KR20210032401A

KR20210032401A - 항-il36r 항체

Info

Publication number: KR20210032401A
Application number: KR1020217002970A
Authority: KR
Inventors: 지네트 페어허스트; 엘레나 가노바; 윌리엄 올슨; 소콜 하쉬나스토
Original assignee: 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date: 2018-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2021-03-24
Also published as: IL280013A; US20200017592A1; PH12020552178A1; CN112513091A; AU2019306217A1; AU2019306217B2; US11267893B2; WO2020018503A2; BR112020027015A2; MX2021000566A; EP3823989A2; WO2020018503A3; JP2021530229A; CA3103531A1; JP7386224B2; SG11202012360YA

Abstract

본 발명은 인간 IL-36 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 및 항원 결합 단편(예: 인간 항체)을 제공한다. IL36R에 의해 매개되는 질환(예를 들어, 손발바닥 건선, 손발바닥 농포증, 전신 농포성 건선, 궤양성 대장염 또는 IBD와 같은 피부 또는 결장 염증성 병태)을 항체 및 단편을 사용해 치료하거나 예방하는 방법도, 항체 및 단편의 제조 방법과 함께 제공된다.

Description

항-IL36R 항체

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2018년 7월 16일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/698,482호; 2019년 5월 13일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/846,989호; 및 2019년 6월 25일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/866,028호의 이익을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

기술분야

본 발명의 분야는, 부분적으로, IL-36 수용체에 결합하는 항체, 및 건선 또는 염증성 장 질환을 포함하는 염증성 장애를 치료하기 위한 이러한 항체의 용도에 관한 것이다.

참조에 의한 서열 목록의 통합

2019년 7월 15일에 생성되고, EFS-Web을 통해 미국 특허 상표청에 제출된 "36432_10484US01_SequenceListing"이란 명칭의 176 KB의 ASCII 텍스트 파일 내 서열 목록이 참조로써 본원에 포함된다.

인터루킨(IL)-36 사이토카인은 IL-36R 및 IL-1RAcP로 이루어진 공통 수용체에 결합하여 염증 반응을 자극하는 3가지 작용제, IL-36α, IL-36β, 및 IL-36γ를 포함한다. IL-36 수용체(IL-36R)는 사이토카인의 IL-1 계열의 하위 집합(IL-36α, IL-36β, 및 IL-36γ)에 대한 단일 통과 막 수용체이며, 이들 리간드 중 어느 하나에 결합할 때, NFκB 및 미토겐 활성화 키나아제를 포함하는 신호 전달 캐스케이드를 유도하는 이의 공동 수용체인 IL-1R 부속 단백질이 동원된다(Sims 등의 2010년 문헌 참조).

건선과 같은 일부 염증성 피부 질환의 매개체는 IL-36이다. 건선은 흔한 면역 매개성 염증성 피부 질환으로서, 변이체 판상 건선 및 전신성 농포 건선을 포함한다. 표준 치료 지침에는 국소 스테로이드, 국소 비타민 D, 전신 면역억제제 및 항종양 괴사 인자(TNF) α, 항-인터루킨(IL)-23 및 항-IL-17 항체와 같은 다양한 생물학적 제제의 사용이 포함된다. IL-36 구성원은 판상 건선의 병변 피부에서 과발현되며, IL-36R의 활성화는 TNF-α/IL-23/IL-17/IL-22 축과 함께 건선성 염증의 지속과 항구화에 기여할 수 있다. (Di Cesare 등의 문헌[The IL-23/Th17 axis in the immunopathogenesis of psoriasis, Journal of Investigative Dermatology 129: 1339-1350 (2009)] 및 Blumberg 등의 문헌[IL-1RL2 and its ligands contribute to the cytokine network in psoriasis. J Immunol 185: 4354-4362 (2010)] 참조).

그러나, 손발바닥 농포증(PPP) 및 손발바닥 농포 건선(PPPP)에 대해 현재 이용 가능한 치료제는 제한적이다. 스페솔리맙(Spesolimab) 및 ANB019는 임상 개발 단계에 있는 항-IL36R 항체이며, 면역원성 및 효능과 관련된 단점을 겪는 가지고 있다.

본 발명은 우수한 특성을 나타내는 항-IL36R 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 그룹 당 3마리의 시노몰구스 원숭이(0.5 및 5 mg/kg 피하 투여군; n=3/군)를 대상으로 한 약동학 연구에서, 본원에 제시된 항-IL36R 항체(예: H4H14708P2)가 항-IL36R 항체인 APE6155보다 약 1.2배 더 큰 노출을 나타낸다는 것이 관찰되었다. 또한, 예를 들어, IMQ 유도 피부 염증에서 피부 두께 및 병리학 점수를 감소시키고, 피부에서 전염증성 사이토카인을 감소시키는 데 있어서 APE6155가 본원에 제시된 항-IL36R 항체보다 더 적은 효능을 나타낸다는 것도 관찰되었다. 인간화 항-IL36R 항체인 스페솔리맙은 GPP를 가진 인간 대상체에서 높은 수준의 항-약물 항체를 나타냈다. 1상 임상시험에서, 1회 투여 후 2주차에 7명의 환자 중 3명에게서 항-약물 항체가 나타났고 20주차까지 지속되었다. 스페솔리맙의 이러한 특성은 만성 장기 치료에는 이상적이지 않을 것이다. Amin, First Data in GPP from Competitor Anti-IL36 Provides Proof of Concept of ANB019, Flash Note, Company Update, AnaptysBio, Jefferies (2018년 9월 16일). 본 발명의 인간 항-IL36R 항체는 인간에서 높은 면역원성을 가질 것으로 예상되지 않는다.

본 발명은 (i) 기준 항원 결합 단백질과 동일한 IL36R 상의 에피토프에 특이적으로 결합하거나; (ii) IL36R 폴리펩티드에 결합하기 위해 기준 항원 결합 단백질과 경쟁하는 항원 결합 단백질(예: 항체 또는 이의 항원 결합 단백질, 예를 들어, 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 다중 특이적 항체)를 제공하며, 여기서 기준 항원 결합 단백질은: (a) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154,170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린; 및/또는 (b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은: (i) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154,170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린; 및/또는 (ii) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 (a) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154,170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역; 및/또는 (b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은: (a) 서열 번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154,170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154,170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 중쇄 면역글로불린의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역 글로불린; 및/또는 (b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 경쇄 면역글로불린의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 다음을 포함하는 중쇄 면역글로불린을 포함한다: 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및/또는 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및/또는 서열번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및/또는 서열번호 52에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 54에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및/또는 서열번호 68에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 72에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및/또는 서열번호 84에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 86에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 88에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및/또는 서열번호 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 102에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 104에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및/또는 서열번호 116에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 118에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 120에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및/또는 서열번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 134에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 136에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및/또는 서열번호 140에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 142에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 144에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및/또는 서열번호 156에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 158에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 160에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및/또는 서열번호 172에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 174에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 176에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; 및/또는 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및/또는 서열번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및/또는 서열번호 44에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 46에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및/또는 서열번호 60에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 62에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및/또는 서열번호 76에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 80에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및/또는 서열번호 92에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 94에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 96에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및/또는 서열번호 108에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 112에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및/또는 서열번호 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 128에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및/또는 서열번호 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 128에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및/또는 서열번호 148에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 150에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 152에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및/또는 서열번호 164에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 166에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 168에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 및/또는 서열번호 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 128에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3. 　 본 발명의 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은: (1) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역; 및 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (2) 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역; 및 서열번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (3) 서열번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역; 및 서열번호 44에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 46에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (4) 서열번호 52에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 54에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역; 및 서열번호 60에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 62에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (5) 서열번호 68에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 70에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 72에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역; 및 서열번호 76에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 80에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (6) 서열번호 84에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 86에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 88에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역; 및 서열번호 92에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 94에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 96에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (7) 서열번호 100에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 102에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 104에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역; 및 서열번호 108에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 112에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (8) 서열번호 116에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 118에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 120에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역; 및 서열번호 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 128에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (9) 서열번호 132에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 134에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 136에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역; 및 서열번호 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 128에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (10) 서열번호 140에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 142에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 144에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역; 및 서열번호 148에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 150에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 152에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (11) 서열번호 156에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 158에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 160에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역; 및 서열번호 164에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 166에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 168에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; 또는 (12) 서열번호 172에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; 서열번호 174에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 서열번호 176에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역; 및 서열번호 124에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; 서열번호 126에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 서열번호 128에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함한다. 　 본 발명의 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 (a) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154,170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린; 및/또는 (b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산을 포함하는 경쇄 면역글로불린을 포함한다. 본 발명은 다음을 포함하는 항원 결합 단백질(예: 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 포함하며: (a) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (b) 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (c) 서열번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (d) 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (e) 서열번호 66에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 74에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (f) 서열번호 82에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 90에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (g) 서열번호 98에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 106에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (h) 서열번호 114에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 122에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (i) 서열번호 130에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 122에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (j) (c) 서열번호 138에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 146에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; (k) 서열번호 154에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역; 및/또는 (l) 서열번호 170에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 122에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변 영역 - 예를 들어, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 중쇄 불변 영역(예: IgG (예: IgG1 또는 IgG4))에 연결되고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 경쇄 불변 영역(예: 람다 또는 카파)에 연결된다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄 불변 영역은 인간 불변 영역이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질(예: 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은 다음을 포함한다: (a) 서열번호 180에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 182에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린; (b) 서열번호 184에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 186에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린; (c) 서열번호 188에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 190에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린; (d) 서열번호 192에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 194에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린; (e) 서열번호 196에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 198에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린; (f) 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 202에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린; (g) 서열번호 204에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 206에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린; (h) 서열번호 208에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 210에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린; (i) 서열번호 212에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 214에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린; (j) 서열번호 216에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 218에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린; (k) 서열번호 220에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 222에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린; 및/또는 (l) 서열번호 224에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 226에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린. 　

본 발명의 항원 결합 단백질은, 본 발명의 구현예에서, 다음 특성 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다:

· 25℃에서 약 2.18 nM 내지 약 13.9 nM의 K^D 또는 37℃에서 약 4.25 nM 내지 약 29.5 nM의 K_D로 인간 IL36R에 결합함;

· 25℃에서 약 7.87 nM 내지 약 34.4 nM의 K_D 또는 37℃에서 약 14.4 nM 내지 약 58.2 nM의 K_D로 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) IL36R에 결합함;

· 25℃에서 약 173 pM 내지 약 5.79 nM의 K^D 또는 37℃에서 약 205 pM 내지 약 28.7 nM의 K^D로 마우스 IgG2a에 융합된 인간 IL36R에 결합함;

· 25℃에서 약 212 pM 내지 약 14 nM의 K_D 또는 37℃에서 약 264 pM 내지 약 40.9 nM의 K_D로 마우스 IgG2a Fc 태그로 발현 된 IL1RAcP 세포 외 도메인에 융합된 인간 IL36R에 결합함;

· IL36R에 결합하기 위해 H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2와 경쟁함;

· IL-1RAcP 및 IL36R 리간드의 존재 하에, 숙주 세포(예를 들어, 인간 또는 필리핀 원숭이)에서 리포터 유전자에 융합되는 하나 이상의 NFκB 요소의 IL-36R에 의한 활성화를 차단함;

· 피부 염증을 예방 또는 개선하거나, 피부 염증을 앓고 있는 대상체에서 피부 두께 또는 총 병리 점수를 감소시키거나, 전염증성 사이토카인 수준을 감소시킴;

· 대장염 또는 결장 염증을 예방 또는 개선하거나, 이러한 대장염 또는 결장 염증을 가진 대상체에서 LCN2 폴리펩티드의 배설 수준을 감소시킴;

· 결합될 때, 서열번호 227에 제시된 인간 IL36R(IL-1RL2)의 잔기 (a) 113-119, 113-122, 116-119 및/또는 116-122; 및/또는 (b) 264-271, 267-271, 268-271, 268-276, 268-277 및/또는 271-276 (또는 야생형 IL-1RL2에서의 상응하는 잔기)이 펩신 및/또는 프로테아제 XIII로 인해 분해되지 않게 보호하고/하거나 중수소의 존재 하에 중수소화되지 않게 보호함;

· 본원에서 서열번호 227로 제시된 아미노산을 포함하는 인간 IL36R의 잔기 113-119, 113-122, 116-119, 116-122, 264-271, 267-271, 268-271, 268-276, 268-277 및/또는 271-276 (또는 야생형 IL-1RL2에서의 상응하는 잔기)에서 IL36R(IL-1RL2)(예: 인간 IL36R)에 결합함;

· 예를 들어, 약 80.0, 80.1, 81.0 또는 81.5%의 커버리지 또는 약 80~81 또는 80~82%의 커버리지로 IL36R(IL-1RL2)(예: 인간 IL36R)의 도메인 II에 결합함; 및/또는

· 아미노산 서열 YKQILHLGKD(서열번호 229)(서열번호 227의 아미노산 113-122)를 포함하는 폴리펩티드에 결합함;

· 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 nM 또는 1~6 nM의 IC₅₀으로 (예를 들어, 약 10 nM의 농도에서) 예를 들어, 시험관 내 표피 각질세포, 장 근섬유아세포 및/또는 CD14+ 단핵구에서 IL36α, IL36β 및/또는 IL36γ를 억제함; 및/또는

· Schild 검정 포맷으로 측정했을 때, IL36R에 의한 NFκB(예: HEK293과 같은 세포에서 NFκB 반응 요소 (5x)-루시퍼라제-IRES-GFP 리포터)의 IL36α, IL36β 및/또는 IL36γ 매개 활성화를 경쟁적으로 억제함.

본 발명의 항원 결합 단백질과 복합체화된 IL36R 폴리펩티드 또는 이의 항원 단편(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 다중특이적 항체)를 포함하는 복합체도 본 발명의 범주에 포함된다.

또한, 본 발명은 본 발명의 항원 결합 단백질(예: 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 다중특이적 항체) 또는 이의 면역글로불린 사슬을 만드는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (a) 상기 항원 결합 단백질의 면역글로불린 사슬을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포(예: 중국 햄스터 난소(CHO) 세포) 내로 도입하는 단계; (b) 폴리뉴클레오티드의 발현에 유리한 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 임의로, 숙주 세포 및/또는 숙주 세포가 성장하는 배지로부터 항원 결합 단백질 또는 면역글로불린 사슬을 단리하는 단계를 포함한다. 이러한 방법의 산물인 항원 결합 단백질 및 면역글로불린 사슬 또한 본 발명의 일부이다.

본 발명은 또한, (a) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154,170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 사슬의 면역글로불린 중쇄 가변 영역의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3; 및/또는 (b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 사슬의 면역글로불린 경쇄 가변 영역의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3; 또는 본원에 제시된 임의의 아미노산 서열, 예를 들어 (c) 서열번호 1 내지 226으로 이루어진 군으로부터 선택된 수에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 　 이러한 폴리펩티드 중 하나 이상(예를 들어, 2개, 예를 들어, 본원에 제시된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 일부이다. 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예를 들어, 플라스미드도 본 발명의 일부이다. 본원에 제시된 임의의 항원 결합 단백질 또는 면역글로불린 사슬 또는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터(예를 들어, 숙주 세포의 염색체 내에 통합되거나 이소성인 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터)를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포)는 본 발명의 일부이다.

본원에 제시된 항원 결합 단백질(예: 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 다중특이적 항체) 중 하나 이상을 포함하고, 임의로, 추가 치료제(예: 항염증제, 항-TNF알파 항체 또는 이의 항원 결합 단편, IL17 억제제, IL23p19 억제제, IL12p40 억제제, 구셀쿠맙, 우스테키누맙, 브로달루맙, 익세키주맙, 세쿠키누맙, 면역글로불린에 연결된 하나 이상의 인간 TNF 수용체 또는 이의 단편, 인플릭시맙, 아달리무맙, 에타너셉트, 두필루맙, 사릴루맙, 토실리주맙, 골리무맙, 아바타셉트, 토파시티닙, 아바타셉트, 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 이부프로펜, 나프록센, 아세트아미노펜, 아스피린, 셀레콕시브, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 코르티코스테로이드, 코르티손 및 프레드니손)와 연계되는 조성물 또는 키트는 본 발명의 일부를 형성한다.

본원에 제시된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 다중특이적 항체) 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및, 임의로, 추가 치료제를 포함하는 약학적 조성물도 본 발명의 일부이다.

본 발명은 또한, 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 다중특이적 항체) 또는 본원에 제시된 조성물을 포함하는 용기 또는 주사 장치(예를 들어, 미리 채워진 주사기)를 제공한다.

본 발명은 IL36R 매개 장애(예: 염증성 질환 또는 자가면역 질환 또는 염증성 장 질환)의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체(예: 인간)에게서 이를 치료하거나 예방하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 대상체에게, 본원에 제시된 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 다중특이적 항체)의 치료적 유효량을, 임의로, 추가의 치료제(예를 들어, 항염증제)와 연계하여 투여(예를 들어, 비경구)하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한, 본원에 제시된 것과 같은 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 다중특이적 항체)을 대상체(예: 인간)의 신체 내로 투여하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항원 결합 단백질을, 임의로, 추가의 치료제(예: 항염증제)와 연계하여 대상체의 신체 내에 (예를 들어, 피하, 정맥내, 또는 근육내) 주입하는 단계를 포함한다.

본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174,176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 및/또는 226에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 포함한다.

본 발명은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173,175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 211, 215, 219, 223, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221 및/또는 225에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 변이체를 포함한다.

도 1. 생식선과 H4H14706P2의 V_H 및 V_L 간의 서열 비교.
도 2. 생식선과 H4H14708P2의 V_H 및 V_L 간의 서열 비교.
도 3 (A~F). H4H14706P2 및 H4H14708P2의 농도 증가는 IL-36α(A 및 D), IL-36β(B 및 E), 또는 IL-36γ(C 및 F) 투여량 반응 곡선을 우측으로 이동시켰으며, 이는 H4H14706P2 및 H4H14708P2(RLU, 상대 광 단위)에 의한 억제의 경쟁적 성질을 나타낸다.
도 4. 0.5 mg/kg 또는 5.0 mg/kg의 항체를 피하 투여한 시노몰구스 원숭이에서 H4H141706P2 및 APE6155 약동학 분석(시간 경과에 따른 혈청 내 항체 농도).

본 발병에 따르면, 당업계의 기술에 속하는 종래의 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술들은 문헌에서 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, Sambrook, Fritsch & Maniatis의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (본원에서 "Sambrook 등의 1989 문헌"이라 함); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel 등의(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)를 참조한다.

항-IL36R "항원 결합 단백질"은 IL1RL2 서브유닛(IL-1Rrp2)에서 IL36 수용체에 특이적으로 결합하는 단일 폴리펩티드(예: ScFv(단쇄 가변 단편)) 또는 둘 이상의 폴리펩티드(예: 사량체 IgG 항체)의 복합체이다. IL-36R은, 이에 대한 항원 결합 단백질의 결합의 맥락에서, IL-1RL2를 지칭한다. 본 발명의 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 단일특이적 또는 다중특이적(예: 이중특이적)인지, 또는 1가 또는 다가(예: 2가)인지 여부와 상관 없이 항체 또는 항원 결합 단편이다. 1가 항원 결합 단백질은 하나의 항원 결합 도메인을 갖는 반면, 2가 항원 결합 단백질은 2개의 항원 결합 도메인을 갖는다.

폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA를 포함한다. 본 발명은 프로모터 또는 다른 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되는, 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일반적으로, "프로모터(promoter)" 또는 "프로모터 서열(promoter sequence)"은 세포 내에서 (예를 들어, 직접적으로 또는 프로모터가 결합된 단백질 또는 물질을 통해) RNA 중합효소에 의해 결합할 수 있고 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역을 지칭한다. 일반적으로, 프로모터 서열은 그의 3' 말단에서 전사 개시 부위에 의해 결합되고, 상류(5' 방향)로 연장되어 임의의 수준의 전사를 개시하는 데 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함한다. 프로모터 서열 내에서, (예를 들어, 뉴클레아제 S1과의 맵핑에 의해 편리하게 정의되는) 전사 개시 부위뿐만 아니라 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인(공통 서열)이 발견될 수 있다. 프로모터는, 인핸서 및 억제자 서열을 포함하는 다른 발현 조절 서열 또는 본 발명의 핵산과 작동 가능하게 연결될 수 있다. 유전자 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있는 프로모터는, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(미국 특허 제5,385,839호 및 제5,168,062호), SV40 초기 프로모터 영역(Benoist 등의 (1981) Nature 290:304-310), 라우스 육종 바이러스의 3' 장말단 반복체에 함유된 프로모터(Yamamoto 등의 (1980) Cell 22:787-797), 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터(Wagner 등의 (1981) Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(Brinster 등의 (1982) Nature 296:39-42); 베타-락타마제 프로모터와 같은 원핵 발현 벡터(VIIIa-Komaroff 등의 (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731), 또는 tac 프로모터(DeBoer 등의 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25)를 포함하지만 이들로 한정되지는 않으며; 또한 Scientific American (1980) 242:74-94에 나오는 "Useful proteins from recombinant bacteria"; 및 효모 또는 다른 진균에서 유래된 프로모터 요소, 예컨대 Gal 4 프로모터, ADC(알코올 탈수소효소) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나아제) 프로모터 또는 알칼리 인산분해효소 프로모터 등을 참조한다.

폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 세포에서, 서열이 코딩 서열의 RNA 중합효소 매개 전사를 RNA로, 바람직하게는 mRNA로 유도할 때 프로모터 또는 다른 발현 조절 서열에 "작동 가능하게 연결"되는데, 그런 다음, (인트론을 함유하는 경우) RNA 스플라이싱될 수 있고, 임의로, 코딩 서열에 의해 암호화된 단백질로 번역될 수 있다.

인터루킨-36 수용체 (IL36R)

IL-36R은 4개의 신호전달 복합체(IL-1RI, IL-18R, IL-33R, 및 IL-36R), 및 2개의 유인 수용체 및 2개의 음성 조절자를 형성하는 6개의 수용체 단백질을 함유하는 IL-1 수용체 계열의 구성원이다. IL-36R은 IL-1Rrp2(IL-1RL2, 인터루킨 1 수용체 유사체 2 또는 인터루킨 1 수용체 관련 단백질 2로도 알려짐)로 명명된 수용체 서브유닛 및 공동 수용체 서브유닛 인터루킨-1 수용체 부속 단백질인 IL-1RAcP로 이루어진 이종이량체이다. 수용체는 3가지 상이한 작용제인 IL-36α, IL-36 β, 및 IL-36γ(IL-1F6, IL-1F8, 및 IL-1F9로도 알려짐)를 인식할 수 있다. 또한 2개의 수용체 길항제 IL-36Ra 및 IL-38가 있는데, 이들은 IL-36 수용체에 결합하여 염증성 사이토카인의 발현을 감소시킨다. IL-36α, IL-36β, 및 IL-36γ는 IL-36R/IL-1RAcP 수용체를 통해 신호를 전달하여 p38 및 JNK와 같은 NF-κB 및 MAPK를 활성화하고 염증 반응을 촉진한다.

본 발명의 일 구현예에서, 호모 사피엔스 IL1RL2 서열은 Genbank 수탁 번호 NP_003845.2 하에 이용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 호모 사피엔스 IL1RL2의 아미노산 서열은 서열 번호 177에 제시된다.

본 발명의 일 구현예에서, 호모 사피엔스 IL-1RAcP 서열은 Genbank 수탁 번호 NP_002173.1 하에 이용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 호모 사피엔스 IL-1RAcP의 아미노산 서열은 서열 번호 178에 제시된다.

항-IL36 항체 및 이의 항원 결합 단편

본 발명은 IL36R 단백질에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 또는 이의 항원 단편, 예컨대 항체(예: 인간 항체) 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. IL36R 상에서 본원에 제시된 항원 결합 단백질 중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합하거나, IL36R에 결합하기 위해 이들과 경쟁하는 항원 결합 단백질도 본 발명의 일부이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 4개의 폴리펩티드 사슬, 2개의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC)를 포함하는 면역글로불린 분자(즉, "전체 항체 분자") 뿐만 아니라 이의 다량체 - 예를 들어, H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2를 지칭한다. 본 발명의 일 구현예에서, 각각의 중쇄(HC)는 중쇄 가변 영역("HCVR" 또는 "V_H")(예: 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154 또는 170 또는 이의 변이체) 및 중쇄 불변 영역(도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함함)을 포함하고; 각각의 경쇄(LC)는 경쇄 가변 영역("LCVR" 또는 "V_L")(예를 들어, 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146 또는 162 또는 이의 변이체) 및 경쇄 불변 영역(C_L)을 포함한다. V_H와 V_L 영역은, 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더 보존적인 영역이 중간에 끼어 있는 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명된 초가변 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 아미노 말단에서 카르복시 말단의 방향으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 발명의 특정 구현예에서, 항체(또는 이의 항원 결합 단편)의 FR은 인간 생식계열 서열과 동일하거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변형된다.

일반적으로, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 사슬 둘 다의 가변 도메인은 비교적 보존적인 프레임워크 영역(FR) 내에 위치한, 상보성 결정 영역(CDR)으로도 불리는 3개의 초가변 영역을 포함한다. 일반적으로, N-말단에서 C-말단 방향으로, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 각각의 도메인에 대한 아미노산의 할당은 관심 면역글로불린의 단백질 서열의 정의(definitions of Sequences of Proteins of Immunological Interest), Kabat 등; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat 등의 (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia 등의 (1987) J Mol. Biol. 196:901-917, 또는 Chothia 등의 (1989) Nature 342:878-883에 따른다.

예를 들어, 본 발명은 항원 결합 단백질을 제공하고, 상기 항원 결합 단백질은: (a) 서열 번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154, 170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154, 170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70, 80 또는 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 중쇄 면역글로불린의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역 글로불린; 및 (b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70, 80 또는 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 경쇄 면역글로불린의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 항원 결합 단백질은: (i) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154,170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린; 또는 이의 변이체; 및 (ii) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린; 또는 이의 변이체를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 V_H를 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 V_L을 포함하는 경쇄 면역글로불린을 포함하며, 여기서

CDR-H1은 서열번호4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 140, 156 또는 172에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고;

CDR-H2는 서열번호6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 142, 158 또는 174에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고;

CDR-H3은 서열번호 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 144, 160 또는 176에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하며;　

CDR-L1은 서열번호 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 124, 148 또는 164에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고;

CDR-L2는 서열번호 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 126, 150 또는 166에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하며;

CDR-L3은 서열번호 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 128, 152 또는 168에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다.

본 발명은 단클론 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 및 이의 항원 결합 단편뿐만 아니라, 복수의 단리된 단클론 항원 결합 단백질을 포함하는 단클론 조성물을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단클론 항체" 또는 "mAb"는 실질적으로 균질한 항체 집단의 구성원을 지칭하며, 집단을 포함하는 항체 분자는 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 가능한 돌연변이를 제외하고는 아미노산 서열에 있어서 동일하다. 조성물에서 "복수의" 이러한 단클론 항체 및 단편은 동일한 (즉, 전술한 바와 같이, 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 가능한 돌연변이를 제외하고는 아미노산 서열에 있어서 동일한) 항체 및 단편의 농도를 지칭하며, 여기서 농도는 자연에서 (예를 들어, 마우스마우스 또는 인간과 같은 숙주 유기체의 혈액에서) 정상적으로 발생하게 될 것보다 높다.

본 발명의 일 구현예에서, 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어, IgA(예: IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG(예: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4) 또는 IgM 유형의 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어 카파 또는 람다 유형의 경쇄 불변 도메인을 포함한다.

본 발명은 인간 항원 결합 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 항체 또는 항원 결합 단편과 같은 용어 "인간" 항원 결합 단백질은, 인간 세포에 존재하거나 마우스 세포와 같은 비인간 세포로 이식되었는지 여부와 상관없이, 인간 생식선 면역글로불린에서 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체 및 단편을 포함한다. 예를 들어, US8502018, US6596541 또는 US5789215를 참조한다. 본 발명의 인간 mAb는 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예컨대, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체 내 체세포성 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 예를 들면 CDR과 특정 CDR3에 포함할 수 있다. 그러나, 본 설명에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종(예: 마우스)의 생식선으로부터 유도된 CDR 서열이 인간 FR 서열 상에 이식된 항체를 포함하도록 의도되지는 않는다. 상기 용어는 비인간 포유동물 또는 비인간 포유동물의 세포에서 재조합적으로 생성되는 항체를 포함한다. 상기 용어는 인간 대상체로부터 직접적으로 단리된 천연 항체를 포함하도록 의도되지는 않는다.

본 발명은 항-IL36R 키메라 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 및 이의 항원 결합 단편, 및 이의 사용 방법을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "키메라 항체"는 제1 항체 유래의 가변 도메인 및 제2 항체 유래의 불변 도메인을 갖는 항체이며, 여기서 제1 및 제2 항체는 상이한 종에서 유래된다. (예를 들어, US4816567; 및 Morrison 등의 문헌[(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855] 참조).

용어 "재조합" 항원 결합 단백질, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어 스플라이싱 및 이식유전자 발현을 포함하는 재조합 DNA 기술과 같은, 당업계에 알려진 기술 또는 방법에 의해 생성, 발현, 단리 또는 수득된 이러한 분자를 지칭한다. 상기 용어는 (유전자이식 마우스와 같은 유전자이식 비인간 포유동물을 포함하는) 비인간 포유동물 또는 세포(예: CHO 세포)에서, 예컨대 세포 발현 시스템에서 발현되었거나, 재조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체를 포함한다.

본원에 개시된 재조합 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 및 항원 결합 단편은 또한 대장균/T7 발현 시스템에서 생산될 수도 있다. 본 구현예에서, 본 발명의 항-IL36R 항체 면역글로불린 분자를 암호화하는 핵산(예: H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2)은 pET-기반 플라스미드 내에 삽입되고 대장균/T7 시스템에서 발현된다. 예를 들어, 본 발명은 숙주 세포(예를 들어, 대장균과 같은 박테리아 숙주 세포, 예컨대 BL21 또는 BL21DE3)에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 이의 면역글로불린 사살을 발현시키는 방법을 포함하며, 상기 방법은 세포에서, T7 프로모터에 작동 가능하게 연결된 면역글로불린 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 또한 포함하는 T7 RNA 중합효소를 발현시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 대장균과 같은 박테리아 숙주 세포는 lac 프로모터에 작동 가능하게 연결된 T7 RNA 중합효소 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 중합효소와 사슬의 발현은 숙주 세포를 IPTG(이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드)와 함께 인큐베이션함으로써 유도된다. US4952496 및 US5693489 또는 Studier & Moffatt의 문헌[Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J. Mol. Biol. 1986 May 5;189(1): 113-30]을 참조한다.

재조합 항체를 생산하기 위한 당업계에 알려진 여러 가지 방법이 있다. 항체의 재조합 생산을 하나의 예시적인 방법은 US4816567에 개시되어 있다.

형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 임의의 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드를 포유류 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질 융합, 전기천공, 폴리뉴클레오티드(들)의 리포좀으로의 캡슐화, 유전자총 주사(biolistic injection) 및 핵 내로 DNA의 직접 미세주입을 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유류 세포 내로 도입될 수 있다. 세포를 형질전환하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호; 제4,912,040호; 제4,740,461호 및 제4,959,455호를 참조한다. 따라서, 본 발명은 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예컨대 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이의 면역글로불린 사슬을 만들기 위한 재조합 방법을 포함하며, 상기 방법은 (i) 항원 결합 단백질(예: H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2)의 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 사슬을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223 및/또는 225 중 어느 하나 또는 그 이상에서의 뉴클레오티드 서열; 또는 이의 변이체를 포함함)를 도입하는 단계로서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에 있고/있거나; 숙주 세포 염색체로 일체화되고/되거나 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 단계, (ii) 폴리뉴클레오티드의 발현에 유리한 조건 하에 숙주 세포(예를 들어, CHO 또는 피치아(Pichia) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris))를 배양하는 단계, 및 (iii) 임의로, 숙주 세포 및/또는 숙주 세포가 성장하는 배지로부터 항원 결합 단백질(예: 항체 또는 단편) 또는 사슬을 단리하는 단계를 포함한다. 둘 이상의 면역글로불린 사슬, 예를 들어, 2개의 중쇄 면역글로불린 사슬 및 2개의 경쇄 면역글로불린 사슬을 포함하는 항체를 포함하는 항원 결합 단백질(예: 항체 또는 항원 결합 단편)을 만들 때, 단일 숙주 세포에서 사슬의 공동 발현은, 예를 들어, 세포 내에서, 또는 세포 표면 상에서, 또는 세포의 외부에서(이러한 사슬이 분비되는 경우), 사슬의 결합을 유도하여 항원 결합 단백질(예: 항체 또는 항원 결합 단편)을 형성한다. 본 발명의 방법은, 세포에서 면역글로불린 중쇄만 발현되거나, 면역글로불린 경쇄만 발현되거나, 둘 다가 발현되는 것들(예를 들어, 성숙한 단편 및/또는 이의 가변 도메인을 포함하여 본원에서 논의되는 것들 중 어느 하나)를 포함한다. 이러한 단쇄는, 예를 들어, 이러한 사슬을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편의 발현에 있어서 중간체로서 유용하다. 예를 들어, 본 발명은 또한, 서열번호 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 137, 153, 169, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 211, 215, 219 또는 223에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 중쇄 면역글로불린(또는 이의 가변 도메인) 또는 이의 CDR; 및 서열번호 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 145, 161, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221 또는 225에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 경쇄 면역글로불린(또는 이의 가변 도메인) 또는 이의 CDR을 포함하고, 이러한 생산 방법의 산물인 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예컨대 항체 및 이의 항원 결합 단편, 및 임의로, 본원에 제시된 정제 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법의 산물은 항-IL36R 항원 결합 단백질로서, 이는 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154,170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 V_H 또는 중쇄 면역글로불린; 및 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산을 포함하는 V_L 또는 경쇄 면역글로불린을 포함하는 항체 또는 단편이다.

본 발명의 일 구현예에서, 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 만드는 방법은, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 침전 및/또는 여과에 의해 항원 결합 단백질을 정제하는 방법을 포함한다. 이러한 방법의 산물도 본 발명의 일부를 형성한다.

포유류 세포를 포함하여, 진핵 및 원핵 숙주 세포는 항-IL36R 항원 결합 단백질(예: 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 발현을 위한 숙주로서 사용될 수 있다. 이러한 숙주 세포는 당업계에 잘 알려져 있고, 많은 숙주 세포가 미국형 배양 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC)으로부터 입수 가능하다. 이들 숙주 세포는, 특히, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예: Hep G2), A549 세포, 3T3 세포, HEK-293 세포 및 다수의 다른 세포주를 포함한다. 포유류 숙주 세포는 인간, 마우스, 랫트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주(예를 들어, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 또는 트리코플루시나 니(Trichoplusia ni), 양서류 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 및 진균 세포이다. 진균 세포는 효모 및 사상 진균 세포를 포함하며, 이에는, 예를 들어, 피치아(Pichia), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 핀란디카(Pichia finlandica), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피치아 코클라메(Pichia koclamae), 피치아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피치아 미누타(Pichia minuta)(오가테아 미누타(Ogataea minuta), 피치아 린드네리(Pichia lindneri)), 피치아 오푼티에(Pichia opuntiae), 피치아 테르모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피치아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피치아 구에르컴(Pichia guercuum), 피치아 피즈페리(Pichia pijperi), 피치아 스팁티스(Pichia stiptis), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피치아 종, 사카로마이세스 세리비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 종, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 종, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스페르질루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르질루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르질루스 오리제(Aspergillus oryzae), 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei), 크리소스포리엄 럭노웬스(Chrysosporium lucknowense), 푸자리움(Fusarium) 종, 푸자리움 그라미니아룸(Fusarium gramineum), 푸자리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)가 포함된다. 본 발명은 H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2와 같은 항원 결합 단백질; 및/또는 이의 하나 이상의 면역글로불린 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포 또는 전술한 임의 유형의 숙주 세포)를 포함한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 항원 결합 단백질, 예를 들어, H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2에 의해 결합되는 IL36R 또는 이의 항원 단편 또는 이들의 융합체(예: His₆, Fc 및/또는 myc)를 발현하는 세포를 포함하되, 예를 들어, 세포는 대상체의 체내에 있거나 시험관 내에 있다.

또한, 본 발명은 항-IL36R 항체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 IL36R 폴리펩티드 또는 이의 항원 단편 또는 이의 융합체와 복합체화된/되었거나 제2 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예: 검출 가능하게 표지된 제2 항체)와 복합체화된, 본원에서 논의된 항-IR36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 복합체를 제공한다. 본 발명의 일 구현예에서, 복합체는 시험관 내에 있거나 (예를 들어, 고형 기재에 고정되어 있거나) 대상체의 신체 내에 있다.

용어 "특이적으로 결합하는"은 이러한 항원 결합 단백질들(예: mAb)이 IL36R 단백질과 같은 항원에 대해, 예를 들어, 25℃또는 37℃에서 Octet® HTX 바이오센서와 같은 실시간 무표지 바이오층 간섭계 검정에 의해, 또는 BIACORE??과 같은 표면 플라스몬 공명에 의해, 또는 용액 친화도 ELISA에 의해 측정했을 때, 적어도 약 58 nM(예를 들어, 10^-9 M; 10^-10M, 10^-11 M, 또는 10^-12 M)의 KD로서 표현된 결합 친화도를 갖는 것을 지칭한다. 본 발명은 IL36R 단백질에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 항-IL36R 항원 결합 단백질은 인간 및/또는 필리핀 원숭이 IL36R에 결합하기 위한 KD 값을 포함하며, 상기 값은 표 4-1 내지 4-8 중 어느 하나에 제시되어 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 항체 또는 항원 결합 단백질의 "항원 결합 부분" 또는 "항원 결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생적이거나, 효소적으로 수득할 수 있거나, 합성 또는 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항원 결합 단편의 비제한적 예는: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')₂ 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단쇄 Fv (scFv) 분자; 및 (vi) dAb 단편을 포함하고; 이들은 항체의 초가변 영역(예를 들어, CDR3 펩티드와 같은 단리된 상보성 결정 영역(CDR))을 모방하는 아미노산 잔기, 또는 제한된 FR3-CDR3-FR4 펩티드로 이루어진다. 다른 조작된 분자, 예컨대, 도메인 특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실 항체, 키메라 항체, CDR-이식 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 및 작은 모듈형 면역치료제(SMIP) 등도 본원에 사용된 바와 같은 "항원 결합 단편"이란 표현에 포함된다. 본 발명의 일 구현예에서, 항원 결합 단편은 H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2의 3개 이상의 CDR(예: CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3; 또는 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)을 포함한다.

항체의 항원 결합 단편은, 본 발명의 일 구현예에서, 적어도 하나의 가변 도메인을 포함하게 된다. 이러한 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성을 가질 수 있고, 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 이들과 프레임 내에 있는 적어도 하나의 CDR을 일반적으로 포함하게 된다. V_L 도메인과 결합된 V_H 도메인을 갖는 항원 결합 단편에서, V_H 및 V_L 도메인은 임의의 적절한 배열로 서로에 대해 위치할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체로서, V_H - V_H, V_H - V_L 또는 V_L - V_L 이량체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원 결합 단편은 단량체 V_H 또는 V_L 도메인을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 항체의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 결합된 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원 결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비제한적인 예시적 구성은 다음을 포함한다: (i) V_H-C_H1; (ii) V_H-C_H2; (iii) V_H-C_H3; (iv) V_H-C_H1-C_H2; (v) V_H-C_H1-C_H2-C_H3; (vi) V_H-C_H2-C_H3; (vii) V_H-C_L; (viii) V_L-C_H1; (ix) V_L-C_H2; (x) V_L-C_H3; (xi) V_L-C_H1-C_H2; (xii) V_L-C_H1-C_H2-C_H3; (xiii) V_L-C_H2-C_H3; 및 (xiv) V_L-C_L. 위에서 열거된 임의의 예시적인 구성을 포함하는 가변 및 불변 도메인의 임의의 구성에서, 이러한 가변 및 불변 도메인은 직접적으로 상호간에 연결되거나 또는 전체 또는 부분적인 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩티드 분자의 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에 가요성 또는 반 가요성 연결을 초래하는 적어도 2개(예를 들어, 5 10, 15, 20, 40, 60개 또는 그 이상)의 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체의 항원 결합 단편은 위에서 열거된 가변 및 불변 도메인 구성 중 어느 하나의 동종-이량체 또는 이종-이량체(또는 다른 다량체)를 포함할 수 있으며, 이들은 (예를 들어, 이황화 결합(들)에 의해) 서로 비공유 결합되고/되거나, 하나 이상의 단량체 V_H 또는 V_L 도메인과 비공유 결합된다.

항원 결합 단백질(예: 항체 및 항원 결합 단편)은 단일 특이적이거나 다중특이적(예: 이중특이적)일 수 있다. 다중특이적 항원 결합 단백질은 본원에서 추가로 논의된다.

특정 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질(예: 항체 또는 항체 단편)은 리간드, 검출 가능한 표지 또는 치료 모이어티("면역접합체"), 제2 항-IL36R 항체, 또는 임의의 다른 치료 모이어티와 같은 모이어티에 접합될 수 있다.

"단리된" 항원 결합 단백질(예: 항체 또는 이의 항원 결합 단편), 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 이들이 생산되는 세포 또는 세포 배양물에서 유래된 다른 생물학적 분자가 적어도 부분적으로 없다. 이러한 생물학적 분자는 핵산, 단백질, 다른 항체 또는 항원 결합 단편, 지질, 탄수화물, 또는 세포 부스러기 및 성장 배지와 같은 다른 물질을 포함한다. 추가로, 단리된 항원 결합 단백질은 숙주 세포 또는 이의 성장 배지에서 유래된 생물학적 분자와 같은 발현 시스템 성분이 적어도 부분적으로 없을 수 있다. 일반적으로, 용어 "단리된"은 이러한 생물학적 분자의 완전한 부재, 또는 물, 완충제, 또는 염의 부재, 또는 항원 결합 단백질(예: 항체 또는 항원 결합 단편)을 포함하는 약학적 제형 성분을 지칭하도록 의도되지는 않는다.

본 발명은 본 발명의 항원 결합 단백질(예: H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2)과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다.

용어 "에피토프"는 항원 결합 단백질의 특이적 항원 결정 부위, 예를 들어 파라토프로서 알려진, 항체 분자의 가변 영역과 상호 작용하는 (예를 들어, IL1RL2에 대한) 항원 결정자를 지칭한다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원 상의 상이한 영역에 결합할 수 있고 상이한 생물학적 효능을 가질 수 있다. 용어 "에피토프"는 또한, B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위 및/또는 항체가 결합하는 항원의 영역을 지칭할 수 있다. 에피토프는 구조적 또는 기능적으로 정의될 수도 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 서브 세트이며, 상호 작용의 친화도에 직접 기여하는 잔기들을 갖는다. 에피토프는 선형이거나, 비선형 아미노산으로 이루어진 입체 구조일 수 있다. 특정 구현예에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 기 또는 설포닐 기와 같은, 분자들의 화학적으로 활성 표면군인 결정기를 포함할 수 있으며, 소정의 구현예들에서, 특이적인 3차원 구조적 특성, 및/또는 특이적인 전하 특성을 가질 수도 있다.

항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 단편 또는 폴리펩티드의 에피토프를 결정하는 방법은 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩티드 블롯 분석(Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63 참조), 펩티드 절단 분석, 결정학적 연구 및 NMR 분석을 포함한다. 또한, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 사용될 수 있다(Tomer 2000, Prot. Sci. 9:487-496 참조). 항원 결합 단백질(예: 항체 또는 단편 또는 폴리펩티드)이 상호 작용하는 폴리펩티드 내의 아미노산을 식별하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분석법에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 예를 들어, Ehring의 문헌[(1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen 및 Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A]을 참조한다.

본 발명은 IL36R, 예를 들어 본원에서 논의된 것과 같은 변이체 IL36R 에피토프에 결합하기 위해 본 발명의 항원 결합 단백질, 예를 들어, H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2와 경쟁하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "경쟁"은 항원 결합 단백질(예: 항체 또는 이의 항원 결합 단편)이 항원(예: IL1RL2)에 결합하여 또 다른 항원 결합 단백질(예: 항체 또는 이의 항원 결합 단편)이 항원에 결합하는 것을 억제하거나 차단하는 것을 지칭한다. 상기 용어는 2개의 항원 결합 단백질(예: 항체) 간의 쌍방 경쟁, 즉 제1 항체가 결합하여 제2 항체의 결합을 차단하는 것 및 그 반대의 경우도 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 항원 결합 단백질(예: 항체) 및 제2 항원 결합 단백질(예: 항체)은 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 항원 결합 단백질(예: 항체)은 상이하지만, 예를 들어, 중첩하는 에피토프에 결합할 수 있고, 여기서 한 항체의 결합은, 예를 들어, 입체 장애(steric hindrance)에 의해 제2 항체의 결합을 억제하거나 차단한다. 항원 결합 단백질(예: 항체) 간의 경쟁은 당업계에 알려진 방법, 예를 들어, 실시간 비표지 바이오-층 간섭계 검정에 의해 측정될 수 있다. 또한, 항-IL36R 항원 결합 단백질(예: 단클론 항체(mAb)) 간의 결합 경쟁은 Octet RED384 바이오센서(Pall ForteBio Corp.)를 이용한 대한 실시간, 무표지 바이오층 간섭 분석을 사용하여 결정할 수 있다.

일반적으로, 임의의 방식으로 변형되는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 IL36R에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하며, 예를 들어, 그 활성이 몰 기준으로 표현될 때, (부모 항체와 비교했을 때) IL36R 결합 활성의 적어도 10%를 보유한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 부모 항체 대비 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 또는 이상의 IL36R 결합 친화도를 보유한다. 또한, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 그의 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환(항체의 "보존적 변이체" 또는 "기능 보존 변이체"로서 지칭됨)을 포함할 수 있는 것으로 의도된다.

폴리펩티드의 "변이체", 예컨대 면역글로불린 사슬(예: H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2 V_H, V_L, HC 또는 LC)는 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행할 때, 본원에 제시된 기준 아미노산 서열(예: 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224 또는 226 중 어느 하나)과 적어도 약 70 내지 99.9%(예: 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9%) 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭하며, 여기서, BLAST 알고리즘의 파라미터는 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 간에 가장 큰 일치를 제공하도록 선택된다(예: 예상 임계값: 10; 단어 크기: 3; 쿼리 범위에서의 최대 일치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 비용: 존재 11, 연장 1; 조건부 구성 점수 매트릭스 조정).

폴리뉴클레오티드의 "변이체"는 BLAST 알고리즘으로 비교를 수행할 때, 본원에 제시된 기준 뉴클레오티드 서열(예: 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173,175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 211, 215, 219, 223, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221 및/또는 225 중 어느 하나)과 적어도 약 70 내지 99.9%(예: 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 여기서 BLAST 알고리즘의 파라미터는 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 간에 가장 큰 일치를 제공하도록 선택된다(예: 예상 임계값: 10; 단어 크기: 28; 쿼리 범위에서 최대 일치: 0; 일치/불일치 점수: 1, -2; 갭 비용: 선형).

다음의 참조 문헌은 서열 분석에 종종 사용되는 BLAST 알고리즘에 관한 것이다: BLAST ALGORITHMS: Altschul 등의 문헌 [(2005) FEBS J. 272(20): 5101-5109]; Altschul, S. F. 등의 문헌[(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]; Gish, W. 등의 문헌[(1993) Nature Genet. 3:266-272]; Madden, T. L. 등의 문헌[(1996) Meth. Enzymol. 266:131-141]; Altschul, S. F. 등의 문헌[(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]; Zhang, J. 등의 문헌[(1997) Genome Res. 7:649-656]; Wootton, J. C. 등의 문헌[(1993) Comput. Chem. 17:149-163]; Hancock, J. M. 등의 문헌[(1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70]; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M. O. 등의 문헌["A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M. O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.]; Schwartz, R. M. 등의 문헌["Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3.'' M. O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.]; Altschul, S. F.의 문헌[(1991) J. Mol. Biol. 219:555-565]; States, D. J. 등의 문헌[(1991) Methods 3:66-70]; Henikoff, S. 등의 문헌[(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919]; Altschul, S. F. 등의 문헌[(1993) J. Mol. Evol. 36:290-300]; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S. 등의 문헌[(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]; Karlin, S. 등의 문헌[(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A. 등의 문헌[(1994) Ann. Prob. 22:2022-2039]; 및 Altschul, S. F.의 문헌["Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, N.Y.]

항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은, 본 발명의 일 구현예에서, 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154,170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산과 적어도 70%(예: 80%, 85%, 90%, 95%, 99%)의 아미노산 서열 동일성을 갖는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역; 및/또는 서열 번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산과 적어도 70%(예: 80%, 85%, 90%, 95%, 99%)의 아미노산 서열 동일성을 갖는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역을 포함한다.

또한, 항-IL36R 항원 결합 단백질은, 예를 들어, 미스센스 돌연변이(예를 들어, 보존적 치환), 비-센스 돌연변이, 결실, 또는 삽입과 같은 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의) 돌연변이를 제외한, 본원에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열을 포함하지만, 이러한 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 면역글로불린 경쇄(또는 V_L) 변이체, 및/또는 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154,170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열을 포함하지만 이러한 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 면역글로불린 중쇄(또는 V_H) 변이체를 포함하는 항-IL36R 항원 결합 단백질을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 항-IL36R 항원 결합 단백질은: CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하되, 이러한 CDR 중 하나 이상(예: 1 또는 2 또는 3개)은 이러한 돌연변이 중 하나 이상(예: 보존적 치환)을 갖는 면역글로불린 경쇄 변이체; 및/또는 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하되, 이러한 CDR 중 하나 이상(예: 1 또는 2 또는 3개)은 이러한 돌연변이 중 하나 이상(예: 보존적 치환)을 갖는 면역글로불린 중쇄 변이체를 포함한다.

본 발명의 구현예는 또한, 면역글로불린 V_H 및 V_L, 또는, HC 및 LC를 포함하는 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항-IL36R 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하며, V_H, V_L, HC 또는 LC는 본원에 구체적으로 제시된 상응하는 V_H, V_L, HC 또는 LC의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상(예: 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99%)의 전체적인 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 변이체 아미노산 서열을 포함하지만, 여기서 이러한 면역글로불린의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3은 변이체가 아니며, 본원에 명시적으로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 이러한 구현예에서, 변이체 항원 결합 단백질 내의 CDR 자체는 변이체가 아니다.

본원에 제시된 면역글로불린 사슬의 "보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 치환"은 폴리펩티드 내에 아미노산의 하나 이상의 치환이 존재하고, 다른 아미노산은 유사한 특성(예: 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 골격 형태 및 강성 등)을 갖는 변이체를 지칭한다. 이러한 변화는 항체 또는 단편의 생물학적 활성을 상당히 파괴하지 않고도 빈번하게 이루어질 수 있다. 본 기술분야의 당업자는 일반적으로, 폴리펩티드의 비필수 영역에서의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인식한다(예를 들어, Watson 등의 문헌[(1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4^th Ed.)] 참조). 또한, 구조적으로 또는 기능적으로 유사한 아미노산의 치환이 생물학적 활성을 상당히 파괴할 가능성은 적다. 본 발명은 이러한 보존적으로 변형된 변이체 면역글로불린 사슬을 포함하는 항-IL36R 항원 결합 단백질을 포함한다.

유사한 화학적 성질을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산의 군의 예는 다음을 포함한다: 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신; 2) 지방족-히드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드 함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르트산염 및 글루탐산염; 및 7) 황 함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는: 발린-류신-이소류신; 페닐알라닌-티로신; 리신-아르기닌; 알라닌-발린; 글루탐산염-아스파르트산염; 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안적으로, 보존적 치환은 Gonnet 등의 문헌에 개시된 PAM250 로그 우도 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다(예: Gonnet 등의 문헌[(1992) Science 256: 1443 45] 참조).

예를 들어, 변이체 면역글로불린 사슬을 포함하는, 본원에 제시된 항-IL36R 항원 결합 단백질은 다음 특성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다:

· 예를 들어, 25℃에서 약 2.18 nM 내지 약 13.9 nM의 K_D, 또는 예를 들어, 37℃에서 약 4.25 nM 내지 약 29.5 nM의 K_D로 인간 IL36R(예: IL1RL2)에 결합함(예를 들어, myc-myc-His₆ 태그에 융합됨);

· 예를 들어, 25℃에서 약 7.87 nM 내지 약 34.4 nM의 K_D, 또는 예를 들어, 37℃에서 약 14.4 nM 내지 약 58.2 nM의 K_D로 필리핀 원숭이 IL36R(예: IL1RL2)에 결합함(예를 들어, myc-myc-His₆ 태그에 융합됨);

· 예를 들어, 25℃에서 약 173 pM 내지 약 5.79 nM의 K_D, 또는 예를 들어, 37℃에서 약 205 pM 내지 약 28.7 nM의 K_D로 인간 IL36R(예: IL1RL2)에 결합함(예를 들어, 마우스 IgG2a에 융합됨);

· 예를 들어, 25℃에서 약 212 pM 내지 약 14 nM의 K_D, 또는 예를 들어, 37℃에서 약 264 pM 내지 약 40.9 nM의 K_D로 인간 IL36R(예: IL1RL2)에 결합함(예를 들어, 마우스 IgG2a Fc 태그로 표현된 IL1RAcP 세포외 도메인에 융합됨);

· IL36R(예: IL1RL2)에 결합하기 위해 다음의 항-IL36R 항체 중 하나 이상과 경쟁하되: H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 및/또는 H4H14760P2, 임의로, H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 및/또는 H4H14760P2와 경쟁하는 이러한 항-IL36R 항체 또는 단편은 항체 APE3798; APE4086; APE5125/APE5100; APE5216; APE5281; APE5214/APE4881; APE5280; APE5257; APE5258/APE5076; APE5212; APE5213/5066; APE5211; APE5217/APE5060; APE3849; APE3850; APE5600; APE5598; APE5627; APE6064; APE6060; APE6157; APE6155/APE6917; APE6194; APE3847; APE5713; APE6083; APE6903/APE7247; APE6904; 및/또는 APE6907 (예: APE6155) 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 CDR 또는 이의 가변 영역을 포함하는 항원 결합 단편이 아님(WO2016/168542 참조);

· IL-1RAcP 및 리간드(예: hIL-36α, hIL-36β, 및/또는 hIL-36γ)의 존재 하에, IL-36R(예: 인간 또는 필리핀 원숭이)에 의한 NFκB의 활성화를 약 1 X 10^-10M 내지 7 X 10^-9M의 IC₅₀으로 차단하되, 예를 들어, NFκB는 예를 들어, NFκB 반응 요소 (5x)-루시퍼라제-IRES-GFP를 함유하는 HEK293과 같은 숙주 세포임;

· 예를 들어, 이러한 항원 결합 단백질로 치료 받지 않은 대상체에 비해, 피부 염증(예: 만성 또는 급성), 예를 들어 화학적으로 유도된 (예를 들어, 이미퀴모드 유도성) 피부 염증을 앓고 있는 대상체에서, 예를 들어, 인간 DITRA(인터루킨 36 수용체 길항제의 결핍) 질환의 증상을 나타내는 마우스와 같은 마우스에서, 피부 염증(예: 만성 또는 급성)을 예방 또는 개선하거나, 피부 두께를 감소시키거나, 총 병리학 점수를 감소시키거나, 전염증성 사이토카인 수준(예: KC-GRO, IL6, IL1b 및/또는 TNFalpha)을 감소시킴(상기 질환은 예를 들어, Marrakchi 등의 문헌[Interleukin-36-receptor antagonist deficiency and generalized pustular psoriasis, N Engl J Med 365:620-628 (2011)]에 기술되어 있음); 및/또는

· 이러한 항원 결합 단백질로 치료 받지 않은 대상체에 비해, 이러한 대장염 또는 결장 염증을 가진 대상체에서, 예를 들어, DITRA 마우스와 같은 마우스에서, 대장염 또는 결장 염증, 예를 들어, 덱스트란 황산 나트륨(DSS) 또는 옥사졸론에 의해 유도된, 예를 들어 화학적으로 유도된 대장염 또는 결장 염증을 예방 또는 개선하거나, LCN2 폴리펩티드의 배설 수준을 감소시킴;

· 결합될 때, 서열번호 227에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL36R 폴리펩티드의 잔기 (a) 113-119, 113-122, 116-119 및/또는 116-122; 및/또는 (b) 264-271, 267-271, 268-271, 268-276, 268-277 및/또는 271-276이 (예: 아스페르질루스 사이토이(Aspergillus saitoi)에서) 펩신 및/또는 프로테아제 XIII에 의해 분해되지 않게 보호하고/하거나 중수소(예: D₂O)의 존재 하에 중수소화되지 않게 보호함;*

· 서열번호 227에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL36R 폴리펩티드의 잔기 113-119, 113-122, 116-119, 116-122, 264-271, 267-271, 268-271, 268-276, 268-277 및/또는 271-276에서 IL36R, 예를 들어 이의 IL1RL2 서브유닛에 결합함;*　

· 예를 들어, 약 80.0, 80.1, 81.0 또는 81.5%의 커버리지로 IL36R의 도메인 II에 결합함;

· 아미노산 서열 YKQILHLGKD (서열번호 229) (서열번호 227의 아미노산 113-122) 및/또는 GVETHVSFREHNYL (서열번호 230) (서열번호 227의 아미노산 264-277)을 포함하는 폴리펩티드에 결합함;

· Schild 검정 포맷으로 측정했을 때, IL36R에 의한 NFκB의 IL36α, IL36β 및/또는 IL36γ 매개 활성화(예: HEK293과 같은 세포에서 NFκB 반응 요소 (5x)-루시퍼라제-IRES-GFP 리포터)를 경쟁적으로 억제함.

* 서열번호 227에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 태그된 IL36R 폴리펩티드에 제시된 것들에 상응하는 잔기에서, 예를 들어, UniProt 수탁 번호 Q9HB29에 제시된 것과 같은, 천연 IL36R(IL1-RL2)에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함함. 아래 참조:

113-119: YKQILHL (서열번호 228) (서열번호 227의 아미노산 113-119);

113-122: YKQILHLGKD (서열번호 229) (서연번호 227의 아미노산 113-122);

116-119: ILHL (서열번호 231) (서열번호 227의 아미노산 116-119);

116-122: ILHLGKD (서열번호 232) (서열번호 227의 아미노산 116-122);

264-271: GVETHVSF (서열번호 233) (서열번호 227의 264-271);

267-271: THVSF (서열번호 234) (서열번호 227의 아미노산 267-271);

268-271: HVSF (서열번호 235) (서열번호 227의 아미노산 268-271);

268-276: HVSFREHNL (서열번호 236) (서열번호 227의 아미노산 268-276);

268-277: HVSFREHNLY (서열번호 237) (서열번호 227의 아미노산 268-277);

271-276: FREHNL (서열번호 238) (서열번호 227의 아미노산 271-276).

아래에 강조된 인간 IL36R(IL1RL2) 내의 잔기를 참조한다:

MTGLVSLSYF PLSTRSCALQ SCRQPGLGMW SLLLCGLSIA LPLSVTADGC KDIFMKNEIL

SASQPFAFNC TFPPITSGEV SVTWYKNSSK IPVSKIIQSR IHQDETWILF LPMEWGDSGV

YQCVIKGRDS CHRIHVNLTV FEKHWCDTSI GGLPNLSDEY KQILHLGKDD SLTCHLHFPK

SCVLGPIKWY KDCNEIKGER FTVLETRLLV SNVSAEDRGN YACQAILTHS GKQYEVLNGI

TVSITERAGY GGSVPKIIYP KNHSIEVQLG TTLIVDCNVT DTKDNTNLRC WRVNNTLVDD

YYDESKRIRE GVETHVSFRE HNLYTVNITF LEVKMEDYGL PFMCHAGVST AYIILQLPAP

DFRAYLIGGL IALVAVAVSV VYIYNIFKID IVLWYRSAFH STETIVDGKL YDAYVLYPKP

HKESQRHAVD ALVLNILPEV LERQCGYKLF IFGRDEFPGQ AVANVIDENV KLCRRLIVIV

VPESLGFGLL KNLSEEQIAV YSALIQDGMK VILIELEKIE DYTVMPESIQ YIKQKHGAIR

WHGDFTEQSQ CMKTKFWKTV RYHMPPRRCR PFPPVQLLQH TPCYRTAGPE LGSRRKKCTLTTG

(서열번호 117)

본 발명은 "중화" 또는 "길항제" 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는데, 이들은 임의의 검출 가능한 정도까지 IL36R의 활성을 억제하는 분자를 포함한다(예를 들어, IL36 리간드 결합).

"H4H14699P2", "H4H14700P2", "H4H14706P2", "H4H14708P2", "H4H14709P", "H4H14728P", "H4H14731P", "H4H14732P2", "H4H14734P2", "H4H14757P", "H4H14758P" 및 "H4H14760P2"는 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154,170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224(또는 이의 변이체)의 각각의 면역글로불린 중쇄 또는 이의 가변 영역(V_H); 및 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226(또는 이의 변이체)의 각각의 면역글로불린 경쇄 또는 이의 가변 영역(V_L)을 포함하거나, 이들의 CDR(CDR-H1 (또는 이의 변이체), CDR-H2 (또는 이의 변이체) 및 CDR-H3 (또는 이의 변이체))을 포함하는 중쇄 또는 V_H 및/또는 이들의 CDR(CDR-L1 (또는 이의 변이체), CDR-L2 (또는 이의 변이체) 및 CDR-L3 (또는 이의 변이체))을 포함하는 경쇄 또는 V_L을 포함하는 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 및 이의 항원 결합 단편(다중특이적 항원 결합 단백질 포함)을 지칭하며, 예를 들어, 여기서 면역글로불린 사슬, 가변 영역 및/또는 CDR은 아래에 기술된 특정 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, V_H는 IgG 불변 중쇄 도메인(예: IgG1 또는 IgG4)에 연결되고/되거나 V_L은 람다 또는 카파 불변 경쇄 도메인에 연결된다.

본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 본원에 제시된 아미노산 서열뿐만 아니라 항체 또는 단편에 대한 세포적 변형 및 시험관 내 번역 후 변형도 포함하는 면역글로불린 사슬을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 본원에 제시된 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 서열(예: CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및/또는 CDR-L3)을 포함하는 IL36R에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편뿐만 아니라, 하나 이상의 아스파라긴, 세린 및/또는 트레오닌 잔기가 글리코실화되고, 하나 이상의 아스파라긴 잔기가 탈아미드화되고, 하나 이상의 잔기(예: Met, Trp 및/또는 His)가 산화되고, N-말단 글루타민은 피로글루타메이트(pyroE)이고/이거나 C-말단 리신이 소실되는 항체 또는 단편도 포함한다.

본 발명은 본 발명의 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2를 포함하는 용기(예를 들어, 캡 또는 크로마토그래피 컬럼, 중공 보어형 주사바늘, 또는 주사기 실린더가 구비된 가령 플라스틱 또는 유리 바이알)을 제공한다.

본 발명은 또한, IL36R에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편), 예를 들어, H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2,또는 이의 약학적 조성물을 포함하는 주사 장치를 제공한다. 주사 장치는 키트 내에 포장될 수 있다. 주사 장치는 비경구 경로, 예를 들어, 근육 내, 피하 또는 정맥내 경로를 통해 대상체의 신체 내에 물질을 도입하는 장치이다. 예를 들어, 주사 장치는, 예를 들어, 주사할 유체(예를 들어, 항체 또는 이의 단편 또는 약학적 조성물을 포함함)를 담기 위한 실린더나 통(barrel); 유체의 주입을 위해 피부 및/또는 혈관에 찔러 넣기 위한 바늘; 및 주사 바늘 구멍을 통해 유체를 실린더 밖으로 밀어 내기 위한 플런저를 포함하는 주사기(예: 약학적 조성물로 미리 채워진, 예컨대 자동 주사기)일 수 있다.

본 발명은 본 발명의 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2를 대상체에게 투여하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 항원 결합 단백질을 대상체(예: 인간)의 신체 내로 예를 들어 비경구로 도입하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 주사기 바늘을 대상체의 신체에 찔러 넣는 단계, 및 항원 결합 단백질을 대상체의 신체 내로, 예를 들어, 대상체의 정맥, 동맥, 종양, 근육 조직 또는 피하 조직에 주입하는 단계를 포함한다.

인간 항체의 제조

유전자 이식 마우스에서 인간 항체를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 임의의 공지된 방법을 본 발명의 맥락에서 사용하여, IL36R(예: IL1RL2)에 특이적으로 결합하는 인간 항체를 만들 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 IL36R(예: IL1RL2 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편), 또는 약독화되었거나 불활성화된 생 바이러스, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA로 면역화된 마우스로부터 수득된다. 대안적으로, IL36R은 표준 생화학 기술을 사용하여 생산되고 변형되어 면역원으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 면역원은 IL36R(예: IL1RL2) 폴리펩티드 백신일 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 추가접종 주사제(booster injection)가 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 면역원은 대장균(E. coli)에서 발현되거나 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 임의의 다른 진핵생물 세포 또는 포유동물 세포에서 발현되는 재조합 IL36R 폴리펩티드(예: IL1RL2)일 수 있다.

단클론 항체를 생성하기 위한 VELOCIMMUNE?? 기술(예를 들어, 미국 특허 제6,596,541호, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE® 참조) 또는 기타 알려진 방법을 사용해, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는, IL36R에 대한 고 친화도 키메라 항체를 단리할 수 있다. VELOCIMMUNE® 기술은 내인성 마우스 불변 영역 유전자좌에 작동 가능하게 연결된 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 게놈을 갖는 유전자 이식 마우스를 생성하는 것을 포함하며, 이 마우스는 항원 자극에 반응하여 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함하는 항체를 생산한다. 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA는 단리되어 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA에 작동 가능하게 연결된다. 그런 다음, DNA는 완전한 인간 항체를 발현할 수 있는 세포에서 발현된다.

일반적으로, VELOCIMMUNE® 마우스에게 관심 항원을 접종하고, 림프 세포(예컨대 B 세포)는 항체를 발현하는 마우스로부터 회수된다. 림프 세포를 골수종 세포주와 융합하여 불멸성 하이브리도마 세포주를 제조할 수 있고, 이러한 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선택하여 관심 항원에 대해 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 식별한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA를 단리하어, 중쇄 및 경쇄의 바람직한 이소형 불변 영역에 연결할 수 있다. 이러한 항체 단백질은 세포(예: CHO 세포)에서 생산될 수 있다. 대안적으로, 항원 특이적 키메라 항체 또는 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인을 암호화하는 DNA를 항원 특이적 림프구로부터 직접 단리할 수 있다.

처음에, 고 친화도 키메라 항체를 인간 가변 영역과 마우스 불변 영역을 갖도록 단리한다. 항체의 특성을 분석하여 친화도, 선택도, 에피토프 등을 포함하는 바람직한 특성에 맞게 선택한다. 마우스 불변 영역을 원하는 인간 불변 영역과 교체하여 본 발명의 완전한 인간 항체, 예를 들어 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4를 생성한다. 선택된 불변 영역은 특이적 용도에 따라 매우 다양할 수 있지만, 고친화도 항원 결합 특성 및 표적 특이성 특성은 가변 영역에 존재한다.

Fc 변이체를 포함하는 항-IL36R 항체

본 개시의 특정 구현예에 따르면, 예를 들어 중성 pH와 비교해 산성 pH에서 예를 들어 FcRn 수용체에 대한 항체 결합을 강화시키거나 감쇠시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단백질이 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 Fc 도메인의 C_H2 또는 C_H3 영역에서 돌연변이를 포함하는 항-IL36R 항체를 포함하되, 돌연변이(들)는 산성 환경에서(예를 들어, pH가 약 5.5 내지 6.0 범위인 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이러한 돌연변이는, 동물에게 투여되는 경우 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 이러한 Fc 변형의 비제한적인 예는, 예를 들어, 위치 250의 변형(예: E 또는 Q); 250 및 428에서의 변형(예: L 또는 F); 252에서의 변형(예: L/Y/F/W 또는 T), 254에서의 변형(예: S 또는 T), 및 256에서의 변형(예: S/R/Q/E/D 또는 T); 또는 위치 428 및/또는 433에서의 변형(예: H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434에서의 변형(예: A, W, H, F 또는 Y [N434A, N434W, N434H, N434F 또는 N434Y]); 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308에서의 변형(예: 308F, V308F), 및 434에서의 변형을 포함한다. 일 구현예에서, 변형은 428L(예: M428L) 및 434S(예: N434S) 변형; 428L, 259I(예: V259I), 및 308F(예: V308F) 변형; 433K(예: H433K) 및 434(예: 434Y) 변형; 252, 254, 및 256(예: 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예: T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형(예: 308F 또는 308P)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 변형은 265A(예: D265A) 및/또는 297A(예: N297A) 변형을 포함한다.

예를 들어, 본 발명은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이의 하나 이상의 쌍 또는 군을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다: 250Q 및 248L(예: T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E(예: M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S(예: M428L 및 N434S); 257I 및 311I(예: P257I 및 Q311I); 257I 및 434H(예: P257I 및 N434H); 376V 및 434H(예: D376V 및 N434H); 307A, 380A 및 434A(예: T307A, E380A 및 N434A); 및 433K 및 434F(예: H433K 및 N434F).

전술한 Fc 도메인 돌연변이의 임의의 가능한 조합을 포함하는, 본원에 제시된 V_H 및/또는 V_L을 포함하는 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 및 이의 항원 결합 단편은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 고려된다.

본 발명은 또한, 본원에 제시된 V_H 및 키메라 중쇄 불변(C_H) 영역을 포함하는 항-IL36R 항원 결합 단백질, 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 키메라 C_H 영역은 둘 이상의 면역글로불린 이소형의 C_H 영역으로부터 유래된 분절을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항체는, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자에서 유래된 C_H3 도메인의 일부 또는 전부와 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자에서 유래된 C_H2 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 키메라 C_H 영역을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 키메라 힌지 영역을 갖는 키메라 C_H 영역을 포함한다. 예를 들어, 키메라 힌지는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역 유래의 "하부 힌지" 서열(EU 넘버링에 따른 위치 228 내지 236에서의 아미노산 잔기)과 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역 유래의 "상부 힌지" 아미노산 서열(EU 넘버링에 따른 위치 216 내지 227에서의 아미노산 잔기)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 키메라 힌지 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 상부 힌지 유래의 아미노산 잔기, 및 인간 IgG2 하부 힌지 유래의 아미노산 잔기를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 키메라 C_H 영역을 포함하는 항체는, 특정 구현예에서, 항체의 치료 특성 또는 약동학적 특성에 나쁜 영향을 미치지 않으면서 변형된 Fc 효과기 기능을 나타낼 수 있다. (예를 들어, WO2014/022540 참조).

다중특이적 항원 결합 단백질

본 발명은 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 및 이의 항원 결합 단편뿐만 아니라, 이의 사용 방법 및 이러한 항원 결합 단백질을 만드는 방법을 포함한다. 용어 "항-IL36R" 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 다중특이적(예: 이중특이적 또는 이중파라토프성) 분자를 포함하며, 다중특이적 분자는 IL36R(예: IL1RL2)에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 제1 항원 결합 도메인(예를 들어, H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2에서 유래된 항원 결합 도메인), 및 상이한 항원 또는 IL36R 내의 에피토프에 결합하되, 제1 항원 결합 도메인과는 다른 제2 항원 결합 도메인(예: IL23-p19, IL12/IL23-p40, TNFalpha, IL-22, MADCAM, a4b7, CCR9, 및/또는 CCR6)을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩되지 않는다.

"H4H14699P2"; "H4H14700P2"; "H4H14706P2"; "H4H14708P2"; "H4H14709P"; "H4H14728P"; "H4H14731P"; "H4H14732P2"; "H4H14734P2"; "H4H14757P"; "H4H14758P" 또는 "H4H14760P2"는, H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2의 HCDR 및 LCDR, V_H 및 V_L, 또는 HC 및 LC를 각각 포함하고, 상이한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인 포함하는 다중특이적 분자, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에서, 다중특이적 분자에 포함될 수 있는 IL36R(예: IL1RL2)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인은 다음을 포함한다:

(1)

(i) 다음으로부터 선택된 면역글로불린 중쇄의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(V_H) 서열: H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 및 H4H14760P2, 및

(ii) 다음으로부터 선택된 면역글로불린 중쇄의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 각각 포함하는 중쇄 가변 도메인(V_L) 서열: H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 및 H4H14760P2;

또는

(2)

(i) 다음으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인(V_H) 서열: H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 및 H4H14760P2; 및

(ii) 다음으로부터 각각 선택된 경쇄 가변 도메인(V_L) 서열: H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 및 H4H14760P2;

및

상이한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 도메인.

본 발명의 일 구현예에서, 다중특이적 항체 또는 단편은 3개 이상의 상이한 결합 특이성(예: 삼중특이적 분자), 예를 들어, 제1 및/또는 제2 항원 결합 도메인과 동일하거나 상이한 하나 이상의 추가 항원 결합 도메인을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에서, 이중특이적 항원 결합 단편은 제1 에피토프(예: IL36R)에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 scFv(예를 들어, H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 및 H4H14760P2의 V_H 및 V_L을 포함함) 및 상이한 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제2 scFv를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 제1 및 제2 scFv는 링커, 예를 들어, 펩티드 링커(예를 들어, (GGGGS)_n(서열번호 177)과 같은 GS 링커, 여기서 n은 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임)를 통해 테더링된다.

다른 이중특이적 항원 결합 단편은 H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 및 H4H14760P2의 중쇄 및 경쇄 CDR 및 상이한 에피토프에 결합하는 또 다른 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함하는 이중특이적 IgG 항체의 F(ab)₂를 포함한다.

면역접합체

본 발명은 다른 모이어티, 예를 들어, 치료 모이어티에 접합된 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편("면역접합체")을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 본원에 제시된 추가의 치료제 중 어느 하나에 접합된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역접합체"는 또 다른 항원 결합 단백질, 방사성 제제, 리포터 모이어티, 효소, 펩티드, 단백질 또는 치료제에 화학적으로 또는 생물학적으로 연결되는 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편을 지칭한다.

치료적 방법 및 예방적 방법

본 발명은, IL-36R 매개 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체(예: 인간)에게 항-IR36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2)의 치료적 유효량을 투여함으로써 이러한 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

"치료(treat 또는 treating)"는 IL36R 매개 질환을 가진 대상체에게 본 발명의 항-IR36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편(예: H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2)을 투여하여, IL36R-매개 질환의 하나 이상의 징후 및/또는 증상 및/또는 임상적 표시가 퇴행하거나 제거되고/되거나 그의 진행이 억제되는 것(예를 들어, 대상체에서의 질환이 안정화되건, 감소되거나, 제거되는 것)을 의미한다.

IL36R-매개 질환을 "예방하는 것(preventing)"은 대상체의 신체에서 징후가 나타나기 전에 대상체에게 본 발명의 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2)을 투여하는 것을 의미한다.

인터루킨 IL-36RN은 IL-36R에서 IL-36알파, IL-36베타 및 IL-36감마의 전염증성 신호를 길항하는 IL-1 사이토카인 계열 구성원이다.

IL-36R 매개 질환은 IL-36R의 활성(예를 들어, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ와 같은 리간드의 수용체 결합으로 인한 NFκB 및 MAP 키나아제를 통한 하류 염증 신호 전달의 활성화)에 의해, 예를 들어, IL36R 길항제(예: IL-36RN)의 결핍으로 인해 유발되거나 악화되는 임의의 질환이다. 본 발명의 일 구현예에서, IL36RN에서의 돌연변이가 IL-36R 매개 질환의 근원이다. 이러한 질환의 예는 자가면역 장애 및/또는 염증성 장애이다. 본 발명의 구현예에서, 항-IL36R 항원 결합 단백질로 치료되는 IL-36R 매개 질환은 염증성 장애, 자가면역 장애, 인터류킨 IL-36 수용체 길항제(DITRA) 결핍 증후군, 포진성 농가진, 말단피부염, 피부 호중구성 농포성 질환, 건선, 농포성 질환, 전신 농포성 건선(GPP; 예를 들어, 가족성 또는 산발성), 심상성 건선/판상 건선, 손발바닥 농포성 건선(PPPP), 손발바닥 농포증(PPP), 대장염, 염증성 장 질환, 궤장성 대장염, 크론병, 화학적으로 유도된 대장염, 염증, 기도 염증(예: 호중구성 기도 염증, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 천식), 관절 염증(예: 강직성 척추염, 류마티스성 관절염 또는 건선성 관절염), 신장 염증, 원형 탈모증, 피부 염증(예: 화학적으로 유도된 피부 염증, 건선, 농포성 건선, 전신성 농포 건선, 손발바닥 농포증, 손발바닥 농포성 건선, 심상성 건선 또는 건선성 피부 병변), 가시세포증, 각막 비후증, 킨들러 증후군, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 신증후군, ANCA(항-호중구 세포질 항체) 관련 혈관병증, 세뇨관 간질성 병변, 또는 사구체신염이다.

염증성 장애는 건강한 조직의 파괴를 야기할 수 있는 조절되지 않거나 원하지 않는 염증을 특징으로 하는 장애이다.

자가면역 질환은 면역 체계가 실수로 자신의 몸을 공격하는 병태이다.

포진성 농가진(IH)은 드문 임신성 피부병의 하나로서, 현재는 전신성 농포 건선의 한 형태로 간주된다. 본 발명의 일 구현예에서, IL36RN에서의 돌연변이가 IH의 근원이다.

말단피부염은 가령 3개월 내지 15세의 소아에게 영향을 미칠 수 있는 피부 병태로서, 신체 상에 가려운 적색 또는 자주색 수포의 발생, 복부 팽만, 발열, 및 림프절이 붓고 아픈 것을 특징으로 한다. 말단피부염의 원인은 바이러스일 수 있다. IL-36 수용체 길항제(예를 들어, IL-36Ra)의 돌연변이는 GPP 환자 및 연속성 말단피부염 환자에서 높은 비율로 존재한다. 본 발명의 일 구현예에서, IL36RN에서의 돌연변이가 말단피부염의 근원이다.

건선은 피부 플라크를 유발하는 자가면역 질환으로서, 피부 플라크는 가려움 또는 통증을 수반하는 두껍고 건조한 홍피성 패치(patch)이다. 건선의 가장 흔한 형태는 심상성 건선(판상 건선)이며, 이는 무릎, 팔꿈치, 두피 및 몸통을 포함하여 모든 피부 부위에 나타날 수 붉게 융기된 피부의 뚜렷한 플라크를 특징으로 한다. 플라크 위에 쌓인 은빛이 도는 흰색의 박편은 인설(scale)이라 불리는데, 이는 죽은 피부 세포로 구성된다. 이러한 인설은 느슨해지면서 플라크로부터 끊임없이 떨어져 나간다. 피부 증상으로는 통증, 가려움 및 갈라짐이 있다.

전신성 농포 건선(GPP)은 중증 형태의 건선이다. GPP를 가진 개체는 일반적으로 피부의 넓은 부위가 붉어지고 염증이 생기며 고름으로 채워진 수포(농포)가 발생하는 에피소드를 반복적으로 겪는다. GPP를 가진 대상체의 일부는 플라크로 고통을 겪는다. 피부 문제로는 발열, 극도의 피로감(피로), 근쇠약, 백혈구 수 증가, 신체 전반에 걸친 다른 염증 징후(전신 염증)을 동반할 수 있다. IL-36 사이토카인은 GPP의 발생에 역할을 하는 것으로 보인다. 본 발명의 일 구현예에서, IL36RN에서의 돌연변이가 GPP의 근원이다.

손발바닥 농포 건선(PPPP; 4P)은 국소성 농포 건선의 한 형태로서, 피부의 손발바닥 표면에서 플라크와 농포가 발생하는 것을 특징으로 한다. PPPP는 IL-36R 길항제 기능의 이상을 초래하는 동형접합체 또는 화합물 이형접합체 IL36RN 유전자 돌연변이와 관련이 있을 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, IL36RN에서의 돌연변이가 PPPP의 근원이다.

손발바닥 농포증(PPP; 3P)은 면역 매개 장애로서, 수포와 같은 농포를 손바닥과 발바닥에 나타나게 한다. 일반적으로, PPP가 있는 대상체는 플라크로 고통 받지는 않는다. 본 발명의 일 구현예에서, IL36RN에서의 돌연변이가 PPP의 근원이다.

인터루킨 IL-36 수용체 길항제(DITRA) 결핍 증후군은 IL36RN의 돌연변이에 의해 야기되는 희귀한 상 염색체 열성 질환이다. DITRA는 IL36R 길항제 결핍증으로 인한 고열, 무력증, 및 전신 염증과 관련된 전신성 농포 건선의 재발 및 중증 발적을 특징으로 하는 면역 결핍증을 수반하는 희귀한 유전적 자가염증성 증후군이다. 건선성 손발톱 변화(예: 파임 및 손발톱탈락증)와 어린선(ichthyosis)은 때때로 관련이 있을 수 있다. Marrakchi 등의 문헌[New Engl J. Med. 365(7): 620-628 (2011)] 참조. 본 발명의 일 구현예에서, IL36RN에서의 돌연변이가 DITRA의 근원이다.

염증성 질환은 대상체의 신체 내 하나 이상의 부위에서 비정상적인 염증을 특징으로 하는 병태이다. 자가면역 질환은 대상체의 자가 면역 체계가 대상체의 신체 조직을 비정상적인 공격하는 것을 특징으로 하는 병태이다.

ANCA 관련 혈관병증(AAV)은 다발성 혈관염을 동반한 육아종증(이전의 베게너 육아종증), 현미경적 다발성 혈관염, 및 EGPA/처그 스트라우스를 포함하는 염증성 장애이다. 이들 병태는 혈관 폐색 및 신장과 같은 필수 기관으로 가는 혈류 감소를 초래하는 만성 염증을 특징으로 한다.

염증성 장 질환(IBD)은 위장(GI)관의 만성 염증을 특징으로 하는 2가지 병태(크론병 및 궤양성 대장염)를 포함하는 용어이다.

호중구성 기도 염증은 폐로 호중구가 유입되어 매개되는 기도의 염증이다. 호중구성 기도 염증의 징후 및 증상은 천식 및 천명(wheezing)을 포함한다.

만성 폐색성 폐질환(COPD)은 폐로부터의 기류 폐색을 유발하는 만성 염증성 폐질환이다. 징후 및 증상은 호흡곤란, 기침, 점액(가래) 생성 및 천명을 포함한다.

강직성 척추염(AS)은 척추(예: 천장(SI) 관절 및 축상 골격)의 장기간 염증을 특징으로 하는 질환이다. 시간이 지남에 따라, AS는 척추의 일부 요추골이 서로 달라붙게 만들 수 있다. 증상으로는 허리와 둔부의 통증과 경직이 있다.

류마티스성 관절염은 관절 염증을 특징으로 하는 자가면역 병태이다. 증상으로는 압통, 온감, 관절 부종; 관절 경직, 피로, 발열 및 체중 감소가 있다.

건선성 관절염은 관절염의 한 형태로서 건선 환자 중 일부에게서 발병한다. 증상으로는 손가락과 발가락 부종, 발 통증 및 허리 통증이 있다.

원형 탈모증은 신체에 작은 탈모 부위가 생기는 것을 특징으로 하는 부분 탈모(spot baldness)이다.

가시세포증은 피부의 유극층(단순 세포층)의 미만성 표피 비후화(과다형성)로서, 해당 부분은 다른 피부보다 더 짙게 보일 수 있다. 과다각화증은 피부 외층이 비후화되는 것이다.

과다각화증은 종종 햇빛, 화학물질 또는 빈번한 마찰 또는 압력으로 인해 피부가 비후화되는 것이다. 피부 비후화는 케라틴이라고 불리는 질긴 보호 단백질을 함유하는 피부의 외층에서 일반적으로 발생한다.

킨들러 증후군은 선천성 말단 피부 수포, 감광성, 진행성 다형피부증, 및 미만성 피부 위축을 특징으로 하는 상염색체 열성 유전성 피부병이다. 증상은 점막에서 흔히 나타나며, 구강 점막, 치은, 및 위장관에서도 빈번하게 발생한다.

전신 홍반성 루푸스(SLE)는 자가면역 질환이다. 이 질환에서는 신체의 면역 체계가 실수로 건강한 조직을 공격한다. SLE는 피부, 관절, 신장, 뇌 및 기타 기관에 영향을 미칠 수 있다.

신증후군은 신체가 소변을 통해 지나치게 많은 단백질을 배출 시키는 신장 장애입니다. 신증후군은 혈액에서 노폐물과 과도한 수분을 걸러내는 신장 내 작은 혈관 클러스터의 손상으로 인해 일반적으로 발생한다. 신증후군 증상에는 부기(부종), 특히 발과 발목의 부기, 거품이 많은 소변, (체액 저류로 인한) 체중 증가, 피로 및 식욕 상실이 포함될 수 있다.

사구체신염은 신장 사구체의 염증이다. 증상으로는 소변 내 적혈구로 인한 잉크색 또는 콜라색의 소변(혈뇨), (단백뇨로 인한) 거품이 많은 소변, 높은 혈압(고혈압), 체액 저류(부종) 등이 있다.

IL-36R 매개 질환의 치료 또는 예방을 위한 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편(예: H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2)의 유효 투여량 또는 치료적 유효 투여량은, 질환의 임상적 표시, 징후 및/또는 증상의 퇴행 또는 제거를 유도하거나, 이러한 표시, 징후 및/또는 증상의 진행을 억제함으로써, 치료된 대상체에서 질환의 임상적 표시, 징후 및/또는 증상 중 하나 이상을 완화하기에 충분한 항체 또는 단편의 양을 지칭한다. 투여량은 투여 대상체의 연령 및 크기, 표적 질환, 상태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 예를 들어 성인 인간 대상체에서 IL36R 매개 질환을 치료 또는 예방하기 위한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 유효 투여량 또는 치료적 유효 투여량은 약 1 mg/kg 이상, 예를 들어 약 1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg이다. 감염의 중증도에 따라, 치료의 빈도와 기간을 조정할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 초기 투여량으로 투여되고, 이어서 1회 이상의 이차 투여량이 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 초기 투여량에 이어서 항원 결합 단백질의 제2 또는 복수의 후속 투여량은 초기 투여량과 거의 동일하거나 더 적은 양으로 투여되며, 여기서 후속 투여량들 간에는 적어도 1 내지 3일; 적어도 1주; 적어도 2주; 적어도 3주; 적어도 4주; 적어도 5주; 적어도 6주; 적어도 7주; 적어도 8주; 적어도 9주; 적어도 10주; 적어도 12주; 또는 적어도 14주만큼 간격을 둔다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 포유동물(예를 들어, 랫트, 마우스, 고양이, 개, 소, 양, 말, 염소, 토끼), 바람직하게는 인간, 예를 들어 IL-36R 매개 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 인간을 지칭한다. 대상체는 IL-36R 매개 질환을 가질 수 있거나, 이러한 질환에 걸리기 쉽다. 본 발명의 일 구현예에서, 대상체는 동형접합성 또는 이형접합성 IL36RN 돌연변이 유전자형을 갖는다.

본 발명은 IL36R-매개 질환이 발생할 위험이 있는 대상체에게 항-IL36R 항원 결합 단백질을 투여하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 질환은 피부 염증성 질환 또는 결장 염증성 질환이다. 본원의 실시예 5는 DITRA-유사 마우스 모델에서 피부 염증 질환이 이미퀴모드에 노출하기 전 및 피부 염증 증상의 발생 전에 예방될 수 있다는 것을 입증하였다. 본 발명의 일 구현예에서, IL36R-매개 질환(예를 들어, 피부 염증)은 임의의 임상적으로 유의한 염증 이전에, 예를 들어, 피부 염증 이전에, 또는 염증 유도성 피부 두께에 있어서, (본원에서 논의된 바와 같은) 총 병리 점수에 있어서, 또는 피부 내 KC-GRO, IL-6, IL-1beta 또는 TNFalpha와 같은 전염증성 사이토카인의 존재에 있어서 임의의 증가가 있기 전에 항원 결합 단백질의 예방적 투여량을 대상체에게 투여함으로써 예방된다. 본 발명의 일 구현예에서, IL36R-매개 질환을 예방하기 위한 본 발명의 항-IL36R 항원 결합 단백질의 투여량은 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg이다.

조합 및 약학적 조성물

본 발명은 항-IL36R 항원 결합 단백질 및 하나 이상의 성분을 포함하는 조성물뿐만 아니라 이의 사용 방법 및 이러한 조성물을 만드는 방법을 제공한다.

항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 및 이의 항원 결합 단편(예를 들어, H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2)의 약학적 조성물을 제조하기 위해, 항원 결합 단백질을 약학적으로 허용 가능한 운반체 또는 부형제와 혼합한다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984); Hardman 등의 문헌[(2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.]; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis 등의 문헌[(eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY]; Lieberman 등의 문헌[(eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY]; Lieberman 등의 문헌[(eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.]을 참조한다. 본 발명의 일 구현예에서, 약학적 조성물은 멸균 상태이다. 이러한 조성물은 본 발명의 일부이다.

본 발명의 약학적 조성물은, 예를 들어, 물, 완충제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 비이온성 세제, 항산화제 및/또는 기타 미량 첨가제와 같은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 및/또는 안정화제를 포함한다.

본 발명의 범위는 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2), 또는 이의 약학적 조성물(약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하지만 실질적으로 물은 포함하지 않음)을 포함하는 건조된, 예를 들어, 동결 건조된 조성물을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예: H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2)과 연계하여 대상체에게 투여되는 추가의 치료제는 의사의 처방 참고집 2003(Physicians' Desk Reference)(Thomson Healthcare; 57^th edition (Nov. 1, 2002))에 따라 대상체에게 투여된다.

항원 결합 단백질 또는 이의 조성물의 투여 방법은 다양할 수 있다. 투여 경로는 경구, 직장, 경점막, 장, 비경구; 근육내, 피하, 피내, 골수내, 경막내, 직접 뇌실내, 정맥내, 복강내, 비강내, 안구내, 흡입, 취입, 국소, 피부, 경피, 또는 동맥내를 포함한다.

본 발명은 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예: H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2)을 대상체에게 투여하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 단백질 또는 약학적 조성물 또는 이들의 조합을 대상체의 신체 내로 도입하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어 주사기 바늘을 대상체의 신체에 찔러 넣는 단계, 및 항원 결합 단백질 또는 약학적 조성물 또는 이들의 조합을 대상체의 신체 내로, 예를 들어, 대상체의 정맥, 동맥, 종양, 근육 조직 또는 피하 조직에 주입하는 단계를 포함한다.

본 발명은 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예: H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2) 중 어느 하나, 또는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물, 또는 이들의 조합을 포함하는 용기(예를 들어, 캡 또는 크로마토그래피 컬럼, 중공 보어형 주사 바늘, 또는 주사기 실린더가 구비된 플라스틱 또는 유리 바이알)를 제공한다.

본 발명은 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2)을 포함하고, 하나 이상의 추가의 치료제와 연계된 조합을 포함한다. 항-IL36R 항원 결합 단백질 및 추가의 치료제는 단일 조성물 또는 별도의 조성물일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 추가 치료제는 항염증제이다. 본 발명의 일 구현예에서, 추가의 치료제는 또 다른 항-IL35R 항원 결합 단백질, IL17 억제제, IL23p19 억제제, IL12p40 억제제, 구셀쿠맙, 우스테키누맙, 브로달루맙, 익세키주맙, 세쿠키누맙, 항-TNFalpha 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 인간 IgG1의 Fc 부분과 같은 면역글로불린에 연결된 하나 이상의 인간 TNF 수용체 또는 이의 단편, 인플릭시맙, 아달리무맙, 에타너셉트, 두필루맙, 사릴루맙, 토실리주맙, 골리무맙, 아바타셉트, 토파시티닙, 아바타셉트, 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 이부프로펜, 나프록센, 아세트아미노펜, 아스피린, 셀레콕시브, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 코르티코스테로이드, 코르티손, 또는 프레드니손이다.

항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2를 추가의 치료제와 연계하여 투여함으로써, IL-36 매개 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하거나 예방하는 방법은 본 발명의 일부이다.

용어 "연계하여(in association with)"는 성분인, 본 발명의 항-IL36R 항원 결합 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편이 메토트렉세이트와 같은 다른 제제와 함께 가령 동시 전달을 위한 단일 조성물로 제형화되거나, 2가지 이상의 조성물(예를 들어, 각각의 성분을 포함하는 키트)로 별도로 제형화될 수 있음을 나타낸다. 각각의 성분은 다른 성분이 투여되는 시간과 다른 시간에 대상체에게 투여될 수 있으며; 예를 들어, 각각의 투여는 주어진 기간에 걸쳐 간격을 두고 비동시적으로 (예를 들어, 개별적으로 또는 순차적으로) 투여될 수 있다. 또한, 별도의 성분은 동일한 경로 또는 상이한 경로로 대상체에게 투여될 수 있다.

실시예

하기 실시예들은 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시와 설명을 제공하도록 제시되며, 발명자들이 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.

실시예 1 : IL-36R에 특이적으로 결합하는 인간 항체의 생성

전장 IL36R (IL-1RL2) 서열을 포함하는 DNA 면역원으로 VELOCIMMUNE 마우스(즉, 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 조작된 마우스)를 면역화하여 항-IL36R 항체를 수득하였다. IL36R-특이적 면역분석법에 의해 항체 면역 반응을 모니터링하고, 완전한 인간 항-IL36R 항체를 단리하고 정제하였다. 본원에 제시된 바와 같이 생성된 항체의 VH 및 VL과 이들의 각 생식선 간의 예시적 비교는 도 1 및 도 2에 제시되어 있다.

[표 1] 본 발명의 면역글로불린 사슬 서열*

*V_H, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, V_L, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3에 상응하는 수는 본원에 제시된 서열번호를 지칭한다. "PEP"는 아미노산 서열을 지칭하고; "DNA"는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.

서열번호 1

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATT

CACCTTTGATGATTATGCCATACACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGTTATCAGTTGGA

ATAGTGATATCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTAT

CTGCAAATGAATAGTCTGAGAACTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGGATATAACTGGAACTTCTTTGACTA

TTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

서열번호 2

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAIHWVRQAPGKGLEWVSVISWNSDIIGYADSVKGRFTVSRDNAKNSLY

LQMNSLRTEDTALYYCAKGYNWNFFDYWGQGTLVTVSS;

서열번호 3

GGA TTC ACC TTT GAT GAT TAT GCC;

서열번호 4

G F T F D D Y A;

서열번호 5

ATC AGT TGG AAT AGT GAT ATC ATA;

서열번호 6

I S W N S D I I;

SEQ ID NO: 7

GCA AAA GGA TAT AAC TGG AAC TTC TTT GAC TAT;

서열번호 8

A K G Y N W N F F D Y;

서열번호 9

GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTATCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCA

GAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATAATGCAGCAAACA

GGGCCACTGACATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCT

GAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAA

A;

서열번호 10

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYNAANRATDIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP

EDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK;

서열번호 11

CAG AGT GTT AGC AGC TAC;

서열번호 12

Q S V S S Y;

서열번호 13

AAT GCA GCA;

서열번호 14

N A A;

서열번호 15

CAG CAG CGT AGC AAC TGG CCT CTC ACT;

서열번호 16

Q Q R S N W P L T;

서열번호 17

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT

CACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAACTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTAGTTGGA

ATAGTGATGTCATAGCCTATTCGGACTCTGTGAAGGGCCGCTTCACCATTTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTAT

CTGCAAATGAACAGTCTGGGAACTGAGGACACGGCCTTATATTACTGTGCAAAAGGCCATAACTGGAACTTCTTTGACTA

TTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

서열번호 18

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQTPGKGLEWVSVISWNSDVIAYSDSVKGRFTISRDNAKNSLY

LQMNSLGTEDTALYYCAKGHNWNFFDYWGQGTLVTVSS;

서열번호 19

GGA TTC ACC TTT GAT GAT TAT GCC;

서열번호 20

G F T F D D Y A;

서열번호 21

ATT AGT TGG AAT AGT GAT GTC ATA;

서열번호 22

I S W N S D V I;

서열번호 23

GCA AAA GGC CAT AAC TGG AAC TTC TTT GAC TAT;

서열번호 24

A K G H N W N F F D Y;

서열번호 25

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGAGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCA

GAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATAATGTAGCCAACA

GGGCCACAGACATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCGGCCTAGAGCCT

GAAGATTTTGCAGTTTATTTCTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAA

A;

서열번호 26

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYNVANRATDIPARFSGSGSGTDFTLTISGLEP

EDFAVYFCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK;

서열번호 27

CAG AGT GTT AGC AGC TAC;

서열번호 28

Q S V S S Y;

서열번호 29

AAT GTA GCC;

서열번호 30

N V A;

서열번호 31

CAG CAG CGT AGC AAC TGG CCT CTC ACT;

서열번호 32

Q Q R S N W P L T;

서열번호 33

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATT

CACCTTTGATGATTATGCCATACACTGGGTCCGGCAATCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGTTATCAGTTGGA

ATAGTGATGTCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTAT

CTGCAGATGAATAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGGATATAACTGGAACTTCTTTGACTA

TTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

서열번호 34

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFDDYAIHWVRQSPGKGLEWVSVISWNSDVIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLY

LQMNSLRAEDTALYYCAKGYNWNFFDYWGQGTLVTVSS;

서열번호 35

GGA TTC ACC TTT GAT GAT TAT GCC;

서열번호 36

G F T F D D Y A;

서열번호 37

ATC AGT TGG AAT AGT GAT GTC ATA;

서열번호 38

I S W N S D V I;

서열번호 39

GCA AAA GGA TAT AAC TGG AAC TTC TTT GAC TAT;

서열번호 40

A K G Y N W N F F D Y;

서열번호 41

A;

서열번호 42

EDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK;

서열번호 43

CAG AGT GTT AGC AGC TAC;

서열번호 44

Q S V S S Y;

서열번호 45

AAT GCA GCA;

서열번호 46

N A A;

서열번호 47

CAG CAG CGT AGC AAC TGG CCT CTC ACT;

서열번호 48

Q Q R S N W P L T;

서열번호 49

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT

CACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAATGGGTCTCAGTTATTAGTTGGA

ATAGTGATGTCATAGCCTATTCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTAT

CTGCAAATGAACAGTCTGAGAACTGAGGACACGGCCTTATATTACTGTACAAAAGGCCATAAGTGGAGCTTCTTTGACTA

TTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

서열번호 50

EVQLVESGGDLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSVISWNSDVIAYSDSVKGRFTISRDNAKNSLY

LQMNSLRTEDTALYYCTKGHKWSFFDYWGQGTLVTVSS;

서열번호 51

GGA TTC ACC TTT GAT GAT TAT GCC;

서열번호 52

G F T F D D Y A;

서열번호 53

ATT AGT TGG AAT AGT GAT GTC ATA;

서열번호 54

I S W N S D V I;

SEQ ID NO: 55

ACA AAA GGC CAT AAG TGG AGC TTC TTT GAC TAT;

SEQ ID NO: 56

T K G H K W S F F D Y;

SEQ ID NO: 57

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCA

GAGTATTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGACTCCTCATCTTTAATGTAGCCAACA

A;

SEQ ID NO: 58

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIFNVANRATDIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP

EDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIK;

SEQ ID NO: 59

CAG AGT ATT AGC AGC TAC;

SEQ ID NO: 60

Q S I S S Y;

SEQ ID NO: 61

AAT GTA GCC;

SEQ ID NO: 62

N V A;

SEQ ID NO: 63

CAG CAG CGT AGC AAC TGG CCT CTC ACT;

SEQ ID NO: 64

Q Q R S N W P L T;

SEQ ID NO: 65

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTTCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGATT

CACCTTTAGCGACTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTGGAA

ATGGTGGTGACACATACTACGGAGACTTCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT

CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGGCGAGGACACGGCCGCATATTTCTGTGTGATAGATCTTGACTATTGGGGTCAGGGAAC

CCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 66

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSGISGNGGDTYYGDFVKGRFTISRDNSKNTLY

LQMNSLRGEDTAAYFCVIDLDYWGQGTLVTVSS;

SEQ ID NO: 67

GGA TTC ACC TTT AGC GAC TAT GCC;

SEQ ID NO: 68

G F T F S D Y A;

SEQ ID NO: 69

ATT AGT GGA AAT GGT GGT GAC ACA;

SEQ ID NO: 70

I S G N G G D T;

SEQ ID NO: 71

GTG ATA GAT CTT GAC TAT;

SEQ ID NO: 72

V I D L D Y;

SEQ ID NO: 73

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGAAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCA

GAGTATTAGTAGCTGGTTGGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAGGCTCCTGATCTATAAGGCGTCTATTT

TAGGAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT

GATGATTTTGCTACTTATTACTGCCACCAGTATAATAGTTATTTGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAA

A;

SEQ ID NO: 74

DIQMTQSPSTLSASEGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPRLLIYKASILGDGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQP

DDFATYYCHQYNSYLWTFGQGTKVEIK;

SEQ ID NO: 75

CAG AGT ATT AGT AGC TGG;

SEQ ID NO: 76

Q S I S S W;

SEQ ID NO: 77

AAG GCG TCT;

SEQ ID NO: 78

K A S;

SEQ ID NO: 79

CAC CAG TAT AAT AGT TAT TTG TGG ACG;

SEQ ID NO: 80

H Q Y N S Y L W T;

SEQ ID NO: 81

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGG

CTCCATCAGCAGTGCTGATTACTATTGGAGCTGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGATCCATCT

ATTATACTGGGAGTACTTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGACTTACCATATCAATAGACACGTCTGAGAACCAGTTC

TCTTTGAAACTGACCTCTCTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGCGAGGAGGCTAACTGGGGATCCCA

CTTTGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 82

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSADYYWSWIRQHPGKGLEWIGSIYYTGSTYYNPSLKSRLTISIDTSENQF

SLKLTSLTAADTAVYYCASEEANWGSHFDSWGQGTLVTVSS;

SEQ ID NO: 83

GGT GGC TCC ATC AGC AGT GCT GAT TAC TAT;

SEQ ID NO: 84

G G S I S S A D Y Y;

SEQ ID NO: 85

ATC TAT TAT ACT GGG AGT ACT;

SEQ ID NO: 86

I Y Y T G S T;

SEQ ID NO: 87

GCG AGC GAG GAG GCT AAC TGG GGA TCC CAC TTT GAC TCC;

SEQ ID NO: 88

A S E E A N W G S H F D S;

SEQ ID NO: 89

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCA

GAGCATTGACAACTTTTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTT

TGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT

GAAGATTTTGCATCTTACTACTGTCAACATAGTCACAGTGCCCATCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGAT

TAAA;

SEQ ID NO: 90

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDNFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP

EDFASYYCQHSHSAHPITFGQGTRLEIK;

SEQ ID NO: 91

CAG AGC ATT GAC AAC TTT;

SEQ ID NO: 92

Q S I D N F;

SEQ ID NO: 93

GCT GCA TCC;

SEQ ID NO: 94

A A S;

SEQ ID NO: 95

CAA CAT AGT CAC AGT GCC CAT CCG ATC ACC;

SEQ ID NO: 96

Q H S H S A H P I T;

SEQ ID NO: 97

CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGG

CTCCATCAGCAGTAGTAATTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGAGACTGGAGTGGATTGGGAGTATCT

ATTATAGTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGACTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAATCAGTTC

TCCCTGAAGCTGACCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGAAGCAGCAGCTTTGACGCA

CTTTGACTTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 98

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSNYYWGWIRQPPGKRLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKTRVTISVDTSKNQF

SLKLTSVTAADTAVYYCAREEAAALTHFDFWGQGTLVTVSS;

SEQ ID NO: 99

GGT GGC TCC ATC AGC AGT AGT AAT TAC TAC;

SEQ ID NO: 100

G G S I S S S N Y Y;

SEQ ID NO: 101

ATC TAT TAT AGT GGG AGC ACC;

SEQ ID NO: 102

I Y Y S G S T;

SEQ ID NO: 103

GCG AGA GAG GAA GCA GCA GCT TTG ACG CAC TTT GAC TTC;

SEQ ID NO: 104

A R E E A A A L T H F D F;

SEQ ID NO: 105

GAGCATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTTGCTGCATCCAGTT

TACAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT

GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACATAGTCACAGTTCCCATCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGAT

TAAA;

SEQ ID NO: 106

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIFAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP

EDFATYYCQHSHSSHPITFGQGTRLEIK;

SEQ ID NO: 107

CAG AGC ATT AGC AAC TAT;

SEQ ID NO: 108

Q S I S N Y;

SEQ ID NO: 109

GCT GCA TCC;

SEQ ID NO: 110

A A S;

SEQ ID NO: 111

CAA CAT AGT CAC AGT TCC CAT CCG ATC ACC;

SEQ ID NO: 112

Q H S H S S H P I T;

SEQ ID NO: 113

CACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAATTGGG

CTGGTTATAACATAGACTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTAT

CTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATATGCGTGGATTCAGTTATGGTTT

CCCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 114

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGINWAGYNIDYADSVKGRFTISRDNAKNSLY

LQMNSLRAEDTALYYCAKDMRGFSYGFPFDYWGQGTLVTVSS;

SEQ ID NO: 115

GGA TTC ACC TTT GAT GAT TAT GCC;

SEQ ID NO: 116

G F T F D D Y A;

SEQ ID NO: 117

ATT AAT TGG GCT GGT TAT AAC ATA;

SEQ ID NO: 118

I N W A G Y N I;

SEQ ID NO: 119

GCA AAA GAT ATG CGT GGA TTC AGT TAT GGT TTC CCC TTT GAC TAC;

SEQ ID NO: 120

A K D M R G F S Y G F P F D Y;

SEQ ID NO: 121

GAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTT

TGCAAAGTGGGGTCCCGTCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT

GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGAT

TAAA;

SEQ ID NO: 122

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP

EDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK;

SEQ ID NO: 123

CAG AGC ATT AGC AGC TAT;

SEQ ID NO: 124

Q S I S S Y;

SEQ ID NO: 125

GCT GCA TCC;

SEQ ID NO: 126

A A S;

SEQ ID NO: 127

CAA CAG AGT TAC AGT ACC CCT CCG ATC ACC;

SEQ ID NO: 128

Q Q S Y S T P P I T;

SEQ ID NO: 129

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTAAAGCCGGGGGGGTCCCTTAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT

TATTTTCAGTAACGCCTGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGCGTGGGTTGGCCGTATTAAAACCG

AAACTGATGGTGGGACAACAGACTACGCTGCACCCGTAAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGACTCAAAAAACACG

CTGTATCTGCAAATGAACAGCGTGAAAACCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTACAGGGGGATACAGCTATGGTGACGA

TAGCAGCAGCTGGAACGAGGGCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 130

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFIFSNAWMNWVRQAPGKGLAWVGRIKTETDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNT

LYLQMNSVKTEDTAVYYCTGGYSYGDDSSSWNEGYYYYGMDVWGQGTTVTVSS;

SEQ ID NO: 131

GGA TTT ATT TTC AGT AAC GCC TGG;

SEQ ID NO: 132

G F I F S N A W;

SEQ ID NO: 133

ATT AAA ACC GAA ACT GAT GGT GGG ACA ACA;

SEQ ID NO: 134

I K T E T D G G T T;

SEQ ID NO: 135

ACA GGG GGA TAC AGC TAT GGT GAC GAT AGC AGC AGC TGG AAC GAG GGC TAC TAC TAC TAC GGT ATG GAC GTC;

SEQ ID NO: 136

T G G Y S Y G D D S S S W N E G Y Y Y Y G M D V;

SEQ ID NO: 137

CACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTCGTTGGA

ATGGTGGTAGTATAGGCTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAGTCCCTGCAT

CTGCAAATGAACAGTCTAAAAACTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATATAGGCGATATTTTGACTGGTTT

TTATGGAGAATACGGAATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 138

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGIRWNGGSIGYVDSVKGRFTISRDNAKKSLH

LQMNSLKTEDTALYYCAKDIGDILTGFYGEYGMDVWGQGTTVTVSS;

SEQ ID NO: 139

GGA TTC ACC TTT GAT GAT TAT GCC;

SEQ ID NO: 140

G F T F D D Y A;

SEQ ID NO: 141

ATT CGT TGG AAT GGT GGT AGT ATA;

SEQ ID NO: 142

I R W N G G S I;

SEQ ID NO: 143

GCA AAA GAT ATA GGC GAT ATT TTG ACT GGT TTT TAT GGA GAA TAC GGA ATG GAC GTC;

SEQ ID NO: 144

A K D I G D I L T G F Y G E Y G M D V;

SEQ ID NO: 145

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGAAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCA

GAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAAGCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTT

TGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCT

GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACATTATCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAA

A;

SEQ ID NO: 146

DIQMTQSPSSLSASEGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKAGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQP

EDFATYYCQQSYIIPYTFGQGTKLEIK;

SEQ ID NO: 147

CAG AGC ATT AGC AGC TAT;

SEQ ID NO: 148

Q S I S S Y;

SEQ ID NO: 149

GCT GCA TCC;

SEQ ID NO: 150

A A S;

SEQ ID NO: 151

CAA CAG AGT TAC ATT ATC CCG TAC ACT;

SEQ ID NO: 152

Q Q S Y I I P Y T;

SEQ ID NO: 153

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGGTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT

CACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAAGTGTTAGGTGGA

ATGGTGGTATTATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTAT

CTGCAAATGAACAGTCTGAGACCTGAGGACACGGCCCTCTATTACTGTGCAAAAGATATAGGCGATGTTTTGACTGGTTA

TTATGGAGAATACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 154

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSSVRWNGGIIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLY

LQMNSLRPEDTALYYCAKDIGDVLTGYYGEYGMDVWGQGTTVTVSS;

SEQ ID NO: 155

GGA TTC ACC TTT GAT GAT TAT GCC;

SEQ ID NO: 156

G F T F D D Y A;

SEQ ID NO: 157

GTT AGG TGG AAT GGT GGT ATT ATA;

SEQ ID NO: 158

V R W N G G I I;

SEQ ID NO: 159

GCA AAA GAT ATA GGC GAT GTT TTG ACT GGT TAT TAT GGA GAA TAC GGT ATG GAC GTC;

SEQ ID NO: 160

A K D I G D V L T G Y Y G E Y G M D V;

SEQ ID NO: 161

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCGCTTGCCGGGCAAGTCA

GAGCATTACCACCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTT

TGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGTCTGCAACCT

GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACATTTCCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA;

SEQ ID NO: 162

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIACRASQSITTYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP

EDFATYYCQQSYISPYTFGQGTKLEIK;

SEQ ID NO: 163

CAG AGC ATT ACC ACC TAT;

SEQ ID NO: 164

Q S I T T Y;

SEQ ID NO: 165

GCT GCA TCC;

SEQ ID NO: 166

A A S;

SEQ ID NO: 167

CAA CAG AGT TAC ATT TCC CCG TAC ACT;

SEQ ID NO: 168

Q Q S Y I S P Y T;

SEQ ID NO: 169

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAAGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT

CACCTTCAGTAATTATGGCATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCGATTATATTATATG

ATGGAAGTAATCAACACTATGCAGATTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATTTCCAGAGACAATTCCAAAAACACGCTGTAT

CTTCAAATGAACAACCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAGATCTTGATCTTTGGAGTGGTTATTA

TACAAACGGGGACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA;

SEQ ID NO: 170

QVQLVESGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSNYGIHWVRQAPGKGLEWVAIILYDGSNQHYADSVKGRFTISRDNSKNTLY

LQMNNLRAEDTAVYYCARDLDLWSGYYTNGDGMDVWGQGTTVTVSS;

SEQ ID NO: 171

GGA TTC ACC TTC AGT AAT TAT GGC;

SEQ ID NO: 172

G F T F S N Y G;

SEQ ID NO: 173

ATA TTA TAT GAT GGA AGT AAT CAA;

SEQ ID NO: 174

I L Y D G S N Q;

SEQ ID NO: 175

GCG AGA GAT CTT GAT CTT TGG AGT GGT TAT TAT ACA AAC GGG GAC GGT ATG GAC GTC;

SEQ ID NO: 176

A R D L D L W S G Y Y T N G D G M D V;

본 발명의 항원 결합 단백질의 불변 도메인을 포함하는 중쇄 및 경쇄 면역글로불린의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 아래에 제시되어 있다:

H4H14699P2

중쇄 DNA

TTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCA

GGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAAC

TCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT

GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACA

AGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTG

TTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGA

AGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGT

TCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG

GTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTA

CACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCG

ACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC

TCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCA

TGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

(SEQ ID NO: 179)

중쇄 폴리펩티드

LQMNSLRTEDTALYYCAKGYNWNFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN

SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFL

FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK

VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG

SFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO: 180)

경쇄 DNA

ACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGT

GCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAG

GAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGA

GAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGT

GT

(SEQ ID NO: 181)

경쇄 폴리펩티드

EDFAVYYCQQRSNWPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ

ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 182)

H4H14700P2

중쇄 DNA

TGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

(SEQ ID NO: 183)

중쇄 폴리펩티드

LQMNSLGTEDTALYYCAKGHNWNFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN

SFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO: 184)

경쇄 DNA

GT

(SEQ ID NO: 185)

경쇄 폴리펩티드

EDFAVYFCQQRSNWPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ

ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 186)

H4H14706P2

중쇄 DNA

TGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

(SEQ ID NO: 187)

중쇄 폴리펩티드

LQMNSLRAEDTALYYCAKGYNWNFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN

SFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO: 188)

경쇄 DNA GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTATCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCA

GT

(SEQ ID NO: 189)

경쇄 폴리펩티드

ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 190)

H4H14708P2

중쇄 DNA

TGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

(SEQ ID NO: 191)

중쇄 폴리펩티드

LQMNSLRTEDTALYYCTKGHKWSFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN

SFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO: 192)

경쇄 DNA

GT

(SEQ ID NO: 193)

경쇄 폴리펩티드

ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 194)

H4H14709P

중쇄 DNA

CCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGA

GCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACC

AGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG

CAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCA

AATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCC

AAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCA

GTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACC

GTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGC

CTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATC

CCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT

GGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTAC

AGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA

CCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

(SEQ ID NO: 195)

중쇄 폴리펩티드

LQMNSLRGEDTAAYFCVIDLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT

SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKP

KDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKG

LPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY

SRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO: 196)

경쇄 DNA

GT

(SEQ ID NO: 197)

경쇄 폴리펩티드

DDFATYYCHQYNSYLWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ

ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 198)

H4H14728P

중쇄 DNA

CTTTGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGC

CCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTG

TCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAG

CAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCA

AGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCA

GTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGT

GAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG

AGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTAC

AAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCC

ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCT

ACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC

TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTC

CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

(SEQ ID NO: 199)

중쇄 폴리펩티드

SLKLTSLTAADTAVYYCASEEANWGSHFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV

SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPS

VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY

KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO: 200)

경쇄 DNA

TAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTG

TGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC

CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTA

CGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAG

AGTGT

(SEQ ID NO: 201)

경쇄 폴리펩티드

EDFASYYCQHSHSAHPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS

QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 202)

H4H14731P

중쇄 DNA

CTTTGACTTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGC

CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

(SEQ ID NO: 203)

중쇄 폴리펩티드

SLKLTSVTAADTAVYYCAREEAAALTHFDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV

SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO: 204)

경쇄 DNA

AGTGT

(SEQ ID NO: 205)

경쇄 폴리펩티드

EDFATYYCQHSHSSHPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS

QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 206)

H4H14732P2

중쇄 DNA

CCCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGG

CGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG

GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT

CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACA

CCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCA

TCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGA

CGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGC

GGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAG

TACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA

GCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT

TCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTG

GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATG

CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

(SEQ ID NO: 207)

중쇄 폴리펩티드

LQMNSLRAEDTALYYCAKDMRGFSYGFPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT

VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGP

SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE

YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL

DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO: 208)

경쇄 DNA

TAAAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGT

GTTAG

(SEQ ID NO: 209)

경쇄 폴리펩티드

EDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIKTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ

ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 210)

H4H14734P2

중쇄 DNA

TAGCAGCAGCTGGAACGAGGGCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAG

CCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGC

CTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC

GGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCT

ACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCA

CCCTGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTC

CCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATG

GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC

GTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAA

AACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGA

ACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG

GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAA

GAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCC

TCTCCCTGTCTCTGGGTAAATGA

(SEQ ID NO: 211)

중쇄 폴리펩티드

LYLQMNSVKTEDTAVYYCTGGYSYGDDSSSWNEGYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGC

LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCP

PCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLT

VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP

ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO: 212)

경쇄 DNA

GTTAG

(SEQ ID NO: 213)

경쇄 폴리펩티드

ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 214)

H4H14757P

중쇄 DNA

TTATGGAGAATACGGAATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGG

TCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCC

GAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGG

ACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACA

AGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGTTC

CTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTG

CGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA

AGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTG

AACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGG

GCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC

TGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG

CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAA

TGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAAT

GA

(SEQ ID NO: 215)

중쇄 폴리펩티드

LQMNSLKTEDTALYYCAKDIGDILTGFYGEYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFP

EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEF

LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL

NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT

PPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO: 216)

경쇄 DNA

GT

(SEQ ID NO: 217)

경쇄 폴리펩티드

EDFATYYCQQSYIIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ

ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 218)

H4H14758P

중쇄 DNA

TTATGGAGAATACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGG

GA

(SEQ ID NO: 219)

중쇄 폴리펩티드

LQMNSLRPEDTALYYCAKDIGDVLTGYYGEYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFP

PPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO: 220)

경쇄 DNA

GAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACATTTCCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAA

GT

(SEQ ID NO: 221)

경쇄 폴리펩티드

EDFATYYCQQSYISPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ

ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 222)

H4H14760P2

중쇄 DNA

TACAAACGGGGACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGG

GA

(SEQ ID NO: 223)

중쇄 폴리펩티드

LQMNNLRAEDTAVYYCARDLDLWSGYYTNGDGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFP

PPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO: 224)

경쇄 DNA

GTTAG

(SEQ ID NO: 225)

경쇄 폴리펩티드

ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO: 226)

실시예 2 : HEK293/D9(NFκB-루시퍼라제)/hIL-36R 및 HEK293/NFκB-루시퍼라제/mfIL-36R 세포를 이용한 생물검정.

IL-36 수용체(IL-36R)는 사이토카인 IL-1 계열의 하위 집합인, IL-36α, IL-36β, 및 IL-36γ에 대한 단일 통과 막 수용체이며, 이들 리간드에 결합할 때, NFκB 및 미토겐 활성화 키나아제 경로를 포함하는 신호 전달 캐스케이드를 유도하는 공동 수용체인 IL-1R 부속 단백질(IL-1RAcP)이 동원된다(Sims 등의 2010년 문헌 참조). HEK293 세포에서 루시퍼라아제 리포터[NFκB 반응 요소 (5x) -루시퍼라아제-IRES-GFP]와 함께 전장 인간 IL-36R(hIL-36R; 수탁 번호 NP_003845.2의 아미노산 1 내지 575) 또는 필리핀 원숭이 IL-36R(MfIL-36R)을 안정적으로 발현하는 리포터 세포주를 사용해 IL-36R 활성화를 통해 NFκB에 의한 전사 활성화를 검출하기 위한 생물검정을 개발하였다. IL-1RAcP는 HEK293 세포주에서 내인성으로 발현된다. HEK293/NFκB-luc/hIL-36R 및 HEK293/NFκB-luc/MfIL-36R로 지칭되는, 생성된 안정한 세포주를 단리하고, 10% FBS, NEAA, 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 및 500 μg/mL G418이 포함된 DMEM에서 유지시켰다.

생물검정을 위해, 세포를 0.1% FBS가 보충된 OPTIMEM 중의 96-웰 분석 플레이트에 10,000 세포/웰로 시딩한 다음, 5% CO₂ 하에 37°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 리간드의 투여량 반응을 결정하기 위해, 인간 IL-36α(hIL-36α; R&D Systems, #6995/IL), 인간 IL-36β(hIL-36β; R&D Systems, #6334-IL), 또는 인간 IL-36γ(hIL-36γ; R&D Systems, #6835-IL)를 1:3으로 연속 희석하고 (10 nM에서 0.0002 nM까지) 세포에 첨가하였다. 희석 완충액을 함유하지만 IL-36 리간드는 함유하지 않은 대조군도 세포의 하나의 샘플에 첨가하였다. 억제를 측정하기 위해, 항체를 1:3으로 연속 희석하고 (100 nM에서 0.002 nM까지) 항체가 없는 대조군 샘플을 추가하여 세포와 함께 미리 인큐베이션한 다음, 일정한 농도의 hIL-36α, hIL-36β, 또는 hIL-36γ를 첨가하였다. HEK293/NFκB-luc/hIL-36R 세포로 시험하기 위해, 20 pM의 hIL-36α, 15 pM의 hIL-36β, 또는 10 pM의 hIL-36γ를 일정한 농도로 사용하였고, HEK293/NFκB-luc/mfIL-36R 세포로 시험하기 위해, 500 pM의 hIL-36α, 600 pM의 hIL-36β, 또는 300 pM의 hIL-36γ를 일정한 농도로 사용하였다. 5% CO₂ 하에 37°C에서 5.5시간 동안 인큐베이션한 후, OneGlo 시약(Promega, # E6051)을 샘플에 첨가하고, 이어서 Victor X(Perkin Elmer) 플레이트 판독기를 사용해 루시퍼라아제 활성을 측정하였다.

비선형 회귀(4-파라미터 로지스틱스)를 사용해 Prism 6 소프트웨어(GraphPad)로 결과를 분석하여 EC₅₀ 및 IC₅₀ 값을 수득하였다. 최대 억제를 결정하기 위해, 각 항체에 대한 최대 RLU 값과 최소 RLU 값 사이의 범위를, 분석 당 IL-36 리간드 사용되지 않은 경우와 일정한 양의 IL-36이 사용된 경우 간의 RLU 범위의 백분율로서 계산하였다.

표 2-1에 나타낸 바와 같이, 시험된 본 발명의 항-IL-36R 항체 12개 중 9개는 20 pM hIL-36α에 의한 HEK293/NFkB-luc/hIL-36R 세포의 자극을 100 pM 내지 970 pM 범위의 IC₅₀ 값으로 완전히 차단하였다. 시험한 IL-36R 항체 중 하나는 22%의 최대 차단 백분율로 HEK293/NFkB-luc/hIL-36R 세포의 hIL-36α 자극의 부분적 차단을 입증하였다. 시험한 IL-36R 항체 중 하나는 61%의 최대 차단 백분율로 HEK293/NFkB-luc/hIL-36R 세포의 hIL-36α 자극의 약한 차단을 입증한 반면, 시험한 항-IL-36R 항체 중 다른 하나는 hIL-36α 자극의 억제를 나타내지 않았다. 시험된 본 발명의 항-IL-36R 항체 12개 중 6개는 15 pM hIL-36β에 의한 HEK293/NFkB-luc/hIL-36R 세포의 자극을 120 pM 내지 1.3 nM 범위의 IC₅₀ 값으로 완전히 차단하였다. 시험한 IL-36R 항체 중 하나는 69%의 최대 차단 백분율로 HEK293/NFkB-luc/hIL-36R 세포의 hIL-36β 자극의 약한 차단을 입증하였고, 시험한 항-IL-36R 항체 중 5개는 hIL-36α 자극의 측정 가능한 억제를 나타내지 않았다. 시험된 본 발명의 항-IL-36R 항체 12개 중 6개는 10 pM hIL-36γ에 의한 HEK293/NFkB-luc/hIL-36R 세포의 자극을 120 pM 내지 1.2 nM 범위의 IC₅₀ 값으로 완전히 차단하였다. 시험된 본 발명의 항-IL-36R 항체 중 4개는 24 내지 87%의 최대 차단 백분율로 hIL-36γ 자극의 부분적 차단을 입증하였다. 시험된 본 발명의 항-IL-36R 항체 중 하나는 69%의 최대 차단 백분율로 hIL-36γ 자극의 약한 차단을 나타냈으며, 본 발명의 하나의 항-IL36R 항체는 hIL-36γ 자극의 억제를 나타내지 않았다. 시험된 이소형 대조군 항체는 HEK293/NFkB-luc/hIL-36R 세포의 IL-36 리간드 자극의 억제를 나타내지 않았다. 표 2-1에 나타낸 바와 같이, hIL-36α, hIL-36β, 및 hIL-36γ는 각각 12 pM, 14 pM, 및 8.4 pM의 EC₅₀ 값으로 HEK293/NFkB-luc/hIL-36R 세포를 활성화하였다.

표2-2에 나타낸 바와 같이, 시험된 본 발명의 항-IL-36R 항체 12개 중 6개는 500 pM hIL-36α에 의한 HEK293/NFkB-luc/MfIL-36R 세포의 자극을 60 pM 내지 3.1 nM 범위의 IC₅₀ 값으로 완전히 또는 거의 완전히 차단하였다. 시험한 IL-36R 항체 중 2개는 29 및 47%의 최대 차단 백분율로 HEK293/NFkB-luc/MfIL-36R 세포의 hIL-36α 자극의 약한 차단을 입증한 반면, 시험한 항-IL-36R 항체 중 4개는 이러한 세포주에 대한 hIL-36α 자극의 억제를 나타내지 않았다. 시험된 본 발명의 항-IL-36R 항체 12개 중 6개는 600 pM hIL-36β에 의한 HEK293/NFkB-luc/MfIL-36R 세포의 자극을 120 pM 내지 7.1 nM 범위의 IC₅₀ 값으로 완전히 또는 거의 완전히 차단하였다. 시험한 본 발명의 IL-36R 항체 중 3개는 36 내지 48%의 최대 차단 백분율로 HEK293/NFkB-luc/MfIL-36R 세포의 hIL-36β 자극의 약한 차단을 입증한 반면, 시험한 항-IL-36R 항체 중 3개는 이러한 세포주에 대한 hIL-36β 자극의 억제를 나타내지 않았다. 시험된 본 발명의 항-IL-36R 항체 중 6개는 300 pM hIL-36γ에 의한 HEK293/NFkB-luc/MfIL-36R 세포의 자극을 85 pM 내지 5.4 nM 범위의 IC₅₀ 값으로 완전히 또는 거의 완전히 차단하였다. 시험한 본 발명의 IL-36R 항체 중 3개는 25 내지 43%의 최대 차단 백분율로 HEK293/NFkB-luc/MfIL-36R 세포의 hIL-36γ 자극의 약한 차단을 입증한 반면, 시험한 항-IL-36R 항체 중 3개는 이러한 세포주에 대한 hIL-36γ 자극의 억제를 나타내지 않았다. 시험된 이소형 대조군 항체는 HEK293/NFkB-luc/MfIL-36R 세포의 IL-36 리간드 자극의 억제를 나타내지 않았다. 표 2-1에 나타낸 바와 같이, hIL-36α, hIL-36β, 및 hIL-36γ는 각각 170 pM, 270 pM, 및 62 pM의 EC₅₀ 값으로 HEK293/NFkB-luc/MfIL-36R 세포를 활성화하였다.

[표 2-1] hIL-36 리간드에 의한 HEK293/NFκB-luc/hIL-36R 세포 자극의 항-IL-36R 항체 억제.

[표 2-2] hIL-36 리간드에 의한 HEK293/NFκB-luc/MfIL-36R 세포 자극의 항-IL-36R 항체 억제.

실시예 3 : IL-36R 옥텟 교차 경쟁

한 무리의 상이한 항-IL-36R 항체 간의 결합 경쟁은 Octet^® HTX 바이오센서(ForteBio, A Division of Pall Life Sciences)를 이용한 실시간, 비표지 바이오층 간섭 검정을 사용해 결정하였다. 전체 실험은 25℃에서, 0.01M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05 % v/v 계면활성제 Tween-20, 0.002 % NaN₃ 및 1mg/mL BSA (HBS-ET 약동학 완충액) 중에서, 플레이트를 1000 rpm의 속도로 진탕시키면서 수행하였다. C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그(hIL-36R-MMH: mROR1 신호 서열 (M1-A29)-인간 IL36R(D20-Y337)-mycmycHis₆)로 발현된 재조합 인간 IL-36R 세포외 도메인 상에서 각각의 에피토프에 결합하기 위해 2개의 항체가 서로 경쟁할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 30 μg/mL의 hIL-36R-MMH가 포함된 웰에 바이오센서를 3분 동안 침지함으로써, 항-His 항체로 코팅된 Octet 바이오센서(Fortebio Inc, # 18-5079) 상에 약 0.3 nM의 hIL-36R-MMH를 먼저 포획하였다. 이어서, 항원이 포획된 바이오센서를 50 μg/mL의 제1 항-IL-36R 항체(이하 mAb-1로 지칭함) 용액이 포함된 웰에 4분 동안 침지하여 mAb-1로 포화시켰다. 이어서, 바이오센서를 50 μg/mL의 제2 항-IL-36R 항체(이하 mAb-2로 지칭함) 용액이 포함된 웰에 3분 동안 후속하여 침지하였다. 실험의 단계와 단계 사이에, HBS-ET 동역학 완충액 중에서 바이오센서를 세척하였다. 실시간 결합 반응을 실험의 전체 과정 동안 모니터링하고, 모든 단계에 대한 최대 결합 반응을 기록하였다. mAb-1과 미리 복합체화된 hIL-36R-MMH에 결합하는 mAb-2의 반응을 비교하고, 상이한 항-IL-36R 항체들의 경쟁적/비경쟁적 거동을 표 3-1에 나타낸 바와 같이 결정하였다.

[표 3-1] 인간 IL-36R-MMH에 결합하기 위한 항-IL-36R 항체들의 교차 경쟁

실시예 4 : 항체 결합 동역학

정제된 항-IL-36R 항체에 결합하는 IL-36R에 대한 평형 해리 상수 (K_D)는 실시간 표면 플라스몬 공명 바이오센서를 사용해 Biacore 4000 기기로 결정하였다. Biacore 센서 표면을 먼저 단클론 마우스 항-인간 Fc 항체(GE, # BR-1008-39)와의 아민 결합에 의해 유도체화하여 항-IL-36R 단클론 항체를 포획하였다. 모든 결합 연구는 25℃와 37℃에서 0.01 M Hepes pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05 % v/v 계면활성제 Tween-20 (HBS-ET 러닝 완충액)에서 수행하였다. HBS-ET 러닝 완충액 (100 nM 내지 3.7 Nm 범위, 3-배 희석물) 중 상이한 농도의 IL-36R 시약, C-말단 myc-myc-헥산히스티딘 태그로 발현된 인간 IL-36R 세포외 도메인 (hIL-36R-MMH), C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그로 발현된 필리핀 원숭이 IL-36R 세포외 도메인 (mfIL-36R-MMH: mROR1 신호 서열 (M1-A29).필리핀 원숭이 IL36R_엑토 도메인 (D20-A336).mycmycHis6), C-말단 마우스 IgG2a Fc 태그로 발현된 인간 IL-36R 세포외 도메인 (hIL-36R-mFc: mROR1 신호 서열 (M1-A29)-인간 IL36R (D20-Y337)-마우스 IgG2aFc (E98-K330)) 또는 인간 IL-36R 세포외 도메인 및 마우스 IgG2a Fc 태그로 발현된 IL1RAcP 세포외 도메인의 인라인 융합 단백질 (hIL-36R-Trap-mFc: mROR1 신호 서열 (M1-A29)-인간 IL36R 엑토 도메인 (D20-Y337)-인간 IL1RacP 엑토 도메인(S21-E359)-마우스 IgG2aFc)을 항-IL-36R 항체가 포획된 표면 상에 30 μL/분의 유속으로 4분 동안 주입하고, HBS-ET 러닝 완충액 중에서 이들의 해리를 10분 동안 모니터링하였다. 동역학 결합 속도 상수(k _a ) 및 해리 속도 상수(k _d )는 Scrubber 2.0c 곡선-피팅 소프트웨어를 사용해 실시간 결합 센서그램을 1:1 결합 모델에 피팅하여 결정하였다. 결합 해리 평형 상수(K_D) 및 해리 반감기(t½)를 동적 속도 상수로부터 다음과 같이 계산하였다:

25℃및 37℃에서 본 발명의 상이한 항-IL-36R 항체에 결합하는 hIL-36R-MMH, mfIL-36R-MMH 또는 hIL-36R.mFc에 대한 결합 동역학 파라미터는 표 4-1 내지 4-8에 나타나 있다. 표 4-1에 나타낸 바와 같이, 25℃에서, hIL-36R-MMH는 2.18 nM 내지 13.9 nM 범위의 K _D 값으로 본 발명의 항-IL-36R 항체 모두에 결합하였다. 표 4-2에 나타낸 바와 같이, 37℃에서, hIL-36R-MMH는 4.25 nM 내지 29.5 nM 범위의 K _D 값으로 본 발명의 항-IL-36R 항체 모두에 결합하였다. 표 4-3에 나타낸 바와 같이, 25℃에서, mfIL-36R-MMH는 7.87 nM 내지 34.4 nM 범위의 K _D 값으로 본 발명의 항-IL-36R 항체 12개 중 9개에 결합하였다. 표 4-4에 나타낸 바와 같이, 37℃에서, mfIL-36R-MMH는 14.4 nM 내지 58.2 nM 범위의 K _D 값으로 본 발명의 항-IL-36R 항체 12개 중 9개에 결합하였다. 표 4-5에 나타낸 바와 같이, 25℃에서, hIL-36R-mFc는 173 pM 내지 5.79 nM 범위의 K _D 값으로 본 발명의 항-IL-36R 항체 12개 중 11개에 결합하였다. 본 발명의 하나의 항-IL-36R 항체는 25℃에서의 실험 조건 하에서 hIL-36R-mFc에 대한 결합이 확정적이지 않음을 입증하였다. 표 4-6에 나타낸 바와 같이, 37℃에서, hIL-36R-mFc는 205 pM 내지 28.7 nM 범위의 K _D 값으로 본 발명의 항-IL-36R 항체 모두에 결합하였다. 표 4-7에 나타낸 바와 같이, 25℃에서, hIL-36R-Trap-mFc는 212 pM 내지 14 nM 범위의 K _D 값으로 본 발명의 항-IL-36R 항체 모두에 결합하였다. 표 4-8에 나타낸 바와 같이, 37℃에서, hIL-36R-Trap-mFc는 264 pM 내지 40.9 nM 범위의 K _D 값으로 본 발명의 항-IL-36R 항체 모두에 결합하였다.

[표 4-1] 25℃에서 hIL-36R-MMH에 결합하는 항-IL-36R 항체의 결합 동역학 파라미터

[표 4-2] 37℃에서 hIL-36R-MMH에 결합하는 항-IL-36R 항체의 결합 동역학 파라미터

[표 4-3] 25℃에서 mfIL-36R-MMH에 결합하는 항-IL-36R 항체의 결합 동역학 파라미터

*NB는 실험 조건 하에서, mfIL-36R-MMH 시약이 포획된 항-IL-36R 항체에 결합하지 않았음을 나타낸다.

[표 4-4] 37℃에서 mfIL-36R-MMH에 결합하는 항-IL-36R 항체의 결합 동역학 파라미터

[표 4-5] 25℃에서 hIL-36R-mFc에 결합하는 항-IL-36R 항체의 결합 동역학 파라미터

*IC는 실험 조건 하에서, hIL-36R.mFc 결합이 확정적이지 않음을 나타낸다.

[표 4-6] 37℃에서 hIL-36R-mFc에 결합하는 항-IL-36R 항체의 결합 동역학 파라미터

[표 4-7] 25℃에서 hIL-36R-Trap-mFc에 결합하는 항-IL-36R 항체의 결합 동역학 파라미터

[표 4-8] 37℃에서 hIL-36R-Trap-mFc에 결합하는 항-IL-36R 항체의 결합 동역학 파라미터

정제된 항-IL-36R 항체에 결합된 IL-36R의 해리 속도에 대한 pH의 효과를 결정하기 위한 추가의 결합 실험을 수행하였으며, 이는 실시간 표면 플라스몬 공명 바이오센서를 사용해 Biacore T200 기기로 결정하였다. Biacore 센서 표면을 먼저 단클론 마우스 항-인간 Fc 항체(GE, # BR-1008-39)와의 아민 결합에 의해 유도체화하여 항-IL-36R 항체를 포획하였다. 이들 Biacore 결합 연구는 2개의 러닝 완충액인 PBS-T, pH7.4 (8.1 mM Na₂HPO₄, 1.9 mM NaH₂PO₄, 3 mM KCl, 137 mM NaCl, 0.05 % v/v Tween-20, pH 7.4로 조정함) 및 PBS-T, pH 6.0 (6.6 mM Na₂HPO₄, 3.4 mM NaH₂PO₄, 3mM KCl, 137 mM NaCl, 0.05 % v/v Tween-20, pH 6.0으로 조정함)를 사용해 수행하였다. PBS-T, pH7.4 완충액(100 nM 내지 11.11 nM 범위, 3배 희석물)에서 제조된 상이한 농도의 hIL-36R-MMH 및 mfIL-36R-MMH를 항-IL-36R 항체가 포획된 표면 상에 50 μL/분의 유속으로 4분 동안 주입하고, 2가지 러닝 완충액인 PBS-T, pH 7.4 및 PBS-T, pH 6.0에서 이들의 해리를 10분 동안 모니터링하였다. 이들 결합 동역학 실험 모두는 25℃와 37℃에서 수행하였다. 동역학 해리 상수(k _d )는 Scrubber 2.0c 곡선 피팅 소프트웨어를 사용해 1:1 결합 모델에 실시간 센서그램을 피팅함으로써 결정하였다. 결합 해리 반감기(t½)는 k _d 로부터 다음과 같이 계산하였다:

2가지 러닝 완충액인 PBS-T, pH 7.4 및 PBS-T, pH 6.0 중에서 25℃와 37℃에서 상이한 항-IL-36R 항체에 결합하는 hIL-36R-MMH 또는 mfIL-36R-MMH에 대한 결합 해리 속도 상수는 표 4-9 내지 4-12에 나타나 있다.

[표 4-9] 25℃에서 수행된, 2가지 실행 완충액에서 hIL-36R-MMH에 결합하는 항-IL-36R 단클론 항체의 결합 해리 속도 상수.

[표 4-10] 37℃에서 수행된, 2가지 실행 완충액에서 hIL-36R-MMH에 결합하는 항-IL-36R 단클론 항체의 결합 해리 속도 상수.

[표 4-11] 25℃에서 수행된, 2가지 실행 완충액에서 mfIL-36R-MMH에 결합하는 항-IL-36R 단클론 항체의 결합 해리 속도 상수.

*NB는 현재의 실험 조건 하에서, 항 -hFc 포획 된 항-IL-36R mAb에 대한 mfIL-36R-MMH의 결합이 관찰되지 않았음을 나타낸다.

[표 4-12] 37℃에서 수행된, 2가지 실행 완충액에서 mfIL-36R-MMH에 결합하는 항-IL-36R 단클론 항체의 결합 해리 속도 상수.

실시예 5 : IMQ 유도 피부 염증 및 만성 대장염의 마우스 모델에서 항-IL36R의 생체 내 평가.

인간화 IL-36R/hIL-36α, β, γ 마우스를 대상으로 본 발명의 항-인간 IL-36R 단클론 항체를 급성 및 만성 이미퀴모드(IMQ)-유도 피부 염증, 및 만성 덱스트란 황산나트륨(DSS) 유도 대장염에 대해 생체 내에서 시험하였다. 전염증성 패널 1(마우스) 다중 면역분석 키트를 사용하여 피부 및 결장 균질물에서 사이토카인 검출을 수행하였다. 마우스 Duoset Lipocalin-2/NGAL ELISA 키트를 사용해 대변 균질물에서 리포칼린 2(Lcn2)를 검출하였다. 마우스 MPO ELISA 키트를 사용하여 결장 균질물에서 미엘로퍼옥시다아제(MPO) 활성을 측정하였다.

항-IL36R 항체인 H4H14706P2 및 H4H14708P2를 인간 이소형 일치 대조군 IgG4 항체와 함께 사용하였다.

피부 및 장 염증에서 IL-36R의 역할을 조사하고 생체 내에서 hIL-36R 길항작용의 효능을 시험하기 위해, 본 발명의 항-인간 IL-36R 단클론 항체를 이미퀴모드(IMQ) 유도 피부 염증 및 DSS 유도 만성 대장염의 쥣과 모델에서 시험하였다. 두 모델 모두에서 Velocigene은 인간 IL-36R을 발현하는 동형 접합 마우스를 생성하였고, 인간 IL-36α, β, γ 및 내인성 마우스 IL-36Ra를 사용하였다(생성된 마우스는 DITRA(인터루킨 36 수용체 길항제 결핍) 환자에서 관찰된 돌연변이와 유사한 인간 IL-36R에 대한 마우스 IL-36Ra의 친화도 감소로 인해 DITRA-유사 마우스로 지칭됨 (Marrakchi 등의 문헌[Interleukin-36-receptor antagonist deficiency and generalized pustular psoriasis, N Engl J Med 365:620-628 (2011)] 참조).

유전자형 Il1rl2^hu/hu Il1f6^hu/hu Il1f8^hu/hu Il1f9^hu/hu를 갖는 인간화 마우스 계통을 생성하였다. 이러한 마우스 계통에서, 인간 IL1F6, IL1F8, 및 IL1F9는 내인성 마우스 IL1F6, IL1F8, 및 IL1F9(각각 IL36α, β 및 γ로도 불림)를 치환하고; 키메라 IL1RL2는 내인성 마우스 IL1RL2를 치환하였다. 키메라 IL1RL2는 인간 IL1RL2 세포외 도메인 및 마우스 세포내 도메인을 가졌다. 이를 통해, 키메라 수용체는 세포외 도메인을 인간화하면서 마우스의 세포내 신호전달 특이성을 유지하였고, 따라서 인간 리간드 IL1F6, IL1F8, 및 IL1F9에 결합할 수 있었다.

DITRA-유사 마우스에서 급성 및 만성 IMQ-유도 피부 염증 유도 및 항체 치료. 피부 염증을 유도하기 위해, 마우스 털 관리기(Oster, MiniMax, Cat# 78049-100)를 사용해 8~10주령의 인간화 DITRA-유사 암컷 마우스의 등털을 면도하고, IMQ 크림을 도포하기 3일 전에 0.5 g의 Veet 제모 젤(hair removal gel)로 피부의 털을 뽑았다. 상업적으로 이용 가능한 IMQ 크림(5%) (Aldara, GM Health Care Limited, NDC 99207-206-12) 또는 바셀린(CVS Pharmacy)의 일일 국소 투여량 62.5 mg을 마우스의 면도한 등 피부에 연속 4일 동안 도포하여 급성 질환을 유도하고, 연속 9일 동안 도포하여 만성 질환을 유도하였다. 알다라(Aldara)의 일일 국소 투여량인 62.5 mg을 3.125 mg의 활성 화합물로 번역하였다. 급성 IMQ 유도 피부 염증의 경우, IMQ 도포를 개시하기 전 3일차(-3d) 및 개시 후 1일차(1d)에 항-인간 IL-36R 항체인 H4H14706P2 및 H4H14708P2를 10 mg/kg 및 1 mg/kg으로 등 피부에 피하 투여하였다. 대조군에게는 PBS 및 10 mg/kg의 hIgG4 이소형 대조군 주사제를 투여하였다. 만성 IMQ-유도 피부 염증의 경우, d4 및 d8에 항-인간 IL-36R 항체인 H4H14706P2 및 H4H14708P2를 10 mg/kg의 치료적 투여량으로 등 피부에 피하 투여하였다. IMQ 적용을 시작 한 지 2일 또는 3일 후, 마우스의 등 피부에서는 홍반, 인설 및 비후화의 징후가 나타나기 시작했다. 염증의 중증도는 임상적 건선 면적 및 중증도 지수의 적절한 버전을 사용해 매일 측정하였다. 홍반, 인설 및 비후화는 0 내지 4의 척도로 독립적으로 채점하였다: 0, 없음; 1, 약간; 2, 보통; 3, 현저함; 및 4, 매우 현저함(van der Fits 등의 문헌[Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol 2009, 182:5836-5845] 참조). 급성 IMQ-유도 피부 염증의 경우 d4에, 만성 IMQ-유도 피부 염증의 경우 d11에 캘리퍼(Kaefer)를 사용해 피부 두께를 측정하였다.

조직병리학. 6 mm 직경의 마우스 등 피부 조직을 10% 완충 포르말린에 고정시키고, 4~5 m의 파라핀 포매된 절편을 헤모톡실린 및 에오신으로 염색했다. 피부 절편을 부전각하증, 정상각화증, 먼로 미세농양, 가시세포증, 표피 궤양, 진피 및 피하의 염증, 진피 및 피하의 혈관 울혈, 소포 과다각화증 및 상피 과다형성의 존재에 대해 맹검 방식으로 평가하였다. 0~4의 채점 척도를 사용했다: 0-정상 범위 내, 1-최소, 2-경증, 3-중등도 및 4-중증. 개별 조직병리학적 특징 점수를 합산하여 각 마우스에 대한 총 병리학 점수를 계산하였다. 데이터 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. Danilenko의 Review paper: preclinical models of psoriasis, Vet Pathol. 2008 Jul;45(4):563-75; Lowes 등의 문헌[Pathogenesis and therapy of psoriasis, Nature. 2007 Feb 22;445(7130):866-73]; Mecklenburg 등의 문헌[Proliferative and non-proliferative lesions of the rat and mouse integument, J Toxicol Pathol. 2013;26(3 Suppl):27S-57S]; Uribe-Herranz 등의 문헌[IL-1R1 signaling facilitates Munro's microabscess formation in psoriasiform imiquimod-induced skin inflammation, J Invest Dermatol. 2013 Jun;133(6):1541-9]; van der Fits 등의 문헌[Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis, J Immunol. 2009 May 1;182(9):5836-45] 참조.

피부 균질물에서 사이토카인의 측정. 쥣과 동물의 등에서 6 mm 직경의 전층 피부 조직을 채취하여 T-per 완충액(Thermo Scientific, Cat# 378510), 1x Halt 프로테아제 억제제 칵테일(Thermo Scientific, Cat# 87786) 및 5 M EDTA 용액(Thermo Scientific, Cat3 78429)이 담긴 15 mL 튜브에 넣었다. 피부 조직은 Polytron(PT10-35 GT-D, Cat# 9158158)을 사용하여 1분 동안 28000 rpm으로 분해하고 얼음 위에 두었다. 생성된 피부 균질물을 4℃에서 8분 동안 1500 rpm으로 원심분리하고 상청액을 96-웰 플레이트에 수집하였다. 피부 균질물에 대해 단백질 검정 염료(BioRad, Cat# 500-0006)를 사용해 브래드포드 단백질 검정을 수행하여 총 단백질 함량을 정량화하였다. 피부 균질물 중 사이토카인 농도는 제조업체의 지침에 따라 전염증성 패널 1(마우스) 다중 면역검정 키트(MesoScale Discovery, Cat# K15048D)를 사용하여 측정했다. 요약하자면, 포획 항체로 사전 코팅된 플레이트에 50 μL/웰의 캘리브레이터(calibrators)와 샘플(희석제 41에 희석함)을 첨가하고, 2시간 동안 700 rpm으로 진탕하면서 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 0.05% (w/v) Tween-20이 포함된 1xPBS로 플레이트를 3회 세척한 다음, 희석제 45에 희석한 25 μL의 검출 항체 용액을 첨가하였다. 2시간 동안 진탕하면서 실온에서 인큐베이션한 후, 플레이트를 3회 세척하고, 150 μL의 2x 판독 완충액을 각 웰에 첨가하였다. MSD Spector^® 기구를 이용해 즉시 전기화학발광(electrochemiluminescence)을 판독했다. 데이터 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 사이토카인 수준을 총 단백질 함량에 대해 정규화하였다.

DITRA-유사 마우스에서 만성 대장염의 DSS-유도 모델의 유도 및 항체 치료. 만성 DSS-매개 대장염을 유도하기 위해, 평균 체중이 23 g을 초과하는 12~20주령의 암컷 DITRA-유사 마우스에게 음용수 중 3% DSS(Sigma-Aldrich Cat# 87786)를 7일 동안 투여하고, 이어서 증류수를 10일 동안 투여하였다. 이 사이클을 d28까지 2회 반복하였다. 대조군에게는 연구 기간 동안 증류수를 투여하였다. 항-인간 IL-36R 항체인 H4H14706P2 및 H4H14708P2를 10 mg/kg 및 5 mg/kg으로 d7부터 격주로 복강내 투여하였다. 대조군에게는 PBS 및 10 mg/kg의 hIgG4 이소형 대조군 주사제를 투여하였다. 매일 마우스의 체중을 측정하고 대장염의 임상적 징후(예: 대변 일관성 및 혈변)에 대해 모니터링하였다. d28에, 마우스를 안락사시키고 결장 길이를 측정하였다.

결장 균질물에서 Lcn-2의 측정. 연구 전반에 걸쳐 장 염증을 모니터링하기 위해, 매주 개별 DITRA-유사 마우스의 배설물을 2 mL 딥 웰 플레이트에 수집하여 -80℃로 보관했다. 시험 완료 후, 다른 날에 수집한 배설물들을 균질화시켰다. 요약하자면, 0.1% Tween-20, 1x Halt 프로테아제 억제제 칵테일(Thermo Scientific, Cat# 87786) 및 5M EDTA 용액(Thermo Scientific, Cat3 78429)이 포함된 1 mL PBS로 배설물 샘플을 재구성하였다. 웰에 2개의 텅스텐 3 mm 카바이드 비드(Qiagen, Cat# 69997)를 첨가한 후, 플레이트를 진탕기에 배치한 뒤 4℃에서 가장 빠른 속도로 밤새 진탕하였다. 균질한 배설물 현탁액을 4℃에서 10분 동안 1200 rpm으로 원심분리하고 상청액을 96-웰 플레이트에 수집하였다. 제조업자의 지침에 따라 마우스 Duoset 리포칼린-2/NGAL ELISA 키트(R&D Systems, Cat# DY1857)를 사용하여 배설물 리포칼린-2(Lcn2) 수준을 측정했다. 데이터 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

결장 균질물에서 미엘로퍼옥시다아제(MPO) 활성의 측정. 결장의 원위 부분의 조각을 T-per 완충액(Thermo Scientific, Cat# 378510), 1x Halt 프로테아제 억제제 칵테일(Thermo Scientific, Cat# 87786) 및 5M EDTA 용액(Thermo Scientific, Cat# 78429)이 담긴 2 mL 마이크로 원심분리 튜브에 2개의 텅스텐 3 mm 카바이드 비드(Qiagen, Cat# 69997)와 함께 넣었다. 결장 조직은 Qiagen Tissue Lyser II를 27.5s^-1의 주파수로 사용해 10분 동안 파괴하였다. 튜브를 4℃에서 8분 동안 1500 rpm으로 원심분리하고 상청액을 96-웰 플레이트에 수집하였다. 결장 균질물에 대해 단백질 검정 염료(BioRad, Cat# 500-0006)를 사용해 브래드포드 단백질 검정을 수행하여 총 단백질 함량을 정량화하였다. 결장 균질물 중 미엘로퍼옥시다아제(MPO) 활성은, 제조업체의 지침에 따라 마우스 MPO ELISA 키트(Hycult Biotech, Cat# HK210-02)를 사용해 측정했다. 데이터 분석은 GraphPad Prism™ 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. MPO 수준을 총 단백질 함량에 대해 정규화하였다.

결장 균질물에서 사이토카인의 측정. 결장 균질물 중 사이토카인 농도는 제조업체의 지침에 따라 전염증성 패널 1(마우스) 다중 면역검정 키트(MesoScale Discovery, Cat# K15048D)를 사용하여 측정했다. 요약하자면, 포획 항체로 사전 코팅된 플레이트에 50 μL/웰의 캘리브레이터(calibrators)와 샘플(희석제 41에 희석함)을 첨가하고, 2시간 동안 700 rpm으로 진탕하면서 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 0.05% (w/v) Tween-20이 포함된 1xPBS로 플레이트를 3회 세척한 다음, 희석제 45에 희석한 25 μL의 검출 항체 용액을 첨가하였다. 2시간 동안 진탕하면서 실온에서 인큐베이션한 후, 플레이트를 3회 세척하고, 150 μL의 2x 판독 완충액을 각 웰에 첨가하였다. MSD Spector^® 기구를 이용해 즉시 전기화학발광(electrochemiluminescence)을 판독했다. 데이터 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 사이토카인 수준을 총 단백질 함량에 대해 정규화하였다.

통계 분석 . 군 내에서의 통계적 유의성은 투키의 다중 비교 사후 검정(^#, *p<0.01; ^##,**p<0.001; ^###,***p<0.001; ^####,****p<0.0001))을 사용해 일원 Anova에 의해 결정하였다.

결과 요약 및 결론

항-인간 IL-36R 단클론 항체는 예방적 투여 시 DITRA-유사 마우스에서 급성 피부 염증을 억제한다. 피부 염증에서 IL-36R의 역할을 조사하기 위해, 2개의 항-인간 IL-36R 단클론 항체인 H4H14706P2 및 H4H14708P2를, 표현형 및 조직학적 특성 측면에서 인간 건선 병변과 매우 유사한 건선양 피부염의 IMQ-유도 모델에서 시험하였다(Van der Fits 등의 문헌[Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis, J Immunol 2009, 182:5836-5845]; Swindell 등의 문헌[Genome-wide expression profiling of five mouse models identifies similarities and differences with human psoriasis, PLoS One 2011, 6: e18266]; Okayasu 등의 문헌[A novel model in the induction of reliable experimental and chronic ulcerative colitis in mice, Gastroenterology 1990, 98:694-702] 참조). IMQ를 DITRA-유사 마우스의 면도된 등 피부에 연속 4일 동안 매일 도포하였다. H4H14706P2 및 H4H14708P2 항체를 -3d 및 d1에 10 mg/kg 및 1 mg/kg으로 투여하였다. 대조군에게는 PBS 및 hIgG4 이소형 대조군 주사제를 10 mg/kg으로 투여하였다. d4에, 피부 두께를 측정하고, 후속 조직병리학적 평가 및 단백질 단리를 위해 피부를 채취하였다. H4H14706P2 및 H4H14708P2 항체 둘 다는 이소형 대조군에 비해 IMQ 유도 피부 두께를 투여량 의존적 방식으로 상당히 감소시켰다(표 5-1). 피부 병변에 대한 조직병리학적 평가는, 항-인간 IL-36R 항체 치료를 통해 부전각화증(parakeratosis) 및 먼로의 미세농양을 포함하는 총 병리 점수의 유의한 감소를 보여주었다(표 5-2).

[표 5-1] 항-인간 IL-36R 항체는 급성 IMQ 유도 피부 염증에서 피부 두께를 감소시켰다. 두께는 μm 단위로 표시된다. 군 내에서의 통계적 유의성은, 투키의 다중 비교 사후 검정 및 계산된 평균의 표준 오차(SEM±)를 사용해 일원 Anova에 의해 결정하였다: ^# 바셀린 치료군과는 상당히 다름; * PBS 치료군 및 이소형 치료군과는 상당히 다름. N=9/군.

p 값: ^#,*p<0.01; ^##,**p<0.001; ^###,***p<0.001; ^####,****p<0.0001

[표 5-2] 항-인간 IL-36R 항체는 급성 IMQ 유도 피부 염증에서 총 병리학 점수를 감소시켰다. 군 내에서의 통계적 유의성은, 투키의 다중 비교 사후 검정 및 계산된 평균의 표준 오차(SEM±)를 사용해 일원 Anova에 의해 결정하였다: ^# 바셀린 치료군과는 상당히 다름; * PBS 치료군 및 이소형 치료군과는 상당히 다름. N=9/군.

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또한, H4H14706P2 및 H4H14708P2 항체를 이용한 hIL-36R 차단은 피부 균질물에서 KC-GRO, IL-6, IL-1β 및 TNFα 생성을 66~93% 감소시켰다 (표 5-3).

[표 5-3] hIL-36R 길항작용은 IMQ로 치료한 DITRA-유사 마우스(급성 피부 염증 모델)의 피부에서 전염증성 사이토카인을 유의하게 감소시켰다. PBS/바셀린 대조군의 사이토카인 수준을 모든 치료군으로부터 차감하였다. 군 내에서의 통계적 유의성은, 투키의 다중 비교 사후 검정 및 계산된 평균의 표준 오차(SEM±)를 사용해 일원 Anova에 의해 결정하였다: * PBS 치료군 및 이소형 치료군과는 상당히 다름. N=9/군.

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항-인간 IL-36R 단클론 항체는 치료적 투여 시 만성 피부 염증을 억제한다. 생체 내에서 hIL-36R 길항작용의 치료적 효능을 추가로 조사하기 위해, 항-인간 IL-36R 항체를 만성 IMQ 유도 피부 염증 모델에서 시험하였다. 2주 동안, DITRA-유사 마우스의 면도한 등 피부에 IMQ를 9일 동안 도포하였고, 중간에 2일의 무치료 기간을 두었다. H4H14706P2 및 H4H14708P2 항체는 d4와 d8에 10 mg/kg의 투여량으로 피하 투여하였다. 대조군에게는 PBS 및 hIgG4 이소형 대조군 주사제를 10 mg/kg으로 투여하였다. d11에, 피부 두께를 측정하고, 후속 조직병리학적 평가 및 단백질 단리를 위해 피부를 채취하였다. 표 5-4 및 5-5에 나타낸 바와 같이, H4H14706P2 및 H4H14708P2 항체는 DITRA-유사 마우스에서 IMQ 유도 피부 두께 및 병리 병변 점수를 감소시키는 데 있어서 유의하고 유사한 효능을 나타냈다. H4H14706P2 및 H4H14708P2를 투여한 결과, DITRA-유사 마우스의 피부에서 IMQ 유도 전염증성 사이토카인의 IMQ 유도 생산이 유의하게 억제되었다(표 5-6).

[표 5-4] 항-인간 IL-36R 항체의 치료적 투여는 만성 IMQ 유도 피부 염증에서 피부 두께를 감소시켰다. 두께는 μm 단위로 표시된다. 군 내에서의 통계적 유의성은, 투키의 다중 비교 사후 검정 및 계산된 평균의 표준 오차(SEM±)를 사용해 일원 Anova에 의해 결정하였다: ^# 바셀린 치료군과는 상당히 다름; * PBS 치료군 및 이소형 치료군과는 상당히 다름. N=9/군.

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[표 5-5] 항-인간 IL-36R 항체의 치료적 투여는 만성 IMQ 유도 피부 염증에서 총 병리한 점수를 감소시켰다. 군 내에서의 통계적 유의성은, 투키의 다중 비교 사후 검정 및 계산된 평균의 표준 오차(SEM±)를 사용해 일원 Anova에 의해 결정하였다: ^# 바셀린 치료군과는 상당히 다름; * PBS 치료군 및 이소형 치료군과는 상당히 다름. N=9/군.

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[표 5-6] hIL-36R 길항작용은 만성 IMQ 유도 피부 염증에서 전염증성 사이토카인을 유의하게 억제하였다. PBS/바셀린 대조군의 사이토카인 수준을 모든 치료군으로부터 차감하였다. 군 내에서의 통계적 유의성은, 투키의 다중 비교 사후 검정 및 계산된 평균의 표준 오차(SEM±)를 사용해 일원 Anova에 의해 결정하였다: * PBS 치료군 및 이소형 치료군과는 상당히 다름. N=9/군.

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종합적으로, 이들 데이터를 통해 생체 내에서 IMQ 유도 피부 염증을 개선하는 데 있어서 항-인간 IL-36R 항체의 예방적 및 치료적 효능이 입증되었다. H4H14706P2 및 H4H14708P2 항체는 DITRA-유사 마우스에서 급성 및 만성 IMQ 유도 피부 병리 모두를 상당히 감소시키는 유사한 능력을 나타냈다.

항-인간 IL-36R 단클론 항체는 치료적 투여 시 DITRA-유사 마우스에서 DSS 유도 만성 대장염을 개선한다. 장 염증에서 IL-36R 길항작용의 역할을 조사하기 위해, 장 손상의 화학 모델을 사용하였다. 이 모델에는, 결장 상피를 손상시키고(Okayasu 등의 문헌[A novel model in the induction of reliable experimental and chronic ulcerative colitis in mice, Gastroenterology 1990, 98:694-702] 참조) 강력한 염증 반응을 유발하여(Rakoff-Nahoum 등의 문헌[Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell 2004, 118: 229-241] 참조) 염증성 장질환, 특히 궤양성 대장염의 주된 특징을 나타내는 DSS의 경구 투여를 사용하였다. DITRA-유사 마우스에게 2 사이클에 걸쳐 7일 동안 2~3% DSS를 투여하고 이어서 10일 동인 물을 투여함으로써, 이들 마우스가 만성 DSS-유도 대장염에 걸리게 하였다. H4H14706P2 및 H4H14708P2 항체를 d7에서 시작하여 10 mg/kg 및 5 mg/kg으로 투여하였다. 대조군에게는 PBS 및 hIgG4 이소형 대조군 복강내 주사제를 10 mg/kg으로 투여하였다. 질환의 상이한 단계에서 장 염증을 모니터링하기 위해, 장 손상에 있어서 염증의 비침습적 바이오마커인, 배설물 리포칼린-2(Lcn2) 단백질을 측정하기 위해 개별 마우스의 배설물을 매주 수집하였다(Thorsvik 등의 문헌[Fecal neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a biomarker for inflammatory bowel disease. J Gastroenterol Hepatol 2017, 32:128-135] 참조). 표 5-7에 나타낸 바와 같이, PBS 치료군 및 hIgG4 치료군은 물 단독 치료군과 비교해 d12, d19(미도시) 및 d28에 배설물 Lcn2 수준의 유의한 상향조절을 나타냈다. 반대로, H4H14706P2 및 H4H14708P2의 2가지 치료적 투여는 PBS 치료군 및 이소형 치료군과 비교해 d12에 Lcn2 수준을 투여량 의존적 방식으로 유의하게 감소시켰다. d19(미 도시) 및 d28에 항-인간 IL-36 항체 치료군에서 배설물 Lcn2 수준의 지속적인 감소가 관찰되었는데, 이는 DITRA-유사 마우스에서 장 염증을 감소시키는 데 있어서 항-IL-36R 항체에 대한 역할을 뒷받침한다(표 5-7). H4H14706P2 항체는 H4H14708P2에 비해 Lcn2 수준을 감소시킴으로써 장 염증을 감소시키는 더 양호한 능력을 나타냈다(표 5-7).

[표 5-7] hIL-36R 길항작용은 만성 DSS-유도 대장염에 있어서 DITRA-유사 마우스에서 배설물 Lcn2 수준을 유의하게 감소시켰다. 군 내에서의 통계적 유의성은, 투키의 다중 비교 사후 검정 및 계산된 평균의 표준 오차(SEM±)를 사용해 일원 Anova에 의해 결정하였다: ^# 물 치료군과는 상당히 다름; * PBS 치료군 및 이소형 치료군과는 상당히 다름. N=6-8/군.

p 값: ^#,*p<0.01; ^##,**p<0.001; ^###,***p<0.001; ^####,****p<0.0001

H4H14706P2 및 H4H14708P2 항체를 이용한 hIL-36R 차단은 결장 DSS-치료된 DITRA 유사 마우스에서 MPO 활성를 감소시키고(표 5-8) 전염증성 사이토카인을 61~95% 감소시켰다(표 5-9).

[표 5-8] 항-인간 IL-36R 항체의 치료적 투여는 DSS-치료된 DITRA 유사 마우스의 결장에서 MPO 활성을 감소시켰다. MPO 수준은 총 단백질 mg당 ng로서 제시된다. 군 내에서의 통계적 유의성은, 투키의 다중 비교 사후 검정 및 계산된 평균의 표준 오차(SEM±)를 사용해 일원 Anova에 의해 결정하였다: ^# 물 치료군과는 상당히 다름; * PBS 치료군 및 이소형 치료군과는 상당히 다름. N=6-8/군.

p 값: ^#,*p<0.01; ^##,**p<0.001; ^###,***p<0.001; ^####,****p<0.0001

[표 5-9] 항-인간 IL-36R 항체의 치료적 투여는 DSS-치료된 DITRA 유사 마우스의 결장에서 전염증성 사이토카인을 감소시켰다. MPO 수준은 총 단백질 mg당 ng로서 제시된다. 군 내에서의 통계적 유의성은, 투키의 다중 비교 사후 검정 및 계산된 평균의 표준 오차(SEM±)를 사용해 일원 Anova에 의해 결정하였다: ^# 물 치료군과는 상당히 다름; * PBS 치료군 및 이소형 치료군과는 상당히 다름. N=6-8/군.

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Lcn2 수준이 더 감소된 관찰과 일관되게, H4H14706P2 항체는 H4H14708P2와 비교해, 결장에서 MPO 활성 및 전염증성 사이토카인을 감소시키는 데 있어서 우월한 효능을 나타냈다.

실시예 6 . IL-36R에 결합하는 H4H14706P2, H4H14708P2, 및 H4H14731P의 수소 중수소 교환에 의한 에피토프 맵핑.

H4H14706P2, H4H14708P2, 및 H4H14731P(항-hIL-36 단클론 항체)와 상호작용하는 IL-36R(hIL-36R.mmH로 지정되고 서열번호 227에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 재조합 인간 IL-36R)의 아미노산 잔기를 결정하기 위해 질량 분광분석(HDX-MS)을 이용한 수소 중수소 교환 에피토프 맵핑을 수행하였다. H/D 교환 방법의 일반적인 설명은, 예를 들어, Ehring의 문헌[(1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259]; 및 Engen 및 Smith의 문헌[(2001) Anal. Chem. 73:256A-265A]에 제시되어 있다.

HDX-MS 실험은 중수소 표지화 및 퀀칭을 위한 Leaptec HDX PAL 시스템, 샘플 분해 및 로딩을 위한 Waters Acquity M-Class (Auxiliary solvent manager), 분석 컬럼 구배를 위한 Waters Acquity M-Class (μBinary solvent manager) 및 펩티드 질량 측정을 위한 Thermo Q Exactive HF 질량 분광분석기로 이루어진 일체형 HDX/MS 플랫폼을 이용해 수행하였다.

표지화 용액을 pD 7.0의 D₂O(10 mM 인산 완충액, 140 mM NaCl, 및 3 mM KCl, 25℃에서 pH 7.4와 동등함) 중의 PBS 완충액으로서 제조하였다. 중수소 표지화를 위해, 11 μL의 IL-36R.mmH(REGN2105, H4H14706P2 및 H4H14708P2 실험에서는 45.6 μM, 또는 H4H14731P 실험에서는 63.3 μM) 또는 H4H14706P2, H4H14708P2, 또는 H4H14731P와 1:0.7의 몰비로 혼합된 IL-36R.mmH(Ag-Ab 복합체)를 20℃에서 44 μL D₂O 표지화 용액과 함께 다양한 시점 동안(예: 중수소화되지 않은 대조군 = 0초; 중수소 표지된 경우 5분 및 10분) 두 번씩 인큐베이션하였다. 55 μL의 사전 냉각된 퀀칭 완충액(0.5 M TCEP-HCl, 8 M 우레아 및 1% 포름산)을 각 샘플에 첨가하여 20℃에서 5분 동안 인큐베이션함으로써 중수소화 반응을 퀀칭시켰다. 그런 다음, 퀀칭된 샘플을 온라인 펩신/프로테아제 XIII 분해를 위해 Waters HDX Manager에 주입하였다. 분해된 펩티드를 10%-32% B의 13분 구배(이동상 A: 물 중 0.5% 포름산, 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산)를 통해 C8 컬럼(1.0 mm x 50 mm, NovaBioassay)에 의해 분리하였다. 용출된 펩티드를 LC-MS/MS 또는 LC-MS 모드에서 Q Exactive HF 질량 분광분석법으로 분석하였다.

중수소화되지 않은 IL-36R 샘플의 LC-MS/MS 데이터를 Byonic 검색 엔진( Protein Metrics)을 사용해 IL-36R을 포함하는 데이터베이스 및 이의 무작위화된 서열에 대해 검색하였다. 비특이적 효소 분해 및 인간 당질화를 공통 변수 변경으로서 사용하여 (ELN에서의) 검색 파라미터를 기본값으로 설정하였다. 그런 다음, 식별된 펩티드의 목록을 HDX 워크벤치 소프트웨어(버전 3.3)로 가져와서 모든 중수소화된 샘플로부터 LC-MS에 의해 검출된 각 펩티드의 중수소 흡수를 계산하였다. 주어진 펩티드에 대해, 각 시점에서의 중심 질량(강도 가중 평균 질량)을 사용하여 중수소 흡수(D) 및 중수소 흡수율(%D)을 계산하였다.

hIL-36R.mmH 단독 샘플 및 H4H14706P2와 복합체화된 hIL-36R.mmH 샘플 모두로부터 REGN2105(hIL-36R.mmH)에서 유래된 총 163개의 펩티드를 식별하였는데, 이는 hIL-36R의 81.5% 서열 커버리지를 나타낸다. 5%를 초과하는 차등 D-흡수율 값을 나타내는 임의의 펩티드를 유의하게 보호된 것으로 정의하였다. REGN2105 상의 아미노산 113-122(YKQILHLGKD) (서열번호 229) (서열번호 227의 아미노산 113-122)에 상응하는 펩티드는 H4H14706P2에 의해 유의하게 보호되었다.

hIL-36R.mmH 단독 샘플 및 H4H14708P2와 복합체화된 hIL-36R.mmH 샘플 모두로부터 REGN2105(hIL-36R.mmH)에서 유래된 총 148개의 펩티드를 식별하였는데, 이는 hIL-36R의 80.1% 서열 커버리지를 나타낸다. 5%를 초과하는 차등 D-흡수율 값을 나타내는 임의의 펩티드를 유의하게 보호된 것으로 정의하였다. REGN2105 상의 아미노산 113-122(YKQILHLGKD) (서열번호 229) (서열번호 227의 아미노산 113-122)에 상응하는 펩티드는 H4H14708P2에 의해 유의하게 보호되었다.

hIL-36R.mmH 단독 샘플 및 H4H14731P와 복합체화된 hIL-36R.mmH 샘플 모두로부터 REGN2105(hIL-36R.mmH)에서 유래된 총 237개의 펩티드를 식별하였는데, 이는 hIL-36R의 88.2% 서열 커버리지를 나타낸다. 5%를 초과하는 차등 D-흡수율 값을 나타내는 임의의 펩티드를 유의하게 보호된 것으로 정의하였다. REGN2105 상의 아미노산 264-277(GVETHVSFREHNLY) (서열번호 230) (서열번호 227의 아미노산 264-277)에 상응하는 펩티드는 H4H14731P에 의해 유의하게 보호되었다.

[표 6-1] H4H14706P2에 결합할 때 상당히 보호되는 IL-36R.mmH 펩티드

[표 6-2] H4H14708P2에 결합할 때 상당히 보호되는 IL-36R.mmH 펩티드

[표 6-3] H4H14731P에 결합할 때 상당히 보호되는 IL-36R.mmH 펩티드

재조합 인간 IL-36R(IL1RL2; 인터루킨 1 수용체 유사 2; REGN2105) (hIL36R.mmH)의 아미노산 서열: C-말단 myc-myc-헥사히스티딘(mmH) 태그를 갖는 단량체 인간 IL-36R(아미노산 D20-Y337, 수탁 번호 Q9HB29) (밑줄 표시):

DGCKDIFMKNEILSASQPFAFNCTFPPITSGEVSVTWYKNSSKIPVSKIIQSRIHQDETWILFLPMEWGDSGVYQCVIKGRDSCHRIHVNLTVFEKHWCDTSIGGLPNLSDEYKQILHLGKDDSLTCHLHFPKSCVLGPIKWYKDCNEIKGERFTVLETRLLVSNVSAEDRGNYACQAILTHSGKQYEVLNGITVSITERAGYGGSVPKIIYPKNHSIEVQLGTTLIVDCNVTDTKDNTNLRCWRVNNTLVDDYYDESKRIREGVETHVSFREHNLYTVNITFLEVKMEDYGLPFMCHAGVSTAYIILQLPAPDFRAYEQKLISEEDLGGEQKLISEEDLHHHHHH (서열번호 227).

실시예 7 : IMQ 유도 피부 염증과 옥사졸론 유도 피부 염증 및 만성 대장염의 마우스 모델에서 항-IL36R의 생체 내 평가.

본 발명의 항-인간 IL-36R 단클론 항체를 시험관 내 일차 인간 세포 검정에서 시험하고; 인간화 IL-36R/hIL-36α, β, γ 마우스를 대상으로 한 생체 내 이미퀴모드(IMQ)-유도 피부 염증 검정에서 다른 항-인간 IL-36R 단클론 항체와 비교하였다. 또한, 본 발명의 항-인간 IL-36R 단클론 항체를 인간화 IL-36R/hIL-36α, β, γ 마우스를 대상으로 한 옥사졸론 유도 대장염 모델에서 생체 내에서 시험하였다.

인간 CXCL8/IL-8을 위한 DuoSet ELISA(R&D Systems)를 사용해 배양 상청액에서 IL-8을 검출하고, 전염증성 패널 1(마우스 및 인간) 다중 면역 검정 키트(MSD)를 사용해 피부 및 결장 균질물에서 사이토카인을 검출하였다. 시험된 단클론 항체는 H4H14706P2, H4H14708P2, APE6155 (IgG4) 및 인간 IgG4 이소형 대조군 (REGN1002) 이었다.

(IgG4 불변 도메인을 포함하는) APE6155 중쇄는 다음 아미노산 서열을 포함한다:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMNWVRQAPRQGLEWMGMFHPTGDVTRLNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARTTSMIIGGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(서열 번호 239)

(카파 불변 도메인을 포함하는) APE6155 경쇄는 다음 아미노산 서열을 포함한다:

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSKSLLHRNAITYFYWYLHKPGQPPQLLIYQMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(서열 번호 240)

WO2016/168542 참조.

시험관 내 일차 인간 세포 검정에서 시험간 내 항-인간 IL-36R 항체 검정. 정상 인간 표피 각질세포(NNHLF; Lonza, Cat# 00192627, lot#254498) 및 장 근섬유아세포(InMyoFib; Lonza, Cat# CC-2902, lot# 0000254498)를 BulletKitTM (Lonza, Cat# CC-00192060, lot#0000484385)로 보충된 KGM-Gold^TM 및 BulletKitTM (Lonza, Cat# CC-3182, lot# 00004736694)로 보충된 SmGm^TM-2 중에서 4~5회 시험관 내 계대 배양하였다. 제조업체의 지침에 따라, EasySep 인간 단핵구 단리 키트(StemCell, Cat#19359)를 사용하여 3명의 상이한 공여자의 말초 혈액으로부터 인간 CD14+ 단핵구를 단리하였다. 분석 전날, 일차 인간 세포를 상응하는 배지 중에서 바닥이 편평한 96-웰 플레이트에 웰 당 10000개 꼴로 도말하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 일정 농도(10 nM) 또는 (1500 nM에서 시작해) 연속 희석된 rhIL-36α/IL-1F6 [aa6-158] (R&D Systems, Cat# 6995-IL-010/CF, lot# DAFZ0313051), rhIL-36β/IL-1F8 [aa5-157] (R&D Systems, Cat# 6834-IL-010/CF, lot# DAKU0514062 및 rhIL-36γ/IL-1F9 [aa18-169] (R&D Systems, Cat# 6835-IL-010/CF, lot# DAPK0215011)가 단독으로 또는 조합으로 존재하는 가운데, 세포를 자극하였다. 2400 nM에서 시작하는 항-인간 IL-36R 항체의 연속 희석물을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 상청액을 수집하여 인간 CXCL8/IL-8를 위한 DuoSet ELISA 개발 시스템(R&D Systems, Cat# DY208-05, lot# 325963)을 사용해 IL-8을 측정하였다. EC₅₀ 및 IC₅₀ 값을 얻기 위해, GraphPad Prism™ 소프트웨어의 비선형 회귀(software. 비선형 회귀(4-파라미터 로지스틱스)를 사용해 결과를 분석하였다.

IMQ-유도 피부 염증에서 항-인간 IL-36R 항체를 시험하고 비교하기. 피부 염증을 유도하기 위해, 마우스 털 관리기(Oster, MiniMax, Cat# 78049-100)를 사용해 8~10주령의 인간화 DITRA-유사 암컷 마우스의 등털을 면도하고, IMQ 크림을 도포하기 3일 전에 0.5 g의 Veet 제모 젤로 피부의 털을 뽑았다. 상업적으로 이용 가능한 IMQ 크림(5%) (Aldara, GM Health Care Limited, NDC 99207-206-12, lot# QJ044A) 또는 바셀린(CVS Pharmacy, NDC 59779-902-88)의 일일 국소 투여량 62.5 mg을 마우스의 면도한 등 피부에 연속 4일 동안 도포하였다. 알다라(Aldara)의 일일 국소 투여량인 62.5 mg을 3.125 mg의 활성 화합물로 교체하였다. 항-인간 IL-36R 항체 - H4H14706P2, H4H14708P2 및 APE6155(IgG4)를 -3d 및 d1에 10 mg/kg으로 등 피부에 피하 투여하였다. 대조군에게는 PBS 및 10 mg/kg의 hIgG4 이소형 대조군 (REGN1002) 주사제를 투여하였다. IMQ 적용을 시작 한 지 2일 또는 3일 후, 마우스의 등 피부에서는 홍반, 인설 및 비후화의 징후가 나타나기 시작했다. 염증의 중증도는 임상적 건선 면적 및 중증도 지수의 적절한 버전을 사용해 매일 측정하였다. 홍반, 인설 및 비후화는 0 내지 4의 척도로 독립적으로 채점하였다: 0, 없음; 1, 약간; 2, 보통; 3, 현저함; 및 4, 매우 현저함(van der Fits 등의 문헌[Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol 2009, 182:5836-5845] 참조). 피부 두께는 d5에 캘리퍼(Kaefer)를 사용하여 측정하였다.

조직병리학. 6 mm 직경의 마우스 등 피부 조직을 10% 완충 포르말린에 고정시키고, 4~5 m의 파라핀 포매된 절편을 헤모톡실린 및 에오신으로 염색했다. 피부 절편을 부전각하증, 정상각화증, 먼로 미세농양, 가시세포증, 표피 궤양, 진피 및 피하의 염증, 진피 및 피하의 혈관 울혈, 소포 과다각화증 및 상피 과다형성의 존재에 대해 맹검 방식으로 평가하였다. 0~4의 채점 척도를 사용했다: 0-정상 범위 내, 1-최소, 2-경증, 3-중등도 및 4-중증. 개별 조직병리학적 특징 점수를 합산하여 각 마우스에 대한 총 병리학 점수를 계산하였다. 데이터 분석은 GraphPad Prism™ 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

피부 균질물에서 사이토카인의 측정. 쥣과 동물의 등에서 6 mm 직경의 전층 피부 조직을 채취하여 T-per 완충액(Thermo Scientific, Cat# 378510, lot# RF236217), 1x Halt 프로테아제 억제제 칵테일(Thermo Scientific, Cat# 87786, lot# QG221763) 및 5 M EDTA 용액(Thermo Scientific, Cat3 78429)이 담긴 15 mL 튜브에 넣었다. 피부 조직은 Polytron(PT10-35 GT-D, Cat# 9158158)을 사용하여 1분 동안 28000 rpm으로 분해하고 얼음 위에 두었다. 생성된 피부 균질물을 4℃에서 8분 동안 1500 rpm으로 원심분리하고 상청액을 96-웰 플레이트에 수집하였다. 피부 균질물에 대해 단백질 검정 염료(BioRad, Cat# 500-0006, lot# 210008149)를 사용해 브래드포드 단백질 검정을 수행하여 총 단백질 함량을 정량화하였다. 피부 균질물 중 사이토카인 농도는 제조업체의 지침에 따라 전염증성 패널 1(마우스) 다중 면역검정 키트(MesoScale Discovery, Cat# K15048D)를 사용하여 측정했다. 요약하자면, 포획 항체로 사전 코팅된 플레이트에 50 μL/웰의 캘리브레이터(calibrators)와 샘플(희석제 41에 희석함)을 첨가하고, 2시간 동안 700 rpm으로 진탕하면서 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 0.05% (w/v) Tween-20이 포함된 1xPBS로 플레이트를 3회 세척한 다음, 희석제 45에 희석한 25 μL의 검출 항체 용액을 첨가하였다. 2시간 동안 진탕하면서 실온에서 인큐베이션한 후, 플레이트를 3회 세척하고, 150 μL의 2x 판독 완충액을 각 웰에 첨가하였다. MSD Spector^® 기구를 이용해 즉시 전기화학발광(electrochemiluminescence)을 판독했다. 데이터 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 사이토카인 수준을 총 단백질 함량에 대해 정규화하였다.

옥사졸론 유도 장 염증에서 항-인간 IL-36R 단클론 항체 시험 - DITRA-유사 마우스에서 만성 대장염 및 항체 치료의 옥사졸론 유도 모델의 유도. 옥사졸론 대장염을 전술한 바와 같이 유도하였다(Heller 등의 문헌Oxazolone colitis, a Th2 colitis model resembling ulcerative colitis, is mediated by IL-13-producing NK-T cells. Immunity 2002, 17: 629-638] 참조). 간략하게, DITRA-유사 마우스를 사전 감작시키기 위해, 2 x 2 cm² 크기의 복부 피부를 면도하고, 100% 에탄올로 희석된 100 l의 3% 용액 옥사졸론((4-에톡시메틸렌-2-페닐-2-옥사졸린-5-온; Sigma Aldrich)을 도포하였다. 사전 감작 후 5일차 및 7일차에, 전신 마취한 마우스에게 50% 에탄올로 희석한 50 μl의 1.5% 옥사졸론을 직장내 투여하였다. 대조군 마우스를 100% 에탄올로 사전 감작시키고 50% 에탄올을 직장내 주사하였다. 항-인간 IL-36R 항체인 H4H14706P2 및 H4H14708P2를 10 mg/kg 및 5 mg/kg으로 d2, d5 및 d7에 복강내 투여하였다. 대조군에게는 PBS 및 10 mg/kg의 hIgG4 이소형 대조군 (REGN1002) 주사제를 투여하였다. 매일 마우스의 체중을 측정하고 대장염의 임상적 징후(예: 대변 일관성 및 혈변)에 대해 모니터링하였다. d8에, 마우스를 안락사시키고 결장을 채취하였다.

결장 균질물에서 사이토카인의 측정. 결장의 원위 부분의 조각을 T-per 완충액(Thermo Scientific), 1x Halt 프로테아제 억제제 칵테일(Thermo Scientific) 및 5M EDTA 용액(Thermo Scientific)이 담긴 2 mL 마이크로 원심분리 튜브에 2개의 텅스텐 3 mm 카바이드 비드(Qiagen)와 함께 넣었다. 결장 조직은 Qiagen Tissue Lyser II를 27.5s ^-1 의 주파수로 사용해 10분 동안 파괴하였다. 튜브를 4℃에서 8분 동안 1500 rpm으로 원심분리하고 상청액을 96-웰 플레이트에 수집하였다. 모든 피부 균질물에 대해 단백질 검정 염료(BioRad)를 사용해 브래드포드 단백질 검정을 수행하여 총 단백질 함량을 정량화하였다.

결장 균질물 중 사이토카인 농도는 제조업체의 지침에 따라 전염증성 패널 1(마우스) 다중 면역검정 키트(MesoScale Discovery, Cat# K15048D)를 사용하여 측정했다. 요약하자면, 포획 항체로 사전 코팅된 플레이트에 50 μL/웰의 캘리브레이터(calibrators)와 샘플(희석제 41에 희석함)을 첨가하고, 2시간 동안 700 rpm으로 진탕하면서 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 0.05% (w/v) Tween-20이 포함된 1xPBS로 플레이트를 3회 세척한 다음, 희석제 45에 희석한 25 μL의 검출 항체 용액을 첨가하였다. 2시간 동안 진탕하면서 실온에서 인큐베이션한 후, 플레이트를 3회 세척하고, 150 μL의 2x 판독 완충액을 각 웰에 첨가하였다. MSD Spector^® 기구를 이용해 전기화학발광을 즉시 판독했다. 데이터 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 사이토카인 수준을 총 단백질 함량에 대해 정규화하였다.

통계 분석 . 군 내에서의 통계적 유의성은 투키의 다중 비교 사후 검정(*p<0.05, **p<0.005, ***p<0.0005, ****p<0.00001)을 사용해 일원 Anova에 의해 결정하였다.

결과 요약 및 결론 - 항-인간 IL-36R 단클론 항체는 시험관 내에서 일차 인간 세포에서의 인간 IL-36R 신호전달을 강력하게 억제한다. 인간 표피 각질세포(NHEK), 인간 장 근섬유아세포(InMyoFib) 및 말초 혈액(PB) 유래 CD14⁺ 단핵구를 10 nM의 IL-36α, β, γ로 시험관 내에서 자극하였다. 연속적으로 희석된 항-인간 IL-36R 단클론 항체(H4H14706P2 및 H4H14708P2)를 배양물에 첨가하고, 인큐베이션 후 24시간 시점에 상청액을 수집하고, IL-36 자극에 의한 인간 IL-8 생성을 측정하였다. 항-인간 IL-36R 단클론 항체는 시험관 내에서 1~6 nM의 IC₅₀으로 인간 표피 각질세포, 인간 장 근섬유아세포 및 말초 혈액(PB) 유래 CD14₊ 단핵구에서 3개의 IL-36 사이토카인 모두를 강력하게 억제한다(표 7-1).

[표 7-1] 항-인간 IL-36R 항체, H4H14706P2 및 H4H14708P2는 인간 일차 세포에서 인간 IL-36α, β, 및 γ를 시험관 내에서 억제하였다.

항-인간 IL-36R 단클론 항체 H4H14706P2 및 H4H14708P2는 DITRA-유사 마우스에서 IMQ-유도 피부 염증을 억제하는 데 있어서 APE6155 항체보다 더 강력하다. H4H14706P2와 H4H14708P2 및 APE6155 항-인간 IL-36R 단클론 항체를 건선양 피부염의 IMQ-유도 모델에서 직접 시험하였다. IMQ를 DITRA-유사 마우스의 면도된 등 피부에 연속 4일 동안 매일 도포하였다. H4H14706P2와 H4H14708P2 및 APE6155 항체를 -3d 및 d1에 10 mg/kg으로 투여하였다. 대조군에게는 PBS 및 hIgG4 이소형 대조군 주사제를 10 mg/kg으로 투여하였다. d5에, 피부 두께를 측정하고, 후속 조직병리학적 평가 및 단백질 단리를 위해 피부를 채취하였다. H4H14706P2 및 H4H14708P2 항체 둘 다는 APE6155에 비해 IMQ 유도 피부 두께를 유의하게 감소시키는 데 있어서 더 큰 효능을 나타냈다(표 7-2). 피부 병변에 대한 조직병리학적 평가는, 항-인간 IL-36R 항체 치료를 통해 부전각화증 및 먼로의 미세농양을 포함하는 총 병리 점수의 더 큰 감소를 보여주었다(표 7-3).

[표 7-2] 항-인간 IL-36R 항체, H4H14706P2 및 H4H14708P2는 IMQ-유도 피부 염증에서 피부 두께를 감소시키는 데 있어서 APE6155 항-인간 IL-36R 항체보다 더 강력하다. ^~

^~ 두께는 μm 단위로 표시된다. 군 내에서의 통계적 유의성은, 투키의 다중 비교 사후 검정 및 계산된 평균의 표준 오차(SEM±)를 사용해 일원 Anova에 의해 결정하였다: * PBS 치료군 및 이소형 치료군과는 상당히 다름(n=9/군).

[표 7-3] 항-인간 IL-36R 항체, H4H14706P2 및 H4H14708P2는 IMQ 유도 피부 염증에서 총 병리 점수를 감소시키는 데 있어서 APE6155보다 더 큰 효능을 나타냈다. ^$

^$군 내에서의 통계적 유의성은, 투키의 다중 비교 사후 검정 및 계산된 평균의 표준 오차(SEM±)를 사용해 일원 Anova에 의해 결정하였다: * PBS 치료군 및 이소형 치료군과는 상당히 다름(n=9/군).

또한, H4H14706P2 및 H4H14708P2 항체를 이용한 인간 hIL-36R 차단은 COMP5382에 비해 피부 균질물에서 KC-GRO, IL-6, IL-1β, 및 TNFα 생성을 더 크게 감소시켰다 (표 7-4).

[표 7-4] 항-인간 IL-36R 항체, H4H14706P2 및 H4H14708P2는 피부에서 전염증성 사이토카인을 감소시키는 데 있어서 APE6155보다 더 큰 효능을 나타냈다. ^Δ

^Δ 값은 "총 조직의 mg당 pg"로 제시된다. 군 내에서의 통계적 유의성은, 투키의 다중 비교 사후 검정 및 계산된 평균의 표준 오차(SEM±)를 사용해 일원 Anova에 의해 결정하였다: * PBS 치료군 및 이소형 치료군과는 상당히 다름(n=9/군).

항-인간 IL-36R 길항작용은 DITRA 유사 마우스에서 옥사졸론 유도 대장염을 개선한다. 장에서 IL-36의 생물학적 기능을 추가로 조사하기 위해, 인간 궤양성 대장염과 조직학적으로 유사한 IBD의 또 다른 전임상 모델인 옥사졸론 유도 대장염에서 IL-36R 차단의 효능을 시험하였다(Heller 등). 항-인간 IL-36R 항체, H4H14706P2 및 H4H14708P2의 예방적 투여는, 옥사졸론으로 치료한 DITRA-유사 마우스의 결장 내 IL-4, IL-6 및 TNF-α의 수준에 반영된 바와 같이, PBS 치료군 및 이소형 대조군 치료군에 비해, DITRA-유사 마우스에서 옥사졸론 유도 질환 중증도를 유의하게 감소시켰다(표 7-5).

[표 7-5] 인간 IL-36R 길항작용은 DITRA 유사 마우스의 생체 내에서 옥사졸론 유도 대장염을 개선한다.

DITRA-유사 마우스를 100% 에탄올에 용해시킨 3% 옥사졸론 용액으로 사전 감작시키고, 5일 후에 1.5% 옥사졸론 및 비히클(50% 에탄올)을 직장내 투여하였다. 사전 감작 후 2, 5 및 7일차에 마우스에게 PBS, 항-인간 IL-36R mAb 및 hIgG4 이소형 대조군을 복강내 주사하였다. PBS, 항-인간 IL-36R mAb 및 hIgG4 이소형 대조군을 주사한 옥사졸론 및 비히클로 치료한 DITRA 유사 마우스의 결장 균질물에서 전염증성 사이토카인 수준. 값은 "총 조직의 mg당 pg"로 제시된다. 군 내에서의 통계적 유의성은, 투키의 다중 비교 사후 검정 및 계산된 평균의 표준 오차(SEM±)를 사용해 일원 Anova에 의해 결정하였다: *는 PBS 치료군 및 이소형 치료군과는 상당히 다름을 나타낸다(n=5/군).

실시예 8 : Schild 분석을 위한, 인간 HEK293/NFkB-luc/hIL36R 세포주를 사용한 생물검정

항-IL36R 항체인 H4H14706P2 및 H4H14708P2의 억제 특성을 특성화하기 위해, Schild 분석을 수행하였다. 본 방법은 억제제에 의한 길항작용의 성질을 평가하고, 다수의 조건이 충족될 때 경쟁적 길항제의 친화도를 측정한다(Colquhoun의 문헌[Why the Schild method is better than Schild realized, Trends Pharmacol Sci. 2007 Dec;28(12):608-14] 참조).

생물검정을 위해, HEK293/NFκB-luc/hIL-36R 세포를 저혈청 배지인 0.1%FBS 및 OPTIMEM 중의 96-웰 분석 플레이트 상에 10,000개 세포/웰로 시딩하고, 5% CO₂ 하에 37℃에서 밤새 인큐베이션한다. 다음 날, 항체를 상이한 고정 농도(9 nM, 3 nM, 1 nM, 0.3 nM 또는 0.1 nM)로 세포에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 세포와 함께 사전 배양하였다. 항체가 없는 조건도 포함시켰다. 그런 다음, IL-36α, IL-36β 또는 IL-36γ를 100 nM에서 2 pM 또는 100 nM에서 0.1 pM까지 연속 희석하고, 리간드가 없는 샘플과 함께 세포에 첨가하였다. 5% CO₂ 하에 37℃에서 5.5시간 동안 인큐베이션한 후, Victor X5 또는 EnVision™ 다중표지 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 사용해 루시퍼라아제 활성을 검출하고, Prism 7(GraphPad)가 구비된 Gaddum/Schild EC₅₀ shift를 사용해 결과를 분석하였다.

H4H14706P2 및 H4H14708P2에 대한 Schild 분석은, 항체의 양이 증가함에 따라 IL36 리간드 투여량-반응 곡선이 우측으로 평행 이동하였고, H4H14706P2 및 H4H14708P2의 억제 효과가 IL36 리간드의 양을 증가시킴으로써 대처할 수 있다는 것을 보여주었는데, 이는 H4H14706P2 및 H4H14708P2의 경쟁적 억제를 시사한다(도 3(A~F)).

실시예 9 : 약동학(PK) 연구

PK 특성 분석을 위해 암컷 시노몰구스 원숭이를 투여량 군에 배정하고; 동물(3마리/군)에게 5 또는 0.5 mg/kg의 H4H14708P2 또는 APE6155를 1회 SC 주사하였다. 투여 전 및 투여 후 4, 24, 48, 72, 120, 168, 240, 336, 504, 576, 672, 840, 912, 1008, 1080, 1176, 1248, 1344, 1512 및 1680시간차에 모든 동물로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 혈청 중 전체 H4H14708P2 또는 APE6155의 농도는 비-검증식 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)을 사용해 결정하였다. 상기 방법은 시노몰구스 혈청에서 총 인간 IgG 농도를 측정하기 위해 설계되었다. 약동학 파라미터는 비구획 분석을 사용하여 추정하였다. H4H14708P2는 5 mg/kg 투여량에서 APE6155보다 약 1.3배 더 큰 노출을 갖고, 0.5 mg/kg 투여량에서는 APE6155보다 약 1.2배 더 큰 노출을 갖는 것으로 관찰되었다. 도 4를 참조한다.

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본원에 인용된 모든 참조 문헌은 각각의 개별 간행물, 데이터베이스 항목(예를 들어, Genbank 서열 또는 GeneID 항목), 특허 출원, 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참조로서 통합되도록 표시된 것과 동일한 정도로 참조로서 통합된다. 참조에 의한 이러한 인용문은 통합은, 비록 이러한 인용이 참조에 의한 통합에 대한 전적인 인용문에 밀접하지는 않더라도, 각각의 그리고 모든 개별 간행물, 데이터베이스 항목(예를 들어, Genbank 서열 또는 GeneID 항목), 특허 출원 또는 특허와 관련되도록 출원인에 의해 의도된다. 참조에 의한 전용 인용문의 통합이 본 명세서 내에 포함된 경우, 이는 어떠한 방식으로도 참조에 의한 일반 인용문의 통합을 약화시키지 않는다. 본원에서 참조 문헌의 인용은 해당 참조 문헌이 관련 선행 기술임을 인정하는 것으로 의도되지 않으며, 이들 간행물 또는 문서의 내용 또는 날짜에 대해 인정하는 것으로 간주되지 않는다.

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354 <210> 50 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Trp Asn Ser Asp Val Ile Ala Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Lys Gly His Lys Trp Ser Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 51 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 ggattcacct ttgatgatta tgcc 24 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala 1 5 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 attagttgga atagtgatgt cata 24 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Ile Ser Trp Asn Ser Asp Val Ile 1 5 <210> 55 <211> 33 <212> DNA <213> Homo 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Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 cagagtatta gcagctac 18 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 aatgtagcc 9 <210> 62 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Asn Val Ala 1 <210> 63 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 cagcagcgta gcaactggcc tctcact 27 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 65 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggttcagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgcgcag cctctggatt cacctttagc gactatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attagtggaa atggtggtga cacatactac 180 ggagacttcg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag aggcgaggac acggccgcat atttctgtgt gatagatctt 300 gactattggg gtcagggaac cctggtcacc gtctcctca 339 <210> 66 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Gly Asn Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Gly Asp Phe Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Ile Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 ggattcacct ttagcgacta tgcc 24 <210> 68 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala 1 5 <210> 69 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 attagtggaa atggtggtga caca 24 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Ile Ser Gly Asn Gly 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Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asn Ser Tyr Leu Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 cagagtatta gtagctgg 18 <210> 76 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Gln Ser Ile Ser Ser Trp 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 aaggcgtct 9 <210> 78 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Lys Ala Ser 1 <210> 79 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 caccagtata atagttattt gtggacg 27 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 His Gln Tyr Asn Ser Tyr Leu Trp Thr 1 5 <210> 81 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtgctgatt actattggag ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt ggatccatct attatactgg gagtacttac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgacttacc atatcaatag acacgtctga gaaccagttc 240 tctttgaaac tgacctctct gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagcgag 300 gaggctaact ggggatccca ctttgactcc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 82 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Glu Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Glu Glu Ala Asn Trp Gly Ser His Phe Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 83 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 ggtggctcca tcagcagtgc tgattactat 30 <210> 84 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ala Asp Tyr Tyr 1 5 10 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens 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actactgggg ctggatccgc 120 cagcccccag ggaagagact ggagtggatt gggagtatct attatagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagac tcgagtcacc atatccgtag acacgtccaa gaatcagttc 240 tccctgaagc tgacctctgt gaccgccgca gacacggctg tgtattactg tgcgagagag 300 gaagcagcag ctttgacgca ctttgacttc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 98 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Thr Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Glu Ala Ala Ala Leu Thr His Phe Asp Phe Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 99 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 ggtggctcca tcagcagtag taattactac 30 <210> 100 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Tyr Tyr 1 5 10 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 atctattata gtgggagcac c 21 <210> 102 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 103 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 gcgagagagg aagcagcagc tttgacgcac tttgacttc 39 <210> 104 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Ala Arg Glu Glu Ala Ala Ala Leu Thr His Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 105 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctttgct gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacat agtcacagtt cccatccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324 <210> 106 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser His Ser Ser His Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 107 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 cagagcatta gcaactat 18 <210> 108 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 109 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 gctgcatcc 9 <210> 110 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Ala Ala Ser 1 <210> 111 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 caacatagtc acagttccca tccgatcacc 30 <210> 112 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Gln His Ser His Ser 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ggtcccgtca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324 <210> 122 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 123 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123 cagagcatta gcagctat 18 <210> 124 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 125 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125 gctgcatcc 9 <210> 126 <211> 3 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Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ala Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Lys Thr Glu Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60 Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Val Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Gly Gly Tyr Ser Tyr Gly Asp Asp Ser Ser Ser Trp Asn 100 105 110 Glu Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 115 120 125 Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 131 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 131 ggatttattt tcagtaacgc ctgg 24 <210> 132 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Gly Phe Ile Phe Ser Asn Ala Trp 1 5 <210> 133 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 133 attaaaaccg aaactgatgg tgggacaaca 30 <210> 134 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Ile Lys Thr Glu Thr Asp Gly Gly Thr Thr 1 5 10 <210> 135 <211> 72 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 135 acagggggat acagctatgg tgacgatagc agcagctgga acgagggcta ctactactac 60 ggtatggacg tc 72 <210> 136 <211> 24 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cacgtgcgtg 780 gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg 840 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg 900 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 960 gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020 ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag 1080 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200 tccttcttcc tctacagcag gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc 1260 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gtccctctcc 1320 ctgtctctgg gtaaatga 1338 <210> 180 <211> 445 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 180 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Trp Asn Ser Asp Ile Ile Gly 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cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag 1080 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200 tccttcttcc tctacagcag gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc 1260 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gtccctctcc 1320 ctgtctctgg gtaaatga 1338 <210> 184 <211> 445 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 184 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Trp Asn Ser Asp Val Ile Ala Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly His Asn Trp Asn Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 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Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 227 <211> 346 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant Human IL-36R polypeptide (hIL-36R.mmH) <400> 227 Asp Gly Cys Lys Asp Ile Phe Met Lys Asn Glu Ile Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15 Gln Pro Phe Ala Phe Asn Cys Thr Phe Pro Pro Ile Thr Ser Gly Glu 20 25 30 Val Ser Val Thr Trp 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Thr Leu Val Asp Asp Tyr Tyr Asp 245 250 255 Glu Ser Lys Arg Ile Arg Glu Gly Val Glu Thr His Val Ser Phe Arg 260 265 270 Glu His Asn Leu Tyr Thr Val Asn Ile Thr Phe Leu Glu Val Lys Met 275 280 285 Glu Asp Tyr Gly Leu Pro Phe Met Cys His Ala Gly Val Ser Thr Ala 290 295 300 Tyr Ile Ile Leu Gln Leu Pro Ala Pro Asp Phe Arg Ala Tyr Glu Gln 305 310 315 320 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser 325 330 335 Glu Glu Asp Leu His His His His His His 340 345 <210> 228 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 228 Tyr Lys Gln Ile Leu His Leu 1 5 <210> 229 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 229 Tyr Lys Gln Ile Leu His Leu Gly Lys Asp 1 5 10 <210> 230 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 230 Gly Val Glu Thr His Val Ser Phe Arg Glu His Asn Tyr Leu 1 5 10 <210> 231 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 231 Ile Leu His Leu 1 <210> 232 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 232 Ile Leu His Leu Gly Lys Asp 1 5 <210> 233 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 233 Gly Val Glu Thr His Val Ser Phe 1 5 <210> 234 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 234 Thr His Val Ser Phe 1 5 <210> 235 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 235 His Val Ser Phe 1 <210> 236 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 236 His Val Ser Phe Arg Glu His Asn Leu 1 5 <210> 237 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 237 His Val Ser Phe Arg Glu His Asn Leu Tyr 1 5 10 <210> 238 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 238 Phe Arg Glu His Asn Leu 1 5 <210> 239 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide: APE6155 heavy chain (comprising an IgG4 constant domain) <400> 239 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Phe His Pro Thr Gly Asp Val Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Thr Ser Met Ile Ile Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 240 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide: APE6155 light chain (comprising a Kappa constant domain) <400> 240 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg 20 25 30 Asn Ala Ile Thr Tyr Phe Tyr Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims

항체 또는 이의 항원 결합 단편인 단리된 항원 결합 단백질로서:
잔기 113-119, 113-122, 116-119, 116-122, 264-271, 267-271, 268-271, 268-276, 268-277 및/또는 271-276에서 서열번호 227에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합하거나;　
(i) IL36R 상에서 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하거나;
(ii) IL36R 폴리펩티드에 결합하기 위해 기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 경쟁하되,
기준 항체 또는 이의 항원 결합 단편은:
(a) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154,170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 또는 이의 가변 영역;
(b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린, 또는 이의 가변 영역을 포함하는, 단리된 항원 결합 단백질.
단리된 항원 결합 단백질로서,
(i) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154, 170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 또는 이의 가변 영역; 및/또는
(ii) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린, 또는 이의 가변 영역을 포함하는, 단리된 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154, 170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역; 및/또는
(b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역을 포함하는, 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154, 170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154, 170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역; 및/또는
(b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역을 포함하는, 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역 및/또는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역은:
서열번호 4에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 6에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 8에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
서열번호 20에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 22에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 24에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3;
및/또는
서열번호 36에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 38에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 40에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
서열번호 52에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 54에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 56에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
서열번호 68에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 70에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 72에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
서열번호 84에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 86에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 88에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
서열번호 100에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 102에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 104에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
서열번호 116에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 118에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 120에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
서열번호 132에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 134에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 136에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
서열번호 140에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 142에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 144에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
서열번호 156에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 158에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 160에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
서열번호 172에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 174에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 176에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3을 포함하고/하거나　
상기 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역은:
서열번호 12에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 14에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 16에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 및/또는
서열번호 28에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 30에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 32에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 및/또는
서열번호 44에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 46에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 48에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 및/또는
서열번호 60에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 62에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 64에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 및/또는
서열번호 76에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 78에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 80에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 및/또는
서열번호 92에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 94에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 96에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 및/또는
서열번호 108에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 110에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 112에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
서열번호 124에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 126에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 128에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3; 및/또는
서열번호 148에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 150에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 152에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3; 및/또는
서열번호 164에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 166에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 168에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서:
(1)
서열번호 4에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 6에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 8에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역, 및
서열번호 12에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 14에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 16에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역;
(2)
서열번호 20에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 22에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 24에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역, 및
서열번호 28에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 30에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 32에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역;
(3)
서열번호 36에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 38에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 40에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역, 및
서열번호 44에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 46에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 48에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역;
(4)
서열번호 52에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 54에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 56에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역, 및
서열번호 60에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 62에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 64에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역;
(5)
서열번호 68에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 70에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 72에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역, 및
서열번호 76에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 78에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 80에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역;
(6)
서열번호 84에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 86에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 88에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역, 및
서열번호 92에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 94에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 96에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역;
(7)
서열번호 100에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 102에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 104에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역, 및
서열번호 108에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 110에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 112에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역;
(8)
서열번호 116에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 118에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 120에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역, 및
서열번호 124에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 126에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 128에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역;
(9)
서열번호 132에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 134에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 136에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역, 및
서열번호 124에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 126에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 128에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역;
(10)
서열번호 140에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 142에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 144에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역, 및
서열번호 148에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 150에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 152에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역;
(11)
서열번호 156에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 158에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 160에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역, 및
서열번호 164에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 166에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 168에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역; 또는
(12)
서열번호 172에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H1;
서열번호 174에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H2; 및
서열번호 176에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역, 및
서열번호 124에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L1;
서열번호 126에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L2; 및
서열번호 128에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154, 170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역; 및/또는
(b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역을 포함하는, 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변영역; 　
(b) 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변영역; 　
(c) 서열번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변영역; 　
(d) 서열번호 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변영역; 　
(e) 서열번호 66에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 74에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변영역; 　
(f) 서열번호 82에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 90에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변영역; 　
(g) 서열번호 98에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 106에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변영역; 　
(h) 서열번호 114에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 122에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변영역; 　
(i) 서열번호 130에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 122에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변영역; 　
(j) 서열번호 138에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 146에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변영역; 　
(k) 서열번호 154에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 162에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변영역; 및/또는
(l) 서열번호 170에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린 가변 영역, 및 서열번호 122에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변영역을 포함하는, 항원 결합 단백질. 　
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 면역글로불린 가변 영역은 IgG, IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 영역에 연결되고, 경쇄 면역글로불린 가변 영역은 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역에 연결되는, 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 서열번호 180에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 182에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린 가변영역;
(b) 서열번호 184에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및서열번호 186에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린;
(c) 서열번호 188에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 190에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린;
(d) 서열번호 192에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 194에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린;
(e) 서열번호 196에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 198에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린;
(f) 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 202에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린;
(g) 서열번호 204에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 206에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린;
(h) 서열번호 208에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 210에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린;
(i) 서열번호 212에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 214에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린;
(j) 서열번호 216에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 218에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린;
(k) 서열번호 220에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 222에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린; 및/또는
(j) 서열번호 224에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 면역글로불린, 및 서열번호 226에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 면역글로불린을 포함하는, 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단백질인, 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적인 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 특성 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 단백질:
· 25℃에서 약 2.18 nM 내지 약 13.9 nM의 K_D로, 또는 37℃에서 약 4.25 nM 내지 약 29.5 nM의 K_D로 인간 IL36R(IL-1RL2)에 결합함;
· 25℃에서 약 7.87 nM 내지 약 34.4 nM의 K_D로, 또는 37℃에서 약 14.4 nM 내지 약 58.2 nM의 K_D로 필리핀 원숭이 IL36R(IL-1RL2)에 결합함;
· 25℃에서 약 173 pM 내지 약 5.79 nM의 K_D로, 또는 37℃에서 약 205 pM 내지 약 28.7 nM의 K_D로, 마우스 IgG2a에 융합된 인간 IL36R(IL-1RL2)에 결합함;
· 25℃에서 약 212 pM 내지 약 14 nM의 K_D로, 또는 37℃에서 약 264 pM 내지 약 40.9 nM의 K_D로, 마우스 IgG2a Fc 태그로 발현된 IL1RAcP 세포외 도메인에 융합된 인간 IL36R(IL-1RL2)에 결합함;
· IL36R (IL-1RL2)에 결합하기 위해 H4H14699P2; H4H14700P2; H4H14706P2; H4H14708P2; H4H14709P; H4H14728P; H4H14731P; H4H14732P2; H4H14734P2; H4H14757P; H4H14758P 또는 H4H14760P2와 경쟁하되, 임의로, 상기 항원 결합 단백질은 APE6155 또는 이의 항원 결합 단편이 아님;
· IL-1RAcP 및 IL36R 리간드의 존재 하에, 숙주 세포에서 리포터 유전자에 융합되는 하나 이상의 NFκB 요소의 IL-36R(IL-1RL2)에 의한 활성화를 차단함;
· 피부 염증을 예방 또는 개선하거나, 피부 염증을 앓고 있는 대상체에서 피부 두께 또는 총 병리 점수를 감소시키거나, 전염증성 사이토카인 수준을 감소시킴;
· 대장염 또는 결장 염증 예방 또는 개선하거나, 이러한 대장염 또는 결장 염증을 가진 대상체에서 LCN2 폴리펩티드의 배설 수준을 감소시킴;
· 결합될 때, 서열 번호 227에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 인간 IL36R(IL-1RL2)의 잔기 (a) 113-119, 113-122, 116-119 및/또는 116-122; 및/또는 (b) 264-271, 267-271, 268-271, 268-276, 268-277 및/또는 271-276이 펩신 및/또는 프로테아제 XIII로 인해 분해되지 않게 보호하고/하거나, 중수소의 존재하에 중수소화되지 않게 보호함;
· 잔기 113-119, 113-122, 116-119, 116-122, 264-271, 267-271, 268-271, 268-276, 268-277 및/또는 271-276에서 서열번호 227에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 IL36R (IL-1RL2)에 결합함;
· IL36R (IL-1RL2)의 도메인 II에 결합함;
· 아미노산 서열 YKQILHLGKD (서열번호 229) (서열번호 227의 아미노산 113-122)를 포함하는 폴리펩티드에 결합함;
· 약 1~6 nM의 IC₅₀으로 시험관 내 각질 세포, 장 근섬유아세포 및/또는 CD14+ 단핵구에서 IL36α, IL36β 및/또는 IL36γ를 억제함; 및/또는
· IL36R에 의한 NFκB의 IL36α, IL36β, 및/또는 IL36γ 매개 활성화를 경쟁적으로 억제함.
IL36R 폴리펩티드에 결합된 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질을 포함하는 복합체.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질 또는 이의 면역글로불린 사슬을 만드는 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 상기 항원 결합 단백질의 면역글로불린 사슬을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내에 도입하는 단계;
(b) 폴리뉴클레오티드의 발현에 유리한 조건 하의 배지에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 임의로, 숙주 세포 및/또는 숙주 세포를 성장시키는 배지로부터 항원 결합 단백질 또는 면역글로불린 사슬을 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
제15항에 있어서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포인, 방법.
제15항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법의 산물인 항원 결합 단백질 또는 면역글로불린 사슬.
폴리펩티드로서,
(a) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 138, 154,170, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220 또는 224에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3; 및/또는
(b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 146, 162, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222 또는 226에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 면역글로불린 또는 이의 가변 영역의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3; 또는
(c) 서열번호 1-226로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 변이체를 포함하는, 폴리펩티드.
제18항의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제19항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제1항 내지 제13항, 제17항, 제18항, 제19항 또는 제20항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질 또는 면역글로불린 사슬 또는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제1항 내지 제13항 및 제17항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질 중 하나 이상을 포함하고, 임의로 추가의 치료제와 연계되는 조성물 또는 키트.
제1항 내지 제13항 및 제17항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 및 임의로 추가의 치료제를 포함하는 약학적 조성물.
제22항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증제인 추가 치료제와 연계되는, 조성물 또는 키트.
제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 치료제는 항-TNFalpha 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 면역글로불린과 연결된 하나 이상의 인간 TNF 수용체 또는 이의 단편, IL17 억제제, IL23p19 억제제, IL12p40 억제제, 구셀쿠맙, 우스테키누맙, 브로달루맙, 익세키주맙, 세쿠키누맙, 인플릭시맙, 아달리무맙, 에타너셉트, 두필루맙, 사릴루맙, 토실리주맙, 골리무맙, 아바타셉트, 토파시티닙, 아바타셉트, 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 이부프로펜, 나프록센, 아세트아미노펜, 아스피린, 셀레콕시브, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 코르티코스테로이드, 코르티손 및 프레드니손으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원인, 조성물 또는 키트.
제1항 내지 제13항, 제17항 또는 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질 또는 조성물을 포함하는 용기 또는 주사 장치.
IL-36R 매개 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하거나 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제13항 또는 제17항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질의 치료적 유효량을 추가 치료제와 임의로 연계하여 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
염증성 장애, 자가면역 장애, 인터루킨 IL-36 수용체 길항제(DITRA) 결핍 증후군, 포진성 농가진, 말단피부염, 피부 호중구성 농포성 질환, 농포성 질환, 건선, 전신 농포성 건선, 심상성 건선, 손발바닥 농포성 건선, 손발바닥 농포증, 대장염, 기도 염증, 관절 염증, 신장 염증, 원형 탈모증, 피부 염증, 가시세포증, 각막 비후증, 킨들러 증후군, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 신증후군, ANCA(항-호중구 세포질 항체) 관련 혈관병증, 세뇨관 간질성 병변, 또는 사구체신염을 치료하거나 예방하기 위한 방법으로서, 제1항 내지 제13항 또는 제17항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질의 치료적 유효량을 추가 치료제와 임의로 연계하여 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제27항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 건선 또는 염증성 장 질환을 치료하거나 예방하기 위한, 방법.
제1항 내지 제13항 또는 제17항 중 어느 한 항의 항원 결합 단백질을 대상체의 신체 내에 투여하는 방법으로서, 상기 항원 결합 단백질을 임의로 추가 치료제와 연계하여 대상체의 신체 내에 주사하는 단계를 포함하는, 방법.
제30항에 있어서, 항원 결합 단백질은 대상체의 신체에 피하, 정맥내 또는 근육내 주입되는, 방법.
제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 동형접합성 또는 이형접합성 IL36RN 돌연변이 유전자형을 갖는, 방법.