KR20120023858A - 인터루킨-10 항체, 이를 함유하는 약제학적 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

인터루킨-10 항체, 이를 함유하는 약제학적 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에서 제공된 방법 및 조성물은 일반적으로 IL-10 특이적 항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 사람화된 IL-10 특이적인 항체의 조성물 및 IL-10의 생물학적 활성의 조절, 특히 자가면역 질환 및 병원체-매개된 면역병리학에 있어서 이러한 항체의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

인터루킨-10 항체, 이를 함유하는 약제학적 조성물 및 이의 제조방법{Interleukin-10 antibodies, a pharmaceutical composition comprising the same, and A method of producing the same}
본 원은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된, 2003년 11월 10일자로 출원된 미국 가 특허원 제60/518,999호의 이익을 청구한다.
본 발명은 일반적으로 인터루킨-10(IL-10) 특이적인 항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 사람 IL-10을 인지하고 특히 자가면역 질환에서 이의 활성을 조절하는 사람화된 항체에 관한 것이다.
초기에 사이토킨 합성 억제제 인자 또는 CSIF로 공지된, 인터루킨-10(IL-10)은 조혈 세포, 특히 면역 세포의 강력한 면역조절인자이다. 활성화된 Th2 세포, B 세포, 각질세포, 단핵세포 및 대식세포와 같은 세포는 IL-10을 생산한다[참조: Moore et al., Rev. Immunol. 11: 165 (1993)]. IL-10은 T 세포, 단핵세포 및 대식세포를 포함하는 다수의 세포의 활성화 및 효과기 작용을 억제한다. 특히, IL-10은 Th1 세포, 천연 킬러 세포, 단핵세포 및 대식세포와 같은 세포에 의해 IL-1, IFN-γ 및 TNF의 합성을 포함하는 사이토킨 합성을 억제한다[참조: Fiorentino et al., J. Exp. Med., 170: 2081-2095 (1989); Fiorentino et al., J. Immunol. 146: 3444 (1991); Hsu et al., Int. Immunol. 4: 563 (1992); Hsu et al., Int. Immunol. 4: 563 (1992); D'Andrea et al., J. Exp. Med. 178: 1041 (1993); de Waal Malefyt et al., J. Exp. Med. 174: 915 (1991); Fiorentino et al., J. Immunol. 147: 3815 (1991)].
다수의 병원체, 특히 세포내 병원체는 면역 반응에 의해 병원체의 효과적인 제거를 지연시키거나 완전히 차단하기 위해 IL-10 생산을 유발한다[참조: Moore et al., Annu. Rev. Immunol. 11: 165 (1993)]. 예를 들어, HIV, 나병 또는 결핵을 지닌 환자로부터의 혈액 림프구에서, 말초 혈액 림프구는 병원체에 의한 챌린지시 시험관내에서 통상적으로 무력하거나 비반응성이다. 그러나, 여기서 IL-10의 중화는, 활성 효과기 반응, 즉, Th1 반응성이 이들 세포에 존재함을 입증한다. 즉, IL-10은, 이의 감염성 상태를 촉진시키기 위한 병원체에 의해 효과적으로 차출(commandeer)되는 것으로 여겨진다.
IL-10은 또한 생체내에서 자가면역성과 관련되어 있다. 자가면역성은 자가항체, 자가반응성 T 세포, 또는 정상 조직을 표적화하는 이의 일부 조합으로부터의 발현에서 생성되었다. 자가면역병의 하나의 예는 신체 전체에서 결합 조직이 염증을 일으키는 만성 관절병인 전신홍반루푸스(SLE)이다. 정상 체 조직을 이것이 외부 침입물인 것처럼 공격하는 자가항체는 특징적인 염증을 초래한다. 정확한 원인은 완전히 이해되지 않았지만, 연구자들은, 이것이 유전적 및 환경적 성분 둘다를 지닌 것으로 여기고 있다. 상세하게는, B-세포 과반응성 및 각종 자가항체의 존재가 SLE를 특징지운다. 통상적으로 이본쇄 DNA(IgG 항-dsDNA abs)에 대해 반응성인 IgG 자가항체는 SLE 환자에서 상승된다. SLE 환자의 60 내지 70%는 IgG 항-dsDNA abs를 생성하며, 이들중 일부는 신독성이다. SLE는 안면 발진으로부터 불구 및 잠정적으로 생명을 위협하는 기관 기능장애에 이르는 범위의 증상을 지니며, 남성보다 여성에서 10배 더 만연한다. 이는 어떠한 연령에서도 진행될 수 있으나 젊은 성인에서 가장 일반적이다.
다수의 연구가 SLE와 관련된 병리학에서 IL-10에 대한 역할을 지지하고 있다. 예를 들면, IL-10은 전형적으로 적절한 자극없이는 세포에 의해 생산되지 않지만, SLE 환자로부터 B 세포 및 대식세포는 시험관내에서 높은 수준의 IL-10을 자발적으로 생산한다[참조: Llorente, et al., Arthritis Rheum. 40: 249-60 (1997)]. 몇몇 연구에서, 연구자들은, IL-10의 혈청 수준과 질병 활성간의 상관관계를 입증하였다. 또한, 생체내 및 시험관내 연구 둘다는, IL-10 생산의 차단이 SLE의 임상적인 소견을 완화시킬 수 있음을 입증하였다[참조: Gonzalez-Amaro, et al. J. Autoimmunity 11: 395-402 (1998)].
지금까지, SLE의 소견중 하나인 루푸스 신장염은 면역억제 치료요법, 예를 들면, 코르티코스테로이드 및 사이클로포스파미드의 사용을 통해 치료되어 왔다. 비록 효과적이라고 해도, 이들 치료요법에는, 장기간의 치료요법을 방해하는 비-특이적이고 실질적인 독성이 존재한다. 따라서, 특이적인 중화 항체는 IL-10의 억제 효과는 제거하면서 나머지 면역 반응 네트웍은 손상시키지 않는 IL-10의 효과적인 길항제일 수 있다.
생체내에서 치료제로서 항체를 사용하는데 있어서 가장 현저한 제한은 항체의 면역원성이다. 대부분의 모노클로날 항체는 설치류로부터 기원하므로, 사람에 있어서 반복된 사용은 치료학적 항체에 대한 면역 반응의 생성을 초래한다. 이러한 면역 반응은 치료 효능을 최소로 상실하면서 잠정적으로 최대의 치명적인 초과민반응을 초래한다. 설치류 항체의 면역원성을 감소시키기 위한 초기 노력은 키메라 항체의 생산을 포함하며, 여기서, 마우스 가변 영역은 사람 고정 영역과 융합된다[참조: Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439 (1987)]. 그러나, 사람 가변 영역 및 마우스 고정 영역의 하이브리드를 주입한 마우스는 사람 가변 영역에 대해 지시된 강력한 항-항체 반응을 진행하며, 이는 이러한 키메라 항체내 전체 설치류 Fv 영역의 보유로 환자에서 원치않는 면역원성이 초래될 수 있음을 제안하고 있다.
일반적으로, 가변성 도메인의 상보성 결정 영역(CDR) 루프는 항체 분자의 결합 부위를 포함하는 것으로 여겨진다. 따라서, 사람 골격(framework)내로 설치류 CDR 루프의 이식(즉, 사람화)는 설치류 서열을 추가로 최소화하기 위해 시도되었다[참조: Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)]. 그러나, CDR 루프 교환은 여전히 원래의 항체와 동일한 결합 특성을 지닌 항체를 균일하게 초래하지 못한다. 사람화된 항체내 CDR 루프 지지체중 포함된 잔기인 골격 잔기(FR)내 변화는 또한 항원 결합 친화성을 보존하는데 요구된다[참조: Kabat et al., Immunol. 147: 1709 (1991)]. 다수의 사람화된 항체 작제물에서 CDR 이식 및 골격 잔기 보존의 이용이 보고되어 있지만, 특정 서열이 목적한 결합 및 때때로 생물학적 특성을 지닌 항체를 생성할 것인지는 예견하기 어렵다[참조: Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029 (1980) Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4181 (1991), 및 Hodgson, Bio/Technology 9: 421 (1991)]. 더우기, 대부분의 선행 연구는 동물 경 및 중 가변 서열에 대한 상이한 사람 서열을 사용하여, 이러한 연구의 예견성이 의문시되고 있다. 공지된 항체의 서열이 사용되거나, 더욱 통상적으로 공지된 X-선 구조, 항체 NEW 및 KOL을 갖는 항체의 서열이 사용되고 있다[참조: Jones et al., 상기 참조; Verhoeyen et al., 상기 참조; 및 German et al., 상기 참조]. 정확한 서열 정보는 단지 약간의 사람화된 작제물의 경우에만 보고되어 있다.
본 발명은 사람 IL-10을 인지하고 특히 자가면역 질환과 관련하여 이의 활성을 조절하는 사람화된 모노클로날 항체를 제공한다. 사람화된 항체는 현재의 치료와 관련된 독성 및 비-특이성없이 대안적인 치료요법 선택을 제공한다.
발명의 간단한 요약
본원에서는 CDR1에서 서열 1, CDR2에서 서열 2 및 CDR3에서 서열 3으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; 및 골격 영역(여기서, 골격 영역의 아미노산 서열은 모든 또는 실질적으로 모든 사람 면역글로불린 아미노산 서열이다)을 포함하는 하나 이상의 항체 경쇄 가변 영역 또는 이의 결합 단편; 및 CDR1에서 서열 6, CDR2에서 서열 7 및 CDR3에서 서열 8의 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; 및 골격 영역(여기서, 골격 영역의 아미노산 서열은 모든 또는 실질적으로 모든 사람 면역글로불린 아미노산 서열이다)을 포함하는 하나 이상의 항체 중쇄 가변 영역 또는 이의 결합 단편을 포함하는, IL-10과 결합하는 사람화된 재조합 항체 분자, 또는 이의 결합 단편이 제공된다. 또한, 본원에서는 항체 경쇄 또는 이의 결합 단편이 서열 4의 가변 영역을 지닌 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 제공한다. 하나의 특정 양태에서, 항체 경쇄 또는 이의 결합 단편은 서열 5의 가변 영역 및 고정 영역을 가진 폴리펩타이드를 포함한다. 하나의 특정 양태에서, 항체 중쇄 또는 이의 결합 단편은 서열 9의 가변 영역을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 다른 특정 양태에서, 항체 중쇄 또는 이의 결합 단편은 서열 10의 가변 영역 및 고정 영역을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
추가로 본원에서는 CDR1에서 서열 1, CDR2에서 서열 2 및 CDR3에서 서열 3으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 항체 경쇄 가변 영역 또는 이의 결합 단편; 및 CDR1에서 서열 6, CDR2에서 서열 7 및 CDR3에서 서열 8로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 항체 중쇄 가변 영역 또는 이의 결합 단편을 포함하는, IL-10에 결합하는 키메라 재조합 항체 분자 또는 이의 결합 단편이 제공된다.
또한, 본원에서는 CDR1에서 서열 11, CDR2에서 서열 12 및 CDR3에서 서열 13으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; 및 골격 영역(여기서, 골격 영역의 아미노산 서열은 모든 또는 실질적으로 모든 사람 면역글로불린 아미노산 서열이다)을 포함하는 하나 이상의 항체 경쇄 또는 이의 결합 단편; 및 CDR1에서 서열 15, CDR2에서 서열 16 및 CDR3에서 서열 17로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; 및 골격 영역(여기서, 골격 영역의 아미노산 서열은 모든 또는 실질적으로 모든 사람 면역글로불린 아미노산 서열이다)을 포함하는 하나 이상의 항체 중쇄 또는 이의 결합 단편을 포함하는, IL-10에 결합하는 사람화된 재조합 항체 분자 또는 이의 결합 단편이 제공된다. 하나의 특정 양태에서, 항체 경쇄 또는 이의 결합 단편은 서열 14의 가변 영역 및 고정 영역을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 여전히 다른 특정 양태에서, 항체 중쇄 또는 이의 결합 단편은 서열 18의 가변 영역 및 고정 영역을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또한, 본원에서는 CDR1에서 서열 11, CDR2에서 서열 12 및 CDR3에서 서열 13으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 항체 경쇄 또는 이의 결합 단편; 및 CDR1에서 서열 15, CDR2에서 서열 16 및 CDR3에서 서열 17로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 항체 중쇄 또는 이의 결합 단편을 포함하는, IL-10에 결합하는 키메라 재조합 항체 분자 또는 이의 결합 단편이 제공된다.
하나의 양태에서, 상기 기술된 항체는 중쇄 고정 영역을 추가로 포함하며, 여기서, 상기 중쇄 고정 영역은 γ1, γ2, γ3 및 γ4 사람 중쇄 고정 영역 또는 이의 변이체를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 기술된 항체는 또한 경쇄 고정 영역을 포함하며, 여기서, 경쇄 고정 영역은 람다 또는 카파 사람 경쇄 고정 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 이들 항체의 결합 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, 및 디아바디(diabody)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항체 단편이다.
또한, 본원에는 IL-10의 생물학적 활성을 차단하는데 효과적인 양의 IL-10에 대해 특이적인 항체, 또는 이의 결합 단편을 면역 반응을 제어할 필요가 있는 환자에게 투여함을 포함하여, 사람 대상체에서 면역 반응을 제어하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 항체는 본원에 기술된 항체이다. 당해 방법에 의해 제어된 면역 반응은 체액성 반응 또는 세포성 반응이다. 하나의 양태에서, 당해 방법에 의해 치료된 대상은 전신홍반루푸스이다. 다른 양태에서, 대상은 면역 혈소판감소자색반(ITC)이다. 다른 양태에서, 대상은 루푸스 신장염이다. 추가의 양태에서, 대상은 HIV이다. 다른 양태에서, 대상은 C형 간염이다. 하나의 특정 양태에서, 사람 대상체에서 면역 반응을 제어하는 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 (1) IL-10의 생물학적 활성을 차단하기에 효과적인 양의 IL-10에 특이적인 항체, 또는 이의 결합 단편(여기서, 당해 항체는 본원에 기술된 항체이다), 및 (2) 면역제어제를 투여하는 것을 포함한다.
본원에는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 배합된 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서, 항체는 상기 기술된 항체중 하나이다.
또한, 본원에는 상기 기술된 항체의 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산이 제공된다. 또한, 벡터로 형질감염된 숙주 세포에 의해 인지된 조절 서열에 작동적으로 결합된 분리된 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 본원에는 분리된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 또한, 본원에는 핵산 서열이 발현되는 조건하에서 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양함으로써 폴리펩타이드를 생산하고, 당해 폴리펩타이드를 숙주 세포로부터 회수함을 포함하는 폴리펩타이드의 생산 방법이 제공된다.
본원에는 서열 19의 핵산 서열을 갖는 경쇄 및 서열 20의 핵산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 IL-10에 특이적인 항체를 암호화하는 분리된 핵산 서열이 제공된다. 추가의 양태에서, 경쇄는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) 기탁번호 제PTA-5923호를 지니고 중쇄는 ATCC 기탁번호 제PTA-5922호를 지닌다.
본원에는 서열 21의 핵산 서열을 지닌 경쇄 및 서열 22의 핵산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 IL-10에 대해 특이적인 항체를 암호화하는 분리된 핵산 서열이 제공된다. 추가의 양태에서, 경쇄는 ATCC 기탁번호 제PTA-5927호를 지니고 중쇄는 ATCC 기탁번호 제PTA-5926호를 지닌다.
또한 본원에는 상기 핵산 서열이 암호화하고 있는 항체의 결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산 서열이 제공된다. 하나의 양태에서, 결합 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv 및 F(ab')2로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항체 단편이다.
본원에는 a) 목적하는 생물학적 활성을 지닌 비-사람 항체를 확인하는 단계; b) 비-사람 항체 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 측정하는 단계; c) 사람 배선(germline) 서열의 그룹에 대해 비사람 항체 서열을 비교하는 단계; 및 d) 최대 총 잔기 점수를 갖는 사람 배선 서열을 수용체 배선 서열로서 확인하는 단계를 포함하여, 사람화된 항체에 대한 수용체 배선 서열을 확인하는 방법이 제공되며, 여기서, 상기 단계 c)에서의 비교는 1) 비-사람 VH 및 VL 도메인의 서열에 서열 잔기 번호를 지정하는 단계; 2) 서열내 CDR 및 FR 영역을 묘사하는 단계; 3) 비-사람 및 사람 배선 서열이 확인되도록 각각의 잔기 위치에서 예정된 점수를 지정하는 단계; 및 4) 각각의 사람 배선 서열에 대한 총 점수를 생성시키기 위해 잔기 점수 모두를 합하는 소 단계를 포함한다. 하나의 양태에서, 당해 방법은 또한 5) 비-사람 및 사람 배선 서열이 동일한 각각의 잔기 위치[이는 소단계 (4)이후 총 잔기 점수와 동일한 배선 서열에 대해 소단계 (3)에서 기록되지 않았다]에 대해 수치 1을 지정하는 단계; 및 6) 잔기 점수 모두를 합하여 각각의 사람 배선 서열에 대한 총 점수를 생성시키는 단계를 포함하는 소단계들을 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 비-사람 항체는 IL-10에 대해 특이적이며 IL-10의 생물학적 활성을 억제한다. 특정 양태에서, 수치는 각각 VH 및 VL 영역에 대한 표 2 및 3에서와 같이 잔기에 지정된다.
본원은 또한 상기 방법에 의해 생성된 항체를 제공한다.
도 1a는 항-사람 IL-10 항체인, 12G8의 가변성 경쇄와 관련하여 잠재적인 수용체 배선 서열에 대해 잔기 수 및 수치를 지정하는 것을 도시한다.
도 1b는 항-사람 IL-10 항체인, 12G8의 가변성 중쇄와 관련하여 잠재적인 수용체 배선 서열에 대한 잔기 수 및 수치를 지정하는 것을 도시한다.
도 1c는 항-사람 IL-10 항체인, 11D8의 가변성 경쇄와 관련하여 잠재적인 수용체 배선 서열에 대한 잔기 수 및 수치를 지정하는 것을 도시한다.
도 1d는 항-사람 IL-10 항체인, 12D8의 가변성 중쇄와 관련하여 잠재적인 수용체 배선 서열에 대한 잔기 수 및 수치를 지정하는 것을 도시한다.
도 2a는 실시예 III에 기술된 바와 같이 정맥내 투여된 12G8 항체에 대한 농도-시간 프로파일을 나타낸다.
도 2b는 실시예 III에 기술된 바와 같이 피하 투여된 12G8에 대한 농도-시간 프로파일을 나타낸다.
도 3a는 사람화된 항-IL-10 항체인, SCH708980의 투여가 IL-10 유전자삽입 마우스에서 리슈만편모충 주요 감염에 대해 내성을 부여함을 나타낸다. 감염은 나타낸 시간에서 캘리퍼로 발바닥 부종을 측정함으로써 결정하였다. 12G8 항체는 실시예 VI에서 기술한 바와 같이 투여하였다.
도 3b는 랫트 항-IL-10 항체인, 12G8의 투여가 IL-10 유전자삽입 마우스에서 리슈만편모충 주요 감염에 대해 내성을 부여함을 나타낸다. 감염은 나타낸 시간에서 캘리퍼로 발바닥 부종을 측정함으로써 결정하였다. 12G8 항체는 실시예 VI에 기술된 바와 같이 투여하였다.
기술을 명확하게 하나 제한하지는 않으면서, 본 발명의 상세한 기술을 하기의 소단락으로 나눈다.
A. 정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 통상의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 지닌다. 본원에 언급된 모든 특허, 특허원, 공개된 출원 및 기타 공보는 이의 전문이 참조로 인용된다. 당해 단락에 설정된 정의가 본원에 참조로 인용된 특허, 특허원, 공개된 출원 및 기타 공보에 설정된 정의와 반대되거나 또한 일치하지 않는 경우, 당해 단락에서 설정된 정의는 본원에 참조로 인용된 정의에 우선한다.
본원에 사용된 것으로서, "a" 또는 "an"은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "항체"는 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 특정 형태의 항체 또는 이의 단편을 말한다. 즉, 이는 광범위한 의미로 사용되며 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 모노클로날 항체(전체 길이의 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예: 이특이적 항체), 및 항체 단편을 특히 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "IL-10 결합 단편" 또는 "이의 결합 단편"은 IL-10 활성을 억제하는 자체의 생물학적 활성을 여전히 실질적으로 보유하는 항체의 단편 또는 유도체를 포함한다. 따라서, 용어 "항체 단편" 또는 IL-10 결합 단편은 완전한 길이의 항체의 일부, 일반적으로 이의 항원 결합 또는 가변 영역을 말한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 일본쇄 항체 분자; 예를 들면, sc-Fv; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 통상적으로 결합 단편 또는 유도체는 자체의 IL-10 억제 활성의 50% 이상을 보유한다. 바람직하게는, 결합 단편 또는 유도체는 자체 IL-10 억제 활성의 60% 이상, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100%를 보유한다. 또한 IL-10 결합 단편은 자체의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질 항체의 집단으로부터 수득된 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 존재하는 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단을 포함하는 개개 항체를 말한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고 단일의 항원 에피토프에 대해 지시되어 있다. 대조적으로, 통상의(폴리클로날) 항체 제제는 통상적으로 상이한 에피토프에 대해 지시된(또는 특이적인) 다수의 항체를 포함한다. 수식어구 "모노클로날"은 항체의 실질적인 동질 집단으로부터 수득된 바와 같은 항체의 특성을 나타내며, 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌[참조: Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(참조: 미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들면, 문헌[참조: Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다.
본원의 모노클로날 항체는 특이적으로 "키메라" 항체(면역글로불린)을 포함하며, 여기서, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 기원하거나 또는 특수 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체내 상응하는 서열과 동일하거나 동질인 반면, 나머지 쇄는 다른 종으로부터 기원하거나 또는 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체내 상응하는 서열, 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이러한 항체의 단편과 동일하거나 동질이다[참조: 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)].
본원에 사용된 것으로서, 용어 "일본쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 말하며, 여기서, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 또한, sFv가 항원 결합을 위해 바람직한 구조를 형성하도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 포함한다. sFv에 대해서는 문헌[참조: Pluckthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소 항체 단편을 말하며, 당해 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄(VH - VL)내 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 쇄에서 2개의 도메인 사이에 쌍을 이루는 것을 허용하도록 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인들을 다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 이루도록 하고 2개의 항원-결합 부위를 생성할 수 있다. 디아바디는 문헌[참조: 유럽 특허 제404,097호; 제WO93/11161호; 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기술되어 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "사람화된 항체"는 비-사람(예: 쥐) 항체 및 사람 항체로부터의 서열을 함유하는 항체 형태를 말한다. 이러한 항체는 비-사람 면역글로불린으로부터 기원한 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일반적으로, 사람화된 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나, 및 통상적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-사람 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 사람 면역글로불린 서열의 것에 상응한다. 사람화된 항체는 또한 임의로, 전형적으로 사람 면역글로불린의 것인 면역글로불린 고정 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "초가변 영역"은 항원-결합에 관여하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기[즉, 경쇄 가변 도메인내 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인내 잔기 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3)][참조: Kabat et Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)] 및/또는 "초가변성 루프"로부터의 잔기[즉, 경쇄 가변 영역내 잔기 26-32(L1) 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및 중쇄 가변 도메인내 잔기 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3)][참조: Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)]를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "골격" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 CDR 잔기로 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 말한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "보전적 치환"은 수득되는 분자의 생물학적 활성을 변경시키지 않고 일반적으로 제조할 수 있으며 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 아미노산의 치환을 말한다. 당해 분야의 숙련가는, 일반적으로 폴리펩타이드의 비-필수 영역내 단일의 아미노산 치환이 실질적으로 생물학적 활성을 변경하지 않는다는 것을 인지한다[참조: Watson, et al., Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Edition 1987)]. 이러한 예시적인 치환은 바람직하게는 다음과 같이 표 1에 기재된 것에 따라 이루어진다:
[표 1]
Figure pat00001
다른 치환도 또한 허용가능하며 공지된 보존적 치환에 따라 또는 경험적으로 결정될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "분리된 핵산 분자"는 항체 핵산의 천연 공급원과 주로 연관되어 있는 하나 이상의 오염된 핵산 분자로부터 확인되고 분리된 핵산 분자를 말한다. 분리된 핵산 분자는 천연에서 발견되는 형태 또는 세트 이외의 것이다. 따라서, 분리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 것과 같은 핵산 분자와는 구별된다. 그러나, 분리된 핵산 분자는, 예를 들면, 핵산 분자가 천연 세포의 것과는 상이한 염색체 위치에 있는, 항체를 주로 발현하는 세포내 함유된 핵산 분자를 포함한다.
표현 "조절 서열"은 특수 숙주 유기체내 작동적으로 결합된 암호화 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 말한다. 원핵세포에 적합한 조절 서열은 예를 들면, 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 작용적 관계로 위치하는 경우에 "작동적으로 결합(operably linked)"된다. 예를 들어, 전서열 또는 분리 리더용 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드용 DNA에 작동적으로 결합되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 암호화 서열에 작동적으로 결합되거나; 또는 리보솜 결합 부위가 해독을 용이하게 하도록 위치하는 경우 암호화 서열에 작동적으로 결합된다. 일반적으로 "작동적으로 결합된"은, 결합되는 DNA 서열이 연속적이고, 분리 리더의 경우, 연속 및 판독상임을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적이어서는 안된다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰(ligation)시킴에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(adaptor) 또는 링커를 통상의 실시에 따라 사용한다.
본원에 사용된 것으로서, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되며 모든 이러한 정의는 자손을 포함한다. 즉, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 전이의 수와 상관없이 기원한 1차 대상체 세포 및 배양물을 포함한다. 모든 자손이 계획적인 또는 우연한 돌연변이에 기인하여 DNA 함량이 정확하게 동일하지는 않을 수 있음이 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되는 것과 동일한 작용 또는 생물학적 활성을 가진 돌연변이체 자손도 포함된다. 명백한 지정이 의도되는 경우, 문맥으로부터 명백할 것이다.
본원에 사용된 것으로서, "폴리머라제 (연)쇄 반응(polymerase chain reaction)" 또는 "PCR"은, 소량의 핵산, RNA 및/또는 DNA의 특정 조각은, 예를 들면, 미국 특허 제4,683,195호에 기술된 바와 같이 증폭시키는 과정 또는 기술을 말한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 설계될 수 있도록, 목적 또는 이를 초과하는 영역의 말단으로부터 서열 정보가 유용할 필요가 있으며; 이들 프라이머는 증폭될 주형의 반대쪽 쇄에 대해 서열에 있어 동일하거나 유사할 것이다. 2개의 프라이머의 5' 말단 뉴클레오타이드는 증폭된 물질의 말단과 일치할 수 있다. PCR을 사용하여 총 게놈 DNA로부터의 특정 RNA 서열, 특정 DNA 서열, 및 총 세포 RNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열로부터 전사된 cDNA를 증폭시킬 수 있다[참조: Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263 (1987); Erlich, ed. , PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N. Y. , 1989)]. 본원에 사용된 것으로서, PCR은 프라이머 및 핵산 폴리머라제로서 공지된 핵산을 사용하여 핵산의 특정 종을 증폭시키거나 생성시키는 것을 포함하는 핵산 시험 샘플을 증폭시키기 위한 핵산 폴리머라제 반응 방법의 하나로 고려되나, 유일한 것은 아니다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "배선 서열(germline sequence)"은 재배열되지 않은 면역글로불린 DNA 서열의 서열을 말한다. 재배열되지 않은 면역글로불린의 특정의 적합한 공급원이 사용될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "면역제어제"는 면역 반응을 제어하거나 조절하는 천연 또는 합성제를 말한다. 면역 반응은 체액성 반응 또는 세포성 반응일 수 있다.
B. IL-10 특이적인 항체
본원에 기술된 조성물 및 방법은 특히 면역 반응에 있어서 IL-10 활성의 조절에 관한 것이다. 상세하게는, 본원의 조성물 및 방법은 사이토킨, IL-10에 대해 특이적인 항체를 사용한다. IL-10은 면역 반응에 포함된 각종의 세포 유형의 성장, 분화 및 사이토킨 합성의 조절을 통해 T 및 B 세포 반응을 조절하는 강력한 사이토킨이다. 중요한 것은, IL-10 생산이 흔히 자가면역병 및 병원체 유도된 면역병리학과 관련되어 있다. 따라서, IL-10 활성을 조절하고 억제하는 조성물, 및 이의 방법은 자가면역병 및 관련 증상의 진행 및 지속을 변화시키고 병원체-관련 면역병리학을 완화시키거나 감소시킬 수 있다.
사람화된 항체를 사용한 IL-10 활성의 표적화는 몇몇의 유일한 장점을 제공한다. 우선, 항체를 사용하여 IL-10을 표적화하는 것은 IL-10 활성의 특정 제어를 허용하면서 나머지 면역반응을 손상시키지 않는다. 병원체-유도된 면역병리학의 많은 경우에서, IL-10 활성의 감소 또는 제거는 바람직한 효과기 면역 반응을 허용함으로써 추가의 병리학없이 병원체를 제거할 수 있다. 자가면역 환자의 경우, IL-10 활성의 감소 또는 제거는 질병 및/또는 자체의 증상을 감소시키거나 제거하면서 환자의 면역 순응성을 유지할 수 있다. 둘째로, 사람화된 IL-10 항체는 면역원성 설치류 항체와 관련된 제한을 극복한다. 사람 서열의 사용은 외적으로 투여된 항체의 면역원성을 제거하면서 치료학적 투여를 허용한다.
사람화된 항체는 비-사람 및 사람 항체로부터의 서열을 함유한다. 통상적으로 사람화 과정은 바람직한 생물학적 활성을 갖는, 즉 IL-10 활성을 억제하는 비-사람 항체의 생성으로 개시한다. 적절한 특성을 지닌 비-사람 항체가 확인되면, 재조합 수단을 사용하여 비-사람 및 사람 서열을 사용한 하이브리드 서열을 생성시킨다.
C. IL-10 특이적인 항체의 생성
모노클로날 항체를 생성하기 위한 어떠한 적합한 방법도 사용할 수 있다. 예를 들면, 수용체는 IL-10 또는 이의 단편으로 면역화시킬 수 있다. 어떠한 적합한 면역화 방법도 사용할 수 있다. 이러한 방법은 부형제, 기타 면역자극제, 반복된 부스터 면역화(booster immunization), 및 하나 이상의 면역화 경로의 사용을 포함할 수 있다.
IL-10의 어떠한 적합한 공급원을 본원에 기술된 조성물 및 방법의 비-사람 항체의 생성을 위한 면역원으로서 사용할 수 있다. 이러한 형태는 당해 분야에 공지된 재조합, 합성, 화학 또는 효소 분해 수단에 의해 생성된 전체 단백질, 펩타이드 및 에피토프를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. IL-10은 2개의 내부침투 폴리펩타이드 쇄의 산-민감성인, 비공유 단독이량체이다. 사이토킨은 인터페론 및 조혈성 사이토킨과 유사한 α-나선 다발 구조를 포함하는 잘 보존된 서열을 지닌 160개 아미노산 길이이다. 사람 및 쥐 IL-10은 73% 아미노산 상동성을 지니며, 사람 IL-10은 쥐 및 사람 세포상에서 활성이다. IL-10은 시판되거나 잘 공지된 분자 생물학 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 유전자뱅크 cDNA 서열은 사람, 돼지-테일드 짧은꼬리 원숭이(pig-tailed macaque), 만가비(mangabey), 레서스(rhesus) 및 올빼미-원숭이(owl monkey), 여우 원숭이, 마우스, 랫트, 기나아 피그, 시리안 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 등에 유용하다. 재조합 사람 IL-10은 N-글리코실화되지 않은 17 내지 18kDa 폴리펩타이드이다.
어떠한 형태의 항원도 생물학적으로 활성인 항체를 생성하기에 충분한 항체를 생성하기 위해 사용할 수 있다. 따라서, 유발되는 항원은 단일 에피토프, 다수 에피토프, 또는 전체 단백질 단독 또는 당해 분야에 공지된 하나 이상의 면역성 증가제와의 배합물일 수 있다. 유발되는 항원은 분리된 완전-길이 단백질, 세포 표면 단백질(예를 들면, 항원의 적어도 일부로 형질감염된 세포로 면역화시킨), 또는 가용성 단백질(예를 들면, 단백질의 단지 세포외 도메인 부분으로 면역화시킨)일 수 있다. 항원은 유전적으로 개질된 세포내에서 생산될 수 있다. 항원을 암호화하는 DNA는 게놈성 또는 비-게놈성(예를 들면, cDNA)일 수 있으며 적어도 일부의 세포외 도메인을 암호화한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "일부"는 목적한 항원의 면역원성 에피토프를 구성하기 위한, 적절하게는 아미노산 또는 핵산의 최소 수를 말한다. 아데노바이러스 벡터, 플라스미드, 및 양이온성 지질과 같은 비-바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는 목적한 세포의 형질전환에 적합한 특정의 유전 벡터를 사용할 수 있다.
어떠한 적합한 방법도 사용하여 IL-10을 억제하기 위한 목적하는 생물학적 특성을 지닌 항체를 유발시킬 수 있다. 마우스, 설치류, 영장류, 사람 등과 같은 각종 포유동물 숙주로부터 모노클로날 항체(mAb)를 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 모노클로날 항체를 제조하기 위한 기술의 묘사는 문헌[참조: Stites, et al. (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4th ed. ) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 및 이에 인용된 문헌; Harlow and Lane (1988) ANTIBODIES : LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES : PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed. ) Academic Press, New York, NY]에서 찾을 수 있다. 따라서, 모노클로날 항체는 당해 분야의 숙련된 연구가에게 익숙한 각종 기술로 수득할 수 있다. 통상적으로, 목적한 항원으로 면역화시킨 동물로부터의 비장 세포를 일반적으로 골수종 세포와의 융합에 의해 무한증식시킬 수 있다[참조: Kohler and Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6: 511-519]. 무한증식의 대안적인 방법은 엡슈타인 바르 바이러스(Epstein Barr Virus), 온코유전자(Oncogene) 또는 레트로바이러스, 또는 당해 분야에 공지된 기타 방법을 사용한 형질전환을 포함한다[참조: Doyle, et al. (eds. 1994 및 주기적인 보충서) CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley and Sons, New York, NY]. 단일의 무한증식된 세포로부터 생성된 콜로니를 항원에 대한 목적하는 특이성 및 친화성의 항체 생산에 대해 스크리닝하고, 이러한 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 수율을 척추동물 숙주의 복강내로 주입시킴을 포함하는 각종 기술에 의해 증진시킬 수 있다. 달리는, 예를 들면, 문헌[참조: Huse, et al. (1989) Science 246: 1275-1281]에 요약된 일반적인 프로토콜에 따라 사람 B 세포로부터의 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 모노클로날 항체 또는 이의 결합 단편을 암호화하는 DNA 서열을 분리할 수 있다.
다른 적합한 기술은 파아지 또는 유사한 벡터내 항체 라이브러리의 선택을 포함한다[참조: Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989); 및 Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)]. 키메라 항체 또는 사람화된 항체를 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드 및 항체는 변형시키거나 또는 변형시키지 않고 사용할 수 있다. 흔히, 폴리펩타이드 및 항체는 검출가능한 시그날을 제공하는 물질을 공유적으로 또는 비공유적으로 결합시킴으로써 표지될 것이다. 광범위한 표지 및 접합 기술은 알려져 있으며 과학 및 특허 문헌 둘다에 상세히 보고되어 있다. 적합한 표지는 방사성핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광성 잔기, 화학발광 잔기, 자기 입자 등을 포함한다. 이러한 표지의 사용을 교시하고 있는 특허는 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호를 포함한다. 또한 재조합 면역글로불린이 생산되거나[참조: Cabilly의 미국 특허 제4,816,567호; 및 Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033]; 또는 유전자삽입 마우스에서 제조될 수 있다[참조: Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15: 146-156; 또한 Abgenix and Medarex technologies].
IL-10의 예정된 단편에 대한 항체 또는 결합 조성물은 폴리펩타이드, 단편, 펩타이드, 또는 에피토프와 담체 단백질과의 접합체를 사용하여 동물을 면역화시킴으로써 생성시킬 수 있다. 모노클로날 항체는 목적하는 항체를 분비하는 세포로부터 제조한다. 이러한 항체는 정상 또는 결함 IL-10에 결합시키기 위해 스크리닝할 수 있다. 이들 모노클로날 항체는 일반적으로 ELISA에 의해 측정한 것으로서 약 1μM 이상, 더욱 일반적으로 약 300nM 이상, 통상적으로 약 30nM 이상, 바람직하게는 약 10nM 이상, 더욱 바람직하게는 약 3nM 이상의 Kd 값으로 결합할 것이다. 적합한 비-사람 항체는 또한 상기 단락 D에 기술된 생물학적 검정을 사용하여 확인할 수 있다.
C. IL-10 특이적인 항체의 사람화
어떠한 적합한 비-사람 항체도 초가변 영역에 대한 공급원으로 사용할 수 있다. 비-사람 항체에 대한 공급원은 쥐, 루핀(lupine), 소 및 영장류를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대부분의 경우에, 사람화된 항체는 사람 면역글로불린(수용체 항체)이며, 여기서, 수용체의 초가변 영역 잔기는 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 지닌 마우스, 랫트, 토끼 또는 비사람 영장류와 같은 비-사람 종(공여체 항체)로부터의 초가변 영역 잔기로 대체된다. 일부 예에서, 사람 면역글로불린의 Fv 골격 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-사람 잔기로 대체된다. 또한, 사람화된 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 목적한 생물학적 활성의 항체 성능을 추가로 개량하기 위해 이루어진다. 추가의 세부사항에 대해서는 문헌[참조: Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)]을 참조한다.
항체를 재조합적으로 가공하기 위한 방법은 보쓰(Boss) 등의 미국 특허 제4,816,397호, 카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 제4,816,567호, 로우(Law) 등의 유럽 특허원 공보 제438 310호 및 윈터(Winter) 등의 유럽 특허원 공보 제239 400호에 기술되어 있다.
사람화된 항-IL-10 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오타이드 변화를 사람화된 항-IL-10 항체 DNA내로 도입시키거나, 펩타이드 합성에 의해 제조한다. 이러한 변이는 사람화된 항-IL-10 F(ab)에 대해 나타낸 아미노산 서열(예: 서열 5 및 10)내 잔기로부터의 결실, 잔기내로의 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 어떠한 조합도 최종 작제물에 도달하기 위해 이루어지며, 단, 최종 작제물은 목적한 특성을 지닌다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같은 사람화된 항-IL-10 항체의 해독후 과정을 변경시킬 수 있다.
돌연변이유발을 위해 바람직한 위치인 사람화된 항-IL-10 항체 펩타이드의 특정 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌[참조: Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)]에 기술되어 있는 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 여기서, 표적 잔기의 그룹 또는 잔기가 확인되며(예를 들면, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기), 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 IL-10 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 미친다. 이후, 치환에 대해 작용적 민감성을 입증하는 아미노산 잔기는 치환 부위에서 또는 부위에 대해 추가의 변이 또는 기타 변이를 도입시킴으로써 개량한다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입시키기 위한 부위는 예정되는 반면, 돌연변이 자체의 특성은 예정될 필요가 없다. 예를 들어, 제공된 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하며, 발현된 사람화된 항-IL-10 항체 변이체를 목적한 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 지닌 사람화된 항-IL-10 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 사람화된 항-IL-10 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드의 사람화된 항-IL-10 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이러한 변이체는 제거된 사람화된 항-IL-10 항체 분자내 하나 이상의 아미노산 잔기 및 이의 위치에서 삽입된 상이한 잔기를 지닌다. 치환성 돌연변이유발에 대한 최대 관심 부위는 초가변 루프를 포함하나, FR 변형이 또한 고려된다. 하기 기술된 방법에서 표 2 및 3은 변경될 수 있는 초가변 영역에 대한 안내를 제공한다. 항원 결합에 관여하는 초가변 영역 잔기 또는 FR 잔기는 일반적으로 비교적 보존된 방식으로 치환된다.
항체의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 원래 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 변경은 항체에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및/또는 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가를 의미한다. 항체의 글리코실화는 통상적으로 N-결합되거나 O-결합된다. N-결합된은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 잔기가 부착됨을 말한다. 트리펩타이드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(여기서, X는 프롤린을 제외한 모든 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 잔기의 효소적 부착을 위한 인지 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드내 이들 트리펩타이드 서열의 존재는 강력한 글리코실화 부위를 생성한다. O-결합된 글리코실화는, 비록 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 또한 사용될 수 있다고 해도, 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토즈 또는 크실로즈중 하나의 하이드록시아미노산으로의 부착을 말한다.
항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가는 편리하게는 이것이 하나 이상의 상기한 트리펩타이드 서열(N-결합된 글리코실화 부위의 경우)을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 달성된다. 이러한 변경은 또한 원래의 항체의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기에 의한 첨가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다(O-결합된 글리코실화 부위의 경우).
사람화된 IL-10 특이적인 항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 각종 방법으로 제조된다. 이들 방법은 천연 공급원(천연적으로 발생하는 아미노산 서열 변이체의 경우)으로부터의 분리 또는 사람화된 항-IL-10 항체의 앞서 제조된 변이체 버젼 또는 비-변이체 버젼의 올리고뉴클레오타이드-매개된(또는 부위-지시된) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
주로, 사람화된 항-IL-10 항체의 아미노산 서열 변이체는 중쇄 또는 경쇄의 원래의 사람화된 항체 아미노산 서열(즉, 서열 5 및 10)과 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 95% 이상 동질성인 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열을 지닐 것이다. 당해 서열과 관련한 동질성 또는 상동성은 본원에서 경우에 따라, 최대 퍼센트의 서열 동질성을 달성하기 위한 서열의 정렬 및 갭의 도입, 및 그러나 서열 동질성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않은 후 사람화된 항-IL-10 잔기와 동질성인 후보 서열내 아미노산 잔기의 퍼센트로 정의한다. 항체 서열내 N-말단, C-말단, 또는 내부 연장, 결실 또는 삽입의 어느 것도 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 해석되어서는 안된다.
사람화된 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 특정 부류의 면역글로불린으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 IgG 항체이다. IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 IgG의 동형이 사용될 수 있다. IgG 동형의 변이체도 또한 고려된다. 사람화된 항체는 하나 이상의 부류 또는 동형으로부터의 서열을 포함할 수 있다. 목적한 생물학적 활성을 생성하기 위한 필수적인 고정 도메인 서열의 최적화는 하기 기술된 생물학적 검정에서 항체를 스크리닝함으로써 용이하게 달성된다.
유사하게, 경쇄 부류도 본원의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 상세하게는, 카파, 람다 또는 이의 변이체가 본 발명의 조성물 및 방법에 유용하다.
비-사람 항체로부터의 CDR 서열의 어떠한 적합한 부위도 사용할 수 있다. CDR 서열은 하나 이상의 잔기의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 돌연변이유발됨으로써 CDR 서열이 사용된 사람 및 비-사람 항체 서열과 구별될 수 있다. 이러한 돌연변이는 최소일 수 있음이 고려된다. 통상적으로, 75% 이상, 더욱 흔히는 90%, 및 가장 바람직하게는 95% 이상의 사람화된 항체 잔기가 비-사람 CDR 잔기의 것에 상응한다.
사람 항체로부터 FR 서열의 어떠한 적합한 부위도 사용할 수 있다. FR 서열은 하나 이상의 잔기의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 돌연변이유발됨으로써 FR 서열은 사용된 사람 및 비-사람 항체 서열과 구별될 수 있다. 이러한 돌연변이는 최소일 수 있음이 고려된다. 통상적으로, 75% 이상, 더욱 흔히 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 95% 이상의 사람화된 항체 잔기가 사람 FR 잔기의 것에 상응할 것이다.
CDR 및 FR 잔기는 문헌[참조: Kabat. Kabat et Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md. (1987)]의 표준 서열 정의에 따라 측정한다.
본원에서는
a) 목적하는 생물학적 활성을 갖는 비-사람 항체를 확인하는 단계;
b) 비-사람 항체 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 측정하는 단계;
c) 사람 배선(germline) 서열의 그룹에 대해 비사람 항체 서열을 비교하는 단계; 및
d) 최대 총 잔기 점수를 갖는 사람 배선 서열을 수용체 배선 서열로서 확인하는 단계를 포함하는, 사람화된 항체에 대한 수용체 배선 서열을 확인하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 단계 c)에서의 비교는 1) 상기 카베트(Kabat)에 따라 비-사람 V 서열 잔기 번호를 지정하는 단계; 2) 상기 카베트에 따라 서열내 CDR 및 FR 영역을 묘사하는 단계; 3) 비-사람 및 사람 항체 배선 서열이 동일한 특정 잔기 위치에서 예정된 점수를 지정하는 단계; 및 4) 잔기 점수 모두를 더하여 각각의 사람 배선 서열에 대한 총 점수를 생성시키는 단계의 소단계들을 포함한다. 하나의 양태에서, 당해 방법은 5) 소단계 (3)에서 기록되지 않았던 비-사람 및 사람 항체 배선 서열이 소단계 (4)후 동일한 총 잔기 점수를 지닌 배선 서열에 대해 동일한 각각의 FR 잔기 위치에 대해 점수 1을 지정하는 단계; 6) 잔기 점수 모두를 합하여 각각의 사람 배선 서열에 대한 총 점수를 생성시키는 단계의 소단계를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 비-사람 항체는 IL-10에 대해 특이적이며 IL-10의 생물학적 활성을 억제한다. 본원에서는 또한 상기 방법에 의해 생성된 항체를 제공한다.
하나의 양태에서, IL-10 항체는 다음 방법을 사용하여 사람화시킨다. 우선, IL-10 항체의 비-사람 VL 및 VH 도메인을 클로닝하고 서열분석하며, 아미노산 서열을 측정한다. 이후에, 비-사람 VH 서열을 5개의 사람 VH 배선 아미노산 서열의 그룹과 비교한다. 5개 그룹은 소그룹 IGHV1 및 IGHV4로부터의 하나의 대표 및 소 그룹 IGHV3으로부터의 3개의 대표를 함유한다. VH 소그룹은 문헌[참조: M.-P. Lefranc, Exp. Clin. Immunogenetics, 18: 100-116 (2001)]에 나열되어 있다. 상세하게는, 5개의 배선 서열과의 비교는 카배트 번호매김 시스템에 따라 비-사람 VH 서열에 잔기 번호를 지정하는 것으로 시작한다[참조: Kabat, et al., U. S. Department of Health and Human Services, NIH Pub. 91-3242 (5th Ed., 1991)]. 이후에 비-사람 VH 서열을 5개의 사람 배선 서열의 각각과 정렬시킨다. V 유전자는 단지 VH 잔기 1 내지 94만을 포함하므로, 이들 잔기만이 정렬인 것으로 고려한다. 다음, 서열내 상보성-결정(CDR) 및 골격(FR) 영역을 묘사한다. CDR 및 FR은 문헌[참조: Kabat, et al. , U. S. Department of Health and Human Services, NIH Pub. 91- 3242 (5th Ed., 1991), 및 C. Chothia & A. M. Lesk, Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)]에 제공된 정의의 조합에 따라 묘사한다. 따라서, 사용된 CDR 정의는 VH 도메인의 CDR1의 경우 잔기 26 내지 35번이고, VH 도메인의 CDR2의 경우 잔기 50 내지 65번이며, CDR3는 VH 도메인의 CDR3의 경우 95 내지 102번이다. 다음 단계는 비-사람 및 사람 서열이 동일한 확인된 잔기 위치에 점수를 지정하는 것을 포함한다. 이러한 점수매김의 하나의 예는 하기 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure pat00002
잔사 위치에 점수를 지정한 후, 모든 잔사 점수를 합계낸다. 수용체 배선 서열은 최대 총 점수를 지닌 것이다. 2개 이상의 배선 서열이 동일한 점수를 갖는 경우에, 각각의 위치에 대해 총계에 1을 가하며, 여기서, 비-사람 및 사람 서열은 다음 잔기에 대해 동일하다: 1, 3, 5-23, 25, 36, 38, 40-43, 46, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 77, 79-90, 및 92 (최대 49). 잔기 점수를 다시 합계내며, 수용체 배선 서열은 최대 총 점수를 지닌 것이다. 2개 이상의 배선 서열이 여전히 동일한 점수를 지니는 경우, 하나를 수용체 배선 서열로서 사용할 수 있다.
VL 서열이 VL의 카파 소부류의 구성원인 경우, IL-10 특이적인 항체로부터의 비-사람 VL 서열을 4개 그룹의 사람 VL 카파 배선 아미노산 서열과 비교한다. 4개 서열은 문헌[참조: V. Barbie & M.- P. Lefranc, Exp. Clin. Immunogenetics 15: 171-183(1998) 및 M. -P. Lefranc, Exp. Clin. Immunogenetics 18: 161-174(2001)]에 나열된 4개의 확립된 사람 VL 소그룹 각각으로부터의 대표적인 것으로 이루어진다. 4개 서열은 또한 카배트 등의 문헌[참조: U. S. Department of Health and Human Services, NIH Pub. 91-3242, pp. 103-130 (5th Ed., 1991)]에 나열된 4개의 소그룹에 상응한다. 4개의 배선 서열에 대한 비-사람 서열의 비교는 카배트 등의 문헌[참조: U. S. Department of Health and Human Services, NIH Pub. 91-3242 (5th Ed. , 1991)]에 따라 비-사람 VL 서열 잔기에 잔기 번호를 지정하는 것으로 개시한다. 이후에 비-사람 VL 서열을 4개의 사람 배선 서열 각각에 정렬한다. V 유전자는 단지 VL 잔기 1 내지 95번만을 포함하므로, 이들 잔기는 단지 정렬된 것으로 고려된다. 다음, 상보성-결정(CDR) 및 골격(FR) 영역을 서열내에서 묘사한다. CDR 및 FR을 카배트의 문헌[참조: U. S. Department of Health and Human Services, NIH Pub. 91- 3242 Ed. 1991, 및 C. Chothia & A. M. Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)]에 제공된 정의의 조합에 따라 묘사한다. 따라서, 사용된 CDR 정의는 VL 도메인의 CDR1의 경우 잔기 24-34, CDR2의 경우 잔기 50-56 및 CDR3의 경우 잔기 89-97이다. 다음 단계는 비-사람 및 사람 서열이 동일한 확인된 잔기 위치에 점수를 지정하는 것을 포함한다. 이러한 점수매김의 예는 하기 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure pat00003
잔기 위치에 점수를 지정한 후, 총 잔기 점수를 합한다. 수용체 배선 서열은 최대 총 점수를 지닌 것이다. 2개 이상의 배선 서열이 동일한 점수를 지니는 경우에, 각각의 위치에 대해 총 점수에 1을 더하며, 여기서, 비-사람 및 사람 서열은 다음 잔기의 경우 동일하다: 1, 3, 5-23, 35, 37, 39-42, 57, 59-61, 63, 65-70, 72-86, 및 88. 잔기 점수를 다시 총계를 내며, 수용체 배선 서열은 최대 총 점수를 지닌 것이다. 2개 이상의 배선 서열이 여전히 동일한 점수를 갖는 경우, 하나를 수용체 배선 서열로서 사용할 수 있다.
항체의 재조합 생산을 위해, 이를 암호화하는 핵산을 분리하여 추가의 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능한 벡터내에 삽입한다. 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 용이하게 분리되며, 통상의 과정(예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여)을 사용하여 서열분석한다. 많은 벡터들이 이용가능하다. 벡터 성분들은 일반적으로 하나 이상의 시그날 서열, 복제 오리진, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
하나의 양태에서, 항체는 CDR1에서 서열 1(KTSQNIFENLA), CDR2에서 서열 2(NASPLQA), 및 CDR3에서 서열 3(HQYYSGYT)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; 및 골격 영역(여기서, 골격 영역의 아미노산 서열은 모든 또는 실질적으로 모든 사람 면역글로불린 아미노산 서열이다)을 포함하는, 하나 이상의 항체 경쇄 가변 영역, 또는 이의 결합 단편; 및 CDR1에서 서열 6(GFTFSDYHMA), CDR2에서 서열 7(SITLDATYTYYRDSVRG), CDR3에서 서열 8(HRGFSVWLDY)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드; 및 골격 영역(여기서, 골격 영역의 아미노산 서열은 모든 또는 실질적으로 모든 사람 면역글로불린 아미노산 서열이다)을 포함하는, 하나 이상의 항체 중쇄 가변 영역 또는 이의 결합 단편을 포함하는, IL-10에 결합하는 사람화된 재조합 항체 분자 또는 이의 결합 단편이다. 특정 양태에서, 항체 경쇄 또는 이의 결합 단편은 서열 4의 가변 영역(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTSQNIFENLAWYQQKPGKAPKLLIYNASPLQAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYSGYTFGPGTKLELKRT)을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 하나의 특정 양태에서, 항체 경쇄 또는 이의 결합 단편은 서열 5의 가변 영역 및 고정 영역을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다(참조: 표 4). 하나의 특정 양태에서, 항체 중쇄 또는 이의 결합 단편은 서열 9의 가변 영역((QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSDYHMAWVRQAPGKGLEWVASITLDATYTYYRDSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHRGFSVWLDYWGQGTLVTVSS)을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 하나의 특정 양태에서, 항체 중쇄 또는 이의 결합 단편은 서열 10의 가변 영역 및 고정 영역을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다(참조: 표 5).
사람화된 12G8 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산을 함유하는 플라스미드는 각각 기탁 번호 제PTA-5923호 및 제PTA-5922호로서 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 기탁되어 있다.
[표 4]
사람화된 12G8 항체의 경쇄에 대한 완전한 길이의 서열
Figure pat00004
[표 5]
사람화된 12G8 항체의 중쇄에 대한 완전한 길이의 서열
Figure pat00005
Figure pat00006
하나의 양태에서, 항체는 CDR1에서 서열 11(RASESVDDYGHSFMH), CDR2에서 서열 12(RASTLES), 및 CDR3에서 서열 13(QQGNEDPWT)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 및 골격 영역(여기서, 골격 영역의 아미노산 서열은 모든 또는 실질적으로 모든 사람 면역글로불린 아미노산 서열이다)을 포함하는 하나 이상의 항체 경쇄 또는 이의 결합 단편; 및 CDR1에서 서열 15(GFSLTNYGVH): CDR2에서 서열 16(VIWSGGSTDYNAAFIS) 및 CDR3에서 서열 17(NRGYDVYFDY)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 및 이의 골격 영역(여기서, 골격 영역의 아미노산 서열은 모든 또는 실질적으로 모든 사람 면역글로불린 아미노산 서열이다)을 포함하는 하나 이상의 항체 중쇄 또는 이의 결합 단편을 포함하는, IL-10에 결합하는 사람화된 재조합 항체 분자 또는 이의 결합 단편이다. 하나의 특정 양태에서, 항체 경쇄 또는 이의 결합 단편은 서열 14의 가변 영역 및 고정 영역을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다(참조: 표 6). 다른 특정 양태에서, 항체 중쇄 또는 이의 결합 단편은 서열 18의 가변 영역 및 고정 영역을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다(참조: 표 7).
사람화된 11D8 중쇄 및 경쇄를 함유하는 플라스미드는 각각 기탁 번호 제PTA-5926호 및 제PTA-5927호로 ATCC에 기탁되었다.
[표 6]
사람화된 11D8 항체의 경쇄에 대한 완전한 길이의 서열
Figure pat00007
[표 7]
사람화된 11D8 항체의 중쇄에 대한 완전한 길이의 서열
Figure pat00008
Figure pat00009
하나의 양태에서, 상기 기술된 항체는 중쇄 고정 영역을 추가로 포함하며, 여기서, 중쇄 고정 영역은 γ1, γ2, γ3 또는 γ4 사람 중쇄 고정 영역 또는 이의 변이체를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 기술된 항체는 경쇄 고정 영역을 추가로 포함하며, 여기서, 경쇄 고정 영역은 람다 또는 카파 사람 경쇄 고정 영역을 포함한다. 일부 양태에서, 이들 항체의 결합 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, 및 디아바디로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항체 단편이다.
또한 본원에서는 CDR1에서 서열 1, CDR2에서 서열 2 및 CDR3에서 서열 3으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 항체 경쇄 가변 영역 또는 이의 결합 단편; 및 CDR1에서 서열 6, CDR2에서 서열 7 및 CDR3에서 서열 8로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 항체 중쇄 가변 영역 또는 이의 결합 단편을 포함하는, IL-10에 결합하는 키메라 재조합 항체 분자 또는 이의 결합 단편이 제공된다.
특정 양태에서, 키메라 재조합 항체 분자는 서열 23에 나타낸 경쇄 및 서열 24에 나타낸 중쇄를 지닌다(참조: 표 8). 12G8 키메라 항체 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산은 각각 기탁 번호 제PTA-5925호 및 제PTA-5924호로 ATCC에 기탁되었다.
[표 8]
키메라 12G8 항-사람 IL-10 항체의 서열
Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
본원에서는 CDR1에서 서열 11, CDR2에서 서열 12 및 CDR3에서 서열 13으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 항체 경쇄 또는 이의 결합 단편; 및 CDR1에서 서열 15, CDR2에서 서열 16 및 CDR3에서 서열 17로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 항체 중쇄 또는 이의 결합 단편을 포함하는, IL-10에 결합하는 키메라 재조합체 항체 분자 또는 이의 결합 단편이 제공된다.
또한, 본원에서는 상기 기술한 항체의 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산이 제공된다. 또한, 본원에서는 벡터로 형질감염된 숙주 세포에 의해 인지된 조절 서열에 작동적으로 결합된 분리된 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 본원에는 분리된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 또한 본원에서는 핵산 서열이 발현되는 조건하에서 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양함으로써 폴리펩타이드를 생산하고, 이를 숙주 세포로부터 회수함을 포함하여, 폴리펩타이드를 생산하는 방법이 제공된다.
본원에서는 서열 19의 핵산 서열을 갖는 경쇄 및 서열 20의 핵산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는, IL-10에 대해 특이적인 항체를 암호화하는 분리된 핵산 서열이 제공된다(참조: 표 4 및 표 5).
본원에서는 서열 21의 핵산 서열을 갖는 경쇄 및 서열 22의 핵산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는, IL-10에 특이적인 항체를 암호화하는 분리된 핵산 서열이 제공된다(참조: 표 6 및 표 7).
또한 본원에서는 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 항체의 결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산 서열이 제공된다. 하나의 양태에서, 결합 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, 및 디아바디로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항체 단편이다.
이특이적 항체가 또한 본 발명의 방법 및 조성물에서 유용하다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "이특이적 항체"는 2개 이상의 상이한 항원성 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체, 통상적으로 모노클로날 항체를 말한다. 하나의 양태에서, 에피토프는 동일한 항원으로부터 기원한다. 다른 양태에서, 에피토프는 2개의 상이한 항원으로부터 기원한다. 이특이적 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 이특이적 항체는 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공-발현을 사용하여 재조합적으로 제조할 수 있다[참조: Milstein et al., Nature 305; 537-39(1983)]. 달리는, 이특이적 항체를 화학적 연결을 사용하여 제조할 수 있다[참조: Brennan, et al., Science 229: 81 (1985)]. 이특이적 항체는 이특이적 항체 단편을 포함한다[참조: Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-48 (1993), Gruber, et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994)].
D. 사람화된 항-IL-10 항체의 생물학적 활성
사람화된 항-IL-10 항체에서 바람직한 것으로서 본원에 정의된 특성을 갖는 항체는 시험관내 생물학적 억제 활성 또는 적합한 결합 친화성에 대해 스크리닝할 수 있다. 목적 항체(예: 이의 수용체에 대한 사이토킨의 결합을 차단하는 것)에 의해 결합된 사람 IL-10상의 에피토프에 결합하는 항체에 대해 스크리닝하기 위해, 문헌[참조: ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기술된 바와 같은 정규의 가교-차단 검정을 수행할 수 있다. 달리는, 문헌[참조: Champe et al., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995)]에 기술된 바와 같은 에피토프 맵핑을 수행하여 항체가 목적 에피토프에 결합하는지를 결정할 수 있다. 항체 친화성(예: 사람 IL-10에 대한 친화성)은 표준 스캐챠드 분석(scatchard analysis)을 사용하여 측정할 수 있다. 바람직한 사람화된 항체는, 약 1x10-7이하; 바람직하게는 약 1x10-8이하; 더욱 바람직하게는 약 1x10-9 이하; 및 가장 바람직하게는 약 2x10-10이하의 Kd의 값으로 사람 IL-10에 결합하는 것들이다.
본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 항체 및 이의 단편은 생물학적으로 활성인 항체 및 단편이다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "생물학적으로 활성인"은 직접 또는 간접적으로 생물학적 효과를 발휘하며 목적하는 항원성 에피토프에 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 말한다. 통상적으로, 이들 효과는, IL-10가 이의 수용체에 결합하지 못하는 것에서 초래된다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "특이적"은 표적 항원 에피토프에 대한 항체의 선택적인 결합을 말한다. 항체는 제공된 조건하에서 IL-10에 대한 결합을 비관련 항원 또는 항원 혼합물에 대한 결합과 비교함으로써 결합의 특이성에 대해 시험할 수 있다. 항체가 비관련 항원 또는 항원 혼합물보다 10배 이상, 및 바람직하게는 50배 이상으로 IL-10에 결합하는 경우, 이를 특이적인 것으로 고려한다.
억제성 IL-10 특이적인 항체는 IL-1, IFN-γ, PGE2, IL-12, TNF, CC 및 CXC 케모킨의 생산, 및 MHC 제II 부류 항원, CD54, CD80 및 CD86의 세포 표면 발현을 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 방식으로도 이의 생물학적 활성을 억제할 수 있다. IL-10 특이적인 항체의 생물학적 활성은 어떠한 유용한 방법으로도 측정할 수 있다(참조: 미국 특허 제6,239,260호 및 제6,207,154호). 하나의 예에서, 생물학적 활성은 쥐 비만 세포주, MC9/2를 사용하는 세포 증식 검정에서 평가한다[참조: Thompson-Snipes et al., J. Exp. Med. 173: 507-10(1991)]. IL-10은 당해 세포주의 증식을 자극하므로 억제성 항체는 증식을 감소시키는 자체의 능력으로 확인할 수 있다. MC9/2 세포주의 증식에 대한 ED50은 통상적으로 0.5 내지 1.0ng/mL이다. 항체는 비-결합 항체의 존재하에 또는 항체의 부재하에 세포의 증식에 대해 세포의 증식을 억제하는 경우 증식에 대해 억제성이다. 증식은 적합한 방법을 사용하여 정량할 수 있다. 통상적으로, 증식은 방사성-표지된 뉴클레오타이드의 DNA(예: 3H-티미딘)내로의 삽입을 평가함으로써 측정한다. 다른 양태에서, 증식은 ATP 발광으로 측정한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물에 유용한 항체는 IL-10의 생물학적 활성을 80%, 더욱 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 99% 억제한다.
E. 사람화된 항-IL-10 항체의 용도
본원에서는 IL-10의 생물학적 활성을 차단하는데 효과적인 양의, IL-10에 특이적인 항체 또는 이의 결합 단편을 이를 필요로하는 대상체에게 투여함을 포함하여, 사람 대상체에서 면역 반응을 제어하는 방법을 제공하며, 여기서, 항체는 CDR1에서 서열 1, CDR2에서 서열 2, 및 CDR3에서 서열 3으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 골격 영역(여기서, 골격 영역의 아미노산 서열은 모든 또는 실질적으로 모든 사람 면역글로불린 아미노산 서열이다)을 포함하는 하나 이상의 항체 경쇄 가변 영역 또는 이의 결합 단편; 및 CDR1에서 서열 6, CDR2에서 서열 7, 및 CDR3에서 서열 8로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 골격 영역(여기서, 골격 영역의 아미노산 서열은 모든 또는 실질적으로 모든 사람 면역글로불린 아미노산 서열이다)을 포함하는 하나 이상의 항체 중쇄 가변 영역 또는 이의 결합 단편을 포함하는, IL-10에 결합하는 사람화된 재조합 항체 분자 또는 이의 결합 단편이다.
추가로, 본원에서는 IL-10의 생물학적 활성을 차단하는데 효과적인 양의, IL-10에 특이적인 항체 또는 이의 결합 단편을 이를 필요로하는 대상체에게 투여함을 포함하여, 사람 대상체에서 면역 반응을 제어하는 방법을 제공하며, 여기서, 항체는 CDR1에서 서열 11, CDR2에서 서열 12, 및 CDR3에서 서열 13으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 골격 영역(여기서, 골격 영역의 아미노산 서열은 모든 또는 실질적으로 모든 사람 면역글로불린 아미노산 서열이다)을 포함하는 하나 이상의 항체 경쇄 또는 이의 결합 단편; 및 CDR1에서 서열 15, CDR2에서 서열 16, 및 CDR3에서 서열 17로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 골격 영역(여기서, 골격 영역의 아미노산 서열은 모든 또는 실질적으로 모든 사람 면역글로불린 아미노산 서열이다)을 포함하는 하나 이상의 항체 중쇄 또는 이의 결합 단편을 포함하는, IL-10에 결합하는 사람화된 재조합 항체 분자 또는 이의 결합 단편이다.
당해 방법에 의해 제어된 면역 반응은 체액성 또는 세포성 반응이다. 체액성 또는 세포성 반응의 제어는 당해 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 높은 수준의 자가반응성 항체와 관련된 질병, 예를 들면, SLE에서, 예비-처리 혈청 수준에 대해 이들 항체의 혈청 수준의 감소는 체액성 반응의 제어의 지표이다. 유사하게, 세포성 면역 반응의 제어는 잘 공지된 시험관내 분석, 예를 들면 유동 셀 분석 검정에 의한 말초 혈액 림프구의 활성화 표현형의 특성화 또는 증식 및 세포독성 검정을 사용하여 측정할 수 있다(참조: CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, 가장 최근 저서). 하나의 양태에서, 당해 방법으로 치료되는 대상은 전신홍반루푸스이다. 다른 양태에서, 대상은 면역혈소판감소자색반(ITC)이다. 다른 양태에서, 대상은 루푸스 신장염이다. 추가의 양태에서, 대상은 HIV를 갖는다. 다른 양태에서, 대상은 C형 간염이다.
본원에서는, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 항체, 또는 이의 결합 단편을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서, 항체는 본원에 기술된 항체중 하나이다.
IL-10 특이적인 항체를 사용한 치료로부터 유리할 수 있는 어떠한 대상체도 본원에 제공된 조성물 및 방법을 사용하여 치료할 수 있다. 어떠한 대상체도 본원에 제공된 방법 및 조성물을 사용하여 치료할 수 있다. 이러한 대상체는 자가 면역병 또는 증상 또는 병원체-유발된 면역병리학을 지닌 포유동물, 바람직하게는 사람이다. 하나의 특정 양태에서, 대상체는 SLE, 루푸스 신장염, 류마티스 관절염, ITC, HIV 또는 C형 간염 환자이다. 기술된 방법 및 조성물의 수의학적 용도도 또한 고려된다.
본원에 사용된 것으로서, "억제하다" 또는 "치료하다" 또는 "치료"는 자가면역병 또는 병원체 유발된 면역병리학과 관련된 증상의 진행의 지연 및/또는 진행되거나 진행될 것으로 예측되는 이러한 증상의 중증도에 있어서의 감소를 포함한다. 당해 용어는 또한 존재하는 조절되지 않거나 원치않는 자가면역-관련 또는 병원체-유발된 면역병리학 증상을 완화시키고, 추가의 증상을 예방하며, 이러한 증상의 근원을 완화시키거나 예방하는 것을 포함한다. 즉, 당해 용어는 자가면역 또는 병원체-유발된 면역병리학 병 또는 증상, 또는 이러한 질병 또는 증상으로 진행될 잠재력을 지닌 척추 동물 대상체에 대해 유리한 결과가 부과됨을 나타낸다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "치료학적 유효량" 또는 "유효량"은 단독으로, 또는 추가의 치료체와 함께 세포, 조직 또는 대상체에 투여되는 경우, 자가면역병 또는 병원체-유발된 면역병리학 관련 질병 또는 상태, 또는 당해 질병의 진행을 예방하거나 완화하는데 효과적인 IL-10 특이적인 항체의 양을 말한다. 치료학적 유효 투여량은 또한 증상들의 완화, 예를 들면, 관련 의학 상태의 치료, 치유, 예방 또는 완화, 또는 이러한 상태의 치료, 치유, 예방 또는 완화율의 증가를 초래하기에 충분한 화합물의 양을 말한다. 단독 투여된 개개의 활성 성분에 적용되는 경우, 치료학적 유효 투여량은 성분 단독을 말한다. 조합물에 적용되는 경우, 치료학적 유효 투여량은 조합적으로, 연속으로 또는 동시에 투여하는 것에 상관없이 치료학적 효과를 생성하는 활성 성분의 조합된 양을 말한다.
본 발명의 방법에 유용한 항체(재조합체 및 비-재조합체 공급원을 포함하나 이에 한정되지 않는 공급원으로부터 기원한 어떠한 공급원으로부터)는 자체로서 또는 각종 질환을 치료하거나 완화시키기 위한 투여량으로 적합한 담체 또는 부형제와 혼합된 경우 약제학적 조성물로서 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 (단백질 및 담체외에) 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 및 당해 분야에 잘 공지된 기타 물질을 함유할 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용되는"은 활성 성분(들)의 생물학적 활성의 효능을 방해하지 않는 비-독성 물질을 의미한다. 담체의 특징은 투여 경로에 의존할 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 기타 면역제어제 또는 면역조절제를 함유할 수 있다. 어떠한 적합한 면역제어제도 사용할 수 있으며, 소염제, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 타크롤리무스(예: FK-506), 시롤리무스, 인터페론, 가용성 사이토킨 수용체(예: sTNRF 및 sIL-1R), 사이토킨 활성을 중화시키는 제제(예: 인플릭스마브, 에타너셉트), 마이코페놀레이트 모페틸, 15-데옥시스페르구알린, 탈리도마이드, 글라티라머, 아자티오프린, 레플루노마이드, 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 약제학적 조성물은 또한 광치료요법 및 조사와 같은 기타 치료학적 양식과 함께 사용할 수 있다.
다른 양태에서, 본원에 제공된 방법의 검정을 수행하기 위해 필요한 시약을 함유하는 키트가 제공된다. 상세하게는 본원에서는 하나 이상의 용기를 함유하는 구획 키트가 제공되며, 여기서, 제1 용기는 IL-10에 특이적인 하나 이상의 항체를 포함하고, 하나 이상의 다른 용기는 하나 이상의 재구성 시약, 투여 시약을 포함한다. 용기는 유리, 플라스틱, 또는 플라스틱 또는 제지의 스트립(strip)일 수 있다. 하나의 양태에서, 키트는 또한 기록 지침서(written instruction)를 함유한다.
본원에 제공된 치료 또는 사용 방법을 실행하는데 있어서, 본원에 제공된 항체의 치료학적 유효량이 IL-10을 사용한 치료에 적합한 상태를 지닌 포유동물에게 투여된다. 항체는 본원의 방법에 따라 단독으로 또는 다른 면역조절 인자(예: 사이토킨), 면역제어제 등을 사용하는 치료와 같은 다른 치료요법과 함께 투여할 수 있다. 하나 이상의 생물학적 활성제를 공-투여하는 경우, 본원에 제공된 항체는 생물학적 활성제(들)와 동시에 또는 연속적으로 투여할 수 있다. 연속 투여하는 경우, 주치의는 생물학적 활성제(들)와 함께 본 발명의 단백질의 적절한 투여 순서를 결정할 것이다.
단독으로 또는 면역제어제와 함께 투여된 항체 조성물의 독성 및 치료학적 효능은 세포 배양물 또는 시험 동물에서, 예를 들면 LD50(집단의 50%가 치사되는 투여량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 효과적인 투여량)을 측정하기 위한 표준 약제학적 과정으로 측정할 수 있다. 독성 및 치료학적 효과 사이의 투여량 비가 치료학적 지표이며, 이는 LD50 및 ED50사이의 비로 나타낼 수 있다. 높은 치료학적 지표를 나타내는 항체가 바람직하다. 이러한 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이타는 사람에서 사용하기 위한 용량 범위를 제형화하는데 사용할 수 있다. 이러한 화합물의 용량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위내에 있다. 용량은 사용된 용량형 및 이용된 투여 경로에 따라 당해 범위내에서 변할 수 있다.
본 방법의 항체의 제형화 및 투여를 위한 기술은 문헌(참조: REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 최근 저서)에서 찾을 수 있다. 투여 유형은 특히 중요하지 않다. 적합한 투여 경로는 예를 들면 경구, 직장, 경점막 또는 장내 투여; 근육내, 피하, 골수내 주사, 및 경막내, 직접적인 내실내, 정맥내, 복강내, 비강내 또는 안구내 주사를 포함하는 비경구 전달을 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 사용되거나 또는 본 발명의 방법을 실행하기 위해 사용된 항체의 투여는 경구 소화, 흡입, 국소 적용 또는 피부, 피하, 복강내, 비경구, 동맥내 또는 정맥내 주사와 같은 각종 통상의 방법으로 수행할 수 있다. 환자에게 정맥내 투여하는 것이 바람직하다.
달리는, 예를 들면 흔히 데포트(depot) 또는 서방성 제형으로 면역병리학으로 특징화되는 병원체-유발된 병변 또는 관절내에 직접 항체를 주입함을 통해 전신계 방식보다는 국소로 항체를 투여할 수 있다. 또한, 항체를 예를 들면, 면역병리학에 의해 특징화되는 병원체-유발된 병변 또는 관절을 표적화하는 조직-특이적인 항체로 피복된 리포좀속에 표적화된 약물 전달 시스템으로 투여할 수 있다. 리포좀은 고통을 받는 조직에 의해 표적화되고 선택적으로 취해진다.
본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 활성 화합물을 약제학적으로 사용할 수 있는 제제로 가공하는 것을 촉진하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상의 방식으로 제형화할 수 있다. 이들 약제학적 조성물은 자체 공지된 방식, 예를 들면 통상의 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 레비게이팅(levigating), 유화, 캅셀화, 트래핑화(entrapping) 또는 동결건조 과정으로 제조할 수 있다. 적절한 제형화는 선택된 투여 경로에 따라 좌우된다. 액체형으로 투여하는 경우, 물, 석유, 동물 또는 식물 기원의 오일, 예를 들면, 땅콩 오일, 광 오일, 대두 오일 또는 참깨 오일, 또는 합성 오일과 같은 액체 담체를 가할 수 있다. 약제학적 조성물의 액체형은 생리학적 염수 용액, 덱스트로즈 또는 기타 사카라이드 용액, 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜을 추가로 함유할 수 있다. 액체형으로 투여하는 경우, 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질 약 0.5 내지 90중량%, 및 바람직하게는 본 발명의 단백질 약 1 내지 50중량%를 함유한다.
본원의 치료학적 유효량의 항체를 정맥내, 피부 또는 피하 주사에 의해 투여하는 경우, 본 발명의 단백질은 피로겐이 없는, 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 것이다. pH, 등장성, 안정성 등을 지닌 이러한 비경구적으로 허용되는 단백질 용액의 제제는 당해 분야의 숙련가의 기술내에 있다. 정맥내, 피부 또는 피하 주사용의 바람직한 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질외에, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 덱스트로즈 주사액, 덱스트로즈 및 염화나트륨 주사액, 락테이트화된 링거 주사액과 같은 등장성 비히클, 또는 당해 분야에 공지된 기타 비히클을 함유해야 한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 안정화제, 방부제, 완충제, 항산화제 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기타 첨가제를 함유할 수 있다. 주사용으로, 본 발명의 제제는 수용액, 바람직하게는 행크스액(Hanks' solution), 링거액, 또는 생리학적 염수 완충액과 같은 생리학적으로 허용되는 완충액 속에서 제형화할 수 있다. 경점막 투여용으로, 침투할 장벽에 대해 적절한 침투제를 제형중에 사용한다. 이러한 침투제는 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 방법에 따라 사용하기 위한 항체는 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 가스를 사용하여 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 형태로 편리하게 전달한다. 가압된 에어로졸의 경우에, 용량 단위는 밸브를 제공하여 계량된 양을 전달함으로써 측정할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 예를 들면, 젤라틴의 캅셀제 또는 카트리지는 화합물과 적합한 분말 기재, 예를 들면, 락토즈 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다. 화합물은 주사, 예를 들면, 거환 주사 또는 연속 주입에 의해 비경구 투여용으로 제형화할 수 있다. 주입용 제형은 단위 용량형, 예를 들면, 앰풀 또는 다-투여량 용기내에 첨가된 방부제와 함께 제공할 수 있다. 조성물은 오일성 또는 수성 비히클중 현탁제, 액제 또는 유제 형태를 취할 수 있고, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다.
비경구 투여용 약제학적 제형은 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 오일성 주사 현탁액으로 제조할 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 참깨 오일과 같은 지방 오일, 또는 에틸 올레이트 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 화합물의 가용성을 증가시킴으로써 고 농축 용액의 제조를 허용하는 제제 또는 적합한 안정화제를 함유할 수 있다. 또한, 활성 성분은 사용전에 적합한 비히클, 예를 들면, 피로겐이 없는 멸균수를 사용하여 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 기술된 방법에 유용한 항체의 양은 치료하는 상태의 특성 및 중증도, 및 치료전 환자가 겪는 특성에 따를 것이다. 궁극적으로, 주치의는 각각의 개인 환자를 치료하기 위해 본 발명의 단백질의 양을 결정할 것이다. 용량은 개개 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 변할 것으로 예측된다. 초기에, 주치의는 본 발명의 방법의 항체의 낮은 투여량을 투여하고 환자의 반응을 관측할 것이다. 본 발명의 보다 많은 투여량의 항체를, 최적 치료 효과가 환자에 대해 수득될 때까지 및 투여가 추가로 증가되지 않는 시점에서 투여할 수 있다. 본원의 방법을 실행하기 위해 사용된 각종 약제학적 조성물은 체중 kg당 본 발명의 항체 약 0.01㎍ 내지 약 100mg(바람직하게는 약 0.1㎍ 내지 약 10mg, 더욱 바람직하게는 약 0.1㎍ 내지 약 1mg)을 함유해야 한다. 투여하는 경우, 본 발명에서 사용하기 위한 치료학적 조성물은 피로겐이 없는 생리학적으로 허용되는 형태이다. 상술한 바와 같은 조성물중에 임의로 포함될 수도 있는 본 발명의 방법의 항체외의 치료학적으로 유용한 제제가, 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 방법에서 조성물과 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 용량은 환자의 상태 측면에서 개개 전문의에 의해 선택될 수 있다[참조: Fingl et al., THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (최근 저서)]. 용량 및 간격은 목적하는 치료학적 효과를 유지하기에 충분한 활성 잔기의 혈장 수준, 또는 최소 유효 농도(MEC)을 제공하기 위해 개별적으로 조절될 수 있다. MEC는 각각의 화합물에 대해 변할 수 있으나 시험관내 데이타, 예를 들어, 본원에 기술된 분석을 사용하여 생물학적 활성을 50 내지 90%를 억제시키는데 필요한 농도로부터 추정할 수 있다.
본원에 제공된 항체는 단독으로 또는 다른 치료학적 양식과 조합하여 투여할 수 있다. 본원에서 제공된 항체는 또한 단독으로, 또는 IL-10 활성의 억제제로서 또는 기타 면역제어제로서 확인된 다른 항원과 함께 투여할 수 있다.
자가면역성이 관여된 어떠한 질병도 본 발명의 방법으로 치료할 수 있다. 바람직하게는, IL-10 특이적인 항체를 사용한 치료를 위해 표적화된 자가면역 질병은 비정상적인 IL-10 발현 수준 및/또는 적절한 세포성, 즉, Th1-매개된 반응의 결여에 의해 특성화된다. 이러한 질병은 전신홍반루푸스(SLE), 면역혈소판감소자색반(ITC), 루푸스 신장염, 당뇨병, 인슐린-의존성 진성 당뇨병(IDDM), 류마티스 관절염(RA)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
병원체-유발된 면역병리학이 관여하는 어떠한 질병도 본 발명의 방법으로 치료할 수 있다. 바람직하게는, IL-10 특이적인 항체로 치료하기 위해 표적화된 병원체-유발된 면역병리학은 비정상적인 IL-10 발현 수준 및/또는 적절한 세포성, 즉 Th1-매개된 반응의 결여로 특성화된다. 이러한 질병은 HIV, C형 간염, 내장리슈만편모충증, 말라리아증, 사상충증, 나병, 결핵, 칸디다증 및 엠. 아비움(M. avium) 감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 광범위한 영역은 이러한 특정 양태에 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는 하기 실시예를 참조로 잘 이해된다.
실시예
실시예 I 일반적인 방법
일부 표준 방법은 문헌[참조: Maniatis, et al. (1982) MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, (2d ed.), vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., BIOLOGY, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; or Ausubel, et al. (1987 및 보충물) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene/Wiley, New York]에 기술되어 있다. 단백질 정제 방법은 황산암모늄 침전, 컬럼 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 결정화 및 기타 방법과 같은 방법을 포함한다[참조: Ausubel, et al. (1987 주기적인 보충물); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" in METH. ENZYMOL., vol. 182 및 당해 시리즈의 다른 권; 및 단백질 정제 제품의 사용에 있어서의 제조업자의 문헌, 예를 들면, 미국 뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 파마시아(Pharmacia) 또는 캘리포니아주 리치몬드 소재의 바이오-라드(Bio-Rad)]. 재조합체 기술과의 조합은 적절한 단편, 예를 들면, 프로테아제-제거가능한 서열을 통해 융합될 수 있는 FLAG 서열 또는 등량체에 대한 융합을 허용한다[참조: Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent"in Setlow (ed.) GENETIC ENGINEERING, PRINCIPLE AND METHODS 12: 87-98, Plenum Press, N. Y.; 및 Crowe, et al. (1992) QIAEXPRESS: THE HIGH LEVEL EXPRESSION & PROTEIN PURIFICATION SYSTEM, Qiagen, Inc., Chatsworth, CA].
컴퓨터 서열 분석은 예를 들면 GCG(U. Wisconsin) 및 진뱅크(GenBank) 공급원으로부터의 것을 포함하는 시판되는 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행한다. 공개된 서열 데이타베이스, 예를 들면, 진뱅크 및 기타의 것이 또한 사용된다.
실시예 II 항-사람 IL-10 항체의 사람화
랫트 항-사람 IL-10 항체, 12G8의 사람화를 상기 C 단락에서 기술한 바와 같이 수행하였다. 도 1은 시험하는 배선 서열과 동일한 잔기 위치에 대한 잔기 번호 지정 및 상응하는 점수의 지정을 나타낸다. 계산은 12G8 항-사람 IL-10 항체의 경쇄(도 1a) 및 중쇄(도 1b)의 12G8 가변 영역 및 11D8 항-사람 IL-10 항체의 경쇄(도 1c) 및 중쇄(도 1d)의 가변 영역에 대해 나타낸다.
실시예 III 12G8, 항-사람 IL-10 항체의 약력학
목적: 쥐 모델에서 12F8에 대한 생체내 말단 반감기 및 피하 생이용성을 평가하기 위하여.
항체: 10mM Na 아세테이트, 8% 슈크로즈, pH 5.25의 비히클중에 투여된 항체
마우스: 챨스 리버 래보러토리스(Charles River Laboratories)로부터 시판되는 Crl:CD-1？(ICR)BR 암컷 마우스.
실험 설계: 항체를 정맥내(외측 꼬리 정맥) 또는 피하(목덜미 또는 어깨뼈 또는 측면 옆구리에 피하 주사)로 하나의 거환으로 마우스에 주입하였다. 항체 투여량은 마우스당 0.03, 0.3, 3.0 및 30mg/kg을 포함한다. 마우스를 주입후 28일까지 관측하였다. 이 시기 동안에, 마우스를 칭량하고 혈청 샘플을 취하였다. 12G8(SCH 708980) 그룹(그룹 1 내지 8)에 대한 혈청 샘플을 5마리의 마우스/싯점을 사용하여 주입후 0.5, 1, 3, 6, 10, 16시간, 및 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 21 및 28일째에 취하였다. 비히클 그룹(그룹 9)에서, 혈청 샘플을 주사 전, 주사 후 1시간째에, 14일 후 또는 21일 후 단지 5마리의 마우스/싯점을 사용하여 취하였다. 혈청 IL-10 수준 및 혈청 12G8 항체 수준을 특정 ELISA로 측정하였다.
약력학적 매개변수 측정.
모든 매개변수를 프로그램(WinNonlin Pro v 4.0)을 사용하여 평가하고 계산하였다. 비구획화 분석을 위해, 모델 200(SC) 또는 모델 201(IV)을 사용하였다. 입력 데이타는 투여량-정상화된 그룹 대수 평균 농도-시간 데이타였다. 입력 투여량은 그룹 2 내지 4 및 6 내지 8에 대한 명목 투여량이었다. 그룹 1 및 5에 대한 입력 투여량은 0.014mg/kg이었다. 구획화 분석을 위해, 모델 3(SC) 또는 모델 7(IV)을 사용하였다. 입력 데이타는 투여량-정상화된 개개 동물 농도-시간 데이타였다. 모든 피트(fit)를 개개의 데이타 점에 대한 균일한 칭량(wt=1)으로 사용하였다. 입력 투여량은 그룹 2 내지 4 및 6 내지 8에 대한 명목 투여량이었다. 그룹 1 및 5에 대한 도입 투여량은 0.014mg/kg이었다. 우수한 피트를 가시적인 관찰, 추정된/계산된 매개변수, 잔기 및 AIC & SBC 범주에 대한 SE의 비교를 사용하여 평가하였다.
투여 용액 회수의 요약은 하기 표에 나타낸다.
[표 9]
체중, 투여량 수준, 및 투여량 용액 농도(평균 ± SD)의 요약
Figure pat00013
하기 나타낸 표는 정맥내 주입을 통한 12G8 항체를 제공받는 그룹으로부터의 데이타를 요약한 것이다.
[표 10]
정맥내 거환제 투여 그룹에 대한 비구획법 매개변수
[표 11]
정맥내 거환제 투여 그룹에 대한 구획법 매개변수
Figure pat00015
하기 나타낸 표는 피하 주입을 통한 12F8 항체를 투여받은 그룹으로부터의 데이타를 요약한 것이다.
[표 12]
피하 거환제 투여 그룹에 대한 비구획법 매개 변수
Figure pat00016
* 생이용성은 과소견적된 정맥내 AUC로 인하여 높을 수 있다.
[표 13]
피하 거환제 투여 그룹에 대한 구획법 매개변수
Figure pat00017
농도-시간 프로파일은 도 2에서의 각종 용량 및 경로를 사용하여 12F8 항체에 대해 나타낸다.
결론: 투여량은 최저 투여량 수준을 제외한 모든 그룹에 대한 명목치의 20%였다. 아마도 SCH708980(사람화된 12G8) 항체의 존재로 인한 예측한 농도보다 낮은 농도가 그룹 7 또는 8에서 주입후 10일째부터 관측되었다. (A) 정맥내 거환 약력학. 반감기, 청소량 및 분포량은 다른 IgG1 모노클로날 항체에 대해 관측된 것을 대표한다. 분포 용량은 최소 혈관외 분포를 제안하는 혈청 용량과 대략 동일하거나 약간 더 높다. 말기 반감기는 10일 내지 17일의 범위였다. AUC에 있어서의 증가는 일반적으로 투여량에 비례하며 이는 시험한 투여량 범위에 걸쳐 선형 PK를 제안하고 있다. (B) 피하내 거환 약력학. 최대 농도는 일반적으로 투여량과 비례하며 투여 후 1 내지 2일째에 도달하며, 이는 시험한 투여량 범위에 걸친 지속적인 흡수율 및 흡수 정도를 제안한다. AUC에서의 증가는 일반적으로 투여량에 비례하였으며 이는 일반적으로 선형 PK를 제안한다. 말기 제거 반감기는 다른 IgG1 모노클로날 항체와 유사한 8 내지 14일 범위였다. 절대 생이용성은 70 내지 100%의 범위로 높지만, 90% 초과의 추정치는 정맥내 AUC의 과소견적으로 인하여 높을 수 있다.
실시예 IV. KinExA 기술을 사용한 사람화된 항-사람 IL-10 항체 SCH 708980(12G8)에 대한 평형 해리 상수(Kd)의 측정
사람화된 항체 SCH 708980에 대한 평형 해리 상수(Kd)를 KinExA 3000[사피다인 인스트루먼츠 인코포레이티드(Sapidyne Instruments Inc.) 제조원]을 사용하여 측정하였다. KinExA는 항체, 항원 및 항체-항원 복합체의 혼합물중 복합화되지 않은 항체의 농도를 측정하는 것을 기본으로 하는 역학적 배제 검정의 원리를 이용한다. 유리 항체의 농도는 당해 혼합물을 짧은 기간 동안 고체-상 고정된 항원에 노출시킴으로써 측정한다. 실제로, 이는 유동 셀 내에 트래핑된 항원 피복된 입자를 통과하여 용액상 항원-항체 혼합물을 유동시킴으로써 달성된다. 당해 장치에 의해 생성된 데이타는 통상의 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 평형 상수는 다음 추정을 기준으로 하는 수학적 이론을 사용하여 계산하였다:
1. 결합은 평형에 대한 가역적인 결합 방정식을 따른다:
Kon[Ab][Ag] = Koff[AbAg]
2. 항체 및 항원은 1 : 1로 결합하며, 총 항체는 항원-항체 복합체 + 유리 항체이다.
3. 장치 신호는 유리 항체 농도에 선형으로 관련되어 있다.
사용된 물질: 모노클로날 사람화된 항체 SCH 708980 내지 재조합체 사람 IL-10(h12G8); 재조합체 사람 IL-10(hIL-10); 재조합체 마우스 IL-10(mIL-10), 재조합체 시노 IL-10(cyno IL-10); PMMA 입자, 98 마이크론[사피딘(Sapidyne) 제조원, 제품 번호 제440198호]; 뉴트라비딘[피어스(Pierce) 제조원, 제품 번호 제31000호]; EZ-링크 TFP PEO-바이오틴[피어스 제조원, 제품 번호 제21219호]; 바이오티닐화된 rhIL-10; 및 Cy5 접합된 염소 항-HuIgG (H + L)[잭슨 임뮤노리서치 래보러토리즈(Jackson Immunoresearch laboratories) 제조원, 제품 번호 제109-175-088호, lot 49069].
PMMA 입자를 제조업자의 프로토콜에 따라 바이오티닐화된 rhIL5로 피복시켰다. rhIL5 EZ-링크 TFP의 바이오티닐화를 위해 PEO-바이오틴을 제조업자의 추천(Pierce bulletin 0874)에 따라 사용하였다. 모든 실험 과정을 KinExA 3000 매뉴얼에 따라 수행하였다.
실험 조건: 모든 수행을 2번 시행하였다. hIL-10 수행의 경우 다음 조건이 사용되었다:
샘플 용적: 1.5ml
샘플 유동 속도: 0.25ml/분
표지 용적: 0.5ml
표지 유동 속도: 0.25ml/분
mAb 농도: 0.1nM
최대 Ag(hIL-10) 농도: 4.0nM
최소 Ag(hIL-10) 농도: 3.91pM
항원의 2배 일련 희석물을 제조하고 고정 농도에서 항체와 혼합하였다. 혼합물을 실온(RT)에서 2시간 동안 항온처리하여 평형화하였다.
mIL-10 수행의 경우 다음 조건을 사용하였다:
샘플 용적: 0.5ml
샘플 유동 속도: 0.25ml/분
표지 용적: 0.5ml
표지 유동 속도: 0.25ml/분
mAb 농도: 1nM
최대 Ag(mIL-10) 농도: 50nM
최소 Ag(mIL-10) 농도: 48.8pM
항원의 2배 일련 희석물을 제조하고 고정 농도에서 항체와 혼합하였다. 혼합물을 실온(RT)에서 2시간 동안 항온처리하여 평형화하였다.
cyno IL-10의 경우 다음 조건을 사용하였다:
샘플 용적: 2ml
샘플 유동 속도: 0.25ml/분
표지 용적: 1ml
표지 유동 속도: 0.25ml/분
mAb 농도: 0.1nM
최대 Ag(mIL-10) 농도: 5.0nM
최소 Ag(mIL-10) 농도: 4.88pM
항원의 2배 일련 희석물을 제조하고 고정 농도에서 항체와 혼합하였다. 혼합물을 실온(RT)에서 2시간 동안 항온처리하여 평형화하였다.
결과를 하기 표에 나타낸다.
[표 14]
KinExA 기술을 사용한 12F8 항체에 대한 평형 해리 상수(Kd)
Figure pat00018
Figure pat00019
실시예 V. 상이한 기원의 재조합체 IL-10에 대한 항-hIL-10 모노클로날 항체 및 hIL-10-Ra의 결합을 측정하기 위한 경쟁적 전기화학발광 분석(ECLA)의 적용
기술의 요약. 전기화학발광 기술은 아이젠 인코포레이티드(IGEN, Inc. 미국 메릴랜드주 게이더스부르그 소재)에 의해 개발되었으며 당해 작업에서 사용된 M-시리즈 M8/384 분석기에서 사용한다. 전기화학발광 기술은 트리프로필아민(TPA)의 존재하에서 전압 적용시 전기화학발광을 생성하는 안정한 루테늄 금속 킬레이트(Ori-TAG)를 이용한다. 직경이 마이크론인 상자성 비드는 고체상으로 작용하여 신속한 분석 역학을 촉진한다. 비드/착물을 유동 셀을 통해 전달하고 자기 적용에 의해 전극에서 포획한다. 전압을 적용시키고 수득되는 전기화학발광을 측정한다.
사용된 물질. 96 웰 폴리프로필렌 플레이트[코스타(Costar) 제조원, 제품 번호 제3365호, 피셔 사이언스(Fisher Sci) 제조원, 제품 번호 제07200697호); 0.1% BSA, 0.05% 트윈 20, PBS pH 7.5의 검정 완충액; 상자성 비드[스트렙트아비딘-다이나비드, 인젠 인코포레이티드, 제품 번호 제110029호); 재조합체 사람 IL-10 이량체(hIL-10-이량체); 재조합체 사람 IL-10 단량체(hIL-10-모노); 재조합체 마우스 IL-10(mIL-10); 재조합체 시노 IL-10(시노 IL-10); 및 재조합체 hIL-10Ra(hIL-10Ra): FLAG-태그된 단백질. Ori-Tag 표지된 항-FLAG M2 모노클로날 항체를 Ori-Tag-NHS 에스테르(인젠 인코포레이티드, 제품 번호 제110034호)를 사용하여 제조업자의 프로토콜(OriTag 표지: IgG 챌린지 비 8:1)에 따라 제조하였다. 항-Flag M2 모노클로날 항체는 시그마(Sigma, 제품 번호 F3165)로 부터 시판되었다. Ori-Tag 표지된 항 hIgG 1A2 모노클로날 항체를 랫트 항 hIgG 모노클로날 항체를 사용하여 상기와 같이 제조하였다. Ori-Tag 표지된 항 랫트 IgG 항체를 상기와 같이 폴리클로날 염소 항 랫트 IgG(H+L) 항체[미국 필라델피아 소재의 잭슨 임뮤노리서치 래보러토리스 인코포레이티드(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.), 제품 번호 112-005-143]로부터 제조하였다. 바이오티닐화된 재조합체 사람 IL-10(hIL-10-바이오틴)을 제조업자의 추천(Pierce bulletin 0874)에 따라 TFP-PEO-바이오틴(Pierce, 제품 번호 제21219호)을 사용하여 제조하였다. 랫트 항 hIL-10mAb 12G8(r12G8):JES3.12G8 및 사람화된 항 hIL-10 mAb 12G8(h12G8-1)을 본원에 기술된 바와 같이 제조하였다.
프로토콜. 50 마이크로리터의 검정 완충액중 1/3의 일련 희석물을 최초 웰에서 3㎍/ml로 개시하여 모든 표지되지 않은 IL-10 제제(mIL-10, 시노 IL-10, hIL-10 이량체, hIL-10 모노)에 대한 96-웰 미세역가 플레이트속에서 제조하였다. 모든 샘플을 2회 수행하였다. 25ng/ml의 hIL-10 바이오틴 50㎕를 각각의 웰에 가한 후 hIL-10Ra(100ng/ml에서 50㎕) 또는 항 hIL-10 mAb(10ng/ml에서 50㎕)를 첨가하였다. 50㎕의 Ori-Tag 접합된 제2 항체를 각각의 웰에 500ng/ml의 농도에서 가하였다. hIL-10Ra, r12G8 및 h12G8의 경우 다음의 접합된 Ori-Tag를 상응하게 사용하였다: 항-FLAG M2-OriTag, 항-랫트 IgG-OriTag 및 항 hIgG 1A2-OriTag. 최종적으로 각각의 웰에 50㎕의 스트렙트아비딘-다이나비드를 0.1mg/ml에서 가하였다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한 후 플레이트를 M-시리즈 M8/384 분석기로 가공하였다. 표지되지 않은 IL-10에 의한 시그날의 억제 퍼센트를 대조군 샘플에 대해 계산하였다. 데이타를 플롯팅하고 IC50을 계산하기 위해 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하였다.
결과를 하기 표에 나타낸다
[표 15]
ECLA를 사용한 결합 친화성 측정
Figure pat00020
Figure pat00021
랫트 12G8 항체 및 사람화된 12G8 항체(SCH708980)의 특성화의 결과를 하기 표에 요약한다.
[표 16]
Figure pat00022
실시예 VI. 생체내에서 사람화된 항-사람 IL-10 항체의 중화 효과
SCH 708980 및 JES.12G8의 생체내 중화 효능을 마우스내 레이슈마니아 주요 모델(Leishmania major model)에서 평가하였다. 당해 모델에서, 일반적으로 기생충 감염에 대해 내성인 CB6F1 마우스는 MHC II 부류 프로모터의 제어하에서 사람 IL-10 유전자도입에 대한 이형접합에 의해 민감하게 되었다. CB6F1 또는 CB6F1-huIL-10Tg 마우스를 15x106 정체상 엘. 마이어(L. major) 기생충을 사용한 발바닥 피하 챌린지전 3일째에 개시하여 주마다 SCH 708980 또는 JES.12G8을 피하 주사하였다. 질병 진행은 발바닥 팽윤을 주마다 측정하여 모니터하였다. 도 3은, SCH708980(사람화된 12G8) 및 모체 랫트 12G8 둘다가 투여량 의존적 방식으로 IL-10의 보호 효과를 중화시켰음을 나타낸다.
본 발명의 많은 변형 및 변화는 당해 분야의 숙련가에게 명백해지는 바와 같이 이의 취지 및 영역에 벗어남이 없이 이루어질 수 있다. 본원에 기술된 특정 양태는 단지 실시예로 제공되며, 본 발명은 첨부된 청구의 범위의 측면에서 이러한 청구의 범위가 부여된 완전한 범위의 등량체와 함께 제한되며; 본 발명은 실시예의 방법에 의해 본원에 제공된 특정 양태로 제한되지는 않는다.
상기 공보 또는 서류의 인용은 이중 어느 것도 선행 분야에 해당된다는 승인으로 요구되는 것이 아니며 이들 공보 또는 서류의 내용 또는 날짜에 대한 어떠한 승인으로서 요구되는 것도 아니다. 본원에 언급된 미국 특허 및 기타 공보는 본원에 참조로 인용된다.
ATCC PTA-5922 20040420 ATCC PTA-5923 20040420 ATCC PTA-5924 20040420 ATCC PTA-5925 20040420 ATCC PTA-5926 20040420 ATCC PTA-5927 20040420
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Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 His Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Leu Asp Ala Thr Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Arg Gly Phe Ser Val Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly 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gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347 <210> 21 <211> 654 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gagccagtga aagtgttgat gattatggcc atagttttat gcactggtac 120 cagcagaaac ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatc gtgcatccac cctagaatct 180 ggcatcccag acaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc 240 agactggagc ctgaagattt tgcagtgtat tactgtcagc aaggtaatga ggatccgtgg 300 acgttcggtc aaggtaccaa ggtggaaatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654 <210> 22 <211> 1344 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggttt ctcattaaca aactatggtg tacactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtg atatggagtg gtggaagcac agactataat 180 gcagctttca tatcccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aaataggggg 300 tacgacgtct actttgacta ctggggccaa ggcacccttg tcacagtctc gtcggctagc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320 agcctctccc tgtctccggg taaa 1344 <210> 23 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric 12G8 <400> 23 Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala 1 5 10 15 Met Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Thr Ser Gln Asn Ile 35 40 45 Phe Glu Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Arg Glu Pro Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Phe Asn Ala Ser Pro Leu Gln Ala Gly Ile Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser 85 90 95 Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Tyr Tyr Ser 100 105 110 Gly Tyr Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val 115 120 125 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 130 135 140 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 145 150 155 160 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 165 170 175 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 180 185 190 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 195 200 205 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 210 215 220 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 24 <211> 371 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chimeric 12G8 <400> 24 Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Phe Met Lys Asp 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp Tyr His Met Ala Trp Val Arg Gln Ser Pro Asp Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Leu Asp Ala Thr Tyr Thr Tyr Tyr Arg 65 70 75 80 Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Lys Thr 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Phe Tyr Cys Thr Arg His Arg Gly Phe Ser Val Trp Leu Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 245 250 255 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Tyr Thr 370 <210> 25 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chimeric 12G8 <400> 25 atggctccag ttcaactttt agggcttttg gtgctcttcc tcccagccat gagatgtgac 60 atccagatga cccagtctcc ttcactcctg tctgcatctg tgggagacag agtcactctc 120 aactgcaaga caagtcagaa catttttgag aacttggcct ggtatcagca aaagcttaga 180 gaacctccca aactcctgat ttttaatgca agccctttgc aagcgggcat cccttcaagg 240 ttcagtggca gtggatctgg tacagatttc acactcacca tcaccagcct gcagcctgag 300 gatgttgcca catatttctg ccaccagtat tatagcgggt acacgtttgg acctgggacc 360 aagctggaac tgaaacgtac ggtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 420 gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga 480 gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt 540 gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc 600 aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 660 tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttaa 699 <210> 26 <211> 1113 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Chimeric 12G8 <400> 26 atggacatca ggctcagctt ggttttcctt gtccttttta tgaaagatgt ccagtgtgag 60 gtgcagttgg tggagtctgg aggaggcttg gtgcggcctg gagggtccct gagactctcc 120 tgtacagcct caggattcac tttcagtgac tatcacatgg cctgggtccg ccagtctcca 180 gacaagggtc tggagtgggt cgcaagcatt actcttgatg ctacctacac ttactatcgc 240 gactccgtga ggggccgatt caccatctcc cgaaataatg caaaaaccac cctttacctg 300 caaatggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttttt actgtacaag acatcgaggc 360 tttagcgtct ggcttgatta ctggggccaa ggagtcatgg tcactgtctc ttcagctagc 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac acc 1113

Claims (25)

  1. CDR1에서 서열 11, CDR2에서 서열 12 및 CDR3에서 서열 13으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 및 골격 영역(여기서, 골격 영역의 아미노산 서열은 모든 또는 실질적으로 모든 사람 면역글로불린 아미노산 서열이다)을 포함하는 하나 이상의 항체 경쇄 또는 이의 결합 단편; 및
    CDR1에서 서열 15, CDR2에서 서열 16 및 CDR3에서 서열 17의 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 및 골격 영역(여기서, 골격 영역의 아미노산 서열은 모든 또는 실질적으로 모든 사람 면역글로불린 아미노산 서열이다)을 포함하는 하나 이상의 항체 중쇄 또는 이의 결합 단편을 포함하는, IL-10과 결합하는 사람화된 재조합 항체 분자, 또는 이의 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, γ1, γ2, γ3 또는 γ4 사람 중쇄 고정 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 고정 영역을 추가로 포함하는 항체.
  3. 제1항에 있어서, 람다 또는 카파 사람 경쇄 고정 영역을 포함하는 경쇄 고정 영역을 추가로 포함하는 항체.
  4. 제1항에 있어서, 결합 단편이 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, 및 디아바디(diabody)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항체 단편인 항체.
  5. 제1항에 있어서, 항체 경쇄, 또는 이의 결합 단편이 서열 14의 가변 영역 및 고정 영역을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 항체.
  6. 제1항에 있어서, 항체 중쇄, 또는 이의 결합 단편이 서열 18의 가변 영역 및 고정 영역을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 항체.
  7. CDR1에서 서열 11, CDR2에서 서열 12 및 CDR3에서 서열 13의 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 항체 경쇄 또는 이의 결합 단편; 및 CDR1에서 서열 15, CDR2에서 서열 16 및 CDR3에서 서열 17의 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 하나 이상의 항체 중쇄 또는 이의 결합 단편을 포함하는, IL-10과 결합하는 키메라 재조합 항체 분자, 또는 이의 결합 단편.
  8. 면역 반응을 제어할 필요가 있는 사람 대상체에게 제1항 또는 제7항에 따른, IL-10에 특이적인 항체 또는 이의 결합 단편을, IL-10의 생물학적 활성을 차단하기에 효과적인 양으로 투여함을 포함하여, 사람 대상체에서 면역 반응을 제어하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 면역 반응이 체액성 반응인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 대상체가 전신홍반루푸스를 지니는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 대상체가 면역 혈소판감소자색반(ITC)을 지니는 방법.
  12. 제8항에 있어서, 대상체가 루푸스 신장염을 지니는 방법.
  13. 제8항에 있어서, 대상체가 HIV를 지니는 방법.
  14. 제8항에 있어서, 대상체가 C형 간염을 지니는 방법.
  15. 제8항에 있어서, 면역제어제를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  16. 제1항 또는 제7항의 항체, 또는 이의 결합 단편을 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 면역제어제를 추가로 포함하는 조성물.
  18. 제1항 또는 제7항의 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산.
  19. 벡터로 형질감염된 숙주 세포에 의해 인지된 조절 서열에 작동적으로 결합된 제18항에 따른 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  20. 제19항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  21. 핵산 서열이 발현되는 조건하에서 제20항에 따른 숙주 세포를 배양함으로써 폴리펩타이드를 생산하고, 당해 폴리펩타이드를 숙주 세포로부터 회수함을 포함하는, 폴리펩타이드의 생산 방법.
  22. 서열 21의 핵산 서열을 갖는 경쇄 및 서열 22의 핵산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는, IL-10에 특이적인 항체를 암호화하는 분리된 핵산 서열.
  23. 제22항에 있어서, 경쇄가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) 기탁 번호 제PTA-5927호를 갖고 중쇄가 ATCC 기탁 번호 제PTA-5926호를 갖는 핵산 서열.
  24. 제22항에 따른 핵산 서열에 의해 암호화된 항체의 결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산 서열.
  25. 제24항에 있어서, 결합 단편이 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, 및 디아바디로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항체 단편인 핵산 서열.
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