CN100595212C

CN100595212C - 白细胞介素-10抗体

Info

Publication number: CN100595212C
Application number: CN200480040148A
Authority: CN
Inventors: L·G·普雷斯塔
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme BV
Priority date: 2003-11-10
Filing date: 2004-11-09
Publication date: 2010-03-24
Anticipated expiration: 2024-11-09
Also published as: US7662379B2; AU2004290044B2; EP1694705B1; AU2004290044A1; IL202681A; PL1694705T3; AR074780A2; AU2011200606A1; PT1694705E; CN102010471A; AU2011200606B2; SG155205A1; DK1694705T3; KR20120025618A; CA2812856A1; KR20060120093A; RS51180B; CA2545255C; NO20062672L; HRP20090517T1

Abstract

在此提供的方法和组合物一般地涉及IL-10特异性抗体和其用途。更具体地说，人源化IL-10特异性抗体的组合物和使用这样的抗体的方法，用于调整IL-10的生物学活性，特别是在自体免疫失调和病原体介导的免疫病理中。

Description

白细胞介素-10抗体

本申请要求于2003年11月10日提交的美国临时专利申请No.60/518,999的利益，通过引用将它完全地合并在此。

发明领域

[0001]本发明一般地涉及白细胞介素-10(IL-10)特异性抗体和其用途。更具体地，本发明涉及人源化的抗体，其识别人类IL-10并调整其活性，特别是在自体免疫失调中。

发明背景

[0002]最初被称为细胞因子合成抑制因子或CSIF的白细胞介素-10(IL-10)是造血细胞、特别是免疫细胞的有效的免疫调节物。一些细胞，例如活化的Th2细胞、B细胞、角质形成细胞、单核细胞和巨噬细胞产生IL-10。参见，例如，Moore等，Anne.Rev.Immunol.11：165(1993)。IL-10抑制许多细胞，包括T细胞、单核细胞和巨噬细胞的活化和效应物功能。特别地，IL-10抑制细胞，例如Th1细胞、天然杀伤细胞、单核细胞和巨噬细胞的细胞因子合成，包括IL-1、IFN-γ和TNF的合成。参见，例如，Fiorentino等，J.Exp.Med.，170：2081-2095(1989)；Fiorentino等，J.Immunol.146：3444(1991)；Hsu等，Int.Immunol.4：563(1992)；Hsu等，Int.Immunol.4：563(1992)；D′Andrea等，J.Exp.Med.178：1041(1993)；de Waal Malefyt等，J.Exp.Med.174：915(1991)；Fiorentino等，J.Immunol.147：3815(1991)。

[0003]多种病原体，特别是细胞内病原体，引起IL-10产生来减慢或完全地停止由免疫反应有效地去除病原体。Moore等，Annu.Rev.Immunol.11：165(1993)。例如，在来自患有HIV、麻疯病或肺结核的患者的血液淋巴细胞中，当用病原体攻击时，外周血淋巴细胞在体外一般是无变应性的或非响应性的。然而，在这些当中IL-10的中和作用表明活性的效应物应答，即，Th1反应性存在于这些细胞中。因而，相信IL-10被病原体有效地利用来促进其传染性状态。

[0004]IL-10还与体内自身免疫相关。自身免疫由靶向正常组织的自身抗体、自身反应性T细胞或它们的某些组合的发展引起。自身免疫性疾病的一个实例是全身性红斑狼疮(SLE)，一种慢性风湿性疾病，在其中全身的结缔组织都成为炎性的。自身抗体攻击正常的身体组织，好象正常的身体组织是外部侵入的，引起特征性的炎症。虽然还不完全了解准确的原因，研究人员相信它兼备遗传性和环境性的因素。特别地，B细胞超活动性和各种自身抗体的存在是SLE的特征。一般地，与双链DNA反应的IgG自身抗体(IgG抗dsDNA abs)在SLE患者中升高了。60到70％之间的SLE患者产生IgG抗dsDNA abs，其中一些是有肾脏毒性的。SLE在女性中比在男性中高发十倍，具有的症状从面部的皮疹到致残性和潜在危急生命的器官功能障碍。它可以在任何年龄发作，但最常见的是在年轻成年人中。

[0005]大量的研究证明了IL-10在与SLE相关的病理过程中的作用。例如，尽管IL-10一般不由未受适当刺激的细胞产生，但是来自SLE患者的B细胞和巨噬细胞在体外都自然地产生高水平的IL-10。Llorente等，Arthritis Rheum.40：249-60(1997)。在几项研究中，研究人员证明了IL-10血清水平和疾病活动性之间的相关性。此外，体内和体外研究都表明，阻断IL-10产生可以减轻SLE的临床表现。参见，例如，Gonzalez-Amaro等，J.Autoimmunity 11：395-402(1998)。

[0006]迄今为止，已经通过使用免疫抑制性治疗，例如，糖皮质激素和环磷酰胺，治疗了SLE的表现之一，狼疮肾炎。尽管是有效的，这些治疗是非特异性的，并且存在妨碍长期治疗的显著的毒性。因而，特异性中和抗体可能是IL-10的有效拮抗物，容许除去IL-10的抑制性效果而保持免疫反应网络的其余部分的完整性。

[0007]在体内使用抗体作为治疗剂的最重要限制是抗体的免疫原性。大多数单克隆抗体来源于啮齿动物，在人类中重复使用引起针对治疗性抗体的免疫反应的产生。这种免疫反应最小会引起治疗效力的损失，最大会引起潜在的致死性过敏反应。降低啮齿动物抗体的免疫原性的最初的努力包括产生嵌合抗体，其中鼠可变区与人类恒定区融合。Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439(1987)。然而，用人类可变区和小鼠恒定区的杂合体注射的小鼠发展出针对人类可变区的强烈的抗抗体反应，提示在这种嵌合抗体中保留完整的啮齿动物Fv区域仍可能在患者中产生不需要的免疫原性。

[0008]普遍认为的是，可变结构域的互补决定区(CDR)环包括抗体分子的结合位点。因此，尝试将啮齿动物CDR环移植到人类框架上(即，人源化)来进一步最小化啮齿动物序列。Jones等，Nature321：522(1986)；Verhoeyen等，Science 239：1534(1988)。然而，CDR环交换仍然不能一致地产生具有与起始抗体相同结合性质的抗体。在人源化抗体中涉及CDR环支持的框架残基(FR)的变化也是保存抗原结合亲合性所需的。Kabat等，J.Immunol.147：1709(1991)。尽管已经报道了在许多人源化抗体构建体中使用CDR移植和框架残基保留，还是很难预测具体的序列是否会产生具有期望的结合性质、有时是生物学性质的抗体。参见，例如，Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029(1989)，Gorman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4181(1991)，and Hodgson，Bio/Technology 9：421(1991)。此外，大多数在先的研究使用了不同的人类序列用于动物的轻链和重链可变序列，使得这种研究的预测的性质是不可靠的。已经使用了已知抗体的序列，或更典型地，具有已知X射线结构的那些抗体，抗体NEW和KOL的序列。参见，例如，Jones等，见上文；Verhoeyen等，见上文；和Gorman等，见上文。仅对少数的人源化构建体报道了确切的序列信息。

[0009]本发明提供了识别人类IL-10并调整其活性，特别是关于自体免疫失调的活性的人源化单克隆抗体。人源化抗体应当提供没有与当前的治疗相关的毒性和非特异性的替换性治疗选择。

发明概述

[0010]在此提供的是一种结合IL-10的人源化重组抗体分子或其结合片段，包含：至少一个抗体轻链可变区或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：1、CDR2的SEQ ID NO：2和CDR3的SEQ ID NO：3构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽；和框架区，其中框架区的氨基酸序列全部或基本上全部是人类免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一个抗体重链可变区或其结合片段，包含具有选自CDR1的SEQ ID NO：6、CDR2的SEQ ID NO：7和CDR3的SEQ ID NO：8的组的至少一个氨基酸序列的多肽；和框架区，其中框架区的氨基酸序列全部或基本上全部是人类免疫球蛋白氨基酸序列。在此还提供的是抗体，其中所述抗体轻链或其结合片段包含具有SEQ ID NO：4的可变区的多肽。在一个特定的实施方式中，所述抗体轻链或其结合片段包含具有SEQ ID NO：5的可变区和恒定区的多肽。在一个特定的实施方式中，所述抗体重链或其结合片段包含具有SEQ ID NO：9的可变区的多肽。在另一个特定的实施方式中，所述抗体重链或其结合片段包含具有SEQ ID NO：10的可变区和恒定区的多肽。

[0011]在此进一步提供是一种结合IL-10的嵌合重组抗体分子或其结合片段，包含：至少一个抗体轻链可变区或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：1、CDR2的SEQ ID NO：2和CDR3的SEQ ID NO：3构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽；和至少一个抗体重链可变区或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ IDNO：6、CDR2的SEQ ID NO：7和CDR3的SEQ ID NO：8构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽。

[0012]还在此提供的是一种结合IL-10的人源化重组抗体分子或其结合片段，包含：至少一个抗体轻链或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：11、CDR2的SEQ ID NO：12和CDR3的SEQID NO：13构成的组的氨基酸序列的多肽；和框架区，其中所述框架区的氨基酸序列全部或基本上全部是人类免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一个抗体重链或其结合片段，包括具有选自由CDR1的SEQ IDNO：15、CDR2的SEQ ID NO：16和CDR3的SEQ ID NO：17构成的组的氨基酸序列的多肽；和框架区，其中所述框架区的氨基酸序列全部或基本上全部是人类免疫球蛋白氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述抗体轻链或其结合片段包含具有SEQ ID NO：14的可变区和恒定区的多肽。在又一个特定的实施方式中，所述抗体重链或其结合片段包含具有SEQ ID NO：18的可变区和恒定区的多肽。

[0013]在此进一步提供是一种结合IL-10的嵌合重组抗体分子或其结合片段，包含：至少一个抗体轻链或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：11、CDR2的SEQ ID NO：12和CDR3的SEQID NO：13构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽；和至少一个抗体重链或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：15、CDR2的SEQ ID NO：16和CDR3的SEQ ID NO：17构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽。

[0014]在一个实施方式中，以上描述的抗体进一步包含重链恒定区，其中所述重链恒定区包含γ1、γ2、γ3或γ4人类重链恒定区或其变体。在一个实施方式中，上述抗体进一步包含轻链恒定区，其中所述轻链恒定区包含lambda或kappa人类轻链恒定区。在某些实施方式中，这些抗体的结合片段是选自由Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)₂和双抗体(diabody)构成的组的抗体片段。

[0015]在此进一步提供的是在人类受试者中抑制免疫反应的方法，包括向需要其的受试者以有效阻断IL-10的生物学活性的量施用特异于IL-10的抗体或其结合片段，其中所述抗体是在此公开的抗体。通过这种方法抑制的免疫反应是体液的或细胞的反应。在一个实施方式中，用这种方法治疗的受试者患有全身性红斑狼疮。在另一个实施方式中，所述受试者患有免疫性血小板减少性紫癜(ITC)。在又一个实施方式中，所述受试者患有狼疮肾炎。在进一步的实施方式中，所述受试者患有HIV。在另一个实施方式中，所述受试者患有肝炎C。在一个特定的实施方式中，在人类受试者中抑制免疫反应的方法包括向需要其的受试者施用(1)有效阻断IL-10的生物学活性的量的特异于IL-10的抗体或其结合片段，其中所述抗体是在此公开的抗体，和(2)免疫抑制试剂。

[0016]在此提供的是一种组合物，包含抗体或其结合片段，与药学上可接受的载体或稀释剂组合，其中所述抗体是以上公开的抗体之一。

[0017]进一步提供的是编码以上公开的抗体的多肽的分离的核酸。在此还提供的是表达载体，包含与控制序列可操作连接的分离的核酸序列，所述控制序列由用所述载体转染的宿主细胞识别。在此提供的是包含所述载体的宿主细胞，所述载体包含所述分离的核酸序列。在此进一步提供的是生产多肽的方法，包括在表达所述核酸序列的条件下培养包含所述载体的宿主细胞，从而产生所述多肽，并从宿主细胞回收所述多肽。

[0018]在此提供的是编码特异于IL-10的抗体的分离的核酸序列，包含具有SEQ ID NO：19的核酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：20的核酸序列的重链。在进一步的实施方式中，所述轻链具有美国典型培养物保藏所(ATCC)保藏号PTA-5923，所述重链具有ATCC保藏号PTA-5922。

[0019]在此提供的是编码特异于IL-10的抗体的分离的核酸序列，包含具有SEQ ID NO：21的核酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：22的核酸序列的重链。在进一步的实施方式中，所述轻链具有ATCC保藏号PTA-5927，所述重链具有ATCC保藏号PTA-5926。

[0020]在此进一步提供的是编码抗体的结合片段的分离的核酸序列，所述抗体由上述核酸序列编码。在一个实施方式中，所述结合片段是选自由Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv和F(ab’)₂构成的组的抗体片段。

[0021]在此提供的是鉴定人源化抗体的接受体种系序列的方法，包括步骤：a)鉴定具有期望的生物学活性的非人类抗体；b)确定非人类抗体V_H和V_L结构域的氨基酸序列；和c)将非人类抗体序列与一组人类种系序列进行比较，其中所述比较包括子步骤：1)给非人类V_H和V_L结构域序列的序列分配残基编号；2)描绘序列中的CDR和FR区域；3)在非人类和人类种系序列相同的每个残基位置分配预定的数字分值；和4)总和所有的残基分值来产生每个人类种系序列的总分值；和d)将具有最高的总残基分值的人类种系序列鉴定作为接受体种系序列。在一个实施方式中，所述方法进一步包括子步骤：5)在子步骤(4)之后，为具有相同总残基分值的种系序列，对在子步骤(3)中未计分的非人类和人类种系序列相同的每个残基位置分配数字分值1；6)总和所有残基分值来产生每个人类种系序列的总分值。在特定的实施方式中，所述非人类抗体特异于IL-10并且抑制IL-10的生物学活性。在特定的实施方式中，对于V_H和V_L区分别如表2和3中的将数字分值分配给残基。

[0022]在此进一步提供的是通过上述方法产生的抗体。

附图的简要说明

[0023)附图1A显示了相对于抗人类IL-10抗体12G8的可变轻链，给潜在的接受体种系序列分配残基编号和数字分值。

[0024]附图1B显示了相对于抗人类IL-10抗体12G8的可变重链，给潜在的接受体种系序列分配残基编号和数字分值。

[0025]附图1C显示了相对于抗人类IL-10抗体11D8的可变轻链，给潜在的接受体种系序列分配残基编号和数字分值。

[0026]附图1D显示了相对于抗人类IL-10抗体12D8的可变重链，给潜在的接受体种系序列分配残基编号和数字分值。

[0027]附图2A是如实施例III中描述i.v.施用的12G8抗体的浓度-时间分布曲线。

[0028]附图2B是如实施例III中描述s.c.施用的12G8的浓度-时间分布曲线。

[0029]附图3A显示了施用人源化抗IL-10抗体SCH708980，在IL-10转基因小鼠中赋予了对Leishmania major感染的抗性。感染通过在指定的时间用卡尺测量爪垫肿胀来确定。如实施例VI中描述的施用12G8抗体。

[0030]附图3B显示了施用大鼠抗IL-10抗体12G8，在IL-10转基因小鼠中赋予了对Leishmania major感染的抗性。感染通过在指定的时间用卡尺测量爪垫肿胀来确定。如实施例VI中描述的施用12G8抗体。

发明的详细说明

[0031]为了公开的清楚性，而不是进行限制，将发明的详细说明分成以下的小节。

A.定义

[0032]如果没有另外定义，此处使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的一个普通技术人员通常所理解的相同含义。在此引用的所有专利、申请、公开的申请和其他出版物通过引用将它们完整地合并。如果在本节中阐述的定义与通过引用合并在此的专利、申请、公开的申请和其他出版物阐述的定义相反或不一致，在本节中阐述的定义优于通过引用合并在此的定义。

[0033]如在此使用的，“a”或“an”意指“至少一个”或“一个或多个”。

[0034]如在此使用的，术语“抗体”是指展现出期望的生物学活性的任何形式的抗体或其片段。因而，在最宽泛的含义上使用它，并且特别地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现了期望的生物学活性。

[0035]如在此使用的，术语“IL-10结合片段”或“其结合片段”包括仍然基本上保存了它抑制IL-10活性的生物学活性的抗体的片段或衍生物。因此，术语“抗体片段”或IL-10结合片段是指全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如，sc-Fv；和由抗体片段形成的多特异性抗体。典型地，结合片段或衍生物保持了它的IL-10抑制活性的至少50％。优选的，结合片段或衍生物保持了它的IL-10抑制活性的至少60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。还预期的是IL-10结合片段可以包括基本上不改变它的生物活性的保守性氨基酸替换。

[0036]此处使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能自然发生的突变之外，组成所述群体的单个抗体是同一的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原性表位。相比之下，常规的(多克隆的)抗体制品一般包括针对(或特异于)不同表位的许多抗体。修饰语“单克隆”表明了抗体是从基本上同质的抗体群体获得的特性，不能被看作是需要通过任何特别的方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler等，Nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”也可以利用，例如，Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。

[0037]在此单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，在“嵌合”抗体中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列同一或同源，而该链的其余部分与来源于另一个物种或属于另一个抗体种类或亚类的抗体中的相应序列同一或同源，还包括这种抗体的片段，只要它们显示出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。

[0038]如在此使用的，术语“单链Fy”或“scFv”抗体是指包含抗体的V_H和V_L结构域的抗体片段，其中这些结构域以单个多肽链存在。通常，Fv多肽进一步包含V_H和V_L结构域之间的多肽接头，其允许sFv形成用于抗原结合的期望的结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun，THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONALANTIBODIES，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)。

[0039]如在此使用的，术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小的抗体片段，所述片段在同一多肽链中包含连接到轻链可变区(V_L)的重链可变区(V_H)(V_H-V_L)。通过使用非常短以致不能容许在同一链上两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)中有更详细的描述。

[0040]如在此使用的，术语“人源化抗体”是指含有来自非人类(例如，鼠)抗体以及人类抗体的序列的抗体形式。这种抗体是含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。一般地，人源化抗体包括基本上所有至少一个，典型地是两个可变结构域，其中，所有的或基本上所有的高变环相应于非人免疫球蛋白的高变环，和所有的或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区的一部分。

[0041]如在此使用的，术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变结构域中的残基23-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变结构域的残基31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))，和/或来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变结构域中的残基26-32(LI)，50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothiaand Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。如在此使用的，术语“框架”或“FR”残基是指除了在此定义为CDR残基的高变区残基之外的那些可变区残基。

[0042]如在此使用的，术语“保守性替换”是指本领域技术人员已知的氨基酸替换，并可以在通常不改变产生的分子的生物学活性的情况下进行。本领域技术人员都认可的是，一般地，在多肽的非关键区域的单个氨基酸替换基本上不改变生物学活性(参见，例如，Watson等，Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，p.224(4th Edition 1987))。这种示范性的替换优选的根据以下的表1中阐述的那些来进行：

表1

初始残基保守性替换

Ala(A) Gly；Ser

Arg(R) Lys

Asn(N) Gln；His

Cys(C) Ser

Gln(Q) Asn

Glu(E) Asp

Gly(G) Ala；Pro

His(H) Asn；Gln

Ile(I) Leu；Val

Leu(L) Ile；Val

Lys(K) Arg；Gln；Glu

Met(M) Leu；Tyr；Ile

Phe(F) Met；Leu；Tyr

Ser(S) Thr

Thr(T) Ser

Trp(W) Tyr

Tyr(Y) Trp；Phe

Val(V) Ile；Leu

[0043]其他替换也是可允许的，可以经验性地或根据已知的保守性替换来确定。

[0044]如在此使用的，术语“分离的核酸分子”是指鉴定和分离自至少一个污染物核酸分子的核酸分子，在抗体核酸的天然来源中所述核酸分子通常与污染物核酸分子缔合。分离的核酸分子不同于其天然存在的形式或环境(setting)。因此分离的核酸分子不同于在天然细胞中存在的核酸分子。然而，分离的核酸分子包括被包含在通常表达抗体的细胞中的核酸分子，在所述细胞中，例如，所述核酸分子位于不同于天然细胞的染色体位置中。

[0045]表达“控制序列”是指在特定的宿主生物中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适合于原核生物的控制序列包括启动子、任选地包括操纵序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。

[0046]当被置于与另一个核酸序列的功能性关系中时，核酸是“可操作地连接的”。例如，如果被表达为参与多肽分泌的蛋白原，前序列(presequence)或分泌前导区的DNA可操作地与多肽的DNA连接；如果影响序列的转录，则启动子或增强子可操作地与编码序列连接；或如果将其放置以便于翻译，核糖体结合位点可操作地与编码序列连接。一般地，“可操作地连接”意思指被连接的DNA序列是连续的，以及对分泌前导区而言，是连续的并处于阅读状态。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点进行连接来实现连接。如果这种位点不存在，按照常规做法使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

[0047]如在此使用的，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换地使用，所有这样的指定都包括子代。因而，词语“转化体”和“转化细胞”包括原始的目标细胞和由此衍生的培养物，不考虑转移的次数。还应理解的是，由于有意的或无意的突变，所有子代在DNA内容方面可能不是精确相同的。根据最初转化的细胞筛选的具有相同功能或生物学活性的突变子代也包括在内。当希望不同的指定时，可以从上下文来明确。

[0048]如在此使用的，“聚合酶链式反应”或“PCR”是指一种过程或技术，其中按照例如美国专利No.4,683,195中描述的扩增核酸、RNA和/或DNA的微量的特定片段。通常，需要得到目标区域的末端或其以外的序列信息，从而可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列上与要扩增的模板的相对的链是相同的或类似的。两个引物的5’末端核苷酸可以与扩增的材料的末端重合。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列，和从总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般地参见Mullis等，Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.51：263(1987)；Erlich，ed.，PCRTECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y.，1989)。如在此使用的，PCR被认为是一个，但不是仅有的核酸聚合酶反应方法的实例，用于扩增核酸测试样品，包括使用已知核酸作为引物和核酸聚合酶来扩增或产生核酸的特定片段。

[0049]如在此使用的，术语“种系序列”是指未重排(unrearranged)的免疫球蛋白DNA序列的序列。可以使用未重排免疫球蛋白的任何适合的来源。

[0050]如在此使用的，术语“免疫抑制试剂”是指抑制或调整免疫反应的天然的或合成的试剂。所述免疫反应是体液的或细胞的反应。

B.IL-10特异性抗体

[0051]在此公开的组合物和方法涉及调节IL-10活性，特别是在免疫反应中。特别地，此处的组合物和方法使用特异于细胞因子IL-10的抗体。IL-10是强力的细胞因子，通过调控涉及免疫反应的各种细胞类型的生长、分化和细胞因子合成来调整T细胞和B细胞反应。值得注意的，IL-10产生常常与自体免疫疾病和病原体诱导的免疫病理相关。因此，调整和抑制IL-10活性的组合物和方法可以改变自身免疫性疾病和相关症状的发展和持续，和改善或降低病原体相关的免疫病理。

[0052]用人源化抗体靶向IL-10活性提供了几种独特的益处。首先，用抗体靶向IL-10允许特异性抑制IL-10活性而保留免疫反应的其余部分的完整性。在许多病原体诱导的免疫病理的情况下，IL-10活性的降低或消除将允许期望的效应物免疫反应来消除病原体而不发生进一步的病变。对于自体免疫患者来说，IL-10活性的降低或消除将降低或消除疾病和/或疾病的症状而保留患者的免疫能力。第二，人源化IL-10抗体绕过了与免疫原性啮齿动物抗体有关的限制。使用人类序列消除了外源性施用的抗体的免疫原性，容许治疗性地施用。

[0053]人源化抗体含有来自非人类以及人类抗体的序列。一般地，人源化的过程从产生具有期望生物学活性，即，抑制IL-10活性的非人类抗体开始。一旦鉴定出具有合适的特性的非人类抗体，则采用重组手段使用非人类和人类序列来产生杂交序列。

C.IL-10特异性抗体的产生

[0054]可以使用任何用于产生单克隆抗体的适合的方法。例如，可以用IL-10或其片段免疫接受者。可以使用任何适合的免疫方法。这样的方法可以包括佐剂、其他免疫刺激剂、重复强化免疫，和使用一种或多种免疫途径。

[0055]可以使用任何适合的IL-10来源作为免疫原用于产生在此公开的组合物和方法的非人类抗体。这样的形式包括，但不限于完整蛋白质、肽和表位，通过本领域已知的重组的、合成的、化学的或酶降解手段来产生。IL-10是酸敏感的、两个渗透(interpenetrating)多肽链的非共价同源二聚体。该细胞因子的长度是160个氨基酸，具有良好保守的序列，包括类似于干扰素和造血细胞因子的α-螺旋管束结构。人类和鼠的IL-10具有73％氨基酸同源性，人类IL-10对鼠和人细胞是有活性的。IL-10是商业上可获得的或可以使用公知的分子生物学技术生产。对于人类、猪尾恒河猴、mangabey、恒河猴、和猫头鹰猴、狐猴、小鼠、大鼠、豚鼠、金黄仓鼠、兔、猫、狗以及其他，GenbankcDNA序列都是可获得的。重组人IL-10是没有N-糖基化的17-18kDa多肽。

[0056]足以产生生物学活性的抗体的任何形式的抗原可被用于产生抗体。因而，引发抗原可以是单独的单个表位、多个表位、或完整蛋白质，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强试剂组合。引发抗原可以是分离的全长蛋白质、细胞表面蛋白(例如，用抗原的至少一部分转染的细胞来免疫)，或可溶蛋白质(例如，仅用蛋白质的细胞外结构域部分来免疫)。抗原可以在遗传地修饰的细胞中生产。编码所述抗原的DNA可以是基因组或非基因组的(例如，cDNA)并且编码细胞外结构域的至少一部分。如在此使用的，术语“部分”是指视情况组成目标抗原的免疫原性表位的最小数量的氨基酸或核酸。可以采用适合于转化目标细胞的任何遗传载体，包括但不限于腺病毒载体、质粒和非病毒载体，例如阳离子脂质。

[0057]可以使用任何适合的方法来引发具有期望的生物性质的抗体来抑制IL-10。期望的是从各种哺乳动物宿主，例如小鼠、啮齿动物、灵长类、人类等制备单克隆抗体(mAbs)。可以在，例如，Stites等(eds.)BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY(4th ed.)LangeMedical Publications，Los Altos，CA，和其中引用的参考文献；Harlowand Lane(1988)ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL CSHPress；Goding(1986)MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLESAND PRACTICE(2d ed.)Academic Press，New York，NY中找到制备这样的单克隆抗体的技术的说明。因而，可以通过本领域研究人员熟知的各种技术来获得单克隆抗体。一般地，通常通过与骨髓瘤细胞融合来使来自用期望抗原免疫的动物的脾脏细胞永生化。参见Kohler和Milstein(1976)Eur.J.Immunol.6：511-519。永生化的替换性方法包括用Epstein Barr Virus、致癌基因或逆转录病毒转化，或本领域已知的其他方法。参见，例如，Doyle，等(eds.1994和定期的增刊)CELLAND TISSUE CULTURE：LABORATORY PROCEDURES，John Wileyand Sons，New York，NY。根据对抗原有期望特异性和亲合性的抗体的产生来筛选产自单个永生细胞的集落，由这种细胞产生的单克隆抗体的产量可以通过各种技术来增强，包括注射到脊椎动物宿主的腹膜腔内。做为选择，人们可以根据例如Huse等(1989)Science 246：1275-1281描述的一般性方案通过筛选来自人类B细胞的DNA文库，来分离编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列。

[0058]其他适合的技术包括在噬菌体或类似的载体中选择抗体的文库。参见，例如，Huse等，Science 246：1275-1281(1989)；和Ward等，Nature 341：544-546(1989)。本发明的多肽和抗体可以有修饰或没有修饰地使用，包括嵌合的或人源化的抗体。经常地，多肽和抗体通过共价地或非共价地连接提供可检测信号的物质来进行标记。各种标记物和连接技术是已知的，在科学和专利文献中有广泛的报道。适合的标记物包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制物、荧光部分、化学发光部分、磁性粒子，等等。教导了使用这样的标记物的专利包括美国专利Nos.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。并且，可以生产重组免疫球蛋白，参见Cabilly美国专利No.4,816,567；和Queen等(1989)Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 86：10029-10033；或在转基因小鼠中制造，参见Mendez等(1997)Nature Genetics 15：146-156；也参见Abgenix和Medarex技术。

[0059]可以通过用多肽、片段、肽或表位与载体蛋白的结合物免疫动物，来产生针对IL-10的预定片段的抗体或结合组合物。从分泌期望抗体的细胞制备单克隆抗体。可以筛选这些抗体来结合正常的或缺陷的IL-10。通常经ELISA测定，这些单克隆抗体通常以至少约1μM、更一般地至少约300nM、典型地至少约30nM、优选的至少约10nM、更优选的至少约3nM或更好的K_d值结合。也可以使用以下的小节D中描述的生物测定来鉴定适合的非人类抗体。

C.IL-10特异性抗体的人源化

[0060]可以使用任何适合的非人类抗体作为高变区的来源。非人类抗体的来源包括，但不限于，鼠、狼、牛和灵长类。对于大多数的部分来说，人源化的抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，在其中受者的高变区残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的、具有期望的特异性、亲合性和能力(capacity)的高变区残基替代。在有些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含既不在受者抗体也不在供体抗体中存在的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体的期望生物学活性性能。有关详细情形，参见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Reichmann等，Nature 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

[0061]已经描述了重组性地工程化抗体的方法，例如，Boss等(美国专利No.4,816,397)，Cabilly等(美国专利No.4,816,567)，Law等(欧洲专利申请公开No.438310)和Winter(欧洲专利申请公开No.239400)。

[0062]通过向人源化抗IL-10抗体DNA中导入合适的核苷酸变化或通过肽合成，来制备人源化抗IL-10抗体的氨基酸序列变体。这样的变体包括，例如，删除和/或插入和/或替换人源化抗IL-10F(ab)所示的(例如，SEQ ID NO 5和10)氨基酸序列内的残基。进行删除、插入和替换的任何组合来得到最终的构建体，条件是最终的构建体具有期望的特性。氨基酸变化也可能改变人源化抗IL-10抗体的翻译后加工，例如，改变糖基化位点的数目或位置。

[0063]用于鉴定作为优选的的突变位置的、人源化抗IL-10抗体多肽的某些残基或区域的方法，称为“丙氨酸扫描突变”，由Cunningham和Wells，Science 244：1081-1085(1989)所描述。在此，鉴定残基或一组目标残基(例如，带电残基如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性的或带负电的氨基酸(最优选的丙氨酸或聚丙氨酸)替换来影响氨基酸与IL-10抗原的相互作用。然后通过在替换的位点导入进一步的或其他的变化来改进表现出对替换有功能敏感性的氨基酸残基。因而，当确定了导入氨基酸序列变化的位点时，不必预先确定突变本身的性质。例如，为了分析在给定位点的突变的性能，在目标密码子或区域进行ala扫描或随机突变，并根据期望的活性筛选表达的人源化抗IL-10抗体的变体。

[0064]氨基酸序列插入包括在氨基和/或羧基末端的、长度为一个残基到含有一百个或更多残基的多肽的融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内的插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的人源化抗IL-10抗体或与表位标签融合的抗体。人源化抗IL-10抗体分子的其他插入变体包括提高抗体的血清半衰期的酶或多肽与人源化抗IL-10抗体的N-或C-末端的融合。

[0065]另一种类型的变体是氨基酸替换变体。这些变体具有在人源化抗IL-10抗体分子中除去的至少一个氨基酸残基和在它的位置上插入的不同的残基。替换突变的最感兴趣的位点包括高变环，但FR改变也是期望的。在以下描述的方法中的表2和表3提供了关于可改变的高变区残基的指导。涉及抗原结合的高变区残基或FR残基一般以相对保守的方式替换。

[0066]抗体的另一种类型的氨基酸变体改变了抗体的原始的糖基化模式。改变的意思是删除抗体中存在的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加不存在于抗体中的一个或多个糖基化位点。抗体的糖基化典型地是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分附着到天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸，是碳水化合物部分酶促附着到天冬酰胺侧链的识别序列。因而，在多肽中这些三肽序列的任何一个的存在都产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着到羟基氨基酸上，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，而5-羟脯氨酸或5-羟基赖氨酸也可以使用。

[0067]可以通过改变氨基酸序列使其含有上述三肽序列的一个或多个(用于N-连接的糖基化位点)来方便地实现给抗体添加糖基化位点。也可以通过向原始抗体的序列中添加或替换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(用于O-连接的糖基化位点)来进行改变。

[0068]通过本领域已知的各种方法来制备编码人源化IL-10特异性抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括，但不限于，从天然来源分离(对于天然发生的氨基酸序列变体)，或通过寡核苷酸介导的(或定点)突变，PCR突变，和较早制备的人源化抗IL-10抗体的变体或非变体型式的表达盒突变来制备。

[0069]通常，人源化抗IL-10抗体的氨基酸序列变体具有的氨基酸序列与轻链或重链的原始人源化抗体氨基酸序列(例如，如SEQ IDNO：5和10)具有至少75％的氨基酸序列同一性，更优选的至少80％，更优选的至少85％，更优选的至少90％，最优选的至少95％。对这个序列的同一性或同源性在此被定义为在候选序列中与人源化抗IL-10残基相同的氨基酸残基的百分比，如果有必要，在比对序列和导入缺口之后，以到达最大的序列同一性百分比，而不考虑任何保守性替换作为序列同一性的部分。对抗体序列的N-末端、C-末端或内部延伸、删除或插入，都不应被认为影响序列同一性或同源性。

[0070]人源化抗体可以选自任何类型的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE。优选的，抗体是IgG抗体。可以使用IgG的任何同种型，包括IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。IgG同种型的变体也是被考虑的。人源化抗体可以包含来自超过一个类型或同种型的序列。通过在如下所述的生物测定中筛选抗体来容易地实现必需恒定结构域序列的优化以产生期望的生物活性。

[0071]同样地，任一类型的轻链都可用于此处的组合物和方法中。特别地，在当前的组合物和方法中，kappa、lambda或其变体是有用的。

[0072]可以使用来自非人类抗体的CDR序列的任何适合的部分。通过替换、插入或删除至少一个残基来突变CDR序列，使得CDR序列不同于所采用的人类和非人类抗体序列。期望的是这种突变是最小的。一般地，至少75％的人源化抗体残基相应于非人类CDR残基，更经常地为90％，最优选的大于95％。

[0073]可以使用来自人类抗体的FR序列的任何适合的部分。通过替换、插入或删除至少一个残基来突变FR序列，使得FR序列不同于所采用的人类和非人类抗体序列。期望的是这种突变是最小的。一般地，至少75％的人源化抗体残基相应于人类FR残基，更经常地为90％，最优选的大于95％。

[0074]CDR和FR残基根据Kabat的标准序列定义来确定。Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institutesof Health，Bethesda Md.(1987)。

[0075]在此提供的是鉴定人源化抗体的接受体种系序列的方法，该方法包括步骤：a)鉴定具有期望的生物学活性的非人类抗体；b)确定非人类抗体V_H和V_L结构域的氨基酸序列；和c)将非人类抗体序列与一组人类种系序列进行比较，其中所述比较包括子步骤：1)根据上述Kabat给非人类V序列分配残基编号；2)根据上述Kabat描绘序列中的CDR和FR区域；3)在非人类和人类抗体种系序列的相同的特定残基位置分配预定的数字分值；和4)总和所有的残基分值来产生每个人类种系序列的总分；和d)将具有最高的总残基分值的人类种系序列鉴定作为接受体种系序列。在一个实施方式中，所述方法进一步包括子步骤：5)在子步骤(4)之后，为具有相同总残基分值的种系序列，对在子步骤(3)中未计分的非人类和人类抗体种系序列相同的每个FR残基位置分配数字分值1；6)总和所有残基分值来产生每个人类种系序列的总分值。在特定的实施方式中，所述非人类抗体特异于IL-10并且抑制IL-10的生物学活性。在此还提供的是通过上述方法产生的抗体。

[0076]在一个实施方式中，使用以下方法对IL-10抗体进行人源化。首先，对IL-10抗体的非人类V_L和V_H结构域进行克隆和序列，并测定氨基酸序列。然后，将非人类V_H序列与一组五个人类V_H种系氨基酸序列比较。这五个的组含有来自IGHV1和IGHV4亚群的一个代表和来自IGHV3亚群的三个代表。VH亚群在M.-P.Lefranc，Exp.Clin.Immunogenetics，18：100-116(2001)中列出了。特别地，与五个种系序列的比较从根据Kabat编号系统给非人类V_H序列分配残基编号开始。参见Kabat等，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Pub.91-3242(5th Ed.，1991)。然后将非人类VH序列与五个人类种系序列中的每一个进行比对。由于V基因仅包含V_H残基1-94，在比对中仅考虑这些残基。接下来，描绘序列中的互补决定区(CDR)和框架区(FR)。根据在Kabat，等，U.S.Department of Health andHuman SerVices，NIH Pub.91-3242(5th Ed.，1991)和C.Chothia&A.M.Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)中提供的定义的组合来描绘CDR和FR。因此，使用的CDR定义对于V_H结构域是CDR1为残基26-35，CDR2为残基50-65，CDR3为残基95-102。接下来的步骤包括在非人类和人类序列吻合的鉴定的残基位置分配数字分值。这种计分的一个实例在以下的表2中示出。

max89

^＊表示影响CDR构象，C.Chothia等，Nature 342：877-883，(1989)。

[0077]在给残基位置分配数字分值之后，总和所有残基的分值。接受体种系序列是具有最高总分的那个。在两个或多个种系序列具有相同的分值的情况下，则在以下残基：1，3，5-23，25，36，38，40-43，46，66，68，70，72，74，75，77，79-90和92上非人类和人类序列相同的每个位置上给总分加1(最大49)。再次总计残基分值，接受体种系序列是具有最高总分的那个。如果两个或多个种系序列仍然具有相同的分值，任何一个都可被用作接受体种系序列。

[0078]如果V_L序列是V_L的kappa亚类的成员，将来自IL-10特异性抗体的非人类V_L序列与一组四个人类V_L kappa种系氨基酸序列进行比较。这四个序列由来自在V.Barbie & M.-P.Lefranc，Exp.Clin.Immnnogenetics 15：171-183(1998)和M.-P.Lefranc，Exp.Clin.Immunogenetics 18：161-174(2001)中列出的四个已确定人类V_L亚群的每个的一个代表组成。这四个序列也相应于Kabat等，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Pub.91-3242，pp.103-130(5th Ed.，1991)中列出的四个亚群。非人类序列与四个种系序列的比较从根据Kabat等，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH Pub.91-3242(5th Ed.，1991)给非人类V_L序列残基分配残基编号开始。然后将非人类V_L序列与四个人类种系序列中的每一个进行比对。由于V基因仅包含V_L残基1-95，在比对中仅考虑这些残基。接下来，描绘序列中的互补决定区(CDR)和框架区(FR)。根据在Kabat等，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPub.91-3242(5th Ed.，1991)和C.Chothia & A.M.Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)中提供的定义的组合来描绘CDR和FR。因此，使用的CDR定义对于V_L结构域是CDR1为残基24-34，CDR2为残基50-56，CDR3为残基89-97。接下来的步骤包括在非人类和人类序列吻合的鉴定的残基位置分配数字分值。这种计分的一个实例在以下的表3中示出。

^＊表示影响CDR构象，C.Chothia等，Nature 342：877-883，(1989)。

[0079]在给残基位置分配数字分值之后，总和所有残基的分值。接受体种系序列是具有最高总分的那个。在两个或多个种系具有具有相同的分值的情况下，则在以下残基：1，3，5-23，35，37，39-42，57，59-61，63，65-70，72-86和88上非人类和人类序列相同的每个位置上给总分加1。再次总计残基分值，接受体种系序列是具有最高总分的那个。如果两个或多个种系序列仍然具有相同的分值，任何一个都可被用作接受体种系序列。

[0080]对于抗体的重组生产，分离编码抗体的核酸，并插入到可复制载体中用于进一步的克隆(DNA的扩增)或用于表达。利用常规程序容易地分离编码单克隆抗体的DNA并测序(例如，利用能与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。许多载体是可获得的。载体成分一般包括，但不限于，一种或多种以下成分：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

[0081]在一个实施方式中，抗体是结合IL-10的人源化重组抗体分子或其结合片段，包含：至少一个抗体轻链可变区或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：1(KTSQNIFENLA)、CDR2的SEQ ID NO：2(NASPLQA)和CDR3的SEQ ID NO：3(HQYYSGYT)构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽；和框架区，其中框架区的氨基酸序列全部或基本上全部是人类免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一个抗体重链可变区或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：6(GFTFSDYHMA)、CDR2的SEQ ID NO：7(SITLDATYTYYRDSVRG)和CDR3的SEQ ID NO：8(HRGFSVWLDY)构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽；和框架区，其中框架区的氨基酸序列全部或基本上全部是人类免疫球蛋白氨基酸序列。在特定的实施方式中，所述抗体轻链或其结合片段包含具有SEQ ID NO：4

(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTSQNIFENLAWYQQKPGKAPKLLIYNASPLQAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYSG-YTFGPGTKLELKRT)

的可变区的多肽。在一个特定的实施方式中，所述抗体轻链或其结合片段包含具有SEQ ID NO：5的可变区和恒定区的多肽。参见表4。在一个特定的实施方式中，所述抗体重链或其结合片段包含具有SEQID NO：9

(QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSDYHMAWVRQAPGKGLEWVASITLDATYTYYRDSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHRGFSVWLDYWGQGTLVTVSS)

的可变区的多肽。在另一个特定的实施方式中，所述抗体重链或其结合片段包含具有SEQ ID NO：10的可变区和恒定区的多肽。参见表5。

[0082]含有编码人源化12G8轻链和重链的核酸的质粒保藏在美国典型培养物保藏所(ATCC)，保藏号分别为PTA-5923和PTA-5922。

表4.人源化12G8抗体的轻链的全长序列

SEQ ID NO：5人源化12G8抗体的全长氨基酸序列

SEQ ID NO：19人源化12G8抗体的全长核酸序列

-->可变轻链结构域

D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T

GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT

C K T S Q N I F E N L A W Y Q Q K P G K A P

TGC AAG ACA AGT CAG AAC ATT TTT GAG AAC TTG GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT

K L L I Y N A S P L Q A G V P S R F S G S G

AAG CTC CTG ATC TAT AAT GCA AGC CCT TTG CAA GCG GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA

S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C

TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAC TAC TGT

-->人类

H Q Y Y S G Y T F G P G T K L E L K R T V A

CAC CAG TAT TAT AGC GGG TAC ACG TTT GGA CCT GGG ACC AAG CTG GAA CTG AAA CGT ACG GTG GCT

轻链恒定结构域

A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V

GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG

C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q

TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA

S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S

TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC

T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q

ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG

G L S S P V T K S F N R G E C

GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT

表5.人源化12G8抗体的重链的全长序列

SEQ ID NO：10人源化12G8抗体的全长氨基酸序列

SEQ ID NO：20人源化12G8抗体的全长核酸序列

Q V Q L V E S G G G V V Q P G R S L R L S C

CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT

A A S G F T F S D Y H M A W V R Q A P G K G

GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT GAC TAT CAT ATG GCC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG

L E W V A S I T L D A T Y T Y Y R D S V R G

CTG GAG TGG GTG GCA AGC ATT ACT CTT GAT GCT ACC TAC ACT TAC TAT CGC GAC TCC GTG CGC GGC

R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A

CGC TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCT

E D T A V Y Y C A R H R G F S V W L D Y W G

GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA CAT CGA GGC TTT AGC GTC TGG CTT GAT TAC TGG GGC

-->人类IgG1恒定重链结构域

Q G T L V T V S S A S T K G P S V F P L A P

CAA GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCG TCG GCT AGC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC

S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E

TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGCTGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA

P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L

CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA

Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q

CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG

T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K

ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA

S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V

TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC

F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V

TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG

V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V

GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG

H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L

CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC

T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L

ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC

P A P I E K T I S K A K G Q P K E P Q V Y T

CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC

L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F

CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC

Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T

TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG

P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R

CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG

W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q

TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG

K S L S L S P G K

AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA

[0083]在一个实施方式中，抗体是结合IL-10的人源化重组抗体分子或其结合片段，包含：至少一个抗体轻链或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：11(RASESVDDYGHSFMH)、CDR2的SEQ ID NO：12(RASTLES)和CDR3的SEQ ID NO：13(QQGNEDPWT)构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽；和框架区，其中框架区的氨基酸序列全部或基本上全部是人类免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一个抗体重链或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：15(GFSLTNYGVH)、CDR2的SEQ ID NO：16(VIWSGGSTDYNAAFIS)和CDR3的SEQ ID NO：17(NRGYDVYFDY)构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽；和框架区，其中框架区的氨基酸序列全部或基本上全部是人类免疫球蛋白氨基酸序列。在一个特定的实施方式中，所述抗体轻链或其结合片段包含具有SEQ ID NO：14的可变区和恒定区的多肽。参见表6。在又一个特定的实施方式中，所述抗体重链或其结合片段包含具有SEQ IDNO：18的可变区和恒定区的多肽。参见表7。

[0084]含有人源化11D8重链和轻链的质粒保藏在ATCC，保藏号分别为PTA-5926和PTA-5927。

表6.人源化11D8抗体的轻链的全长序列

SEQ ID NO：14人源化11D8抗体的全长氨基酸序列

SEQ ID NO：21人源化11D8抗体的全长核苷酸序列

E I V L T Q S P G T L S L S P G E R A T

GAA ATT GTG TTG ACG CAG TCT CCA GGC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GCC ACC

L S C R A S E S V D D Y G H S F M H W Y

CTC TCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT GTT GAT GAT TAT GGC CAT AGT TTT ATG CAC TGG TAC

Q Q K P G Q A P R L L I Y R A S T L E S

CAG CAG AAA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT CGT GCA TCC ACC CTA GAA TCT

G I P D R F S G S G S G T D F T L T I S

GGC ATC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACT CTC ACC ATC AGC

R L E P E D F A V Y Y C Q Q G N E D P W

AGA CTG GAG CCT GAA GAT TTT GCA GTG TAT TAC TGT CAG CAA GGT AAT GAG GAT CCG TGG

T F G Q G T K V E I K R T V A A P S V F

ACG TTC GGT CAA GGT ACC AAG GTG GAA ATC AAG CGT ACG GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC

I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L

ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG

N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S

AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG

G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S

GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC

S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V

AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC

T H Q G L S S P V T K S F N R G E C

ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT

表7.人源化11D8抗体的重链的全长序列

SEQ ID NO：18人源化11D8抗体的全长氨基酸序列

SEQ ID NO：22人源化11D8抗体的全长核苷酸序列

Q V Q L V E S G G G V V Q P G R S

CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG TCC

L R L S C A A S G F S L T N Y G V H W V

CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGT TTC TCA TTA ACA AAC TAT GGT GTA CAC TGG GTC

R Q A P G K G L E W V A V I W S G G S T

CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA GTG ATA TGG AGT GGT GGA AGC ACA

D Y N A A F I S R F T I S R D N S K N T

GAC TAT AAT GCA GCT TTC ATA TCC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG

L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A R

CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA

N R G Y D V Y F D Y W G Q G T L V T V S

AAT AGG GGG TAC GAC GTC TAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC CTT GTC ACA GTC TCG

S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S

TCG GCT AGC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT

G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V

GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG

S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S

TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC

S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q

TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG

T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E

ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG

P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G

CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG

G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T

GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC

P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N

CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC

W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y

TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC

N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G

AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC

K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I

AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC

S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D

TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT

E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D

GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC

I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P

ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC

V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R

GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG

W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y

TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC

T Q K S L S L S P G K

ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA

[0085]在一个实施方式中，以上描述的抗体进一步包含重链恒定区，其中所述重链恒定区包含γ1、γ2、γ3或γ4人类重链恒定区或其变体。在一个实施方式中，上述抗体进一步包含轻链恒定区，其中所述轻链恒定区包含lambda或kappa人类轻链恒定区。在某些实施方式中，这些抗体的结合片段是选自由Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)₂和双抗体(diabody)构成的组的抗体片段。

[0086]还提供的是一种结合IL-10的嵌合重组抗体分子或其结合片段，包含：至少一个抗体轻链可变区或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：1、CDR2的SEQ ID NO：2和CDR3的SEQID NO：3构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽；和至少一个抗体重链可变区或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：6、CDR2的SEQ ID NO：7和CDR3的SEQ ID NO：8构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽。

[0087]在特定的实施方式中，嵌合重组抗体分子具有SEQ IDNO：23中列出的轻链和SEQ ID NO：24中列出的重链。参见表8。编码12G8嵌合抗体轻链和重链的核酸保藏在ATCC，保藏号分别为PTA-5925和PTA-5924。

表8.嵌合12G8抗人类IL-10抗体的序列

SEQ ID NO：23轻链的氨基酸序列

SEQ ID NO：25轻链的核酸序列

-->信号序列

M A P V Q L L G L L V L F L P A M R C

ATG GCT CCA GTT CAA CTT TTA GGG CTT TTG GTG CTC TTC CTC CCA GCC ATG AGA TGT

成熟IgG

-->大鼠12G8轻链可变结构域

D I Q M T Q S P S L L S A S V G D R V T L N

GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCT TCA CTC CTG TCT GCA TCT GTG GGA GAC AGA GTC ACT CTC AAC

C K T S Q N I F E N L A W Y Q Q K L R E P P

TGC AAG ACA AGT CAG AAC ATT TTT GAG AAC TTG GCC TGG TAT CAG CAA AAG CTT AGA GAA CCT CCC

K L L I F N A S P L Q A G I P S R F S G S G

AAA CTC CTG ATT TTT AAT GCA AGC CCT TTG CAA GCG GGC ATC CCT TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA

S G T D F T L T I T S L Q P E D V A T Y F C

TCT GGT ACA GAT TTC ACA CTC ACC ATC ACC AGC CTG CAG CCT GAG GAT GTT GCC ACA TAT TTC TGC

-->人类

H Q Y Y S G Y T F G P G T K L E L K R T V A

恒定轻链结构域

A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V

C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q

S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S

T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q

G L S S P V T K S F N R G E C

GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAA

SEQ ID NO：24重链的氨基酸序列

SEQ ID NO：26重链的核酸序列

M D I R L S L V F L V L F M K D V Q C

ATG GAC ATC AGG CTC AGC TTG GTT TTC CTT GTC CTT TTT ATG AAA GAT GTC CAG TGT

成熟IgG

-->大鼠12G8可变重链结构域

E V Q L V E S G G G L V R P G G S L R L S C

GAG GTG CAG TTG GTG GAG TCT GGA GGA GGC TTG GTG CGG CCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT

T A S G F T F S D Y H M A W V R Q S P D K G

ACA GCC TCA GGA TTC ACT TTC AGT GAC TAT CAC ATG GCC TGG GTC CGC CAG TCT CCA GAC AAG GGT

L E W V A S I T L D A T Y T Y Y R D S V R G

CTG GAG TGG GTC GCA AGC ATT ACT CTT GAT GCT ACC TAC ACT TAC TAT CGC GAC TCC GTG AGG GGC

R F T I S R N N A K T T L Y L Q M D S L R S

CGA TTC ACC ATC TCC CGA AAT AAT GCA AAA ACC ACC CTT TAC CTG CAA ATG GAC AGT CTG AGG TCT

E D T A T F Y C T R H R G F S V W L D Y W G

GAG GAC ACG GCC ACT TTT TAC TGT ACA AGA CAT CGA GGC TTT AGC GTC TGG CTT GAT TAC TGG GGC

-->人类IgG1重链

Q G V M V T V S S A S T K G P S V F P L A P

CAA GGA GTC ATG GTC ACT GTC TCT TCA GCT AGC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC

S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E

TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA

P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L

Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q

T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K

S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V

F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V

V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V

GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG

H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L

T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L

P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T

[0088]在此进一步提供是一种结合IL-10的嵌合重组抗体分子或其结合片段，包含：至少一个抗体轻链或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：11、CDR2的SEQ ID NO：12和CDR3的SEQID NO：13构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽；和至少一个抗体重链或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：15、CDR2的SEQ ID NO：16和CDR3的SEQ ID NO：17构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽。

[0089]进一步提供的是编码以上公开的抗体的多肽的分离的核酸。在此还提供的是表达载体，包含与控制序列可操作连接的分离的核酸序列，所述控制序列由用所述载体转染的宿主细胞识别。在此提供的是包含所述载体的宿主细胞，所述载体包含所述分离的核酸序列。在此进一步提供的是生产多肽的方法，包括在表达所述核酸序列的条件下培养包含所述载体的宿主细胞，从而产生所述多肽，并从宿主细胞回收所述多肽。

[0090]在此提供的是编码特异于IL-10的抗体的分离的核酸序列，包含具有SEQ ID NO：19的核酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：20的核酸序列的重链。参见表4和5。

[0091]在此提供的是编码特异于IL-10的抗体的分离的核酸序列，包含具有SEQ ID NO：21的核酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：22的核酸序列的重链。参见表6和7。

[0092]在此进一步提供的是编码抗体的结合片段的分离的核酸序列，所述抗体由上述核酸序列编码。在一个实施方式中，所述结合片段是选自由Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)₂和双抗体构成的组的抗体片段。

[0093]在本发明的方法和组合物中双特异性抗体也是有用的。如在此使用的，术语“双特异性抗体”是指具有对至少两个不同的抗原表位的结合特异性的抗体，一般是单克隆抗体。在一个实施方式中，表位来自相同的抗原。在另一个实施方式中，表位来自两个不同的抗原。制造双特异性抗体的方法是本领域已知的。例如，可以利用共表达两个免疫球蛋白重链/轻链对来重组性地产生双特异性抗体。参见，例如，Milstein等，Nature 305：537-39(1983)。做为选择，可以利用化学连接来制备双特异性抗体。参见，例如，Brennan等，Science 229：81(1985)。双特异性抗体包括双特异性抗体片段。参见，例如，Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-48(1993)，Gruber等，J.Immunol.152：5368(1994)。

D.人源化抗IL-10抗体的生物学活性

[0094]可以根据体外的抑制性生物活性或适合的结合亲合性来筛选具有人源化抗IL-10抗体中期望的、在此鉴定的特征的抗体。为了筛选结合人类IL-10上的表位的抗体，所述表位被目标抗体结合(例如，阻断细胞因子与其受体结合的那些)，可以进行常规的交叉阻断(cross-blocking)分析，例如在ANTIBODIES，A LABORATORYMANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)中描述的。做为选择，可以进行表位作图，例如，Champe等，J.Biol.Chem.270：1388-1394(1995)中描述的，来确定抗体是否结合目标表位。可以使用标准的Scatchard分析来测定抗体亲合性(例如，对人类IL-10的亲合性)。优选的人源化抗体是以不超过约1×10^-7；优选的不超过约1×10^-8；更优选的不超过约1×10^-9；和最优选的不超过约2×10^-10的Kd值与人类IL-10结合的那些。

[0095]在当前组合物和方法中有用的抗体和其片段是生物学活性的抗体和片段。如在此使用的，术语“生物学活性的”是指能够结合期望的抗原表位并且直接或间接地发挥生物效应的抗体或抗体片段。一般地，这些效应由IL-10与其受体结合的失败所引起。如在此使用的，术语“特异性”是指抗体与目标抗原表位的选择性结合。可以通过在给定的条件组合的情况下比较与IL-10的结合和与不相关抗原或抗原混合物的结合，来检测抗体的结合特异性。如果抗体与IL-10的结合是与不相关抗原或抗原混合物的结合的至少10倍，优选的50倍，则它被认为是特异性的。

[0096]抑制性IL-10特异性抗体可以以任何方式抑制IL-10的生物学活性，包括但不限于IL-1、IFN-γ、PGE2、IL-12、TNF、CC和CXC趋化因子的产生，和MHC II类抗原、CD54、CD80和CD86的细胞表面表达。可以通过任何有用的方法来测定IL-10特异性抗体的生物活性。参见，例如，美国专利Nos：6,239,260和6,207,154。在一个实例中，使用鼠肥大细胞系MC9/2在细胞增殖分析中评定生物活性。参见Thompson-Snipes等，J.Exp.Med.173：507-10(1991)。IL-10刺激这个细胞系的增殖，因而可以通过其降低增殖的能力来鉴定抑制性抗体。MC9/2细胞系的增殖的ED₅₀一般是0.5-1.0ng/ml。相对于不存在抗体的情况下或存在非结合抗体的情况下细胞的增殖，如果抗体抑制细胞的增殖，则抗体对于增殖是抑制性的。可以使用任何适合的方法来测定增殖。一般地，通过评定放射性标记的核苷酸(例如，³H-胸腺嘧啶核苷)对DNA的掺入来测定增殖。在另一个实施方式中，通过ATP荧光来测定增殖。优选的，在当前组合物中有用的抗体抑制IL-10的生物活性的80％，更优选的95％，最优选的99％。

E.人源化抗IL-10抗体的使用

[0097]在此提供的是在人类受试者中抑制免疫反应的方法，包括以有效阻断IL-10的生物学活性的量向需要其的受试者施用特异于IL-10的抗体或其结合片段，其中所述抗体是结合IL-10的人源化重组抗体分子或其结合片段，包含：至少一个抗体轻链可变区或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：1、CDR2的SEQ ID NO：2和CDR3的SEQ ID NO：3构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽；和框架区，其中框架区的氨基酸序列全部或基本上全部是人类免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一个抗体重链可变区或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：6、CDR2的SEQ ID NO：7和CDR3的SEQ ID NO：8构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽；和框架区，其中框架区的氨基酸序列全部或基本上全部是人类免疫球蛋白氨基酸序列。

[0098]进一步提供的是在人类受试者中抑制免疫反应的方法，包括以有效阻断IL-10的生物学活性的量向需要其的受试者施用特异于IL-10的抗体或其结合片段，其中所述抗体是结合IL-10的人源化重组抗体分子或其结合片段，包含：至少一个抗体轻链或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：11、CDR2的SEQ ID NO：12和CDR3的SEQ ID NO：13构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽；和框架区，其中框架区的氨基酸序列全部或基本上全部是人类免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一个抗体重链或其结合片段，包含具有选自由CDR1的SEQ ID NO：15、CDR2的SEQ ID NO：16和CDR3的SEQID NO：17构成的组的至少一个氨基酸序列的多肽；和框架区，其中框架区的氨基酸序列全部或基本上全部是人类免疫球蛋白氨基酸序列。

[0100]通过这种方法抑制的免疫反应是体液的或细胞的反应。可以使用本领域公知的方法测定对体液和细胞反应的抑制。例如，在与高水平的自身反应性抗体相关的疾病中，例如，SLE，相对于治疗之前的血清水平，这些抗体的血清水平的减少是抑制体液反应的指示。同样地，可使用公知的体外分析来测定对细胞免疫反应的抑制，例如，增殖和细胞毒性化验或通过例如流动细胞计数分析来鉴定外周血淋巴细胞的活化表型。参见，CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY，最新的版本。在一个实施方式中，用这种方法治疗的受试者患有全身性红斑狼疮。在另一个实施方式中，所述受试者患有免疫性血小板减少性紫癜(ITC)。在又一个实施方式中，所述受试者患有狼疮肾炎。在进一步的实施方式中，所述受试者患有HIV。在另一个实施方式中，所述受试者患有肝炎C。

[0101]在此提供的是一种组合物，包含抗体或其结合片段，与药学可接受的载体或稀释剂组合，其中所述抗体是在此公开的抗体之一。

[0102]可从IL-10特异性抗体的治疗受益的任何受试者都可以使用在此提供的组合物和方法进行治疗。任何受试者都可以用在此提供的方法和组合物进行治疗。这样的受试者是患有自身免疫性疾病或症状或病原体诱导的免疫病理的哺乳动物，优选的是人类。在一个特定的实施方式中，受试者患有SLE、狼疮肾炎、类风湿性关节炎、ITC、HIV或肝炎C。公开的方法和组合物的兽医学用途也是预期的。

[0103]如在此使用的，“抑制”或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”包括延缓与自身免疫性疾病或病原体诱导的免疫病理有关的症状的发展和/或降低将要或预期会发展的这种症状的严重程度。这些术语进一步包括改善现有的不受控制或不需要的自体免疫相关的或病原体诱导的免疫病理症状，预防其他的症状，和改善或预防这种症状的根本原因。因而，这些术语表示已经赋予脊椎动物受试者有益结果，所述受试者患有自体免疫或病原体诱导的免疫病理疾病或症状，或有发展出这种疾病或症状的可能性。

[0104]如在此使用的，术语“治疗有效量”或“有效量”是指IL-10特异性抗体的数量，当单独地或与其他治疗剂组合地向细胞、组织或受试者施用时，对于预防或改善与自身免疫性疾病或病原体诱导的免疫病理相关的疾病或状况，或疾病的发展是有效的。治疗有效剂量进一步是指足以引起症状的改善的化合物的数量，例如，相关医学状况的治疗、治愈、预防或改善，或这种状况的治疗、治愈、预防或改善的比例方面的提高。当应用于单独施用的单个活性成分时，治疗有效剂量单指该成分。当应用于组合时，治疗有效剂量是指产生治疗效果的活性成分的组合的量，无论是组合、顺序还是同时地施用的。

[0105]在当前方法中有用的抗体(从任何来源衍生的，无限制地包括来自重组和非重组的来源)可以单独施用给需要的受试者，或在药物组合物中施用，在所述药物组合物中抗体与一定剂量的适合的载体或赋形剂混合，来治疗或改善各种失调。这种组合物也可以含有(除蛋白质和载体之外)稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂和其他本领域公知的材料。术语“药学上可接受的”意思指不干扰活性成分的生物学活性的有效性的无毒材料。载体的特征取决于施用途径。

[0106]本发明的药物组合物也可以含有其他免疫抑制试剂或免疫调节试剂。可以使用任何适合的免疫抑制试剂，包括但不限于抗炎剂、皮质类固醇类、环孢霉素、他克莫司(即，FK-506)、西罗莫司、干扰素、可溶细胞因子受体(例如，sTNRF和sIL-lR)、中和细胞因子活性的试剂(例如，英夫单抗、etanercept)、霉酚酸莫非替克、15-deoxyspergualin、酞胺哌啶酮、拉格太咪尔、咪唑硫嘌呤、来氟洛米、环磷酰胺、氨甲蝶呤，等等。药物组合物也可以采用其他治疗形式，例如光线疗法和放射疗法。

[0107]在另一个实施方式中，提供了试剂盒，其含有进行在此提供的方法的化验所必需的试剂。在此特别提供的是分室试剂盒，包括一个或多个容器，其中第一容器包含一种或多种特异于IL-10的抗体，一个或多个其他容器包含一种或多种以下试剂：重构试剂，施用试剂。所述容器可以是玻璃的、塑料的、或塑料或纸的试片(strips)。在一个实施方式中，试剂盒还含有书面指导。

[0108]在实施在此提供的治疗方法或用途时，在此提供的治疗有效量的抗体被施用给具有适合于用IL-10治疗的状况的哺乳动物。所述抗体可以根据在此提供的方法单独施用，或与其他治疗组合施用，例如，采用其他免疫调节因子(例如，细胞因子)、免疫抑制制剂等的治疗。当与一种或多种生物活性试剂共施用时，在此提供的抗体可以与生物活性试剂同时地或顺序地施用。如果顺序地施用，主治医师将决定与生物活性试剂组合施用本发明的蛋白质的合适顺序。

[0109]单独地或与其他免疫抑制试剂组合施用的抗体组合物的毒性和治疗效能可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来测定，例如，测定LD₅₀(对群体的50％的致死剂量)和ED₅₀(在群体的50％中治疗有效的剂量)。在有毒和治疗效果之间的剂量比例是治疗指数，它可以被表示为LD₅₀和ED₅₀之间的比例。展现出高治疗指数的抗体是优选的。从这些细胞培养分析和动物研究获得的数据可被用于配制用于人类的剂量范围。这种化合物的剂量优选地处在包括很小或没有毒性的ED₅₀的循环浓度范围内。取决于采用的剂型和使用的给药途径，剂量可以在这个范围内变动。

[0110]配制和施用本方法的抗体的技术可以在REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.最新的版本中找到。施用的方式不是特别重要的。适合的施用途径可包括例如，口的、直肠的、穿粘膜的或肠的施用；胃肠外的递送，包括肌肉内的、皮下的、髓内的注射，以及鞘内的、直接心室内的、静脉内的、腹膜内的、鼻内的或眼球内注射。用于药物组合物或用于实践本发明的方法的抗体施用可以以各种常规途径进行，例如，口服摄取、吸入、局部施用或皮肤的、皮下的、腹膜内的、胃肠外的、动脉内的或静脉内的注射。对患者静脉内施用是优选的。

[0111]替换性地，可以以局部而不是全身性方式施用抗体，例如通过将所述抗体直接注射到关节炎的关节或病原体诱导的以免疫病理为特征的病灶，通常以储库或持续释放制剂的形式。此外，可以在靶向药物递送系统中施用抗体，例如在包被有组织特异性抗体的脂质体中，靶向例如关节炎的关节或病原体诱导的以免疫病理为特征的病灶。所述脂质体靶向患病组织并被患病组织选择性地吸收。

[0112]因而根据当前方法使用的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的载体按常规的方式来配制，所述载体包括便于将活性化合物加工成可以药学上使用的制品的赋形剂和辅助剂。这些药物组合物可以按照本身已知的方式，例如，通过常规的混合、溶解、粒化、制成糖衣、研磨、乳化、密封、包埋或冻干过程来制造。适当的配方取决于选择的给药途径。当以液体形式施用时，可以添加液体载体，例如水、石油、动物或植物来源的油，例如花生油、矿物油、豆油、或芝麻油、或合成油。药物组合物的液体形式可以进一步含有生理盐溶液、葡萄糖或其他糖类溶液，或二醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式施用时，药物组合物含有按重量计约0.5到90％的本发明的蛋白质，和优选的约1到50％的本发明的蛋白质。

[0113]当通过静脉注射、皮肤或皮下注射施用治疗有效量的此处的方法的抗体时，本发明的蛋白质将处于无热原的、胃肠外可接受的水溶液的形式。制备这种胃肠外可接受的蛋白质溶液，适当考虑pH、等渗性、稳定性等，在本领域技术人员的能力范围内。用于静脉注射、皮肤或皮下注射的优选的药物组合物，除本发明的蛋白质之外应含有等渗赋形剂，例如氯化钠注射液、Ringer′s注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、Lactated Ringer′s注射液或本领域已知的其他赋形剂。本发明的药物组合物也可含有稳定剂、防腐剂、缓冲液、抗氧化剂或其他本领域技术人员已知的添加物。为了注射，可将本发明的药剂配制在水溶液中，优选的在生理学相容的缓冲液例如Hanks′溶液、Ringer′s溶液或生理盐水缓冲液中。对于穿粘膜施用，将适合于需透过的障碍物的渗透剂用在配方中。这种渗透剂是本领域公知的。

[0114]对于吸入施用，使用适合的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体，以气溶胶喷雾呈现的形式从加压的包装物或喷雾器方便地递送用于根据当前方法使用的抗体。对于加压的气雾剂来说，剂量单位可以通过提供一阀来递送计量的数量来确定。例如，在吸入器或吹入器中使用的明胶的药囊和药筒可以配制为含有化合物和适当的粉末基剂，例如乳糖或淀粉的粉末混合物。所述化合物可以配制为通过注射用于肠胃外施用，例如，通过弹丸注射或连续的输注。用于注射的制剂可以单位剂型存在，例如，在带有添加的防腐剂的安瓿瓶或多剂量容器中。组合物可以采用在油或水赋形剂中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，可以含有配方试剂，例如悬浮、稳定和/或分散试剂。

[0115]用于肠胃外施用的药物制剂包括水可溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以视情况制备为油性注射悬浮液。适合的亲油性溶剂或赋形剂包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬浮液可以含有提高悬浮液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠盐、山梨醇或葡聚糖。任选的，悬浮液也可以含有适合的稳定剂或提高化合物的溶解性以允许制备高浓度溶液的试剂。做为选择，活性成分可以是粉未形式用于在使用前与适合的赋形剂，例如，无菌的无热原水构制。

[0116]在本发明的药物组合物中在公开的方法中有用的抗体的数量将取决于待治疗的状况的性质和严重程度，并取决于患者已经经历的在先治疗的性质。最后，主治医师将决定治疗每个单独的患者所用的本发明的蛋白质的数量。预期的是，剂量将根据单个患者的年龄、体重和反应而变化。起初，主治医师将施用低剂量的当前方法的抗体，并观察患者的反应。可以给患者施用更大剂量的本发明的抗体直到获得最佳的治疗效果，在这个时候不再进一步提高剂量。期待的是，用于实践此处的方法的各种药物组合物应含有每kg体重约0.01μg到约100mg(优选的约0.1μg到约10mg，更优选的约0.1μg到约1mg)的本发明的抗体。当施用时，用于本发明的治疗组合物理所当然地是无热原的、生理学可接受的形式。除了当前方法的抗体之外也可任选地包括在如上所述的组合物中的治疗有用的试剂，可以替换性地或附加地与本发明的方法中的组合物同时地或顺序地施用。可以由独立的医师根据患者的状况选择确切的制剂、给药途径和剂量。参见，例如，Fingl等，THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS(最新版本)。可以分别调整剂量数量和间隔以提供足以维持期望的治疗效果的活性部分的血浆水平、或最小有效浓度(MEC)。对于每种化合物MEC将变化，但可以根据体外数据估计；例如，使用在此描述的化验达到50-90％生物活性抑制作用所必需的浓度。

[0117]在此提供的抗体可以单独地或与其他治疗形式组合施用。在此提供的抗体也可以单独地或与鉴定为IL-10活性的抑制物的其他抗体或其他免疫抑制试剂组合施用。

[0118]涉及自身免疫的任何疾病都可以用当前方法治疗。优选的，可用IL-10特异性抗体治疗的自体免疫疾病的特征在于异常的IL-10表达水平和/或缺乏适合的细胞，即，Th1介导的，反应。这种疾病包括，但不限于，全身性红斑狼疮(SLE)、免疫性血小板减少性紫癜(ITC)、狼疮肾炎、糖尿病、胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、类风湿性关节炎(RA)。

[0119]涉及病原体诱导的免疫病理的任何疾病都可以用当前的方法治疗。优选的，可用IL-10特异性抗体治疗的病原体诱导的免疫病理的特征在于异常的IL-10表达水平和/或缺乏适合的细胞，即，Th1介导的，反应。这种疾病包括，但不限于，HIV、肝炎C、内脏利什曼病(visceral leishmaniasis)、疟疾、丝虫病、麻疯病、肺结核、念珠菌病和M.avium感染。

[0120]参考以下实施例最好地了解本发明的宽阔范围，其不意味着将本发明限制到特定的实施方式。

F.实施例

实施例I.一般方法

[0121]描述或参考了一些标准方法，例如，Maniatis等(1982)MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press；Sambrook等(1989)MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，(2d ed.)，vols.1-3，CSH Press，NY；Ausubel等，BIOLOGY，Greene PublishingAssociates，Brooklyn，NY；或Ausubel等(1987和增刊)CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene/Wiley，NewYork。蛋白质纯化方法包括这样的方法，如硫酸铵沉淀、柱层析、电泳、离心、结晶，等。参见，例如，Ausubel等(1987和定期的增刊)；Deutscher(1990)″Guide to Protein Purification″in METH.ENZYMOL.，vol.182，和这套丛书中的其他卷；和关于蛋白质纯化产品的使用的厂家资料，例如Pharmacia、Piscataway、N.J.或Bio-Rad，Richmond，CA。结合重组技术容许与合适的片段融合，例如FLAG序列或同等物，其可以通过蛋白酶可除去序列融合。参见，例如，Hochuli(1990)″Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent″in Setlow(ed.)GENETIC ENGINEERING，PRINCIPLE ANDMETHODS 12：87-98，Plenum Press，N.Y.；和Crowe等(1992)QIAEXPRESS：THE HIGH LEVEL EXPRESSION & PROTEINPURIFICATION SYSTEM，Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA。

[0122]进行计算机序列分析，例如，使用可用的软件程序，包括来自GCG(U.Wisconsin)和GenBank来源的那些。还使用了公众的序列数据库，例如来自GenBank等的。

实施例II.抗人类IL-10抗体的人源化

[0123]如以上小节C中描述的进行大鼠抗人类IL-10抗体12G8的人源化。附图1显示了分配残基编号和为与检查的种系序列相同的残基位置分配相应的数字分值。显示了对12G8抗人类IL-10抗体的轻链(附图1A)和重链(附图1B)的12G8可变区，和对11D8抗人类IL-10抗体的轻链(附图1C)和重链(附图1D)的可变区进行的计算。

实施例III.抗人类IL-10抗体12G8的药物动力学

[0124]目的：在鼠模型中获得对12F8抗体的体内终末半衰期和皮下生物利用率的估计。

[0125]抗体：在10mM醋酸钠、8％蔗糖、pH 5.25的赋形剂中施用抗体。

[0126]小鼠：Crl:CD-

(ICR)BR雌性小鼠购自Charles RiverLaboratories。

[0127]实验设计：小鼠接受静脉内(i.v.侧面尾静脉)或皮下(s.c.颈背部或肩胛中或体侧)单次抗体弹丸注射。抗体剂量包括0.03、0.3、3.0和30mg/kg每小鼠。观察小鼠直到注射后28天。在这个时间周期期间，对小鼠称重并采取血清样品。对于12G8(SCH 708980)组(组1-8)，在注射后0.5、1、3、6、10、16小时，第1、2、3、5、7、10、14、21和28天，用5只小鼠/时点，采取血清样品。在赋形剂组(组9)中，仅在注射前、注射后1小时、14天或21天使用5小鼠/时点采取血清样品。使用特异性ELISA测定血清IL-10水平和血清12G8抗体水平。

[0128]药物动力学参数测定.使用WinNonlin Pro v4.0估计或计算所有参数。对于非分区分析，使用Model 200(SC)或Model 201(IV)。输入数据是剂量标准化的组算术平均浓度-时间数据。对于组2-4和6-8，输入剂量是标称剂量。对于组1和5，输入剂量是0.014mg/kg。对于分区分析，使用Model 3(SC)或Model 7(IV)。输入数据是剂量标准化的单个动物浓度-时间数据。所有匹配对各数据点使用均一的权重(wt＝1)。对于组2-4和6-8，输入剂量是标称剂量。对于组1和5，输入剂量是0.014mg/kg。使用目测检查评估好的匹配，对估计的/计算的参数、留数和AIC & SBC指标进行SE的比较。

在下表中显示了给药溶液回收的概述。

表9.体重、剂量水平、给药溶液浓度的概述(平均值±SD)

组	途径	体重(g)	标称剂量水平<sup>B</sup>(mg/kg)	实际剂量水平(mg/kg)	标称给药溶液浓度<sup>D</sup>(mg/mL)	实际给药溶液浓度(mg/mL)	实际剂量占标称剂量的％
组	途径	体重(g)	标称剂量水平<sup>B</sup>(mg/kg)	实际剂量水平(mg/kg)	标称给药溶液浓度<sup>D</sup>(mg/mL)	实际给药溶液浓度(mg/mL)	实际剂量占标称剂量的％	1	IV	28.2±2.61	0.03	11.4±1.02	～0.0075	0.0032	38.0
2	IV	29.7±2.83	0.3	251±23.4	～0.075	0.074	83.7	1	IV	28.2±2.61	0.03	11.4±1.02	～0.0075	0.0032	38.0
2	IV	29.7±2.83	0.3	251±23.4	～0.075	0.074	83.7	3	IV	24.5±2.00	3.0	3410±268	～0.75	0.83	114
4	IV	30.0±3.38	30.0	28300±3040	Min 7.5	8.40	94.3	3	IV	24.5±2.00	3.0	3410±268	～0.75	0.83	114
4	IV	30.0±3.38	30.0	28300±3040	Min 7.5	8.40	94.3	5	SC	28.4±2.38	0.03	11.4±0.954	～0.0075	0.0032	38.0
6	SC	29.9±2.87	0.3	250±23.1	～0.075	0.074	83.3	5	SC	28.4±2.38	0.03	11.4±0.954	～0.0075	0.0032	38.0
6	SC	29.9±2.87	0.3	250±23.1	～0.075	0.074	83.3	7	SC	24.7±1.95	3.0	3380±263	～0.75	0.83	113
8	SC	29.7±2.61	30.0	28500±248	Min 7.5	8.4	95.0	7	SC	24.7±1.95	3.0	3380±263	～0.75	0.83	113

[0129]以下显示的表格概述了来自通过i.v.注射接受了12G8抗体的组的数据。

表10.IV丸剂给药组的非分区方法参数

表11.IV丸剂给药组的分区方法参数

[0130]以下显示的表格概述了来自通过s.c.注射接受了12F8抗体的组的数据。

表12.SC丸剂给药组的非分区方法参数

^＊由于低估了IV AUC，生物利用率可能是高的。

表13.SC丸剂给药组的分区方法参数

[0131]在图2中显示了使用各种剂量和途径的12F8抗体的浓度时间分布。

[0132]结论：对于除最低剂量水平以外的所有组，剂量都在标称的20％以内。低于预期浓度大概是由于抗SCH708980(人源化12G8)抗体的存在，可以在组7或8中注射后10天观察到。(A)IV丸剂药物动力学。半衰期、清除率和分布容积对于其他IgG1单克隆抗体所见的都是典型的。分布容积近似相等于血清容积或稍大于血清容积，表明极小的血管外的分布。终末半衰期在10到17天的范围。AUC的升高一般与剂量成比例，表明在测验的剂量范围上的线性PK。(B)SC 丸剂药物动力学。最大浓度一般是与剂量成比例的，在给药后1-2天达到，表明在测验的剂量范围上一致的吸收速率和幅度。AUC的升高一般与剂量成比例，表明线性PK。终末消除半衰期范围在8-14天，类似于其他IgG1单克隆抗体。绝对生物利用率很高，范围＝70-100％，尽管由于低估了IV AUC，估计值＞90％可能是高的。

实施例IV.使用KinExA技术对人源化抗人类IL-10抗体SCH 708980 (12G8)测定平衡解离常数(Kd)

[0133]使用KinExA 3000(Sapidyne Instruments Inc.)测定人源化抗体SCH 708980的平衡解离常数(Kd)。KinExA根据测量抗体、抗原和抗体-抗原复合物的混合物中未复合的抗体的浓度，使用了动力学排阻分析(Kinetic Exclusion Assay)方法的原则。通过将混合物暴露到固相固定化的抗原中很短的时间，来测量游离抗体的浓度。实际上，这是通过使液相抗原-抗体混合物流经抗原包被的粒子来实现的，所述粒子被捕获在流动细胞中。使用常规软件分析从仪器产生的数据。根据以下假定使用数学理论计算平衡常数：

1.结合遵循平衡的可逆结合方程式：

K_on[Ab][Ag]＝K_off[AbAg]

2.抗体和抗原1∶1结合，总抗体等于抗原抗体复合物加上游离抗体

3.仪器信号与游离抗体浓度线性相关。

[0134]使用的材料：针对重组人类IL-10的单克隆的人源化抗体SCH 708980(h12G8)；重组人类IL-10(hIL-10)；重组小鼠IL-10(mIL-10)，重组犬IL-10(犬IL-10)；PMMA粒子，98微米(Sapidyne，Cat No.440198)；Neutravidin(Pierce，Cat No.31000)；EZ-link TFPPEO-Biotin(Pierce，Cat No.21219)；生物素化的rhIL-10；和Cy5结合的山羊抗HuIgG(H+L)(Jackson Immunoresearch LaboratoriesCat.No 109-175-088，lot 49069)。

[0135]PMMA粒子根据厂家的方案用生物素化的rhIL5包被。对于rhIL5的生物素化，根据厂家的推荐(Pierce bulletin 0874)使用EZ-link TFP PEO-Biotin。所有实验步骤根据KinExA 3000手册进行。

[0136]实验条件：所有的都一式两份地进行。对于hIL-10，使用以下条件：

样品体积：1.5ml

样品流速：0.25ml/min

标记物体积：0.5ml

标记物流速：0.25ml/min

mAb浓度：0.1nM

最高Ag(hIL-10)浓度：4.0nM

最低Ag(hIL-10)浓度：3.91pM

[0137]制备抗原的两倍连续稀释物，并与恒定浓度的抗体混合。将混合物在室温下(RT)孵化2小时以达到平衡。

[0138]对于mIL-10，使用以下条件：

样品体积：0.5ml

样品流速：0.25ml/min

标记物体积：0.5ml

标记物流速：0.25ml/min

mAb浓度：1nM

最高Ag(mIL-10)浓度：50nM

最低Ag(mIL-10)浓度：48.8pM

[0139]制备抗原的两倍连续稀释物，并与恒定浓度的抗体混合。将混合物在RT孵化2小时以达到平衡。

[0140]对于犬IL-10，使用以下条件：

样品体积：2ml

样品流速：0.25ml/min

标记物体积：1ml

标记物流速：0.25ml/min

mAb浓度：0.1nM

最高Ag(mIL-10)浓度：5.0nM

最低Ag(mIL-10)浓度：4.88pM

[0141]制备抗原的两倍连续稀释物，并与恒定浓度的抗体混合。将混合物在RT孵化2小时以达到平衡。

[0142]结果在下表中示出。

表14.使用KinExA技术的12F8抗体平衡解离常数(Kd)

抗原	抗原单体M.W.(kDa)	抗体	Kd(标准)	误差(％)
抗原	抗原单体M.W.(kDa)	抗体	Kd(标准)	误差(％)	hIL-10#1	19.5	hz x hIL-10mAb12G8-1	2.738e-11	2.18％
hIL-10#2	19.5	hz x hIL-10mAb12G8，SCH708980	3.232e-11	4.4％	hIL-10#1	19.5	hz x hIL-10mAb12G8-1	2.738e-11	2.18％
hIL-10#2	19.5	hz x hIL-10mAb12G8，SCH708980	3.232e-11	4.4％	hIL-10#3	19.5	hz x hIL-10mAb12G8，SCH708980	1.553e-11	3.7％
mIL-10#1	19.5	hz x hIL-10mAb12G8-1	2.82e-10	1.42％	hIL-10#3	19.5	hz x hIL-10mAb12G8，SCH708980	1.553e-11	3.7％
mIL-10#1	19.5	hz x hIL-10mAb12G8-1	2.82e-10	1.42％	mIL-10#2	19.5	hz x hIL-10mAb12G8，SCH708980	2.673e-10	1.65％
mIL-10#3	19.5	hz x hIL-10mAb12G8，SCH708980	3.078e-10	1.97％	mIL-10#2	19.5	hz x hIL-10mAb12G8，SCH708980	2.673e-10	1.65％
mIL-10#3	19.5	hz x hIL-10mAb12G8，SCH708980	3.078e-10	1.97％	Cyno IL-10#1	19.5	hz x hIL-10mAb12G8-1	3.97e-11	1.93％
Cyno IL-10#2	19.5	hz x hIL-10mAb12G8，SCH708980	9.657e-11	1.37％	Cyno IL-10#1	19.5	hz x hIL-10mAb12G8-1	3.97e-11	1.93％
Cyno IL-10#2	19.5	hz x hIL-10mAb12G8，SCH708980	9.657e-11	1.37％	Cyno IL-10#3	19.5	hz x hIL-10mAb12G8，SCH708980	9.245e-11	3.5％

实施例V.应用竞争性电化学发光化验(ECLA)来测量抗hIL-10单克隆抗体和hIL-10-Ra与不同来源的重组IL-10的结合。

[0143]技术概述.电化学发光技术是由IGEN，Inc(Gaithersburg，MD)开发的，被应用在用于这个工作的M系列M8/384分析仪中。电化学发光技术使用了稳定的钌金属螯合物(Ori-TAG)，在存在三丙胺(TPA)的情况下，其在施加电压时产生电化学发光。顺磁性的球珠，直径为数微米，充当固相并且便于快速的分析动力学。球珠/复合物引导经过流动细胞，通过施加磁性被俘获在电极上。施加电压，测量产生的电化学发光。

[0144]使用的材料.96孔聚丙烯平板(Costar，Cat.No.3365，Fisher Sci.Cat.No.07200697)；0.1％ BSA、0.05％吐温20、PBS pH 7.5的化验缓冲液；顺磁性的球珠(Streptavidin-Dynabeads，Igen，Inc.，Cat.No.110029)；重组人类IL-10二聚物(hIL-10-dimer)；重组人类IL-10单体(hIL-10-mono)；重组小鼠IL-10(mIL-10)；重组犬IL-10(cynoIL-10)；和重组hIL-10Ra(hIL-10Ra)：FLAG-标记的蛋白质。根据厂家的方案使用Ori-Tag-NHS酯(Igen，Inc.Cat.No.110034)制备Ori-Tag标记的抗FLAG M2单克隆抗体(OriTag标记物∶IgG攻击比例8∶1)。抗Flag M2单克隆抗体购自Sigma(Cat.No.F3165)。使用大鼠抗hIgG单克隆抗体如上制备Ori-Tag标记的抗hIgG 1A2单克隆抗体。从多克隆山羊抗大鼠IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoresearchLaboratories，Inc.PA，Cat.No.112-005-143)如上制备Ori-Tag标记的抗大鼠IgG抗体。根据厂家的推荐(Pierce bulletin 0874)使用TFP-PEO-生物素(Pierce，Cat.No.21219)制备生物素化的重组人类IL-10(hIL-10-生物素)。如在此描述的制备大鼠抗hIL-10 mAb 12G8(r12G8)：JES3.12G8和人源化抗hIL-10 mAb 12G8(h12G8-1)。

[0145]方案.对所有未标记的IL-10制品(mIL-10、犬IL-10、hIL-10二聚物、hIL-10单体)在96孔微量滴定板中进行50微升化验缓冲液的1/3连续稀释，从第一孔的3μg/ml开始。所有样品进行一式两份。将25ng/ml的50μl hIL-10-生物素添加到每个孔中，随后添加hIL-10Ra(100ng/ml 50μl)或抗hIL-10mAb(10ng/ml 50μl)。向每个孔中以500ng/ml的浓度添加50微升Ori-Tag结合的第二抗体。对于hIL-10Ra、r12G8和h12G8，相应地使用以下的Ori-Tag结合物：抗FLAG M2-OriTag、抗大鼠IgG-OriTag和抗hIgG 1A2-OriTag。最后，向每个孔添加50μl 0.1mg/ml的链霉抗生物素-Dynabeads。在室温下孵化一小时以后，用M系列M8/384分析仪处理平板。相对于对照样品，计算未标记IL-10制品的信号的抑制百分比。为了标绘数据和计算IC₅₀，使用GraphPad Prism软件。

[0146]结果在下表中示出。

表15.使用ELCA测定结合亲合性

抗原	抗原单体M.W.(kDa)	抗体/受体	IC<sub>50</sub>(nM)	SD
抗原	抗原单体M.W.(kDa)	抗体/受体	IC<sub>50</sub>(nM)	SD	mIL-10	19.5	RatxhIL-10mAbJES3.12G8	37.9	17.8
Cyno IL-10	19.5	RatxhIL-10mAbJES3.12G8	6.6	1.5	mIL-10	19.5	RatxhIL-10mAbJES3.12G8	37.9	17.8
Cyno IL-10	19.5	RatxhIL-10mAbJES3.12G8	6.6	1.5	hIL-10(二聚体)	19.5	RatxhIL-10mAbJES3.12G8	4.7	0.8
hIL-10(单体)	19.5	RatxhIL-10mAbJES3.12G8	7.1	0.6	hIL-10(二聚体)	19.5	RatxhIL-10mAbJES3.12G8	4.7	0.8
hIL-10(单体)	19.5	RatxhIL-10mAbJES3.12G8	7.1	0.6	mlL-10	19.5	hzxhIL-10mAb12G8-1	53.0	8.2
Cyno IL-10	19.5	hzxhIL-10mAb12G8-1	4.9	0.9	mlL-10	19.5	hzxhIL-10mAb12G8-1	53.0	8.2
Cyno IL-10	19.5	hzxhIL-10mAb12G8-1	4.9	0.9	hIL-10(二聚体)	19.5	hzxhIL-10mAb12G8-1	4.0	0.5
hIL-10(单体)	19.5	hzxhIL-10mAb12G8-1	5.8	1.0	hIL-10(二聚体)	19.5	hzxhIL-10mAb12G8-1	4.0	0.5
hIL-10(单体)	19.5	hzxhIL-10mAb12G8-1	5.8	1.0	mIL-10	19.5	huIL-10Ra	未结合	-
Cyno IL-10	19.5	huIL-10Ra	17.6	7.0	mIL-10	19.5	huIL-10Ra	未结合	-
Cyno IL-10	19.5	huIL-10Ra	17.6	7.0	hIL-10(二聚体)	19.5	huIL-10Ra	2.9	0.4
hIL-10(单体)	19.5	huIL-10Ra	7.2	1.1	hIL-10(二聚体)	19.5	huIL-10Ra	2.9	0.4

[0147]在下表中概述大鼠12G8抗体和人源化12G8抗体(SCH708980)的表征的结果。

表16

大鼠12G8

SCH708980(hu12G8)

实施例VI.人源化抗人类IL-10抗体的体内中和效果

[0148]在小鼠Leishnaania major模型中中评估SCH 708980和JES.12G8的体内中和效力。在这个模型中，通常对寄生虫感染有抗性的CB6F1小鼠通过MHC II类启动子控制下的人类IL-10转基因的杂合来变为易感的。在用15×10⁶静止期L.major寄生虫进行s.c.爪垫攻击之前的3天，开始每周地用SCH 708980或JES.12G8s.c.注射CB6F1或CB6F1-huIL-10Tg小鼠。通过每周测量爪垫肿胀来监控疾病发展。附图3显示了SCH708980(人源化12G8)和亲本大鼠12G8都以剂量依赖性的方式中和了IL-10的保护效应。

[0149]可以进行对本发明的许多修改和变化而不背离它的精神和范围，这对于本领域的技术人员是显而易见的。在此描述的特定实施方式仅以举例的方式来提供，本发明将由附随的权利要求的条目与该权利要求所享有的等同物的完整范围一起来限制；本发明不被特定的实施方式限制，所述实施方式通过举例的方式呈现于此。

[0150]对上述出版物或文件的引述不意味着认可任何上述的内容是相关的先有技术，其也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何认可。在此引用的美国专利和其他出版物通过引用合并在此。

序列表

<110>Schering Corporation

<120>白细胞介素-10抗体

<130>DX06061-RFD

<150>US 60/518,999

<151>2003-11-10

<160>26

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>11

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>1

Lys Thr Ser Gln Asn Ile Phe Glu Asn Leu Ala

1 5 10

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>2

Asn Ala Ser Pro Leu Gln Ala

1 5

<210>3

<211>8

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>3

His Gln Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr

1 5

<210>4

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asn Ile Phe Glu Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Ser Pro Leu Gln Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr

100 105

<210>5

<211>213

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asn Ile Phe Glu Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Ser Pro Leu Gln Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>6

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr His Met Ala

1 5 10

<210>7

<211>17

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>7

Ser Ile Thr Leu Asp Ala Thr Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Arg

1 5 10 15

Gly

<210>8

<211>10

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>8

His Arg Gly Phe Ser Val Trp Leu Asp Tyr

1 5 10

<210>9

<211>119

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>9

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

His Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Thr Leu Asp Ala Thr Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Arg Gly Phe Ser Val Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>10

<211>449

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>10

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

His Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Thr Leu Asp Ala Thr Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Arg Gly Phe Ser Val Trp Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210>11

<211>15

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>11

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr Gly His Ser Phe Met His

1 5 10 15

<210>12

<211>7

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>12

Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser

1 5

<210>13

<211>9

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>13

Gln Gln Gly Asn Glu Asp Pro Trp Thr

1 5

<210>14

<211>218

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>14

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr

20 25 30

Gly His Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210>15

<211>10

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>15

Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His

1 5 10

<210>16

<211>16

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>16

Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser

1 5 10 15

<210>17

<211>10

<212>PRT

<213>Rattus norVegicus

<400>17

Asn Arg Gly Tyr Asp Val Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210>18

<211>448

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>18

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile

50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asn Arg Gly Tyr Asp Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210>19

<211>639

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>19

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgca agacaagtca gaacattttt gagaacttgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctataat gcaagccctt tgcaagcggg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaccag tattatagcg ggtacacgtt tggacctggg 300

accaagctgg aactgaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360

gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420

agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480

agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540

agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600

agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt 639

<210>20

<211>1347

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>20

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactatcata tggcctgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcaagc attactcttg atgctaccta cacttactat 180

cgcgactccg tgcgcggccg cttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagacatcga 300

ggctttagcg tctggcttga ttactggggc caaggcaccc tggtcaccgt ctcgtcggct 360

agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347

<210>21

<211>654

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>21

gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gagccagtga aagtgttgat gattatggcc atagttttat gcactggtac 120

cagcagaaac ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatc gtgcatccac cctagaatct 180

ggcatcccag acaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc 240

agactggagc ctgaagattt tgcagtgtat tactgtcagc aaggtaatga ggatccgtgg 300

acgttcggtc aaggtaccaa ggtggaaatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654

<210>22

<211>1344

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>22

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggttt ctcattaaca aactatggtg tacactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtg atatggagtg gtggaagcac agactataat 180

gcagctttca tatcccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 240

caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aaataggggg 300

tacgacgtct actttgacta ctggggccaa ggcacccttg tcacagtctc gtcggctagc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320

agcctctccc tgtctccggg taaa 1344

<210>23

<211>232

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>嵌合12G8

<400>23

Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Phe Leu Pro Ala

1 5 10 15

Met Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Thr Ser Gln Asn Ile

35 40 45

Phe Glu Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Arg Glu Pro Pro Lys

50 55 60

Leu Leu Ile Phe Asn Ala Ser Pro Leu Gln Ala Gly Ile Pro Ser Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser

85 90 95

Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Tyr Tyr Ser

100 105 110

Gly Tyr Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210>24

<211>371

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>嵌合12G8

<400>24

Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Phe Met Lys Asp

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Asp Tyr His Met Ala Trp Val Arg Gln Ser Pro Asp Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Leu Asp Ala Thr Tyr Thr Tyr Tyr Arg

65 70 75 80

Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Ash Ala Lys Thr

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Phe Tyr Cys Thr Arg His Arg Gly Phe Ser Val Trp Leu Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys ASn Val Asn

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr

370

<210>25

<211>699

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>嵌合12G8

<400>25

atggctccag ttcaactttt agggcttttg gtgctcttcc tcccagccat gagatgtgac 60

atccagatga cccagtctcc ttcactcctg tctgcatctg tgggagacag agtcactctc 120

aactgcaaga caagtcagaa catttttgag aacttggcct ggtatcagca aaagcttaga 180

gaacctccca aactcctgat ttttaatgca agccctttgc aagcgggcat cccttcaagg 240

ttcagtggca gtggatctgg tacagatttc acactcacca tcaccagcct gcagcctgag 300

gatgttgcca catatttctg ccaccagtat tatagcgggt acacgtttgg acctgggacc 360

aagctggaac tgaaacgtac ggtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 420

gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga 480

gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt 540

gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc 600

aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc 660

tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttaa 699

<210>26

<211>1113

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>嵌合12G8

<400>26

atggacatca ggctcagctt ggttttcctt gtccttttta tgaaagatgt ccagtgtgag 60

gtgcagttgg tggagtctgg aggaggcttg gtgcggcctg gagggtccct gagactctcc 120

tgtacagcct caggattcac tttcagtgac tatcacatgg cctgggtccg ccagtctcca 180

gacaagggtc tggagtgggt cgcaagcatt actcttgatg ctacctacac ttactatcgc 240

gactccgtga ggggccgatt caccatctcc cgaaataatg caaaaaccac cctttacctg 300

caaatggaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttttt actgtacaag acatcgaggc 360

tttagcgtct ggcttgatta ctggggccaa ggagtcatgg tcactgtctc ttcagctagc 420

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac acc 1113

Claims

1.结合IL-10的人源化重组抗体分子或其抗体片段，包含：

至少一个抗体轻链可变区，包含具有SEQ ID NO：4的可变区的多肽；和

至少一个抗体重链可变区，包含具有SEQ ID NO：9的可变区的多肽。

2.权利要求1的抗体，进一步包含重链恒定区，其中所述重链恒定区包含γ1、γ2、γ3或γ4人类重链恒定区。

3.权利要求1的抗体，进一步包含轻链恒定区，其中所述轻链恒定区包含lambda或kappa人类轻链恒定区。

4.权利要求1的抗体，其中所述抗体片段选自由Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)₂和双抗体构成的组。

5.权利要求1的抗体，其中所述抗体轻链包含具有SEQ ID NO：5的可变区和恒定区的多肽。

6.权利要求1的抗体，其中所述抗体重链包含具有SEQ ID NO：10的可变区和恒定区的多肽。

7.一种组合物，包含抗体或其抗体片段，与药学上可接受的载体或稀释剂组合，其中所述抗体是权利要求1的抗体。

8.权利要求7的组合物，进一步包括免疫抑制试剂。

9.编码权利要求1的多肽的分离的核酸。

10.一种表达载体，包含与控制序列可操作连接的权利要求9的核酸序列，所述控制序列由用所述载体转染的宿主细胞识别。

11.包含权利要求10的载体的宿主细胞。

12.生产多肽的方法，包括在表述所述核酸序列的条件下体外培养权利要求11的宿主细胞，从而产生所述多肽，并从宿主细胞回收所述多肽。

13.编码特异于IL-10的抗体的分离的核酸序列，包含具有SEQ IDNO：19的核酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：20的核酸序列的重链。

14.权利要求13的核酸，其中所述轻链具有ATCC保藏号PTA-5923，所述重链具有ATCC保藏号PTA-5922。

15.编码抗体的抗体片段的分离的核酸序列，所述抗体由权利要求13的核酸序列编码。

16.权利要求15的核酸，其中所述抗体片段选自由Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)₂和双抗体构成的组。