KR20120006033A - Ｐ38 ｍａｐ 키나제 억제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 p38 미토겐-활성화된 단백질 키나제 효소 (p38 MAP 키나제 억제제), 특히 그의 알파 및 감마 키나제 서브-타입의 억제제로서, 모든 입체이성체 및 호변이성체를 포함한 하기 화학식(1)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 및 약제학적 배합물을 포함하는 치료, 특히 COPD와 같은 폐의 염증성 질환을 포함하는 염증성 질환의 치료에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다.
Figure pct00038

Description

Ｐ38 ＭＡＰ 키나제 억제제{P38 MAP KINASE INHIBITORS}
본 발명은 p38 미토겐-활성화된 단백질 키나제 효소의 억제제 (본원에서는 p38 MAP 키나제 억제제라고 함), 특히 이들의 알파 및 감마 키나제 서브-타입, 및 약제학적 배합물에서의 용도를 포함한 치료법에서의 그의 용도, 특히 COPD와 같은 폐의 염증성 질환을 포함한 염증성 질환의 치료에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다.
각각 조직-특이적 발현 패턴을 나타내는 4 개의 p38 MAPK 이소형태 (각각 알파, 베타, 감마 및 델타)가 확인되었다. p38 MAPK 알파 및 베타 이소형태는 신체 전체에 걸쳐서 편재하여 발현되며, 다수의 상이한 세포 타입 내에서 발견된다. p38 MAPK 알파 및 베타 이소형태는 특정한 공지의 소분자 p38 MAPK 억제제에 의해서 억제된다. 더 초기 세대의 화합물은 이들 이소형태의 편재하는 발현 패턴 및 화합물의 오프-타겟 (off-target) 효과로 인하여 매우 독성이었다. 더 최근의 억제제들은 p38 MAPK 알파 및 베타 이소형태에 대해서 매우 선택적으로 개선되었고, 더 넓은 안전 범위 (safety margin)를 갖는다.
p38 MAPK 감마 및 델타 이소형태에 대해서는 덜 알려져 있다. 이들 이소형태는 특정의 조직/세포에서 발현된다 (p38 알파 및 p38 베타 이소형태와는 다름). p38 MAPK-델타 이소형태는 췌장, 고환, 폐, 소장 및 신장에서 더 많이 발현된다. 이것은 또한 매크로파지에서 풍부하며 [Smith, SJ. (2006) Br . J. Pharmacol . 149:393-404), 호중구, CD4+ T 세포 및 내피세포에서 검출할 수 있다 [www.genecard.org, Karin, K. (1999) J. Immunol.]. p38 MAPK 감마에 대해서는 거의 알려지지 않았지만, 이것은 뇌, 골격근 및 심장에서뿐만 아니라 림프구 및 매크로파지에서 더 많이 발현된다 (www.genecard.org).
p38 MAPK-감마 및 -델타의 선택적 소분자 억제제는 현재 이용할 수 없지만, 한가지 기존의 화합물인 BIRB 796은 팬 (pan)-이소형태 억제활성을 갖는 것으로 알려져 있다. p38 MAPK 알파를 억제하는데 필요로 하는 상기 화합물의 농도보다 더 높은 농도에서 p38 감마 및 p38 델타 억제가 관찰된다 [Kuma, Y. (2005) J. Biol . Chem. 280:19472-19479]. BIRB 796은 또한, 상류 키나제 MKK6 또는 MKK4에 의한 p38 MAPK 또는 JNK의 포스포릴화를 손상시킨다. 상기 문헌 (Kuma)에서는 MAPK에 대한 억제제의 결합에 의해서 야기된 형태 변화가 그의 포스포릴화 부위 및 상류 활성화제에 대한 도킹 (docking) 부위 둘 다의 구조에 영향을 미치고, 따라서 p38 MAPK 또는 JNK의 포스포릴화를 손상시킬 수 있다는 가능성을 검토하였다.
p38 MAP 키나제는 인간 질병, 예를 들어, 중증 천식 및 COPD에서 만성적인 지속적 염증을 개시 및 유지시키는데 포함되는 다수의 시그날링 경로에서 중요한 역할을 하는 것으로 믿어진다. 현재는, p38 MAP 키나제가 광범위한 전염증성 사이토킨에 의해서 활성화되고, 그의 활성화는 추가의 전염성 사이토킨의 동원 및 방출을 야기한다는 것을 입증하는 다수의 문헌이 존재한다. 실제로, 일부의 임상시험으로부터의 데이터는 p38 MAP 키나제 억제제에 의한 치료 중에 환자에게서 질병 활성에 있어서의 유익한 변화를 나타낸다. 예를 들어, 문헌 [Smith, S. J. (2006) Br . J. Pharmacol. 149:393-404]에는 PBMCs로부터의 TNFα (IL-8은 아님) 방출에 대한 p38 MAP 키나제 억제제의 억제효과를 기술하였다. 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD)의 치료에 있어서의 p38 MAP 키나제의 억제제의 용도가 제안된다. p38 MAPKα/β에 대해서 표적화된 소분자 억제제는 일반적으로 코르티코스테로이드 둔감성인 COPD가 있는 환자로부터 수득된 세포 및 조직에서 [Smith, S. J. (2006) Br . J. Pharmacol. 149:393-404], 및 생체내 동물 모델에서 [Underwood, D. C. et al. (2000) 279:895-902; Nath, P. et al. (2006) Eur . J. Pharmacol. 544:160-167; Medicherla S. et al. (2008) J. Pharm . Exp . Ther. 324:921-929] 염증의 다양한 파라메터를 감소시키는데 효과적인 것으로 판명되었다. 이루센 (Irusen)과 동료들은 또한, 핵 내의 글루코코르티코이드 수용체 (GR)의 결합 친화성의 감소를 통한 코르티코스테로이드 둔감성에 대한 p38 MAPK α/β의 연루의 가능성을 시사하였다 [Irusen, E. et al., (2002) J. Allergy Clin . Immunol., 109:649-657]. AMG548, BIRB 796, VX702, SCIO469 및 SCIO323을 포함한 광범한 p38 MAP 키나제 억제제를 사용한 임상적 경험은 문헌 [Lee et al. (2005) Current Med . Chem. 12,:2979-2994]에 기술되어 있다.
COPD는 기본적 염증이 흡입된 코르티코스테로이드의 소염효과에 대해서 실질적으로 저항성인 것으로 보고된 상태이다. 따라서, COPD를 치료하기 위한 탁월한 전략은 고유한 소염효과, 및 흡입된 코르티코스테로이드에 대한 COPD 환자의 폐 조직의 민감성을 증가시키는 능력 둘 다를 갖는 개입을 개발하는 것일 것이다. 메르카도 (Mercado) 등의 최근의 간행물 [2007; American Thoracic Society Abstract A56]은 침묵성 p38 감마가 코르티코스테로이드에 대한 민감성을 복원하는 잠재력을 가짐을 입증하였다. 따라서, COPD 및 중증 천식의 치료를 위한 p38 MAP 키나제 억제제의 사용에 대해서는 "2-갈래" 효과가 있을 수 있다.
이제는 호흡기 바이러스 감염의 역할을 천식 및/또는 COPD를 앓고 있는 환자에게서 악화를 개시시키는데 강력하게 연루시키는 상당량의 증거가 있다. 악화는 질병 증후학의 제어를 재-정립하기 위한 치료 강도의 증가를 필요로 한다. 중증인 경우에, 악화는 충분히 입원, 또는 그의 가장 극한 상황에서는 환자의 사망을 야기할 수 있다. 일반적으로 악화와 관련된 바이러스에는 리노바이러스, 인플루엔자 및 호흡기 세포융합 바이러스 등이 있다. 이들 바이러스들에 대한 세포의 반응은, 현재 바이러스 입자의 복제뿐만 아니라, ICAM1(세포간 부착 분자 1)의 상향조절 및 사이토킨의 방출을 포함하는 것으로 알려져 있다. 이들 바이러스들에 대한 p38 키나제 억제제의 효과에 대한 조사가 있었으며, p38 키나제 억제제에 보호 효과가 감지될 수 있다는 것을 암시하는 일부 보고서가 있었다. 특히, 일부 보고서에는 IL-8의 바이러스-유래 방출 억제는 공지 화합물, SB203580으로 인비트로에서 수행될 수 있다. 리노바이러스-유래 감염 및 임상전 인비보 모델에서의 바이러스 복제를 감소시키는 제제의 효능에 대한 분석이 중요한 과제를 남긴다는 것은 주목할만한 것이다. 그러나, 마우스 내 인플루엔자 및 기니 피그 내 파라인플루엔자라는 잘 확립된 인비보 모델이 존재한다.
인간 만성 염증성 질환의 치료에 있어서 p38 MAP 키나제 억제제의 유용성을 저해하는 주된 장애는 환자에게서 관찰된 독성이었다. 이것은 상기에 구체적으로 언급된 모든 것을 포함한, 진행된 다수의 화합물의 임상적 개발의 중지를 야기하기에 충분히 심각하였다.
개선된 치료학적 잠재력을 갖는, 특히 적절한 치료학적 용량에서 더 효과적이고, 더 장시간 작용하고/하거나 덜 독성인 p38 MAP 키나제 억제제로 치료학적으로 유용한 신규의 화합물을 확인하고 개발할 필요성이 남아있다. 본 발명의 목적은 우수한 소염성 잠재력을 나타내는, 예를 들면, 특정의 서브-타입 특이성을 갖는 p38 MAP 키나제를 억제하는 화합물을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명에 따르면, 그의 모든 입체이성체 및 호변이성체를 포함한 하기 화학식(1)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 솔베이트가 제공된다:
Figure pct00001
화학식(1)의 화합물의 계통명은 N-(4-(4-(3-(3-tert-부틸-1-p-톨릴-1H-피라졸-5-일)우레이도)나프탈렌-1-일옥시)피리딘-2-일)-2-메톡시아세트아미드이다.
발명의 상세한 설명
화학식(1)의 염의 예에는, HCl 및 HBr 염과 같은 강한 무기산의 산 부가염과 메탄설폰산염과 같은 강한 유기산의 부가염 등 약제학적으로 허용되는 모든 염이 포함되나, 이에 한하지 않는다.
이하 본원에서 사용되는 화학식(1)의 화합물의 정의는, 문맥상 특별히 달리 지시하지 않는 한, 상기 화합물의 염, 솔베이트, 및 모든 호변이성체를 포함하고자 한다. 솔베이트의 예로는 하이드레이트를 들 수 있다.
본원에서 제공되는 발명은 화학식(1)의 화합물의 프로드럭까지 확장되며, 이는 생체내 분해되고/되거나 대사되어 화학식(1)의 활성 화합물을 제공하는 화합물을 말한다. 프로드럭의 일반적인 예에는, 단순한 에스테르, 및 혼합 카보네이트 에스테르와 같은 기타 에스테르, 카바메이트, 글리코시드, 에테르, 아세탈 및 케탈 등이 포함된다.
본 발명의 추가적인 측면으로서, 화학식(1)의 화합물의 하나 이상의 대사물, 특히 하나 이상의 치료적 활성을 갖는 화학식(1)의 화합물의 대사물이 제공된다. 본원에서 사용되는 대사물이란, 화학식(1)의 화합물의 대사로부터 생체내 생성되는 화합물, 예컨대, 산화 대사물 및/또는 예를 들면 O-탈알킬화로부터 생성되는 대사물 등을 들 수 있다.
본 발명의 화합물은 명시된 원자가 천연적으로 존재하거나 비-천연적으로 존재하는 동위원소에 의해서 대체된 경우를 포함한다. 일 구체예로서, 동위원소는 안정한 동위원소이다. 따라서, 본 발명의 화합물은 예를 들어, 중수소 함유 화합물 등을 포함한다.
본원은 또한, 본원에서 정의된 화합물의 모든 다형체까지 확장된다.
화학식(1)의 화합물의 제조 경로의 예를 하기 반응식 1에 나타내었다:
[반응식 1]
Figure pct00002
따라서, 화학식(1)의 화합물은, 화학식(8)의 화합물을 화학식(A)의 화합물과 반응시키는 것을 포함하는 공정으로 제조될 수 있다:
Figure pct00003
Figure pct00004
상기 식에서, LG1은 이탈기, 예를 들면, 클로로와 같은 할로겐이다.
염기(예: N,N-디이소프로필에틸아민)의 존재하에 적절하게 반응을 수행할 수 있다.
화학식(8)의 화합물은, 화학식(7)의 화합물을 화학식(6)의 화합물 및 화학식(B)의 화합물과 반응시켜 제조될 수 있다:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
상기 식에서, LG2 및 LG3는 각각 독립적으로 이탈기를 나타낸다(예: LG2는 Cl3CO-이고, LG3는 Cl이다. 다르게는, LG2 및 LG3는 둘다 동일할 수 있어, 예를 들면, LG2 및 LG3는 모두 이미다졸 또는 할로겐 예컨대 클로로를 나타냄).
반응은 적절하게 비양성자성 용매(예: 디클로로메탄)에서 수행하여, 화학적으로 민감한 기에 대해 적절한 보호기를 사용한다.
화학식(6)의 화합물은, 화학식(4a)의 화합물을 화학식(C)의 화합물과, 예를 들면, 적절한 촉매, 예컨대, 균일한 팔라듐 촉매의 존재하에 반응시킨 후, 아민 보호기를 제거하여 제조될 수 있다:
Figure pct00008
Figure pct00009
상기 식에서, P1은 적절한 아민 보호기이고, LG4는 클로로와 같은 이탈기를 나타낸다. 예를 들면, 보호기가 tert-부톡시카보닐인 경우, 이들은 디클로로메탄 내에서 TFA로 처리하여 제거할 수 있다.
화학식(4a)의 화합물은 화학식(3a)의 화합물을 보호하여, 예를 들면, 디-tert-부틸 디카보네이트 및 DMAP를 사용하여 제조될 수 있다:
Figure pct00010
상기 식에서, LG4는 클로로와 같은 이탈기를 나타낸다.
화학식(3a)의 화합물은 화학식(2)의 화합물을 화학식(D)의 화합물과 적절한 반응 조건하에서, 예를 들면, 포타슘 tert-부톡사이드 및 N-메틸피롤리돈(1-메틸피롤리딘-2-온)과 같은 강염기의 존재하에 반응시켜 제조될 수 있다:
Figure pct00011
Figure pct00012
상기 식에서, LG4는 이탈기, 예를 들면, 할로겐 원자, 화학식(3)의 화합물에 따라, 예컨대, 클로로를 나타낸다.
화학식(1)의 화합물은 또한, 하기 반응식 2로 나타낸 공정에 의해 제조될 수 있다:
[반응식 2]
따라서, 화학식(1)의 화합물은, 화학식(7)의 화합물을 화학식(12)의 반응물과, 예를 들면, 1,1-카보닐-디이미다졸과 같은 적절한 커플링제의 존재하에 반응시켜 제조될 수 있다.
Figure pct00014
Figure pct00015
화학식(12)의 화합물은, 화학식(11)의 화합물을 환원시켜 제조할 수 있다:
Figure pct00016
환원은 탄소 상 팔라듐과 같은 적절한 촉매로 수소화 조건하에서 실시하거나, 아세트산에서 철 분말과 같은 적절한 환원제를 사용하여 화학적으로 실시할 수 있다.
화학식(11)의 화합물은, 화학식(10)의 화합물을 화학식(A)의 화합물과 반응시켜 제조될 수 있다:
Figure pct00017
Figure pct00018
상기 식에서, LG1은 상기 정의된 바와 같이 이탈기를 나타낸다.
반응은 N,N-디이소프로필에틸아민과 같은 적절한 비-친핵성 염기의 존재하에, 예를 들어, 디클로로메탄과 같은 적절한 용매에서 수행될 수 있다.
화학식(10)의 화합물은, 예를 들면, 소듐 하이드라이드 등의 염기와 DMF 등의 적절한 용매의 존재하에, 화학식(9)의 화합물을 화학식(E)의 화합물과 반응시켜 제조될 수 있다:
Figure pct00019
Figure pct00020
상기 식에서 그룹 NR1R2는 아민이거나, 적절하게 보호된 그의 유도체이다. NR1R2이 -NH2가 아닌 경우, 적절한 보호 단계를 거쳐 화학식(10)의 화합물을 제공해야 할 것으로 생각된다.
화학식(2), (7), (9), (A), (B), (C), (D)의 화합물들은 상업적으로 이용가능하거나, 공지되었거나, 신규한 것으로서, 통상적인 방법으로 쉽게 제조할 수 있다. 예를 들면, Regan, J. et al.; J. Medd. Chem., 2003, 46, 4676-4686, WO00/043384, WO2007/087448 및 WO2007/089512 참조.
보호기는 상술한 하나 이상의 반응 중에 화학적으로 민감한 기를 보호하여, 공정이 수행될 수 있도록 하고/하거나 효율적으로 되도록 하기 위해 필요할 수 있다. 따라서, 원하거나 필요에 따라, 통상적인 보호기를 사용하여 중간체 화합물을 보호할 수 있다. 보호기와 이들을 제거하기 위한 수단은 「"Protective Groups in Organic Synthesis", by Theodora W. Greene and Peter G. M. Wuts, published by John Wiley & Sons Inc; 4th Rev Ed., 2006, ISBN-10; 0471697540」에 기술되어 있다. 본원에 설명된 신규한 중간체들은 본 발명의 일면을 형성한다.
화학식(1)의 화합물은 p38 MAP 키나제 억제제로서, 일 측면에 있어서 상기 화합물은 질병, 예를 들면, COPD 및/또는 천식에 유용하다.
놀랍게도, 상기 화합물은 다른 공지의 p38 MAP 키나제 억제제, 예컨대, BIRB796에 비해, 작용의 지속성 및 영속성이 길 것으로 예상된다.
일 구체예로서, 화학식(1)의 화합물은 p38 MAPK 알파 및/또는 감마 서브타입 억제제이다.
본원에서 사용되는 작용의 지속성은 타겟(예컨대, 수용체)으로부터 화합물의 해리도 또는 해리 상수와 관련된다. 낮은 해리도는 지속성의 원인이 될 수 있다.
낮은 해리도는 높은 해리도와 결합하여 강한 치료적 본질을 제공하는 경향이 있다.
화학식(1)의 화합물은 생체내에서 강할 수 있다.
전형적으로, 현재까지 개발된 선행 기술 화합물들은 경구 투여를 위한 것이었다. 이러한 전략은 적절한 약력학적 프로파일에 의해서 그들의 작용 지속기간을 달성하는 화합물을 최적화하는 것을 수반한다. 이것은 투약 후 및 투약 간에 임상적 효과를 제공하기에 충분한 약물 농도가 확립되고 유지되는 것을 보장한다. 이러한 접근방법의 필연적인 결과는 모든 체조직, 특히 간 및 장이 약물의 치료학적으로 활성인 농도 (이들이 치료할 질병에 의해서 안 좋은 영향을 받든지 아니든지)에 노출될 수 있도록 한다.
대체 전략은 약물이 염증이 있는 기관에 직접 투여되는 치료 접근방법을 고안하는 것이다 (국소 요법). 이러한 접근방법은 모든 만성 염증성 질환을 치료하는데 적합하지 않지만, 이것은 폐 질환 (천식, COPD), 피부 질환 (아토피 피부염 및 건선), 코 질환 (알레르기성 비염) 및 위장 질환 (궤양성 대장염)에서 광범하게 이용되었다.
국소 요법에서, 효능은 (i) 약물이 지속적인 작용기간을 갖고, 전신적 독성의 위험을 최소화하도록 해당 기관에 유지되는 것을 보장하거나, (ii) 약물의 바람직한 효과를 지속시키는데 유용한 활성 약물의 "저장소"를 생성시키는 제제를 생산함으로써 달성될 수 있다. 접근방법 (i)은 COPD에 대한 치료로서 폐에 국소적으로 투여되며, 그의 표적 수용체에 대해서 예외적으로 높은 친화성을 가져서 매우 느린 오프-율 (off-rate) 및 결과적으로 지속적인 작용의 지속기간을 제공하는 항콜린성 약물 티오트로피움 (Spiriva)으로 예시된다.
본원의 일 측면으로서, 화학식(1)의 화합물은 국소 전달, 예컨대, 폐로의 국소 전달에 특히 적합하고, 특히 호흡기 질환, 예를 들면, COPD 및/또는 천식과 같은 만성 호흡기 질환의 치료에 적합하다.
일 구체예로서, 화학식(1)의 화합물은 코르티코스테로이드에 의한 치료에 대해서, 이러한 치료 체제에 반응하지 않는 환자를 감작시키는데 적합하다.
화학식(1)의 화합물은 또한, 류마티스성 관절염의 치료에 유용할 수 있다.
화학식(1)의 화합물은 항바이러스성을 가질 수 있어, 예를 들면, 피코르나바이러스에 의한 세포(예: 호흡기 상피 세포)의 감염, 특히, 리노바이러스, 인플루엔자 또는 호흡기 세포융합 바이러스에 의한 감염을 방지할 수 있다.
따라서, 상기 화합물은 항바이러스제로 생각되며, 특히 피코르나바이러스 감염, 예컨대, 리노바이러스 감염, 인플루엔자 또는 호흡기 세포융합 바이러스의 예방, 치료 또는 호전시키는데 적합하다.
일 구체예로서, 화학식(1)의 화합물은 리노바이러스 감염과 같은 바이러스 감염과 특히 생체내 IL-8과 같은 사이토킨의 방출을 유발하는 바이러스 감염에 의해 유발되는 염증을 감소시킬 수 있다. 이러한 활성은, 예를 들면, 본원 실시예에 기술된 바와 같이, 리노바이러스 유발 IL-8 분석을 사용하여 생체외에서 테스트할 수 있다.
일 구체예로서, 화학식(1)의 화합물은 특히 생체내에서 리노바이러스에 의해 유발되느 ICAM1 발현을 감소시킬 수 있다. ICAM1은 세포를 감염시키기 위해, 이른바 메이저 그루브(major groove) 리노바이러스 항원형(serotype)에 의해 사용되는 수용체 메커니즘이다. 이러한 활성은, 예를 들면, 본원 실시예에 기술된 방법으로 측정할 수 있다.
상기 특성들은, 울혈 심부전, COPD, 천식, 당뇨, 암 중 하나 이상의 질병의 만성 상태에 있는 환자들 및/또는 예를 들어, 장기 이식후 면역억제된 환자들에 있어서, 질병의 악화, 특히 바이러스 악화의 치료 및/또는 예방에 화학식(1)의 화합물을 사용하는데 특히 적합하게 할 것으로 기대된다.
특히, 화학식(1)의 화합물은, 예를 들어, COPD(만성 기관지염 및 폐기종 포함), 천식, 소아 천식, 낭포성 섬유증, 유육종증, 특발성 폐섬유증, 알레르기성 비염, 비염, 부비동염, 특히 천식 및 COPD(만성 기관지염 및 폐기종 포함) 등 중 하나 이상의 호흡기 장애를 치료하는데 유용할 수 있다.
화학식(1)의 화합물은 또한, 알레르기성 결막염, 결막염, 알레르기성 피부염, 접촉성 피부염, 건선, 궤양성 대장염, 류마티스성 관절염 또는 골관절염에 대에 2차의 염증성 관절을 포함하는, 국소 또는 국부적 요법에 의해 치료될 수 있는 하나 이상의 상태를 치료하는데 유용할 수 있다.
화학식(1)의 화합물은 또한, 류마티스성 관절염, 췌장염, 악액질, 비-소세포 폐암종, 유방암종, 위암종, 결장직장암종 및 악성 흑색종을 포함한 종양의 증식 및 전이의 억제를 포함한 특정의 다른 상태의 치료에 유용할 것으로 예상된다.
화학식(1)의 화합물은 또한, 환자의 상태가 코르티코스테로이드 치료에 대해 무반응성이 되는 경우, 환자의 상태를 코르티코스테로이드에 의한 치료에 대해서 재-감작시킬 수 있다.
추가로, 본 발명은 임의로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
희석제 및 담체는 비경구, 경구, 국소, 점막 및 직장 투여에 적합한 것을 포함할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 이러한 조성물은 예를 들어, 특히 액체 용액 또는 현탁액의 형태로 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내 또는 관절-주위 투여용으로; 특히 정제 또는 캅셀제 형태의 경구 투여용으로; 특히 분말, 비강내 점적제 (drop) 또는 에어로졸 형태의 국소, 예를 들어, 폐 또는 비강내 투여용 및 경피 투여용으로; 예를 들어, 협측, 설하 또는 질점막에 대한 점막 투여용, 및 예를 들어, 좌제 형태의 직장 투여용으로 제조될 수 있다.
상기 조성물은 편리하게는 단위 제형으로 투여될 수 있어, 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985)]에 기술된 것과 같은 약제학적 기술분야에서 잘 알려진 방법 중의 어떤 것을 사용하여서도 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제제는 부형제로서 멸균수 또는 식염수, 프로필렌 글리콜과 같은 알킬렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물 기원의 오일, 수소화된 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 비강내 투여를 위한 제제는 고체일 수 있으며, 부형제, 예를 들어, 락토즈 또는 덱스트란을 함유할 수 있거나, 비강내 점적제 또는 정량 (metered) 스프레이의 형태로 사용하기 위한 수성 또는 유성 용액일 수 있다. 협측 투여를 위한 대표적인 부형제에는 당류, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 전젤라틴화 전분 등이 포함된다.
경구 투여에 적합한 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 상화성인 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있으며, 고체 또는 액체 형태일 수 있다. 정제 및 캅셀제는 결합제, 예를 들어, 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트라가칸트, 또는 폴리-비닐피롤리돈; 락토즈, 슈크로즈, 옥수수 전분, 인산칼슘, 소르비톨 또는 글리신과 같은 충진제; 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 실리카와 같은 윤활제; 및 나트륨 라우릴 설페이트와 같은 계면활성제를 사용하여 제조될 수 있다. 액체 조성물은 통상적인 첨가제, 예를 들어, 소르비톨 시럽, 메틸 셀룰로즈, 당 시럽, 젤라틴, 카복시메틸-셀룰로즈, 또는 식용 지방과 같은 현탁화제; 레시틴 또는 아카시아와 같은 유화제; 편도유, 야자유, 간유 또는 낙화생유와 같은 식물유; 부틸화 하이드록시아니솔 (BHA) 및 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT)과 같은 보존제를 함유할 수 있다. 액체 조성물은 단위 투약형으로 제공하기 전에, 예를 들어, 젤라틴 내에 캅셀화될 수 있다.
고체 경구 투약형에는 정제, 2-부분 경질 외피 캅셀제 및 연질 탄성 젤라틴 (SEG) 캅셀제가 포함된다.
건조 외피 제제는 전형적으로, 약 40% 내지 60% 농도의 젤라틴, 약 20% 내지 30% 농도의 가소제 (예를 들어, 글리세린, 소르비톨 또는 프로필렌 글리콜) 및 약 30% 내지 40% 농도의 물로 이루어진다. 보존제, 염료, 불투명화제 및 방향제와 같은 다른 물질이 또한 존재할 수 있다. 상기 액체 충진 물질은 용해, 가용화 또는 분산된 (밀랍, 수소화 피마자유 또는 폴리에틸렌 글리콜 4000과 같은 현탁화제와 함께) 고체 약물, 또는 광유, 식물유, 트리글리세라이드, 글리콜, 폴리올 및 표면-활성제와 같은 비히클 또는 비히클의 조합물 내의 액체 약물을 포함한다.
적합하게는, 화학식(1)의 화합물은 폐에 국소적으로 투여된다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명에 따라, 임의로 하나 이상의 국소적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께, 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 폐에 대한 국소 투여는 에어로졸 제제를 사용함으로써 달성될 수 있다. 에어로졸 제제는 전형적으로 클로로플루오로카본 (CFC) 또는 하이드로플루오로카본 (HFC)과 같은 적합한 에어로졸 추진제 (propellant) 내에 현탁 또는 용해된 활성 성분을 포함한다. 적합한 CFC 추진제에는 트리클로로모노플루오로메탄 (추진제 11), 디클로로테트라플루오로메탄 (추진제 114), 및 디클로로디플루오로메탄 (추진제 12)이 포함된다. 적합한 HFC 추진제에는 테트라플루오로에탄 (HFC-134a) 및 헵타플루오로프로판 (HFC-227)이 포함된다. 추진제는 전형적으로 전체 흡입 조성물의 중량 기준으로 40 중량% 내지 99.5 중량%, 예를 들어, 40 중량% 내지 90 중량%를 포함한다. 상기 제제는 공용매 (예를 들어, 에탄올) 및 계면활성제 (예를 들어, 레시틴, 소르비탄 트리올리에이트 등)를 포함한 부형제를 포함할 수 있다. 에어로졸 제제는 캐니스터 (canisters) 내에 포장될 수 있으며, 적합한 용량은 정량 밸브 (metering valve) (예를 들어, Bespak, Valois 또는 3M에 의해서 공급되는 것과 같음)를 이용하여 송달된다.
폐에 대한 국소 투여는 또한, 수성 용액 또는 현탁제와 같은 비-가압 제제를 사용하여 달성될 수도 있다. 이것은 네불라이저 (nebuliser)를 이용하여 투여될 수 있다. 폐에 대한 국소 투여는 또한, 건조-분말 제제를 사용하여 달성될 수도 있다. 건조 분말 제제는 본 발명의 화합물을 전형적으로는 1-10 미크론의 질량 평균 공기역학 직경 (MMAD)을 갖는 미분된 형태로 함유할 수 있다. 상기 제제는 전형적으로, 통상 큰 입자 크기, 예를 들어, 100 ㎛ 이상의 MMAD의 락토즈와 같은 국소적으로 허용되는 희석제를 함유할 수 있다. 건조 분말 송달 시스템의 예로는 스핀헤일러 (SPINHALER), 디스크헤일러 (DISKHALER), 터보헤일러 (TURBOHALER), 디스커스 (DISKUS) 및 클릭헤일러 (CLICKHALER)가 포함된다.
본 발명에 따르는 화합물은 치료학적으로 활성을 갖도록 계획된다. 추가의 관점에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다. 따라서, 추가의 관점에서 본 발명은 상기 언급된 하나 이상의 상태의 치료에 있어서의 본 발명에 기술된 바와 같은 화합물을 제공한다.
추가의 관점에서, 본 발명은 상기 언급된 하나 이상의 상태의 치료를 위한 의약의 제조를 위해 본 발명에 기술된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다.
추가의 관점에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 본 발명의 화합물 또는 그의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 상기 언급된 하나 이상의 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
용어 "치료"는 예방뿐만 아니라 치료학적 치료를 포함하고자 하는 것이다.
본 발명의 화합물은 또한, 하나 또는 그 이상의 다른 활성 성분, 예를 들어, 상기 언급된 상태를 치료하는데 적합한 활성 성분과 함께 투여될 수도 있다. 예를 들어, 호흡기 장애의 치료를 위해서 이용가능한 조합은 스테로이드 (예를 들어, 부데소나이드, 베클로메타손 디프로피오네이트, 플루티카손 프로피오네이트, 모메타손 푸로에이트, 플루티카손 푸로에이트), 베타 아고니스트 (예를 들어, 터부탈린, 살부타몰, 살메테롤, 포르모테롤) 및/또는 크산틴 (예를 들어, 테오필린)와의 조합을 포함한다. 기타 적합한 활성제에는, 항콜린제, 예컨대, 티오트로피움 및 항바이러스제, 예컨대, 포스페이트로서 자나미비르 또는 오셀타미비르가 포함되나, 이에 한하지 않는다. 기타 항바이러스제에는 페라미비르 및 라니나미비르 등이 포함된다.
화학식(1)의 화합물의 항바이러스 특성과 관련하여, 하기에 나타난 데이터는 발명자들로 하여금, 다른 항바이러스 요법이 호흡기 질환, 예컨대, COPD 및/또는 천식 및/또는 상기 제시된 하나 이상의 질환을 갖는 환자들의 상태 악화를 치료 또는 예방하는데 유용할 것이라는 사실을 알 수 있게 한다. 따라서, 일 측면에 있어서, 울혈 심부전, 당뇨, 암 등의 만성 상태를 갖는 환자들 또는 예를 들면 장기 이식후 면역억제된 환자들에 있어서, 호흡기 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 항바이러스 요법, 예컨대, 자나마비르 또는 오셀타미비르(예를 들어, 오셀타미비르 포스페이트)를 사용하는 것이 제공된다.
약어
AcOH 빙초산
Aq 수성
Ac 아세틸
ATP 아데노신-5'-트리포스페이트
BALF 기관지폐포 세정액
Br 브로드
BSA 소혈청 알부민
CatCart® 촉매적 카트리지
CDI 1,1-카보닐-디이미다졸
COPD 만성 폐쇄성 폐질환
D 이중선
Pd2(dba)3 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐
DCM 디클로로메탄
DIAD 디이소프로필아자디카복실레이트
DIBAL-H 디이소부틸알루미늄 하이드라이드
DMAP N,N-디메틸피리딘-4-아민
DIPEA N,N-디이소프로필에틸아민
DMF N,N-디메틸포름아미드
DMSO 디메틸 설폭사이드
ELISA 효소 면역흡착 어세이
EtOAc 에틸 아세테이트
FCS 태자 송아지 혈청
FRET 형광 공명 에너지 전이
HEPES 2-(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일)에탄설폰산
Hr 시간
HRP 호스래디쉬 퍼옥시다제
HRV 인간 리노바이러스
ICAM1 세포간 부착 분자 1
lgG 면역글로블린 G
IL-8 인터류킨 8
JNK c-Jun N-말단 키나제
LPS 리포다당질
MAPK 미토겐 단백질 활성화 단백질 키나제
MAPKAP-K2 미토겐-활성화 단백질 키나제-활성화 단백질 키나제 2
MeOH 메탄올
Min 분
MTT 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드
NMP N-메틸-2-피롤리돈(1-메틸피롤리딘-2-온)
NSE 유의적 효과 없음
OD 광학 밀도
PBMC 말초 혈액 단핵 세포
PBS 포스페이트 완충 식염수
PMA 포볼 미리스테이트 아세테이트
PPh3 트리페닐포스핀
RSV 호흡기 세포융합 바이러스
RP HPLC 역상 고성능 액체 크로마토그래피
S 단일선
SCX 고체 지지된 양이온 교환
SDS 나트륨 도데실 설페이트
SiO2 실리카 겔
T 삼중선
TCID50 50% 조직 배양 감염 용량
TFA 트리플루오로아세트산
THF 테트라하이드로푸란
TMB 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘
TNFα 종양괴사인자 알파
XantPhos 4,5-비스(디페닐포스피노)-9,9-디메틸크산텐
일반적 절차
모든 출발물질 및 용매는 상업적 공급원으로부터 수득되었거나, 인용된 문헌에 따라 제조되었다. 수소화는 명시된 조건 하에서 테일스 H-큐브 유동 반응기 (Thales H-cube flow reactor) 상에서 수행되었다. 유기 용액은 일상적으로 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. SCX는 Supelco로부터 구입하였으며, 사용하기 전에 1M 수성 HCl로 처리하였다. 정제될 반응 혼합물은 우선 MeOH로 희석하고, 몇 방울의 AcOH로 산성으로 만들었다. 이 용액을 바로 SCX 상에 부하시키고, MeOH로 세척하였다. 그 후, 원하는 물질을 MeOH 중의 1% NH3로 세척함으로써 용출시켰다. 칼럼 크로마토그래피는 명시된 양을 사용하여 실리사이클 미리 충전된 실리카 (230-400 메쉬, 40-63 μM) 카트리지 상에서 수행하였다.
정제용 역상 고성능 액체 크로마토그래피:
215 및 254 ㎚에서의 UV 검출을 사용하여 10 분에 걸쳐, 0.1% v/v 포름산을 함유하는 H2O-MeCN 구배에 의해 유속 28 ㎖/min으로 용출시키는 애질런트 스칼라 (Agilent Scalar) 칼럼 C18, 5 ㎛ (21.2×50 ㎜). 구배 정보: 0.0-0.5 min: 95% H2O-5% MeCN; 0.5-7.0 min; 95% H2O-5% MeCN으로부터 5% H2O-95% MeCN으로 램핑 (ramped); 7.0-7.9 min: 5% H2O-95% MeCN에서 유지; 7.9-8.0 min: 95% H2O-5% MeCN로 복귀; 8.0-10.0 min: 95% H2O-5% MeCN에서 유지.
분석 방법
역상 고성능 액체 크로마토그래피:
215 및 254 ㎚에서의 UV 검출을 사용하여 7 분에 걸쳐, 0.1% v/v 포름산을 함유하는 H2O-MeCN 구배에 의해 유속 2.5 ㎖.min- 1으로 용출시키는 애질런트 스칼라 (Agilent Scalar) 칼럼 C18, 5 ㎛ (4.6×50 ㎜) 또는 워터스 엑스브릿지 (Waters XBridge) C18, 5 ㎛ (4.6×50 ㎜). 구배 정보: 0.0-0.1 min: 95% H2O-5% MeCN; 0.1-5.0 min; 95% H2O-5% MeCN으로부터 5% H2O-95% MeCN으로 램핑; 5.0-5.5 min: 5% H2O-95% MeCN에서 유지; 5.5-5.6 min: 5% H2O-95% MeCN에서 유지, 유속을 3.5 ㎖.min- 1으로 증가시킴; 5.6-6.6 min: 5% H2O-95% MeCN에서 유지, 유속 3.5 ㎖.min-1; 6.6-6.75 min: 95% H2O-5% MeCN으로 복귀, 유속 3.5 ㎖.min-1; 6.75-6.9 min: 95% H2O-5% MeCN에서 유지, 유속 3.5 ㎖.min-1; 6.9-7.0 min: 95% H2O-5% MeCN에서 유지, 유속을 2.5 ㎖.min- 1으로 감소시킴.
1H NMR 분광법:
표준으로 잔류하는 비-중수소화된 용매를 사용하는 브루커 어밴스 (Bruker Avance) III 400 MHz
반응식 1에 대한 실험 방법
4-(2- 클로로피리딘 -4- 일옥시 )나프탈렌-1-아민 (3)
Figure pct00021
-20℃에서 NMP (40 ㎖) 중의 2-클로로-4-플루오로피리딘 (1.261 g, 9.58 mmol) 및 4-아미노-1-나프톨 하이드로클로라이드(2) (750 ㎎, 3.83 mmol)의 교반 용액에 칼륨 tert-부톡사이드 (1.290 g, 11.50 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT로 가온시켰다. 2.5 시간 후에 반응 혼합물을 물 (100 ㎖)로 희석하고, EtOAc (100 ㎖, 그 후에 2×80 ㎖)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하여 염수 (150 ㎖)로 세척하고, 건조시켜, 진공 중에서 증발시켰다. 조생성물을 MeOH 용액 중의 1% NH3로 용출시키는 SCX 포획 및 방출에 적용하고, 용매를 진공 중에서 제거하여 갈색 고체로서 표제 화합물을 얻었다 (1.019 g, 92%): m/z 271 (M+H)+ (ES+).
4-(2- 클로로피리딘 -4- 일옥시 )나프탈렌-1-N,N-디- tert - 부틸카바메이트 (4)
Figure pct00022
0℃에서 THF (30 ㎖) 중의 4-(2-클로로피리딘-4-일옥시)나프탈렌-1-아민(3) (1.019 g, 3.76 mmol)의 교반 용액에 DMAP (0.034 g, 0.282 mmol) 및 이어서 디-tert-부틸 디카보네이트 (0.904 g, 4.14 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30 분 동안 교반한 후, RT로 가온시켰다. 1.5 시간 후에, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 추가의 디-tert-부틸 디카보네이트 (0.904 g, 4.14 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 O℃에서 15 분간, 이어서 RT에서 교반하였다. 16 시간 후에, 반응 혼합물을 물 (40 ㎖)로 희석하고, EtOAc (2×40 ㎖)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하여 염수 (75 ㎖)로 세척하고, 건조시켜, 진공 중에서 증발시켰다. 조물질을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (SiO2; 80 g, 이소-헥산 중의 0 내지 40% EtOAc, 구배 용출)에 의해서 정제하여 자주색 고체로서 4-(2-클로로피리딘-4-일옥시)나프탈렌-1-N,N-디-tert-부틸카바메이트 (4)을 얻었다 (0.892 g, 48%): m/z 471 (M+H)+ (ES+).
tert -부틸 4-(4-N,N-디- tert - 부틸카바밀 )나프탈렌-1- 일옥시 )피리딘-2- 일카바 메이트 (5)
Figure pct00023
4-(2-클로로피리딘-4-일옥시)나프탈렌-1-N,N-디-tert-부틸카바메이트 (4) (0.892 g, 1.894 mmol), tert-부틸 카바메이트 (0.666 g, 5.68 mmol), 탄산세슘 (0.926 g, 2.84 mmol), Pd2(dba)3 (0.043 g, 0.047 mmol) 및 XantPhos (0.055 g, 0.095 mmol)의 혼합물을 THF (10 ㎖)에 현탁시켰다. 반응 혼합물을 질소로 완전하게 퍼지한 다음에, 환류 하에서 가열하였다. 15 시간 후에, 혼합물을 RT로 냉각시키고, 물 (35 ㎖)로 희석하여, EtOAc (35 ㎖, 25 ㎖)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하여 염수 (50 ㎖)로 세척하고, 건조시키고, 진공 중에서 증발시켰다. 조물질을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (SiO2; 80 g, 이소-헥산 중의 0-30% EtOAc, 구배 용출)에 의해서 정제하여 백색 고체로서 tert-부틸 4-(4-N,N-디-tert-부틸카바밀)나프탈렌-1-일옥시)피리딘-2-일카바메이트 (5)을 얻었다 (289 ㎎, 28%): m/z 552 (M+H)+ (ES+).
4-(4-아미노나프탈렌-1- 일옥시 )피리딘-2-아민 (6)
Figure pct00024
0℃에서 DCM (8 ㎖) 중의 tert-부틸 4-(4-(N,N-디-tert-부틸카바밀)나프탈렌-1-일옥시)피리딘-2-일카바메이트(5) (289 ㎎, 0.524 mmol)의 교반 용액에 TFA (4 ㎖)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 서서히 RT로 가온하면서 교반하였다. 5시간 후에, 휘발성 물질을 진공 중에서 제거하고, 잔류물을 MeOH (5 ㎖)에 녹이고, MeOH 용액 중의 1% NH3로 용출시키는 SCX 포획 및 방출에 적용하였다. 용매를 진공 중에서 제거하여 갈색-오렌지색 오일로서 4-(4-아미노나프탈렌-1-일옥시)피리딘-2-아민 (6) (116 ㎎, 85%)을 수득하였다: m/z 252 (M+H)+ (ES+).
1-(4-(2- 아미노피리딘 -4- 일옥시 )나프탈렌-1-일)-3-(3- tert -부틸-1-p- 톨릴 -1H-피라졸-5-일) 우레아 (8)
Figure pct00025
NaHCO3의 포화 용액 (14 ㎖)을 DCM (20 ㎖) 중의 5-아미노피라졸 (7) (206 ㎎, 0.900 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 트리클로로메틸클로로포르메이트 (0.326 ml, 2.70 mmol)을 일부에 첨가하면서 격렬하게 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 추가로 80 분간 격렬하게 교반하였다. 층을 분리하여 유기층을 진공 중에서 건조, 증발시켜, 생성된 오렌지색 오일을 고진공 하에서 추가로 30분간 건조시켰다. 그 후, 분리된 이소시아네이트를 THF (6.0 ㎖)에 녹이고, 질소 하의 0℃에서 유지시켰다.
THF (3 ㎖) 중의 4-(4-아미노나프탈렌-1-일옥시)피리딘-2-아민 (116 ㎎, 0.462 mmol) 및 DIPEA (240 ㎕, 1.39 mmol)의 교반 용액에 0℃에서 상기 제조된 이소시아네이트 용액의 분취액 (2.0 ㎖, 0.300 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 서서히 RT로 가온하였다. THF 중의 이소시아네이트 용액의 추가의 분취액을 1.5 hr 후 (1 ㎖, 0.150 mmol) 및 추가로 3.5 hr 후 (0.5 ㎖, 0.075 mmol)에 반응 혼합물에 첨가하였다. 20 hr 후에, 물 (30 ㎖)을 첨가하고, 혼합물을 EtOAc (2×30 ㎖)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하여 염수 (50 ㎖)로 세척하고, 건조시킨 다음에 진공 중에서 증발시켰다. 수득된 조물질을 플래쉬 (flash) 칼럼 크로마토그래피 (SiO2; 12 g, 이소-헥산 중의 25-100% [EtOAc 중의 5% MeOH], 구배 용출)에 의해서 정제하여 갈색 오일로서 1-(4-(2-아미노피리딘-4-일옥시)나프탈렌-1-일)-3-(3-tert-부틸-1-p-톨릴-1H-피라졸-5-일)우레아 (8) (127 ㎎, 49%)를 얻었다: m/z 507 (M+H)+ (ES+).
N-(4-(4-(3-(3- tert -부틸-1-p- 톨릴 -1H- 피라졸 -5-일) 우레이도 )나프탈렌-1- 일옥시 )피리딘-2-일)-2- 메톡시아세트아미드 (1)
Figure pct00026
메톡시아세틸 클로라이드(64.2㎕, 0.703 mmol)을, THF (5 ml)중의 1-(4-(2-아미노피리딘-4-일옥시)나프탈렌-1-일)-3-(3-tert-부틸-1-p-톨릴-1H-피라졸-5-일)우레아 (8) (89 mg, 0.176 mmol) 및 DIPEA (153㎕, 0.878 mmol)의 혼합물에 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 추가로 20분간 교반한 후, RT로 가온하였다. 2.5 시간 후, MeOH (3 ㎖)중의 1% NH3 용액을 첨가하여 퀀칭하고, 반응 혼합물을 추가로 45 분간 교반하였다. 진공에서 휘발성 물질을 제거하고, 잔여물을 MeOH (5ml) 및 AcOH (2 ml)의 혼합물에 용해시키고, MeOH 용액 중의 1% NH3로 용출시키는 SCX 포획 및 방출에 적용하였다. 조물질을 플래쉬 (flash) 칼럼 크로마토그래피 (SiO2; 12 g, 이소-헥산 중의 0 내지 60% [EtOAc 중의 5% MeOH], 구배 용출)에 의해서 정제하여 흰색 고체인 N-(4-(4-(3-(3-tert-부틸-1-p-톨릴-1H-피라졸-5-일)우레이도)나프탈렌-1-일옥시)피리딘-2-일)-2-메톡시아세트아미드 (1) (62 mg, 61%)를 얻었다:
Figure pct00027

반응식 2에 대한 실험 방법
4-(4- 니트로나프탈렌 -1- 일옥시 )피리딘-2-아민 (10)
Figure pct00028
DMF (200 ml)중의 2-아미노피리딘-4-올 (23.0 g, 209 mmol)의 교반 용액에, 질소하의 0℃에서 일부에 NaH (광유 중 60% 분산물, 9.21 g, 230 mmol)를 30분에 걸쳐 첨가하였다. 혼합물을 RT로 가온하고, 1시간 후에 0℃로 냉각한 후, DMF (100 ml) 중의 1-플루오로-4-니트로나프틸렌 (9) (40.0 g, 209 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT로 가온시키고, 1.5시간 후에 물 (1 L)로 희석하여 EtOAc (3×500 ㎖)로 추출하였다. 유기 추출물을 합쳐 물(3×700 ㎖)과 염수(500 ml)로 세척하였다. 분리된 황색 침전물을 여과하여 수집하고, 물 (500 ml)로 세척하여, 진공에서 밤새 건조시켰다. 유기층을 진공에서 건조(MgSO4)하고, 여과 및 증발시켰다. 잔여물을 아세토니트릴 (20 ml) 및 에테르 (200 ml)의 혼합물로 분쇄하여 적색 고체를 수득하고, 이소헥산 (200 ml)으로 세척하였다. 분쇄물로부터의 상청액을 진공에서 증발시키고, 잔여물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (SiO2; 120 g, 이소헥산 중의 30-100% EtOAc, 구배 용출)로 정제하였다. 생성물을 앞서 분리된 두 개의 고체와 배합하고 MeOH (500 ml)에 녹여, 진공으로 증발시키고 황색 고체인 4-(4-니트로나프탈렌-1-일옥시)피리딘-2-아민 (10)을 수득하였다: m/z 282 (M+H)+ (ES+).
2- 메톡시 -N-(4-(4- 니트로나프탈렌 -1- 일옥시 )피리딘-2-일) 아세트아미드 (11)
Figure pct00029
DCM (600 ml) 중의 4-(4-니트로나프탈렌-1-일옥시)피리딘-2-아민 (10) (40.0 g, 135 mmol) 및 DIPEA (48.1 ㎖, 270 mmol)의 교반 용액에, 질소하의 0℃에서 메톡시아세틸 클로라이드 (18.53 ㎖, 203 mmol)를 적가하였다. 혼합물을 RT로 가온시키고, 1시간 후에 암모니아 (100 ml, MeOH 중의 7M) 용액을 첨가하여 30분간 교반을 계속하였고, 침전물이 형성되었다. 혼합물을 진공에서 증발시키고, 물 (1 L)을 잔여물에 첨가하여 적색 현탁물을 제공하였다. 황색이 지속될 때까지 빙초산을 적가하였다(~5 ml). 여과하여 고체를 수집하고 물 (300 ml)로 세척하여 황색 고체인 2-메톡시-N-(4-(4-니트로나프탈렌-1-일옥시)피리딘-2-일)아세트아미드 (11) (44.1 g, 90%)를 수득하였다: m/z 354 (M+H)+ (ES+).
N-(4-(4-아미노나프탈렌-1- 일옥시 )피리딘-2-일)-2- 메톡시아세트아미드 (12)
Figure pct00030
아세트산 (300 ml)중의 2-메톡시-N-(4-(4-니트로나프탈렌-1-일옥시)피리딘-2-일)아세트아미드 (11) (44.0 g, 125 mmol) 및 철 분말 (41.7 g, 747 mmol)의 교반된 현탁물을 45℃로 가열하였다. 3시간 후, 혼합물을 RT로 냉각시키고, 천천히 주의 깊게 고체 Na2CO3 (200 g) 상으로 부었다. 혼합물이 격렬하게 발포하였다. 혼합물을 물 (500 ml)과 EtOAc (500 ml)에 분배하였다. 수성층을 고체 Na2CO3로 염기화하여 pH 11로 하고, 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 수성층 및 셀라이트 패드를 EtOAc (3×500 ml)으로 추출하고, 합쳐진 추출물을 포화 수성 NaHCO3 용액 (500 ml)로 세척하고, 건조(MgSO4)하여, 진공에서 증발시키고, 자색 폼으로서 N-(4-(4-아미노나프탈렌-1-일옥시)피리딘-2-일)-2-메톡시아세트아미드 (12)를 수득하였다 (35.0 g, 78%): m/z 324 (M+H)+ (ES+).
N-(4-(4-(3-(3- tert -부틸-1-p- 톨릴 -1H- 피라졸 -5-일) 우레이도 )나프탈렌-1- 일 옥시)피리딘-2-일)-2- 메톡시아세트아미드 (1)
Figure pct00031
DCM (250 ml) 중의 CDI (28.8 g, 178 mmol)의 교반된 현탁물에, 질소하의 RT에서 3-tert-부틸-1-p-톨릴-1H-피라졸-5-아민 (7) (40.7 g, 178 mmol)을 일정 비율로(portion-wise) 1시간에 걸쳐 첨가하였다. 1시간 후에 생성된 암적색 용액을 1시간에 걸쳐 DCM (1 L) 중의 N-(4-(4-아미노나프탈렌-1-일옥시)피리딘-2-일)-2-메톡시아세트아미드 (12) (35.5 g, 99 mmol)의 교반 용액에 적가하였다. 1시간 후에 MeOH (100 ml)를 첨가하고, 혼합물을 RT에서 16시간 동안 유지시켰다. 반응 혼합물을 진공에서 증발시키고, 잔여물을 DCM (500 ml)에 녹여 물과 포화 수성 NaHCO3 용액 (500 ml)로 세척하였다. 유기층을 건조시키고(MgSO4) 진공에서 증발시킨 후, 잔여물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (SiO2, 800 g, DCM 중의 2% MeOH, 구배 용출)로 정제하였다. 상기 생성물을 에틸 아세테이트/헵탄 (5:3 v/v 혼합물 800 ml)로부터 재결정하여 백색 분말의 N-(4-(4-(3-(3-tert-부틸-1-p-톨릴-1H-피라졸-5-일)우레이도)나프탈렌-1-일옥시)피리딘-2-일)-2-메톡시아세트아미드 (1) (25.5 g, 45%)를 수득하였다. 실험치: C, 68.41; H, 5.93; N, 14.36; C33H34N6O4 이론치: C, 68.49; H, 5.92; N, 14.52%.
생물학적 시험
인비트로 어세이를 통해 확립된 화학식(1)의 화합물의 특성을 하기에 요약하여 나타내었다. 화학식(1)의 화합물은 BIRB 796에 대해 프로파일에 있어서 실질적인 차이를 나타내었다. 두 화합물 모두 THP-1 세포 및 분화된 U937 세포에서는 LPS-유도된 TNFα 방출의 유효하고 효과적인 억제제이지만 (표 1), BIRB 796는 본 발명자들이 조사한 다른 6개의 시스템, 즉: 분화된 U937 세포에서 LPS-유도된 IL-8 방출 (BIRB 796 최대억제의 31%; 화학식(1)의 화합물 IC50: 7.9 nM); 객담 매크로파지로부터 LPS-유도된 IL-8 방출 (표 2); 인간 기관지 상피 세포주, BEAS2B 세포에서 폴리 I:C 유도된 ICAM1 발현 (BIRB 796 10μg/ml에서 효과 없음; 화학식(1)의 화합물 IC50: 1.7 nM), BEAS2B 세포에서 리노바이러스-유도된 ICAM1 발현 (표 2); BEAS2B 세포에서 리노바이러스-유도된 IL-8 방출 (표 2) 및 MRC5 세포에서 리노바이러스 복제에서는 유의적인 효과를 나타내지 않았다 (NSE). 명백히 반대로, 화학식(1)의 화합물은 모든 6개의 시스템에서 활성을 나타내었고, U937 세포에서 LPS-유도된 TNFα 방출에서 나타낸 것들과 동등하거나 이를 능가하는 효능의 수준을 나타내었다.
Figure pct00032
Figure pct00033
인간의 치명적인 폐 섬유아세포, MRC 세포에서 리노바이러스 복제를 억제시키고자 하는 이들 두 화합물의 잠재성을 더욱 조사하였다. BIRB 796은 1.9μM 이하의 농도 범위에서 바이러스 복제에 영향을 미치지 않는다는 것이 증명되었다. 그러나, 본 발명자들은 화학식(1)의 화합물의 농도 효과 곡선을 조사하고, 1 log 차수에 의해 5.2 nM의 농도가 바이러스 역가를 감소시킨다는 것을 알게 되었다. 이러한 분석에 대한 설명은 다음과 같다:
효소 억제 분석
화합물의 효소 억제활성은 공여체와 수용체 형광단 (Z-LYTE, Invitrogen Ltd., Paisley, UK)로 표지된 합성 펩타이드를 사용하여 FRET로 측정하였다. 재조합 포스포릴화 p38 MAPK γ (MAPK12: Millipore)를 HEPES 완충액 중에서 희석하고, 화합물을 원하는 최종 농도로 혼합시키고, 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 다음으로 FRET 펩타이드 (2μM) 및 ATP (100μM)를 효소/화합물 혼합물에 첨가하고, 1시간 동안 배양하였다. 형광 마이크로플레이트 판독기 (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific)에서 검출하기 전에, 발색 시약(프로테아제)을 1 시간 동안 첨가하였다. 부위-특이적 프로테아제만이 비-포스포릴화된 펩타이드를 분해하고, FRET 시그날을 제거하였다. 각 반응의 포스포릴화 레벨은, 높은 비는 높은 포스포릴화를 나타내고, 낮은 비는 낮은 포스포릴화 레벨을 나타내는 플루오레세인 방출 (수용체)에 대한 쿠마린 방출 (공여체)의 비를 사용하여 계산하였다. 비-억제된 대조군에 대하여 각 반응의 억제 백분율을 계산한 후, 50% 억제농도 (IC50 값)은 농도-반응곡선으로부터 계산하였다.
p38 MAPK 알파 (MAPK14: Invitrogen)의 경우에, 효소 활성은 하류 분자인 MAPKAP-K2의 활성화/포스포릴화를 결정함으로써 간접적으로 평가하였다. p38 MAPKα 단백질을 RT에서 2시간 동안 혼합하였다. 그 후, p38α 불활성 표적 MAPKAP-K2 (Invitrogen) 및 MAPKAP-K2에 대한 포스포릴화 표적인 FRET 펩타이드 (2μM), 및 ATP (10μM)를 효소/화합물 혼합물에 첨가하고, 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 발색 시약을 첨가하고, 혼합물을 1 시간 동안 배양한 후에 형광에 의한 검출은 시험 프로토콜을 완료하였다.
U937 세포 및 THP -1 세포에서 LPS -유도된 TNF α 방출: 효능
인간 단핵구 세포주인 U937 세포를 포볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA; 100 ng/㎖)와 함께 48 내지 72 시간 동안 배양하여 매크로파지-타입 세포로 분화시켰다. 세포를 최종 농도의 화합물과 함께 2시간 동안 전-배양하였다. 그 후, 세포를 0.1 ㎍/㎖의 LPS (E. coli로부터: O111:B4, Sigma)로 4시간 동안 자극하고, 샌드위치 ELISA (Duo-set, R&D systems)에 의한 TNFα 농도 측정을 위해서 상층액을 수집하였다. TNFα 생성 억제는 비히클 대조군과 비교하여 시험 화합물의 각각의 농도에서 10 ㎍/㎖의 BIRB 796에 의해서 달성된 것의 백분율로 계산하였다. 상대적 50% 유효농도 (R-EC50)는 생성된 농도-반응곡선으로부터 측정하였다. 인간 단핵구 세포주인 THP-1도 역시 본 분석에 사용되었다. THP-1 세포를 3 ㎍/㎖의 LPS (E. coli로부터: O111:B4, Sigma)로 4시간 동안 자극하고, TNFα 농도 측정을 위해서 상층액을 수집하였다. 50% 억제 농도 (IC50)를 생성된 농도-반응곡선으로부터 측정하였다.
U937 세포에서 LPS -유도된 IL -8 방출: 효능
인간 단핵구 세포주인 U937 세포를 포볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA; 100 ng/㎖)와 함께 48 내지 72 시간 동안 배양하여 매크로파지-타입 세포로 분화시켰다. 세포를 최종 농도의 화합물과 함께 2시간 동안 전-배양하였다. 그 후, 세포를 0.1 ㎍/㎖의 LPS (E. coli로부터: O111:B4, Sigma)로 4시간 동안 자극하고, 샌드위치 ELISA (Duo-set, R&D systems)에 의한 IL-8 농도 측정을 위해서 상층액을 수집하였다. IL-8 생성 억제는 비히클 대조군과 비교하여 시험 화합물의 각각의 농도에서 10 ㎍/㎖의 BIRB 796에 의해서 달성된 것의 백분율로 계산하였다. 50% 억제 농도 (IC50)를 생성된 농도-반응곡선으로부터 측정하였다.
BEAS2B 세포에서 폴리 I:C-유도된 ICAM -1 유도: 효력
폴리 I:C (1 ㎍/㎖) (Invivogen Ltd., San Diego, CA)를 올리고펙타민 (Oligofectamine; Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 BEAS2B 세포 (인간 기관지 상피세포, ATCC)에 형질감염시켰다. 세포를 최종 농도의 화합물과 함께 2시간 동안 전-배양하였다. 세포 표면상에서 ICAM1 발현 레벨을 세포-기반 ELISA에 의해서 측정하였다. 간략히, 폴리 I:C 형질감염 후 18시간째에 세포를 PBS 중의 4% 포름알데히드로 고정시켰다. 0.1% 나트륨 아지드 및 1% 과산화수소를 첨가하여 내인성 퍼옥시다제를 퀀칭한 후에, 세포를 세척-완충액 (PBS 중의 0.1% 트윈: PBS-트윈)으로 세척하였다. 웰을 PBS-트윈 중의 5% 밀크로 1시간 동안 차단한 후에, 세포를 1% BSA PBS 중에서 항-인간 ICAM-1 항체 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 세포를 PBS-트윈으로 세척하고, 2차 항체 (HRP-컨주게이트된 항-토끼 IgG, Dako Ltd., Glostrup, Denmark)와 함께 배양하였다. ICAM-1 시그날은, 기질을 첨가하고, 분광광도계를 사용하여 655 ㎚의 기준 파장으로 450 ㎚에서 판독함으로써 검출하였다. 그 후, 세포를 PBS-트윈으로 세척하고, 각각의 웰 내의 총 세포수는 크리스탈 바이올렛 (Crystal Violet) 염색 및 1% SDS 용액에 의한 용출 후에 595 ㎚에서 흡광도를 판독함으로서 측정하였다. 측정된 OD 450-655 판독치를 각각의 웰에서의 OD595 판독치로 나누어줌으로써 세포수에 대해서 보정하였다. ICAM-1 발현 억제를 비히클 대조군과 비교하여 시험 화합물의 각각의 농도에서 계산하였다. 50% 억제 농도 (IC50)를 생성된 농도-반응곡선으로부터 측정하였다.
객담 매크로파지 분석
건강한 지원자에 3%(w/v) 고장 식염수의 분무 용액을 흡입시켜 객담을 유발시켰다. 그 후, 디티오트레이톨(최종 0.02%)을 첨가하고, 객담의 점도가 낮아질 때까지 볼텍스 믹서(vortex mixer)를 사용하여 격렬하게 혼합하였다. 원심분리(1500 rpm으로 10분간)로 생성된 셀 펠렛을 10% FCS RPMI-1640에서 재현탁시키고, 고 바인딩 플레이트(CellBIND®, Corning Limited. UK)에서 2시간 동안 판 부착(plate adhesion)으로 객담 매크로파지를 분리하였다. 부착된 셀을 RPMI-1640으로 세척하고, LPS(1μg/ml)로 자극하였다. 4시간 배양 후, 듀오셋 ELISA 전개 키트(R&D 시스템, Minneapolis, MN)을 사용하여 IL-8 생성을 측정하기 위해, 상층액을 수집하였다. LPS 자극 전에 2시간 화합물을 첨가하였다.
리노바이러스 -유도된 IL -8 및 ICAM -1
인간 리노바이러스 RV16 (HRV)을 미국 ATCC (American Type Culture Collection; Manassas, VA)로부터 얻었다. 헬라 세포를 세포의 80%가 세포변성이 일어날 때까지 HRV로 감염시켜 바이러스 스톡을 생성하였다.
BEAS2B 세포를 5 MOI(감염 다중도 5)의 HRV로 감염시키고, 33℃에서 2시간 동안 부드럽게 흔들면서 배양하여 흡수시켰다. 그 후, 세포를 PBS로 세척하고, 새 배지를 첨가하여, 추가로 72시간 동안 세포를 배양하였다. 듀오셋 ELISA 전개 키트(R&D 시스템, Minneapolis, MN)을 사용하여 IL-8 농도를 측정하기 위해, 상층액을 수집하였다.
ICAM-1 발현 세포 표면의 레벨을 세포-기반 ELISA로 측정하였다. 적당히 배양한 후, 세포를 PBS 중의 4% 포름알데히드로 고정시켰다. 0.1% 나트륨 아지드 및 1% 과산화수소를 첨가하여 내인성 퍼옥시다제를 퀀칭한 후에, 웰을 세척-완충액 (PBS 중의 0.05% 트윈: PBS-트윈)으로 세척하였다. 웰을 PBS-트윈 중의 5% 밀크로 1시간 동안 차단한 후에, 세포를 5% BSA PBS-트윈(1:500) 중에서 안티-인간 ICAM-1 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 웰을 PBS-트윈으로 세척하고, 2차 항체 (HRP-컨주게이트된 안티-토끼 IgG, Dako Ltd.)와 함께 배양하였다. ICAM-1 시그날은 기질을 첨가하고, 분광광도계를 사용하여 655 ㎚의 기준 파장으로 450 ㎚에서 판독함으로써 검출하였다. 그 후, 세포를 PBS-트윈으로 세척하고, 각각의 웰 내의 총 세포수를 크리스탈 바이올렛 (Crystal Violet) 염색 및 1% SDS 용액에 의한 용출 후에 595 ㎚에서 흡광도를 판독하여 측정하였다. 측정된 OD 450-655 판독치를 각각의 웰에서의 OD595 판독치로 나누어줌으로써 세포수에 대해서 보정하였다. 비감염된 HRV가 씻겨 나간 경우, HRV 감염 2시간 전 및 감염 2시간 후에 화합물을 첨가하였다.
리노바이러스 -적정 분석
MRC5 세포(인간 기관지 상피세포, ATCC)를 1 MOI(감염 다중도 1.0)의 HRV로 감염시키고, 33℃에서 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 배양하여 흡수시켰다. 그 후, 세포를 PBS로 세척하고, 새 배지를 첨가하여, 추가로 96시간 동안 세포를 배양하였다. 상층액을 수집하고, 바이러스 함유 상층액의 10-배 단계 희석을 제조하였다. 융합성 헬라 세포 단층을 단계적으로 희석된 상층액(10-1 내지 10-5)으로 감염시키고, 감염 4일 후 MTT 분석으로 세포변성 효과를 분석하여 모든 적정을 실시하였다. 각각의 처리에 있어서 헬라 세포의 50%를 감염시키는데 필요로 하는 바이러스의 양을 TCID50 U/mL로서 계산하였다. 비감염된 HRV가 씻겨 나간 경우, HRV 감염 2시간 전 및 감염 1시간 후에 화합물을 첨가하였다.
마우스에서 LPS -유도된 호중구 축적
비-단식 마우스에게 LPS 처리를 시작하기 전의 지정된 시기에 (2-12 시간 범위 내에) 비히클 또는 시험물질을 기관내 경로로 투여하였다. T=0에서, 마우스를 노출 챔버 내에 배치하고, LPS에 노출시켰다. LPS 공격 8시간 후에, 동물을 마취시키고, 기관에 캐눌라를 삽입하고, 1 ㎖의 PBS를 기관 카테터를 통해서 폐 내로 주입 및 배출시킴으로써 BALF를 추출하였다. BALF 샘플 내의 총 백혈구 수 및 차등 백혈구 수는 뉴바우어 혈구계 (Neubaur haemocytometer)를 사용하여 측정하였다. BALF 샘플의 사이토스핀 (Cytospin) 도말표본을 실온에서 5분간 200 rpm으로 원심분리하여 제조하고, 디프퀵 염색 시스템 (DiffQuik stain system; Dade Behring)을 사용하여 염색하였다. 세포는 오일 액침 현미경검사를 사용하여 계수하였다. 화합물(1)로 마우스를 처리하면, LPS 공격 전 2, 8 또는 12시간에 처리된 경우 BALF 내로 호중구 축적을 억제한다는 것을 알 수 있었다 (표 3 및 4).
Figure pct00034
Figure pct00035

기니아피그에서 알레르겐-유도된 호산구 축적
던킨 하틀레이 (Dunkin Hartley) 기니아피그를 오브알부민으로 면역시켰다. 6 용량의 비히클 또는 실시예 8 (1.5 ㎎/㎖)을 매 12 시간마다 에어로졸로 투여하였으며, 최종 용량은 알레르겐 공격 (등급 V, OVA; 30 분의 기간에 걸쳐 데비블리스 (De Vibliss) 초음파 네불라이저 2000을 사용하여 에어로졸화된 10 ㎍/㎖ 용액)을 개시하기 2 시간 전에 투여하였다. 2 그룹의 동물에게는 실시예 8의 6 용량을 제공한 반면에, 추가의 2 그룹에게는 비히클의 6 용량을 제공하였다. OVA 공격 8 또는 24 시간 후 (그룹에 대한 상세한 것은 상기 참조), 기관에 캐눌라를 삽입하고, BALF를 추출하였다. 이것을 위한 절차는 기관 카테터를 통해서 5 ㎖의 PBS를 폐 내로 흡인시키는 것을 수반한다. BALF 유체 샘플 내의 총 및 차등 백혈구 수는 뉴바우어 혈구계를 사용하여 측정하였다. BALF 유체 샘플의 사이토스핀 도말표본을 실온에서 5 분 동안 200 rpm으로 원심분리함으로써 제조하고, 디프퀵 염색 시스템 (Dade Behring)을 사용하여 염색하였다. 세포는 오일 액침 현미경검사를 사용하여 맹검 계수하였다.
화합물(1)에 의한 기니아피그의 처리는 오브아부민 공격 후 8 및 24 시간째에 조사한 경우에 BALF 내로의 호산구 축적을 억제하는 것을 알 수 있었다 (표 5).
Figure pct00036

담배 연기 모델
A/J 마우스 (수컷, 5-주령)를 소형 동물을 위한 담배 연기 흡입실험 시스템 (모델 SIS-CS; Sibata Scientific Technology, Tokyo, Japan)을 사용하여 11일 동안 30 분/일로 담배 연기 (4% 담배 연기, 압축 공기로 희석됨)에 노출시켰다. 시험물질은 마지막 담배 연기 노출 후에 3일 동안 매일 2 회씩 치료학적으로 비내로 제공하였다 (50% DMSO/PBS 중의 용액 35 ㎕). 최종 투약한 지 12 시간 후에, 동물을 마취시키고, 기관에 캐눌라를 삽입하고, 기관지폐포 세정액 (BALF)을 수집하였다. 폐포 매크로파지 및 호중구의 수는 안티-마우스 MOMA2 항체 (매크로파지) 또는 안티-마우스 7/4 항체 (호중구)를 사용하여 FACS 분석 (EPICS® ALTRA II, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA)에 의해서 결정하였다.
화합물(1)에 의한 처리의 결과는 도 1 (호중구) 및 도 2 (활성화된 폐포 매크로파지)에 나타내었다. 세포수에 대한 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다. 본 시험을 위해서 사용된 담배 연기 모델은 코르티코스테로이드 무반응성 시스템으로 보고되며 [Medicherta S. et al ., (2008); J. Pharmacol . Exp . Ther . 324(3):921-9], 이것은 플루티카손 프로피오네이트가 LPS-유도된 호중구 축적의 >80% 억제를 제공하는 동일한 용량인 50 ㎍/㎖ (35㎕, bid, in)에서 기도 내의 호중구 또는 매크로파지 축적을 억제하지 않았음을 뒷받침하였다. 그러나, 화합물(1)에 의한 처리는 호중구 및 활성화된 매크로파지에 있어서, 뚜렷하게 용량-의존 감소를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
오브알부민 공격/ 파라인플루엔자 감염 모델
수컷 던킨-하틀레이 기니아-피그 (300-350 g, n=6/그룹)를 1 ㎖ 생리식염수 (i.p.) 중의 100 ㎍ 오브알부민 (OVA) + 100 ㎎ Al2(OH)3로 제2일 및 7일에 감작시켰다. 파라인플루엔자 바이러스 (PIV-3; 106 감염 유니트) 또는 바이러스가 없는 배지를 제11일 및 12일에 비내로 주입하였다. 동물을 네불라이징된 (i) 1.5 ㎎/일의 용량의 플루티카손 프로피오네이트 (초기 시험은 플루티카손 프로피오네이트의 이 용량이 PIV3 배지로 처리된 감작된 동물에서 오브알부민-매개된 폐기능 변화를 억제하였음을 확립하였다) 또는 (ii) 화합물(1) (0.15 ㎎/일) 또는 (iii) 상기 나타낸 용량의 플루티카손 프로피오네이트와 화합물(1)의 조합, 또는 (iv) 비히클 (DMSO:에탄올:식염수, 30:30:40%)로 제10-15일에 처리하였다. 모든 동물은 제15일에 네불라이징된 OVA (10 ㎍/㎖)로 1 시간 동안 공격하고, 특이적 기도 컨덕턴스 (specific airways conductance) (sGaw)의 반복 측정은 전신 혈량측정법을 사용하여 24 시간의 기간에 걸쳐서 이루어졌다. OVA 공격 후의 sGaw의 측정은 기준선으로부터의 변화율 %로서 도시된다. 도 3은 단일요법으로서의 화합물(1)의 효과를 나타낸 반면, 도 4는 플루티카손 프로피오네이트와 조합하여 투여된 경우의 효과를 나타낸다. 화합물(1)에 의한 단독 처리는, 오브알부민 공격에 대한 초기(처음 1시간) 기관지수축 반응에 영향이 없었으나, 이후의 반응(처리후 2-12시간)을 뚜렷하게 억제한다는 것을 알 수 있었다. 플루티카손 프로피오네이트와 함께 투여된 경우, 오브알비민 공격으로 유발된 기관지수축 반응이 초기 및 그 이후 모두에서 억제되었다.
요약
생체외 생물학적 시험은 화학식(1)의 화합물이 소염 활성(분화된 U937 세포 및 THP-1 세포로부터의 LPS-유도된 TNFα 방출을 포함)의 생체외 모델에서 우수한 효능을 나타내는 p38 MAP 키나제 서브타입 알파 및 감마의 강력한 억제제임을 보여준다. 또한, 화학식(1)의 화합물은 리노바이러스-유도된 염증과 리노바이러스 복제를 모두 억제시킬 수 있는 놀라운 특성을 나타낸다.
명세서 및 이하의 특허청구범위 전체에 걸쳐서, 문맥에서 달리 언급하지 않는 한, 단어 '포함한다' 및 '포함하는'과 같은 변형어는 언급된 정수, 단계, 정수의 그룹 또는 단계의 그룹을 포함하며, 임의의 다른 정수, 단계, 정수의 그룹 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 것을 나타내는 것으로 이해될 수 있다.
본 발명에 인용된 모든 특허 및 특허출원은 그 전체를 참조로 인용한다.
본 명세서 및 특허청구범위가 일부분을 형성하는 출원은 어떤 후속 추원에 대해서도 선행기술을 위한 기초로서 사용될 수 있다. 이러한 후속 출원의 특허청구범위는 본 발명에 기술된 어떤 특징 또는 특징의 조합에 관한 것일 수 있다. 이들은 생성물, 조성물, 방법 또는 용도 특허청구범위의 형태를 취할 수 있으며, 예로서 및 제한이 없이, 특허청구범위를 포함할 수 있다.
도 1은 화합물(1) 처리에 의한 BALF 내의 호중구 축적을 나타낸 것이다.
도 2는 화합물(1) 처리에 의한 BALF 내의 MOMA2+ 매크로파지 축적을 나타낸 것이다.
도 3은 화합물(1) 및 플루티카손 프로피오네이트의 단독 처리에 의한, OVA 감작된 PIV3 감염 기니아피그에서 OVA 노출 후의 sGaw 값의 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 화합물(1) 및 플루티카손 프로피오네이트의 조합 처리에 의한, OVA 감작된 PIV3 감염 기니아피그에서 OVA 노출 후의 sGaw 값의 변화를 나타낸 것이다.

Claims (9)

  1. 모든 입체이성체 및 호변이성체를 포함한 하기 화학식(1)의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00037
    .
  2. 것으로서, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 제1항의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물.
  3. 약제로서 사용하기 위한 제1항의 화학식(1)의 화합물.
  4. COPD(만성 기관지염 및 폐기종 포함), 천식, 소아 천식, 낭포성 섬유증, 유육종증, 특발성 폐섬유증과 같은 만성 호흡기 질환 환자에서 질병의 악화를 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 제1항의 화학식(1)의 화합물 또는 제2항의 조성물.
  5. COPD(만성 기관지염 및 폐기종 포함), 천식, 소아 천식, 낭포성 섬유증, 유육종증, 특발성 폐섬유증, 알레르기성 비염, 비염, 부비동염, 알레르기성 결막염, 결막염, 알레르기성 피부염, 접촉 피부염, 건선, 궤양성 대장염, 류마티스성 관절염 또는 골관절염에 대해 2차적인 염증성 관절, 류마티스성 관절염, 췌장염, 악액질로부터 선택되는 상태를 치료 또는 예방하고, 비-소세포 폐암종, 유방암종, 위암종, 결장직장암종 및 악성 흑색종을 포함하는 종양의 증식 및 전이를 억제하는데 사용하기 위한 제1항의 화학식(1)의 화합물 또는 제2항의 조성물.
  6. COPD(만성 기관지염 및 폐기종 포함), 천식, 소아 천식, 낭포성 섬유증, 유육종증, 특발성 폐섬유증, 알레르기성 비염, 비염, 부비동염, 알레르기성 결막염, 결막염, 알레르기성 피부염, 접촉 피부염, 건선, 궤양성 대장염, 류마티스성 관절염 또는 골관절염에 대해 2차적인 염증성 관절, 류마티스성 관절염, 췌장염, 악액질로부터 선택되는 상태를 치료 또는 예방하고, 비-소세포 폐암종, 유방암종, 위암종, 결장직장암종 및 악성 흑색종을 포함하는 종양의 증식 및 전이를 억제하는 약제를 제조하기 위한 제1항의 화학식(1)의 화합물 또는 제2항의 조성물의 용도.
  7. 유효량의 제1항의 화학식(1)의 화합물 또는 제2항의 약제학적 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하여, COPD(만성 기관지염 및 폐기종 포함), 천식, 소아 천식, 낭포성 섬유증, 유육종증, 특발성 폐섬유증, 알레르기성 비염, 비염, 부비동염, 알레르기성 결막염, 결막염, 알레르기성 피부염, 접촉 피부염, 건선, 궤양성 대장염, 류마티스성 관절염 또는 골관절염에 대해 2차적인 염증성 관절, 류마티스성 관절염, 췌장염, 악액질로부터 선택되는 상태를 치료하고, 비-소세포 폐암종, 유방암종, 위암종, 결장직장암종 및 악성 흑색종을 포함하는 종양의 증식 및 전이를 억제하는 방법.
  8. 울혈 심부전, 당뇨, 암과 같은 질병의 만성 상태에 있는 환자들 또는 장기 이식 후 면역억제와 같은 질병의 환자들에서, 호흡기 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 제1항의 화학식(1)의 화합물 또는 제2항의 조성물.
  9. 울혈 심부전, 당뇨, 암과 같은 질병의 만성 상태에 있는 환자들 또는 장기 이식 후 면역억제와 같은 질병의 환자들에서, 호흡기 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 자나마비르 또는 오셀타미비르(오셀타미비르 포스페이트 등)와 같은 항바이러스 요법과 병용되는 제1항의 화학식(1)의 화합물 또는 제2항의 조성물.
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