CN103845337A - 脂氧素在制备治疗疼痛制剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于镇痛药物技术领域，涉及脂氧素及其类似物在制备治疗疼痛制剂中的用途，本发明经动物实验，结果表明，脂氧素及其类似物可缓解胫骨癌痛大鼠的机械性痛觉超敏，能够抑制脊髓背角IL-1β，TNF-α等炎性因子的上调，通过与其受体结合抑制相关炎性因子的表达上调完成缓解疼痛。所述的脂氧素及其类似物可作为主要有效成分进一步制备镇痛疫苗或镇痛药物用于治疗急/慢性痛。

Description

脂氧素在制备治疗疼痛制剂中的用途

技术领域

本发明属于镇痛药物技术领域，涉及脂氧素及其类似物在制备治疗疼痛制剂中的用途，所述的脂氧素及其类似物（LXA4, LXB4，ATL等）可作为主要有效成分进一步制备镇痛疫苗或镇痛药物用于治疗急/慢性痛。

背景技术

研究报道，疼痛是一种复杂的生理心理活动，是临床最常见的症状之一。所述疼痛包括伤害性刺激作用于机体引起的痛感觉和机体对于伤害性刺激产生的痛反应。通常临床根据疼痛的性质和持续时间可分为急性痛和慢性痛，而慢性痛又可分为癌性痛和非癌痛。临床实践显示，若干慢性痛患者长期忍受着剧烈疼痛的折磨，因此，缓解疼痛改善患者生存质量是医务工作者面临的重要任务。但是现有的缓解疼痛的药物由于其成瘾性，耐药性或其他毒副作用极大限制了其在临床的广泛使用，寻求安全有效缓解疼痛的药物是目前有关领域的研究热点也是一大难题。

近年来，国内外相关研究表明，在慢性痛特别是骨癌痛中，表现为以脊髓背角胶质细胞大量活化增生和炎性细胞因子的上调为特征的神经炎症，抑制相关炎性因子和信号通路后可显著缓解骨癌痛，提示在骨癌痛中脊髓背角的神经炎症与疼痛的产生密切相关。

脂氧素是一类源于花生四烯酸经一系列脂氧合酶代谢产生的内源性的具有抗炎和促炎症消退的脂类介质。研究显示，其主要通过抑制中性粒细胞向炎症部位的趋化，促进单核巨噬细胞的吞噬作用发挥抗炎和促炎症消退的作用。已有研究表明，单次鞘内及系统给予脂氧素可缓解角叉菜胶诱导的大鼠炎症痛（Svensson CI, Zattoni M, Serhan CN: Lipoxins and aspirin-triggered lipoxin inhibit inflammatory pain processing. J Exp Med 2007, 204:245-252.），连续鞘内给予脂氧素可缓解神经痛大鼠的痛行为（Sun T, Yu E, Yu L, Luo J, Li H, Fu Z: LipoxinA(4) induced antinociception and decreased expression of NF-kappaB and pro-inflammatory cytokines after chronic dorsal root ganglia compression in rats. Eur J Pain 2011.），但是关于脂氧素与骨癌痛的关系尚未见相关报道，也未见脂氧素及其类似物可直接缓解骨癌痛的报道。临床也无直接用脂氧素及其类似物用于治疗骨癌痛的报道。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供脂氧素的新用途，具体涉及脂氧素在制备治疗疼痛制剂中的用途，尤其是脂氧素及其类似物在制备治疗急/慢性疼痛的镇痛疫苗中的应用。

本发明的第二个目的在于提供脂氧素及其类似物在制备治疗慢性痛尤其是骨癌痛的镇痛药物中的应用。

本发明的脂氧素其类似物包括LXA4, LXB4和ATL。

本发明的脂氧素及其类似物进行了动物实验，实验结果显示，脂氧素及其类似物可缓解胫骨癌痛大鼠的机械性痛觉超敏，进而应用免疫荧光，Real-Time PCR，Western Blot等实验技术研究表明，脂氧素受体主要分布于大鼠脊髓背角的星形胶质细胞和神经元，并且能够抑制脊髓背角IL-1β，TNF-α等炎性因子的上调；实验结果表明：脂氧素及其类似物主要是通过与其受体结合抑制相关炎性因子的表达上调完成缓解疼痛。

为了更好的理解本发明的实质，下面以脂氧素及其类似物在骨癌痛大鼠中的作用相关实验进一步阐明。

本发明实验中采用现有技术制作胫骨癌痛大鼠模型，脂氧素及其类似物购自Merck公司及Chemicon公司，在造模后第十一天鞘内给予脂氧素及其类似物，结果显示，鞘内及尾静脉给予ATL均能显著缓解胫骨癌痛大鼠的机械性痛觉超敏，并且随着剂量增大，其镇痛效应和时程也相应延长，此能够抑制脊髓背角炎性因子IL-1β和TNF-α的表达上调，免疫组化结果显示，其受体在脊髓背角主要分布于星形胶质细胞和神经元，因此提示脂氧素及其类似物主要是通过作用于脊髓背角的相关受体通过调节相关信号通路，抑制炎性因子的上调，抑制其脊髓背角的神经炎症达到缓解骨癌痛的作用。

本发明所述的脂氧素是机体可内源性产生的一类具有抗炎作用的脂类介质，研究表明其安全无毒副作用，可作为主要成分，进一步制备镇痛疫苗和镇痛药物，用于临床防治急/慢性痛。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1为行为学结果，

其中，A.为胫骨癌痛大鼠模型评价，⁺⁺⁺P<0.001,与Sham组比较；

B. 为鞘内给予脂氧素及其类似物对胫骨癌痛大鼠的镇痛作用的评价，^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001,与Cancer+NS组比较；^##P<0.01,^###P<0.001,与Cancer+ATL 0.3nmol组比较；

C. 为鞘内给予脂氧素及其类似物对正常大鼠的机械痛阈的影响；

D.为鞘内给予不同剂量ATL对胫骨癌痛大鼠镇痛作用的评价，^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001,与Cancer+NS组比较；^#P<0.05,与Cancer+ATL 0.45nmol组比较；

E.为尾静脉给予不同剂量ATL对胫骨癌痛大鼠镇痛作用的评价，^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001,与Cancer+NS组比较；^#P<0.05,与Cancer+ATL 30nmol/kg组比较。

图2为ALX在脊髓背角的表达及分布，

其中，A.为Western Blot实验，ALX在Naive，Sham及Cancer组的蛋白表达水平；

B.为免疫组化实验，ALX在Naive，Sham及Cancer组脊髓背角的分布。

图3为免疫组化实验，ALX与星形胶质细胞在Naive，Sham及Cancer组脊髓背角的共标。

图4为免疫组化实验，ALX与神经元在Naive，Sham及Cancer组脊髓背角的共标。

图5为免疫组化实验，ALX与小胶质细胞在Naive，Sham及Cancer组脊髓背角的共标情况。

图6为Real-Time PCR实验，鞘内给予ATL后对脊髓背角相关炎性因子表达的影响,^##P<0.01,与Naive组相比；^*P<0.05,与Cancer+NS组比较。

具体实施方式

实施例1

实验动物：雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠160-180g, 雌性SD大鼠70-80g，用于接种肿瘤细胞（购自上海中科院实验动物部）。

肿瘤细胞：Walker256 大鼠乳腺癌细胞。

主要试剂：LXA4，ATL（Merck公司），LXB4， CD11B抗体（Chemicon公司），ALX抗体（Biological 公司），NeuN抗体（Millipore公司），GFAP抗体（Thermo公司）。

主要仪器：Von-Frey Hair；微量进样器；75%酒精，棉签，10%水合氯醛，异氟醚，硫酸庆大霉素注射液; 1ml, 2ml, 5ml注射器等。

实验动物分组：

A. 胫骨癌痛大鼠模型评价：SD雌性大鼠随机分成三组，分别为Naive，Sham和Cancer组，造模前测基础痛阈，造模后五，七，九，十一天测痛，并在第十一天测痛后灌流取材留做免疫组化。

脂氧素及其类似物对胫骨癌痛大鼠痛阈影响：SD雌性大鼠随机分成四组，分别为Cancer+NS，Cancer+LXA4，Cancer+ATL，Cancer+LXB4组，造模前测基础痛阈，造模后第十一天测痛，测痛后分别给予各组鞘内注射相同剂量的LXA4，ATL或LXB4，对照组给予生理盐水，并在给药后2, 4, 6小时观察其痛阈变化。

脂氧素及其类似物对正常大鼠痛阈影响：SD雌性大鼠随机分成五组，分别为Naive，Naive+NS，Naive+LXA4，Naive+ATL，Naive+LXB4组，测痛后分别给予各组鞘内注射相同剂量的LXA4，ATL或LXB4，对照组给予生理盐水，并在给药后2, 4, 6小时观察其痛阈变化。

不同剂量的 ATL 对胫骨癌痛大鼠机械痛阈的影响：雌性SD大鼠随机分成四组，分别为Cancer+NS，Cancer+ATL 0.03nmol, Cancer+ATL 0.3nmol, Cancer+ATL 0.45nmol 组，造模前测基础痛阈，在造模后第十一天测痛后分别给予各组鞘内注射相应剂量的ATL，对照组给予生理盐水，并在给药后2, 4, 6, 8, 12小时测痛，观察其痛阈变化。

系统给予 ATL 对胫骨癌痛大鼠机械痛阈的影响：雌性SD大鼠随机分成三组，分别为Cancer+NS，Cancer+ATL 30 nmol/kg, Caner+ATL 120 nmol/kg组, 造模前测基础痛阈，在造模后第十一天测痛后分别给予各组尾静脉注射相应剂量的ATL，对照组给予生理盐水，并在给药后1, 2, 3, 4, 6, 8,12小时测痛，观察其痛阈变化。

胫骨癌痛模型制作

按照Mao-Ying (Mao-Ying QL, Zhao J, Dong ZQ, Wang J, Yu J, Yan MF, Zhang YQ, Wu GC, Wang YQ: A rat model of bone cancer pain induced by intra-tibia inoculation of Walker 256 mammary gland carcinoma cells. Biochem Biophys Res Commun 2006, 345:1292-1298.)的胫骨癌痛大鼠模型的方法制作。基本步骤:大鼠腹腔注射8%水合氯醛(5ml/kg)麻醉后,右侧膝关节部位剃毛,表面皮肤用75%酒精消毒;左手指固定膝关节使其表面皮肤紧张,然后用7号针头在膝关节处(髌韧带外侧缘)沿胫骨纵轴走向往胫骨远端钻孔,深约1cm,用微量注射器(10μl)向胫骨骨髓腔内注射肿瘤细胞建立胫骨癌痛模型。微量进样器依次吸入:1μl空气、2μl明胶海绵水溶液、1μl空气、4μl肿瘤细胞、1μl空气。另有大鼠注射4μl PBS做为对照。接种后留针片刻。每只大鼠腹腔注射0.2ml 硫酸庆大霉素以防感染。

异氟醚麻醉大鼠后，大鼠取俯卧位，腹部垫高，以大鼠两侧坐骨棘为解剖标志，此两点间连线与脊柱的交点处，大致位于L5-L6，向上或向下探寻棘突最高点，以食指定位，右手持50μl微量进样器从椎间隙垂直缓慢进针，穿刺针进入蛛网膜下腔时有落空感，以尾巴甩动为穿刺成功的标志，这时即可缓慢注入药物，注射体积为20μl；

异氟醚麻醉大鼠后，大鼠取俯卧位，用酒精擦拭后，左手拉直尾巴，右手持针，针尖与水平面成十五度到三十度的角，顺着血管的方向，斜面向上，针尖刺入血管后立即与血管方向水平，见回血，无阻力，即可注射，注射体积为100μl。

机械痛阈测定

在室温(22±1)℃的安静环境中, 采用弗莱毛(Von Frey hair, Stoelting, Wood Dale, 美国)细丝测定机械性痛觉超敏来评定癌痛大鼠疼痛状况。测定时将大鼠置于底为网格的特制有机玻璃格子(26cm ×20cm ×14cm)内,适应20min后,根据Chaplan等（Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, Chung JM, Yaksh TL: Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods 1994, 53:55-63.）介绍的up-and-down法,将一系列Von Frey细丝(0. 4、0. 6、1.4、2. 0、4. 0、6. 0、8. 0、15. 0 g)从2.0g力度开始参照up-and-down方法刺激大鼠移植侧脚掌中部皮肤,观察大鼠缩足反应无反应记为“O”,有反应记为“X”。如果第一根毛刺激没有反应 ,则给予大一级力度的毛刺激;如果有反应则改用小一级力度的毛刺激,反复类推,从有反应的那一次开始测5次,得到一串以“O”或“X”组合的序列,将该序列和最后一根毛的力度(f)输入软件计算出机械性疼痛阈值作为机械性痛阈值。50%缩足反应阈值(g) =(10[Xf + kδ]) /10000。其中Xf=log (f);δ为各个毛力度取log后的均差,在此约等于0.224;k为根据测量所得“X”、“O”序列查表后得到的值,此部分查表和计算均由软件自动处理。为避免频繁或长时间的刺激造成动物耐受或痛敏,每根毛每次刺激时间为1～2s,前后两次不同刺激间隔5min，即弗莱毛实验。

免疫荧光

1 ）标本制备：在造模后第十一天测痛后灌流取材，大鼠麻醉后取仰卧位，开胸暴露心脏，从左心室插入灌流针头，灌注溶液注入后，在右心耳剪口，用0.9％生理盐水洗净组织内血液，速度宜快，待从右心耳流出的液体已变清亮时停止灌洗改用4%多聚甲醛灌注，然后取脊髓L4-L5段，放入20%蔗糖溶液中4℃冰箱过夜，待组织沉底后放入 30%蔗糖溶液中4℃冰箱过夜，恒温切片机（Leica 2000）,制备30μm厚的脊髓薄片，放入保护液中，-20℃冰箱保存。

）免疫荧光的方法：取出脊髓片，用0.01M的PBS漂洗3×5min, 放入封闭液中37℃孵育1h,取出后放入一抗（兔抗ALX为1: 400，小鼠抗NeuN为1: 500，小鼠抗CD11B为1: 200，小鼠抗GFAP为1:1000），4℃摇床过夜。次日，脊髓片自一抗中取出，用0.01M的PBS漂洗3×10min,放入二抗（羊抗兔1:1000，羊抗小鼠1:1000），避光37℃孵育1h后，用0.01M的PBS漂洗3×10min，用抗荧光淬灭剂封片，共聚焦显微镜下拍照。

）蛋白样品制备：常规处理大鼠，取脊髓L4-L5段，按20mg/ 100 μl 加入Ripa 裂解液（含PMSF），冰浴10min, 低温超声匀浆，以13000 r/min 4-7℃离心15min，取上清，用BCA法测定蛋白浓度后，按比例添加5×凝胶上样缓冲液，放入沸水中煮8min,室温静置30min后，分装置于-20℃冰箱备用。

） SDS-PAGE 电泳：分别制备10%分离胶和5%基层胶，待胶凝固后上样，每孔7μl约40μg,加样后凝胶放置于装有电泳缓冲液的电泳槽进行电泳，电泳条件：积层胶70V约50min跑至分离胶时换成电压120V,待样品中的溴酚蓝迁移至胶的边缘时结束电泳，将胶卸下，在100V电压下转移至PVDF膜上，转膜时间为110min,转膜结束后，将PVDF膜放入封闭液中4℃摇床孵育2h,封闭后将PVDF膜放入一抗反应液（兔抗ALX，1:1000溶于封闭液）4℃摇床孵育过夜，次日将PVDF膜自一抗中取出，1×TBST漂洗 3×10min，放入二抗（羊抗兔，按照1:5000），4℃摇床孵育2h，1×TBST漂洗 3×10min，加ECL发光液，用Image Quant LAS 4000mini化学发光成像仪拍照；

3）用成像仪自带软件分析，以各组GAPDH条带的扫描值标化相应组的ALX的蛋白表达量。

）总 RNA 提取：每组大鼠麻醉后取脊髓，按照Trizol法提取总RNA。

）引物设计：IL-1β，IL-6，TNF-α引物参考文献（Wang J, Li J, Sheng X, Zhao H, Cao XD, Wang YQ, Wu GC: Beta-adrenoceptor mediated surgery-induced production of pro-inflammatory cytokines in rat microglia cells. J Neuroimmunol 2010, 223:77-83.）并用Blast验证，本实验采用GAPDH作为内参，引物序列如下：

Primer GAPDH：Forward: 5’-cccttcattgacctcaactac-3’

Reverse: 5’-cttctccatggtggtgaagac-3’

Primer IL-1β: Forward: 5’-atgagagcatccagcttcaaatc-3’

Reverse: 5’-cacactagcaggtcgtcatcatc -3’

Primer IL-6: Forward: 5’- gacaaagccagagtccttca -3’

Reverse: 5’- actaggtttgccgagtagac -3’

Primer TNF-α: Forward: 5’- cgagatgtggaactggcaga -3’

Reverse: 5’- ctacgggcttgtcactcga -3’

3 ）逆转录合成 cDNA 第一链：在0.2ml无RNase的PCR管中依次加入以下试剂：Total RNA(1ug/μl) 2μl，Oligo dT(0.5ug/μl) 1μl，DEPC H₂O(Rnase-free)调体积至12μl。70℃变性5min，冰浴5min。加入5×RT buffer 5μl，10 mM 4dNTPs 2μl，RNase inhibitor(40U/μl) 0.5μl，M-MLV Reverse Transcriptase (200U/μl) 1μl，DEPC H₂O 4.5μl。37℃水浴60 min，95℃水浴5min，冰浴5min。

） Real-Time PCR: 在0.2ml PCR管中依次加入以下试剂：2×SybrGreen 12.5μl，Sense primer 1μl，Antisense primer 1μl，逆转录产物 2μl，dd H₂O 8.5μl混匀，瞬时离心，上机，94℃ 45s，59℃(IL-1β，IL-6，TNF-α)1min，72℃1min。参照Livak等（Livak KJ, Schmittgen TD: Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.Methods 2001, 25:402-408.），用2−^△△CT法分析结果。

实验数据用SPSS11.0统计软件进行统计分析，实验结果以 + S表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用独立样本T检验，P<0.05为显著性差异。

行为学结果显示：

胫骨癌痛模型评价：各组在造模前基础痛阈无差异，造模后从第三天开始，Cancer组和Sham组相比，痛阈显著降低（P<0.001）持续到观察结束,Sham组和Naive组间无差异（如图1A所示）。

鞘内给予脂氧素及其类似物对胫骨癌痛大鼠痛阈影响：各组在造模前基础痛阈无差异，造模后第十一天测痛，各模型组痛阈均显著降低，组间无差异，给药后，与Cancer+NS组相比，Cancer+ATL组从给药后2h开始痛阈显著升高（P<0.001）持续到给药后6h，Cancer+LXA4组在给药后2h痛阈升高（P<0.01），Cancer+LXB4组在给药后2h痛阈也有提升（P<0.05），与Cancer+ATL组相比，Cancer+LXA4组在给药后4,6h有差异（P<0.01），Cancer+LXB4组在给药后2,4,6h均有差异（如图1B所示），LXA4, ATL, LXB4三者从镇痛时程和峰值比较，ATL对胫骨癌痛大鼠镇痛效果更好，因此后续关于脂氧素对胫骨癌痛大鼠镇痛效果的研究均以ATL为主。

鞘内给予脂氧素及其类似物对正常大鼠痛阈影响：各组在给药前测基础痛阈，无差异，给药后2,4,6h测痛，各组间无差异（如图1C所示），表明脂氧素及其类似物对正常大鼠的痛阈无影响。

鞘内给予不同剂量 ATL 对胫骨癌痛大鼠痛阈影响：各组在造模前测基础痛阈，无差异，造模后第十一天测痛，各模型组痛阈均显著下降，组间无差异，与Cancer+NS组相比，Cancer+ATL 0.03 nmol 和Cancer+ATL 0.3 nmol从给药后2h痛阈提高，持续到6h（P<0.05）；Cancer+ATL 0.45 nmol 从给药后2h痛阈升高，持续到给药后8h(p<0.05),并且在4h和6h（P<0.001）如图1D所示。

系统给予不同剂量 ATL 对胫骨癌痛大鼠痛阈影响：各组在造模前测基础痛阈，无差异，造模后第十一天测痛，各模型组痛阈均显著下降，组间无差异。给药后，与Cancer+NS组相比，Cancer+ATL 120 nmol/kg 组在给药后痛阈显著升高持续到给药后4h,其中3,4h(P<0.01); Cancer+ATL 30 nmol/kg 在给药后3h痛阈升高（P<0.05），如图1E所示。

免疫组化结果：

脂氧素受体 (ALX) 在脊髓背角的表达与分布：

1）ALX主要分布于脊髓背角浅层，在Naive，Sham和Cancer组间无显著差异，如图2B所示。

2）ALX与神经元和星形胶质细胞均有共标，但是与小胶质细胞没有共标，提示，ALX主要分布于神经元和星形胶质细胞，如图3,4,5所示。

实验结果显示，脂氧素受体蛋白在Naive，Sham和Cancer组无显著差异（如图2A所示）。

实验结果显示，与Naive组相比，Cancer+NS组IL-1β，IL-6，TNF-α均显著升高（P<0.01），与Cancer+NS组相比，Cancer+ATL组的IL-1β和TNF-α的表达是下调的（P<0.05），如图6所示。

Claims (5)

1.脂氧素及其类似物在制备治疗疼痛制剂中的用途。

2.脂氧素及其类似物在制备治疗急/慢性痛的镇痛疫苗中的应用。

3.脂氧素及其类似物在制备治疗急/慢性痛的镇痛药物中的应用。

4.按权利要求1所述的用途，其特征在于疼痛是骨癌痛。

5.按权利要求1，2或3所述的用途，其特征在于，所述的脂氧素其类似物包括LXA4, LXB4和ATL。

Images