NO343065B1

NO343065B1 - Anvendelse av en nervevekstfaktor (NGF)-antagonist for fremstilling av et medikament til behandling av benkreftsmerte i et individ, hvor NGF-antagonisten er et anti-NGF-antagonistantistoff, anti-NGF-antagonist-antistoff for anvendelse ved behandling av benkreftsmerte i et individ, et sett derav til behandling av benkreftsmerte, og en farmasøytisk sammensetning til behandling av benkreftsmerte.

Info

Publication number: NO343065B1
Application number: NO20065070A
Authority: NO
Inventors: David L Shelton; Patrick William Mantyh
Original assignee: Univ Minnesota; Rinat Neroscience Corp
Priority date: 2004-04-07
Filing date: 2006-11-03
Publication date: 2018-10-22
Also published as: US20090252744A1; US7425329B2; CA2562024A1; CA2562024C; ATE456580T1; JP5706853B2; EP2206728B9; EP2206728B1; ES2665758T9; NO20180735A1; DK2206728T3; RU2389509C2; AU2005243247A1; IL178226A; BRPI0508390B1; US20110243961A1; DK1732949T3; DE602005019144D1; JP2012229238A; US8226951B2

Abstract

Oppfinnelsen vedrører fremgangsmåter og preparater til forebygging eller behandling av benkreftsmerte, inkludert kreftsmerte som er assosiert med beinmetastase, ved å administrere en antagonist av nervevekstfaktor (NGF). NGF- antagonisten kan være et anti-NGF (slik som anti-hNGF)-antistoff som er i stand til å binde hNGF.

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelsen av en nervevekstfaktor (NGF)-antagonist til fremstilling av et medikament for behandling av benkreftsmerte.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Nervevekstfaktor (NGF) var det første neurotrofinet som ble identifisert, og dets rolle i utviklingen og overlevelse for både perifere og sentrale nevroner har blitt godt karakterisert. NGF har blitt vist å være en kritisk overlevelses- og opprettholdelsesfaktor i utviklingen av perifere sympatisk og embryonale sensoriske nevroner og for basale forhjernekolinerge nevroner (Smeyne, et al., Nature 368:246-249 (1994); Crowley et al., Cell 76:1001-1011 (1994)). NGF oppregulerer ekspresjon av nevropeptider i sensoriske nevroner (Lindsay et al., Nature 337:362-364 (1989)), og dens aktivitet er mediert gjennom to ulike, membranbundne reseptorer, TrkA-tyrosinkinasereseptoren og p75-reseptoren som er strukturelt beslektet med andre medlemmer av tumornekrosefaktor reseptorfamilien (Chao, et al., Science 232:518-521 (1986)).

I tillegg til dens virkninger i nervesystemet har NGF i økende grad blitt implisert i prosesser utenfor nervesystemet. For eksempel har NGF blitt vist å forsterke vaskulær permeabilitet hos rotter (Otten et al., Eur J Pharmacol. 106:199-201 (1984)), forsterke T-og B-celle immunresponser (Otten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10059-10063 (1989)), indusere lymfocyttdifferensiering og mastcelleproliferasjon og forårsake frigjøringen av løselige biologiske signaler fra mastceller (Matsuda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6508-6512 (1988); Pearce et al., J. Physiol. 372:379-393 (1986); Bischoff et al., Blood 79:2662-2669 (1992); Horigome et al., J. Biol. Chem. 268:14881-14887 (1993)). Selv om eksogent tilført NGF har blitt vist å være i stand til å ha alle disse effektene er det viktig å bemerke at det kun sjelden har blitt vist at endogent NGF er viktig i noen av disse prosessene in vivo (Torcia et al., Cell. 85(3):345-56 (1996)). Det er derfor ikke klart hva effekten kan bli, hvis noen, av å inhibere bioaktiviteten til endogent NGF.

NGF blir produsert av et antall celletyper inkludert mastceller (Leon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3739-3743 (1994)). B-lymfocytter (Torcia et al., Cell 85:345-356 (1996), keratinocytter (Di Marco et al., J. Biol. Chem. 268:22838-22846)), glatte muskelceller (Ueyama et al., J. Hypertens. 11:1061-1065 (1993)), fibroblaster (Lindholm et al., Eur. J. Neurosci. 2:795-801 (1990)), bronkiale epitelceller (Kassel et al., Clin. Exp. Allergy 31:1432-40 (2001)), nyremesangialceller (Steiner et al., Am. J. Physiol.

261:Y792-798 (1991)) og skjelettmuskelmyorør (Schwartz et al., J Photochem, Photobiol. B 66:195-200 (2002)). NGF-reseptorer har blitt funnet på en mengde celletyper utenfor nervesystemet. For eksempel har TrkA blitt funnet på humane monocytter, T- og B-celle lymfocytter og mastceller.

En sammenheng mellom økte NGF-nivåer og en rekke inflammatoriske tilstander har blitt observert hos humane pasienter så vel som i flere dyremodeller. Disse inkluderer systemisk lupus erytematosus (Bracci-Laudiero et al., Neuroreport 4:563-565 (1993)), multippel sklerose (Bracci-Laudiero et al., Neorosci. Lett. 147-21 (1992)), psoriasis (Raychaudhuri et al., Acta Derm. l’enerol. 78:84-86 (1998)), artritt (Falcimi et al., Ann. Rheum. Dis. 55:745-748 (1996)), interstitiell cystitt (Okragly et al., J. Urology 161:438-441 (1991)), astma (Braun et al., Eur. J. Immunol. 28:3240-3251 (1998), pankreatitt og prostatitt.

Et forhøyet nivå av NGF i perifere vev er konsekvent forbundet med inflammasjon og har blitt observert i en rekke former for arteritt. Synoviumet hos pasienter som er rammet av reumatoid artritt uttrykker høye nivåer av NGF mens i ikke-betent synovium har NGF har blitt rapportert å være ikke påvisbart (Aloe, et al. Arch. Rheum. 35:351-355 (1992)). Tilsvarende resultater ble sett hos rotter med eksperimentelt indusert reumatoid artritt (Aloe, et al., Clin. Exp. Rheumatol. 10:203-204 (1992); Halliday et al., Neurochem. Res. 23:919-22 (1998)). Forhøyede nivåer av NGF har blitt rapportert hos transgene arterittmus sammen med en økning i antall mastceller. (Aloe et al., Int. J. Tissue Reactions-Exp. Clin. Aspects 15:139-143 (1993)).

Behandling med eksogent NGF leder til en økning i smerte og smertefølsomhet. Dette er illustrert ved det faktumet at injeksjon av NGF fører til en signifikant økning i smerte og smertefølsomhet i begge dyremodeller (Lewin et al., J. Neurosci. 13:2136-2148 (1993); Amann, et al., Pain 64, 323-329 (1996); Andreev et al., Pain 63, 109-115 (1995)) og human (Dyck et al., Neurology 48, 501-505 (1997); Petty et al., Annals Neurol. 36, 244-246 (1994)). NGF ser ut til å virke ved flere mekanismer inkludert indusering av neurotrofin BDNF (Apfel et al., Mol. Cell. Neurosci. 7(2), 134-142 (1996); Michael et al., J. Neurosci 17, 8476-8490 (1997)) som i sin tur endrer smertesignalprosessering i ryggmargen (Hains et al., Neurosci Lett. 320(3), 125-8 (2002); Miletic et al., Neurosci Lett. 319(3), 137-40 (2002); Thompson et al., Proc Natl Acad Sci USA 96(14), 7714-8 (1999)), indusering av endringer i de perifere og sentrale forbindelsene til de sensoriske nevronene og andre smerteoverførende nevroner i ryggmargen (Lewin et al., European Journal of Neuoroscience 6, 1903-1912 (1994); Thompson et al. Pain 62, 219-231 (1995)), indusering av endringer i aksonvekst (Lindsay, RM, J Neurosci. 8(7), 2394-405 (1988)), indusering av bradykininreseptor ekspresjon (Peterson et al., Neuroscience 83:161-168 (1998)), indusering av endringer i ekspresjon av gener som er ansvarlig for nerveaktivering og signaloverføring slik som ionekanaler (Boettger et al., Brain 125(Pt 2), 252-63 (2002); Kerr et al., Neuroreport 12(14), 3077-8 (2001); Gould et al., Brain Res 854(1-2), 19-29 (2002); Fjell et al., J. Neurophysiol. 81:803-810 (1999)), potensering av den smerterelaterte reseptoren TRPV1 (Chuang et al., Nature 411 (6840), 957-62 (2001); Shu og Mendell, Naurosci. Lett. 274:159-162 (1999)), og forårsaker patologiske endringer i muskler (Foster et al., J Pathol 197(2), 245-55 (2002)). Mange av disse endringene foregår direkte på de smerteoverførende sensoriske nevronene og er tilsynelatende ikke avhengig av samtidig betennelse. I tillegg er det minst to andre celletyper som er kjent for å respondere på NGF og som kan være involvert i endringer i smertefølelse og følsomhet. Den første av disse, er mastcellen, har blitt rapportert å respondere på NGF med degranulering (Yan et al., Clin. Sci. (Lond) 80:565-569 (1991)) eller, i andre studier, å forårsake eller øke mediatorproduksjon eller -frigjøring i samarbeid med andre midler (Pearce og Thompson, J. Physiol.

372:379-393 (1986), Kawamoto et al., J. Immunol. 168:6412-6419 (2002)). Det har klart blitt vist i rotte at NGF-medierte smerteresponser i det minste er noe mediert av mastceller (Lewin et al., Eur. J. Neurosci. 6:1903-1912 (1994), Woolf, et al., J. Neurosci. 16:2716-2723 (1996) selv om den potensielle relevansen av dette fremdeles ikke er vist hos mennesker. Primære sympatisk nevroner er også kjent for å respondere på NGF og også være involvert i smertesignalering (Aley et al., Neuroscience 71:1083-1090 (1996)). Det er klart at fjerning av sympatisk innervasjon modifiserer hyperalgesien som normalt ses som respons på behandling med NGF (Woolf et al., J. Neurosci. 16:2716-2712 (1996)).

Anvendelsen av NGF-antagonister, slik som anti-NGF-antistoff, for å behandle forskjellige typer av smerte har blitt beskrevet. Se f.eks. US serienr. 10/682,331, 10/682,638, 10/682,332 (publ. nr. 2004/0131615), 10/783,730 (publ. nr. 2004/0253244), 10/745,775 (publ. nr. 2004/0237124), 10/791,162; PCT/US03/32089 (WO 04/032870); PCT/US03/32083 (WO 2005/000194); PCT/US03/32113; PCT/US2004/05162 (WO 04/073653); PCT/US03/41252 (WO 04/058184).

Benkreftsmerte kan fremkomme hos mennesker fra enten primær bentumor eller vanligere fra benmetastaser (slik som fra bryst-, prostata- og lunge karsinomer). Se Luger et al., Pain 99:397-406 (2002). En musemodell med benkreftsmerte har blitt utviklet, og denne modellen med benkreftsmerte gjenspeiler smerten som er observert hos mennesker med moderat til fremskreden benkreftsmerte. Se Luger et al., Pain 99:397-406 (2002); Clohisy et al., Clinical Orthopaedics and Related Research 415S:S279-S288 (2003); Schwei et al., J. Neurosci. 19:10886-10897 (1999); Honore et al., Nat. Med. 6:521-529 (2000). Publikasjoner av Honore et al. og Schwei et al. bekrefter at den nevrokjemiske signaturen for observerte endringer i ryggmargen og DRG hos benkreftbærende dyr er unik og mulig å skille fra enten typisk betennelsessmerte eller typisk nevropatisk smerte selv om det ser ut til å være komponenter i denne biokjemiske signaturen som ligner klassiske betennelses- og nevropatiske smertetilstander i denne modellen. Honore et al. Neuroscience 98:585-598 (2000); Schwei et al., J. Neurosci. 19:10886-10897 (1999); Luger et al., Pain 99:397-406 (2002).

WO 02/096458 vedrører anvendelse av anti-NGF antistoffer, bl.a. mAb 911, til behandling av NGF-relaterte forstyrrelser slik som astma, artritt og psoriasis. Det fremkommer at anti-NGF antistoffer kan anvendes til behandling av sykdommer som er forbundet med forhøyede nivåer av NGF, herav hyperalgesia og kronisk smerte. Det vises at behandling med anti-NGF Mab 911 blokkerte NGF indusert termisk hyperalgesia, dvs. følsomhet overfor smerte.

US 5,147,294 beskriver behandling av kronisk smerte vha. en antagonist av en nerve-vekstfaktor. Antagonisten kan være et monoklonalt antistoff mot NGF som nøytraliserer NGF aktiviteten ved reaktiv kontakt. Kronisk smerte assosiert med strukturelle sykdommer kjennetegnes av langvarige perioder med smerte forårsaket av bl.a. metastatisk cancer.

Kort oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er basert på oppdagelsen av at antagonister av NGF, slik som et anti-NGF-antistoff, er effektive i å behandle benkreftsmerte inkludert kreftsmerte assosiert med benmetastaser. Behandlingen tar for seg ett eller flere aspekter av benkreftsmerte inkludert kreftsmerte assosiert med benmetastaser som er beskrevet her.

Oppfinnelsen kjennetegnes ved at den vedrører anvendelse av en nervevekstfaktor (NGF)-antagonist for fremstilling av et medikament til behandling av benkreftsmerte i et individ, hvor NGF-antagonisten er et anti-NGF-antagonistantistoff som binder seg til den samme NGF epitopen som, og/eller konkurrerer for binding til NGF med et antistoff som omfatter en tungkjede variabel region som består av aminosyre sekvensen med SEKV ID Nr.

1 og en lettkjede variabel region som består av aminosyre sekvensen med SEKV ID Nr. 2, og hvor anti-NGF-antagonistantistoffet binder humant NGF med en KD på omtrent 0,1 nM eller mindre enn omtrent 0,1 nM.

I ett aspekt frembringer oppfinnelsen anvendelsen an en anti-NGF antagonist for fremstilling av et medikament for behandling av benkreftsmerte inkludert kreftsmerte assosiert med benmetastaser (også betegnet ”benmetastasesmerte”). I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med en NSAID. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med et opioid smertestillende middel og en NSAID. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten ikke koadministrert med et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten ikke koadministrert med NSAID.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen anvendelsen an en anti-NGF antagonist for fremstilling av et medikament for å redusere forekomst av benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser, lindring av benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser, døyving av benkreftsmerte inkludert kreftsmerte assosiert med benmetastaser og/eller forsinkelse av utviklingen eller progresjonen av benkreftsmerte inkludert kreftsmerte assosiert med benmetastaser hos et individ. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med en NSAID. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med et opioid smertestillende middel og en NSAID. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten ikke koadministrert med et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten ikke koadministrert med en NSAID.

I noen utførelsesformer er benkreftsmerten fra kreft som stammer fra ben. I noen utførelsesformer er benkreftsmerten fra osteosarkom. I noen utførelsesformer er benkreftsmerten fra kreft som er metastasert i ben. I noen utførelsesformer er benmetastasen prostatakreft som er metastasert i ben. I noen utførelsesformer er benmetastasen brystkreft som er metastasert i ben. I noen utførelsesformer er benmetastasen lungekreft som er metastasert i ben. I noen utførelsesformer er benmetastasen sarkom som er metastasert i ben. I noen utførelsesformer er benmetastasen nyrekreft som er metastasert i ben. I noen utførelsesformer er benmetastasen multippelt myelom som er metastasert i ben. I noen utførelsesformer er kreftsmerten som blir behandlet mild til moderat. I noen utførelsesformer er kreftsmerten som blir behandlet moderat til alvorlig. I noen utførelsesformer er kreftsmerten som blir behandlet alvorlig.

En NGF-antagonist som er passende til anvendelse ifølge oppfinnelsen er ethvert middel som direkte eller indirekte kan føre til minsket biologisk NGF-aktivitet. I noen utførelsesformer binder en NGF-antagonist (f.eks. et antistoff) til (interagere fysisk med) NGF, binder til en NGF-reseptor (slik som trkA-reseptor og/eller p75) og/eller reduserer (forhindrer og/eller blokkerer) nedstrøms-NGF-reseptorsignalering (f.eks. inhibitorer av kinasesignalering). I noen utførelsesformer binder dermed en NGF-antagonist (fysisk interagerer med) NGF. I andre utførelsesformer binder en NGF-antagonist til en NGF-reseptor (slik som TrkA-reseptor og/eller p75). I andre utførelsesformer reduserer en NGF-antagonist (forhindrer og/eller blokkerer) nedstrøms-NGF-reseptorsignalering (f.eks. inhibitorer av kinasesignalering). I andre utførelsesformer inhiberer (reduserer) en NGF-antagonist NGF-syntese og/eller frigjøring. I en annen utførelsesform er NGF-antagonisten et TrkA-immunadhesin. I noen utførelsesformer binder NGF-antagonisten NGF (slik som hNGF) og binder ikke vesentlig til beslektede neurotrofiner, slik som NT-3, NT4/5 og/eller BDNF. I noen utførelsesformer er NGF-antagonisten valgt fra enhver eller flere av de følgende: et anti-NGF-antistoff, et antisensmolekyl rettet mot en NGF (inkludert et antisensmolekyl som er rettet mot en nukleinsyre som koder for NGF), et antisensmolekyl rettet mot en NGF-reseptor (slik som TrkA og/eller p75) inkludert et antisensmolekyl som er rettet mot en nukleinsyre som koder for en NGF-reseptor, en inhibitorisk NGF-forbindelse, en strukturell NGF-analog, en dominant-negativ mutasjon av en TrkA og/eller p75-reseptor som binder en NGF, et anti-TrkA-antistoff, et anti-p75-antistoff og en kinaseinhibitor. I en annen utførelsesform er NGF-antagonisten et anti-NGF-antistoff. I nok en annen utførelsesform er anti-NGF-antistoffet humanisert (slik som antistoff-E3 som er beskrevet her). I noen utførelsesformer er anti-NGF-antistoffet antistoff-E3 (som beskrevet her). I andre utførelsesformer omfatter anti-NGF-antistoffet én eller flere CDR for antistoff E3 (slik som én, to, tre, fire, fem eller i noen utførelsesformer alle seks CDR’ene fra E3). I andre utførelsesformer er antistoffet humant. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet tre CDR’er fra tungkjeden til E3. I noen utførelsesformer omfatter antistoffet tre CDR’er fra lettkjeden til E3. I andre utførelsesformer omfatter anti-NGF-antistoffet aminosyresekvensen til tungkjedevariabelregionen som vist i tabell 1 (SEKV. ID nr. 1). I andre utførelsesformer omfatter anti-NGF-antistoffet aminosyresekvensen til lettkjedevariabelregionen som er vist i tabell 2 (SEKV. ID nr. 2). I andre utførelsesformer omfatter anti-NGF-antistoffet aminosyresekvensen til tungkjedevariabelregionen som er vist i tabell 1 (SEKV. ID nr. 1) og aminosyresekvensen til lettkjedevariabelregionen som er vist i tabell 2 (SEKV. ID nr. 2). I andre utførelsesformer omfatter antistoffet en modifisert konstant region, slik som en konstant region som er immunologisk inert, f.eks. som ikke utløser komplementmediert lysis, eller som ikke stimulerer antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC). I andre utførelsesformer er konstantregionen modifisert som beskrevet i Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; PCT-søknad nr. PCT/GB99/01441; og/eller UK patentsøknad nr. 9809951.8.

I noen utførelsesformer binder NGF-antagonisten til NGF. I andre utførelsesformer er NGF-antagonisten et antistoff som binder spesifikt til NGF (slik som humant NGF). I andre utførelsesformer binder antistoffet hovedsakelig den samme NGF-epitope-6 som et antistoff som er valgt fra ethvert eller flere av de følgende monoklonale museantistoffene: MAb 911, Mab 912 og MAb 938 (se Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)). I noen utførelsesformer binder NGF-antagonisten til trkA-reseptoren. NGF-antagonisten kan være et monoklonalt anti-humant NGF (anti-hNGF)-antistoff som er i stand til å binde hNGF og effektivt inhibere bindingen av hNGF til human TrkA (hTrkA) og/eller effektivt inhibere aktivering av human TrkA-reseptor.

Bindingsaffiniteten til et anti-NGF-antistoff mot NGF (slik som hNGF) kan være omtrent 0,10 til omtrent 1,0 nM, omtrent 0,10 nM til omtrent 0,80 nM, omtrent 0,15 til omtrent 0,75 nM og omtrent 0,18 til omtrent 0,72 nM. I én utførelsesform er bindingsaffiniteten mellom omtrent 2 pM og 22 pM. I noen utførelsesformer er bindingsaffiniteten omtrent 10 nM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten mindre enn omtrent 10 nM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten omtrent 0,1 nM eller omtrent 0,07 nM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten mindre enn omtrent 0,1 nM, eller mindre enn omtrent 0,07 nM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten enhver av omtrent 100 nM, omtrent 50 nM, omtrent 10 nM, omtrent 1 nM, omtrent 500 pM, omtrent 100 pM eller omtrent 50 pM til enhver av omtrent 2 pM, omtrent 5 pM, omtrent 10 pM, omtrent 15 pM, omtrent 20 pM eller omtrent 40 pM. I noen utførelsesformer er bindingsaffiniteten enhver av omtrent 100 nM, omtrent 50 nM, omtrent 10 nM, omtrent 1 nM, omtrent 500 pM, omtrent 100 pM eller omtrent 50 pM eller mindre enn omtrent 50 pM. I noen utførelsesformer er bindingsaffiniteten mindre enn av noen av omtrent 100 nM, omtrent 50 nM, omtrent 10 nM, omtrent 1 nM, omtrent 500 pM, omtrent 100 pM eller omtrent 50 pM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten omtrent 2 pM, omtrent 5 pM, omtrent 10 pM, omtrent 15 pM, omtrent 20 pM, omtrent 40 pM eller større enn omtrent 40 pM. Slik som det er velkjent på fagområdet kan bindingsaffinitet bli uttrykt som KD, eller dissosiasjonskonstant, og en økt bindingsaffinitet tilsvarer en minsket KD. Bindingsaffiniteten for monoklonalt anti-NGF-museantistoff 911 (Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000) for humant NGF er omtrent 10 nM, og bindingsaffiniteten for humanisert anti-NGF-antistoff E3 (som er beskrevet her) for humant NGF er omtrent 0,07 nM. Bindingsaffiniteter for antistoff 911 og E3 blir målt ved å benytte deres Fab-fragmenter.

NGF-antagonisten kan bli administrert før, i løpet av og/eller etter at et individ har blitt diagnostisert med benkreft eller etter at kreften har metastasert seg i ben.

Administrering av en NGF-antagonist kan foregå på enhver måte som er kjent på fagområdet, inkludert oralt, intravenøst, subkutant, intraarterielt, intramuskulært, intrakardielt, intraspinalt, intratoraktisk, intraperitonealt, intraventrikulært, sublingvalt og/eller transdermalt. I noen utførelsesformer er NGF-antagonisten et anti-NGF-antistoff, og administreringen foregår på én eller flere av de følgende måtene: intravenøst, subkutant, via inhalering, intraarterielt, intramuskulært, intrakardielt, intraventrikulært og intraperitonealt. Administrering kan være systemisk, f.eks. intravenøs eller lokalisert.

I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten administrert i en dose på omtrent 0,1-10 mg/kg kroppsvekt og i andre utførelsesformer blir NGF-antagonisten administrert i en dose på omtrent 0,3-2,0 mg/kg kroppsvekt.

I et annet aspekt vedrører oppfinnelsen en sammensetning til behandling og/eller forebygging av benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser som omfatter en effektiv mengde av en nervevekstfaktor (NGF)-antagonist i kombinasjon med én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienser. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med en NSAID. I noen utførelses-former blir NGF-antagonisten ikke koadministrert med et opioid smertestillende middel enn NSAID. I noen utførelsesformer er NGF-antagonisten et antistoff som spesifikt binder til NGF-molekylet. I andre utførelsesformer er NGF-antagonisten enhver antagonist som er beskrevet her.

I et annet aspekt vedrører oppfinnelsen et sett til anvendelse i enhver av fremgangsmåtene som er beskrevet her. I noen utførelsesformer omfatter settet enhver av NGF-antagonistene som er beskrevet her, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer. I andre utførelsesformer omfatter settet ytterligere instruksjoner for anvendelse av NGF-antagonisten i enhver av fremgangsmåtene som er beskrevet her.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 er en graf som viser pågående smerte som vurderes ved spontan sammenhukning og spontan unnviking i løpet av en 2 min. observasjonsperiode på dag 10 og dag 14 eller sarkominjeksjon. ”Naiv” refererer til dyr uten noen injeksjon. ”Sham veh.” refererer til dyr som er injisert med α-minimum essensielt medium inn i marghulen i lårbenet og senere injisert med fysiologisk saltløsning. ”Sarc Veh.” referere til dyr som er injisert med sarkom inn i marghulen i lårbeinet og senere injisert med fysiologisk saltløsning. ”Sarc Anti-NGF” refererer til dyr som er injisert med sarkom i marghulen i lårbeinet og senere injisert med anti-NGF-antistoff 911.

Figur 2 er en graf som viser ambulerende smerte slik den er undersøkt ved bruk av lemmer og tvunget ambulerende gardering (rotarod) på dag 10 og 14 etter sarkominjeksjon. ”Naiv” refererer til dyr uten noen injeksjon. ”Sham veh.” refererer til dyr som er injisert med α-minimum essensielt medium inn i marghulen i lårbeinet og senere injisert med fysiologisk saltløsning. ”Sarc veh.” refererer til dyr som er injisert med sarkom i marghulen i lårbeinet og senere injisert med fysiologisk saltløsning. ”Sarc Anti-NGF” refererer til dyr som er injisert med sarkom i marghulen i lårbeinet og senere injisert med anti-NGF-antistoff 911.

Figur 3 er en graf som viser berøringsfremkalt smerte som vurderes ved palpitasjonsindusert gardering og palpitasjonsindusert sammenunnviking i løpet av en 2 min. observasjonsperiode på dag 10 og dag 14 etter sarkominjeksjon. ”Naiv” refererer til dyr uten noen injeksjon. ”Sham veh.” refererer til dyr som er injisert med α-minimum essensielt medium inn i marghulen i lårbeinet og senere injisert med fysiologisk saltløsning. ”Sarc veh.” refererer til dyr som er injisert med sarkom i marghulen i lårbeinet og senere injisert med fysiologisk saltløsning. ”Sarc Anti-NGF” refererer til dyr som er injisert med sarkom i marghulen i lårbeinet og senere injisert med anti-NGF-antistoff 911.

Figur 4 viser fotografier som viser at anti-NGF-antistoffet ikke hadde noen effekt på sykdomsprogresjon i ben på dag 14 (d14) etter tumorinjeksjon. Sham-dyr (n=8) som er gitt vehikkel (sham vehikkel) er vist i (a) og (d), sarkom (GFP-transfektert)-injiserte dyr (n=13), gitt vehikkel (sarkom vehikkel) er vist i (b) og (e) og sarkom (GFP-transfektert)-injiserte dyr (n=8), gitt anti-NGF-antistoffet (sarkom anti-NGF) er vist i (c) og (f). Figur 4a, 4b og 4c er radiografer som viser tilstedeværelse eller fravær av benødeleggelse. Figur 4d, 4e og 4f er fotografier som viser immunfarging med anti-GFP-antistoff. Skaleringsstolpe: 1 mm.

Figur 5 viser fotografier som viser at anti-NGF-antistoffbehandlingen ikke hadde noen observerbar effekt på sensorisk nerveforsyning i hud. Hudprøver fra bakpoter fra både sarkominjiserte (a, b) og naive (c, d) mus ble immunfarget for det nevropeptid-kalsitoningenbeslektede peptidet (CGRP) som merker ikke-myelinerte peptiderge sensoriske nervefibre. Immunfarging av CGRP fra hudprøve fra bakpote fra sarkominjiserte og vehikkelbehandlede (a, n=3) mus, sarkominjiserte og anti-NGF-antistoffbehandlede (b, n=8) mus, naive og vehikkelbehandlede (c, n=8) mus og naive og anti-NGF-antistoffbehandlede (d, n=8) mus er vist. Skaleringsstolpe: 50 μm.

Figur 6 viser grafer som viser at anti-NGF-behandling avsluttet benkreftsmerte. Tiden som ble brukt sammenhuket og antall spontane unnvikinger i det sarkominjiserte lemmet over en 2 min. observasjonsperiode ble benyttet som et mål på foreliggende smerte 8, 10, 12 og 14 dager etter injeksjon og avgrensning av sarkomceller til venstre lårben (a, b). Parametere for bevegelsesfremkalt smerte inkluderte kvantifisering av tiden som ble brukt sammenhuket og antallet sammenunnvikinger over en 2 min. observasjonsperiode etter en normalt ikke-skadelig palpasjon i det sarkominjiserte lårbenet (c, d). ”#” indikerer P<0,05 vs. sham vehikkel, og ”*” indikerer P<0,05 vs. sarkom vehikkel.

Figur 7 viser grafer som viser at anti-NGF-behandling ikke hadde noen effekt på termiske eller mekaniske baselinjegrenseverdier og hadde større virkning enn morfin (MS) i å redusere benkreftsmerte. Figur 7a og 7b viser termisk følsomhet (a, n=8 for naive+vehikkel, n=8 for naive+anti-NGF) målt ved ventetid for tilbaketrekning av pote på et termostimulus og mekanisk følsomhet (b, n=8 for naiv+vehikkel, n=8 for naiv+anti-NGF) målt ved 50 % grenseverdi av mekanisk stimulering ved anti-NGF-behandling (10 mg/kg, i.p., hver femte dag) hos naive mus. Figur 7c og 7d viser pågående smerteoppførsel evaluert ved hjelp av måling av spontan gardering (c) over en 2 min. observasjonsperiode, og bevegelsesfremkalt smerte undersøkt ved å måle tiden som blir benyttet sammen-huket (d) over en 2 min. observasjonsperiode etter normal ikke-giftig palpitasjon av distalt lårben. Verdi for spontan gardering (c) og palpatasjonsindusert gardering (d) for naive, sham og vehikkelbehandlede, sarkominjiserte og vehikkelbehandlede, sarkominjiserte og morfin (n=8, 10 mg/kg i.p. administrert 15 min. før testing)-behandlet, sarkominjisert og morfin (n=8, 30 mg/kg i.p. administrert 15 min. før testing)-behandlet, og sarkominjisert og anti-NGF-antistoff (n=8, 10 mg/kg, hver 5. dag i.p. administrert fra 6 dager til 14 dager etter tumorinjeksjon)-behandlede mus er vist. Feilstolper representerer S.E.M. ”#” indikerer P<0,05 versus sham vehikkel (n=8), ”*” indikerer P<0,05 versus sarkom vehikkel og ”+” indikerer P<0,05 versus sarkom morfin.

Figur 8 viser fotografiet som viser at behandling med anti-NGF-antagonist-antistoff reduserte nevrokjemiske endringer og makrofaginfiltrering i dorsalrotganglier (DRG) hos tumorbærende dyr. Figur 8a og 8b viser immunfluorescensfarging av aktiverende transkripsjonsfaktor-3 (ATF-3) i ipsilateral L2 DRG hos tumorbærende dyr behandlet med vehikkel (a, n=8) og behandlet med anti-NGF-antistoff (b, n=8) 14 dager etter tumorimplantasjon. Nedre panel viser immunfluorescensfarging av CD-68 som indikerer tettheten av aktiverte og infiltrerende makrofager rundt skadde sensoriske nevroner i ipsilateral-DRG hos tumorbærende dyr behandlet med vehikkel (c, n=7) og behandlet med anti-NGF-antistoff (d, n=7). Skaleringsstolper a-d = 5 μm.

Figur 9 viser mikrografer som viser at nevrokjemiske endringer assosiert med sentral sensibilisering ble avsluttet ved administrering av anti-NGF. Figur 9A og 9B viser immunfarging av dynorfin i dorsalhornet i ryggmargen hos sarkominjiserte og vehikkelbehandlede mus (A, n=9) og sarkominjiserte og anti-NGF-antistoffbehandlede mus (B, n=4). Figur 9C og 9D viser representative konfokale bilder av c-Fos-uttrykkende nevroner i ryggmargen i sarkominjiserte og vehikkelbehandlede mus (c, n=4) og sarkominjiserte og anti-NGF-antistoffbehandlede mus (D, n=4) etter en normal ikke-skadelig palpitasjon i tumorbærende lemmer. Skaleringsstolpe: 150 μm for A og B, 200 μm for C og D.

Figur 10 viser grafer som viser at anti-NGF-terapi avsluttet prostatatumorindusert benkreftsmerte. Anti-NGF-behandling (10 mg/kg i.p. gitt på dagene 7, 12 og 17 etter tumorinjeksjon) avsluttet pågående benkreftsmerteoppførsel begynnende på dag 7 etter tumorinjeksjon gjennom sykdomsprogresjon. Tiden som ble benyttet sammenhuket og antallet spontane sammenunnvikinger i ACE-1-injiserte lårben over en 2 min. observasjonsperiode ble benyttet som mål på pågående smerte (A, B). Anti-NGF (fylt firkant) reduserte signifikant pågående smerteoppførsel hos tumorinjiserte dyr sammenlignet med ACE-1 vehikkel (åpen firkant) og ble redusert til nesten sham-nivåer på dag 9 for alle parametere (sirkel). Både gardering og unnviking i sham vehikkel dyrene var vesentlig forskjellig fra ACE-1 vehikkeldyr over sykdomsprogresjonen. Anti-NGF-behandling hadde ingen effekt på basale termiske eller mekaniske responser som målt ved tendens til pote-tilbaketrekning og for et termisk stimulus eller økning i grenseverdi for mekanisk stimulering (C, D). Anti-NGF-behandling ga en større reduksjon i pågående smerteoppførsel på dag 19 enn 10 mg/kg eller 30 mg/kg morfin (i.p., 15 min. før testing) (E, F). Bevegelses-fremkalt smerte ble målt ved kvantifisering av tiden som ble tilbragt sammenhuket og antallet av unnvikinger over en 2 min. observasjonsperiode etter en normal ikke-skadelig palpitasjon av ACE-1-injisert lårben (G, H). Feilstolper representerer S.E.M. for Fig. 10A-F indikerer ”#” P<0,05 versus sham vehikkel, ”*” indikerer Pz0,05 versus ACE-1 vehikkel og ”+” indikerer P<0,05 versus ACE-1 morfin. For Fig. 10G og 10H indikerer ”*” P<0,01 versus sham, og ”#” indikerer P<0,01 versus ACE-1 vehikkel.

Figur 11 er fotografier som viser at anti-NGF-antistoffbehandling ikke hadde noe effekt på tumorbildet eller tumorindusert benremodellering. Sham-dyr, gitt vehikkel (A) viste ingen radiografisk eller histologisk (H&E) (D) åpenbar benødeleggelse på dag 19, mens ACE-1 vehikkeldyr (B, E) og ACE-1 anti-NGF-dyr (C, F) viste signifikant tumorvekst og benremodellering når det ble undersøkt radiologisk og histologisk. H = hematopoetiske celler, T = tumor, WB = ACE-1-indusert bendannelse, skaleringsstolpe = 1,5 mm.

Figur 12 er bilder som viser at anti-NGF-terapi ikke signifikant reduserte tumorindusert osteoklastogenese. TRAP-fargede bilder med sham vehikkel (A), ACE-1 vehikkel (B), og ACE-1 anti-NGF (C) illustrerer at proliferasjon forekom i denne modellen langs regioner med tumorindusert benremodellering med en økning i antallet osteoklaster pr. mm<2>i diafysealt intramdeullært område hos både de anti-NGF- og vehikkelbehandlede dyrene sammenlignet med sham vehikkel og naive vehikkeldyr. Det var ingen observerbare forskjeller i histologisk utseende av osteoklastene langs tumor/benovergangen eller makrofager i tumoren når anti-NGF-behandlede dyr (C) ble sammenlignet med vehikkelbehandlede dyr (B). Sham vehikkel (A)-dyr presenterte osteoklastantall og morfologi, og makrofager som ikke var signifikant forskjellig fra naive dyr. Piler = osteoklaster, pilhoder = makrofager, MB = mineralisert ben, H = hematopoetiske celler, T = tumor, skaleringsstolpe: 50 μm.

Figur 13 er fotografier som viser at anti-NGF-terapi ikke påvirket tettheten hos kalsitoninbenrelaterte peptidimmunreaktive (CGRP-IR)-sensoriske fibre i lårbenet. Det var ingen observerbar forskjell i nivået av immunfluorescens eller tetthet av CGRP-IR-fibre mellom ACE-1 vehikkel (A)-dyr og ACE-1 anti-NGF (B)-dyr. Legg også merke til at det var en opprettholdelse av CGRP-IR-fibre med anti-NGF-terapi. T = tumor, skaleringsstolpe: 50 μm.

Figur 14 er fotografier som viser at anti-NGF-terapi ikke påvirket tettheten av kalsitoningenrelaterte peptidimmunreaktive (CGRP-IR)-sensoriske fibre i huden i bakpoten. Det var ingen observerbar forskjell i nivåene av immunfluorescens eller tetthet av CGRP-IR-fibre i hud mellom naive vehikkel (A)-mus og naive anti-NGF (B)-mus. Tilsvarende var det ingen forskjell i nivået av immunfluorescens eller tetthet av CGRP-IR-nervefibre mellom ACE-1 vehikkel (C)-dyr og ACE-1 anti-NGF (D)-dyr. Legg også merke til at det ikke var noen forskjell i CGRP-IR-nervefibre mellom de naive og de ACE-1-injiserte musene (A, B versus C, D). Skaleringsstolpe: 50 μm.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er basert på oppdagelsen av at in vivo-administrering av en terapeutisk effektiv mengde av en NGF-antagonist slik som et monoklonalt anti-NGF-antistoff kan bli benyttet til å behandle benkreftsmerte, inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastase. Oppfinnelsen er basert på observasjoner i en muse-benkreftmodell der administrering av anti-NGF-antagonistantistoff er påfallende effektivt i å redusere både pågående og bevegelsesfremkalt benkreftsmerte.

Oppfinnelsen vedrører forebyggingen eller behandlingen av benkreftsmerte, inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser hos et individ (både hos mennesker og ikke-mennesker) ved å administrere en effektiv mengde av en NGF-antagonist slik som et anti-NGF-antistoff, f.eks. et monoklonalt anti-humant NGF (antihNGF)-antistoff. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med NSAID. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten ikke koadministrert med et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten ikke koadministrert med en NSAID.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen lindring, forsinkelse av utviklingen av og/eller forebygging av progresjonen av benkreftsmerte, inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastase, som omfatter å administrere en effektiv mengde av en NGF-antagonist til et individ. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med en NSAID. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten ikke koadministrert med et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten ikke koadministrert med en NSAID.

Oppfinnelsen vedrører også preparater og sett til anvendelse ved behandling av benkreftsmerte, inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastase, som omfatter en NGF-antagonist slik som et anti-NGF-antistoff, f.eks. et monoklonalt anti-NGF-antistoff, til anvendelse i enhver av fremgangsmåtene som her blir omtalt. I noen utførelsesformer er anti-NGF-antistoffet i stand til å effektivt inhibere NGF-binding til sin TrkA- og/eller p75-reseptor og/eller i å effektivt inhibere NGF fra å aktivere sin TrkA- og/eller p75-reseptor.

Generelle teknikker

Utøvelsen av foreliggende oppfinnelse vil benytte, dersom ikke annet er indikert, konvensjonelle teknikker for molekylær biologi (inkludert rekombinante teknikker), mikrobiologi, cellebiologi, biokjemi og immunologi, som alle ligger innenfor det fagfolk er i stand til å utføre. Slike teknikker er fullt ut forklart i litteraturen, slik som i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, red., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, red., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, red. 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather og P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths og D.G. Newell, red., 1993-9) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir og C.C. Blackwell, red.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller og M.P. Calos, red., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al., red., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., red., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., red., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway og P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty, red., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd og C. Dean, red., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow og D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti og J.D. Capra, red., Harwood Academic Publishers, 1995).

Definisjoner

Et “antistoff” (benyttet om hverandre i flertallsform) er et immunglobulinmolekyl som er i stand til spesifikk binding med et mål, slik som et karbohydrat, polynukleotid, lipid, polypeptid, osv., gjennom minst ett antigengjenkjenningssete, lokalisert i variabelregionen til immunglobulinmolekylet. Som anvedt her omfatter uttrykket ikke bare intakte polyklonale eller monoklonale antistoffer, men også fragmenter derav (slik som Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), enkeltkjede (ScFv), mutanter derav, fusjonsproteiner som omfatter en antistoffdel, humaniserte antistoffer, kimære antistoffer, diastoff, lineære antistoffer, enkeltkjedeantistoffer, multispesfikke antistoffer (f.eks. bispesifikke antistoffer) og enhver annen modifisert konfigurasjon av immunglobulinmolekylet som omfatter et antigengjenkjenningssete av den ønskede spesifisiteten. Et antistoff inkluderer et antistoff av enhver klasse, slik som IgG, IgA eller IgM (eller underklasser derav), og antistoffet behøver ikke være fra noen spesiell klasse. Avhengig av antistoff-aminosyresekvensen til konstantdomenet i dets tunge kjeder, kan immunglobulinet bli tilordnet forskjellige klasser. Det er fem hovedklasser av immunglobuliner: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM, og flere av disse kan bli ytterligere delt i underklasser (isotyper), f.eks. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 og IgA2. Tungkjedekonstantdomenene som svarer til de forskjellige klassene av immunglobuliner blir henholdsvis kalt alfa, delta, epsilon, gamma og mu.

Subenhetstrukturene og de tredimensjonale konfigurasjonene for forskjellige klasser av immunglobuliner er velkjente.

Et ”monoklonalt antistoff” refererer til en homogen antistoffpopulasjon der det monoklonale antistoffet er sammensatt av aminosyrer (naturlig forekommende og ikkenaturlig forekommende) som er involvert i den selektive bindingen av et antigen. En populasjon av monoklonale antistoffer er svært spesifikk, der den er rettet direkte mot et enkelt antigensete. Uttrykket ”monoklonalt antistoff” omfatter ikke bare intakte monoklonale antistoffer og fullengde monoklonale antistoffer, men også fragmenter derav (slik som Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), enkeltkjede (ScFv), mutanter derav, fusjonsproteiner som omfatter en antistoffdel, humaniserte monoklonale antistoffer, kimære monoklonale antistoffer og enhver annen modifisert konfigurasjon av immunglobulinmolekylet som omfatter et antigengjenkjenningssete med den nødvendige spesifisiteten og evnen til å binde til et antigen. Det er ikke ment å skulle være begrenset med hensyn på kilden som antistoffet eller måten det er fremstilt på (f.eks. ved hjelp av hybridom, fag-seleksjon, rekombinant ekspresjon, transgene dyr, osv.).

Som anvedt her refererer uttrykket ”nervevekstfaktor” og ”NGF” til nervevekstfaktor og varianter derav som opprettholder i det minste en del av aktiviteten til NGF. Som anvendt her inkluderer NGF alle pattedyrarter av nativ sekvens NGF, inkludert menneske, hund, kattedyr, hester eller storfe.

”NGF-reseptor” refererer til et polypeptid som er bundet av eller aktivert av NGF. NGF-reseptorer inkluderer TrkA-reseptoren og p75-reseptoren fra enhver pattedyrart, inkludert menneske, hunder, kattedyr, hester, primater eller storfe.

En ”NGF-antagonist” refererer til ethvert molekyl som blokkerer, undertrykker eller reduserer (inkludert signifikant) NGF-biologisk aktivitet, inkludert nedstrømsveier som er mediert ved NGF-signalering, slik som reseptorbinding og/eller fremkalling av en cellulær respons på NGF. Uttrykket ”antagonist” innebærer ingen spesifikk mekanisme for biologisk virkning over hodet, og skal inkludere og omfatte alle mulige farmakologiske, fysiologiske og biokjemiske interaksjoner med NGF, enten direkte eller indirekte, eller om den interagerer med NGF, dens reseptor eller gjennom en annen mekanisme, og dens konsekvenser som kan bli oppnådd i en rekke forskjellige og kjemisk divergerende sammensetninger.

Eksempelmessige NGF-antagonister inkluderer et anti-NGF-antistoff, et antisensmolekyl rettet mot en NGF (inkludert et antisensmolekyl rettet mot en nukleinsyre som koder for NGF), en NGF-inhibitorisk forbindelse, en NGF-strukturell analog, en dominant-negativ mutasjon for en TrkA-reseptor som binder en NGF, et TrkA-immunadhesin, et anti-TrkA-antistoff, et anti-p75-antistoff og en kinaseinhibitor. For formålet med foreliggende oppfinnelse vil det bli eksplisitt forstått at uttrykket ”antagonist” omfatter alle tidligere identifiserte uttrykk, titler og funksjonelle tilstander og karakteristika hvorved NGF selv, en biologisk NGF-aktivitet (inkludert dens evne til å mediere ethvert aspekt av kreftsmerte assosiert med benmetastaser), eller konsekvensene av den biologiske aktivitet er vesentlig fjernet, redusert eller nøytralisert i enhver meningsfull grad. I noen utførelsesformer binder (fysisk interagerer med) en NGF-antagonist (f.eks. et antistoff) NGF, binder til en NGF-reseptor (slik som TrkA-reseptor og/eller p75-reseptor), reduserer (forhindrer og/eller blokkerer) nedstrøms NGF-reseptorsignalering og/eller inhiberer (reduserer) NGF-syntese, produksjon eller frigjøring. I andre utførelsesformer binder en NGF-antagonist NGF og forhindrer TrkA-reseptordimerisering og/eller TrkA-autofosforylering. I andre utførelsesformer inhiberer eller reduserer en NGF-antagonist NGF-syntese og/eller produksjon (frigjøring). Eksempler på typer av NGF-antagonister er tilveiebrakt her.

Som anvedt her refererer et ”anti-NGF-antistoff” til et antistoff som er i stand til å binde til NGF og inhibere NGF-biologisk aktivitet og/eller nedstrømsveier mediert ved NGF-signalering.

Et ”TrkA-immunadhesin” refererer til et løselig kimært molekyl som omfatter et fragment av en TrkA-reseptor, for eksempel. det ekstracellulære domenet til en TrkA-reseptor og en immunglobulinsekvens som beholder bindingsspesifisiteten til TrkA-reseptoren.

”Biologisk aktivitet” for NGF refererer vanligvis til evnen til å binde NGF-reseptorer og/eller aktivere NGF-reseptorsignaleringsveier. En biologisk aktivitet inkluderer enhver av eller flere av de følgende: evnen til å binde en NGF-reseptor (slik som p75 og/eller TrkA), evnen til å fremme TrkA-reseptordimerisering og/eller autofosforylering, evnen til å aktivere en NGF-reseptorsignaleringsvei, evnen til å fremme celledifferensiering, proliferasjon, overlevelse, vekst, migrasjon og andre endringer i cellefysiologi, inkludert (i tilfellet med nevroner, inkludert perifere og sentrale nevroner) endringer i nevronmorfologi, synaptogenese, synaptisk funksjon, neurotransmitter- og/eller nevropeptidfrigjøring og/eller regenerering etter skade og evnen til å mediere kreftsmerte assosiert med benmetastase.

Som anvendt her er ”behandling” en tilnærming for å oppnå fordelaktige eller ønskede kliniske resultater. For formålet med denne oppfinnelsen inkluderer fordelaktige eller ønskede kliniske resultater én eller flere av de følgende: forbedring i ethvert aspekt av smerte inkludert nedsatt alvorlighetsgrad, lindring av ett eller flere symptomer assosiert med benkreftsmerte (f.eks. kreftsmerte assosiert med benmetastaser) inkludert ethvert aspekt av benkreftsmerte (slik som forkortelse av varigheten av smerte og/eller reduksjon av smertefølsomhet eller fornemmelse).

En ”effektiv mengde” er en mengde som er tilstrekkelig til å føre til fordelaktige eller ønskede kliniske resultater, inkludert lindring eller reduksjon av smerte. For formålet med denne oppfinnelsen er en effektiv mengde av en NGF-antagonist en mengde som er tilstrekkelig til å behandle, lindre, redusere intensiteten av eller forhindre benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser. I noen utførelsesformer kan den ”effektive mengden” redusere smerten ved pågående smerte og/eller gjennombruddssmerte (inkludert ambulerende smerte og berøringsfremkalt smerte) og den kan bli administrert før, i løpet av og/eller etter at kreften har metastasert seg i ben. I noen utførelsesformer er den ”effektive mengden” en mengde som er tilstrekkelig til å forsinke utviklingen av benkreftsmerte, inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser.

”Redusere omfang” av smerte betyr enhver av å redusere alvorlighet (som kan inkludere å redusere behovet for og/eller mengden av (f.eks. eksponering overfor) andre legemidler og/eller terapier som vanligvis blir benyttet ved disse tilstandene), varigheten og/eller hyppigheten (inkludert for eksempel forsinkelse eller økning av tid til benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastase hos et individ). Slik som det er åpenbart for fagfolk på området kan individer variere når det gjelder deres respons overfor behandling, og som sådan reflekterer for eksempel en ”fremgangsmåte for å redusere omfang av benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastase hos et individ” administrering av NGF-antagonisten som er beskrevet her basert på en rimelig forventning om at slik administrering sannsynligvis kan forårsake en slik reduksjon i forekomst hos dette spesielle individet.

”Lindring” av benkreftsmerte (slik som kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser) eller av ett eller flere symptomer på benkreftsmerte betyr en nedgang i eller forbedring av ett eller flere symptomer på en benkreftsmerte sammenlignet med ikke å administrere en NGF-antagonist. ”Lindring” inkluderer også forkortelse eller reduksjon i varigheten av et symptom.

”Døyving” av benkreftsmerte (slik som kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser) eller av ett eller flere symptomer på en benkreftsmerte betyr minskning av omfanget av én eller flere uønskede kliniske manifestasjoner av benkreftsmerte hos et individ eller en populasjon av individer som blir behandlet med en NGF-antagonist i overensstemmelse med oppfinnelsen.

Som anvendt her betyr ”forsinkelse” av utviklingen av benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser å utsette, hindre, sinke, stoppe, stabilisere og/eller utsette progresjon av benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser. Denne forsinkelsen kan ha varierende lengder av tid, avhengig av sykehistorien og/eller individene som blir behandlet. Som det er åpenbart for fagfolk på området kan en tilstrekkelig eller signifikant forsinkelse i realiteten omfatte forebygging, ved at individet ikke utvikler benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser. En fremgangsmåte som ”forsinker” utvikling av symptomet er en fremgangsmåte som reduserer sannsynligheten for å utvikle symptomet innenfor en gitt tidsramme og/eller redusere omfanget av symptomer i en gitt tidsramme, når den sammenlignes med ikke å benytte fremgangsmåten. Slike sammenligninger er typisk basert på kliniske studier, ved å anvende et antall individer som er tilstrekkelig til å gi et statistisk signifikant resultat.

”Utvikling” eller ”progresjon” for benkreftsmerte, inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastase, betyr innledende manifestasjoner og/eller påfølgende progresjon av forstyrrelsen. Utvikling av benkreftsmerte, inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastase, kan være påvisbart og vurdert ved å benytte standard kliniske teknikker som er velkjente på fagområdet. Utvikling refererer imidlertid også til progresjon som kan være ikke-påvisbar. For formålet med denne oppfinnelsen refererer utvikling eller progresjon til den biologiske forløpet av symptomene. ”Utvikling” inkluderer forekomst, tilbakefall og oppstart. Som anvedt her inkluderer ”start” eller ”forekomst” for benkreftsmerte (slik som kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser” innledende oppstart og/eller tilbakefall.

Som anvedt her inkluderer ”koadministrering” samtidig administrering og/eller administrering ved forskjellige tidspunkter. Koadministrering omfatter også administrering som en koformulering (dvs. NGF-antagonisten og et middel er tilstede i den samme sammen-setningen) eller administrering som separate preparater. Som anvedt her er koadministrering ment å omfatte ethvert tilfelle der midlet og NGF-antagonisten blir administrert til et individ, som kan foregå samtidig og/eller separat. Som ytterligere diskutert her er det forstått at NGF-antagonisten og et middel kan bli administrert ved forskjellige doseringsfrekvenser eller intervaller. For eksempel kan et anti-NGF-antistoff bli administrert ukentlig, mens midlet kan bli administrert hyppigere. Det er forstått slik at NGF-antagonisten og midlet kan bli administrert ved å benytte samme administreringsmåte eller forskjellige administreringsmåter.

Uttrykket ”opioid smertestillende middel” refererer til alle legemidler, naturlige eller syntetiske, med morfinlignende virkninger. De syntetiske og halvsyntetiske opioide smertestillende midlene er derivater av fem kjemiske klasser av forbindelser: fenantrener, fenylheptylaminer, fenylpiperidiner, morfinaner og benzomorfaner, der alle disse ligger innenfor omfanget av uttrykket. Eksempler på opioide smertestillende midler inkluderer kodein, dehydrokodein, diacetylmorfin, hydrokodon, hydromorfon, levorfanol, oksymorfon, alfentanil, buprenorfin, butorfanol, fentanyl, sufentanyl, meperidin, metadon, nalbufin, propoksyfen og pentazosin eller farmasøytisk akseptable salter derav.

Uttrykket ”NSAID” refererer til en ikke-steroid, antiinflammatorisk forbindelse. NSAID’er er kategorisert i kraft av deres evne til å inhibere syklooksygenase.

Syklooksygenase-1 og syklooksygenase-2 er to hovedisoformer av syklooksygenase og de fleste standard-NSAID’er er blandede inhibitorer av de to isoformene. De fleste standard-NSAID’er faller innenfor én av de følgende fem strukturelle kategoriene: (1) propionsyrederivater, slik som ibuprofen, naproksen, naprosyn, diklofenak og ketoprofen, (2) eddiksyrederivater slik som tolmetin og slindak, (3) fenaminsyrederivater slik som mefanaminsyre og meklofenaminsyre, (4) bifenylkarboksylsyrederivater slik som diflunisal og flufenisal, og (5) oksikamer slik som piroksim, sudoksikam og isoksikam.

En annen klasse av NSAID har blitt beskrevet som selektivt inhiberer syklooksygenase-2. Cox-2-inhibitorer har blitt beskrevet, f.eks. i US patentskrifter nr.

5 616 601, 5 604 260, 5 593 994, 5 550 142, 5 536 752, 5 521 213, 5 475 995, 5 639 780, 5 604 253, 5 552 422, 5 510 368, 5 436 265, 5 409 944 og 5 130 311. Visse eksempelmessige COX-2-inhibitorer inkludert celecoxib (SC-58635), DUP-697, flosulid (CGP-28238), meloksikam, 6-metoksy-2-naftyleddiksyre (6-MNA), rofekoksib, MK-966, nabumeton (prolegemiddel for 6-MNA), nimesulid, NS-398, SC-5766, SC-58215, T-614 eller kombinasjoner derav.

Et ”individ” er et pattedyr, mer foretrukket et menneske. pattedyr inkluderer, gårdsdyr, sportsdyr, kjæledyr, primater, hester, hunder, katter, mus og rotter.

Anvendelse i fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen

Med hensyn på alle fremgangsmåtene som er beskrevet her inkluderer referanse til en NGF-antagonist også sammensetninger som omfatter ett eller flere av disse midlene. Disse sammensetningene kan ytterligere omfatte passende eksipienser, slik som farmasøytisk akseptable eksipienser (bærere) inkludert buffere, som er velkjente på fagområdet. Foreliggende oppfinnelse kan også bli anvendt alene eller i kombinasjon med andre konvensjonelle fremgangsmåter for behandling.

Fremgangsmåter til forebygging eller behandling av en kreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser

Foreliggende oppfinnelse er nyttig for å behandle, forsinke utviklingen av og/eller forebygge benkreftsmerte, inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastase hos et individ, både hos et menneske og et ikke-menneske. Livskvaliteten hos individer som har benkreft kan bli forbedret.

Kreftmetastaser i ben kan være assosiert med en netto bendannelse eller en netto benødeleggelse. I noen utførelsesformer blir fremgangsmåten anvendt for å behandle benkreftsmerte som er assosiert med en netto bendannelse (osteoblastisk aktivitet), slik som for å behandle smerte ved prostatakreftmetastaser i ben. I noen utførelsesformer blir fremgangsmåten anvendt for å behandle benkreftsmerte som er assosiert med en netto benødeleggelse (osteolytisk aktivitet), slik som for å behandle smerte ved sarkommetastase i ben.

I ett aspekt omtaler således beskrivelsen fremgangsmåte for å behandle benkreftsmerte, inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser, hos et individ, som omfatter å administrere en effektiv mengde av en NGF-antagonist, slik som et anti-NGF-antistoff. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert ved et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med en NSAID. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med et opioid smertestillende middel og en NSAID. I noen utførelsesformer blir mengden av det opioide smertestillende middel og/eller NSAID som blir administrert for lindring av smerte redusert sammenlignet med mengden som ble administrert i fravær av NGF-antagonisten. Skadelige effekter som skyldes det opioide smertestillende midlet og/eller NSAID kan bli redusert eller eliminert når de blir koadministrert med NGF-antagonisten. I noen utførelsesformer blir ikke NGF-antagonisten koadministrert med et opioid smertestillende middel. I andre utførelsesformer blir NGF-antagonisten ikke koadministrert med en NSAID. I andre utførelsesformer blir ikke NGF-antagonisten koadministrert med et opioid smertestillende middel og/eller en NSAID.

I et annet aspekt omtaler beskrivelsen fremgangsmåter for å forebygge, lindre og/eller forebygge utviklingen eller progresjonen av benkreftsmerte, inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med en NSAID. I noen utførelsesformer blir en NGF-antagonisten koadministrert med et opioid smertestillende middel og en NSAID. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten ikke koadministrert med et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten ikke koadministrert med en NSAID. I noen utførelsesformer blir ikke NGF-antagonisten koadministrert med et opioid smertestillende middel og/eller en NSAID.

Det er verdsatt at selv om referanse her vanligvis blir gjort til behandling eller forebygging av benkreftsmerte slik som kreftsmerte som er assosiert med benmetastase så kan NGF-antagonisten bli administrert før en hendelse eller tilstand(er) med en økt risiko for benkreftsmerte.

En NGF-antagonist kan bli administrert i forbindelse med andre terapier for benkreft, slik som stråling og kjemoterapi. NGF-antagonisten kan også bli administrert i forbindelse med andre smertestillende midler som blir benyttet mot benkreftsmerte.

Eksempler på slike smertestillende midler er bisfosfonater (f.eks. alendronat), gabapentin og stråling. Mengden av disse smertestillende midlene som blir administrert for benkreftsmertelindring kan være redusert, sammenlignet med mengden som blir administrert i fravær av NGF-antagonisten. Skadelige effekter som skyldes disse smertestillende midlene kan bli redusert eller eliminert når det blir koadministrert med NGF-antagonisten.

Diagnostisering eller vurdering av smerte er veletablert på fagområdet. Vurdering kan bli utført basert på objektive mål, slik som observasjon av oppførsel slik som reaksjon på stimuli, ansiktsuttrykk og lignende. Vurdering kan også bli basert på subjektive mål, slik som pasientkarakterisering av smerte ved å benytte forskjellige smerteskalaer. Se f.eks. Katz et al., Surg Clin North Am. (1999) 79 (2): 231-52, Caraceni et al., J Pain Symptom Manage (2002) 23(3):239-55.

NGF-antagonister

Fremgangsmåtene ifølge beskrivelsen benytter en NGF-antagonist, som refererer til ethvert molekyl som blokkerer, undertrykker eller reduserer (inkludert signifikant) biologisk NGF-aktivitet, inkludert nedstrømsveier som blir mediert ved NGF-signalering, slik som reseptorbinding og/eller utløsning av en cellulær respons overfor NGF. Uttrykket ”antagonist” impliserer ingen spesifikk mekanisme for biologisk virkning over hodet, og skal omfatte og inkludere alle mulige farmakologiske, fysiologiske og biokjemiske interaksjoner med NGF og dens konsekvenser som kan bli oppnådd ved hjelp av en mengde ulike, og kjemisk divergente, sammensetninger. Eksempelmessige NGF-antagonister inkluderer et anti-NGF-antistoff, et antisensmolekyl rettet mot NGF (inkludert et antisensmolekyl som er rettet mot en nukleinsyre som koder for NGF), et antisensmolekyl som er rettet mot en NGF-reseptor (slik som TrkA-reseptor og/eller p75-reseptor) (inkludert et antisensmolekyl rettet mot en nukleinsyre som koder for TrkA og/eller p75), en NGF-inhibitorisk forbindelse, en NGF-strukturell analog, en dominant-negativ mutasjon i en TrkA-reseptor som binder en NGF, et TrkA-immunadhesin, et anti-TrkA-antistoff, en dominant-negativ mutasjon i en p75-reseptor som binder en NGF, et anti-p75-antistoff og en kinaseinhibitor. For formålet ved foreliggende oppfinnelse vil det være slik at uttrykket ”antagonist” omfatter alle de tidligere identifiserte uttrykkene, titlene og funksjonelle tilstandene og karakteristika hvorved NGF selv, en NGF-biologisk aktivitet (inkludert dens evne til å mediere ethvert aspekt av kreftsmerte som er assosiert med benemtastase), eller konsekvensene av den biologiske aktiviteten, i all vesentlighet blir stoppet, minsket eller nøytralisert i enhver meningsfull grad. I noen utførelsesformer binder (interagerer fysisk med) en NGF-antagonist (f.eks. et antistoff) NGF, binder til en NGF-reseptor (slik som TrkA-reseptor og/eller p75-reseptor) og/eller reduserer (hindrer og/eller blokkerer) nedstrøms-NGF-reseptorsignalering. I noen utførelsesformer binder (interagerer fysisk med) en NGF-antagonist dermed NGF. I noen utførelsesformer er NGF-antagonisten et polypeptid som binder til NGF. I noen utførelsesformer er NGF-antagonisten et peptid eller et modifisert peptid (slik som NGF-bindende peptid fusjonert til et Fc-domene) beskrevet i PCT WO 2004/026329. I andre utførelsesformer binder en NGF-antagonist til en NGF-reseptor (slik som TrkA-reseptor eller p75). I andre utførelsesformer reduserer en NGF-antagonist (hindrer og/eller blokkerer) nedstrøms-NGF-reseptorsignalering (f.eks. inhibitorer av kinasesignalering og inhibitorer av nedstrømssignaleringskaskade). I andre utførelsesformer inhiberer (reduserer) en NGF-antagonist NGF-syntese og/eller frigjøring. I en annen utførelsesform er NGF-antagonisten en NGF-antagonist som ikke er et TrkA-immunadhesin (dvs. er forskjellig fra et TrkAimmunadhesin). I en annen utførelsesform er NGF-antagonisten forskjellig fra et anti-NGF-antistoff. I en annen utførelsesform er NGF-antagonisten forskjellig fra et TrkA-immunadhesin og forskjellig fra et anti-NGF-antistoff. I noen utførelsesformer binder NGF-antagonisten NGF (slik som hNGF) og binder ikke vesentlig til beslektede neurotrofiner, slik som NT-3, NT4/5 og/eller BDNF. I noen utførelsesformer er ikke NGF-antagonisten assosiert med en skadelig immunrespons. I andre utførelsesformer er NGF-antagonisten et anti-NGF-antistoff. I andre utførelsesformer er anti-NGF-antistoffet humanisert (slik som antistoff E3 som er beskrevet her). I noen utførelsesformer er anti-NGF-antistoffet antistoff E3 (som beskrevet her). I andre utførelsesformer omfatter anti-NGF-antistoffet én eller flere CDR’er fra antistoff E3 (slik som én, to, tre, fire, fem eller i noen utførelsesformer av alle seks CDR’ene fra E3). I andre utførelsesformer er antistoffet humant. I noen utførelsesformer er antistoffet et humant anti-NGF-nøytraliserende antistoff som beskrevet i WO 2005/019266. I andre utførelsesformer omfatter anti-NGF-antistoffet aminosyresekvensen til tungkjedevariabelregionen som er vist i tabell 1 (SEKV. ID nr. 1) og aminosyresekvensen til lettkjedevariabelregionen som er vist i tabell 2 (SEKV. ID nr. 2). I andre utførelsesformer omfatter antistoffet en modifisert konstantregion slik som en konstantregion som er immunologisk inert, f.eks. som ikke utløser komplementmediert lysis, eller som ikke stimulerer antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC). I andre utførelsesformer er konstantregionen modifisert som beskrevet i Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624, PCT-søknad nr.

PCT/GB99/01441, og/eller UK patentsøknad nr. 9809951.8.

Anti-NGF-antistoffer

I noen utførelsesformer av oppfinnelsen omfatter NGF-antagonisten et anti-NGF-antistoff. Et anti-NGF-antistoff bør oppvise enhver av én eller flere av de følgende karakteristika: (a) binde til NGF og inhibere biologisk NGF-aktivitet og/eller nedstrømsveier som er mediert ved NGF-signaleringsfunksjonen, (b) forebygge, lindre eller behandle ethvert aspekt av benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastase, (c) blokkere eller minske NGF-reseptoraktivering (inkludert TrkA-reseptordimerisering og/eller autofosforylering), (d) øke uttømming av NGF, (e) inhibere (redusere) NGF-syntese, produksjon eller frigjøring.

Anti-NGF-antistoffer er kjent på fagområdet, se f.eks. PCT-publikasjon nr. WO 01/78698, WO 01/64247, US patenter nr. 5 844 092, 5 877 016 og 6 153 189, Hongo et al., Hybridoma, 19:215-227 (2000), Cell. Molec. Biol. 13:559-568 (1993), GenBank aksesjonsnr. U39608. U39609, L17078 eller L17077.

I noen utførelsesformer er anti-NGF-antistoffet et monoklonalt, humanisert, museanti-NGF-antistoff betegnet antistoff ”E3” (PCT WO 04/058184), som omfatter den humane tungkjede-IgG2a-konstantregionen som inneholder de følgende mutasjonene: A330P331 til S330S331 (aminosyrenummerering med referanse til villtype-IgG2a-sekvensen, se Eur. J.

Immunol. (1999) 29:2613-2624), den humane lettkjede-kappa-konstantregionen, og tungkjede- og lettkjedevariabelregionene som er vist i tabell 1 og 2.

Tabell 1: Tungkjedevariabelregion QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWG DGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVS

(SEKV. ID nr. 1).

Tabell 2: Lettkjedevariabelregion DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSR FHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRT (SEKV. ID nr. 2).

De følgende polynukleotidene som koder for tungkjedevariabelregionen eller lettkjedevariabelregionen ble deponert hos ATCC 8. januar 2003:

Vektor Eb.911.3E er et polynukleotid som koder for lettkjedevariabelregionen som er vist i tabell 2, vektor Eb.pur.911.3E er et polynukleotid som koder for lettkjedevariabelregionen som er vist i tabell 2 og vektor Db.911.3E er et polynukleotid som koder for tungkjedevariabelregionen som er vist i tabell 1. Disse polynukleotidene koder også for konstantdomener.

Det finnes minst to teknikker for å bestemme CDR’er: (1) en tilnærming basert på kryss-art-sekvensvariabilitet (dvs. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5. utgave, 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)), og (2) en tilnærming som er basert på krystallografiske undersøkelser av antigen-antistoff-komplekser (Chothia et al. (1989) Nature 342:877, Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-947)). Som anvedt her kan en CDR referere til CDR’er som er definert ved en hvilken som helst tilnærming eller ved en kombinasjon av begge tilnærmingene.

I en annen utførelsesform omfatter anti-NGF-antistoffet én eller flere CDR’er fra antistoff E3 (slik som én, to, tre, fire, fem eller i noen utførelsesformer alle seks CDR’ene fra E3). Bestemmelse av CDR-regioner ligger innenfor kunnskapen på fagområdet. CDR’er kan være Kabat, Chothia eller en kombinasjon av Kabat og Chothia.

Antistoffene som er nevnt i foreliggende oppfinnelse kan omfatte monoklonale antistoffer, polyklonale antistoffer, antistoff-fragmenter (f.eks. Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fc, osv.), kimære antistoffer, bispesifikke antistoffer, heterokonjugatantistoffer, enkeltkjede (ScFv), mutanter derav, fusjonsproteiner som omfatter en antistoffdel, humaniserte antistoffer og enhver annen modifisert konfigurasjon av immunglobulinmolekylet som omfatter et antigengjenkjenningssete av nødvendig spesifisitet, inkludert glykosyleringsvarianter av antistoffer, aminosyresekvensvarianter av antistoffer og kovalent modifiserte antistoffer. Antistoffene kan stamme fra mus, rotte, menneske, eller ha ethvert annet opphav (inkludert kimære eller humaniserte antistoffer). For formålet med denne oppfinnelsen reagerer antistoffet med NGF på en måte som inhiberer NGF og/eller nedstrømsveier som er mediert ved NGF-signaleringsfunksjonen. I én utførelsesform er antistoffet et humant antistoff som gjenkjenner én eller flere epitoper på human NGF. I en annen utførelsesform er antistoffet et muse- eller rotteantistoff som gjenkjenner én eller flere epitoper på human NGF. I en annen utførelsesform gjenkjenner antistoffet én eller flere epitoper på en NGF som er valgt fra gruppen som består av: NGF fra primater, hunder, kattedyr, hester og storfe. I en annen utførelsesform omfatter antistoffet en modifisert konstantregion, slik som en konstantregion som er immunologisk inert, som f.eks. ikke utløser komplementmediert lysis, eller som ikke stimulerer antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC). ADCC-aktivitet kan bli undersøkt ved å benytte fremgangsmåter som er tilkjennegjort i US patentskrift nr. 5 500 362. I andre utførelsesformer er konstantregionen modifisert som beskrevet i Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624, PCT-søknad nr. PCT/GB99/01441 og/eller UK patentsøknad nr. 9809951.8.

Bindingsaffiniteten for et anti-NGF-antistoff til NGF (slik som hNGF) kan være omtrent 0,10 til omtrent 0,80 nM, omtrent 0,15 til omtrent 0,75 nM og omtrent 0,18 til omtrent 0,72 nM. I én utførelsesform er bindingsaffiniteten mellom omtrent 2 pM og 22 pM. I noen utførelsesformer er bindingsaffiniteten omtrent 10 nM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten mindre enn omtrent 10 nM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten omtrent 0,1 nM eller omtrent 0,07 nM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten mindre enn omtrent 0,1 nM, eller mindre enn omtrent 0,07 nM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten enhver av omtrent 100 nM, omtrent 50 nM, omtrent 10 nM, omtrent 1 nM, omtrent 500 pM, omtrent 100 pM eller omtrent 50 pM til enhver av omtrent 2 pM, omtrent 5 pM, omtrent 10 pM, omtrent 15 pM, omtrent 20 pM eller omtrent 40 pM. I noen utførelsesformer er bindingsaffiniteten enhver av omtrent 100 nM, omtrent 50 nM, omtrent 10 nM, omtrent 1 nM, omtrent 500 pM, omtrent 100 pM eller omtrent 50 pM eller mindre enn omtrent 50 pM. I noen utførelsesformer er bindingsaffiniteten mindre enn enhver av omtrent 100 nM, omtrent 50 nM, omtrent 10 nM, omtrent 1 nM, omtrent 500 pM, omtrent 100 pM eller omtrent 50 pM. I andre utførelsesformer er bindingsaffiniteten omtrent 2 pM, omtrent 5 pM, omtrent 10 pM, omtrent 15 pM, omtrent 20 pM, omtrent 40 pM eller større enn omtrent 40 pM.

Én måte å bestemme bindingsaffinitet for antistoffer for NGF er å måle bindingsaffiniteten til monofunksjonelle Fab-fragmenter av antistoffet. For å fremskaffe monofunksjonelle Fab-fragmenter kan et antistoff (f.eks. IgG) bli kløyvd med papain eller uttrykt rekombinant. Affiniteten til et anti-NGF-Fab-fragment av et antistoff kan bli bestemt ved hjelp av surface-plasmon-resonans (BIAcore3000<TM>surface plasmon resonance (SPR)-system, BIAcore, INC., Piscataway, NJ). CM5-brikker kan bli aktivert med N-etyl-N’-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiinidhydroklorid (EDC) og N-hydroksysuksinimid (NHS) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Human NGF (eller enhver annen NGF) kan bli fortynnet i 10 mM natriumacetat pH 4,0 og injisert over den aktiverte brikken ved en konsentrasjon på 0,005 mg/ml. Ved å benytte variabel strømningstid over de individuelle brikkekanalene kan to områder med antigentetthet bli oppnådd: 100-200 responsenheter (RU) for detaljerte kinetikkstudier og 500-600 RU til screeningsanalyser. Brikken kan bli blokkert med etanolamin. Regenerasjonsstudier har vist at en blanding av elueringsbuffer fra Pierce (produkt nr. 21004, Pierce Biotechnology, Rockford IL) og 4 M NaCl (2:1) effektivt fjerner det bundne Fab mens aktiviteten til hNGF blir behold på brikken i mer enn 200 injeksjoner. HBS-EP-buffer (0,01M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % surfaktant P20) blir benyttet som kjørebuffer for BIAcore-analysen. Seriefortynninger (0,1-10x estimert KD) av rensede Fab-prøver blir injisert i 1 min. ved 100 μl/min. og dissosieringstider på opptil 2 timer blir tillatt. Konsentrasjonene av Fab-proteinet blir bestemt ved hjelp av ELISA og/eller SDS-PAGE-elektroforese ved å benytte en Fab med kjent konsentrasjon (som bestemt ved aminosyreanalyse) som en standard. Kinetikkassosieringshastigheter (kon) og dissosiasjonshastigheter (koff) blir oppnådd samtidig ved å tilpasse dataene til en 1:1 Langmuir-bindingsmodell (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) ved å benytte BIAevaluationprogrammet. Likevektdissosiasjonskonstant (KD)-verdi blir beregnet som koff/kon. Denne protokollen er egnet for anvendelse ved bestemmelse av bindingsaffinitet av et antistoff mot enhver NGF, inkludert human NGF, NGF fra et annet virveldyr (i noen tilfeller pattedyr) (slik som muse-NGF, rotte-NGF, primat-NGF), så vel som for anvendelse med andre neurotrofiner, slik som de beslektede neurotrofinene NT3, NT4/5 og/eller BDNF.

I noen utførelsesformer binder antistoffet human NGF, og binder ikke signifikant en NGF fra en annen virveldyrart (i noen utførelsesformer pattedyr). I noen utførelsesformer binder antistoffet human NGF så vel som én eller flere NGF fra en annen virveldyrart (i noen utførelsesformer pattedyr). I andre utførelsesformer binder antistoff NGF og kryssreagerer ikke signifikant med andre neurotrofiner (slik som de beslektede neurotrofinene NT3, NT4/5 og/eller BDNF). I noen utførelsesformer binder antistoff NGF så vel som minst ett annet neurotrofin. I noen utførelsesformer binder antistoffet til en pattedyrart av NGF, slik som fra hest eller hund, men binder ikke signifikant til NGF fra andre pattedyrarter.

Epitopen(e) kan være kontinuerlige eller diskontinuerlige. I én utførelsesform binder antistoffet hovedsakelig de samme hNGF-epitopene som et antistoff som er valgt fra gruppen som består av MAb 911, MAb 912 og MAn 938 som beskrevet i Hongo et al., Hybridoma, 19:215-227 (2000). I en annen utførelsesform binder antistoffet hovedsakelig den samme hNGF-epitopen som MAb 911. I en annen utførelsesform binder antistoffet hovedsakelig den samme epitopen som MAb 909. Hongo et al., ovenfor. For eksempel kan epitopen omfatte én eller flere av: restene K32, K34 og E35 i variabelregionen 1 (aminosyrene 23-35) i hNGF, restene Y79 og T81 i variabelregionen 4 (aminosyrene 81-88) i hNGF, restene H84 og K88 i variabelregionen 4, resten R103 mellom variabelregionen 5 (aminosyrene 94-98) i hNGF og C-terminalen (aminosyrene 111-118) i hNGF, resten E11 i pre-variabelregionen 1 (aminosyrene 10-23) i hNGF, Y52 mellom variabelregionen 2 (aminosyrene 40-49) i hNGF og variabelregionen 3 (aminosyrene 59-66) i hNGF, restene L112 og S113 i C-terminalen til hNGF, restene R59 og R69 i variabelregionen 3 i hNGF, eller restene V18, V20 og G23 i prevariabelregonen 1 i hNGF. I tillegg kan en epitop omfatte én eller flere av variabelregion 1, variabelregion 3, variabelregion 4, variabelregion 5, den N-terminale regionen og/eller den C-terminale regionen til hNGF. I en annen utførelsesform reduserer antistoffet signifikant løsemiddeltilgjengeligheten for resten R103 i hNGF. Det er slik at selv om epitopene som er beskrevet ovenfor vedrører human NGF, så kan en fagperson på området sammenstille strukturene til human NGF med NGF fra en annen art og identifisere sannsynlige motparter til disse epitopene.

I ett aspekt kan antistoffer (f.eks. humane, humaniserte, museantistoffer, kimære antistoffer) som kan inhibere NGF bli fremstilt ved å benytte immunogener som uttrykker fullengdesekvenser eller partielle sekvenser av NGF. I et annet aspekt kan et immunogen som omfatter en celle som overuttrykker NGF bli benyttet. Et annet eksempel på et immunogen som kan bli benyttet er NGF-protein som inneholder fullengde-NGF eller en del av NGF-proteinet.

Anti-NGF-antistoffene kan bli fremstilt ved hjelp av enhver fremgangsmåte som er kjent på fagområdet. Måten og tidsplanen for immunisering av vertsdyret er vanligvis i tråd med etablerte og konvensjonelle teknikker for antistoffstimulering og -fremstilling, som ytterligere beskrevet her. Generelle teknikker for fremstilling av humane antistoffer og museantistoffer er kjent på fagområdet og er beskrevet her.

Det er tenkt at ethvert pattedyrindivid inkludert mennesker eller antistoffproduserende celler fra disse kan bli manipulert slik at de virker som basisen for fremstilling av pattedyr, inkludert humane, hybridomcellelinjer. Typisk blir vertsdyret inokulert intraperitonealt, intramuskulært, oralt, subkutant, intraplantært og/eller intradermalt med en mengde av immunogen, inkludert som beskrevet her.

Hybridomer kan bli fremstilt fra lymfocyttene og immortaliserte myelomceller ved å benytte den generelle somatiske cellehybridiseringsteknikken til Kohler, B. og Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497 eller som modifisert av Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982). Tilgjengelige myelomlinjer, inkludert X63-Ag8.653 og de som er fra the Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, kan bli benyttet i hybridiseringen. Vanligvis involverer teknikken å fusjonere myelomceller og lymfoide celler ved å anvende et fusogen slik som polyetylenglykol, eller ved elektriske midler som er velkjente for fagfolk på området. Etter fusjoneringen blir cellene separert fra fusjonsmediet og dyrket i et selektivt vekstmedium, slik som hypoksantin-aminopterin-tymidin (HAT)medium, for å eliminere ikke-hybridiserte morceller. Ethvert av mediene som er beskrevet her, supplert med eller uten serum, kan anvendes ved dyrking av hybridomer som utskiller monoklonale antistoffer. Som et annet alternativ til cellefusjonsteknikken kan EBV-immortaliserte B-celler anvendes for å fremstille de monoklonale anti-NGF-antistoffene ifølge oppfinnelsen. Hybridomene blir ekspandert og subklonet, hvis ønsket, og supernatantene undersøkes for anti-immunogen aktivitet ved konvensjonelle immunanalyseprosedyrer (f.eks. radioimmunanalyse, enzymimmunanalyse eller fluorescensimmunanalyse).

Hybridomer som kan anvendes som antistoffkilde omfatter alle derivater, etterkommer celler av morhybridomene som produserer monoklonale antistoffer som er spesifikke for NGF, eller en del derav.

Hybridomer som produserer slike antistoffer kan bli dyrket in vitro eller in vivo ved å benytte kjente prosedyrer. De monoklonale antistoffene kan bli isolert fra kulturmediet eller kroppsvæsker, ved hjelp av konvensjonelle immunglobulinrenseprosedyrer slik som ammoniumsulfatpresipitering, gelelektroforese, dialyse, kromatografi og ultrafiltrering, hvis ønsket. Uønsket aktivitet, hvis tilstede, kan bli fjernet, for eksempel ved å kjøre preparatet over adsorbenter fremstilt av immunogenene bundet til en fast fase og eluere eller frigjøre de ønskede antistoffene fra immunogenet. Immunisering av et vertsdyr med en human NGF, eller et fragment som inneholder målaminosyresekvensen konjugert til et protein som er immunogent i arten som skal bli immunisert, f.eks. albueskjell hemocyanin, serumalbumin, bovint tyroglobulin eller soyabønnetrypsininhibitor ved å benytte et bifunksjonelt eller derivatiserende middel, for eksempel maleimidobenzoylsulfosuksinimidester (konjugering gjennom cysteinrester), N-hydroksysuksinimid (gjennom lysinrester), glytaraldehyd, suksinanhydrid, SOCl2 eller R1N=C=NR, der R og R1 er forskjellige alkylgrupper, kan gi en populasjon av antistoffer (f.eks. monoklonale antistoffer).

Hvis det er ønskelig kan anti-NGF-antistoffet (monoklonalt eller polyklonalt) av interesse bli sekvensert og polynukleotidsekvensen kan deretter bli klonet inn i en vektor for ekspresjon eller formering. Sekvensen som koder for antistoffet av interesse kan bli opprettholdt i vektor i en vertscelle og vertscellen kan deretter bli ekspandert og frosset for fremtidig anvendelse. I et alternativ kan polynukleotidsekvensen bli benyttet til genetisk manipulasjon for å ”humanisere” antistoffet eller for å forbedre affiniteten, eller andre karakteristika til antistoffet. For eksempel kan konstantregionen bli fremstilt slik at den mer ligner humane konstantregioner for å unngå immunrespons hvis antistoffet blir benyttet i kliniske studier og behandlinger på mennesker. Det kan være ønskelig å genetisk manipulere antistoffsekvensen for å fremskaffe høyere affinitet for NGF og større effekt i å inhibere NGF. Det vil være åpenbart for fagfolk på området at én eller flere polynukleotidendringer kan bli gjort i anti-NGF-antistoffet og fremdeles opprettholde dets bindingsevne til NGF.

”Humaniserte” antistoffer refererer vanligvis til et molekyl som har et antigenbindingssete som i all vesentlighet er avledet fra et immunglobulin fra en ikke-human art og den gjenværende immunglobulinstrukturen til molekylet er basert på strukturen og/eller sekvensen til et humant immunglobulin. Antigenbindingssetet kan omfatte enten komplette variabeldomene fusjonert på konstantdomener eller kun de komplementaritetsbestemmende regionene (CDR’er) podet på passende rammeverksregioner i variabeldomenene. Antigenbindingsseter kan være villtype eller modifisert ved én eller flere aminosyresubstitusjoner, f.eks. modifisert for å ligne nærmere på humant immunglobulin. Noen former av humaniserte antistoffer opprettholder alle CDR-sekvensene (for eksempel et humanisert museantistoff som inneholder alle seks CDR’er fra museantistoffene). Andre former av humaniserte antistoffer har én eller flere CDR (én, to, tre, fire, fem, seks) som er endret i forhold til det opprinnelige antistoffet. I noen tilfeller er rammeverksregion(FR)-rester eller andre rester i det humane immunglobulinet erstattet med tilsvarende ikke-humane rester. Videre kan humaniserte antistoffer omfatte rester som ikke er funnet i mottakerantistoffet eller i donorantistoffet.

Det er fire generelle trinn for å humanisere et monoklonalt antistoff. Disse er: (1) bestemme nukleotid- og den forutsagte aminosyresekvensen for utgangsantistoffets lett- og -tungkjedevariabeldomener (2) designe det humaniserte antistoffet, dvs. bestemme hvilken antistofframmeverksregion som skal anvendes i humaniseringsprosessen (3) de faktiske humaniserende metodikkene/teknikkene og (4) transfeksjonen og ekspresjonen av det humaniserte antistoffet. Se for eksempel US patentskrifter nr. 4 816 567, 5 807 715, 5 866 692, 6 331 415, 5 530 101, 5 693 761, 5 693 762, 5 585 089, 6 180 370 og

6 548 640.

Et antall ”humaniserte” antistoffmolekyler som omfatter et antigenbindingssete som er avledet fra et ikke-humant immunglobulin har blitt beskrevet, inkludert kimære antistoffer som har gnager- eller modifiserte gnager-V-regioner og deres assosierte komplementaritetsbestemmende regioner (CDR’er) fusjonert til humane konstantdomener. Se for eksempel Winter et al., Nature 349:293-299 (1991), Lobuglio et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224 (1989), Shaw et al., J Immunol. 138:4534-4538 (1987), og Brown et al., Cancer Res. 47:3577-3583 (1987). Andre referanser beskriver gnager-CDR’er podet på en human støtterammeverksregion (FR) før fusjon med et passende humant antistoffkonstantdomene. Se for eksempel Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988), og Jones et al., Nature 321:522-525 (1986). En annen referanse beskriver gnager-CDR’er støttet av rekombinant fremstilte gnagerrammeverksregioner. Se for eksempel europeisk patentpublikasjon nr. 0519596. Disse ”humaniserte” molekylene er designet for å minimalisere uønsket immunologisk respons mot anti-humane gnagerantistoffmolekyler som begrenser varigheten og effektiviteten ved terapeutiske applikasjoner av disse enhetene hos humane mottakere. For eksempel kan antistoffkonstantregionen bli fremstilt slik at den er immunologisk inert (f.eks., utløser ikke komplement lysis). Se f.eks. PCT-søknad nr. PCT/GB99/01441, UK patentsøknad nr. 9809951.8. Andre fremgangsmåter for å humanisere antistoffer som også kan bli benyttet er tilkjennegjort av Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 (1991) og i US patentskriftene nr. 6 180 377, 6 054 297, 5 997 867, 5 866 692, 6 210 671 og 6 350 861, og i PCT-publikasjon nr. WO 01/27160. Humanisering kan også inkludere affinitetsmodning. Se f.eks. US serienr. 10/745,775 og PCT/US03/41252.

I nok et annet alternativ kan fullt humane antistoffer bli oppnådd ved å benytte kommersielt tilgjengelige mus som har blitt konstruert slik at de uttrykker spesifikke humane immunglobulinproteiner. Transgene dyr som er designet for å produsere en mer ønskelig (f.eks. fullt humane antistoffer) eller mer robust immunrespons kan også bli benyttet for generering av humaniserte eller humane antistoffer. Eksempler på slik teknologi er Xenomouse<TM>fra Abgenix, Inc. (Fremont, CA) og HuMAb-Mouse<®>og TC Mouse<TM>fra Medarex, Inc. (Princeton, NJ).

I et alternativ kan antistoffer bli fremstilt rekombinant og uttrykt ved å benytte enhver kjent fremgangsmåte på fagområdet. I et annet alternativ kan antistoffet bli fremstilt rekombinant ved phage-display-teknologi Se for eksempel US patentskrifter nr. 5 565 332, 5 580 717, 5 733 743 og 6 265 150 og Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994). Alternativt kan phage-display-teknologien (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) bli benyttet for å fremstille humane antistoffer og antistoff-fragmenter in vitro, fra immunglobulinvariabel (V)-domene-genreportoarer fra ikke-immuniserte donorer. Ifølge denne teknikken blir antistoff-V-domenegener klonet i ramme i enten et hoved- eller et mindre kappeproteingen fra en filamentøs bakteriofag, slik som M13 eller fd, og bli oppvist som funksjonelle antistoff-fragmenter på overflaten til fag-partikkelen. Fordi den filamentøse partikkelen inneholder en enkeltrådet DNA-kopi av fag-genomet fører seleksjoner som er basert på de funksjonelle egenskapene til antistoffet også til seleksjon av genet som koder for antistoffet som oppviser disse egenskapene. Slik hermer fagen noen av egenskapene til B-cellen. Phage-display kan bli utført i en rekke formater, for en gjennomgang se f.eks. Johnson, Kevin S. og Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Flere kilder for V-gensegmenter kan bli benyttet til phage-display. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) isolerte et bredt utvalg av anti-oksazolonantistoffer fra et lite, tilfeldig kombinatorisk bibliotek av V-gener fra miltene til immuniserte mus. Et repertoar av V-genet fra ikke-immuniserte humane donorer kan bli konstruert og antistoffer mot et bredt utvalg av antigener (inkludert selv-antigener) kan bli isolert ved hovedsakelig å følge teknikkene som er beskrevet av Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) eller Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). I en naturlig immunrespons akkumulerer antistoffgener mutasjoner i stort omfang (somatisk hypermutasjon). Noen av de innførte endringene vil overføre høyere affinitet, og B-celler som oppviser høyaffinitets-overflate-immunglobulin blir fortrinnsvis replikert og differensiert under etterfølgende antigenutfordring. Denne naturlige prosessen kan bli etterlignet ved å benytte teknikken som er kjent som ”kjede-shuffling”. Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). I denne fremgangsmåten kan affiniteten til ”primære” humane antistoffer som er fremskaffet ved hjelp av phage-display bli forbedret ved å sekvensielt erstatte tungkjede- og lettkjede-V-regiongener med repertoarer av naturlig forekommende varianter (repertoarer) av V-domenegener fremskaffet fra ikkeimmuniserte donorer. Denne teknikken muliggjør produksjonen av antistoffer og antistofffragmenter med affiniteter i pM-nM-området. En strategi for å fremstille svært store fagantistoffrepertoarer (også kjent som ”the mother-of-all libraries”) har blitt beskrevet av Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993). Gen-shuffling kan også bli benyttet for å avlede humane antistoffer fra gnagerantistoffer, der det humane antistoffet har tilsvarende affiniteter og spesifisiteter som gnagerutgangsantistoffet. Ifølge denne fremgangsmåten, som også ble referert til som ”epitop-imprinting”, blir tungkjede- eller lettkjede-V-domenegenet til gnagerantistoffene som er blitt fremskaffet ved hjelp av phagedisplay-teknikken erstattet med et repertoar av humane V-domenegener, for å danne gnager-humane-kimærer. Seleksjon på antigen fører til isolering av humane variabelregioner som er i stand til å gjenopprette et funksjonelt antigenbindingssete, dvs. epitopen styrer (preger) valget av partner. Når prosessen blir gjentatt for å erstatte det gjenværende gnager-V-domenet blir et humant antistoff fremskaffet (se PCT-publikasjon nr. WO 93/06213, publisert 1. april 1993). Ulik tradisjonell humanisering av gnagerantistoffer ved CDR-transplantering, tilveiebringer denne teknikken fullstendig humane antistoffer, som ikke har noen rammeverksrester eller CDR-rester av gnageroppav.

Det er klart at selv om diskusjonen ovenfor angår humaniserte antistoffer så er det generelle prinsippet som blir diskutert anvennelig for å tilpasse antistoffer til anvendelse i f.eks. hunder, katter, primater, hester og storfe. Det er ytterligere klart at ett eller flere aspekter av humanisering av et antistoff som beskrevet her kan bli kombinert f.eks. med CDR-poding, rammeverksmutasjon og CDR-mutasjon.

Antistoffer kan bli fremstilt rekombinant ved først å isolere antistoffene og de antistoffproduserende cellene fra vertsdyr, fremskaffe gensekvensen og anvende gensekvensen for å uttrykke antistoffet rekombinant i vertsceller (f.eks. CHO-celler). En annen fremgangsmåte som kan bli benyttet er å uttrykke antistoffsekvensen i planter (f.eks. tobakk) eller i transgen melk. Fremgangsmåter for å uttrykke antistoffer rekombinant i planter eller melk har blitt beskrevet. Se for eksempel Peeters, et al., Vaccine 19:2756 (2001), Lonberg, N. og D. Huszar Int. Rev. Immuniol 13:65 (1995), og Pollock et al., J Immunol Methods 231:147(1999). Fremgangsmåter for å fremstille derivater av antistoffer, f.eks. humaniserte, enkeltkjede osv. er kjent på fagområdet.

Immunanalyser og flowcytometri sorteringsteknikker slik som fluorescensaktivert cellesortering (FACS) kan også bli benyttet for å isolere antistoffer som er spesifikk for NGF.

Antistoffene kan bli bundet til mange forskjellige bærere. Bærere kan være aktive og/eller inerte. Eksempler på velkjente bærere inkluderer polypropylen, polystyren, polyetylen, dekstran, nylon, amylaser, glass, naturlige og modifiserte cellulosetyper, polyakrylamider, agaroser og magnetitt. Bærerens natur kan enten være løselig eller uløselig for formål med oppfinnelsen. Fagfolk på området vil være kjent med andre egnede bærere for binding av antistoffer, eller vil være i stand til å finne slike, ved å benytte rutinemessig eksperimentering.

DNA som koder for de monoklonale antistoffene kan lett bli isolert og sekvensert ved å benytte konvensjonelle prosedyrer (f.eks. ved å benytte oligonukleotidprober som er i stand til å binde spesifikt til gener som koder for de tunge og lette kjedene til de monoklonale antistoffene). Hybridomcellene fungerer som en foretrukket kilde for slikt DNA. Når det er isolert kan DNAet bli plassert i ekspresjonsvektorer (slik som ekspresjonsvektorer som er beskrevet i PCT-publikasjon nr. WO 87/04462), som deretter blir tranfektert inn i vertsceller slik som E. coli-celler, ape-COS-celler, kinesisk hamster ovarie(CHO)-celler eller myelomceller ellers ikke produserer immunglobulinprotein, for å oppnå syntesen av monoklonale antistoffer i de rekombinante vertscellene. Se f. eks. PCT-publikasjon nr. WO 87/04462. DNAet kan også bli modifisert, for eksempel ved å substituere den kodende sekvensen for humane tung- og lettkjede konstantdomener i stedet for de homologe murine sekvensene, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984), eller ved å kovalent koble hele eller deler av den kodende sekvensen for et ikke-immunglobulin polypeptid til den immunglobulin kodende sekvensen. På denne måten blir ”kimære” eller ”hybride” antistoffer fremstilt som har bindingsspesifisiteten til et monoklonalt anti-NGF-antistoff som er beskrevet her.

Anti-NGF-antistoffer kan bli karakterisert ved å anvende fremgangsmåter som er velkjente på fagområdet. En fremgangsmåte er for eksempel å identifisere epitopen til hvilken det binder eller ”epitopkartlegging”. Det finnes mange fremgangsmåter som er kjent på fagområdet for å kartlegge og karakterisere lokaliseringen av epitoper på proteiner, inkludert å finne løsningen på krystallstrukturen til et antistoff-antigenkompleks, konkurranseanalyser, genfragment ekspresjonsanalyser og syntetiske peptidbaserte analyser, som beskrevet for eksempel i kapittel 11 i Harlow og Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. I et ytterligere eksempel kan epitopkartlegging anvendes for å bestemme sekvensen til hvilken et anti-NGF-antistoff binder. Epitop-kartlegging er kommersielt tilgjengelig fra forskjellige kilder, for eksempel, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Nederland). Epitopen kan være en lineær epitop, dvs. inneholdt i en enkel strekning av aminosyrer, eller en konformasjonell epitop dannet ved en tredimensjonal interaksjon av aminosyrer som ikke nødvendigvis er inneholdt i en enkelt strekning (primærstruktur lineær sekvens). Peptider av forskjellig lengde (f.eks. minst 4-6 aminosyrer lange) kan bli isolert eller syntetisert (f.eks. rekombinant) og anvendt i bindingsanalyser med et anti-NGF-antistoff. I et annet eksempel kan epitopen som anti-NGF-antistoffet binder til, bli bestemt i en systematisk screening ved å anvende overlappende peptider som er avledet fra NGF-sekvensen og bestemme binding av anti-NGF-antistoffet. Ifølge genfragment-ekspresjonsanalysene blir den åpne leserammen som koder for NGF fragmentert enten tilfeldig eller ved spesifikke genetiske konstruksjoner og reaktiviteten til de uttrykte fragmentene av NGF med antistoffet som skal bli testet blir bestemt. Genfragmentene kan for eksempel bli fremstilt med PCR og deretter transkribert og translatert til protein in vitro, i nærvær av radioaktive aminosyrer. Bindingen av antistoffet til de radioaktivt merkede NGF-fragmentene blir deretter bestemt ved immunpresipitering og gelelektroforese. Visse epitoper kan også bli identifisert ved å anvende store biblioteker av tilfeldige peptidsekvenser oppvist på overflaten av fag-partikler (fag-biblioteker). Alternativt kan et definert bibliotek av overlappende peptidfragmenter bli testet for binding til testantistoffet i enkle bindingsanalyser. I et ytterligere eksempel kan mutagenese av et antigenbindende domene, domenebyttingseksperimenter og alaninskanning-mutagenese bli utført for å identifisere rester som er påkrevd, tilstrekkelige og/eller nødvendige for epitopbinding. For eksempel kan domenebyttingseksperimenter bli utført ved å anvende en mutant NGF der forskjellige fragmenter av NGF-polypeptidet har blitt erstattet (byttet ut) med sekvenser fra et nært beslektet, men antigent distinkt protein (slik som et annet medlem av neurotrofinproteinfamilien). Ved å bedømme binding av antistoffet til mutant NGFet kan viktigheten av det bestemte NGF-fragmentet for antistoffbinding bli vurdert.

Nok en annen fremgangsmåte som kan bli benyttet til å karakterisere et anti-NGF-antistoff er å benytte konkurranseanalyser med andre antistoffer som er kjent for å binde til det samme antigenet, dvs. forskjellige fragmenter på NGF, for å bestemme om anti-NGF-antistoffet binder til den samme epitopen som andre antistoffer. Konkurranseanalyser er velkjent for fagfolk på området. Eksempler på antistoffer som kan bli benyttet i konkurranseanalysene i foreliggende oppfinnelse inkluderer MAb 911, 912, 938, som beskrevet i Hongo, et al., Hybridoma 19:215-227 (2000).

Andre NGF-antagonister

NGF-antagonister som er forskjellige fra anti-NGF-antistoffet er også omtalt. I noen utførelsesformer ifølge beskrivelsen omfatter NGF-antagonisten minst ett antisensmolekyl som er i stand til å blokkere eller minske ekspresjonen av en funksjonell NGF. Nukleotidsekvenser for NGF er kjent og er lett tilgjengelig fra allment tilgjengelige databaser. Se f.eks. Borsani et al., Nuc. Acids Res. 1990, 18, 4020, aksesjonsnummer NM 002506, Ullrich et al., Nature 303:821-825 (1983). Det er rutinemessig å fremstille antisens-oligonukleotidmolekyler som spesifikt vil binde NGF-mRNA uten å kryssreagere med andre polynukleotider. Eksempelmessige målseter inkluderer initieringskodonet, de 5’ regulatoriske regionene, den kodende sekvensen og den 3’ utranslaterte regionen. Oligonukleotidene er omtrent 10-100 nukleotider i lengde, omtrent 15-50 nukleotider i lengde, omtrent 18-25 nukleotider i lengde eller mer. Oligonukleotidene kan omfatte ryggradsmodifikasjoner slik som for eksempel fosforotioatbindinger og 2’-O-sukkermodifiseringer som er velkjente på fagområdet. Eksempelmessige antisensmolekyler inkluderer NGF-antisensmolekylene som er beskrevet i US publikasjon nr. 20010046959, se også http://www.rna-tec.com/repair.htm.

NGF-antagonisten kan omfatte minst ett antisensmolekyl som er i stand til å blokkere eller redusere ekspresjonen av en funksjonell NGF-reseptor (slik som TrkA og/eller p75). Woolf et al., J. Neurosci. (2001) 21(3):1047-55, Taglialetela et al., J Neurochem (1996) 66(5): 1826-35). Nukleotidsekvenser for TrkA og p75 er kjent og er lett tilgjengelig fra allment tilgjengelige databaser.

Alternativt kan NGF-ekspresjon og/eller frigjøring og/eller NGF-reseptorekspresjon bli redusert ved å anvende gen-knockdown, morfolinooligonukleotider, RNAi eller ribozymer, fremgangsmåter som er velkjente på fagområdet. Se

http://www.macalester.edu/ �montgomery/RNAi-html; http://pub32.ezboard.comlfmorpilolinosfrmI9.showMessage?topicID=6.topic; http://www.highveld.com/ribozyme.html.

NGF-antagonisten kan omfatte minst én NGF-inhibitorisk forbindelse. Som anvedt her refererer ”NGF-inhibitorisk forbindelse” til en forbindelse som er forskjellig fra et anti-NGF-antistoff som direkte eller indirekte reduserer, inhiberer, nøytraliserer eller opphever NGF-biologisk aktivitet. En NGF-inhibitorisk forbindelse bør oppvise enhver av eller flere av de følgende karakteristika: (a) binde til NGF og inhibere biologisk NGF-aktivitet og/eller nedstrømsveier mediert av NGF-signaleringsfunksjon, (b) forebygge, lindre eller behandle ethvert aspekt av benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser, (c) blokkere eller minske NGF-reseptoraktivering (inkludert TrkA-reseptordimerisering og/eller autofosforylering), (d) øke fjerning av NGF, (e) inhibere (redusere) NGF-syntese, produksjon eller frigjøring. Eksempelmessige NGF-inhibitoriske forbindelser inkluderer de små molekylære NGF-inhibitorene som er beskrevet i US publikasjon nr.

20010046959, forbindelsene som inhiberer NGFs binding til p75, som beskrevet i PCT-publikasjon nr. WO 00/69829 og PD90780 [7-(benzolylamino)-4,9-dihydro-4-metyl-9-oksopyrazolo[5,1-b]kinazolin-2-karboksylsyre] som beskrevet av Colquhoun et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 310(2):505-11 (2004), forbindelsene som inhiberer NGFs binding til TrkA og/eller p75, som beskrevet i PCT-publikasjon nr. WO 98/17278. Ytterligere eksempler på NGF-inhibitoriske forbindelser inkluderer forbindelsene som er beskrevet i PCT-publikasjon nr. WO 02/17914 og WO 02/20479 og i US patentskrift nr. 5 342 942, 6 127 401 og 6 359 130. Ytterligere eksempelmessige NGF-inhibitoriske forbindelser er forbindelser som er kompetitive inhibitorer av NGF. Se US patentskrift nr. 6 291 247. Videre kan fagfolk på området fremstille andre små molekylære NGF-inhibitoriske forbindelser.

En NGF-inhibitorisk forbindelse binder NGF. Eksempel-messige steder for målsøking (binding) inkluderer delen av NGF som binder til TrkA-reseptoren og/eller p75-reseptoren, og de delene av NGF som er nærliggende til reseptorbindingsregionen og som delvis er ansvarlig for den korrekte tredimensjonale formen av reseptorbindingsdelen. En NGF-inhibitorisk forbindelse kan binde en NGF-reseptor (slik som TrkA og/eller p75) og inhibere en biologisk NGF-aktivitet. Eksempelmessige seter for målsøking inkluderer de delene av TrkA og/eller p75 som binder til NGF.

Et lite molekyl kan ha en molekylvekt på omtrent enhver av 100-20000 dalton, 500-15000 dalton eller 1000-10000 dalton. Biblioteker med små molekyler er kommersielt tilgjengelige. De små molekylene kan bli administrert ved å benytte enhver kjent måte på fagområdet, inkludert inhalering, intraperitonealt, intravenøst, intramuskulært, subkutant, intratekalt, intraventrikulært, oralt, enteralt, parenteralt, intranasalt eller dermalt. Vanligvis, når NGF-antagonisten ifølge oppfinnelsen er et lite molekyl, vil den bli administrert i doseringen på 0,1-300 mg/kg av vekten til pasienten delt inn i én til tre eller flere doser. For en voksen pasient med normal vekt kan doser varierende fra 1 mg til 5 g pr. dose bli administrert.

En NGF-antagonist kan omfatte minst én NGF-strukturell analog. ”NGF-strukturelle analoger” refererer til forbindelser som har en tilsvarende 3-dimensjonal struktur som en del av den for NGF og som binder til en NGF-reseptor ved fysiologiske betingelser in vitro eller in vivo, der bindingen i det minste delvis inhiberer en biologisk NGF-aktivitet. I én utførelsesform binder den NGF-strukturelle analogen til en TrkA og/eller en p75-reseptor. Eksempelmessige NGF-strukturelle analoger inkluderer de bisykliske peptidene som er beskrevet i PCT-publikasjon nr. WO 97/15593, de bisykliske peptidene som er beskrevet i US patentskrift nr. 6 291 247, de sykliske forbindelsene som er beskrevet i US patentskrift nr.

6 017 878 og NGF-avledede peptider som er beskrevet i PCT-publikasjon nr. WO 89/09225. Passende NGF-strukturelle analoger kan også bli designet og syntetisert ved molekylær modellering av NGF-reseptorbinding, for eksempel ved fremgangsmåten som er beskrevet i PCT-publikasjon nr. WO 98/06048. De NGF-strukturelle analogene kan være monomerer eller dimerer/oligomerer i enhver ønsket kombinasjon av de samme eller forskjellige strukturer for å fremskaffe forbedrede affiniteter og biologiske effekter.

I andre utførelsesformer tilveiebringer oppfinnelsen en NGF-antagonist som omfatter minst én dominant-negativ mutant av TrkA-reseptoren og/eller p75-reseptoren. Fagfolk på området kan fremstille dominant-negative mutanter av f.eks. TrkA-reseptoren slik at reseptoren vil binde NGF og slik virke som et ”sluk” for å fange NGF’er. De dominantnegative mutantene vil imidlertid ikke ha den normale, biologiske aktiviteten til TrkA-reseptoren ved binding til NGF. Eksempelmessige dominant-negative mutanter inkluderer mutantene som er beskrevet i de følgende referansene: Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 100884, Eide et al., J. Neurosci. 1996, 16, 3123, Liu et al., J. Neurosci 1997, 17, 8749, Klein et al., Cell 1990, 61, 647, Valenzuela et al., Neuron 1993, 10, 963, Tsoulfas et al., Neuron 1993, 10, 975 og Lamballe et al., EMBO J. 1993, 12, 3083. De dominantnegative mutantene kan bli administrert i proteinform eller i form av en ekspresjonsvektor slik at den dominant-negative mutanten, f.eks. mutant-TrkA-reseptor, blir uttrykt in vivo. Proteinet eller ekspresjonsvektoren kan bli administrert ved å benytte enhver kjent måte på fagområdet, slik som intraperitonealt, intravenøst, intramuskulært, subkutant, intratekalt, intraventrikulært, oralt, enteralt, parenteralt, intranasalt, dermalt eller ved inhalering. For eksempel inkluderer administrering av ekspresjonsvektorer lokal eller systemisk administrering, inkludert injeksjon, oral administrering, partikkelkanon eller kateterisert administrering og topisk administrering. Fagfolk på området er kjent med administrering av ekspresjonsvektor for å oppnå ekspresjon av et eksogent protein in vivo. Se f.eks. US patentskrift nr. 6 436 908, 6 413 942 og 6 376 471.

Målrettet levering av terapeutiske sammensetninger som inneholder et antisenspolynukleotid, en ekspresjonsvektor eller subgenomiske polynukleotider kan også bli benyttet. Reseptormedierte DNA-leveringsteknikker er beskrevetfor eksempel i Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202, Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, red.) (1994), Wu et al., J. Biol. Chem.

(1988) 263:621, Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542, Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655, Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338. Terapeutiske sammensetninger som inneholder et polynukleotid blir administrert i et område på omtrent 100 ng til omtrent 200 mg med DNA for lokal administrering i en genterapiprotokoll. I noen utførelsesformer kan konsentrasjonsområdet på omtrent 500 ng til omtrent 50 mg, omtrent 1 μg til omtrent 2 mg, omtrent 5 μg til omtrent 500 μg og omtrent 20 μg til omtrent 100 μg med DNA eller mer også bli benyttet i en genterapiprotokoll. De terapeutiske polynukleotidene og polypeptidene kan bli levert ved å benytte genleveringsvehikler. Genleveringsvehikkelen kan være av virusopphav eller ikke-virusopphav (se generelt Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51, Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845, Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185, og Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). Ekspresjon av slike kodende sekvenser kan bli indusert ved å benytte endogene pattedyrpromotorer eller heterologe promotorer og/eller enhancere. Ekspresjon av den kodende sekvensen kan enten være konstitutiv eller regulert.

Virusbaserte vektorer for levering av et ønsket polynukleotid og ekspresjon i en ønsket celle er velkjent på fagområdet. Eksempelmessige virusbaserte vehikler inkluderer rekombinant retrovirus (se f.eks. PCT-publikasjon nr. WO 90/07936, WO 94/03622, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 91/02805, US patentskrifter nr.

5 219 740 og 4 777 127, GB patent nr. 2 200 651 og EP patent nr. 0 345 242), alfavirusbaserte vektorer (f.eks. Sindbisvirusvektorer, Semliki-forestvirus (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), Ross River virus (ATCC VR-373, ATCC VR-1246) og Venezuelansk hesteencefalittvirus (ATCC VR-923, ATCC VR-1250, ATCC VR-1249, ATCC VR-532)), og adenoassosierte virus (AAV)-vektorer (se f.eks. PCT-publikasjonsnr. WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984 og WO 95/00655). Administrering av DNA bundet til drepte adenovirus som beskrevet i Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147 kan også bli benyttet.

Ikke-virale leveringsvehikler og fremgangsmåter kan også bli benyttet, inkludert polykationkondensert DNA bundet eller ubundet til drepte adenovirus alene (se f.eks. Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147), ligandbundet DNA (se f.eks. Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985), eukaryote celleleveringsvehikkelceller (se f.eks. US patentskrift nr. 5 814 482, PCT-publikasjon nr. WO 95/07994, WO 96/17072, WO 95/30763 og WO 97/42338) og nukleinladningsnøytralisering eller fusjon med cellemembraner. Nakent DNA kan også bli benyttet. Eksempelmessige nakent DNA-introduksjonsfremgangsmåter er beskrevet i PCT-publikasjon nr. 90/11092 og US patentskrift nr. 5 580 859. Liposomer som kan virke som genleveringsvehikler er beskrevet i US patentskrift nr. 5 422 120, PCT-publikasjon nr. WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445 og EP patent nr. 0 524 968. Ytterligere tilnærminger er beskrevet i Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411, og i Woeffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1995) 91:1581.

Det er også åpenbart at en ekspresjonsvektor kan bli benyttet for å styre ekspresjon av enhver av de proteinbaserte NGF-antagonistene beskrevet her (f.eks. anti-NGF-antistoff, TrkA-immunadhesin, osv.). For eksempel er andre TrkA-reseptorfragmenter som er i stand til å blokkere (fra delvis til fullstendig blokkering) NGF og/eller en biologisk NGF-aktivitet kjent på fagområdet.

NGF-antagonisten kan omfatte minst ett TrkA-immun-adhesin. TrkA-immunadhesiner, slik de blir benyttet her, refererer til løselige kimære molekyler som omfatter det ekstracellulære domenet fra en TrkA-reseptor og en immunglobulinsekvens, som opprettholder bindingsspesifisiteten til TrkA-reseptoren (opprettholder vesentlig bindingsspesifisiteten til TrkA-reseptoren) og som er i stand til å binde til NGF.

TrkA-immunadhesiner er kjent på fagområdet og har blitt funnet å blokkere bindingen av NGF til TrkA-reseptoren. Se f.eks. US patentskrift nr. 6 153 189. Brennan et al., rapporterer administrering av TrkA-immunadhesin i en rottemodell med postkirurgisk smerte. Se Society for Neuroscience Abstracts 24 (1-2) 880 (1998). TrkA-immunadhesinet kan omfatte en fusjon av en TrkA-reseptoraminosyresekvens (eller en del derav) fra TrkA-ekstracellulærdomene som er i stand til å binde NGF (for eksempel en aminosyresekvens som vesentlig opprettholder bindingsspesifisiteten til TrkA-reseptoren) og en immunglobulinsekvens. TrkA-reseptoren kan være en human TrkA-reseptorsekvens, og fusjonen er med en immunglobulin-konstantdomene-sekvens. Immunglobulin-konstantdomene-sekvensen kan være en immunglobulin-tungkjede-konstantdomene-sekvens. Assosieringen av to TrkA-reseptor-immunglobulin-tungkjede-fusjoner kan (f.eks. via kovalent binding ved disulfidbindinger) føre til en homodimer immunglobulin-lignende struktur. En immunglobulinlettkjede kan ytterligere bli assosiert med én eller begge TrkA-reseptor-immunglobulinkimærene i den disulfidbundne dimeren for å gi en homotrimer eller homotetramer struktur. Eksempler på passende TrkA-immunadhesiner inkluderer de som er beskrevet i US patent nr. 6 153 189.

NGF-antagonistene kan omfatte minst ett anti-TrkA-antistoff som er i stand til å blokkere, undertrykke, endre og/eller redusere NGFs fysiske interaksjon med TrkA-reseptoren og/eller nedstrømssignalering, hvorved en biologisk NGF-aktivitet blir redusert og/eller blokkert. Anti-TrkA-antistoffer er kjent på fagområdet. Eksempelmessige anti-TrkA-antistoffer inkluderer de som er beskrevet i PCT-publikasjon nr. WO 97/21732, WO 00/73344, WO 02/15824 og US publikasjonsnr. 20010046959.

NGF-antagonisten kan omfatte minst ett anti-p75-antistoff som er i stand til å blokkere, undertrykke og/eller redusere NGFs fysiske interaksjon med p75-reseptoren og/eller nedstrømssignalering hvorved en biologisk NGF-aktivitet ble redusert og/eller blokkert.

NGF-antagonisten kan omfatte minst én kinaseinhibitor som er i stand til å inhibere nedstrøms-kinasesignalering som er assosiert med TrkA og/eller p75-reseptoraktivitet. En eksempelmessig kinaseinhibitor er K252a eller K252b, som er kjent på fagområdet og beskrevet i Knusel et al., J. Neurochem. 59:715-722 (1992), Knusel et al., J. Neurochemistry 57:955-962 (1991), Koizumi et al., J. Neuroscience 8:715-721 (1988), Hirata et al., Chemical Abstracts 111:728, XP00204135, se abstract og 12. Collective Chemical Substance Index, side 34237, c. 3 (5-7), 55-60, 66-69), s. 34238, c.1 (41-44), c.2 (25-27, 32-33), s. 3423, c.3 (48-50, 52-53), og US patent nr. 6 306 849.

Det er forventet at et antall andre kategorier av NGF-antagonister vil bli identifisert hvis de blir lett etter av en kliniker.

Identifisering av NGF-antagonister

Anti-NGF-antistoffer kan bli identifisert eller karakterisert ved å benytte fremgangsmåter som er kjent på fagområdet, hvorved reduksjon, lindring eller nøytralisering av en biologisk NGF-aktivitet blir påvist og/eller målt. Fremgangsmåter som er beskrevet i PCT/WO 04/065560 kan bli benyttet. En annen fremgangsmåte, for eksempel en kinasereseptoraktiverings-(KIRA)-analyse som er beskrevet i US patentskrift nr. 5 766 863 og 5 891 650, kan bli benyttet for å identifisere NGF-antagonster. Denne ELISA-typen analyse er passende for kvalitativ eller kvantitativ måling av kinaseaktivering ved å måle autofosforyleringen av kinasedomenet for en reseptorprotein-tyrosinkinase (heretter ”rPTK”), f.eks. TrkA-reseptor, i tillegg til for identifisering og karakterisering av potensielle antagonister for en valgt rPTK, f.eks. TrkA. Det første stadiet i analysen involverer fosforylering av kinasedomenet til en kinasereseptor, f.eks. en TrkA-reseptor, der reseptoren er tilstede i cellemembranen til en eukaryot celle. Reseptoren kan være en endogen reseptor eller nukleinsyre som koder for reseptoren, eller en reseptorkonstruksjon, som kan være transformert på cellen. Typisk blir en første fast fase (f.eks. en brønn i en første analyseplate) belagt med en vesentlig homogen populasjon av slike celler (vanligvis en pattedyrcellelinje) slik at cellene fester seg på den faste fasen. Ofte er cellene adherente og adhererer dermed naturlig til den første faste fasen. Hvis en ”reseptorkonstruksjon” blir benyttet omfatter denne vanligvis en fusjon av en kinasereseptor og et flagg-polypeptid. Flagg-polypeptidet blir gjenkjent av innfangingsmidlet, ofte et innfangingsantistoff, i ELISA-delen av analysen. En analytt, slik som et kandidat-anti-NGF-antistoff eller annen NGF-antagonist blir deretter tilsatt sammen med NGF til brønnene som inneholder de adherente cellene, slik at tyrosinkinase-reseptoren (f.eks. TrkA-reseptoren) blir eksponert for (eller kontaktet med) NGF og analytten. Denne analysen muliggjør identifisering av antistoffer (eller andre NGF-antagonister) som inhiberer aktivering av TrkA ved dens ligand-NGF. Etter eksponering for NGF og analytten blir de adherente cellene oppløst ved å anvende en lysisbuffer (som har en løseliggjørende detergent der i) og forsiktig risting, for derved å frigjøre cellelysatet som kan underkastet ELISA-delen av analysen direkte, uten behov for konsentrering eller klaring av cellelysatet.

Det således fremstilte cellelysatet er dermed klart til å underkastes ELISA-stadiet av analysen. Som et første trinn i ELISA-stadiet blir en andre fast fase (vanligvis en brønn i en ELISA-mikrotiterplate) belagt med et innfangingsmiddel (ofte et innfangingsantistoff) som binder spesifikt til tyrosinkinasereseptoren, eller i tilfelle med en reseptorkonstruksjon, til flagg-polypeptidet. Belegning av den andre faste fasen blir utført slik at innfangingsmidlet festes på den andre faste fasen. Innfangingsmiddelet er vanligvis et monoklonalt antistoff, men som beskrevet i eksemplene her, kan polyklonale antistoffer også bli benyttet.

Cellelysatet som er fremskaffet blir deretter eksponert for, eller kontaktet med, det festede innfangingsmidlet slik at reseptoren eller reseptorkonstruksjonen festes til (eller blir fanget i) den andre faste fasen. Et vasketrinn blir deretter utført for å fjerne ubundet cellelysat og etterlate den innfangede reseptoren eller reseptorkonstruksjonen. Den festede eller innfangede reseptoren eller reseptorkonstruksjonen blir deretter eksponert for, eller kontaktet med, et anti-fosfotyrosinantistoff som identifiserer fosforylerte tyrosinrester i tyrosinkinasereseptoren. I én utførelsesform blir anti-fosfotyrosinantistoffet konjugert (direkte eller indirekte) med et enzym som katalyserer en fargeendring av et ikke-radioaktivt fargereagens. Følgelig kan fosforylering av reseptoren bli målt ved en etterfølgende fargeendring av reagenset. Enzymet kan bli bundet til anti-fosfotyrosin-antistoffet direkte, eller et konjugerende molekyl (f.eks. biotin), kan bli konjugert til anti-fosfotyrosin-antistoffet og enzymet kan deretter bli bundet til anti-fosfotyrosinantistoffet via det konjugerende molekylet. Til slutt blir binding av anti-fosfotyrosin-antistoffet til den innfangede reseptoren eller reseptorkonstruksjonen målt, f.eks. ved en fargeendring i fargereagenset.

NGF-antagonisten kan også bli identifisert ved å inkubere et kandidatmiddel med NGF og overvåke enhver av én eller flere av de følgende karakteristika: (a) binding til NGF og inhibering av biologisk NGF-aktivitet og/eller nedstrømsveier som er mediert ved NGF-signaleringsfunksjon, (b) forebygging, lindring eller behandling av ethvert aspekt av benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser, (c) blokkering eller reduksjon av NGF-reseptoraktivering (inkludert TrkA-reseptor-dimerisering og/eller autofosforylering), (d) øke fjerning av NGF, (e) inhibering (redusering) av NGF-syntese, -produksjon eller -frigjøring. I noen utførelsesformer blir en NGF-antagonist identifisert ved å inkubere et kandidatmiddel med NGF og overvåke binding og tilhørende reduksjon eller nøytralisering av en biologisk aktivitet av NGF. Bindingsanalysen kan bli utført med rensede NGF-polypeptider, eller med celler som naturlig uttrykker, eller som er transfektert til å uttrykke, NGF-polypeptider. I en utførelsesform er bindingsanalysen en kompetitiv bindingsanalyse, der evnen til et kandidatantistoff til å konkurrere med en kjent NGF-antagonist for NGF-binding blir evaluert. Analysen kan bli utført i forskjellige formater, inkludert ELISA-formatet. I andre utførelsesformer blir en NGF-antagonist identifisert ved å inkubere et kandidatmiddel med NGF og overvåke medfølgende inhibering av TrkA-reseptordimerisering og/eller autofosforylering.

Etter innledende identifisering kan aktiviteten til en kandidat-anti-NGF-antagonist bli ytterligere bekreftet og forbedret ved bioanalyser, kjent for å teste de målsøkte, biologiske aktivitetene. Alternativt kan bioanalyse bli benyttet for å screene kandidater direkte. For eksempel fremmer NGF et antall morfologisk gjenkjennbare endringer i responsive celler. Disse inkluderer fremming av differensieringen av PC12-celler og økning av veksten av neuritter fra disse cellene (Greene og Tischler, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73:2424-2428 (1976), Urfer et al., Biochem. 36:4775-4781 (1997), Tsoulfas et al., Neuron 10:975-990 (1993)), fremming av neurittutvekst fra eksplantater av responsive sensoriske og sympatisk ganglier (Levi-Montalcini, R. og Angeletti, P. Nerve growth factor. Physiol. Rev. 48, 534-569, 1968) og fremming av overlevelse av NGF-avhengige nevroner slik som embryonale dorsale rotganglier, trigeminale ganglier eller sympatisk ganglionevroner (f.eks. Chun & Patterson, Dev. Biol. 75:705-711 (1977), Buchman & Davies, Development 118:989-1001, (1993). Således innebærer analysen for inhibering av biologisk NGF-aktivitet dyrkning av NGF-responsive celler med NGF pluss en analytt, slik som et kandidat-anti-NGF-antistoff eller en kandidat-NGF-antagonist. Etter en passende tid vil celleresponsen bli analysert (celledifferensiering, nevrittutvekst eller celleoverlevelse).

En kandidat-NGF-antagonists evne til å blokkere eller nøytralisere en biologisk aktivitet av NGF, kan også bli vurdert ved å overvåke kandidatmidlets evne til å inhibere NGF-mediert overlevelse i den embryonale rotte-dorsalrotganglie-overlevelses-bioanalysen som beskrevet i Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000).

Sammensetniger til anvendelse i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen Sammensetningene for anvendelse ifølge oppfinnelsen omfatter en effektiv mengde av NGF-antagonist (slik som et anti-NGF-antistoff) og omfatter i noen utførelsesformer ytterligere en farmasøytisk akseptabel eksipiens. I noen utførelsesformer er sammensetningen til anvendelse i enhver av terapiene som er beskrevet her. Eksempler på slike sammensetninger, i tillegg til hvordan de formuleres, er også beskrevet i en tidligere snitt og nedenfor. I én utførelsesform omfatter sammensetningen en NGF-antagonist. I en annen utførelsesform omfatter sammensetningen én eller flere NGF-antagonister. I en annen utførelsesform omfatter sammensetningen én eller flere NGF-antagonister som er valgt fra enhver av én eller flere av de følgende: en antagonist (f.eks. et antistoff) som binder (fysisk interagerer med) NGF, en antagonist som binder til en NGF-reseptor (slik som TrkA og/eller p75-reseptor), og en antagonist som reduserer (hindrer og/eller blokkerer) nedstrøms-NGF-reseptorsignalering. I andre utførelsesformer omfatter sammensetningen enhver NGF-antagonist som ikke er et TrkA-immunadhesin (dvs. er forskjellig fra et TrkA-immunadhesin). I andre utførelsesformer omfatter sammensetningen enhver NGF-antagonist som er forskjellig fra et anti-NGF-antistoff. I andre utførelsesformer omfatter sammensetningen enhver NGF-antagonist som er forskjellig fra et TrkA-immunadhesin og forskjellig fra et anti-NGF-antistoff. I andre utførelsesformer inhiberer en NGF-antagonist (reduserer) NGF-syntese, -produksjon eller -frigjøring. I noen utførelsesformer binder NGF-antagonisten NGF og kryssreagerer ikke vesentlig med beslektede neurotrofiner (slik som NT3, NT4/5 og/eller BDNF). I noen utførelsesformer er ikke NGF-antagonisten assosiert med en skadelig immunrespons. I noen utførelsesformer er NGF-antagonisten valgt fra gruppen som består av et anti-NGF-antistoff, et antisensmolekyl rettet mot en NGF (inkludert et antisensmolekyl som er rettet mot en nukleinsyre som koder for NGF), et antisensmolekyl som er rettet mot en NGF-reseptor (slik som TrkA og/eller p75), en NGF-inhibitorisk forbindelse, en NGF-strukturell analog, en dominant-negativ mutasjon for en TrkA-reseptor som binder en NGF, et TrkA-immunadhesin, et anti-TrkA-antistoff, et anti-p75-antistoff og en kinaseinhibitor. I en annen utførelsesform er NGF-antagonisten et anti-NGF-antistoff. I andre utførelsesformer gjenkjenner anti-NGF-antistoffet human NGF. I noen utførelsesformer er anti-NGF-antistoffet humant. I andre utførelsesformer er anti-NGF-antistoffet humanisert (slik som antistoff E3 som er beskrevet her). I andre utførelsesformer omfatter anti-NGF-antistoffet konstantregionen som ikke utløser en uønsket immunrespons, slik som antistoffmediert lysis eller ADCC. I andre utførelsesformer omfatter anti-NGF-antistoffet én eller flere CDR’er fra antistoff E3 (slik som én, to, tre, fire, fem, eller i noen utførelsesformer alle seks CDR’ene fra E3).

Det er slik å forstå at sammensetningene kan omfatte mer enn én NGF-antagonist. For eksempel kan sammensetningen omfatte mer enn ett medlem av en klasse av NGF-antagonister (f.eks. en blanding av anti-NGF-antistoffer som gjenkjenner forskjellige epitoper på NGF), i tillegg til medlemmer av forskjellige klasser av NGF-antagonister (f.eks. et anti-NGF-antistoff og en NGF-inhibitorisk forbindelse). Andre eksempelmessige sammensetninger omfatter mer enn ett anti-NGF-antistoff som gjenkjenner den samme epitopen/epitoper, forskjellige utgaver av anti-NGF-antistoffer som binder til forskjellige epitoper på NGF eller forskjellige NGF-inhibitoriske forbindelser.

Sammensetningene som ble benyttet i foreliggende oppfinnelse kan ytterligere omfatte farmasøytisk akseptable bærere, eksipienser eller stabiliserende midler (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20. utgave (2000) Lippincott Williams og Wilkins, red. K.E. Hoover), i form av lyofiliserte formuleringer eller vandige løsninger. Akseptable bærere, eksipienser eller stabiliserende midler er ikke-toksiske for mottakerne ved doseringen av konsentrasjonene som blir benyttet, og kan omfatte buffere slik som fosfat, sitrat og andre organiske syrer, antioksidanter inkludert askorbinsyre og metionin, preserveringsmidler (slik som oktadecyldimetylbenzylammoniumklorid, heksametoniumklorid, benzalkoniumklorid, benzatoniumklorid, fenol, butyl- eller benzylalkohol, alkylparabener slik som metyl- eller propylparaben, katekol, resorsinol, sykloheksanol, 3-pentanol og m-kresol), lavmolekylære (mindre enn omtrent 10 rester) polypeptider, proteiner slik som serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner, hydrofile polymerer slik som polyvinylpyrrolidon, aminosyrer slik som glysin, glutamin, asparagin, histidin, arginin eller lysin, monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater inkludert glukose, mannose eller dekstraner, chelaterende midler slik som EDTA, sukkertyper slik som sukrose, mannitol, trehalose eller sorbitol, saltdannende motioner slik som natrium, metallkomplekser (f.eks. Zn-proteinkomplekser) og/eller ikkeioniske overflateaktive stoffer slik TWEEN<TM>, PLURONICS<TM>eller polyetylenglykol (PEG). Farmasøytisk akseptable eksipienser er ytterligere beskrevet her.

NGF-antagonisten og sammensetningene derav kan også bli benyttet i sammenheng med andre midler som virker for å forsterke og/eller komplementere effektiviteten til midlene. I noen utførelsesformer er det andre midlet et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer er det andre midlet en NSAID. I noen utførelsesformer er ikke disse midlene opioide smertestillende midler. I noen utførelsesformer er ikke disse midlene NSAID.

Sett

Sett ifølge oppfinnelsen inkluderer én eller flere beholdere som omfatter en NGF-antagonist (slik som et antistoff, slik som humanisert antistoff E3 som er beskrevet her) og i noen utførelsesformer omfatter de ytterligere instruksjoner for anvendelse i overensstemmelse med enhver av fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen som er beskrevet her. I noen utførelsesformer er NGF-antagonisten enhver NGF-antagonist som er beskrevet her. I andre utførelsesformer omfatter settet en NGF-antagonist som ikke er et TrkA-immunoadhesin (dvs. er forskjellig fra et TrkA-immunadhesin). I andre utførelsesformer omfatter settet en NG-antagonist som er forskjellig fra et anti-NGF-antistoff. I andre utførelsesformer omfatter settet enhver NGF-antagonist som er forskjellig fra et TrkA-immunoadhesin og forskjellig fra et anti-NGF-antistoff. I noen utførelsesformer omfatter settet et anti-NGF-antistoff (slik som antistoff E3 som er beskrevet her). I andre utførelsesformer omfatter settet et anti-NGF-antistoff som omfatter én eller flere CDR’er for antistoffetere (slik som én, to, tre, fire, fem eller i noen utførelsesformer alle seks CDR fra E3). I noen utførelsesformer inkluderer settet et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer inkluderer settet en NSAID. I noen utførelsesformer inkluderer settet ikke et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer inkluderer settet ikke en NSAID. I noen utførelsesformer omfatter de inkluderte instruksjonene en beskrivelse av administrering av NGF-antagonisten for å behandle, lindre eller forebygge benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser ifølge enhver av fremgangsmåtene som er beskrevet her. Dette kan ytterligere omfatte en beskrivelse av utvelgelse av et individ som er passende for behandling basert på identifisering uansett om dette individet har benkreftsmerte inkludert kreftsmerte assosiert med benmetastase eller hvorvidt individet har en risiko for å utvikle benkreftsmerte inkludert kreftsmerte assosiert med benmetastaser. I andre utførelsesformer omfatter instruksjonene en beskrivelse av administrering av en NGF-antagonist for å behandle, forebygge og/eller lindre benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser. I andre utførelsesformer omfatter instruksjonene en beskrivelse av administrering av en NGF-antagonist til et individ med risiko for benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministrert med en NSAID. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten koadministert med et opioid smertestillende middel og en NSAID. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten ikke koadministrert med et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten ikke koadministrert med en NSAID.

Instruksjonene som vedrører anvendelsen av en NGF-antagonist inkluderer vanligvis informasjon som gjelder dosering, doseringsplan og administreringsmåte for den påtenkte behandlingen. Beholderne kan være enhetsdoser, pakker med flere doser (f.eks. multidosepakker) eller subenhetsdoser. Instruksjoner som blir levert i settene ifølge oppfinnelsen er typisk skrevne instruksjoner på et merke eller på et pakningsvedlegg (f.eks. et papirark inkludert i settet), men maskinlesbare instruksjoner (f.eks. instruksjoner som ligger på en magnetisk stripe eller optisk lagringsdiskett) er også akseptable.

Merket eller pakningsvedlegget indikerer at sammensetningen blir benyttet til behandling, lindring og/eller forebygging av benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser. Instruksjoner kan bli tilveiebrakt for å utøve enhver av fremgangsmåtene som er beskrevet her.

Settene ifølge denne oppfinnelsen foreligger i passende forpakning. Passende forpakning inkluderer rør, flasker, krukker, fleksibel forpakning (f.eks. forseglede Mylar- eller plastikkbager) og lignende. Også omfattet er forpakninger til anvendelse i kombinasjon med en spesifikk innretning, slik som en inhalator, neseadministreringsadministrering (f.eks. en atomiser) eller en infusjonsinnretning slik som en minipumpe. Et sett kan ha en steril inngangsåpning (f.eks. kan beholderen være en intravenøs løsningspose eller et rør som har en stopper som er mulig å gjennomtrenge ved hjelp av en hypoderm injeksjonsnål).

Beholderen kan også ha en steril inngangsport (f.eks. kan beholderen være en intravenøs løsningspose eller et rør som har en stopper som er mulig å trenge gjennom ved hjelp av en hypoderm injeksjonsnål). Minst ett aktivt middel i preparatet er en NGF-antagonist, slik som et anti-NGF-antistoff. Beholderen kan ytterligere omfatte et andre farmasøytisk aktivt middel.

Sett kan eventuelt tilveiebringe ytterligere komponenter slik som buffere og tolkningsinformasjon. Normalt omfatter settet en beholder og et merke eller et pakningsvedlegg på eller assosiert med beholderen.

I noen utførelsesformer tilveiebringer oppfinnelsen fremstilte artikler som omfatter innholdet i settene som er beskrevet ovenfor. I noen utførelsesformer omfatter settene en NGF-antagonist (slik som et anti-NGF-antistoff) med informasjon som antyder anvendelse for å behandle benkreftsmerte inkludert kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser.

Administrering av en NGF-antagonist og vurdering av en behandling

NGF-antagonisten kan bli administrert til et individ på enhver passende måte. For eksempel kan NGF-antagonisten bli administrert oralt, intravenøst, sublingvalt, subkutant, intraarterielt, intrasynovialt, intravesikulært (slik som via blæren), intramuskulært, intrakardielt, intratoraktisk, intraperitonealt, intraventrikulært, sublingvalt, ved hjelp av inhalering, med stikkpiller og transdermalt. De kan bli administrert oralt, f.eks. i form av tabletter, trosjeer, kapsler, eliksirer, suspensjoner, servere, oblater, slikkedrops, tyggegummi eller lignende som er fremstilt ved hjelp av prosedyrer som er anerkjent på fagområdet.

I noen utførelsesformer blir i overensstemmelse med dette NGF-antagonistene, slik som et anti-NGF-antistoff, administrert til et individ i overensstemmelse med kjente fremgangsmåter, slik som intravenøs administrering, f.eks. som en bolus eller ved kontinuerlig infusjon over en tidsperiode, ved intramuskulær, intraperitoneal, intracerebrospinal, subkutan, intraartikulær, intrasynovial, intratekal, oral, ved inhalering eller ved topiske ruter. Kommersielt tilgjengelige nebulisatorer for flytende formuleringer, inkludert jet-nebulisatorer og ultrasoniske nebulisatorer er nyttige for administrering.

Flytende formuleringer kan bli nebulisert direkte og lyofilisert pulver kan bli nebulisert etter rekonstitusjon. Alternativt kan NGF-antagonisten bli aerosolisert ved å benytte en fluorkarbonformulering og en doseinhalator med utmåling, eller kan bli inhalert som et lyofilisert og oppmålt pulver.

I én utførelsesform blir en NGF-antagonist administrert via setespesifikke eller målrettede lokale leveringsteknikker. Eksempler på setespesifikke eller målrettede lokale leveringsteknikker inkluderer forskjellige implanterbare depotkilder for NGF-antagonisten eller lokale leveringskatetre, slik som infusjonskatetre, et intravenøst kateter eller et målkateter, syntetiske transplantater, tilleggsomslag, shunt eller stenter eller andre implanterbare innretninger, setespesifikke bærere, direkte injeksjon eller direkte applikasjon. Se f.eks. PCT-publikasjon nr. WO 00/53211 og US patentskrift nr. 5 981 568.

Forskjellige formuleringer av en NGF-antagonist (slik som et anti-NGF-antistoff) kan bli benyttet til administrering. I noen utførelsesformer kan en NGF-antagonist bli administrert rent. I noen utførelsesformer omfatter NGF-antagonisten et anti-NGF-antistoff, og kan foreligge i forskjellige formuleringer, inkludert formuleringer som omfatter en farmasøytisk akseptabel eksipiens. Farmasøytisk akseptable eksipienser er kjent på fagområdet og er relativt inerte stoffer som fremmer administrering av et farmakologisk effektivt stoff. For eksempel kan en eksipiens i form eller konsistens eller virke som et fortynningsmiddel. Passende eksipienser inkluderer stabiliserende midler, fuktgjøremidler og emulgatorer, salter for å variere osmolaritet, innkapslende midler, buffere og hudpenetrerende forsterkere. Eksipienser i tillegg til formuleringer for parenteral og ikkeparenteral legemiddellevering er fremlagt i Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20. utgave Mack Publishing (2000).

I noen utførelsesformer blir disse midlene formulert for administrering ved injeksjon (f.eks. intraperitonealt, intravenøst, subkutant, intramuskulært osv.). Disse midlene kan slik bli kombinert med farmasøytisk akseptable vehikler slik som fysiologisk saltløsning, Ringers løsning, dekstroseløsning og lignende. De spesielle doseringsregimene, dvs. dose, timing og repetisjon, vil være avhengig av det spesielle individet og dette individets medisinske historie.

Et anti-NGF-antistoff kan bli administrert ved å benytte en passende fremgangsmåte, inkludert injeksjon (f.eks. intraperitonealt, intravenøst, subkutant, intramuskulært, osv.). Anti-NGF-antistoffet kan også bli administrert via inhalering, som beskrevet her. For administrering av anti-NGF-antistoffer kan vanligvis en første kandidatdosering være omtrent 2 mg/kg. For formålet med foreliggende oppfinnelse kan en typisk daglig dosering ligge i området fra omtrent noen av 0,1 μg/kg til 3 μg/kg til 30 μg/kg til 300 μg/kg til 3 mg/kg, til 30 mg/kg til 100 mg/kg eller mer, avhengig av faktorene som er nevnt ovenfor. For repeterte administreringer over flere dager eller lengre, avhengig av tilstanden, blir behandlingen opprettholdt inntil en ønsket undertrykking av symptomer fremkommer eller inntil tilstrekkelig terapeutiske nivåer er oppnådd for å redusere kreftsmerte som er assosiert med benmetastase. Et eksempelmessig doseringsregime omfatter administrering av en første dose på omtrent 2 mg/kg, etterfulgt av en ukentlig opprettholdelsesdose på omtrent 1 mg/kg av anti-NGF-antistoffet, eller etterfulgt av en opprettholdelsesdose på omtrent 1 mg/kg hver andre uke. Likevel kan andre doseringsregimer være nyttige, avhengig av mønsteret for farmakokinetisk nedbrytning som utøveren ønsker å oppnå. For eksempel er dosering fra 1-4 ganger i uken omfattet. I noen utførelsesformer kan dosering som strekker seg fra omtrent 3 μg/mg til omtrent 2 μg/kg (slik som omtrent 3 μg/mg, omtrent 10 μg/mg, omtrent 30 μg/mg, omtrent 100 μg/mg, omtrent 300 μg/mg, omtrent 1 mg/kg og omtrent 2 mg/kg) bli benyttet. I noen utførelsesformer er doseringsfrekvens én gang hver uke, hver andre uke, hver fjerde uke, hver femte uke, hver sjette uke, hver syvende uke, hver åttende uke, hver niende uke eller hver tiende uke, eller én gang hver måned, hver andre måned eller hver tredje måned eller lenger. Progresjonen til denne terapien er enkel å overvåke ved hjelp av konvensjonelle teknikker og analyser.

Doseringsregimene (inkludert NGF-antagonistene som ble benyttet) kan variere over tid.

Når den ikke er et antistoff kan vanligvis en NGF-antagonist (i noen utførelsesformer) bli administrert i omfanget av omtrent 0,1-300 mg/kg av vekten til pasienten delt på 1-3 doser, eller som tilkjennegjort her. I noen utførelsesformer, for en voksen pasient med normal vekt, kan doseringer som strekker seg fra omtrent 0,3-5,00 mg/kg bli administrert. De spesielle doseringsregimene, dvs. dose, timing og repetisjon, vil være avhengig av det spesielle individet og dette individets medisinske historie, i tillegg til egenskapene til de individuelle midlene (slik som halveringstiden til midlet og andre overveielser som er velkjente på fagområdet).

For formålet med foreliggende oppfinnelse vil den hensiktsmessige doseringen av en NGF-antagonist være avhengig av NGF-antagonisten/antagonistene (eller sammensetninger derav) som blir benyttet, typen og alvorligheten av smerten som skal bli behandlet, hvorvidt midlet er administrert for preventive eller terapeutiske formål, tidligere terapi, pasientens kliniske historie og respons overfor midlet, og diskresjonen til den utøvende legen. Typisk vil klinikeren administrere en NGF-antagonist, slik som et anti-NGF-antistoff, inntil en dosering er nådd som oppnår det ønskede resultat.

Empiriske overveielser, slik som halveringstiden, vil vanligvis bidra til bestemmelsen av doseringen. For eksempel kan antistoffer som er kompatible med det humane immunsystemet, slik som humaniserte antistoffer eller fullt humane antistoffer, bli benyttet for å forlenge halveringstiden til antistoffet og for å forhindre at antistoffet blir angrepet av vertens immunsystem. Hyppighet av administrering kan bli bestemt og justert over tidslengden til terapien, og er generelt, men ikke nødvendigvis, basert på behandling og/eller undertrykking og/eller lindring og/eller forsinkelse av smerte. Alternativt kan vedvarende kontinuerlig frigjørende formuleringer av anti-NGF-antistoffene være hensiktsmessige. Forskjellige formuleringer og innretninger for å oppnå ved varende frigjøring er kjent på fagområdet.

I én utførelsesform kan doseringer for en NGF-antagonist bli bestemt empirisk hos individer som har blitt gitt én eller flere administreringer av NGF-antagonist (slik som et antistoff). Individer blir gitt økende doseringer av NGF-antagonist, f.eks. anti-NGF-antistoff. For å undersøke effektiviteten for en NGF-antagonist kan en indikator på smerte bli fulgt.

Administrering av en NGF-antagonist i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan være kontinuerlig eller avbrutt, avhengig av f.eks. mottakerens fysiologiske tilstand, hvorvidt formålet med administreringen er terapeutisk eller profylaktisk, og andre faktorer som er kjent for erfarne fagfolk. Administreringen av NGF-antagonist (f.eks. om NGF-antagonisten er et anti-NGF-antistoff) kan være hovedsakelig kontinuerlig over en forhåndsvalgt tidsperiode eller kan være i en serie med oppdelte doser, f.eks. enten før, i løpet av eller etter utvikling av smerte, før, i løpet av, før og etter, i løpet av og etter, før og i løpet av eller før, i løpet av og etter utvikling av smerte. Administrering kan være før, i løpet av og/eller etter at kreft har metastasert seg til ben, og enhver annen hendelse som sannsynligvis kan gi opphav til kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser.

I noen utførelsesformer kan flere enn én NGF-antagonist, slik som et antistoff, være tilstede. Antagonisten kan være den samme eller forskjellig fra hverandre. Minst én, minst to, minst tre, minst fire, minst fem forskjellige NGF-antagonister kan være tilstede. Vanligvis har disse NGF-antagonistene komplementære aktiviteter som ikke skadelig påvirker hverandre. NGF-antagonister kan også bli benyttet i sammenheng med andre midler som virker for å forsterke og/eller komplementere effektiviteten til midlene. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten ikke koadministrert med et opioid smertestillende middel. I noen utførelsesformer blir NGF-antagonisten ikke koadministrert med NSAID.

Terapeutiske formuleringer av NGF-antagonisten (slik som et antistoff) som blir benyttet i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse blir fremstilt for lagring ved å blande et antistoff som har den ønskede graden av renhet med eventuelle farmasøytisk akseptable bærere, eksipienser eller stabilisatorer (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20. utgave Mack Publishing (2000)), i form av lyofiliserte formuleringer eller vandige løsninger. Akseptable bærere, eksipienser eller stabilisatorer er ikke-toksiske overfor mottakerne ved doseringen av konsentrasjonene som blir benyttet, og kan omfatte buffere slik som fosfat, sitrat og andre organiske syrer, salter slik som natriumklorid, antioksidanter inkludert askorbinsyre og metionin, preserveringsmidler (slik som oktadesyldimetylbenzylammoniumklorid, heksametoniumklorid, benzalkoniumklorid, benzetoniumklorid, fenol, butyl- eller benzylalkohol, alkylparabener slik som metyl- eller propylparaben, katekol, resorsinol, sykloheksanol, 3-pentanol og m-kresol), lavmolekylære (mindre enn omtrent 10 rester) polypeptider, proteiner slik som serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner, hydrofile polymerer slik som polyvinylpyrrolidon, aminosyrer slik som glysin, glutamin, asparagin, histidin, arginin eller lysin, monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater inkludert glukose, mannose eller dekstriner, chelaterende midler slik som EDTA, sukkertyper så som sukrose, mannitol, trehalose eller sorbitol, saltdannende motioner slik som natrium, metallkomplekser (f.eks. Zn-proteinkomplekser) og/eller ikkeioniske overflateaktive stoffer slik som TWEEN<TM>, PLURONICS<TM>eller polyetylenglykol (PEG).

Liposomer som inneholder NGF-antagonisten (slik som et antistoff) ble fremstilt ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent på fagområdet, slike som er beskrevet i Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985), Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 /1980) og US patentskriftene nr. 4 485 045 og 4 544 545. Liposomer med forbedret sirkulasjonstid er tilkjennegjort i US patentskrift nr. 5 013 556. Spesielt nyttige liposomer kan bli generert ved hjelp av revers fase avdampningsfremgangsmåten med et lipidpreparat som omfatter fosfatidylcholin, kolesterol og PEG-derivatisert fosfatidyletanolamin (PEG-PE). Liposomer blir kjørt gjennom filtre med definert porestørrelse for å gi liposomer med den ønskede diameteren.

De aktive ingrediensene kan også bli fanget i mikrokapsler som f.eks. er fremstilt ved hjelp av koaserveringsteknikker eller ved hjelp av interfasepolymerisering, f.eks. hydroksymetylcellulose- eller gelatinmikrokapsler og poly-(metylmetacylat)-mikrokapsler, i kolloidale legemiddelleveringssystemer (f.eks. liposomer, albuminmikrokuler, mikroemulsjoner, nanopartikler og nanokapsler) eller i makroemulsjoner. Slike teknikker er tilkjennegjort i Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20. utgave Mack Publishing (2000).

Vedvarende frigjørende preparater kan bli fremstilt. Passende eksempler på vedvarende frigjørende preparater inkluderer halvgjennomtrengelige matriser av faste hydrofobe polymerer inneholdende antistoffet, der matrisene foreligger i form av formgitte artikler, f.eks. filmer eller mikrokapsler. Eksempler på vedvarende frigjørende matriser inkluderer polyestere, hydrogeler (f.eks. poly(2-hydroksyetylmetakrylat), eller ’poly(vinylalkohol)), polylaktider (US patentskrift nr. 3 773 919), kopolymerer av L-glutaminsyre og 7-etyl-L-glutamat, ikke-nedbrytbart etylen-vinylacetat, nedbrytbare melkesyre-glykolsyre-kopolymerer slik som LUPRON DEPOT<TM>(injiserbare mikrokuler sammensatt av melkesyre-glykolsyre-kopolymer og leuprolidacetat), sukroseacetatisobutyrat og poly-D-(-)-3-hydroksysmørsyre.

Formuleringene som skal bli benyttet til in vivo-administrering må være sterile. Dette blir enkelt utført ved hjelp av f.eks. filtrering gjennom sterile filtreringsmembraner. Terapeutiske anti-NGF-antistoffpreparater blir generelt plassert i en beholder som har en steril inngangsport, f.eks. en intravenøs løsningspose eller et rør som har en stopper som er mulig å gjennomtrenge ved hjelp av en hypoderm injeksjonsnål.

Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan foreligge i enhetsdoseringsformer slik som tabletter, piller, kapsler, pulvere, granuler, løsninger eller suspensjoner eller stikkpiller, til oral, parenteral eller rektal administrering, eller administrering ved hjelp av inhalering eller insuflering.

Til fremstilling av faste sammensetninger slik som tabletter blir den prinsipielle aktive ingrediensen blandet med en farmasøytisk bærer, f.eks. konvensjonelle tabletteringsingredienser slik som maisstivelse, laktose, sukrose, sorbitol, talkum, stearinsyre, magnesiumstearat, dikalsiumfosfat eller gummityper, og andre farmasøytiske fortynningsmidler, f.eks. vann, for å danne en fast preformuleringssammensetning inneholdende en homogen blanding av forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse, eller et ikke-toksisk farmasøytisk akseptabelt salt derav. Når det refereres til disse preformuleringssammensetningene som homogene er det ment at den aktive ingrediensen er dispergert jevnt i hele sammensetningen slik at sammensetningen enkelt kan bli delt opp i tilsvarende effektive enhetsdoseringsformer slik som tabletter, piller og kapsler. Denne faste preformuleringssammensetningen ble deretter delt opp i enhetsdoseringsformer av typen som er beskrevet ovenfor inneholdende fra 0,1 til omtrent 500 mg av den aktive ingrediensen ifølge foreliggende oppfinnelse. Tablettene eller pillene av den nye sammensetningen kan bli belagte eller på annen måte sammensatt for å tilveiebringe en doseringsform som gir fortrinnet av forlenget virkning. For eksempel kan tabletten eller pillen omfatte en indre doseringskomponent og en ytre doseringskomponent, der den siste foreligger i form av et lag over den første. De to komponentene kan være avgrenset ved hjelp av et enterisk lag som virker for å motstå oppløsning i magen og gjør det mulig for den indre komponenten å passere intakt inn i tarmen eller at frigjøringen av denne blir forsinket i frigjøring. En mengde forskjellige materialer kan bli benyttet til slike enteriske lag eller belegninger, slike materialer inkluderer et antall polymere syrer og blandinger av polymere syrer med slike materialer som sjellakk, cetylalkohol og celluloseacetat.

Passende overflateaktive midler inkluderer spesielt ikke-ioniske midler, slik som polyoksyetylensorbitaner (f.eks. Tween<TM>-20, -40, -60, -80 eller -85) og andre sorbitaner (f.eks. Span<TM>-20, -40, -60, -80 eller -85). Sammensetninger med et overflateaktivt middel vil hensiktsmessig omfatte mellom 0,05 og 5 % overflateaktivt middel og kan være mellom 0,1 og 2,5 %. Det vil være satt pris på at andre ingredienser kan bli tilsatt, f.eks. mannitol eller andre farmasøytisk akseptable vehikler, hvis dette er nødvendig.

Passende emulsjoner kan bli fremstilt ved å benytte kommersielt tilgjengelige fettemulsjoner, slik som Intralipid<TM>, Liposyn<TM>, Infonutrol<TM>, Lipofundin<TM>og Lipiphysan<TM>. Den aktive ingrediensen kan enten bli løst i en forhåndsblandet emulsjonssammensetning eller den kan alternativt bli løst i en olje (f.eks. soyabønneolje, tistelolje, bommulsfrøolje, sesamolje, maisolje eller mandelolje) og en emulsjon kan bli dannet ved å blande med et fosfolipid (f.eks. eggfosfolipider, soyabønnefosfolipider eller soyabønnelecithin) og vann. Det vil være satt pris på at andre ingredienser som blir tilsatt, f.eks. glyserol eller glukose, for å justere tonisiteten til emulsjonen. Passende emulsjoner vil typisk inneholde opptil 10 % olje, f.eks. mellom 5 og 20 %. Fettemulsjonen kan omfatte fettdråper på mellom 0,1 og 1,0 μm, spesielt 0,1 og 0,5 μm, og ha en pH i området fra 5,5 til 8,0.

Emulsjonssammensetningene kan være de som er fremstilt ved å blande en nervevekstfaktorantagonist med Intralipid<TM>eller komponenter derav (soyabønneolje, eggfosfolipider, glyserol og vann).

Sammensetninger for inhalering eller insuflering inkluderer løsninger og suspensjoner i farmasøytisk akseptable vandige eller organiske løsemidler, eller blandinger derav, og pulvere. De flytende eller faste sammenstningene kan inneholde passende farmasøytisk akseptable eksipienser som fremlagt ovenfor. I noen utførelsesformer blir sammenstningene administrert oralt eller nasalt for lokal eller systemisk effekt.

Sammenstninger i fortrinnsvis sterile farmasøytisk akseptable løsemidler kan bli nebulisert ved anvendelse av gasser. Nebuliserte løsninger kan bli pustet direkte inn fra nebulisatorinnretningen eller nebulisatorinnretningen kan være festet på en ansiktsmaske, tent eller avbrutt positiv trykkpustemaskin. Løsnings-, suspensjons- eller pulverpreparater kan bli administrert, fortrinnsvis oralt eller nasalt, fra innretninger som leverer formuleringen på en hensiktsmessig måte.

Behandlingseffektivitet kan bli undersøkt ved hjelp av fremgangsmåter som er velkjente på fagområdet.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Monoklonalt anti-NGF-antistoff er effektivt i å behandle kreftsmerte som er assosiert med benmetastaser

Vi benyttet en murin benkreftsmertemodell for å undersøke virkningen av behandling med anti-NGF-antistoff 911 (et monoklonalt museantistoff, se Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)). Denne murine modellen med benkreftsmerte er utviklet ved intramedulær injeksjon av osteolytiske sarkomceller inn i musens lårben og nålhullet blir deretter fylt med dental amalgam for å begrense tumoren til benet. Se Schwei et al., Neuroscience 19:10886-10897 (1999) og Luger et al., Pain 99:397-406 (2002).

Eksperimenter ble utført på voksne C3H/HeJ-hannmus (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). På dag 0 ble en arterotomi utført etter induksjon med generell anestesi med natriumpentobarbital (50 mg/kg, intraperitoneal (i.p.)). En nål ble satt inn i den medulære kanalen for å danne en vei for sarkomcellene. En fordypning ble deretter lagd ved å benytte et pneumatisk dentalt høyhastighets håndstykke. I tillegg til naive dyr (n=5) ble sham-dyr (n=5) generert med en injeksjon av α-minimum essensielt medium (20 μl, Sigma, St. Louis, MO) inn i det intramedulære hulrommet i lårbenet (betegnet sham) der sarkomdyr (n=5) for hver tilstand som ble testet, ble injisert med medium inneholdende 10<5>2472 osteolytiske sarkomceller (betegnet sarkom eller sark) (20 μl, ATCC, Rockville, MD). For alle dyrene ble injeksjonsstedet forseglet med en dental amalgamplugg for å avgrense cellene eller injisert medium i den intramedulære kanalen og ble etterfulgt av skylling med sterilt vann (hypoton løsning). Til slutt ble snittsåret lukket med sårklemmer. Klemmer ble fjernet på dag 5 slik at det ikke interfererte med atferdstesting. En annen gruppe med sarkominjiserte dyr ble behandlet med anti-NGF (10 mg/kg, i.p.) på dagene 6 og 13.

Atferdsanalyse. Dyr ble testet for smerterelatert atferd på dag 10 og dag 14 etter tumorimplantering. Dyr ble atferdsmessig testet ved å benytte de følgende testene: pågående smerte (spontan gardering og unnviking), ambulerende smerte (anvendelse av lemmer og ”rotarod”) og bevegelsesfremkalt smerte (Palpasjonsfremkalt gardering og palpasjonsfremkalt unnviking). Dyr ble plassert i en observasjons-boks av klar plastikk med et gulv av vaiernetting og tillatt å være der i en periode på 30 min. Etter akklimatisering ble spontan gardering, spontan unnviking, anvendelse av lemmer i løpet av normal ambulering i et åpent felt og gardering i løpet av tvunget ambulering undersøkt. Palpasjonsindusert gardering og unnviking ble målt etter 2 min. perioden med normal ikke-skadelig palpasjon av det distale lårbenet i sarkominjiserte og sham-injiserte dyr.

Antallet spontane unnvikinger og tiden som ble tilbrakt sammenhuket, som er representativt for nosiseptiv atferd, ble registrert simultant i løpet av en 2 min. observasjonsperiode. Gardering ble definert som tiden bakpoten ble holdt i luften mens den var ambulerende og unnvikinger var antall ganger dyret holdt lemmet i luften.

Normal anvendelse av lemmer i løpet av spontan ambulering ble verditilordnet på en skala fra 5-0: (5) normal anvendelse og (0) fullstendig mangel på anvendelse av lemmer.

Tvunget ambulerende gardering ble bestemt ved å benytte en ”rotarod” (Columbus Instruments, Columbus, OH). Rotarodmaskinen har en roterende akse og er utstyrt med hastighets-, akselerasjons- og følsomhetskontroller. Dyrene ble plassert på aksen med X4 fart, 8,0-akselerasjon og 2,5-følsomhet. Tvunget ambulerende gardering ble verditilordnet på en skala fra 5-0: (5) normal anvendelse og (0) fullstendig mangel på anvendelse.

Etter en normal ikke-skadelig palpasjon av det distale lårbenet hos dyr hvert sekund i 2 min. ble dyrene plassert i observasjonsboksen og deres palpasjonsinduserte gardering og palpasjonsinduserte unnviking ble målt i ytterligere 2 min.

Behandling med anti-NGF-antistoff. På dag 6 og dag 13 ble sarkominjiserte dyr intraperitonealt (i.p.) injisert med anti-NGF-antistoff 911 ved 10 mg/kg (sark anti-NGF, n = 5), eller sarkom- og sham-injiserte dyr ble injisert (i.p.) med fysiologisk saltløsning (sham veh eller sark veh, n = 5 for hver tilstand). Alle dyrene ble atferdsmessig analysert på dagene 10 og 14.

Evaluering av pågående smerteatferd. Som vist i Figur 1 utviklet sarkominjiserte dyr (administrert med fysiologisk saltløsning) pågående smerteatferd slik den ble undersøkt ved hjelp av spontan gardering og spontan unnviking (begge å < 0,05, ANOVA) sammenlignet med sham-injiserte dyr (administrert med fysiologisk saltvann). Figur 1 viser også at i.p.-administrering av anti-NGF-antistoff 911 vesentlig reduserte spontan gardering og spontan unnviking hos sarkominjiserte mus på dag 10 og dag 14 etter sarkomimplantering sammenlignet med administrering av fysiologisk saltløsning til sarkominjiserte mus (p < 0,05, ANOVA, for både spontan gardering og spontan unnviking). Disse resultatene tyder på at anti-NGF-antistoff 911 reduserer pågående smerte hos sarkominjiserte mus.

Evaluering av ambulerende smerteatferd. Som vist i Figur 2 utviklet sarkominjiserte dyr (administrert med fysiologisk saltløsning) ambulerende smerteatferd slik den ble undersøkt ved hjelp av anvendelse av lemmer og tvunget ambulerende gardering (rotarod) (begge p < 0,05, ANOVA) sammenlignet med sham-injiserte dyr (administrert med fysiologisk saltløsning). Figur 2 viser også at i.p.-administrering av anti-NGF-antistoff 911 vesentlig økte (nærmere normal) verdi for anvendelse av lemmer og verdi for ambulerende gardering hos sarkominjiserte mus på dag 10 og dag 14 etter sarkomimplantering sammenlignet med administrering av fysiologisk saltløsning til sarkominjiserte mus (p < 0,05, ANOVA, for både anvendelse av lemmer og tvunget ambulerende gardering). Disse resultatene tyder på at anti-NGF-antistoff 911 reduserer ambulerende smerte hos sarkominjiserte mus.

Evaluering av berøringsfremkalt smerteatferd. Som vist i Figur 3 utviklet sarkominjiserte dyr (administrert med fysiologisk saltløsning) berøringsfremkalt smerteatferd slik den ble undersøkt ved hjelp av palpasjonsindusert gardering og palpasjonsindusert unnviking (begge p < 0,05, ANOVA) sammenlignet med sham-injiserte dyr (administrert med fysiologisk saltløsning). Figur 3 viser også at i.p.-administrering av anti-NGF-antistoff 911 vesentlig reduserte palpasjonsindusert gardering og palpasjonsindusert unnviking hos sarkominjiserte mus på dag 10 og dag 14 etter sarkomimplantasjon sammenlignet med administrering av fysiologisk saltløsning til sarkominjiserte mus (p < 0,05, ANOVA, for både palpasjonsindusert gardering og palpasjonsindusert unnviking). Disse resultatene tyder på at anti-NGF-antistoff 911 reduserer berøringsfremkalt smerte hos sarkominjiserte mus.

Eksempel 2

Monoklonalt anti-NGF-antistoff er effektivt i å behandle benkreftsmerte og reduserer flere nevrokjemiske endringer som er assosiert med perifer og sentral sensibilisering i dorsalrotganglier og i ryggmarg

Fremgangsmåter

Dyr. Eksperimenter ble utført på totalt 158 voksne C3H/HeJ-hannmus (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), som veide 20-25 g. Musene ble oppstallet i samsvar med retningslinjene til the National Institutes of Health under spesifikke patogenfrie (SPF) betingelser i autoklaverte bur opprettholdt ved 22<o>C med en alternerende lys- og mørkesyklus på 12 timer og ble gitt autoklavert fôr og vann ad libitum.

Dyrkning og injeksjon av tumorceller. Osteolytiske murine sarkomceller ble anskaffet (NCTC 2472, ATCC, Rockville, MD), stabilt transfektert med grønt fluorescerende protein (GFP) og holdt som tidligere beskrevet av Sabino et al., Cancer Res. 62:7343-9 (2002).

Injeksjon av tumorceller ble utført som tidligere beskrevet. Honore et al., Nat. Med.

6:521-8 (2000), Honore et al., Neuroscience 98:585-598 (2000), Luger et al., Cancer Research 61: 4038-4047 (2001). Kort fortalt ble en arterotomi utført etter induksjon av generell anestesi med natriumpentobarbital (50 mg/kg, i.p.) for å eksponere kondylene i det distale lårbenet. Hanks bufrede sterile saltløsning (HBSS, Sigma Chemical Co., St, Louis, MO, 20 μl, sham, n=40) eller medium inneholdende 10<5>osteolytiske murine sarkomceller (20 μl, NCTC 2472, ATCC, Rockville, MD, sarkom, n=90) ble injisert inn i det intramedulære hulrommet i lårbenet til musen og injeksjonssetet ble forseglet med dental amalgam (Dentsply, Milford, DE), etterfulgt av skylling med sterilfiltrert vann. Et endepunkt på dag 14 ble benyttet, da dette er tidspunktet når tumoren fremdeles er begrenset til benet og det er maksimal presentasjon av kreftrelatert smerteatferd og maksimale endringer i ekspresjon av nevrokjemiske markører for perifer og sentral sensibilisering. Sham-dyr ble benyttet til kontrollanalyse av nevrokjemiske endringer og benhistologi, siden naive dyr ikke var vesentlig forskjellige atferdsmessig, nevrokjemisk eller histologisk.

Behandling med anti-NGF-antistoff. For å undersøke effekten av anti-NGF-antistoffbehandlingen på smerterelatert atferd, nevrokjemiske endringer, tumorvekst og benødeleggelse ble anti-NGF-antistoffet (mAb 911, beskrevet i Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)) administrert (10 mg/kg/hver 5. dag, i.p.) begynnende 6 dager etter injeksjon når observerbar benødeleggelse begynte og ble avsluttet 14 dager etter injeksjon, når ved signifikant benødeleggelse og smerteatferd ble observert. Dosene som ble benyttet i denne undersøkelsen forårsaket ingen skadelige effekter, slik som hypoalgesi, hos naive mus. For å overvåke den generelle helsetilstanden til musene ble vektene registrert på begynnelsen og på slutten av eksperimentene.

Mus ble tilfeldig plassert i behandlingsgrupper som mottok enten sterilt fysiologisk saltløsning (sham vehikkel: n=28, sarkom vehikkel: n=35, 1,4 μl/g/hver 5. dag, i.p.) eller et anti-NGF-antistoff (sham anti-NGF, n=4, sarkom anti-NGF: n=23, 10 mg/kg/hver 5. dag, i.p.) ukentlig. For atferdsmessig sammenligning av anti-NGF-antistoff i forhold til morfinsulfat ble mus gitt en dose med morfin 15 min. før atferdsmessig testing (naive: n=6, sham vehikkel: n=8, sarkom vehikkel: n=8, sarkom anti-NGF: n=8, sarkom morfin 10 mg/kg, i.p.: n=8, sarkom morfin 30 mg/kg, i.p.: n=8). For termisk og mekanisk følsomhetstesting og undersøkelsen av bakpotehudinervasjon ble mus delt i to behandlingsgrupper som mottok enten sterilt fysiologisk saltløsning (naiv vehikkel: n=11) eller et anti-NGF-antistoff (naiv anti-NGF:n=11, 10 mg/kg/hver 5. dag, i.p.) ukentlig i 2 uker.

Karakterisering av anti-NGF-antistoffet. NGF-antagonistantistoffet (mAb 911) er effektivt i å blokkere binding av NGF til TrkA- og p75-NGF-reseptoren og i å inhibere TrkA-autofosforylering og blokkering av NGF-avhengig overlevelse for dorsale rotganglionsensoriske nevroner. Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000).

Avlivning og behandling av vev. Mus ble avlivet på dag 14 etter tumorinjeksjon og vevene ble behandlet for immunhistokjemisk analyse av ryggmarg, dorsale rotganglier (DRG) som tidligere beskrevet og bakpotehud. Honore et al., Nat. Med. 6:521-8 (2000), Luger et al., Cancer Research 61:4038-4047 (2001). Kort fortalt mottok mus en normal ikke-skadelig mekanisk stimulering av det injiserte kneet 1,5 timer før avlivning for induksjon av c-Fos-ekspresjon. Honore et al., Neuroscience 98:585-598 (2000), Hunt et al., Nature 328:632-634 (1987). Etter denne manipuleringen blir musene avlivet med CO2 og perfusert intrakardielt med 12 ml 0,1 M fosfatbufret fysiologisk saltløsning (PBS) etterfulgt av 25 ml 4 % formaldehyd/12,5 % pikrinsyreløsning.

Ryggmargssegmenter (L2-L4), DRG (L1-L5) og fotsålehud ble fjernet, post-fiksert i perfusjonsfikseringsløsningen og kryobeskyttet i 30 % sukrose i 24 timer. Serielle frosne ryggmargs- og hudsnitt, 60 μm tykke, ble skåret på en glidende mikroton, samlet i PBS og behandlet som fritt flytende snitt. Serielle-DRG-snitt, 15 μm tykke, ble skåret på en kryostat og tine-montert på gelatinbelagte preparatglass for behandling.

Etter snitting ble DRG-, ryggmarg- og fotsålehudsnitt raskt skyllet i PBS og deretter inkubert i blokkeringsløsning (3 % normalt eselserum (NDS) 0,3 % Triton X-100 i PBS) i 1 time etterfulgt av inkubering over natt med det primære antistoffet. Ryggmargssnittene ble immunfarget for c-Fos-protein 1:2000, Oncogene Research, San Diego, CA) og dynorfin (polyklonalt marsvin-anti-dynorfin, 1:1000, Neuromics, Minneapolis, MN). DRG-snittene ble immunfarget for aktiverende transkripsjonsfaktor-3 (ATF-3) (polyklonalt kanin-anti-ATF-3, 1:500, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) og CD68 (ED-1, polyklonalt rotte-ant-CD68, 1:5000, Serotec, Raleigh, NC). Hudsnittene ble immunfarget for kalsitoningenrelatert peptid (CGRP) (1:15000, Sigma, St. Louis, MO), tyrosinhydroksylase (TOH) (polyklonalt kanin-anti-TOH,1:2000, Chemicon, Temecula, CA) og nevrofilament-H (klon RT97) (polyklonalt kanin-anti-RT-97, 1:2500, Chemicon, Temecula, CA).

Etter inkubering i primært antistoff ble snitt skyllet i PBS og deretter inkubert i den sekundære antistoffløsningen i 3 timer. Sekundære antistoffer, konjugert til Cy3 eller biotin (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), ble benyttet i henholdsvis 1:600 og 1:500. For å påvise sekundære antistoffer konjugert til biotin: etter sekundær inkubering ble snitt skyllet i PBS og inkubert i Cy3-konjugert streptavidin (1:4000, Jackson ImmunoResearch) i 45 min. For å bekrefte spesifisitet til de primære antistoffene inkluderte kontroller utelatelse av det primære antistoffet eller pre-absorpsjon med det tilsvarende syntetiske peptidet. Etter immunfargingsprosedyrer ble ryggmargssnitt og fotbladhudsnitt montert på gelatinbelagte preparatglass. Monterte snitt av hud, ryggmarg og DRG ble deretter dehydrert i alkoholgradienter (70, 90, 100 %), klaret i xylen og dekkglass ble montert med DPX (Fluka, Sveits).

Etter radiologisk undersøkelse på dag 14 ble høyre (intern kontroll) og venstre (tumorbærende) lårben fiksert i pikrinsyre og 4 % formalin ved 4<o>C over natt og dekalsifisert i 10 % EDTA (Sigma, St. Louis, MO) i ikke mer enn 14 dager. Ben ble deretter innkapslet i parafin. Lårbensnitt, 5 μm tykke, ble skåret i det laterale planet og farget med tartratresistent syrefosfatase (TRAP) og hemotoksylin og eosin (H&E) for å visualisere histologiske egenskaper for den normale benmargen, tumoren, osteoklastene og makrofagene. For å visualisere sarkomceller ved å benytte fluorescensmikroskopi ble lårbensnitt som var 5 μm tykke farget med et antistoff frembrakt mot grønt fluorescerende protein (GFP) (kanin-anti-GFP, 1:6000, Molecular Probes, Eugene, OR). GFP-farging ble utført ved å benytte TSA-pluss cyanin 3-system (PerkinElmer Life Sciences, Inc., Boston, MA), som tidligere beskrevet av Sevcik et al., Pain 111:169-80 (2004).

Immunhistokjemisk analyse av sham- og kreftlårbenet ble utført på det kalsifiserte, parafininnleirede serielle snitt på 14 μm. Tyraminsignalamplifiserings (TSA)-systemet (Perkin Elmer life Sciences, Boston, MA) ble benyttet for å amplifisere Cy3-merkede antistoffer. Endogene peroksidaser ble slukket ved å inkubere snittene i 2 % hydrogenperoksid i 1 time. Snittene ble deretter skyllet tre ganger med PBS i 10 min. og blokkert i TSA-blokkeringsbuffer i 1 time. Primært antiserum ble tilsatt ved fjerning av blokkeringsbufferen og tillatt å inkubere ved romtemperatur over natt. Primære, afferente, ikke-myelinerte og tynt myelinerte sensoriske nervefibre ble merket ved å benytte et antistoff frembrakt mot polyklonalt kanin-anti-kalsitoningenrelatert peptid (CGRP) (1:15000, Sigma). Snittene ble skyllet tre ganger i TSA-vaskebuffer i 10 min. etterfulgt av 45 min. inkubering i streptavidin HRP (1:4000). Snitt ble deretter skyllet tre ganger med TSA-vaskebuffer i 20 min. CY3-konjugert tyramin (1:600) ble tilsatt til lårbenet i 7 min., vasket to ganger med TSA-vaskebuffer og én gang med PBS. Til slutt ble snittene lufttørket, dehydrert gjennom en alkoholgradient (70, 90 og 100 %), klaret i xylen og montert med DPX (Fluka).

Radiografisk analyse og osteoklast- og makrofagproliferasjonsanalyse av ben.

Radiografer (Faxitron X-ray Corp., Wheeling, IL) av dissekerte lårben ble fremskaffet på dag 14 tidspunktet for optimalt å undersøke benødeleggelse. Bilder ble tatt på en Kodak Mini-R 2000 mammografifilm (Eastman Kodak Co., Rochester, NY, eksponeringssettinger: 7 sek., 21 kVp). Omfanget av tumorindusert lårbensødeleggelse ble radiologisk undersøkt i det laterale planet for hele benbildet ved 5X forstørrelse ved å benytte en skala fra 0-5 (0, normalt ben uten noen tegn på ødeleggelse og 5, fulltykkelses-bikortikalt bentap). Honore et al., Nat. Med. 6:521-8 (2000), Honore et al., Neuroscience 98:585-598 (2000), Luger et al., Cancer Research 61:4038-4047 (2001).

Osteoklast- og tumorassosiert makrofag (TAM)-proliferasjon ble bestemt ved å kvantifisere antallet TRAP+-osteoklaster eller TAM’er på TRAP-fargede lårbenssnitt som tidligere beskrevet. Honore et al., Nat. Med. 6:521-8 (2000), Honore et al., Neuroscience 98:585-598 (2000). Kort fortalt blir TAM’er differensiert histologisk fra osteoklaster på lårbensnitt farget med TRAP fordi TRAP+-celler er fritt og multidimensjonelt fordelt i hele tumormassen. Makrofager i benet blir aktivert på grunn av tumorfrigjorte faktorer som stimulerer cellene, og den cellulære fremkomsten av disse aktiverte TAM’ene blir markert ved deres svært irregulære overflate, multiple lamellipodia og fagocyttiske vakuoler.

Osteoklaster blir histologisk differensiert som celler som fremstår som TRAP+ og som er nært assosiert med regioner med benresorpsjon. Disse cellene er multinukleære og blir funnet langs det kortikale og trabekulære benet. Resultater blir uttrykt som det gjennomsnittelige antallet osteoklaster pr. mm eller TAM’er pr. mm<2>.

Kvantifisering av tumorvekst. Lårben som inneholder GFP-uttrykkende sarkomceller ble avbildet ved å benytte et gult 515 nm lavpass emissjonsfilter på et Nikon E600 fluorescensmikroskop utstyrt med et SPOT II digitalkamera som benytter SPOT-bildeopptakssprogramvare (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI). Det totale arealet av intramedullært hulrom og prosenten av intramedullært hulrom som er okkupert av tumor ble beregnet ved å benytte Image Pro Plus v3.0 programvare (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Sabino et al., Cancer Res. 62:7343-9 (2002), Sevcik et al., Pain 111:169-80 (2004). Tumoregenskapene til sarkomceller som er transfektert med GFP, slik som veksthastigheter, omfanget av benresorpsjon og evnen til å indusere benkreftrelatert smerteatferd, var temporært, atferdsmessig og fysisk identisk med ikke-transfekterte sarkomceller. Sabino et al., Cancer Res. 62:7343-9 (2002).

Kvantifisering av sensoriske fibre i ben. Antallet sensoriske nervefibre ble bestemt som tidligere beskrevet. Mach et al., Neuroscience 113:155-66 (2002). Kort forklart ble antallet CGRP-positive fibre i tre benregioner (proksimalt, distalt og diafysealt) og tre benvev (periosteum, mineralisert ben og marg) kvantifisert. Kun nervefibre som var lenger enn 30 μm i lengde ble inkludert i analysen. Seks seksjoner pr. dyr ble analysert og fibrene som ble talt ble uttrykt som fibre pr. totalt benareal.

Kvantifisering av ryggmarg, dorsalrotganglion og bakpotehud. Fluorescensmerket ryggmark, DRG og hudvevsnitt ble analysert ved å benytte enten et MRC 1024 konfokalt mikroskop bildebehandlingssystem (Bio-Rad, Philadelphia, PA), eller et SPOT II digitalkamera på et Olympus BX-60 fluorescensmikroskop med SPOT-bildeopptaksprogramvare (Diagnostic Instruments, Inc.).

Antallet DRG-nevroner som uttrykker aktiverende transkripsjonsfaktor-3 (ATF-3) ble talt ved 200x forstørrelse med et 1 cm<2>okularrutenett. Det totale antall nevroner (små, medium og store) ble bestemt ved å telle både merkede og ikke-merkede nevronale cellekropper (ikke-merkede cellekropper oppviser bakgrunnsmerking som kan bli undersøkt med et rodamin- eller FITC-filter) og resultatet uttrykt som prosent av totalt antall nevroner som uttrykker ATF-3-immunreaktivitet (IR). For å forhindre duplikattelling av nevronale cellekropper ble tellinger utført på hver fjerde serielle snitt for hver markør. For å kvantifisere de aktiverte eller infiltrerende makrofagene i DRG ble SPOT-kamera gråskalabilder fremskaffet på et minimum av fire ipsilaterale og kontralaterale DRG-snitt pr. dyr og analysert ved å benytte Image Pro Plus versjon 3.0 programvare (Media Cybernetics). For hvert bilde ble regioner av DRG som inneholdt kun sensoriske nevronale cellekropper (ekskludert perifere nerver) markert. Mens det ble sett på monitoren ble øvre og nedre grenseverdier for grånivåtetthet satt slik at kun spesifikke CD68-IR-cellulære profiler ble skjelnet fra bakgrunnen i den utledede DRG. Antallet cellulære profiler ble talt pr. snitt automatisk. SPOT-kamera utgangen hadde blitt kalibrert i Image Pro Plus slik at det faktiske arealet for hver markert region innenfor bildene kunne bli bestemt. Seksjonsverdiene for CD68-IR-cellulære profiler og markerte arealer ble summert for hvert dyr og resultatet ble uttrykt som totalt antall CD68-IR-cellulære profiler pr. enhet areal (mm<2>).

Kvantifisering ble utført i ryggmargssnitt på lumbarnivåene L2-L4 siden disse ryggsegmentene mottar signifikante afferente inpulser fra L1-L3 DRG’ene, som er de prinsippielle gangliene som tilveiebringer afferente inpulser til muselårbenet. Edoff et al., Cell & Tissue Research 299:193-200 (2000), Molander C, J. Comp. Neurol. 260:246-255 (1987), Puigdellivol-Sanchez A et al., the Anatomical Record 260:180-188 (2000), Puigdellivol-Sanchez A et al., Neurosci. Lett. 251:169-172 (1998). Kvantifisering av ryggmargssnitt for dynorfin ble tilveiebragt fra 4 tilfeldig valgte L2-L4 koronale ryggmargssnitt pr. dyr. Antallet dynorfin-IR-nevroner i ryggmargssjikt III-VI ble talt ved 100x forstørrelse og uttrykt som gjennomsnittelig antall nevroner pr. 60 μm L2-L4 snitt pr. dyr. Antallet c-Fos-IR-nevroner ble talt i sjikt III-VI fra det dorsale horn i 8 tilfeldig valgte L3/L4 koronale ryggmargssnitt pr. dyr. For å bli ansett som c-Fos-IR ble immunfluorescensgrenseverdien for den nukleære profil satt ved tre ganger det gjennomsnittelige bakgrunnsimmunfluorescensnivået for vevssnittet. Resultater er gitt som gjennomsnittelig antall c-Fos-IR-nevroner pr. ryggmargssnitt.

Kvantifisering av epidermal innervasjonstetthet ble utført på fire tilfeldig valgte fotbladhudsnitt fra bakpote pr. dyr. Det totale antallet CGRP, TOH og RT97-IR-nervefibre ble talt ved 200x forstørrelse. Tellingsregler ble etablert for bare å telle enkle intraepidermale fibre og ikke multiple grener av samme fiber. McCarthy et al., Neurology 45:1848-55 (1995). Den totale lengden av epidermis i alle snitt som ble kvantifisert ble målt ved å benytte et okularrutenett på 1 cm<2>. Kun nervefibre som var minst 25 μm lange og projisert inn i den overflatiske epidermis ble talt. Resultater er gitt som det gjennomsnittelige antallet intraepidermale nervefibre pr. mm lengde pr. dyr.

Atferdsanalyse. Mus ble testet for benkreftsmerterelatert atferd 10 og 14 dager etter sham- eller tumorinjeksjoner når smerteatferd er signifikant tydelig for å undersøke effektiviteten av anti-NGF-behandling. Anti-NGF-behandling ble sammenlignet med morfin (Baxter, Deerfield, IL, 10 mg/kg, i.p.)-behandling og ble administrert 15 min. før atferdstesting for å sikre at dyrene ble testet i det terapeutiske vinduet med legemiddelvirkning. Hasselstrom et al., Pharmacology & Toxicology 79:40-6 (1996).

Mus ble også testet 8, 10, 12 og 14 dager etter tumor- eller sham-injeksjoner for å undersøke virkningen av anti-NGF-behandling (10 mg/kg/hver 5. dag, i.p.) i å svekke smerterelatert atferd gjennom progresjonen til sykdommen. Dyr ble observert over en 2-minutters periode og pågående og palpasjonsfremkalt benkreftsmerteatferd ble analysert, som tidligere beskrevet. Luger et al., Pain 99:397-406 (2002), Sabino et al., Cancer Res. 62:7343-9 (2002), Sabino et al., International Journal of Cancer 104:550-558 (2003). Kort fortalt ble antallet bakpoteunnvikinger og tiden som ble brukt sammenhuket registrert som tiltak mot pågående smerte, da disse tiltakene speiler pasientene i en klinisk setting med benkreft som beskytter eller holder opp sitt tumorbærende lem. I vår modell ble bevegelsesfremkalt smerte som skyldes palpasjon i det injiserte lemmet evaluert ved å benytte tidligere validerte tester. Luger et al., Cancer Research 61: 4038-4047 (2001), Sabino et al., International J. of Cancer 104: 550-558 (2003), Sevcik et al., Pain 111: 169-80 (2004). Palpasjonsfremkalt smerteatferd ble undersøkt hvor dyr fikk en normal ikkeskadelig palpasjon i det tumor- eller sham-injiserte lemmet i to minyutter før observasjon. Luger et al., Cancer Research 61: 4038-4047 (2001), Sevick et al., Pain 111: 169-80 (2004). Mus ble overvåket over en 2-minutters periode og antallet unnvikinger og tid som ble benyttet sammenhuket ble registrert. Palpasjonsfremkalte atferdstester ble utviklet for å reflektere den kliniske tilstanden når pasienter med benkreft opplever smerte etter normal ikke-skadelig bevegelse i det tumorbærende lemmet.

Etter en 15 minutters akklimatiseringsperiode ble termisk og mekanisk følsomhet målt hos naive og naive anti-NGF-dyr for å vurdere hvorvidt de normale smertegrenseresponsene var endret med anti-NGF-behandling. Termisk følsomhet ble målt ved å benytte en Thermal Paw Stimulator (University of California, San Diego, San Diego, CA). Intensiteten på strålingsvarme ble justert slik at de naive dyrene responderte på varmen ved å løfte opp bakpoten omtrent ni sekunder etter at varmen ble påsatt. Choi et al., Life Sci. 73: 471-85 (2003). Musene ble tillatt å få 5 minutter til å hente seg inn igjen mellom hver prøve. En enkelt prøve bestod av fire målinger pr. bakpote, den lengste latensiteten ble droppet og de gjenværende tre målingene ble brukt til å lage et gjennomsnitt. Mekanisk følsomhet ble målt ved å benytte en tidligere validert fremgangsmåte. Chaplan et al., J. Neuroscience Methods 53: 55-63 (1994). Von Frey-filamenter (Stoelting Co., Wood Dale, IL) ble påført på bakpoten til dyrene og grenseverdien for å dra poten vekk ble bestemt ved å øke og minske stimuleringsintensiteten mellom 0,2 og 15,1 g ekvivalenter med kraft. En positiv respons ble notert hvis poten raskt ble trukket tilbake.

RT-PCR-analyse av mRNA-nivåer av NGF i 2472-cellelinjen. Total-RNA fra triplikatmusevevsprøver eller 2472-sarkomceller ble klargjort i overensstemmelse med produsentens instruksjoner ved å benytte RNeasy micro kit (Qiagen), og RNA ble kvantifisert ved å benytte Ribogreen-reagens (Molecular Probes). Totrinns-RT-PCR ble utført ved å benytte TaqMan Gold RT-PCR kit (Applied Biosystems). RNA ble reverstranskribert ved å benytte tilfeldige heksamerer og cDNA ble amplifisert ved å benytte et primer/probe-sett som er spesifikt for NGF (muNGF-187F: GGGCTGGATGGCATGCT (SEKV. ID nr. 3), muNGF-256R: GCGTCCTTGGCAAAACCTT (SEKV. ID nr. 4), muNGF-208T:

CCAAGCTCACCTCAGTGTCTGGGCC (SEKV. ID nr. 5)). Prøvene ble analysert i duplikat fra RT-nivået og normalisert til total RNA-input.

Statistisk analyse. SPSS versjon 11 datastatistikkpakken (SPSS, Chicago, IL) ble benyttet for å utføre statistisk analyse. Blandingseffekt-lineærregresjonsmodellering ble benyttet for å analysere de repeterte målingsdataene, som kan tilpasse individer målt ved forskjellige tidsintervaller, inkludere både faste og tidsvarierende kovariater og kan estimere individuelle endringsrater. Hver avhengig utfallsvariabel ble sammenlignet over grupper ved å benytte en ikke-parametrisk analyse av varians (Kruskal-Wallis). Signifikant Kruskal-Wallis-analyse ble etterfulgt av ikke-parametrisk post-hoc-sammenligninger mellom par av grupper ved å benytte Mann-Whitney-U-testen. Resultater ble ansett som statistisk signifikante ved P<0,05. I alle tilfeller hadde undersøkeren ingen kunnskap om den eksperimentelle status for hvert dyr.

Resultater

Anti-NGF-administrering hadde ingen effekt på sykdomsprogresjon eller makrofaginfiltrering i ben. Effektene av anti-NGF-behandling på benødeleggelse, osteoklastproliferasjon og tumorvekst ble undersøkt på dag 14 etter tumorinjeksjon. Sham-injiserte mus viste ikke signifikant benødeleggelse (benverdi 0,9 0,4, Figur 4a), osteoklastproliferasjon (4,6 0,4 osteoklaster/mm) eller tumorvekst (Figur 4d), som vurdert ved henholdsvis radiologisk analyse, TRAP-analyse og H&E/GFP-analyse, som sammenlignet med sarkominjiserte mus. I sarkom vehikkel-mus var det omfattende benødeleggelse som observert og karakterisert ved multifokal radiogjennomstråling (benverdi 3,5 0,2, Figur 4b), markert økning i antallet osteoklaster (4,0 0,7 osteoklaster/mm) og tumoren hadde fullstendig fylt ut det intramedulære hulrommet (100 0,0 % av intramedullært hulrom, Figur 4e). Behandling av tumorbærende mus med anti-NGF fra dag 6 til dag 14 etter tumorinjeksjon førte ikke til noen signifikant endring i benresorpsjon (3,1 0,6, Figur 4c), ingen reduksjon i sarkomindusert osteoklastproliferasjon (3,5 0,1 osteoklaster/mm) eller tumorvekst (98,0 0,9 % av det intramedulære hulrommet, Figur 4f) som sammenlignet med sarkom vehikkeldyr.

Fjorten dager etter tumorinjeksjon viste sarkom vehikkel-mus en oppregulering av TAM (39,8 12,6 TAM/mm<2>) sammenlignet med sham vehikkel-kontrollmus (0,0 0,0 TAM/mm<2>). Anti-NGF-behandling av sarkominjiserte mus (29,5 7,3 TAM/mm<2>) endret ikke signifikant denne TAM-infiltreringen, som sett i sarkom vehikkel-musene.

Anti-NGF-behandling hadde ingen observerbar effekt på sensorisk eller sympatisk innervasjon i ben eller hud. Tynt myelinerte eller ikke-myelinerte peptiderge sensoriske nervefibre ble merket med et antistoff dannet mot kalsitoningenrelatert peptid (CGRP).

CGRP-IR-nervefibre ble funnet i hele benet (periosteum, mineralisert ben og benmarg) til både naive vehikkel (12,2 0,3 fibre/mm) og naive anti-NGF (13,0 0,8 fibre/mm)-dyr.

Tynt myelinerte eller ikke-myelinerte peptiderge sensoriske nervefibre (CGRP-IR), store myelinerte sensoriske fibre (RT97-IR) og noradrenerge sympatiske nervefibre (TOH-IR) ble analysert i fotbladhud fra bakpote ved hjelp av antistoffer dannet mot henholdsvis CGRP, RT-97 og TOH. Det var ingen signifikante forskjeller mellom intensiteten eller tettheten av CGRP-positive fibre i sarkom vehikkel (12,0 0,8 fibre/mm) og sarkom anti-NGF (12,5 0,6 fibre/mm)-bakpotehudprøver (Figur 5a og 5b). Tilsvarende var det ingen forskjell i intensitet eller tetthet for CGRP-positive fibre mellom naive vehikkel (Figur 5c, n=8)-mus og naive anti-NGF (Figur 5d, n=8)-mus. Det var ingen endring i antallet nervefibre som uttrykte CGRP i sarkom-injiserte og naive mus (a, b vs. c, d). Forskjeller i tettheten og intensiteten for RT-97-positive og TOH-positive fibre var også ikke påvisbart hos sarkom vehikkel (7,3 0,7 RT-97 fibre/mm, 3,1 0,7 TOH fibre/mm) og sarkom anti-NGF-behandlede (7,3 0,7 RT-97 fibre/mm, 3,6 0,7 TOH fibre/mm) dyr. Tilsvarende var det ingen signifikant forskjell mellom intensiteten eller tettheten for CGRP-positive fibre hos naive vehikkel (12,5 0,5 fibre/mm) og naive anti-NGF (11,9 0,7 fibre/mm), bakpotehudprøver (Figur 5c og 5d). Forskjeller i tettheten og intensiteten for RT-97-positive og TOH-positive fibre var også ikke påvisbare hos naive vehikkel (10,4 0,4 RT97 fibre/mm, 3,4 0,4 TOH fibre/mm) og naive anti-NGF-behandlede (11,9 0,7 RT97 fibre/mm, 3,0 0,8 TOH fibre/mm)-dyr. Det var ingen signifikante, observerbare forskjeller mellom intensiteten eller tettheten for CGRP-, RT97- eller TOH-positive fibre i hudprøvene fra sarkom vehikkel og sarkom anti-NGF versus naiv vehikkel og naiv anti-NGF-dyr.

Anti-NGF-antistoffterapi reduserte signifikant benkreftsmerteatferd. Sarkom vehikkel-mus viste en lengre tid tilbragt sammenhuket sammenlignet med sham vehikkelkontrollene (Figur 6a). I tillegg viste sarkom vehikkel-mus et økt antall unnvikinger sammenlignet med sham vehikkel-kontroller (Figur 6b). Administrering av anti-NGF (fra dag 6 til dag 14) hos sarkom-injiserte mus avsluttet signifikant spontan gardering sammenlignet med sarkom vehikkel-mus (Figur 6a). Anti-NGF-behandling reduserte også signifikant spontan unnviking hos sarkom-injiserte mus (Figur 6b).

Bevegelsesfremkalt smerte ble analysert ved å måle palpasjonsinduserte responser. Sarkom vehikkel-mus viste en større andel tid tilbragt sammenhuket etter palpasjon sammenlignet med sham vehikkel-kontrollene (Figur 6c). Sarkom vehikkel-mus viste også et økt antall unnvikinger etter palpasjon sammenlignet med sham vehikkel-kontroller (Figur 6d). Anti-NGF-behandling hos sarkominjiserte mus reduserte signifikant både palpasjonsfremkalt gardering (Figur 6c) og palpasjonsfremkalt unnviking (Figur 6d). I preliminære undersøkelser ble ingen signifikante atferdsforskjeller eller bivirkninger observert mellom sham-opererte dyr som mottok enten vehikkel eller anti-NGF.

Figur 6 viser at anti-NGF-behandling (n=8) fra 6-14 dager etter tumorinjeksjon (triangel) vesentlig reduserte pågående og palpasjonsfremkalt smerteatferd på dagene 10, 12 og 14 sammenlignet med sarkom vehikkel (n=8) (firkant), og var signifikant redusert til sham-nivåer på dag 10 for alle parametere (diamant). Ved alle tidspunkter er sham vehikkel (n=8) vesentlig forskjellig fra sarkom vehikkel. Slik svekket anti-NGF-behandling (10 mg/kg, i.p., hver femte dag) både pågående og bevegelsesfremkalt benkreftsmerteatferd gjennom progresjonen til sykdommen.

Anti-NGF-behandling hadde ingen effekt på termiske eller mekaniske baselinjegrenseverdier og var sammenlignbar med effektiviteten til morfin i å redusere benkreftsmerte. Det var ingen signifikant økning i latens for potetilbakedragelse overfor et termisk stimuli eller økning i grenseverdi for mekanisk stimulering med anti-NGF-administrering sammenlignet med normale smertegrenser. Anti-NGF-behandling hadde ingen effekt på enten normal termisk respons (Figur 7a) sammenlignet med naiv vehikkel eller normal mekanisk stimulering (Figur 7b) sammenlignet med naiv vehikkel.

Dyr ble testet for å sammenligne virkningen av morfinsulfat (MS) med anti-NGF-antistoffet i å redusere benkreftrelatert atferd. Atferdsmessig vurdering på dag 10 og 14 avslørte at sarkom vehikkel-dyr viste statistisk lengre tid sammenhuket (Figur 7c) og økt tid sammenhuket i respons på palpasjon (Figur 7d) i det injiserte lemmet sammenlignet med sham vehikkel-dyr. Behandling med enten anti-NGF (10 mg/kg/hver 5. dag, i.p.) eller morfinsulfat (10 mg/kg eller 30 mg/kg i.p.) reduserte signifikant både pågående og bevegelsesfremkalt garderingsadferd på dagene 10 og 14 etter tumorinjeksjon (Figur 7c, 7d) sammenlignet med sarkom vehikkel-mus. Anti-NGF-behandling svekket signifikant benkreftrelatert smerteatferd mer effektivt sammenlignet med morfindoser på enten 10 mg/kg eller 30 mg/kg (P<0,05 vs. sarkom anti-NGF).

Anti-NGF-behandling modulerte perifere endringer indusert ved benkreft i DRG. Aktiverende transkripsjonsfaktor-3 (ATF-3), som er i ATF/CREB-familien, har tidligere blitt vist og er oppregulert i en modell med perifer nerveskade. Tsujino et al., Molecular & Cellular Neurosciences 15: 170-82 (2000). Denne oppreguleringen ble sett i sensoriske og motornevroncellekropper og er kjent for å merke skadde nevroner. Det var signifikant økning i prosentandelen av ATF-3-IR-nevroner i L2-DRG ipsilateralt for det sarkominjiserte lårbenet (14,0 5,9 % av totale nevroner i L2-uttrykt ATF-3, Figur 8a) sammenlignet med sham vehikkel (1,6 0,5 % av totale nevroner i L2-uttrykt ATF-3). Behandling med anti-NGF svekket signifikant ekspresjonen av ATF-3 (2,6 1,0 % av totale nevroner i L2-uttrykt ATF-3, Figur 8b) 14 dager etter tumorinjeksjon.

Makrofaginfiltrering har blitt vist å være oppregulert på grunn av perifer nerveskade. Abbadie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 7947-52 (2003), Myers et al., Exp. Neurol. 141: 94-101 (1996), Tofaris et al., J. Neurosci. 22: 6696-703 (2002). Et antistoff dannet mot CD68 (ED-1), som er et lysosomalt protein uttrykt av aktiverte vevsmakrofager, ble benyttet for å undersøke makrofaginfiltrering i sarkominjiserte mus. Det var en oppregulering i antallet CD68-IR-nevroner i ipsilateralt DRG hos sarkom vehikkel-mus (119,6 12,1 cellulære profiler/L2 ipsilateral DRG, Figur 8c) sammenlignet med sham vehikkel (80,6 6,0 cellulære profiler/L2 ipsilateral DRG). Anti-NGF-behandling reduserte signifikant oppreguleringen av CD68-IR-nevroner i ipsilateral DRG (92,0 9,9 cellulære profiler/L2 ipsilateral DRG, Figur 8d) hos sarkominjiserte mus, noe som tyder på en signifikant reduksjon i antallet aktiverte og infiltrerende makrofager i ipsilateral L2-DRG hos tumorbærende dyr.

Anti-NGF-behandling modulerte sentrale endringer indusert av benkreft i ryggmargen. Ekspresjon av dynorfin har blitt vist å være involvert i opprettholdelsen av kronisk smerte. Vanderah et al., Pain 92: 5-9 (2001). Dynorfinekspresjon har også blitt vist å være oppregulert i det dorsale horn i ryggmargen ved flere vedvarende smertetilstander. Iadarola, et al., Brain Res. 455: 205-212 (1988), Noguchi et al., Molecular Brain Research 10: 227-233 (1991), Schwei et al., J. Neurosci. 19: 10886-97 (1999). I sham vehikkelmus uttrykte en liten mengde ryggmargsnevroner dynorfin i dype ryggmargssjikt (2,3 1,1 dyn-IR-nevroner/L3/L4-snitt). I motsetning til dette uttrykte sarkom vehikkel-mus vesentlig mer dynorfin-IR-nevroner (6,0 0,5 dyn-IR-nevroner/L3/L4-snitt, Figur 9A). Anti-NGF-behandling redusere signifikant oppreguleringen av dynorfinekspresjon (2,0 0,6 dyn-IR-nevroner-L3/L4-snitt, Figur 9B) hos sarkominjiserte mus.

Umiddelbar-tidlig genaktivering ble forhindret ved anti-NGF-behandling.

Ekspresjonen av c-Fos i det dype dorsale hornet (sjikt III-VI) har blitt benyttet som en markør på sentralsensibilisering i sarkominduserte benkreftsmertetilstander. Honore et al., Nat. Med. 6: 521-8 (2000), Honore et al., Neuroscience 98:585-598 (2000), Luger et al., Cancer Research 61: 4038-4047 (2001), Schwei et al., J. Neurosci. 19: 10886-97 (1999). Normal, ikke-skadelig palpasjon hos sham-opererte dyr førte til minimal ekspresjon av c-Fos i dype sjikt. Sabino et al., Cancer Res. 62: 7343-9 (2002). I benkrefttilstanden viste sarkom vehikkel-mus et økt antall c-Fos-IR-nevroner (27,7 4,9, cFos-IR-nevroner/L3/L4-snitten, Figur 9C) og behandling med anti-NGF reduserte signifikant denne ekspresjonen (11,1 1,9, cFos-IR-nevroner/L3/L4-snitten, Figur 9D).

RT-PCR-resultater. For å kunne se hvorvidt sarkomtumorcellene var en mulig kilde for NGF ble 2472-celler dyrket i kultur vurdert for deres nivå av NGF-mRNA ved hjelp av RT-PCR. Disse nivåene ble sammenlignet med flere normale vev fra musen, så vel som nivået av NGF-mRNA fra spyttkjertel fra hannmus, en kilde for avvikende høyt eksokrint NGF. Som sett i tabell 3 nedenfor inneholdt sarkom-2472-celler in vitro lett påvisbart NGF-mRNA. Dette nivået er i området for NGF-mRNA-nivåer som er fremskaffet fra normale vev som uttrykker høye nivåer av NGF-mRNA, slik som iris. Shelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7951-5 (1984). Likevel er dette nivået flere ganger under nivået for NGF-mRNA som er tilstede i spyttkjertler hos hannmus.

Tabell 3. RT-PCR-data som viser nivå av NGF-ekspresjon

Eksempel 3

Effekt av monoklonalt anti-NGF-antistoff i behandling av benkreftsmerte i en murin modell utviklet ved intramedullær injeksjon av osteoblastiske prostatatumorceller inn i lårben

Fremgangsmåter

Murin prostatamodell for benkreftsmerte. En murin prostatamodell for benkreftsmerte ble benyttet for å vurdere virkningen av behandling med anti-NGF-antistoff 911 (et monoklonalt museantistoff, se Hongo et al., Hybridoma 19:215-227 (2000)). Osteoblastiske hundekarsinomceller (ACE-1, gave fra Dr. Thomas J. Rosol, Ohio State University) ble opprettholdt og injeksjoner av tumorceller ble utført som tidligere beskrevet. Sabono et al., Cancer Res. 62: 7343-7349, 2002, Honore et al., Nature Medicine 6: 521-528, 2000, Honore et al., Prog. Brain Res. 129: 389-397, 2000, Luger et al., Cancer Research 61: 4038-4047, 2001. Kort fortalt ble ACE-1-celler dyrket i medium ved 37<o>C og 5 % CO2. Cellene ble dyrket i T75-flasker (7,5 cm<2>) og passert ved 80-90 % konfluens, to ganger i uken. Kun passeringer mellom 3 og 11 blir benyttet i denne studien. På dag 0 etter induksjon av generell anestesi med natriumpentobarbital (50 mg/kg, i.p.) ble en arterotomi utført for å eksponere kondylene i det distale lårbenet. Hanks bufrede sterile fysiologiske saltløsning (HBSS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, 20 μl, sham, n=7) eller medium inneholdende 10<5>osteoblastiske hunde-ACE-1-celler (20 μl, ACE-1, n=60) ble injisert inn i det intra medulære hulrommet i muselårbenet og injeksjonsstedet ble forseglet med dental amalgam (Dentsply, Milford, DE), etterfulgt av skylling med sterilfiltrert vann. Eksperimentet ble utført på totalt 89 8-10 uker gamle voksne atymiske hann-nakenmus (Harlan Laboratories, Madison, WI), som veide fra 20-32 g. Musene ble oppstallet i overensstemmelse med retningslinjer fra the National Institutes of Health under spesifikke patogenfrie (SPF) betingelser i autoklaverte bur holdt ved 22<o>C med en lys-mørke syklus på 12 timer og ble gitt autoklavert fôr og vann ad libitum.

Et post-injeksjonsendepunkt på dag 19 ble benyttet, siden dette er tidspunktet når tumoren fremdeles er begrenset til benet, det er maksimal presentasjon av kreftrelatert smerteatferd og tumorindusert benremodellering. Sham-dyr ble benyttet til kontrollanalyse av atferdseksperimenter og benhistologi/immunhistokjemi, siden naive dyr ikke var signifikant forskjellig fra sham-dyr atferdsmessig 10 dager etter tumorinjeksjon.

Behandling med anti-NGF-antistoff eller morfin. På dagene 7, 12 og 17 etter tumorinjeksjon ble ACE-1-injiserte dyr intraperitonealt (i.p.) injisert med anti-NGF-antistoff 911 ved 10 mg/kg (ACE-1 anti-NGF, n=9), ACE-1-injiserte dyr ble injisert (i.p.) med fysiologisk saltløsning (ACE-1 veh, n=21, 1,4 μl/kg) og sham-injiserte dyr ble injisert (i.p.) med fysiologisk saltløsning (sham veh, n=7). Alle dyr ble atferdsmessig analysert mellom dagene 7 og 19.

For atferdsmessig sammenligning av anti-NGF-antistoff i forhold til morfinsulfat ble mus gitt en akutt dose med morfin 15 min. før atferdsmessig testing (naiv: n=6, sham: n=7, ACE-1 vehikkel: n=7, ACE-1 anti-NGF: n=7, ACE-1 morfin 10 mg/kg, s.c.: n=8, ACE-1 morfin 30 mg/kg, s.c.: n=8). For termisk og mekanisk følsomhetstesting og undersøkelsen av bakpotehudinervasjon ble naive mus delt i to behandlingsgrupper som mottok enten sterilt fysiologisk saltløsning (naiv vehikkel: n=8) eller anti-NGF-antistoff (naiv anti-NGF: n=8, 10 mg/kg, i.p.).

Atferdsmessige analyser. Dyr ble testet for smerterelatert atferd både før og på dagene 7, 9, 11, 13, 15, 17 og 19 etter tumorimplantasjon eller sham-injeksjon. Dyr ble atferdsmessig testet ved å benytte de følgende testene: pågående smerte (spontan gardering og unnviking) og bevegelsesfremkalt smerte (palpasjonsfremkalt gardering og palpasjonsfremkalt unnviking). Dyr ble plassert i en observasjonsboks av klar plastikk med et vaiernettgulv og tillatt å være der i en periode på 30 min. Etter akklimatisering ble spontan gardering og spontan unnviking vurdert. Palpasjonsindusert gardering og unnviking ble målt etter 2 min. perioden med normal ikke-skadelig palpasjon i det distale lårbenet hos ACE-1- og sham-injiserte dyr. Disse testene ble utført som beskrevet i eksemplene 1 og 2.

Avlivning og behandling av vev. Mus ble avlivet 19 dager etter tumorinjeksjon og vevene ble behandlet for immunhistokjemisk analyse av lårbenet og bakpotehud som tidligere beskrevet Honore et al., Prog. Brain Res. 129: 389-397, 2000, Honore et al., Nat. Med. 6: 521-8 (2000), Luger et al., Cancer Research 61: 4038-4047 (2001). Mus ble avlivet med CO2 og perfusert intrakardielt med 12 ml 0,1 M fosfatbufret fysiologisk saltløsning (PBS) etterfulgt av 25 ml 4 % formaldehyd/12,5 % pikrinsyreløsning.

Fotbladhud fra bakpote ble fjernet, postfiksert i perfusjonsfikseringsmidlet og kryobeskyttet i 30 % sukrose i 24 timer. Serielle hudsnitt, 60 μm tykke, ble skåret på en glidende mikrotom, samlet i PBS og behandlet som frite flytende snitt. Etter snitting ble fotbladhudsnitt raskt skyllet i PBS og deretter inkubert i blokkeringsløsning (3 % normalt eselserum (NDS) 0,3 % Triton X-100 i PBS) i 1 time etterfulgt av inkubering over natt i det primære antistoffet. Hudsnitt ble immunfarget for kalsitoningenrelatert peptid (CGRP) (1:15000, Sigma, St. Louis, MO), tyrosinhydroksylase (TOH) (polyklonal kanin-anti-TOH, 1:2000, Chemicon, Temecula, CA) og nevrofilament-H (klon RT97) (polyklonalt kanin-anti-RT-97, 1:2500, Chemicon, Temecula, CA).

Etter inkubering i primært antistoff ble snittene skyllet i PBS og deretter inkubert i den sekundære antistoffløsningen i 3 timer. Sekundære antistoffer, konjugert til Cy3 eller biotin (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) ble henholdsvis benyttet ved 1:600 eller 1:500. For å påvise antistoffer konjugert med biotin ble snittene skyllet i PBS og inkubert i Cy3-konjugert streptavidin (1:4000, Jackson ImmunoResearch) i 45 min. For å bekrefte spesifisitet for de primære antistoffene inkluderte kontroller utelatelse av det primære antistoffet eller preabsorpsjon med det tilsvarende syntetiske peptidet. Ved å følge immunfargingsprosedyrer ble fotbladhudsnitt skyllet, montert på gelatinbelagte slides.

Monterte snitt ble deretter dehydrert i alkoholgradienter (70, 90, 100 %), klaret i xylen og dekkglass ble montert med DPX (Fluka, Buchs, Sveits).

Etter radiologisk undersøkelse på dag 19 etter tumorinjeksjon ble høyre (internkontroll) og venstre (tumorbærende) lårben fiksert i pikrinsyre og 4 % formalin ved 4<o>C over natt og dekalsifisert i 10 % EDTA (Sigma) i ikke mer enn 14 dager. Ben ble deretter innkapslet i parafin. Lårbensnitter, 5 μm tykke, ble skåret i det laterale planet og farget med tartratresistent sur fosfatase (TRAP) og hematoksilin og eosin (H&E) for å visualisere histologiske egenskaper for den normale benmargen, tumoren, osteoklastene, osteoblastene og makrofagene (Ms).

Immunhistokjemisk analyse av sham-lårben og kreftrammet lårben ble utført på dekalsifiserte, parafininnbakte 14 μm serielle snitt. Endogene peroksidaser ble slukket ved å inkubere snittene i 2 % hydrogenperoksid 1 time. Snittene ble deretter skyllet tre ganger med PBS i 10 min. og blokkert i TSA-blokkeringsbuffer (TSA-pluss cyanin 3 system, PerkinElmer Life Sciences, Inc., Boston, MA) i 1 time. Primært antiserum ble tilsatt ved fjerning av blokkeringsbufferen og tillatt å inkubere ved romtemperatur over natt. Primære, afferente, ikke-myelinerte og tynt myelinerte sensoriske nervefibre ble merket ved å benytte et antistoff frembrakt mot polyklonalt kanin-anti-kalsitoningenrelatert peptid (CGRP) (1:15000, Sigma). Snittene ble skyllet tre ganger i TSA-vaskebuffer i 10 min. etterfulgt av 45 min. inkubering i streptavidin-HRP (1:4000). Snittene ble deretter skyllet tre ganger med TSA-vaskebuffer i 10 min. CY3-konjugert tyramin (1:600) fra TSA-pluss cyanin 3 system ble påført lårbenet i 7 min., skyllet to ganger med TSA-vaskebuffer og én gang med PBS. Til slutt ble snittene lufttørket, dehydrert gjennom en alkoholgradient (70, 90 og 100 %), klaret i xylen og montert med DPX (Fluka).

Radiografisk analyse av ben. Radiografer (Faxitron X-ray Corp., Wheeling, IL) av dissekerte lårben ble fremskaffet på tidspunktet 19 dager for å vurdere omfanget av bendannelse og -ødeleggelse. Bildet ble tatt på en Kodak Min-R 2000 mammografifilm (Eastman Kodak Co., Rochester, NY, eksponeringssettinger: 7 sek., 21 kVp). Analyse av bentetthet ble benyttet for å vurdere omfanget av tumorindusert benremodellering radiografisk i det laterale planet på bilder av helt ben ved fem ganger forstørrelse. Tumorog ikke-tumorbærende lårben (n=8 for naiv vehikkel, sham vehikkel, ACE-1 vehikkel og ACE-1 anti-NGF) ble analysert ved å benytte ImageJ (Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, MD) på en tilsvarende måte som en tidligere beskrevet protokoll. Corey et al., Prostate 52: 20-33, 2002. Kort fortalt ble blanke radiograffilmer og en standardtrinntablett (Eastman Kodak Co.) benyttet for å utvikle en kalibreringskurve. ImageJ ble benyttet for å måle optisk tetthet og deretter konvertert til transmisjon som følger: transmisjon = 1/(antilog10[optisk tetthet]). Gitt at data er bestemt fra et negativt bilde, så er slik transmisjon en direkte representasjon av bentetthet. En HP ScanJet 7400c-skanner ble benyttet til å registrere sub-metningslårbensradiografer og avlesninger ble registrert i duplikat fra hvert lårben. Resultater er presentert som normalisert transmisjonssnitt SE.

Histologisk analyse av osteoblaster, osteoklaster og makrofager, tumorvekst og benremodellering. Osteoblastproliferasjon ble analysert ved å kvantifisere antallet osteoblaster umiddelbart i kontakt med regioner med både tumorindusert ny bendannelse begrenset til inne i lårbenet og kortikalt ben i hele det diafyseale intramedulære hulrommet for naive dyr, sham-injiserte mus og tumorbærende mus. Diafysealt intramedulært hulrom ble definert til å strekke seg fra de proksimale distale trabekula til de distale proksimale trabekula og ble valgt for kvantifisering siden hoveddelen av aktiv benremodellering foregår i denne regionen. Osteoblaster ble identifisert som de cellene som var i direkte kontakt med den nylig frembrakte benmatriksen og arrangert i typiske kubiske eller kollonnemessige epitellag og bundet til hverandre via en tynn utvekst som var mulig å identifisere ved høy forstørrelse (200x eller mer). Resultater er presentert som antallet osteoblaster/mm<2>i diafysealt intramedulært hulrom for naive, sham-injiserte og tumorbærende mus.

Osteoklastproliferasjon ble bestemt ved å kvantifisere antallet TRAP+-osteoklaster ved ben/tumorovergangen og ved den normale marg-benovergangen for naive, sham-injiserte og ACE-1-injiserte mus på TRAP-fargede lårbensnitt som tidligere beskrevet. Honore et al., Nat. Med. 6: 521-528 (2000). Kort fortalt er osteoklaster histologisk differensierte celler som fremkommer som TRAP+ og som er nært assosiert med regionene med benresorpsjon. Disse cellene er multinukleære og blir funnet i Howships lacunae langs det kortikale og trabekulære benet. Fawcett, D. W., A Textbook of Histology. In: D. Dreibelbis (red.), Bone, 11. utgave, sider 211-213. Philadelphia, PA: W.B. Saunders Company, 1986. Makrofag (Ms)-proliferasjon ble bestemt ved å kvantifisere antallet TRAP+-celler som var fordelt i hele tumoren og i normal marg som ikke er assosiert med den endosteale overflaten til det mineraliserte benet. Makrofager i benet blir aktivert på grunn av tumorfrigjorte faktorer som stimulerer cellene, og det cellulære utseende til disse aktiverte Ms er preget av deres svært irregulære overflate, multiple lamellipober og fagocyttiske vakuoler. Resultater er uttrykt som gjennomsnittelig antall av osteoklaster pr. mm<2>eller Ms pr. mm<2>i diafysealt intramedulært hulrom.

Lårben inneholdende ACE-1-celler ble avbildet ved å benytte lysfeltmikroskopi på et Nikon E600 fluorescensmikroskop utstyrt med et SPOT II digitalkamera som benytter SPOT-bildeopptakporgramvare (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI). Det totale arealet i intramedulært hulrom og prosentandelen av intramedulært hulrom som er okkupert av tumor, bendannelse og gjenværende hematopoetiske celler ble beregnet ved å benytte Image Pro Plus v3.0 programvare (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Sabino et al., Cancer Res. 62: 7343-7349, 2002, Sevcik et al., Pain 111: 169-180, 2004. Bendannelse ble analysert ved å benytte de samme H&E-fargede lårbensnittene som ble benyttet for å kvantifisere tumorvekst. Lårbensnitt ble sett på under polarisert lys for å identifisere regioner med vevet og lamellær bendannelse. Regioner med vevet bendannelse ble avbildet med SPOT II-digitalkameraet og kvantifisert ved å benytte Image Pro Plus v3.0 programvare. Resultater er presentert som arealet med tumor, tumorindusert bendannelse og gjenværende hematopoetiske celle som en prosentandel av det totale intramedulære arealet.

Kvantifisering av sensoriske fibre i ben og hud. Antallet sensoriske nervefibre ble bestemt som tidligere beskrevet. Mach et al., Neuroscience 113: 155-166, 2002. Kort fortalt ble antallet CGRP-IR-fibre i tre benregioner (proksimal, distal og diafyseal) og de tre benvevene (periosteum, mineralisert ben og marg) identifisert ved å benytte et MRC-1024 Confocal Imaging-system (Bio-Rad, Richmond, CA) utstyrt med et 20X objektiv. Nervefibertellinger ble utført ved å se på seks lårbensnitt pr. mus med et Olympus BH-2 fluorescensutstyrt mikroskop. Kun nervefibre som var større enn 30 μm ble inkludert i analysen. For å måle det totale overflatearealet (mm<2>) for hvert ben analyserte ved de samme lårbensnittene som nervefibertellingene ble fremskaffet fra. Det totale benarealet ble målt på digitale bilder av lårbensnitt som var fremskaffet ved å benytte et SPOT II-digitalkamera og Image Pro Plus v3.0 programvare. Resultater er presentert som antall fibre som er talt pr. totale benareal.

Kvantifisering av epidermal innervasjonstetthet ble utført på 4 tilfeldig valgte fotsålehudsnitt fra bakpote pr. mus. Det totale antallet CGRP-, TOH- og RT97-IR-nervefibre ble talt ved 200X forstørrelse. Tellingsregler ble etablert for kun å telle enkle intraepidermale fibre og ikke multiple grener av samme fiber. McCarthy et al., Neurology 45: 1848-1855, 1995. Den totale lengden av epidermis i alle snitt som ble kvantifisert ble målt ved å benytte et trådnett på 1 cm<2>. Kun nervefibre som var minst 30 μm lange og som projiserte inn i epidermis ble talt. Resultater er gitt som det gjennomsnittelige antallet av intraepidermale fibre pr. mm lengde pr. mus.

RC-PCR-analyse av mRNA-nivåer for NGF i ACE-1-celler. Total-RNA fra hundehjerneeller hundeprostatatumorceller ACE-1 ble fremskaffet i overensstemmelse med produsentens instruksjoner ved å benytte RNasy micro kit (Qiagen), og RNA ble kvantifisert ved å benytte Ribogreen-reagens (Molecular Probes). Totrinns-RT-PCR ble utført ved å benytte TaqMan Gold RT-PCR kit (Applied Biosystems). RNA ble reverstranskribert ved å benytte tilfeldige heksamerer, og cDNA ble amplifisert ved å benytte et primer/probesett som er spesifikt for NGF (LB041: AACAGGACTCACAGGAGCAA (SEKV. ID nr. 6), LB042:

CGGCACTTGGTCTCAAAGAA (SEKV. ID nr. 7) og LB045: AATGTTCACCTCTCCCAGCACCATCA (SEKV. ID nr. 8)). Prøvene ble analysert i duplikat fra RT-trinnet og normalisert til total-RNA-input.

Statistisk analyse. Statview-datastatistikkpakken (SAS Institute, Inc., Cary, NC) ble benyttet til å utføre statistiske tester. Enveis-ANOVA ble benyttet for å sammenligne atferdsmessige resultater, benhistologiske resultater og immunhistokjemiske mål blant eksperimentgruppene. For multiple sammenligninger ble Fishers PLSD (beskyttede minst signifikante forskjell)-post-hoc-test benyttet. Signifikansnivå ble satt ved P<0,05. Den individuelle undersøkeren som var ansvarlig for atferdsanalyse, immunhistokjemianalyse og verditilordning av benremodellering hadde ingen kunnskap om den eksperimentelle situasjonen for hvert dyr.

Resultater

Anti-NGF-terapi svekket benkreftsmerte i større omfang enn morfinsulfat, men påvirket ikke termiske og mekaniske baselinjegrenseverdier. Pågående smerte ble analysert ved å måle spontan gardering og unnviking over en 2-minutters tidsperiode. ACE-1 vehikkel-mus viste en større del av tiden tilbragt sammenhuket (7,7 0,8 sek., dag 19) sammenlignet med sham vehikkel-kontrollen (0,6 0,3 sek., dag 19, Figur 10A). I tillegg oppviste ACE-1 vehikkel-mus et økt antall unnvikinger (11,9 1,2, dag 19) sammenlignet med sham vehikkel-kontroller (1,0 0,4, dag 19, Figur 10B). Administrering av anti-NGF til ACE-1-injiserte mus svekket signifikant spontan gardering (1,2 0,4 sek., dag 19) sammenlignet med ACE-1 vehikkel-mus (Figur 10A). Anti-NGF-behandling reduserte også signifikant spontane unnvikinger hos ACE-1-injiserte mus (2,1 0,7, dag 19) sammenlignet med ACE-1 vehikkel (Figur 10B). I preliminære undersøkelser ble ingen signifikante, atferdsmessige forskjeller eller bivirkninger observert mellom sham-opererte kontroller som mottok enten vehikkel eller anti-NGF.

Anti-NGF-terapi hadde ingen effekt på enten normal termisk respons (10,2 0,4 sek., dag 19) sammenlignet med naiv vehikkel (11,2 0,4 sek., dag 19, Figur 10C) eller normal mekanisk respons (5,4 0,3 g, dag 19) sammenlignet med naiv vehikkel (5,2 0,4 g, dag 19, Figur 10D).

Dyr ble testet for å sammenligne virkningen av morfinsulfat (MS) i forhold til anti-NGF-antistoffet i å redusere benkreftrelatert atferd. Atferdsmessig vurderinger på dagene 11 og 19 etter tumorinjeksjon avslørte at ACE-1 vehikkel-dyr viste statistisk lengre tid beskyttende det injiserte lemmet (6,0 1,0 og 7,6 1,2 sek., dag 11 og 19) sammenlignet med sham vehikkel-mus (0,4 0,2 og 0,6 0,3 sek., henholdsvis dag 11 og 19, Figur 10E). ACE-1 vehikkel viser også statistisk større antall unnvikinger i det injiserte lemmet (8,6 1,2 og 11,7 1,7, henholdsvis dag 11 og 19) sammenlignet med sham vehikkelmus (0,7 0,3 og 1,0 0,4, henholdsvis dag 11 og 19, Figur 10F). Pågående sammenhukning var signifikant redusert ved enten kronisk behandling med anti-NGF (2,1 1,1 og 1,4 0,4 sek., henholdsvis dag 11 og 19), akutt 10 mg/kg morfinsulfat (3,5 0,3 og 4,0 0,5 sek., henholdsvis dag 11 og 19) eller akutt 30 mg/kg morfinsulfat (2,2 0,3 og 2,0 0,4 sek., henholdsvis dag 11 og 19) sammenlignet med ACE-1 vehikkel-mus (Figur 10E). Pågående unnviking ble også signifikant redusert ved enten kronisk behandling med anti-NGF (3,4 0,7 og 2,6 0,6, henholdsvis dag 11 og 19), akutt 10 mg/kg morfinsulfat (5,6 0,5 og 6,8 0,7, henholdsvis dag 11 og 19) eller akutt 30 mg/kg morfinsulfat (3,6 0,5 og 3,5 0,7, henholdsvis dag 11 og 19) sammenlignet med ACE-1 vehikkel-mus (Figur 10F). Anti-NGF-terapi svekket signifikant den benkreftrelaterte smerteatferden mer effektivt enn akutt 10 mg/kg morfinsulfat. Ingen forskjeller i sluttvekter ble observert mellom sham vehikkel (27 1 g), ACE-1 vehikkel (27 1 g) og ACE-1 anti-NGF (26 1 g)-dyr. I disse studiene ble ingen signifikante, atferdsmessige forskjeller eller bivirkninger, slik som ataksi, sykdom eller letargi observert mellom dyr som mottok enten vehikkel eller anti-NGF.

Anti-NGF-terapi svekket berøringsfremkalt benkreftsmerte. Berøringsfremkalt smerteatferd ble også vurdert. Palpasjonsindusert gardering og unnviking ble målt etter 2 min. perioden med normalt ikke-skadelig palpasjon i det distale lårbenet hos ACE-1- og sham-injiserte dyr. Som vist i Figur 10G og 10H utviklet ACE-1-injiserte dyr (administrert med fysiologisk saltløsning) berøringsfremkalt smerteatferd ved dag 7 slik dette ble vurdert ved palpasjonsindusert gardering (Figur 10G) og palpasjonsindusert unnviking (Figur 10H) begge p<0,01, ANOVA) sammenlignet med sham-injiserte dyr (administrert med fysiologisk saltløsning). Figur 10G og 10H viser også at i.p.-administrering av anti-NGF-antistoff 911 signifikant reduserer palpasjonsindusert gardering (Figur 10G) og palpasjonsindusert unnviking (Figur 10H) hos ACE-1-injiserte mus fra dag 11 til dag 19 etter ACE-1-tumorimplantasjon sammenlignet med administrering av fysiologisk saltløsning til ACE-1-injiserte mus (p < 0,01, ANOVA, for både palpasjonsindusert gardering og palpasjonsindusert unnviking). Disse resultatene tyder på at anti-NGF-antistoff 911 reduserer berøringsfremkalt smerte hos ACE-1-injiserte mus.

Anti-NGF-terapi hadde ingen effekt på markører for sykdomsprogresjon eller tumorindusert bendannelse. Effekten av anti-NGF-terapi på bendannelse og ødeleggelse, tumorvekst (Figur 11) og osteoklastproliferasjon (Figur 12) ble undersøkt 19 dager etter tumorinjeksjon (tabell 4 nedenfor). Sham-injiserte mus viste ingen signifikant benremodellering (normalisert transmisjonsverdi på 115 2 %) (Figur 11A), osteoklastproliferasjon i hele det intramedulære hulrommet (16 10 osteoklaster/mm<2>diafysialt intramedulært område) (Figur 12A) eller tumorceller (0 0 %) (Figur 11D), som undersøkte henholdsvis radiologisk analyse, TRAP-analyse og H&E-analyse, sammenlignet med ACE-1-induserte mus. Hos ACE-1 vehikkel-mus var det omfattende men nært ekvivalent bendannelse og -ødeleggelse slik dette ble observert og karakterisert ved hjelp av multifokal diafyseal brodannelse og radiostråling (normalisert transmisjonsverdi på 109 5 %) (Figur 11B), markert økning i antallet osteoklaster (Figur 12B) og osteoblaster i hele det diafyseale intramedulære området (47 3 osteoklaster/mm<2>og 127 7 osteoblaster/mm<2>) og tumoren hadde fylt mesteparten av det intramedulære hulrommet (60 7 % av intramedulært hulrom) (Figur 11E). Behandling av tumorbærende mus med anti-NGF-antistoff fra dag 7 etter tumorinjeksjon førte ikke til noen signifikant endring i benremodellering (normalisert transmisjonsverdi på 106 9 %) (Figur 11C), ingen reduksjon i ACE-1-indusert osteoklastproliferasjon (Figur 12C) eller osteoblastproliferasjon i det diafyseale intramedulære området (47 5 osteoklaster/mm<2>og 118 15 osteoblaster/mm<2>) eller tumorvekst (57 6 % av intramedulært hulrom) sammenlignet med ACE-1 vehikkel-dyr (Figur 11F).

Tabell 4: Histologisk og radiologisk kvantifisering av benremodellering og tumorprogresjon hos anti-NGF- og vehikkelbehandlede ACE-1-dyr

(Naiv transmisjon)

<a>P < 0,05 versus naiv.

<b>P < 0,05 versus sham (enveis-ANOVA, Fishers PLSD).

Nitten dager etter tumorinjeksjon viste ACE-1 vehikkel-mus en økning i makrofager (Ms) (27 2 Ms/mm<2>diafysealt intramedulært hulrom) sammenlignet med sham vehikkel-kontrollmus (2 1 Ms/mm<2>). Anti-NGF-behandling av ACE-1-injiserte mus (24 3 Ms/mm<2>) endret ikke vesentlig Ms-infiltrering, som sett hos ACE-1 vehikkelmusene (tabell 4).

Anti-NGF-terapi har ingen observerbar effekt på sensorisk eller sympatisk innervering i ben eller hud. Tynt myelinerte eller ikke-myelinerte peptiderge sensoriske nervefibre (CGRP-IR), store myelinerte sensoriske fibre (RT97-IR) og noradrenerge sympatisk nervefibre (TOH-IR) ble analysert i de ACE-1-injiserte lårbenene eller fotbladhud fra bakpote ved hjelp av immunhistokjemi ved å benytte antistoff frembrakt mot CGRP, RT-97 og TOH. CGRP-IR-nervefibre ble funnet i hele benet (periosteum, mineralisert ben, benmarg og tumor) hos ACE-1 vehikkel (23,5 1,9 fibre/mm<2>) og ACE-1 anti-NGF-(24,0 1,9 fibre/mm<2>)-dyr i tillett til i sham vehikkel (28,2 1,5 fibre/mm<2>) og naiv vehikkel-dyr (24,6 2,4 fibre/mm<2>) eller naiv anti-NGF-dyr (23,1 1,9 fibre/mm<1>) (Figur 14). Det var ingen signifikant forskjell mellom intensiteten eller tettheten av CGRP-IR-fibre hos ACE-1 vehikkel (13,9 0,5 fibre/mm) og ACE-1 anti-NGF (15,2 0,7 fibre/mm) bakpotehudprøver (Figur 13A og B). Tilsvarende var det ingen signifikant forskjell mellom intensiteten eller tettheten av CGRP-IR-fibre i naiv vehikkel (14,4 0,4 fibre/mm) og naiv anti-NGF (14,2 1,3 fibre/mm) bakpotehudprøve (Figur 14A og B). Forskjeller i tettheten og intensiteten for RT97-IR- og TOH-IR-fibre var også ikke påvisbar i naiv vehikkel (4,2 2,2 RT97 fibre/mm, 16,0 2,7 TOH fibre/mm) og naiv anti-NGF-behandlede (8,0 0,5 RT97 fibre/mm, 12,8 1,1 TOH fibre/mm)-dyr. Det var ingen signifikante, observerbare forskjeller mellom intensiteten eller tettheten av CGRP-, RT97- eller TOH-IR-fibre i hudprøvene fra ACE-1 vehikkel og ACE-1 anti-NGF versus naiv vehikkel og naiv anti-NGF-dyr.

Nivå av mRNA-ekspresjon i ACE-1-celler. NGF-ekspresjon i hundehjerne og ACE-1-celler ble sammenlignet. Fem uavhengige ACE-1-prøver ble analysert og i hver av disse var NGF-ekspresjon under nivået for påvisning i PCR-analysen. NGF i hundehjerne krysset grensen ved syklus 35,2 i et eksperiment med 40 sykluser, mens ACE-1-prøvene ikke krysset grensene etter 40 sykluser. Slik var NGF-mRNA-ekspresjon i ACE-1-prøvene minst 27,8 ganger mindre enn ekspresjon i hjerne.

Eksempel 4

Smertestillende effekter av anti-NGF-antistoff E3 hos pasienter med moderat til alvorlig smerte fra metastaser i ben på grunn av enten prostata- eller brystkreft I en randomisert, placebokontrollert, dobbelblind undersøkelse ble smertestillende effekter (inkludert tid frem til start, tid til topp, varighet i tillegg til smertelindring målt ved hjelp av Visual Analogue Scale (VAS)) av intravenøse doser (100 μg/kg, 300 μg/kg eller 1000 μg/kg) med anti-NGF-antistoff E3 sammenlignet med placebo hos pasienter med moderat til alvorlig smerte fra metastaser i ben på grunn av enten prostata- eller brystkreft. Voksne menn og kvinner (alle mellom 35-75 år) som opplever moderat til alvorlig smerte fra metastaser i ben som skyldes enten prostata- eller brystkreft, blir tatt inn i studien. I løpet av screeningsperioden må pasientene registrere sitt smertenivå fire ganger pr. dag og også registrere deres anvendelse av andre smertestillende midler i 14 dager før anti-NGF-antistoff E3.

280 pasienter ble tatt med i studien. Anti-NGF-antistoff E3-administrering foregår på morgenen på dag 1 og dag 29, etter registreringen av to uker med baselinjesmertenivå, anvendelse av andre smertestillende midler og skadelige hendelser. 280 pasienter blir delt i fire grupper og hver gruppe har 70 pasienter. Pasienter i hver gruppe blir behandlet med placebo, 100 μg/kg, 300 μg/kg eller 1000 μg/kg med anti-NGF-antistoff E3.

Smertestillende effekter blir vurdert fire ganger daglig i 14 dager før dosering og i en periode på 6 måneder etter administrering av antistoff E3. Resultater blir vurdert som endring fra screeningsbaselinjen (gjennomsnittelig smertenivå i 14 dager før administrering av placebo eller antistoff E3). Enhver reduksjon i smerteverdier og/eller reduksjon i anvendelse av andre smertestillende midler i én eller flere grupper av pasienter som blir behandlet med anti-NGF-antistoff E3 sammenlignet med placebo viser effektivitet for behandlingen med anti-NGF-antistoff E3.

Claims

Patentkrav

1. Anvendelse av en nervevekstfaktor (NGF)-antagonist for fremstilling av et medikament til behandling av benkreftsmerte i et individ, hvor NGF-antagonisten er et anti-NGF-antagonistantistoff som binder seg til den samme NGF epitopen som, og/eller konkurrerer for binding til NGF med et antistoff som omfatter en tungkjede variabel region som består av aminosyre sekvensen med SEKV ID Nr. 1 og en lettkjede variabel region som består av aminosyre sekvensen med SEKV ID Nr. 2, og hvor anti-NGF-antagonistantistoffet binder humant NGF med en KD på omtrent 0,1 nM eller mindre enn omtrent 0,1 nM.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor benkreftsmerten er fra kreft som har oppstått i ben.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvor benkreftsmerten er fra osteosarkom.

4. Anvendelse ifølge krav 1, hvor benkreftsmerten er fra kreft som er metastasert til ben.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvor kreften som er metastasert til ben er valgt fra prostatakreft, brystkreft, lungekreft, sarkom, og nyrekreft som er metastasert i ben.

6. Anvendelse ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor antistoffet binder en epitop som omfatter en eller flere av: rester K32, K34 og E35; rester Y79 og T81; rester H84 og K88; rest R103; rest E11; rester L112 og S113; rester R59 og R69; eller rester V18, V20 og G23 av menneskelig NGF.

7. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de tidligere kravene, hvor anti-NGF-antagonist-antistoffet er et monoklonalt antistoff.

8. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, hvor anti-NGF-antagonistantistoffet er et humanisert antistoff.

9. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, hvor anti-NGF-antagonistantistoffet er et humant antistoff.

10. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de tidligere kravene, hvor anti-NGF-antagonist-antistoffet binder humant NGF.

11. Anvendelse ifølge krav 10, hvor anti-NGF-antagonist-antistoffet ytterligere binder gnager-NGF.

12. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de tidligere kravene, hvor NGF-antagonisten ikke blir koadministrert med et opioid smertestillende middel.

13. Anti-NGF-antagonist-antistoff for anvendelse ved behandling av benkreftsmerte i et individ, hvor NGF-antagonisten er et anti-NGF-antagonistantistoff som binder seg til den samme NGF epitopen som, og/eller konkurrerer for binding til NGF med et antistoff som omfatter en tungkjede variabel region som består av aminosyre sekvensen med SEKV ID Nr.

14. Sett til behandling av benkreftsmerte,

k a r a k t e r i s e r t v e d at det omfatter en NGF-antagonist og instruksjoner for å anvende NGF-antagonisten for å behandle benkreftsmerte, hvor NGF-antagonisten er et anti-NGF-antagonistantistoff, hvor NGF-antagonisten er et anti-NGF-antagonistantistoff som binder seg til den samme NGF epitopen som, og/eller konkurrerer for binding til NGF med et antistoff som omfatter en tungkjede variabel region som består av aminosyre sekvensen med SEKV ID Nr. 1 og en lettkjede variabel region som består av aminosyre sekvensen med SEKV ID Nr. 2, og hvor og hvor anti-NGF-antagonistantistoffet binder humant NGF med en KD på omtrent 0,1 nM eller mindre enn omtrent 0,1 nM.

15. Farmasøytisk sammensetning til behandling av benkreftsmerte,

k a r a k t e r i s e r t v e d at det omfatter en NGF-antagonist og en farmasøytisk effektiv bærer hvor NGF-antagonisten er et anti-NGF-antagonistantistoff, hvor NGF-antagonisten er et anti-NGF-antagonistantistoff som binder seg til den samme NGF epitopen som, og/eller konkurrerer for binding til NGF med et antistoff som omfatter en tungkjede variabel region som består av aminosyre sekvensen med SEKV ID Nr. 1 og en lettkjede variabel region som består av aminosyre sekvensen med SEKV ID Nr. 2, og hvor anti-NGF-antagonistantistoffet binder humant NGF med en KD på omtrent 0,1 nM eller mindre enn omtrent 0,1 nM.