시켰으며, cDNA는 NGF(LB041: AACAGGACTCACAGGAGCAA (SEQ ID NO:6), LB042: CGGCACTTGGTCTCAAAGAA (SEQ ID NO:7), 및 LB045: AATGTTCACCTCTCCCAGCACCATCA (SEQ ID NO:8))에 대하여 특이적인 프라이머/프로브 세트를 사용하여 증폭시켰다. 샘플은 RT 단계에서 2번 분석하였으며 총 RNA 투입으로 표준화하였다.

통계적 분석. Statview 컴퓨터 통계 패키지(SAS Institute, Inc., 노스캐롤라이나주 캐리 소재)를 사용하여 통계 테스트를 수행하였다. 일원 분산분석(One-way ANOVA)을 사용하여 실험 군들 간 행동적 결과, 골 조직학적 결과 및 면역조직화학적 측정치를 비교하였다. 다중 비교를 위해, 피셔의 PLSD(보호된 최소 유의차 검정) 사후검증(post hoc test)을 사용하였다. 중요성 수준은 P < 0.05로 하였다. 행동, 면역조직화학적 분석 및 골 개조의 기록의 책임을 맡고 있는 개개의 조사자들에게 각 동물의 실험적 상태를 숨기고 실험하였다.

결과

항-NGF 요법은 황산모르핀보다 더 큰 범위로 골암 통증을 약화시켰으나 기준선 열 또는 기계적 역치에 영향을 미치지는 않았다. 진행 통증은 2분 기간에 걸친 무의식적 방어자세 및 위축을 측정함으로써 분석하였다. ACE-1 + 비히클 마우스는 샴 + 비히클 대조군(0.6+0.3 초, 19일, 도 10A)에 비해서 더 긴 방어자세 소요 시간(7.7±0.8 초, 19일)을 나타내었다. 또한, ACE-1 + 비히클 마아스는 샴 + 비히클 대조군(1.0±0.4, 19일, 도 10B)에 비해서 증가된 수의 위축(11.9±1.2, 19일)을 나타내었다. ACE-1 주사한 마우스에 항-NGF의 투여는 ACE-1 + 비히클 마우스에 비해서 무의식적 방어자세를 현저히 약화시켰다(1.2±0.4 초, 19일)(도 10A). 또한, 항-NGF 처치는 ACE-1 + 비히클에 비해서 ACE-1 주사 마우스에서 무의식적 위축을 현저히 감소시켰다(2.1±0.7, 19일)(도 10B). 예비 연구에서, 비히클이나 항-NGF를 수용한 샴 작동된 대조군 사이에는 어떤 유의한 행동적 차이 또는 부작용은 발견되지 않았다.

항-NGF 요법은 미투약 + 비히클(11.2±0.4 초, 19일, 도 10C)에 비해서 정상적 열 반응(10.2±0.4 초, 19일) 또는 미투약 + 비히클(5.2±0.4 g, 19일, 도 10D)에 비해서 정상적 기계적 반응(5.4±0.3 g 19일)에 어떤 영향도 미치지 않았다.

골암 관련 행동을 감소시키는 데 황산모르핀(MS)과 항-NGF 항체의 효능을 비교하기 위해서 동물 테스트를 하였다. 11일 및 19일 종양 주사 후 행동의 평가는 ACE-1 + 비히클 동물이 통계학적으로 샴 + 비히클 마우스(각각, 0.4±0.2 및 0.6±0.3 초, 11일 및 19일, 도 10E)에 비해서 주사된 사지의 더 긴 시간 방어자세를 나타내었다(각각, 6.0±1.0 및 7.6±1.2 초, 11일 및 19일)는 것을 보여주었다. 또한, ACE-1 + 비히클은 샴 + 비히클 마우스(각각 0.7±0.3 및 1.0±0.4, 11일 및 19일, 도 10F)에 비해서 통계학적으로 주사된 사지의 더 큰 수의 위축을 나타내었다(각각, 8.6±1.2 및 11.7±1.7, 11일 및 19일). 진행중 방어자세는 ACE-1 + 비히클 마우스(도 10E)에 비해서 항-NGF의 장기 처치(각각, 2.1±1.1 및 1.4±0.4 초, 11일 및 19일), 단기 10 mg/kg 황산모르핀(각각, 3.5±0.3 및 4.0±0.5 초, 11일 및 19일) 또는 단기 30 mg/kg 황산모르핀(각각, 2.2±0.3 및 2.0±0.4 초, 11일 및 19일)에 의하여 현저히 감소하였다(도 10E). 또한, 진행중 위축은 ACE-1 + 비히클 마우스에 비해서 항-NGF의 장기 처치(각각, 3.4±1.7 및 2.6±0.6, 11일 및 19일), 단기 10 mg/kg 황산모르핀(각각, 5.6±0.5 및 6.8±0.7, 11일 및 19일) 또는 단기 30 mg/kg 황산모르핀(각각, 3.6±0.5 및 3.5±0.7, 11일 및 19일)에 의하여 현저히 감소하였다(도 1OF). 항-NGF 요법은 단기 10 mg/kg 황산모르핀보다 골암 관련 통증 행동을 현저히 약화시켰다. 샴 + 비히클(27±1 g), ACE-1 + 비히클(27±1 g) 및 ACE-1 + 항-NGF(26±l g) 동물 사이에는 최종 몸무게의 어떤 차이도 발견되지 않았다. 이들 연구에서, 비히클 또는 항-NGF를 수용한 동물 사이에 유의한 행동적 차이 또는 부작용, 예를 들면 운동실조증, 질병 또는 혼수는 발견되지 않았다.

항-NGF 요법은 접촉-유발 골암 통증을 약화시켰다. 또한, 접촉-유발 통증 행동을 평가하였다. ACE-1 및 샴 주사 동물에서 원단 대퇴골의 정상적 무독성 촉진의 2분 기간 후 촉진-유도 방어자세 및 위축을 측정하였다. 도 10G 및 10H에서 나타낸 바와 같이, ACE-1 주사한 동물(식염수와 함께 투여함)은 샴 주사한 동물(식염수와 함께 투여함)에 비해서 촉진-유도 방어자세(도 10G) 및 촉진-유도 위축(도 10H)에 의하여 평가(모두 p < 0.01, ANOVA)한 바와 같이 7일까지 접촉-유발 통증 행동을 일으켰다. 또한, 도 10G 및 도 10H는 항-NGF 911의 복강내 투여가 ACE-1 주사한 마우스에 식염수를 투여한 것에 비해서 ACE-1 종양 이식 후 11일 내지 19일 ACE-1 주사한 마우스에서 촉진-유도 방어자세(도 10G) 및 촉진-유도 위축(도 10H)을 현저히 감소시켰다는 것을 나타낸다(촉진-유도 방어자세 및 촉진-유도 위축의 경우, p < 0.01, ANOVA). 이들 결과는 항-NGF 항체 911이 ACE-1 주사한 동물에서 접촉-유발 통증을 감소시킨다는 것을 나타낸다.

항-NGF 요법은 질병 진행 또는 종양 유도 골 형성의 마커에 어떤 영향도 미치지 않았다. 골 형성 및 파괴, 종양 성장(도 11), 및 파골세포 증식(도 12)에 미치는 항-NGF 요법의 효과를 종양 주사 후 19일에 검사하였다(하기 표 4). 샴-주사한 마우스는 ACE-1 주사한 마우스에 비해서, 각각 방사선, TRAP 및 H&E 분석에 의하여 평가한 바와 같이, 현저한 골 개조(115±2%의 표준화 전달 수치)(도 11A), 전체 척수내 공간 전반의 파골세포 증식(16±10 파골세포/골간의 척수내 면적 mm²)(도 12A) 또는 종양 세포(0±0%)(도 11D)를 나타내지 않았다. ACE-1 + 비히클 마우스에서, 다중초점 골간 브리징 및 방사선투과성(109±5%의 표준화 전달 수치)(도 11B), 골간 척수내 영역 전반의 파골세포(도 12B) 및 조골세포 수의 현저한 증가(47±3 파골세포/mm² 및 127±7 조골세포/mm²)에 의하여 관찰되고 특성화된, 광범위하지만 거의 균질한 골 형성 및 파괴가 있었으며, 종양은 대부분의 척수내 공간을 채웠다(척수내 공간의 60±7%)(도 11E). 종양 보유 마우스를 종양 주사 후 7일부터 항-NGF 항체로 처치한 것은 ACE-1 + 비히클 동물에 비해서, 골 개조의 어떤 유의한 변화(106±9%의 표준화 전달 수치)(도 11C), ACE-1 유도 파골세포의 어떤 감소(도 12C) 또는 골간 척수내 영역 전반의 조골세포 증식(47±5 파골세포/mm² 및 118±15 조골세포/mm²) 또는 종양 성장(척수내 공간의 57±6%)도 야기시키지 않았다(도 11F).

[표 4]

종양 주사 후 19일에, ACE-1 + 비히클 마우스는 샴 + 비히클 대조군 마우스(2±1 Ms/mm²)에 비해서 대식세포(Ms)(27±2 Ms/골간 척수내 영역 mm²)의 증가를 나타내었다. ACE-1 주사한 마우스의 항-NGF 처치(24±3 Ms/mm²)는 ACE-1 + 비히클 마우스에서 나타난 바와 같이, Ms 침윤을 현저히 변경하지 않았다(표 4).

항-NGF 요법은 뼈 또는 피부의 감각 또는 교감신경 지배에 관찰가능한 영향을 미치지 않았다. 각각 CGRP, RT-97 및 TOH에 대한 항체를 사용한 면역조직화학에 의하여 ACE-1 주사한 대퇴골 또는 뒷발의 발바닥 피부에서 얇은 수초 또는 무수초 펩티드작용성 감각 신경섬유(CGRP-IR), 대 수초 감각섬유(RT97-IR) 및 노르아드레날린 작용성 교감 신경섬유(TOH-IR)를 분석하였다. CGRP-IR 신경섬유는 샴 + 비히클(28.2±1.5 섬유/mm²) 및 미투약 + 비히클 동물(24.6±2.4 동물/mm²) 또는 미투약 + 항-NGF 동물(23.1±1.9 섬유/mm²)에서뿐만 아니라 ACE-1 + 비히클(23.5±1.9 섬유/mm²) 및 ACE-1 + 항-NGF(24.0±1.9 섬유/mm²) 동물의 전체 뼈(골막, 광물질함유 뼈, 골수 및 종양) 전반에 걸쳐 발견되었다(도 14). ACE-1 + 비히클(13.9±0.5 섬유/mm)과 ACE-1 + 항-NGF(15.2±0.7 섬유/mm) 뒷발 피부 샘플에서 CGRP-IR 섬유의 강도 또는 밀도 간에 어떤 유의한 차이도 없었다(도 13A&B). 유사하게, 미투약 + 비히클(14.4±0.4 섬유/mm)과 미투약 + 항-NGF(14.2±1.3 섬유/mm) 뒷발 피부 샘플에서 CGRP-IR 섬유의 강도 또는 밀도 간에 어떤 유의한 차이도 없었다(도 14A&B). 또한, 미투약 + 비히클(4.2±2.2 RT97 + 섬유/mm; 16.0±2.7 TOH + 섬유/mm)과 미투약 + 항-NGF 처치한(8.0±0.6 RT97 + 섬유/mm; 12.8±1.1 TOH + 섬유/mm) 동물에서 RT97-IR 및 TOH-IR 섬유의 밀도 및 강도의 차이는 검출할 수 없었다. ACE-1 + 비히클 및 ACE-1+ 항-NGF 대 미투약 + 비히클 및 미투약 + 항-NGF 동물에서 CGRP, RT97 또는 TOH-IR 섬유의 강도 또는 밀도 간에 현저하게 관찰가능한 차이점은 없었다.

ACE-1 세포에서의 mRNA 발현의 수준. 개 뇌와 ACE-1 세포에서의 NGF 발현을 비교하였다. 5개의 독립된 ACE-1 샘플을 분석하였는데, 각각에서 NGF 발현은 PCR 분석의 검출 수준 미만이었다. 개 뇌에서의 NGF는 40 순환 실험 중 35.2 순환에서 역치를 넘은 반면, ACE-1 샘플은 40 순환 후 역치를 넘지 못하였다. 따라서, ACE-1 샘플에서의 NGF mRNA 발현은 뇌에서의 발현보다 적어도 27.8 배 미만이었다.

실시예 4

전립선암 또는 유방암에서 기인한 뼈로의 전이에서 비롯된 중간 내지 중증 통증을 가진 환자에서 항-NGF 항체 E3의 진통 효과

무작위의, 플라시보 조절된, 이중맹검 연구에서, 항-NGF 항체 E3의 정맥내 투여량(100 ㎍/kg, 300 ㎍/kg 또는 1,000 ㎍/kg)의 (시각적 아날로그 스케일(VAS)에 의하여 측정된 통증 완화뿐만 아니라 발병 시간, 최고조 시간, 지속기간을 포함한) 진통 효과를 전립선암 또는 유방암에서 기인한 뼈로의 전이에서 비롯된 중간 내지 중증 통증을 가진 환자에서 플라시보와 비교한다. 전립선암 또는 유방암에서 기인한 뼈로의 전이에서 비롯된 중간 내지 중증 통증을 경험하고 있는 성인 남성 및 여성(35 내지 75세의 연령)이 본 연구에 등록되었다. 스크리닝 기간 동안, 환자들은 매일 4회 그들의 통증 수준을 기록해야 하고, 또한 항-NGF 항체 E3의 투여 전 14일 동안 그들의 다른 진통 의약의 사용을 기록해야 한다.

280명의 환자가 본 연구에 승인되었다. 1일 및 29일 아침에 항-NGF 항체 E3 투여가 이뤄지고, 그 후 기준선 통증 수준, 다른 진통제 사용 및 유해사건의 2주의 기록을 한다. 280명의 환자를 4 그룹으로 나누어, 각 그룹은 70명의 환자를 가진다. 각 그룹의 환자를 플라시보, 항-NGF 항체 E3의 100 ㎍/kg, 300 ㎍/kg 또는 1,000 ㎍/kg으로 처치한다.

투약 전 14일 동안 및 항체 E3의 투여 후 6개월의 기간 동안 매일 4회 진통 효과를 평가한다. 결과는 스크리닝 기준선(플라시보 또는 항체 E3의 투여 전 14일 동안의 평균 통증 수준)으로부터의 변화로서 평가한다. 플라시보에 비해서 항-NGF 항체 E3로 처치한 하나 이상의 환자 그룹에서 통증 수치의 임의의 감소 및/또는 다른 진통제의 사용의 감소는 항-NGF 항체 E3를 통한 치료의 효능을 입증한다.

전술한 발명은 이해를 명확히 할 목적으로 예시 및 실시예의 방식으로 일부 상세하게 설명하였지만, 설명 및 실시예들이 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

SEQUENCE LISTING <110> Rinat Neuroscience Corp. Regents of University of Minnesota <120> Methods for treating bone cancer pain by administering a nerve growth factor antagonist <130> PC19494A <140> PCT/US2005/011786 <141> 2005-04-07 <150> US 60/560,781 <151> 2004-04-07 <150> US 60/620,654 <151> 2004-10-19 <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr 20 25 30 Asp Leu Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Val Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 2 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu His Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 gggctggatg gcatgct 17 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 gcgtccttgg caaaacctt 19 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 ccaagctcac ctcagtgtct gggcc 25 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 aacaggactc acaggagcaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 cggcacttgg tctcaaagaa 20 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 aatgttcacc tctcccagca ccatca 26

Claims

신경성장인자(NGF) 길항제의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체의 골암 통증을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 골암 통증은 뼈에서 유래된 암에서 비롯된 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 골암 통증은 골육종에서 비롯된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 골암 통증은 뼈로 전이된 암에서 비롯된 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 골암 통증은 뼈로 전이된 전립선암에서 비롯된 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 골암 통증은 뼈로 전이된 유방암에서 비롯된 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 골암 통증은 뼈로 전이된 폐암에서 비롯된 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 골암 통증은 뼈로 전이된 육종에서 비롯된 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 골암 통증은 뼈로 전이된 신암에서 비롯된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, NGF 길항제는 항-NGF 길항제 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체는 모노클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체는 사람화된 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체는 사람 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체는 사람 NGF와 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체는 설치류 NGF와 더 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체는 약 0.1 nM 또는 약 0.1 nM 미만의 K_D를 가진 사람 NGF와 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 항-NGF 길항제 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, NGF 길항제는 아편양 진통제와 병용투여되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
골암 통증을 치료하기 위한 NGF 길항제 및 NGF 길항제의 사용 설명서를 포함하는 골암 통증 치료용 키트.