MXPA06005210A

MXPA06005210A - Anticuerpos de interleucina-10

Info

Publication number: MXPA06005210A
Application number: MXPA/A/2006/005210A
Authority: MX
Inventors: Leonard G Presta
Original assignee: Leonard G Presta
Priority date: 2003-11-10
Filing date: 2006-05-09
Publication date: 2006-10-17

Abstract

Los métodos y composiciones proporcionados en la presente invención se refieren, en general, a anticuerpos específicos de IL-10 y sus usos;más específicamente, las composiciones de anticuerpos específicos de IL-10 humanizados y métodos para utilizar ese tipo de anticuerpos en la modulación de la actividad biológica de IL-10, particularmente en trastornos autoinmunes e inmunopatología mediada por un patógeno.

Description

ANTICUERPOS DE INTERLEUC1NA-10 La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de Patente de E.U.A. No. 60/518,999, presentada el 10 de noviembre de 2003, que se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a anticuerpos específicos de interleucina 10 (IL-10) y a sus usos. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos humanizados que reconocen IL-10 humana y modulan su actividad, particularmente en trastornos autoinmunes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Inicialmente conocida como el factor de inhibición de la síntesis de citocinas o CSIF, la interleucina 10 (IL-10) es un potente inmunomodulador de las células hematopoyéticas, particularmente células inmunes. Las células tales como células Th2 activadas, células B, queratinocitos, monocitos y macrófagos producen IL-10. Véase, por ejemplo, Moore et al., Annu. Rev. Immunol. 11:165 (1993). IL-10 inhibe la activación y las funciones efectoras de una cantidad de células que incluyen a las células T, monocitos y macrófagos.

En particular, IL-10 inhibe la síntesis de citocinas, incluyendo aquella de IL-1 , IFN-y y TNF, por células tales como las células Th1 , células matadoras naturales, monocitos, y macrófagos. Véase, por ejemplo, Florentino et al., J. Exp. Med., 170:2081-2095 (1989); Florentino et al., J. Immunol. 146:3444 (1991); Hsu et al., Int. Immunol. 4:563 (1992); Hsu et al., Int. Immunol. 4:563 (1992); D'Andrea et al., J. Exp. Med. 178:1041 (1993); de Waal Malefyt et al., J. Exp. Med. 174:915 (1991); Florentino et al., J. Immunol. 147:3815 (1991 ). Múltiples patógenos, particularmente patógenos intracelulares, activan la producción de IL-10 para alentar o completamente evitar la eliminación eficaz del patógeno mediante la respuesta inmune. Moore et al., Annu. Rev. Immunol. 1 _:165 (1993). Por ejemplo, en los linfocitos sanguíneos de pacientes con VIH, lepra o tuberculosis, los linfocitos sanguíneos periféricos son típicamente anérgicos o no respondedores in vitro cuando se desafían con el patógeno. Sin embargo, la neutralización de IL-10 en estos demostró que una respuesta efectora activa, es decir, reactividad Th1 , estaba presente en estas células. Por lo tanto, se cree que IL-10 es requisada eficazmente por el patógeno para facilitar su estado infeccioso. IL-10 es también asociada con la autoinmunidad in vivo. La autoinmunidad es el resultado del desarrollo de auto-anticuerpos, células T auto-reactivas, o alguna combinación de los mismos que apuntan al tejido normal. Un ejemplo de enfermedad autoinmune es el lupus sistémico eritematoso (SLE, por la expresión en inglés "systemic lupus erythematosus"), una enfermedad reumática crónica en la cual el tejido conectivo de todo el cuerpo se inflama. Los auto-anticuerpos que atacan a los tejidos del cuerpo normales como si fueran una invasión externa dan como resultado la inflamación característica. Si bien la causa precisa no es completamente entendida, los investigadores creen que tiene tanto componentes genéticos como ambientales. Específicamente, la hiperactividad de las células B y la presencia de diversos auto-anticuerpos caracterizan al SLE. Típicamente, los auto-anticuerpos de IgG reactivos a ADN de doble hebra (abs anti-dsDNA IgG) se elevan en pacientes con SLE. Entre 60 y 70% de los pacientes con SLE producen abs anti-dsDNA de IgG, algunos de los cuales son nefrotóxicos. SLE es diez veces más prevaleciente en las mujeres que en los hombres, con síntomas que varían entre zarpullidos faciales a discapacitar y disfunción orgánica potencialmente amenazadora de la vida. Puede desarrollarse a cualquier edad, aunque es más común en los adultos jóvenes. Numerosos estudios apoyan un rol de IL-10 en la patología asociada con SLE. Por ejemplo, si bien IL-10 típicamente no es producida por células sin la apropiada estimulación, tanto las células B como los macrófagos de pacientes con SLE producen de manera espontánea altos niveles de IL-10 in vitro. Llórente, et al., Arthritis Rheum. 40:249-60 (1997). En diversos estudios, los investigadores demostraron una correlación entre los niveles en suero de IL-10 y la actividad de la enfermedad. Asimismo, tanto los estudios in vivo como in vitro demostraron que el bloqueo de la producción de IL-10 puede aliviar las manifestaciones clínicas de SLE. Véase, por ejemplo, González-Amaro, et al. J. Autoimmunity 11:395-402 (1998).

Hasta la fecha, una de las manifestaciones del SLE, lupus nefritis, ha sido tratada con el uso de terapias inmunosupresoras, por ejemplo, corticosteroides y ciclofosfamidas. Si bien son eficaces, estas terapias son no específicas y existen toxicidades sustancíales las cuales evitan la terapia de largo plazo. Por lo tanto, los anticuerpos neutralizantes específicos pueden ser antagonistas eficaces de IL-10, permitiendo la eliminación de los efectos supresores de IL-10 dejando al mismo tiempo al resto de la red de respuestas inmunes intacta. La limitación más significativa frente al uso de anticuerpos como un agente terapéutico in vivo es la ¡nmunogenicidad de los anticuerpos. Como la mayoría de los anticuerpos monoclonales son derivados de roedores, el uso repetido en humanos da como resultado la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo terapéutico. Ese tipo de respuesta inmune da como resultado una pérdida de la eficacia terapéutica en un mínimo y una respuesta anafiláctica fatal potencial en un máximo. Los esfuerzos iniciales para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos de roedores involucraron la producción de anticuerpos quiméricos, en los cuales las regiones variables de ratón fueron fusionadas con regiones constantes humanas. Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439 (1987). Sin embargo, los ratones inyectados con híbridos de regiones variables humanas y regiones constantes de ratón desarrollan una respuesta anti-anticuerpos fuerte dirigida contra la región variable humana, lo cual sugiere que la retención de la región Fv de roedor entera en ese tipo de anticuerpos quiméricos aun puede dar como resultado una inmunogenicidad no deseada en pacientes. En general, se cree que los lazos de la región determinante de la complementariedad (CDR, por la expresión en inglés "complementarity determining región") de los dominios variables comprenden el sitio de unión de las moléculas de anticuerpos. Por lo tanto, el injerto de lazos de CDR de roedor en estructuras humanas (es decir, humanización) se intentó para minimizar adicionalmente las secuencias de roedor. Jones et al., Nature 321 :522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988). Sin embargo, los intercambios de lazos de CDR aun no dan como resultado, uniformemente, un anticuerpo con las mismas propiedades de unión que el anticuerpo de origen. Los cambios en los residuos estructurales (FR, por "framework residues"), residuos involucrados en el soporte de lazos de CDR, en anticuerpos humanizados también deben preservar la afinidad de unión al antígeno. Kabat et al., J. Immunol. 147:1709 (1991 ). Si bien el uso de injertos de CDR y preservación de residuos estructurales en una cantidad de construcciones de anticuerpos humanizados ha sido reportado, es difícil predecir si una secuencia en particular dará como resultado el anticuerpo con las propiedades de unión y algunas veces biológicas deseadas. Véase, por ejemplo, Queen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:10029 (1989), Gorman et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:4181 (1991 ), y Hodgson, Bio/Technology 9:421 (1991). Asimismo, la mayoría de los estudios anteriores utilizaron diferentes secuencias humanas para secuencias variables ligeras y pesadas animales, tornando a la naturaleza predictiva de tales estudios cuestionable. Las secuencias de anticuerpos conocidos se han utilizado o, más típicamente, aquellas de anticuerpos que tienen estructuras de rayos X conocidas, anticuerpos NEW y KOL. Véase, por ejemplo, Jones et al., supra; Verhoeyen et al., supra; y Gorman et al., supra. La información de secuencias exacta ha sido reportada para sólo unas pocas construcciones humanizadas. La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales humanizados los cuales reconocen IL-10 humana y modulan su actividad, en particular con respecto a los trastornos autoinmunes. El anticuerpo humanizado debería proporcionar una elección de terapia alternativa sin la toxicidad y la no especificidad asociadas con los tratamientos actuales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporciona en la presente una molécula de anticuerpo recombinante humanizada que se une a IL-10, o a su fragmento de unión, que comprende: por lo menos una región variable de cadena ligera de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:1 en CDR1 , SEC ID NO:2 en CDR2, y SEC ID NO:3 en CDR3; y una región de estructura, en donde la secuencia de aminoácidos de la región de estructura es toda o sustancialmente toda de una secuencia de aminoácidos de inmunoglobina humana; y por lo menos una región variable de cadena pesada de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de SEC ID NO:6 en CDR1 , SEC ID NO:7 en CDR2, y SEC ID NO:8 en CDR3; y una región estructural, en donde la secuencia de aminoácidos de la región estructural es en su totalidad o sustancialmente en su totalidad de una secuencia de aminoácidos de inmunoglobina humana. También se proporciona en la presente un anticuerpo, en el cual la cadena ligera del anticuerpo, o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable de SEC ID NO:4. En una modalidad específica, la cadena ligera del anticuerpo, o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región constante de SEC ID NO:5. En una modalidad específica, la cadena pesada de anticuerpo, o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable de SEC ID NO:9. En otra modalidad específica, la cadena pesada del anticuerpo, o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región constante de SEC ID NO: 10. Se proporciona adicionalmente en la presente invención una molécula de anticuerpo recombinante quimérica que une IL-10 o su fragmento de unión, que comprende: por lo menos una región variable de cadena ligera de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende: por lo menos una región variable de cadena ligera del anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID NO:1 en CDR1 , SEC ID N0:2 en CDR2, y SEC ID N0:3 en CDR3; y por lo menos una región variable de cadena pesada de anticuerpo , o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:6 en CDR1 , SEC ID NO:7 en CDR2, y SEC ID NO:8 en CDR3. En la presente invención también se proporciona una molécula de anticuerpo recombinante humanizado que une IL-10, o su fragmento de unión, que comprende: por lo menos una cadena ligera de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:11 en CDR1 , SEC ID NO:12 en CDR2, y SEC ID NO:13 en CDR3; y una región de estructura, en la cual la secuencia de aminoácidos de la región de estructura es toda o sustancialmente toda de una secuencia de aminoácidos de inmunoglobina humana; y por lo menos una cadena pesada de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:15 en CDR1 , SEC ID NO:16 en CDR2, y SEC ID NO:17 en CDR3; y una región estructural, en donde la secuencia de aminoácidos de la región estructural es toda o sustancialmente toda de una secuencia de aminoácidos de inmunoglobina humana. En una modalidad específica, la cadena ligera del anticuerpo, o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región constante de SEC ID NO:14. En aun otra modalidad específica, la cadena pesada del anticuerpo, o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región constante de SEC ID NO: 18. En la presente invención se provee una molécula de anticuerpo recombinante quimérica que une IL-10, o su fragmento de unión, que comprende: por lo menos una cadena ligera del anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:11 en CDR1 , SEC ID NO:12 en CDR2, y SEC ID NO:13 en CDR3; y por lo menos una cadena pesada del anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:15 en CDR1 , SEC ID NO:16 en CDR2, y SEC ID NO:17 en CDR3. En una modalidad, los anticuerpos descritos más arriba comprenden además una región constante de cadena pesada, en donde la región constante de cadena pesada comprende una región constante de cadena pesada humana ?1 , ?2, ?3, o ?4 o una variante de la misma. En una modalidad, los anticuerpos antes descritos comprenden además una región constante de cadena ligera, en donde la región constante de cadena ligera comprende una región constante de cadena ligera humana lambda o kappa. En algunas modalidades, el fragmento de unión de estos anticuerpos es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo formado por Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, y un diacuerpo.

Se provee adicionalmente en la presente invención un método de supresión de una respuesta inmune en un sujeto humano que comprende administrar a un sujeto que lo necesita un anticuerpo específico para IL-10, o su fragmento de unión, en una cantidad eficaz para bloquear la actividad biológica de IL-10, en donde el anticuerpo es un anticuerpo descrito en la presente Invención. La respuesta inmune suprimida por este método es una respuesta humoral o celular. En una modalidad, el sujeto tratado mediante este método tiene lupus sistémico eritematoso. En otra modalidad, el sujeto tiene púrpura trombocitopénica inmune (ITC, por sus siglas en inglés "immune thrombocytopenic purpura"). En aun otra modalidad, el sujeto tiene lupus nefritis. En una modalidad adicional, el sujeto tiene VIH. En otra modalidad, el sujeto tiene hepatitis C. En una modalidad específica, el método de supresión de una respuesta inmune en un sujeto humano que comprende administrar a un sujeto que lo necesita (1) un anticuerpo específico para IL-10, o su fragmento de unión, en una cantidad eficaz para bloquear la actividad biológica de IL-10, en donde el anticuerpo es un anticuerpo descrito en la presente, y (2) un agente inmunosupresor. Se proporciona en la presente invención una composición que comprende un anticuerpo, o su fragmento de unión, en combinación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, en donde el anticuerpo es uno de los anticuerpos antes descritos. Se proporciona adicionalmente en la presente invención un ácido nucleico aislado que codifica al polipéptido de los anticuerpos antes descritos.

También se proporciona en la presente invención un vector de expresión que comprende la secuencia de ácidos nucleicos aislados ligada operativamente a secuencias control reconocidas por una célula huésped transfectada con el vector. Se proporciona en la presente invención una célula huésped que comprende el vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos aislados. Se provee además en la presente un método para producir un polipéptido, que comprende cultivar la célula huésped que comprende el vector bajo condiciones en las cuales la secuencia de ácidos nucleicos es expresada, produciendo de ese modo el polipéptido, y recuperando el polipéptido de la célula huésped. Se provee en la presente invención una secuencia de ácidos nucleicos aislados que codifica un anticuerpo específico para IL-10 que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO: 19 y una cadena pesada que tiene la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO:20. En otras modalidades, la cadena ligera tiene un número de depósito en el American Type Culture Collection (ATCC) de PTA-5923 y la cadena pesada tiene un número de depósito en ATCC de PTA-5922. Se proporciona en la presente invención una secuencia de ácidos nucleicos aislados que codifica un anticuerpo específico para IL-10 que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO:21 y una cadena pesada que tiene la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO:22. En una modalidad adicional, la cadena ligera tiene un número de depósito en el ATCC de PTA-5927 y la cadena pesada tiene un número de depósito en el ATCC de PTA-5926. Se provee además en la presente invención una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un fragmento de unión del anticuerpo codificado por las secuencias de ácidos nucleicos antes mencionadas. En una modalidad, el fragmento de unión es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo formado por Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, y F(ab')2. Se proporciona en la presente invención un método para identificar una secuencia de línea germinal aceptora para un anticuerpo humanizado, cuyo método comprende los pasos de: a) identificar un anticuerpo no humano que tiene la actividad biológica deseada; b) determinar la secuencia de aminoácidos de los dominios VH y VL de anticuerpo no humano; y c) comparar la secuencia de anticuerpo no humano con un grupo de secuencias de líneas germinales humanas, en donde la comparación comprende los subpasos de: 1 ) asignar la secuencia de números de residuos de secuencias de dominios VH y VL no humanas; 2) delinear las regiones de CDR y FR en la secuencia; 3) asignar un resultado numérico predeterminado en cada posición residual para la cual las secuencias de línea germinal no humana y humana son idénticas; y 4) totalizar todos los resultados de residuos para generar un resultado total para cada secuencia de línea germinal humana; y d) identificar la secuencia de línea germinal humana con el resultado de residuos total más alto como la secuencia de línea germinal aceptora. En una modalidad, el método comprende además los subpasos de: 5) asignar un resultado numérico de 1 por cada posición de residuo para la cual las secuencias de línea germinal humana y no humana son idénticas que no fue calificada en el subpaso (3) a secuencias de línea germinal con resultados de residuos totales idénticos después del subpaso (4); 6) totalizar todos los resultados de residuos para generar un resultado total para cada secuencia de línea germinal humana. En una modalidad específica, el anticuerpo no humano es específico para IL-10 e inhibe la actividad biológica de IL-10. En una modalidad específica, los resultados numéricos son asignados a los residuos como en los Cuadros 2 y 3 para las regiones VH y VL, respectivamente. Se provee adicionalmente en la presente un anticuerpo generado mediante el método antes mencionado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1A muestra la asignación de números de residuos y resultados numéricos a la secuencia de la línea germinal aceptora potencial con relación a la cadena ligera variable del anticuerpo de IL-10 anti-humano, 12G8. La Figura 1 B muestra la asignación de números de residuos y resultados numéricos a la secuencia de la línea germinal aceptora potencial con relación a la cadena pesada variable del anticuerpo de IL-10 anti-humano, La Figura 1C muestra la asignación de números de residuos y resultados numéricos a la secuencia de la línea germinal aceptora potencial con relación a la cadena ligera variable del anticuerpo de IL-10 anti-humano, 11D8. La Figura 1 D muestra la asignación de números de residuos y resultados numéricos a la secuencia de la línea germinal aceptora potencial con relación a la cadena pesada variable del anticuerpo de IL-10 anti-humano, 12D8. La Figura 2A es un perfil de concentración- tiempo para el anticuerpo 12G8 administrado i.v. según lo descrito en el Ejemplo III. La Figura 2B es un perfil de concentración- tiempo para el anticuerpo 12G8 administrado s.c. según lo descrito en el Ejemplo III. La Figura 3A muestra que la administración del anticuerpo anti-IL-10 humanizado, SCH708980, confiere resistencia a la infección Leishmania major en ratones transgénicos con IL-10. La infección fue determinada midiendo la hinchazón de la almohadilla del pie con un calibre en los tiempos indicados. Se administró el anticuerpo 12G8 según lo descrito en el Ejemplo VI. La Figura 3B muestra que la administración del anticuerpo anti-IL-10 de rata, 12G8, confiere resistencia a la infección Leishmania major en ratones transgénicos con IL-10. La infección fue determinada midiendo la hinchazón de la almohadilla del pie con un calibre en los tiempos indicados.

Se administró el anticuerpo 12G8 según lo descrito en el Ejemplo VI.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Por razones de claridad de la descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención es dividida en las subsecciones que siguen.

A. Definiciones A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención tienen el mismo significado al comúnmente entendido por un experto en la técnica a la cual pertenece esta invención. Todas las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones a las que se hace referencia en la presente se incorporan como referencia en su totalidad. Si una definición expuesta en esta sección es contraria a, o de algún otro modo, inconsistente con una definición expuesta en las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones que se incorporan en la presente como referencia, la definición expuesta en esta sección prevalece con respecto a la definición que se incorpora en la presente como referencia. Como se utiliza en la presente invención, "un" o "uno/a" significa "por lo menos uno/a" o "uno/a o más." Como se utiliza en la presente invención, el término "anticuerpo" se refiere a cualquier forma de anticuerpo o su fragmento que exhibe la actividad biológica deseada. Por lo tanto, se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada. Como se utiliza en la presente invención, el término "fragmento de unión a IL-10" o "su fragmento de unión" abarca un fragmento o un derivado de un anticuerpo que aun retiene sustancialmente su actividad biológica de inhibir la actividad de IL-10. Por consiguiente, el término "fragmento de anticuerpo" o fragmento de unión a IL-10 se refiere a una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región de unión al antígeno o variable del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen a los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena única, por ejemplo, sc-Fv; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Típicamente, un fragmento de unión o derivado retiene por lo menos un 50% de su actividad inhibitoria de IL-10. Preferentemente, un fragmento de unión o derivado retiene al menos un 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de su actividad inhibitoria de IL-10. También se pretende que un fragmento de unión a IL-10 puede incluir sustituciones de aminoácidos conservadores que no alteran sustancialmente su actividad biológica. El término "anticuerpo monoclonal", como se utiliza en la presente invención, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un único epítope antígeno. En contraste, las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales típicamente incluyen una multitud de anticuerpos dirigidos contra (o específicos para) diferentes epítopes. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como siendo obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como requiriendo la producción del anticuerpo mediante cualquier método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser utilizados de conformidad con la presente invención pueden prepararse mediante el método del hibridoma primero descrito por Kohler et al., Nature 256: 495 (1975), o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Pat. estadounidense No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden ser aislados de bibliotecas de anticuerpos de fagos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales de la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie en particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo en particular, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntica a u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo, como así también fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada (Pat. Estadounidense No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad Sci. USA 81.: 6851-6855 (1984)). Como se utiliza en la presente invención, el término "Fv de cadena única" o anticuerpo "scFv" se refiere a fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica única. En general, el polipéptido Fv comprende además un ligante de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite que sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una reseña de sFv, véase Pluckthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994). Como se utiliza en la presente invención, el término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante el uso de un ligante que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos son descritos más completamente en, por ejemplo, Patente Europea 404,097; WO 93/11161 ; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Como se utiliza en la presente invención, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) como así también anticuerpos humanos. Ese tipo de anticuerpos son anticuerpos quiméricos los cuales contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en donde la totalidad o sustancialmente la totalidad de los lazos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Como se utiliza en la presente invención, el término "región hipervariable" se refiere a los residuos aminoácidos de un anticuerpo los cuales son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (es decir, los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y los residuos 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos residuos de un "lazo hipervariable" (es decir los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Como se utiliza en la presente invención, el término "estructura" o residuos "FR" se refiere a aquellos residuos de dominio variable distintos a los residuos de región hipervariable definidos en la presente invención como residuos CDR. Como se utiliza en la presente invención, el termino "sustitución conservadora" se refiere a sustituciones de aminoácidos que son conocidas por expertos en esta técnica pueden realizarse generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Los expertos en esta técnica reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos únicas en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson, et al., Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4ta Edición 1987)). Ese tipo de sustituciones ejemplares se efectúan preferentemente de conformidad con lo expuesto en el Cuadro 1 como sigue: CUADRO 1 Residuo original Sustitución conservadora Ala (A) Gly; Ser Arg (R) Lys Asn (N) Gln; His Cys (C) Ser Gln (Q) Asn Glu (E) Asp Giy (G) Ala; Pro His (H) Asn; Gln He (I) Leu; Va! Leu (L) lie; Val Lys (K) Arg; Gln; Glu Met (M) Leu; Tyr; lie Phe (F) Met; Leu; Tyr Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Trp; Phe Val (V) lie; Leu Otras sustituciones son más permisibles y pueden determinarse empíricamente o de conformidad con sustituciones conservadoras conocidas. Como se utiliza en la presente invención, el término "molécula de ácido nucleico aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que es identificada y separada de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual está comúnmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislado es distinta a aquella con la forma o disposición en la cual es encontrada en la naturaleza. Por consiguiente, las moléculas de ácido nucleico aislado son distinguidas de la molécula de ácido nucleico de la manera en que existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que comúnmente expresan el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente a la de las células naturales. La expresión "secuencias control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora operativamente ligada en un organismo huésped en particular. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Las células eucarióticas son conocidas que utilizan promotores, señales de poliadenilación e intensificadores. El ácido nucleico es "ligado operativamente" cuando es colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una presecuencia o líder secretor está ligado operativamente a ADN para un polipéptido si es expresado como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador está ligado operativamente a una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está ligado operativamente a una secuencia codificadora si está posicionado de modo de facilitar la traducción. En general, "ligado operativamente" significa que las secuencias de ADN que se están ligando son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguo y en fase de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen que ser contiguos. La conexión se logra mediante la ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores o ligantes oligonucleotídicos sintéticos se utilizan de conformidad con la práctica convencional. Como se utiliza en la presente invención, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan intercambiablemente y todas tales designaciones incluyen a la progenie. Por lo tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen a la célula primaria en cuestión y cultivos derivados de la misma sin importar el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertentes. Las progenies mutantes que tienen la misma función o actividad biológica de conformidad con la selección en la célula originalmente transformada se incluyen. Cuando se pretenden distintas designaciones, quedará claro a partir del contexto. Como se utiliza en la presente invención, "reacción en cadena de polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento o técnica en donde cantidades diminutas de un trozo específico de ácido nucleico, ARN y/o ADN, se amplifican según lo descrito en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4,683,195. En general, la información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá necesita estar disponible, de modo que puedan diseñarse cebadores de oligonucleótidos; estos cebadores serán idénticos o similares en secuencia a las hebras opuestas del patrón a ser amplificado. Los nucleótidos de terminal 5' de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR puede ser utilizada para amplificar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas de ADN genómico total y ADNc transcripto de ARN celular total, secuencias bacteriófagas o plásmidas, etc. Véase, en general Mullís et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51 :263 (1987); Erlich, ed., PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y., 1989). Como se utiliza en la presente Invención, la PCR es considerada como un ejemplo, aunque no el único ejemplo, de un método de reacción de polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de ensayo de ácido nucleico que comprende el uso de un ácido nucleico conocido como un cebador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar un trozo específico de ácido nucleico. Como se utiliza en la presente invención, el término "secuencia de línea germinal" se refiere a una secuencia de secuencias de ADN de inmunoglobulina no reorganizada. Puede utilizarse cualquier fuente adecuada de inmunoglobulina no reorganizada. Como se utiliza en la presente invención, el término "agente inmunosupresor" se refiere a agentes naturales o sintéticos que suprimen o modulan una respuesta inmune. La respuesta inmune puede ser una respuesta humoral o celular.

B. Anticuerpos específicos de IL-10 Las composiciones y métodos descritos en la presente invención se refieren a la modulación de la actividad de IL-10, particularmente en las respuestas inmunes. Específicamente, las composiciones y métodos de la presente invención emplean anticuerpos específicos de la citocina, IL-10. IL- 10 es una potente citocina que modula las respuestas de las células T y B a través de la regulación de crecimiento, diferenciación y síntesis de citocinas de una variedad de tipos celulares involucrados en las respuestas inmunes. Notablemente, la producción de IL-10 está asociada frecuentemente con enfermedades autoinmunes e inmunopatología inducida por patógeno. Por consiguiente, una composición, y métodos de la misma, que modula e inhibe la actividad de IL-10 puede alterar el desarrollo y sostenimiento de una enfermedad autoinmune y síntomas relacionados y aliviar o reducir la inmunopatología asociada con el patógeno. La localización del blanco de la actividad de IL-10 con anticuerpos humanizados ofrece diversas ventajas únicas. En primer lugar, la localización del blanco de IL-10 con anticuerpo permite una supresión específica de la actividad de IL-10 dejando al mismo tiempo el resto de la respuesta inmune intacto. En muchos casos de inmunopatología inducida por un patógeno, la reducción o eliminación de la actividad de IL-10 debería permitir que la respuesta inmune efectora deseada se elimine con patógeno sin más patología. Para el paciente autoinmune, la reducción o eliminación de la actividad de IL-10 debería reducir o eliminar la enfermedad y/o sus síntomas manteniendo al mismo tiempo la competencia inmune del paciente. En segundo lugar, los anticuerpos de IL-10 humanizados evitan la limitación asociada con los anticuerpos de roedor inmunógenos. El uso de secuencias humanas elimina la inmunogenicidad de los anticuerpos exógenamente administrados, permitiendo la administración terapéutica. Los anticuerpos humanizados contienen secuencias de anticuerpos no humanos como así también de anticuerpos humanos. Típicamente, el proceso de humanización comienza con la generación de un anticuerpo no humano que tiene la actividad biológica deseada, es decir, inhibe la actividad de IL-10. Una vez que un anticuerpo no humano con las características apropiadas es identificado, luego se emplean medios recombinantes para crear una secuencia híbrida utilizando secuencias humanas y no humanas.

C. Generación de Anticuerpos Específicos anti-IL-10 Puede utilizarse cualquier método adecuado para generar anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, un receptor puede ser inmunizado con IL-10 o un fragmento del mismo. Puede utilizarse cualquier método adecuado de inmunización. Ese tipo de métodos puede incluir adyuvantes, otros inmunoestimulantes, inmunizaciones de refuerzo repetidas, y el uso de una o más rutas de inmunización. Puede utilizarse cualquier fuente de IL-10 como el inmunógeno para la generación del anticuerpo no humano de las composiciones y métodos descritos en la presente invención. Tales formas incluyen, aunque no se limitan a proteína entera, péptido(s) y epítopes, generados a través de medios de degradación recombinante, sintética, química o enzimática conocidos en la técnica. IL-10 es un homodímero sensible al ácido, no covalente de dos cadenas polipeptídicas interpenetrantes. La citocina tiene 160 aminoácidos de longitud con secuencias bien conservadas que incluyen una estructura de manojos a-helicoidales similar a interferones y citocinas hemopoyéticas. IL-10 humana y de murino tienen 73% de homología de aminoácidos, siendo IL-10 humana activa en células de murino y humanas. IL-10 está comerciaimente disponible o puede ser producida utilizando técnicas de biología molecular bien conocidas. Las secuencias de ADNc del Genbank están disponibles para el humano, macaco cola de chancho, mangabey, rhesus, y monos lechuzas, lémur, ratón, rata, conejillo de Indias, hámster sirio, conejo, gato, perro como así también otros. IL-10 humana recombinante es un polipéptido de 17-18 kDa que es no N gllcosilado. Puede utilizarse cualquier forma del antígeno para generar el anticuerpo que es suficiente para generar un anticuerpo biológicamente activo. Por consiguiente, el antígeno activador puede ser un epítope único, múltiples epítopes o la proteína entera sola o en combinación con uno o más agentes intensificadores de la inmunogenicidad conocidos en la técnica. El antígeno activador puede ser una proteína de longitud completa aislada, una proteína de superficie celular (por ejemplo, inmunizando con células transfectadas con por lo menos una porción del antígeno), o una proteína soluble (por ejemplo, inmunizando con solamente la porción del dominio extracelular de la proteína). El antígeno puede ser producido en una célula genéticamente modificada. El ADN que codifica al antígeno puede ser genómico o no genómico (por ejemplo, ADNc) y codifica por lo menos una porción del dominio extracelular. Como se utiliza en la presente invención, el término "porción" se refiere a la cantidad mínima de aminoácidos o ácidos nucleicos, según lo apropiado, para constituir un epítope inmunógeno del antígeno de interés. Puede utilizarse cualquier vector genético adecuado para la transformación de las células de interés, incluyendo aunque sin limitarse a los vectores adenovirales, plásmidos y vectores no virales, tales como lípidos catiónicos. Puede utilizarse cualquier método adecuado para activar un anticuerpo con las propiedades biológicas deseadas para inhibir IL-10. Es conveniente preparar anticuerpos monoclonales (mAbs) de diversos huéspedes mamíferos, tales como ratones, roedores, primates, humanos, etc. La descripción de las técnicas para preparar ese tipo de anticuerpos monoclonales puede encontrarse en, por ejemplo, Stites, et al. (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas allí; Harlow y Lañe (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRAGTICE (2d ed.) Academic Press, Nueva York, NY. Por lo tanto, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales mediante una variedad de técnicas conocidas por los investigadores expertos en la técnica. Típicamente, las células del bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado son inmortalizadas, comúnmente por fusión con una célula de mieloma. Véase Kohler y Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511-519. Los métodos alternativos de inmortalización incluyen la transformación con Virus Epstein Barr, oncogenes, o retrovirus, u otros métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Doyle, et al. (eds. 1994 y suplementos regulares) CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES, John Wiley and Sons, Nueva York, NY. Las colonias que surgen de células inmortalizadas únicas son seleccionadas para producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas para el antígeno, y el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por tales células puede ser aumentado mediante diversas técnicas, incluyendo inyección en la cavidad peritoneal de un huésped vertebrado. Alternativamente, se pueden aislar secuencias de ADN las cuales codifican a un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo mediante selección de una biblioteca de ADN de células B humanas de acuerdo, por ejemplo, con el protocolo general delineado por Huse, et al. (1989) Science 246:1275-1281. Otras técnicas adecuadas involucran la selección de bibliotecas de anticuerpos en fago o vectores similares. Véase, por ejemplo, Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); y Ward et al., Nature 341 : 544-546 (1989). Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados con o sin modificación, incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos serán rotulados uniendo, ya sea covalentemente o no covalentemente, una sustancia la cual provee una señal detectable. Se conocen una amplia variedad de rótulos y técnicas de conjugación y son reportadas de manera extensa tanto en la literatura científica como en la de patentes. Los rótulos adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, porciones fluorescientes, porciones quimiluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que describen el uso de tales rótulos incluyen las Patentes de los Estados Unidos Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; y 4,366,241. Asimismo, pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes, véase Cabilly Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567; y Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; o prepararse en ratones transgénicos, véase Méndez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; también véase Abgenix and Medarex technologies. Los anticuerpos o composiciones de unión contra fragmentos predeterminados de IL-10 pueden ser cultivados mediante inmunización de animales con conjugados del polipéptido, fragmentos, péptidos o epítopes con proteínas portadoras. Los anticuerpos monoclonales son preparados a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos pueden ser seleccionados para unión a IL-10 normal o defectuosa. Estos anticuerpos monoclonales se unirán generalmente con por lo menos una Kfj de aproximadamente 1 µM, más generalmente por lo menos aproximadamente 300 nM, típicamente por lo menos aproximadamente 30 nM, preferentemente por lo menos aproximadamente 10 nM, más preferentemente por lo menos aproximadamente 3 nM o mejor, generalmente determinado por ELISA. Los anticuerpos no humanos adecuados también pueden ser identificados utilizando los ensayos biológicos en la Sección D infra.

C. Humanización de Anticuerpos Específicos anti-IL-10 Puede utilizarse cualquier anticuerpo no humano adecuado como una fuente para la región hipervariable. Las fuentes para anticuerpos no humanos incluyen, aunque no se limitan a, murina, lupina, bovina y primates. La gran mayoría de los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de la región hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estructura Fv (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados con residuos no humanos correspondientes. Adicionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos los cuales no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para adicionalmente refinar el rendimiento de los anticuerpos de la actividad biológica deseada. Para más detalles, véase Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). Los métodos para construir recombinantemente anticuerpos han sido descritos, por ejemplo, por Boss et al. (Patente de los Estados Unidos No. 4,816,397), Cabilly et al. (Patente de los Estados Unidos No. 4,816,567), Law et al. (Publicación de Solicitud de Patente Europea No. 438 310) y Winter (Publicación de Solicitud de Patente Europea No. 239 400). Las variantes de secuencias de aminoácidos de anticuerpo anti- IL-10 humanizado se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN de anticuerpo anti-IL-10 humanizado, o mediante síntesis peptídica. Tales variantes incluyen, por ejemplo, deleclones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos mostradas para el F(ab) anti-IL-10 humanizado (por ejemplo, como en SEC ID Nos 5 y 10). Se realiza cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para arribar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos post-traducción del anticuerpo anti-IL-10 humanizado, tal como cambiando el número o posición de los sitios de glicosilación. Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del polipéptido del anticuerpo anti-IL-10 humanizado que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de exploración de alanina", según lo descrito por Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivo son identificados (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y reemplazados por un aminoácido cargado negativamente o neutro (más preferentemente alanina o polialanina) para efectuar la interacción de los aminoácidos con antígeno de IL-10. Los residuos de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones luego son refinados introduciendo otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. Por lo tanto, si bien el sitio para introducir una variación de secuencias de aminoácidos es predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para anilizar el rendimiento de una mutación en un sitio determinado, se lleva a cabo una mutagénesis al azar o de barrido ala en el codón objetivo o región y las variantes de anticuerpos anti-IL-10 humanizados expresadas son seleccionadas para determinar la actividad deseada. Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxil- terminales que rondan en cuanto a su longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, como así también inserciones intrasecuencias de residuos de aminoácidos únicos o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen anticuerpo anti-IL-10 humanizado con un residuo metionilo de terminal N o el anticuerpo fusionado a una etiquera de epítope. Otras variantes insercionales de la molécula de anticuerpo anti-IL-10 humanizado incluye la fusión al término N o C del anticuerpo anti-IL-10 humanizado de una enzima o un polipéptido el cual incrementa la vida media en suero del anticuerpo. Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen por lo menos un residuo aminoácido en la molécula del anticuerpo anti-IL-10 humanizado eliminado y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen los lazos hipervariables, aunque también se contemplan las alteraciones de FR. Los Cuadros 2 y 3 en el método descrito a continuación proporcionan una guía en cuanto a los residuos de región hipervariable que pueden ser alterados. Los residuos de región hipervariable o residuos de FR involucrados en la unión al antígeno son generalmente sustituidos en forma relativamente conservadora. Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Alterar quiere decir delecionar una o más porciones de carbohidrato encontradas en el anticuerpo, y/o agregar uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glicosilación de anticuerpos es típicamente N-ligada u O-ligada. N-ligada se refiere a la unión de la porción carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripéptidas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptidas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación O-ligada se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, si bien también puede utilizarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias tripéptidas antes descritas (para sitios de glicosilación N-ligada). La alteración también puede realizarse mediante la adición de, o sustitución con, uno o más residuos serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glicosilación O-ligada). Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican variantes de secuencias de aminoácidos de anticuerpo específico anti-IL-10 humanizado se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, aunque sin limitarse a, la aislación de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos naturales) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis de cásete de una variante previamente preparada o una versión no variante de anticuerpo anti-IL-10 humanizado. Comúnmente, las variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-IL-10 humanizado tendrán una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 75% de identidad de secuencias de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos del anticuerpo humanizado originales de la cadena pesada o de la cadena ligera (por ejemplo, como en SEC ID NO:5 y 10), más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, y más preferentemente por lo menos 95%. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidato que son idénticas con los residuos anti-IL- 0 humanizados, después de alinear las secuencias e introducir espacios vacíos, en caso de ser necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencias. Ninguna de las extensiones, deleciones o inserciones de terminal N, terminal C o internas en la secuencia del anticuerpo será interpretada como que afecta la identidad u homología de secuencia. El anticuerpo humanizado puede ser seleccionado de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA, e IgE. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. Puede utilizarse cualquier isotipo de IgG, incluyendo IgG-,, lgG2, lgG3, e lgG . También son contempladas las variantes de los isotipos de IgG. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo. La optimización de las secuencias de dominio constante necesarias para generar la actividad biológica deseada se logra fácilmente mediante selección de los anticuerpos en los ensayos biológicos descritos más abajo. Asimismo, puede utilizar cualquier clase de cadena ligera en las composiciones y métodos de la presente invención. Específicamente, kappa, lambda, o variantes de los mismos son útiles en las presentes componentes y métodos. Puede utilizarse cualquier porción de las secuencias de CDR del anticuerpo no humano. Las secuencias de CDR pueden ser mutagenizadas mediante sustitución, inserción o deleción de por lo menos un residuo de modo que la secuencia de CDR sea distinta a la secuencia del anticuerpo humano y no humano empleada. Se contempla que tales mutaciones serían mínimas. Típicamente, por lo menos 75% de los residuos del anticuerpo humanizado corresponderán a aquellos de los residuos de CDR no humanas, más frecuentemente 90%, y más preferentemente más del 95%. Cualquier porción adecuada de las secuencias de FR del anticuerpo humano puede ser utilizada. Las secuencias de FR pueden ser mutagenizadas por sustitución, inserción o deleción de por lo menos un residuo de modo que la secuencia de FR sea distinta a la secuencia de anticuerpo humano y no humano empleada. Se contempla que tales mutaciones serían mínimas. Típicamente, por lo menos 75% de los residuos de anticuerpo humanizado corresponderán a aquellos de los residuos de FR humanos, más frecuentemente 90%, y más preferentemente más del 95%. Los residuos CDR y FR son determinados de conformidad con la definición de secuencias estándar de Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md. (1987). Se provee en la presente memoria descriptiva un método para identificar una secuencia de línea germinal aceptora para un anticuerpo humanizado, cuyo método comprende los pasos de: a) identificar un anticuerpo no humano que tiene la actividad biológica deseada; b) determinar la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano de dominios VH y V ; y c) comparar la secuencia de anticuerpo no humano con un grupo de secuencias de línea germinal humana, en donde la comparación comprende los subpasos de: 1) asignar a las secuencias V no humanas números de residuos de conformidad con Kabat supra; 2) delinear las regiones de CDR y FR en la secuencia de conformidad con Kabat supra; 3) asignar un resultado numérico predeterminado en posición de residuo específico para la cual las secuencias de línea germinal de anticuerpo no humano y humano son idénticas: y 4) totalizar todos los resultados de residuos para generar un resultado total para cada secuencia de línea germinal humana; y d) identificar la secuencia de línea germinal humana con el resultado de residuos total más alto como la secuencia de línea general aceptora. En una modalidad, el método comprende además los subpasos de: 5) asignar un resultado numérico de 1 para cada posición de residuo de FR para la cual las secuencias de línea germinal de anticuerpo humano y no humano son idénticas que no fue calificada en el subpaso (3) a secuencias de línea germinal con resultados de residuos totales idénticos después del subpaso (4); 6) totalizar todos los resultados de residuos para generar un resultado total para cada secuencia de línea germinal humana. En una modalidad específica, el anticuerpo no humano es específico para IL-10 e inhibe la actividad biológica de IL-10. También se provee en la presente memoria descriptiva un anticuerpo generado mediante el método antes mencionado. En una modalidad, el anticuerpo anti-IL-10 es humanizado utilizando el siguiente método. En primer lugar, los dominios VL y VH no humanos del anticuerpo anti-IL-10 son clonados y secuenciados, y se determina la secuencia de aminoácidos. Luego, se compara la secuencia de VH no humana con un grupo de cinco secuencias de aminoácidos de línea germinal de VH humanas. Los cinco grupos contienen un representante de los subgrupos IGHV1 y IGHV4 y tres representantes del subgrupo IGHV3. Los subgrupos VH son mencionados en M. P. Lefranc, Exp. Clin. Immunogenetics, 18:100-116 (2001). Específicamente, la comparación con las cinco secuencias de líneas germinales comienza con la asignación de números de residuos a la secuencia de VH no humana de conformidad con el sistema de numeración de Kabat. Véase Kabat, et al., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos (U. S. Department of Health and Human Services), NIH Pub. 91-3242 (5ta Ed., 1991). Luego, la secuencia V no humana se alinea con cada una de las cinco secuencias de líneas germinales humanas. Puesto que los genes V solamente comprenden residuos VH 1-94, solo estos residuos son considerados en la alineación. A continuación, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, " complementarity-determining región") y de estructura ("framework región") en la secuencia son delineadas. CDR y FR son delineadas de conformidad con la combinación de las definiciones proporcionadas en Kabat, et al., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos (U. S. Department of Health and Human Services), NIH Pub. 91-3242 (5ta Ed., 1991 ), y C. Chothia & A.M. Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987). Por lo tanto, la definición de CDR utilizada es residuos 26-35 para CDR1 , residuos 50-65 para CDR2, y CDR3 es los residuos 95-102 para CDR3 del dominio VH. El paso siguiente involucra asignar un resultado numérico en posición de residuo identificada donde las secuencias no humanas y humanas son idénticas. Un ejemplo de esta calificación se muestra en el Cuadro 2 a continuación.

CUADRO 2 max 89 * Se notó que afecta la conformación de CDR en C. Chothia et al., Nature 342:877-883, (1989).

Después de asignar un resultado numérico a las posiciones de los residuos, todos los resultados de los residuos son sumados. La secuencia de línea germinal aceptora es la del resultado total más alto. En un caso en el cual dos o más secuencias de línea germinal tienen resultados idénticos, luego se agrega 1 al total para cada posición donde las secuencias no humanas y humanas son IDÉNTICAS para los siguientes residuos: 1 , 3, 5-23, 25, 36, 38, 40-43, 46, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 77, 79-90, y 92 (máx 49). Los resultados de los residuos son sumados nuevamente, y la secuencia de línea germinal aceptora es aquella con el resultado total más alto. Si dos o más secuencias de línea germinal aun tienen resultados idénticos, cualquiera de las dos puede utilizarse como la secuencia de línea germinal aceptora. Si la secuencia de VL es un miembro de la subclase kappa de VL, la secuencia de VL no humana del anticuerpo específico para IL-10 se compara con un grupo de cuatro secuencias de aminoácidos de línea germinal kappa de VL humana. Las cuatro secuencias están formadas por un representante de cada uno de los cuatro subgrupos de VL humanos establecidos enlistados en V. Barbie & M.-P. Lefranc, Exp. Clin. Immunogenetics 15:171-183 (1998) y M. P. Lefranc, Exp. Clin. Immunogenetics 18:161-174 (2001). Las cuatro secuencias también corresponden a los cuatro subgrupos enlistados en Kabat et al., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos (U. S. Department of Health and Human Services), NIH Pub. 91-3242, pp. 103-130 (5ta Ed., 1991). La comparación de la secuencia no humana con las cuatro secuencias de línea germinal comienza con la asignación de números de residuos a los residuos de secuencias VL no humanas de conformidad con Kabat et al., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos (U. S. Department of Health and Human Services), NIH Pub. 91-3242 (5ta Ed., 1991 ). Las secuencias VL no humnas son luego alineadas con cada una de las cuatro secuencias de línea germinal humanas. Puesto que los genes V solamente comprenden residuos VL 1-95, solo estos residuos son considerados en la alineación. A continuación, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, " complementarity-determining región") y de estructura ("framework región") en la secuencia son delineadas. CDR y FR son delineadas de conformidad con la combinación de las definiciones proporcionadas en Kabat, et al., Departamiento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos (U. S. Department of Health and Human Services), NIH Pub. 91-3242 (5ta Ed., 1991 ), y C. Chothia & A.M. Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987). Por lo tanto, la definición de CDR utilizada es residuos 24-34 para CDR1 , residuos 50-56 para CDR2, y residuos 89-97 para CDR3 del dominio VL. El paso siguiente involucra asignar un resultado numérico en posición de residuo identificada donde las secuencias no humanas y humanas son idénticas. Un ejemplo de esta calificación se muestra en el Cuadro 3 a continuación.

CUADRO 3 * Se notó como afectando la conformación de CDR en C. Chothia et al., Nature 342:877-883, (1989). Después de que se asigna un resultado numérico a las posiciones de los residuos, se suman todos los resultados de los residuos. La secuencia de línea germinal aceptora es aquella con el resultado total más alto. En un caso en el cual dos o más secuencias de líneas germinales tienen resultados idénticos, entonces se agrega 1 al total para cada posición donde las secuencias no humana y humana son IDÉNTICAS para los siguientes residuos: 1 , 3, 5-23, 35, 37, 39-42, 57, 59-61 , 63, 65-70, 72-86, y 88. Los resultados de los residuos se suman nuevamente y la secuencia de línea germinal aceptora es aquella con el resultado total más alto. Si dos o más secuencias de línea germinal aun tienen resultados idénticos, cualquiera de las dos se puede utilizar como la secuencia de línea germinal aceptora. Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica se aisla y se inserta en un vector replicable para más clonación (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica al anticuerpo monoclonal es fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Se encuentran disponibles muchos vectores. Los componentes vectoriales generalmente incluyen, aunque sin limitarse a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento ¡ntensificador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. En una modalidad, el anticuerpo es una molécula de anticuerpo recombinante humanizada que une IL-10, o su fragmento de unión, que comprende: por lo menos una región variable de cadena ligera del anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:1 (KTSQNIFENLA) en CDR1 , SEC ID NO:2 (NASPLQA) en CDR2, y SEC ID NO:3 (HQYYSGYT) en CDR3; y una región de estructura, en la cual la secuencia de aminoácidos de la región de estructura es toda o sustancialmente toda de una secuencia de aminoácidos de inmunoglobina humana; y por lo menos una región variable de cadena pesada del anticuerpo o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:6 (GFTFSDYHMA) en CDR1 , SEC ID NO:7 (SITLDATYTYYRDSVRG) en CDR2, SEC ID NO:8 (HRGFSVWLDY) en CDR3; y una región de estructura, en la cual la secuencia de aminoácidos de la región de estructura es toda o sustancialmente toda de una secuencia de aminoácidos de inmunoglobina humana. En una modalidad específica, la cadena ligera del anticuerpo o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable de SEC ID NO:4 (DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTSQNIFENLAWYQQKPGKAPKLLIY NASPLQAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYSG-YTFGPGTKLELKRT). En una modalidad específica, la cadena ligera del anticuerpo o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región constante de SEC ID NO:5. Véase el Cuadro 4. En una modalidad específica, la cadena pesada del anticuerpo o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable de SEC ID NO:9 (QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDYHMAWV RQAPGKGLEWVASITLDATYTYYRDSVRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE DTAVYYCARHRGFSVWLDYWGQGTLVTVSS). En una modalidad específica, la cadena pesada del anticuerpo o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región constante de SEC ID NO:10. Véase el Cuadro 5. Los plásmidos que contienen los ácidos nucleicos que codifican las cadenas ligera y pesada de 12G8 humanizado fueron depositados ante el American Type Culture Collection (ATCC) como números de depósitos PTA-5923 y PTA-5922, respectivamente.

CUADRO 4 Secuencias de longitud completa para la cadena ligera del anticuerpo 12G8 humanizado SEC ID NO:5 Secuencia de aminoácidos de longitud completa de anticuerpo 12G8 humanizado SEC ID NO:19 Secuencia de ácidos nucleicos de longitud completa de anticuerpo 12G8 humanizado -> domino ligero variable D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT C K T S Q N I F E N L A Y Q Q K P G A P TGC AAG ACÁ AGT CAG AAC ATT TTT GAG AAC TTG GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT K L L I Y N A S P L Q A G V P S R F S G S G AAG CTC CTG ATC TAT AAT GCA AGC CCT TTG CAA GCG GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA S G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C TCT GGG ACÁ GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAC TAC TGT —> humano H Q Y Y S G Y T F G P G T K L E L K R T V A CAC CAG TAT TAT AGC GGG TAC ACG TTT GGA CCT GGG ACC AAG CTG GAA CTG AAA CGT ACG GTG GCT dominio constante ligero A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG C L L N N F Y P R E A K V Q K V D N A L Q TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACÁ GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG G L S S P V T K S F N R G E C GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACÁ AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT CUADRO 5 Secuencias de longitud completa para cadena pesada del anticuerpo 12G8 humanizado SEC ID NO: 10 Secuencia de aminoácidos de longitud completa de anticuerpo 12G8 humanizado SEC ID N?:20 Secuencia de ácidos nucleicos de longitud completa de anticuerpo 12G8 humanizado Q V Q L V E S G G G V V Q P G R S L R L S C CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT A A S G F T F S D Y H M A W V R Q A P G K G GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT GAC TAT CAT ATG GCC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG L E W V A S I T L D A T Y T Y Y R D S V R G CTG GAG TGG GTG GCA AGC ATT ACT CTT GAT GCT ACC TAC ACT TAC TAT CGC GAC TCC GTG CGC GGC R F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A CGC TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCT E D T A V Y Y C A R H R G F S V W L D Y G GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA CAT CGA GGC TTT AGC GTC TGG CTT GAT TAC TGG GGC —> dominios pesados constantes de IgGl humana Q G T L V T V S S A S T K G P S V F P L A P CAA GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCG TCG GCT AGC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC AC GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA P V T V S N S G A L T S G V H T F P A V L CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACÁ TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V TTC CTC TTC CCC OCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC GCT GAG GTC AC TGC GTG V V D V S H E D P E V K F N Y V D G V E V GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L CAT AAT GCC AAG AC AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC T V L H Q D L N G K E Y K C K V S N K A L ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GGC CTC P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC L P P S R D E L T K N Q V S L T C L V K G F CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC Y P S D I A V E E S N G Q P E N N Y K T T TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG AGC ACG P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG W Q Q G N V F S C S V M H E A H N H Y T Q TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG K S L S S P G K AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA En una modalidad, el anticuerpo es una molécula de anticuerpo recombinante humanizado que une IL-10, o su fragmento de unión, que comprende: por lo menos una cadena ligera de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:11 (RASESVDDYGHSFMH) en CDR1, SEC ID NO: 12 (RASTLES) en CDR2, y SEC ID NO:13 (QQGNEDPWT) en CDR3; y una región de estructura, en la cual la secuencia de aminoácidos de la región de estructura es toda o sustancialmente toda de una secuencia de aminoácidos de inmunoglobina humana; y por lo menos una cadena pesada de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:15 (GFSLTNYGVH) en CDR1 , SEC ID NO:16 (VIWSGGSTDYNAAFIS) en CDR2, y SEC ID NO:17 (NRGYDVYFDY) en CDR3; y una región de estructura, en la cual la secuencia de aminoácidos de la región de estructura es toda o sustancialmente toda de una secuencia de aminoácidos de inmunoglobina humana. En una modalidad específica, la cadena ligera de anticuerpo, o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región constante de SEC ID NO: 14. Véase el Cuadro 6. En otra modalidad específica, la cadena pesada del anticuerpo, o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región constante de SEC ID NO:18. Véase el Cuadro 7. Los plásmidos que contienen ias cadenas pesada y ligera de 11 D8 humanizado se depositaron antes la ATCC como números de depósitos PTA-5926 y PTA-5927, respectivamente.

CUADRO 6 Secuencias de longitud completa para la cadena ligera del anticuerpo 11D8 humanizado SEC ID NO: 1 Secuencia de aminoácidos de longitud completa para anticuerpo 11D8 humanizado SEC ID NO: 21 Secuencia de nucleótidos de longitud completa para anticuerpo 11D8 humanizado E I V T Q S P G T L S S P G E R A T GAA ATT GTG TTG ACG CAG TCT CCA GGC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GCC ACC L S C R A S E S V D D Y G H S F M H W Y CTC TCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT GTT GAT GAT TAT GGC CAT AGT TTT ATG CAC TGG TAC Q Q K P G Q A P R L I Y R A S T L E S CAG CAG AAA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT CGT GCA TCC ACC CTA GAA TCT G I P D R F S G S G S G T D F T L T I S GGC ATC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG AC GAC TTC ACT CTC ACC ATC AGC R L E P E D F A V Y Y C Q Q G N E D P AGA CTG GAG CCT GAA GAT TTT GCA GTG TAT TAC TGT CAG CAA GGT AAT GAG GAT CCG TGG T F G Q G T K V E I K R T V A A P S V F ACG TTC GGT CAA GGT ACC AAG GTG GAA ATC AAG CGT ACG GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S S GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACÁ GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC T H Q G L S S P V T K S F N R G E C ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACÁ AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT CUADRO 7 Secuencias de longitud completa para la cadena pesada del anticuerpo 11D8 humanizado SEC ID NO: 18 Secuencia de aminoácidos de longitud completa para anticuerpo 11D8 humanizado SEC ID NO: 22 Secuencia de nucleótidos de longitud completa para el anticuerpo 11D8 humanizado Q V Q L V E S G G G V V Q P G R S CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG TCC L R L S C A A S G F S L T N Y G V H W V CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGT TTC TCA TTA ACÁ AAC TAT GGT GTA CAC TGG GTC R Q A P G K G L E W V A V I S G G S T CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA GTG ATA TGG AGT GGT GGA AGC ACÁ D Y N A A F I S R F T I S R D N S K N T GAC TAT AAT GCA GCT TTC ATA TCC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A R CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA N R G Y D V Y F D Y W G Q G T L V T V S AAT AGG GGG TAC GAC GTC TAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC CTT GTC ACÁ GTC TCG S A S T K G P S V F P L A P S S K S T S TCG GCT AGC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V GGG GGC ACÁ GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG S N S G A L T S G V H T F P A V L Q S TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACÁ TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N CCT GAG GTC ACÁ TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG AC AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R D TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT E L T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC I A V E E S N G Q P E N N Y K T T P P ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC V L D S D G S F F L Y S K T V D K S R GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG W Q Q G N V F S C S V H E A L H N H Y TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC .TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC T Q K S L S L S P G K ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA En una modalidad, los anticuerpos descritos supra comprenden además una región constante de cadena pesada, en donde la región constante de cadena pesada comprende una región constante de cadena pesada humana de ?1, ?2, ?3, o ?4 o una variante de la misma. En una modalidad, los anticuerpos antes descritos comprenden una región constante de cadena ligera, en donde la región constante de cadena ligera comprende una región constante de cadena ligera lambda o kappa. En algunas modalidades, el fragmento de unión de estos anticuerpos es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo formado por Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, y un diacuerpo. También se proporciona en la presente memoria descriptiva una molécula de anticuerpo recombinante quimérico que une IL-10 o su fragmento de unión, que comprende: por lo menos una región variable de cadena ligera del anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:1 en CDR1 , SEC ID NO:2 en CDR2, y SEC ID NO:3 en CDR3; y por lo menos una región variable de cadena pesada del anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:6 en CDR1 , SEC ID NO:7 en CDR2, y SEC ID NO:8 en CDR3. En una modalidad específica, la molécula de anticuerpo recombinante quimérico tiene una cadena ligera según lo expuesto en SEC ID NO: 23 y una cadena pesada según lo expuesto en SEC ID NO:24. Véase el Cuadro 8. Los ácidos nucleicos que codifican ias cadenas ligera y pesada del anticuerpo 12G8 quimérico se depositaron en ATCC como números de depósito PTA-5925 y PTA-5924, respectivamente.

CUADRO 8 Secuencias del anticuerpo anti-IL-10 anti-humano 12G8 quimérico SEC ID NO: 23 Secuencia de aminoácidos de cadena ligera SEC ID NO: 25 Secuencia de ácidos nucleicos de cadena ligera —> secuencia de señal M A P V Q L L G L L V L F L P A M R C ATG GCT CCA GTT CAA CTT TTA GGG CTT TTG GTG CTC TTC CTC OCA GCC ATG AGA TGT IgG madura —> dominio variable ligero de 12G8 de rata D I Q T Q S P S L L S A S V G D R V T L N GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCT TCA CTC CTG TCT GCA TCT GTG GGA GAC AGA GTC ACT CTC AAC C K T S Q N I F E N L A Y Q Q K L R E P P TGC AAG ACÁ AGT CAG AAC ATT TTT GAG AAC TTG GCC TGG TAT CAG CAA AAG CTT AGA GAA CCT CCC K L L I F A' S P L Q A G I P S R F S G S G AAA CTC CTG ATT TTT AAT GCA AGC CCT TTG CAA GCG GGC ATC CCT TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA S G T D F T L T I T S L Q P E D V A T Y F C TCT GGT AC GAT TTC ACÁ CTC ACC ATC ACC AGC CTG CAG CCT GAG GAT GTT GCC ACÁ TAT TTC TGC —> humano H Q Y Y S G Y T F G P G T K L E L K R T V A CAC CAG TAT TAT AGC GGG TAC ACG TTT GGA CCT GGG ACC AAG CTG GAA CTG AAA CGT ACG GTG GCT dominio ligero constante A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG C L L N N F Y P R E A K V Q K V D N A L Q TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACÁ GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG G L S S P V T K S F N R G E C GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACÁ AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAA SEC ID NO: 24 Secuencia de aminoácidos de cadena pesada SEC ID NO: 26 Secuencia de ácidos nucleicos de cadena pesada M D I R L S L V F L V L F M K D ' V Q C ATG GAC ATC AGG CTC AGC TTG GTT TTC CTT GTC CTT TTT ATG AAA GAT GTC CAG TGT IgG madura —> dominio pesado variable de 12G8 de rata T A S G F T F S D Y H M A W V R Q S P D K G AC GCC TCA GGA TTC ACT TTC AGT GAC TAT CAC ATG GCC TGG GTC CGC CAG TCT CCA GAC AAG GGT L E V A S I T L D A T Y T Y Y R D S V R G CTG GAG TGG GTC GCA AGC ATT ACT CTT GAT GCT ACC TAC ACT TAC TAT CGC GAC TCC GTG AGG GGC R F T I S R N N A K T T L Y L Q M D S L R S CGA TTC ACC ATC TCC CGA AAT AAT GCA AAA ACC ACC CTT TAC CTG CAA ATG GAC AGT CTG AGG TCT E D T A T F Y C T R H R G F S V W L D Y W G GAG GAC ACG GCC ACT TTT TAC TGT ACÁ AGA CAT CGA GGC TTT AGC GTC TGG CTT GAT TAC TGG GGC —> cadena pesada de IgGl humana Q G V M V T V S S A S T K G P S V F P L A P CAA GGA GTC ATG GTC ACT GTC TCT TCA GCT AGC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC S S K S T S G G T A A G C L V K D Y F P E TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACÁ GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA P V T V S N S G A L T S G V H T F P A V L CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V TCT TGT GAC AAA ACT CAC AC TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACÁ TGC GTG V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L CAT AAT GCC AAG ACÁ AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC T V L H Q D L N G K E Y K C K V S N K A L ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T OCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC Se provee además en la presente una molécula de anticuerpo recombinante quimérico que une IL-10, o su fragmento de unión, que comprende: por lo menos una cadena ligera de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:11 en CDR1 , SEC ID NO:12 en CDR2, y SEC ID NO:13 en CDR3; y por lo menos una cadena pesada de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:15 en CDR1 , SEC ID NO:16 en CDR2, y SEC ID NO:17 en CDR3. Se proporciona además en la presente un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de los anticuerpos descritos supra. También se proporciona un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico aislada ligada operativamente a secuencias control reconocidas por una célula huésped transfectada con el vector. En la presente invención se proporciona una célula huésped que comprende el vector bajo condiciones en las cuales la secuencia de ácido nucleico es expresada, produciendo así el polipéptido, y recuperando el polipéptido de la célula huésped. En la presente invención se proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo específico anti-IL-10 que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 19 y una cadena pesada que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO:20. Véase los Cuadros 4 y 5. En la presente invención se proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo específico anti-IL-10 que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID N0:21 y una cadena pesada que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO:22. Véase los Cuadros 6 y 7. En la presente invención se proporciona además una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un fragmento de unión del anticuerpo codificado por las secuencias de ácidos nucleicos antes mencionadas. En una modalidad, el fragmento de unión es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo formado por Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, y un diacuerpo. Los anticuerpos bi-específicos son también útiles en los presentes métodos y composiciones. Como se utiliza en la presente invención, el término "anticuerpo bi-específico" se refiere a un anticuerpo, típicamente un anticuerpo monoclonal, que tiene especificidades de unión durante por lo menos dos epítopes antígenos diferentes. En una modalidad, los epítopes son del mismo antígeno. En otra modalidad, los epítopes son de dos antígenos diferentes. Los métodos para preparar anticuerpos bi-específicos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos bi-específicos recombinantemente utilizando la co-expresión de dos pares de cadena pesada/ cadena ligera de inmunoglobullna. Véase, por ejemplo, Milstein et al., Nature 305: 537-39 (1983). Alternativamente, se pueden preparar anticuerpos bi-específicos utilizando ligación química. Véase, por ejemplo, Brennan, eí al., Science 229: 81 (1985). Los anticuerpos bi-específicos incluyen fragmentos de anticuerpos bi-específicos. Véase, por ejemplo, Hollinger, eí al., Proc. Nati.

Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-48 (1993), Gruber, eí al., J. Immunol. 152: 5368 (1994).

D. Actividad Biológica de Anticuerpos Anti-IL-10 Humanizados Los anticuerpos que tienen las características identificadas en la presente invención como deseables en un anticuerpo anti-IL-10 humanizado puede seleccionarse para la actividad biológica inhibitoria in vitro o afinidad de unión adecuada. Para seleccionar anticuerpos que se unen al epítope en IL- 10 humana unida mediante un anticuerpo de interés (por ejemplo, aquellos que bloquean la unión de la citocina a su receptor), puede llevarse a cabo un ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como el descrito en ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988). Alternativamente, el mapeo de epítopes, por ejemplo, según lo descrito en Champe et al., J. Biol. Chem. 270: 1388-1394 (1995), puede llevarse a cabo para determinar si el anticuerpo une un epítope de interés. Las afinidades de los anticuerpos (por ejemplo, para IL-10 humana) pueden determinarse utilizando análisis Scatchard estándar. Los anticuerpos humanizados preferidos son aquellos que unen IL-10 humana con un valor Kd de no más de aproximadamente 1x10"7; preferentemente no más de aproximadamente 1x10"8; más preferentemente no más de aproximadamente 1x10"9; y más preferentemente no más de aproximadamente 2x10"10. Los anticuerpos y sus fragmentos útiles en las presentes composiciones y métodos son anticuerpos y fragmentos biológicamente activos. Como se utiliza en la presente invención, el término "biológicamente activo" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es capaz de unir el epítope antígeno deseado y directa o indirectamente ejercer un efecto biológico. Típicamente, estos efectos dan como resultado la no unión de IL-10 a su receptor. Como se utiliza en la presente invención, el término "específico" se refiere a la unión selectiva del anticuerpo al epítope antígeno objetivo. Los anticuerpos pueden ser ensayados para determinar su especificidad de unión comparando la unión a IL-10 con la unión a antígeno o mezcla de antígenos irrelevante bajo un conjunto determinado de condiciones. Si el anticuerpo se une a IL-10 por lo menos 10, y preferentemente 50 veces más que al antígeno o mezcla de antígenos irrelevante entonces se considera específico. El anticuerpo específico de IL-10 inhibitorio puede inhibir su actividad biológica de cualquier manera, incluyendo aunque sin limitarse a la producción de quimioquinas de IL-1 , IFN-?, PGE2, IL-12, TNF, CC y CXC, y la expresión de superficie celular de antígenos de clase II MHC, CD54, CD80, y CD86. La actividad biológica de un anticuerpo específico anti-IL-10 puede determinarse mediante cualquier método útil. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos: 6,239,260 y 6,207,154. En un ejemplo, la actividad biológica es evaluada en un ensayo de proliferación celular utilizando la línea de célula cebada de murino, MC9/2. Véase Thompson-Snipes et al., J. Exp. Med. 173:507-10 (1991 ). IL-10 estimula la proliferación de esta línea celular, y por lo tanto se puede identificar un anticuerpo inhibitorio mediante su capacidad de reducir la proliferación. La ED50 para la proliferación de la línea celular MC9/2 es típicamente de 0.5-1.0 ng/mL. Un anticuerpo es inhibitorio para la proliferación si inhibe la proliferación de células con relación a la proliferación de células en ausencia del anticuerpo o en presente de un anticuerpo de no unión. La proliferación puede ser medida utilizando cualquier método adecuado. Típicamente, la proliferación se determina evaluando la incorporación de nucleótidos rotulados radioactivamente en ADN (por ejemplo, 3H-timidina). En otra modalidad, la proliferación se determina mediante luminiscencia de ATP. Preferentemente, el anticuerpo útil en las presentes composiciones inhibe un 80% de la actividad biológica de IL-10, más preferentemente 95%, más preferentemente 99%.

E. Usos de Anticuerpos Anti-IL-10 Humanizados En la presente invención se proporciona un método para suprimir una respuesta inmune en un sujeto humano que comprende administrar a un sujeto que lo necesita un anticuerpo específico para IL-10, o su fragmento de unión, en una cantidad eficaz para bloquear la actividad biológica de IL-10, en donde el anticuerpo es una molécula de anticuerpo recombinante humanizado que une IL-10, o su fragmento de unión, que comprende: por lo menos una región variable de cadena ligera de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO. en CDR1, SEC ID NO:2 en CDR2, y SEC ID NO:3 en CDR3; y una región de estructura, en donde la secuencia de aminoácidos de la región de estructura es toda o sustancialmente toda de una secuencia de aminoácidos de inmunoglobina humana; y por lo menos una región variable de cadena pesada del anticuerpo o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:6 en CDR1 , SEC ID NO:7 en CDR2, y SEC ID NO:8 en CDR3; y una región de estructura, en donde la secuencia de aminoácidos de la región de estructura es toda o sustancialmente toda de una secuencia de aminoácidos de inmunoglobina humana. En la presente invención se proporciona además un método para suprimir una respuesta inmune en un sujeto humano que comprende administrar a un sujeto que lo necesita un anticuerpo específico para IL-10, o su fragmento de unión, en una cantidad eficaz para bloquear la actividad biológica de IL-10, en donde el anticuerpo es una molécula de anticuerpo recombinante humanizado que une IL-10, o su fragmento de unión, que comprende: por lo menos una cadena ligera de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:11 en CDR1 , SEC ID NO:12 en CDR2, y SEC ID NO:13 en CDR3; y una región de estructura, en donde la secuencia de aminoácidos de la región de estructura es en su totalidad o sustancialmente en su totalidad una secuencia de aminoácidos de ¡nmmunoglobina humana; y por lo menos una cadena pesada de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:15 en CDR1 , SEC ID NO:16 en CDR2, y SEC ID NO:17 en CDR3; y una región de estructura, en donde la secuencia de aminoácidos de la región de estructura es en su totalidad o sustancialmente en su totalidad una secuencia de aminoácidos de inmmunoglobina humana. La respuesta inmune suprimida por estos métodos es una respuesta humoral o celular. La supresión de las respuestas humorales y celulares puede determinarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, en enfermedades asociadas con altos niveles de anticuerpos auto-reactivos, por ejemplo, SLE, una reducción en los niveles en suero de estos anticuerpos con relación a los niveles en suero previos al tratamiento es una indicación de la supresión de la respuesta humoral. Asimismo, la supresión de la respuesta inmune celular puede determinarse utilizando análisis in vitro bien conocidos, por ejemplo, ensayos de proliferación y citotoxicidad o caracterización de fenotipos de activación de linfocitos sanguíneos periféricos mediante, por ejemplo, análisis citométrico de flujo. Véase CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, edición más reciente. En una modalidad, el sujeto tratado mediante este método tiene lupus sistémico eritematoso. En otra modalidad, el sujeto tiene púrpura trombocitopénica inmune (ITC, abreviatura de la expresión inglesa "immune thrombocytopenic purpura"). En aun otra modalidad, el sujeto tiene lupus nefritis. En una modalidad adicional, el sujeto tiene VIH. En otra modalidad el sujeto tiene hepatitis C En la presente invención se proporciona una composición que comprende un anticuerpo, o su fragmento de unión, en combinación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, en donde el anticuerpo es uno de los anticuerpos descritos en la presente invención. Cualquier sujeto que se beneficiaría con el tratamiento con anticuerpos específicos anti-IL-10 puede ser tratado utilizando las composiciones y métodos provistos en la presente invención. Cualquier sujeto puede ser tratado con los métodos y composiciones proporcionados en la presente invención. Ese tipo de sujeto es un mamífero, preferentemente un humano, con una enfermedad autoinmune o síntoma o inmunopatología patógeno- inducida. En una modalidad específica, el sujeto tiene SLE, lupus nefritis, artritis reumatoidea, ITC, VIH o hepatitis C. Los usos veterinarios de los métodos y composiciones descritos son también contemplados. Como se utiliza en la presente invención, "inhibir" o "tratar" o "tratamiento" incluye un postergación del desarrollo de los síntomas asociados con una enfermedad autoinmune o inmunopatología patógeno- inducida y/o una reducción en la severidad de tales síntomas que se espesa que se desarrollen o que se van a desarrollar. Los términos incluyen además aliviar síntomas de inmunopatologías relacionados con el sistema autoinmune o inducidos por un patógeno descontrolados o no deseados, evitando síntomas adicionales, y aliviando o previniendo las causas subyacentes de esos síntomas. Por lo tanto, los términos denotan que se ha conferido un resultado beneficioso en un sujeto vertebrado con una enfermedad o síntoma de inmunopatología autoinmune o inducido por un patógeno, o con el potencial de desarrollar ese tipo de enfermedad o síntoma. Como se utiliza en la presente invención, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo específico anti-IL-10 que cuando se administra sola o en combinación con un agente terapéutico adicional a una célula, tejido o sujeto es eficaz para prevenir o aliviar la enfermedad autoinmune o enfermedad o condición asociada con la inmunopatología inducida por un patógeno o la progresión de la enfermedad. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere además a aquella cantidad del compuesto suficiente para dar como resultado un alivio de los síntomas, por ejemplo, tratamiento, curación, prevención o alivio de la afección médica relevante, o un incremento en la velocidad de tratamiento, curación, prevención o alivio de ese tipo de afecciones. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual administrado solo, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan como resultado el efecto terapéutico, ya sea administrado en combinación, en serie o en forma simultánea. Un anticuerpo útil en los presentes métodos (de cualquier fuente derivada, incluyendo sin limitación de fuentes recombinantes y no recombinantes) puede ser administrado a un sujeto que lo necesite, por si solo, o en composiciones farmacéuticas ya sea que este mezclado con portadores o excipiente(s) adecuados en dosis para tratar o aliviar una variedad de trastornos. Ese tipo de composición también puede contener (además de proteína y un portador) diluyentes, agentes de relleno, sales, reguladores de pH, estabilizantes, solubilizantes y otros materiales bien conocidos en la técnica. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del o de los ingredientes activos. Las características del portador dependerán de la ruta de administración. La composición farmacéutica de la invención también puede contener otros agentes inmunosupresores o inmunomoduladores. Puede emplearse cualquier agente inmunosupresor adecuado, incluyendo aunque sin limitarse a agentes anti-inflamatorios, corticosteroides, ciclosporina, tacrolimus (es decir, FK-506), sirolimus, interferones, receptores de citocinas solubles (por ejemplo, sTNRF y slL-1 R), agentes que neutralizan la actividad de citocinas (por ejemplo, ¡nflixmab, etanercept), mofetilo de micofenolato, 15-desoxispergualin, talidomide, glatiramer, azatioprina, leflunomida, ciclofosfamida, metotrexato, y similares. La composición farmacéutica también puede ser empleada con otras modalidades terapéuticas tales como fototerapia y radicación. En otra modalidad, se proveen equipos que contienen los reactivos necesarios para llevar a cabo los ensayos de los métodos provistos en la presente invención. Se proporciona específicamente en la presente invención un equipo con compartimentos que comprende uno o más envases, en donde un primer envase comprende uno o más anticuerpos específicos de IL-10, y uno o más envases adicionales que comprenden uno o más de los siguientes: reactivos de reconstitución, reactivos de administración. Los envases pueden ser envases de vidrio, plástico, o tiras de plástico o de papel. En una modalidad, el equipo también contiene instrucciones escritas. En la práctica de los métodos de tratamiento o uso provistos en la presente invención, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo proporcionada en la presente invención a un mamífero que tiene una afección adecuada para el tratamiento con IL-10. El anticuerpo puede ser administrado de conformidad con los métodos de la presente invención, ya sea solo o en combinación con otras terapias tales como tratamientos que emplean otros factores inmunomoduladores (por ejemplo citocinas), agentes inmunosupresores, y similares.Cuando se co-administra con uno o más agentes biológicamente activos, el anticuerpo provisto en la presente invención puede ser administrado ya sea en forma simultánea con el o los agentes biológicamente activos, o secuencialmente. En caso de administrarse secuencialmente, el experto en la práctica decidirá cual será la secuencia apropiada de administración de la proteína de la presente invención en combinación con el o los agentes biológicamente activos. La toxicidad y eficacia terapéutica de las composiciones de anticuerpo, administradas solas o en combinación con un agente inmunosupresor, se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población). La relación de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede ser expresado como la relación entre LD50 y ED50. Los anticuerpos que exhiben altos índices terapéuticos son preferidos. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de cultivos celulares y estudios en animales pueden utilizarse en la formulación de un rango de dosificación para uso en el humano. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferentemente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 como poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la ruta de administración utilizada. Las técnicas para la formulación y administración de los anticuerpos de los presentes métodos pueden encontrarse en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co., Easton, Pa., última edición. El modo de administración no es particularmente importante. Las rutas adecuadas de administración pueden incluir, por ejemplo, la administración oral, rectal, transmucosal, o intestinal; administración parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, como así también inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales, o intraoculares. La administración del anticuerpo utilizado en la composición farmacéutica o para poner en práctica el método de la presente invención puede llevarse a cabo en una variedad de maneras convencionales, tales como ingestión oral, inhalación, aplicación tópica o cutánea, inyección subcutánea, intraperitoneal, parenteral, intraarterial o intravenosa. La administración intravenosa al paciente es preferida. Alternativamente, se puede administrar el anticuerpo en forma local más que en forma sistémica, por ejemplo, por medio de inyección del anticuerpo directamente en una articulación artrítica o lesión inducida por un patógeno caracterizada por inmunopatología, a menudo en una formulación de depósito ("depot") o de liberación sostenida. Por añadidura, se puede administrar el anticuerpo en un sistema de administración de fármaco direccionado, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo tejido-específico, con direccionamiento, por ejemplo, hacia una articulación artrítica o lesión inducida por un patógeno caracterizada por una inmunopatología. Los liposonas serán direccionados a y absorbidos selectivamente por el tejido afectado. Las composiciones farmacéuticas para utilizar de conformidad con los presentes métodos pueden de ese modo ser formuladas en forma convencional utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan le procesamiento de los compuestos activos en las preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser manufacturadas de manera conocida, per se, por ejemplo, por medio de procesos de mezclado, disolución, granulación, preparación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, entrampado o liofilización. La formulación adecuada depende de la ruta de administración seleccionada. Cuando se administra en forma líquida, un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites de origen animal o vegetal tales como aceite de cacahuate, aceite mineral, aceite de soya, o aceite de ajonjolí, o pueden agregarse aceites sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede contener además solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene entre aproximadamente 0.5 y 90% en peso de la proteína de la presente invención, y preferentemente entre aproximadamente 1 y 50% de proteína de la presente invención. Cuando una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo de los métodos de la presente invención se administra por inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, la proteína de la presente invención estará en la forma de una solución acuosa, libre de pirógenos, parenteralmente aceptable. La preparación de ese tipo de soluciones proteicas parenteralmente aceptables, teniendo debida consideración del pH, isotonicidad, estabilidad y similares, está dentro del conocimiento en la técnica. Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea debería contener, además de la proteína de la presente invención, un vehículo isotónico tal como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa, Inyección de Dextrosa y Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer Lactada, u otro vehículo según es conocido en la técnica. La composición farmacéutica de la presente invención también puede contener estabilizantes, conservadores, reguladores de pH, antioxidantes u otros aditivos conocidos por los expertos en la técnica. Para inyección, los agentes de la invención pueden ser formulados tales como solución de Hank, solución de Ringer o regulador de pH de solución salina fisiológica. Para la administración transmucosal, se utilizan en la formulación, agentes de la penetración apropiados para que la barrera sea penetrada. Ese tipo de agentes de la penetración son generalmente conocidos en la técnica. Para la administración por inhalación, los anticuerpos para utilizar de conformidad con los presentes métodos son convenientemente administrados en la forma de una presentación de pulverización en aerosol de envases presurizados o un nebullzador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluormetano, triclorofluormetano, diclorotetrafluoretano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede ser determinada proporcionando Una válvula para administrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para utilizar en un inhalador o insuflador que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón. Los compuestos pueden ser formulados para la administración parenteral por inyección, por ejemplo, mediante inyección por bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden ser presentadas en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases de múltiples dosis, con un conservador agregado. Las composiciones pueden adoptar ese tipo de formas como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos u acuosos, y pueden contener agentes formuladores tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Las formulaciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble. Adicionalmente, pueden prepararse suspensiones de los compuestos activos como suspensiones para inyección oleosas apropiadas. Los solventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de ajonjolí o esteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato etílico o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones para inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de un polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógeno estéril, antes del uso. La cantidad de anticuerpo útil en los métodos descritos en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que se está tratando, y de la naturaleza de los tratamientos previos a los que el paciente se ha sometido. Por último, el experto en la técnica decidirá la cantidad de proteína de la presente invención con la cual tratar a cada paciente individual. Se espera que la dosificación varíe de conformidad con la edad, peso y respuesta del paciente individual. Inicialmente, el experto en la práctica administrará bajas dosis de anticuerpos de los presentes métodos y observará la respuesta del paciente. Pueden administrarse dosis más grandes de anticuerpos de la presente invención hasta que se obtiene el efecto terapéutico óptimo para el paciente, y en ese momento la dosificación no es incrementada adicionalmente. Se contempla que las diversas composiciones farmacéuticas utilizadas para practicar los métodos de la presente invención deberían contener aproximadamente 0.01 µg hasta aproximadamente 100 mg (preferentemente aproximadamente 0.1 µg hasta aproximadamente 10 mg, más preferentemente aproximadamente 0.1 µg hasta aproximadamente 1 mg) de anticuerpo de la presente invención por cada kg de peso corporal. Cuando se administra, la composición terapéutica para utilizar en esta invención está, naturalmente, en una forma libre de pirógenos, fisiológicamente aceptable. Los agentes terapéuticamente útiles distintos a un anticuerpo de los presentes métodos que también pueden incluirse opcionalmente en la composición según lo descrito anteriormente, pueden alternativa o adicionalmente ser administrados en forma simultánea o secuencial con la composición en los métodos de la invención. La formulación exacta, la ruta de administración y la dosificación pueden seleccionarse por el médico individual en vista de la condición del paciente. Véase, por ejemplo, Fingí eí al., THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (última edición). La cantidad de dosificación y el intervalo pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles en plasma de la porción activa suficientes para mantener los efectos terapéuticos deseados, o concentración mínima eficaz (MEC, abreviatura de la expresión inglesa "minimal effective concentration"). La MEC variará para cada compuesto aunque puede estimarse a partir de los datos in vitro; por ejemplo, la concentración necesaria para lograr un 50-90% de inhibición de la actividad biológica utilizando los ensayos descritos en la presente invención. El anticuerpo proporcionado en la presente invención puede ser administrado solo o en combinación con otras modalidades terapéuticas. El anticuerpo proporcionado en la presente invención también puede ser administrado solo o en combinación con otros anticuerpos identificados como inhibidores de la actividad de IL-10 u otros agentes ¡nmunosupresores. Cualquier enfermedad donde está implicada la autoinmunidad puede ser tratada con los presentes métodos. Preferentemente, las enfermedades autoinmunes para las cuales se busca el tratamiento con anticuerpos específicos de IL-10 se caracterizan por niveles de expresión de IL-10 anormales y/o una falta de respuestas celulares, es decir, mediadas por Th1 , apropiadas. Ese tipo de enfermedad incluye, aunque no se limita a lupus sistémico eritematoso (SLE, abreviatura de la expresión inglesa "systemic lupus erythematosus"), púrpura trombocitopénica inmune (ITC, abreviatura de la expresión inglesa "immune thrombocytopenic purpura"), lupus nefritis, diabetes, diabetes insulino-dependiente, diabetes mellitus (IDDM), artritis reumatoidea (RA, abreviatura de la expresión inglesa "rheumatoid arthritis"). Cualquier enfermedad donde la inmunopatología inducida por un patógeno está implicada puede ser tratada con los presentes métodos. Preferentemente, las inmunopatologías inducidas por un patógeno que tienen como objetivo ser tratadas con los anticuerpos específicos de IL-10 son caracterizadas por niveles de expresión de IL-10 anormales y/o por una falta de respuestas celulares, es decir, mediadas por Th1 , apropiadas. Tales enfermedades incluyen, aunque sin limitarse a, infecciones de VIH, hepatitis C, leishmaniasis visceral, malaria, filariasis, lepra, tuberculosis, candidiasis, e infecciones de M. avium. El amplio alcance de esta invención es mejor comprendido con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales no tienen el propósito de limitar las invenciones a las modalidades específicas.

F. Ejemplos EJEMPLO I Métodos Generales Se hace referencia o se describen algunos de los métodos convencionales, por ejemplo, en Maniatis, et al. (1982) MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, (2d ed.), vols. 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., BIOLOGY, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel, et al. (1987 y Suplementos) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene/Wiley, Nueva York. Los métodos para la purificación proteica incluyen métodos tales como precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna, electroforesis, centrifugación, cristalización y demás. Véase, por ejemplo, Ausubel, et al. (1987 y suplementos regulares); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification" en METH. ENZYMOL., vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; y bibliografía del fabricante acerca del uso de productos de purificación proteica, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, N.J., o Bio-Rad, Richmond, CA.La combinación con técnicas recombinantes da lugar a la fusión a segmentos apropiados, por ejemplo, a una secuencia FLAG o un equivalente el cual puede ser fusionado por medio de una secuencia eliminable por proteasa. Véase, por ejemplo, Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow (ed.) GENETIG ENGINEERING, PRINCIPLE AND METHODS 12:87-98, Plenum Press, N.Y.; y Crowe, et al. (1992) QIAEXPRESS: THE HIGH LEVEL EXPRESSION & PROTEIN PURIFICATION SYSTEM, Qiagen, Inc., Chatsworth, CA. Se lleva a cabo el análisis de secuencias por computadora, por ejemplo, utilizando software disponibles, incluyendo aquellos de las fuentes GCG (U. Wisconsin) y GenBank. También se utilizaron bases de datos de secuencias públicas, por ejemplo, de GenBank ay otros.

EJEMPLO II Humanización de anticuerpos de IL-10 anti-humanos La humanización del anticuerpo de IL-10 anti-humano de rata, 12G8, se llevó a cabo según lo descrito en la Sección C supra. Las Figuras 1A a 1 D muestran la asignación de la asignación de números de residuos y resultados numéricos correspondientes para las posiciones de los residuos que son idénticos a las secuencias de líneas germinales que se están examinando. Los cálculos se muestran para las regiones variables de 12G8 de la cadena ligera (Figura 1A) ay pesada (Figura 1B) del anticuerpo de IL-10 anti-humanoe 12G8 y para las regiones variables de la cadena ligera (Figura 1 C) y pesada (Figura 1 D) del anticuerpo de IL-10 anti-humano 11 D8.

EJEMPLO III Farmacocinética de 12G8, un anticuerpo de IL-10 anti-humano Objetivo: Obtener estimaciones de vidas medias terminales in vivo y biodisponibilidad subcutánea para el anticuerpo 12F8 en un modelo murino. Anticuerpo: El anticuerpo es administrado en un vehículo de acetato de Na 10 mM, sacarosa 8%, pH 5.25. Ratones: Se adquirieron ratones hembras Crl:CD-1®(ICR)BR de Charles River Laboratories.

Diseño Experimental: Los ratones recibieron una inyección de bolo único de anticuerpo ya sea por vía intravenosa (i.v. en vena de cola lateral) o por vía subcutánea (s.c. en nuca del cuello o flanco medio-escapular o lateral). Las dosis de anticuerpo incluyeron 0.03, 0.3, 3.0, y 30 mg/kg por ratón. Los ratones fueron observados durante hasta 28 días post-inyección. Durante este período de tiempo, los ratones fueron pesados y las muestras en suero tomadas. Las muestras en suero para los grupos 12G8 (SCH 708980) (Grupos 1-8) se tomaron a 0.5, 1 , 3, 6, 10, 16 horas, Día 1 , 2, 3, 5, 7, 10, 14, 21 , y 28 post-inyección utilizando 5 ratones/ punto en el tiempo. En el grupo de vehículo (Grupo 9), se tomaron las muestras en suero a pre-inyección, 1 hora post-inyección, día 14 o día 21 solamente utilizando 5 ratones/ punto en el tiempo. Los niveles de IL-10 en suero y los niveles de anticuerpo 12G8 en suero se determinaron utilizando ELISAs específicos. Determinaciones de Parámetros Farmacocinéticos. Todos los parámetros fueron estimados o calculados utilizando WinNonlin Pro v 4.0. Para los análisis sin división en compartimientos, se utilizó el Modelo 200 (SC) o el Modelo 201 (IV). Los datos de entrada eran datos de concentración media-tiempo aritméticos de grupos de dosis normalizadas. Las dosis de entrada eran dosis nominales para los Grupos 2-4 y 6-8. La dosis de entrada para los Grupos 1 y 5 fue de 0.014 mg/kg. Para los análisis con división en compartimientos, se utilizó el Modelo 3 (SC) o el Modelo 7 (IV). Los datos de entrada eran datos de concentración -tiempo por animal individuales de dosis normalizadas. Todos los ajustes utilizaron un peso uniforme (peso= 1) para los puntos de datos individuales. Las dosis de entrada eran dosis nominales para los Grupos 2-4 y 6-8. La dosis de entrada para los Grupos 1 y 5 fue de 0,014 mg/kg. Se evaluó el buen ajuste utilizando inspección visual, comparaciones de SE's para los parámetros estimados/ calculados, residuales y criterios de AIC & SBC. Una síntesis de la recuperación de soluciones de dosificación se muestra en el Cuadro 9 que aparece a continuación.

CUADRO 9 Los cuadros 10 y 11 que se muestran a continuación sintetizan s datos de los grupos que recibieron el anticuerpo 12G8 por inyección i.v.

CUADRO 10 Parámetros de Método sin División en Compartimientos para Grupos de Dosificación por Bolo IV CUADRO 11 Parámetros del Método con Compartimientos para los Grupos de Dosificación por Bolo IV Los cuadros 12 y 13 que se muestran a continuación sintetizan datos de los grupos que recibieron el anticuerpo 12F8 por inyección s.c.

CUADRO 12 Parámetros del Método sin División en Compartimientos para Grupos de Dosificación por Bolo SC La biodisponibilidad puede ser alta debido a una subestimación de IV AUC.

CUADRO 13 Parámetros del Método de División en Compartimientos para Grupos de Dosificación por Bolo SC Los perfiles de concentración - tiempo se muestran para el anticuerpo 12F8 utilizando diversas dosificaciones y rutas en las Figuras 2A y 2B. Conclusiones: Las dosis estaban dentro del 20% de nominal para todos los grupos excepto el nivel de dosis más bajo. Las concentraciones más bajas de lo esperado, probablemente debido a la presencia de anticuerpos anti -SCH708980 (12G8 humanizado) fueron observadas desde el Día 10 post-inyección en grupos 7 u 8. (A) Farmacocinética de Bolo IV. Las vidas medias, volúmenes de eliminación y distribución son típicos de aquellos vistos para otros anticuerpos monoclonales de lgG1. El volumen de distribución es aproximadamente igual a o levemente mayor que el volumen en suero lo que sugiere una distribución extravascular mínima. Las vidas medias terminales oscilaron entre 10 y 17 días. El incremento en AUC era generalmente proporcional a la dosis sugiriendo PK lineal con respecto al rago de la dosis ensayado. (B) Farmacocinética de Bolo SC. Las concentraciones máximas eran generalmente proporcionales a la dosis y se alcanzaron alrededor de los días 1-2 post-dosis sugiriendo índices consistentes y grados de absorción con respecto al rango de dosis ensayado. El incremento en la AUC era generalmente proporcional a la dosis sugiriendo PK lineal. Las vidas medias de eliminación terminal oscilaron entre 8-14 días, similar a otros anticuerpos monoclonales de lgG1. La biodisponibilidad absoluta era alta, rango= 70-100%, si bien las estimaciones > 90% pueden ser altas debido a la subestimación de IV AUC.

EJEMPLO IV Determinación de la Constante de Disociación de Eguilibrio (Kd) para anticuerpo de IL-10 anti-humano humanizado SCH 708980 (12G8) utilizando tecnología KinExA La constante de disociación de equilibrio (Kd) para el anticuerpo humanizado SCH 708980 se determinó utilizando KinExA 3000 (Sapidyne Instruments Inc.). KinExA utiliza el principio del método de Ensayo de Exclusión Cinética basado en la medición de la concentración de anticuerpo no complejado en una mezcla de anticuerpo, antígeno y complejo anticuerpo -antígeno. La concentración de anticuerpo libre se midió exponiendo la mezcla a un antígeno inmovilizado en fase sólida durante un período de tiempo muy breve. En la práctica, esto se logró haciendo fluir la mezcla de antígeno - anticuerpo en fase de solución pasando partículas recubiertas con antígeno atrapadas en una celda de flujo. Los datos generados mediante el instrumento se analizaron utilizando el software habitual. Se calcularon las constantes de equilibrio utilizando una teoría matemática basada en las siguientes hipótesis: 1. La unión sigue la ecuación de unión reversible para equilibrio: Kon [Ab] [Ag] = Koff[AbAg] 2. El anticuerpo y el antígeno se unen 1 : 1 , y el anticuerpo total iguala complejo antígeno - anticuerpo más anticuerpo libre 3. La señal del instrumento está linealmente relacionada con la concentración de anticuerpo libre Materiales utilizados: Anticuerpo monoclonal humanizado SCH 708980 de IL-10 humana recombinante (h12G8); IL-10 humana recombinante (hlL-10); IL-10 de ratón recombinante (mlL-10), IL-10 Cyno recombinante (Cyno IL-10); partículas PMMA, 98 micrones (Sapidyne, Cat No. 440198); Neutravidina (Pierce, Cat No. 31000); EZ- link TFP PEO- Biotina (Pierce, Cat No. 21219); rhlL-10 biotinilada; y anti- HulgG de cabra Cy5 conjugado (H + L) (Jackson Immunoresearch Laboratories Cat. No 109-175-088, lot 49069). Las partículas de PMMA fueron recubiertas con rhlL5 biotinilada de conformidad con los protocolos del fabricante. Para la biotinilación de rhlL5 se utilizó EZ-Iink TFP PEO-biotina de conformidad con las recomendaciones del fabricante (Pierce bulletin 0874). Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de conformidad con el manual KinExA 3000. Condiciones Experimentales: Todas las operaciones se llevaron a cabo por duplicado. Para las operaciones con hlL-10 se utilizaron las siguientes condiciones: Volumen de Muestra: 1.5 ml índice de Flujo de Muestra: 0.25 ml/min Volumen de rótulo: 0.5 ml índice de flujo de rótulo: 0.25 ml/min Conc. de mAb: 0.1 nM Conc. de Ag ( hlL-10) más elevada: 4.0 nM Conc. de Ag (hlL-10) más baja: 3.91 pM Se prepararon diluciones seriales dobles del antígeno y se mezclaron con el anticuerpo a una concentración constante. La mezcla se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente (TA) para equilibrar. Para las operaciones con mlL-10 se utilizaron las siguientes condiciones: Volumen de Muestra: 0.5 ml índice de Flujo de Muestra: 0.25 ml/min Volumen de rótulo: 0.5 ml índice de flujo de rótulo: 0.25 ml/min Conc. de mAb: 1 nM Conc. de Ag ( mlL-10) más elevada: 50 nM Conc. de Ag (mlL-10) más baja: 48.8 pM Se prepararon diluciones seriales dobles del antígeno y se mezclaron con el anticuerpo a una concentración constante. La mezcla se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente (TA) para equilibrar. Para las operaciones con Cyno IL-10 se utilizaron las siguientes condiciones: Volumen de Muestra: 2 ml índice de Flujo de Muestra: 0.25 ml/min Volumen de rótulo: 1 ml índice de flujo de rótulo: 0.25 ml/min Conc. de mAb: 0.1 nM Conc. de Ag ( mlL-10) más elevada: 5.0 nM Conc. de Ag (mlL-10) más baja: 4.88 pM Se prepararon diluciones seriales dobles del antígeno y se mezclaron con el anticuerpo a una concentración constante. La mezcla se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente (TA) para equilibrar. Los resultados se muestran en el Cuadro 14 que aparece a continuación.

CUADRO 14 Constante de Disociación de Eguilibrio (Kd) Para el Anticuerpo 12F8 utilizando tecnología KinExA EJEMPLO V Aplicación de ensayo de electroquimiluminiscencia competitiva (ECLA, "electrochemiluminescence assay") para medir la unión de anticuerpos monoclonales anti-hlL-10 y hlL-10-Ra a IL-10 recombinante de origen diferente Síntesis de tecnología. La tecnología de electroquimiluminiscencia fue desarrollada por IGEN, Inc (Gaithersburg, MD) y es empleada en el analizador serie M M8/384 utilizado en este trabajo. La tecnología de electroluminiscencia utiliza un metal de rutenio estable quelado (Ori-TAG) el cual, en presencia de tripropilamina (TPA), genera electroquimiluminiscencia luego de la aplicación de voltaje. Las perlas paramagnéticas, micrones de diámetro, actúan como la fase sólida y facilitan la rápida cinética del ensayo. El complejo/ perla es pasado por canal a través de una celda de flujo y capturado en un electrodo mediante aplicación magnética. El voltaje es aplicado y la electroquimiluminiscencia resultante es medida. Materiales utilizados. Placas de polipropileno de 96 pocilios (Costar, Cat. No. 3365, Fisher Sci. Cat. No. 07200697); regulador de pH de ensayo de BSA 0.1 %, tween 20 0.05%, PBS pH 7.5; perlas paramagnéticas (Streptavidin-Dynabeads, Igen, Inc., Cat .No. 110029); dímero de IL-10 humana recombinante (dímero hlL-10); monómero de IL-10 humano recombinante (mono-hlL-10); IL-10 de ratón recombinante (mlL-10); IL-10 cyno recombinante (cyno IL-10); y hlL-10Ra recombinante ( hlL-10Ra): proteína etiquetada con FLAG. Se prepararon anticuerpos monoclonales M2 anti-FLAG rotulados con Ori-Tag utilizando Ori-Tag-NHS éster (Igen, Inc. Cat. No. 110034) de conformidad con el protocolo del fabricante (rótulo OriTag: relación del desafío con IgG 8:1). Los anticuerpos M2 anti-Flag monoclonales fueron obtenidos de Sigma (Cat. No. F3165). Los anticuerpos monoclonales 1A2 anti hlgG rotulados con Ori-Tag se prepararon como se describió anteriormente utilizando anticuerpos monoclonales anti hlgG de rata. Se prepararon anticuerpos de IgG de rata rotulados con Ori-Tag según lo descrito anteriormente de anticuerpos de Cabra policlonales anti IgG (H+L) de rata (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. PA, Cat. No. 112-005-143). Se preparó IL-10 humana recombinante biotinilada (hlL-10-biotina) utilizando TFP-PEO-biotina (Pierce, Cat. No. 21219) de conformidad con las recomendaciones del fabricante (Pierce bulletin 0874). El 12G8 mAb anti hlL- 10 de rata (r12G8): JES3.12G8 y mAb 12G8 anti hlL-10 humanizado (h12G8- 1 ) se prepararon según lo descrito en la presente invención. Protocolo. Se realizaron 1/3 diluciones seriales en 50 microlitros del regulador de pH de ensayo en una placa de microtítulo de 96 pocilios para todas las preparaciones de IL-10 sin rotular (mlL-10, cyno IL-10, dímero hlL- 10, hlL-10 mono) comenzando con 3 µg/ml en el primer pocilio. Todas las muestras se llevaron a cabo por duplicado. 50 µl de hlL-10-biotina en 25 ng/ml se agregaron a cada pocilio, seguido por la adición de hlL-10Ra (50 µl en 100 ng/ml) o mAb anti hlL-10 (50 µl en 10 ng/ml ). Se agregaron 50 microlitros de anticuerpos secundarios conjugados con Ori-Tag a cada pocilio a una conc. de 500 ng/ml. Para hlL-10Ra, r12G8 y h12G8 se utilizaron los siguientes conjugados con Ori-Tag concordantemente: M2 anti-FLAG -OriTag, IgG antirata -OriTag y anti hlgG 1A2-Or¡Tag. Finalmente, a cada pocilio se agregaron 50 µl de Streptavidina-Dynabeads a 0.1 mg/ml. Después de incubación de una hora a temperatura ambiente la placa fue procesada mediante el analizador serie M M8/384. Se calculó el porcentaje de inhibición de la señal por las preparaciones de IL-10 sin rotular con relación a las muestras control. Para trazar los datos y calcular la IC5o se utilizó el Software GraphPad Prism.

Los resultados se muestran en el siguiente Cuadro 15.

CUADRO 15 Determinación de afinidad de unión utilizando ECLA Los resultados de la caracterización del anticuerpo 12G8 de rata y el anticuerpo 12G8 humanizado (SCH708980) se sintetizan en el siguiente Cuadro 16.

CUADRO 16 12G8 de rata IGEN Kinexa Biacore Bioensayo IC50(nM) Kd(pM) Kd(pM) IC50(pM) media±S.D. (n) media±S.D.(n) media±S.D.(n) media±S.D.(n) IL-10 de ratón 38±18 (2) 7400±2500 (9) IL-10 cyno 6.6±1.5 (2) 330±60 (9) IL-10 hu 4.7±0.8 (2) 23 (1) 277+39 (7) 66±9 (5) SCH708980 (hu12G8) IGEN Kinexa Biacore Bioensayo IC50(nM) Kd(pM) Kd(pM) IC50(pM) media±S.D. (n) media±S.D.(n) medja±S.D.(n) media±S.D.(n) IL-10 de ratón 53+8 (2) 286±21 (3) 8600±600 (8) IL-10 cyno 4.9±0.9 (2) 76±32 (3) 659±71 (8) IL-10 hu 4.0±0.5 (2) 25±9 (3) 511±68 (11) 93±9 (5) EJEMPLO VI Efectos de neutralización de anticuerpo IL-10 anti-humano humanizado m vivo Se evaluó la eficacia neutralizante in vivo de SCH 708980 y JES.12G8 en el modelo Leishmania major en ratones. En este modelo, ratones CB6F1 normalmente resistentes a la infección por parásitos se tornaron susceptibles por heterozigosidad para un transgen de IL-10 humana bajo el control del promotor de clase II MHC. Ratones CB6F1 o CB6F1-hulL-10Tg fueron inyectados s.c. con SCH 708980 o JES.12G8 semanalmente comenzando tres días antes de la prueba en la almohadilla dei pie s.c. con 15x106 parásitos L. major en fase estacionaria. Se controló la progresión de la enfermedad mediante mediciones semanales de la hinchazón de las almohadillas del pie. Las Figuras 3A y 3B muestran que tanto SCH708980 (el 12G8 humanizado) como 12G8 de rata madre neutralizaron el efecto protector de IL-10 en forma dosis- dependiente. Pueden efectuarse muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin apartarse de su espíritu y alcance, según se pondrá en evidencia para los expertos en la técnica. Las modalidades específicas descritas aquí son ofrecidas a modo de ejemplo solamente, y la invención debe ser limitada por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance completo de los equivalentes a los cuales tienen derecho tales reivindicaciones; y la invención no debe ser limitada por las modalidades específicas que han sido presentadas aquí a modo de ejemplo. La mención de las publicaciones o documentos antes mencionados no tiene el propósito de ser un reconocimiento de que cualquiera de las que antecede es técnica anterior pertinente, ni constituye reconocimiento alguno en cuanto al contenido o fecha de estas publicaciones o documentos. Las patentes de los Estados Unidos y otras publicaciones a las que se hace referencia en la presente invención se incorporan como referencia.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una molécula de anticuerpo recombinante humanizado que une IL-10 o su fragmento, que comprende: por lo menos una región variable de cadena ligera de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:1 en CDR1 , SEC ID NO:2 en CDR2, y SEC ID NO:3 en CDR3; y una región de estructura, en donde la secuencia de aminoácidos de la región de estructura es en su totalidad o sustancialmente en su totalidad una secuencia de aminoácidos de inmunoglobina humana; y por lo menos una región variable de cadena pesada de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:6 en CDR1 , SEC ID NO:7 en CDR2, y SEC ID NO:8 en CDR3; y una región de estructura, en donde la secuencia de aminoácidos de la región de estructura es en su totalidad o sustancialmente en su totalidad una secuencia de aminoácidos de inmunoglobina humana.

2.- La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente una región constante de cadena pesada, en donde la región constante de cadena pesada comprende una región constante de cadena pesada humana ?1 , ?2, ?3 o ?4 o una variante de la misma.

3.- La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende adicionalmente una región constante de cadena ligera, en donde la región constante de cadena ligera comprende una región constante de cadena ligera humana lambda o kappa.

4.- La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el fragmento de unión es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo formado por Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, y un diacuerpo.

5.- La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la cadena ligera de anticuerpo, o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable de SEC ID NO:4.

6.- La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque la cadena ligera del anticuerpo, o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región constante de SEC ID NO:5.

7.- La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la cadena pesada del anticuerpo, o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable de SEC ID NO:9.

8.- La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la cadena pesada del anticuerpo, o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región constante de SEC ID NO:10. 9.- Una molécula de anticuerpo recombinante quimérico que une

IL-10 o su fragmento de unión, que comprende: por lo menos una región variable de cadena ligera de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:1 en CDR1 , SEC ID NO:2 en CDR2, y SEC ID NO:3 en CDR3; y por lo menos una región variable de cadena pesada de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:6 en CDR1 , SEC ID NO:7 en CDR2, y SEC ID NO:8 en CDR3.

10.- Una molécula de anticuerpo recombinante humanizado que une IL-10, o su fragmento de unión, que comprende: por lo menos una cadena ligera de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:11 en CDR1 , SEC ID NO:12 en CDR2, y SEC ID NO: 13 en CDR3; y una región de estructura, en la cual la secuencia de aminoácidos de la región de estructura es toda o sustancialmente toda de una secuencia de aminoácidos de inmunoglobina humana; y por lo menos una cadena pesada de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID NO:15 en CDR1 , SEC ID NO:16 en CDR2, y SEC ID NO:17 en CDR3; y una región estructural, en donde la secuencia de aminoácidos de la región estructural es toda o sustancialmente toda de una secuencia de aminoácidos de inmunoglobina humana.

11.- La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque comprende adicionalmente una región constante de cadena pesada, en donde la región constante de cadena pesada comprende una región constante de cadena pesada humana ?1 , ?2, ?3, o ?4 o una variante de la misma.

12.- La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque comprende adicionalmente una región constante de cadena ligera, en donde la región constante de cadena ligera comprende una región constante de cadena ligera humana lambda o kappa.

13.- La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el fragmento de unión es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo formado por Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, y un diacuerpo. 14.- La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque la cadena ligera del anticuerpo, o su fragmento de unión comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región constante de SEC ID NO:

14.

15.- La molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque la cadena pesada del anticuerpo, o su fragmento de unión, comprende un polipéptido que tiene una región variable y una región constante de SEC ID NO: 18.

16.- Una molécula de anticuerpo recombinante quimérico que une IL-10, o su fragmento de unión, que comprende: por lo menos una cadena ligera de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:11 en CDR1 , SEC ID NO:12 en CDR2, y SEC ID NO:13 en CDR3; y por lo menos una cadena pesada de anticuerpo, o su fragmento de unión, que comprende un polipéptido que tiene por lo menos una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:15 en CDR1 , SEC ID NO:16 en CDR2, y SEC ID NO. 7 en CDR3.

17.- El uso de un anticuerpo específico para 1L-10, o su fragmento de unión, en una cantidad eficaz para bloquear la actividad biológica de IL-10, en donde el anticuerpo es el anticuerpo de la reivindicación 1 o 9, para preparar un medicamento para suprimir una respuesta inmune en un sujeto humano.

18.- El uso que se reclama en la reivindicación 17, en donde la respuesta inmune es una respuesta humoral.

19.- El uso que se reclama en la reivindicación 17, en donde el sujeto tiene lupus sistémico eritematoso.

20.- El uso que se reclama en la reivindicación 17, en donde el sujeto tiene púrpura trombocitopénica inmune (ITC, abreviatura de la expresión inglesa "immune thrombocytopenic purpura").

21.- El uso que se reclama en la reivindicación 17, en donde el sujeto tiene lupus nefritis.

22.- El uso que se reclama en la reivindicación 17, en donde el sujeto tiene VIH.

23.- El uso que se reclama en la reivindicación 17, en donde el sujeto tiene hepatitis C.

24.- El uso que se reclama en la reivindicación 17, en donde dicho medicamento es administrable con un agente inmunosupresor.

25.- El uso de un anticuerpo específico de IL-10 o su fragmento de unión, en una cantidad eficaz para bloquear la actividad biológica de IL-10, en donde el anticuerpo es el anticuerpo de la reivindicación 10 o 16, para preparar un medicamento para suprimir una respuesta inmune en un sujeto humano.

26.- El uso que se reclama en la reivindicación 25, en donde la respuesta inmune es una respuesta humoral.

27.- El uso que se reclama en la reivindicación 25, en donde el sujeto tiene lupus sistémico eritematoso.

28.- El uso que se reclama en la reivindicación 25, en donde el sujeto tiene púrpura trombocitopénica inmune (ITC, abreviatura de la expresión inglesa "immune thrombocytopenic purpura").

29.- El uso que se reclama en la reivindicación 25, en donde el sujeto tiene lupus nefritis.

30.- El uso que se reclama en la reivindicación 25, en donde el sujeto tiene VIH.

31.- El uso que se reclama en la reivindicación 25, en donde el sujeto tiene hepatitis C.

32.- El uso que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho medicamento es administrable con un agente inmunosupresor.

33.- Una composición que comprende un anticuerpo, o su fragmento de unión, en combinación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, en donde el anticuerpo es el anticuerpo de la reivindicación 1 o 9.

34.- La composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque comprende adicionalmente un agente inmunosupresor.

35.- Una composición que comprende un anticuerpo, o su fragmento de unión, en combinación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, en donde el anticuerpo es el anticuerpo de la reivindicación 10 o 16.

36.- La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque comprende adicionalmente un agente inmunosupresor.

37.- Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 1 o 9.

38.- Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 10 o 16.

39.- Un vector de expresión que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 37 ligada operativamente a secuencias control reconocidas por una célula huésped transfectada con el vector.

40.- Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 38.

41.- Un método para producir un polipéptido, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 40 bajo condiciones en donde la secuencia de ácidos nucleicos es expresada, produciendo así el polipéptido, y recuperando el polipéptido de la célula huésped.

42.- Un vector de expresión que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 38 ligada operativamente a secuencias control reconocida por una célula huésped transfectada con el vector.

43.- Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 42.

44.- Un método para producir un polipéptido, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 43 bajo condiciones en donde la secuencia de ácidos nucleicos es expresada, produciendo así el polipéptido, y recuperando el polipéptido de la célula huésped.

45.- Una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un anticuerpo específico de IL-10 que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO:21 y una cadena pesada que tiene la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO:22.

46.- La secuencia de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada además porque la cadena ligera tiene un número de depósito en el American Type Culture Collection (ATCC) de PTA- 5923 y la cadena pesada tiene un número de depósito en el ATCC de PTA- 5922.

47.- Una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un anticuerpo específico de IL-10 que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO:23 y una cadena pesada que tiene la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID NO:24.

48.- La secuencia de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque la cadena ligera tiene un número de depósito en el ATCC de PTA-5927 y la cadena pesada tiene un número de depósito en el ATCC de PTA-5926.

49.- Una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un fragmento de unión del anticuerpo codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 45.

50.- Una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica un fragmento de unión del anticuerpo codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 47.

51.- La secuencia de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 49 o 50, caracterizada además porque el fragmento de unión es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo formado por Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, y un diacuerpo.

52.- Un método para identificar una secuencia de línea germinal aceptora para un anticuerpo humanizado, cuyo método comprende los pasos de: a) identificar un anticuerpo no humano que tiene la actividad biológica deseada; b) determinar la secuencia de aminoácidos de los dominios VH y V de anticuerpo no humano; y c) comparar la secuencia de anticuerpo no humano con un grupo de secuencias de líneas germinales humanas, en donde la comparación comprende los subpasos de: 1 ) asignar la secuencia de números de residuos de secuencias de dominios VH y V no humanas; 2) delinear las regiones CDR y FR en la secuencia; 3) asignar un resultado numérico predeterminado en cada posición residual para la cual las secuencias de línea germinal no humana y humana son idénticas; y 4) totalizar todos los resultados de residuos para generar un resultado total para cada secuencia de línea germinal humana; y d) identificar la secuencia de línea germinal humana con el resultado de residuos total más alto como la secuencia de línea germinal aceptora.

53.- El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque comprende adicionalmente los subpasos de: a) asignar un resultado numérico de 1 por cada posición de residuo para la cual las secuencias de línea germinal humana y no humana son idénticas que no fue calificada en el subpaso (3) a secuencias de línea germinal con resultados de residuos totales idénticos después del subpaso (4); b) totalizar todos los resultados de residuos para generar un resultado total para cada secuencia de línea germinal humana.

54.- El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque la región VH es calificada como sigue:

55.- El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque la región VL es calificada como sigue:

56.- El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque el anticuerpo no humano es específico para IL-10 e inhibe la actividad biológica de IL-10.

57.- Un anticuerpo generado mediante el método que se describe en la reivindicación 52.