ES2329907T3 - Anticuerpos contra interleucina-10. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de anticuerpo recombinante humanizada que se une a IL-10 o fragmento de unión del mismo, que comprende: al menos una región variable de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión del mismo, que comprende un polipéptido que tiene una región variable de la SEC ID Nº:4; y al menos una región variable de cadena pesada del anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, que comprende un polipéptido que tiene una región variable de la SEC ID Nº:9.
Description
Anticuerpos contra
interleucina-10.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención se refiere en general a
anticuerpos específicos contra interleucina-10
(IL-10) y a usos de los mismos. Más
específicamente, la invención se refiere a anticuerpos humanizados
que reconocen la IL-10 humana y modulan su
actividad, particularmente en trastornos autoinmunes.
Inicialmente conocido como factor inhibidor de
la síntesis de citocinas o CSIF, la interleucina-10
(IL-10) es un potente inmunomodulador de células
hematopoyéticas, particularmente de células inmunes. Células tales
como células Th2 activadas, células B, queratinocitos, monocitos y
macrófagos producen IL-10. Véase, por ejemplo,
Moore et al., Annu. Rev. Immunol. 11:165 (1993). La
IL-10 inhibe las funciones de activación y efectoras
de varias células que incluyen las células T, monocitos y
macrófagos. En particular, la IL-10 inhibe la
síntesis de citocinas, incluidas la de IL-1,
IFN-\gamma y TNF, por células tales como células
Th1, células asesinas naturales, monocitos y macrófagos. Véase, por
ejemplo Fiorentino et al., J. Exp. Med.,
170:2081-2095 (1989); Fiorentino et al., J.
Immunol. 146:3444 (1991); Hsu et al., Int. Immunol. 4:563
(1992); Hsu et al., Int. Immunol. 4:563 (1992); D'Andrea
et al., J. Exp. Med. 178:1041 (1993); de Waal Malefyt et
al., J. Exp. Med. 174:915 (1991); Fiorentino et al., J.
Immunol. 147:3815 (1991).
Múltiples patógenos, particularmente patógenos
intracelulares, provocan la producción de IL-10 para
ralentizar o detener completamente la eliminación eficaz del
patógeno por la respuesta inmune. Moore et al., Annu. Rev.
Immunol. 11:165 (1993). Por ejemplo, en linfocitos de sangre de
pacientes con VIH, lepra o tuberculosis, los linfocitos de sangre
periférica son típicamente anérgicos o insensibles in vitro
cuando se exponen al patógeno. Sin embargo, la neutralización de la
IL-10 en estos pacientes demostró que en estas
células estaba presente una respuesta efectora activa, es decir,
reactividad de Th1. Por lo tanto, se cree que el patógeno se
apropia eficazmente de la IL-10 para facilitar su
estado infeccioso.
La IL-10 también se asocia con
la autoinmunidad in vivo. La autoinmunidad es el resultado
del desarrollo de autoanticuerpos, células T autorreactivas o
alguna combinación de los mismos que se dirigen al tejido normal.
Un ejemplo de enfermedad autoinmune es el lupus eritematoso
sistémico (LES), una enfermedad reumática crónica en la que se
inflama el tejido conectivo de todo el cuerpo. Los autoanticuerpos
que atacan el tejido normal del cuerpo como si fuera una invasión
externa producen la inflamación característica. Aunque la causa
exacta no se comprende completamente, los investigadores creen que
tiene componentes tanto genéticos como ambientales.
Específicamente, el LES se caracteriza por la hiperactividad de las
células B y la presencia de diversos autoanticuerpos. Típicamente,
en pacientes con LES están elevados los niveles de autoanticuerpos
de IgG reactivos contra ADN bicatenario (Ab de IgG
anti-ADNbc) son elevados. Entre el 60 y el 70% de
los pacientes con LES producen Ab de IgG
anti-ADNbc, algunos de los cuales son nefrotóxicos.
El LES es 10 veces más prevalente en mujeres que en hombres, con
síntomas que varían desde erupciones faciales a disfunción orgánica
discapacitante y potencialmente con peligro para la vida. Puede
contraerse a cualquier edad, pero es más común en adultos
jóvenes.
Numerosos estudios apoyan la intervención de la
IL-10 en la patología asociada con el LES. Por
ejemplo, aunque las células típicamente no producen
IL-10 sin la estimulación adecuada, tanto las
células B como los macrófagos de pacientes con LES producen de
manera espontánea in vitro altos niveles de
IL-10. Llorente, et al., Arthritis Rheum.
40:249-60 (1997). En diversos estudios, los
investigadores demostraron una correlación entre los niveles de
IL-10 en suero y la actividad de la enfermedad.
Además, estudios tanto in vivo como in vitro
demostraron que el bloqueo de la producción de IL-10
puede aliviar las manifestaciones clínicas del LES. Véase, por
ejemplo, Gonzalez-Amaro, et al. J.
Autoimmunity 11:395-402 (1998).
Hasta la fecha, el lupus nefrítico, una de las
manifestaciones del LES, se ha tratado mediante el uso de terapias
inmunosupresoras, por ejemplo, corticosteroides y ciclofosfamidas.
Aunque estas terapias son eficaces, no son específicas y existen
toxicidades sustanciales que impiden la terapia prolongada. Por lo
tanto, los anticuerpos neutralizadores específicos pueden ser
antagonistas eficaces de la IL-10, permitiendo la
eliminación de los efectos supresores de la IL-10
dejando intacto el resto de la cadena de la respuesta inmune.
El documento DE 19529 026 describe anticuerpos
murinos contra IL-10.
La limitación más significativa en el uso de
anticuerpos como agente terapéutico in vivo es la
inmunogenicidad de los anticuerpos. Como la mayoría de los
anticuerpos monoclonales proceden de roedores, el uso repetido en
seres humanos hace que se genere una respuesta inmune contra el
anticuerpo terapéutico. Tal respuesta inmune da lugar a una pérdida
de la eficacia terapéutica a un mínimo y la creación de una
potencial respuesta anafiláctica letal a un máximo. Los esfuerzos
iniciales para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos de
roedores implicaron la producción de anticuerpos quiméricos, en los
que se fusionaron regiones variables de ratón con regiones
constantes humanas. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:3439 (1987). Sin embargo, ratones inyectados con híbridos de
regiones variables humanas y regiones constantes de ratón
desarrollan una fuerte respuesta anti-anticuerpo
dirigida contra la región variable humana, lo que sugiere que la
conservación de toda la región Fv de roedor en tales anticuerpos
quiméricos todavía puede producir una inmunogenicidad no deseada en
pacientes.
Generalmente se cree que los bucles de la región
determinante de complementariedad (CDR) de los dominios variables
comprenden el sitio de unión de las moléculas de anticuerpo. Por lo
tanto, se intentó el injerto de bucles de CDR de roedor en regiones
flanqueantes humanas (es decir, humanización) para minimizar
adicionalmente las secuencias de los roedores. Jones et al.,
Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534
(1988). Sin embargo, los intercambios de bucles de CDR no producen
un anticuerpo de manera uniforme con las mismas propiedades de
unión que el anticuerpo de origen. En anticuerpos humanizados
también se requieren cambios en los restos flanqueantes (FR),
restos implicados en sostener el bucle de CDR, para conservar la
afinidad de unión al antígeno. Kabat et al., J. Immunol.
147:1709 (1991). Aunque se ha descrito el uso de injertos de CDR y
la conservación de restos flanqueantes en varias construcciones de
anticuerpos humanizados, es difícil predecir si una secuencia
particular producirá el anticuerpo con la unión y, algunas veces,
con las propiedades biológicas deseadas. Véase, por ejemplo,
Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029 (1989),
Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4181 (1991), y
Hodgson, Bio/Technology 9: 421 (1991). Además, la mayoría de los
estudios anteriores usaron secuencias humanas diferentes para
secuencias variables ligeras y pesadas de animales, cuestionando la
naturaleza predictiva de tales estudios. Se han usado secuencias de
anticuerpos conocidos o, más típicamente, las de anticuerpos que
tienen estructuras de rayos X conocidas, anticuerpos NEW y KOL.
Véase, por ejemplo, Jones et al., anteriormente; Verhoeyen
et al., anteriormente; y Goman et al., anteriormente.
La información de la secuencia exacta se ha descrito únicamente para
algunas construcciones humanizadas.
La presente invención se refiere a moléculas de
anticuerpos recombinantes humanizados que se unen a
IL-10 o a fragmentos de unión de las mismas, que
comprenden:
- al menos una región variable de cadena ligera de anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, que comprende un polipéptido que tiene una región variable de la SEC ID Nº:4; y
- al menos una región variable de cadena pesada de anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, que comprende un polipéptido que tiene una región variable de la SEC ID Nº:9.
Los anticuerpos pueden comprender adicionalmente
una región constante de cadena pesada, donde la región constante de
cadena pesada comprende una región constante de cadena pesada humana
\gamma^{1}, \gamma^{2}, \gamma^{3} o \gamma^{4} o
una variante de las mismas.
La invención también proporciona ácidos
nucleicos aislados que codifican los polipéptidos respectivos, así
como vectores de expresión que comprenden la secuencia de ácido
nucleico unida operativamente a secuencias de control reconocidas
por una célula hospedadora transfectada con el vector y la célula
hospedadora que comprende estos vectores.
De acuerdo con un aspecto, estas células
hospedadoras pueden usarse en métodos de producción de un
polipéptido, que comprenden cultivar in vitro la célula
hospedadora en condiciones en las que se expresa la secuencia de
ácido nucleico, produciéndose de esta manera el polipéptido, y
recuperar el polipéptido de la célula hospedadora.
En otro aspecto, la invención proporciona
composiciones que comprenden un anticuerpo, o fragmento de unión
del mismo, en combinación con un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable, donde el anticuerpo es un anticuerpo
como se ha definido anteriormente.
De acuerdo con una realización adicional, la
invención proporciona el uso de un anticuerpo específico para
IL-10, o un fragmento de unión del mismo, en una
cantidad eficaz para bloquear la actividad biológica de
IL-10 para la preparación de un medicamento para
suprimir una respuesta inmune en un sujeto humano, donde el
anticuerpo es el anticuerpo como se ha definido anteriormente y
donde el sujeto tiene lupus eritematoso sistémico o lupus
nefrítico.
En una realización, los anticuerpos descritos
anteriormente comprenden adicionalmente una región constante de
cadena pesada, donde la región constante de cadena pesada comprende
una región constante de cadena pesada humana \gamma^{1},
\gamma^{2}, \gamma^{3} o \gamma^{4} o una variante de
las mismas. En una realización, los anticuerpos descritos
anteriormente comprenden adicionalmente una región constante de
cadena ligera, donde la región constante de cadena ligera comprende
una región constante de cadena ligera humana lambda o kappa. En
algunas realizaciones, el fragmento de unión de estos anticuerpos es
un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en
Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')_{2} y
un diacuerpo.
En este documento se proporciona una composición
que comprende un anticuerpo, o un fragmento de unión del mismo, en
combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable,
donde el anticuerpo es uno de los anticuerpos descritos
anteriormente.
En este documento se proporciona adicionalmente
un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de los
anticuerpos descritos anteriormente. También se proporciona en este
documento un vector de expresión que comprende la secuencia de
ácido nucleico aislada unida operativamente a secuencias de control
reconocidas por una célula hospedadora transfectada con el vector.
En este documento se proporciona una célula hospedadora que
comprende el vector que comprende la secuencia de ácido nucleico
aislada. Adicionalmente se proporciona en este documento un método
para producir un polipéptido, que comprende cultivar la célula
hospedadora que comprende el vector en condiciones en las que se
expresa la secuencia de ácido nucleico, produciéndose de esta manera
el polipéptido, y recuperar el polipéptido de la célula
hospedadora.
En este documento se proporciona una secuencia
de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo específico
para IL-10 que comprende una cadena ligera que tiene
la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº:19 y una cadena
pesada que tiene la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº:20.
En realizaciones adicionales, la cadena ligera tiene un número de
depósito de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC)
PTA-5923 y la cadena pesada tiene un número de
depósito de la ATCC PTA-5922.
En este documento se proporciona una secuencia
de ácido nucleico aislada que codifica una anticuerpo específico
para IL-10 que comprende una cadena ligera que tiene
la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº:21 y una cadena
pesada que tiene la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº:22.
En una realización adicional, la cadena ligera tiene un número de
depósito PTA-5925 en la ATCC y la cadena pesada
tiene un número de depósito PTA-5924 en la
ATCC.
Adicionalmente se proporciona en este documento
una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un fragmento
de unión del anticuerpo codificado por las secuencias de ácido
nucleico anteriores. En una realización, el fragmento de unión es
un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en
Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv y
F(ab')_{2}.
La Figura 1A muestra la asignación de números de
restos y puntuaciones numéricas a la posible secuencia de la línea
germinal aceptora con respecto a la cadena ligera variable del
anticuerpo anti-IL-10 humana,
12G8.
La Figura 1B muestra la asignación de números de
restos y puntuaciones numéricas a la posible secuencia de la línea
germinal aceptora con respecto a la cadena pesada variable del
anticuerpo anti-IL-10 humana,
12G8.
La Figura 1C muestra la asignación de números de
restos y puntuaciones numéricas a la posible secuencia de la línea
germinal aceptora con respecto a la cadena ligera variable del
anticuerpo anti-IL-10 humana,
11D8.
La Figura 1D muestra la asignación de números de
restos y puntuaciones numéricas a la posible secuencia de la línea
germinal aceptora con respecto a la cadena pesada variable del
anticuerpo anti-IL-10 humana,
12D8.
La Figura 2A es un perfil de concentración con
respecto al tiempo para el anticuerpo 12G8 administrado i.v. como
se describe en el Ejemplo III.
La Figura 2B es un perfil de concentración con
respecto al tiempo para 12G8 administrado s.c. como se describe en
el Ejemplo III.
La Figura 3A muestra que la administración del
anticuerpo anti-IL-10 humanizado,
SCH708980, confiere resistencia a la infección por
Leishmania major, en ratones transgénicos para
IL-10. La infección se determinó midiendo la
hinchazón de las almohadillas plantares con un calibrador en los
tiempos indicados. El anticuerpo 12G8 se administró como se
describe en el Ejemplo VI.
La Figura 3B demuestra que la administración del
anticuerpo anti-IL-10 de rata, 12G8,
confiere resistencia a la infección por Leishmania major, en
ratones transgénicos para IL-10. La infección se
determinó midiendo la hinchazón de las almohadillas plantares con
un calibrador en los tiempos indicados. El anticuerpo 12G8 se
administró como se describe en el Ejemplo VI.
Para mayor claridad de la descripción, y no a
modo de limitación, la descripción detallada de la invención se
divide en las siguientes subsecciones.
A menos que se definan de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el
mismo significado que el normalmente entendido por un especialista
habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Si una
definición indicada en esta sección es contraria o de algún modo
incongruente con una definición indicada en las patentes,
solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones que están
incorporadas en este documento como referencia, la definición
indicada en esta sección prevalece sobre la definición incorporada
en este documento como referencia.
Como se usa en este documento, "uno"
significa "al menos uno" o "uno o más".
Como se usa en este documento, el término
"anticuerpo" se refiere a cualquier forma de anticuerpo o
fragmento del mismo que presenta la actividad biológica deseada.
Por tanto, se usa en el sentido más amplio e incluye
específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos
monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales,
anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos
biespecíficos), y fragmentos de anticuerpos siempre que presenten
la actividad biológica deseada.
Como se usa en este documento, la expresión
"fragmento de unión a IL-10" o "fragmento de
unión del mismo" incluye un fragmento o un derivado de un
anticuerpo que aún conserva sustancialmente su actividad biológica
de inhibir la actividad de IL-10. Por lo tanto, la
expresión "fragmento de anticuerpo" o fragmento de unión a
IL-10 se refiere a una parte de un anticuerpo de
longitud completa, generalmente a la región de unión al antígeno o
a la región variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de
anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv;
diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos
monocatenarios, por ejemplo, sc-Fv y anticuerpos
multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Típicamente, un fragmento de unión o derivado conserva al menos el
50% de su actividad inhibidora de IL-10.
Preferiblemente, un fragmento de unión o derivado conserva al menos
el 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o el 100% de su actividad
inhibitoria para IL-10. Se pretende también que un
fragmento de unión a IL-10 pueda incluir
sustituciones de aminoácidos conservativos que no alteren
sustancialmente su actividad biológica.
La expresión "anticuerpo monoclonal", como
se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a
partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es
decir, los anticuerpos individuales que constituyen la población
son idénticos excepto por las posibles mutaciones de origen natural
que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los
anticuerpos monoclonales son sumamente específicos, dirigiéndose
contra un único epítopo del antígeno. En cambio, las preparaciones
de anticuerpos convencionales (policlonales) incluyen típicamente
una multitud de anticuerpos dirigidos contra (o específicamente
para) diferentes epítopos. El modificador "monoclonal" indica
que el carácter del anticuerpo se obtiene a partir de una población
sustancialmente homogénea de anticuerpos y no se considera que sea
necesaria la producción del anticuerpo por ningún método
particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usar de
acuerdo con la presente invención pueden producirse por el método
del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al.,
Nature 256: 495 (1975), o pueden producirse por métodos de ADN
recombinante (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº
4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden
aislarse de bibliotecas de anticuerpos en fagos usando, por ejemplo,
las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:
624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol.
222: 581-597 (1991).
Los anticuerpos monoclonales descritos en este
documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos"
(inmunoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o
ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en
anticuerpos procedentes de una especie particular o que pertenecen a
una clase o subclase de anticuerpo particular, aunque el resto de
la cadena (o cadenas) sea idéntica u homóloga a las secuencias
correspondientes en los anticuerpos procedentes de otras especies o
que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como
fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten la actividad
biológica deseada (Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567; y
Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:
685-6855 (1984)).
Como se usa en este documento, la expresión
anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" se refiere a
fragmentos del anticuerpo que comprenden los dominios V_{H} y
V_{L} del anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una
sola cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende
adicionalmente un enlazador polipeptídico entre los dominios
V_{H} y V_{L} que permite al sFv formar la estructura deseada
para la unión al antígeno. Para una revisión de sFv, véase
Pluckthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113.
Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York,
pág. 269-315 (1994).
Como se usa en este documento, el término
"diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos
con dos sitios de unión al antígeno, comprendiendo dichos
fragmentos un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado
a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena
polipeptídica (V_{H}-V_{L}). Usando un
enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento
entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven
obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra
cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se
describen más detalladamente, por ejemplo, en los documentos EP
404.097; WO 93/11161 y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad.
Sci USA 90: 6444-6448 (1993).
Como se usa en este documento, la expresión
"anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos que
contienen secuencias de anticuerpos no humanos (por ejemplo,
murinos), así como de anticuerpos humanos. Tales anticuerpos son
anticuerpos quiméricos que contienen secuencias mínimas procedentes
de inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado
comprenderá sustancialmente todos o al menos uno, y típicamente
dos, dominios variables, en el que todos o sustancialmente todos los
bucles hipervariables se corresponden con los de una
inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las
regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El
anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una
parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente
la de una inmunoglobulina humana.
Como se usa en este documento, la expresión
"región hipervariable" se refiere a los restos de aminoácidos
de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La
región hipervariable comprende restos de aminoácidos de una
"región determinante de complementariedad" o "CDR" (es
decir, los restos 24-34 (L1), 50-56
(L2) y 89-97 (L3) del dominio variable de la cadena
ligera y los restos 31-35 (H1),
50-65 (H2) y 95-102 (H3) del
dominio variable de la cadena pesada, Kabat et al., Sequences
of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health
Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o
los restos de un "bucle hipervariable" (es decir los restos
26-32 (L1), 50-52 (L2) y
91-96 (L3) del dominio variable de la cadena ligera
y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y
96-101 (H3) del dominio variable de la cadena
pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917
(1987)). Como se usa en este documento, la expresión restos
"flanqueantes" o "FR" se refiere a los restos del dominio
variable distintos a los restos de la región hipervariable definidos
en este documento como restos CDR.
Como se usa en este documento, la expresión
"sustitución conservativa" se refiere a las sustituciones de
aminoácidos conocidas por los especialistas en esta técnica y
generalmente pueden realizarse sin alterar la actividad biológica
de la molécula resultante. Los especialistas en esta técnica
reconocen que, en general, las sustituciones de un solo aminoácido
en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran
sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo.,
Watson, et al., Molecular Biology of the Gene, The
Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Edition 1987)). Tales
sustituciones ejemplares se realizan preferiblemente de acuerdo con
las que se indican en la siguiente TABLA 1:
También son permisibles otras sustituciones y
pueden determinarse empíricamente o de acuerdo con las sustituciones
conservativas conocidas.
Como se usa en este documento, la expresión
"molécula de ácido nucleico aislada" se refiere a una molécula
de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una
molécula de ácido nucleico contaminante con la que está
habitualmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico del
anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta en
forma o composición en la que se encuentra en la naturaleza. Las
moléculas de ácido nucleico aisladas por lo tanto se distinguen de
la molécula de ácido nucleico que existe en las células de manera
natural. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye
una molécula de ácido nucleico contenida en células que
habitualmente expresan el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula
de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de
la de las células naturales.
La expresión "secuencias de control" se
refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante unida operativamente en un organismo
hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas
para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente
una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe
que las células eucariotas utilizan promotores, señales de
poliadenilación y potenciadores.
El ácido nucleico está "unido
operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con
otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una
presecuencia o líder secretor está unido operativamente al ADN para
un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en
la secreción de polipéptido; un promotor o potenciador está unido
operativamente a una secuencia codificante si afecta a la
transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está
unido operativamente a una secuencia codificante si está situado de
manera que facilita la traducción. Generalmente, "unido
operativamente" significa que las secuencias de ADN que están
unidas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y
en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que
ser contiguos. La unión se consigue por ligamiento en sitios de
restricción adecuados. Si tales sitios no existen, se usan los
adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo
con la práctica convencional.
Como se usa en este documento, las expresiones
"célula", "línea celular", y "cultivo celular" se
usan de manera intercambiable y todas tales designaciones incluyen
progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células
transformadas" incluyen la célula primaria del sujeto y cultivos
derivados de ella sin tener en cuenta el número de transferencias.
También se entiende que toda la progenie no debe ser precisamente
idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o
involuntarias. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma
función o actividad biológica que la explorada en la célula
transformada originalmente. Cuando se pretendan realizar
designaciones distintas, será evidente por el contexto.
Como se usa en este documento, "reacción en
cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un
procedimiento o técnica en la que se amplifican pequeñas cantidades
de un parte específica de ácido nucleico, ARN y/o ADN, como se
describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.683.195.
Generalmente, es necesario que esté disponible la información de
secuencia desde los extremos de la región de interés o más allá, de
manera que puedan diseñarse cebadores oligonucleotídicos; estos
cebadores tendrán secuencia idéntica o similar a las cadenas
opuestas del molde a amplificar. Los nucleótidos 5' terminales de
los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material
amplificado. La PCR puede usarse para amplificar secuencias de ARN
específicas, secuencias de ADN específicas procedentes del ADN
genómico total y ADNc transcrito a partir de ARN celular total,
secuencias de bacteriófagos o plásmidos, etc. Véase, en general,
Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263
(1987); Erlich, ed., PCR TECHNOLOGY (Stockson Press, N.Y., 1989).
Como se usa en este documento, se considera que la PCR es un
ejemplo, pero no el único, de un método de reacción de polimerasa
de ácido nucleico para la amplificación de una muestra de ensayo de
ácido nucleico que comprende el uso de un ácido nucleico conocido
como un cebador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o
generar una parte específica del ácido
nucleico.
nucleico.
Como se usa en este documento, la expresión
"secuencia de línea germinal" se refiere a una secuencia de
secuencias de ADN de inmunoglobulina no transpuestas. Puede usarse
cualquier fuente de inmunoglobulina no transpuesta.
Como se usa en este documento, la expresión
"agente inmunosupresor" se refiere a agentes naturales o
sintéticos que suprimen o modulan una respuesta inmune. La
respuesta inmune puede ser una respuesta humoral o celular.
Las composiciones y métodos descritos en este
documento se refieren a la modulación de la actividad de
IL-10, particularmente en respuestas inmunes.
Específicamente, las composiciones y métodos de este documento
emplean anticuerpos específicos como se ha definido anteriormente
para la citocina IL-10. IL-10 es una
potente citocina que modula las respuestas de las células T y B a
través de la regulación del crecimiento, diferenciación y síntesis
de citocinas de una diversidad de tipos celulares implicadas en
respuestas inmunes. Particularmente, la producción de
IL-10 está frecuentemente asociada a enfermedades
autoinmunes e inmunopatología inducida por patógenos. Por lo tanto,
una composición; y métodos de la misma, que modulen e inhiban la
actividad de IL-10 pueden alterar el desarrollo y
el mantenimiento de una enfermedad autoinmune y síntomas
relacionados y mejorar o reducir la inmunopatología asociada a
patógenos.
La dirección a la actividad de
IL-10 con anticuerpos humanizados ofrece varias
ventajas únicas. En primer lugar, la dirección a
IL-10 con anticuerpos permite una supresión
específica de la actividad de IL-10 mientras que se
deja intacto el resto de la respuesta inmune. En muchos casos de
inmunopatología inducida por patógenos, la reducción o eliminación
de la actividad de IL-10 debe permitir que la
respuesta inmune efectora deseada se elimine con el patógeno sin
una patología adicional. Para el paciente autoinmune, la reducción o
eliminación de la actividad de IL-10 debe reducir o
eliminar la enfermedad y/o sus síntomas mientras que se mantiene la
competencia inmune del paciente. En segundo lugar, los anticuerpos
contra IL-10 humanizados eluden la limitación
asociada a anticuerpos inmunogénicos de roedores. El uso de
secuencias humanas elimina la inmunogenicidad de los anticuerpos
administrados exógenamente, permitiendo la administración
terapéutica.
Los anticuerpos humanizados contienen secuencias
de anticuerpos no humanos así como de humanos. Típicamente, el
proceso de humanización comienza con la generación de un anticuerpo
no humano que tiene la actividad biológica deseada, es decir,
inhibe la actividad de IL-10. Una vez que se ha
identificado el anticuerpo no humano con las características
apropiadas, se emplean entonces medios recombinantes para crear una
secuencia híbrida usando secuencias humanas y no humanas.
Para generar anticuerpos monoclonales puede
usarse cualquier método adecuado. Por ejemplo, un receptor puede
inmunizarse con IL-10 o con un fragmento de la
misma. Puede usarse cualquier método adecuado de inmunización.
Tales métodos pueden incluir adyuvantes, otros inmunoestimuladores,
inmunizaciones de refuerzo repetidas y el uso de una o más vías de
inmunización.
Puede usarse cualquier fuente adecuada de
IL-10 como inmunógeno para la generación del
anticuerpo no humano de las composiciones y métodos descritos en
este documento. Tales formas incluyen, pero no están limitadas a la
proteína completa, péptido (o péptidos) y epítopos, generados a
través de medios recombinantes, sintéticos, químicos o de
degradación enzimática conocidos en la técnica. La
IL-10 es un homodímero no covalente, sensible a
ácidos, de dos cadenas polipeptídicas interpenetrantes. La citocina
tiene una longitud de 160 aminoácidos con secuencias bien
conservadas que incluyen una estructura en haz
\alpha-helicoidal similar a la de los
interferones y citocinas hematopoyéticas. La IL-10
humana y murina tienen una homología de aminoácidos del 73%, siendo
la IL-10 humana activa sobre células murinas y
humanas. La IL-10 está disponible en el mercado o
puede producirse usando técnicas de biología molecular bien
conocidas. En el Genbank están disponibles secuencias de ADNc de
ser humano, macaco de cola de cerdo, mangabey, mono rhesus y mono
búho, lémur, ratón, rata, cobaya, hámster sirio, conejo, gato,
perro así como otros. La IL-10 humana recombinante
es un polipéptido de 17-18 kDa que no está
N-glicosila-
do.
do.
Para generar el anticuerpo puede usarse
cualquier forma de antígeno que sea suficiente para generar un
anticuerpo biológicamente activo. Por tanto, el antígeno inductor
puede ser un epítopo simple, epítopos múltiples o la proteína
completa sola o en combinación con uno o más agentes conocidos en la
técnica que potencian la inmunogenicidad. El antígeno inductor
puede ser una proteína aislada de longitud completa, una proteína de
la superficie celular (por ejemplo, inmunizando con células
transfectadas con al menos una parte del antígeno), o una proteína
soluble (por ejemplo, inmunizando únicamente con la parte del
domino extracelular de la proteína). El antígeno puede producirse
en una célula modificada genéticamente. El ADN que codifica el
antígeno puede ser genómico o no genómico (por ejemplo, ADNc) que
codifica al menos una parte del dominio extracelular. Como se usa en
este documento, el término "parte" se refiere a un número
mínimo de aminoácidos o ácidos nucleicos, según proceda, para
constituir un epítopo inmunogénico del antígeno de interés. Puede
emplearse cualquiera de los vectores genéticos adecuados para la
transformación de las células de interés, incluyendo pero sin
limitación vectores adenovirales, plásmidos y vectores no virales,
tales como lípidos catiónicos.
Puede usarse cualquier método adecuado para
inducir un anticuerpo con las propiedades biológicas deseadas para
inhibir IL-10. Es deseable preparar anticuerpos
monoclonales (mAb) a partir de diversos hospedadores mamíferos,
tales como ratones, roedores, primates, seres humanos, etc. Pueden
encontrarse descripciones sobre técnicas de preparación de tales
anticuerpos monoclonales, por ejemplo, en Stites, et al.
(eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4th ed.) Lange Medical
Publications, Los Altos, CA, y en referencias citadas en este
documento; Harlow y Lane (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH
Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE
(2d ed.) Academic Press, New York, NY. Por tanto, los anticuerpos
monoclonales pueden obtenerse por una diversidad de técnicas con
las que estarán familiarizados los investigadores expertos en la
técnica. Típicamente, los esplenocitos de un animal inmunizado con
un antígeno deseado se inmortalizan, habitualmente por fusión con
una célula de mieloma. Véase Kohler y Milstein (1976) Eur. J.
Immunol. 6:511-519. Los métodos de inmortalización
alternativos incluyen transformación con Virus Epstein Barr,
oncogenes o retrovirus u otros métodos conocidos en la técnica.
Véase, por ejemplo, Doyle et al. (eds. 1994 y suplementos de
prensa) CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley
and Sons, New York, NY. Las colonias que surgen de células únicas
inmortalizadas se exploran para la producción de anticuerpos de la
especificidad y afinidad deseadas para el antígeno, y el
rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por tales
células puede potenciarse por diversas técnicas, que incluyen la
inyección en la cavidad peritoneal de un hospedador vertebrado.
Como alternativa, pueden aislarse secuencias de ADN que codifican un
anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo explorando
una genoteca de ADN a partir de células B humanas de acuerdo con,
por ejemplo, el protocolo general descrito por Huse et al.
(1989) Science 246:1275-1281.
Otras técnicas adecuadas implican la selección
de bibliotecas de anticuerpos en fagos o vectores similares. Véase,
por ejemplo, Huse et al., Science
246:1275-1281 (1989); y Ward et al., Nature
341:544-546 (1989). Los polipéptidos y anticuerpos
de la presente invención pueden usarse con o sin modificación,
incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Frecuentemente,
los polipéptidos y anticuerpos se marcarán por unión covalente o no
covalente de una sustancia que proporciona una señal detectable. Se
conocen una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación
y se describen de manera extensa tanto en la bibliografía científica
como en la patentes. Los marcadores adecuados incluyen
radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, restos
fluorescentes, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas y
similares. Las patentes que enseñan el uso de tales marcadores
incluyen las patentes de Estados Unidos Nº 3.817.837; 3.850.752;
3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. También
pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes, véase Cabilly
Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567 y Queen et al. (1989)
Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033; o
producirse en ratones transgénicos, véase Méndez et al.
(1997) Nature Genetics 15:146-156; véanse también
las tecnologías de Abgenix y Medarex.
Pueden inducirse anticuerpos o composiciones de
unión contra fragmentos predeterminados de IL-10
inmunizando animales con conjugados del polipéptido, fragmentos,
péptidos o epítopos con proteínas transportadoras. Los anticuerpos
monoclonales se preparan a partir de células que secretan el
anticuerpo deseado. Estos anticuerpos pueden explorarse para unirse
a IL-10 normal o defectuosa. Estos anticuerpos
monoclonales se unirán habitualmente con una K_{d} de al menos
aproximadamente 1 \muM, más habitualmente de al menos
aproximadamente 300 nM, típicamente de al menos aproximadamente 30
nM, preferiblemente de al menos aproximadamente 10 nM, más
preferiblemente de al menos aproximadamente 3 nM o mejor,
determinado habitualmente por ELISA. También pueden identificarse
anticuerpos no humanos adecuados usando los ensayos biológicos
descritos en la Sección D a continuación.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Puede usarse cualquier anticuerpo no humano
adecuado como una fuente para la región hipervariable. Las fuentes
para anticuerpos no humanos incluyen, pero sin limitación, animales
de las clases murina, lupina, bovina y primates. En su mayoría, los
anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo
receptor) en las que los restos de la región hipervariable del
receptor están sustituidos por restos de la región hipervariable de
una especie no humana (anticuerpo donante), tales como ratón, rata,
conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y
capacidad deseada. En algunos casos, los restos de la región
flanqueante (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana están
sustituidos por restos no humanos correspondientes. Además, los
anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se
encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante.
Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el
comportamiento de la actividad biológica deseada del anticuerpo.
Para detalles adicionales, véase Jones et al., Nature
321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature
332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct.
Biol. 2:593-596 (1992).
Se han descrito métodos de modificación por
ingeniería genética recombinante para anticuerpos, por ejemplo, en
Boss et al. (Patente de Estados Unidos Nº 4.816.397), Cabily
et al. (Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567), Law et
al. (Publicación de Solicitud de Patente Europea Nº 438 310) y
Winter (Publicación de Solicitud de Patente Europea Nº 239
400).
Las variantes de la secuencia de aminoácidos del
anticuerpo anti-IL-10 humanizado
están preparadas introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en
el ADN del anticuerpo anti-IL-10
humanizado, o mediante síntesis peptídica. Tales variantes
incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o
sustituciones de, restos dentro de las secuencias de aminoácidos
presentadas por el F(ab) del
anti-IL-10 humanizado (por ejemplo
como en las SEC ID Nº 5 y 10). Para llegar a la construcción final
se realiza cualquier combinación de deleción; inserción y
sustitución, siempre que la construcción final posea las
características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden
alterar procesos post-traduccionales del anticuerpo
anti-IL-10 humanizado, tales como
cambios de número o posición de sitios de glicosilación.
Un método útil para la identificación de
determinados restos o regiones del polipéptido del anticuerpo
anti-IL-10 humanizado que son
localizaciones preferidas para la mutagénesis se denomina
"mutagénesis de exploración de alanina", como se describe por
Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085 (1989).
En este método, se identifica un resto o grupo de restos diana (por
ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se
sustituyen por un aminoácido cargado negativamente o neutro (más
preferiblemente alanina o polialanina) para influir en la
interacción de los aminoácidos con el antígeno
IL-10. Los restos de aminoácidos que demuestran
sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan después
introduciendo variantes adicionales u otras en, o para, los sitios
de sustitución. Por tanto, aunque el sitio para la introducción de
una variación en la secuencia de aminoácidos esté predeterminado,
la naturaleza de la mutación per se no está predeterminada.
Por ejemplo, para analizar el comportamiento de una mutación en un
sitio dado, en el codón o región diana se realiza la mutagénesis de
exploración de ala o mutagénesis al azar y se exploran las variantes
expresadas del anticuerpo
anti-IL-10 humanizado para la
actividad deseada.
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos
incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminal que varían en
longitud desde un resto hasta polipéptidos que contienen cientos o
más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de
aminoácidos simples o múltiples. Los ejemplos de inserciones
terminales incluyen el anticuerpo
anti-IL-10 humanizado con un resto
metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a una
etiqueta epítopo. Otras variantes insercionales de la molécula del
anticuerpo anti-IL-10 humanizado
incluyen la fusión de una enzima o un polipéptido al N o C terminal
del anticuerpo anti-IL-10 humanizado
lo que aumenta la semivida del anticuerpo en suero.
Otro tipo de variante es una variante de
sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un resto
de aminoácido eliminado en la molécula del anticuerpo
anti-IL-10 humanizado y en su lugar
un resto diferente insertado. Los sitios de mayor interés para la
mutagénesis sustitucional incluyen los bucles hipervariables, pero
también se contemplan alteraciones en la FR. En el método descrito
a continuación las tablas 2 y 3 proporcionan una orientación en
cuanto a los restos de la región hipervariable que pueden alterarse.
Los restos de la región hipervariable o restos FR implicados en la
unión al antígeno se sustituyen generalmente de manera relativamente
conservativa.
Otro tipo de variante de aminoácidos del
anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del
anticuerpo. Por alteración se entiende la deleción de uno o más
restos de hidratos de carbono encontrados en el anticuerpo y/o la
adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes
en el anticuerpo. La glicosilación de anticuerpos está típicamente
unida a N o unida a O. Unida a N se refiere a la unión del resto de
hidrato de carbono a la cadena lateral de un resto de asparagina.
Las secuencias tripeptídicas
asparagina-X-serina y
asparagina-X-trionina, donde X es
cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de
reconocimiento para la unión enzimática del resto de hidrato de
carbono a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia
de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido
crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación unida a
O se refiere a la unión de uno de los azúcares
N-aceilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido
hidroxiamino, más habitualmente serina o trionina, aunque también
puede usarse 5-hidroxiprolina o
5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación al
anticuerpo se consigue convenientemente alterando la secuencia de
aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias
tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación
unidos a N). La alteración también puede realizarse por la adición
de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina en la
secuencia del anticuerpo original (sitios de glicosilación unidos a
O).
Las moléculas de ácido nucleico que codifican
variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo específico
para IL-10 humanizado se preparan por una diversidad
de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero
sin limitación, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de
variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural) o la
preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida
al sitio), mutagénesis por PCR, y mutagénesis de casete de una
versión de variante anterior preparada o una no variante del
anticuerpo anti-IL-10
humanizado.
Habitualmente, las variantes de secuencia de
aminoácidos del anticuerpo
anti-IL-10 humanizado tendrán una
secuencia de aminoácidos que tiene al menos identidad de secuencia
de aminoácidos del 75% con las secuencias de aminoácidos del
anticuerpo humanizado original de la cadena pesada o ligera más
preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el
85%, más preferiblemente al menos el 90% y más preferiblemente al
menos el 95%. En este documento la identidad u homología con
respecto a esta secuencia se define como el porcentaje de restos de
aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los restos
anti-IL-10 humanizados, después del
alineamiento de las secuencias y de la introducción de huecos, si es
necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de
secuencia, y sin tener en cuenta ninguna sustitución conservativa
como parte de la identidad de secuencia. Ninguna extensión,
deleción o inserción N-terminal,
C-terminal o interna en la secuencia del anticuerpo
deberá interpretarse como que afecta a la identidad u homología de
la secuencia.
El anticuerpo humanizado puede seleccionarse de
cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e
IgE. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. Puede
usarse cualquier isotipo de IgG, incluyendo IgG_{1}, IgG_{2},
IgG_{3} e IgG_{4}. También se contemplan variantes de los
isotipos IgG. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias
de más de una clase o isotipo. La optimización de las secuencias de
dominio constante necesarias para generar la actividad biológica
deseada se consigue fácilmente explorando los anticuerpos en los
ensayos biológicos descritos a continuación.
Del mismo modo, en las composiciones y métodos
de este documento puede usarse cualquier clase de cadena ligera.
Específicamente, son útiles en las composiciones y métodos
presentes, kappa, lambda o variantes de las mismas.
En este documento se proporciona un método para
identificar una secuencia de la línea germinal aceptora para un
anticuerpo humanizado, cuyo método comprende las etapas de: a)
identificar un anticuerpo no humano que tenga la actividad
biológica deseada, b) determinar la secuencia de aminoácidos de los
dominios V_{H} y V_{L} de un anticuerpo no humano y c) comparar
la secuencia del anticuerpo no humano con un grupo de secuencias de
la línea germinal humana, donde la comparación comprende las
subetapas de: 1) asignar los números de los restos de las
secuencias V no humanas de acuerdo con Kabat anteriormente; 2)
delinear las regiones CDR y FR en la secuencia de acuerdo con Kabat
anteriormente; 3) asignar una puntuación numérica predeterminada en
la posición del resto específica para las que son idénticas las
secuencias de la línea germinal del anticuerpo no humano y humano y
4) totalizar todas las puntuaciones de los restos para generar una
puntuación total para cada secuencia de la línea germinal humana y
d) identificar la secuencia germinal humana con la mayor puntuación
total de los restos como la secuencia de línea germinal aceptora. En
una realización el método comprende adicionalmente las subetapas
de: 5) asignar una puntuación numérica de 1 para cada posición de
resto de FR para la que las secuencias de la línea germinal del
anticuerpo no humano y humano son idénticas que no se puntuó en la
subetapa (3) en secuencias de la línea germinal con puntuaciones
totales de restos idénticas después de la subetapa (4); 6)
totalizar todas las puntuaciones de los restos para generar una
puntuación total para cada secuencia de línea germinal humana. En
una realización específica, el anticuerpo no humano es específico
para IL-10 e inhibe la actividad biológica de
IL-10. En este documento también se proporciona un
anticuerpo generado por el método anterior.
En una realización, el anticuerpo
IL-10 se humaniza usando el siguiente método. En
primer lugar, los dominios V_{L} y V_{H} no humanos del
anticuerpo IL-10 se clonan y se secuencian y se
determina la secuencia de aminoácidos. Después, la secuencia
V_{H} no humana se compara con un grupo de cinco secuencias de
aminoácidos de la línea germinal V_{H} humana. Los cinco grupos
contienen un representante de los subgrupos IGHV1 e IGHV4 y tres
representantes del subgrupo IGHV3. Los subgrupos V_{H} se enumeran
en M.-P. Lefranc, Exp. Clin. Immunogenetics,
18:100-116 (2001). Específicamente, la comparación
con las cinco secuencias de la línea germinal comienzan con la
asignación de números a restos de la secuencia V_{H} no humana de
acuerdo con el sistema de numeración Kabat. Véase Kabat, et
al., U.S. Departament of Health and Human Services, NIH Pub.
91-3242 (5th Ed., 1991). La secuencia V_{H} no
humana se alinea después con cada una de las cinco secuencias de la
línea germinal humana. Como los genes de V comprenden únicamente
1-94 restos V_{H}, únicamente estos restos se
consideran en el alineamiento. A continuación, se delinean las
regiones flanqueantes (FR) y determinantes de la complementariedad
(CDR) en la secuencia. La CDR y la FR se delinean de acuerdo con la
combinación de las definiciones proporcionadas en Kabat, et
al., U.S. Departamento of Health and Human Services, NIH Pub.
91-3242 (5th Ed., 1991) y C. Chothia & A.M.
Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987). Por lo
tanto, la definición usada para la CDR es restos
26-35 para la CDR1, restos 50-65
para la CDR2 y la CDR3 es restos 95-102 para la
CDR3 del dominio V_{H}. La etapa siguiente implica la asignación
de una puntuación numérica en la posición de restos identificados
donde las secuencias no humanas y humanas son idénticas. Un ejemplo
de esta puntuación se muestra en la siguiente Tabla 2.
\newpage
Después de asignar una puntuación numérica a las
posiciones de los restos, se totalizan todas las puntuaciones de
los restos. La secuencia de la línea germinal aceptora es la que
tiene la mayor puntuación total. En un caso en el que dos o más
secuencias de la línea germinal tengan idénticas puntuaciones,
entonces se añade 1 al total para cada posición en la que las
secuencias no humanas y humanas son IDÉNTICAS para los siguientes
restos: 1, 3, 5-23, 25, 36, 38,
40-43, 46, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 77,
79-90 y 92 (max 49). Las puntuaciones se totalizan
de nuevo, y la secuencia de la línea germinal aceptora es la que
tiene la mayor puntuación total. Si dos o más secuencias de la
línea germinal aún tienen puntuaciones idénticas, cualquiera de las
dos puede usarse como la secuencia de la línea germinal
aceptora.
Si la secuencia para V_{L} es un miembro de la
subclase kappa de V_{L}, la secuencia V_{L} no humana del
anticuerpo específico para IL-10 se compara con un
grupo de cuatro secuencias de aminoácidos de la línea germinal
kappa V_{L} humana. Las cuatro secuencias están comprendidas por
un representante de cada uno de los cuatro subgrupos de V_{L}
humanos establecidos enumerados en V. Barbie & M.-P. Lefranc,
Exp. Clin. Immunogenetics 15:171-183 (1998) and
M.-P. Lefranc, Exp. Clin. Immunogenetics 18:161-174
(2001). Las cuatro secuencias también se corresponden con los
cuatro subgrupos enumerados en Kabat et al., U. S.
Departament of Health and Human Services, NIH Pub.
91-3242, págs. 103-130 (5th Ed.,
1991). La comparación de la secuencia no humana con las cuatro
secuencias de la línea germinal comienzan con la asignación de las
puntuaciones de los restos para los restos de la secuencia V_{L}
no humana de acuerdo con Kabat et al., U. S. Departament of
Health and Human Services, NIH Pub. 91-3242, pp.
103-130 (5th Ed., 1991). Las secuencias V_{L} no
humanas se alinean después con cada una de las cuatro secuencias de
la línea germinal humana. Como los genes de V comprenden únicamente
1-95 restos de V_{L,} únicamente se consideran
estos restos en el alineamiento. Después, las regiones flanqueantes
(FR) y las determinantes de la complementariedad (CDR) se delinean
en la secuencia. CDR y FR se delinean de acuerdo con la combinación
de las definiciones proporcionadas en Kabat et al., U. S.
Departament of Health and Human Services, NIH Pub.
91-3242, pp. 103-130 (5th Ed.,
1991), y C. Chothia & A.M. Lesk, J. Mol. Biol.,
196:901-917 (1987). Por lo tanto, la definición de
CDR usada es restos 24-34 para la CDR1, restos
50-56 para la CDR2 y restos 89-97
para la CDR3 del dominio V_{L}. La siguiente etapa implica la
asignación de una puntuación numérica en una posición de un resto
identificado donde las secuencias humanas y no humanas son
idénticas. Un ejemplo de esta puntuación se muestra en la siguiente
Tabla 3.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Después de asignar una puntuación numérica a las
posiciones de los restos, se totalizan todas las puntuaciones de
los restos. La secuencia de la línea germinal aceptora es la que
tiene la mayor puntuación total. En un caso en el que dos o más
secuencias de la línea germinal tengan idénticas puntuaciones,
entonces se añade 1 al total para cada posición en la que las
secuencias no humanas y humanas son IDÉNTICAS para los siguientes
restos: 1, 3, 5-23, 35, 37, 39-42,
57, 59-61, 63, 65-70,
72-86 y 88. Las puntuaciones de los restos se
totalizan de nuevo y la secuencia de la línea germinal aceptora es
la que tiene la mayor puntuación total. Si dos o más secuencias de
la línea germinal aún tienen puntuaciones idénticas, cualquiera de
las dos puede usarse como la secuencia de la línea germinal
aceptora.
aceptora.
\newpage
Para la producción recombinante del anticuerpo,
el ácido nucleico que le codifica se aísla y se inserta en un
vector replicable para clonación (amplificación del ADN) o para
expresión adicional. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal
se aísla y se secuencia fácilmente usando procedimientos
convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que
son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las
cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Están disponibles muchos
vectores. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero
sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal,
un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento
potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la
transcripción.
En una realización, el anticuerpo es una
molécula del anticuerpo recombinante humanizado que se une a
IL-10, o a un fragmento de unión del mismo, que
comprende: al menos una región variable de cadena ligera del
anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, que comprende un
polipéptido que tiene al menos una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº:1 (KTSQNIFENLA) en
la CDR1, SEC ID Nº:2 (NASPLQA) en la CDR2 y SEC ID Nº:3 (HQYYSGYT)
en la CDR3; y una región flanqueante, en la que la secuencia de
aminoácidos de la región flanqueante es toda o sustancialmente toda
la secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina humana; y al
menos una región variable de cadena pesada del anticuerpo, o
fragmento de unión del mismo, que comprende un polipéptido que
tiene al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo
que consiste en SEC ID Nº:6 (GFTFSDYHMA) en la CDR1, SEC ID Nº:7
(SITLDATYTYYRDSVRG) en la CDR2, SEC ID Nº:8 (HRGFSVWLDY) en la
CDR3; y una región flanqueante, en la que la secuencia de
aminoácidos de la región flanqueante es toda o sustancialmente toda
la secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina humana. En una
realización específica, la cadena ligera del anticuerpo o fragmento
de unión del mismo, comprende un polipéptido que tiene una región
variable de la SEC ID Nº:4
(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTSQNIFENLAWYQQKPGKAPK
LLIY NASPLQAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYSGYTFGPGTKLELKRT). En una realización específica, la cadena ligera del anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región constante de la SEC ID Nº:5. Véase Tabla 4. En una realización específica, la cadena pesada del anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, comprende un polipéptido que tiene una región variable de la SEC ID Nº:9 (QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSDYHMAWVRQAPGKGLEWVA
SITLDATYTYYRDSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YYCARHRGFSVWLDYWGQGTLVTVSS).
En otra realización específica, la cadena pesada del anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región constante de la SEC ID Nº:10. Véase Tabla 5.
LLIY NASPLQAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYSGYTFGPGTKLELKRT). En una realización específica, la cadena ligera del anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región constante de la SEC ID Nº:5. Véase Tabla 4. En una realización específica, la cadena pesada del anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, comprende un polipéptido que tiene una región variable de la SEC ID Nº:9 (QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSDYHMAWVRQAPGKGLEWVA
SITLDATYTYYRDSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YYCARHRGFSVWLDYWGQGTLVTVSS).
En otra realización específica, la cadena pesada del anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región constante de la SEC ID Nº:10. Véase Tabla 5.
Los plásmidos que contienen los ácidos nucleicos
que codifican las cadenas ligera y pesada del 12G8 humanizado se
depositaron con los números de depósito PTA-5923 y
PTA-5922, respectivamente en la Colección de Cultivo
Tipo Americano (ATCC).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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En una realización, el anticuerpo es una
molécula de anticuerpo recombinante humanizado que se une a
IL-10, o a un fragmento de unión del mismo, que
comprende: al menos una cadena ligera del anticuerpo o fragmento de
unión del mismo, que comprende un polipéptido que tiene al menos una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la
SEC ID Nº:11 (RASESVDDYGHSFMH) en la CDR1, SEC ID Nº:12 (CASTLES) en
la CDR2 y SEC ID Nº:13 (QQGNEDPWT) en la CDR3; y una región
flanqueante, en la que la secuencia de aminoácidos de la región
flanqueante es toda o sustancialmente toda una secuencia de
aminoácidos de la inmunoglobulina humana; y al menos una cadena
pesada del anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, que comprende
un polipéptido que tiene al menos una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº:15 (GFSLTNYGVH)
en la CDR1, la SEC ID Nº:16 (VIWSGGSTDYNAAFIS) en la CDR2 y la SEC
ID Nº:17 (NRGYDVYFDY) en la CDR3; y una región flanqueante, en la
que la secuencia de aminoácidos de la región flanqueante es toda o
sustancialmente toda la secuencia de aminoácidos de la
inmunoglobulina. En una realización específica, la cadena ligera del
anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, comprende un
polipéptido que tiene una región variable y una región constante de
la SEC ID Nº:14. Véase Tabla 6. Aún en otra realización específica,
la cadena pesada del anticuerpo, o fragmento de unión del mismo,
comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región
constante de la SEC ID Nº:18. Véase Tabla 7.
Los plásmidos que contienen las cadenas pesadas
y ligeras del 11D8 humanizado se depositaron en la ATCC con los
números de depósito PTA-5926 y
PTA-5927, respectivamente.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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En una realización, los anticuerpos descritos
anteriormente comprenden adicionalmente una región constante de
cadena pesada, en la que la región constante de cadena pesada
comprende una región constante de cadena pesada humana \gamma1,
\gamma2, \gamma3 o \gamma4 o una variante de las mismas. En
una realización, los anticuerpos descritos anteriormente comprenden
adicionalmente una región constante de cadena ligera, donde la
región constante de cadena ligera comprende una región constante de
cadena ligera humana lambda o kappa. En algunas realizaciones, el
fragmento de unión de estos anticuerpos es un fragmento de
anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab',
Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')_{2} y un
diacuerpo.
También se proporciona en este documento una
molécula de anticuerpo recombinante quimérico que se une a
IL-10 o a un fragmento de unión del mismo, que
comprende: al menos una región variable de cadena ligera del
anticuerpo o un fragmento de unión del mismo, que comprende un
polipéptido que tiene al menos una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº:1 en la CDR1,
SEC ID Nº:2 en la CDR2 y SEC ID Nº:3 en la CDR3, y al menos una
región variable de cadena pesada del anticuerpo, o fragmento de
unión del mismo, que comprende un polipéptido que tiene al menos
una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en
la SEC ID Nº:6 en la CDR1, SEC ID Nº:7 en la CDR2 y SEC ID Nº:8 en
la CDR3.
En una realización específica, la molécula de
anticuerpo recombinante quimérico tiene una cadena ligera como se
indica en la SEC ID Nº:23 y una cadena pesada como se indica en la
SEC ID Nº:24. Véase Tabla 8. Los ácidos nucleicos que codifican las
cadenas ligera y pesada del anticuerpo quimérico 12G8 se depositan
en la ATCC con el número de depósito PTA-5925 y
PTA-5924, respectivamente.
\newpage
En este documento se proporciona adicionalmente
una molécula de anticuerpo recombinante quimérico que se une a
IL-10, o fragmento de unión del mismo, que
comprende: al menos una cadena ligera del anticuerpo o fragmento de
unión del mismo, que comprende un polipéptido que tiene al menos una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la
SEC ID Nº:11 en la CDR1, SEC ID Nº:12 en la CDR2 y SEC ID Nº:13 en
la CDR3 y al menos una cadena pesada del anticuerpo, o fragmento de
unión del mismo, que comprende un polipéptido que tiene al menos
una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en
la SEC ID Nº:15 en la CDR1, SEC ID Nº:16 en la CDR2 y SEC ID Nº:17
en la CDR3.
En este documento se proporciona adicionalmente
un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de los
anticuerpos descritos anteriormente. También se describe en este
documento un vector de expresión que comprende la secuencia aislada
de ácido nucleico unida operativamente a secuencias de control
reconocidas por una célula hospedadora transfectada con el vector.
Se proporciona en este documento una célula hospedadora que
comprende el vector que comprende la secuencia aislada de ácido
nucleico. Además se proporciona en este documento un método para la
producción de un polipéptido, que comprende cultivar la célula
hospedadora que comprende el vector en condiciones en las que se
expresa la secuencia de ácido nucleico, produciendo de esta manera
el polipéptido y recuperando el polipéptido de la célula
hospedadora.
En este documento se proporciona una secuencia
de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo específico
para IL-10 que comprende una cadena ligera que tiene
la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº:19 y una cadena
pesada que tiene la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº:21.
Véanse Tablas 4 y 5.
En este documento se proporciona una secuencia
de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo específico
para IL-10 que comprende una cadena ligera que tiene
la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº:21 y una cadena
pesada que tiene la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº:22.
Véanse Tablas 6 y 7.
Además se proporciona en este documento una
secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un fragmento de
unión del anticuerpo codificado por las secuencias anteriores de
ácido nucleico. En una realización, el fragmento de unión es un
fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fab,
Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')_{2} y un
diacuerpo.
Los anticuerpos biespecíficos también son útiles
en los métodos y composiciones presentes. Como se usa en este
documento, la expresión "anticuerpo biespecífico" se refiere a
un anticuerpo, típicamente un anticuerpo monoclonal que tiene
especificidades de unión para al menos dos epítopos antigénicos
diferentes. En una realización, los epítopos son del mismo
antígeno. En otra realización, los epítopos son de dos antígenos
diferentes. En la técnica se conocen métodos para producir
anticuerpos biespecíficos. Por ejemplo, pueden producirse
anticuerpos biespecíficos de manera recombinante usando la
co-expresión de dos pares de cadenas pesada/ligera
de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo Milstein et al.,
Nature 305: 537-39 (1983). Como alternativa, pueden
prepararse anticuerpos biespecíficos usando enlace químico. Véase,
por ejemplo, Brennan, et al., Science 229: 81 (1985). Los
anticuerpos biespecíficos incluyen fragmentos de anticuerpo
biespecíficos. Véase, por ejemplo Hollinger, et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-48 (1993), Gruber,
et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).
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En este documento se proporciona el uso de un
anticuerpo específico para IL-10 o un fragmento de
unión del mismo, en una cantidad eficaz para bloquear la actividad
biológica de IL-10 para la preparación de un
medicamento para suprimir una respuesta inmune en un sujeto humano,
en el que el anticuerpo es un anticuerpo como se ha definido
anteriormente y en el que el sujeto padece lupus eritematoso
sistémico o lupus nefrítico.
Se proporciona en este documento una composición
que comprende un anticuerpo, o fragmento de unión al mismo, en
combinación con un transportador o diluyente farmacéuticamente
aceptable, en el que el anticuerpo es uno de los anticuerpos
definidos anteriormente.
Cualquier sujeto que se beneficie del
tratamiento con anticuerpos específicos para IL-10
puede tratarse usando las composiciones y métodos proporcionados en
este documento. Puede tratarse cualquier sujeto con los métodos y
composiciones proporcionadas en ese documento. Tal sujeto es un
mamífero, preferiblemente un ser humano, con una enfermedad o
síntoma autoinmune o una inmunopatología inducida por patógenos. En
una realización específica, el sujeto padece LES, lupus nefrítico,
artritis reumatoide, ITC, VIH o hepatitis C. También pueden
contemplarse usos veterinarios de los métodos y composiciones
descritos.
Como se usa en este documento, "inhibe" o
"trata" o "tratamiento" incluye un aplazamiento del
desarrollo de los síntomas asociados con la enfermedad autoinmune o
inmunopatología inducida por patógenos y/o una reducción de la
gravedad de tales síntomas que se esperará o que se espere que se
desarrollen. Los términos incluyen adicionalmente mejorar los
síntomas inmunopatológicos inducidos por patógenos o relacionados
con enfermedades autoinmunes existentes incontrolados y no
deseados, prevenir síntomas adicionales y mejorar o prevenir las
causas subyacentes de tales síntomas. Por tanto, los términos
indican que se ha conferido un resultado beneficioso en un sujeto
vertebrado con una enfermedad o síntoma autoinmune o
inmunopatológica inducida por patógenos, o con el potencial para
desarrollar tal enfermedad o síntoma.
Como se usa en este documento, la expresión
"cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se
refiere a una cantidad de un anticuerpo específico para
IL-10 que cuando se administra sola o en combinación
con un agente terapéutico adicional a una célula, tejido o sujeto
es eficaz para prevenir o mejorar la enfermedad autoinmune o
enfermedad o estado asociado a la inmunopatología inducida por
patógenos o la progresión de la enfermedad. Una dosis
terapéuticamente eficaz se refiere además a una cantidad del
compuesto suficiente para dar lugar a una mejora de los síntomas,
por ejemplo, tratamiento, curación, prevención o mejora de la
condición médica pertinente, o un incremento en la tasa de
tratamiento, curación, prevención o mejora de tales condiciones.
Cuando se aplica a un ingrediente activo individual administrado
solo, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere al ingrediente
solo. Cuando se aplica en una combinación, una dosis
terapéuticamente eficaz se refiere a cantidades combinadas de los
ingredientes activos que dan como resultado un efecto terapéutico,
ya sea administrada en combinación, en serie o de manera
simultánea.
simultánea.
Como se describe anteriormente, puede
administrase un anticuerpo a un sujeto que lo necesita, por sí solo,
o en composiciones farmacéuticas cuando se mezcla con vehículos o
un excipiente (o excipientes) adecuados a dosis para tratar o
mejorar una diversidad de trastornos. Tal composición puede contener
también (además de la proteína y un vehículo) diluyentes, cargas,
sales, tampones, estabilizantes, solubilizantes, y otros materiales
bien conocidos en la técnica. La expresión "farmacéuticamente
aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con
la eficacia de la actividad biológica del ingrediente (o
ingredientes) activo. Las características del vehículo dependerán
de la vía de administración.
La composición farmacéutica de la invención
también contiene otros agentes inmunosupresores o inmunomoduladores.
Puede emplearse cualquier inmunosupresor adecuado, que incluye pero
sin limitación agentes antiinflamatorios, corticosteroides,
ciclosporina, tracolimus (es decir, FK-506),
sirolimus, interferones, receptores solubles de citocina (por
ejemplo, sTNRF y sIL-1R), agentes que neutralizan la
actividad de la citocina (por ejemplo, inflixmab, etanercept),
micofenolato mofetil, 15-deoxispergualin,
talidomida, glatiramer, azatioprina, leflunomida, ciclofosfamida,
metotrexato y similares. La composición farmacéutica también puede
emplearse con otras modalidades terapéuticas tales como fototerapia
y radiación.
En otra realización, se proporcionan kits que
contienen los reactivos necesarios para realizar los ensayos de los
métodos proporcionados en este documento. En este documento se
proporcionan específicamente un kit con compartimentos que
comprende uno o más envases, en el que el primer envase comprende
uno o más anticuerpos específicos para IL-10, y uno
o más otros envases que comprenden uno o más de lo que se indica a
continuación: reactivos de reconstitución, reactivos de
administración. Los envases pueden ser de vidrio, plástico o tiras
de plástico o de papel. En una realización, el kit también contiene
instrucciones escritas.
Practicando los métodos del tratamiento o uso
proporcionados en este documento, se administra una cantidad
terapéuticamente eficaz del anticuerpo proporcionado en este
documento a un mamífero que tiene una afección adecuada para el
tratamiento con IL-10. El anticuerpo puede
administrarse de acuerdo con los métodos descritos en este
documento tanto solos o en combinación con otras terapias tales como
tratamientos que emplean otros factores de inmunomodulación (por
ejemplo, citocinas), agentes inmunosupresores, y similares. Cuando
se co-administra con uno o más agentes
biológicamente activos, el anticuerpo proporcionado en este
documento puede administrarse tanto de manera simultánea con el
agente (o agentes) biológicamente activo, como de manera secuencial.
Si se administra de manera secuencial, el médico tratante decidirá
sobre la secuencia apropiada para suministrar la proteína de la
presente invención en combinación con el agente (o agentes)
biológicamente activo.
La toxicidad y eficacia terapéutica de las
composiciones del anticuerpo, administradas solas o en combinación
con un agente inmunosupresor, puede determinarse mediante
procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o
animales experimentales, por ejemplo, para la determinación de
DL_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) y DE_{50}
(la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La
proporción de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es
el índice terapéutico y puede expresarse como la proporción entre
DL_{50} y DE_{50}. Los anticuerpos preferidos son los que
presentan índices terapéuticos elevados. Los datos obtenidos a
partir de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales
pueden usarse para formular una variedad de dosificaciones para el
uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos se
encuentra preferiblemente dentro de un rango de concentraciones
circulantes que incluyen la DE_{50} con escasa o ninguna
toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango
dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de
administración utilizada.
Pueden encontrarse técnicas para la formulación
y administración de los anticuerpos de los métodos presentes en
REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co., Easton,
Pa., última Edición. El modo de administración no es
particularmente importante. Las vías de administración adecuadas
pueden incluir, por ejemplo, la administración oral, rectal,
transmucosa o intestinal, suministro parenteral, incluyendo
intramuscular, subcutáneo, inyecciones intramedulares, así como
inyección intratecal, intraventricular directa, intravenosa,
intraperitoneal, intranasal o intraocular. La administración del
anticuerpo usado en la composición farmacéutica o para practicar el
método de la presente invención puede realizarse en una diversidad
de formas convencionales tales como ingestión oral, inhalación,
aplicación tópica o inyección cutánea, subcutánea, intraperitoneal,
parenteral, intraarterial o intravenosa. Se prefiere la
administración intravenosa al paciente.
Como alternativa, puede administrarse el
anticuerpo de manera local en lugar de sistémica, por ejemplo,
inyectando directamente el anticuerpo en una articulación artrítica
o lesión inducida por patógenos caracterizada por inmunopatología,
a menudo en una formulación de depósito o liberación prolongada.
Además, puede administrarse el anticuerpo en un sistema de
suministro del medicamento dirigido, por ejemplo, en un liposoma
recubierto con un anticuerpo específico de tejido, dirigido a, por
ejemplo, una articulación artrítica o lesión inducida por patógenos
caracterizada por inmunopatología. Los liposomas se dirigirán a y se
captarán de manera selectiva por el tejido afectado.
Las composiciones farmacéuticas para usar de
acuerdo con los presentes métodos pueden formularse por tanto de
manera convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente
aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan la
elaboración de los compuestos activos en preparaciones que puede
usarse farmacéuticamente. Estas composiciones farmacéuticas pueden
elaborarse de una manera propiamente conocida, por ejemplo, por
medio de procedimientos convencionales, mezclando, disolviendo,
granulando, fabricando grageas, levigando, emulsificando,
encapsulando, por atrapamiento o liofilizando. La formulación
adecuada depende de la vía de administración elegida. Cuando se
administra en forma líquida, puede añadirse un vehículo líquido tal
como agua, vaselina, aceites de origen animal o vegetal tales como
aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de soja o aceite de
sésamo, o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición
farmacéutica puede contener además solución salina fisiológica,
dextrosa u otra solución sacárida, o glicoles tales como
etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol,. Cuando se
administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene
aproximadamente del 0,5 al 90% en peso de la proteína de la
presente invención y preferiblemente aproximadamente del 1 al 50%
en peso de la proteína de la presente
invención.
invención.
Cuando se administra una cantidad
terapéuticamente eficaz del anticuerpo de los métodos de este
documento por inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, la
proteína de la presente invención estará en forma de una solución
acuosa parenteralmente aceptable, sin pirógeno. La preparación de
tales soluciones de proteína aceptables por vía parenteral, que
tienen debidamente en cuenta el pH, la isotonicidad, estabilidad y
similares, está dentro de la experiencia en la técnica. Una
composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa,
cutánea o subcutánea debe contener, además de la proteína de la
presente invención, un vehículo isotónico tal como inyección de
Cloruro de Sodio, inyección de Ringer, inyección de Dextrosa,
inyección de Dextrosa y Cloruro de Sodio, inyección de Lactato de
Ringer u otro vehículo como se conoce en la técnica. La composición
farmacéutica de la presente invención también puede contener
estabilizantes, conservantes, tamponantes, antioxidantes u otros
aditivos conocidos por los especialistas en la técnica. Para la
inyección, los agentes de la invención pueden formularse en
soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente
compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o
tampón de solución salina fisiológica. Para la administración
transmucosa, en la formulación se usan penetrantes apropiados para
penetrar la barrera. Tales penetrantes se conocen generalmente en
la técnica.
Para la administración por inhalación, los
anticuerpos para usar de acuerdo con los métodos presentes se
suministran convenientemente en forma de una presentación de
pulverización en aerosol en envases presurizados o un nebulizador,
con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo,
diclorodifluorometano, triclorofluorometano,
diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En
el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación debe
determinarse proporcionando una válvula para suministrar una
cantidad de dosis medida. Las cápsulas y cartuchos, por ejemplo, de
gelatina para el uso en un inhalador o insuflador deben formularse
conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo
adecuada tal como lactosa o almidón. Los compuestos pueden
formularse para administración parenteral por inyección, por
ejemplo, por inyección en bolo o infusión continúa. Las
formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de
dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases
multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden
tomar formas tales como, suspensiones, soluciones o emulsiones en
vehículos oleaginosos o acuosos, y pueden contener agentes
formuladores tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o
dispersantes.
Las formulaciones farmacéuticas para
administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los
compuestos activos en forma hidrosoluble. De manera adicional, las
suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como
suspensiones de inyecciones oleaginosas apropiadas. Los disolventes
o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tales
como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales
como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones
de inyección acuosa pueden contener sustancias que aumentan la
viscosidad de la suspensión, tales como carboximetil celulosa
sódica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también
puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la
solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de
soluciones altamente concentradas. Como alternativa, el ingrediente
activo puede estar en forma de polvo para la constitución con un
vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril sin pirógeno, antes
del uso.
La cantidad de anticuerpo usado en los métodos
descritos en la composición farmacéutica de la presente invención
dependerá de la naturaleza y gravedad de la afección a tratar, y de
la naturaleza de tratamientos previos que el paciente ha
experimentado. Por último, el médico tratante decidirá la cantidad
de proteína de la presente invención con la que tratar a cada
paciente individual. Es de esperar que la dosificación variará de
acuerdo con la edad, peso y respuesta del paciente individual.
Inicialmente, el médico tratante administrará dosis reducidas de
los anticuerpos de los métodos presentes y observará la respuesta
del paciente. Pueden administrarse mayores dosis de los anticuerpos
de la presente invención hasta obtener el efecto terapéutico óptimo
para el paciente, y en este punto no aumentar más la dosificación.
Se contempla que las diversas composiciones farmacéuticas usadas
para practicar los métodos de este documento debe contener
aproximadamente de 0,01 \mug a aproximadamente 100 mg
(preferiblemente aproximadamente de 0,1 \mug a aproximadamente 10
mg, más preferiblemente aproximadamente de 0,1 \mug a
aproximadamente 1 mg) del anticuerpo de la presente invención por kg
de peso corporal. Cuando se administra, la composición terapéutica
para el uso en esta invención es, por supuesto, en una forma
fisiológicamente aceptable, sin pirógeno. Los agentes
terapéuticamente útiles distintos a un anticuerpo de los métodos
presentes que también pueden incluirse opcionalmente en la
composición como se ha descrito anteriormente, pueden administrarse
de manera alternativa o adicionalmente, simultáneamente o
secuencialmente con la composición en los métodos de la invención.
El médico en cuestión puede elegir la formulación exacta, vía de
administración y dosificación en función del estado del paciente.
Véase, por ejemplo, Fingl et al., THE PHARMACOLOGICAL BASIS
OF THERAPEUTICS (última edición). La cantidad e intervalo de la
dosificación debe ajustarse individualmente para proporcionar los
niveles en plasma del resto activo lo suficiente para mantener los
efectos terapéuticos deseados, o la concentración mínima eficaz
(CME). La CME variará para cada compuesto pero puede estimarse a
partir de datos in vitro; por ejemplo, la concentración
necesaria para conseguir una inhibición del 50-90%
de la actividad biológica usando los ensayos descritos en ese
documento.
El anticuerpo proporcionado en este documento
puede administrarse solo o en combinación con otras modalidades
terapéuticas. El anticuerpo proporcionado en este documento también
puede administrarse solo o en combinación con otros anticuerpos
identificados como inhibidores de la actividad de
IL-10 u otros agentes inmunosupresores.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
I
En Maniatis, et al. (1982) MOLECULAR
CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) MOLECULAR
CLONING: A LABORATORY MANUAL, (2d ed.), vols. 1-3,
CSH Press, NY; Ausubel, et al., BIOLOGY, Greene Publishing
Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel, et al. (1987 y
Suplementos) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene/Wiley,
New York se describen o se mencionan, por ejemplo, algunos de los
métodos convencionales. Los métodos para la purificación de
proteínas incluyen métodos tales como precipitación con sulfato de
amonio, cromatografía de columna, electroforesis, centrifugación,
cristalización y otros. Véase, por ejemplo, Ausubel, et al.
(1987 y suplementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to
Protein Purification" in METH. ENZYMOL., vol. 182, y otros
volúmenes en esta serie, y bibliografía del fabricante sobre el uso
de los productos de purificación de las proteínas, por ejemplo,
Pharmacia, Piscataway, N.J., o Bio-Rad, Richmond,
CA. La combinación con técnicas recombinantes permiten la fusión a
segmentos apropiados, por ejemplo, a una secuencia FLAG o una
equivalente que pueden fusionarse mediante una secuencia extraíble
por proteasa. Véase, por ejemplo, Hochuli (1990) "Purification of
Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow
(ed.) GENETIC ENGINEERING, PRINCIPLE AND METHODS
12:87-98, Plenum Press, N.Y.; y Crowe, et al.
(1992) QIAEXPRESS: THE HIGH LEVEL EXPRESSION & PROTEIN
PURIFICATION SYSTEM, Qiagen, Inc., Chatsworth, CA.
El análisis de secuencia por ordenador se
realiza, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles,
que incluyen los de las fuentes del GCG (U. Wisconsin) y GenBank.
También se usaron bases de datos de secuencias públicas, por
ejemplo, del GenBank y otras.
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Ejemplo
II
La humanización del anticuerpo de rata
anti-IL-10 humana, 12G8, se realizó
como se describe en la sección C anteriormente. La Figura 1 muestra
la asignación de los números de los restos y las puntuaciones
numéricas correspondientes que son idénticas a las secuencias de la
línea germinal a examinar. Se muestran los cálculos para las
regiones variables de 12G8 de la cadena ligera (Figura 1A) y pesada
(Figura 1B) del anticuerpo
anti-IL-10 humana 12G8 y para las
regiones variables de la cadena ligera (Figura 1C) y pesada (Figura
1D) del anticuerpo anti-IL-10
humana 11D8.
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Ejemplo
III
Objetivo: Obtener estimaciones de las
semividas terminales in-vivo y de la
biodisponibilidad subcutánea para el anticuerpo 12F8 en un modelo
murino.
Anticuerpo: El anticuerpo se administra
en un vehículo de acetato sódico 10 mM, sacarosa al 8%, pH 5,25.
Ratones: Se adquirieron ratones hembra
Crl:CD-1®(ICR)BR de Charles River
Laboratories.
Diseño Experimental: Los ratones
recibieron una inyección de bolo simple del anticuerpo por vía
intravenosa (i.v. en la vena lateral de la cola) o por vía
subcutánea (s.c. en la base del cuello o escapular medio o flanco
lateral). Las dosis del anticuerpo incluyó 0,03, 0,3, 3,0 y 30 mg/kg
por ratón. Los ratones se observaron hasta un máximo de 28 días
después de la inyección. Durante este período de tiempo, los ratones
se pesaron y se tomaron muestras de suero. Las muestras de suero
para los grupos (Grupos 1-8) de 12G8 (SCH 708980) se
tomaron a las 0,5, 1, 3, 6, 10, 16 horas, los Días 1, 2, 3, 5, 7,
10, 14, 21 y 28 después de la inyección usando 5 ratones/punto de
tiempo. En el grupo vehículo (Grupo 9), se tomaron muestras de suero
antes de la inyección, 1 hora después de la inyección, el día 14 o
el día 21 usando únicamente 5 ratones/punto de tiempo. Los niveles
de IL-10 en suero y los niveles del anticuerpo 12G8
en suero se determinaron usando ELISA específicos
Determinaciones de los Parámetros
Farmacocinéticos. Todos los parámetros se estimaron o se
calcularon usando WinNonlin Pro v 4.0. Para el análisis no
compartimental se usó el Modelo 200 (SC) o el Modelo 201 (IV). Los
datos de entrada eran datos de media aritmética de concentración
frente a tiempo de grupos normalizados con respecto a la dosis. Las
dosis de entrada eran dosis nominales para los Grupos
2-4 y 6-8. Las dosis de entrada
para los grupos 1 y 5 era de 0,014 mg/kg. Para el análisis
compartimental, se usó el Modelo 3 (SC) o el Modelo 7 (IV). Los
datos de entrada eran datos de concentración frente a tiempo del
animal individual normalizado con respecto a la dosis. Todos los
ajustes usaron ponderación uniforme (wt=1) (peso=1) para puntos de
datos individuales. Las dosis de entrada eran dosis nominales para
los Grupos 2-4 y 6-8. Las dosis de
entrada para los Grupos 1 y 5 era de 0,014 mg/kg. Se evaluó un buen
ajuste usando inspección visual, comparaciones de SE para los
parámetros estimados/calculados, residuales y criterios AIC &
SBC.
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En la siguiente Tabla se muestra un resumen de
la recuperación de la solución de dosificación.
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\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La siguiente tabla muestra los datos resumidos
para los grupos que reciben el anticuerpo 12G8 por inyección
i.v.
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\newpage
Las siguientes tablas muestran los datos
resumidos de los grupos que reciben el anticuerpo 12F8 por inyección
s.c.
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\vskip1.000000\baselineskip
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En la figura 2 se muestran los perfiles de
concentración-tiempo para el anticuerpo 12F8 usando
diversas dosificaciones y vías.
\newpage
Conclusiones: Las dosis estaban dentro
del 20% del nominal para todos los grupos excepto para el nivel de
dosis inferior. Se observaron concentraciones inferiores a las
esperadas, probablemente debido a la presencia de anticuerpos
anti-SCH708980 (12G8 humanizado), desde el Día 10
después de la inyección en los grupos 7 u 8. (A) Farmacocinética
de Bolo IV. Las semi-vidas, aclaramiento y
volúmenes de distribución son típicos de los observados en otros
anticuerpos monoclonales de IgG1. El volumen de distribución es
aproximadamente igual o ligeramente superior al volumen en suero lo
que sugiere distribución extravascular mínima. Las
semi-vidas terminales varían de 10 a 17 días. El
aumento en AUC era generalmente proporcional a la dosis lo que
sugiere PK lineal superior al intervalo de la dosis ensayada. (B)
Farmacocinética de Bolo SC. Las concentraciones máximas eran
generalmente proporcionales a la dosis y se alcanzaron a los
1-2 días después de la dosis lo que sugiere índices
y grados de absorción superiores al intervalo de la dosis ensayada.
El aumento en AUC era generalmente proporcional a la dosis lo que
sugiere PK lineal. Las semi-vidas de eliminación
terminal variaban de 8 a 14 días, similar a otros anticuerpos
monoclonales de IgG1. La biodisponibilidad absoluta era elevada,
intervalo = 70-100%, aunque la estimación > al
90% puede ser alta debido a infravaloración de AUC IV.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
IV
La constante de disociación en equilibrio (Kd)
para el anticuerpo humanizado SCH 708990 se determinó usando KinExA
3000 (Sapidyne Instruments Inc.). KinExA usa el principio del método
de Ensayo de Exclusión Cinético basándose en la medición de
concentración de anticuerpo que no ha formado complejo en una mezcla
de anticuerpo, antígeno y complejo
anticuerpo-antígeno. La concentración de anticuerpo
libre se midió exponiendo la mezcla a un antígeno inmovilizado en
una fase sólida durante un periodo de tiempo muy corto. En la
práctica, esto se consiguió haciendo pasar la fase en solución de
la mezcla por partículas recubiertas con antígeno inmovilizadas en
una célula de flujo. Los datos generados por el instrumento se
analizaron usando programas informáticos habituales. Las constantes
en equilibro se calcularon usando una teoría matemática basándose en
las siguientes hipótesis:
- 1.
- La unión sigue la ecuación de unión reversible para el equilibro:
K_{on} [Ab]
[Ag] =
K_{off}[AbAg]
- 2.
- El anticuerpo y el antígeno se unen 1:1 y el total de anticuerpo es equivalente al complejo antígeno-anticuerpo más el anticuerpo libre
- 3.
- La señal del instrumento se relaciona linealmente con la concentración de anticuerpo libre.
\vskip1.000000\baselineskip
Materiales usados: Anticuerpo monoclonal
humanizado SCH 708980 para IL-10 humana recombinante
(h12G8); IL-10 humana recombinante
(hIL-10); IL-10 de ratón
recombinante (mIL-10), IL-10 de mono
cynomolgus (cyno) recombinante (cyno IL-10); PMMA
(partículas de polimetacrilato de metilo), 98 micrómetros (Sapidyne,
Cat Nº 440198), Neutravidina (Pierce, Cat Nº 31000);
Ez-link TFP PEO-biotina (Pierce, Cat
Nº 21219); rhIL-10 Biotinilada y Cy5 conjugado con
Cabra anti IgG Hu (H+L) (Jackson Immunoresearch Laboratories Cat. Nº
109-175-088, lote 49069).
Las partículas de PMMA se recubrieron con rhIL5
biotinilada de acuerdo con los protocolos del fabricante. Para la
biotinilación de rhIL5 se usó Ez-link TFP
PEO-biotina de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante (boletín Pierce 0874). Todos los procedimientos
experimentales se realizaron de acuerdo con el manual KinExA
3000.
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones experimentales: Todos los
procesamientos se realizaron por duplicado. Para procesamientos de
hIL-10 se usaron las siguientes condiciones:
- Volumen de la muestra: 1,5 ml
- Caudal de la muestra: 0,25 ml/min
- Volumen del marcador: 0,5 ml
- Caudal del marcador: 0,25 ml/min
- Concentración de mAb: 0,1 nM
- Conc. máxima de Ag (hIL-10): 4,0 nM
- Conc. mínima de Ag (hIL-10): 3,91 pM
Se prepararon diluciones seriadas dobles del
antígeno y se mezclaron con el anticuerpo a concentración constante.
La mezcla se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente (RT)
hasta equilibrarse.
\vskip1.000000\baselineskip
Para procesamientos de mIL-10 se
usaron las siguientes condiciones:
- Volumen de la muestra: 0,5 ml
- Caudal de la muestra: 0,25 ml/min
- Volumen del marcador: 0,5 ml
- Caudal del marcador: 0,25 ml/min
- Conc. de mAb: 1 nM
- Conc. máxima de Ag (mIL-10): 50 nM
- Conc. mínima de Ag (mIL-10) 48,8 pM
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon diluciones seriadas dobles del
antígeno y se mezcló con el anticuerpo a concentración constante.
La mezcla se incubó durante 2 horas a RT hasta equilibrarse.
\vskip1.000000\baselineskip
Para procesamientos de cyno
IL-10 se usaron las siguientes condiciones:
- Volumen de la muestra: 2 ml
- Caudal de la muestra: 0,25 ml/min
- Volumen del marcador: 1 ml
- Caudal del marcador: 0,25 ml/min
- Conc. de mAb: 0,1 nM
- Conc. máxima de Ag (mIL-10): 5,0 nM
- Conc. mínima de Ag (mIL-10): 4,88 pM
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon diluciones seriadas dobles del
antígeno y se mezclaron con el anticuerpo a concentración constante.
La mezcla se incubó durante 2 horas a RT hasta equilibrarse.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados se muestran en la siguiente
Tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
V
Resumen de la tecnología. Se desarrolló
tecnología electroquimioluminiscente por IGEN, Inc (Gaithersburg,
MD) y se empleó en el analizador M-serie M8/384
usado en este trabajo. La tecnología electroquimioluminiscente
utiliza un quelato metálico de rutenio (Ori-TAG)
estable que, en presencia de tripropilamina (TPA), genera
electroquimioluminiscencia después de la aplicación de tensión. Las
perlas paramagnéticas, de micrómetros de diámetro, actúan como la
fase sólida y facilitan ensayos cinéticos rápidos. El complejo/perla
se canaliza a través de una célula de flujo y se captura en un
electrodo por aplicación magnética. Se aplica tensión y la
electroquimioluminiscencia resultante se mide.
Materiales usados. Placas de
Polipropileno de 96 pocillos (Costar, Cat. Nº 3365, Fisher Sci. Cat.
Nº 07200697); tampón de ensayo de BSA al 0,1%, tween 20 al 0,05%,
PBS a pH 7,5; perlas paramagnéticas
(Estreptavidina-Dinaperlas, Igen, Inc., Cat. Nº
110029); dímero de IL-10 humana recombinante
(hIL-10-dimer); monómero de
IL-10 humana recombinante
(hIL-10-mono); IL-10
de ratón recombinante (mIL-10);
IL-10 de cyno recombinante (cyno
IL-10) y hIL-10Ra recombinante
(hIL-10Ra): proteína marcada con FLAG. Se prepararon
anticuerpos monoclonales anti-FLAG M2 marcados con
Ori-Tag usando éster
Ori-Tag-NHS (Igen, Inc. Cat. No.
110034) de acuerdo con el protocolo del fabricante (marcador
OriTAg: proporción de exposición a IgG: 8:1). Se adquirieron
anticuerpos monoclonales Anti-Flag M2 de Sigma
(Cat. Nº F3165). Se prepararon anticuerpos monoclonales anti hIgG
1A2 marcados con Ori-Tag como antes usando
anticuerpos monoclonales anti hIgG de rata. Se prepararon
anticuerpos anti IgG de rata marcados con Ori-Tag
como antes a partir de anticuerpos policlonales de cabra anti hIgG
de rata (H+L) (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. PA, Cat.
Nº 112-005-143). Se preparó
IL-10 humana recombinante biotinilada
(hIL-10-biotina) usando
TFP-PEO-biotina (Pierce, Cat. Nº
21219) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (boletín
Pierce 0874). Se prepararon mAb 12G8
anti-hIL-10 de rata (r12G8):
JES3.12G8 y mAb 12G8 anti hIL-10 humanizado
(r12G8-1) como se ha descrito en este documento.
Protocolo. Se realizaron diluciones
seriadas 1/3 en 50 microlitros del tampón de ensayo en placas de
microtitulación de 96 pocillos para todas las preparaciones de
IL-10 no marcadas (mIL-10, cyno
IL-10, hIL-10 dímero,
hIL-10 mono) comenzando con 3 \mug/ml en el
primer pocillo. Todas las muestras se procesaron por duplicado. A
cada pocillo se añadieron 50 \mul de
hIL-10-biotina a 25 ng/ml, seguido
por la adición de hIL-10Ra (50 \mul a 100 ng/ml)
o mAb anti hIL-10 (50 \mul a 10 ng/ml). A cada
pocillo se añadieron 50 microlitros de anticuerpos secundarios
conjugados con OriTag a una concentración de 500 ng/ml. Por
consiguiente, para hIL-10Ra, r12G8 y h12G8 se
usaron los siguientes conjugados con Ori-Tag:
anti-FLAG M2-OriTag, IgG
anti-rata-OriTag y anti hIgG
1A2-OriTag. Finalmente a cada pocillo se le
añadieron 50 \mul de Estreptavidina-Dinaperlas a
0,1 mg/ml. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente
las placas se procesaron por el analizador M de la serie M8/394. Se
calculó el porcentaje de inhibición de la señal mediante
preparaciones IL-10 sin marcar con respecto a las
muestras de control. Para representar los datos y calcular la
CI_{50} se usó el programa informático GraphPad Prism.
Los resultados se muestran en la siguiente
Tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
En la siguiente tabla se resumen los resultados
de la caracterización del anticuerpo 12G8 de rata y del anticuerpo
12G8 humanizado (SCH708980).
Ejemplo
VI
Se evaluó in vivo la eficacia
neutralizante de SCH 708980 y JES.12G8 en el modelo Leishmania
major en ratones. En este modelo, los ratones CB6F1
normalmente resistentes a la infección del parásito se volvieron
susceptibles por heterocigosidad de un transgén de
IL-10 humano bajo control del promotor MHC de clase
II. A ratones CB6F1 o
CB6F1-huIL-10Tg se les inyectó
semanalmente por vía s.c. SCH 708980 o JES.12G8 comenzando tres
días antes de la exposición s.c. en la almohadilla plantar con
parásitos L. major 15x10^{6} en fase estacionaria. La
progresión de la enfermedad se controló midiendo semanalmente la
hinchazón de la almohadilla plantar. La Figura 3 muestra que tanto
SCH708980 (el 12G8 humanizado) como el 12G8 parental de rata
neutralizan el efecto protector de IL-10 de una
manera dependiente de la dosis.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Corporación Schering
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTICUERPOS PARA
INTERLEUCINA-10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> DX06061-RFD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> ESTADOS UNIDOS 60/518.999
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
10-11-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión de patente 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 10
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 449
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\newpage
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<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 448
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
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<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 639
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1347
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 654
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1344
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12G8 Quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 371
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12G8 Quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 699
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12G8 Quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 12G8 Quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Una molécula de anticuerpo recombinante
humanizada que se une a IL-10 o fragmento de unión
del mismo, que comprende:
al menos una región variable de cadena ligera
del anticuerpo o fragmento de unión del mismo, que comprende un
polipéptido que tiene una región variable de la SEC ID Nº:4; y
al menos una región variable de cadena pesada
del anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, que comprende un
polipéptido que tiene una región variable de la SEC ID Nº:9.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente una región constante de cadena pesada, en
la que la región constante de cadena pesada comprende una región
constante de cadena pesada humana \gamma1, \gamma2, \gamma3 o
\gamma4 o una variante de la mismas.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente una región constante de cadena ligera, en
la que la región constante de cadena ligera comprende una región
constante de cadena ligera humana lambda o kappa.
4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el
que el fragmento de unión es un fragmento de anticuerpo seleccionado
del grupo que consiste en Fab, Fab', Fab'-SH, Fv,
scFv, F(ab')_{2} y un diacuerpo.
5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el
que la cadena ligera del anticuerpo, o fragmento de unión del
mismo, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una
región constante de la SEC ID Nº:5.
6. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el
que la cadena pesada del anticuerpo, o fragmento de unión del
mismo, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una
región constante de la SEC ID Nº:10.
7. El uso de un anticuerpo específico para
IL-10, o un fragmento de unión del mismo, en una
cantidad eficaz para bloquear la actividad biológica de
IL-10 para la preparación de un medicamento para la
supresión de una respuesta inmune en un sujeto humano, en el que el
anticuerpo es el anticuerpo de la reivindicación 1 y en el que el
sujeto padece lupus eritematoso sistémico o lupus nefrítico.
8. El uso de la reivindicación 7, que comprende
adicionalmente la administración de un agente inmunosupresor.
9. Una composición que comprende un anticuerpo,
o fragmento de unión del mismo, en combinación con un vehículo o
diluyente farmacéuticamente aceptable, en la que el anticuerpo es el
anticuerpo de reivindicación 1.
10. La composición de la reivindicación 9, que
comprende adicionalmente un agente inmunosupresor.
11. Un ácido nucleico aislado que codifica el
polipéptido de la reivindicación 1.
12. Un vector de expresión que comprende la
secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 11 unida
operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula
hospedadora transfectada con el vector.
13. Una célula hospedadora aislada que comprende
el vector de la reivindicación 12.
14. Un método para la producción de un
polipéptido, que comprende el cultivo in vitro de la célula
hospedadora de la reivindicación 13 en condiciones en las que la
secuencia de ácido nucleico se expresa, produciendo de esta manera
el polipéptido y recuperando el polipéptido de la célula
hospedadora.
15. Una secuencia de ácido nucleico aislada que
codifica un anticuerpo específico para IL-10 que
comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de ácido
nucleico de la SEC ID Nº:19 y una cadena pesada que tiene la
secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº:20.
16. El ácido nucleico de la reivindicación 15,
en el que la cadena ligera tiene un número de depósito
PTA-5923 de la ATCC y la cadena pesada tiene un
número de depósito PTA-5922 de la ATCC.
17. Una secuencia de ácido nucleico aislada que
codifica un fragmento de unión del anticuerpo codificado por la
secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 15.
18. El ácido nucleico de la reivindicación 17,
en el que el fragmento de unión es un fragmento de anticuerpo
seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab',
Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')_{2} y un
diacuerpo.
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