KR100629017B1 - Ｃｄ3에 대한 하이브리드 사람/설치류 ｉｇｇ 항체, 및이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 중쇄에 가변 영역 프레임워크와 함께 서열번호: 2, 4 및 6의 아미노산 서열 및 이들 각각의 보존적으로 변형된 변이체로부터 선택된 하나 이상의 CDR를 갖고, 경쇄에 가변 영역 프레임워크와 함께 서열번호: 8, 10 및 12의 아미노산 서열 및 이들 각각의 보존적으로 변형된 변이체로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 갖는, CD3 항원 복합체에 대해 결합 친화성을 갖는 IgG 항체로서, 중쇄 가변 영역 프레임워크가 서열면에서 사람 타입 서열에 상응하고, 경쇄 가변 영역 프레임워크가 설치류 타입 서열에 특징적인 특정 아미노산을 하나 이상 포함함을 특징으로 하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 포유동물 세포 발현 시스템에 의해 향상된 수율로 발현될 수 있다.

Description

ＣＤ3에 대한 하이브리드 사람/설치류 ＩＧＧ 항체, 및 이의 제조 방법 {HYBRID HUMAN/RODENT IGG ANTIBODY TO CD3, AND METHODS OF ITS CONSTRUCTION}
본 발명은 CD3 항원 복합체에 대해 유도된 신규한 항체, 이들 항체의 생성을 코드화하는 DNA 및 RNA, 이들 항체를 생성시킬 수 있는 이러한 DNA 및/또는 RNA를 함유하는 세포주, 및 DNA, RNA 및/또는 세포를 사용하여 항체를 생성시키는 방법에 관한 것이다.
사람 CD3 항원은 T 세포의 표면에 있는 T 세포 수용체와 비공유적으로 결합되어 있는 최소한 4개의 불변 폴리펩티드로 구성되어 있고, 현재 일반적으로 CD3 항원 복합체로서 일컬어진다. 이것은 T 세포 수용체에 의한 항원 인식에 반응하는 T 세포 활성화 과정에 긴밀하게 관여한다. 모든 CD3 모노클로날 항체는 IL1(인터루킨 1) 및 IL2(인터루킨 2)와 같은 2차적 증식 자극체에 대해 T 세포를 감작시키는 데에 사용될 수 있다. 또한, 특정 CD3 모노클로날 항체는 그 자체로 T 세포에 대해 분열유발성(mitogenic)이다. 이러한 특성은 이소타입 의존성이며, CD3 항체 Fc 도메인과 보조 세포의 표면에 있는 Fc 수용체와의 상호작용으로부터 생긴다.
설치류 CD3 항체는 항원에 대한 T 세포 반응을 억제시키거나, 향상시키거나, 재유도시킴으로써 면역학적 상태에 영향을 미치는 데에 사용되어 왔다. 따라서, 이들은 예를 들어 신장, 간 및 심장 동종이식편의 이식 후 거부 에피소드(episode)를 치료하기 위한 면역억제제로서 사용하기에 사람에게서 현저한 치료 가능성을 갖 는다.
WO 92/06193 및 이의 대응특허 (GB 2249310A, Appn No.s EP. 91917169.4, JP 516117/91 and U.S. Serial No. 07/862543; 이들의 내용은 본원에 참고로 인용되어 있다)는 항체에 대한 가변 영역 유전자를 리쉐입핑(re-shaping)하거나 "인간화"시키고, 이들을 관련된 사람 불변 도메인 유전자와 결합된 형태로 발현시킴에 의한 CD3 항체 항글로불린 반응 문제를 다루고 있다. 이는 모노클로날 항체의 비사람 부분을 항글로불린 반응이 일어날 것 같지 않도록 하는 낮은 수준으로 감소시킨다.
WO 93/19196 및 이의 대응특허 (예: EP 0586617, US 5585097 and US Serial No. 08/478684; 이들의 내용은 본원에 참고로 인용되어 있다)는 제 1 용량 반응의 문제에 관한 것이다. 이들 특허 문헌에는 항원 결합 특이성과 면역억제 특성을 의외로 보유하지만 시험관내에서 T 세포 유사분열생식을 유도시키지 않고 생체내에서 사이토카인 방출 수준의 감소를 유도시키지 않으면서 특정한 Fc 결합 능력을 유지하는 IgG 서브클래스의 아글리코실화된 인간화된 CD3 항체의 용도가 기재되어 있다.
이들 CD3 항체는 현저한 치료적 가치를 갖지만, 세포 배양으로 이들을 생성하는 것은 쉽지 않은 것으로 입증되었다. 사실상, 불량한 항체 수율은 트랜스펙션된 세포주의 불량한 성장에 수반되는 것으로 알려져 있다. 수 년에 걸친 많은 실험 후, 달성된 최대 항체 수율은 약 10㎍/㎖ 였으며, CD3 항체를 발현시키는 세포는 매우 느리게 성장하였다. 또한, 이들 세포는 대규모 생산을 위해 사용된 중공 카트리지 시스템에서 시간이 지남에 따라 네거티브하게 된다.
CD3 항체의 상기 언급된 발현에 사용된 셀테크 글루타민 신테시스 (Celltech Glutamine Sythesis) 벡터 시스템 pEE12는 일상적으로 약 200㎍/㎖로 그 밖의 인간화된 항체의 발현을 제공한다. 최초 래트 하이브리도마 세포주 (YTH 12.5)는 세포 배양시에 100㎍/㎖의 비교적 정상적인 수준으로 발현되며, 이는 인간화된 형태와 관련되는 불량한 항체 생성율을 나타낸다. 하나 이상의 발현된 인간화된 단백질은 세포에 대해 독성인 것으로 드러나는데, 이는 세포의 트랜스펙션 후 이들이 성장하는 것 보다 빨리 네거티브하게 되기 때문인 것으로 여겨진다.
본 발명자들은 키메라 형태의 안티-CD3 항체를 생성시키고, 래트 CD3 경쇄 가변 영역을 사람 람다 불변 영역과 결합시키고, 이것을 인간화된 CD3 아글리코실 중쇄를 함유하는 pEE12 내로 클로닝시킴으로써, 이들이 작용성의 아글리코실화된 CD3 항체를 배양물 1㎖ 당 60 내지 100㎍로 발현시키는 골수종 세포주를 생성시킬 수 있다는 것을 현재 의외로 발견하였다. 제한 희석 클로닝에 의해, 더욱 높은 발현 수준 (예를 들어, 약 120㎍/㎖)을 제공하며, 세포 성장에 대해 바람직하지 않은 효과를 미치지 않으면서 대규모 생산과 관련된 장기간 배양에서 안정하게 남아있는 일부 클론이 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명의 키메라 항체는 보통 래트 유도된 항체와 관련된 안티글로불린 반응없이 양호한 생산 능력을 제공한다.
따라서, 본 발명은 중쇄가 가변 영역 프레임워크와 함께 SEQ ID No 2, 4 및 6의 아미노산 서열 및 이들 각각의 보존적으로 변형된 변이체로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 갖고, 경쇄가 가변 영역 프레임워크와 함께 SEQ ID No 8, 10 및 12의 아미노산 서열 및 이들 각각의 보존적으로 변형된 변이체로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 갖는, CD3 항원 복합체에 대해 결합 친화성을 갖는 IgG 항체로서, 중쇄 가변 영역 프레임워크가 서열면에서 사람 타입 서열에 상응하고, 경쇄 가변 영역이 설치류 타입 서열에 특징적인 특정 아미노산을 하나 이상 포함함을 특징으로 하는 항체를 제공한다.
바람직하게는, 경쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역이 상응하는 완전한 사람 타입을 갖는 경우 보다 경쇄와 중쇄가 더욱 강력하게 결합되도록 하는 설치류 타입 서열에 특이적인 충분한 아미노산을 포함한다. 이것은 편리하게는 경쇄 가변 영역이 설치류(예를 들어, 래트) 서열에 완전히 상응하게 되도록 하는 정도일 수 있다. 대안적으로, 래트에 특징적인 아미노산 중 단지 일부 또는 심지어 하나가 포함될 수 있다.
경쇄 가변 영역 서열에서 사람 타입 보다는 설치류 타입을 갖는 특정 아미노산은 본원에 첨부된 서열목록내의 SEQ ID No 14에 도시된 아미노산으로부터 선택되며, SEQ ID No 14는 모든 가능한 래트 프레임워크에 특징적인 아미노산이 각각의 CDR 서열과 함께 포함되어 있는 바람직한 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열이다. 따라서, SEQ ID No 14의 래트 경쇄 가변 프레임워크 영역에 특징적인 아미노산은 다음과 같다: Gln-1, Ala-2, Val-3, Val-4, Ala-7, Asn-8, Thr-12, Leu-14, Ser-16, Lys-19, Leu-20, Leu-39, Tyr-40, Glu-41, Ser-44, Met-48, Tyr-50, Phe-75, His-79, Asn-80, Val-81, Ala-82, Ile-83, Ile-88 및 Phe-90. 상응하는 사람 아미노산은 각각의 경우 Asp-1, Phe-2, Met-3, Leu-4, Pro-7, His-8, Glu-12, Pro-14, Lys-15, Ile-19, Ile-20, Gln-39, Arg-40, Pro-41, Ala-44, Val-48, Phe-50, Ser-75, Ser-79, Gly-80, Leu-81, Gln-82, Thr-83, Asp-88 및 Tyr-90 이다. 후자 사람 서열은 EP 0586617 B의 6쪽 및 상응하는 미국 특허 출원에 예시되어 있다.
편리하게는, 중쇄 가변 영역 프레임워크는 사람 타입을 갖고, 경쇄 가변 영역은 설치류 타입을 가지며, 모든 상기 명시된 아미노산은 SEQ ID No 14의 래트 타입이다. 그러나, 안정한 경쇄-중쇄 상호작용이 종래의 완전하게 인간화된 형태에 의해 제공된 상호작용 이상으로 달성될 수 있도록 하기에 충분한 설치류(예를 들어, 래트) 서열이 존재하는 한은 SEQ ID No 14의 이들 위치 중 하나 이상 (전부는 아님)은 사람 타입을 가질 수 있다. 이러한 상호작용은 항체가 공급자(Celltech) 지시에 따라 pEE12 세포에서 발현되는 경우 50㎍/㎖를 초과하여, 더욱 바람직하게는 100㎍/㎖를 초과하여 달성되도록 하는 정도가 바람직하다. 바람직하게는, 이러한 세포는 수 주간 사용한 후 현저한 개수로 네거티브하게 되지 않아야 한다.
PCR을 사용하는 부위 유도 돌연변이유발과 같은 기법이, 본 발명의 모든 구체예가 과도한 어려움없이 생성될 수 있고 pEE12 세포로부터 발현 수준에 대해 스크리닝될 수 있게 할 정도로, 이러한 다양한 경쇄 가변부를 필요한 만큼 생성시킬 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다.
SEQ ID No 2,4,6,8,10 및 12의 CDR 아미노 서열은 WO 93/19196의 CDR (a),(b),(c),(d),(e) 및 (f)에 상응하고, CDR 그 자체는 하기에서 각각의 CDR (a) 내지 (f)로도 언급될 수 있다.
바람직하게는, 중쇄 및/또는 경쇄 각각은 SEQ ID No 2,4 및 6 및 SEQ ID No 8,10 및 12의 이들 각각의 CDR 중 세 개 모두를 갖는다.
바람직하게는, 항체는 아글리코실화된다. 용어 "아글리코실화된"은 본 발명에 따른 항체가 글리코실화되지 않은 것임을 나타내도록 보통의 용법으로 사용된다.
프레임워크 영역과 관련된 용어 "사람 타입"은 온전한 항체로 존재하는 경우 사람에게 실질적으로 비면역원성일 정도로 사람 프레임워크와 충분히 유사한 프레임워크를 의미한다. 바람직하게는, 사람 타입 프레임워크를 갖는 중쇄를 갖는 본 발명의 항체는 CD3 항원에 대한 설치류 항체 친화성의 60 내지 140%, 더욱 전형적으로는 80 내지 100%를 갖는다. 인간화된 모노클로날 항체 및 설치류 모노클로날로부터 이들을 생성시키는 방법의 특징은 US 5585089에 기재되어 있으며, 이 특허의 내용은 이러한 목적을 위해 본원에 참고로 편입되어 있다. 사람 타입 중쇄 가변 영역과 이의 래트 대응부의 중쇄 가변 영역의 비교는 SEQ ID No 16 (래트)을 SEQ ID No 20의 N-말단에서 발견되는 상응하는 영역과 비교함으로써 이루어질 수 있다. SEQ ID No 15는 SEQ ID No 16을 코드화하는 DNA의 서열이다. 따라서, 사람 타입 프레임워크 영역은 예를 들어 SEQ ID No 20의 N-말단 119개 아미노산의 서열을 SEQ ID No 16의 서열과 구별짓는 13개 변화 중 7개 이상을 가질 수 있다. 더욱바람직하게는, 사람 타입의 모든 아미노산이 포함된다. 이들 변화는 예를 들어 이들 서열의 위치 5, 18, 19, 42, 49, 75, 77, 78, 88, 93, 97, 98 및 114 중 어느 하나에서 이루어질 수 있다.
프레임워크 영역과 관련된 용어 "설치류 타입"은 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스)의 항체의 프레임워크에 아미노산 서열면에서 상응하는 프레임워크를 의미한다. 안티-CD3 항체의 경우, 편리한 프레임워크 아미노산은 래트 항체의 프레임워크 아미노산이다.
CD3 항원의 추가 논의는 퍼스트 인터내셔날 워크샵 앤드 컨퍼런스 온 휴먼 루코사이트 디퍼런시에이션 안티젠스 (First International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens)의 보고서에서 발견되며, CD3 항원에 대해 유도된 다양한 글리코실화된 항체의 설명도 옥스포드 유니버시티 프레스 (Oxford University Press)에 의해 발행된 이러한 일련의 워크샵스(Workshops) 및 컨퍼런시스(Conferences)의 보고서, 특히 3판 및 4판에서 발견된다. 이러한 항체의 특정한 예로는 문헌[Van Ller et al., Euro. J. Immunol., 1987, 17, 1599-1604, Alegre et al., J. Immunol., 1991, 140, 1184; and Smith et al., ibid, 1986, 16, 478]에 기재된 항체가 있으며, 마지막 문헌은 IgG1 항체 UCHT1와 이의 변이체에 관한 것이다.
그러나, 본 발명에 따른 항체에 대한 기초로서 특히 관심있는 것은 항체 OKT3 및 YTH 12.5.14.2에 함유된 CDR이다. 항체 OKT3는 예를 들어 문헌[Chatenaud et al., Transplantation, 1991, 51, 334] 및 [the New England Journal of Medicine paper, 1985, 313, 339]와, 특허 EP 0 018 795 및 US 4,361,539에 기재되어 있다. 항체 YTH 12.5.14.2 (이하 YTH12.5로서 일컬어짐)는 예를 들어 문헌[Clark et al., European J. Immunol., 1989, 19, 381-388]에 논의되어 있고, 리쉐입핑된 YTH 12.5 항체는 EP 0504350 및 이의 대응특허 US Serial No 08/362780과 US 5585097의 주제이며, 이들 출원에는 이러한 항체에 존재하는 CDR이 상세히 설명되어 있다. US Serial No 08/362780, US 5585097 및 US 4361539의 내용은 본원에 참고로 편입되어 있다.
용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 당 분야에 널리 공지된 용어로서, 항체-항원 친화성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 변화를 함유하는 변이체를 나타낸다. 편의상, 이러한 용어는 이러한 목적으로 본원에 참고로 편입되어 있는 US 5380712에서 발견되는 바와 같이 정의된다.
CDR 중에서, 중쇄 CDR (a), (b) 및 (c)가 가장 중요하다. 본 발명의 항체가 불변 도메인을 또한 함유한다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다.
CDR (a), (b) 및 (c)는 중쇄에서, 리더에서 불변 도메인 (n-말단에서 C-말단) 방향으로 사람 프레임워크 영역 1/(a)/사람 프레임워크 영역 2/(b)/사람 프레임워크 영역 3/(c)/사람 프레임워크 영역 4의 순서로 배열되어 있고, CDR (d), (e) 및 (f)는 경쇄에서, 리더에서 불변 도메인 방향으로 설치류 프레임워크 영역 1/(d)/설치류 프레임워크 영역 2/(e)/설치류 프레임워크 영역 3/(f)/설치류 프레임워크 영역 4의 순서로 배열되어 있다. 따라서, 세 개 모두가 존재하는 경우, 중쇄 CDR은 리더에서 불변 도메인 방향으로 (a),(b),(c)의 순서로 배열되고, 경쇄 CDR은 리더에서 불변 도메인 방향으로 (d),(e),(f)의 순서로 배열되는 것이 바람직하다. 설치류 프레임워크 영역은 바람직하게는 래트이다.
그러나, 본 발명에 따른 항체가 이미 공지된 CDR과 매우 상이한 CDR을 함유하고, 그렇지 않더라도, CDR (a),(b) 및 (c), 및 (d),(e) 및 (f) 중 단지 하나 또는 두개를 각각 함유하는 중쇄 및 특히 경쇄를 가질 수 있을 것이라는 것이 인식되어야 한다. 그러나, 상기 정의된 모든 6개의 CDR이 본 발명에 따른 항체에 반드시 존재할 필요는 없다고 하더라도, 모든 6개의 CDR이 가장 바람직한 항체에 존재하는 것이 가장 일반적일 것이다.
따라서, 특히 바람직한 항체는 아미노산 서열 SEQ ID No 2,4 및 6 또는 이들 각각의 보존적으로 변형된 변이체를 포함하는 세 개의 CDR (a),(b) 및 (c)를 갖는 사람 타입 중쇄 및 아미노산 서열 SEQ ID No 8,10 및 12 또는 이들 각각의 보존적으로 변형된 변이체를 포함하는 세 개의 CDR (d),(e) 및 (f)를 갖는 래트 경쇄를 가지며, 여기에서, 중쇄 CDR은 리더에서 불변 영역 방향으로 (a),(b),(c)의 순서로 배열되고, 경쇄 CDR은 리더에서 불변 영역 방향으로 (d),(e),(f)의 순서로 배열된다.
본 발명의 첫 번째 양태의 바람직한 형태는 사람 CD3 항원에 대해 결합 친화성을 갖는 항체, 특히 아글리코실화된 항체를 제공하며, 여기에서, 항체 불변 영역은 사람 기원의 불변 영역을 가지거나 이로부터 유도되고, 특히, 래트 경쇄 가변 영역에 부착된 람다 불변 영역이다.
한 가지 편리한 가능성은 항체가 아미노산 서열면에서 YTH12.5 하이브리도마의 경쇄 가변 영역, 즉, SEQ ID No 14의 경쇄 가변 영역에 상응하는 래트 경쇄 가변 도메인 프레임워크를 갖는다는 것이지만, 불변 영역은 사람 기원의 불변 영역을 갖거나 이로부터 유도되는 것이 바람직할 것이며, 예를 들어 사람 람다 불변 영역일 것이다. 바람직한 래트 사람 키메라 경쇄 및 람다 불변 영역 아미노산 서열은 SEQ ID No 18의 아미노산 서열이다. YTH12.5를 코드화하는 재조합 핵산, 예를 들어 DNA는 SEQ ID No 13의 아미노산 서열을 포함하는 반면, 래트 경쇄 가변 영역 및 사람 람다 불변 영역을 코드화하는 재조합 핵산은 SEQ ID No 17을 포함한다.
특정한 사람 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열은 바람직한 CDR 서열의 그래프팅(grafting)에 바람직할 것인데, 이는 CDR의 3차원 입체형태가 이러한 서열에서 더욱 잘 유지되고, 항체가 항원에 대해 고수준의 결합 친화성을 보유할 것이기 때문이다. 중쇄 가변(V) 영역 프레임워크는 B 세포 하이브리도마 세포주 18/2로부터 유도된 사람 VH 타입 III 유전자 VH26.D.J.에 의해 코드화된 프레임워크인 것이 바람직하다 (Huminghat, Dersimonian et al., Journal of Immunology, 139, 2496-2501; WO 93/19196 and US Serial No 08/478684).
본 발명의 첫 번째 양태의 바람직한 형태에 있어서, 래트 안티-CD3 항체의 중쇄의 하나 이상의 바람직한 CDR은 리더에서 불변 영역 방향으로 읽혀지는 다음의 아미노산 서열을 갖는 사람 가변 도메인 프레임워크에 존재하며, CDR은 상기 정의된 CDR (a),(b) 또는 (c), 이들의 보존적으로 변형된 변이체 또는 대체 CDR을 나타낸다: SEQ ID No 21/CDR/SEQ ID No 22/CDR/SEQ ID No 23/CDR/SEQ ID No 24.
유사하게는, 래트 CD3 항체의 경쇄의 하나 이상의 바람직한 CDR은 리더에서 불변 영역 방향으로 읽혀지는 다음의 아미노산 서열을 갖는 설치류 가변 도메인 프레임워크에 존재하며, CDR은 상기 정의된 CDR (d),(e) 또는 (f), 이들의 보존적으로 변형된 변이체 또는 대체 CDR을 나타낸다: SEQ ID No 25/CDR/SEQ ID No 26/CDR/SEQ ID No 27/CDR/SEQ ID No 28.
세 개의 바람직한 경쇄 CDR 모두를 함유하는 아글리코실화된 항체의 경우, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID No 14를 포함한다.
중쇄 및 경쇄 불변 영역은 IgG 항체로서의 항체에 대하여 원하는 대상으로서 상이한 타입의 항체를 기초로 할 수 있지만, 이들이 설치류(예를 들어, 래트 또는 마우스) 기원의 불변 영역을 갖거나 이들로부터 유도될 수 있다고 하더라도, 이들은 사람 기원의 불변 영역으로부터 유도되는 것이 바람직하다. 전술한 바와 같이, 경쇄의 경우, 불변 영역은 람다 타입을 갖는 것이 바람직하고, 중쇄의 경우, 아글리코실화를 달성하도록 변형된 (적합한 경우) IgG 이소타입, 특히 IgG1을 갖는 것이 바람직하다.
세 개의 바람직한 중쇄 CDR 모두를 함유하는 아글리코실화된 항체의 경우, 중쇄 가변 영역 및 사람 IgG1 CH1-힌지 아글리코실CH2CH3는 SEQ ID No 20을 포함하며, SEQ ID No 19의 DNA에 의해 코드화된다.
IgG 이소타입의 모든 사람 불변 영역은 N-글리코실화 모티프 아스파라긴297-X298-세린299 또는 트레오닌299 (여기에서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기이다)의 일부를 구성하는 위치 297에 있는 아스파라긴 잔기에서 글리코실화되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 이러한 불변 영역에 있는 아스파라긴297을 글리코실화될 수 없는 또 다른 아미노산으로 대체시킴으로써 아글리코실화될 수 있다. 임의의 아미노산 잔기가 잠재적으로 사용될 수 있지만, 알라닌이 가장 바람직하다. 대안적으로, 아스파라긴297에서의 글리코실화는 모티프 중의 그 밖의 잔기 중의 하나를 변화시킴으로써, 예를 들어 잔기 298을 프롤린으로 대체시키거나, 잔기 299를 세린 또는 트레오닌 이외의 임의의 아미노산으로 대체시킴으로써 방지될 수 있다. 이러한 부위 유도 돌연변이유발을 수행하기 위한 기법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 아머샴(Amersham)으로부터 구입할 수 있는 부위 유도 돌연변이유발 키트를 사용하여 수행될 수 있다. 방법은 하기에 추가로 예시된다.
CDR 중의 하나의 아미노산을 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체시키는 것, 예를 들어 글루탐산 잔기를 아스파르트산 잔기로 대체시키는 것이, 치환(들)이 이루어진 펩티드 또는 단백질의 특성 또는 구조를 실질적으로 변화시킬 수 없다는 것이 당 분야에 널리 인식되어 있다. 따라서, 본 발명의 아글리코실화된 항체는 바람직한 CDR을 함유하지만 CDR의 결합 친화성 및 특이성을 실질적으로 변화시키지 않으면서 치환(들)이 이루어진 특정 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다. 대안적으로는, 결실은 CDR의 아미노산 잔기 서열에서 이루어질 수 있거나, 서열은 여전히 활성을 보유하면서 N-말단 및 C-말단 중 하나 또는 둘 모두에서 신장될 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 아글리코실화된 항체는 항원에 대한 친화성 상수가 105 mole-1 이상, 예를 들어 1012 mole-1 이하인 정도이다. 상이한 친화성을 갖는 리간드가 상이한 용도에 대해 적합할 수 있는데, 예를 들어, 106, 107 또는 108 mole-1 이상의 친화성이 몇몇 경우 적합할 수 있다. 그러나, 106 내지 108 mole-1의 친화성을 갖는 항체가 종종 적합할 것이다. 편리하게는, 항체는 다른 항원에 대해 임의의 실질적인 결합 친화성을 또한 나타내지 않는다. 항체의 결합 친화성 및 항체 특이성은 본원에 참고로 편입된 EP 0586617 및 US Serial No 08/478684 및 US 5585097의 실시예 부분에 기재된 방법과 같은 검정 방법 (참조: Example 5--Effector Cell Retargeting Assay) 또는 ELISA 및 그 밖의 면역검정과 같은 기법에 의해 시험될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 두 개의 동일한 경쇄 및 두 개의 동일한 중쇄를 가질 수 있는 "Y"형 구조를 갖는 아글리코실화된 IgG CD3 항체이므로, 2가이며, 각각의 항원 결합 부위는 CD3 항원에 대해 친화성을 갖는다. 대안적으로, 본 발명은 항체의 아암(arm) 중의 하나만이 CD3 항원에 대해 결합 친화성을 갖는 항체에도 적용될 수 있다. 이러한 항체는 다양한 형태를 취할 수 있다. 따라서, 항체의 나머지 아암은, 예를 들어 미국 특허 출원 제4,474,893호 (본원에 참고문헌으로 인용됨) 및 유럽 특허 출원 제87907123.1호 및 제87907124.9호(EP0293405)에 기재된 바와 같이, 항체가 이중 특이적 항체가 되게 하도록 CD3 이외의 항원에 대해 결합 친화성을 가질 수 있다. 대안적으로, 항체는 결합 친화성을 나타내는 하나의 아암만을 가질 수 있으며, 이러한 항체는 "1가(monovalent)"라고 일컬어진다.
1가 항체 (또는 항체 단편)은 다수의 방법으로 제조될 수 있다. 글레니(Glennie)와 스티븐슨(Stevenson)의 문헌[Nature, 295, 712-713, (1982)]에 는 효소 분해에 의해 1가 항체를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 스티븐슨 등은 효소적으로 생성된 Fab'와 Fc 단편이 화학적으로 교차결합되는 1가 항체 제조에 대한 두 번째 방법을 설명한다 [Anticancer Drug Design, 3, 219-230 (1989)]. 이들 방법에 있어서, 생성된 1가 항체는 이들의 Fab' 아암 중 하나를 잃었다. 1가 항체를 제조하는 세 번째 방법은 European Patent No. 131424에 기재되어 있다. 이 방법에 있어서, 항체의 "Y" 형태가 유지되지만, 두 개의 Fab' 도메인 중 하나만이 항원에 결합할 것이다. 이는 항체의 중쇄와 결합하여 1가 항체가 목적 항체인 생성물의 혼합물을 생성시키는 관련없는 경쇄를 코딩하는 유전자를 하이브리도마내로 도입시킴으로써 달성된다.
그러나, 더욱 바람직하게는, 본 발명의 1가의 아글리코실화된 CD3 항체는 하기 방법에 의해 제조된다. 이것은 중쇄의 가변 영역 도메인 및 첫 번째 불변 영역 도메인이 없는 트렁케이팅(truncating)된 중쇄를 코딩하는 유전자로서 이들 각각의 도메인에 대한 엑손이 결여된 유전자를 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자와 함께 적당한 발현 시스템, 예를 들어 하기 기술되는 세포 시스템내로 도입시키는 것을 포함한다. 이것은 (a) 완전한 2가 항체인 항체, (b) 두 개의 트렁케이팅된 중쇄로만 구성된 항체 단편 (즉, Fc 단편) 및 (c) 트렁케이팅된 중쇄 및 경쇄와 함께 정상적인 중쇄로 구성된, CD3 항원에 대해 1가인 항체의 단편의 혼합물의 세포 시스템에 의해 생성된다. 이러한 항체 단편 (c)는 1가인데, 이는 이것이 하나의 Fab' 아암만을 갖기 때문이다. 이러한 방법에 의해 이러한 단편의 형태로 1가 항체를 생성시키는 것이 여러 가지 이유로 인해 바람직하다. 따라서, 생성된 항체 단편은 세포 시스템에 의해 생성된 항체의 혼합물로부터 용이하게 정제되는데, 이는 이것이 예를 들어 이것의 분자량을 기초로 하여 간단하게 분리될 수 있기 때문이다. 이것은 생성된 1가 항체가 크기와 외관면에서 2가 항체와 유사한 특징을 갖는 유럽 특허 제131424호의 방법으로는 가능하지 않다.
또한, 본 발명의 방법에 의한 1가 항체 단편의 생성은 더욱 용이하게 조절될 수 있는 조건을 사용하므로, 복합 반응 생성물의 분리를 필요로 하는 효소 분해/화학적 커플링 방법과 같이 우연한 것이 아니며, 추가의 장점은 사용된 세포주가 효소 분해/화학적 커플링 방법에 필요한 연속 합성 방법을 사용할 필요없이 1가 항체 단편을 계속 생성시킬 것이라는 데에 있다.
본 발명에 따른 아글리코실화된 항체는 자연계에서 발생하지 않으며, 이러한 아글리코실화된 항체는 일반적으로 다수의 방법으로 합성적으로 생성될 수 있는 것으로 믿어진다. 그러나, 가장 편리하게는, 항체에 존재하는 중쇄 및 경쇄의 불변 영역과 가변 영역에 대한 적합한 유전자 구성물이 개별적으로 수득된 후, 적당한 발현 시스템내로 삽입되는 것이다.
바람직한 구조의 리간드의 가변 도메인을 코드화하는 유전자가 생성되어, 부위 유도 돌연변이유발된 항체의 불변 도메인을 코드화하는 유전자에 부착되는 것이 편리할 수 있다. 이러한 불변 유전자는 하이브리도마 cDNA 또는 염색체 DNA로부터 수득될 수 있으며, 부위 유도 돌연변이유발되어 아글리코실화된 불변 영역을 생성시킬 수 있다. 또한, 가변 영역을 코드화하는 유전자는 본원에 포함된 CDR을 확인하는 데에 사용되는 유전자 합성 기법에 의해 유도될 수 있다. DNA를 위한 적합 한 클로닝 비히클은 다양한 타입을 가질 수 있다.
이러한 유전자가 다양한 방법에 의해 제공될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 예를 들어, (i) CD3 항원에 대한 일련의 하이브리도마를 공지된 방식으로 유도시키고, (ii) WO 92/06193 및 WO 93/19196 및 이들의 대응 US 특허에 기재된 방법에 의해 mRNA를 추출하고, PCR을 사용하여 이것을 cDNA로 전환시킴으로써 이들 하이브리도마로부터 DNA를 제조하고, (iii) 이러한 cDNA를 서열면에서 CDR 상보적 DNA 서열에 상응하는 올리고누클레오티드 프로브로 스크리닝하고, (iv) 임의의 포지티브하게 확인된 하이브리도마를 서열화하고, (v) 상기 특허에 기재된 인간화 기법에 의해 래트 서열을 리쉐입핑시킬 수 있다. 몇몇 CDR, 바람직하게는 6개의 바람직한 CDR 모두를 생성시킬 수 있도록 하기 위해, 부위 유도 돌연변이유발을 사용하여 원하는 DNA를 프레임워크 코드화 DNA의 상응하는 지점에 삽입시킬 수 있다.
세포 시스템의 배양을 통해 이들 유전자를 발현시켜서 작용성 CD3 리간드를 생성시키는 것은 적합한 원핵 세포 시스템 또는 특히 진핵 세포 시스템, 특히 골수종 세포주 (예를 들어, YB2/3.01/Ag20 (이하 YO라 일컬어짐) 래트 골수종 세포, NS0 골수종 세포, 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포)와 같은 무한증식 포유동물 세포주 (그러나, 식물 세포를 사용하는 것도 관심을 끈다)를 다양한 항체 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킨 후, 형질전환된 세포 시스템을 배양하여 원하는 항체를 생성시킴으로써 달성되는 것이 가장 편리하다. 본 발명에 따른 리간드를 제조하는 데에 사용되는 이러한 일반적인 기법은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌["Molecular Cloning" by Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989 (2nd editon)]에 기재되어 있다. 이러한 기법은 본원에 참고문헌으로 인용된 WO 93/19196 및 US Serial No 08/478684에 포함된 실시예에 의해 더욱 상세히 예시되어 있다.
따라서, 본 발명의 두 번째 양태는 항체를 발현시킬 수 있는 세포를 배양하여 항체를 발현시키는 것을 포함하여, CD3 항원에 대해 결합 친화성을 갖는 첫 번째 양태에 따른 아글리코실화된 IgG 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 세 번째 양태는 그 자체로 본 발명에 따른 아글리코실화된 항체를 발현시키는 세포주를 제공한다.
이러한 세포주 중 바람직한 것은 상기 기재된 바람직한 CDR을 코드화하는 DNA 서열을 포함하는 세포주이다. 상기 기재된 CDR (a) 내지 (f)를 코딩하는 누클레오티드 서열의 군은 각각 (a) 내지 (f)로 하기에 나타나 있지만, CDR 아미노산 서열을 여전히 코드화하면서 유전 코드의 축중에 의해 이들 서열에서 변화가 이루어질 수 있음이 인식될 것이다.
(a) SEQ ID No 1; (b) SEQ ID No 3; (c) SEQ ID No 5; (d) SEQ ID No 7; (e) SEQ ID No 9; (f) SEQ ID No 11
이러한 세포주는 특히 (1) (a),(b) 및 (c) 중 하나 이상을 함유하는 사람 중쇄 가변 프레임워크 영역을 발현시키는 DNA 및 (2) (d),(e) 및 (f) 중 하나 이상을 함유하는 설치류 (예를 들어, 래트) 경쇄 가변 프레임워크 영역을 발현시키는 DNA를 포함하는 거대한 DNA 서열을 함유할 것이다.
이러한 DNA의 특정한 예는 상기 논의된 사람 IgG.CH1-힌지-아글리코실-CH2CH3에 결합된 사람 VH 타입 III 유전자 VH26.D.J에 의해 코딩되는 중쇄 프레임워크에 배열된 CDR (a),(b) 및 (c)를 코딩하는 SEQ ID No 19, 및 YTH 12.5 사람 람다 불변 영역 키메라 단백질에 의해 코딩되는 경쇄 프레임워크에 배열된 CDR (d),(e) 및 (f)를 코딩하는 서열 SEQ ID No 17 이다.
본 발명에 따른 키메라성의 부분적으로 인간화된 아글리코실화된 항체는 특히 면역억제, 특히 이식편 거부의 조절에서 치료적 가치를 가지며, 여기서, 면역 억제는 절대적이 아니라 일시적인 것이 특히 바람직하며, 이로써, T 세포는 완전히 파괴되지 않지만, 그 대신 CD3 항원-TCR 복합체의 항체 차단에 의해 비작용성으로 된다. 또한, 아글리코실화된 CD3 항체는 암의 치료, 특히, 이중특이적 항체 (이펙터 세포 재표적화를 위해) 또는 항체-독소 컨쥬게이트의 구성과 같은 다른 분야에서 잠재성을 가질 수 있으며, 여기서, 치료제의 효능은 각각 이펙터 세포의 Fc 매개된 치사 또는 Fc 수용체 함유 세포의 비특이적 치사에 의해 약화된다.
네 번째 양태에 있어서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 아글리코실화된 항체를 투여하는 것을 포함하여, 암, 특히, 림프종에 걸린 환자를 치료하거나, 면역억제 목적으로 (예를 들어 이식편 거부가 일어나는 환자의 경우) 사용되는 방법을 포함한다.
본 발명의 첫 번째 양태에 따른 아글리코실화된 항체는 상기 항체를 생리적으로 허용되는 희석제 또는 캐리어와 함께 환자에게 투여함으로써 환자에게 투여되도록 제형화될 수 있다. 항체는 바람직하게는 멸균되고 발열물질이 없는 희석제 또는 캐리어와 함께 주사가능한 형태로 투여된다. 길잡이로서, 적당한 용량의 항체가 예를 들어 10일의 기간에 걸쳐서 매일 약 1-10㎎으로 주사되지만, 첫 번째 용량 반응의 배제로 인해, 개개의 환자의 필요에 좌우되어 소망에 따라 더 많은 양의 항체, 예를 들어 매일 100㎎ 이하의 항체를 투여할 수 있는 것으로 제시될 수 있다. 수의학적 사용은 유사한 g/kg 용량을 기초로 한다.
이제 본 발명은 하기 제한적이지 않은 실시예, 도면 및 서열목록을 참조로 하여서만 예시에 의해 설명될 것이다. 청구의 범위에 속하는 본 발명의 추가의 구체예가 이러한 설명을 고려하여 당업자에게 인식될 것이다.
도면
도 1은 완전히 인간화된 아글리코실 CD3 (EP0586617, US Serial No08/478684 및 US5585097)와 래트 경쇄 가변 프레임워크 영역이 사용되는 본 발명의 키메라 항체의 결합에 대한 FACS 검정의 플롯을 도시한다. 경쇄 YTH12.5LAG1 단독으로는 정상적인 결합을 나타내지 못하는데, 이는 이것이 중쇄와 결합하지 않기 때문이다.
도 2는 표면상에서 CD52 항원을 발현시키는, pOXD52neo 벡터를 사용하여 생성시킨 두 개의 키메라 트랜스펙턴트의 결합에 대한 FACS 검정의 플롯을 나타낸다. 이는 트랜스펙턴트가 클로날 집단인지를 모니터링하는 수단으로서의 pOXCD52neo 벡터의 용도를 나타낸다. CD52로 염색된 경우, TF 12.5L/CD3A..27은 하나의 피크를 가지며, 이는 모든 세포가 CD3 항체를 생성시킴을 나타내는 반면, TF12.5L/CD3A.34는 CD3 항체를 생성시키지 않는 세포의 네거티브 집단을 나타내는 두 개의 피크를 갖는다.
도 3은 본 발명의 키메라 및 종래의 인간화된 아글리코실CD3에 대한 항체 수율의 측정치로서 사람 IgG 생성을 비교하는 ELISA에서의 희석에 대한 OD492의 플롯을 도시한다. 트랜스펙션시킨 지 3주후에 시험된 CD3 상층액은, 본 발명의 키메라 항체를 코드화하는 DNA가 함유된 세포는 약 120㎍/㎖을 생성시키며, 완전히 인간화된 CD3는 10㎍/㎖ 미만을 생성시킴을 나타낸다.
도 4 및 5는 본 발명의 키메라 항체와 쥬르카트(Jurkat) 세포에 대한 완전히 인간화된 CD3의 항체 친화성에 대한 결합 플롯을 도시한다. 100㎍/㎖의 공지된 농도에서 출발한 후, 1/20으로 희석시키고, 7배 타이트레이션(titration)을 1/2560으로 희석시킨다. 염색 패턴은 친화성이 동일함을 입증한다.
서열 목록
SEQ ID No 1은 CDR (a)를 코드화하는 DNA의 서열이다.
SEQ ID No 2는 CDR (a)의 아미노산 서열이다.
SEQ ID No 3은 CDR (b)를 코드화하는 DNA의 서열이다.
SEQ ID No 4는 CDR (b)의 아미노산 서열이다.
SEQ ID No 5는 CDR (c)를 코드화하는 DNA의 서열이다.
SEQ ID No 6은 CDR (c)의 아미노산 서열이다.
SEQ ID No 7은 CDR (d)를 코드화하는 DNA의 서열이다.
SEQ ID No 8는 CDR (d)의 아미노산 서열이다.
SEQ ID No 9는 CDR (e)를 코드화하는 DNA의 서열이다.
SEQ ID No 10은 CDR (e)의 아미노산 서열이다.
SEQ ID No 11은 CDR (f)를 코드화하는 DNA의 서열이다.
SEQ ID No 12는 CDR (f)의 아미노산 서열이다.
SEQ ID No 13은 래트 경쇄 가변 영역을 코드화하는 DNA의 서열이다.
SEQ ID No 14는 래트 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
SEQ ID No 15는 각각의 CDR을 포함하는 래트 중쇄 가변 영역을 코드화하는 DNA의 서열이다.
SEQ ID No 16은 각각의 CDR을 포함하는 래트 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
SEQ ID No 17은 각각의 CDR을 갖는 래트 경쇄 가변 영역 및 사람 람다 불변 영역을 코드화하는 DNA의 서열이다.
SEQ ID No 18은 각각의 CDR을 갖는 래트 경쇄 가변 영역 및 사람 람다 불변 영역의 아미노산 서열이다.
SEQ ID No 19는 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역 및 사람 CH1-힌지-아글리코실CH2CH3를 코드화하는 DNA 서열이다.
SEQ ID No 20은 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역 및 사람 CH1-힌지-아글리코실CH2CH3의 아미노산 서열이다.
SEQ ID No 21 내지 24는 CDR이 없는 사람 중쇄 가변 도메인 프레임워크의 아미노산 서열이다.
SEQ ID No 25 내지 28은 CDR이 없는 래트 경쇄 가변 도메인 프레임워크의 아미노산 서열이다.
SEQ ID No 29 및 30은 pEE12내로 래트 CD3 경쇄 가변 영역을 클로닝시키는 데에 사용되는 프라이머의 서열이다.
일반적인 방법
인간화된 중쇄를 갖는 CD 3 특이적 모노클로날 항체를 생성시키는 일반적인 방법.
사람 CD3 항원에 대해 특이적인 래트 항체 YTH 12.5의 V 영역 유전자의 클로닝과 리쉐입핑을 루틀리지(Routledge) 등의 문헌[1991,Eur.J.Immunol.,21,2717] 및 UK 특허 출원 번호 제9121126.8호(GB2249310)과 이의 대응특허에 기술된 바와 같이 수행한다. YTH 12.5는 CD3 항원 복합체에 대해 특이적인 IgG2b 모노클로날 항체를 분비하는 래트 하이브리도마 세포주이지만, 방법은 동일한 CDR을 갖는 CD3 특이적 항체를 분비하는 다른 세포에도 적용될 수 있다 (전술한 설명을 참조하라).
요약하면, 방법은 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 사용하면서 올랜디(Orlandi) 등의 문헌[1989, PNAS USA, 86, 3833]의 방법을 기초로 한다. VH 유전자 (중쇄 가변 영역 유전자)를 올리고누클레오티드 프라이머 VH1FOR 및 VH1BACK를 사용하여 클로닝시킨다 (상기 인용된 특허를 참조하라). PCR 생성물을, 부위 유도 돌연변이유발이 6개의 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하여 수행된 벡터 M13-VHPCR1내로 결찰시킨다. VL 유전자 (경쇄 가변 영역 유전자)를 공지된 VLё 서열을 기초로 하여 설계한 프라이머를 사용하여 클로닝시킨다. 유전자를 사람 람다 경쇄 불변 영역과 함께 벡터 M13-VKPCR내로 클로닝시킨다. 이 벡터에서, VL 프레임워크의 돌연변이유발을 5개의 올리고누클레오티드를 사용하여 수행한다. 그 후, 인간화된 VL 유전자를 발현 벡터
Figure 112004031050906-pct00001
내로 삽입시킨다.
리쉐입핑된 CD3 VH 유전자가 상이한 면역글로불린 H 쇄 불변 영역 유전자와 함께 발현될 수 있는 벡터 p316을 생성시키고, 이 벡터는
Figure 112004031050906-pct00002
벡터를 기초로 한다 (Gunning et al., 1987, P.N.A.S. USA, 85, 7719-7723). 디히드로폴레이트 환원효소 (dhft) 유전자와 SV 40 발현 시그널 (Page & Sydenham, 1991, Biotechnology, 9, 64)를 함유하는 DNA의 1.65 Kb 단편을
Figure 112004031050906-pct00003
의 독특한 EcoRI 부위내로 삽입시킨다. 그 후, 리쉐입핑된 CD3-VH 유전자를 코드화하는 700bp HindIII-BamHI DNA 단편을 벡터의 다중 클로닝 부위내로
Figure 112004031050906-pct00004
액틴 프로모터의 다운스트림에 및 이의 조절을 받게 하면서 클로닝시킨다. 그 후, 원하는 H 쇄 불변 영역 유전자 (게놈 구조)를 CD3-VH 유전자의 다운스트림에 있는 독특한 BamH1 제한 효소 부위내로 삽입시킬 수 있다.
아글리코실화된 사람 IgG1 불변 영역을 다카하시(Takahashi) 등의 문헌[1982, Cell, 29, 671-679]에 기재된 야생형 G1m(1,17) 유전자로부터 다음과 같이 유도시킨다. 유전자를 벡터 M13 tg131 내로 클로닝시키고, 여기서, 부위 유도 돌연변이유발을 수행하여 (Amersham International PLC kit) 위치 297의 아미노산 잔기를 아스파라긴에서 알라닌 잔기로 변이시킨다.
Asn-297에 있는 올리고사카라이드는 모든 정상적인 사람 IgG 항체의 특징이며 (Kabat et al.,1987, Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health Human Services Publication), IgG 분자의 두 개의 중쇄는 각각 아스파라긴 잔기의 아미드기에 결합된 하나의 분지쇄 탄수화물기를 갖는다 (Rademacher and Dwek, 1984, Prog. Immunol., 5, 95-112). 아스파라긴이 알라닌으로 치환되면 항체의 글리코실화가 방지된다.
2.3 Kb 아글리코실 IgG1 불변 영역을 BamHI과 BgIII를 사용하는 이중 분해에 의해 M13으로부터 절제시키고, 벡터 p316의 BamHI 부위내로 결찰시켜서, 클론 p323을 생성시킨다.
dhfr- 차이니즈 햄스터 난소 세포의 서브컨플루언트(subconfluent) 단일층을 중쇄를 함유하는 벡터 p323과 리쉐입핑된 사람 ё 경쇄를 함유하는 제 2 벡터 p274 (Routledge et al., 1991, Eur. J. Immunol., 21,2717-2725)로 코트랜스펙션(co-transfection)시킨다. 트랜스펙션시키기 전, 두 개의 플라스미드 DNA를 제한 엔도누클레아제 PvuI를 사용하여 선형화시킨다. 트랜스펙션을 제조업자의 권고에 따르면서 DOTMA 시약 (Boehringer, Germany)을 사용하여 수행한다.
중쇄 및 경쇄 트랜스펙턴트를, 크산틴/히포크산틴을 함유하지 않고 5%(v/v) 투석된 우태아혈청을 함유하는 IMDM 중에서 선택한다.
유사한 야생형 사람 IgG1-CD3 중쇄 벡터 p278의 제조 방법은 다른 문헌에 기재되어 있다 (참조: Routledge et al., 1991, Eur. J. Immunol., 21, 2717-2725 및 UK 특허 출원 제9121126.8호(GB2249310) - 본원에 참고문헌으로 인용되어 있음). 온전한 사람 IgG2 (Flanagan & Rabbitts, 1982, Nature 300, 709-713), IgG3 (Huck et al., 1986, Nuc. Acid. Res., 14, 1779-1789), IgG4 (Flanagan & Rabbitts, 1982, Nature 300, 709-713), 엡실론(Epsilon) (Flanagan & Rabbitts, 1982, EMBO. Journal 1, 655-660) 및 알파(Alpha)-2 (Flanagan & Rabbitts, 1982, Nature 300, 709-713) 불변 영역 유전자를 함유하는 H-쇄 발현 벡터 (각각 벡터 p317, p318, p320, p321 및 p325)는 벡터 p316으로부터 유도된다. 이들 벡터를 경쇄 벡터 p274와 함께 이미 공지된 dhfr- CHO 세포내로 도입시키면 각각
Figure 112006022941457-pct00010
이소타입의 CD3 항체를 분비시키는 세포주가 생성된다. CD3 항체를 발현하는 세포를 연질 아가에서 2라운드의 클로닝을 수행한 후, 롤러 보틀(roller bottle) 배양물로 증식시킨다. 각각의 세포주로부터의 약 4 리터의 조직 배양 상층액로부터의 면역글로불린을 암모늄 설페이트 침전에 의해 농축시키고, PBS에 대해 광범위하게 투석시킨 후, 하기와 같이 정량한다:
항체가 순수하지 않은 경우, CD3 항원 결합력을 갖는 항체의 농도를 특이적으로 정량하도록 설계된 경합 검정을 사용한다. 사람 T 세포 모세포를, 키메라 패널과 동일한 CD3 항원의 에피토프에 결합하는 항체인 FITC 표지된 UCHT-1과 인큐베이션시킨다. 사용된 FITC 시약의 농도는 절반을 포화시킬 정도인 것으로 사전 측정된다. 표지되지 않은 YTH 12.5 (HPLC 정제됨)를 공지된 출발 농도로부터 타이트레이팅(titrating)하고, T 세포와 UCHT-1 FITC를 함유하는 웰에 첨가한다. 표지되지 않은 항체는 항원 결합 부위에 대해 경합 물질로서 작용한다. 이는 세포가 FACS 분석을 사용하여 실험되는 경우 나타나는 평균 형광성의 감소로서 검출된다. 따라서, 미지의 출발 농도로부터의 키메라 항체의 타이트레이팅은 평균 형광성이 항체 희석율에 대해 플로팅되는 경우 일련의 S자형 곡선을 생성시킨다. 이들 곡선은 표준 YTH 12.5 곡선과 직접 비교될 수 있으며, 등가 항체가 사용될 수 있다.
실시예 1:
사람 중쇄 가변 프레임워크가 IgG1 불변 영역에 결합되어 있고, 래트 경쇄 가변 프레임워크가 사람 람다 불변 영역에 결합되어 있는, 서열면에서 YTH 12.5 래트 항체로부터의 CDR에 상응하는 CDR을 함유하는 사람 CD3 항원에 대해 특이적인 아글리코실화된 항체의 제조
래트 CD3 중쇄만을 발현시키는 YTH12.5LAG1의 쇄상실(chain loss) 변이체가 CD3 경쇄의 상실에 대해 선택되었고, 완전히 인간화된 아글리코실 CD3 중쇄에서 트랜스펙션시킬 목적으로 사용되었다. 인간화된 IgG1 아글리코실 CD3 중쇄 구성물을 코드화하는 1.4kb BamH1-HindIII DNA 단편을 상이한 선택성 마커를 함유하는 두 개의 상이한 발현 벡터 pHβApr-1 gpt (Gunning et al (1987) P.N.A.S. USA 84, 4831 and 85, 7719-7723) 및 pOXCD52neo (Frewin unpublished)의 다중 클로닝 부위내로 클로닝시켰다.
pOXCD52neo 발현 벡터를 고수준 항체 생성율을 제공하는 강력한 '폴리펩티드 사슬 연장 인자 1' 프로모터 (EF1)을 사용하여 생성시켰다 (참조: Shigekazu Nagata NAR, Vol 18, No 17, page 5322). 이것은 네오마이신 선택성 마커와 함께 구성물내에 위치한다. 또한, 벡터에는 TK 프로모터에 의해 유도된 Campath CD52 표면 발현된 항원에 대한 cDNA가 포함된다 (이러한 모든 프로모터와 마커는 자유로이 이용할 수 있다). 세포 표면상에서의 CD52의 발현은 CD52 항체를 사용하여 형질전환체를 확인할 수 있게 해준다.
그 후, YTH 12.5LAG1를 일렉트로포레이션에 의해 두 개의 플라스미드로 개별적으로 트랜스펙션시키고, 생존 콜로니가 시험할 정도로 성장할 때까지 수 주에 걸쳐서, 무거운 트랜스펙턴트를 5% 우태아혈청, MPA 및 크산틴이 함유된 IMDM으로 pHβApr-1gpt에 대해 선택하고, 5% 우태아혈청 및 1㎎/㎖ G418이 함유된 IMDM으로 pOXCD52neo에 대해 선택하였다. 둘 모두의 트랜스펙션은 ELISA를 사용하여 사람 IgG1 생성에 대해 스크리닝하는 경우 포지티브 클론을 생성시켰다. 작용성 CD3 항체를 사람 T 세포주 쥬르카트 (ATCC TIB 512 (J. Immunol 133, 123-128 (1984))에 결합시킴으로써 시험하였고, FACS (Becton Dickinson)에 의해 분석하였는데, 둘 모두의 검정은 30 내지 50㎍/㎖의 항체 수율을 나타내었다.
pOXCD52neo 벡터는 세포 표면 마커 CD52를 사용하여 항체를 생성시키는 트랜스펙션된 세포를 모니터링할 수 있게 해준다. FITC 트랜스펙션된 세포와 결합된 Campath CD52 항체를 취함으로써 이러한 마커 분비 항체를 함유하는 세포만이 항체를 생성시키는 세포의 비율에 대해 FACS에 의해 분석될 수 있고, 클로날 상태가 확인될 수 있다. 네거티브 생성 세포는 검출되지 않았고, 항체 수율은 정상 세포 성장을 보이면서 50㎍/㎖를 유지하였다.
제한 효소 부위 HindIII와 EcoR1을 도입시켜서 셀테크(Celltech) 발현 벡터 pEE12 내로 클로닝될 수 있도록 하는 프라이머를 사용하여 래트 CD3 경쇄 가변 영역을 사람 람다 불변 영역에 결합시키는 PCR 어셈블리를 사용하여 키메라 형태의 아글리코실 CD3 항체를 생성시켰다 (참조: Bebbington et al (1992) Biotechnology 10, 169). 프라이머 서열은 본원에 첨부된 서열목록의 SEQ ID No 29 및 30 이다.
최종 구성물을 서열화시키고, 인간화된 CD3 아글리코실 중쇄를 이미 함유하는 pEE12 내로 클로닝시키고, 이것을 일렉트로포레이션에 의해 골수종 세포주 NS0 (ECACC No 85110503-Galfre and Milstein (1981) Enzymology 73 (B) 3-46) 내로 트랜스펙션시켰다. 생성된 클론을 사람 IgG1 및 사람 람다 경쇄에 대해 ELISA를 사용하여 항체 생성에 대해 스크리닝하고, 사람 T 세포 클론 쥬르카트 세포주에 결합하는 것에 대해 FACS로 스크리닝하였다. ELISA는 포획 항체로서 염소 안티-사람 IgFc (Sigma I2136)을 사용하고, 검출 항체로서 비오티닐화된 양 안티-사람 IgG (Amersham RPN 1003) 또는 비오티닐화된 염소 안티-사람 람다 경쇄 (Amersham RPN 1188)를 사용한다. (참조: Routledge et al Eur. J. Immunol (1991) 21:2717-2725).
1회의 트랜스펙션 후, 16개의 클론은 리쉐입핑된 아글리코실 CD3을 사용하는 임의의 다른 트랜스펙션 보다 훨씬 높은 수준인 60㎍/㎖ 내지 100㎍/㎖을 발현시켰다. 그 후, 이들 트랜스펙턴트를 제한 희석 클로닝에 의해 클로닝시켰고, 이들 중 몇몇은 120㎍/㎖으로 개선되었다. 이들은 장기간 배양 및 대규모 항체 생성에서 세포 성장과 관련된 문제없이 안정한 채로 있었다.
도 1 내지 4는 이미 공지된 완전히 인간화된 아글리코실 안티-CD3 항체와 동일한 능력을 가지면서 CD3과 결합하는 본 발명의 항체의 능력을 나타낸다.
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Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 21: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 30 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: unknown (ii) MOLECULE TYPE: peptide (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: Region (B) LOCATION:1..30 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 21: Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 22: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 14 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: 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Claims (43)

  1. 중쇄가 서열번호: 2, 4 및 6의 아미노산 서열 또는 이들 각각의 보존적으로 변형된 변이체를 갖는 CDR들과 함께 가변 영역 프레임 워크를 가지고, 경쇄가 서열번호: 8, 10 및 12의 아미노산 서열 또는 이들 각각의 보존적으로 변형된 변이체를 갖는 CDR들과 함께 가변 영역 프레임워크를 갖는,
    사람 CD3 항원 복합체에 대해 결합 친화성을 갖고 사람 IgG 타입의 아글리코실화된 중쇄 불변 영역 및 사람 람다 타입의 경쇄 불변 영역을 가지는 IgG 항체로서,
    중쇄 가변 영역 프레임워크가 서열면에서 사람 타입 서열에 상응하고, 경쇄 가변 영역 프레임워크가 항체를 코드화하는 DNA가 NS0 골수종 세포에 트랜스펙션된 pEE12 벡터내에서 발현되는 경우 50㎍/㎖가 넘는 항체 수율이 수득되도록 하는 래트 타입 서열에 특징적인 특정 아미노산을 하나 이상 포함하는 래트-사람 키메라 쇄이며,
    상기 래트-사람 키메라 쇄가, Gln-1 → Asp-1; Ala-2 → Phe-2; Val-3 → Met-3; Val-4 → Leu-4; Ala-7 → Pro-7; Asn-8 → His-8; Thr-12 → Glu-12; Leu-14 → Pro-14; Ser-16 → Lys-16; Lys-19 → Ile-19; Leu-20 → Ile-20; Leu-39 → Gln-39; Tyr-40 → Arg-40; Glu-41 → Pro-41; Ser-44 → Ala-44; Met-48 → Val-48; Tyr-50 → Phe-50; Phe-75 → Ser-75; His-79 → Ser-79; Asn-80 → Gly-80; Val-81 → Leu-81; Ala-82 → Gln-82; Ile-83 → Thr-83; Ile-88 → Asp-88 및 Phe-90 → Tyr-90으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어진 래트 프레임워크 서열로부터 유래됨을 특징으로 하는 IgG 항체.
  2. 제1항에 있어서, 아글리코실화가, 글리코실화될 수 없는 아미노산에 의해 치환된 아스파라긴 잔기를 가지는, N-글리코실화 모티프, 아스파라긴-X-세린 또는 아스파라긴-X-트레오닌, 또는 아스파라긴의 글리코실화를 방지하도록 이와 같이 변경된 다른 모티프 잔기들 중 하나를 구비한 사람 타입 불변 영역을 가짐에 의해 제공됨을 특징으로 하는 항체.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 래트 서열에 완전하게 상응함을 특징으로 하는 항체.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, CDR들이, 중쇄에서는 리더에서 불변 도메인 (n-말단에서 C-말단) 방향으로 사람 프레임워크 영역 1/서열번호: 2/사람 프레임워크 영역 2/서열번호: 4/사람 프레임워크 영역 3/서열번호: 6/사람 프레임워크 영역 4의 순서로 배열되고, 경쇄에서는 리더에서 불변 도메인 방향으로 래트 프레임워크 영역 1/서열번호: 8/래트 프레임워크 영역 2/서열번호: 10/래트 프레임워크 영역 3/서열번호: 12/래트 프레임워크 영역 4의 순서로 배열됨을 특징으로 하는 항체.
  9. 제1항에 있어서, 사람 프레임워크 영역이 아미노산 서열 서열번호: 21, 22, 23 및/또는 24를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  10. 제1항에 있어서, 래트 안티-CD3 항체의 중쇄의 하나 이상의 바람직한 CDR들이, 리더에서 불변 영역 방향으로 서열번호: 21/CDR/서열번호: 22/CDR/서열번호: 23/CDR/서열번호: 24로 읽혀지는 아미노산 서열을 갖는 사람 가변 도메인 프레임워크에 존재함을 특징으로 하는 항체.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제1항에 있어서, 서열번호: 14의 래트 경쇄 가변 도메인 프레임워크 영역을 포함함을 특징으로 하는 항체.
  16. 제1항에 있어서, 래트 사람 키메라 경쇄 및 람다 불변 영역 아미노산 서열 서열번호: 18을 포함함을 특징으로 하는 항체.
  17. 중쇄 불변 영역이 IgG1 이소타입을 갖는, 제1항에 따른 아글리코실화된 항체.
  18. 불변 영역 중쇄의 위치 297의 아스파라긴 잔기가 대안의 아미노산 잔기로 대체된, 제1항에 따른 아글리코실화된 항체.
  19. 제 18항에 있어서, 아스파라긴 잔기가 알라닌 잔기에 의해 대체됨을 특징으로 하는 아글리코실화된 항체.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 생리학적으로 허용되는 희석제 또는 캐리어를 포함하는 약제학적 조성물 형태임을 특징으로 하는 제1, 2, 4, 8, 9, 10 및 15 내지 19항 중 어느 한 항에 따른 아글리코실화된 항체.
  24. 치료에 사용되는 제1, 2, 4, 8, 9, 10 및 15 내지 19항 중 어느 한 항에 따른 아글리코실화된 항체.
  25. 삭제
  26. 제1, 2, 4, 8, 9, 10 및 15 내지 19항 중 어느 한 항에 따른 항체를 코드화하는 재조합 핵산.
  27. 제26항에 있어서, 서열번호: 13의 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  28. 제26항에 있어서, 서열번호: 17의 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  29. 제26항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호: 20의 펩티드를 코드화함을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  30. 제26항에 있어서, 리더에서 불변 영역 방향으로 서열번호: 25/CDR/서열번호: 26/CDR/서열번호: 27/CDR/서열번호: 28로 읽혀지는 아미노산 서열을 코드화함을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  31. 제26항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호: 14를 코드화함을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  32. 제26항에 있어서, DNA임을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  33. 아미노산 서열 서열번호: 18을 포함하는 단백질을 코드화함을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  34. 서열번호: 17의 재조합 DNA.
  35. 제26항에 따른 재조합 핵산을 포함함을 특징으로 하는 단백질 발현 시스템.
  36. 제35항에 있어서, 제26항에 따른 핵산이 삽입된 벡터를 포함함을 특징으로 하는 시스템.
  37. 제35항에 있어서, 각각 중쇄 및 경쇄를 코드화하는 재조합 핵산의 별개의 구성물을 포함함을 특징으로 하는 시스템.
  38. 제37항에 있어서, 구성물이 불변 영역을 갖는 쇄를 코드화함을 특징으로 하는 시스템.
  39. 제1, 2, 4, 8, 9, 10 및 15 내지 19항 중 어느 한 항에 따른 항체를 발현시키는 원핵 세포 또는 진핵 세포.
  40. 제39항에 있어서, 제30항에 따른 핵산을 포함함을 특징으로 하는 세포.
  41. 제39항에 있어서, 무한증식 사람 세포임을 특징으로 하는 세포.
  42. 제39항에 따른 세포를 배양하는 것을 포함함을 특징으로 하는 제1항에 따른 항체를 생성시키는 방법.
  43. 제1, 2, 4, 8, 9, 10 및 15 내지 19항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하여, 암에 걸린 환자 또는 면역억제가 필요한 환자를 치료하기 위한 약제 조성물.
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