JP4629228B2 - CD3に対するヒト/げっ歯動物ハイブリドIgG抗体、およびその構築の方法 - Google Patents
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Description
本発明は、CD3抗原複合体に対する新規抗体、これらの抗体を産生するためにコードするDNAおよびRNA、これらを産生できるようなDNAおよび/またはRNAを含む細胞系、およびこれらのDNA、RNAおよび/または細胞を使用してこれらの抗体を産生する方法に関する。
【0002】
ヒトCD3抗原は、T細胞の表面でT細胞受容体と非共有結合で会合する最少4本の不変ポリペプチド鎖より成り、一般に今ではCD3抗原複合体と言われている。この複合体は、T細胞受容体による抗原認識に応答するT細胞活性化の方法に密接に関与している。すべてのCD3モノクローナル抗体は、IL1(インターロイキン1)およびIL2(インターロイキン2)のような2次増殖性刺激に対してT細胞を感作するのに、使うことができる。さらに、ある種のCD3モノクローナル抗体は自身が、T細胞に対して分裂促進性である。この性質は、イソタイプ依存性で、CD3抗体Fcドメインと補助細胞の表面上のFc受容体との相互作用に由来する。
【0003】
げっ歯動物のCD3抗体は、抗原に対するT細胞応答を抑圧、促進、または再方向づけすることによって、免疫状態を操作するのに使われてきた。したがって、それらの抗体は、例えば腎臓、肝臓、および心臓の同種移植片の移植後の拒絶反応エピソードの治療のために、免疫抑制剤としてヒトの治療用に使える可能性が相当高い。
【0004】
国際特許出願公開WO92/06193およびその対応出願(英国特許第2249310A号,出願番号欧州特許第91917169.4号,日本特許出願公開第516117/91号および米国特許出願シリアル番号第07/862543号;これらの内容は参考文献として本明細書に援用される)は、CD3抗体抗グロブリン応答問題を、その抗体の可変部遺伝子を再構成する、すなわち「ヒト化」すること、および関連するヒト定常ドメイン遺伝子と会合させ、発現させることにより、解決している。これにより、そのモノクローナル抗体の非ヒト含量は、抗グロブリン応答が起こらない程度に減少する。
【0005】
国際特許出願公開WO93/19196およびその対応出願(例えば、欧州特許第0586617号,米国特許第5585097号および米国特許出願シリアル番号第08/478684号;これらの内容は参考文献として本明細書中に援用される)は、一次投与量応答の問題を解決している。これらの文献は、IgGサブクラスの非グリコシル化ヒト化CD3抗体の使用を教示している。、これらの抗体は、意外にもその抗原結合特異性および免疫抑圧性質を保留しているものの、in vitroでT細胞分裂促進を誘導せず、in vivoで低レベルのサイトカイン放出を誘導するが、なお若干のFc結合能を維持している。
【0006】
これらのCD3抗体の治療価値は高いが、細胞培養での産生が容易とはされていない。実際、トランスフェクトされた細胞系での増殖の悪さとともに、抗体の収量も低いことがわかっている。数年にわたる多大の努力にもかかわらず、達成できた最高の抗体濃度は約10μg/mlで、CD3抗体を発現する細胞の増殖は非常に遅かった。さらに、大規模産生に用いられたホローカートリッジシステム(hollow cartridge systems)中では、これらの細胞は時間とともに産生を停止する(go negative)。
【0007】
CD3抗体の前記発現に用いられたCelltech Glutamine Synthesisのベクター系PEE12は、他のヒト化抗体の発現を約200μg/mlで日常的に行う。当初のラットハイブリドーマ細胞系(YTH12.5)は、細胞培養で比較的正常濃度として100μg/mlを発現しており、抗体生産性の低さはそのヒト化型と関連することを示している。トランスフェクション後に、細胞は増殖するより速く産生を停止したので、発現されたヒト化タンパク質群のうちの一つまたは一つより多くがそれらの細胞に有毒のようである。
【0008】
このほど本発明者らは驚くべきことに、ラットCD3軽鎖可変領域をヒトラムダ定常領域に連結し、これを、ヒト化CD3非グリコシル化(aglycosylated)重鎖を含むPEE12中へクローニングして、抗CD3抗体のキメラ型をつくることによって、機能性非グリコシル化CD3抗体を培養細胞で60から100μg/mlのレベルで発現するミエローマ細胞系を産生できることを、見出した。限界希釈クローニングを用いることによって、それらのクローンから、さらに高い、例えば120μg/ml程度の発現レベルを示し、大規模産生の長期培養でも細胞増殖に都合の悪い影響を全く与えず、安定な状態を保ついくつかのクローンを、選択できた。このように、本発明のキメラ抗体は、ラット由来の抗体に通常見られる抗グロブリン応答がなく、良好な生産性をもたらす。
【0009】
したがって、本発明は、CD3抗原複合体に対し結合親和性を有するIgG抗体であって、重鎖は、配列番号2、配列番号4および配列番号6およびそれらの保存的に修飾された変異体(variants)のアミノ酸配列から選択された少なくとも一つのCDRとともに可変領域枠組み構造を有し、そして軽鎖は、配列番号8、配列番号10および配列番号12およびそれらの保存的に修飾された変異体のアミノ酸配列から選択された少なくとも一つのCDRとともに可変領域枠組み構造を有し、
当該重鎖可変領域枠組み構造は配列がヒト型配列に対応し、当該軽鎖可変領域枠組み構造は、げっ歯動物型配列に特徴的な一つまたは一つより多くの特定のアミノ酸を含むことを特徴とする、前記抗体を提供する。
【0010】
好ましくは軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域が完全にヒト型に相当する場合よりも強くその軽鎖および重鎖が会合するように、げっ歯動物型配列に特異的なアミノ酸を十分に含む。これは、便利には、その軽鎖可変領域がげっ歯動物、例えばラット、の配列に完全に対応するようにしてもよい。あるいは、ラット特有のアミノ酸をいくつかだけ、もしくは一つだけでも含ませることも可能である。
【0011】
軽鎖可変領域配列でヒト型よりむしろげっ歯動物型である特定のアミノ酸は、本明細書中の配列表中の配列番号14に示すものから選択される。その配列は、ラット枠組み構造に特有のすべての可能性のあるアミノ酸が、それぞれのCDR配列とともに、含まれている、好ましい軽鎖可変領域枠組み構造配列である。したがって、配列番号14中のラット軽鎖可変枠組み構造領域に特徴的なアミノ酸は、Gln−1,Ala−2,Val−3,Val−4,Ala−7,Asn−8,Thr−12,Leu−14,Ser−16,Lys−19,Leu−20,Leu−39,Tyr−40,Glu−41,Ser−44,Met−48,Tyr−50,Phe−75,His−79,Asn−80,Val−81,Ala−82,Ile−83,Ile−88 およびPhe−90である。それぞれに対応するヒトアミノ酸は、Asp−1,Phe−2,Met−3,Leu−4,Pro−7,His−8,Glu−12,Pro−14,Lys−15,Ile−19,Ile−20,Gln−39,Arg−40,Pro−41,Ala−44,Val−48,Phe−50,Ser−75,Ser−79,Gly−80,Leu−81,Gln−82,Thr−83,Asp−88およびTyr−90である。この後者のヒト配列は、欧州特許第0586617B号の第6頁およびそれに対応する米国特許出願に図示されている。
【0012】
便利には、その重鎖可変領域枠組み構造はヒト型であり、そして軽鎖可変領域は、配列番号14のラット型である前記指定のすべてのアミノ酸をもつ、げっ歯動物型のものである。しかしながら、先行技術の完全ヒト化型による相互作用よりも安定した軽・重鎖相互作用が達成できるだけ、げっ歯動物、例えばラットの配列が十分存在するならば、配列番号14のこれらの位置のすべてではないが、一つまたは一つより多くはヒト型であってもよい。そのような相互作用は、好ましくは供給者(Celltech)の指示にしたがって、その抗体がPEE12細胞中で発現された場合、50μg/ml以上、より好ましくは100μg/ml以上である。また、それらの細胞は、数週間の使用後でも有意な数が産生停止をしない(not go negetive)ことが、好ましい。
【0013】
本発明のすべての態様を過度の負担を伴わずに産生し、そしてPEE12細胞からの発現量をスクリーニングできるように、PCRを用いた部位特異的突然変異誘発のような技術によって、これらさまざまな可変軽鎖の必要な産生が可能であることを、当業者は了解するはずである。
【0014】
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10および配列番号12のCDRアミノ配列は、国際特許公開WO93/19196のCDR(a),CDR(b),CDR(c),CDR(d),CDR(e)およびCDR(f)に対応し、それらのCDR自身も、以下それぞれCDR(a)からCDR(f)として呼称うる場合がある。
【0015】
好ましくは、重鎖および/または軽鎖各々は、配列番号2、配列番号4、配列番号6のCDR、並びに配列番号8、配列番号10、配列番号12のCDRの三つすべてをそれぞれ有する。
【0016】
好ましくは、抗体は非グリコシル化型である。非グリコシル化されているという用語は、その通常の使途では、本発明の抗体がグリコシル化されていないことを指すのに使われる。
【0017】
その枠組み構造領域に関するヒト型という用語は、ヒト枠組み構造に十分類似しており、無傷の(intact)抗体中に存在する場合、ヒトで実質的に非免疫原性である枠組み構造を意味する。好ましくは、ヒト型枠組み構造を備えた重鎖をもつ本発明の抗体は、CD3抗原に対するげっ歯動物抗体親和性の60から140%、より典型的には少なくとも80から100%の親和性を有する。ヒト化モノクローナル抗体の特性およびげっ歯動物モノクローナルからこれらをつくる方法は、米国特許第5585089号に開示されており、それらの内容は、その目的のために参考文献として本明細書に援用される。ヒト型重鎖可変領域とそのラット対応物との比較は、配列番号16(ラット)を、配列番号20のN末端にみられるその対応領域に比較することにより、行うことも可能である。配列番号15は、配列番号16をコードするDNAのものである。したがって、ヒト型枠組み構造領域は、例えば配列番号20のN−末端119個のアミノ酸の配列を、配列番号16のものと異ならせる13箇所の変化のうち、7または7以上を有しても良い。より好ましくは、ヒト型のすべてのアミノ酸が取り込まれることである。これらの変化は、例えば、これらの配列の5位、18位、19位、42位、49位、75位、77位、78位、88位、93位、97位、98位および114位のいずれでもよい。
【0018】
その枠組み構造領域に関するげっ歯動物型という用語は、げっ歯動物、例えばラットまたはマウスの抗体のものにアミノ酸配列が対応する枠組み構造を意味する。抗CD3抗体の場合、便宜的な枠組み構造アミノ酸はラット抗体のものである。
【0019】
CD3抗原についてのさらなる論考は、ヒト白血球分化抗原に関する第1回国際ワークショップおよび会議の報告にみられ、CD3抗原に対して向けられた各種グリコシル化抗体の記載は、該シリーズのワークショップおよび会議の報告、特にOxford University Pressにより出版された第3回および第4回の報告にもみられる。その種の抗体の具体的な例として、Van Llerら、Euro. J. Immunol., 1987, 17:1599−1604, Alegreら、J.Immunol., 1991, 140: 1184により記載された報告、およびIgG1抗体UCHT1およびその変異体(variants)に関する最終刊行物であるSmithら、同誌、1986、16:478による報告がある。
【0020】
しかし、本発明の抗体の基礎として特に興味があるのは、抗体OKT3およびYTH12.5.14.2に含まれるCDRである。抗体OKT3は、Chatenaudら、Transplantation,1991、51:334およびNew England Journal of Medicine 誌、1985、313:339、さらに欧州特許第0018795号および米国特許第4,361,539号のような刊行物で論考されている。抗体YTH12.5.14.2(以下、YTH12.5と記す)は、Clarkら、European J. Immunol., 1989, 19: 381−388のような刊行物で論考されており、再構成YTH12.5抗体は、欧州特許第0504350号およびその対応出願の米国特許出願シリアル番号第08/362780号および米国特許第5585097号の主題であり、これらの出願は、当該抗体中に存在するCDRについて詳細に記載している。米国特許出願シリアル番号第08/362780号、米国特許第5585097号および米国特許第4361539号の内容は、参考文献として本明細書に援用される。
【0021】
「保存的に修飾された変異体(variants)」という用語は、当該技術分野において周知であり、抗体・抗原親和性に実質的に影響しない変化を含む変異体を指す。この用語は、便利には米国特許第5380712号にみられるように定義され、その内容はその目的のために参考文献として本明細書に援用される。
【0022】
CDRのうちで重鎖CDR(a),重鎖CDR(b)および重鎖CDR(c)が最も重要である。本発明のそれらの抗体も定常ドメインを含むことを、当業者は了解するはずである。
【0023】
それらCDR(a)、CDR(b)およびCDR(c)は、重鎖中で順番に次の順序で配列している:すなわち、リーダーから定常ドメイン(N末端からC末端)方向に、ヒト枠組み構造領域1/(a)/ヒト枠組み構造領域2/(b)/ヒト枠組み構造領域3/(c)/ヒト枠組み構造領域4で、そしてれらCDR(d),CDR(e)およびCDR(f)は、軽鎖中で次の順序で配列している:すなわち、リーダーから定常ドメイン方向にげっ歯動物枠組み構造領域1/(d)/ げっ歯動物枠組み構造領域2/(e)/げっ歯動物枠組み構造領域3/(f)/げっ歯動物枠組み構造領域4である。したがって、三つすべてが存在する場合、それらの重鎖CDRは、リーダーから定常ドメイン方向へ(a), (b), (c)の順序で配列し、またそれら軽鎖CDRは、リーダーから定常ドメイン方向へ(d), (e), (f)の順序で配列していることが好ましい。そのげっ歯動物枠組み構造領域は、好ましくはラットのものである。
【0024】
しかしながら、本発明の抗体は、本明細書に既に記載されたものとは極めて異なるCDRを含むことも可能であり、また、たとえそうでなくても、CDR(a)、CDR(b)、CDR(c)、およびCDR(d),CDR(e)、CDR(f)のうちそれぞれ一つのみまたは二つを含む重鎖および特に軽鎖をもつこともあり得ることを認めるべきである。だが、本発明の抗体では、したがって上述の6種すべてのCDRの存在が必ずしも必要なわけではないが、最も好ましい抗体では、6種すべてのCDRが存在するのが最も通常である。
【0025】
特に好ましい抗体は、したがって、配列番号2、配列番号4および配列番号6またはそれぞれの保存的に修飾された変異体のアミノ酸配列を含む三つのCDR(a),CDR(b)およびCDR(c)を有するヒト型重鎖と、配列番号8、配列番号10および配列番号12またはそれぞれの保存的に修飾された変異体のアミノ酸配列を含む三つのCDR(d),CDR(e)およびCDR(f)を有する軽鎖とをもち、それらの重鎖CDRはリーダー定常領域方向に(a), (b), (c)の順序で並び、またそれらの軽鎖CDRはリーダー定常領域方向に(d), (e), (f)の順序で並んでいる、ものである。
【0026】
本発明の第一の側面の好ましい型は、ヒトCD3抗原に結合親和性を有する抗体、特に、非グリコシル化型の抗体であって、その抗体定常領域がヒト起源の一つであるかまたは由来し、特に、ラット軽鎖可変領域に付着したラムダ定常領域である、前記抗体を提供する。
【0027】
一つの便利な可能性は、その抗体が、YTH12.5ハイブリドーマ中のアミノ酸配列、すなわち、配列番号14のものに対応するラット軽鎖可変ドメイン枠組み構造領域をもつことであるが、その定常領域は、好ましくはなお、ヒト起源の一つであるはまたは由来し、例えば、ヒトラムダ定常領域とする、ことである。好ましいラットヒトキメラ軽鎖およびラムダ定常領域アミノ酸配列は、配列番号18のものである。YTH12.5をコードする組換え核酸、例えばDNAは、配列番号13のアミノ酸配列を含むが、一方、ラット軽鎖可変領域およびヒトラムダ定常領域をコードするものは、配列番号17を含む。
【0028】
ある種のヒト重鎖可変ドメイン枠組み構造配列には、それらの好ましいCDR配列を移植するのが好ましい。それは、それらのCDRの三次元立体配座がそのような配列で、よりよく維持され、当該抗体は当該抗原に対する高レベルの結合親和性を保持するであろう。その重鎖可変(V)領域枠組み構造は、B細胞ハイブリドーマ細胞系18/2(Huminghat, Dersimonianら、Journal of Immunology, 139:2496−2501;国際特許出願公開WO93/19196号および米国特許出願シリアル番号第08/478684)からのヒトVHIII型遺伝子VH26.D.J.によりコードされるものが好ましい。
【0029】
本発明の第一の側面の好ましい形では、したがって、リーダーから定常領域方向で読むと、以下のアミノ酸配列、すなわち、
配列番号21/CDR/配列番号22/CDR/配列番号23/CDR/配列番号24
[ここで、CDRは本明細書で既に定義されたCDR(a),CDR(b)またはCDR(c)を示すCDR,その保存的に修飾された変異体、もしくは別のCDRである]
を有するヒト可変ドメイン枠組み構造中に、ラット抗CD3抗体の重鎖の一つまたは一つより多くの好ましいCDRが存在する。
【0030】
同様に、リーダーから定常領域方向で読むと以下のアミノ酸配列、すなわち
配列番号25/CDR/配列番号26/CDR/配列番号27/CDR/配列番号28
[ここで、CDRは本明細書で既に定義されたCDR(d),CDR(e)またはCDR(f)を示すCDR、その保存的に修飾された変異体、もしくは別のCDRである]
を有するげっ歯動物可変ドメイン枠組み構造中にラットCD3抗体の軽鎖の一つまたは一つより多くの好ましいCDRが存在する。
【0031】
3種すべての好ましい軽鎖CDRを含む非グリコシル化抗体では、その軽鎖可変領域は配列番号14を含む:
それらの重および軽鎖定常領域は、抗体に対する所望の対象はIgG抗体であるが、異なるタイプの抗体に基づくことも可能である。しかしながら、げっ歯動物、例えばラットまたはマウス起源のもの、もしくはそれらに由来するものでもよいが、好ましくはヒト起源のものまたはそれらに由来するものである。上に記載のように、該軽鎖の場合、その定常領域は好ましくはラムダタイプで、該重鎖の場合、それは好ましくは、適切として非グリコシル化を果たすように修飾されたIgGイソタイプ、特にIgG1である。
【0032】
3種すべての好ましい重鎖CDRを含む非グリコシル化抗体では、その重鎖可変領域およびヒトIgG1 CH1−ヒンジ非グリコシル化CH2CH3は、配列番号20を含み、配列番号19のDNAによりコードされる。
【0033】
そのIgGイソタイプのすべてのヒト定常領域は、297位のアスパラギン残基でグリコシル化されていることが知られているが、この位置は、アスパラギン297−X298−セリン299またはトレオニン299、ここでXはプロリン以外のアミノ酸の残基、というNグリコシル化モチーフの一部を構成している。本発明の抗体は、その定常領域でアスパラギン297とグリコシル化が不可能なもう一つのアミノ酸との置換によって、このように非グリコシル化されてもよい。他の任意のアミノ酸残基が潜在的に使用可能であるが、アラニンが最も好ましい。あるいは、アスパラギン297でのグリコシル化は、そのモチーフの他の残基の一つを変える、例えば、298残基をプロリンに、または299残基をセリンもしくはトレオニン以外のアミノ酸に置換することにより、阻止してもよい。この部位特異的突然変異誘発を実施するための技術は、当業者には周知のものであり、例えばAmershamから商業的に入手可能な部位特異的突然変異誘発キットを用いて、例えば実行してもよい。以下に、その手順をさらに例示する。
【0034】
あるCDR中の一つのアミノ酸を、同じような性質をもつもう一つのアミノ酸に置換する、例えば、グルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換することは、その置換または複数の置換が行われたペプチドまたはタンパク質の性質または構造を実質的に変えないこともあり得ることは、当該技術分野で周知である。したがって、本発明の非グリコシル化抗体は、好ましいCDRを含むが、そのような置換もしくは複数の置換が、それらのCDRの結合親和性および特異性を実質的に変えずに生じた特定のアミノ酸配列をもつような抗体を含む。あるいは、それらのCDRのアミノ酸残基配列中に欠失をつくってもよいし、もしくはそれらの配列を、活性をなお保留しながら、NおよびC末端の片方または両方で伸長してもよい。
【0035】
本発明の好ましい非グリコシル化抗体は、その抗原に対するアフィニティ(親和性)定数が105モル-1またはそれ以上、例えば1012モル-1未満であるようなものである。異なる親和性のリガンドは異なる使用に適することがあり得るので、
例えば、106、107、または108モル-1またはそれ以上の親和性が場合によっては、適切であり得る。しかしながら、106から108モル-1の範囲の親和性をもつ抗体がしばしば適している。都合のよいことに、それらの抗体も、他の抗原には実質的な結合親和性を示さない。抗体の結合親和性および抗体特異性は、参考文献として本明細書に援用されている欧州特許第0586617号および米国特許出願シリアル番号第08/478684号および米国特許第5585097号の実施例の項(実施例5−−−エフェクター細胞再ターゲッティングアッセイを参照)に記載されているようなアッセイ手順またはELISAおよび他のイムノアッセイのような技術により、テストしてもよい。
【0036】
本発明の抗体は、2本の同一軽鎖および2本の同一重鎖をもつことがあり得る「Y」字型の立体配置をもつ非グリコシル化IgG CD3抗体で、そのため当該CD3抗原に親和性を有する各抗原結合部位を備えた二価抗体である。あるいは、本発明は、その抗体のそれらの腕の1本だけがCD3抗原に対する結合親和性をもつ抗体にも、適用できる。その種の抗体はさまざまな形をとり得る。したがって、その抗体のもう1本の腕はCD3以外の抗原に結合親和性をもつことがあり得るので、例えば米国特許第4,474,893号(参考文献として本明細書に援用される)および欧州特許出願第87907123.1号および第87907124.9号に記載されるように、その抗体は二重特異性抗体である。あるいはその抗体は結合親和性を示す腕を1本だけもつこともあり得るので、そのような抗体は「一価抗体」と言われる。
【0037】
一価抗体(または抗体断片)は、多くの方法で調製可能である。GlennieおよびStevenson(Nature,295:712−713,(1982))は、酵素消化により一価抗体を調製する方法を記載している。Stevensonらは、酵素的に産生されたFab’およびFc断片を化学的に架橋する一価抗体調製の第二の方法を記載している(Anticancer Drug Design,3:219−230(1989))。これらの方法では、生じた一価抗体は、それらのFab'腕の1本を失っている。一価抗体を調製する第三の方法は、欧州特許第131424号に記載されている。この方法では、その抗体の「Y」字型は維持されているが、二つのFab'ドメインの一つだけが抗原に結合する。これは、その一価抗体が関心の一つである生産物の混合を産生するために、その抗体の重鎖に組合わせる無関係な軽鎖をコードする遺伝子をハイブリドーマに導入することにより、達成される。
【0038】
しかし、より好ましくは、本発明の一価非グリコシル化CD3抗体は次の方法で調製される。これは、適当な発現系、例えば下記に記載するような細胞系に、それらの重および軽鎖をコードする遺伝子類とともに、当該重鎖の可変領域ドメインおよび第一定常領域ドメインを欠く短縮型(truncated)重鎖をコードする遺伝子、すなわち、それらの各ドメインのエキソンを欠く遺伝子、の導入を含む。その結果、該細胞系により、(a)完全な二価の抗体である抗体、(b)2本の短縮型重鎖(すなわち、Fc断片)のみから成る抗体断片および(c)短縮型重鎖および、正常の重鎖と会合した軽鎖とから成る、CD3抗原に対し一価の抗体の断片の混合物が産生される。その種の抗体断片(c)は、1本のFab’腕だけをもつので、一価である。この方法によるそのような形での一価抗体の産生は、多くの理由で好まれる。したがって、得られた抗体断片は、その細胞系により産生された抗体の混合物からの精製が、例えば、単純に分子量に基ついて分離可能なので、容易である。産生された一価抗体が、大きさおよび外見で二価抗体と同じような特徴をもつ欧州特許第131424号の方法の場合、それはできない。
【0039】
さらに、その新しい方法による一価抗体断片の産生は、ずっと容易に制御が可能で、複雑な反応産生物の分離が必要な酵素消化/化学カップリング手順ほど危険ではない条件を使っている。、加えて、使われるその細胞系は、酵素消化/化学カップリング手順で要求されるような連続的な合成手順を必要とせず、一価抗体断片を連続産生する利点がある。
【0040】
本発明の非グリコシル化抗体は天然には生ぜず、それらの非グリコシル化抗体は、多くの方法で合成的に一般には産生可能である。しかし、最も便利には、その抗体中に存在する重および軽鎖の定常および可変領域の適切な遺伝子構築物を、別々に得て、次いで適当な発現系へ挿入する。
【0041】
所望される構造のリガンドの可変ドメインをコードする遺伝子を作って、便利には部位特異的突然変異誘発を受けた抗体の定常ドメインをコードする遺伝子に付着させてもよい。これらの定常遺伝子は、ハイブリドーマcDNAまたは染色体DNAから得て、その非グリコシル化定常領域をつくるために部位特異的突然変異誘発を受けさせてもよい。それらの可変領域をコードする遺伝子も、そこに含まれるCDR類の同定に使われる遺伝子合成技術により、得ることも可能である。そのDNAのための適当なクローニングベクターにはさまざまなタイプがあり得る。
【0042】
そのような遺伝子類はさまざまな方法によって調達が可能なことは、当業者には了解されるはずである。例えば、(i)CD3抗原に対する一連のハイブリドーマを既知の方法で培養する、(ii)それらのハイブリドーマから、国際特許出願公開WO92/06193および国際特許出願公開WO93/19196およびそれらに対応する米国特許に述べられている手順、すなわち、mRNAを抽出し、それをPCRを用いてcDNAへ変換する、(iii)このcDNAを、CDR相補的DNA配列に対応する配列のオリゴヌクレオチドプローブで、スクリーニングする、(iv)ポジティブに同定されたすべてのハイブリドーマの配列を決定する、そして(v)前記特許に述べられているヒト化技術により、そのラット配列を再構成する、ことが可能である。数種の、好ましくは、6種すべての好ましいCDRの産生を可能にするためには、部位特異的突然変異誘発を採用して、DNAをコードする枠組み構造の対応箇所に所望のDNAを挿入してもよい。
【0043】
機能性CD3リガンドを産生するために、細胞システムの培養によりそれらの遺伝子を発現させることは最も便利には、適当な原核生物細胞システムまたは特に真核生物細胞システム、特に骨髄腫細胞系、例えば、YB2/3.01/Ag20(以下、YOと記す)ラット骨髄腫細胞、NSO骨髄腫細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞のようなほ乳類不死化細胞系を(植物細胞の利用も興味はあるが)、各種抗体領域をコードするDNAを含む発現ベクターとともに、形質転換し、次いでその形質転換細胞システムを培養して、所望の抗体を産生することにより果たされる。本発明に従うリガンドの製造に使うそのような一般的技術は、当業者には周知であり、またSambrook, FritschおよびManiatis 「Molecular Cloning」Cold Spring Harbour Laboratory Press、1989(第2版)のような刊行物に記載されている。それらの技術はさらに、参考文献として本明細書に援用される国際特許出願公開WO93/19196および米国特許出願シリアル番号第08/478684号にある実施例により具体的に説明されている。
【0044】
本発明の第二の側面は、このように、CD3抗原に対する結合親和性を有する第一の側面に従う非グリコシル化IgG抗体を調製するための方法であって、前記抗体の発現を実行するために、当該抗体を発現できる細胞を培養することを含む、前記方法を提供する。本発明の第三の側面はまた、本発明自体である非グリコシル化抗体を発現する細胞系を提供する。
【0045】
そのような細胞系の中で好ましいのは、上述された好ましいCDRをコードするDNA配列を含むものである。上述されたそれらのCDR(a)から(f)をコードする一群のヌクレオチド配列は、それぞれ以下の(a)から(f)に示すようなものであるが、遺伝暗号の縮重のため、それらのCDRのアミノ酸配列をそのままコードしながらも、それらの配列に変動がありえることは、ご理解いただけるであろう。
【0046】
(a)配列番号1;(b)配列番号3;(c)配列番号5;(d)配列番号7;(e)配列番号9;(f)配列番号11
そのような細胞系は、(1)一つまたは一つより多くの(a),(b)および(c)をもつヒト重鎖可変枠組み構造領域を発現するDNA、並びに(2)一つまたは一つより多くの(d),(e)および(f)をもつげっ歯動物、例えばラット軽鎖可変枠組み構造領域を発現するDNAを含む、より大きなDNA配列を特に含有するであろう。
【0047】
そのようなDNAの具体的な例は、上に論考されたヒトIgG CH1−ヒンジ−非グリコシル化−CH2CH3に連結されたヒトVH III型遺伝子VH26.D.Jによりコードされる重鎖枠組み構造中に並んだCDR(a),(b)および(c)をコードする配列番号19およびYTH12.5ヒトラムダ定常領域キメラタンパク質によりコードされる軽鎖枠組み構造中に並んだCDR(d),(e)および(f)をコードする配列番号17である。
【0048】
本発明のキメラ性一部ヒト化非グリコシル化抗体は、特に免疫抑制、免疫抑制が完全であるよりむしろ一時的で、そのためT細胞が完全には破壊されず、CD3抗原−TCR複合体の抗体遮断により非機能性になっていることが、特段に望ましい移植組織拒絶の制御に特に治療価値がある。加えて、それらの非グリコシル化CD3抗体は、癌の治療のような他の分野、具体的には、治療剤の効果が、エフェクター細胞のFc仲介による死滅またはFc受容体所有細胞の非特異的死滅により、それぞれ危なくされる恐れがある(エフェクター細胞再ターゲティング用の)二重特異性抗体または抗体−毒素結合体の構築に可能性がある。
【0049】
第四の側面ではしたがって、本発明は癌特にリンパ腫の患者を治療する方法または免疫抑制の目的、例えば、移植組織拒絶が起こり得る場合の処置方法を含むが、それには、本発明の第一の側面に従う非グリコシル化抗体の治療有効量を投与することを含む。
【0050】
本発明の第一の側面の非グリコシル化抗体は、生理的に受容可能な希釈剤または担体とともに当該抗体を投与することによる、患者への投与を処方してもよい。それらの抗体は、無菌かつ発熱因子を含まない希釈剤または担体とともに注射可能な形態で、投与されるのが好ましい。参考までに述べると、抗体の適量は、ある期間、例えば10日間にわたって、毎日約1−10mgの注射量であるが、初回用量応答がなければ、個々の患者の必要に応じて望ましければ、例えば100mgまでのより多量の抗体を投与することも可能であろう。獣医用でも同様なg/kg用量基準によっている。
【0051】
本発明はここで、下記の非限定的な実施例、図面および配列表だけを参照に、例証として記載される。請求の範囲内に該当する本発明のさらなる実施態様は、これらの見方によって、当該技術分野の当業者には浮かぶであろう。
配列表
配列番号1は、CDR(a)をコードするDNAの配列である。
配列番号2は、CDR(a)のアミノ酸配列である。
配列番号3は、CDR(b)をコードするDNAの配列である。
配列番号4は、CDR(b)のアミノ酸配列である。
配列番号5は、CDR(c)をコードするDNAの配列である。
配列番号6は、CDR(c)のアミノ酸配列である。
配列番号7は、CDR(d)をコードするDNAの配列である。
配列番号8は、CDR(d)のアミノ酸配列である。
配列番号9は、CDR(e)をコードするDNAの配列である。
配列番号10は、CDR(e)のアミノ酸配列である。
配列番号11は、CDR(f)をコードするDNAの配列である。
配列番号12は、CDR(f)のアミノ酸配列である。
配列番号13は、ラット軽鎖可変領域をコードするDNAの配列である。
配列番号14は、ラット軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号15は、それぞれのCDRを含むラット重鎖可変領域をコードするDNAの配列である。
配列番号16は、それぞれのCDRを含むラット重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号17は、それぞれのCDRおよびヒトラムダ定常領域をもつラット軽鎖可変領域をコードするDNAの配列である。
配列番号18は、それぞれのCDRおよびヒトラムダ定常領域をもつラット軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号19は、CDRおよびヒトCH1−ヒンジ−非グリコシル化CH2CH3をもつ重鎖可変領域をコードするDNA配列である。
配列番号20は、CDRおよびヒトCH1−ヒンジ−非グリコシル化CH2CH3をもつ重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号21から24は、CDRをもたないヒト重鎖可変ドメイン枠組み構造のアミノ酸配列である。
配列番号25から28は、CDRをもたないラット軽鎖可変ドメイン枠組み構造のアミノ酸配列である。
配列番号29および30は、ラットCD3軽鎖可変領域をPEE12へクローニングするのに用いるプライマーのものである。
一般的方法論
ヒト化重鎖をもつCD3特異的モノクローナル抗体を産生する一般的方法
ヒトCD3抗原に特異的なラット抗体YTH12.5のV領域遺伝子のクローニングと再構成は、Routledgeら、1991、Eur. J. Immunol., 21:2717および英国特許出願第9121126.8号およびその対応出願に記載されているように行う。YTH12.5は、CD3抗原複合体に特異的なIgG2bモノクローナル抗体を分泌するラットハイブリドーマ細胞系であるが、その方法論は、同一のCDRをもつCD3特異的抗体を分泌する他の細胞にも適用できる(前掲の記述を参照)。
【0052】
要するに、その方法論は、複製連鎖反応(PCR)を用いるOrlandiら、1989、PNAS USA, 86:3833の方法に基づく。そのVH遺伝子(重鎖可変領域遺伝子)は、オリゴヌクレオチドプライマーVH1FORおよびVH1BACK(前記援用特許類を参照)を用いて、クローン化される。それらのPCR生産物は、部位特異的突然変異誘発を6オリゴヌクレオチドプライマー類を用いて実行するベクターM13−VHPCR1中へ、連結される。そのVL遺伝子(軽鎖可変領域遺伝子)は、公表済みのVLe配列に基づいてデザインされたプライマーを用いて、クローン化された。当該遺伝子は、ヒトラムダ軽鎖定常領域とともに、ベクターM13−VKPCR中へ、クローン化される。このベクターにおいて、VL枠組み構造の突然変異誘発が5オリゴヌクレオチド類を用いて実行される。次に当該ヒト化VL遺伝子は、発現ベクターpHaApr−1へ挿入される。
【0053】
ベクターp316は、その中で再構成CD3VH遺伝子が、異なる免疫グロブリンH鎖定常領域遺伝子類と結合して、発現されることがあり得るように生成され、またこのベクターは、pHaApr−gptベクターに基づいている(Gunningら、1987、P.N.A.S. USA, 85:7719−7723)。ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhft)遺伝子およびSV40発現シグナル(PageおよびSydenham、1991、Biotechnology,9:64)をもつDNAの1.65Kb断片は、pHaApr−gptの特有のクEcoRI部位へ挿入される。再構成CD3−VH遺伝子をコードする700bp HindIII−BamHI DNAは、次に、a アクチンプロモターの下流で、そのコントロール下にあるベクターの多重クローニング部位へクローン化される。その所望のH鎖定常領域遺伝子(ゲノム立体配置で)は、次いで、該CD3−VH遺伝子の下流の特有のBamH1制限酵素部位へ挿入も可能である。
【0054】
非グリコシル化ヒトIgG1定常領域は、Takahashiら(1982、Cell,29:671−679)により記載された野生型G1m(1、17)遺伝子から、下記のように得られる。その遺伝子は、297位のアミノ酸残基をアスパラギン残基からアラニン残基へ変異させるため部位特異的突然変異誘発が実行される(Amersham International PLCキット)ベクターM13 tg131へ、クローン化される。
【0055】
Asp−297のオリゴ糖は、すべての正常なヒトIgG抗体の特徴で(Kabatら、1987、Sequence of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health Human Services Publication)、IgG分子中の2本の重鎖のそれぞれは、アスパラギン残基のアミド基に結合された単分岐鎖炭水化物基をもっている(RademacherおよびDwek,1984、Prog. Immunol., 5:95−112)。アラニンによるアスパラギンの置換は、抗体のグリコシル化を阻害する。
【0056】
2.3Kb非グリコシル化IgG1定常領域は、BamHIおよびBgIIIを用いる二重消化により、M13から切り出され、クローンp323を産生するために、ベクターp316のBamHI部位へ連結される。
【0057】
dhfrマイナスチャイニーズハムスター卵巣細胞のサブコンフルエントな単層をその重鎖遺伝子を含むベクターp323、並びに再構成ヒトe軽鎖(Routledgeら、1991、Eur. J. Immunol., 21:2717−2725)を含む第二ベクターp274で、共トランスフェクトする。トランスフェクション前に、両プラスミドDNAは、制限酵素エンドヌクレアーゼPvuIを用いて線状化された。トランスフェクションは、DOTMA試薬(Boehringer、ドイツ)を用い、製造者の勧告に従って、行われる。
【0058】
重および軽鎖トランスフェクタント(形質導入体)は、5%(v/v)透析ウシ胎児血清を含み、キサンチン/ヒポキサンチンを含まないIMDM中で、選択される。
【0059】
類似の野生型ヒトIgG1−CD3重鎖ベクターp278の産生は、別途記載されている(Routledgeら、1991、Eur. J. Immunol., 21:2717−2725および英国特許第9121126.8号、参考文献として本明細書に援用される)。非変異体ヒトIgG2(FlanaganおよびRabbitts、1982、Nature300:709−713)、IgG3(Huckら、1986、Nuc. Acid. Res., 14:1779−1789)、IgG4(FlanaganおよびRabbitts、1982、Nature 300:709−713)、Epsilon(FlanaganおよびRabbitts、1982、EMBO. Journal 1:655−660)およびAlpha−2(FlanaganおよびRabbitts、1982、Nature 300:709−713)定常領域遺伝子をもつH鎖発現ベクター(それぞれベクターp317,p318,p320,p321およびp325)は、ベクターp316から由来する。これらのベクターを、軽鎖ベクターp274と結合させ、既述のようにdhfr−CHO細胞へ導入して、それぞれa1, a2, a3, a4, a およびa−2イソタイプのCD3抗体を分泌する細胞系を作った。CD3抗体を発現する細胞を、軟寒天のクローニングに2回かけ、次いで、回転びん培養へ拡大した。各細胞系の約4リットルの組織培養上清からの免疫グロブリンを、硫酸アンモニウム沈殿により濃縮し、PBSに対して徹底的に透析し、次いで以下のように定量する:
当該抗体は純粋でないので、CD3抗原結合能をもつ抗体の濃度を特異的に定量するためにデザインされた競合測定法を用いた。ヒトT細胞芽球を、CD3抗原の同じエピトープにキメラパネルとして結合する抗体であるFITC標識UCHT−1と、インキュベートする。使用するFITC試薬の濃度は、半飽和に予め定量しておく。非標識YHT12.5(高速液クロ純度)を、既知の開始濃度から滴定し、T細胞およびUCHT−1 FITCを含むウエルに加えた。その非標識抗体は、その抗原結合部位に対する競合剤として働く。これは、それらの細胞をFACS分析により調べたときに見られる平均蛍光の減少として、検出される。したがって、未知の開始濃度からのキメラ抗体の滴定によって、平均蛍光を抗体希釈に対してプロットすれば、一連のシグモイド曲線が得られる。これらの曲線は、YTH12.5標準曲線と直接比較することが可能であり、相当する抗体を使ってもよい。
【0060】
【実施例】
実施例1
ヒトCD3抗原に特異的な非グリコシル化抗体であって、IgG1定常領域に結合されたヒト重鎖可変枠組み構造およびヒトラムダ定常領域に結合されたラット軽鎖可変枠組み構造中に、YTH12.5ラット抗体由来のものに配列が対応するCDRを含む、前記抗体の調製。
【0061】
YTH12.5LAG1の鎖消失変異体(chain loss variant)を、CD3軽鎖を消失し、ラット重鎖のみを発現するものに選び、完全ヒト化非グリコシル化CD3重鎖中にトランスフェクトする目的に使用した。ヒト化IgG1非グリコシル化CD3重鎖構築物をコードする1.4Kb BamH1−Hind111 DNA断片を、異なる選択マーカーを含む二つの異なる発現ベクター、pHβApr−1 gpt (Gunningら(1987)P.N.A.S. USA 84:4831および85:7719−7723)およびpOXCD52neo (Frewin未発表)の多重クローニング部位へクローン化した。
【0062】
pOXCD52neo発現ベクターは、高レベルの抗体産生をする強力な「ポリペプチド鎖伸長因子1」プロモーター(EF1)を使って、産生される(Shigekazu Nagata NAR, 18巻、17号、5322ページ)。これは、ネオマイシン選択マーカーとともに、構築物中に配置される。またそのベクター中には、TKプロモーターにより駆動される、Campath CD52表面発現性抗原に対するcDNAも含まれる(これらすべてのプロモーターおよびマーカーは、有効性のために、誰でも利用できるものである)。細胞表面でのCD52の発現は、CD52抗体を用いる形質転換体の同定を可能にしている。
【0063】
YTH12.5LAG1は、次いで、電気穿孔法により二つのプラスミドと別々にトランスフェクトされ、またヘビートランスフェクタントが、5%ウシ胎児血清、MPAおよびpHβApr−1gpt用キサンチンを含むIMDMおよび5%ウシ胎児血清およびpOXCD52neo用1mg/mlG418を含むIMDMで、二、三週間にわたって検査用の生きたコロニーが増殖するまで、選択された。両トランスフェクションは、ELISAを使ってヒトIgG1産生をスクリーニングしたところ、陽性クローンを生じていた。機能性CD3抗体を、ヒトT細胞系Jurkat (ATCC TIB 152 (J. Immunol. 133: 123−128 (1984))に対する結合によりテストし、またFACS (Becton Dickinson) により分析したところ、両アッセイは30および50μg/mlの間の抗体の収量を示した。
【0064】
pOXCD52neoベクターは、細胞表面マーカーCD52を利用して、抗体を産生するトランスフェクト細胞のモニタリングを可能にする。このマーカーを含む細胞だけが抗体を分泌するので、FITCに結合されたCampath CD52抗体を取ることにより、トランスフェクト細胞について、抗体を産生している細胞の百分率をFACSによって分析し、またクローン状態を確認することが可能である。陰性の産生細胞は全く検出されず、抗体収量は50μg/mlのままで、細胞増殖も正常であった。
【0065】
非グリコシル化CD3抗体のキメラ型は、Celltech発現ベクターPEE12 (Bebbingtonら(1992)Biotechnology 10:169参照)中へクローニングを可能にする制限酵素部位Hind IIIおよびEcoR1を導入するプライマーを使って、ラットCD3軽鎖可変領域をヒトラムダ定常領域へ結合させるためにPCRアセンブリーを用いて、産生された。それらのプライマー配列は、本明細書中の配列表中の配列番号29および配列番号30である。
【0066】
その最終構築物の配列を決定し、ヒト化CD3非グリコシル化重鎖を既に含むPEE12中へクローン化し、さらにこれを、骨髄腫細胞系NSO(ECACC No85110503−GalfreおよびMilstein(1981) Enzymology 73(B): 3−46) 中へ電気穿孔法によりトランスフェクトした。得られたクローンは、ヒトIgG1およびヒトラムダ軽鎖に対するELISAを用いて抗体産生について、またFACSに基づいてヒトT細胞クローンJurkat細胞系に対する結合について、スクリーニングされた。そのELISAでは、ヤギ抗ヒトIgFc (Sigma I2136)を捕捉用抗体として、そしてビオチニル化ヒツジ抗ヒトIgG (Amersham RPN 1003)またはビオチニル化ヤギ抗ヒトラムダ軽鎖(Amersham RPN 1188)を検出用抗体として使用している(RoutledgeらEur. J. Immunol (1991) 21: 2717−2725 参照)。
【0067】
一回のトランスフェクション後、16クローンが60μg/mlから100μg/mlを発現したが、これは、再構成非グリコシル化CD3による他のどのトランスフェクションよりはるかに多かった。これらのトランスフェクタントは、次いで、限界希釈クローニング法によりクローン化され、それらのいくつかは120μg/mlへ改良した。それらは、長期培養および大規模抗体産生で安定しており、細胞増殖にも全く問題がなかった。
【0068】
図1から4は、先行技術の、既に記載された完全ヒト化非グリコシル化抗CD3抗体と同じ能力で、それらの抗体がCD3に結合できることを、具体的に示している。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、(欧州特許第0586617号、米国特許出願シリアル番号第08/478684および米国特許第5585097号の)完全ヒト化非グリコシル化CD3、および、ラット軽鎖可変枠組み構造領域が採用されている本発明のキメラ抗体との、結合のFACSアッセイのプロットを示す。軽鎖YTH12.5LAG1だけは、重鎖と会合していないので、正常な結合を示していない。
【図2】 図2は、pOXD52neoベクターを用いて産生され、したがってそれらの表面にCD52抗原を発現する、二種のキメラトランスフェクタントの結合のFACSアッセイのプロットを示す。これらは、トランスフェクタントがクローン集団かどうかをモニターする方法として、pOXCD52neoの使用を具体的に説明している。TF12.L/CD3A.27はCD52で染めると1ピークを有し、これはすべての細胞がCD3抗体を産生していることを示す。一方、TF12.5L/CD3A.34は2ピークを有し、これはCD3抗体を産生しない負の細胞集団を示す。
【図3】 図3は、本発明のキメラおよび先行技術のヒト化非グリコシル化CD3に対する抗体収量の目安としてヒトIgG産生を比較した、ELISAにおける希釈に対するOD492のプロットを示す。トランスフェクション後3週間にテストしたCD3上清は、本発明のキメラ抗体をコードするDNAを含む細胞が、約120μg/mlを産生し、また、完全ヒト化CD3を含む細胞が、10μg/ml以下を産生することを示している。
【図4】 図4および5は、本発明のキメラ抗体および完全ヒト化CD3のジャーカット細胞に対する親和性の結合プロットを示す。既知濃度の100μg/mlから開始し、次いで1/20希釈、以下1/2560希釈まで7回力価測定した。染色パターンは、親和性が同じであることを、証明している。
【図5】 図4および5は、本発明のキメラ抗体および完全ヒト化CD3のジャーカット細胞に対する親和性の結合プロットを示す。既知濃度の100μg/mlから開始し、次いで1/20希釈、以下1/2560希釈まで7回力価測定した。染色パターンは、親和性が同じであることを、証明している。
【配列表】
Claims (21)
- ヒトラムダ定常領域を有し、CD3抗原複合体に対し結合親和性を有する非グリコシル化IgG1抗体であって、重鎖は、CDRとともに可変領域枠組み構造を有し、それは下記のアミノ酸配列からなるものであり、
そして軽鎖は、下記のCDRとともに可変領域枠組み構造を有し、
CDR1: Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ile Glu Asn Asn Tyr Val His
CDR2: Asp Asp Asp Lys Arg Pro Asp
CDR3: His Ser Tyr Val Ser Ser Phe Asn Val
CDRを含む軽鎖可変領域およびヒトラムダ定常領域は下記のアミノ酸配列、
を有するという特徴を有する、上記抗体。 - 定常領域重鎖の297位のアスパラギン残基が別のアミノ酸残基により置換されている、非グリコシル化型の請求項1に記載の抗体。
- 当該アスパラギン残基がアラニン残基に置換されている、非グリコシル化型の請求項2に記載の抗体。
- 抗体が、生理的に受容可能な希釈剤または担体を含む薬剤組成物の形であることを特徴とする、非グリコシル化型の請求項1ないし3のいずれか1項に記載の抗体。
- 治療に使用するための、非グリコシル化型の請求項1ないし4のいずれか1項に記載の抗体。
- 免疫抑制または癌の治療に使用するための医薬の製造のための、非グリコシル化型の請求項1ないし4のいずれか1項に記載の抗体の使用。
- 請求項1ないし4のいずれか一つに記載の抗体をコードする組換え体核酸。
- 配列番号13のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項7に記載の組換え体核酸。
- 配列番号17のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項7または8に記載の組換え体核酸。
- アミノ酸配列 配列番号20のペプチドをコードすることを特徴とする、請求項7ないし9のいずれか一つに記載の組換え体核酸。
- リーダーから定常領域方向に読むと、配列番号25/CDR/配列番号26/CDR/配列番号27/CDR/配列番号28のアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、請求項7ないし10のいずれか一つに記載の組換え体核酸。
- アミノ酸配列 配列番号14をコードすることを特徴とする、請求項7ないし11のいずれか一つに記載の組換え体核酸。
- DNAであることを特徴とする、請求項7ないし12のいずれか一つに記載の組換え体核酸。
- 請求項7ないし13のいずれか一つに記載の組換え体核酸を含むことを特徴とする、タンパク質発現系。
- 請求項7ないし13のいずれか一つに記載の核酸を組み入れたベクターを含むことを特徴とする、請求項14に記載の系。
- 重鎖および軽鎖をそれぞれコードする組換え体核酸の別々の構築物を含むことを特徴とする、請求項14または15に記載の系。
- 構築物が定常領域を伴う鎖をコードする、請求項16に記載の系。
- 請求項1または2に記載の抗体を発現する原核生物細胞または真核生物細胞。
- 請求項7ないし13のいずれか一つに記載の核酸を含むことを特徴とする、請求項18に記載の細胞。
- 不死化ヒト細胞であることを特徴とする、請求項18または19に記載の細胞。
- 請求項18ないし20のいずれか一つに記載の細胞を培養することを含むことを特徴とする、請求項1または2に記載の抗体を産生するための方法。
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