CN101023099B - 通过施用神经生长因子拮抗剂治疗骨癌痛的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于预防或治疗包括与骨转移相关的癌症疼痛的骨癌痛的方法和组合物，所述预防或治疗是通过施用神经生长因子(NGF)的拮抗剂而实现。NGF拮抗剂可以是能够结合hNGF的抗NGF(如抗hNGF)抗体。

Description

通过施用神经生长因子拮抗剂治疗骨癌痛的方法
与相关申请的交叉参考
本申请要求在1994年10月19日递交的美国临时专利申请系列号No.60/620,654和在2004年4月7日递交的No.60/560,781的优先权，所有这些在此以其整体引入作为参考。
关于联邦政府所资助的研究或开发的声明
本发明是在美国政府的支持下进行的，国立卫生院拨款号为5R37-NS23970-16、5R01-DA11986-05和1R01-NS048021-01A1。美国政府在本发明中有一定权利。
发明领域
本发明涉及神经生长因子(NGF)拮抗剂用于骨癌痛的预防、改善或治疗的用途。
发明背景
神经生长因子(NGF)是第一个被鉴定的神经营养蛋白，已很好地表征了其在周围和中枢神经元的发育和存活中的作用。已经证明NGF是在周围交感神经元和胚胎感觉神经元以及基底前脑胆碱能神经元的发育中关键的存活和维持因子(Smeyne等人Nature 368：246-249(1994)；Crowley等人，Cell 76：1001-1011(1994))。NGF在感觉神经元中上调神经肽的表达(Lindsay等人，Nature 337：362-364(1989))，其活性通过与肿瘤坏死因子受体家族的其它成员结构相关的两个不同的膜-结合受体即TrkA酪氨酸激酶受体和p75受体介导(Chao等人，Science 232：518-521(1986))。
除了其在神经系统中的效应，逐渐发现NGF参与神经系统外的过程。例如，已经证明NGF能在大鼠中提高血管的渗透性(Otten等人，Eur JPharmacol.106：199-201(1984))、提高T细胞和B细胞免疫应答(Otten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10059-10063(1989))、诱导淋巴细胞分化和肥大细胞增殖以及导致从肥大细胞中释放可溶性生物学信号(Matsuda等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6508-6512(1988)；Pearce等人，J.Physiol.372：379-393(1986)；Bischoff等人，Blood 79：2662-2669(1992)；Horigome等人，J Biol.Chem.268：14881-14887(1993))。尽管已经证明外源性添加的NGF能具有所有这些效应，需要注意的是几乎很少证明内源性NGF在体内任何的这些过程中也很重要(Torcia等人，Cell.85(3)：345-56(1996))。因此，不清楚抑制内源性NGF的生物活性可能会产生什么影响(如果有影响的话)。
NGF由许多细胞类型产生，包括肥大细胞(Leon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3739-3743(1994))、B淋巴细胞(Torcia等人，Cell 85：345-356(1996)、角质形成细胞(Di Marco等人，J.Biol.Chem.268：22838-22846))、平滑肌细胞(Ueyama等人，J.Hypertens.11：1061-1065(1993))、成纤维细胞(Lindholm等人，Eur.J.Neurosci.2：795-801(1990))、支气管上皮细胞(Kassel等人，Clin，Exp.Allergy 31：1432-40(2001))、肾系膜细胞(Steiner等人，Am.J.Physiol.261：F792-798(1991))以及骨骼肌肌管(Schwartz等人，J Photochem，Photobiol.B 66：195-200(2002))。已经在神经系统外的多种细胞类型上发现了NGF受体。例如，已经在人类单核细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞以及肥大细胞上发现了TrkA。
已经在人类患者以及若干动物模型中观察到了增加的NGF水平和多种炎症状态之间的联系。这些包括系统性红斑狼疮(Bracci-Laudiero等人，Neuroreport 4：563-565(1993))、多发性硬化症(Bracci-Laudiero等人，Neurosci.Lett.147：9-12(1992))、银屑病(Raychaudhuri等人，Acta Derm.l′enereol.78：84-86(1998))、关节炎(Falcimi等人，Ann.Rheum.Dis.55：745-748(1996))、间质性膀胱炎(Okragly等人，J.Urology 161：438-441(1991))、哮喘(Braun等人，Eur.J Immunol.28：3240-3251(1998))、胰腺炎和前列腺炎。
相对应地，周围组织中提高的NGF水平始终与炎症相关并且已经在许多类型的关节炎中观察到。受类风湿性关节炎侵袭的患者的滑膜表达高水平的NGF，而在未发炎的滑膜中据报道检测不到NGF(Aloe等人，Arch.Rheum.35：351-355(1992))。在患有实验诱导的类风湿性关节炎的大鼠中观察到类似的结果(Aloe等人，Clin.Exp.Rheumatol.10：203-204(1992)；Halliday等人，Neurochem.Res.23：919-22(1998))。已有报道在转基因关节炎小鼠中NGF水平提高且肥大细胞的数量增加(Aloe等人，Int.J.TissueReactions-Exp.Clin.Aspects 15：139-143(1993))。
用外源性NGF治疗导致疼痛和疼痛敏感性增加。这是通过在动物模型(Lewin等人，J.Neurosci.13：2136-2148(1993)；Amann等人，Pain 64，323-329(1996)；Andreev等人，Pain 63，109-115(1995))和在人类(Dyck等人，Neurology 48，501-505(1997)；Petty等人，Annals Neurol.36，244-246(1994))中注射NGF均导致疼痛和疼痛敏感性显著增加的事实阐明。NGF似乎通过多种机制起作用，包括诱导神经营养蛋白BDNF(Apfel等人，Mol.Cell.Neurosci.7(2)，(1996)；Michael等人，J.Neurosci 17，8476-8490(1997))，其依次改变脊髓中疼痛信号的加工(Hains等人，Neurosci Lett.320(3)，125-8(2002)；Miletic等人，Neurosci Lett.319(3)，137-40(2002)；Thompson等人，Proc Natl Acad Sci USA 96(14)，7714-8(1999))，诱导脊髓中感觉神经元和其它传递疼痛的神经元在周围连接和中枢连接中的改变(Lewin等人，European Journal of Neuroscience 6，1903-1912(1994)；Thompson等人，Pain 62，219-231(1995))，诱导轴突生长的改变(Lindsay，RM，J Neurosci.8(7)，2394-405(1988))，诱导缓激肽受体表达(Peterson等人，Neuroscience 83：161-168(1998))，诱导负责神经活化和传导如离子通道的基因表达的改变(Boettger等人，Brain 125(Pt 2)，252-63(2002)；Kerr等人，Neuroreport 12(14)，(2001)；Gould等人，Brain Res 854(1-2)，(2000)；Fjell等人，J.Neurophysiol.81：803-810(1999))，加强疼痛相关受体TRPV1(Chuang等人，Nature 411(6840)，957-62(2001)；Shu和Mendell，Neurosci.Lett.274：159-162(1999))以及导致肌肉的病理改变(Foster等人，J Pathol197(2)，245-55(2002))。许多的这些改变直接发生在传导疼痛的感觉神经元上并且显然不依赖于所伴随的炎症。另外，已知至少有两类其它细胞类型应答NGF，并且其可能参与疼痛感觉或敏感性的改变。这些细胞类型中的第一个即肥大细胞，已被报道应答NGF产生脱粒(Yan等人，Clin.Sci.(Lond)80：565-569(1991))或者(在其它研究中)与其它试剂协同导致或增加递质产生或释放(Pearce和Thompson，J.Physiol.372：379-393(1986)，Kawamoto等人，J.Immunol.168：6412-6419(2002))。在大鼠中已清楚地证明NGF所介导的疼痛应答至少在某种程度上由肥大细胞介导(Lewin等人，Eur.J.Neurosci.6：1903-1912(1994)，Woolf等人，J Neurosci.16：2716-2723(1996)，尽管这种潜在的关联仍然需要在人类中得到证实。已知初级交感神经元也应答NGF并且参与疼痛信号传导(Aley等人，Neuroscience71：1083-1090(1996))。人们已清楚除去交感神经的神经支配改变通常所见的应答NGF治疗的痛觉过敏(Woolf等人，J.Neurosci.16：2716-2723(1996))。
已经描述了使用NGF拮抗剂，如抗NGF抗体治疗多种类型的疼痛。见，例如，美国系列号No.10/682,331、10/682,638、10/682,332(公开号No.2004/0131615)、10/783,730(公开号No.2004/0253244)、10/745,775(公开号No.2004/0237124)、10/791,162；PCT/US 03/32089(WO 04/032870)；PCT/US03/32083(WO 2005/000194)；PCT/US03/32113；PCT/US2004/05162(WO 04/073653)；PCT/US03/41252(WO 04/058184)。
骨癌痛可能出现在原发性骨肿瘤或者更常见地出现在骨转移瘤(如来自乳腺癌、前列腺癌和肺癌)的患者中。见Luger等人，Pain 99：397-406(2002)。已经开发了骨癌痛的小鼠模型，骨癌痛的这种模型反映了在患有中度到晚期骨癌痛人患者中所观察到的疼痛。见Luger等人，Pain 99：397-406(2002)；Clohisy等人，Clinical Orthopaedics and Related Research415S：S279-S288(2003)；Schwei等人，J.Neruosci.19：10886-10897(1999)；Honore等人，Nat.Med.6：521-529(2000)。Honore等人和Schwei等人所发表的文章叙述了在患骨癌动物的脊髓和DRG中所观察到的改变的神经化学标志是独特的，并且可与典型的炎性疼痛或典型的神经病性疼痛相区别，尽管该生化标志中似乎存在着与该模型中的典型炎性和神经病性疼痛情况类似的成分。Honore等人Neuroscience 98：585-598(2000)；Schwei等人J.Neruosci.19：10886-10897(1999)；Luger等人，Pain 99：397-406(2002)。
这里所引用的所有参考文献，包括专利申请和公开物，以其整体引入作为参考。
发明简述
本发明是基于NGF拮抗剂如抗NGF抗体能有效治疗包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的发现。所述治疗针对包括与本文所述的骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的一个或多个方面。
在一个方面，本发明公开了通过施用神经生长因子(NGF)拮抗剂预防或治疗包括与骨转移有关的癌症疼痛(也称作“骨转移痛”)的骨癌痛的方法。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与阿片样止痛剂一同施用。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与NSAID一同施用。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与阿片样止痛剂和NSAID一同施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂不与阿片样止痛剂一同施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂不与NSAID一同施用。
在另一个方面，本发明提供在个体中减少包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的发生率、改善包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛、减轻包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛和/或延缓包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的发生或进展的方法，所述方法包括施用有效量的NGF拮抗剂。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与阿片样止痛剂一同施用。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与NSAID一同施用。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与阿片样止痛剂和NSAID一同施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂不与阿片样止痛剂一同施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂不与NSAID一同施用。
在一些实施方案中，骨癌痛来自起源于骨的癌症。在一些实施方案中，骨癌痛来自骨肉瘤。在一些实施方案中，骨癌痛来自转移到骨的癌症。在一些实施方案中，骨转移是转移到骨的前列腺癌。在一些实施方案中，骨转移是转移到骨的乳腺癌。在一些实施方案中，骨转移是转移到骨的肺癌。在一些实施方案中，骨转移是转移到骨的肉瘤。在一些实施方案中，骨转移是转移到骨的肾癌。在一些实施方案中，骨转移是转移到骨的多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，所治疗的癌症疼痛是轻度到中度的疼痛。在一些实施方案中，所治疗的癌症疼痛是中度到重度的疼痛。在一些实施方案中，所治疗的癌症疼痛是重度的疼痛。
适于在本发明方法中使用的NGF拮抗剂是可直接或间接地导致NGF生物活性降低的任何试剂。在一些实施方案中，NGF拮抗剂(例如，抗体)结合(物理上相互作用)NGF、结合NGF受体(如trkA受体和/或p75)，和/或减少(妨碍和/或阻滞)下游NGF受体信号传导(例如，激酶信号传导的抑制剂)。因此，在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合(物理上相互作用)NGF。在其它实施方案中，NGF拮抗剂结合NGF受体(如TrkA受体和/或p75)。在其它实施方案中，NGF拮抗剂减少(妨碍和/或阻滞)下游NGF受体信号传导(例如，激酶信号传导的抑制剂)。在其它实施方案中，NGF拮抗剂抑制(减少)NGF合成和/或释放。在另一实施方案中，NGF拮抗剂是TrkA免疫粘附素。在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合NGF(如hNGF)并且不显著地结合相关的神经营养蛋白如NT-3、NT4/5和/或BDNF。在一些实施方案中，NGF拮抗剂选自下列中的任何一个或多个：抗NGF抗体、针对NGF的反义分子(包括针对编码NGF的核酸的反义分子)、针对NGF受体(如trkA和/或p75)的反义分子(包括针对编码NGF受体的核酸的反义分子)、NGF抑制性化合物、NGF结构类似物、结合NGF的TrkA和/或p75受体的显性失活突变、抗TrkA抗体、抗p75抗体和激酶抑制剂。在另一实施方案中，NGF拮抗剂是抗NGF抗体。又在其它实施方案中，抗NGF抗体是人源化的(如本文所述的抗体E3)。在一些实施方案中，抗NGF抗体是抗体E3(如本文所述)。在其它实施方案中，抗NGF抗体包括抗体E3的一个或多个CDR(如E3的一个、两个、三个、四个、五个CDR，或者在一些实施方案中，E3的所有六个CDR)。在其它实施方案中，抗体是人抗体。在一些实施方案中，抗体包括E3的重链的三个CDR。在一些实施方案中，抗体包括E3的轻链的三个CDR。又在其它实施方案中，抗NGF抗体包括在表1中所示的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。在其它实施方案中，抗NGF抗体包括在表2中所示的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。又在其它实施方案中，抗NGF抗体包括在表1中所示的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和在表2中所示的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。又在其它实施方案中，抗体包含修饰的恒定区，如免疫学上惰性的恒定区，例如，不触发补体介导的溶解，或者不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在其它实施方案中，如Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624；PCT申请号PCT/GB99/01441；和/或英国专利申请No.9809951.8中所述修饰恒定区。
在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合NGF。又在其它实施方案中，NGF拮抗剂是特异性结合NGF(如人类NGF)的抗体。又在其它实施方案中，抗体与选自下列小鼠单克隆抗体中的任何一种或多种抗体结合基本上相同的NGF表位6：MAb 911、MAb 912和MAb 938(见Hongo等人，Hybridoma 19：215-227(2000))。在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合trkA受体。NGF拮抗剂可以是抗人NGF(抗hNGF)单克隆抗体，其能结合hNGF并且有效地抑制hNGF与人TrkA(hTrkA)的结合和/或有效地抑制人TrkA受体的活化。
抗NGF抗体与NGF(如hNGF)的结合亲和力可以是约0.10nM到约1.0nM、约0.10nM到约0.80nM、约0.15nM到约0.75nM以及约0.18nM到约0.72nM。在一个实施方案中，结合亲和力是在约2pM和22pM之间。在有些实施方案中，结合亲和力是约10nM。在其它实施方案中，结合亲和力小于约10nM。在其它实施方案中，结合亲和力是约0.1nM或约0.07nM。在其它实施方案中，结合亲和力小于约0.1nM，或者小于约0.07nM。在其它实施方案中，结合亲和力是约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM，或者约50pM中的任何一种到约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM或约40pM中的任何一种。在一些实施方案中，结合亲和力是约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM，或约50pM，或小于约50pM中的任何一种。在一些实施方案中，结合亲和力小于如下的任何一种：约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM或约50pM。又在其它实施方案中，结合亲和力是约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM、约40pM、或者高于约40pM。如本领域公知的，结合亲和力可表达为KD，或者说解离常数，且增加的结合亲和力对应于减少的KD。抗NGF小鼠单克隆抗体911(Hongo等人，Hybridoma 19：215-227(2000)与人NGF的结合亲和力为约10nM，而人源化抗NGF抗体E3(如本文所述)与人NGF的结合亲和力是约0.07nM。抗体911和E3的结合亲和力是使用其Fab片段测量的。
可在个体被诊断为患有骨癌或者癌症转移到骨之前、期间和/或之后施用NGF拮抗剂。可通过现有技术中的任何已知方式施用NGF拮抗剂，包括：口服、静脉内、皮下、动脉内、肌肉内、心内、脊柱内、胸内、腹膜内、心室内、舌下和/或经皮。在一些实施方案中，NGF拮抗剂是抗NGF抗体，通过下列方式中的一种或多种施用：静脉内、皮下、经吸入、动脉内、肌肉内、心内、心室内以及腹膜内。给药可以是全身性的，例如静脉内，或者是局部的。
在一些实施方案中，以约0.1到10mg/kg体重的剂量施用NGF拮抗剂，在另一些实施方案中，以约0.3到2.0mg/kg体重的剂量施用NGF拮抗剂。
在另一方面，本发明公开了用于治疗和/或预防包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的组合物，包括与一种或多种可药用赋形剂联合的有效量的神经生长因子(NGF)拮抗剂。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与阿片样止痛剂一同施用。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与NSAID一同施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂不与阿片样止痛剂或NSAID一同施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂是特异性结合NGF分子的抗体。在其它实施方案中，NGF拮抗剂是本文所述的任何拮抗剂。
在另一方面，本发明公开了用于本文所述任何方法的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包括与可药用载体联合的任何本文所述的NGF拮抗剂。在其它实施方案中，试剂盒还包括在本文所述任何方法中使用NGF拮抗剂的说明书。
附图简述
图1是描述肉瘤注射后的第10天和第14天通过在2分钟观察期间的自发防卫和自发畏缩评估进行性疼痛的图。“未注射肉瘤”指没有进行任何注射的动物。“假处理+载体”指将α-极限必需培养基注射到股骨骨髓腔内且稍后注射盐水的动物。“肉瘤+载体”指将肉瘤注射到股骨骨髓腔内且稍后注射盐水的动物。“肉瘤+抗NGF”指将肉瘤注射到股骨骨髓腔内且稍后注射抗NGF抗体911的动物。
图2是描述在肉瘤注射后的第10天和第14天，通过肢体使用和被迫的步行防卫(转棒)评估步行痛的图。“未注射肉瘤”指没有进行任何注射的动物。“假处理+载体”指将α-极限必需培养基注射到股骨骨髓腔内且稍后注射盐水的动物。“肉瘤+载体”指将肉瘤注射到股骨骨髓腔内且稍后注射盐水的动物。“肉瘤+抗NGF”指将肉瘤注射到股骨骨髓腔内且稍后注射抗NGF抗体911的动物。
图3是描述在肉瘤注射后的第10天和第14天，通过在2分钟观察期间的触诊诱导的防卫和触诊诱导的畏缩评估接触引起的疼痛的图。“未注射肉瘤”指没有进行任何注射的动物。“假处理+载体”指将α-极限必需培养基注射到股骨骨髓腔内且稍后注射盐水的动物。“肉瘤+载体”指将肉瘤注射到股骨骨髓腔内且稍后注射盐水的动物。“肉瘤+抗NGF”指将肉瘤注射到股骨骨髓腔内且稍后注射抗NGF抗体911的动物。
图4显示证明抗NGF抗体在肿瘤注射后第14天(d14)对骨的疾病进展无影响的照片。(a)和(d)显示了给予载体的假处理动物(假处理+载体)(n＝8)；(b)和(e)显示了给予载体的注射了肉瘤(GFP转染的)的动物(肉瘤+载体)(n＝13)；(c)和(f)显示了给予抗NGF抗体的注射了肉瘤(GFP转染的)的动物(肉瘤+抗NGF)(n＝8)。图4a、4b和4c显示了存在或缺乏骨破坏时的射线照片。图4d、4e、4f显示了用抗GFP抗体免疫染色的照片。刻度条：1mm。
图5显示证明抗NGF抗体治疗对皮肤的感觉神经支配没有可观察到的影响的照片。将注射肉瘤的(a，b)和未注射肉瘤的(c，d)小鼠的后爪皮肤样品进行神经肽降钙素基因相关肽(CGRP)的免疫染色，其标记无髓鞘的肽能感觉神经纤维。显示注射了肉瘤并用载体处理的(a，n＝3)小鼠、注射了肉瘤并用抗NGF抗体处理的(b，n＝8)小鼠，未注射肉瘤并用载体处理的(c，n＝8)小鼠，以及未注射肉瘤并用抗NGF抗体处理的(d，n＝8)小鼠的后爪皮肤样品的CGRP免疫染色。刻度条：50μm。
图6显示证明抗NGF治疗减弱骨癌痛的图。使用在2分钟的观察期间注射了肉瘤的肢体防卫所用去的时间和自发畏缩次数作为将肉瘤细胞注射到并限于左侧股骨中后第8、10、12和14天进行性疼痛的衡量(a，b)。运动所引发的疼痛参数包括注射了肉瘤的股骨在正常无害触诊后，在2分钟观察期间防卫所用时间和畏缩数的定量(c，d)。“#”表示相对于假处理+载体，P＜0.05；“＊”表示相对于肉瘤+载体，P＜0.05。
图7显示证明抗NGF的治疗对基线热阈值或机械阈值没有影响以及在减少骨癌痛方面比吗啡(MS)更有效的图。图7a和7b显示在未注射肉瘤小鼠中通过爪对热刺激撤回的潜伏期所测得的热敏感性(a，对于未注射肉瘤+载体，n＝8，对于未注射肉瘤+抗NGF，n＝8)和通过抗NGF治疗(10mg/kg，腹膜内注射，每5天一次)的机械刺激的50％阈值所测得的机械敏感性(b，对于未注射肉瘤+载体n＝8，对于未注射肉瘤+抗NGF，n＝8)。图7c和7d显示远侧股骨的正常无害触诊后，通过测量2分钟观察期间的自发防卫(c)评估进行性的疼痛行为，以及通过测量在2分钟观察期间防卫所用的时间(d)评价运动所引发的疼痛。显示未注射肉瘤的、假处理并用载体处理的、注射肉瘤并用载体处理的、注射肉瘤并用吗啡(n＝8，试验前15分钟腹膜内给药10mg/kg)处理的、注射肉瘤并用吗啡(n＝8，试验前15分钟腹膜内给药30mg/kg)处理的，以及注射肉瘤并用抗NGF抗体(n＝8，肿瘤注射后第6天起到第14天，每5天腹膜内给药10mg/kg)处理的小鼠的自发防卫值(c)和触诊诱导的防卫值(d)。误差条表示S.E.M。“#”表示相对于假处理+载体(n＝8)，P＜0.05；“＊”表示相对于肉瘤+载体，P＜0.05；“+”表示相对于肉瘤+吗啡，P＜0.05。
图8显示证明用抗NGF拮抗剂抗体治疗在携带肿瘤动物的背根神经节(DRG)中减少神经化学改变和巨噬细胞浸润的照片。图8a和8b显示肿瘤移植后14天，在用载体处理的(a，n＝8)和用抗NGF抗体处理的(b，n＝8)携带肿瘤动物的同侧L2 DRG中，活化的转录因子3(ATF-3)的免疫荧光染色。下图显示在用载体处理的(c，n＝7)和用抗NGF抗体处理的(d，n＝7)携带肿瘤动物的同侧DRG内，指示损伤感觉神经元周围活化的和浸润的巨噬细胞的密度的CD-68的免疫荧光染色。刻度条a-d＝5μm。
图9显示证明通过施用抗NGF减弱与中央致敏作用有关的神经化学变化的显微照片。图9A和9B显示在注射了肉瘤并用载体处理的小鼠(A，n＝9)和注射了肉瘤并用抗NGF抗体处理的小鼠(B，n＝4)的脊髓后角中强啡肽的免疫染色。图9C和9D显示在携带肿瘤肢体的正常无害触诊后，在注射了肉瘤并用载体处理的小鼠(C，n＝4)和注射了肉瘤并用抗NGF抗体处理的小鼠(D，n＝4)中表达c-Fos的脊髓神经元的代表性共聚焦图象。刻度条：对于A和B是150μm；对于C和D是200μm。
图10显示证明抗NGF治疗减弱前列腺肿瘤诱导的骨癌痛的图。抗NGF治疗(10mg/kg，腹膜内注射，在肿瘤注射后的第7、12和17天施用)在肿瘤注射后的第7天开始，在整个疾病进展中减弱进行性的骨癌痛行为。使用在2分钟的观察期间在注射了ACE-1的股骨中防卫所用的时间和自发畏缩次数作为对进行性疼痛的衡量(A，B)。与ACE-1+载体(空心正方形)相比，抗NGF(实心正方形)在注射了肿瘤的动物中显著减少进行性的疼痛行为，并且在第9天所有参数(圆形)均降低到接近假处理的水平。在疾病的进展中，在假处理+载体的动物中防卫和畏缩都与ACE-1+载体的动物显著不同。通过测量爪对热刺激撤回的潜伏期或者机械刺激阈值的增加，抗NGF治疗对基础热反应或机械反应没有影响(C，D)。抗NGF治疗在第19天比10mg/kg或30mg/kg吗啡(测试前15分钟腹膜内注射)更多地减少进行性的疼痛行为(E，F)。通过对注射ACE-1的股骨的正常无害触诊后在2分钟观察期间防卫所用的时间和畏缩次数进行定量，测量运动引发的疼痛(G，H)。误差条代表S.E.M。对于图10A-F，“#”表示相对于假处理+载体，P＜0.05；“＊”表示相对于ACE-1+载体，P＜0.05；“+”表示相对于ACE-1+吗啡，P＜0.05。对于图10G和10H，“＊”表示相对于假处理，P＜0.01；“#”表示相对于ACE-1+载体，P＜0.01。
图11是证明抗NGF抗体治疗对肿瘤负荷或肿瘤诱导的骨重建没有影响的照片。给予载体的假处理动物(A)在第19天在放射显影照片上或组织学上(H&E)未显示明显的骨破坏(D)，而当用放射显影照片或组织学进行检查时，ACE-1+载体动物(B，E)和ACE-1+抗NGF动物(C，F)显示显著的肿瘤生长和骨重建。H＝造血细胞；T＝肿瘤；WB＝ACE-1诱导的骨形成；刻度条＝1.5mm。
图12是证明抗NGF治疗不能显著减少肿瘤诱导的破骨细胞发生的图象。假处理+载体(A)、ACE-1+载体(B)和ACE-1+抗NGF(C)的TRAP染色的图象说明，增殖发生在该模型中沿着肿瘤诱导的骨重建区域，与假处理+载体和未注射肿瘤+载体的动物相比，抗NGF和用载体处理的(荷瘤)动物中每平方毫米骨干髓内区中破骨细胞的数量均增加。当将用抗NGF处理的动物(C)与用载体处理的动物(B)进行比较时，沿肿瘤/骨界面的破骨细胞或者整个肿瘤中的巨噬细胞在组织学外观上没有可见的差异。假处理+载体(A)动物呈现的破骨细胞数量和形态以及巨噬细胞均与未注射肿瘤的动物无显著地不同。箭头＝破骨细胞；箭头状记号＝巨噬细胞；MB＝矿化的骨；H＝造血细胞；T＝肿瘤；刻度条：50μm。
图13是证明抗NGF治疗不影响股骨中降钙素基因相关肽免疫反应(CGRP-IR)感觉纤维的密度的照片。在ACE-1+载体(A)的动物和ACE-1+抗NGF(B)的动物之间，CGRP-IR纤维的免疫荧光水平或密度没有可见的差异。还注意到，抗NGF治疗维持CGRP-IR纤维。T＝肿瘤，刻度条：50μm。
图14是证明抗NGF治疗不影响后爪皮肤中降钙素基因相关肽免疫反应(CGRP-IR)感觉纤维的密度的照片。在未注射肿瘤+载体(A)的小鼠和未注射肿瘤+抗NGF(B)的小鼠之间，皮肤中CGRP-IR纤维的免疫荧光水平或密度没有可见的差异。类似地，在ACE-1+载体(C)的动物和ACE-1+抗NGF(D)的动物之间，CGRP-IR神经纤维的免疫荧光水平或密度没有差异。还注意到，在未注射肿瘤的和ACE-1注射的小鼠之间(A，B相对于C，D)CGRP-IR神经纤维没有差异。刻度条：50μm。
发明详述
本发明是基于体内施用治疗有效量的NGF拮抗剂(如NGF单克隆抗体)可用于治疗包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的发现。本发明是基于在小鼠骨癌模型中施用抗NGF拮抗剂抗体显著有效地减少进行性的和运动引发的骨癌痛的观察。
本发明公开了通过施用有效量的NGF拮抗剂[如抗NGF抗体，例如抗人NGF(抗hNGF)单克隆抗体]在个体(包括人和非人)中预防或治疗包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的方法。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与阿片样止痛剂一同施用。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与NSAID一同施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂不与阿片样止痛剂一同施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂不与NSAID一同施用。
在另一方面，本发明提供改善、延缓发展和/或预防包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛进展的方法，包括向个体施用有效量的NGF拮抗剂。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与阿片样止痛剂一同施用。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与NSAID一同施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂不与阿片样止痛剂一同施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂不与NSAID一同施用。
本发明也公开了用于治疗包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的组合物和试剂盒，所述组合物和试剂盒包括NGF拮抗剂如抗NGF抗体，例如，抗NGF单克隆抗体，用于这里所提供的任何方法。在一些实施方案中，抗NGF抗体能有效地抑制NGF结合其TrkA和/或p75受体和/或能有效地抑制NGF活化其TrkA和/或p75受体。
常规技术
除非另有说明，本发明的实施将使用在本领域技术内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。这些技术已在文献中充分说明，如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Methods in Molecular Biology，HumanaPress；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑，1993-8)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook of ExperimentalImmunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos，编辑，1987)；CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑，1987)；PCR：ThePolymerase Chain Reaction，(Mullis等人编辑，1994)；Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan等人编辑，1991)；Short Protocols in MolecularBiology(Wiley and Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.编辑，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practicalapproach(P.Shepherd和C.Dean编辑，Oxford University Press，2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow和D.Lane(Cold SpringHarbor Laboratory Press，1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑，Harwood Academic Publishers，1995)。
定义
“抗体”(可互换地使用复数形式)是免疫球蛋白分子，能够通过至少一个位于所述免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合靶标，如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如文中所用，该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且还包括其片段(如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及包括具有所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。抗体包括任何类型的抗体，如IgG、IgA或IgM(或者它们的亚型)，且抗体不必是任何特殊的类型。根据其重链恒定区的抗体氨基酸序列，可将免疫球蛋白分成不同的类型。有五种主要的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些类型中的几种可进一步被分成亚型(同位型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类型的免疫球蛋白对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是公知的。
“单克隆抗体”指均质的抗体群，其中单克隆抗体由参与选择性结合抗原的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)构成。针对单一抗原位点的单克隆抗体群是高度特异性的。术语“单克隆抗体”不仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且也包括其片段(如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合的单克隆抗体，以及包括具有所需特异性的抗原识别位点和结合抗原能力的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。有关抗体的来源或者抗体制备的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)并非旨在限制。
如本文所用，术语“神经生长因子”和“NGF”指神经生长因子及其保留至少部分NGF活性的变体。如本文所用，NGF包括所有哺乳动物物种的天然序列NGF，包括人、犬、猫、马或牛。
“NGF受体”指被NGF结合或活化的多肽。NGF受体包括任何哺乳动物物种的TrkA受体和p75受体，包括但不限于：人、犬、猫、马、灵长类或牛。
“NGF拮抗剂”指阻滞、抑制或减少(包括显著地)NGF生物活性的任何分子，所述NGF生物活性包括由NGF信号传导介导的下游通路，如受体结合和/或引起对NGF的细胞应答。术语“拮抗剂”无论如何不意味着任何特殊的生物学作用机制，并被认为是清楚地包括和包含了与NGF的所有可能的药理学的、生理的和生化的相互作用(所述相互作用可以是直接地或间接地，是与NGF、其受体，或者通过另一种机制的相互作用)，并且可通过多种不同的且化学上各异的组合物获得的其结果。示范性的NGF拮抗剂包括但不限于：抗NGF抗体、针对NGF的反义分子(包括针对编码NGF的核酸的反义分子)、NGF抑制性化合物、NGF结构类似物、结合NGF的TrkA受体的显性失活突变、TrkA免疫粘附素、抗TrkA抗体、抗p75抗体以及激酶抑制剂。为了本发明的目的，将清楚地理解为术语“拮抗剂”涵盖所有以前所鉴定的术语、名称以及功能状态和特征，由此NGF本身、NGF生物活性(包括但不限于其介导与骨转移有关的癌症疼痛的任何方面的能力)或者其生物活性的结果在任何有意义的程度上被实质上无效化、降低或中和。在一些实施方案中，NGF拮抗剂(例如，抗体)结合(物理上相互作用)NGF、结合NGF受体(如trkA受体和/或p75受体)、减少(妨碍和/或阻滞)下游NGF受体信号传导，和/或抑制(减少)NGF合成、生产或释放。在其它实施方案中，NGF拮抗剂结合NGF并防止TrkA受体二聚化和/或TrkA自体磷酸化。在其它实施方案中，NGF拮抗剂抑制或减少NGF合成和/或生产(释放)。NGF拮抗剂类型的实例在文中提供。
如本文所用，“抗NGF抗体”指能结合NGF并抑制NGF生物活性和/或由NGF信号传导介导的下游通路的抗体。
“TrkA免疫粘附素”指包括TrkA受体片段的可溶性嵌合分子，例如，TrkA受体的胞外区和免疫球蛋白序列，其保留TrkA受体的结合特异性。
NGF的“生物活性”通常指结合NGF受体和/或活化NGF受体信号传导途径的能力。生物活性没有限制地包括下列中的任何一种或多种：结合NGF受体(如p75和/或TrkA)的能力；促进TrkA受体二聚化和/或自体磷酸化的能力；活化NGF受体信号传导通路的能力；促进细胞分化、增殖、存活、生长、迁移和细胞生理学其它改变的能力，包括(在神经元的情况中，包括周围和中枢神经元)在神经元形态学、突触发生、突触功能、神经递质和/或神经肽释放和损伤后再生方面的改变；以及调解与骨转移相关的癌症疼痛的能力。
如本文所用，“治疗”是一种获得有益的或期望临床结果的方法。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于下列中的一种或多种：疼痛的任何方面的改善，包括减少严重程度，减轻与骨癌痛(例如，与骨转移有关的癌症疼痛)有关的一种或多种症状，包括骨癌痛的任何方面(如缩短疼痛持续的时间，和/或减少疼痛的敏感性或感觉)。
“有效量”是足以达到包括减轻或减少疼痛的有益或期望的临床结果的量。为了本发明的目的，NGF拮抗剂的有效量是足以治疗、改善、减少疼痛的强度或者预防包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的量。在一些实施方案中，“有效量”可减少进行性的疼痛和/或突破性的疼痛(包括步行痛和接触引发的疼痛)的疼痛，其可在癌症转移到骨之前、期间和/或之后施用。在一些实施方案中，“有效量”是足以延缓包括与骨转移有关癌症疼痛的骨癌痛的发展的量。
疼痛的“减少发生率”意指减少疼痛的严重程度(其可包括减少通常用于这些情况的其它药物和/或治疗的需求和/或量(例如，接触))、持续时间、和/或频率(包括，例如，在个体中延缓或增加包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的时间)中的任何一种。如本领域的那些技术人员所理解的，个体在其对治疗的应答方面可能不同，并且如，例如，“在个体中包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛减少发生率的方法”反映了施用本文所述的NGF拮抗剂，该施用是基于这种施用可能在该特定个体中导致这样的发生率降低的合理期望。
“改善”骨癌痛(如与骨转移有关的癌症疼痛)或者骨癌痛的一种或多种症状意指与不施用NGF拮抗剂相比，减少或改善骨癌痛的一种或多种症状。“改善”也包括缩短或减少症状的持续时间。
“减轻”骨癌痛(如与骨转移有关的癌症疼痛)或者骨癌痛的一种或多种症状意指在根据本发明使用NGF拮抗剂治疗的个体或个体群中减少骨癌痛的一种或多种不期望的临床表现的程度。
如本文所用，“延缓”包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的发展意指推迟、妨碍、减慢、延迟、稳定和/或延缓包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的进展。该延缓可以是改变时间的长度，取决于病史和/或治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，充分或显著的延缓可以在本质上包括预防，这在于个体不发展为包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛。“延缓”症状发展的方法是当与不使用该方法相比时，在特定的时间范围内减少发展症状的可能性和/或在特定的时间范围内减少症状的程度的方法。这些比较一般是基于临床研究，使用足以给出统计学意义结果的受试者数量。
包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的“发展”或“进展”意指该紊乱的最初表现和/或随后的进展。包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛发展可以是可检测到的并且可使用本领域公知的标准临床技术进行评估。然而，发展也指可能不被检测到的进展。为了本发明的目的，发展或进展指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用，骨癌痛(如与骨转移有关的癌症疼痛)的“发作”或“发生”包括最初的发作和/或复发。
如本文所用，“共施用”包括同时施用和/或在不同时间施用。共施用也包括以共制剂(即，NGF拮抗剂和试剂存在于同一组合物中)施用或者以独立的组合物施用。如本文所用，共施用意指包括其可同时和/或单独地向个体施用试剂和NGF拮抗剂的任何情况。如在这里所进一步讨论的，应当理解的是，NGF拮抗剂和试剂可以以不同的给药频率或时间间隔施用。例如，抗NGF抗体可每周施用一次，而试剂可更频繁地施用。应当理解的是，可以以相同的给药途径或不同的给药途径施用NGF拮抗剂和试剂。术语“阿片样止痛剂”指具有吗啡样作用的，天然的或合成的所有药物。合成的和半合成的阿片样止痛剂有五类化合物的化学衍生物：菲类；苯庚胺类；苯哌啶类；吗啡喃类；以及苯并吗啡喃类，所有这些都落入该术语的范围内。示范性的阿片样止痛剂包括可待因、双氢可待因、海洛因、二氢可待因酮、氢吗啡酮、左啡烷、羟吗啡酮、阿芬他尼、丁丙诺啡、布托啡诺、芬太尼、舒芬太尼、杜冷丁、美沙酮、纳布啡(nalbuphine)、丙氧芬和喷他佐辛或它们的可药用盐。
术语“NSAID”指非甾族抗炎化合物。NSAID根据它们抑制环加氧酶的能力进行分类。环加氧酶1和环加氧酶2是环加氧酶的两种主要同工型，绝大部分标准的NSAID是这两种同工型的混合抑制剂。绝大多数NSAID属于下列五种结构范畴之一：(1)丙酸衍生物，如布洛芬、萘普生、甲氧萘丙酸、双氯酚酸钠和酮基布洛芬；(2)乙酸衍生物，如托耳米丁(tolmetin)和slindac；(3)灭酸衍生物，如甲灭酸和甲氯灭酸；(4)联苯羧酸衍生物，如二氟尼柳和氟苯乙酰水杨酸(flufenisal)；以及(5)昔康类(oxicams)如吡罗昔康(piroxim)、湿痛喜康(sudoxican)和伊索昔康(isoxican)。
已描述了选择性抑制环加氧酶2的另一类NSAID。例如，在美国专利No.5,616,601；5,604,260；5,593,994；5,550,142；5,536,752；5,521,213；5,475,995；5,639,780；5,604,253；5,552,422；5,510,368；5,436,265；5,409,944；和5,130,311中已描述了Cox-2抑制剂，所有这些在此引入作为参考。某些示范性的COX-2抑制剂包括塞来昔布(celecoxib)(SC-58635)、DUP-697、氟舒胺(flosulide)(CGP-28238)、美洛昔康(meloxicam)、6-甲氧基-2萘乙酸(6-MNA)、洛芬昔布(rofecoxib)、MK-966、瑞力芬(nabumetone)(6-MNA的前体药物)、尼美舒利(nimesulide)、NS-398、SC-5766、SC-58215、T-614；或者它们的组合。
“个体”是哺乳动物，更优选地是人。哺乳动物包括但不限于：农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。
本发明的方法
就本文所述的所有方法而言，涉及的NGF拮抗剂也包括包含一种或多种这些(NGF拮抗剂)试剂的组合物。这些组合物可还包括适当的赋形剂，如包括缓冲液的可药用赋形剂(载体)，这些都是本领域中公知的。本发明可单独或者结合其它常规治疗方法使用。
预防或治疗包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的方法
本发明可用于在个体(人和动物)中治疗、延缓包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的发展和/或预防包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛。可改善患骨癌个体的生活质量。
癌症转移到骨可能与网骨形成或网骨破坏有关。在一些实施方案中，本发明的方法用于治疗与网骨形成(成骨细胞活性)有关的骨癌痛，如用于治疗前列腺癌转移到骨中的疼痛。在一些实施方案中，本发明的方法用于治疗与网骨破坏(溶骨活性)有关的骨癌痛，如用于治疗肉瘤转移到骨的疼痛。
因此，在一个方面，本发明提供在个体中治疗包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的方法，其包括施用有效量的NGF拮抗剂，如抗NGF抗体。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与阿片样止痛剂一同施用。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与NSAID一同施用。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与阿片样止痛剂和NSAID一同施用。在一些实施方案中，与在缺乏NGF拮抗剂时所施用的量相比，减少了用于疼痛减轻所施用的阿片样止痛剂和/或NSAID的量。当与NGF拮抗剂一同施用时，可减少或消除由于阿片样止痛剂和/或NSAID引起的副作用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂不与阿片样止痛剂一同施用。在其它实施方案中，NGF拮抗剂不与NSAID一同施用。在其它实施方案中，NGF拮抗剂不与阿片样止痛剂和/或NSAID一同施用。
在另一方面，本发明提供预防、改善和/或预防包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的发展或进展的方法。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与阿片样止痛剂一同施用。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与NSAID一同施用。在一些实施方案中，将NGF拮抗剂与阿片样止痛剂和NSAID一同施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂不与阿片样止痛剂一同施用。在其它实施方案中，NGF拮抗剂不与NSAID一同施用。在其它实施方案中，NGF拮抗剂不与阿片样止痛剂和/或NSAID一同施用。
应该理解的是，尽管这里通常涉及治疗或预防骨癌痛如与骨转移有关的癌症疼痛，但是可在骨癌痛风险增加的事件或情况前施用NGF拮抗剂。
NGF拮抗剂可联合骨癌的其它疗法一同施用，如放疗和化疗。NGF拮抗剂也可联合用于骨癌痛的其它止痛剂一同施用。这种止痛剂的实例有二磷酸酯(例如，阿来屈酯)、加巴喷丁(gabapentin)和放疗。与在缺乏NGF拮抗剂时所施用的量相比，可减少用于骨癌痛减轻所施用的这些止痛剂的量。当与NGF拮抗剂一同施用时，可减少或消除由于这些止痛剂所引起的副作用。
在本领域中已很好地建立了疼痛的诊断或评估。可基于客观的测量进行评估，如行为的观察，如对刺激的反应，面部表情等。评估也可基于主观衡量，如使用各种疼痛尺度的患者的疼痛表征。见，例如，Katz等人，Surg Clin North Am.(1999)79(2)：231-52；Caraceni等人J PainSymptom Manage(2002)23(3)：239-55。
NGF拮抗剂
本发明的方法使用NGF拮抗剂，其指阻滞、抑制或减少(包括显著地)NGF生物活性的任何分子，包括由NGF信号传导介导的下游通路，如受体结合和/或引起对NGF的细胞应答。术语“拮抗剂”无论如何不意味着任何特殊的生物作用机制，而且被认为是清楚地包括和包含了与NGF的所有可能的药学的、生理的和生化的相互作用，以及可通过多种不同且化学上各异的组合物获得的其结果。示范性的NGF拮抗剂包括，但不限于，抗NGF抗体、针对NGF的反义分子(包括针对编码NGF的核酸的反义分子)、针对NGF受体(如TrkA受体和/或p75受体)的反义分子(包括针对编码TrkA和/或p75的核酸的反义分子)、NGF抑制性化合物、NGF结构类似物、结合NGF的TrkA受体的显性失活突变、TrkA免疫粘附素、抗TrkA抗体、结合NGF的p75受体的显性失活突变、抗p75抗体以及激酶抑制剂。为了本发明的目的，将清楚地理解为，术语“拮抗剂”包括所有以前所鉴定的术语、名称以及功能状态和特征，由此NGF本身、NGF生物活性(包括，但不限于其调解与骨转移有关的癌症疼痛的任何方面的能力)，或者生物活性的结果，在任何有意义程度上被实质上无效化、降低或中和。在一些实施方案中，NGF拮抗剂(例如，抗体)结合(物理上相互作用)NGF，结合NGF受体(如TrkA受体和/或p75受体)、和/或减少(妨碍和/或阻滞)下游NGF受体信号传导。因此，在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合(物理上相互作用)NGF。在一些实施方案中，NGF拮抗剂是结合NGF的多肽。在一些实施方案中，NGF拮抗剂是PCT WO 2004/026329中所述的肽或修饰肽(如与Fc区融合的结合NGF的肽)。在另一个实施方案中，NGF拮抗剂结合NGF受体(如trkA受体或p75)。在其它实施方案中，NGF拮抗剂减少(妨碍和/或阻滞)下游NGF受体信号传导(例如，激酶信号传导的抑制剂和下游信号传导级联的抑制剂)。在其它实施方案中，NGF拮抗剂抑制(减少)NGF合成和/或释放。在另一个实施方案中，NGF拮抗剂是非TrkA免疫粘附素(即，与TrkA免疫粘附素不同)的NGF拮抗剂。在另一个实施方案中，NGF拮抗剂不同于抗NGF抗体。在另一个实施方案中，NGF不同于TrkA免疫粘附素并且不同于抗NGF抗体。在某些实施方案中，NGF拮抗剂结合NGF(如hNGF)并且不显著地结合相关的神经营养蛋白，如NT-3、NT4/5和/或BDNF。在一些实施方案中，NGF拮抗剂与不利的免疫应答无关。在其它实施方案中，NGF拮抗剂是抗NGF抗体。在其它实施方案中，抗NGF抗体是人源化的(如本文所述的抗体E3)。在一些实施方案中，抗NGF抗体是抗体E3(如本文所述)。在其它实施方案中，抗NGF抗体包括抗体E3的一个或多个CDR(如E3的一个、二个、三个、四个、五个CDR，或者在一些实施方案中，E3的所有六个CDR)。在其它实施方案中，抗体是人抗体。在一些实施方案中，抗体是在WO 2005/019266中所述的人抗NGF中和抗体。在其它实施方案中，抗NGF抗体包括在表1中所示的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和在表2中所示的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。在其它实施方案中，抗体包括修饰的恒定区，如免疫学惰性的恒定区，例如，不引起补体介导的溶解，或者不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在其它实施方案中，如Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624、PCT申请号PCT/GB99/01441和/或英国专利申请No.9809951.8中所述修饰恒定区。
抗NGF抗体
在本发明的一些实施方案中，NGF拮抗剂包括抗NGF抗体。抗NGF抗体应当显示下列特征中的任何一种或多种：(a)结合NGF并抑制NGF生物活性和/或由NGF信号传导功能介导的下游通路；(b)预防、改善或治疗包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的任何方面；(c)阻滞或降低NGF受体活化(包括TrkA受体二聚化和/或自体磷酸化)；(d)增加NGF的清除；(e)抑制(减少)NGF合成、产生或释放。
抗NGF抗体是本领域中已知的，见，例如，PCT公开号WO01/78698、WO 01/64247、美国专利No.5,844,092、5,877,016和6,153,189；Hongo等人，Hybridoma，19：215-227(2000)；Cell.Molec.Biol.13：559-568(1993)；GenBank登记号No.U39608、U39609、L17078或L17077。
在一些实施方案中，抗NGF抗体是称作“E3”的人源化小鼠抗NGF单克隆抗体(PCT WO 04/058184)，其包括含有下列突变的人重链IgG2a恒定区：A330P331到S330S331(氨基酸编号参照野生型IgG2a序列；见Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624)；人轻链κ恒定区；以及在表1和2中所示的重链和轻链可变区。
表1：重链恒定区
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVS(SEQ ID NO：1)。
表2：轻链可变区
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRT(SEQ ID NO：2)。
编码重链可变区或轻链可变区的下列多核苷酸于2003年1月8日保藏在ATCC。
  材料   ATCC登记号   保藏日期
  载体Eb.911.3E   E3轻链V区   PTA-4893   2003年1月8日
  载体Eb.pur.911.3E   E3轻链V区   PTA-4894   2003年1月8日
  载体Db.911.3E   E3重链V区   PTA-4895   2003年1月8日
载体Eb.911.3E是编码表2所示轻链可变区的多核苷酸；载体Eb.pur.911.3E是编码表2所示轻链可变区的多核苷酸，载体Db.911.3E是编码表1所示重链可变区的多核苷酸。这些多核苷酸也编码恒定区。
有至少两种确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版，1991，National Institutes of Health，Bethesda MD))；和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶研究的方法(Chothia等人(1989)Nature 342：877；Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273：927-948))。如本文所用，CDR可指由两种方法中的一种或者由两种方法的组合所定义的CDR。
在另一个实施方案中，抗NGF抗体包括抗体E3的一个或多个CDR(如一个、二个、三个、四个、五个，或者在一些实施方案中，E3的所有六个CDR)。CDR区的测定是本领域技术人员公知的。CDR可以是Kabat、Chothia、或者Kabat和Chothia方法的组合所确定的。
可用于本发明的抗体可包括单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc等)、嵌合抗体、双特异性抗体、异缀合物(heteroconjugate)抗体、单链(ScFv)、其突变体；包括抗体部分的融合蛋白、人源化抗体，以及包括具有所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体以及共价修饰的抗体。抗体可以是小鼠、大鼠、人或者任何其它来源的(包括嵌合的或人源化的抗体)。为了本发明的目的，抗体以抑制NGF和/或由NGF信号传导功能介导的下游途径的方式与NGF反应。在一个实施方案中，抗体是识别人NGF上的一个或多个表位的人抗体。在另一个实施方案中，抗体是识别人NGF上的一个或多个表位的小鼠或大鼠抗体。在另一个实施方案中，抗体识别由灵长类、犬、猫和牛的NGF组成的组中选择的NGF上一个或多个表位。在其它实施方案中，抗体包括修饰的恒定区，如免疫学上惰性的恒定区，例如，不引起补体介导的溶解，或者不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。可使用在美国专利No.5,500,362中所述公开的方法评估ADCC活性。在其它实施方案中，如Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624；PCT申请No.PCT/GB99/01441和/或英国专利申请No.9809951.8中所述修饰恒定区。
抗NGF抗体与NGF(如hNGF)的结合亲和力可以是约0.10到约0.80nM、约0.15到约0.75nM以及约0.18到约0.72nM。在一个实施方案中，结合亲和力是在约2pM和22pM之间。在某个实施方案中，结合亲和力是约10nM。在其它的实施方案中，结合亲和力小于约10nM。在其它的实施方案中，结合亲和力是约0.1nM或约0.07nM。在其它的实施方案中，结合亲和力小于约0.1nM，或者小于约0.07nM。在其它的实施方案中，结合亲和力是约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM，或者约50pM中的任何一种到约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM或约40pM中的任何一种。在一些实施方案中，结合亲和力是约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM、或约50pM，或者小于约50pM中的任何一种。在一些实施方案中，结合亲和力小于以下的任何一种：约100nM、约50nM、约10nM、约1nM、约500pM、约100pM，或约50pM。在其它的实施方案中，结合亲和力是约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM、约40pM、或者高于约40pM。
测定抗体与NGF的结合亲和力的一种方法是通过测量抗体的单功能Fab片段的结合亲和力。为了获得单功能Fab片段，可用木瓜蛋白酶切割或者重组表达抗体(例如，IgG)。可通过表面胞质团共振(BlAcore 3000TM表面胞质团共振(SPR)系统，BIAcore，INC，Piscaway NJ)测量抗体的抗NGFFab片段的亲和力。根据生产商的使用说明，CM5芯片可用N-乙基-N′-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。可将人NGF(或者其它NGF)稀释到pH 4.0的10mM乙酸钠中并且以0.005mg/mL的浓度注射到活化的芯片上。使用横跨单个芯片槽的可变流量时间，可获得抗原密度的两个范围：详细动力研究的100-200应答单位(RU)和筛选测定的500-600RU。芯片可用乙醇胺封闭。再生研究已经证明Pierce洗脱缓冲液(产品号No.21004，Pierce Biotechnology，Rockford IL)和4M NaCl(2∶1)的混合物有效地除去结合的Fab，而在超过200次的注射后仍然保留芯片上hNGF的活性。使用HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15 NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20)作为BIAcore测定的流动缓冲液。将纯化的Fab样品的连续稀释液(0.1-10×估计的KD)以100μL/分钟注射1分钟，并且进行长达2小时的解离。使用已知浓度(如通过氨基酸分析确定的)的Fab作为标准，通过ELISA和/或SDS-PAGE电泳测定Fab蛋白的浓度。使用BIA评估程序通过使数据拟合1∶1 Langmuir结合模型，同时地获得动力学结合率(kon)和解离率(koff)(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L.Petersson，B.(1994).Methods Enzymology 6.99-110)。平衡解离常数(KD)值计算为koff/kon。该方案适用于测定抗体与任何NGF的结合亲和力，包括人NGF、其它脊椎动物(在一些实施方案中为哺乳动物)的NGF(如小鼠NGF、大鼠NGF、灵长类NGF)，以及用于测定抗体与其它神经营养蛋白的结合亲和力，如相关的神经营养蛋白NT3、NT4/5和/或BDNF。
在一些实施方案中，抗体结合人NGF，并且不显著地结合来自另一脊椎动物物种(在一些实施方案中为哺乳动物)的NGF。在一些实施方案中，抗体结合人NGF以及一种或多种来自另一脊椎动物物种(在一些实施方案中为哺乳动物)的NGF。又在其它实施方案中，抗体结合NGF并且不显著与其它神经营养蛋白(如相关的神经营养蛋白，NT3、NT4/5和/或BDNF)交叉反应。在一些实施方案中，抗体结合NGF以及至少一种其它神经营养蛋白。在一些实施方案中，抗体结合哺乳动物种的NGF，如马或狗，但是不显著地结合来自另一种哺乳动物种的NGF。
表位可以是连续的或不连续的。在一个实施方案中，抗体与从由如Hongo等人，Hybridoma，19：215-227(2000)所述的MAb 911、MAb 912和MAb 938组成的组中选择的抗体结合基本上相同的hNGF表位。在另一个实施方案中，抗体与MAb 911结合基本上相同的hNGF表位。在另一个实施方案中，抗体与MAb 909结合基本上相同的表位。Hongo等人，同前。例如，表位可包括下列残基中的一个或多个：hNGF的可变区1(氨基酸23-35)内的残基K32、K34和E35；hNGF可变区4(氨基酸81-88)内的残基F79和T81；可变区4内的残基H84和K88；hNGF的可变区5(氨基酸94-98)和hNGF的C末端(氨基酸111-118)之间的残基R103；hNGF的前可变区1(氨基酸10-23)内的残基E11；hNGF的可变区2(氨基酸40-49)和hNGF的可变区3(氨基酸59-66)之间的Y52；hNGF的C末端内的残基L112和S113；hNGF的可变区3内的残基R59和R69；或者hNGF的前可变区1内的残基V18、V20和G23。另外，表位可包括hNGF的可变区1、可变区3、可变区4、可变区5、N末端区和/或C末端中的一种或多种。又在另一个实施方案中，抗体显著减少hNGF的残基R103的溶剂可接近性。应当理解的是，尽管上述表位涉及人NGF，但是普通技术人员会将人NGF的结构与其它物种的NGF进行比对从而鉴定这些表位可能的对应物。
在一个方面，可通过使用表达NGF的全长或部分序列的免疫原制备能抑制NGF的抗体(例如，人的、人源化的、小鼠的、嵌合的)。在另一个方面，可使用包括过量表达NGF的细胞的免疫原。可使用的免疫原的另一个实例是含有全长NGF或者NGF蛋白的一部分的NGF蛋白。
可通过本领域中的任何已知方法制备抗NGF抗体。宿主动物的免疫途径和免疫时间表通常与如这里进一步所述的已建立的和常规的用于抗体刺激和生产的技术相一致。生产人和小鼠抗体的一般技术在本领域中是公知的并且在这里进行描述。
可以考虑对包括人的任何哺乳动物受试者或由其而来的抗体生产细胞进行操作以用作生产包括人的哺乳动物的杂交瘤细胞系的基础。一般地，包括如本文所述的宿主动物通过腹膜内、肌肉内、口服、皮下、趾内和/或真皮内接种一定量的免疫原所述。
可使用Kohler，B.和Milstein，C.(1975)Nature 256：495-497的一般的体细胞杂交技术或者如由Buck，D.W.等人，In Vitro，18：377-381(1982)所修改的方法从淋巴细胞和永生化的骨髓瘤细胞制备杂交瘤。可在杂交中使用的可获得的骨髓瘤系包括但不限于X63-Ag8.653和从Salk Institute，CellDistribution Center；San Diego，Calif.，USA中获得的那些。通常，该技术包括使用融合剂如聚乙二醇，或者通过本领域技术人员公知的电方法将骨髓瘤细胞和淋巴细胞融合。融合后，将细胞从融合培养基中分离并在选择性生长培养基，如次黄嘌呤-氨甲蝶呤-胸腺嘧啶(HAT)培养基中生长，以除去未杂交的亲代细胞。本文所述的培养基中的任何一种，补充或不补充血清，可用于培养分泌单克隆抗体的杂交瘤。作为另一种备选的细胞融合技术，可使用EBV永生化的B细胞生产本发明的抗NGF单克隆抗体。将杂交瘤扩增和亚克隆，如果期望的话，通过常规的免疫测定操作(例如，放射免疫测定、酶免疫测定或荧光免疫测定)测定上清液的抗免疫原活性。
可用作抗体来源的杂交瘤包括产生NGF特异性单克隆抗体或其部分的亲本杂交瘤的所有衍生物、子代细胞。
可使用已知方法在体外或体内培养产生这种抗体的杂交瘤。如果期望，可通过常规免疫球蛋白纯化方法如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、层析以及超滤从培养基或体液中分离单克隆抗体。可通过例如，通过将制品流过由附着到固相上的免疫原所构成的吸附剂，以及从免疫原上洗脱或释放期望的抗体除去不期望的活性(如果存在的话)。使用双功能的或衍生化的试剂，例如，马来酰亚胺基苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或者R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基)，用人NGF或者含有缀合到对待免疫物种具有免疫原性的蛋白质(例如，匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或者大豆胰蛋白酶抑制剂)的靶氨基酸序列的片段免疫宿主动物可产生抗体群(例如，单克隆抗体)。
如果期望的话，可对目的抗NGF抗体(单克隆或多克隆)进行测序，接着可将多核苷酸序列克隆到用于表达或增殖的载体中。可将编码目的抗体的序列保持在宿主细胞内的载体中，接着将宿主细胞进行扩增并冷冻备用。在备选的方法中，可使用多核苷酸序列用于遗传操作以“人源化”抗体或者提高亲和力或抗体的其它特征。例如，如果将抗体用于人类的临床试验和治疗，那么可对恒定区进行基因工程改造以使其更类似人的恒定区以避免免疫应答。可能期望遗传操作抗体序列以获得对NGF的更高亲和力和在抑制NGF中的更高效能。对抗NGF抗体进行一种或多种多核苷酸改变并且仍然保持其与NGF的结合能力对于本领域技术人员来说是显而易见的。
“人源化”抗体通常指具有抗原结合位点的一种分子，其基本上衍生自非人物种的免疫球蛋白并且保留了基于人免疫球蛋白结构和/或序列的分子的免疫球蛋白结构。抗原结合位点可包括融合到恒定区上的完整的可变区或者仅仅是移植到可变区中的适当的构架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的或者通过一种或多种氨基酸取代修饰，例如，进行修饰以便更接近人免疫球蛋白。人源化抗体的一些类型保留了所有CDR序列(例如，包含小鼠抗体的所有六个CDR的人源化小鼠抗体)。人源化抗体的其它类型具有一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，其相对于原始抗体发生了改变。在一些情况中，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基或其它残基被对应的非人残基替换。此外，人源化的抗体可包括在受体抗体中或者供体抗体中未发现过的残基。
人源化单克隆抗体有四个常规步骤。它们是：(1)确定起始抗体轻链和重链可变区的核苷酸和预测的氨基酸序列，(2)设计人源化抗体，即，决定在人源化过程中使用哪些个抗体构架区，(3)实际的人源化方法/技术以及(4)人源化抗体的转染和表达。见，例如，美国专利No.4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089；6,180,370和6,548,640。
已经描述了许多包括来自非人免疫球蛋白的抗原结合位点的“人源化”抗体分子，包括具有啮齿动物V区或修饰的啮齿动物V区和与之相连的融合到人恒定区的互补决定区(CDR)的嵌合抗体。见，例如，Winter等人Nature 349：293-299(1991)，Lobuglio等人Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86：4220-4224(1989)，Shaw等人J Immunol.138：4534-4538(1987)以及Brown等人Cancer Res.47：3577-3583(1987)。其它参考文献描述在与适当的人抗体恒定区融合前，将啮齿动物的CDR移植到人类支持构架区(FR)中。见，例如，Riechmann等人Nature 332：323-327(1988)，Verhoeyen等人Science 239：1534-1536(1988)，和Jones等人Nature 321：522-525(1986)。另外的参考文献描述了得到重组镶饰的啮齿动物构架区支持的啮齿动物CDR。见，例如，欧洲专利公开号No.0519596。设计这些“人源化的”分子以便最小化对啮齿动物抗人抗体分子不期望的免疫应答，该免疫应答限制了这些部分在人类受体中治疗应用的持续时间和效应。例如，可对抗体恒定区进行基因工程改造使其成为免疫惰性(例如，不引起补体溶解)。见，例如，PCT申请号PCT/GB99/01441；英国专利申请号No.9809951.8。也可利用的人源化抗体的其它方法由Daugherty等人，Nucl.Acids Res.19：2471-2476(1991)和美国专利No.6,180,377；6,054,297；5,997,867；5,866,692；6,210,671和6,350,861以及PCT公开号WO01/27160公开。人源化还可包括亲和力成熟。见，例如，美国系列号No.10/745,775和PCT/US03/41252。
而在另一个备选的方法中，可通过使用可商业获得的经过基因工程改造以表达特异性人免疫球蛋白的小鼠来获得全人抗体。被设计用来产生更为期望的(例如，全人抗体)或者更强免疫应答的转基因动物也可被用于产生人源化抗体或人抗体。这种技术的实例有Abgenix，Inc.(Fremont，CA)的XenomouseTM和Medarex，Inc.(Princeton，NJ)的
Figure G200580018506420061208D000311
和TC MouseTM。
在备选的方法中，可使用本领域中的任何公知方法重组地制备抗体和表达抗体。在另一个备选的方法中，可通过噬菌体展示技术重组地制备抗体。见，例如，美国专利No.5,565,332；5,580,717；5,733,743和6,265,150；以及Winter等人，Annu.Rev.Immunol.12：433-455(1994)。备选地，可使用噬菌体展示技术(McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990))从未免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)区基因所有组成成分中，体外生产人抗体和抗体片段。根据该技术，将抗体V区基因符合读框地克隆到丝状噬菌体，如M13或fd的主要或次要包膜蛋白基因中，并且作为有功能的抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此基于抗体的功能特性的选择也导致对编码显示那些特性抗体基因的选择。因此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行；综述见，例如，Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology 3，564-571(1993)。可使用几种来源的V基因片段用于噬菌体展示。Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)从来自免疫小鼠脾脏的V基因的小型随机组合文库中分离了一批不同的抗噁唑酮抗体。可构建未免疫的人供体的V基因的所有组成成分，且可基本上根据下列由Mark等人，J Mol.Biol.222：581-597(1991)，或者Griffith等人，EMBO J.12：725-734(1993)所述的技术分离针对一批不同抗原(包括自身抗原)的抗体。在自然的免疫应答中，抗体基因高速地累积突变(体细胞超变)。一些引入的改变将赋予更高的亲和力，在接下来的抗体攻击期间展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞被优先复制和分化。可通过使用被称作“链改组”的技术模拟这种自然过程。Marks等人，Biol/Technol.10：779-783(1992)。在该方法中，可通过用从未免疫的供体中所获得的V区基因的天然存在的变体(所有组成成分)的所有组成成分按顺序地替换重链和轻链V区基因，提高通过噬菌体展示所获得的“原始”人抗体的亲和力。这种技术使能够产生亲和力范围在pM-nM级的抗体和抗体片段。已由Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.21：2265-2266(1993)描述了制备极大噬菌体抗体所有组成成分的策略(也称作“所有文库之母”)。也可使用基因改组从啮齿动物抗体中衍生人抗体，其中人抗体具有与起始啮齿动物抗体类似的亲和力和特异性。根据该方法(其也被称作“表位印记”)，通过噬菌体展示技术将获得的啮齿动物抗体的重链或轻链V区基因用人V区基因的所有组成成分替换，产生啮齿动物-人嵌合体。抗原的选择导致能恢复功能性抗原结合位点的人可变区的分离，即，表位统治(印上)配偶体的选择。当为了替换剩下的啮齿动物的V区而重复该方法时，得到人抗体(见1993年4月1日公开的PCT公开号WO 93/06213)。不同于传统的通过CDR移植的啮齿动物抗体的人源化，该技术完全地提供了没有啮齿动物来源的构架或CDR残基的人抗体。
显而易见的是，尽管上述讨论属于人源化的抗体，但是所讨论的总原则可用于定制用于例如狗、猫、灵长类、马和牛的抗体。更加显而易见的是，本文所述的人源化抗体的一个或更多的方面，例如，CDR移植、构架突变和CDR突变可以被组合在一起。
可以重组地制备抗体，首先从宿主动物中分离抗体和产生抗体的细胞，获得基因序列，并使用该基因序列在宿主细胞(例如，CHO细胞)中重组地表达该抗体。可使用的另一种方法是在植物(例如，烟草)或转基因牛奶中表达抗体序列。已经公开了在植物或牛奶中重组地表达抗体的方法。见，例如，Peeters等人Vaccine 19：2756(2001)；Lonberg，N.和D.HuszarInt.Rev.Immunol 13：65(1995)以及Pollock等人，J Immunol Methods 231：147(1999)。制备抗体的衍生物，例如，人源化的，单链等的方法是本领域中公知的。
也可使用免疫测定和流式细胞分选技术如荧光激活细胞分选(FACS)分离对NGF特异的抗体。
可将抗体结合到许多不同的载体上。载体可以是有活性的和/或惰性的。公知载体的实例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、玻璃、天然的和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。为了本发明的目的，载体的性质可以是可溶的或不溶的。那些本领域的技术人员将会知道用于结合抗体的其它合适的载体，或者将能够使用常规实验确定这些载体。
使用常规方法(例如，通过使用能特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链基因的寡核苷酸探针)可以容易地分离编码单克隆抗体的DNA并测序。杂交瘤细胞作为这种DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中(如在PCT公开号WO 87/04462中公开的表达载体)，然后将其转染到宿主细胞内如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或者不产生免疫球蛋白蛋白质的骨髓瘤细胞，以便在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。见，例如，PCT公开号WO 87/04462。所述DNA也可以进行修饰，例如，通过用人重链和轻链恒定区的编码序列取代同源的小鼠序列，Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.81：6851(1984)，或者通过将非免疫球蛋白多肽的所有或部分编码序列共价连接到免疫球蛋白的编码序列。用该方式可制备具有这里的抗NGF单克隆抗体结合特异性的“嵌合”或“杂种”的抗体。
可使用本领域中的公知方法表征抗NGF抗体。例如，一种方法是确定其与之结合的表位，或者说“表位作图”。在本领域中有许多已知的方法可用于对蛋白质上的表位位置进行作图和表征，包括解析抗体-抗原复合物的结晶结构、竞争测定、基因片段表达测定以及基于合成肽的测定，例如Harlow和Lane，Using Antibodies，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1999第11章中所述的方法。在另一个实例中，可使用表位作图确定抗NGF抗体与之结合的序列。表位作图可从多种来源商业地获得，例如，Pepscan系统(Edelhertweg 15，8219 PH Lelystad，荷兰)。所述表位可以是线性表位，即，包含在单独的一段氨基酸中，或者是由可以不必包含在单独的一段序列中(一级结构线性序列)的氨基酸的三维相互作用形成的构象表位。可分离或合成(例如，通过重组)多种长度(例如，至少长4-6个氨基酸)的肽并用于与抗NGF抗体的结合测定。在另一个实例中，通过使用衍生自NGF序列的重叠肽并测定与抗NGF抗体的结合，可在系统筛选中确定抗NGF抗体与之结合的表位。根据基因片段表达测定，将编码NGF的可读框随机地或者通过特异性遗传构造分段，并且测定所表达的NGF片段与待测抗体的反应性。例如，可通过PCR产生基因片段，然后在体外转录并在放射性氨基酸存在下翻译成蛋白质。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳确定抗体与放射性标记的NGF片段的结合。也可通过使用在噬菌体颗粒(噬菌体文库)表面上所展示的大量随机肽序列文库鉴定某些表位。备选地，可在简单的结合测定中检验限定的重叠肽片段文库与试验抗体的结合。在另一个实例中，可进行抗原结合区的诱变、区域交换试验和丙氨酸扫描诱变以鉴定对于表位结合所需要的、充分的和/或必需的残基。例如，可使用突变体NGF进行区域交换试验，其中用紧密相关的，但抗原性不同的蛋白质(如神经营养蛋白蛋白质家族的另一个成员)的序列替换(交换)NGF多肽的多种片段。通过评估抗体与突变体NGF的结合，可评估特定NGF片段与抗体结合的重要性。
另一种可用于表征抗NGF抗体的方法是使用竞争测定，用已知结合相同抗原(即多种NGF片段)的其它抗体测定该抗NGF抗体是否与其它抗体一样结合相同的表位。竞争测定是本领域技术人员公知的。可在本发明的竞争测定中使用的抗体实例包括MAb 911、912、938，如Hongo等人，Hybridoma 1 9：215-227(2000)中所述。
其它NGF拮抗剂
可使用与抗NGF抗体不同的NGF拮抗剂。在本发明的一些实施方案中，NGF拮抗剂包括至少一种能阻滞或降低功能性NGF表达的反义分子。NGF的核苷酸序列是已知的并且很容易地从公众可获得的数据库中获得。见，例如，Borsani等人，Nuc.Acids Res.1990，18，4020；登记号NM002506；Ullrich等人，Nature 303：821-825(1983)。制备特异性结合NGFmRNA而不与其它多核苷酸交叉反应的反义寡核苷酸分子是常规方法。示范性的靶向位点包括但不限于：起始密码子、5’调节区、编码序列和3’非翻译区。在一些实施方案中，寡核苷酸长约10-100个核苷酸，长约15-50个核苷酸，长约18-25个核苷酸，或者更长。寡核苷酸可包括骨架修饰如，例如，本领域公知的硫代磷酸酯键以及2’-O糖修饰。示范性的反义分子包括美国公开No.20010046959中所述的NGF反义分子；也见http://www.rna-tec.com/repair.htm。
在其它实施方案中，NGF拮抗剂包括至少一种能阻滞或降低功能性NGF受体(如TrkA和/或p75)表达的反义分子。Woolf等人，J.Neurosci.(2001)21(3)：1047-55；Taglialetela等人，J Neurochem(1996)66(5)：1826-35。TrkA和p75的核苷酸序列是已知的并且很容易从公众可获得的数据库中获得。
备选地，可使用本领域公知的基因敲除、吗啉代寡核苷酸、RNAi或者核酶方法降低NGF表达和/或释放和/或NGF受体表达。见
http://www.macalester.edu/～montgomery/RNAi.html；
http://pub32.ezboard.com/fmorpholinosfrm19.showMessage？topicID＝6.topic；
http://www.highveld.com/ribozyme.html。
在其它实施方案中，NGF拮抗剂包括至少一种NGF抑制性化合物。如本文所用，“NGF抑制性化合物”指与抗NGF抗体不同的化合物，其可直接地或间接地减少、抑制、中和或取消NGF生物活性。NGF抑制性化合物应当显示下列特征中的任何一种或多种：(a)结合NGF并抑制NGF生物活性和/或由NGF信号传导功能介导的下游通路；(b)预防、改善或治疗包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的任何方面；(c)阻滞或降低NGF受体活化(包括TrkA受体二聚化和/或自体磷酸化)；(d)增加NGF的清除；(e)抑制(减少)NGF合成、生产或释放。示范性的NGF抑制性化合物包括美国公开No.20010046959中所述的小分子NGF抑制剂；如PCT公开号WO 00/69829中所述的抑制NGF与p75结合的化合物，以及由Colquhoun等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.310(2)：505-11(2004)所述的PD90780[7-(苯基氨基)-4，9-二氢-4-甲基-9-氧代-吡唑[5，1-b]喹唑啉-2-羧酸]；如PCT公开号WO 98/17278中所述的抑制NGF与TrkA和/或p75结合的化合物。NGF抑制性化合物的另外实例包括PCT公开号WO 02/17914和WO02/20479，以及美国专利No.5,342,942；6,127,401和6,359,130中所述的化合物。更多的示范性的NGF抑制性化合物是NGF的竞争性抑制剂。见美国专利No.6,291,247。此外，本领域技术人员可制备其它小分子NGF抑制性化合物。
在一些实施方案中，NGF抑制性化合物结合NGF。示范性的靶向(结合)位点包括但不限于：结合TrkA受体和/或p75受体的NGF部分，以及那些邻近受体结合区且部分地负责受体结合部分的正确三维形状的NGF部分。在另一个实施方案中，NGF抑制性化合物结合NGF受体(如TrkA和/或p75)并抑制NGF生物活性。示范性的靶向位点包括那些结合NGF的TrkA和/或p75的部分。
在包括小分子的实施方案中，小分子可具有约100到20,000道尔顿、500到15,000道尔顿，或者1000到10,000道尔顿中的任何一种的分子量。小分子的文库可商业地获得。可使用本领域中已知的任何方法施用小分子，包括吸入、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、鞘内、心室内、口服、肠内、胃肠外、鼻内或皮肤途径。一般地，当根据本发明的NGF拮抗剂是小分子时，将0.1-300mg/kg患者体重的量分成1到3次或更多次的剂量的速度施用。对于正常体重的成年患者，可按照每次剂量从1mg到5g施用。
在其它实施方案中，NGF拮抗剂包括至少一种NGF结构类似物。本发明中的“NGF结构类似物”指具有与NGF的三维结构的一部分类似的三维结构并且在生理条件下在体外或在体内结合NGF受体的化合物，其中结合至少部分地抑制NGF生物活性。在一个实施方案中，NGF结构类似物结合TrkA和/或p75受体。示范性的NGF结构类似物包括但不限于：PCT公开号WO 97/15593中所述的双环肽；美国专利No.6,291,247中所述的双环肽；美国专利No.6,017,878中所述的环状化合物；以及PCT公开号WO 89/09225中所述的NGF衍生的肽。也可通过NGF受体结合的分子模型设计并合成适当的NGF结构类似物，例如，通过PCT公开号WO98/06048中所述的方法。NGF结构类似物可以是单体，或者是以相同或不同结构的任何期望组合以获得改善的亲和力和生物效应的二聚体/寡聚体。
在其它实施方案中，本发明提供包括至少一种TrkA受体和/或p75受体的显性失活突变体的NGF拮抗剂。本领域技术人员可制备例如，TrkA受体的显性失活突变体，使得该受体将结合NGF并且因此用作“接收池(sink)”以捕获NGF。然而，一旦结合NGF，显性失活突变体将不具有TrkA受体的正常生物活性。示范性的显性失活突变体包括但不限于在下列参考文献中所述的突变体：Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95，10884；Eide等人，J Neurosci.1996，16，3123；Liu等人，J.Neurosci 1997，17，8749；Klein等人，Cell 1990，61，647；Valenzuela等人，Neuron 1993，10，963；Tsoulfas等人，Neuron 1993，10，975；以及Lamballe等人，EMBO J.1993，12，3083，这些参考文献中的每一篇在此以其整体引入作为参考。显性失活突变体可以蛋白质形式或以表达载体的形式施用，使得显性失活突变体，例如突变体TrkA受体在体内表达。蛋白质或表达载体可使用本领域中的任何已知方法施用，如腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、鞘内、心室内、口服、肠内、胃肠外、鼻内、皮肤或者通过吸入。例如，表达载体的施用包括局部或全身性施用，包括注射、口服给药、颗粒枪或插入导管施用，以及局部施用。本领域技术人员熟悉表达载体的给药方式以获得外源蛋白在体内的表达。见，例如，美国专利No.6,436,908；6,413,942和6,376,471。
 也可使用含有反义多核苷酸、表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向给药。在例如，Findeis等人，Trends Biotechnol.(1993)11：202；Chiou等人，Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct GeneTransfer(J.A.Wolff，编辑)(1994)；Wu等人，J.Biol.Chem.(1988)263：621；Wu等人，J.Biol.Chem.(1994)269：542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：3655；Wu等人，J.Biol.Chem.(1991)266：338中描述了受体介导的DNA递药技术。在基因治疗方案中，对于局部给药，以约100ng到约200mg DNA的范围施用含有多核苷酸的治疗组合物。在一些实施方案中，在基因治疗方案期间也可使用约500ng到约50mg、约1μg到约2mg、约5μg到约500μg、以及约20μg到约100μg DNA，或者更多的浓度范围。可使用基因递药载体递送本发明的治疗性多核苷酸和多肽。基因递送载体可以是病毒或非病毒来源的(一般参见，Jolly，Cancer GeneTherapy(1994)1：51；Kimura，Human Gene Therapy(1994)5：845；Connelly，Human Gene Therapy(1995)1：185和Kaplitt，Nature Genetics(1994)6：148)。可使用内源性哺乳动物的或异源性启动子和/或增强子诱导这种编码序列的表达。编码序列的表达可以是组成型的或被调控的。
在期望细胞中递送期望多核苷酸和表达的基于病毒的载体是本领域公知的。示范性的基于病毒的载体包括但不限于：重组逆转录病毒(见，例如，PCT公开号WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；美国专利No.5,219,740和4,777,127；英国专利No.2,200,651以及欧洲专利No.0 345 242)、基于甲病毒属的载体(例如，辛德毕斯(Sindbis)病毒载体、Semliki森林病毒(ATCCVR-67；ATCC VR-1247)、罗斯(Ross)河病毒(ATCC VR-373；ATCCVR-1246)以及委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))以及腺伴随病毒(AAV)载体(见，例如，PCT公开号WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)。也可如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147中所述施用与灭活的腺病毒连接的DNA。
也可使用非病毒的递药载体和方法，包括但不限于：单独与灭活的腺病毒相连或不相连的聚阳离子的浓缩DNA(见，例如，Curiel，Hum.GeneTher.(1992)3：147)；连接配体的DNA(见，例如，Wu，J.Biol.Chem.(1989)264：16985)；真核细胞递药载体细胞(见，例如美国专利No.5,814,482；PCT公开号WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763和WO 97/42338)以及核电荷中和或与细胞膜的融合。也可以使用裸DNA。示范性的裸DNA导入法描述于PCT公开号WO 90/11092和美国专利No.5,580,859。可用作基因递送载体的脂质体描述于美国专利No.5,422,120；PCT公开号WO95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445；和EP专利No.0524968。另外的方法描述于Philip，Mol.Cell Biol.(1994)14：2411和Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91：1581。
同样显而易见的是，可使用表达载体指导本文所述的任何基于蛋白质的NGF拮抗剂(例如，抗NGF抗体、TrkA免疫粘附素等)的表达。例如，能阻断(从部分阻断到完全阻断)NGF和/或NGF生物活性的其它TrkA受体片段是本领域公知的。
在另一个实施方案中，NGF拮抗剂包括至少一种TrkA免疫粘附素。如本文所用TrkA免疫粘附素指包括TrkA受体的胞外域和免疫球蛋白序列的可溶嵌合分子，，所述免疫球蛋白序列保留TrkA受体的结合特异性(基本上保留trkA受体的结合特异性)并能够结合NGF。
TrkA免疫粘附素是本领域公知的，并且已发现阻断NGF结合TrkA受体。见，例如，美国专利No.6,153,189。Brennan等人报道在术后疼痛的大鼠模型中施用TrkA免疫粘附素。见Society for Neuroscience Abstracts24(1-2)880(1998)。在一个实施方案中，TrkA免疫粘附素包括能结合NGF的TrkA胞外域的TrkA受体的氨基酸序列(或其一部分)(在一些实施方案中，为基本上保留trkA受体的结合特异性的氨基酸序列)和免疫球蛋白序列的融合。在一些实施方案中，TrkA受体是人TrkA受体序列，且其融合是与免疫球蛋白恒定区序列的融合。在其它实施方案中，免疫球蛋白恒定区序列是免疫球蛋白重链恒定区序列。在其它实施方案中，两个TrkA受体-免疫球蛋白重链融合的联合(例如，通过二硫键的共价连接)导致同型二聚体免疫球蛋白样结构。可将免疫球蛋白轻链进一步与二硫键结合的二聚体中的一个或两个TrkA受体-免疫球蛋白嵌合体连接以产生同型三聚体或同型四聚体结构。合适的TrkA免疫粘附素的实例包括在美国专利No.6,153,189中描述的那些。
在另一个实施方案中，NGF拮抗剂包括至少一种能阻断、抑制、改变和/或减少NGF与TrkA受体的物理相互作用和/或下游信号传导的抗TrkA抗体，由此NGF的生物活性被降低和/或被阻断。抗TrkA抗体是本领域中已知的。示范性的抗TrkA抗体包括在PCT公开号WO 97/21732、WO00/73344、WO 02/15924，和美国公开No.20010046959中描述的那些。
在另一个实施方案中，NGF拮抗剂包括至少一种能阻断、抑制和/或减少NGF与p75受体的物理相互作用和/或下游信号传导的抗p75抗体，由此NGF的生物活性被降低和/或被阻断。
在另一个实施方案中，NGF拮抗剂包括至少一种能抑制与TrkA和/或p75受体活性相关的下游激酶信号传导的激酶抑制剂。示范性的激酶抑制剂是K252a或K252b，这是本领域中已知的并且描述于Knusel等人，J.Neurochem.59：715-722(1992)；Knusel等人，J.Neurochemistry 57：955-962(1991)；Koizumi等人，J.Neuroscience 8：715-721(1988)；Hirata等人，Chemical Abstracts 111：728，XP00204135，见摘要和12th CollectiveChemical Substance Index，p.34237，c.3(5-7)，55-60，66-69)，p.34238，c.1(41-44)，c.2(25-27，32-33)，p.3423，c.3(48-50，52-53)；以及美国专利No.6,306,849。
如果由临床医师寻找的话，预计将会鉴定出许多其它类型的NGF拮抗剂。
NGF拮抗剂的鉴定
可使用本领域中的已知方法鉴定或表征抗NGF抗体和其它NGF拮抗剂，由此检测和/或测量NGF生物活性的减少、改善或中和。可使用在PCTWO 04/065560中所述的方法。可使用其它方法，例如，在美国专利No.5,766,863和5,891,650中所述的激酶受体活化(KIRA)测定鉴定NGF拮抗剂。该ELISA型测定适用于激酶活化的定性或定量测量，通过测量受体蛋白酪氨酸激酶(下文中称作“rPTK”)，例如TrkA受体的激酶区的自体磷酸化，而且适于所选rPTK(如TrkA)的潜在拮抗剂的鉴定和表征。测定的第一阶段包括激酶受体(例如TrkA受体)的激酶区的磷酸化，其中受体存在于真核细胞的细胞膜内。受体可以是内源的受体或者是可被转化到细胞内的编码受体的核酸或受体构建体。一般地，将第一固相(例如，第一测定板的孔)用基本上同种的这类细胞群(通常是哺乳动物细胞系)包被，使得细胞粘附到固相上。通常，细胞是粘附的并且因此天然地粘附到第一固相上。如果使用“受体构建体”，其通常包括激酶受体和flag多肽的融合。在测定的ELISA部分中该flag多肽被捕获剂(通常是捕获抗体)识别。然后连同NGF一起向具有粘附细胞的孔中添加分析物，如候选抗NGF抗体或其它NGF拮抗剂，使得酪蛋白激酶受体(例如，TrkA受体)暴露于(或者接触)NGF和分析物。该测定能鉴定抑制其配体NGF对TrkA活化的抗体(或其它NGF拮抗剂)。暴露于NGF和分析物后，使用裂解缓冲液(其中具有增溶的去污剂)并且轻轻震荡溶解粘附的细胞，因而释放细胞裂解液可直接用于测定的ELISA部分，不需要细胞裂解液的浓缩或澄清。
接着这样制备的细胞裂解液可进行ELISA阶段的测定。作为ELISA阶段中的第一步，将第二固相(通常是ELISA微量滴定板的孔)用特异性结合酪蛋白激酶受体的捕获剂包被，或者，在受体构建体的情况中，用特异性结合flag多肽的捕获剂(通常是捕获抗体)包被。进行第二固相的包被使得捕获剂粘附到第二固相上。该捕获剂通常是单克隆抗体，但是，如在这里的实例中所述的，也可以使用多克隆抗体。然后将所获得的细胞裂解液暴露于，或者接触粘附的捕获剂使得受体或受体构建体粘附到(或被捕获在)第二固相上。然后进行洗涤步骤，以便除去未结合的细胞裂解物，留下被捕获的受体或受体构建体。然后将粘附的或被捕获的受体或受体构建体暴露于，或接触能鉴定酪氨酸激酶受体中磷酸化酪氨酸残基的抗磷酸酪氨酸抗体。在一个实施方案中，将抗磷酸酪氨酸抗体缀合(直接地或间接地)到催化非放射性颜色试剂的颜色改变的酶上。从而可通过随后试剂的颜色改变测量受体的磷酸化。可将酶直接结合到抗磷酸酪氨酸抗体上，或者可将缀合分子(例如，生物素)缀合到抗磷酸酪氨酸抗体上，并且可随后借助于缀合分子将酶结合到抗磷酸酪氨酸抗体上。最后，例如，通过颜色试剂的颜色改变测量抗磷酸酪氨酸抗体与捕获的受体或受体构建体的结合。
也可通过将候选试剂与NGF孵育并监测下列特征中的任何一种或多种来鉴定NGF拮抗剂：(a)结合NGF并抑制NGF生物活性和/或由NGF信号传导功能介导的下游通路；(b)预防、改善、或治疗包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的任何方面；(c)阻断或降低NGF受体活化(包括TrkA受体二聚化和/或自体磷酸化)；(d)增加NGF的清除；(e)抑制(减少)NGF合成、生产或释放。在一些实施方案中，通过将候选试剂与NGF孵育并监测结合和伴随的NGF生物活性的减少或中和鉴定NGF拮抗剂。可用纯化的NGF多肽，用天然表达的或者经过转化表达NGF多肽的细胞进行结合测定。在一个实施方案中，结合测定是竞争性结合测定，其中评估候选抗体与已知NGF拮抗剂竞争结合NGF的能力。测定可以多种形式进行，包括ELISA形式。在其它实施方案中，通过将候选试剂与NGF孵育并监测伴随的TrkA受体二聚体化和/或自体磷酸化的抑制鉴定NGF拮抗剂。
初步鉴定后，可通过检验靶向生物活性的已知生物测定进一步证实并提纯候选抗NGF拮抗剂的活性。备选地，可使用生物测定直接筛选候选分子。例如，NGF促进应答细胞许多形态学上可识别的改变。这些包括但不限于：促进PC12细胞的分化并提高从这些细胞中长出轴突(Greene和Tischler，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 73：2424-2428(1976)；Urfer等人，Biochem.36：4775-4781(1997)；Tsoulfas等人，Neuron 10：975-990(1993))，促进从应答的感觉和交感神经节的外植体中长出轴突(Levi-Montalcini，R.和Angeletti，P.Nerve growth factor.Physiol.Rev.48，534-569，1968)以及促进NGF依赖神经元的存活，如胚胎背根神经节、三叉神经节或交感神经神经节神经元(例如，Chun & Patterson，Dev.Biol.75：705-711，(1977)；Buchman & Davies，Development 118：989-1001，(1993)。因此，NGF生物活性的抑制测定需要将NGF应答细胞与NGF和分析物(如候选的抗NGF抗体或候选的NGF拮抗剂)一起培养。培养适当的时间后，测定细胞的应答(细胞分化、轴突长出或细胞存活)。
也可如Hongo等人，Hybridoma 19：215-227(2000)中所述，通过在胚胎大鼠背根神经节存活生物测定中监测候选试剂抑制NGF所介导存活的能力，评估候选NGF拮抗剂阻断或中和NGF生物活性的能力。
用于本发明方法的组合物
在本发明方法中使用的组合物包括有效量的NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)，以及，在一些实施方案中，还包括可药用赋形剂。在一些实施方案中，组合物用于本文所述方法中的任何一种。这种组合物的实例，以及如何配制，也描述于以前的部分和下面的部分。在一个实施方案中，组合物包括NGF拮抗剂。在另一个实施方案中，组合物包括一种或多种NGF拮抗剂。在另一种实施方案中，组合物包括从下列类型中的任何一种或多种选出的一种或多种NGF拮抗剂：结合(物理上相互作用)NGF的拮抗剂(例如，抗体)、结合NGF受体(如TrkA和/或p75受体)的拮抗剂，以及降低(阻碍和/或阻断)下游NGF受体信号传导的拮抗剂。又在其它实施方案中，组合物包括不是TrkA免疫粘附素(即，与TrkA免疫粘附素不同)的NGF拮抗剂。在其它实施方案中，组合物包括与抗NGF抗体不同的任何NGF拮抗剂。又在其它实施方案中，组合物包括与TrkA免疫粘附素不同并且与抗NGF抗体不同的任何NGF拮抗剂。在其它实施方案中，NGF拮抗剂抑制(减少)NGF合成、生产或释放。在一些实施方案中，NGF拮抗剂结合NGF并且不显著地与相关的神经营养蛋白(如NT3、NT4/5，和/或BDNF)发生交叉反应。在一些实施方案中，NGF拮抗剂与不利的免疫应答无关。在一些实施方案中，NGF拮抗剂从由抗NGF抗体、针对NGF的反义分子(包括针对编码NGF的核酸的反义分子)、针对NGF受体(如TrkA和/或p75)的反义分子、NGF抑制性化合物、NGF结构类似物、结合NGF的TrkA受体的显性失活突变、TrkA免疫粘附素、抗TrkA抗体、抗p75抗体和激酶抑制剂组成的组中选择。在另一个实施方案中，NGF拮抗剂是抗NGF抗体。在其它实施方案中，抗NGF抗体识别人NGF。在一些实施方案中，抗NGF抗体是人抗NGF抗体。在其它实施方案中，抗NGF抗体是人源化抗体(如本文所述的抗体E3)。在其它实施方案中，抗NGF抗体包括不引起不需要的或不期望的免疫应答(如抗体介导的细胞溶解或ADCC)的恒定区。在其它实施方案中，抗NGF抗体包括抗体E3的一个或多个CDR(如E3的一个、二个、三个、四个、五个CDR，或者，在一些实施方案中，E3的所有六个CDR)。
应当理解的是，组合物可包括一种以上的NGF拮抗剂。例如，组合物可包括一种类型NGF拮抗剂的一种以上的成员(例如，识别NGF不同表位的抗NGF抗体的混合物)，以及许多不同类型的NGF拮抗剂(例如，抗NGF抗体和NGF抑制性化合物)。其它示范性的组合物包括一种以上识别同一表位的抗NGF抗体、结合NGF不同表位的不同物种的抗NGF抗体、或者不同的NGF抑制性化合物。
本发明中使用的组合物可进一步包括冷冻干燥制剂或水溶液形式的可药用载体、赋形剂或稳定剂(Remington：The Science and Practice ofPharmacy第20版(2000)Lippincott Williams and Wilkins，编辑K.E.Hoover.)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度水平对受体是无毒的，并且可包括如磷酸、柠檬酸和其它有机酸的缓冲液；包括抗坏血酸和甲硫氨酸的抗氧化剂；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双胺；苯扎氯铵、氯化苄乙氧铵；酚醇、丁醇或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子(salt-forming counter-ions)如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或者聚乙二醇(PEG)。这里进一步描述了可药用赋形剂。
NGF拮抗剂及其组合物也可与用于提高和/或补充试剂效力的其它试剂联合使用。在一些实施方案中，其它试剂是阿片样止痛剂。在一些实施方案中，其它试剂是NSAID。在一些实施方案中，这些试剂不是阿片样止痛剂。在一些实施方案中，这些试剂不是NSAID。
试剂盒
本发明也提供用于即刻方法的试剂盒。本发明的试剂盒包括一个或多个包含NGF拮抗剂(如抗体，如本文所述的人源化抗体E3)的容器，在一些实施方案中，还包括与本文所述的本发明的任何一种方法一致的使用说明。在一些实施方案中，NGF拮抗剂是本文所述的任何NGF拮抗剂。在其它实施方案中，试剂盒包括并非TrkA免疫粘附素(即，与TrkA免疫粘附素不同)的NGF拮抗剂。在其它实施方案中，试剂盒包括与抗NGF抗体不同的NGF拮抗剂。在其它实施方案中，试剂盒包括与TrkA免疫粘附素不同并且与抗NGF抗体不同的任何NGF拮抗剂。在一些实施方案中，试剂盒包括抗NGF抗体(如本文所述的抗体E3)。在其它实施方案中，试剂盒包括包含抗体E3的一个或多个CDR(如一个、二个、三个、四个、五个，或者，在一些实施方案中，E3的所有六个CDR)的抗NGF抗体。在一些实施方案中，试剂盒包括阿片样止痛剂。在一些实施方案中，试剂盒包括NSAID。在一些实施方案中，试剂盒不包括阿片样止痛剂。在一些实施方案中，试剂盒不包括NSAID。在一些实施方案中，所包含的使用说明书包括根据本文所述方法中的任何一种的施用NGF拮抗剂用于治疗、改善或预防包括与骨转移有关的癌症痛的骨癌痛的描述。基于鉴定个体是否具有包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛或者个体是否有患包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的风险，试剂盒可进一步包括选择适于治疗的个体的描述。在其它实施方案中，说明书包括施用NGF拮抗剂用于治疗、预防和/或改善包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛的描述。在其它实施方案中，说明书包括向患有包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛风险的个体施用NGF拮抗剂的描述。在一些实施方案中，NGF拮抗剂与阿片样止痛剂一同施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂与NSAID一同施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂与阿片样止痛剂和NSAID一同施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂不与阿片样止痛剂一同施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂不与NSAID一同施用。
涉及NGF拮抗剂使用的说明书通常包括如用于预期治疗的剂量、给药时间表以及给药途径的信息。容器可以是单位剂量、大包装(例如，多剂量包装)或者亚单位剂量。本发明的试剂盒中所提供的说明书通常是标签或包装插页(例如，包含在试剂盒中的纸片)上的书面说明，但是机器可读的说明(例如，在磁性或光学存储盘上携带的说明)也是可接受的。
标签或包装插页指示组合物可用于治疗、改善和/或预防包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛。可提供说明书用于进行本文所述方法中的任何一种。
本发明的试剂盒是以适当的包装形式。适当的包装包括但不限于：小瓶、瓶、罐、柔性包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。也考虑与特殊装置，如吸入器、鼻给药装置(例如，喷雾器)或者输注装置如微型泵联合使用的包装。试剂盒可具有无菌入口(例如容器可以是静脉内溶液袋或者是具有可被皮下注射针头穿透的塞子的小瓶)。容器也可具有无菌入口(例如容器可以是静脉内溶液袋或者是具有可被皮下注射针头穿透的塞子的小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是NGF拮抗剂，如抗NGF抗体。容器还可包括第二药物活性剂。
试剂盒可任选地提供另外的成分如缓冲液和阐释性信息。通常，试剂盒包括一种容器和位于容器上的或与容器相连的标签或者包装插页。
在一些实施方案中，本发明提供包括上述试剂盒内容物的产品的文章。在一些实施方案中，试剂盒包括具有表明用于治疗包括与骨转移有关的癌症疼痛的骨癌痛信息的NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)。
NGF拮抗剂的施用和治疗的评估
可通过任何适当的途径向个体施用NGF拮抗剂。例如，NGF拮抗剂可通过口服、静脉内、舌下、皮下、动脉内、滑膜内、膀胱内(如经膀胱)、肌肉内、心内、胸内、腹膜内、心室内、舌下、通过吸入、通过栓剂以及经皮施用。它们可通过口服施用，例如，以通过本领域公认的操作制备的片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬液、糖浆、薄片(wafer)、糖果(lollypop)、口香糖等的形式。对于本领域技术人员应当显而易见的是，本文所述的实例并非旨在限制，而是用于说明可利用的技术。
因此，在一些实施方案中，根据已知的方法，如静脉内施用，例如，浓注或者通过一段时期内的连续输注、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径，向个体施用NGF拮抗剂如抗NGF抗体。可使用可商业购买得到的用于液体制剂的喷雾器进行给药，包括喷射喷雾器和超声喷雾器。液体制剂可直接进行喷雾给药，冷冻干燥粉末可在重构后进行喷雾给药。备选地，NGF拮抗剂可使用碳氟化合物制剂和计量剂量吸入器进行气雾化，或者作为冷冻干燥的和碾磨的粉末吸入。
在一个实施方案中，NGF拮抗剂通过定点或靶向局部递药技术施用。定点或靶向局部递药技术的实例包括各种可植入的NGF拮抗剂的贮藏源或者局部递药导管，如输注导管、留置导管、或者针导管、合成移植物、外膜包(adventitial wrap)、分流器和斯腾特固定模(stent)或者其它可植入的装置、定点载体，直接注射或者直接施用。见，例如，PCT公开号WO00/53211和美国专利No.5,981,568。
可使用NGF拮抗剂(如抗NGF抗体)的多种制剂进行给药。在一些实施方案中，可仅给予NGF拮抗剂。在一些实施方案中，NGF拮抗剂包括抗NGF抗体，并且可以多种制剂的形式，包括包含可药用赋形剂的制剂。可药用赋形剂是本领域中已知的，并且是便于药理学上有效物质施用的相对惰性的物质。例如，赋形剂可产生形状或稠度，或者作为稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于：稳定剂、润湿和乳化剂、用于改变重量克分子渗透浓度的盐、封胶剂(encapsulating agents)、缓冲物以及皮肤穿透增强剂。在Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版MackPublishing(2000)中阐述了用于肠胃外和非肠胃外药物递送的赋形剂以及制剂。
在一些实施方案中，配制这些试剂用于通过注射(例如，腹膜内、静脉内、皮下、肌肉内等)给药。因此，可将这些试剂与可药用载体如盐水、Ringer溶液、葡萄糖溶液等结合。特定的剂量施用方案，即，剂量、时间选择和重复，将取决于特定的个体以及该个体的病史。
可使用任何适当的方法包括通过注射(例如，腹膜内、静脉内、皮下、肌肉内等)方式施用抗NGF抗体。如本文所述，抗NGF抗体也可通过吸入施用。一般地，对于抗NGF抗体的施用，最初的候选剂量可以是约2mg/kg。对于本发明的目的，取决于上述因素，一般的每日剂量范围可在约0.1μg/kg到3μg/kg到30μg/kg到300μg/kg到3mg/kg，到30mg/kg到100mg/kg或者更高。对于几天或更长时间期间的重复给药，视情况而定，持续进行治疗直到发生了所期望的症状的抑制或者直到达到了足够的治疗水平以至于减少了与骨转移有关的癌症疼痛。示范性的剂量方案包括施用约2mg/kg抗NGF抗体的初始剂量，随后每周给药约1mg/kg的维持剂量，或者随后每隔一周给予约1mg/kg的维持剂量。然而，其它剂量方案可能是有用的，这取决于医师希望达到的药代动力衰减的模式。例如，考虑每周给予1到4次。在一些实施方案中，可使用约3μg/mg到约2mg/kg(如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg以及约2mg/kg)的剂量。在一些实施方案中，给药频率是每周1次、每2周1次、每4周1次、每5周1次、每6周1次、每7周1次、每8周1次、每9周1次或者每10周1次；或者每月1次、每2月1次或每3月1次，或者更长。该治疗的进展很容易通过常规技术和测定进行监控。剂量方案(包括所使用的NGF拮抗剂)可随时间变化。
一般地，当其不是抗体时，可以(在一些实施方案中)将NGF拮抗剂以约0.1到300mg/kg患者体重分成1到3次的剂量施用，或者如这里所公开的施用。在一些实施方案中，对于正常体重的成年患者，可给予约0.3到5.00mg/kg的剂量。特定的剂量方案，即剂量、时间选择和重复将取决于特定的个体和该个体的病史，以及单个试剂的性质(如试剂的半衰期半衰期以及本领域公知的其它考虑因素)。
对于本发明的目的，NGF拮抗剂的适当剂量将取决于所用的NGF拮抗剂(或其组合物)、将要治疗的疼痛的类型和严重程度、试剂是否用于预防或治疗目的、以前的治疗、患者的临床病史和对试剂的反应以及治疗医生的判断力。一般地，临床医师将会施用NGF拮抗剂，如抗NGF抗体，直到达到获得期望结果的剂量。
经验考虑因素，如半衰期，通常将会有助于决定剂量。例如，与人免疫系统相容的抗体，如人源化抗体或完全人抗体，可用于延长抗体的半衰期并防止抗体被宿主的免疫系统攻击。在治疗期间可决定并且调整给药的频率，且其通常，但不是必然地，是根据疼痛的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。备选地，抗NGF抗体的持续连续释放制剂可能是适当的。实现持续释放的多种制剂和装置是本领域中已知的。
在一个实施方案中，在已给予一次或多次NGF拮抗剂(如抗体)的个体中可根据经验决定NGF拮抗剂的剂量。例如，可给予个体增量的NGF拮抗剂，例如，抗NGF抗体。为了评估NGF拮抗剂的效能，可监测疼痛的指标。
根据本发明的方法，NGF拮抗剂的施用可以是连续的或者是间断的，其取决于，例如，受体的生理状况，施用的目的是治疗性的还是预防性的，以及经验医生已知的其它因素。NGF拮抗剂的施用(例如，如果NGF拮抗剂是抗NGF抗体)可以是在预先选定的时间期间基本连续的，或者是以系列间隔的剂量施用，例如，在疼痛发展之前、期间或者疼痛发展之后；在疼痛发展之前；在疼痛发展期间；在疼痛发展之前和之后；在疼痛发展期间和之后；在疼痛发展之前和期间；或者在疼痛发展之前、期间以及之后。给药可在癌症转移到骨以及任何其它的可能产生与骨转移有关的癌症疼痛的事件之前、期间和/或之后，。
在一些实施方案中，可存在一种以上的NGF拮抗剂，如抗体。拮抗剂可以彼此相同或不同。可以存在至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种不同的NGF拮抗剂。通常，那些NGF拮抗剂具有不彼此反向影响的互补活性。NGF拮抗剂可与用以提高和/或补充试剂效力的其它试剂联合使用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂不与阿片样止痛剂一同施用。在一些实施方案中，NGF拮抗剂不与NSAID一同施用。
通过将具有期望纯度的抗体与任选的可药用载体、赋形剂或稳定剂混合，以冷冻干燥制剂或水溶液的形式制备用于贮藏的根据本发明所使用的NGF拮抗剂(如抗体)的治疗制剂(Remington，The Science and Practice ofPharmacy第20版Mack Publishing(2000))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度水平对受体无毒，并且可包括如磷酸、柠檬酸和其它有机酸的缓冲液；如氯化钠的盐；包括抗坏血酸和甲硫氨酸的抗氧化剂；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双胺；苯扎氯铵、氯化苄乙氧铵；酚醇、丁醇或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或者聚乙二醇(PEG)。
如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；以及美国专利No.4,485,045和4,544,545中所述，通过本领域的已知方法制备包含NGF拮抗剂(如抗体)的脂质体。美国专利No.5,013,556中公开了循环时间提高的脂质体。可用包括磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物，通过反相蒸发法产生特别有用的脂质体。可将脂质体经过孔大小确定的过滤器挤压以产生具有期望直径的脂质体。
可通过，例如，凝聚技术或者通过界面聚合(例如，在胶态给药系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳状液中分别是羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)将活性成分包裹在制备的微胶囊中。在Remington，The Science and Practice ofPharmacy第20版Mack Publishing(2000)中公开了这些技术。
可制备持续释放的制品。持续释放的制品的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透基质，该基质是以有形颗粒的形式，例如，膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)、或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙烯基乙酸、可降解的乳酸-乙二醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙二醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微球体)、蔗糖乙酸异丁酸盐以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
将用于体内施用的制剂必需是无菌的。这很容易通过例如，经无菌过滤膜的过滤实现。通常将治疗性的抗NGF抗体组合物置于具有无菌入口的容器内，例如，静脉内溶液袋或者经具有可被皮下注射针穿透的塞子的小瓶。
根据本发明的组合物可以是单位剂型如片剂、丸剂、胶囊、散剂、颗粒剂、溶液或混悬液，或者栓剂，用于口服、肠胃外或直肠给药，或者通过吸入或吹入施用。
为了制备固体组合物如片剂，将主要的活性成分与药学载体(例如，常规制片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)以及其它药物稀释剂(例如，水)混合，以形成固体预制组合物，该组合物是含有本发明化合物或者其无毒的可药用盐的同质混合物。当提到这些预制组合物为同质时，意指活性成分被均匀地分散到整个组合物中，使得可将组合物很容易地再分成同样有效的单位剂型如片剂、丸剂和胶囊。然后将该固体预制组合物再分成含有0.1至约500mg的本发明活性成分的上述类型的单位剂型。可将新组合物的片剂或丸剂包被或以其它方式配制以提供赋予延长作用优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包括内部剂量和外部剂量成分，后者以前者上的包膜的形式。可通过用于抵抗胃中的崩解并且允许内部成分完整进入十二指肠或者用于延迟释放的肠溶层将这两种成分分开。可使用多种材料用作这种肠溶层或包衣，这样的材料包括许多聚酸以及聚酸与这些材料如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素的混合物。
合适的表面活性剂具体地包括非离子试剂，如聚氧乙烯山梨糖醇酯(例如，TweenTM 20、40、60、80或85)和其它山梨糖醇酯(例如，SpanTM20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包括0.05％和5％之间的表面活性剂，并且表面活性剂可在0.1％和2.5％之间。应该理解的是，如果必要的话，可添加其它成分，例如，甘露醇或其它可药用载体。
可使用可商业购买得到的脂肪乳剂，如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM和LipiphysanTM制备适当的乳剂。活性成分可溶于预先混合的乳剂组合物或者备选地，可溶于油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)以及磷脂(例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)与水混合所形成的乳剂。应该理解，可添加其它成分，例如，甘油或葡萄糖，以调整乳剂的张力。合适的乳剂一般将含有多达20％的油，例如，在5％和20％之间。脂肪乳剂可包括在0.1和1.0μm之间的脂肪滴，特别是在0.1和0.5μm之间，并且具有5.5到8.0的pH范围。
乳剂组合物可以是通过将神经生长因子拮抗剂与IntralipidTM或者其成分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合所制备的那些。
吸入或吹入的组合物包括可药用溶液和混悬液、水性或有机溶剂、或其混合物，和散剂。液体或固体组合物可含有上述适当的可药用赋形剂。在一些实施方案中，组合物通过口服或鼻吸入途径施用于局部或全身作用。可通过使用气体使溶于优选的无菌可药用溶剂中的组合物雾化。雾化的溶液可直接从雾化装置中通过呼吸摄入或者可将雾化装置附着到面罩、帷幕或间歇正压呼吸机上。可从以适当方式递送制剂的装置施用溶液、混悬液或粉末组合物，优选地通过口服或鼻递送。
可通过本领域公知的方法评估治疗效果。
实施例
提供下列实施例以说明而非限制本发明。
实施例1
抗NGF单克隆抗体有效治疗与骨转移有关的癌症疼痛
我们使用鼠骨癌痛模型来评估用抗NGF抗体911(小鼠单克隆抗体；见Hongo等人，Hybridoma 19：215-227(2000))治疗的效能。通过将溶骨肉瘤细胞髓内注射到小鼠股骨中，然后将针孔用牙科汞合金填充以便将肿瘤限制于骨的范围内从而产生该骨癌痛的鼠模型。见Schwei等人，J.Neuroscience 19：10886-10897(1999)和Luger等人，Pain 99：397-406(2002)。实验在成年雄性C3H/HeJ小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)上进行。在第0天，用戊巴比妥钠(50mg/kg，腹膜内(i.p.))常规麻醉诱导后进行关节切开术。将针插入到髓管内以产生注射肉瘤细胞的通道。然后使用气动牙科高速机头做个凹陷。除了未注射肉瘤的动物(n＝5)，将α-极限必需培养基(20μl，Sigma，St.Louis，MO)注入到股骨的髓内空间(称作假处理)产生假处理的动物(n＝5)，而肉瘤动物(对于每个所检验的情况n＝5)注射含有105个2472溶骨肉瘤细胞(称作肉瘤或sarc)(20μl，ATCC，Rockville，MD)的培养基。对于所有动物，注射位点用牙科汞合金塞封闭以便将细胞或所注射的培养基限于髓内管内并且随后用无菌水(低渗溶液)冲洗。最后，用创伤夹完成切口的关闭。在第5天去除创伤夹以便不干扰行为试验。第二组注射肉瘤的动物在第6天和第13天用抗NGF处理(10mg/kg，腹膜内)。
行为分析。在肿瘤移植后第10天和第14天检验动物的与疼痛相关的行为。使用下列试验检验动物的行为：进行性疼痛(自发的防卫和畏缩)；步行疼痛(肢体使用和转棒)，以及运动引起的疼痛(触诊引起的防卫和触诊引起的畏缩)。将动物置于具有金属丝网底的清晰的塑料观察盒内并使动物在盒中习惯30分钟。适应环境后，评估在开放场地中自发防卫、自发畏缩、在正常步行期间的肢体使用，以及在被迫步行期间的防卫。在注射了肉瘤的和假处理的动物中远侧股骨的正常无害触诊2分钟后，测量触诊诱发的防卫和畏缩。
在2分钟观察期间同时记录代表疼痛引起行为的自发畏缩次数和用于防卫的时间。将防卫定义为后爪举在高处的情况，而步行和畏缩是动物保持肢体举在高处时候的次数。
按5-0等级给在自发步行期间的正常肢体使用评分：(5)正常使用，(0)完全缺乏肢体使用。
使用转棒(Columbus Instruments，Columbus，OH)确定被迫步行的防卫。Rotarod转棒机器具有旋转杆并装备了速度、加速度以及灵敏度控制。将动物置于X4速度、8.0加速度以及2.5灵敏度的杆上。按5-0等级评价被迫的步行防卫：(5)正常使用，(0)完全缺乏使用。
在每两个动物远端股骨的正常无害触诊2分钟后，将动物置于观察盒中，测量另外2分钟期间它们的触诊诱导的防卫和触诊引起的畏缩。
抗NGF抗体的治疗。在第6天和第13天，向注射过肉瘤的动物腹膜内(i.p.)注射10mg/kg的抗NGF抗体911(肉瘤+抗NGF，n＝5)，或者向已注射过肉瘤和假注射的动物注射(i.p.)盐水(假处理+载体或肉瘤+载体，每种情况n＝5)。在第10天和第14天对所有动物进行行为分析。
进行性疼痛行为的评价。如图1所示，通过自发防卫和自发畏缩评估，与假注射的动物(施用盐水)相比，已注射肉瘤的动物(施用盐水)显示出了进行性的疼痛行为(两者均p＜0.05，ANOVA)。图1还显示与向已注射肉瘤的小鼠施用盐水相比，在肿瘤移植后第10天和第14天，腹膜内施用抗NGF抗体911在已注射肉瘤的小鼠中显著减少自发防卫和自发畏缩(对于自发防卫和自发畏缩，两者均p＜0.05，ANOVA)。这些结果表明抗NGF抗体911在注射肉瘤的小鼠中减少进行性疼痛。
步行性疼痛行为的评价。如图2所示，通过肢体使用和被迫的步行防卫(转棒)评估，与假注射的动物(施用盐水)相比，注射了肉瘤的动物(施用盐水)显示出了步行性疼痛行为(两者均p＜0.05，ANOVA)。图2还显示，与向已注射肉瘤的小鼠施用盐水相比，在肉瘤移植后第10天和第14天，腹膜内施用抗NGF抗体911在已注射肉瘤的小鼠中显著增加(更接近正常)肢体使用评分和被迫的步行防卫评分(对于肢体使用和被迫步行防卫，两者均p＜0.05，ANOVA)。这些结果表明抗NGF抗体911在已注射肉瘤的小鼠中减少步行性疼痛。
接触引起的疼痛行为的评价。如图3所示，通过触诊诱发的防卫和触诊诱发的畏缩评估，与假注射的动物(施用盐水)相比，已注射肉瘤的动物(施用盐水)显示出了接触引起的疼痛行为。图3还显示，与向已注射肉瘤的小鼠施用盐水相比，在肉瘤移植后第10天和第14天，抗NGF抗体911的腹膜内施用在已注射肉瘤的小鼠中显著减少触诊诱发的防卫和触诊诱发的畏缩(对于触诊诱发的防卫和触诊诱发的畏缩，两者均p＜0.05，ANOVA)。这些结果表明抗NGF抗体911在已注射肉瘤的小鼠中减少接触引起的疼痛。
实施例2
抗NGF单克隆抗体有效治疗骨癌痛并且在背根神经节和脊髓中减少与外周和中枢致敏有关的数种神经化学变化
方法
动物。实验在总共158只，每只体重在20-25g的成年雄性C3H/HeJ小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)上进行。根据国立卫生院的指导方针，小鼠在特殊的无病原体(SPF)条件下被关在维持于22℃，具有12小时交互的光照和黑暗循环的高压灭菌的笼中，并且随意地给予高压灭菌食物和水。
肿瘤细胞的培养和注射。根据以前由Sabino等人，Cancer Res.62：7343-9(2002)所述方法获得溶骨性小鼠肉瘤细胞(NCTC 2472，ATCC，Rockville，MD)，用绿色荧光蛋白(GFP)稳定转染并维持。
如以前所述进行肿瘤细胞的注射。Honore等人，Nat.Med.6：521-8(2000)；Honore等人，Neuroscience 98：585-598(2000)；Luger等人，CancerResearch 61：4038-4047(2001)。简言之，用戊巴比妥钠(50mg/kg，i.p.)常规麻醉诱导后，进行关节切开术，暴露远侧股骨的骨节。将Hank缓冲的无菌盐水(HBSS，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO；20μl；假处理，n＝40)或者含有105个溶骨性小鼠肉瘤细胞(20μl，NCTC 2472，ATCC，Rockville，MD；假处理，n＝90)的培养基注射到小鼠股骨的髓内空间，并且注射位点用牙科汞合金(Dentsply，Milford，DE)封闭，随后用无菌过滤的水冲洗。使用第14天为终点，由于这是肿瘤仍限于骨的时间点，并且此时有癌症相关疼痛行为的最大表现以及外周和中枢致敏的神经化学标记表达的最大变化。使用假处理的动物作为神经化学变化和骨组织学的对照分析，因为未注射肉瘤的动物在行为上、神经化学方面或组织学上没有显著不同。
抗NGF抗体的治疗。为了评估抗NGF抗体治疗对疼痛相关行为、神经化学变化、肿瘤生长和骨破坏的影响，施用抗NGF抗体(mAb911，描述于Hongo等人，Hybridoma 19：215-227(2000))(10mg/kg/每5天，i.p.)，从注射后6天起可观察到的骨破坏的开始，在注射后14天观察到显著的骨破坏和疼痛行为时终止。在当前研究中所使用的剂量没有在未注射肉瘤的小鼠中引起副作用，如痛觉减退。为了监控小鼠的总的健康状况，在实验开始和终止时记录体重。
将小鼠随机置于每周接受无菌盐水(假处理+载体：n＝28；肉瘤+载体：n＝35；1.4μl/g/每5天，i.p.)或抗NGF抗体(假处理+抗NGF；n＝4；肉瘤+抗NGF：n＝23，10mg/kg/每5天，i.p.)的治疗组。为了进行抗NGF抗体与硫酸吗啡的行为比较，在行为试验前15分钟给予小鼠一定剂量的吗啡(未注射肉瘤：n＝6；假处理+载体：n＝8；肉瘤+载体：n＝8；肉瘤+抗NGF：n＝8；肉瘤+吗啡10mg/kg，i.p.：n＝8；肉瘤+吗啡30mg/kg，i.p.：n＝8)。为了热敏感性和机械敏感性试验和后爪皮肤神经支配的评估，将小鼠分成每周接受无菌盐水(未注射肉瘤+载体：n＝11)或抗NGF抗体(未注射肉瘤+抗NGF：n＝11，10mg/kg/每5天，i.p.)持续2周的两个治疗组。
抗NGF抗体的表征。NGF拮抗剂抗体(mAb 911)有效阻断NGF与TrkA和p75 NGF拮抗剂受体的结合并抑制Trk A自体磷酸化以及阻断背根神经节感觉神经元的依赖NGF的存活。Hongo等人，Hybridoma 19：215-227(2000)。
安乐死和组织的处理。在肿瘤注射后14天处死小鼠，对组织进行加工用于脊髓、前述的背根神经节(DRG)和后爪皮肤的免疫组化分析。Honore等人，Nat.Med.6：521-8(2000)；Luger等人，Cancer Research 61：4038-4047(2001)。简言之，在安乐死前1.5小时小鼠注射过的膝盖接受正常无害的机械刺激以诱导c-Fos表达。Honore等人，Neuroscience 98：585-598(2000)；Hunt等人，Nature 328：632-634(1987)。这种操作后，将小鼠用CO2进行安乐死并用12ml 0.1M磷酸缓冲盐(PBS)心脏内灌注，随后用25ml 4％甲醛/12.5％苦味酸溶液心脏内灌注。
在灌注固定剂中固定后取出(L2-L4)、DGR(L1-L5)和足底皮肤，并在30％蔗糖中冷冻保护24小时。在滑动切片机上切成60μm厚的连续冷冻脊髓和皮肤切片，收集在PBS中，并加工成自由漂浮的切片。在恒冷切片机上切成15μm厚的连续DRG切片，并在明胶包被的载玻片上解冻-固定以待处理。
切片后，将DRG、脊髓和足底皮肤切片在PBS中简单地清洗，然后在封闭液(溶于PBS的3％正常驴血清(NDS)0.3％Triton X-100)中孵育1小时，随后在一抗中孵育过夜。将脊髓切片对c-Fos蛋白(1∶2000，OncogeneResearch，San Diego，CA)和强啡肽(多克隆豚鼠抗强啡肽，1∶1,000，Neuromics，Minneapolis，MN)进行免疫染色。将DRG切片对转录激活因子3(ATF-3)(多克隆兔抗ATF-3，1∶500，Santa Cruz Biotechnologies，SantaCruz，CA)和CD68(ED-1；多克隆大鼠抗CD68，1∶5,000，Serotec，Raleigh，NC)进行免疫染色。将皮肤切片对降钙素基因相关肽(CGRP)(1∶15,000；Sigma，St.Louis，MO)、酪氨酸羟化酶(TOH)(多克隆兔抗TOH，1∶2,000，Chemicon，Temecula，CA)和神经丝H(克隆RT97)(多克隆兔抗RT-97，1∶2,500，Chemicon，Temecula，CA)进行免疫染色。
在一抗中孵育后，将切片在PBS中清洗，然后在二抗溶液中孵育3小时。使用分别为1∶600或1∶500的与Cy3或生物素缀合的二抗(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)。为了检测与生物素缀合的二抗，二抗孵育后，将切片在PBS中冲洗并在Cy3缀合的链霉抗生物素蛋白(1∶4000；Jackson Immuno Research)中孵育45分钟。为了证实一抗的特异性，对照包括省略一抗的对照或者用对应合成肽预吸收的对照。免疫染色操作后，将脊髓和足底皮肤切片固定在明胶包被的载玻片上。然后将所固定的皮肤、脊髓和DRG的切片在乙醇梯度(70、90、100％)中脱水，在二甲苯中使其透明并将盖玻片用DPX(Fluka，Switzerland)封片。
放射检查后，在第14天，将右侧(内对照)和左侧(携带肿瘤)股骨在苦味酸和4％福尔马林中在4℃过夜固定，并在10％EDTA(Sigma.，St.Louis，MO)中脱钙不超过14天。然后将骨包埋在石蜡中。股骨切片从侧面被切成5μm厚并用酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRAP)以及苏木精和伊红(H&E)染色以显示正常骨髓、肿瘤、破骨细胞和巨噬细胞的组织学特征。为了使用荧光显微术显示肉瘤细胞，将5μm厚的股骨切片用抗绿色荧光蛋白(GFP)的抗体(兔抗GFP，1∶6,000，Molecular Probes，Eugene，OR)染色。根据以前由Sevcik等人，Pain 111：169-80(2004)所述的方法，使用TSA-Plus花菁3系统(PerkinElmer Life Sciences，Inc.，Boston，MA)进行GFP染色。
在脱钙的，石蜡包埋的14μm的连续切片上进行假处理的和癌性股骨的免疫组化分析。使用酪胺信号扩增(TSA)系统(Perkin Elmer life Sciences，Boston，MA)扩增Cy3标记的抗体。将切片在2％过氧化氢中孵育1小时淬灭内源性过氧化物酶。然后将切片用PBS冲洗3次，共10分钟，并在TSA封闭缓冲液中封闭1小时。除去封闭缓冲液后立即加入一抗血清并在室温下孵育过夜。使用抗多克隆兔抗降钙素基因相关肽(CGRP)的抗体(1∶15,000；Sigma)标记初级无髓鞘的和有薄髓鞘的感觉神经纤维。将切片在TSA洗涤缓冲液中冲洗三次，共10分钟，随后在链霉抗生物素HRP(1∶4,000)中孵育45分钟。然后将切片用TSA洗涤缓冲液冲洗三次，共10分钟。用缀合CY3的酪胺(1∶600)处理股骨切片7分钟，用TSA洗涤缓冲液冲洗两次并用PBS冲洗一次。最后，将切片进行风干、通过乙醇梯度(70、90和100％)脱水，在二甲苯中使其透明并用DPX(Fluka)封片。
骨的放射性分析以及破骨细胞和巨噬细胞增殖分析。在第14天时间点获得剖开股骨的放射显影图(Faxitron X-ray Corp.，Wheeling，IL)以便最佳地评价骨破坏。图象记录在Kodak Min-R 2000乳腺X线照相术胶片(Eastman Kodak Co.，Rochester，NY；曝光设置：7秒，21kVp)上。在5X放大的整个骨的侧面图象上通过X线照片评估肿瘤诱导的股骨破坏的程度，使用0-5等级(0，没有破坏迹象的正常骨，而5，全部的厚双皮质骨丧失)。Honore等人，Nat.Med.6：521-8(2000)；Honore等人，Neuroscience98：585-598(2000)；Luger等人，Cancer Research 61：4038-4047(2001)。
根据前述方法通过定量TRAP染色的股骨切片上TRAP+破骨细胞或肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的数量，测定破骨细胞和TAM的增殖。Honore等人，Nat.Med.6：521-8(2000)；Honore等人，Neuroscience 98：585-598(2000)。简言之，在用TRAP染色的股骨切片上，TAM可从组织学上与游离和多维地分散在整个肿瘤团中的用TRAP染色为TRAP+的破骨细胞相鉴别。骨内的巨噬细胞由于肿瘤所释放的刺激细胞因子而被活化，且这些被活化的TAM细胞的标志是其高度不规则的表面、多个片状伪足和吞噬泡。呈现TRAP+的破骨细胞可通过组织学鉴别，且其与骨吸收的区域密切相关。这些细胞是多核的并且被发现沿着皮层和小梁骨分布。结果被分别表示成每mm2破骨细胞或每mm2TAM的均值。
肿瘤生长的定量。使用通过Nikon E600荧光显微镜上长缝隙发射光滤光器的515nm黄色光对含有表达GFP的肉瘤细胞的股骨成像，其中荧光显微镜装备了利用SPOT图象捕获软件(Diagnostic Instruments，SterlingHeights，MI)的SPOT II数字照相机。使用Image Pro Plus v3.0软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)计算髓内空间的总面积和肿瘤所占据的髓内空间的百分率。Sabino等人，Cancer Res.62：7343-9(2002)；Sevcik等人，Pain 111：169-80(2004)。用GFP转染的肉瘤细胞的肿瘤特征，如生长率、骨吸收率和诱导与骨癌相关疼痛行为的能力，在时间上、行为上和外观上与非转染的肉瘤细胞完全相同。Sabino等人，Cancer Res.62：7343-9(2002)。
骨内感觉纤维的定量。根据以前所述方法测定感觉神经纤维的数量。Mach等人，Neuroscience 113：155-66(2002)。简言之，定量三个骨区域(近端的、远侧的和骨干的)和三个骨组织(骨膜、矿化骨和骨髓)中CGRP阳性纤维的数量。该分析仅包括长度大于30μm的神经纤维。每个动物分析6个切片，所计数的纤维表示成每总骨面积的纤维数。
脊髓、背根神经节和后爪皮肤的定量。使用MRC 1024共焦显微镜成像系统(Bio-Rad，Philadelphia，PA)，或者Olympus BX-60荧光显微镜上的具有SPOT图象捕获软件(Diagnostic Instruments，Inc.)的SPOT II数字照相机分析荧光标记的脊髓、DRG和皮肤组织切片。
在200x放大率下用1cm2目镜栅格计数表达转录激活因子3(ATF-3)的DRG神经元的数量。通过计数标记和未标记的神经元细胞体(未标记的细胞体显示可通过罗丹明或FITC滤光器检查的背景标记)测定神经元(小的、中等的和大的)的总数，结果表示为表达ATF-3免疫反应性(IR)的神经元总数的百分率。为了防止神经细胞体的重复计数，在每第四个连续切片上对每个标记进行计数。为了定量DRG内激活的或浸润的巨噬细胞，在每个动物的四个同侧和对侧DRG切片中的最小的一个切片上获得SPOT照相机灰色刻度图象并使用Image Pro Plus version 3.0软件(MediaCybernetics)进行分析。对于每个图象，画出仅含有感觉神经元细胞体(不包括外周神经)的DRG区域的轮廓。当观看监测器时，设置更高和更低的灰色水平密度的域值，使在画出的DRG中仅特异性CD68-IR细胞剖面区别于背景。每个切片的细胞剖面的数量被自动计数。在Image Pro Plus中调整SPOT照相机的输出，使得可测定所获图象内每个所画区域的实际面积。对每个动物的CD68-IR细胞剖面的切片数值和所画区域计算总数，且结果被表示为每单位面积(mm2)中CD68-IR细胞剖面的总数。
定量在腰神经部位L2-L4脊髓切片中进行，因为这些神经节段接收来自L1-L3 DRG的大量传入输入，所述L1-L3 DRG是向小鼠股骨提供传入输入的主要神经节。Edoff等人，Cell & Tissue Research 299：193-200(2000)；Molander C，J Coinp.Neurol.260：246-255(1987)；Puigdellivol-Sanchez A等人，the Anatomical Record 260：180-188(2000)；Puigdellivol-Sanchez A等人，Neurosci.Lett.251：169-172(1998)。从每个动物的4个随机选择的L2-L4冠状脊髓切片中获得脊髓切片中强啡肽的定量。在100×放大率时计数脊髓层III-VI中强啡肽-IR神经元的数量并且表示成每个动物中每60μm L2-L4切片中神经元的均值。在每个动物的8个随机选择的L3/L4冠状脊髓切片中计数后角的III-VI层中c-Fos-IR神经元的数量。为了被确认为c-Fos-IR，核剖面的免疫荧光阈值被设置在三倍于组织切片的平均背景免疫荧光水平。结果表示为每个脊髓切片中c-Fos-IR神经元的均值。
在每个动物的4个随机选择的后爪足底皮肤切片上进行表皮神经支配密度的定量。在200×放大率时计数CGRP、TOH和RT97-IR神经纤维的数量。建立计数规则以便仅计数单个表皮内纤维而非同一纤维的多个分支。McCarthy等人，Neurology 45：1848-55(1995)。使用1cm2目镜栅格在所有定量的切片中测量表皮的总长度。仅计数长度至少25μm，并且突入到浅表皮中的神经纤维。结果表示为每个动物每毫米长度中表皮内神经纤维的均值。
行为分析。在假处理或肿瘤注射后第10和14天，当疼痛行为十分明显以至于可以评估抗NGF抗体治疗的效能时，检验小鼠的骨癌痛相关行为。将抗NGF治疗与吗啡(Baxter，Deerfield，IL；10mg/kg，i.p.)治疗进行比较，并在行为检验前15分钟施用，以确保在药物作用的治疗窗内检验动物。Hasselstrom等人，Pharmacology & Toxicology 79：40-6(1996)。
还在肿瘤注射或假处理注射后的8、10、12和14天检验小鼠以评估抗NGF治疗(10mg/kg/每5天，i.p.)在整个疾病的进展中减轻疼痛相关行为的效能。在2分钟期间观察动物并且根据以前所述方法分析进行性的和触诊引起的骨癌痛行为。Luger等人，Pain 99：397-406(2002)；Sabino等人，Cancer Res.62：7343-9(2002)；Sabino等人，International Journal ofCancer 104：550-558(2003)。简言之，将后爪畏缩次数和防卫所花费时间记录为进行性疼痛的测量值，因为这些测量值反映了临床上患有骨癌的患者保护或悬挂他们有肿瘤的肢体。在我们的模型中，使用以前确认的试验评估由注射肢体的触诊引起的运动引发的疼痛。Luger等人，CancerResearch 61：4038-4047(2001)；Sabino等人，International J.of Cancer 104：550-558(2003)；Sevcik等人，Pain 111：169-80(2004)。动物注射肿瘤或假处理的肢体接受正常的无害触诊2分钟，随后观察以检查触诊引起的疼痛行为。Luger等人，Cancer Research 61：4038-4047(2001)；Sevcik等人，Pain 111：169-80(2004)。监控小鼠2分钟，并且记录畏缩次数和防卫所花的时间。发展触诊引起的行为试验以便反映当在有肿瘤的肢体正常无害运动后，患有骨癌的患者经历疼痛的临床情况。
15分钟适应期后，在未注射肿瘤的和未注射肿瘤+抗NGF动物中测量热敏感性和机械敏感性，以评估在用抗NGF治疗后正常的疼痛阈值反应是否发生改变。使用热爪刺激器(University of California，San Diego，SanDiego，CA)测量热敏感性。调整辐射热的强度使未注射肿瘤的动物通过在开始加热后大约9秒举起后爪对热发生反应。Choi等人，Life Sci.73：471-85(2003)。在每次试验之间给小鼠5分钟时间恢复。一个试验由每个后爪4次测量构成，去掉最长的潜伏期并取剩余的3次测量值的平均值。使用以前确认的方法测量机械敏感性。Chaplan等人，J.Neuroscience Methods 53：55-63(1994)。将Von Frey细丝(Stoelting Co.，Wood Dale，IL)应用到动物的后爪，通过增加和降低相当于0.2和15.1克力之间的刺激强度测定撤回的阈值。如果爪迅速撤回，记为阳性反应。
2472细胞系中NGF的mRNA水平的RT PCR分析。使用RNeasy micro试剂盒(Qiagen)，根据生产商的使用说明书从一式三份的小鼠组织标本或2472肉瘤细胞制备总RNA，并使用Ribogreen试剂(Molecular Probes)对RNA进行定量。使用TaqMan Gold RT-PCR试剂盒(Applied Biosystems)进行两步RT-PCR。使用随机六聚体对RNA进行逆转录，并且使用特异于NGF的引物/探针组(muNGF-187F：GGGCTGGATGGCATGCT(SEQID NO：3)、muNGF-256R：GCGTCCTTGGCAAAACCTT(SEQ ID NO：4)、muNGF-208T：CCAAGCTCACCTCAGTGTCTGGGCC(SEQ ID NO：5))扩增cDNA。将RT水平的样品一式两份进行分析，并相对于总RNA输入进行标准化。
绕计分析。使用第11版SPSS计算机统计包(SPSS，Chicago，IL)进行统计分析。使用混合效果线性回归模型分析重复的测量数据，该模型可适应于在不同时间间隔测量的对象，包括固定的和随时间变化的共变量，并且可估计个体的变化率。使用方差的非参数分析(Kruskal-Wallis)将每个从属变量结果进行组间比较。进行Kruskal-Wallis显著性分析后使用Mann-Whitney U检验进行配对组间非参数的事后比较(post-hoccomparisions)。结果在P＜0.05时被认为有统计学意义。在所有情况中，研究者对每个动物的实验情况是未知的。
结果
施用抗NGF对疾病进展或骨中巨噬细胞浸润没有影响。在肿瘤注射后第14天，检查抗NGF治疗对骨破坏、破骨细胞增殖和肿瘤生长的影响。根据放射性、TRAP和H&E/GFP分析的评估，分别与注射肉瘤的小鼠相比，假注射的小鼠没有显示显著的骨破坏(骨评分0.9±0.4；图4a)、破骨细胞增殖(4.6±0.4破骨细胞/mm2)或者肿瘤生长(图4d)。在肉瘤+载体的小鼠中，如所观察到和通过多病灶的射线透射性所表征的那样(骨评分3.5±0.2；图4b)，存在着广泛的骨破坏，破骨细胞的数量显著增加(4.0±0.7破骨细胞/mm2)以及肿瘤已完全填充了髓内空间(髓内空间的100±0.0％；图4e)。与肉瘤+载体动物相比，携带肿瘤的小鼠在肿瘤注射后第6天到第14天的抗NGF的治疗没有产生骨吸收的显著改变(3.1±0.6；图4c)，没有导致肉瘤诱导的破骨细胞增殖降低(3.5±0.1破骨细胞/mm2)或者肿瘤生长降低(髓内空间的98.0±0.9％；图4f)。
肿瘤注射后14天，与假处理+载体的对照小鼠(0.0±0.0TAM/mm2)相比，肉瘤+载体小鼠显示TAM上调(39.8±12.6TAM/mm2)。如在肉瘤+载体小鼠中所看到的，注射肉瘤的小鼠的抗NGF治疗(29.5±7.3TAM/mm2)没有显著改变这种TAM浸润。
抗NGF治疗对骨或皮肤中的感觉或交感神经支配没有可观察到的影响。用抗降钙素基因相关肽(CGRP)的抗体标记有薄髓鞘的或无髓鞘的肽能感觉神经纤维。在未注射肿瘤+载体(12.2±0.3纤维/mm)和未注射肿瘤+抗NGF(13.0±0.8纤维/mm)动物的整个骨(骨膜、矿化骨和骨髓)中都发现了CGRP-IR神经纤维。
分别通过抗CGRP、RT-97和TOH的抗体，分析后爪足底皮肤中有薄髓鞘或无髓鞘肽能感觉神经纤维(CGRP-IR)、大的有髓鞘感觉纤维(RT97-IR)以及去甲肾上腺素能神经纤维(TOH-IR)。在肉瘤+载体(12.0±0.8纤维/mm)和肉瘤+抗NGF(12.5±0.6纤维/mm)后爪皮肤标本中，CGRP阳性纤维的强度或密度之间没有显著差异(图5a和5b)。类似地，在未注射肿瘤+载体(图5c，n＝8)小鼠和未注射肿瘤+抗NGF(图5d，n＝8)小鼠之间，CGRP阳性纤维的强度或密度没有差异。在注射了肉瘤的小鼠和未注射肉瘤的小鼠(a、b对c、d)中表达CGRP的神经纤维的数量没有变化。在肉瘤+载体(7.3±0.7 RT97+纤维/mm；3.1±0.7 TOH+纤维/mm)和肉瘤+抗NGF处理(7.3±0.7 RT97+纤维/mm；3.6±0.7 TOH+纤维/mm)的动物中，也没有检测到RT97阳性和TOH阳性纤维的密度和强度的差异。类似地，在未注射肿瘤+载体(12.5±0.5纤维/mm)和未注射肿瘤+抗NGF(11.9±0.7纤维/mm)的后爪皮肤标本中，CGRP阳性纤维的强度或密度之间没有显著差异(图5c和5d)。在未注射肿瘤+载体(10.4±0.4 RT97+纤维/mm；3.4±0.4 TOH+纤维/mm)和未注射肿瘤+抗NGF处理(11.9±0.7RT97+纤维/mm；3.0±0.8 TOH+纤维/mm)的动物中，也没有检测到RT97阳性和TOH阳性纤维的密度和强度的差异。在肉瘤+载体和肉瘤+抗NGF对未注射肿瘤+载体和未注射肿瘤+抗NGF动物的皮肤标本中，CGRP、RT97或TOH阳性纤维的强度或密度之间没有可观察到的显著差异。
抗NGF抗体治疗显著减少骨癌痛行为。与假处理+载体对照相比，肉瘤+载体小鼠证明防卫所花的时间更多(图6a)。另外，与假处理+载体对照相比，肉瘤+载体小鼠显示畏缩次数增加(图6b)。与肉瘤+载体小鼠相比，在注射肉瘤的小鼠中抗NGF的施用(从第6天到第14天)显著减少自发防卫(图6a)。在注射肉瘤的小鼠中，抗NGF治疗也显著减少自发的畏缩(图6b)。
通过测量触诊诱发的应答，分析运动引起的疼痛。与假处理+载体对照相比，肉瘤+载体小鼠证明触诊后防卫所花的时间更多(图6c)。与假处理+载体对照相比，肉瘤+载体小鼠也显示触诊后畏缩次数增加(图6d)。在注射肉瘤的小鼠中，抗NGF治疗显著减少触诊引起的防卫(图6c)和触诊引起的畏缩(图6d)。在初步研究中，在接受载体或抗NGF的假手术的动物之间没有观察到显著的行为差异或副作用。
图6显示与肉瘤+载体(n＝8)(正方形)相比，从肿瘤注射后第6天到第14天的抗NGF治疗(n＝8)(三角形)在第10、12和14天显著减少进行性的和触诊引起的疼痛行为，并且在第10天所有参数均显著降低到假处理水平(菱形)。在所有的时间点，假处理+载体(n＝8)与肉瘤+载体均显著不同。因此，抗NGF治疗(10mg/kg，i.p.，每5天一次)在整个疾病的进展中减少进行性的和运动引起的骨癌痛行为。
抗NGF治疗对基线热阈值或基线机械阈值没有影响并且在减少骨癌痛方面与吗啡的效能相当。与正常疼痛阈值相比，施用抗NGF没有显著增加爪对热刺激撤回的潜伏期或者增加机械刺激的阈值。与未注射肿瘤+载体相比，抗NGF治疗没有影响正常的热反应(图7a)，与未注射肿瘤+载体相比，也没有影响正常的机械刺激(图7b)。
测试动物以比较硫酸吗啡(MS)与抗NGF抗体在减少骨癌相关行为方面的效能。在10天和14天的行为评估显示，与假处理+载体动物相比，肉瘤+载体动物显示在统计学上注射肢体的防卫时间更长(图7c)，并且对触诊应答的防卫时间增加(图7d)。与肉瘤+载体小鼠相比，用抗NGF(10mg/kg/每5天，i.p.)或硫酸吗啡(10mg/kg，或30mg/kg i.p.)处理在肿瘤注射后第10天和第14天显著减少进行性的和运动引起的防卫行为(图7c、7d)。与10mg/kg或30mg/kg剂量的吗啡相比，抗NGF治疗更有效地显著减少骨癌相关的疼痛行为(相对于肉瘤+抗NGF，P＜0.05)。
抗NGF治疗在DRG中调整由骨癌诱导的外周改变。以前已经在外周神经损伤的模型中证明属于ATF/CREB家族的转录激活因子-3(AT-3)上调。Tsujino等人，Molecular & Cellular Neurosciences 15：170-82(2000)。在感觉和运动神经元细胞体中可见该上调，并且已知可标记受损的神经元。与假处理+载体(在表达ATF-3的L2中总神经元的1.6±0.5％)相比，在注射肉瘤的股骨同侧的L2 DRG中ATF-3-IR神经元的百分率显著增加(在表达ATF-3的L2中总神经元的14.0±5.9％；图8a)。用抗NGF的治疗在肿瘤注射后14天显著减少ATF-3的表达(在表达ATF-3的L2中总神经元的2.6±1.0％；图8b)。
已证明由于外周神经损害导致巨噬细胞浸润上调。Abbadie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100：7947-52(2003)；Myers等人，Exp.Neurol.141：94-101(1996)；Tofaris等人，J Neurosci.22：6696-703(2002)。在注射肉瘤的小鼠中使用抗CD68(一种由活化的组织巨噬细胞所表达的溶酶体蛋白)的抗体(ED-1)评估巨噬细胞浸润。与假处理+载体(80.6±6.0细胞剖面/L2同侧DRG)相比，在肉瘤+载体小鼠的同侧DRG中CD68-IR神经元的数量上调(119.6±12.1细胞剖面/L2同侧DRG；图8c)。在注射肉瘤的小鼠中，抗NGF治疗显著减少同侧DRG中CD68-IR神经元的上调(92.0±9.9细胞剖面/L2同侧DRG；图8d)，表明在携带肿瘤动物的同侧L2 DRG内活化和浸润的巨噬细胞的数量显著减少。
抗NGF治疗在脊髓中调整由骨癌诱导的中枢改变。已经证明强啡肽的表达参与慢性疼痛的维持。Vanderah等人，Pain 92：5-9(2001)。也已经证明在几个持续疼痛状态的脊髓后角中强啡肽表达上调。Iadarola，等人，Brain Res.455：205-212(1988)；Noguchi等人，Molecular Brain Research 10：227-233(1991)；Schwei等人，J.Neurosci.19：10886-97(1999)。在假处理+载体小鼠中，少量脊髓神经元在深脊髓板中表达强啡肽(2.3±1.1 dyn-IR神经元/L3/L4切片)。相反，肉瘤+载体小鼠显著地显示出更多的强啡肽-IR神经元(6.0±0.5 dyn-IR神经元/L3/L4切片；图9A)。在注射肉瘤的小鼠中，抗NGF治疗显著地降低强啡肽表达的上调(2.0±0.6 dyn-IR神经元/L3/L4切片；图9B)。
抗NGF治疗防止即早期基因活化。已利用后角深层(III-VI层)中c-Fos的表达作为在肉瘤诱导的骨癌痛状态中枢性致敏的标记。Honore等人，Nat.Med.6：521-8(2000)；Honore等人，Neuroscience 98：585-598(2000)；Luger等人，Cancer Research 61：4038-4047(2001)；Schwei等人，J.Neurosci.19：10886-97(1999)。假手术动物的正常、无害触诊引起深层中c-Fos的最低表达。Sabino等人，Cancer Res.62：7343-9(2002)。在骨癌状态中，肉瘤+载体小鼠显示c-Fos-IR神经元的数量增加(27.7±4.9；c-Fos-IR神经元/L3/L4切片；图9C)，用抗NGF的治疗显著减少该表达(11.1±1.9；c-Fos-IR神经元/L3/L4切片；图9D)。
RT PCR结果。为探明肉瘤肿瘤细胞是否是NGF的可能来源，通过RT-PCR评估在培养基中生长的2472细胞的NGF mRNA水平。将这些细胞的NGF mRNA水平与小鼠的几种正常组织的NGF mRNA的水平，以及与雄性小鼠唾液腺(一种异常高外分泌NGF来源)的NGF mRNA的水平进行比较。如下表3所示，在体外肉瘤2472细胞中含有容易检测到的NGFmRNA。该水平是在从表达高水平NGF mRNA的正常组织，如虹膜中所获得的NGF mRNA水平的范围内。Shelton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：7951-5(1984)。然而，该水平低于雄性小鼠唾液腺中存在的NGF mRNA水平几个数量级。
表3显示NGF表达水平的RT PCR数据
  组织类型   相对单位
  脑   1.2±0.8
  心房   1.9±0.7
  2472细胞   8±1.1
  虹膜   8.8±3.6
  颌下腺   1359.1±583.7
实施例3
在通过将成骨细胞的前列腺肿瘤细胞髓内注射到股骨内的方法所产生的鼠模型中，抗NGF单克隆抗体治疗骨癌痛的效果
方法
骨癌痛的鼠前列腺模型。使用骨癌痛的鼠前列腺模型评估抗NGF抗体911(小鼠单克隆抗体；见Hongo，等人，Hybridoma 19：215-227(2000))的治疗效能。维持犬成骨细胞癌(ACE-1，由Dr.Thomas J.Rosol，Ohio StateUniveristy馈赠)细胞，并根据以前所述方法对肿瘤细胞进行注射。Sabino等人，Cancer Res.62：7343-7349，2002；Honore等人，Nature Medicine 6：521-528，2000；Honore等人，Prog.Brain Res.129：389-397，2000；Luger等人，Cancer Research 61：4038-4047，2001。简言之，ACE-1细胞在37℃和5％CO2条件下培养基中生长。细胞被培养在T75培养瓶(7.5cm2)中并每周两次地在细胞达到80-90％汇合时传代。在本研究中仅使用在第3代和第11代之间的细胞。在第0天，在用戊巴比妥钠(50mg/kg，i.p.)常规麻醉诱导后，进行关节切开术，暴露远侧股骨的骨节。将Hank缓冲的无菌盐水(HBSS，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO；20μl；假处理，n＝7)或含有105个成骨细胞犬ACE-1细胞(20μl，ACE-1，n＝60)的培养基注射到小鼠股骨的髓内空间并且将注射位点用牙科汞合金(Dentsply，Milford，DE)封闭，随后用无菌过滤水冲洗。实验在总共89只8-10周龄，每只重20-32g的成年雄性无胸腺的裸鼠(Harlan Laboratories，Madison，WI)上进行。根据国立卫生院的指导方针，小鼠圈养在特殊的无病原体(SPF)的条件下，维持于22℃具有12小时交替的光照和黑暗周期的高压灭菌的笼中，并且随意给予高压灭菌的食物和水。
使用注射后第19天作为终点，由于第19天是肿瘤仍然限于骨的时间点，因此有癌症相关疼痛行为以及肿瘤诱导的骨重建的最大表现。由于在肿瘤注射后9天，未注射肿瘤的动物与假处理的动物在行为上没有显著不同，因此使用假处理的动物用于行为实验和骨的组织学/免疫组化的对照分析。
使用抗NGF抗体或吗啡的治疗。在肿瘤注射后的第7、12和17天，向注射了ACE-1的动物腹膜内(i.p.)注射10mg/kg的抗NGF抗体911(ACE-1+抗NGF，n＝9)；注射了ACE-1的动物注射(i.p.)盐水(ACE-1+载体，n＝21；1.4μl/kg)；而假注射的动物注射(i.p.)盐水(假处理+载体，n＝7)。对所有动物在7和19天之间进行行为分析。
为了进行抗NGF抗体与硫酸吗啡的行为比较，在行为检验前15分钟给予小鼠急性剂量的吗啡(未注射肿瘤：n＝6；假处理：n＝7；ACE-1+载体：n＝7；ACE-1+抗NGF：n＝7；ACE-1+吗啡10mg/kg，皮下：n＝8；ACE-1+吗啡30mg/kg，皮下：n＝8)。为了检验热敏感性和机械敏感性以及评估后爪皮肤神经支配，将未注射肿瘤的小鼠分成接受无菌盐水(未注射肿瘤+载体：n＝8)或抗NGF抗体(未注射肿瘤+抗NGF：n＝8，10mg/kg，i.p.)的两个处理组。
行为分析。在肿瘤移植或假注射之前和之后的第7、9、11、13、15和19天检验动物的疼痛相关行为。使用下列试验：进行性的疼痛(自发的防卫和畏缩)和运动引起的疼痛(触诊引起的防卫和触诊引起的畏缩)对动物进行行为检验。将动物置于具有金属丝网底的清晰的塑料观察盒中并使动物习惯30分钟。适应后，评估自发防卫和自发畏缩。在注射ACE-1和假注射动物中，远侧股骨的正常无害触诊2分钟后，测量触诊诱导的防卫和畏缩。如在实施例1和2中所述进行这些试验。
安乐死和组织处理。在注射肿瘤后19天处死小鼠并如以前所述对组织进行处理用于股骨和后爪皮肤的免疫组化分析。Honore等人，Prog.BrainRes.129：389-397，2000；Honore等人，Nat.Med.6：521-8(2000)；Luger等人，Cancer Research 61：4038-4047(2001)。将小鼠用CO2进行安乐死并用12ml 0.1M磷酸缓冲盐(PBS)心内灌注，随后灌注25ml 4％甲醛/12.5％苦味酸溶液。
在灌注固定剂中固定后取出后爪足底皮肤，并在30％蔗糖中冷冻保护24小时。在滑动切片机上切成60μm厚的连续的皮肤切片，在PBS中收集，并加工成自由漂浮的切片。切片后，将足底皮肤切片在PBS中简单冲洗，然后在封闭溶液(溶于PBS的3％正常驴血清(NDS)0.3％Triton X-100)中孵育1小时，随后在一抗中孵育过夜。对皮肤切片进行降钙素基因相关肽(CGRP)(1∶15,000；Sigma，St.Louis，MO)、酪氨酸羟化酶(TOH)(多克隆兔抗TOH，1∶2,000，Chemicon，Temecula，CA)和神经丝H(克隆RT97)(多克隆兔抗TR-97，1∶2,500，Chemicon，Temecula，CA)的免疫染色。
在一抗中孵育后，将切片在PBS中冲洗，然后在二抗溶液中孵育3小时。使用分别为1∶600或1∶500，与Cy3或生物素缀合的二抗(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)。为了检测与生物素缀合的二抗，将切片在PBS中冲洗并在缀合Cy3的链霉抗生物素蛋白(1∶4000；JacksonImmunoResearch)中孵育45分钟。为了证实一抗的特异性，对照包括省略一抗的对照或用对应合成肽预吸收的对照。免疫染色操作后，冲洗足底皮肤切片，于明胶包被的载玻片上固定。然后将固定的切片进行乙醇梯度(70、90、100％)脱水，在二甲苯中使其透明并将盖玻片用DPX(Fluka，Buchs，Switzerland)封片。
放射性检查后，在肿瘤注射后的第19天，将右侧(内对照)和左侧(携带肿瘤)股骨在苦味酸和4％福尔马林中4℃过夜固定，并在10％EDTA(Sigma)中脱钙不超过14天。然后将骨包埋在石蜡中。将股骨切片从侧面切成5μm厚并用酒石酸盐抗性酸性磷酸酶(TRAP)以及苏木精和伊红(H&E)染色以显示正常的骨髓、肿瘤、破骨细胞、成骨细胞和巨噬细胞(Ms)的组织学特征。
在经脱钙、石蜡包埋的14μm连续切片上进行假处理和癌性股骨的免疫组化分析。将切片在2％过氧化氢中孵育1小时淬灭内源性过氧化物酶。然后将切片用PBS冲洗三次，共10分钟，并在TSA封闭缓冲液(TSA-Plus花菁3系统，PerkinElmer Life Sciences，Inc.，Boston，MA)中封闭1小时。除去封闭缓冲液后立即加入一抗血清并在室温下孵育过夜。使用抗多克隆兔抗降钙素基因相关肽(CGRP)的抗体(1∶15,000；Sigma)标记初级无髓鞘和有薄髓鞘的传入感觉神经纤维。将切片在TSA洗涤缓冲液中冲洗三次，共10分钟，随后在链霉抗生物素蛋白HRP(1∶4,000)中孵育45分钟。然后将切片用TSA洗涤缓冲液冲洗3次，共10分钟。用来自TSA-Plus花菁3系统的缀合CY3的酪胺(1∶600)处理股骨切片7分钟，用TSA洗涤缓冲液冲洗两次并用PBS冲洗一次。最后，将切片风干、通过乙醇梯度(70、90、100％)脱水、在二甲苯中使其透明并用DPX(Fluka)封片。
骨的放射性分析。在第19天的时间点获得剖开的股骨的放射性照片(Faxitron X-ray Corp.，Wheeling，IL)以评估骨形成和破坏的程度。图象被记录在Kodak Min-R 2000乳腺X线照相术胶片(Eastman Kodak Co.，Rochester，NY；曝光设置：7秒，21kVp)上。使用骨密度分析在5X放大率时在整个骨图象的侧面通过放射性照片评估肿瘤诱导的骨重建的程度。以与前述方案相似的方式使用‘ImageJ(Research Services Branch，National Institute of Mental Health，Bethesda，MD)’分析有肿瘤和无肿瘤的股骨(对于未注射肿瘤+载体、假处理+载体、ACE-1+载体以及ACE-1+抗NGF，n＝8)。Corey等人，Prostate 52：20-33，2002。简言之，使用空白放射性胶片和标准阶变表(Eastman Kodak Co.)产生校准曲线。使用ImageJ测量光学密度并随后根据下列公式转换成透射：透射＝1/(反log10[光学密度])。由于给出的数据是从底片测定的，因此透射是骨密度的直接表现。使用HP ScanJet 7400c扫描仪捕获亚饱和股骨放射性照片并一式两份记录每个股骨的读数。结果表示为标准化的透射均值±SE。
成骨细胞、破骨细胞和巨噬细胞、肿瘤生长以及骨重建的组织学分析。通过对与股骨内所包含的肿瘤诱导的新骨形成区域以及整个骨干髓内空间中的皮层骨区域直接接触的成骨细胞数进行定量来分析未注射肿瘤动物、假注射的以及有肿瘤的小鼠的成骨细胞增殖。骨干的髓内空间被定义为从近远侧小梁延伸到远侧邻近小梁，并由于是主要的活性骨重建的发生区域而被选择用于定量。成骨细胞被鉴定为与新近产生的骨基质直接接触并分别于典型的立方上皮层或柱状上皮层中，且通过在高放大率(200×或更高)下可识别的细突起相互连接的那些细胞。结果表示为未注射肿瘤的、假注射的以及携带肿瘤的小鼠的成骨细胞数/mm2骨干髓内空间。根据前述方法，通过对未注射肿瘤的、假注射的以及注射ACE-1的小鼠TRAP染色的股骨切片上骨/肿瘤界面处和正常骨髓/骨界面处TRAP+破骨细胞数进行定量，测定破骨细胞的增殖。Honore等人，Nat.Med.6：521-528(2000)。简言之，破骨细胞是显示为TRAP+的可通过组织学鉴别的细胞，并且其与骨吸收区域紧密相关。这些细胞是多核的并且发现存在于沿皮层和小梁骨的腔隙中。Fawcett，D.W.；A Textbook of Histology.D.Dreibelbis(编辑)，Bone，第11版，第211-213页。Philadelphia，PA：W.B。Saunders Company，1986。通过对分散在整个肿瘤和正常骨髓中且不与矿化骨的骨内膜表面相连的TRAP+细胞数定量，测定巨噬细胞(Ms)的增殖。骨内巨噬细胞由肿瘤释放的刺激细胞因子活化，而这些被活化的Ms细胞外观特点是其高度不规则的表面、多个片状伪足和吞噬泡。结果分别表示为骨干髓内空间中每平方毫米的破骨细胞或每平方毫米的Ms的均值。
使用Nikon E600荧光显微镜上的明视野显微术对含有ACE-1细胞的股骨成像，该荧光显微镜装备了利用SPOT图象捕获软件的SPOT II数字照相机(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI)。使用Image Pro Plusv3.0软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)计算髓内空间的总面积以及由肿瘤、骨组成和剩余造血细胞所占据的髓内空间的百分比。Sabino等人，Cancer Res.62：7343-7349，2002；Sevcik等人，Pain 111：169-180，2004。使用与定量骨生长相同的H&E染色股骨切片分析骨形成。在偏振光下观察股骨切片以鉴别骨组成的网状和层状区域。用SPOTII数字照相机成像网状骨组成区域并使用Image Pro Plus v3.0软件定量。结果表示为肿瘤、肿瘤诱导的骨形成以及剩余造血细胞的区域占总髓内区的百分比。
骨和皮肤中感觉纤维的定量。根据前述方法测定感觉神经纤维的数量。Mach等人，Neuroscience 113：155-166，2002。简言之，使用装备了20×物镜的MRC-1024共聚焦成像系统(Bio-Rad，Richmond，CA)鉴定三个骨区域(近端、远端和骨干)和三个骨组织(骨膜、矿化骨和骨髓)中CGRP-IR纤维的数量。用装备了荧光的Olympus BH-2显微镜观测每个小鼠的6个股骨切片，进行神经纤维计数。分析中仅包括长于30μm的神经纤维。为了测量每个骨的总表面积(mm2)，我们分析了从中获得神经纤维计数的同一股骨切片。在使用SPOTII数字照相机和Image Pro Plus v.3.0软件所获得的股骨切片的数字图象上测量总的骨面积。结果表示为每总骨面积中所计数的纤维数。
在每个小鼠的4个随机选择的后爪足底皮肤切片上进行表皮神经支配密度的定量。在200×放大率下计数CGRP、TOH和RT97-IR神经纤维的总数。建立计数规则以便仅计数单个表皮内纤维而不计数同一纤维的多个分支。McCarthy等人，Neurology 45：1848-1855，1995。使用1cm2目镜栅格在所有定量的切片中测量表皮的总长度。仅计数至少长30μm并突入到表皮内的神经纤维。结果表示为每个小鼠中每毫米长表皮内神经纤维的均值。
ACE-1细胞中NGF mRNA水平的RC PCR分析。根据生产商的使用说明使用Rneasy micro试剂盒(Qiagen)从狗脑或狗前列腺肿瘤细胞ACE-1中制备总RNA，并使用Ribogreen试剂(Molecular Probes)对RNA进行定量。使用TaqMan Gold RT-PCR试剂盒(Applied Biosystems)进行两步RT-PCR。使用随机六聚体对RNA进行逆转录，并且使用特异于NGF的引物/探针组(LB041：AACAGGACTCACAGGAGCAA(SEQ ID NO：6)、LB042：CGGCACTTGGTCTCAAAGAA(SEQ ID NO：7)和LB045：AATGTTCACCTCTCCCAGCACCATCA(SEQ ID NO：8))对cDNA进行扩增。将来自RT步骤的样品一式两份地进行分析，并相对于总RNA输入进行标准化。
绕计分析。使用Statview计算机统计包(SAS Institute，Inc.，Cary，NC)进行统计检验。使用单因素方差分析比较实验组间的行为结果、骨组织学结果以及免疫组化的测量值。对于多个比较，使用Fishers′s PLSD(保护的最小显著性差异)事后比较检验(post hoc test)。显著水平被设定为P＜0.05。负责行为、免疫组化分析和对骨重建评分的研究人员对每个动物的实验情况未知。
结果
抗NGF治疗比硫酸吗啡更大程度地减轻骨癌痛但不影响基线热阈值或基线机械阈值。通过测量2分钟时间期间内自发防卫和畏缩分析进行性疼痛。与假处理+载体对照(0.6±0.3秒，第19天，图10A)相比，ACE-1+载体小鼠显示用于防卫所用的时间更多(7.7±0.8秒，第19天)。另外，与假处理+载体对照(1.0±0.4，第19天，图10B)相比，ACE-1+载体小鼠显示畏缩次数增加(11.9±1.2，第19天)。与ACE-1+载体小鼠相比，在注射了ACE-1的小鼠中，施用抗NGF显著减少自发的防卫(1.2±0.4秒，第19天)(图10A)。与ACE-1+载体小鼠相比，在注射了ACE-1的小鼠中，抗NGF治疗也显著减少自发畏缩(2.1±0.7，第19天)(图10B)。在初步研究中，在接受载体或抗NGF的假处理对照之间未观察到显著的行为差异或副作用。
抗NGF治疗与未注射肿瘤+载体(11.2±0.4秒，第19天，图10C)相比，对正常热应答没有影响(10.2±0.4秒，第19天)或者与未注射肿瘤+载体(5.2±0.4g，第19天，图10D)相比，对正常的机械应答没有影响(5.4±0.3g，第19天)。
对动物进行测试以比较硫酸吗啡(MS)与抗NGF抗体在减少骨癌相关行为中的效能。在肿瘤注射后11天和19天的行为评估显示，与假处理+载体小鼠(第11天和第19天分别是0.4±0.2和0.6±0.3秒，图10E)相比，ACE-1+载体动物统计学上显示注射肢体的防卫时间更长(第11天和第19天分别是6.0±1.0和7.6±1.2秒)。与假处理+载体小鼠(第11天和第19天分别是0.7±0.3和1.0±0.4，图10F)相比，ACE-1+载体也在统计学上显示注射肢体畏缩次数更多(第11天和第19天分别是8.6±1.2和11.7±1.7)。与ACE-1+载体小鼠相比，通过抗NGF的慢性治疗(第11天和第19天分别是2.1±1.1和1.4±0.4秒)、急性10mg/kg硫酸吗啡(第11天和第19天分别是3.5±0.3和4.0±0.5秒)或急性30mg/kg硫酸吗啡(第11天和第19天分别是2.2±0.3和2.0±0.4秒)的治疗，进行性防卫显著减少(图10E)。与ACE-1+载体小鼠相比，通过抗NGF的慢性治疗(第11天和第19天分别是3.4±1.7和2.6±0.6)、急性10mg/kg硫酸吗啡(第11天和第19天分别是5.6±0.5和6.8±0.7)或急性30mg/kg硫酸吗啡(第11天和第19天分别是3.6±0.5和3.5±0.7)的治疗，进行性畏缩显著减少(图10F)。抗NGF治疗比急性10mg/kg硫酸吗啡更有效地显著减少骨癌相关疼痛行为。在假处理+载体(27±1g)、ACE-1+载体(27±1g)以及ACE-1+抗NGF(26±1g)动物之间，没有观察到最后体重的差异。在这些研究中，在接受载体或抗NGF的动物之间没有观察到显著的行为差异或副作用，如共济失调、疾病或嗜睡。
抗NGF治疗减少接触引起的骨癌痛。还评估了接触引起的疼痛行为。在ACE-1和假注射的动物中，远端股骨的2分钟正常无害触诊后测量触诊诱导的防卫和畏缩。如在图10G和10H中所示，如通过触诊诱导的防卫(图10G)和触诊诱导的畏缩(图10H)评估(两者均p＜0.01，ANOVA)，与假注射的动物(施用盐水)相比，注射ACE-1的动物(施用盐水)到第7天产生接触引起的疼痛行为。图10G和10H也显示与向注射ACE-1的动物施用盐水相比，在注射ACE-1的小鼠中，从ACE-1肿瘤移植后第11天到第19天抗NGF抗体911的腹膜内施用显著减少触诊诱导的防卫(图10G)和触诊诱导的畏缩(对于触诊诱导的防卫和触诊诱导的畏缩，两者均p＜0.01，ANOVA)(图10H)。这些结果表明抗NGF抗体911在注射ACE-1的动物中减少触诊引起的疼痛。
抗NGF治疗对疾病进展的标记或肿瘤诱导的骨形成没有影响。在肿瘤注射后19天检查抗NGF治疗对骨形成和破坏、肿瘤生长(图11)以及破骨细胞增殖(图12)的影响(下表4)。根据分别通过放射性、TRAP和H&E分析的评估，与注射ACE-1的小鼠相比，假注射的小鼠没有证明有显著的骨重建(115±2％的标准化透射值)(图11A)、整个髓内空间中破骨细胞没有显著增殖(16±10破骨细胞/骨干髓内区mm2)(图12A)，肿瘤细胞也没有显著增加(0±0％)(图11D)。在ACE-1+载体小鼠中，如所观察的和通过多病灶的骨干桥连和射线透射性(109±5％的标准透射值)所表征的那样，存在着广泛的但几乎等同的骨形成和破坏(图11B)、整个骨干髓内区中破骨细胞(图12B)和成骨细胞的数量明显增加(47±3破骨细胞/mm2和127±7成骨细胞/mm2)并且肿瘤已填充了绝大多数髓内空间(髓内空间的60±7％)(图11E)。与ACE-1+载体动物相比，携带肿瘤小鼠从肿瘤注射后第7天开始的抗NGF抗体的治疗没有导致骨重建的显著改变(106±9％的标准化透射值)(图11C)、没有减少整个骨干髓内区中ACE-1诱导的破骨细胞(图12C)或成骨细胞增殖(47±5破骨细胞/mm2和118±15成骨细胞/mm2)或者肿瘤生长(57±6％髓内空间)(图11F)。
表4：抗NGF和载体处理的ACE-1动物骨重建和肿瘤进展的组织学及放射性定量
                      未注射肉瘤   假处理       ACE-1          ACE-1
                      +载体        +载体        +载体          +抗NGF
1.骨组织形态学
破骨细胞(OC)          7±1         16±10       47±3a，b      47±5a，b
(OC#/mm2骨干髓内空间)
成骨细胞(OB)          81±4        72±5        127±7a，b     118±15a，b
(OB#/mm2骨干髓内空间)
巨噬细胞(Ms)          2±1         2±1         27±2a，b      24±3a，b
(Ms#/mm2骨干髓内空间)
肿瘤诱导的新骨形成    0±0         0±0         14±2a，b      13±1a，b
(所占的骨干髓内空间％)
肿瘤细胞              0±0         0±0         60±7a，b      57±6a，b
(所占的髓内空间％)
造血细胞              100±0       100±0       26±8a，b      30±6a，b
(所占的髓内空间％)
2.放射性骨重建评分
标准化透射％
    100±2       115±2       109±5         106±9
a相对于未注射肉瘤P＜0.05；
b相对于假处理P＜0.05(单因素方差分析，Fisher′s PLSD)。
肿瘤注射后19天，与假处理+载体对照小鼠(2±1 Ms/mm2)相比，ACE-1+载体小鼠显示巨噬细胞(Ms)增加(27±2Ms/mm2骨干髓内区)。如在ACE-1+载体小鼠中所见的，注射ACE-1的小鼠的抗NGF治疗(24±3Ms/mm2)没有显著改变Ms浸润(表4)。
抗NGF治疗对骨或皮肤中感觉或交感神经支配没有可观察到的影响。通过使用分别抗CGRP、RT-97和TOH的抗体的免疫组化，在注射ACE-1的股骨或后爪足底皮肤中分析有薄髓鞘的或无髓鞘的肽能感觉神经纤维(CGRP-IR)、大的有髓鞘感觉纤维(RT97-IR)和去甲肾上腺素能交感神经纤维(TOH-IR)。在ACE-1+载体(23.5±1.9纤维/mm2)和ACE-1+抗NGF(24.0±1.9纤维/mm2)动物以及在假处理+载体动物(28.2±1.5纤维/mm2)和未注射肿瘤+载体动物(24.6±2.4纤维/mm2)或未注射肿瘤+抗NGF动物(23.1±1.9纤维/mm2)的整个骨(骨膜、矿化骨、骨髓和肿瘤)中发现CGRP-IR神经纤维(图14)。在ACE-1+载体(13.9±0.5纤维/mm2)和ACE-1+抗NGF(15.2±0.7纤维/mm2)后爪皮肤标本中，CGRP-IR纤维的强度或密度之间没有显著差异(图13A&B)。类似地，在未注射肿瘤+载体(14.4±0.4纤维/mm2)和未注射肿瘤+抗NGF(14.2±1.3纤维/mm2)后爪皮肤标本中，CGRP-IR纤维的强度或密度之间之间没有显著差异(图14A和B)。在未注射肿瘤+载体(4.2±2.2 RT97+纤维/mm2；16.0±2.7 TOH+纤维/mm2)和未注射肿瘤+抗NGF治疗(8.0±0.6 RT97+纤维/mm2；12.8±1.1 TOH+纤维/mm2)的动物中也没有检测到RT97-IR和TOH-IR纤维的密度和强度的差异。相对未注射肿瘤+载体和未注射肿瘤+抗NGF动物，在ACE-1+载体和ACE-1+抗NGF动物的皮肤标本中，CGRP、RT97或TOH-IR纤维的强度或密度之间没有显著的可观察到的差异。
ACE-1细胞中mRNA的表达水平。比较狗脑和ACE-1细胞中的NGF表达。分析5个独立的ACE-1标本，在每一个中NGF表达都低于PCR测定的检测水平。狗脑中的NGF在40个循环实验的35.2个循环时越过了阈值，而ACE-1标本在40个循环后没有越过阈值。因此，ACE-1标本中的NGF mRNA表达至少低于脑中表达的27.8倍。
实施例4
在具有来自前列腺癌或乳腺癌转移到骨产生的中度到重度疼痛的患者中，抗NGF抗体E3的止痛效应
在随机化的、以安慰剂为对照的双盲研究中，在具有来自前列腺或乳腺癌转移到骨的中度到重度疼痛的患者中，将抗NGF抗体E3的静脉内剂量(100μg/kg、300μg/kg或1,000μg/kg)的止痛效果(包括通过视觉模拟评分(VAS)所测量的开始的时间、高峰的时间、持续时间以及疼痛缓解)与用安慰剂的效果进行比较。将由于前列腺或如乳腺癌转移到骨而经历中度到重度疼痛的成年男性和女性(年龄在35到75之间)纳入到研究中。在筛选期间，要求患者每天四次记录他们的疼痛水平并且也记录在施用抗NGF抗体E3前14天他们的其它止痛药物的使用情况。
接纳280名患者进入研究。在记录两周的基线疼痛水平、其它止痛药使用以及不良事件后，抗NGF抗体E3施用发生在第1天和第29天的早上。将280名患者分成四组，每组有70名患者。每组患者用安慰剂、抗NGF抗体E3(100μg/kg、300μg/kg或1,000μg/kg)治疗。
在给药前14天以及在施用抗体E3后6个月，每天四次评估止痛效果。将结果作为对筛选基线(施用安慰剂或抗体E3前14天的平均疼痛水平)的变化评估。与安慰剂相比，在用抗NGF抗体E3治疗的一组或多组患者中，疼痛评分的任何减少和/或其它止痛剂使用的减少均证明了抗NGF抗体E3的治疗效能。
尽管为了清楚理解目的，已经通过说明和实施例的方式相当详细地描述了前述发明，本说明书和实施例不应当被理解为限制本发明的范围。

Claims (19)

1.神经生长因子(NGF)拮抗剂在制备治疗骨癌痛的药物中的用途，其中NGF拮抗剂是抗NGF拮抗剂抗体。
2.权利要求1的用途，其中骨癌痛是来自起源于骨的癌症。
3.权利要求2的用途，其中骨癌痛是来自骨肉瘤。
4.权利要求1的用途，其中骨癌痛是来自转移到骨的癌症。
5.权利要求4的用途，其中骨癌痛是来自转移到骨的前列腺癌。
6.权利要求4的用途，其中骨癌痛是来自转移到骨的乳腺癌。
7.权利要求4的用途，其中骨癌痛是来自转移到骨的肺癌。
8.权利要求4的用途，其中骨癌痛是来自转移到骨的肉瘤。
9.权利要求4的用途，其中骨癌痛是来自转移到骨的肾癌。
10.权利要求1的用途，其中抗NGF拮抗剂抗体是单克隆抗体。
11.权利要求1的用途，其中抗NGF拮抗剂抗体是人源化抗体。
12.权利要求1的用途，其中抗NGF拮抗剂抗体是人抗体。
13.权利要求1的用途，其中抗NGF拮抗剂抗体结合人NGF。
14.权利要求13的用途，其中抗NGF拮抗剂抗体还结合啮齿动物NGF。
15.权利要求13的用途，其中抗NGF拮抗剂抗体以0.1nM或低于0.1nM的KD值结合人NGF。
16.权利要求1的用途，其中抗NGF拮抗剂抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，抗NGF拮抗剂抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
17.权利要求1的用途，其中NGF拮抗剂不与阿片样止痛剂一同施用。
18.治疗骨癌痛的试剂盒，其包含NGF拮抗剂和使用NGF拮抗剂治疗骨癌痛的说明书，其中NGF拮抗剂是抗NGF拮抗剂抗体。
19.用于治疗骨癌痛的药物组合物，其包含NGF拮抗剂和药物有效的载体，其中NGF拮抗剂是抗NGF拮抗剂抗体。
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