JP2012229238A - 神経成長因子アンタゴニストを投与することによって骨癌の疼痛を処置するための方法 - Google Patents

神経成長因子アンタゴニストを投与することによって骨癌の疼痛を処置するための方法 Download PDF

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Abstract

【課題】個体において、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛の発生を減少させる方法、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛を改善させる方法、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛を軽減する方法；および／または骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛の発現または進行を遅延させる方法の提供。
【解決手段】抗ＮＧＦ抗体、例えば、抗ヒトＮＧＦ（抗ｈＮＧＦ）モノクローナル抗体などのＮＧＦアンタゴニストの有効量を投与することにより、個体（ヒトと非ヒトの双方）における骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛を予防または処置する方法。
【選択図】なし

Description

（関連出願に対する相互参照）
本願は、米国仮特許出願番号第６０／６２０，６５４号（２００４年１０月１９日出願
）および同第６０／５６０，７８１号（２００４年４月７日出願）の優先権の利益を主張
し、これらの出願のすべてが、参考としてその全体が本明細書に援用される。
（連邦政府によって資金提供を受けている研究または開発に関する記載）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈの助成金５
Ｒ３７−ＮＳ２３９７０−１６、５Ｒ０１−ＤＡ１１９８６−０５および１Ｒ０１−ＮＳ
０４８０２１−０１Ａ１の下で米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に
おいて一定の権利を有し得る。
（本発明の分野）
本発明は、骨癌の疼痛の予防、改善、または処置のための神経成長因子（ＮＧＦ）アン
タゴニストの使用に関する。
（発明の背景）
神経成長因子（ＮＧＦ）は、同定された最初のニューロトロフィンであり、末梢および
中枢ニューロン双方の発達および生存におけるその役割は、十分に特徴付けられている。
ＮＧＦは、末梢の交感ニューロンおよび胚の感覚ニューロンならびに前脳基底核のコリン
作動性ニューロンの発達における重要な生存および維持因子であることが示されている（
Ｓｍｅｙｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ３６８：２４６−２４９頁（１９９４）；Ｃｒｏｗｌｅｙ
ら、Ｃｅｌｌ７６：１００１−１０１１頁（１９９４））。ＮＧＦは、感覚ニューロンに
おける神経ペプチドの発現をアップレギュレートし（Ｌｉｎｄｓａｙら、Ｎａｔｕｒｅ３
３７：３６２−３６４頁（１９８９））、その活性は、２つの異なる膜結合レセプター、
ＴｒｋＡチロシンキナーゼレセプター、および腫瘍壊死因子レセプターファミリーの他の
メンバーと構造的に関連しているｐ７５レセプターによって媒介されている（Ｃｈａｏら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３２：５１８−５２１頁（１９８６））。
ＮＧＦは、神経系におけるその作用に加えて、神経系外の過程に関与していることが益
々示唆されてきている。例えばＮＧＦは、ラットにおいて、血管透過性を増大させる（Ｏ
ｔｔｏｎら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０６：１９９−２０１頁（１９８４）
）、Ｔ細胞およびＢ細胞の免疫応答を増強させる（Ｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００５９−１００６３頁（１９８９））、リンパ球
の分化および肥満細胞の増殖を誘導し、肥満細胞から可溶性生物学的シグナルを放出させ
る（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：６５０８
−６５１２頁（１９８８）；Ｐｅａｒｃｅら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７２：３７９−３
９３頁（１９８６）；Ｂｉｓｃｈｏｆｆら、Ｂｌｏｏｄ７９：２６６２−２６６９頁（１
９９２）；Ｈｏｒｉｇｏｍｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４８８１−１４８
８７（１９９３））ことが示されている。外来的に加えられたＮＧＦがこれら全ての作用
を有し得ることは示されているが、内因性ＮＧＦが、インビボでこれらの何らかの過程に
おいて重要であることは稀にしか示されていないことに注意することは重要である（Ｔｏ
ｒｃｉａら、Ｃｅｌｌ．８５（３）：３４５−５６頁（１９９６））。したがって、何ら
かの作用があったとしても、内因性ＮＧＦの生物活性阻害のうち、その作用が何であり得
るかは明らかではない。
ＮＧＦは、肥満細胞（Ｌｅｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９
１：３７３９−３７４３頁（１９９４））、Ｂリンパ球（Ｔｏｒｃｉａら、Ｃｅｌｌ８５
：３４５−３５６頁（１９９６）、ケラチノサイト（Ｄｉ Ｍａｒｃｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６８：２２８３８−２２８４６頁））、平滑筋細胞（Ｕｅｙａｍａら、Ｊ
．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１１：１０６１−１０６５頁（１９９３））、繊維芽細胞（Ｌｉ
ｎｄｈｏｌｍら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：７９５−８０１頁（１９９０））
、気管支上皮細胞（Ｋａｓｓｅｌら、Ｃｌｉｎ、Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ３１：１４３２
−４０頁（２００１））、腎糸球体細胞（Ｓｔｅｉｎｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ
．２６１：Ｆ７９２−７９８頁（１９９１））および骨格筋筋管（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、
Ｊ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ、Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ６６：１９５−２００頁（２００２）
）などの多数の細胞型によって産生される。ＮＧＦのレセプターは、神経系の外側の種々
の細胞型に見出されている。例えば、ＴｒｋＡは、ヒトの単球、ＴならびにＢリンパ球お
よび肥満細胞に見出されている。
ＮＧＦ濃度の増加と種々の炎症状態との間の関連が、ヒト患者において、ならびにいく
つかの動物モデルにおいて見られている。これらには、全身性エリテマトーデス（Ｂｒａ
ｃｃｉ−Ｌａｕｄｉｅｒｏら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ４：５６３−５６５（１９９３）
）、多発性硬化症（Ｂｒａｃｃｉ−Ｌａｕｄｉｅｒｏら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．
１４７：９−１２頁（１９９２））、乾癬（Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉら、Ａｃｔａ Ｄ
ｅｒｍ．ｌ’ｅｎｅｒｅｏｌ．７８：８４−８６頁（１９９８））、関節炎（Ｆａｌｃｉ
ｍｉら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５５：７４５−７４８（１９９６））、間質性膀
胱炎（Ｏｋｒａｇｌｙら、Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ１６１：４３８−４４１頁（１９９１））
、喘息（Ｂｒａｕｎら、Ｅｕｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３２４０−３２５１頁（１
９９８））、膵臓炎、および前立腺炎が含まれる。
一貫して、末梢組織におけるＮＧＦ濃度の上昇は、炎症に関連しており、関節炎の多く
の形態に見られている。関節リューマチに罹っている患者の滑液は、高濃度のＮＧＦを発
現するが、非炎症滑液においては、ＮＧＦが検出できないと報告されている（Ａｌｏｅら
、Ａｒｃｈ．Ｒｈｅｕｍ．３５：３５１−３５５頁（１９９２））。実験的に関節リュー
マチを誘導させたラットにおいて、同様な結果が見られている（Ａｌｏｅら、Ｃｌｉｎ．
Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１０：２０３−２０４頁（１９９２）；Ｈａｌｌｉｄａｙ
ら、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２３：９１９−２２頁（１９９８））。遺伝子導入関
節炎マウスにおいて、肥満細胞の数の増加と共に、ＮＧＦ濃度の上昇が報告されている（
Ａｌｏｅら、Ｉｎｔ．Ｌ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ−Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ａｓ
ｐｅｃｔｓ１５：１３９−１４３頁（１９９３））。
外因性ＮＧＦによる処置は、疼痛および疼痛感受性の増大をもたらす。これは、ＮＧＦ
の注射が、動物モデル（Ｌｅｗｉｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：２１３６−２１４
８頁（１９９３）；Ａｍａｎｎら、Ｐａｉｎ６４、３２３−３２９頁（１９９６）；Ａｎ
ｄｒｅｅｖら、Ｐａｉｎ６３、１０９−１１５頁（１９９５））とヒト（Ｄｙｃｋら、Ｎ
ｅｕｒｏｌｏｇｙ４８、５０１−５０５頁（１９９７）；Ｐｅｔｔｙら、ＡｎｎａｌｓＮ
ｅｕｒｏｌ．３６、２４４−２４６頁（１９９４））の双方に、かなりの疼痛および疼痛
感受性の増大をもたらす事実によって例示される。ＮＧＦは、ニューロトロフィンＢＤＮ
Ｆの誘導（Ａｐｆｅｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７（２）、１３４−１
４２頁（１９９６）；Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ１７、８４７６−８４９
０頁（１９９７））次いで、それによる脊髄における疼痛シグナル処理の変化（Ｈａｉｎ
ｓら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．３２０（３）、１２５−８頁（２００２）；Ｍｉｌ
ｅｔｉｃら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３１９（３）、１３７−４０頁（２００２）
；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９６（１４）、
７７１４−８頁（１９９９））、脊髄における感覚ニューロンおよび他の疼痛伝達ニュー
ロンの末梢および中枢の接続変化（Ｌｅｗｉｎら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ６、１９０３−１９１２頁（１９９４）；Ｔｈｏｍｐｓ
ｏｎら、Ｐａｉｎ６２、２１９−２３１頁（１９９５））、軸索成長の誘導（Ｌｉｎｄｓ
ａｙ、ＲＭ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８（７）、２３９４−４０５頁（１９８８））、ブ
ラジキニンレセプター発現の誘導（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ８３
：１６１−１６８頁（１９９８））、イオンチャネルなど、神経の活性化および伝達を担
う遺伝子の発現における変化誘導（Ｂｏｅｔｔｇｅｒら、Ｂｒａｉｎ１２５（Ｐｔ２）、
２５２−６３頁（２００２）；Ｋｅｒｒら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ１２（１４）、３０
７７−８頁（２００１）；Ｇｏｕｌｄら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ８５４（１−２）、１９−
２９頁（２０００）；Ｆｊｅｌｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．８１：８０３−８
１０頁（１９９９））、疼痛関連レセプターＴＲＰＶ１の増強（Ｃｈｕａｎｇら、Ｎａｔ
ｕｒｅ４１１（６８４０）、９５７−６２頁（２００１）；ＳｈｕおよびＭｅｎｄｅｌｌ
、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２７４：１５９−１６２頁（１９９９））および筋肉に
おける病理的変化の原因（Ｆｏｓｔｅｒら、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ１９７（２）、２４５−５
５頁（２００２））など、複数の機構によって作用するようである。これらの変化の多く
は、疼痛伝達感覚ニューロン上に直接生じ、同時に生じている炎症に依るものでないこと
は明らかである。また、ＮＧＦに応答することが知られており、疼痛の感覚および感受性
に関与していると考えられる細胞型が少なくとも他に２つある。これらのうちの第１のも
のである肥満細胞は、脱顆粒化によりＮＧＦに応答する（Ｙａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．
（Ｌｏｎｄ）８０：５６５−５６９頁（１９９１））かまたは、他の研究では、他の因子
と協同して、伝達物質の産生または放出を引き起こすか、または増加させる（Ｐｅａｒｃ
ｅおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７２：３７９−３９３頁（１９８６
）、Ｋａｗａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：６４１２−６４１９（２００２
））ことが報告されている。ラットにおいて、ＮＧＦ媒介の疼痛応答は、少なくともいく
らかは、肥満細胞によって媒介されていることが明らかに示されている（Ｌｅｗｉｎら、
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：１９０３−１９１２頁（１９９４）、Ｗｏｏｌｆら
、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：２７１６−２７２３頁（１９９６）が、ヒトにおいては
、これに関連する可能性が示されているままである。一次交感ニューロンもまた、ＮＧＦ
に応答し、疼痛のシグナル伝達にも関与していることが知られている（Ａｌｅｙら、Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ７１：１０８３−１０９０頁（１９９６））。交感神経刺激伝達を
除去すると、ＮＧＦによる処置に応答して通常見られる痛覚過敏が改変されることが明ら
かである（Ｗｏｏｌｆら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：２７１６−２７２３頁（１９９
６）。
種々のタイプの疼痛を処置するためのＮＧＦアンタゴニスト（例えば、抗ＮＧＦ抗体）
の使用が記載されている。例えば、米国特許出願第１０／６８２，３３１号、第１０／６
８２，６３８号、特許文献１、特許文献２、特許文献３、第１０／７９１，１６２号、特
許文献４、特許文献５、ＰＣＴ／ＵＳ０３／３２１１３号；特許文献６；特許文献７を参
照されたい。
骨癌の疼痛は、ヒトにおいて、原発骨腫瘍から、またはより一般的には、骨転移（乳癌
、前立腺癌、および肺癌などからの）から生じ得る。非特許文献１を参照されたい。骨癌
の疼痛のマウスモデルが開発されており、骨癌の疼痛のこのモデルは、軽度から重度の骨
癌の疼痛を有するヒトに見られる疼痛を反映している。非特許文献１；非特許文献２；非
特許文献３；非特許文献４を参照されたい。ＨｏｎｏｒｅらおよびＳｃｈｗｅｉらによる
論文は、骨癌を有する動物の脊髄およびＤＲＧにおいて見られる変化の神経化学的特性は
、独特であり、このモデルの古典的な炎症状態および神経障害痛状態に類似したこの生化
学的特性成分は存在するようではあるが、典型的な炎症痛または典型的な神経障害痛から
区別できる。非特許文献５；非特許文献３；非特許文献１。
本明細書に引用される特許出願および刊行物などの全ての文献は、参考としてその全体
が援用される。
米国特許出願公開第２００４／０１３１６１５号明細書 米国特許出願公開第２００４／０２５３２４４号明細書 米国特許出願公開第２００４／０２３７１２４号明細書 国際公開第０４／０３２８７０号パンフレット 国際公開第２００５／０００１９４号パンフレット 国際公開第０４／０７３６５３号パンフレット 国際公開第０４／０５８１８４号パンフレット Ｌｕｇｅｒら、Ｐａｉｎ、２００２年、９９、ｐ．３９７−４０６ Ｃｌｏｈｉｓｙら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、４１５Ｓ、Ｓ２７９− Ｓ２８８ Ｓｃｈｗｅｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９９年、１９、ｐ ．１０８８６−１０８９７ Ｈｏｎｏｒｅら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２０００年、６、ｐ．５２１ −２９ Ｈｏｎｏｒｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年、９８、 ｐ．５８５−５９８
（発明の要旨）
本発明は、抗ＮＧＦ抗体などのＮＧＦのアンタゴニストが、骨転移に関連した癌の疼痛
などの骨癌の疼痛の処置に有効であるという発見に基づいている。該処置は、本明細書に
記載された骨転移に関連した癌の疼痛など、骨癌の疼痛の１つ以上の態様に関する。
一局面において、本発明は、神経成長因子（ＮＧＦ）のアンタゴニストを投与すること
により、骨転移に関連した癌の疼痛（「骨転移痛」とも称される）などの骨癌の疼痛を予
防または処置する方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニス
トは、オピオイド鎮痛剤と同時投与される。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタ
ゴニストは、ＮＳＡＩＤと同時投与される。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタ
ゴニストは、オピオイド鎮痛剤およびＮＳＡＩＤと同時投与される。いくつかの実施形態
において、ＮＧＦアンタゴニストは、オピオイド鎮痛剤と同時投与されない。いくつかの
実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＳＡＩＤと同時投与されない。
別の局面において、本発明は、個体において、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の
疼痛の発生を減少させる方法、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛を改善させる
方法、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛を軽減する方法；および／または骨転
移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛の発現または進行を遅延させる方法を提供し、該
方法は、ＮＧＦアンタゴニストの有効量を投与する工程を包含する。いくつかの実施形態
において、ＮＧＦアンタゴニストは、オピオイド鎮痛剤と同時投与される。いくつかの実
施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＳＡＩＤと同時投与される。いくつかの実
施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、オピオイド鎮痛剤およびＮＳＡＩＤと同時投
与される。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、オピオイド鎮痛剤と
同時投与されない。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＳＡＩＤ
と同時投与されない。
いくつかの実施形態において、骨癌の疼痛は、骨に生じた癌に由来する。いくつかの実
施形態において、骨癌の疼痛は、骨肉腫に由来する。いくつかの実施形態において、骨癌
の疼痛は、骨に転移した癌に由来する。いくつかの実施形態において、骨転移は、骨に転
移した前立腺癌である。いくつかの実施形態において、骨転移は、骨に転移した乳癌であ
る。いくつかの実施形態において、骨転移は、骨に転移した肺癌である。いくつかの実施
形態において、骨転移は、骨に転移した肉腫である。いくつかの実施形態において、骨転
移は、骨に転移した腎臓癌である。いくつかの実施形態において、骨転移は、骨に転移し
た多発骨髄腫である。いくつかの実施形態において、処置される癌の疼痛は、軽度から中
等度である。いくつかの実施形態において、処置される癌の疼痛は、中等度から重度であ
る。いくつかの実施形態において、処置される癌の疼痛は、重度である。
本発明の方法における使用に適切なＮＧＦアンタゴニストは、直接的に、または間接的
にＮＧＦ生物活性の減少をもたらす任意の物質である。いくつかの実施形態において、Ｎ
ＧＦアンタゴニスト（例えば抗体）は、ＮＧＦに結合し（物理的に相互作用し）、ＮＧＦ
レセプター（ｔｒｋＡレセプターおよび／またはｐ７５）に結合し、および／または下流
のＮＧＦレセプターシグナル伝達を減少させる（妨害および／または遮断する）（例えば
、キナーゼシグナル伝達のインヒビター）。したがって、いくつかの実施形態において、
ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦに結合する（物理的に相互作用する）。他の実施形態に
おいて、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦレセプター（ＴｒｋＡレセプターおよび／また
はｐ７５）に結合する。他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、下流のＮＧＦ
レセプターシグナル伝達を減少させる（妨害および／または遮断する）（例えば、キナー
ゼシグナル伝達のインヒビター）。他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、Ｎ
ＧＦの合成および／または放出を阻害する（減少させる）。他の実施形態において、ＮＧ
Ｆアンタゴニストは、ＴｒｋＡイムノアドヘシン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）である
。他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦ（ｈＮＧＦなど）に結合し、
ＮＴ−３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦなどの関連ニューロトロフィンに有意に
は結合しない。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、以下のうちの任
意の１つ以上から選択される：抗ＮＧＦ抗体、ＮＧＦ特異的なアンチセンス分子（ＮＧＦ
をコードする核酸に特異的なアンチセンス分子を含む）、ＮＧＦレセプターに特異的なア
ンチセンス分子（ｔｒｋＡおよび／またはｐ７５）（ＮＧＦレセプターをコードする核酸
に特異的なアンチセンス分子を含む）、ＮＧＦ阻害化合物、ＮＧＦ構造類縁体、ＮＧＦに
結合するＴｒｋＡおよび／またはｐ７５の優性ネガティブ変異体、抗ＴｒｋＡ抗体、抗ｐ
７５抗体、およびキナーゼインヒビター。他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニスト
は、抗ＮＧＦ抗体である。さらに他の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、ヒト化されて
いる（本明細書に記載されている抗体、Ｅ３など）。いくつかの実施形態において、抗Ｎ
ＧＦ抗体は抗体Ｅ３である（本明細書に記載されている）。他の実施形態において、抗Ｎ
ＧＦ抗体は、抗体Ｅ３の１つ以上のＣＤＲ（Ｅ３の１つ、２つ、３つ、４つ、５つのＣＤ
Ｒ、または、いくつかの実施形態においては、６つ全てのＣＤＲ）を含む。他の実施形態
において、該抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施形態において、該抗体は、Ｅ３の
重鎖の３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、該抗体は、Ｅ３の軽鎖の３つ
のＣＤＲを含む。さらに他の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、表１に示された重鎖可
変領域のアミノ酸配列（配列番号１）を含む。さらに他の実施形態において、抗ＮＧＦ抗
体は、表２に示された軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２）を含む。さらに他の実
施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、表１に示された重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番
号１）および表２に示された軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２）を含む。さらに
他の実施形態において、該抗体は、免疫学的に非活性、例えば、補体媒介溶解現象を引き
起こさない、または抗体依存細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を刺激しない定常領域などの
修飾定常領域を含む。他の実施形態において、該定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２４頁；国際出願ＰＣＴ／英国９９／０１４４１
号；および／または英国特許出願公開第９８０９９５１．８号に記載されているとおりに
修飾される。
いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦに結合する。さらに他
の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦ（ヒトＮＧＦなど）に特異的に結
合する抗体である。さらに他の実施形態において、該抗体は、以下のマウスモノクローナ
ル抗体の１つ以上から選択された抗体と同じＮＧＦエピトープ６に本質的に結合する：Ｍ
ａｂ９１１、ＭＡｂ９１２およびＭＡｂ９３８（Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１９
：２１５−２２７頁（２０００）を参照）。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタ
ゴニストは、ｔｒｋＡレセプターに結合する。ＮＧＦアンタゴニストは、ｈＮＧＦに結合
でき、ヒトＴｒｋＡ（ｈＴｒｋＡ）に対するｈＮＧＦの結合を効果的に阻害し、および／
またはヒトＴｒｋＡレセプターの活性化を効果的に阻害できる抗ヒトＮＧＦ（抗ｈＮＧＦ
）モノクローナル抗体であり得る。
ＮＧＦ（ｈＮＧＦなど）に対する抗ＮＧＦ抗体の結合親和性は、約０．１０ｎＭから約
１．０ｎＭ、約０．１０ｎＭから約０．８０ｎＭ、約０．１５ｎＭから約０．７５ｎＭ、
および約０．１８ｎＭから約０．７２ｎＭであり得る。一実施形態において、該結合親和
性は、約２ｐＭと２２ｐＭとの間である。いくつかの実施形態において、該結合親和性は
、約１０ｎＭである。他の実施形態において、該結合親和性は、約１０ｎＭ未満である。
他の実施形態において、該結合親和性は、約０．１ｎＭまたは約０．０７ｎＭである。他
の実施形態において、該結合親和性は、約０．１ｎＭ未満、または約０．０７ｎＭ未満で
ある。他の実施形態において、該結合親和性は、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ
、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭのいずれかから、約２ｐＭ
、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、または約４０ｐＭのいずれかまでで
ある。いくつかの実施形態において、該結合親和性は、約約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約
１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭのいずれか、また
は約５０ｐＭ未満である。いくつかの実施形態において、該結合親和性は、約１００ｎＭ
、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭ
のいずれか、または約５０ｐＭのいずれか未満である。さらに他の実施形態において、該
結合親和性は、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭ
、または約４０ｐＭ超である。当該分野に周知のとおり、結合親和性は、ＫＤ、または解
離定数として表すことができ、結合親和性の増加は、ＫＤの減少に対応する。ヒトＮＧＦ
に対する抗ＮＧＦマウスモノクローナル抗体９１１（Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ
１９：２１５−２２７（２０００）の結合親和性は約１０ｎＭであり、ヒトＮＧＦに対す
るヒト化抗ＮＧＦ抗体Ｅ３（本明細書に記載された）の結合親和性は、約０．０７ｎＭで
ある。抗体９１１およびＥ３の結合親和性は、それらのＦａｂ断片を用いて測定された。
ＮＧＦアンタゴニストは、個体が骨癌に罹っている、または癌が骨に転移したと診断さ
れる前に、診断時に、および／または診断後に投与できる。ＮＧＦアンタゴニストは、経
口、静脈内、腹腔内、心室内、舌下、および／または経皮など、当該分野で公知の任意の
手段によって投与できる。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは抗ＮＧ
Ｆ抗体であり、以下の手段の１つ以上によって投与できる：静脈内、皮下、吸入、動脈内
、筋肉内、心臓内、心室内、および腹腔内。投与は、全身、静脈内、または局所であり得
る。
いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から
１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与され、他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは
、約０．３ｍｇ／ｋｇ体重から２．０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。
別の局面において、本発明は、１種または複数の薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わ
せて、有効量の神経成長因子（ＮＧＦ）を含む、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の
疼痛を処置および／または予防するための組成物を特徴とする。いくつかの実施形態にお
いて、ＮＧＦアンタゴニストは、オピオイド鎮痛剤と同時投与される。いくつかの実施形
態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＳＡＩＤと同時投与される。いくつかの実施形
態において、ＮＧＦアンタゴニストは、オピオイド鎮痛剤またはＮＳＡＩＤと同時投与さ
れない。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦ分子に特異的に
結合する抗体である。他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、本明細書に記載
された任意のアンタゴニストである。
別の局面において、本発明は、本明細書に記載された方法のいずれかに使用するための
キットを特徴とする。いくつかの実施形態において、該キットは、薬学的に受容可能な賦
形剤と組み合わせて、本明細書に記載されたＮＧＦアンタゴニストのいずれかを含む。他
の実施形態において、該キットは、本明細書に記載された方法のいずれかにおけるＮＧＦ
アンタゴニストの使用に関する説明書をさらに含む。
（発明の詳細な説明）
本発明は、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛を処置するために、抗ＮＧＦモ
ノクローナル抗体などのＮＧＦアンタゴニストの治療有効量のインビボ投与が使用できる
という発見に基づいている。本発明は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の投与が進行中なら
びに運動誘発双方の骨癌の疼痛の減少に著しく効果的であるマウス骨癌モデルにおける観
察に基づいている。
本発明は、抗ＮＧＦ抗体、例えば、抗ヒトＮＧＦ（抗ｈＮＧＦ）モノクローナル抗体な
どのＮＧＦアンタゴニストの有効量を投与することにより、個体（ヒトと非ヒトの双方）
における骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛を予防または処置する方法を特徴と
する。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、オピオイド鎮痛剤と同時
投与される。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＳＡＩＤと同時
投与される。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、オピオイド鎮痛剤
と同時投与されない。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＳＡＩ
Ｄと同時投与されない。
別の局面において、本発明は、個体に有効量のＮＧＦアンタゴニストを投与する工程を
包含する、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛の進行の改善、発現の遅延、およ
び／または予防のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴ
ニストは、オピオイド鎮痛剤と同時投与される。いくつかの実施形態において、ＮＧＦア
ンタゴニストは、ＮＳＡＩＤと同時投与される。いくつかの実施形態において、ＮＧＦア
ンタゴニストは、オピオイド鎮痛剤と同時投与されない。いくつかの実施形態において、
ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＳＡＩＤと同時投与されない。
本発明はまた、本明細書に提供された方法のいずれかに使用するための抗ＮＧＦ抗体、
例えば、抗ＮＧＦモノクローナル抗体などのＮＧＦアンタゴニストを含む、骨転移に関連
した癌の疼痛などの骨癌の疼痛を処置する組成物およびキットを特徴とする。いくつかの
実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、ＮＧＦがそのＴｒｋＡレセプターおよび／またはｐ
７５レセプターに結合することを効果的に阻害でき、および／またはＮＧＦがそのＴｒｋ
Ａレセプターおよび／またはｐ７５レセプターを活性化することを効果的に阻害できる。
（一般的手法）
他に示されない限り、本発明の実践には、当該分野の範囲内の分子生物学（組換え法を
含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の方法が用いられる。このよ
うな方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、第二版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編
、１９８４年）；Ｍｅｔｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａ
ｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂ
ｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８年）Ａｃａｄｅｍｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍ
ａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７年）；Ｉｎｔ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．
ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８年）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；
Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅ
ｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌ
ｌ編、１９９３〜１９９８年）Ｊ．ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌ
ａｃｋｗｅｌｌ編集）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍ
ｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８
７年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４年）；Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、
１９９１年）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ（ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、１９９９年）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊ
ａｎｅｗａｙおよびｂＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．
Ｆｉｎｃｈ、１９９７年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒ
ｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９年）；Ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ
．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒ
ｅｓｓ、２０００年）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ〔Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９年）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５年）などの文献に十分に説明されている。
（定義）
「抗体」（複数形態が交換可能に用いられる）は、免疫グロブリン分子の可変領域に位
置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポ
リペプチドなどの標的に特異的に結合することのできる免疫グロブリン分子である。本明
細書に用いられる該用語は、完全なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のみならず
、それらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単一鎖（ＳｃＦｖ）
、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイヤボ
ディー、線状抗体、単一鎖抗体、多特異的抗体（例えば二特異的抗体）および必要な特異
性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の任意の修飾立体構造を包含する。抗体
には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ（またはそれらのサブクラス）などの任意のクラスの抗体
が含まれ、また、該抗体はいずれか特定のクラスの抗体である必要はない。免疫グロブリ
ンは、その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に依って、異なったクラスに帰属でき
る。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、および
ＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（イソタイプ）、例えばＩｇＧ１、Ｉｇ
Ｇ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫
グロブリンの異なったクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デル
タ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの種々のクラスのサ
ブユニット構造および三次元立体構造は十分に知られている。
「モノクローナル抗体」とは、該モノクローナル抗体が、抗原の選択的結合に関与する
アミノ酸（天然ならびに非天然）からなる均一な抗体集団を称する。モノクローナル抗体
の集団は特異性が高く、単一の抗原部位に特異的である。用語の「モノクローナル抗体」
は、完全なモノクローナル抗体および完全長モノクローナル抗体のみならず、それらの断
片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単一鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変
異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナ
ル抗体、および必要な特異性および抗原に結合する能力の抗原認識部位を含む免疫グロブ
リン分子の他の任意の修飾立体構造を包含する。抗体の供給源または抗体が作製される方
法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、形質転換動物などによる）に
関して、限定することは意図されていない。
本明細書に用いられる用語の「神経成長因子」および「ＮＧＦ」とは、神経成長因子お
よびＮＧＦの活性の少なくとも一部を保持するその変異体を称する。本明細書に用いられ
るＮＧＦには、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシなどの、全ての哺乳動物種の天然配
列ＮＧＦが含まれる。
「ＮＧＦレセプター」とは、ＮＧＦに結合するかまたはＮＧＦによって活性化されるポ
リペプチドを称する。ＮＧＦレセプターには、限定はしないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ
、サル、またはウシなどの、任意の哺乳動物種のＴｒｋＡレセプターおよびｐ７５レセプ
ターが含まれる。
「ＮＧＦアンタゴニスト」とは、ＮＧＦシグナル伝達に媒介される下流経路、例えば、
ＮＧＦに対する、レセプター結合および／または細胞応答の誘発などのＮＧＦ生物活性を
阻害、抑制または減少させる（有意に、を含めて）任意の分子を称する。用語の「アンタ
ゴニスト」は、生物学的作用の特定の機構を決して意味するのではなく、直接的であろう
と、間接的であろうと、またはＮＧＦと相互作用しようと、そのレセプターと相互作用し
ようと、または他の機構を介してであろうと、ＮＧＦとの全ての可能な薬理学的、生理学
的、および生化学的相互作用、および種々の異なる、また化学的に多肢にわたる組成物に
よって達成し得るその結果を明らかに含み、包含すると考えられている。ＮＧＦアンタゴ
ニストの例としては、限定はしないが、抗ＮＧＦ抗体、ＮＧＦに特異的なアンチセンス分
子（ＮＧＦをコードする核酸に特異的なアンチセンス分子を含む）ＮＧＦ阻害化合物、Ｎ
ＧＦ構造類縁体、ＮＧＦに結合するＴｒｋＡレセプターの優性ネガティブ変異体、Ｔｒｋ
Ａイムノアドヘシン、抗ＴｒｋＡ抗体、抗ｐ７５抗体、およびキナーゼインヒビターが挙
げられる。本発明の目的に関し、用語の「アンタゴニスト」は、それによって、ＮＧＦ自
体，ＮＧＦ活性（限定はしないが、骨転移に関連した癌の疼痛の任意の態様を媒介するそ
の能力など）、または該生物活性の結果が、実質的に無効にされる、減少する、または任
意の有意味な程度に中和される、先に特定した全ての用語、標題、および機能的状態なら
びに特徴を包含することは明らかに理解されるであろう。いくつかの実施形態において、
ＮＧＦアンタゴニスト（例えば、抗体）は、ＮＧＦと結合し（物理的に相互作用し）、Ｎ
ＧＦレセプター（ｔｒｋＡレセプターおよび／またはｐ７５レセプターなど）に結合し、
下流ＮＧＦレセプターシグナル伝達を減少させ（妨害および／または遮断し）、および／
またはＮＧＦの合成、産生または放出を阻害する（減少させる）。他の実施形態において
、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦと結合して、ＴｒｋＡレセプターの二量体化および／
またはＴｒｋＡ自己リン酸化を防止する。他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニスト
は、ＮＧＦの合成および／または産生（放出）を阻害または減少させる。ＮＧＦアンタゴ
ニストのタイプの例が本明細書に提供されている。
本明細書に用いられる「抗ＮＧＦ抗体」とは、ＮＧＦに結合でき、ＮＧＦ生物活性およ
び／またはＮＧＦシグナル伝達に媒介された下流経路を阻害できる抗体を称する。
「ＴｒｋＡイムノアドヘシン」とは、ＴｒｋＡレセプターの断片、例えば、ＴｒｋＡレ
セプターの細胞外ドメインおよびＴｒｋＡレセプターの結合特異性を保持している免疫グ
ロブリン配列を含む可溶性キメラ分子を称する。
ＮＧＦの「生物活性」とは、一般的に、ＮＧＦレセプターに結合し、および／またはＮ
ＧＦレセプターのシグナル伝達経路を活性化する能力を称する。限定はしないが、生物活
性としては、以下のいずれか１つ以上が挙げられる：ＮＧＦレセプター（ｐ７５および／
またはＴｒｋＡなど）に結合する能力；ＴｒｋＡレセプターの二量体化および／または自
己リン酸化を促進する能力；ＮＧＦレセプターのシグナル伝達経路を活性化する能力；細
胞の分化、増殖、生存、成長、移動、およびニューロン形態の変化、シナプス形成、シナ
プス機能、神経伝達物質および／または神経ペプチドの放出および損傷後の再生などの（
末梢および中枢ニューロンを含めて、ニューロンの場合）細胞生理機能における他の変化
を促進する能力；および骨転移に関連した癌の疼痛を媒介する能力。
本明細書に用いられる「処置」とは、有益なまたは所望の臨床結果を得るための方法を
称する。本発明の目的に関し、有益なまたは所望の臨床結果としては、限定はしないが、
以下のうちの１つ以上が挙げられる：重症度の低下、骨癌の疼痛の任意の態様を含む骨癌
の疼痛（例えば、骨転移に関連した癌の疼痛）に関連した１つ以上の症状の軽減（疼痛持
続時間の短縮、および／または疼痛の感受性または感覚の減少など）。
「有効量」は、疼痛の軽減または減少などの有益なまたは所望の臨床結果をもたらす上
で十分な量である。本発明の目的に関し、ＮＧＦアンタゴニストの有効量は、骨転移に関
連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛の強さを処置する、改善させる、減少させる、または骨
癌の疼痛を予防する上で十分な量である。いくつかの実施形態において、「有効量」は、
いくつかの実施形態において、「有効量」は、進行中の疼痛および／またはブレイクスル
ー痛（歩行痛および触診誘発痛など）の疼痛を減少させることができ、それは、癌が骨に
転移する前に、転移時に、および／または転移後に投与できる。いくつかの実施形態にお
いて、「有効量」は、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛の発現を遅延させる上
で十分な量である。
癌の疼痛の「発生の減少」とは、重症度の減少（これらの病態に一般的に用いられる他
の薬剤および／または療法に対する必要性および／または量（例えば、暴露量）の減少を
含み得る）、継続期間、および／または回数（例えば、個体における骨転移に関連した癌
の疼痛などの骨癌の疼痛に至る時間の遅延または増加など）の減少のいずれかを意味する
。当業者によって理解されるように、個体は処置に対するかれらの応答の点で変化し得、
したがって、例えば、「個体における骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛の発生
を減少させる方法」は、このような投与により、その特定の個体における発生のそのよう
な減少をおそらく生じさせ得るとの妥当な予想に基づいて、本明細書に記載されたＮＧＦ
アンタゴニストを投与することを示している。
骨癌の疼痛（骨転移に関連した癌の疼痛など）または骨癌の疼痛の１つ以上の症状の「
改善」とは、ＮＧＦアンタゴニストの非投与に比較して、骨癌の疼痛の１つ以上の症状を
減少させること、または改善することを意味する。また、「改善」には、症状の継続時間
の短縮または減少も含まれる。
骨癌の疼痛（骨転移に関連した癌の疼痛など）または１つ以上の症状の「緩和」とは、
本発明によるＮＧＦアンタゴニストを用いて処置した個体または個体集団における骨癌の
疼痛の１つ以上の望ましくない臨床症状発現の程度を減少させることを意味する。
本明細書に用いられる、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛発現の「遅延」と
は、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛進行を、遅らせる、妨げる、遅速化する
、減速する、安定化する、および／または繰り延べることを意味する。この遅延は、病歴
および／または処置されている固体に依って、時間の長さの変化があり得る。当業者に明
らかであるように、十分なまたは有意な遅延は、事実上、個体が骨転移に関連した癌の疼
痛などの骨癌の疼痛を発現しないという点で、予防を包含し得る。症状の発現を「遅延す
る」方法は、該方法の非使用に比較して、所与の時間枠内での症状発現の可能性を減少さ
せる、および／または所与の時間枠内での症状の程度を減少させる方法である。このよう
な比較は、典型的には、統計的に有意な結果を与える上で十分な対象数を用いた臨床試験
に基づいている。
骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛の「発現」または「進行」とは、障害の最
初の症状発現および／または続いて起こる進行を意味する。骨転移に関連した癌の疼痛な
どの骨癌の疼痛の発現は、当該分野に周知の標準的な臨床的方法を用いて、検出でき評価
できる。しかし、発現とは、検出不可能であり得る進行をも言う。本発明の目的に関し、
発現または進行とは、症状の生物学的経過を言う。「発現」には、発生、再発、および発
症が含まれる。本明細書に用いられる骨癌の疼痛（骨転移に関連した癌の疼痛など）の「
発症」または「発生」には、最初の発症および／または再発が含まれる。
本明細書に用いられる「同時投与」には、同時投与および／または異なる時間における
投与が含まれる。同時投与はまた、共処方（すなわち、ＮＧＦアンタゴニストとある薬剤
が同一組成物中に存在する）としての投与または別個の組成物としての投与を包含する。
本明細書に用いられる同時投与は、同時におよび／または別々に生じ得る、ある薬剤とＮ
ＧＦアンタゴニストが個体に投与される何らかの状況を包含する。本明細書でさらに検討
されるように、ＮＧＦアンタゴニストとある薬剤は、異なる投与回数または間隔で投与で
きることが理解される。例えば、抗ＮＧＦ抗体を週１回投与し、一方、該薬剤をより頻回
投与できる。ＮＧＦアンタゴニストと該薬剤とは、同じ投与経路を用いて投与することも
できるし、異なる投与経路を用いて投与することもできる。
用語の「オピオイド鎮痛剤」とは、モルヒネ様作用を有する天然または合成の全ての薬
剤を称する。合成および半合成オピオイド鎮痛剤は、化合物の５つのクラス：フェナント
レン類、フェニルヘプチルアミン類；フェニルピペリジン類；モルフィナン類；およびベ
ンゾモルファン類の誘導体であり、これらの全てが該用語の範囲内にある。代表的なオピ
オイド鎮痛剤としては、コデイン、ジヒドロコデイン、ジアセチルモルフィン、ヒドロコ
ドン、ヒドロモルフォン、レボルファノール、オキシモルフォン、アルフェンタニル、ブ
プレノルフィン、ブトルファノール、フェンタニル、スフェンタニル、メペリジン、メサ
ドン、ナルブフィン、プロポキシフェン、およびペンタゾシンまたはそれらの薬学的に受
容可能な塩が挙げられる。
用語の「ＮＳＡＩＤ」とは、非ステロイド抗炎症化合物を称する。ＮＳＡＩＤは、シク
ロオキシゲナーゼを阻害するそれらの能力に関して分類される。シクロオキシゲナーゼ１
およびシクロオキシゲナーゼ２は、シクロオキシゲナーゼの主要な２つのイソ型であり、
もっとも標準的なＮＳＡＩＤはこれら２つのイソ型の混合インヒビターである。もっとも
標準的なＮＳＡＩＤは、以下の５つの構造的分類区分の１つに入る：（１）イブプロフェ
ン、ナプロキセン、ナプロシン、ジクロフェナク、およびケトプロフェンなどのプロピオ
ン酸誘導体；（２）トルメチンおよびスリンダクなどの酢酸誘導体；（３）メフェナム酸
およびメクロフェナム酸などのフェナム酸誘導体；（４）ジフルニサルおよびフルフェニ
サルなどのビフェニルカルボン酸誘導体；および（５）ピロキシム、スドキシカム、およ
びイソキシカムなどのオキシカム類。
シクロオキシゲナーゼ２を選択的に阻害するＮＳＡＩＤのもう１つのクラスが記載され
ている。Ｃｏｘ−２インヒビターは、例えば、米国特許第５，６１６，６０１号；第５，
６０４，２６０号；第５，５９３，９９４号；第５，５５０，１４２号；第５，５３６，
７５２号；第５，５２１，２１３号；第５，４７５，９９５号；第５，６３９，７８０号
；第５，６０４，２５３号；第５，５５２，４２２号；第５，５１０，３６８号；第５，
４３６，２６５号；第５，４０９，９４４号；および第５，１３０，３１１号に記載され
ており、これらは全て、参考として本明細書に援用される。一定の代表的なＣｏｘ−２イ
ンヒビターとしては、セレコキシブ（ＳＣ−５８６３５）、ＤＵＰ−６９７、フロスリド
（ＣＧＰ−２８２３８）、メロキシカム、６−メトキシ−２ナフチル酢酸（６−ＭＮＡ）
、ロフェコキシブ、ＭＫ−９６６、ナブメトン（６−ＭＮＡのプロドラッグ）、ニメスリ
ド、ＮＳ−３９８、ＳＣ−５７６６、ＳＣ−５８２１５、Ｔ−６１４、またはそれらの組
み合わせが挙げられる。
「個体」は哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。哺乳動物としては、限定はし
ないが、家畜、競技用動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラット
が挙げられる。
（本発明の方法）
本明細書に記載された全ての方法に関して、ＮＧＦアンタゴニストという言及には、こ
れらの薬剤の１つ以上を含む組成物も含まれる。これらの組成物は、当該分野に周知の緩
衝剤を含め、薬学的に受容可能な賦形剤（キャリア）などの適切な賦形剤をさらに含み得
る。本発明は、単独でも、他の従来の処置法と組み合わせて用いることもできる。
（骨転移に関連した癌の疼痛を含む骨癌の疼痛を予防または処置するための方法）
本発明は、ヒトおよび非ヒト双方の個体における骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌
の疼痛を処置、発現の遅延、および／または予防に有用である。骨癌に罹っている個体の
生活の質を改善することができる。
骨への癌転移は、正味の骨形成または正味の骨破壊に関連し得る。いくつかの実施形態
において、本発明の方法は、前立腺癌の骨への転移の疼痛の処置など、正味の骨形成（骨
芽細胞活性）に関連した骨癌の疼痛の処置に用いられる。いくつかの実施形態において、
本発明の方法は、肉腫の骨への転移の疼痛の処置など、正味の骨破壊（溶骨活性）に関連
した骨癌の疼痛の処置に用いられる。
したがって、一局面において、本発明は、抗ＮＧＦ抗体などのＮＧＦアンタゴニストの
有効量を投与する工程を包含する、個体における骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の
疼痛を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは
オピオイド鎮痛剤と同時投与される。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニス
トはＮＳＡＩＤと同時投与される。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニスト
はオピオイド鎮痛剤およびＮＳＡＩＤと同時投与される。いくつかの実施形態において、
疼痛軽減のために投与されるオピオイド鎮痛剤および／またはＮＳＡＩＤの量はＮＧＦア
ンタゴニストの不在下で投与される量に比較して減少する。オピオイド鎮痛剤および／ま
たはＮＳＡＩＤをＮＧＦアンタゴニストと同時投与すると、それらによる有害作用を減少
または除去できる。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストはオピオイド鎮
痛剤と同時投与されない。他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストはＮＳＡＩＤと
同時投与されない。他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストはオピオイド鎮痛剤お
よび／またはＮＳＡＩＤと同時投与されない。
別の局面において、本発明は、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛の発現また
は進行を予防、改善および／または防止する方法を提供する。いくつかの実施形態におい
て、ＮＧＦアンタゴニストはオピオイド鎮痛剤と同時投与される。いくつかの実施形態に
おいて、ＮＧＦアンタゴニストはＮＳＡＩＤと同時投与される。いくつかの実施形態にお
いて、ＮＧＦアンタゴニストはオピオイド鎮痛剤およびＮＳＡＩＤと同時投与される。い
くつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストはオピオイド鎮痛剤と同時投与されな
い。他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストはＮＳＡＩＤと同時投与されない。他
の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストはオピオイド鎮痛剤および／またはＮＳＡＩ
Ｄと同時投与されない。
本明細書では一般に、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛の処置または予防に
ついての言及がなされているが、骨癌の疼痛の危険性が高まる事象または病態の前に、Ｎ
ＧＦアンタゴニストを投与できることは理解されている。
ＮＧＦアンタゴニストは、放射、および化学療法など、骨癌に対する他の療法と関連さ
せて投与できる。また、ＮＧＦアンタゴニストは、骨癌の疼痛に用いられる他の鎮痛剤と
関連させて投与できる。このような鎮痛剤の例としては、ビスホスホネート（例えばアレ
ンドロネート）、ガバペンチン、および放射がある。骨癌の疼痛の軽減のために投与され
るこれらの鎮痛剤の量は、ＮＧＦアンタゴニストの不在下で投与される量に比較して減少
させることができる。これらの鎮痛剤をＮＧＦアンタゴニストと同時投与すると、それら
による有害作用を減少または除去できる。
疼痛の診断または評価は、当該分野で十分に確立されている。評価は、刺激に対する反
応、顔の表情などを含め、行動の観察などの客観的な目安に基づいて実施できる。評価は
また、種々の疼痛の尺度をもちいて、患者による疼痛の特性化などの主観的な目安に基づ
くこともできる。例えば、Ｋａｔｚら、Ｓｕｒｇ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．（１９
９９）７９（２）：２３１−５２頁；Ｃａｒａｃｅｎｉら、Ｊ Ｐａｉｎ Ｓｙｍｐｔｏ
ｍ Ｍａｎａｇｅ（２００２）２３（３）：２３９−５５頁を参照されたい。
（ＮＧＦアンタゴニスト）
本発明の方法は、レセプター結合および／またはＮＧＦに対する細胞応答の誘発などの
、ＮＧＦシグナル伝達に媒介された下流経路などの、ＮＧＦ生物活性を阻害、抑制または
減少させる（有意に、を含め）任意の分子が称されるＮＧＦアンタゴニストを用いる。用
語の「アンタゴニスト」とは、生物学的作用の特定の機構を決して意味するのではなく、
ＮＧＦとの全ての可能な薬理学的、生理学的、および生化学的な相互作用、ならびに、種
々の異なる、また化学的に多肢にわたる組成物によって達成することのできるその結果を
明らかに含み、包含すると考えられている。ＮＧＦアンタゴニストの例としては、限定は
しないが、抗ＮＧＦ抗体、ＮＧＦに特異的なアンチセンス分子（ＮＧＦをコードする核酸
に特異的なアンチセンス分子を含む）、ＮＧＦレセプター（ＴｒｋＡレセプターおよび／
またはｐ７５レセプターなど）に特異的なアンチセンス分子（ＴｒｋＡおよび／またはｐ
７５をコードする核酸に特異的なアンチセンス分子を含む）、ＮＧＦ阻害化合物、ＮＧＦ
構造類縁体、ＮＧＦに結合するＴｒｋＡレセプターの優性ネガティブ変異体、ＴｒｋＡイ
ムノアドヘシン、抗ＴｒｋＡ抗体、ＮＧＦに結合するｐ７５レセプターの優性ネガティブ
変異体、抗ｐ７５抗体、およびキナーゼインヒビターが挙げられる。本発明の目的に関し
て、用語の「アンタゴニスト」は、先に特定した用語、標題、および、ＮＧＦそれ自体、
ＮＧＦの生物活性（限定はしないが、骨転移に関連した癌の疼痛の何らかの態様を媒介す
るその能力など）、または該生物活性の結果を、何らかの有意味な程度に、実質的に無効
化するか、減少させるか、または中和する機能的状態および特徴全てを包含
する。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニスト（例えば抗体）は、ＮＧＦに
結合し（物理的に相互作用し）、ＮＧＦレセプター（ＴｒｋＡレセプターおよび／または
ｐ７５レセプターなど）に結合し、および／または下流のＮＧＦレセプターシグナル伝達
を減少させる（妨害および／または遮断する）。したがって、いくつかの実施形態におい
て、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦに結合する（物理的に相互作用する）。いくつかの
実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦに結合するポリペプチドである。い
くつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、国際公開ＰＣＴ２００４／０２６
３２９号に記載されているペプチドまたは修飾ペプチド（Ｆｃドメインに融合したＮＧＦ
結合ペプなど）である。他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦレセプ
ター（ＴｒｋＡレセプターおよび／またはｐ７５など）に結合する。他の実施形態におい
て、ＮＧＦアンタゴニストは、下流のＮＧＦレセプターシグナル伝達を減少させる（妨害
および／または遮断する）（例えば、キナーゼシグナル伝達のインヒビターおよび下流シ
グナル伝達カスケードのインヒビター）。他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニスト
は、ＮＧＦの合成および／または放出を阻害する（減少させる）。他の実施形態において
、ＮＧＦアンタゴニストはＴｒｋＡイムノアドヘシンではない（すなわち、ＴｒｋＡイム
ノアドヘシン以外の）ＮＧＦアンタゴニストである。他の実施形態において、ＮＧＦアン
タゴニストは、抗ＮＧＦ抗体以外のものである。他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴ
ニストは、ＴｒｋＡイムノアドヘシン以外で、かつ抗ＮＧＦ抗体以外にものである。いく
つかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦ（ｈＮＧＦなど）に結合し、
ＮＴ−３，ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦなどの関連したニューロトロフィンに有
意には結合しない。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、有害な免疫
応答に関連しない。他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、抗ＮＧＦ抗体であ
る。さらに他の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体はヒト化されている（本明細書に記載さ
れた抗体Ｅ３など）。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、抗体Ｅ３（本明細
書に記載されている）である。他の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、抗体Ｅ３の１つ
以上のＣＤＲ（Ｅ３の１つ、２つ、３つ、４つ、５つのＣＤＲ、またはいくつかの実施形
態においては、６つ全てのＣＤＲなど）を含む。他の実施形態において、該抗体は、ヒト
の抗体である。いくつかの実施形態において、該抗体は、国際公開第２００５／０１９２
６６号に記載されたヒト抗ＮＧＦ中和抗体である。さらに他の実施形態において、抗ＮＧ
Ｆ抗体は、表１に示された重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）および、表２に示
された軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２）を含む。さらに他の実施形態において
、該抗体は、免疫学的に非活性、例えば、補体媒介溶解現象を引き起こさない、または抗
体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）を刺激しない定常領域など、修飾定常領域を含む
。他の実施形態において、該定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２
９：２６１３−２６２４頁；国際出願ＰＣＴ／英国９９／０１４４１号；および／または
英国特許出願公開第９８０９９５１．８．号に記載されているとおり修飾される。
（抗ＮＧＦ抗体）
本発明のいくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、抗ＮＧＦ抗体を含む
。抗ＮＧＦ抗体は、以下の特徴のいずれか１つ以上を示す：（ａ）ＮＧＦに結合し、ＮＧ
Ｆの生物活性および／またはＮＧＦシグナル伝達機能に媒介された下流経路を阻害する；
（ｂ）骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛の何らかの態様を予防、改善、または
処置する；（ｃ）ＮＧＦレセプターの活性化（ＴｒｋＡレセプターの二量体化および／ま
たは自己リン酸化など）を遮断または減少させる；（ｄ）ＮＧＦのクリアランスを増加さ
せる；（ｅ）ＮＧＦの合成、産生または放出を阻害する（減少させる）。
抗ＮＧＦ抗体は、当該分野で公知である。例えば、国際公開ＰＣＴ０１／７８６９８号
、国際公開第０１／６４２４７号、米国特許第５，８４４，０９２号，第５，８７７，０
１６号、および６，１５３，１８９号；Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９：２１
５−２２７頁（２０００）；Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１３：５５９−５６８（
１９９３）；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３９６０８、Ｕ３９６０９、Ｌ１７０７８、また
はＬ１７０７７を参照されたい。
いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、抗体「Ｅ３」と称されるヒト化マウス
抗ＮＧＦモノクローナル抗体（国際公開ＰＣＴ０４／０５８１８４号）であり、これは、
以下の変異体：Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１（アミノ酸は、野生型ＩｇＧ２ａ
の配列に関してナンバリング；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１
３−２６２４頁を参照）を含有するヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常領域；ヒト軽鎖カッパ定常領
域；ならびに表１および表２に示された重鎖および軽鎖の可変領域を含む。
表１：重鎖可変領域
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＩＧＹＤＬＮＷＩＲＱ
ＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＩＩＷＧＤＧＴＴＤＹＮＳＡＶＫＳＲＶＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＦＳ
ＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＷＹＡＴＳＹＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶ
Ｓ（配列番号１）。
表２軽鎖可変領域
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＮＮＬＮＷＹＱＱＫ
ＦＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＦＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＩＱ
ＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＥＨＴＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴ（配列番号２）。
重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードする以下のポリヌクレオチドは、２００３年
１月８日にＡＴＣＣに寄託された：

ベクターＥｂ．９１１．３Ｅは、表２に示された軽鎖可変領域をコードするポリヌクレ
オチドであり；ベクターＥｂ．ｐｕｒ．９１１．３Ｅは、表２に示された軽鎖可変領域を
コードするポリヌクレオチドであり，ベクターＤｂ．９１１．３Ｅは、表１に示された重
鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドは、定常ド
メインもまたコードする。
ＣＤＲｓの決定には、少なくとも２つの方法がある：（１）交差種配列の変動に基づく
方法（すなわち、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、（第５版、１９９１年、Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ））；および
（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づく方法（Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）
Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７７頁；Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ
．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８頁））。本明細書に用いられるＣＤＲは、いずれか
の方法によって、または両方の方法の組み合わせによって定められたＣＤＲを称し得る。
他の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、抗体Ｅ３の１つ以上のＣＤＲ（Ｅ３の１つ、
２つ、３つ、４つ、５つのＣＤＲ、またはいくつかの実施形態においては、６つ全てのＣ
ＤＲなど）を含む。ＣＤＲ領域の決定は、十分に当該分野の範囲内にある。ＣＤＲは、Ｋ
ａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの組み合わせであり得る
。
本発明に有用な抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例え
ば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二特異的抗体
、ヘテロ複合体抗体、単一鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパ
ク質、ヒト化抗体、および必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の
任意の修飾立体構造が包含され、抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体
、および共有修飾抗体が含まれる。該抗体の出所は、マウス、ラット、ヒト、または他の
任意の出所（キメラ抗体およびヒト化抗体を含む）であり得る。本発明の目的に関し、該
抗体は、ＮＧＦおよび／またはＮＧＦシグナル伝達機能に媒介された下流経路を阻害する
様式でＮＧＦと反応する。一実施形態において、該抗体は、ヒトＮＧＦ上の１つ以上のエ
ピトープを認識するヒト抗体である。他の実施形態において、該抗体は、ヒトＮＧＦ上の
１つ以上のエピトープを認識するマウスまたはラットの抗体である。他の実施形態におい
て、該抗体は、霊長類、イヌ、ネコ、うま、およびウシよりなる群から選択されるＮＧＦ
上の１つ以上のエピトープを認識する。他の実施形態において、該抗体は、免疫学的に非
活性、例えば、補体媒介溶解現象を引き起こさない、または抗体依存性細胞媒介細胞毒性
（ＡＤＣＣ）を刺激しない定常領域など、修飾定常領域を含む。ＡＤＣＣ活性は、米国特
許出願第５，５００，３６２号に開示された方法を用いて評価できる。他の実施形態にお
いて、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）２９：２６１３−２６２
４頁；国際出願ＰＣＴ／英国９９／０１４４１号；および／または英国特許出願公開第９
８０９９５１．８．号に記載されたとおりに修飾される。
ＮＧＦ（ｈＮＧＦなど）に対する抗ＮＧＦ抗体の結合親和性は、約０．１０ｎＭから約
０．８０ｎＭ、約０．１５ｎＭから約０．７５ｎＭ、および約０．１８ｎＭから約０．７
２ｎＭであり得る。一実施形態において、該結合親和性は、約２ｐＭと２２ｐＭとの間で
ある。いくつかの実施形態において、該結合親和性は、約１０ｎＭである。他の実施形態
において、該結合親和性は約１０ｎＭ未満である。他の実施形態において、該結合親和性
は、約０．１ｎＭまたは約０．０７ｎＭである。他の実施形態において、該結合親和性は
約０．１ｎＭ未満、または約０．０７ｎＭ未満である。他の実施形態において、該結合親
和性は、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐ
Ｍ、または約５０ｐＭのいずれかから、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、
約２０ｐＭ、または約４０ｐＭのいずれかまでである。いくつかの実施形態において、該
結合親和性は、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１
００ｐＭ、または約５０ｐＭ、もしくは約５０ｐＭ未満のいずれかである。いくつかの実
施形態において、該結合親和性は、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、
約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭのいずれか未満である。さらに他の実施
形態において、該結合親和性は、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０
ｐＭ、約４０ｐＭ、または約４０ｐＭ超である。
ＮＧＦに対する抗体の結合親和性を判定する１つの方法は、該抗体の単機能Ｆａｂ断片
の結合親和性を測定することである。単機能Ｆａｂ断片を得るために、抗体（例えば、Ｉ
ｇＧ）をパパインによって開裂させるか、または組換え発現させることができる。抗体の
抗ＮＧＦＦａｂ断片の親和性は、表面プラスモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ３０００（商標）
表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）システム、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＩＮＣ、ニュージャージー州
、ピスカウェイ）によって判定できる。ＣＭ５チップは、供給元の使用説明書に従い、塩
酸Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイニド（ＥＤＣ）およ
びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）によって活性化できる。ヒトＮＧＦ（または
いずれか他のＮＧＦ）を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０中に希釈し、０．００
５ｍｇ／ｍＬの濃度で、活性化チップ上に注入できる。個々のチップチャネルを越える種
々の流動時間を用いて、２つの抗原濃度範囲を得ることができる：詳細な動態試験用の１
００〜２００応答単位（ＲＵ）およびスクリーニングアッセイ用の５００〜６００ＲＵ。
該チップは、エタノールアミンによってブロックできる。再生試験により、ピアス溶出緩
衝液（製品番号２１００４、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、イリノイ州ロ
ックフォード）と４ＭのＮａＣｌの混合液（２：１）は、２００回の注入にわたって、該
チップ上のｈＮＧＦの活性を保持したまま、効果的に結合Ｆａｂを除去することが示され
た。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＮａＣｌ、３
ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０）を、ＢＩＡｃｏｒｅアッ
セイ用のランニング緩衝液として用いる。精製Ｆａｂサンプルの連続希釈液（０．１〜１
０×予測Ｋｄ）を、１００μＬ／分で１分間注入し、解離時間は２時間までとした。該Ｆ
ａｂタンパク質の濃度は、標準として既知濃度のＦａｂ（アミノ酸分析により決定された
）を用い、ＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって判定する。動態
学的な結合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、ＢＩＡ評価プログラムを用い
、データを１：１ラングミュア結合モデル（Ｋａｒｌｓｓｏｎ、Ｒ．Ｒｏｏｓ、Ｈ．Ｆａ
ｇｅｒｓｔａｍ、Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ６．９９−１１０頁）に当てはめることによって、同時に得られる。平衡
解離定数（ＫＤ）の値は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出される。このプロトコルは、ヒト
ＮＧＦ、他の脊椎動物のＮＧＦ（いくつかの実施形態においては、哺乳動物）（マウスＮ
ＧＦ、ラットＮＧＦ、霊長類ＮＧＦなど）を含めて、任意のＮＧＦに対する抗体の結合親
和性の決定における使用、ならびに関連ニュートロフィンであるＮＴ３、ＮＴ４／５、お
よび／またはＢＤＮＦなどの他のニュートロフィンとの使用に好適である。
いくつかの実施形態において、該抗体は、ヒトＮＧＦに結合し、他の脊椎動物種（いく
つかの実施形態においては、哺乳動物）のＮＧＦには、有意に結合することはない。いく
つかの実施形態において、該抗体は、ヒトＮＧＦ、ならびに他の脊椎動物種（いくつかの
実施形態においては、哺乳動物）の１つ以上のＮＧＦに結合する。さらに他の実施形態に
おいて、該抗体はＮＧＦに結合するが、他のニュートロフィン（関連ニュートロフィンで
あるＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦなど）と有意に交差反応することはな
い。いくつかの実施形態において、該抗体はＮＧＦ、ならびにスクリーニング種の他のニ
ュートロフィンに結合する。いくつかの実施形態において、該抗体は、ウマまたはイヌな
どの哺乳動物種のＮＧＦに結合するが、他の哺乳動物種のＮＧＦに有意に結合することは
ない。
エピトープは連続的であっても不連続的であってもよい。一実施形態において、該抗体
は、本質的に、Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９：２１５−２２７頁（２０００
）に記載されているＭＡｂ９１１、ＭＡｂ９１２、およびＭＡｂ９３８よりなる群から選
択される抗体と同じｈＮＧＦエピトープに結合する。他の実施形態において、該抗体は、
本質的に、ＭＡｂ９１１と同じｈＮＧＦエピトープに結合する。さらに他の実施形態にお
いて、該抗体は、本質的に、ＭＡｂ９０９と同じエピトープに結合する。上記、Ｈｏｎｇ
ｏら。例えば、エピトープは、以下の１つ以上を含み得る：ｈＮＧＦの可変領域１（アミ
ノ酸２３〜３５）内の残基、Ｋ３２、Ｋ３４、およびＥ３５；ｈＮＧＦの可変領域４（ア
ミノ酸８１〜８８）内の残基、Ｆ７９およびＴ８１；可変領域４内の残基、Ｈ８４および
Ｋ８８；ｈＮＧＦの可変領域５（アミノ酸９４〜９８）とｈＮＧＦのＣ末端（アミノ酸１
１１〜１１８）との間の残基、Ｒ１０３；ｈＮＧＦの前可変領域１（アミノ酸１０〜２３
）内の残基、Ｅ１１；ｈＮＧＦの可変領域２（アミノ酸４０〜４９）とｈＮＧＦの可変領
域３（アミノ酸５９〜６６）との間のＹ５２；ｈＮＧＦのＣ末端内の残基、Ｌ１１２およ
びＳ１１３；ｈＮＧＦの可変領域３内の残基、Ｒ５９およびＲ６９；またはｈＮＧＦの前
可変領域１内の残基、Ｖ１８、Ｖ２０、およびＧ２３。また、エピトープは、ｈＮＧＦの
可変領域１、可変領域３、可変領域４、可変領域５、Ｎ末端領域および／またはＣ末端領
域の１つ以上を含み得る。さらに他の実施形態において、該抗体は、ｈＮＧＦの残基、Ｒ
１０３の溶媒接近性を有意に減少させる。上記のエピトープは、ヒトＮＧＦに関するもの
であるが、当業者は、ヒトＮＧＦの構造を、他の種のＮＧＦと配置し、これらのエピトー
プに対する可能性のある対応物を同定することができる。
一局面において、ＮＧＦを阻害し得る抗体（例えば、ヒトの、ヒト化された、マウスの
、キメラの）は、ＮＧＦの完全長配列または部分的配列を発現する免疫原を用いて作製で
きる。別の局面において、ＮＧＦを過剰発現する細胞を含む免疫原を使用できる。使用で
きる免疫原の他の例は、完全長ＮＧＦまたはＮＧＦタンパク質の一部を含有するタンパク
質である。
抗ＮＧＦ抗体は、当該分野で公知の任意の方法によって作製できる。宿主動物の免疫化
の経路および日程計画は、一般に、本明細書でさらに記載されている、抗体の刺激および
産生のための確立された従来の方法に合わせる。ヒトおよびマウスの抗体産生のための一
般的方法は、当該分野に知られており、本明細書に記載されている。
ヒトまたはヒトの抗体産生細胞などの哺乳動物対象を、ヒトを含めた哺乳動物のハイブ
リドーマ細胞系を作製するためのベースとして働くように操作することができる。典型的
には、宿主動物に、本明細書に記載されたものなどの免疫原のある量を、腹腔内、筋肉内
、経口、皮下、足底内、および／または真皮内に接種する。
ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）Ｎ
ａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７頁の全身体細胞ハイブリダイゼーション法またはＢｕ
ｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ、１８：３７７−３８１頁（１９８２）の修飾法を
用いて、リンパ球および継代骨髄腫から調製できる。該ハイブリダイゼーションには、限
定はしないが、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ならびにＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｌ
ｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、米国、カリフォルニア州、サンジエゴか
らのものなど、入手できる骨髄腫系が使用できる。一般に、該方法は、ポリエチレングリ
コールなどのフューゾゲンを用い、または当業者に周知の電気的手段により、骨髄腫細胞
およびリンパ球を融合することを含む。融合の後、ハイブリダイズしていない親細胞を排
除するために、該細胞を融合培地から分離し、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジ
ン（ＨＡＴ）培地などの選択的増殖培地中で増殖させる。本明細書に記載された、血清を
添加した、または添加しない培地はいずれも、モノクローナル抗体を分泌するハイブリド
ーマを培養するために使用できる。細胞融合法の他の代替として、ＥＢＶ継代Ｂ細胞を用
いて、本発明の抗ＮＧＦモノクローナル抗体を作製することができる。所望の場合、該ハ
イブリドーマを増殖させ、サブクローニングし、上澄み液を、従来の免疫アッセイ法（例
えば、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、または蛍光免疫アッセイ）により、抗免疫
原活性に関してアッセイする。
抗体源として使用できるハイブリドーマは、ＮＧＦ、またはその一部に特異的なモノク
ローナル抗体を産生する親ハイブリドーマの全ての誘導体、後代細胞を包含する。
このような抗体を産生するハイブリドーマは、公知の方法を用いて、インビトロまたは
インビボで増殖できる。所望の場合、該モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿、
ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過などの従来の免疫グロブリン
精製法により、培養培地または体液から単離できる。望ましくない活性が存在する場合は
、例えば、固相に結合させた免疫原から作製された吸着材上に該調製物を流し、該免疫原
から所望の抗体を溶出または遊離させることによって、それを除去できる。二官能性剤ま
たは誘導化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイ
ン残基によって結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グリター
ルアデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲとＲ１が異なるアルキル基であるＲ１
Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて、ヒトＮＧＦ、または免疫化される種において、免疫原性であるタ
ンパク質に結合した標的アミノ酸配列を含有する断片による宿主動物の免疫化により、抗
体集団（例えば、モノクローナル抗体）を得ることができる。
所望の場合、対象となる抗ＮＧＦ抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を配列
化でき、次いで、発現または増殖のためにベクター内にクローン化できる。対象となる抗
体をコードする配列を宿主細胞におけるベクター内に維持でき、次いで、該宿主細胞を増
殖させ、将来の使用のために凍結できる。代替として、該抗体を「ヒト化」するため、ま
たは該抗体の親和性もしくは他の特性を改善するために、遺伝子操作用に使用できる。例
えば、該抗体が臨床試験およびヒトにおける処置に使用される場合、免疫応答を避ける目
的で、該定常領域を、ヒトの定常領域により似せるために操作できる。ＮＧＦに対するよ
り大きな親和性およびＮＧＦ阻害におけるより大きな有効性を得るために、該抗体の配列
を遺伝子操作することが望ましいと考えられる。抗ＮＧＦ抗体に対して、１つ以上の変化
を施しても、依然としてＮＧＦに対するその結合能力を維持できることは、当業者に明ら
かであろう。
「ヒト化」抗体とは、一般に、非ヒト種の免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合
部位を有し、しかもヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子の免疫グ
ロブリン構造を残存させている分子を称する。該抗原結合部位は、定常ドメインに融合し
た完全可変ドメインか、または可変ドメインにおける適切なフレームワーク領域に合体さ
せた相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のみのいずれかを含み得る。抗原結合部位は、野生型で
あり得るか、または１つもしくは複数のアミノ酸置換によって修飾した、例えば、ヒトの
免疫グロブリンにより似せるように修飾したものであり得る。ヒト化抗体のいくつかの形
態（例えば、マウス抗体の６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）は、全てのＣ
ＤＲ配列を保存する。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して変化した１つ以上（１
つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）のＣＤＲを有する。いくつかの例において、ヒト免
疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基または他の残基は、対応する非ヒト残基
によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見ら
れない残基を含み得る。
モノクローナルをヒト化するには、４つの一般的ステップがある。これらは：（１）出
発抗体の軽および重可変ドメインのヌクレオチドおよび予想アミノ酸配列の決定（２）ヒ
ト化抗体のデザイン、すなわち、ヒト化工程時に使用する抗体フレームワーク領域の決定
（３）実際のヒト化方法論／技法および（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび
発現である。例えば、米国特許出願第４，８１６，５６７号；第５，８０７，７１５号；
第５，８６６，６９２号；第６，３３１，４１５号；第５，５３０，１０１号；第５，６
９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，５８５，０８９号；第６，１８０，３
７０号；および第６，５４８，６４０号を参照されたい。
ヒト定常ドメインに融合させた齧歯類または修飾齧歯類Ｖ領域およびそれらの関連相補
性決定領域（ＣＤＲ）を有するキメラ抗体など、非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合部
位を含む多数の「ヒト化」抗体分子が記載されている。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔ
ｕｒｅ３４９：２９３−２９９頁（１９９１）、Ｌｏｂｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：４２２０−４２２４頁（１９８９）、Ｓｈａｗら、Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８頁（１９８７）、およびＢｒｏｗｎら、
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３頁（１９８７）を参照されたい。他の
文献には、適切なヒト抗体定常ドメインに融合させる前に、ヒト支持フレームワーク領域
（ＦＲ）に合体させた齧歯類ＣＤＲが記載されている。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、
Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２７頁（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６頁（１９８８）、およびＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ
３２１：５２２−５２５頁（１９８６）を参照されたい。他の文献には、組換え合体させ
た齧歯類フレームワーク領域に支持された齧歯類ＣＤＲが記載されている。例えば、欧州
特許出願公開第０５１９５９６号を参照されたい。ヒトレシピエントにおける齧歯類抗ヒ
ト抗体分子部分の処置適用の時間および有効性を制限するこれら分子に対する望ましくな
い免疫学的応答を最少化するために、これらの「ヒト化」分子はデザインされる。例えば
、抗体定常領域が、免疫学的に不活性（例えば、補体溶解現象を引き起こさない）である
ように操作できる。例えば、国際出願ＰＣＴ／英国９９／０１４４１号；英国特許出願公
開第９８０９９５１．８号を参照されたい。やはり使用できる抗体ヒト化の他の方法は、
Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：２４７１−２４７６頁（
１９９１）により、また、米国特許第６，１８０，３７７号；第６，０５４，２９７号；
第５，９９７，８６７号；第５，８６６，６９２号；第６，２１０，６７１号；および第
６，３５０，８６１号；および国際出願ＰＣＴ０１／２７１６０号に開示されている。ヒ
ト化はまた、親和性成熟も含み得る。例えば、米国特許出願第１０／７４５，７７５号お
よび国際出願ＰＣＴ／米国０３／４１２５２号を参照されたい。
さらに他の代替法において、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操
作された市販のマウスを用いて、完全ヒト抗体を得ることができる。より望ましい（例え
ば、完全ヒト抗体）またはより強い免疫応答を生み出すためにデザインされる形質転換動
物もまた、ヒト化抗体またはヒト抗体を創製するために使用できる。このような技術の例
は、Ａｂｇｅｎｉｃｓ社（カリフォルニア州、フレモント）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標
）ならびにＭｅｄａｒｅｘ社（ニュージャージー州、プリンストン）のＨｕＭＡｂ−Ｍｏ
ｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
１つの代替法において、抗体は、当該分野で公知の任意の方法を用い、組換え作製して
発現させることができる。他の代替法において、抗体は、ファージ表示技術によって組換
え作製できる。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；第５，５８０，７１７号；第
５，７３３，７４３号；および第６，２６５，１５０号；ならびにＷｉｎｔｅｒら、Ａｎ
ｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５頁（１９９４）を参照されたい。
あるいは、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから
、ヒトの抗体および抗体断片を作製するために、ファージ表示技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔ
ｙら、Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５３頁（１９９０））を使用できる。この方法に
より、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージの大型
または小型外殻タンパク質遺伝子内にフレーム内クローニングされ、ファージ粒子の表面
に、機能的抗体断片として表示される。該糸状粒子は、ファージゲノムの１本鎖ＤＮＡコ
ピーを含有するため、該抗体の機能的性質に基づいた選択により、それらの性質を示す抗
体をコードする遺伝子が選択される結果にもなる。したがって、ファージはＢ細胞の性質
のいくつかを模倣する。ファージ表示は、種々のフォーマットにおいて実施でき；レビュ
ーに関しては、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｋｅｖｉｎ Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ、Ｄ
ａｖｉｄ Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ３、５６４−５７１頁（１９９３）を参照されたい。ファージ表示には、いく
つかのＶ遺伝子セグメント源が使用できる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３５２：
６２４−６２８（１９９１）は、免疫化マウスの脾臓から誘導したＶ遺伝子のランダム組
み合わせ小ライブラリーから、多数の多様な抗オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒ
トドナーのＶ遺伝子レパートリーを構築でき、Ｍａｒｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２
２：５８１−５９７頁（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：
７２５−７３４頁（１９９３）によって記載された方法にしたがって、多数の多様な抗原
（自己抗原を含む）に対する抗体を本質的に単離できる。自然免疫応答において、抗体遺
伝子は高率で変異を蓄積する（体細胞過剰変異）。誘導された変化のいくつかにより、よ
り高い親和性が与えられ、引き続く抗原誘発時に、高親和性表面免疫グロブリンを示すＢ
細胞が優先的に複製され、分化される。この自然過程は、「チェーンシャフリング」とし
て知られた方法を用いることによって模倣できる。（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｏｌ．１０：７７９−７８３（１９９２））。この方法では、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝
子を、非免疫化ドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然変異体（レパートリー）のレ
パートリーによって、連続的に置換することによって、ファージ表示によって得られた「
一次」ヒト抗体の親和性を改善できる。この方法により、ｐＭ〜ｎＭ範囲の親和性を有す
る抗体および抗体断片を作製することが可能である。極めて大規模なファージ抗体レパー
トリー（「全ライブラリーの母体」として知られている）を作製するための方式は、Ｗａ
ｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６頁（１
９９３）により記載されている。遺伝子シャフリングはまた、ヒト抗体が、出発齧歯類抗
体と同様な親和性および特異性を有する場合、齧歯類抗体からヒト抗体を誘導するために
も使用できる。「エピトープインプリンティング」とも称されるこの方法によれば、ファ
ージ表示法によって得られた齧歯類抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子が、ヒトＶド
メイン遺伝子のレパートリーによって置換され、齧歯類−ヒトキメラが創製される。抗原
の選択によって機能的抗原結合部位を再生できるヒト可変領域の単離がもたらされる。す
なわち、エピトープは、相手の選択を制御（インプリント）する。残りの齧歯類Ｖドメイ
ンを置換するために、この過程を繰り返せば、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日
に公開された国際出願ＰＣＴ９３／０６２１３号を参照）。ＣＤＲ合体による齧歯類抗体
の伝統的なヒト化とは異なり、この方法は、出所齧歯類のフレームワークまたはＣＤＲ残
基を有さない完全なヒト抗体を提供する。
上記の検討は、ヒト化抗体に関するものであることは明らかであるが、検討された一般
的原理は、例えば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマおよびウシにおける使用を目的に、抗体を
カスタマイズするために適用できる。さらに、本明細書に記載された抗体ヒト化の１つ以
上の態様を、例えば、ＣＤＲ合体、フレームワーク変異およびＣＤＲ変異と組み合わせ得
ることは明らかである。
まず、抗体および抗体産生細胞を宿主動物から単離し、遺伝子配列を得、宿主細胞（例
えばＣＨＯ細胞）において抗体を組換え的に発現させるために、該遺伝子配列を用いるこ
とによって、抗体を組換え的に作製できる。使用できる他の方法は、抗体配列を、植物（
例えばタバコ）または軽質転換ミルクにおいて発現させることである。抗体を、植物また
はミルクにおいて組換え的に発現させる方法は開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓ
ら、Ｖａｃｃｉｎｅ１９：２７５６頁（２００１）；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＤ．Ｈ
ｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１３：６５頁（１９９５）；およびＰｏｌ
ｌｏｃｋら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ２３１：１４７頁（１９９９）を参照
されたい。抗体の誘導体、例えば、ヒト化、一本鎖などを作製する方法は当該分野に公知
である。
ＮＧＦに特異的な抗体を単離するために、免疫アッセイおよび蛍光活性化細胞選別（Ｆ
ＡＣＳ）などのフローサイトメトリー選別法を用いることもできる。
抗体を多くの異なったキャリアに結合することができる。キャリアは活性でも不活性で
もあり得る。よく知られたキャリアの例としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ
エチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ類、ガラス、天然および修飾セルロース
類、ポリアクリルアミド類、寒天類および磁鉄鉱が挙げられる。該キャリアの性質は、本
発明の目的に関して、可溶性でも不溶性でもあり得る。当業者は、抗体に結合させるため
の他の適切なキャリアを知っているか、または慣例的な実験を用いてそのようなものを確
認できるであろう。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは容易に単離され、従来の方法を用いて（例え
ば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することの
できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）配列化できる。ハイブリドー
マ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。該ＤＮＡを単離したら、それ
を発現ベクター（国際出願ＰＣＴ８７／０４４６２号に開示されている発現ベクターなど
）内に入れ、次いでそれを、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を達成す
るために、別の場合には免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ
細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞内
にトランスフェクトする。例えば、ＰＣＴ国際公開第８７／０４４６２号を参照されたい
。該ＤＮＡはまた、例えば、相同性マウス配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメ
インのコード配列を置換することにより、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１（１９８４）、または非免疫グロブリンポリペプチドのコ
ード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることにより修飾
できる。その方法で、本明細書における抗ＮＧＦモノクローナル抗体の結合特異性を有す
る「キメラ」抗体または「ハイブリッド」抗体が調製される。
抗ＮＧＦ抗体は、当該分野に周知の方法を用いて特性化できる。例えば、１つの方法は
、それが結合するエピトープを同定すること、または「エピトープマッピング」である。
タンパク質上のエピトープの位置をマッピングまたは特性化するために、抗体−抗原複合
体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌの第１１章、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｒａｔｏｙ
Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー、１９９９年に記載されてい
る合成的ペプチドベースアッセイなどの多くの方法が当該分野に公知である。さらなる一
例において、抗ＮＧＦ抗体が結合する配列を決定するためにエピトープマッピングが使用
できる。エピトープマッピングは、種々の供給源、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ（オランダ国、８２１９ＰＨ Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ１５）か
ら市販されている。該エピトープは、線状エピトープ、すなわち、アミノ酸の単一ストレ
ッチに含有されているエピトープであり得るか、または必ずしも単一ストレッチ（一次構
造線状配列）に含有されていなくてもよい、アミノ酸の三次元相互作用によって形成され
た立体配置的エピトープであり得る。種々の長さ（例えば、少なくとも、４〜６アミノ酸
長）のペプチドを単離、合成（例えば、組換え的に）でき、抗ＮＧＦ抗体との結合アッセ
イに使用できる。他の実施例において、抗ＮＧＦ抗体が結合するエピトープは、ＮＧＦ配
列に由来するオーバーラップペプチドを用い、抗ＮＧＦ抗体による結合を判定することに
よって、系統的スクリーニングにおいて決定できる。遺伝子断片発現アッセイにより、Ｎ
ＧＦをコードしているオープンリーディングフレームを、ランダムにまたは特定の遺伝子
構造によって断片化し、ＮＧＦの発現断片の、被験抗体との反応性を判定する。該遺伝子
断片は、例えば、ＰＣＲによって作製でき、次いで、放射性アミノ酸の存在下、インビト
ロで転写され、タンパク質に翻訳できる。次いで、放射活性標識されたＮＧＦ断片に対す
る該抗体の結合を、免疫沈降およびゲル電気泳動によって判定する。また、一定のエピト
ープは、ファージ粒子表面上に表示されたランダムなペプチド配列の大ライブラリー（フ
ァージライブラリー）を用いることによって同定できる。あるいは、オーバーラップペプ
チド断片の確定ライブラリーは、簡便な結合アッセイにおいて、試験抗体に対する結合に
関して試験できる。さらなる一実施例において、エピトープ結合に関して要求される、十
分な、および／または必要な残基を同定するために、抗原結合ドメインの変異誘発、ドメ
インスワッピング実験およびアラニンスキャニング変異誘発を実施できる。例えば、密接
に関連しているが、抗原性の異なるタンパク質（ニューロトロフィンタンパク質ファミリ
ーの別のメンバーなど）の配列によって、ＮＧＦポリペプチドの種々の断片が置換された
（スワップされた）変異ＮＧＦを用いて、ドメインスワッピング実験を実施することがで
きる。変異ＮＧＦに対する抗体の結合を評価することによって、抗体結合に対する特定の
ＮＧＦ断片の重要性を評価できる。 抗ＮＧＦ抗体が他の抗体と同じエピトープに結合す
るかどうかを判定するために、抗ＮＧＦ抗体を特性化するために使用できるさらに他の方
法は、同じ抗原、すなわち、ＮＧＦ上の種々の断片に結合することが知られている他の抗
体との競合アッセイを用いることである。競合アッセイは当業者に十分に知られている。
本発明に関する競合アッセイに使用できる抗体の例としては、Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａ１９：２１５−２２７頁（２０００）に記載されているＭＡｂ９１１、９１２、
９３８が挙げられる。
（他のＮＧＦアンタゴニスト）
抗ＮＧＦ抗体以外のＮＧＦアンタゴニストを使用してもよい。本発明のいくつかの実施
形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、機能的ＮＧＦの発現を遮断または減少できる少
なくとも１種のアンチセンス分子を含む。ＮＧＦのヌクレオチド配列は知られており、公
共的に利用できるデータベースから容易に入手できる。例えば、Ｂｏｒｓａｎｉら、Ｎｕ
ｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９０年、１８、４０２０頁；登録番号 ＮＭ００２５０６
；Ｕｌｌｒｉｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ３０３：８２１−８２５頁（１９８３）を参照された
い。他のポリヌクレオチドと交差反応をしない、ＮＧＦのｍＲＮＡと特異的に結合するア
ンチセンスオリゴヌクレオチド分子の調製は、慣例的である。標的部位の例としては、限
定はしないが、開始コドン、５’調節領域、コード化配列および３’非翻訳領域が挙げら
れる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが約１０から１００ヌ
クレオチド、長さが約１５から５０ヌクレオチド、長さが約１８から２５ヌクレオチド、
またはそれ以上である。該オリゴヌクレオチドは、例えば、当該分野に周知のホスホロチ
オエート結合、および２’−Ｏ糖修飾などの主鎖修飾を含み得る。アンチセンス分子の例
としては、米国特許出願公開第２００１００４６９５９号に記載されたＮＧＦアンチセン
ス分子が挙げられ；また、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｎａ−ｔｅｃ．ｃｏｍ／ｒｅｐａｉ
ｒ．ｈｔｍ．を参照されたい。
他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、機能的ＮＧＦレセプター（ＴｒｋＡ
および／またはｐ７５など）の発現を遮断または減少できる少なくとも１種のアンチセン
ス分子を含む。Ｗｏｏｌｆら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１（３）：１０４
７−５５頁；Ｔａｇｌｉａｌｅｔｅｌａら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９６）６６（
５）：１８２６−３５頁。ＴｒｋＡおよびｐ７５のヌクレオチド配列は知られており、公
共的に利用できるデータベースから容易に入手できる。
あるいは、ＮＧＦの発現および／または放出および／またはＮＧＦ授の発現は、遺伝子
ノックダウン、モルホリノオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、またはリボザイム、当該分野
に周知の方法を用いて減少させることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｃａｌｅｓ
ｔｅｒ．ｅｄｕ／〜ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ／ＲＮＡｉ．ｈｔｍｌ；ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂ
３２．ｅｚｂｏａｒｄ．ｃｏｍ／ｆｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓｆｒｍ１９．ｓｈｏｗＭｅｓ
ｓａｇｅ？ｔｏｐｉｃＩＤ＝６．ｔｏｐｉｃ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｇｈｖｅｌｄ
．ｃｏｍ／ｒｉｂｏｚｙｍｅ．ｈｔｍｌを参照されたい。
他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、少なくとも１種のＮＧＦ阻害化合物
を含む。本明細書に用いられる「ＮＧＦ阻害化合物」とは、ＮＧＦの生物活性を直接また
は間接に減少、阻害、中和、または無効化する抗ＮＧＦ抗体以外の化合物を称する。ＮＧ
Ｆ阻害化合物は、以下の特徴のいずれか１つ以上を示す必要がある：（ａ）ＮＧＦに結合
し、ＮＧＦの生物活性および／またはＮＧＦのシグナル伝達機能に媒介される下流経路を
阻害する；（ｂ）骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛のいずれかの態様を予防、
改善、または処置する；（ｃ）ＮＧＦレセプターの活性化（ＴｒｋＡレセプターの二量体
化および／または自己リン酸化など）を遮断または減少させる；（ｄ）ＮＧＦのクリアラ
ンスを増加させる；（ｅ）ＮＧＦの合成、産生または放出を阻害する（減少させる）。Ｎ
ＧＦ阻害化合物の例としては、米国特許出願公開第２００１００４６９５号に記載された
小型分子ＮＧＦインヒビター；国際出願ＰＣＴ００／６９８２９号に記載されたｐ７５に
対するＮＧＦの結合を阻害する化合物、およびＣｏｌｑｕｈｏｕｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａ
ｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３１０（２）：５０５−１１頁（２００４）に記載されたＰ
Ｄ９０７８０〔７−（ベンゾリルアミノ）−４，９−ジヒドロ−４−メチル−９−オキソ
−ピラゾロ〔５，１−ｂ〕キナゾリン−２−カルボン酸〕；国際出願ＰＣＴ９８／１７２
７８号に記載されたＴｒｋＡおよび／またはｐ７５に対するＮＧＦの結合を阻害する化合
物が挙げられる。ＮＧＦ阻害化合物のさらなる例としては、国際出願ＰＣＴ０２／１７９
１４号および第０２／２０４７９号ならびに米国特許第５，３４２，９４２号；第６，１
２７，４０１号；および第３５９，１３０号に記載された化合物が挙げられる。さらなる
例示的ＮＧＦ阻害化合物は、ＮＧＦの競合的インヒビターである化合物である。米国特許
第６，２９１，２４７号を参照されたい。さらに、当業者は、他の小型分子ＮＧＦ阻害化
合物を調製できる。
いくつかの実施形態において、ＮＧＦ阻害化合物は、ＮＧＦと結合する。標的（結合）
部位の例としては、限定はしないが、ＴｒｋＡレセプターおよび／またはｐ７５レセプタ
ーに結合するＮＧＦの部分、およびレセプター結合部位に隣接していて、レセプター結合
部分の正しい三次元形状を生じさせる原因の一部となっているＮＧＦの部分が挙げられる
。他の実施形態において、ＮＧＦ阻害化合物は、ＮＧＦレセプター（ＴｒｋＡおよび／ま
たはｐ７５など）に結合し、ＮＧＦの生物活性を阻害する。標的部位の例としては、ＮＧ
Ｆに結合するＴｒｋＡおよび／またはｐ７５の部分が挙げられる。
小型分子を含む実施形態において、小型分子は、約１００ダルトンから２０，０００ダ
ルトン、５００ダルトンから１５，０００ダルトン、または１０００ダルトンから１０，
０００ダルトンのいずれかの分子量を有し得る。小型分子のライブラリーは市販されてい
る。小型分子は、吸入、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、鞘内、心室内、経口、腸内、非
経口、鼻腔内、または経皮など、当該分野で公知の任意の手段を用いて投与できる。一般
に、本発明によるＮＧＦアンタゴニストが小型分子である場合、０．１から３００ｍｇ／
ｋｇ患者体重の比率で、１回から３回またはそれ以上の回数の用量に分割して投与される
。通常体重の成人患者に対しては、１回用量当たり、１ｍｇから５ｇの範囲の用量を投与
できる。
他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、少なくとも１種のＮＧＦ構造類縁体
を含む。本発明における「ＮＧＦ構造類縁体」とは、ＮＧＦの三次元構造の一部と同様な
三次元構造を有し、結合がＮＧＦの生物活性を、少なくとも部分的に阻害するインビトロ
またはインビボの生理的条件下で、ＮＧＦレセプターに結合する化合物を称する。一実施
形態において、ＮＧＦ構造類縁体は、ＴｒｋＡレセプターおよび／またはｐ７５レセプタ
ーに結合する。ＮＧＦ構造類縁体の例としては、限定はしないが、国際出願ＰＣＴ９７／
１５５９３号に記載された二環式ペプチド；米国特許第６，２９１，２４７号に記載され
た二環式ペプチド；米国特許第６，０１７，８７８号に記載された環式化合物；および国
際出願ＰＣＴ８９／０９２２５号に記載されたＮＧＦ由来ペプチドが挙げられる。適切な
ＮＧＦ構造類縁体はまた、ＮＧＦレセプター結合の分子モデリングにより、例えば、国際
出願ＰＣＴ第９８／０６０４８号に記載された方法によりデザインでき、合成できる。Ｎ
ＧＦ構造類縁体は、親和性および生物的効果の改善を達成するために、同一の、または異
なる構造の任意の所望の組み合わせにおける単量体または二量体／オリゴマーであり得る
。
他の実施形態において、本発明は、ＴｒｋＡレセプターおよび／またはｐ７５レセプタ
ーの少なくとも１種の優性ネガティブ変異体を含むＮＧＦアンタゴニストを提供する。当
業者は、例えば、ＴｒｋＡレセプターが、ＮＧＦに結合し、したがって、ＮＧＦを捕捉す
る「シンク」として作用するように、該レセプターの優性ネガティブ変異体を調製できる
。しかし、該優性ネガティブ変異体は、ＮＧＦに化合物した際に、ＴｒｋＡレセプターの
通常の生物活性を有さない。優性ネガティブ変異体の例としては、限定はしないが、以下
の文献に記載された変異体が挙げられ、それらは各々、参考としてその全体が本明細書に
援用される：Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９８年、９５
、１０８８４；Ｅｉｄｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９６年、１６、３１２３；Ｌｉ
ｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９７年、１７、８７４９；Ｋｌｅｉｎら、Ｃｅｌｌ１
９９０年、６１、６４７；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、Ｎｅｕｒｏｎ１９９３年、１０、９
６３；Ｔｓｏｕｌｆａｓら、Ｎｅｕｒｏｎ１９９３年、１０、９７５；およびＬａｍｂａ
ｌｌｅら、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９３年、１２、３０８３。優性ネガティブ変異体、例えば
ＴｒｋＡレセプター変異体は、インビボで発現されるように、タンパク質の形態で、また
は発現ベクターの形態で投与できる。該タンパク質または発現ベクターは、腹腔内、静脈
内、筋肉内、皮下、鞘内、心室内、経口、腸内、非経口、鼻腔内、経皮、または吸入など
、当該分野で公知の任意の手段を用いて投与できる。例えば発現ベクターの投与には、注
射、経口投与、粒子銃またはカテーテル化投与、および局所投与などの局部的または全身
的投与が含まれる。当業者は、インビボで外来タンパク質の発現を達成するための発現ベ
クターの投与に精通している。例えば米国特許第６，４３６，９０８号；第６，４１３，
９４２号；および第６，３７６，４７１号を参照されたい。
アンチセンスポリヌクレオチド、発現ベクター、またはサブゲノムポリヌクレオチドを
含有する処置用組成物の標的化送達もまた用いられる。レセプター媒介ＤＮＡ送達法は、
例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）１１：
２０２頁；Ｃｈｉｏｕら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｊｏｄｓ Ａｎ
ｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｄｉｒｅｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｊ
．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編）（１９９４）；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２
６３：６２１頁；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５４２頁；Ｚ
ｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：３６５
５頁；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６：３３８頁に記載されてい
る。遺伝子療法プロトコルにおける局部投与に関し、ポリヌクレオチドを含有する処置用
組成物は、約１００ｎｇから約２００ｍｇの範囲のＤＮＡにおいて投与される。いくつか
の実施形態において、遺伝子療法プロトコルの期間、約５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１
μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇ、および約２０μｇから約１００μｇの濃
度範囲のＤＮＡ、またはそれ以上が投与される。本発明の処置用ポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを用いて送達できる。該遺伝子送達ビヒクルは、ウ
ィルス起源または非ウィルス起源のものであり得る（一般的には、Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１；Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎｅ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：８４５頁；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎｅ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５）１：１８５頁；およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）６：１４８頁を参照）。このようなコード化配列
の発現は、外因性の哺乳動物または異種プロモーターおよび／またはエンハンサーを用い
て誘導できる。コード化配列の発現は、構成的でもよいし、調節されていてもよい。
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞における発現のためのウィルスベース
のベクターは、当該分野によく知られている。ウィルスベースのビヒクルの例としては、
限定はしないが、組換えレトロウィルス（例えば、国際出願ＰＣＴ９０／０７９３６号；
９４／０３６２２号；９３／２５６９３号；９３／２５２３４号；９３／１１２３０号；
９３／１０２１８号；９１／０２８０５号；米国特許第５，２１９，７４０号および第４
，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；および欧州特許第０３４５２４
２号を参照）、アルファウィルスベースのベクター（例えば、シンドビスウィルスベクタ
ー、セムリキ森林ウィルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロス
リバーウィルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネズエ
ラウマ脳炎ウィルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ
ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））、およびアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）ベ
クター（例えば、国際出願ＰＣＴ９４／１２６４９号、９３／０３７６９号、９３／１９
１９１号、９４／２８９３８号、９５／１１９８４号および９５／００６５５号を参照）
が挙げられる。Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７頁
に記載されている死アデノウィルスに結合させたＤＮＡ投与もまた使用できる。
限定はしないが、死アデノウィルス結合または非結合ポリカチオン濃縮ＤＮＡ単独（例
えば、Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９２）３：１４７頁を参照）
；リガンド結合ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：
１６９８５を参照）；真核細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８
２号；国際出願ＰＣＴ９５／０７９９４号；９６／１７０７２号；９５／３０７６３号；
および９７／４２３３８号を参照）および核電荷中和または細胞膜との融合などの非ウィ
ルス送達ビヒクルと方法もまた用いることができる。裸のＤＮＡもまた使用できる。裸の
ＤＮＡ導入法の例は、国際出願ＰＣＴ９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，
８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとしてのリポソーム類は、米国特許第５
，４２２，１２０号；国際出願ＰＣＴ９５／１３７９６号；９４／２３６９７号；９１／
１４４４５号；および欧州特許第０５２４９６８号に記載されている。さらなる方法は、
Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９４）１４：２４１１頁、およびＷ
ｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）９１：１５８１
頁に記載されている。
発現ベクターが、本明細書に記載されているタンパク質ベースのＮＧＦアンタゴニスト
（例えば、抗ＮＧＦ抗体、ＴｒｋＡイムノアドヘシンなど）のいずれかの発現を方向付け
るために使用できることも明らかである。例えば、ＮＧＦおよび／またはＮＧＦの生物活
性を遮断できる（部分的遮断から完全遮断まで）他のＴｒｋＡレセプター断片が当該分野
に公知である。
他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、少なくとも１種のＴｒｋＡイムノア
ドヘシンを含む。本明細書に用いられるＴｒｋＡイムノアドヘシンとは、ＴｒｋＡレセプ
ターの結合特異性を保持し（ＴｒｋＡレセプターの結合特異性を実質的に保持し）、かつ
ＮＧＦに結合することができるＴｒｋＡレセプターの細胞外ドメインおよび免疫グロブリ
ンの配列を含む可溶性キメラ分子を称する。
ＴｒｋＡイムノアドヘシンは、当該分野に知られており、ＴｒｋＡレセプターに対する
ＮＧＦの結合を遮断することが判明している。例えば、米国特許第６，１５３，１８９号
を参照されたい。Ｂｒｅｎｎａｎらは、手術後痛のラットモデルにおけるＴｒｋＡイムノ
アドヘシンの投与を報告している。神経科学学会要旨２４（１−２）８８０（１９９８）
を参照されたい。一実施形態において、ＴｒｋＡイムノアドヘシンは、ＮＧＦに結合でき
るＴｒｋＡレセプターの細胞外ドメインのＴｒｋＡレセプターアミノ酸配列（またはその
一部）（いくつかの実施形態においては、ＴｒｋＡレセプターの結合特異性実質的に保持
するアミノ酸配列）と免疫グロブリン配列との融合体を含む。いくつかの実施形態におい
て、ＴｒｋＡレセプターは、ヒトＴｒｋＡレセプター配列であり、該融合体は、免疫グロ
ブリンの定常ドメイン配列とのものである。他の実施形態において、該免疫グロブリン定
常ドメイン配列は、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列である。他の実施形態において
、２つのＴｒｋＡレセプター−免疫グロブリン重鎖融合体の結合（例えば、ジスルフィド
結合による共有結合を介しての）により、ホモ二量体免疫グロブリン様構造が生じる。免
疫グロブリンの軽鎖は、さらに、ジスルフィド結合二量体におけるＴｒｋＡレセプター−
免疫グロブリンキメラの１つまたは双方と結合でき、ホモ三量体またはホモ四量体構造を
生じる。適切なＴｒｋＡイムノアドヘシンの例としては、米国特許第６，１５３，１８９
号に記載されたものが挙げられる。
他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦの、ＴｒｋＡレセプターとの
物理的相互作用および／または下流のシグナル伝達を遮断、抑制、変更、および／または
減少させることができる、少なくとも１種の抗ＴｒｋＡ抗体を含んでなり、これにより、
ＮＧＦの生物活性は、減少および／または遮断される。抗ＴｒｋＡ抗体は、当該分野に公
知である。抗ＴｒｋＡ抗体の例としては、国際出願ＰＣＴ９７／２１７３２号、００／７
３３４４号、０２・１５９２４号、および米国特許出願公開第２００１００４６９５９号
に記載されたものが挙げられる。
他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦの、ｐ７５レセプターとの物
理的相互作用および／または下流のシグナル伝達を遮断、抑制、変更、および／または減
少させることができる、少なくとも１種の抗ｐ７５抗体を含んでなり、これにより、ＮＧ
Ｆの生物活性は、減少および／または遮断される。
他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＴｒｋＡレセプター活性および／ま
たはｐ７５レセプター活性に関連した下流のキナーゼシグナル伝達を阻害できる少なくと
も１種のキナーゼインヒビターを含む。キナーゼインヒビターの例は、Ｋ２５２ａまたは
Ｋ２５２ｂであり、それらは当該分野に知られており、Ｋｎｕｓｅｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ
ｃｈｅｍ．５９：７１５−７２２頁（１９９２）；Ｋｎｕｓｅｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ５７：９５５−９６２頁（１９９１）；Ｋｏｉｚｕｍｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉｅｎｃｅ８：７１５−７２１頁（１９８８）；Ｈｉｒａｔａら、Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ１１１：７２８、ＸＰ００２０４１３５に記載されている。要旨
および第１２版化学物質索引集、ｐ．３４２３７、ｃ．３（５−７）、５５−６０、６６
−６９）、ｐ．３４２３８、ｃ．１（４１−４４）、ｃ．２（２５−２７、３２−３３）
、ｐ．３４２３、ｃ．３（４８−５０、５２−５３）、および米国特許第６，３０６，８
４９号を参照されたい。
臨床医によって探索されれば、他の多数のＮＧＦアンタゴニストの種類が同定されると
考えられる。
（ＮＧＦアンタゴニストの同定）
抗ＮＧＦ抗体および他のＮＧＦアンタゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて同定
または特性化でき、それによって、ＮＧＦ生物活性の減少、改善、または中和が検出およ
び／または測定される。国際公開ＰＣＴ第０４／０６５５６０号に記載された方法を用い
ることができる。ＮＧＦアンタゴニストの同定に、他の方法、例えば、米国特許第５，７
６６，８６３号および第５，８９１，６５０号に記載されているキナーゼレセプター活性
化（ＫＩＲＡ）アッセイを用いることができる。このＥＬＩＳＡタイプのアッセイは、レ
セプタータンパク質チロシンキナーゼ（以後「ｒＰＴＫ］）のキナーゼドメインの自己リ
ン酸化測定によるキナーゼ活性の定性的または定量的測定にとって、ならびに、選択され
たｒＰＴＫ、例えばＴｒｋＡの可能なアンタゴニストの同定および特性化にとって好適で
ある。該アッセイの第１段階には、キナーゼレセプター、例えばＴｒｋＡレセプターのキ
ナーゼドメインのリン酸化が含まれ、該レセプターは、真核細胞の細胞膜に存在する。該
レセプターは、内在性のレセプターもしくは該レセプターをコードする核酸であり得るか
、または、レセプター構築体を細胞内に形質転換し得る。典型的には、第１の固体相（例
えば、第１のアッセイプレートのウェル）を、このような細胞（通常は、哺乳動物細胞系
）の実質的に均一な集団で被覆し、該細胞を該固体相に接着させるようにする。該細胞は
接着性であるために、第１の固体相に自然に接着することが多い。「レセプター構築体」
が用いられる場合、それは通常、キナーゼレセプターとフラッグポリペプチドとの融合体
を含む。フラッグポリペプチドは、アッセイのＥＬＩＳＡ部分において、捕捉剤、しばし
ば捕捉抗体によって認識される。次いで、候補となる抗ＮＧＦ抗体またはたのＮＧＦアン
タゴニストなどの検体を、ＮＧＦと共に、チロシンキナーゼレセプター（例えばＴｒｋＡ
レセプター）がＮＧＦおよび検体に暴露される（または接触する）ように、接着細胞を有
する該ウェルに加える。このアッセイによって、抗体のリガンドＮＧＦによりＴｒｋＡの
活性化を阻害する該抗体（または他のＮＧＦアンタゴニスト）の同定が可能になる。ＮＧ
Ｆおよび検体への暴露後、リーシス緩衝液（中に、可溶化界面活性剤を有する）および静
かな攪拌を用いて、該接着細胞を可溶化し、それによって、細胞ライセートを遊離させ、
細胞ライセートはさらに濃縮または明澄化する必要なく、直接、アッセイのＥＬＩＳＡ部
分に供することができる。
次いで、このように調製された細胞ライセートは、該アッセイのＥＬＩＳＡ段階に供す
る準備ができる。ＥＬＩＳＡ段階の第２ステップとして、第２の固体相（通常は、ＥＬＩ
ＳＡマイクロタイタープレートのウェル）を、チロシンキナーゼレセプターに、または、
レセプター構築体の場合は、フラッグポリペプチドに特異的に結合する捕捉剤（しばしば
捕捉抗体）によって被覆する。該捕捉剤が第２の固体相に接着するように、第２の固体相
の被覆を実施する。該捕捉剤は、一般にモノクローナル抗体であるが、本明細書における
実施例に記載されているように、ポリクローナル抗体もまた使用できる。次いで、該レセ
プターまたはレセプター構築体が第２の固体相に接着する（または捕捉される）ように、
得られた細胞ライセートを接着捕捉剤に暴露させるか、または接触させる。次いで、未結
合の細胞ライセートを除去するために、洗浄ステップを実施すると、捕捉されたレセプタ
ーまたはレセプター構築体が残る。次に、接着している、または捕捉されたレセプターま
たはレセプター構築体を、チロシンキナーゼレセプターにおけるリン酸化チロシン残基を
同定する抗ホスホチロシン抗体に暴露させるか、または接触させる。一実施形態において
、抗ホスホチロシン抗体を、非放射性着色剤の色変化を触媒する酵素に結合する（直接的
に、または間接的に）。したがって、該レセプターのリン酸化は、引き続き、該試薬の色
変化によって測定できる。該酵素は、抗ホスホチロシン抗体に直接結合できるか、または
結合性分子（例えばビオチン）を該抗ホスホチロシン抗体に結合でき、引き続き、該酵素
を、該結合性分子を介して抗ホスホチロシン抗体に結合できる。最後に、捕捉されたレセ
プターまたはレセプター構築体に対する抗ホスホチロシン抗体の結合が、例えば、着色試
薬の色変化によって測定される。
ＮＧＦアンタゴニストはまた、候補試剤をＮＧＦと共にインキュベートし、以下の特徴
のいずれか１つ以上をモニタリングすることによって同定できる：（ａ）ＮＧＦに結合し
、ＮＧＦの生物活性および／またはＮＧＦのシグナル伝達機能に媒介される下流経路を阻
害する；（ｂ）骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛のいずれかの態様を予防、改
善、または処置する；（ｃ）ＮＧＦレセプターの活性化（ＴｒｋＡレセプターの二量体化
および／または自己リン酸化など）を遮断または減少させる；（ｄ）ＮＧＦのクリアラン
スを増加させる；（ｅ）ＮＧＦの合成、産生または放出を阻害する（減少させる）。いく
つかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、候補試剤をＮＧＦと共にインキュベ
ートし、結合および付随するＮＧＦ生物活性の減少または中和をモニタリングすることに
よって同定される。精製ＮＧＦポリペプチドにより、または、ＮＧＦを自然に発現するか
、または発現するようにトランスフェクトされた細胞により、結合アッセイを実施できる
。一実施形態において、該結合アッセイは、ＮＧＦ結合に関して、既知のＮＧＦアンタゴ
ニストと競合する候補抗体の能力が評価される競合結合アッセイである。該アッセイは、
ＥＬＩＳＡフォーマットなどの種々のフォーマットにおいて実施できる。他の実施形態に
おいて、候補物質をＮＧＦと共にインキュベートし、付随するＴｒｋＡレセプターの二量
体化および／または自己リン酸化の阻害をモニタリングすることによって、ＮＧＦアンタ
ゴニストが同定される。
最初の同定に続いて、候補となる抗ＮＧＦアンタゴニストの活性は、標的生物活性を試
験する公知のバイオアッセイによってさらに確認でき、精製できる。あるいは、候補物質
を直接スクリーンするためにバイオアッセイを使用できる。例えば、ＮＧＦは、応答性細
胞において、多数の形態学的に認識できる変化を促す。限定はしないが、これらには、Ｐ
Ｃ１２細胞の分化促進およびこれらの細胞からの軸索突起の成長増進（Ｇｒｅｅｎｅおよ
びＴｉｓｃｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７３：２４２４−２
４２８頁（１９７６）；Ｕｒｆｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：４７７５−４７８１（１
９９７）；Ｔｓｏｕｌｆａｓら、Ｎｅｕｒｏｎ１０：９７５−９９０（１９９３））、応
答性感覚神経節および交感神経節の移植片からの軸索突起の成長促進（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎ
ｔａｌｃｉｎｉ，Ｒ．およびＡｎｇｅｌｅｔｔｉ，Ｐ．Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａ
ｃｔｏｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．４８、５３４−５６９頁（１９６８）および胚の背
側根神経節、三叉神経節、または交感神経節ニューロンなどのＮＧＦ依存性ニューロンの
生存促進（例えば、Ｃｈｕｎ＆Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．７５：７０５−
７１１頁（１９７７）；Ｂｕｃｈｍａｎ＆Ｄａｖｉｅｓ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１８
：９８９−１００１頁（１９９３）が含まれる。したがって、ＮＧＦ生物活性の阻害に関
するアッセイは、ＮＧＦ応答性細胞を、ＮＧＦプラス候補抗ＮＧＦ抗体または候補ＮＧＦ
アンタゴニストなどの検体と共に培養することを含む。適切な時間後に細胞応答をアッセ
イする（細胞分化、軸索突起の成長または細胞生存）。
ＮＧＦの生物活性を遮断または中和する候補ＮＧＦアンタゴニストの能力はまた、Ｈｏ
ｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１９：２１５−２２７頁（２０００）に記載されている胚
ラットの背側根神経節生存バイオアッセイにおいて、ＮＧＦ媒介生存を阻害する候補物質
の能力をモニタリングすることによっても評価できる。
（本発明の方法で使用するための組成物）
本発明の方法に使用される組成物は、ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦ抗体など）の有
効量を含んでなり、いくつかの実施形態においては、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに
含む。いくつかの実施形態において、該組成物は、本明細書に記載される方法のいずれか
に使用されるためのものである。このような組成物の例、ならびに処方の方法もまた、先
の節および下記に記載されている。一実施形態において、該組成物は、１種のＮＧＦアン
タゴニストを含む。他の実施形態において、該組成物は、１種または複数のＮＧＦアンタ
ゴニストを含む。他の実施形態において、該組成物は、以下のいずれか１つ以上から選択
される１種または複数のＮＧＦアンタゴニストを含む：ＮＧＦに結合する（物理的に相互
作用する）アンタゴニスト（例えば抗体）、ＮＧＦレセプター（ＴｒｋＡレセプターおよ
び／またはｐ７５レセプターなど）に結合するアンタゴニスト、および下流のＮＧＦレセ
プターシグナル伝達を減少させる（妨害するおよび／または遮断する）アンタゴニスト。
さらに他の実施形態において、該組成物は、ＴｒｋＡイムノアドヘシンではない（すなわ
ち、ＴｒｋＡイムノアドヘシン以外の）いずれかのＮＧＦアンタゴニストを含む。他の実
施形態において、該組成物は、抗ＮＧＦ抗体以外のいずれかのＮＧＦアンタゴニストを含
む。さらに他の実施形態において、該組成物は、ＴｒｋＡイムノアドヘシン以外であり、
かつ抗ＮＧＦ抗体以外のいずれかのＮＧＦアンタゴニストを含む。他の実施形態において
、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦの合成、産生または放出を阻害する（減少させる）。
いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＧＦに結合し関連ニューロト
ロフィン（ＮＴ３、ＮＴ４／５、および／またはＢＤＮＦなど）と有意には交差反応しな
い。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、有害免疫応答に関連しない
。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、抗ＮＧＦ抗体、ＮＧＦに特異
的なアンチセンス分子（ＮＧＦをコードする核酸に特異的なアンチセンス分子を含む）、
ＮＧＦレセプターに特異的なアンチセンス分子（ｔｒｋＡおよび／またはｐ７５など）、
ＮＧＦ阻害化合物、ＮＧＦ構造類縁体、ＮＧＦに結合するＴｒｋＡレセプターの優性ネガ
ティブ変異体、ＴｒｋＡイムノアドヘシン、抗ＴｒｋＡ抗体、抗ｐ７５抗体、およびキナ
ーゼインヒビターよりなる群から選択される。他の実施形態において、ＮＧＦアンタゴニ
ストは、抗ＮＧＦ抗体である。他の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、ヒトＮＧＦを認
識する。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、ヒトの抗ＮＧＦ抗体である。さ
らに他の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体はヒト化されている（本明細書に記載された抗
体Ｅ３など）。さらに他の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、抗体媒介溶解現象または
ＡＤＣＣなどの望まれない、または望ましくない免疫応答を引き起こさない定常領域を含
む。他の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、抗体Ｅ３の１つ以上のＣＤＲ（Ｅ３の１つ
、２つ、３つ、４つ、５つのＣＤＲ、またはいくつかの実施形態においては、６つ全ての
ＣＤＲなど）を含む。
該組成物が１種超のＮＧＦを含み得ることは理解される。例えば、ある組成物は、ある
クラスのＮＧＦアンタゴニストの１種超のメンバー（例えば、ＮＧＦの異なるエピトープ
を認識する抗ＮＧＦ抗体の混合物）、ならびにＮＧＦアンタゴニストの異なるクラスのメ
ンバー（例えば、抗ＮＧＦ抗体およびＮＧＦ阻害化合物）を含み得る。組成物の他の例は
、同じエピトープを認識する１種超の抗ＮＧＦ抗体、ＮＧＦの異なるエピトープに結合す
る異なる種の抗ＮＧＦ抗体、または異なるＮＧＦ阻害化合物を含む。
本発明に用いられる組成物は、凍結乾燥処方物または水溶液の形態において、薬学的に
受容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤をさらに含み得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：
Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２０
版（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ編、Ｋ．
Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ）。受容可能なキャリア、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与
量および濃度において、レシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、お
よび他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；保存剤
（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザ
ルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコールまたはベン
ジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン類；カ
テコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレソ
ールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、ま
たは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親和性ポリマー；グ
リシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミ
ノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストランなどの単糖類、二糖類、および他の
炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまた
はソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えばＺｎ
−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標
）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含み得る。薬
学的に受容可能な賦形剤は、本明細書にさらに記載されている。
ＮＧＦアンタゴニストおよびその組成物は、該薬剤の有効性を増強および／または補足
するために役立つ他の薬剤と関連させて用いることもできる。いくつかの実施形態におい
て、他の薬剤はオピオイド鎮痛剤である。いくつかの実施形態において、他の薬剤はＮＳ
ＡＩＤである。いくつかの実施形態において、これらの薬剤はオピオイド鎮痛剤ではない
。いくつかの実施形態において、これらの薬剤はＮＳＡＩＤではない。
（キット）
本発明は、当該方法にしようするためのキットもまた提供する。本発明のキットは、Ｎ
ＧＦアンタゴニスト（抗体など、例えば、本明細書に記載されたヒト化抗体Ｅ３）を含む
１つ以上の容器を含み、いくつかの実施形態においては、本明細書に記載された本発明の
方法のいずれかに従った使用説明書をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ
アンタゴニストは、本明細書に記載されたいずれかのＮＧＦアンタゴニストである。さら
に他の実施形態において、該キットは、ＴｒｋＡイムノアドヘシンではない（すなわち、
ＴｒｋＡイムノアドヘシン以外の）ＮＧＦアンタゴニストを含む。他の実施形態において
、該キットは、抗ＮＧＦ抗体以外のＮＧＦアンタゴニストを含む。さらに他の実施形態に
おいて、該キットは、ＴｒｋＡイムノアドヘシン以外であり、かつ抗ＮＧＦ抗体以外であ
るいずれかのＮＧＦアンタゴニストを含む。いくつかの実施形態において、該キットは、
抗ＮＧＦ抗体（本明細書に記載された抗体Ｅ３など）を含む。他の実施形態において、該
キットは、抗体Ｅ３の１つ以上のＣＤＲ（Ｅ３の１つ、２つ、３つ、４つ、５つのＣＤＲ
ｓ、またはいくつかの実施形態においては、６つ全てのＣＤＲｓなど）を含む抗ＮＧＦ抗
体を含む。いくつかの実施形態において、該キットは、オピオイド鎮痛剤を含む。いくつ


かの実施形態において、該キットは、ＮＳＡＩＤを含む。いくつかの実施形態において、
該キットは、オピオイド鎮痛剤を含まない。いくつかの実施形態において、該キットは、
ＮＳＡＩＤを含まない。いくつかの実施形態において、含まれる説明書は、本明細書に記
載された方法のいずれかに従って、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛を処置、
改善または予防するためのＮＧＦアンタゴニストの投与についての説明を含む。該キット
は個体が、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛を有するかどうか、または、骨転
移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛の危険にあるかどうかの確認に基づいた処置に適
切な個体の選択についての説明をさらに含む。さらに他の実施形態において、該説明書は
、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛を処置、予防および／または改善するため
のＮＧＦアンタゴニストの投与についての説明を含む。さらに他の実施形態において、該
説明書は、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛の危険にある個体に対するＮＧＦ
アンタゴニストの投与についての説明を含む。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアン
タゴニストは、オピオイド鎮痛剤と同時投与される。いくつかの実施形態において、ＮＧ
Ｆアンタゴニストは、ＮＳＡＩＤと同時投与される。いくつかの実施形態において、ＮＧ
Ｆアンタゴニストは、オピオイド鎮痛剤およびＮＳＡＩＤと同時投与される。いくつかの
実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、オピオイド鎮痛剤と同時投与されない。い
くつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、ＮＳＡＩＤと同時投与されない。
ＮＧＦアンタゴニストの使用法に関する該説明書は、一般に、意図される処置のための
投与量、投与スケジュール、および投与経路についての情報を含む。該容器は、単位用量
、バルクパッケージ（田尾、多用量パッケージ）またはサブ単位用量であり得る。本発明
のキットに供される説明書は、典型的には、ラベル上の書面による説明書であるか、また
は添付文書（例えば、キットに含まれたシート紙）であるが、機械読み取り用の説明書（
例えば、磁気または光メモリディスク上に設けられた説明書）もまた許容できる
該ラベルまたは添付書は、該組成物が、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼痛を
処置、改善および／または予防するために使用されることを示す。説明書は、本明細書に
記載されたいずれかの方法を実践するために提供できる。
本発明のキットは、適切なパッケージ中にある。適切なパッケージとしては、限定はし
ないが、バイアル、ボトル、広口瓶、柔軟性パッケージ（例えば、密封マイラーまたはプ
ラスチックバッグ）などが挙げられる。また、吸入器、鼻腔投与装置（例えば噴霧器）ま
たはミニポンプなどの注入装置など、特定の装置と組み合わせて使用されるパッケージも
考えられる。キットは、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、外容器は、静脈内液体
用バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであり得る）。キット
は、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、外容器は、静脈内液体用バッグまたは皮下
注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであり得る）。該組成物中の少なくとも１
つの活性剤は、抗ＮＧＦ抗体などのＮＧＦアンタゴニストである。該容器は、第２の薬学
的に活性な薬剤をさらに含み得る。
キットは、緩衝剤および解釈情報などのさらなる成分を任意に提供できる。通常、該キ
ットは、容器、ならびに該容器上の、またはそれと結合させた、ラベルまたは添付文書を
含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、上記のキット内容物を含む製造品を提供する
。いくつかの実施形態において、該キットは、骨転移に関連した癌の疼痛などの骨癌の疼
痛を処置するための使用法を示す情報と共に、ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦ抗体など
）を含む。
（ＮＧＦアンタゴニストの投与および処置の評価）
ＮＧＦアンタゴニストは、任意の適切な経路を介して、個体に投与できる。例えばＮＧ
Ｆアンタゴニストは、経口、静脈内、舌下、皮下、動脈内、滑膜内、嚢内（経膀胱など）
、筋肉内、心臓内、胸腔内、腹腔内、心室内、舌下に、吸入により、座薬により、および
経皮に投与できる。それらは、例えば、当該分野で認められる方法で調製された錠剤、ト
ローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤、ロリポップ剤、
チューインガムなどの形態で、経口投与できる。本明細書に記載された例は、限定する意
図はなく、利用できる方法を例示するものである。
したがって、いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体などのＮＧＦアンタゴニスト
は、静脈内投与、例えば、ボーラスとして、または、ある期間にわたる連続的注入による
静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、滑膜内、髄腔内、経口、吸入ま
たは局所経路によるなど、公知の方法によって、個体に投与される。液体処方物用に、噴
射ネブライザーおよび超音波ネブライザーなどの市販のネブライザーが、投与に有用であ
る。液体処方物は直接噴霧でき、凍結乾燥粉末は、再構成の後に噴霧できる。あるいは、
ＮＧＦアンタゴニストは、炭化フッ素処方物および用量計量吸入器を用いてエアロゾル化
できるか、または凍結乾燥粉末および磨砕粉末として吸入できる。
一実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、部位特異的または標的化局部送達法に
よって投与される。部位特異的または標的化局部送達法の例としては、ＮＧＦアンタゴニ
ストの種々の移植可能なデポー源または注入カテーテル、留置カテーテル、または針カテ
ーテルなどの局部送達カテーテル、合成移植片、外膜ラップ、シャントおよびステントま
たは他の移植可能な装置、部位特異的キャリア、直接注入、または直接塗布が挙げられる
。例えば国際公開ＰＣＴ第００／５３２１１号および米国特許第５，９８１，５６８号を
参照されたい。
ＮＧＦアンタゴニスト（抗ＮＧＦ抗体など）の種々の処方物を投与に使用できる。いく
つかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストはニートで投与できる。いくつかの実施
形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、抗ＮＧＦ抗体を含んでなり、薬学的に受容可能
な賦形剤を含む処方物などの種々の処方物においてあり得る。薬学的に受容可能な賦形剤
は、当該分野に知られており、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な
物質である。例えば賦形剤は、形態または稠度を付与できるか、または希釈剤として働く
。適切な賦形剤としては、限定はしないが、安定化剤、湿潤および乳化剤、種々の浸透圧
用の塩、カプセル化剤、緩衝剤、および皮膚浸透増強剤が挙げられる。賦形剤ならびに非
経口および経口薬物送達用処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａ
ｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ（２０００）に記載されている。
いくつかの実施形態において、これらの薬剤は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下
、筋肉内）による投与用に処方される。したがって、これらの薬剤は、生理食塩水、リン
ガー液、デキストロース液などの薬学的に受容可能なビヒクルと組み合わせることができ
る。具体的な投与法、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、具体的な個体およびそ
の個体の病歴に依存する。
抗ＮＧＦ抗体は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）によるなど、適
切な任意の方法を用いて投与できる。抗ＮＧＦ抗体は、本明細書に記載されているように
、吸入によっても投与できる。一般に、抗ＮＧＦ抗体の投与に関しては、最初の候補用量
は、約２ｍｇ／ｋｇであり得る。本発明の目的に関し、典型的な１日の用量は、上記の因
子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇから３μｇ／ｋｇから３０μｇ／ｋｇから３００μｇ
／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇ、から３０ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範
囲であり得る。数日間またはそれ以上にわたる反復投与に関しては、条件に依存して、処
置は、所望の症状抑制が生じるまで、または骨転移に関連した癌の疼痛を減少させるため
に、十分な処置レベルが達成されるまで、処置が持続される。投与法の一例は、抗ＮＧＦ
抗体の約２ｍｇ／ｋｇの開始用量投与後に、約１ｍｇ／ｋｇの週１回の維持用量の投与、
または、約１ｍｇ／ｋｇの隔週の維持用量の投与を含む。しかし、実践者が達成を望む薬
物動態減衰パターンに依り、他の投与法も有用であり得る。例えば、週１回〜４回の投与
が考慮される。いくつかの実施形態において、約３μｇ／ｍｇから約２ｍｇ／ｋｇの範囲
（約３μｇ／ｍｇ、約１０μｇ／ｍｇ、約３０μｇ／ｍｇ、約１００μｇ／ｍｇ、約３０
０μｇ／ｍｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、および約２ｍｇ／ｋｇなど）の投与が使用できる。いく
つかの実施形態において、投与回数は、１週間に１回、２週間に１回、４週間に１回、５
週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、または１０週
間に１回；あるいは、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、またはより多い月数
に１回である。この療法の進行は、従来の方法およびアッセイにより容易にモニターでき
る。該投与法（使用されるＮＧＦアンタゴニストを含む）は、経時的に変化し得る。
一般に、ＮＧＦアンタゴニストが抗体でない場合、それは、約０．１ｍｇ／ｋｇから３
００ｍｇ／ｋｇ患者体重を１回から３回投与に分割する割合で（いくつかの実施形態にお
いて）、または本明細書に開示されているとおりに投与できる。いくつかの実施形態にお
いて、通常体重の成人患者に対して、約０．３ｍｇ／ｋｇから５．００ｍｇ／ｋｇの範囲
の用量を投与できる。具体的な投与法、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、具体
的な個体およびその個体の病歴、ならびに個々の薬剤の性質（薬剤の半減期、ならびに当
該分野に周知の他の考慮事項など）に依存する。
本発明の目的に関し、ＮＧＦアンタゴニストの適切な用量は、使用されるＮＧＦアンタ
ゴニスト（またはその組成物）、処置する疼痛のタイプおよび重症度、該薬剤の投与が予
防目的か処置目的か、以前の療法、患者の臨床暦および該薬剤に対する応答、ならびに担
当医の裁量に依存する。典型的には、臨床医は、抗ＮＧＦ抗体などのＮＧＦアンタゴニス
トを、所望の結果に達する用量になるまで投与する。
半減期などの経験的な考慮事項が、一般に用量の決定に寄与する。抗体の半減期を延長
させるため、および抗体を宿主の免疫系による攻撃から防ぐために、例えば、ヒト化抗体
または完全ヒト抗体などの、ヒトの免疫系に適合性の抗体が使用できる。投与回数は、処
置過程にわたって決定でき、調整でき、一般に、疼痛の処置および／または抑制および／
または軽減および／または遅延に基づくが、必ずしもそうではない。あるいは、抗ＮＧＦ
抗体の持続的な連続放出処方物が適切であり得る。持続放出達成のための種々の処方物が
当該分野に公知である。
一実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストの用量は、ＮＧＦアンタゴニスト（抗体な
ど）の１回または複数回投与を受けている個体において、経験的に決定できる。個体は、
ＮＧＦアンタゴニスト、例えば抗体の漸増用量を投与される。その後、ＮＧＦアンタゴニ
ストの有効性を評価するために、疼痛の指標があり得る。
本発明における方法によるＮＧＦアンタゴニストの投与は、例えば、レシピエントの生
理学的条件、処置の目的が処置であるか予防であるか、および当該分野の実践者に公知の
他の因子に依って、連続的または間欠的であり得る。ＮＧＦアンタゴニストの投与は（例
えば、ＮＧＦアンタゴニストが抗ＮＧＦ抗体である場合）、例えば、疼痛の発現前、発現
時、または発現後のいずれか；発現前；発現時；発現前および発現後；発現時および発現
後；発現前および発現時；または発現前、発現時、および発現後に、前選択された期間に
わたって、本質的に連続的であり得るか、または一連の間隔を空けた投与であり得る。投
与は、骨への癌の転移、ならびに骨転移に関連した癌の疼痛に生じがちな他の事象の前、
その時および／または後であり得る。
いくつかの実施形態において、１種超の抗体などのＮＧＦアンタゴニストが存在し得る
。アンタゴニストは、互いに同一または異なるものであり得る。少なくとも１種、２種、
３種、４種、５種の異なるＮＧＦアンタゴニストが存在し得る。一般に、それらのＮＧＦ
アンタゴニストは、互いに有害な影響を及ぼさない補完的活性を有する。ＮＧＦアンタゴ
ニストはまた、該薬剤の有効性を増強および／または補完する上で役立つ他の薬剤と関連
させて使用することもできる。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニストは、
オピオイド鎮痛剤と同時投与されない。いくつかの実施形態において、ＮＧＦアンタゴニ
ストは、ＮＳＡＩＤと同時投与されない。
本発明に従って用いられるＮＧＦアンタゴニスト（抗体など）の処置用処方物は、所望の
純度を有する抗体を、任意の薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤と共に
混合することによって、（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒ
ａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ第２０版、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０
００））凍結乾燥処方物または水溶液の形態で保存用に調製される。受容可能なキャリア
、賦形剤または安定化剤は、使用される用量および濃度において、レシピエントに対して
非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸
およびメチオニンなどの抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニ
ウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール
アルコール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピ
ルパラベンなどのアルキルパラベン類；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノー
ル；３−ペンタノール；およびｍ−クレソールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリ
ペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビ
ニルピロリドンなどの親和性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジ
ン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキス
トランなどの単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スク
ロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの
塩形成対イオン；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥ
ＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）な
どの非イオン性界面活性剤を含み得る。
ＮＧＦアンタゴニスト（抗体など）を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：３６８８頁（１９８５）；Ｈｗａｎｇ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４０３０頁（１９８０）；な
らびに米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載されている
方法など、当該分野で公知の方法によって調製される。循環時間を増加させたリポソーム
が、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホス
ファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノールアミン（
ＰＥＧ−ＰＥ）を用いて、逆相蒸着法によって生成させることができる。リポソームを、
一定の孔径のフィルターを通して押し出し、所望の径を有するリポソームを得る。
また、該活性成分は、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロス
フェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエ
マルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション法により、または界面重合により調製
されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチ
ンのマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに捕捉する
こともできる。このような方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎ
ｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ（２０００）に開示されている。
持続放出製剤を調製できる。持続放出製剤の適切な例としては、該抗体を含有する固体
疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられ、該マトリクスは、形状化した製品、例
えば、薄膜、またはマイクロカプセルの形態にある。持続放出マトリクスの例としては、
ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、
またはポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）
、Ｌ−グルタミン酸と７エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレンビ
ニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーお
よび酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸
コポリマー、スクロースアセテートイソブチレート、およびポリ−Ｄ−（−）−３−酪酸
が挙げられる。
インビトロ投与に用いられる処方物は、無菌でなければならない。これは、例えば、滅
菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。処置用抗ＮＧＦ抗体組成物は、一般に、
滅菌アクセスポート、例えば、静脈内液剤バッグまたは皮下注射針によって貫通可能な栓
を有するバイアルを有する容器内に入れられる。
本発明による組成物は、経口、非経口または経直腸投与用に、または吸入または吹入に
よる投与用に、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤または懸濁剤、もしくは座
剤などの単位投与形態においてあり得る。
錠剤などの固体組成物を調製するには、主となる活性成分を製薬的キャリア、例えば、
トウモロコシ澱粉、乳糖、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリ
ン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはゴム類などの慣例的な錠剤化成分、および
他の製薬的希釈剤、例えば、水と混合し、本発明の化合物、または非毒性で薬学的に受容
可能なその塩の均一な混合物を含有する固体予備処方組成物を形成する。これらの予備処
方組成物が均一であるという場合は、該活性成分が該組成物中に均一に分散しているため
、該組成物を、錠剤、丸剤およびカプセル剤などの有効性の等しい単位投与形態へと、容
易に細分割できることを意味する。次に、この固体予備処方組成物を、本発明の活性成分
の０．１ｍｇから約５００ｍｇを含有する上記タイプの単位投与形態へと細分割する。該
新規組成物の錠剤または丸剤は、作用持続の利益を与える投与形態を提供するために、コ
ーティングできるか、そうでなければ、調合できる。例えば、錠剤または丸剤は、内側投
与成分および外側投与成分を含んでなり得、後者は前者上の外層の形態である。これら２
つの成分は、胃内での崩壊抵抗に役立ち、内側成分が損なわれずに通過して十二指腸内に
至るか、または放出を遅らせることを可能にする腸溶層によって分離することができる。
このような腸溶層またはコーティング用には種々の材料が使用でき、このような材料とし
ては、多数の酸重合体ならびに酸重合体とシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セル
ロースなどの材料との混合物が挙げられる。
適切な界面活性剤としては、特に、ポリオキシエチレンソルビタン類（例えば、Ｔｗｅ
ｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン類（例えば、Ｓ
ｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）などの非イオン性試薬が挙げられる
。界面活性剤を有する組成物は、０．０５％と５％との間の界面活性剤を含むことが便利
であり、０．１％と２．５％との間であり得る。必要ならば、他の成分、例えば、マンニ
トールまたは他の薬学的に受容可能なビヒクルを添加し得ることは理解されるであろう。
Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商
標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）などの市販の
脂肪エマルジョンを用いて、適切なエマルジョンを調製できる。該活性成分は、前混合し
たエマルジョン組成物に溶解させ得るか、あるいは、油（例えば、大豆油、ヒマワリ油、
綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油またはアーモンド油）に溶解させ、リン脂質（例えば、
卵リン脂質、大豆リン脂質または大豆レシチン）および水との混合時にエマルジョンを形
成できる。該エマルジョンの張度を調整するために、他の成分、例えば、グリセロールま
たはグルコースを添加できることは理解されよう。適切なエマルジョンは、典型的には、
２０％まで、例えば、５％と２０％との間の油を含有する。該脂肪エマルジョンは、０．
１μｍと１．０μｍとの間、特に、０．１μｍと０．５μｍとの間の脂肪小滴を含んでな
り得、５．５から８．０の範囲のｐＨを有する。
該エマルジョン組成物は、神経成長因子アンタゴニストを、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商
標）またはその成分（大豆油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することによ
って調製されるものであり得る。
吸入または吹入れ用の組成物としては、薬学的に受容可能な水性溶媒または有機溶媒、
またはそれらの混合物中の液剤または懸濁剤、ならびに粉剤が挙げられる。該液体組成物
または固体組成物は、上記の薬学的に受容可能な適切な賦形剤を含有し得る。いくつかの
実施形態において、該組成物は、局部的効果または全身的効果を目的として、経口または
鼻呼吸器経路により投与される。薬学的に受容可能な完全滅菌溶媒中の組成物は、気体の
使用により、噴霧化できる。噴霧化液剤は、噴霧化装置から直接吸い込むことができるか
、または噴霧化装置をフェイスマスク、テントまたは断続的正圧呼吸装置に取り付けるこ
とができる。液剤、懸濁剤または粉剤の組成物は、該処方物を適切な様式で送達する装置
から、好ましくは経口または経鼻腔で投与できる。
処置有効性は、当該分野に周知の方法によって評価することができる。
以下の実施例は、例示のために提供されるものであり、本発明を限定するものではない
。
（実施例１）
（抗ＮＧＦモノクローナル抗体は、骨転移に関連した癌の疼痛の処置に有効である）
我々は、抗ＮＧＦ抗体９１１（マウスモノクローナル抗体；Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａ１９：２１５−２２７頁（２０００））による処置の有効性を評価するために、
マウス骨癌の疼痛モデルを用いた。骨癌の疼痛のマウスモデルは、溶骨性肉腫細胞を、マ
ウスの大腿骨に髄内注入することによって発現させ、次いで、腫瘍を骨に限定するために
、針穴に歯科用アマルガムを充填した。Ｓｃｈｗｅｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ
１９：１０８８６−１０８９７頁（１９９９）；およびＬｕｇｅｒら、Ｐａｉｎ９９：３
９７−４０６頁（２００２）を参照されたい。実験は、成体オスＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メイン州、バールハーバー）に対して実施
した。０日目に、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．）
）による全身麻酔誘導後、関節切開術を実施した。肉腫細胞用の通路を創製するために、
髄管内に針を挿入した。次いで、歯科用空気圧高速ハンドピースを用いてくぼみを作製し
た。無処置マウス（ｎ＝５）に加えて、α−最少必須培地（２０μｌ、Ｓｉｇｍａ、ミズ
ーリ州、セントルイス）を、大腿骨の髄内腔に注入することによって偽処置マウス（ｎ＝
５）を創製し（偽処置と称する）、一方、肉腫マウス（各試験条件についてｎ＝５）には
、１０５２４７２の溶骨性肉腫細胞を含有する培地を注入した（肉腫またはｓａｒｃと称
する）（２０μｌ、ＡＴＣＣ、メリーランド州、ロックビル）。全てのマウスについて、
該細胞または注入培地を髄内腔内に限定するために、注入部位を歯科用アマルガムプラグ
で密封した後、滅菌水（低張性溶液）で潅注した。最後に、創傷クリップにより切開閉鎖
を達成した。行動試験を妨げないように、５日目にクリップを除去した。肉腫注入マウス
の第２群は、６日目と１３日目に抗ＮＧＦ（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）によって処置した
。
行動分析。マウスを、腫瘍移植後、１０日目および１４日目に、疼痛関連行動に関して
試験した。以下の試験を用いて、マウスの行動を試験した：進行中の疼痛（自発的な防御
およびすくみ（ｆｌｉｎｃｈｉｎｇ））；歩行痛（四肢使用およびロータロッド）、およ
び運動誘発痛（触診誘発防御および触診誘発すくみ）。マウスを、金網の底面を有する透
明なプラスチック観察箱に入れ、３０分間、慣らした。馴化後、自発的防御、自発的すく
み、開放場所での通常歩行時の四肢使用、および強制歩行時の防御を評価した。肉腫マウ
スおよび偽処置マウスにおいて、遠位大腿を、２分間、通常の非侵害的触診をした後、触
診に誘発された防御およびすくみを測定した。
自発的すくみの回数および時間消費防御、侵害行動の典型を、２分間の観察時間中、同
時に記録した。防御は、後肢が上方に保持された時と定義し、歩行およびすくみは、マウ
スが後肢を上方に保持した回数と定義した。
自発的歩行時の通常の四肢使用を、５から０の段階でスコア化した：（５）通常使用、
および（０）四肢使用の完全欠如。
強制歩行防御は、ロータロッド（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、オハイ
オ州コランバス）を用いて判定した。ロータロッド装置は、回転ロッドであり、速度、加
速、および感度調節を備えている。マウスを速度Ｘ４、加速８．０、および感度２．５の
該ロッド上に置いた。強制歩行防御を、５〜０の段階で評価した：（５）通常使用、およ
び（０）完全な使用欠如。
２分間、毎秒ごとにマウスの遠位大腿の通常の非侵害的触診をした後、該マウスを観察
箱に入れ、それらの触診誘発防御および触診誘発すくみを、さらに２分間測定した。
抗ＮＧＦ抗体による処置。６日目と１３日目に、肉腫注入マウスに、１０ｍｇ／ｋｇの
抗ＮＧＦ抗体９１１を腹腔内注入した（肉腫＋抗ＮＧＦ、ｎ＝５）、あるいは、肉腫およ
び偽処置注入マウスに、生理食塩水を注入した（腹腔内）（偽処置＋ビヒクルまたは肉腫
＋ビヒクル、各条件につきｎ＝５）。動物全てを１０日目および１４日目に行動分析した
。
進行中の疼痛行動の評価。図１に示されるとおり、肉腫注入マウスは、偽処置注入マウ
ス（生理食塩水を投与）に比較して、自発的防御および自発的すくみによって評価した進
行中の疼痛行動を発現させた（双方ともｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）。図１はまた、抗Ｎ
ＧＦ抗体９１１の腹腔内投与が、肉腫注入マウスに対する生理食塩水投与に比較して、肉
腫移植後１０日目および１４日目に、肉腫注入マウスにおける自発的防御および自発的す
くみを有意に減少させたことを示している（自発的防御および自発的すくみの双方に関し
て、ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）。これらの結果は、抗ＮＧＦ抗体９１１が、肉腫注入マ
ウスにおける進行中の疼痛を減少させることを示している。
歩行痛行動の評価。図２に示されるとおり、肉腫注入マウス（生理食塩水を投与）は、
偽処置注入マウス（生理食塩水を投与）に比較して、四肢使用および強制歩行防御（ロー
タロッド）によって評価した歩行痛行動を発現させた（双方ともｐ＜０．０５、ＡＮＯＶ
Ａ）。図２はまた、抗ＮＧＦ抗体９１１の腹腔内投与が、肉腫注入マウスに対する生理食
塩水投与に比較して、肉腫移植後１０日目および１４日目に、肉腫注入マウスにおける四
肢使用スコアおよび強制歩行防御スコアを有意に増加させたこと（正常に近く）を示して
いる（四肢使用および強制歩行防御の双方に関して、ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）。これ
らの結果は、抗ＮＧＦ抗体９１１が、肉腫注入マウスにおける歩行痛を減少させることを
示している。
触診誘発行動の評価。図３に示されるとおり、肉腫注入マウス（生理食塩水を投与）は
、偽処置注入マウス（生理食塩水を投与）に比較して、触診誘発防御および触診誘発すく
みによって評価した触診誘発痛行動を発現させた（双方ともｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）
。図３はまた、抗ＮＧＦ抗体９１１の腹腔内投与が、肉腫注入マウスに対する生理食塩水
投与に比較して、肉腫移植後１０日目および１４日目に、肉腫注入マウスにおける触診誘
発防御および触診誘発すくみを有意に減少させたことを示している（触診誘発防御および
触診誘発すくみの双方に関して、ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）。これらの結果は、抗ＮＧ
Ｆ抗体９１１が、肉腫注入マウスにおける触診誘発痛を減少させることを示している。
（実施例２）
（抗ＮＧＦモノクローナル抗体は、骨癌の疼痛の処置に有効であり、背側根神経節およ
び脊髄における末梢および中枢感作に関連したいくつかの神経化学的変化を減少させる）
（方法）
動物。体重２０〜２５ｇの合計１５８匹の成体オスＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（Ｊａｃｋｓ
ｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メイン州、バールハーバー）で実験を行った。マウス
は、明暗１２時間交代サイクルで、２２℃に維持され、加熱滅菌した食餌と水を自由に与
えられる加熱滅菌ケージ内で、特定病原体除去（ＳＰＦ）条件下、アメリカ国立衛生研究
所の指針に従って収容した。
培養および腫瘍細胞の注入。溶骨性マウス肉腫細胞を入手し（ＮＣＴＣ２４７２、ＡＴ
ＣＣ、メリーランド州、ロックビル）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を安定にトランス
フェクトし、先に、Ｓａｂｉｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：７３４３−７３４９
頁（２００２）に記載されたとおり維持した。
先に記載されたとおり、腫瘍細胞の注入を行った。Ｈｏｎｏｒｅら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．
６：５２１−５２８頁（２０００）；Ｈｏｎｏｒｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ９８：
５８５−５９８頁（２０００）；Ｌｕｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ６１：
４０３８−４０４７頁（２００１）。簡略に述べると、ペントバルビタールナトリウム（
５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）による全身麻酔誘導後、遠位大腿骨の関節顆を露出させて関節
切開を行った。ハンク緩衝滅菌生理食塩水（ＨＢＳＳ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社
、ミズーリ州、セントルイス；２０μｌ；偽処置、ｎ＝４０）またはビヒクルを含有する
１０５溶骨性マウス肉腫細胞（２０μｌ、ＮＣＴＣ２４７２、ＡＴＣＣ、メリーランド州
ロックビル；肉腫、ｎ＝９０）を、マウス大腿骨の髄内腔内に注入し、注入部位を歯科用
アマルガム（Ｄｅｎｔｓｐｌｙ、デラウェア州ミルフォード）で密封した後、滅菌濾過水
で潅流した。１４日目をエンドポイントとして用いた。この時点は、腫瘍がまだ骨に限定
され、癌に関連する疼痛行動の最大提示および末梢および中枢感作の神経化学的変化の発
現に最大変化がある時点だからである。無処置マウスは、行動的、神経化学的または組織
学的な違いがなかったため、神経化学的変化および骨組織学の対照解析には、偽処置マウ
スを用いた。
抗ＮＧＦ抗体による処置。疼痛関連行動、神経化学的変化、腫瘍成長および骨破壊に及
ぼす抗ＮＧＦ抗体処置の効果を評価するために、骨破壊の開始が認められる注入後６日目
に、抗ＮＧＦ抗体（Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１９：２１５−２２７（２０００
）に記載されたｍＡｂ９１１）の投与を開始し、顕著な骨破壊および疼痛行動が認められ
る注入後１４日目に、投与を終了させた。現行試験にもちいられた用量は、無処置マウス
に、感覚鈍麻などの有害作用を引き起こさなかった。該マウスの全身的健康状態をモニタ
ーするために実験の開始時と終了時に体重を記録した。
マウスは、毎週、滅菌生理食塩水（偽処置＋ビヒクル：ｎ＝２８；肉腫＋ビヒクル：ｎ
＝３５；１．４μｌ／ｇ／５日ごと、腹腔内）または抗ＮＧＦ抗体（偽処置＋抗ＮＧＦ抗
体；ｎ＝４；肉腫＋抗ＮＧＦ抗体：ｎ＝２３、１０ｍｇ／ｋｇ／５日ごと、腹腔内）のい
ずれかを受ける処置群に、無作為に配置した。硫酸モルヒネに対する抗ＮＧＦ抗体の行動
比較のため、マウスに、行動試験の１５分前、１用量のモルヒネを投与した（無処置：ｎ
＝６；偽処置＋ビヒクル：ｎ＝８；肉腫＋ビヒクル：ｎ＝８；肉腫＋抗ＮＧＦ：ｎ＝８；
肉腫＋モルヒネ１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内：ｎ＝８；肉腫＋モルヒネ３０ｍｇ／ｋｇ、腹腔
内：ｎ＝８）。熱的および機械的感受性試験および後肢の皮膚神経支配評価のため、マウ
スを、毎週、２週間にわたり、生理食塩水（無処置＋ビヒクル：ｎ＝１１）または抗ＮＧ
Ｆ抗体（無処置＋抗ＮＧＦ抗体：ｎ＝１１、１０ｍｇ／ｋｇ／５日ごと、腹腔内）のいず
れかを受ける処置群に分けた。
抗ＮＧＦ抗体の特性化。ＮＧＦアンタゴニスト抗体（ｍＡｂ９１１）は、ＴｒｋＡレセ
プターおよびｐ７５レセプターに対するＮＧＦの結合遮断ならびにＴｒｋＡの自己リン酸
化の阻害および背側根神経節感覚ニューロンのＮＧＦ依存性生存の阻害に効果的である。
Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１９：２１５−２２７（２０００）。
安楽死および組織の処理。マウスを腫瘍注入後１４日目に殺処理し、組織を、脊髄、先
に記載した背側根神経節（ＤＲＧ）および後肢皮膚の免疫組織化学的分析のために処理し
た。Ｈｏｎｏｒｅら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：５２１−５２８頁（２０００）；Ｌｕｇｅｒ
ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ６１：４０３８−４０４７（２００１）。簡略に述
べると、マウスは、ｃ−Ｆｏｓ発現誘導のため、安楽死の１．５時間前に注入膝の通常の
非侵害的機械的刺激を受けた。Ｈｏｎｏｒｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ９８：５８５
−５９８頁（２０００）；Ｈｕｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ３２８：６３２−６３４頁（１９８
７）。この操作の後、ＣＯ２でマウスを安楽死させ、０．１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（
ＰＢＳ）１２ｍｌ、続いて４％ホルムアルデヒド／１２．５％ピクリン酸溶液２５ｍｌで
心臓内潅流させた。
脊髄セグメント（Ｌ２〜Ｌ４）、ＤＲＧ（Ｌ１〜Ｌ５）および足底皮膚を除去し、潅流
固定剤中で後固定し、３０％スクロース中、２４時間、凍結保護した。連続凍結した脊髄
および皮膚の切片を、滑走式ミクロトーム上で６０μｍの厚さに切断し、ＰＢＳ中に採集
し、自由浮動切片として処理した。連続ＤＲＧ切片を、クリオスタット上で１５μｍの厚
さに切断し、処理のため、ゼラチンコーティングしたスライドガラス上に解凍定置した。
切片化の後、ＤＲＧ、脊髄および足底皮膚の切片を、ＰＢＳ中で簡単にすすいでから、
ブロッキング液（ＰＢＳ中、３％正常ロバ血清（ＮＤＳ）０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０）中、１時間インキュベートし、引き続き一次抗体中、一晩インキュベートした。脊髄
切片を、ｃ−Ｆｏｓタンパク質（１：２０００、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、
カリフォルニア州サンジエゴ）およびジノルフィン（ポリクローナルモルモット抗ジノル
フィン、１：１，０００、Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ、ミネソタ州ミネアポリス）に関して免疫
染色した。ＤＲＧ切片は、活性化転写因子３（ＡＴＦ−３）（ポリクローナルウサギ抗Ａ
ＴＦ−３、１：５００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリ
フォルニア州サンタクルツ）およびＣＤ６８（ＥＤ−１；ポリクローナルウサギ抗−ＣＤ
６８、１：５，０００、Ｓｅｒｏｔｅｃ、ノースカロライナ州ローリー）に関して免疫染
色した。皮膚切片は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）（１：１５，０００
；Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＯＨ）（ポリ
クローナルウサギ抗ＴＯＨ、１：２，０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメ
クーラ）および神経フィラメントＨ（ＣｌｏｎｅＲＴ９７）（ポリクローナルウサギ抗Ｒ
Ｔ−９７、１：２，５００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメクーラ）に関して
免疫染色した。
一次抗体中でインキュベート後、切片をＰＢＳ中ですすぎ、次いで、二次抗体溶液中、
３時間インキュベートした。Ｃｙ３またはビオチンに結合させた二次抗体（Ｊａｃｋｓｏ
ｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルベニア州、ウェストグローブ）を、それぞ
れ、１：６００または１：５００で使用した。ビオチン結合二次抗体を検出するために：
第２のインキュベーション後、切片をＰＢＳ中ですすぎ、Ｃｙ３結合ストレプトアビジン
（１：４０００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）中で４５分間インキ
ュベートした。一次抗体の特異性を確認するために、対照には、一次抗体欠損または対応
する合成ペプチドによる前吸収を含めた。免疫染色の操作後、脊髄および足底皮膚の切片
を、ゼラチンコーティングしたスライドガラス上に定置した。次いで、皮膚、脊髄および
ＤＲＧの定置切片を、アルコール勾配（７０％、９０％、１００％）において脱水し、キ
シレン中で清浄化し、カバーグラスにＤＰＸ（Ｆｌｕｋａ、スイス国）と共に定置した。
１４日目に、放射線検査後、右（内部対照）および左（腫瘍を有する）大腿骨を、ピク
リン酸および４％ホルマリン中、４℃で一晩固定し、１０％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ、ミズ
ーリ州セントルイス）中、１４日以下の間、脱石灰した。次いで、骨をパラフィンに埋め
込んだ。大腿骨切片を、５μｍの厚さに、側面に切断し、正常な骨髄、腫瘍、破骨細胞お
よびマクロファージの組織学的特徴を視覚化するために、酒石酸耐性アシドホスファター
ゼ（ＴＲＡＰ）ならびにヘマトキシリンおよびエロシン（Ｈ＆Ｅ）により染色した。蛍光
顕微鏡を用いて肉腫細胞を視覚化するため、５μｍ厚さの大腿骨切片を緑色蛍光タンパク
質（ＧＦＰ）に対して増加させた抗体（ウサギ抗ＧＦＰ、１：６，０００、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）によって染色した。ＧＦＰ染色は、先に
、Ｓｅｖｃｉｋら、Ｐａｉｎ１１１：１６９−１８０頁（２００４）に記載されたとおり
、ＴＳＡ−Ｐｌｕｓ Ｃｙａｎｉｎｅ３ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、マサチューセッツ州ボストン）を用いて実施した。
脱石灰し、パラフィンに埋め込んだ１４μｍの連続切片について、偽処置ならびに癌の
大腿骨の免疫組織化学的分析を実施した。Ｃｙ３標識抗体を増幅させるために、Ｔｙｒａ
ｍｉｎｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＳＡ）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ボストン）を用
いた。該切片を、２％過酸化水素中、１時間インキュベートすることにより、内在性ペル
オキシダーゼをクウェンチした。次いで、切片をＰＢＳで１０分間にわたって３回すすぎ
、ＴＳＡブロッキング緩衝液中、１時間ブロックした。ブロッキング緩衝液を除去したら
、一次抗血清を加え、室温で一晩インキュベートした。ポリクローナルウサギ抗カルシト
ニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に対して増加させた抗体（１：１５，０００；Ｓｉ
ｇｍａ）を用いて、第一次導入非ミエリン化および弱ミエリン化感覚神経線維を標識化し
た。切片を、ＴＳＡ洗浄用緩衝液中、１０分間にわたって３回すすぎ、引き続き、ストレ
プトアビジンＨＲＰ（１：４，０００）中、４５分間インキュベートした。次いで、切片
を、ＴＳＡ洗浄用緩衝液中、１０分間にわたって３回すすいだ。ＣＹ３結合チラミン（１
：６００）を、７分間、大腿骨に適用し、ＴＳＡ洗浄用緩衝液で２回、ＰＢＳで１回洗浄
した。最後に、該切片を空気乾燥し、アルコール勾配（７０％、９０％、１００％）によ
って脱水し、キシレン中で清浄化し、ＤＰＸ（Ｆｌｕｋａ）と共に定置した。
骨のＸ線写真解析ならびに破骨細胞およびマクロファージの増殖解析。
骨破壊を視覚的に評価するために、１４日目の時点で、切開した大腿骨のＸ線写真（Ｆａ
ｘｉｔｒｏｎ Ｘｒａｙ社、イリノイ州ウィーリング）を得た。画像は、Ｋｏｄａｋ Ｍ
ｉｎ−Ｒ２０００マンモグラフィーフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ社、ニューヨ
ーク州ロチェスター；露出設定：７秒、２１ｋＶｐ）上で捕捉した。５Ｘの倍率における
骨全体画像の側面において、０から５の段階を用い（０は破壊の徴候の無い正常な骨で、
５は、厚み全体の二層の骨損失）、腫瘍誘発大腿骨破壊の程度を、Ｘ線写真により評価し
た。Ｈｏｎｏｒｅら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：５２１−５２８頁（２０００）；Ｈｏｎｏｒ
ｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ９８：５８５−５９８頁（２０００）；Ｌｕｇｅｒら、
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ６１：４０３８−４０４７頁（２００１）。
破骨細胞および腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭｓ）の増殖を、先に記載したとおり、
ＴＲＡＰ＋破骨細胞の数またはＴＲＡＰ染色大腿骨切片上のＴＡＭｓを数量化することに
より判定した。Ｈｏｎｏｒｅら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：５２１−５２８頁（２０００）；
Ｈｏｎｏｒｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ９８：５８５−５９８頁（２０００）。簡略
に述べると、ＴＲＡＰ＋腫瘍塊全体に自由に多次元的に分散している細胞として、ＴＲＡ
Ｐにより染色された大腿骨切片上の破骨細胞から、ＴＡＭｓは組織学的に区別される。骨
内のマクロファージは、細胞を刺激する腫瘍放出因子によって活性化し、これらの活性化
したＴＡＭｓ細胞の外観は、非常に不規則な表面、多くの膜状仮足および食胞によって特
徴づけられる。破骨細胞は、ＴＲＡＰ＋を現す細胞として組織学的に区別され、骨吸収の
領域に密に関連している。これらの細胞は多核であり、皮質骨および海綿質に沿って見ら
れる。結果は、それぞれ、１ｍｍ当たりの破骨細胞または１ｍｍ２当たりのＴＡＭｓの平
均数として表される。
腫瘍成長の定量化。ＳＰＯＴＩＩデジタルカメラを備えたＮｉｋｏｎＥ６００蛍光顕微
鏡上の黄色５１５長パス発光フィルターを用い、ＳＰＯＴ画像捕捉ソフトウェア（Ｄｉａ
ｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ミシガン州スターリングハイツ）を利用して
ＧＦＰ発現肉腫細胞を含有する大腿骨を画像化した。髄内腔の総面積および腫瘍に占有さ
れた髄内腔のパーセントを、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ｖ３．０ソフトウェア（Ｍ
ｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、メリーランド州シルバースプリング）を用いて算出
した。Ｓａｂｉｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６２：７３４３−７３４９頁（２００２）
；Ｓｅｖｃｉｋら、Ｐａｉｎ１１１：１６９−１８０頁（２００４）。成長速度、骨吸収
の速度および骨癌関連痛行動を誘発する能力などのＧＦＰをトランスフェクトした肉腫細
胞の腫瘍特性は、時間的、行動的および理学的に非トランスフェクト肉腫細胞と同一であ
った。Ｓａｂｉｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６２：７３４３−７３４９頁（２００２）
。
骨内感覚線維の定量化。先に記載したとおり、感覚神経線維の数を判定した。Ｍａｃｈ
ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１１３：１５５−１６６頁（２００２）。簡略に述べると
、３つの骨領域（近位、遠位および骨幹）ならびに３つの骨組織（骨膜、ミネラル化骨お
よび骨髄）において、ＣＧＲＰ陽性骨の数を定量化した。長さが３０μｍ超の神経線維の
みを分析に含めた。マウス１匹当たり６つの切片を分析し、カウントした線維を、骨の総
面積辺りの線維数として表した。
脊髄、背側根神経節および後肢皮膚の定量化
ＭＲＣ１０２４共焦点顕微鏡画像システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ペンシルベニア州、フィラ
デルフィア）、またはＳＰＯＴ画像捕捉ソフトウェア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ社）と共にＯｌｉｍｐｕｓ ＢＸ−６０蛍光顕微鏡上のＳＰＯＴＩＩデジ
タルカメラを用いて、蛍光標識した脊髄、ＤＲＧおよび皮膚組織切片を分析した。
活性化転写因子３（ＡＴＦ−３）を発現しているＤＲＧニューロンの数を、２００Ｘ倍
率で、１ｃｍ２の接眼グリッドを用いてカウントした。標識および非標識ニューロン細胞
体の双方（非標識細胞体は、ローダミンまたはＦＩＴＣフィルターによって検査できる背
景標識を示す）をカウントすることによって、ニューロン（小、中および大）の総数を測
定し、結果は、ＡＴＦ−３免疫活性（ＩＲ）を表すニューロン総数のパーセントとして表
す。ニューロン細胞体の重複カウントを防ぐために、各マーカーにつき、連続切片の４片
ごとにカウントを行った。ＤＲＧにおける活性化または浸潤マクロファージを定量化する
ために、１匹のマウス当たり、最少４片の同側および対側ＤＲＧ切片について、ＳＰＯＴ
カメラグレースケール画像を得て、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓバージョン３．０ソフ
トウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いて分析した。各画像について、
感覚ニューロン細胞体（末梢神経を除く）のみを含有するＤＲＧの領域の輪郭を描いた。
モニターを見ながら、ＤＲＧにおける背景から特異的ＣＤ６８−ＩＲ細胞プロフィルのみ
が区別されるように、輪郭化したグレーレベル密度の上方閾値および下方閾値を設定した
。１切片当たりの細胞プロフィル数が自動的にカウントされた。得られた画像内の輪郭化
された各領域の実際の面積が判定されるように、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓにおいて
、ＳＰＯＴカメラ出力を補正しておいた。ＣＤ６８−ＩＲ細胞プロフィルおよび輪郭化面
積に関する切片の値を、各マウスについてまとめ、結果は１単位面積（ｍｍ２）当たりの
ＣＤ６８−ＩＲ細胞プロフィルの総数として表した。
腰部位Ｌ２〜Ｌ４の脊髄切片において定量化を実施した。これらの脊髄区域がＬ１〜Ｌ
３ＤＲＧから重要な求心性インプットを受け、マウス大腿骨に求心性インプットを提供す
る主要な神経節だからである。Ｅｄｏｆｆら、Ｃｅｌｌ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ２９９：１９３−２００頁（２０００）；Ｍｏｌａｎｄｅｒ Ｃ、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅ
ｕｒｏｌ．２６０：２４６−２５５頁（１９８７）；Ｐｕｉｇｄｅｌｌｉｖｏｌ−Ｓａｎ
ｃｈｅｚ Ａら、ｔｈｅ Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ Ｒｅｃｏｒｄ２６０：１８０−１８８
頁（２０００）；Ｐｕｉｇｄｅｌｌｉｖｏｌ−Ｓａｎｃｈｅｚ Ａら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ
．Ｌｅｔｔ．２５１：１６９−１７２頁（１９９８）。ジノルフィンに関する脊髄切片の
定量化は、マウス１匹当たり４片の無作為選択されたＬ２〜Ｌ４冠状脊髄切片から得られ
た。脊髄ラミナＩＩＩ〜ＩＶにおけるジノルフィン−ＩＲニューロンの数を１００Ｘの倍
率でカウントし、マウス１匹につき、６０μｍのＬ２〜Ｌ４切片当たりのニューロンの平
均数として表した。ｃ−Ｆｏｓ−ＩＲニューロンの数は、マウス１匹当たり８片の無作為
選択されたＬ３／Ｌ４冠状脊髄切片における背側ホーンのラミナＩＩＩ〜ＶＩでカウント
した。ｃ−Ｆｏｓ−ＩＲの検討では、核プロフィルの免疫蛍光閾値を、該組織切片の平均
背景免疫蛍光レベルの３倍に設定した。結果は、１脊髄切片当たりのｃ−Ｆｏｓ−ＩＲニ
ューロンの平均数として示す。
上皮神経支配密度の定量化は、マウス１匹当たり４片の無作為選択された後肢の足底皮
膚切片において実施した。ＣＧＲＰ、ＴＯＨおよびＲＴ−９７ＩＲ神経線維の総数を、２
００Ｘの倍率でカウントした。カウント則は、単一の上皮内線維のみをカウントし、同線
維の複数分枝はカウントしない設定にした。ＭｃＣａｒｔｈｙら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ４
５：１８４８−１８５５頁（１９９５）。定量化した全切片における表皮の全長を、１ｃ
ｍ２の接眼グリッドを用いて測定した。少なくとも２５μｍの長さであって、表面表皮内
へと突出した神経線維のみをカウントした。結果は、マウス１匹につき、１ｍｍ長当たり
の表皮内神経線維の平均数として示す。
行動分析。抗ＮＧＦ処置の有効性を評価するために、疼痛行動が顕著に表れる、偽処置
または腫瘍注入１０日後および１４日後に、骨癌の疼痛関連行動に関してマウスを試験し
た。抗ＮＧＦ処置をモルヒネ（Ｂａｘｔｅｒ、イリノイ州、ディアフィールド）処置と比
較し、マウスが薬物作用の処置ウィンドー内で試験されることを確実にするために、行動
試験の１５分前に投与を行った。Ｈａｓｓｅｌｓｔｏｍら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆
Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ７９：４０−４６（１９９６）。
また、疾患進行の間の疼痛関連行動の減弱化における抗ＮＧＦ処置（１０ｍｇ／ｋｇ／
５日ごと、腹腔内）の有効性を評価するために、腫瘍または偽処置注入８日後、１０日後
、１２日後および１４日後にマウスを試験した。マウスを２分間にわたって観察し、先に
記載したとおり、進行中の、ならびに触診に誘発された骨癌の疼痛行動を分析した。Ｌｕ
ｇｅｒら、Ｐａｉｎ９９：３９７−４０６（２００２）；Ｓａｂｉｎｏら、Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ１０４：５５０−５５８（２００
３）。簡略に述べると、進行中の疼痛の尺度として、後肢のすくみおよび時間消費防御を
記録した。腫瘍を有する四肢を防御または一次停止させる、骨癌を有する臨床設定患者を
、これらの尺度が反映しているからである。我々のモデルにおいて、注入四肢の触診によ
る運動誘発痛を、先に実証された試験を用いて評価した。Ｌｕｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ６１：４０３８−４０４７頁（２００１）；Ｓａｂｉｎｏら、Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ １０４：５５０−５５８頁（２００３）
；Ｓｅｖｃｉｋら、Ｐａｉｎ １１１：１６９−８０頁（２００４）。観察前２分間、動
物が腫瘍または偽処置注入四肢に対す通常の非侵害的触診を受けた触診誘発痛挙動を調べ
た。Ｌｕｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ６１：４０３８−４０４７頁（２０
０１）；Ｓｅｖｃｉｋら、Ｐａｉｎ １１１：１６９−８０頁（２００４）。マウスを２
分間にわたりモニターし、すくみ数および時間消費防御を記録した。触診誘発行動試験は
、骨癌患者が、通常の腫瘍担持四肢の非侵害運動後に疼痛を経験する場合の臨床病態を反
映させるために開発された。
１５分の馴化時間後、熱的および機械的感受性を、無処置動物および無処置＋抗ＮＧＦ
動物において測定して、通常の痛覚閾値応答が、抗ＮＧＦ処置により変化するかどうかを
評価した。熱的感受性は、熱的足刺激装置（サンンディエゴのカリフォルニア大学、カリ
フォルニア州サンンディエゴ）を用いて測定した。無処置動物が、加熱開始凡そ９秒後に
後肢を挙げることによって熱に応答するように放射熱強度を調整した。Ｃｈｏｉら、Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉ．７３：４７１−８５頁（２００３）。各試験の間にこのマウスを回復させ
るために５分間放置した。単独試験は、１後肢当り４回の測定からなり、最長潜伏時間は
除き、残りの３回の測定を平均化した。機械的感受性は、先に実証された方法を用いて測
定した。Ｃｈａｐｌａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５３：５
５−６３頁（１９９４）。Ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ社、イリ
ノイ州ウッドデール）を動物の後肢に適用し、引っ込め閾値を、０．２グラムと１５．１
グラムとの間の等価力で刺激強度を増減させることにより測定した。足が迅速に引っ込め
るかどうか、陽性応答を記述した。
２４７２細胞系におけるＮＧＦのｍＲＮＡレベルのＲＴ ＰＣＲ分析。三重マウス組織
サンプルまたは２４７２肉腫細胞の全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミクロキット（Ｑｕｉａｇ
ｅｎ）を用いて製造元の取扱い説明書に従って調製し、ＲＮＡを、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試
薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて定量化した。ＴａｑＭａｎ Ｇｏｌｄ
ＲＴ−ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて２ステップＲＴ
−ＰＣＲを実施した。該ＲＮＡは、ランダムヘキサマーを用いて逆転写し、ｃＤＮＡは、
ＮＧＦ（ｍｕＮＧＦ−１８７Ｆ；ＧＧＧＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＧＣＴ（配列番号３）、
ｍｕＮＧＦ−２５６Ｒ：ＧＣＧＴＣＣＴＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＴＴ（配列番号４）、ｍｕ
ＮＧＦ−２０８Ｔ：ＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＣＣ（配列番号５
））に特異的なプライマー／プローブセットを用いて増幅した。該サンプルは、ＲＴレベ
ルから二重に分析し、全ＲＮＡインプットに対して正規化した。
統計解析。統計解析を実施するために、ＳＰＳＳ１１版コンピュータ統計パッケージ（
ＳＰＳＳ、イリノイ州シカゴ）を用いた。混合作用の線形回帰モデリングが、反復測定デ
ータを解析するために用いられ、これは、異なる時間間隔で測定された対象の調整ができ
、固定および時間変化双方の共分散を含み、個々の変化率を推定できる。各従属結果の変
数は、ノンパラメトリック分散解析（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）を用いて全群にわ
たって比較した。有意Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ解析に続いて、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔ
ｎｅｙ Ｕ検定を用いて群の対間のノンパラメトリックポストホック比較をした。結果は
、Ｐ＜０．０５で統計的に有意であると考えた。全ての場合、調査者は、各動物の実験状
態に対してブラインド状態であった。
（結果）
抗ＮＧＦの投与は、疾患進行または骨内のマクロファージ進入に対して効果がなかった
。骨破壊、破骨細胞増殖および腫瘍成長に対する抗ＮＧＦの効果を、腫瘍注入後１４日目
に調べた。放射線的ＴＲＡＰおよびＨ＆Ｅ／ＧＦＰ解析により評価されたように、それぞ
れ肉腫注入マウスと比較して、偽処置注入マウスは、有意な骨破壊（骨スコア０．９±０
．４；図４ａ）、破骨細胞増殖（４．６±０．４破骨細胞／ｍｍ）または腫瘍成長（図４
ｄ）を示さなかった。腫瘍＋ビヒクルマウスにおいて、広範囲の骨破壊が観察され、多巣
性放射線透過性（骨スコア０．９±０．４；図４ｂ）、破骨細胞数の著しい増加（４．０
±０．７破骨細胞／ｍｍ）を特徴とし、腫瘍は、髄内腔を完全に満たした（髄内腔の１０
０±０．０％；図４ｅ）。腫瘍注入６日目から１４日目までの抗ＮＧＦによる腫瘍担持マ
ウスの処置は、肉腫＋ビヒクル動物と比較して、骨再吸収において有意な変化を生じず（
３．１±０．６；図４ｃ）、肉腫誘導破骨細胞増殖（３．５±０．１破骨細胞／ｍｍ）ま
たは腫瘍成長（髄内腔の９８．０±０．９％；図４ｆ）を減少させなかった。
腫瘍注入後１４日目に、肉腫＋ビヒクルマウスは、偽処置＋ビヒクル対照マウス（０．
０±０．０ ＴＡＭｓ／ｍｍ２）と比較して、ＴＡＭｓ（３９．８±１２．６ＴＡＭｓ／
ｍｍ２）のアップレギュレーションを示した。肉腫＋ビヒクルマウスに見られるとおり、
肉腫注入マウス（２９．５±７．３ＴＡＭｓ／ｍｍ２）の抗ＮＧＦ処置は、このＴＡＭ侵
入を有意に変化させなかった。
抗ＮＧＦ処置は、骨または皮膚において感覚性または交感神経性神経支配に対して観察
可能な効果はなかった。弱くミエリン化または非ミエリン化ペプチド作動性感覚神経線維
は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に対して増加させた抗体により標識さ
れた。ＣＧＲＰ−ＩＲ神経線維は、無処置＋ビヒクル（１２．２±０．３線維／ｍｍ）お
よび無処置＋抗ＮＧＦ（１３．０±０．８線維／ｍｍ）の動物の骨全体（骨膜、ミネラル
化骨および骨髄）にわたって見られた。
弱くミエリン化または非ミエリン化ペプチド作動性感覚神経線維（ＣＧＲＰ−ＩＲ）、
大型ミエリン化感覚線維（ＲＴ９７−ＩＲ）およびノルアドレナリン作動性交感神経線維
（ＴＯＨ−ＩＲ）は、それぞれＣＧＲＰ、ＲＴ−９７およびＴＯＨに対して増加させた抗
体により、後肢足底皮膚において分析した。肉腫＋ビヒクル（１２．０±０．８線維／ｍ
ｍ）および肉腫＋抗ＮＧＦ（１２．５±０．６線維／ｍｍ）の後肢皮膚サンプルにおいて
ＣＧＲＰ陽性線維の強度または密度の間で有意差はなかった（図５ａおよび５ｂ）。同様
に、無処置＋ビヒクル（図５ｃ、ｎ＝８）マウスと無処置＋抗ＮＧＦ（図５ｄ、ｎ＝８）
マウスとの間のＣＧＲＰ陽性線維の強度または密度において差はなかった。肉腫注入およ
び無処置マウスにおいてＣＧＲＰを発現する神経線維数に変化はなかった（ａ、ｂ対ｃ、
ｄ）。ＲＴ９７陽性線維およびＴＯＨ陽性線維の強度または密度における差もまた、肉腫
＋ビヒクル（７．３±０．７ＲＴ９７＋線維／ｍｍ；３．１±０．７ＴＯＨ線維／ｍｍ）
処置動物および肉腫＋抗ＮＧＦ（７．３±０．７ＲＴ９７＋線維／ｍｍ；３．６±０．７
ＴＯＨ線維／ｍｍ）処置動物において検出できなかった。同様に、無処置＋ビヒクル（１
２．５±０．５線維／ｍｍ）および無処置＋抗ＮＧＦ（１１．９±０．７線維／ｍｍ）の
後肢皮膚サンプルにおいてＣＧＲＰ陽性線維の強度または密度の間で有意差はなかった（
図５ｃおよび５ｄ）。ＲＴ９７陽性線維およびＴＯＨ陽性線維の強度または密度における
差もまた、無処置＋ビヒクル（１０．４±０．７ＲＴ９７＋線維／ｍｍ；３．４±０．４
ＴＯＨ線維／ｍｍ）処置動物および無処置＋抗ＮＧＦ（１１．９±０．７ＲＴ９７＋線維
／ｍｍ；３．０±０．８ＴＯＨ線維／ｍｍ）処置動物において検出できなかった。肉腫＋
ビヒクルと肉腫＋抗ＮＧＦ対無処置＋ビヒクル動物と無処置＋抗ＮＧＦ動物の皮膚サンプ
ルにおけるＣＧＲＰ、ＲＴ９７またはＴＯＨ陽性線維の強度または密度の間で観察可能な
有意差はなかった。
抗ＮＧＦ抗体療法は、骨癌の疼痛行動を有意に軽減した。肉腫＋ビヒクルマウスは、偽
処置＋ビヒクル対照と比較して、より大きな時間消費防御を示した（図６ａ）。さらに肉
腫＋ビヒクルマウスは、偽処置＋ビヒクル対照と比較して、すくみ数の増加を示した（図
６ｂ）。肉腫注入マウスにおいて抗ＮＧＦの投与（６日目から１４日目）は、肉腫＋ビヒ
クルマウスと比較して、有意に自発的防御が減弱した（図６ａ）。抗ＮＧＦ処置はまた、
肉腫注入マウスにおいて自発的すくみを有意に軽減させた（図６ｂ）。
運動誘発痛は、触診誘導応答を測定することにより分析した。肉腫＋ビヒクルマウスは
、偽処置＋ビヒクル対照と比較して、触診後のより大きな時間消費防御を示した（図６ｃ
）。肉腫＋ビヒクルマウスもまた、偽処置＋ビヒクル対照と比較して、すくみ数の増加を
示した（図６ｄ）。肉腫注入マウスにおいて抗ＮＧＦの処置は、触診誘発防御（図６ｃ）
および触診誘発すくみ行為（図６ｄ）の双方を有意に減じた。予備的試験において、ビヒ
クルを受ける偽処置操作動物または抗ＮＧＦ間で、有意な挙動的差異または副作用は観察
されなかった。
腫瘍注入（三角形）後、６日から１４日のＮＧＦ処置（ｎ＝８）は、肉腫＋ビヒクル（
ｎ＝８）（四角形）と比較して１０日目、１２日目および１４日目に進行中のおよび触診
誘発痛行動を有意に減少させ、全てのパラメータに関して１０日目偽処置レベルにまで有
意に減じた（ダイアモンド）ことを図６は示す。全時点で、偽処置＋ビヒクル（ｎ＝８）
は、肉腫＋ビヒクルとは有意に異なる。したがって、抗ＮＧＦ処置（１０ｍｇ／ｋｇ、腹
腔内、５日毎）により、疾患の進行を通して進行中挙動および運動誘発骨癌の疼痛行動の
双方を有意に減弱させた。
抗ＮＧＦ処置は、ベースラインの熱的または機械的閾値に対して影響がなく、骨癌の疼
痛を軽減する上でモルヒンの有効性と同等であった。正常な痛覚閾値と比較して、抗ＮＧ
Ｆ投与により熱的刺激に対する足の引っ込めにおける有意な増加、または機械的刺激の閾
値における有意な増加はなかった。抗ＮＧＦ処置は、無処置＋ビヒクルと比較しての正常
な熱的応答（図７ａ）にも、また無処置＋ビヒクルと比較しての正常な機械的刺激（図７
ｂ）に対しても効果はなかった。
骨癌関連行動を軽減する上で硫酸モルヒン（ＭＳ）の効果を抗ＮＧＦ抗体と比較するた
めに動物を試験した。１０日目および１４日目に行動評価により、肉腫＋ビヒクル動物は
、偽処置＋ビヒクル動物と比較して注入四肢の触診に応答して統計的により長時間の防御
（図７ｃ）および時間防御の増加（図７ｄ）を示すことを明らかにした。抗ＮＧＦ（１０
ｍｇ／ｋｇ／５日毎、腹腔内）または硫酸モルヒン（１０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／
ｋｇ、腹腔内）のいずれの処置によっても、肉腫＋ビヒクルマウスと比較して、腫瘍注入
後１０日目と１４日目に進行中挙動および運動誘発防御挙動の双方を有意に軽減した（図
７ｃ、７ｄ）。抗ＮＧＦ処置により、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇのいずれかモ
ルフィン用量と比較しても、より有効に骨癌関連痛挙動を有意に減弱させた（Ｐ＜０．０
５対肉腫＋抗ＮＧＦ）。
抗ＮＧＦ処置は、ＤＲＧにおける骨癌により誘導された末梢神経変化を調節した。ＡＴ
Ｆ／ＣＲＥＢファミリーである転写因子−３（ＡＴＦ−３）の活性化が、末梢神経傷害の
モデルにおいてアップレギュレートされることが以前に示されている。Ｔｓｕｊｉｎｏら
、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １５：１
７０−８２頁（２０００）。このアップレギュレーションは、感覚および運動ニューロン
細胞本体に見られ、傷害ニューロンを標識することが知られている。偽処置＋ビヒクル（
Ｌ２発現ＡＴＦ−３における全ニューロンのうち１．６±０．５％）と比較して、肉腫注
入大腿骨に同側的なＬ２ＤＲＧにおけるＡＴＦ−３−ＩＲニューロンのパーセンテージが
有意に増加する（Ｌ２発現ＡＴＦ−３における全ニューロンのうち１４．０％±５．９％
；図８ａ）。抗ＮＧＦによる処置により、腫瘍注入１４日後にＡＴＦ−３の発現が有意に
減弱した（Ｌ２発現ＡＴＦ−３における全ニューロンのうち２．６±１．０％；図８ｂ）
。
マクロファージ侵入は、末梢神経損傷によりアップレギュレートされることが示されて
いる。Ａｂｂａｄｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００
：７９４７−５２頁（２００３）；Ｍｙｅｒｓら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４１：９４
−１０１頁（１９９６）；Ｔｏｆａｒｉｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：６６９６−
７０３（２００２）。活性化組織マクロファージにより発現されるリソソームタンパク質
であるＣＤ６８（ＥＤ−１）に対して増加した抗体が、肉腫注入マウスにおけるマクロフ
ァージ侵入を評価するために使用される。偽処置＋ビヒクル（８０．６±６．０細胞プロ
フィル／Ｌ２同側性ＤＲＧ）と比較して肉腫＋ビヒクルマウスの同側性ＤＲＧ（１１９．
６±１２．１細胞プロフィル／Ｌ２同側性ＤＲＧ；図８ｃ）のＣＤ−６８ＩＲニューロン
数にアップレギュレーションがあった。抗ＮＧＦ処置により、肉腫注入マウスにおける同
側性ＤＲＧ（９２．０±９．９細胞プロフィル／Ｌ２同側性ＤＲＧ；図８ｄ）のＣＤ６８
−ＩＲニューロンのアップレギュレーションが有意に減少し、腫瘍担持動物の同側性Ｌ２
ＤＲＧ内に活性化侵入ミクロファージ数の有意な減少を示した。
抗ＮＧＦ処置により、脊髄中の骨癌により誘導される中枢神経変化が調節された。ジノ
ルフィンの発現は、慢性痛の維持に関与することが示されている。Ｖａｎｄｅｒａｈら、
Ｐａｉｎ ９２：５−９頁（２００１）。ジノルフィン発現はまた、幾つかの持続性の疼
痛状態における脊髄の背角においてアップレギュレートされることが示されている。Ｉａ
ｄａｒｏｌａら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．４５５：２０５−２１２頁（１９８８）；Ｎｏｇ
ｕｃｈｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０：２２７−２３
３頁（１９９１）；Ｓｃｈｗｅｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：１０８８６−９７頁
（１９９９）。偽処置＋ビヒクルマウスでは、少量の脊髄ニューロンが、深部脊髄ラミナ
にジノルフィンを発現した（２．３±１．１ ｄｙｎ−ＩＲニューロン／Ｌ３／Ｌ４セク
ション）。対照的に肉腫＋ビヒクルマウスは、有意により多くのジノルフィン−ＩＲニュ
ーロンを発現した（６．０±０．５ ｄｙｎ−ＩＲニューロン／Ｌ３／Ｌ４セクション；
図９Ａ）。抗ＮＧＦ処置は、肉腫注入マウスにおいてジノルフィン発現のアップレギュレ
ーションを有意に減少させた（２．００±０．６ ｄｙｎ−ＩＲニューロン／Ｌ３／Ｌ４
セクション；図９Ｂ）。
最初期遺伝子活性化は、抗ＮＧＦ処置により防止された。深部背角（ラミナＩＩＩ〜Ｖ
Ｉ）におけるｃ−Ｆｏｓの発現は、肉腫誘導骨癌の疼痛状態において中枢感作のマーカー
として利用されている。Ｈｏｎｏｒｅら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：５２１−８（２０００）
；Ｈｏｎｏｒｅら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ９８：５８５−５９８頁（２０００）；Ｌ
ｕｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１：４０３８−４０４７頁（２００１
）；Ｓｃｈｗｅｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：１０８８６−９７（１９９９）。偽
処置処置動物の通常の非侵害性触診は、深部ラミナにおけるｃ−Ｆｏｓの最少発現をもた
らした。Ｓａｂｉｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：７３４３−９（２００２）。骨
癌状態において、肉腫＋ビヒクルマウスは、ｃ−Ｆｏｓ−ＩＲニューロン（２７．７±４
．９；ｃ−Ｆｏｓ−ＩＲニューロン／Ｌ３／Ｌ４セクション；図９Ｃ）および抗ＮＧＦに
よる処置は、この発現を減じた（１１．１±１．９；ｃ−Ｆｏｓ−ＩＲニューロン／Ｌ３
／Ｌ４セクション；図９Ｄ）。
ＲＴ ＰＣＲ結果。肉腫腫瘍細胞が可能なＮＧＦ源であるかどうかを見るために、培養
で増殖させた２４７２細胞をＲＴ ＰＣＲによりＮＧＦ ｍＲＮＡのレベルに関して評価
した。これらのレベルを、マウスの幾つかの正常な組織、ならびに異常に高い外分泌ＮＧ
Ｆ源であるオスマウスの唾液腺におけるＮＧＦ ｍＲＮＡのレベルと比較した。下表３に
示されるように、インビトロ肉腫２４７２細胞は、容易に検出できるＮＧＦ ｍＲＮＡを
含有した。このレベルは、虹彩などの高レベルのＮＧＦ ｍＲＮＡを発現する正常な組織
から得られたＮＧＦｍＲＮＡの範囲内にある。Ｓｈｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：７９５１−５頁（１９８４）。しかしながら、こ
のレベルは、オスマウスの唾液腺に存在するＮＧＦ ｍＲＮＡレベルの数桁下の大きさで
ある。
（表３ ＮＧＦ発現レベルを示すＲＴ ＰＣＲデータ）
（実施例３）
（大腿骨髄内への骨芽細胞性前立腺腫瘍細胞の注入により発現したマウスモデルの骨癌
の疼痛処置における抗ＮＧＦモノクローナル抗体の効果）
（方法）
骨癌の疼痛のマウス前立腺モデル。骨癌の疼痛のマウス前立腺モデルを、抗ＮＧＦ抗体
９１１（マウスモノクローナル抗体；Ｈｏｎｇｏら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９：２１５
−２２７頁（２０００）を参照）による処置効果を評価するために用いた。骨芽細胞性イ
ヌ癌腫（オハイオ州立大学Ｔｈｏｍａｓ Ｊ．Ｒｏｓｏｌ博士より恵与されたＡＣＥ−１
）細胞を維持し、腫瘍細胞の注入を、先に記載されたとおり実施した。Ｓａｂｉｎｏら、
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：７３４３−７３４９頁、２００２年；Ｈｏｎｏｒｅら、Ｎ
ａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：５２１−５２８頁、２０００年；Ｈｏｎｏｒｅら、
Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１２９：３８９−３９７頁、２０００年；Ｌｕｇｅｒら
、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１：４０３８−４０４７頁（２００１）。簡略に
述べると、ＡＣＥ−１細胞を、３７℃および５％ＣＯ２の培地中で増殖させた。細胞をＴ
７５フラスコ（７．５ｃｍ２）中で増殖させ、週に２回、８０〜９０％の集密度で継代し
た。３回から１１回の継代のみを本試験に用いた。０日目にナトリウムペントバルビター
ル（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）による全身麻酔の誘導後、関節切開、遠位大腿骨の関節丘
の曝露を実施した。Ｈａｎｋの緩衝滅菌生理食塩水（ＨＢＳＳ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ社、ミズーリ州セントルイス；偽処置、ｎ＝７）または１０５骨芽細胞性イヌＡＣ
Ｅ−１細胞（２０μｌ、ＡＣＥ−１ｎ＝６０）を含有するビヒクルを、マウス大腿骨の髄
内腔に注入し、注入部位を歯科用アマルガム（Ｄｅｎｔｓｐｌｙ、デラウェア州ミルフォ
ード）で密封し、次いで滅菌ろ過水で潅注した。実験は、２０〜３２ｇ体重の全部で８９
匹の ８〜１０週齢成体の胸腺欠損ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、ウィスコンシン州マジソン）に対して実施した。国立予防衛生研究所のガイドライ
ンに従って特定の病原菌のない（ＳＰＦ）条件下で、１２時間の明暗交代サイクルで、２
２℃に維持されたオートクレーブケージ内にマウスを入れ、滅菌した食餌と水を自由に取
らせた。
注入後１９日目のエンドポイントが用いられた。これは腫瘍が依然として骨に限定され
、癌関連痛挙動および腫瘍誘導骨再形成が最大に提示される時点であるためである。無処
置動物は、腫瘍注入後９日目の偽処置と行動的にはっきりとした差異がないので、偽処置
動物を、行動実験および骨組織学／免疫組織化学の対照のために使用した。
抗ＮＧＦ抗体またはモルヒネによる処置。腫瘍注入後７日目、１２日目、および１７日
目に、ＡＣＥ−１注入動物に、１０ｍｇ／ｋｇで抗ＮＧＦ抗体９１１を腹腔内（ｉ．ｐ．
）注入し（ＡＣＥ−１＋抗ＮＧＦ、ｎ＝９）；ＡＣＥ−１注入動物に、生理食塩水を腹腔
内（ｉ．ｐ．）注入し（ＡＣＥ−１＋ビヒクル、ｎ＝２１；１．４μｌ／ｋｇ）；および
偽処置注入動物に、生理食塩水を腹腔内（ｉ．ｐ．）注入した（偽処置＋ビヒクル、ｎ＝
７）。動物全てを、７日目と１９日目との間の行動を分析した。
抗ＮＧＦ抗体と硫酸モルヒネとの行動比較に関して、マウスに、行動試験１５分前にモ
ルヒネの急性用量（無処置：ｎ＝６；偽処置：ｎ＝７；ＡＣＥ−１＋ビヒクル、ｎ＝７；
ＡＣＥ−１＋抗ＮＧＦ、ｎ＝７；ＡＣＥ−１＋モルヒネ１０ｍｇ／ｋｇ、皮下：ｎ＝８；
ＡＣＥ−１＋モルヒネ３０ｍｇ／ｋｇ、皮下：ｎ＝８）を与えた。熱的および機械的感受
性試験ならびに後肢皮膚の神経支配評価に関して、無処置マウスを、滅菌生理食塩水（無
処置＋ビヒクル：ｎ＝８）または抗ＮＧＦ抗体（無処置＋抗ＮＧＦ：ｎ＝８、１０ｍｇ／
ｋｇ、腹腔内）が与えられる２つの処置群に分けた。
行動分析。動物を、腫瘍移植または偽処置注入前、およびその後７日目、９日目、１１
日目、１３日目、１５日目、１７日目ならびに１９日目の双方で痛覚関連行動に関して試
験した。動物は、以下の試験を用いて行動試験をした：進行中痛（自発的防御およびすく
み）および運動誘発痛（触診誘発防御および触診誘発すくみ）。金網底面を備えた透明な
プラスチック観察箱に動物を入れて３０分間馴化させた。触診誘導防御およびすくみ行動
を、ＡＣＥ−１および偽処置注入動物の遠位大腿骨の通常の非侵害性触診の２分後に測定
した。これらの試験は、実施例１と２に記載されているとおりに実施した。
安楽死および組織の処理。マウスは、注入１９日後に殺処理し、先に記載されたように
大腿骨および後肢皮膚の免疫組織化学的分析のために組織を処理した。Ｈｏｎｏｒｅら、
Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１２９：３８９−３９７頁、２０００年；Ｈｏｎｏｒｅ
ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：５２１−５２８頁、２０００年；Ｌｕｇｅｒ
ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１：４０３８−４０４７頁（２００１）。マウ
スをＣＯ２により安楽死させ、１２ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に次
いで２５ｍｌの４％ホルムアルデヒド／１２．５％ピクリン酸液により心内灌流した。
後肢の足底皮膚を取り、灌流固定液で固定後、３０％ショ糖中２４時間凍結保護した。
６０μｍ厚さの連続皮膚切片を、滑走式ミクロトーム上で切断し、ＰＢＳ中に採取し、自
由浮動状態の切片として処理した。切片化後、足底皮膚切片をＰＢＳで短時間リンスして
から、ブロッキング液（ＰＢＳ中３％正常なロバ血清（ＮＤＳ）０．３％トリトンＸ−１
００）中で１時間インキュベートし、次いで一次抗体中で一晩インキュベートした。皮膚
切片を、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）（１：１５，０００；Ｓｉｇｍａ
、ミズーリ州セントルイス）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＯＨ）（ポリクローナルウ
サギ抗ＴＯＨ、１：２，０００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）およ
びニューロフィラメントＨ（クローンＲＴ９７）（ポリクローナルウサギ抗ＲＴ−９７、
１：２，５００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）に対して免疫染色し
た。
一次抗体中でインキュベーション後、切片をＰＢＳでリンスしてから、二次抗体液中で
３時間インキュベートした。Ｃｙ３またはビオチン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅ
ｓｅａｒｃｈ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）に結合させた二次抗体を、それぞれ
１：６００または１：５００で用いた。ビオチンに結合させた二次抗体を検出するために
、切片をＰＢＳでリンスし、Ｃｙ３結合ストレプタビジン（１：４０００；Ｊａｃｋｓｏ
ｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）中で４５分間インキュベートした。一次抗体の特異
性を確認するために、対照には、一次抗体の除外または相当する合成ペプチドによる前吸
収を含めた。免疫染色処理後、足底皮膚切片をリンスし、ゼラチンコーティングスライド
上に定置した。次に定置した切片を、アルコール勾配（７０、９０、１００％）で脱水し
、キシレンで清浄化し、カバースリップをＤＰＸ（Ｆｌｕｋａ、スイス国Ｂｕｃｈｓ）と
共に定置した。
放射線試験後、腫瘍注入１９日目後に右（内部対照）および左（腫瘍担持）大腿骨を、
ピクリン酸および４％ホルマリン中、４℃で一晩固定し、１０％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）
中、１４日間以内の間、脱石灰した。次いで骨を、パラフィン中に埋め込んだ。５μｍ厚
さの大腿骨切片を、側平面に切断し、酒石酸塩耐性酸性リン酸分解酵素（ＴＲＡＰ）およ
びヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）により染色して正常な脊髄、腫瘍、破骨細胞
、骨芽細胞、およびマクロファージ類（Ｍｓ）の組織学的特性を可視化した。
偽処置および癌性大腿骨の免疫組織学的分析を、脱石灰化、パラフィン埋め込みの１４
μｍ連続切片に対して実施した。内因性ペルオキシダーゼは、２％過酸化水素中、切片を
１時間インキュベートすることによってクエンチした。次に切片をＰＢＳにより１０分間
、３回リンスし、ＴＳＡブロッキング緩衝液（ＴＳＡ−プラスシアニン３システム、Ｐｅ
ｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、マサチューセッツ州ボストン）中
で１時間ブロックした。一次抗血清を、ブロッキング緩衝液の除去の際に加え、室温で一
晩インキュベートした。一次求心性非ミエリン化および弱ミエリン化感覚神経線維を、ポ
リクローナルウサギ抗カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）（１：１５，０００
；Ｓｉｇｍａ）に対して増加した抗体を用いて標識化した。切片をＴＳＡ洗浄用緩衝液中
で１０分間、３回リンスし、次いでストレプタビジン（１：４，０００）中で４５分間イ
ンキュベートした。次に切片を、ＴＳＡ洗浄用緩衝液中で１０分間、３回リンスした。Ｔ
ＳＡ−プラスシアニン３システムからのＣＹ３−結合チラミン（１：６００）を、大腿骨
に７分間適用し、ＴＳＡ洗浄用緩衝液で２回、ＰＢＳで１回リンスした。最後に切片を風
乾し、アルコール勾配（７０、９０、１００％）で脱水し、キシレンで清浄化し、ＤＰＸ
（Ｆｌｕｋａ）と共に定置した。
骨の放射線分析。切開した大腿骨のＸ線写真（Ｆａｘｉｔｒｏｎ Ｘ−ｒａｙ社、イリ
ノイ州ホイーリング）を、骨形成および破壊の程度を評価する１９日目の時点で得た。画
像は、Ｋｏｄａｋ Ｍｉｎ−Ｒ ２０００マンモグラフィーフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ
Ｋｏｄａｋ社、ニューヨーク州ロチェスター；露出設定：７秒、２１ｋＶｐ）で捕捉した
。骨密度の分析は、５倍率の全骨画像の側平面内で腫瘍誘導骨モデリングの程度をＸ線で
評価するため使用した。腫瘍担持および非腫瘍担持大腿骨（無処置＋ビヒクル、偽処置＋
ビヒクル、ＡＣＥ−１＋ビヒクル、およびＡＣＥ−１＋抗ＮＧＦに関してｎ＝８）は、先
に記載されたプロトコルと同様の様式で「ＩｍａｇｅＪ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉ
ｃｅｓ Ｂｒａｎｃｈ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ
Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州ベセスダ）」を用いて分析した。Ｃｏｒｅｙｒａ，Ｐｒｏ
ｓｔａｔｅ ５２：２０−３３頁、２００２年。簡略に述べると、ブランクＸ線フィルム
および標準ステップ錠剤（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ社）は、検量線を作り出すために
使用した。ＩｍａｇｅＪを用いて、光学密度を測定し、引き続き以下のとおり透過率に変
換させた：透過率＝１／（ａｎｔｉｌｏｇ１０［光学密度］）。所与のデータは、陰性画
像から判定される。したがって透過率は、骨密度の直接表示である。サブサチュレーショ
ン大腿骨のＸ線写真を捕捉するためにＨＰ ＳｃａｎＪｅｔ ７４００ｃスキャナーが用
いられ、リーディングは各大腿骨から２重に記録された。結果は、正規化された透過率の
平均値±ＳＥとして提供される。
骨芽細胞、破骨細胞、およびマクロファージ、腫瘍成長ならびに骨再形成の組織学的分
析。無処置動物、偽処置注入、および腫瘍担持マウスに関して骨幹髄内腔全体にわたって
大腿骨および皮質骨内の双方に含まれる腫瘍誘導の新たに骨形成された領域と直に接触す
る骨芽細胞数を定量化することにより、骨芽細胞増殖を分析した。骨幹髄内腔は、近位先
端骨梁から遠位基部骨梁まで延在するものとして定義され、主として活性な骨再形成はこ
の領域に生じるので定量化のために選択された。骨芽細胞は、新たに進展するマトリック
スと直接接触し、また典型的な立方体状または円柱状上皮層に配列し、ならびに高倍率（
２００倍率以上）で確認可能な薄い過程を経て互いに結合している細胞として確認される
。結果は、無処置、偽処置注入、および腫瘍担持マウスに関して骨幹髄内腔の骨芽細胞数
／ｍｍ２として提供される。骨芽細胞増殖は、先に記載されたＴＲＡＰ染色大腿骨切片に
対して無処置、偽処置注入、および腫瘍担持マウスに関して骨／腫瘍界面および正常な骨
髄／骨界面におけるＴＲＡＰ＋破骨細胞数を定量化することにより判定された。Ｈｏｎｏ
ｒｅら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：５２１−５２８頁（２０００）。要約すると、骨芽細胞は
、ＴＲＡＰ＋として出現する組織学的に区別された細胞であり、骨再吸収の領域と密接に
関連する。これらの細胞は、多核性であり、皮質および海綿体に沿ってハウシップ凹窩に
見られる。Ｄ．Ｄｒｅｉｂｅｌｂｉｓ（編集）、Ｂｏｎｅ、１１版、２１１−２１３頁、
ペンシルバニア州フィラデルフィア：Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ社、１９８６年における
Ｆａｗｃｅｔｔ，Ｄ．Ｗ．；Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ。マクロファ
ージ（Ｍｓ）増殖は、腫瘍およびミネラル化骨の骨内膜表面と関連しない正常な骨髄にわ
たって分散しているＴＲＡＰ＋細胞数を定量化することによって判定された。骨内のマク
ロファージは、細胞を刺激する腫瘍放出因子により活性化され、これらの活性化Ｍｓの細
胞出現は、極めて不規則な表面、多膜状仮足および食胞によって特徴付けられる。その結
果は、それぞれ骨幹髄内腔の１ｍｍ２当りの平均破骨細胞数または１ｍｍ２当りの平均Ｍ
ｓ数として表される。
ＡＣＥ−１細胞を含有する大腿骨は、ＳＰＯＴ画像捕捉ソフトウェア（Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ミシガン州スターリングハイツ）を利用するＳＰＯＴ
ＩＩデジタルカメラを具備したＮｉｋｏｎ Ｅ６００蛍光顕微鏡上で明視野顕微鏡を用
いて画像化された。髄内腔の全領域および腫瘍、骨形成、および残りの造血細胞により占
められる髄内腔のパーセントは、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ｖ３．０ソフトウェア
（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、メリーランド州シルバースプリング）を用いて
算出された。Ｓａｂｉｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：７３４３−７３４９頁、２
００２年；Ｓｅｖｃｉｋら、Ｐａｉｎ １１１：１６９−１８０頁、２００４年。骨形成
は、腫瘍形成を定量化するために用いられた同じＨ＆Ｅ染色の大腿骨切片を用いて分析し
た。大腿骨切片を、偏光下で観察して編組み状および層状骨の形成領域を確認した。編組
み状骨の形成領域は、ＳＰＯＴＩＩデジタルカメラで画像化し、Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ｖ３
．０ソフトウェアを用いて定量化した。結果は、全髄内面積のパーセンテージとして腫瘍
、腫瘍誘導骨形成として残りの造血細胞は総髄内面積のパーセンテージとして示される。
骨および皮膚における感覚線維の定量化。感覚神経線維数を、先に記載されたとおり測
定した。Ｍａｃｈら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １１３：１５５−１６６頁、２００２
年。要約すると、３つの骨領域（近位、遠位、骨幹）および３つの骨組織（骨膜、ミネラ
ル化骨および骨髄）におけるＣＧＲＰ−ＩＲ線維数を、２０倍率の対物レンズを具備した
ＭＲＣ−１０２４ Ｃｏｎｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォ
ルニア州リッチモンド）を用いて確認した。神経線維カウントは、１匹につき６枚の大腿
骨切片をＯｌｙｍｐｕｓ ＢＨ−２蛍光装置付顕微鏡により観察することにより実施した
。３０μｍ超の神経線維だけを分析に含めた。各骨の全表面積（ｍｍ２）を測定するため
に、我々は、神経線維カウントを得た同じ大腿骨切片を分析した。全骨面積を、ＳＰＯＴ
ＩＩデジタルカメラおよびＰｒｏ Ｐｌｕｓ ｖ３．０ソフトウェアを用いて得られた大
腿骨切片のデジタル画像上で測定した。その結果は、全骨面積当りにカウントされた線維
数として示される。
表皮神経支配密度の定量化を、マウス１匹当り４枚の無作為に選択された後肢の足底皮
膚に対して実施した。ＣＧＲＰ、ＴＯＨおよびＲＴ９７−ＩＲの全神経線維数を、２００
倍の倍率でカウントした。カウンティング則は、同じ線維の多重枝ではなくて単一の表皮
内線維だけをカウントすると設定した。ＭｃＣａｒｔｈｙら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４５
：１８４８−１８５５頁、１９９５年。定量化した全切片中の表皮の全長を、１ｃｍ２の
接眼グリッドを用いて測定した。少なくとも３０μｍ表皮内に突出している神経線維だけ
をカウントした。その結果は、マウス１匹につき長さ１ｍｍ当り表皮内平均神経線維数と
して示される。
ＡＣＥ−１細胞中のＮＧＦのｍＲＮＡレベルのＲＣ ＰＣＲ。イヌ脳またはイヌ前立腺
腫瘍細胞ＡＣＥ−１に由来する全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ
）を用いて製造元の取扱い説明書に従って調製し、ＲＮＡを、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて定量した。２ステップＲＴ−ＯＣＲは、Ｔ
ａｒＭａｎ Ｇｏｌｄキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施し
た。ＲＮＡは、無作為ヘキサマー類を用いて逆転写し、ｃＤＮＡは、ＮＧＦに特異的なプ
ライマー／プローブセット（ＬＢ０４１：ＡＡＣＡＧＧＡＣＴＣＡＣＡＧＧＡＧＣＡＡ（
配列番号６）、ＬＢ０４２：ＣＧＧＣＡＣＴＴＧＧＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡ（配列番号７）
、およびＬＢ０４５：ＡＡＴＧＴＴＣＡＣＣＴＣＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣＡ（配列番
号８））を用いて増幅した。サンプルは、ＲＴステップから２重反復試験で分析し、全Ｒ
ＮＡインプットに正規化した。
統計解析。Ｓｔａｔｖｉｅｗコンピュータ統計用パッケージ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ社、ノースカロライナ州キャリー）を用いて統計的検定を実施した。一元ＡＮＯＶＡ
を用いて、行動結果、骨組織学的結果、および免疫組織化学分析および骨再形成のスコア
化を実験群間で比較した。多重比較のため、フィッシャーのＰＬＳＤ（保護最小有意差）
ポストホック検定を用いた。有意レベルは、Ｐ＜０．０５に設定した。行動、免疫組織化
学分析および骨再形成のスコア化を担当した調査者個人は、各動物の実験状況に対してブ
ラインドされた。
結果
抗ＮＧＦ療法は、硫酸モルヒネよりも高程度に骨癌の疼痛を源弱させたが、熱的または
機械的閾値のベースラインに影響を及ぼさなかった。進行中の疼痛は、２分の時間にわた
る自発的防御およびすくみを測定することにより分析された。ＡＣＥ−１＋ビヒクルマウ
スは、偽処置＋ビヒクル対照（０．６±０．３秒、１９日目、図１０Ａ）と比較して、よ
り大きな時間消費防御（７．７±０．８秒、１９日目）を示した。さらに、ＡＣＥ−１＋
ビヒクルマウスは、偽処置＋ビヒクル対照（１．０±０．４、１９日目、図１０Ｂ）と比
較して、すくみ数の増加（１１．９±１．２、１９日目）を示した。ＡＣＥ−１注入マウ
スの抗ＮＧＦの投与は、ＡＣＥ−１＋ビヒクルマウス（図１０Ａ）と比較して自発的防御
が有意に源弱した（１．２±０．４秒、１９日目）。抗ＮＧＦ処置はまた、ＡＣＥ−１＋
ビヒクル（図１０Ｂ）と比較してＡＣＥ−１注入マウスにおける自発的すくみ行動を有意
に減少させた（２．１±０．７、１９日目）。予備的試験において、ビヒクルを受けた偽
処置処置対照または抗ＮＧＦ間で有意な行動差または副作用が見られなかった。
抗ＮＧＦ療法は、無処置＋ビヒクル（１１．２±０．４秒、１９日目、図１０Ｃ）と比
較して、正常な熱応答（１０．２±０．４秒、１９日目）に対しても、また無処置＋ビヒ
クル（５．２±０．４ｇ、１９日目、図１０Ｄ）と比較して、正常な機械的応答（５．４
±０．３ｇ、１９日目）に対しても効果が無かった。
骨癌関連行動を軽減する上で抗ＮＧＦ抗体に対する硫酸モルヒネ（ＭＳ）の効果を比較
するために動物を試験した。腫瘍注入１１日目と１９日目の行動評価により、ＡＣＥ−１
＋ビヒクル動物は、偽処置＋ビヒクルマウス（それぞれ１１日目と１９日目において０．
４±０．２秒および０．６±０．３秒、図１０Ｅ）と比較して統計的により長時間の注入
四肢の防御（それぞれ１１日目と１９日目において６．０±１．０秒および７．６±１．
２秒）を示した。ＡＣＥ−１＋ビヒクル動物はまた、偽処置＋ビヒクルマウス（それぞれ
１１日目と１９日目において０．７±０．３および１．０±０．４、図１０Ｆ）と比較し
て、統計的により多くの注入四肢のすくみ（それぞれ１１日目と１９日目において８．６
±１．２および１１．７±１．７）を示した。進行中の防御は、ＡＣＥ−１＋ビヒクル動
物（図１０Ｅ）と比較して、抗ＮＧＦの慢性処置（それぞれ１１日目と１９日目において
２．１±１．１秒および１．４±０．４秒）、急性１０ｍｇ／ｋｇの硫酸モルヒネ処置（
それぞれ１１日目と１９日目において３．５±０．３秒および４．０±０．５秒）または
急性３０ｍｇ／ｋｇの硫酸モルヒネ処置（それぞれ１１日目と１９日目において２．２±
０．３秒および２．０±０．４秒）のいずれによっても有意に減少した。進行中のすくみ
はまた、ＡＣＥ−１＋ビヒクル動物（図１０Ｆ）と比較して、抗ＮＧＦの慢性処置（それ
ぞれ１１日目と１９日目において３．４±１．７および２．６±０．６）、急性１０ｍｇ
／ｋｇの硫酸モルヒネ処置（それぞれ１１日目と１９日目において５．６±０．５および
６．８±０．７）または急性３０ｍｇ／ｋｇの硫酸モルヒネ処置（それぞれ１１日目と１
９日目において３．６±０．５および３．５±０．７）のいずれによっても有意に減少し
た。抗ＮＧＦ療法は、急性１０ｍｇ／ｋｇの硫酸モルヒネよりも有効に骨癌関連痛の行動
を有意に減弱させた。偽処置＋ビヒクル（２７±１ｇ）動物、ＡＣＥ−１＋ビヒクル（２
７±１ｇ）動物、およびＡＣＥ−１＋抗ＮＧＦ（２６±１ｇ）動物間で最終体重における
差異は見られなかった。これらの試験において、有意な行動差または運動失調、疾患、ま
たは傾眠などの副作用は、ビヒクルまたは抗ＮＧＦのいずれを受けた動物間でも見られな
かった。
抗ＮＧＦ療法は、触診誘発骨癌の疼痛を減弱させた。触診誘発痛行動もまた評価した。
触診誘発防御およびすくみを、ＡＣＥ−１および偽処置注入動物における遠位大腿骨の通
常の非侵害的触診の２分間後に測定した。図１０Ｇおよび１０Ｈに示されているように、
ＡＣＥ−１注入動物（生理食塩水と共に投与された）は、偽処置注入動物（生理食塩水と
共に投与された）と比較して、触診誘発防御（図１０Ｇ）および触診誘発すくみ（図１０
Ｈ）（双方ともｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）により評価すると７日目までに触診誘発痛行
動を生じた。図１０Ｇおよび１０Ｈはまた、抗ＮＧＦ抗体９１１の腹腔内投与により、Ａ
ＣＥ−１注入マウスへの生理食塩水投与と比較してＡＣＥ−１腫瘍移植後、１１日目から
１９日目までのＡＣＥ−１注入マウスにおいて触診誘発防御（図１０Ｇ）および触診誘発
すくみ（図１０Ｈ）が有意に減少したことを示している（触診誘発防御および触診誘発す
くみの双方に関してｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）。これらの結果は、抗ＮＧＦ抗体９１１
がＡＣＥ−１注入マウスにおいて触診誘発痛を減少することを示している。
抗ＮＧＦ療法は、疾患進行または腫瘍誘導骨形成のマーカーに対して効果は無かった。
骨形成および破壊、腫瘍成長（図１１）、および破骨細胞増殖（図１２）に対する抗ＮＧ
Ｆ療法の効果を、腫瘍注入１９日後に調べた（下表４）。偽処置注入マウスを、Ｘ線、Ｔ
ＲＡＰおよびＨ＆Ｅ分析によりそれぞれ評価するとＡＣＥ−１注入マウスと比較して、有
意な骨再形成（１１５±２％の正規化透過率値）（図１１Ａ）、髄内腔全体にわたる破骨
細胞増殖（１６±１０破骨細胞／ｍｍ２骨幹髄内面積）（図１２Ａ）または腫瘍細胞（０
±０％）（図１１Ｄ）を示さなかった。ＡＣＥ−１＋ビヒクルマウスにおいて、広範囲で
はあるが、ほぼ等しい骨形成および破壊が観察され、多巣性骨幹架橋およびＸ線透過性（
１０９±５％の正規化透過率値）（図１１Ｂ）、骨幹髄内領域にわたって破骨細胞数（図
１２Ｂ）および骨芽細胞数の著しい増加を特徴とし（４７±３破骨細胞／ｍｍ２および１
２７±７骨芽細胞／ｍｍ２）、腫瘍は、髄内腔の大部分（髄内腔の６０±７％）を満たし
ていた（図１１Ｅ）。腫瘍注入後７日目から抗ＮＧＦ抗体により腫瘍担持マウスを処置す
ると、ＡＣＥ−１＋ビヒクル動物と比較して、骨再形成（１０６±９％の正規化透過率値
）（図１１Ｃ）における有意な変化をもたらさず、骨幹髄内領域にわたってＡＣＥ−１誘
導破骨細胞（図１２Ｃ）または骨芽細胞の増殖減少がなく（４７±５破骨細胞／ｍｍ２お
よび１１８±１５骨芽細胞／ｍｍ２）、または腫瘍成長の減少がなかった（髄内腔の５７
±６％）（図１１Ｆ）。
腫瘍注入１９日後、ＡＣＥ−１＋ビヒクルマウスは、偽処置＋ビヒクル対照マウス（２
±１Ｍｓ／ｍｍ２）と比較して、マクロファージ（Ｍｓ）の増加を示した（２７±２Ｍｓ
／ｍｍ２骨幹髄内面積）。ＡＣＥ−１注入マウスの抗ＮＧＦ処置によって（２４±３Ｍｓ
／ｍｍ２）ＡＣＥ−１＋ビヒクルマウスに見られるようなＭｓ侵入の有意な変化はなかっ
た（表４）。
抗ＮＧＦ療法は、骨および皮膚における感覚神経支配または交感神経支配に対して観察
可能な効果はない。弱ミエリン化または非ミエリン化ペプチド作動性感覚神経線維（ＣＧ
ＲＰ−ＩＲ）、大型ミエリン化感覚線維（ＲＴ９７−ＩＲ）およびノルアドレナリン作動
性交感神経線維（ＴＯＨ−ＩＲ）を、ＡＣＥ−１注入大腿骨または後肢の足底皮膚におい
て、それぞれＣＧＲＰ、ＲＴ−９７およびＴＯＨに対して増加した抗体を用いて免疫組織
化学により分析した。ＣＧＲＰ−ＩＲ神経線維は、ＡＣＥ−１＋ビヒクル動物（２３．５
±１．９線維／ｍｍ２）およびＡＣＥ−１＋抗ＮＧＦ動物（２４．０±１．９線維／ｍｍ
２）ならびに偽処置＋ビヒクル動物（２８．２±１．５線維／ｍｍ２）および無処置＋ビ
ヒクル動物（２４．６±２．４線維／ｍｍ２）または無処置＋抗ＮＧＦ動物（２３．１±
１．９線維／ｍｍ２）の骨全体（骨膜、ミネラル化骨、骨髄および腫瘍）にわたって見ら
れた（図１４）。ＡＣＥ−１＋ビヒクル（１３．９±０．５線維／ｍｍ）およびＡＣＥ−
１＋抗ＮＧＦ（１５．２±０．７線維／ｍｍ）の後肢皮膚サンプルにおいてＣＧＲＰ−Ｉ
Ｒ線維の強度または密度間に有意差はなかった（図１３Ａおよび１３Ｂ）。同様に、無処
置＋ビヒクル（１４．４±０．４線維／ｍｍ）および無処置＋抗ＮＧＦ（１４．２±１．
３線維／ｍｍ）の後肢皮膚サンプルにおいてＣＧＲＰ−ＩＲ線維の強度または密度間に有
意差はなかった（図１４Ａおよび１４Ｂ）。また、ＲＴ９７−ＩＲおよびＴＯＨ−ＩＲ線
維の密度および強度の差異も、無処置＋ビヒクル処置動物（４．２±２．２ ＲＴ９７＋
線維／ｍｍ；１６．０±２．７ ＴＯＨ＋線維／ｍｍ）および無処置＋抗ＮＧＦ処置動物
（８．０±０．６ ＲＴ９７＋線維／ｍｍ；１２．８±１．１ ＴＯＨ＋線維／ｍｍ）に
おいて検出できなかった。ＡＣＥ−１＋ビヒクルとＡＣＥ−１＋抗ＮＧＦ対無処置＋ビヒ
クルと無処置＋抗ＮＧＦ動物の皮膚サンプルにおいて、ＣＧＲＰ、ＲＴ−９７およびＴＯ
Ｈ−ＩＲ線維の強度または密度間に観察できる有意差はなかった。
ＡＣＥ−１細胞におけるｍＲＮＡ発現レベル。イヌ脳およびＡＣＥ−１細胞におけるＮ
ＧＦ発現を比較した。５つの独立したＡＣＥ−１サンプルを分析すると、各々ＮＧＦ発現
は、ＰＣＲアッセイの検出レベル以下であった。イヌ脳中のＮＧＦは、４０サイクルの実
験の３５．２サイクル目で閾値を越えたが、一方、ＡＣＥ−１サンプルは、４０サイクル
後も閾値を越えなかった。したがって、ＡＣＥ−１サンプルにおけるＮＧＦ ｍＲＮＡ発
現は、脳における発現の少なくとも２７．８倍未満であった。
（実施例４）
（前立腺癌または乳癌による骨への転移に由来する中等度から重篤な疼痛を有する患者
における抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の鎮痛効果）
前立腺癌または乳癌による骨への転移に由来する中等度から重篤な疼痛を有する患者に
おける無作為のプラセボ対照二重盲検試験において、抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の静脈内用量（１
００μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、１，０００μｇ／ｋｇ）の鎮痛効果（視覚アナログ
スケール（Ｖｉｓｕａｌ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｓｃａｌｅ）（ＶＡＳ）により測定した発
症までの時間、ピークまでの時間、持続時間ならびに疼痛の改善を含む）を、プラセボと
比較した。前立腺癌または乳癌による骨への転移に由来する中等度から重篤な疼痛を経験
している成人男性および女性（３５才から７５才）を本試験に登録する。スクリーニング
期間に、患者は、１日４回の疼痛レベルの記録、また抗ＮＧＦ抗体Ｅ３の投与前１４日間
の他の鎮痛医薬品の使用記録が求められる。
２８０人の患者が、試験に承認される。２週間のベースライン疼痛レベル、他の鎮痛薬
の使用、および副作用の記録後、１日目と２９日目の朝に抗ＮＧＦ抗体Ｅ−３を投与する
。２８０人の患者を４群に分け、各群が７０人の患者を有する。各群の患者を、プラセボ
、１００μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、または１，０００μｇ／ｋｇの抗ＮＧＦ抗体Ｅ
３により処置する。
鎮痛効果は、抗体Ｅ３の投与前１４日間、投与後６ヵ月間、毎日４回評価する。結果は
、スクリーニングベースライン（プラセボまたは抗体Ｅ３の投与前１４日間の平均疼痛レ
ベル）からの変化として評価する。プラセボと比較して抗ＮＧＦ抗体Ｅ３により処置され
た患者の１群以上における疼痛スコアの減少および／または他の鎮痛薬の使用減少により
、抗ＮＧＦ抗体Ｅ３による処置の有効性が立証されている。
上述の本発明は、理解を明確にする目的で図解および実施例により幾らか詳細に記載さ
れているが、記述および実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならな
い。
図１は、肉腫注入後１０日目および１４日目に、２分間の観察時間中、自発的防御および自発的すくみによって評価した進行中の疼痛を示すグラフである。「無処置」とは、注入なしの動物を言う。「偽処置＋ビヒクル」とは、大腿腔へα最少基本ビヒクルを注入し、その後、生理食塩水を注入した動物を言う。「肉腫＋ビヒクル」とは、大腿腔へ肉腫を注入し、その後、生理食塩水を注入した動物を言う。「肉腫＋抗ＮＧＦ」とは、大腿腔へ肉腫を注入し、その後、抗ＮＧＦ抗体９１１を注入した動物を言う。 図２は、肉腫注入後１０日目および１４日目に、四肢の使用および強制歩行防御（ロータロッド）によって評価した歩行痛を示すグラフである。「無処置」とは、注入なしの動物を言う。「偽処置＋ビヒクル」とは、大腿腔へα最少基本ビヒクルを注入し、その後、生理食塩水を注入した動物を言う。「肉腫＋ビヒクル」とは、大腿腔へ肉腫を注入し、その後、生理食塩水を注入した動物を言う。「肉腫＋抗ＮＧＦ」とは、大腿腔へ肉腫を注入し、その後、抗ＮＧＦ抗体９１１を注入した動物を言う。 図３は、肉腫注入後１０日目および１４日目に、２分間の観察時間中、触診誘導防御および触診誘導すくみによって評価した触診誘発痛を示すグラフである。「無処置」とは、注入なしの動物を言う。「偽処置＋ビヒクル」とは、大腿腔へα最少基本ビヒクルを注入し、その後、生理食塩水を注入した動物を言う。「肉腫＋ビヒクル」とは、大腿腔へ肉腫を注入し、その後、生理食塩水を注入した動物を言う。「肉腫＋抗ＮＧＦ」とは、大腿腔へ肉腫を注入し、その後、抗ＮＧＦ抗体９１１を注入した動物を言う。 図４は、抗ＮＧＦ抗体が、腫瘍注入後１４日目（ｄ１４）に、骨における疾患進行に影響を与えなかったことを証明している写真を示す。ビヒクル（偽処置＋ビヒクル）を投与された偽処置動物（ｎ＝８）、は（ａ）および（ｄ）に示され；ビヒクル（肉腫＋ビヒクル）を投与された肉腫（ＧＦＰ移入）注入動物（ｎ＝１３）、は（ｂ）および（ｅ）に示され；抗ＮＧＦ抗体（肉腫＋抗ＮＧＦ）を投与された肉腫（ＧＦＰ移入）注入動物（ｎ＝８）、は（ｃ）および（ｆ）に示されている。図４ａ、４ｂ、および４ｃは、骨破壊の有無を示すＸ線写真である。図４ｄ、４ｅ、および４ｆは、抗ＧＦＰ抗体による免疫染色を示す写真である。 図５は、抗ＮＧＦ抗体処置が、皮膚における感覚神経刺激伝達に観察可能な影響を与えなかったことを証明している写真を示す。肉腫注入（ａ、ｂ）マウスおよび無処置（ｃ、ｄ）マウスの双方の後肢皮膚サンプルを、無髄ペプチド作動性感覚神経繊維を標識する神経ペプチドカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に関して免疫染色した。肉腫注入およびビヒクル処置（ａ、ｎ＝３）マウス、肉腫注入および抗ＮＧＦ抗体処置（ｂ、ｎ＝８）マウス、無処置およびビヒクル処置（ｃ、ｎ＝８）マウス、ならびに無処置および抗ＮＧＦ抗体処置（ｄ、ｎ＝８）マウスからの後肢皮膚サンプルのＣＧＲＰ免疫染色が示されている。基準線：５０μｍ。 図６は、抗ＮＧＦ処置が、骨癌の疼痛を弱めたことを証明しているグラフを示す。左大腿への肉腫細胞の注入および封じ込めの８日後、１０日後、１２日後、および１４日後における進行中の疼痛の目安として、２分間の観察時間にわたる肉腫注入肢の時間消費防御および自発的すくみの数を用いた。運動誘発痛のパラメータには、肉腫注入大腿（ｃ、ｄ）の通常の非侵害性触診後、２分間の観察時間にわたる時間消費防御およびすくみの数の数量化が含まれた。「＃」は、偽処置＋ビヒクルに対するＰ＜０．０５を示し；「＊」は、肉腫＋ビヒクルに対するＰ＜０．０５を示す。 図７は、抗ＮＧＦ処置が、ベースラインの熱的および機械的閾値に影響を与えず、骨癌の疼痛の減少において、モルヒネ（ＭＳ）よりも大きな有効性を有したことを証明しているグラフを示す。図７ａおよび７ｂは、無処置マウスにおける抗ＮＧＦ処置（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射、５日おき）の、足引っ込めの潜伏時間によって測定した熱感受性（ａ、無処置＋ビヒクルでｎ＝８、無処置＋抗ＮＧＦでｎ＝８）、ならびに機械的刺激の５０％閾値によって測定した機械的感受性（ｂ、無処置＋ビヒクルでｎ＝８、無処置＋抗ＮＧＦでｎ＝８）を示す。図７ｃおよび７ｄは、遠位大腿の通常の非侵害的触診後、２分間の観察時間にわたる自発的防御（ｃ）の測定によって評価された進行中の疼痛行動、および２分間の観察時間にわたる時間消費防御（ｄ）の測定によって評価された運動誘発痛を示す。無処置マウス、偽処置およびビヒクル処置マウス、肉腫注入およびビヒクル処置マウス、肉腫注入およびモルヒネ（ｎ＝８、試験１５分前に１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与）処置マウス、肉腫注入およびモルヒネ（ｎ＝８、試験１５分前に３０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与）処置マウス、および肉腫注入および抗ＮＧＦ抗体（ｎ＝８、腫瘍注入後、６日から１４日、５日おきに、１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与）処置マウスに関する自発的防御（ｃ）および触診誘導防御（ｄ）の値を示している。誤差棒は、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。「＃」は、偽処置＋ビヒクルに対するＰ＜０．０５を示し；「＊」は、肉腫＋ビヒクルに対するＰ＜０．０５を示し；「＋」は、肉腫＋モルヒネに対するＰ＜０．０５を示す。 図８は、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体による処置が、腫瘍担持動物の後根神経節（ＤＲＧ）における神経化学的変化およびマクロファージ侵入を減少させたことを証明している写真を示す。図８ａおよび８ｂは、腫瘍移植１４日後に、ビヒクル処置（ａ、ｎ＝８）ならびに抗ＮＧＦ抗体処置（ｂ、ｎ＝８）された腫瘍担持動物の同側Ｌ２ＤＲＧにおける活性化している転写因子３（ＡＴＦ−３）の免疫蛍光染色を示す。下枠は、ビヒクル処置（ｃ、ｎ＝７）ならびに抗ＮＧＦ抗体処置（ｄ、ｎ＝７）された腫瘍担持動物の同側ＤＲＧ内の損傷感覚ニューロン周囲の活性化され、侵入しているマクロファージの濃度を示しているＣＤ−６８の免疫蛍光染色を示す。基準線ａ〜ｄ＝５μｍ。 図９は、中枢鋭敏化に関連した神経化学的変化が、抗ＮＧＦの投与により弱められたことを証明している顕微鏡写真を示す。図９Ａおよび９Ｂは、肉腫注入してビヒクル処置したマウス（Ａ、ｎ＝９）、ならびに、肉腫注入して抗ＮＧＦ抗体処置したマウス（Ｂ、ｎ＝４）の脊髄の背角におけるダイノルフィンの免疫染色を示す。図９Ｃおよび９Ｄは、腫瘍担持肢の通常の非侵害的触診後、肉腫注入してビヒクル処置したマウス（Ｃ、ｎ＝４）、ならびに、肉腫注入して抗ＮＧＦ抗体処置したマウス（Ｄ、ｎ＝４）における脊髄のニューロンを表しているｃ−Ｆｏｓの代表的共焦点画像を示す。基準線：ＡとＢに関しては１５０μｍ；ＣとＤに関しては２００μｍ。 図１０は、抗ＮＧＦ療法が前立腺腫瘍誘導骨癌の疼痛を弱めたことを証明しているグラフを示す。抗ＮＧＦ処置（腫瘍注入後、７日目、１２日目、および１７日目に１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与）が、疾患進行を通じ、腫瘍注入７日目に始まった進行中の骨癌の疼痛行動を弱めた。進行中の疼痛（Ａ、Ｂ）の目安として、２分間の観察時間にわたる、ＡＣＥ−１注入大腿における時間消費防御および自発的すくみの数を用いた。抗ＮＧＦ（黒正方形）は、ＡＣＥ−１＋ビヒクル（白正方形）に比較して、腫瘍注入動物における進行中の疼痛行動を有意に減少させ、全てのパラメータに関して、９日目に偽処置レベル近くまで減少した（円形）。疾患の進行にわたり、偽処置＋ビヒクル動物における防御とすくみは双方とも、ＡＣＥ−１＋ビヒクル動物とは有意に異なっていた。抗ＮＧＦ処置は、熱刺激に対する足引っ込めの潜伏時間または機械的刺激の閾値増加によって測定した基礎的な熱的応答または機械的応答（Ｃ、Ｄ）に影響を与えなかった。抗ＮＧＦ処置は、１９日目に、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇのモルヒネ（試験１５分前に腹腔内に）よりも、進行中の疼痛行動により大きな減少をもたらした（Ｅ、Ｆ）。運動誘発痛は、ＡＣＥ−１注入大腿の通常の非侵害的触診後、２分間の観察時間にわたる時間消費防御およびすくみの数の計数化によって測定した（Ｇ、Ｈ）。誤差棒はＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。図１０Ａ〜１０Ｆに関して、「＃」は、偽＋ビヒクルに対するＰ＜０．０５を示し；「＊」は、ＡＣＥ−１＋ビヒクルに対するＰ＜０．０５を示し；「＋」は、ＡＣＥ−１＋モルヒネに対するＰ＜０．０５を示す。図１０Ｇおよび１０Ｈに関して、「＊」は、偽処置に対するＰ＜０．０１を示し；「＃」は、ＡＣＥ−１＋ビヒクルに対するＰ＜０．０１を示す。 図１０は、抗ＮＧＦ療法が前立腺腫瘍誘導骨癌の疼痛を弱めたことを証明しているグラフを示す。抗ＮＧＦ処置（腫瘍注入後、７日目、１２日目、および１７日目に１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与）が、疾患進行を通じ、腫瘍注入７日目に始まった進行中の骨癌の疼痛行動を弱めた。進行中の疼痛（Ａ、Ｂ）の目安として、２分間の観察時間にわたる、ＡＣＥ−１注入大腿における時間消費防御および自発的すくみの数を用いた。抗ＮＧＦ（黒正方形）は、ＡＣＥ−１＋ビヒクル（白正方形）に比較して、腫瘍注入動物における進行中の疼痛行動を有意に減少させ、全てのパラメータに関して、９日目に偽処置レベル近くまで減少した（円形）。疾患の進行にわたり、偽処置＋ビヒクル動物における防御とすくみは双方とも、ＡＣＥ−１＋ビヒクル動物とは有意に異なっていた。抗ＮＧＦ処置は、熱刺激に対する足引っ込めの潜伏時間または機械的刺激の閾値増加によって測定した基礎的な熱的応答または機械的応答（Ｃ、Ｄ）に影響を与えなかった。抗ＮＧＦ処置は、１９日目に、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇのモルヒネ（試験１５分前に腹腔内に）よりも、進行中の疼痛行動により大きな減少をもたらした（Ｅ、Ｆ）。運動誘発痛は、ＡＣＥ−１注入大腿の通常の非侵害的触診後、２分間の観察時間にわたる時間消費防御およびすくみの数の計数化によって測定した（Ｇ、Ｈ）。誤差棒はＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。図１０Ａ〜１０Ｆに関して、「＃」は、偽＋ビヒクルに対するＰ＜０．０５を示し；「＊」は、ＡＣＥ−１＋ビヒクルに対するＰ＜０．０５を示し；「＋」は、ＡＣＥ−１＋モルヒネに対するＰ＜０．０５を示す。図１０Ｇおよび１０Ｈに関して、「＊」は、偽処置に対するＰ＜０．０１を示し；「＃」は、ＡＣＥ−１＋ビヒクルに対するＰ＜０．０１を示す。 図１１は、抗ＮＧＦ抗体処置が、腫瘍負荷量および腫瘍誘導骨再形成に影響を与えなかったことを証明している写真である。ビヒクルを投与された偽処置動物、（Ａ）は、１９日目に、Ｘ線写真上または組織学的に（Ｈ＆Ｅ）（Ｄ）明らかな骨破壊を示さなかったが、ＡＣＥ−１＋ビヒクル動物（Ｂ、Ｅ）およびＡＣＥ−１＋抗ＮＧＦ動物（Ｃ、Ｆ）は、Ｘ腺写真上または組織学的に調べた場合、有意な腫瘍の成長および骨再形成を示した。Ｈ＝造血細胞；Ｔ＝腫瘍；ＷＢ＝ＡＣＥ−１誘導骨形成；基準線＝１．５ｍｍ。 図１２は、抗ＮＧＦ療法が、腫瘍誘導破骨細胞生成を有意に減少させることがなかったことを証明している画像である。偽処置＋ビヒクル（Ａ）、ＡＣＥ−１＋ビヒクル（Ｂ）、およびＡＣＥ−１＋抗ＮＧＦ（Ｃ）のＴＲＡＰ染色画像は、偽処置＋ビヒクル動物および無処置＋ビヒクル動物に比較して、このモデルにおいて、抗ＮＧＦ動物とビヒクル処置動物の双方に、骨幹髄内領域の１ｍｍ２当たりの破骨細胞数の増加と共に、腫瘍誘導骨再形成の領域に沿って、増殖が生じたことを示している。抗ＮＧＦ処置動物（Ｃ）をビヒクル処置動物（Ｂ）と比較した場合、腫瘍／骨界面に沿った破骨細胞の組織学的外観または腫瘍を通じてのマクロファージに観察可能な違いはなかった。偽処置＋ビヒクル（Ａ）動物は、無処置動物と有意に異なることのない破骨細胞の数と形態ならびにマクロファージを提示した。矢印＝破骨細胞；矢じり記号＝マクロファージ；ＭＢ＝ミネラル化骨；Ｈ＝造血細胞；Ｔ＝腫瘍；基準線：５０μｍ。 図１３は、抗ＮＧＦ療法が、大腿におけるカルシトニン遺伝子関連ペプチド免疫反応性（ＣＧＲＰ−ＩＲ）感覚線維の濃度に影響を与えなかったことを証明している写真である。ＡＣＥ−１＋ビヒクル（Ａ）動物とＡＣＥ−１＋抗ＮＧＦ（Ｂ）動物との間には、免疫蛍光のレベルまたはＣＧＲＰ−ＩＲ線維の濃度に観察可能な違いはなかった。また、抗ＮＧＦ療法では、ＣＧＲＰ−ＩＲ線維が維持されたことにも注意されたい。Ｔ＝腫瘍；基準線：５０μｍ。 図１４は、抗ＮＧＦ療法が、後肢皮膚におけるカルシトニン遺伝子関連ペプチド免疫反応性（ＣＧＲＰ−ＩＲ）感覚線維の濃度に影響を与えなかったことを証明している写真である。無処置＋ビヒクル（Ａ）マウスと無処置＋抗ＮＧＦ（Ｂ）マウスとの間には、皮膚における免疫蛍光のレベルまたはＣＧＲＰ−ＩＲ線維の濃度に観察可能な違いは存在しなかった。同様に、ＡＣＥ−１＋ビヒクル（Ｃ）動物とＡＣＥ−１＋抗ＮＧＦ（Ｄ）動物との間には、免疫蛍光のレベルまたはＣＧＲＰ−ＩＲ神経線維の濃度に違いはなかった。また、無処置マウスとＡＣＥ−１注入マウスとの間（Ａ、Ｂ対Ｃ、Ｄ）には、ＣＧＲＰ−ＩＲ神経線維に違いがなかったことにも注意されたい。基準線：５０μｍ。

Claims (20)

  1. 神経成長因子（ＮＧＦ）アンタゴニストの有効量を個体に投与する工程を包含する、個体における骨癌の疼痛を処置するための方法。
  2. 前記骨癌の疼痛が、骨に生じる癌に由来する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記骨癌の疼痛が、骨肉腫に由来する、請求項２に記載の方法。
  4. 前記骨癌の疼痛が、骨に転移した癌に由来する、請求項１に記載の方法。
  5. 前記骨癌の疼痛が、骨に転移した前立腺癌に由来する、請求項４に記載の方法。
  6. 前記骨癌の疼痛が、骨に転移した乳癌に由来する、請求項４に記載の方法。
  7. 前記骨癌の疼痛が、骨に転移した肺癌に由来する、請求項４に記載の方法。
  8. 前記骨癌の疼痛が、骨に転移した肉腫に由来する、請求項４に記載の方法。
  9. 前記骨癌の疼痛が、骨に転移した腎臓癌に由来する、請求項４に記載の方法。
  10. 前記ＮＧＦアンタゴニストが、抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が、ヒト化抗体である、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が、ヒト抗体である、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が、ヒトＮＧＦに結合する、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が、げっ歯類ＮＧＦにさらに結合する、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体が、約０．１ｎＭまたは約０．１ｎＭ未満のＫＤでヒトＮＧＦに結合する、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の重鎖可変領域が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
  18. 前記抗ＮＧＦアンタゴニスト抗体の軽鎖可変領域が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
  19. 前記ＮＧＦアンタゴニストが、オピオイド鎮痛剤と同時投与されない請求項１に記載の方法。
  20. ＮＧＦアンタゴニスト、および骨癌の疼痛を処置するためにＮＧＦアンタゴニストを用いる使用説明書を含む、骨癌の疼痛を処置するためのキット。
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