KR20100067683A - (-)-닐바디핀 거울상이성질체를 사용하여 아밀로이드 침착, 아밀로이드 신경독성 및 소교세포증을 감소시키는 방법 - Google Patents

(-)-닐바디핀 거울상이성질체를 사용하여 아밀로이드 침착, 아밀로이드 신경독성 및 소교세포증을 감소시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 디히드로피리딘 화합물 닐바디핀의 (R)-거울상이성질체 (또한 (-)-닐바디핀이라고 공지됨)의 치료상 유효량을 알츠하이머병 (AD)과 같은 뇌 아밀로이드형성 질병으로 고통받고 있는 동물 또는 인간에게 투여함으로써, 상기 동물 또는 인간에서 Aβ 침착, Aβ 신경독성 및 소교세포증을 감소시키는 방법을 제공한다. 외상성 뇌 손상 후 (-)-닐바디핀을 투여하고, 그 후 소정의 기간 동안 치료를 계속함으로써, 외상성 뇌 손상을 앓고 있는 동물 또는 인간에서 Aβ 침착, Aβ 신경독성 및 소교세포증의 위험을 감소시키는 방법이 추가로 제공된다.

Description

(-)-닐바디핀 거울상이성질체를 사용하여 아밀로이드 침착, 아밀로이드 신경독성 및 소교세포증을 감소시키는 방법 {METHOD FOR REDUCING AMYLOID DEPOSITION, AMYLOID NEUROTOXICITY, AND MICROGLIOSIS WITH (-)-NILVADIPINE ENANTIOMER}
본원은 2007년 10월 5일에 출원된 미국 특허 가출원 제60/977,953호 및 2008년 4월 18일에 출원된 미국 특허 가출원 제61/046,109호를 우선권 주장하며, 상기 출원 각각은 그 전문이 참고로 도입된다.
<기술분야>
본 발명은 알츠하이머병과 같은 뇌 아밀로이드형성 질병의 병리생리학적 효과의 치료 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 방법은 닐바디핀의 라세미 혼합물과 비교하여 감소된 항고혈압 부작용으로, 알츠하이머병과 같은 뇌 아밀로이드증과 관련된 질병으로 고통받고 있는 동물 또는 인간의 뇌에서 병리생리학적 효과를 방해하기 위해 닐바디핀의 (-) 거울상이성질체를 투여하는 것을 포함한다.
<관련 분야의 설명>
알츠하이머병 (AD)은 65세 이상 인구의 대략 1％를 괴롭히는 노화의 가장 흔한 신경변성 질환이다. 질병의 특징적인 특성에는 세포내 신경섬유 매듭의 진행성 축적, 세포외 실질 노인성 플라크 및 뇌에서 뇌혈관 침착물이 포함된다. 노인성 플라크 및 뇌혈관 침착물의 주요 성분은 39 내지 43개 아미노산 β-아밀로이드 펩티드 (Aβ)이고, 이는 막횡단 당단백질인 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)로부터 단백질분해로 유도된다.
APP는 590 내지 680개 아미노산 세포외 아미노 말단 도메인 및 대략 55개 아미노산 세포질 꼬리를 갖는 단일-막횡단 단백질이다. 염색체 21 상의 APP 유전자로부터의 전령 RNA는 선택적 스플라이싱을 거쳐 8개의 가능한 이소형을 만들며, 뇌에서는 이 중 3개 (695, 751 및 770개 아미노산 이소형)가 주종이다. APP는 α-, β- 및 γ-세크레타제라고 명명된 3종의 효소 활성을 통한 단백질분해 프로세싱을 거친다. 알파-세크레타제는 Aβ 도메인의 아미노산 17에서 APP를 절단하여, 분비를 위한 큰 가용성 아미노-말단 단편 α-APP를 방출한다. α-세크레타제는 Aβ 도메인 내부를 절단하기 때문에, 이 절단은 Aβ 형성을 방해한다. 별법으로, APP는 β-세크레타아제에 의해 절단되어 Aβ의 아미노 말단을 한정하고 가용성 아미노-말단 단편 β-APP를 생성할 수 있다. γ-세크레타제에 의한 APP의 세포내 카르복시-말단 도메인의 후속 절단은 다중 펩티드를 생성시키며, 이중 가장 흔한 2종은 40-아미노산 Aβ (Aβ40) 및 42-아미노산 Aβ (Aβ42)이다. Aβ40은 분비된 Aβ의 90 내지 95％를 차지하고, 뇌척수액으로부터 회수되는 주요 종이다 (문헌 [Seubert et al., Nature, 359:325-7, 1992]). 대조적으로, 분비된 Aβ의 10％ 미만은 Aβ42이다. Aβ42 생성이 상대적으로 부족함에도 불구하고, Aβ42는 플라크에서 발견되는 주요 종이며, 아마도 Aβ40보다 더 빠르게 불용성 아밀로이드 응집체를 형성하는 그의 능력으로 인해 초기에 침착된다 (문헌 [Jarrett et al., Biochemistry, 32:4693-7, 1993]). 뇌에서의 Aβ의 비정상적인 축적은 APP의 과다발현 또는 변형된 프로세싱으로 인한 것으로 여겨진다.
그러므로, Aβ 펩티드는 AD의 병리생물학에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지고 있으며, 이는 AD의 가족형과 관련된 모든 돌연변이가 APP로부터의 이 펩티드의 변형된 프로세싱을 초래하기 때문이다. 실제로, 뇌에서 불용성 또는 응집된 Aβ의 원섬유의 침착물은 대상체의 유전적 소인에 관계없이 모든 형태의 AD의 두드러진 신경병리학적 특성이다.
Aβ 침착에 수반하여, Aβ 침착물내 및 주위에서의 염증전 사이토카인 및 급성기 반응물의 생성을 포함하는, AD 뇌 내의 염증 경로의 강한 활성화가 존재한다 (문헌 [McGeer et al., J. Leukocyte Biol., 65:409-15, 1999]). 뇌 고유의 선천성 면역 세포인 소교세포(microglia)의 활성화가 이러한 염증 캐스케이드와 긴밀하게 관련되어 있는 것으로 생각되고 있다. 반응성 소교세포가 염증성 단백질과 같은 염증전 사이토카인, 및 알파-1-항키모트립신, 변형 성장 인자 β, 아포지방단백질 E 및 보체 인자와 같은 급성기 반응물을 생성한다는 것이 증명된 바 있으며, 이들 모두가 Aβ 플라크에 국소화되고 Aβ 플라크 "응축" 또는 성숙을 촉진하고 (문헌 [Nilsson et al., J. Neurosci. 21:1444-5, 2001]), 높은 수준에서는 신경변성을 촉진하는 것으로 나타났다. 역학 연구에 따르면 비스테로이드성 항염증성 약물 (NSAID)을 사용하는 환자는 50％ 만큼 많이 감소된 AD 위험을 갖는 것으로 나타났으며 (문헌 [Rogers et al., Neurobiol. Aging 17:681-6, 1996]), NSAID 치료를 받은 AD 환자의 사후 평가에 따르면 위험 감소는 활성화된 소교세포 수의 감소와 관련된 것으로 증명되었다 (문헌 [Mackenzie et al., Neurology 50:986-90, 1998]. 또한, 알츠하이머병에 대한 마우스 모델인 TgAPPsw 마우스에 NSAID (이부프로펜)를 제공한 경우, 이 동물은 소교세포 활성화의 감소와 상관관계가 있는 Aβ 침착, 성상세포증(astrocytosis) 및 이영양성 신경염의 감소를 나타내었다 (문헌 [Lim et al., J. Neurosci. 20:5709-14, 2000]).
따라서, AD 뇌 내의 염증 프로세스의 생성물은 AD 병리학을 악화시킬 수 있다. 또한, 명확한 Aβ 대신에 AD 뇌 내의 활성화된 소교세포가 Aβ 원섬유형성 및 노인성 플라크로서 결과적 침착을 촉진함으로써 병원성이라는 증거가 존재한다 (문헌 [Wegiel et al., Acta Neuropathol. (Berl.) 100:356-64, 2000]).
AD 발병기전이 Aβ의 신경독성 특성으로 인한 것이라는 제안도 있다. Aβ의 세포독성은 먼저 설치류 뇌의 1차 세포 배양물에서 확립되었고, 또한 인간 세포 배양물에서 확립되었다. 매트슨(Mattson) 등의 연구 (문헌 [J. Neurosci., 12:376-389, 1992])는 자극성 신경전달물질 글루타메이트의 존재하에 Aβ가 세포내 칼슘의 즉각적인 병적인 증가를 초래하며, 이는 그의 크게 증가된 2차 전령 활성을 통해 세포에 매우 독성인 것으로 여겨진다는 것을 나타낸다.
미국 특허 출원 제2005/0009885호 (2005년 1월 13일) (뮬란(Mullan) 등)에는 닐바디핀을 사용하여 Aβ 침착을 감소시키는 방법 뿐만 아니라 닐바디핀을 사용하여 뇌 아밀로이드형성 질병을 진단하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 미국 특허 제4,338,322호에는 닐바디핀이 항고혈압 효과에 대해 기재되어 있다. 닐바디핀 (닐바딜™)은 1일당 8 mg, 또는 적절한 항고혈압 효과가 1일당 8 mg에 의해 달성되지 않은 경우 1일당 16 mg의 용량으로 고혈압의 치료에 대해 아일랜드에서 규제 승인되었다. 또한, 닐바디핀의 (+)-거울상이성질체의 항고혈압 효과를 개시하고 있는 미국 특허 제5,508,413호를 참조한다. 라세미 닐바디핀, 및 인간 대상체에서 국소 뇌 혈류에 대한 그의 효과가 하뉴(Hanyu) 등 (문헌 [Nuclear Medicine Communications, vol. 28, no. 4, pages 281-287, April 2007])에 보고되었다.
상기 언급된 보고에도 불구하고, AD의 홀마크인 뇌 변성의 멈추지 않는 진행에 대한 예방에 대한 필요성이 존재하며, 여기서 예방은 원치않는 또는 과도한 혈압 저하와 같은 부작용을 최소로 하는 치료학상 효과적인 치료로 AD 환자에서 발견되는 APP의 변형된 또는 과다발현, Aβ 침착, Aβ 신경독성 및 소교세포-활성화된 염증을 다룬다.
<발명의 요약>
이러한 필요성을 충족시키기 위해, 본 발명은 알츠하이머병 (AD)과 같은 뇌 아밀로이드형성 질병으로 고통받고 있는 동물 또는 인간에게 치료상 유효량의 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀을 투여함으로써, 알츠하이머병 (AD)과 같은 뇌 아밀로이드형성 질병으로 고통받고 있는 동물 또는 인간에서 Aβ 침착, Aβ 신경독성 및 소교세포증(microgliosis)을 감소시키는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 동일한 양의 라세미 닐바디핀과 비교하여 감소된 저혈압 효과를 갖는 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 투여를 제공한다. 또한, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 투여는 저혈압 효과의 감소로 인해 라세미 닐바디핀 또는 (+)-닐바디핀의 투여와 비교하여 투여량 증가를 허용한다. 예를 들어, 본원에 제공된 데이터는 (-)-거울상이성질체에 대한 FPL64176으로 시도된 기준선 대동맥 수축을 나타내었으며, 이는 혈관작용성 (즉, 유도된 혈관수축의 길항작용)을 나타내는 라세미 혼합물 또는 (+)-거울상이성질체와 비교하여 (-)-거울상이성질체에 대한 감소된 혈관작용성과 상관관계가 있다. 바람직한 실시양태에서, (-)-거울상이성질체는 투여되는 조성물에 과량으로 존재하고, 거울상이성질체 과량은 바람직하게는 90％ 이상, 95％ 이상, 및 보다 바람직하게는 98％ 이상 (100％ 포함), 검출가능한 순도 한계 이하이다.
본 발명은 외상성 뇌 손상을 앓고 있는 동물 또는 인간에게 두부 손상 후 치료상 유효량의 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀을 투여하고, 그 후 소정의 기간 동안 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀 치료를 계속함으로써, 외상성 뇌 손상을 앓고 있는 동물 또는 인간에서 Aβ 침착, Aβ 신경독성 및 소교세포증의 위험을 감소시키는 방법을 추가로 제공한다. 특히, 본 발명은 동일한 양의 라세미 닐바디핀과 비교하여 감소된 저혈압 효과를 갖는 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 투여를 제공한다. 또한, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 투여는 저혈압 효과의 감소로 인해 라세미 닐바디핀의 투여와 비교하여 투여량 증가를 허용한다. 바람직한 실시양태에서, (-)-거울상이성질체는 투여되는 조성물에 과량으로 존재하고, 거울상이성질체 과량은 바람직하게는 90％ 이상, 95％ 이상, 및 보다 바람직하게는 98％ 이상 (100％ 포함), 검출가능한 순도 한계 이하이다.
본 발명은 또한 뇌 아밀로이드형성 질병 또는 병태의 발병 위험이 있는 것으로 진단된 동물 또는 인간에게 치료상 유효량의 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀을 투여하는 것을 포함하는, 뇌 아밀로이드형성 질병 또는 병태의 발병 위험이 있는 것으로 진단된 동물 또는 인간에서 뇌 아밀로이드형성 질병 또는 병태의 발병 위험을 감소시키거나 발병개시 또는 진행을 늦추거나 증상을 안정화시키는 방법을 포함하며, 여기서 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀 투여는 뇌 아밀로이드형성 질병 또는 병태의 발병 위험의 진단 후 시작된다. 특히, 본 발명은 동일한 양의 라세미 닐바디핀과 비교하여 감소된 저혈압 효과를 갖는 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 투여를 제공한다. 또한, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 투여는 저혈압 효과의 감소로 인해 라세미 닐바디핀의 투여와 비교하여 투여량 증가를 허용한다. 바람직한 실시양태에서, (-)-거울상이성질체는 투여되는 조성물에 과량으로 존재하고, 거울상이성질체 과량은 바람직하게는 90％ 이상, 95％ 이상, 및 보다 바람직하게는 98％ 이상 (100％ 포함), 검출가능한 순도 한계 이하이다.
본 발명은 뇌 아밀로이드형성 질병과 관련된 하나 이상 또는 모든 인지 및 거동 성향을 포함하는 뇌 아밀로이드형성 질병의 임상 프로파일을 치료하는 것을 제공한다. 예를 들어, AD에 관하여, 이러한 성향에는 최중증 기억 상실, 익숙한 일을 수행하는 것이 곤란함, 언어 장애, 지남력장애, 판단력 감소, 추상적 사고 손상, 성격, 기분 또는 거동의 변화, 및/또는 인지 시험 검사의 특징적인 스코어와 같은 비제한적인 증상 목록이 포함될 수 있다. 이러한 인지 시험에는 개정된 웩슬러 기억 척도 (WMS-R), 임상 치매 척도 (CDR), 간이 정신 상태 검사 (MMSE) 및/또는 알츠하이머병 평가 척도-인지 부척도 (ADAS)가 포함된다.
본 발명은 특이적인 임상 결과를 제공할 수 있는 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀에 의한 치료를 제공한다. 한 치료 종점은 뇌 아밀로이드형성 질병에 의해 영향을 받는 환자에서 하나 이상의 질병 증상의 측정가능한 개선이다. 개선은 증상이 없는 환자에 이르게 할 수 있거나, 치료전 하나 이상의 증상과 비교하여 능력의 개선을 초래할 수 있다. 별법으로, 한 치료 종점은 기준선 증상 수준을 유지하는 것일 수 있다. 다시 말해서, 이 종점은 영구히 또는 일정 기간 동안 질병 또는 질병의 하나 이상의 증상의 안정화를 나타낸다. 또한, 한 치료 종점은 치료되지 않은 대조군과 비교하여 질병 진행 속도의 감소일 수 있다. 또한, 치료는 하나 이상의 증상의 임상 소견전 뇌 아밀로이드형성 질병의 발병 위험이 있는 것으로 고려되는 개인의 예비치료를 포함할 수 있다. 질병 치료에 대한 언급은 또한 하나 이상의 증상의 치료를 포함하며, 여기서 치료는 치유가 아닌 완화이다.
본 발명은 또한 AD와 같은 뇌 아밀로이드형성 질병으로 고통받고 있는 동물 또는 인간의 중추 신경계에서 줄기 세포의 이식 전에 뉴런 줄기 세포에 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 일정량을 투여하는 것을 포함하는, 이식가능한 뉴런 줄기 세포를 처리하는 방법을 제공한다. 투여되는 양은 원하는 세포보호 효과를 달성하는 양이다. 바람직한 실시양태에서, (-)-거울상이성질체는 투여되는 조성물에 과량으로 존재하고, 거울상이성질체 과량은 바람직하게는 90％ 이상, 95％ 이상, 및 보다 바람직하게는 98％ 이상 (100％ 포함), 검출가능한 순도 한계 이하이다.
도 1은 4G8 면역염색 기술을 사용한 TgAPPsw 마우스의 뇌의 상이한 영역에서 Aβ 침착 (Aβ 적재)에 대한 닐바디핀의 만성 투여의 효과를 예시하는 막대 그래프이다.
도 2는 CD45+ 소교세포의 수를 결정하는 CD45 면역염색 기술을 사용한 뇌의 3개의 영역에서 TgAPPsw 마우스에서 소교세포 활성화에 대한 닐바디핀의 만성 투여의 효과를 예시하는 막대 그래프이다.
도 3은 24시간 동안 지질다당류 (LPS)에 의해 시험관내에서 활성화된 N9 뮤린 소교세포에서 소교세포 활성화에 대한 닐바디핀의 효과를 예시하는 막대 그래프이다. 소교세포 활성화는 ELISA에 의해 측정된 TNF-α 생성 (pg/ml)에 의해 결정된다.
도 4는 30 μM 예비응집된 Aβ1-40 (AgAβ)에 의해 3일 동안 처리된 HPNC 세포를 사용한 Aβ 신경독성에 대한 닐바디핀 투여의 효과를 예시하는 막대 그래프이다. 신경독성은 세포로부터 방출된 락트산 데히드로게나제 (LDH)의 양을 측정함으로써 평가된다.
도 5a 및 5b는 APPsw에 의해 형질감염된 인간 교모세포종 세포를 사용한 APP 프로세싱에 대한 닐바디핀의 효과를 예시하는 막대 그래프이다. 세포를 50 nM 및 250 nM 닐바디핀에 의해 24시간 (도 5a) 및 48시간 (도 5b) 동안 처리하였다. 배양 배지 중 Aβ1-40 생성을 ELISA에 의해 측정하였다.
도 6은 24시간 처리후 7W WT APP751 차이니즈 햄스터 난소 세포에 의한 Aβ1-40 생성에 대한 닐바디핀의 순수한 거울상이성질체 형태 (닐바디핀 1 및 닐바디핀 2) 뿐만 아니라 동등한 비율의 2종의 거울상이성질체의 혼합물 (N1+N2)의 효과를 나타내는 용량 반응 곡선이다. 거울상이성질체 양자 모두는 유사한 양상으로 Aβ1-40 생성을 용량 의존적으로 억제하는 것으로 보인다.
도 7은 24시간 처리후 7W WT APP751 차이니즈 햄스터 난소 세포에 의한 Aβ1-42 생성에 대한 닐바디핀의 순수한 거울상이성질체 형태 (닐바디핀 1 및 닐바디핀 2) 뿐만 아니라 동등한 비율의 2종의 거울상이성질체의 혼합물 (N1+N2)의 효과를 나타내는 용량 반응 곡선이다. 순수한 거울상이성질체 닐바디핀 2 뿐만 아니라 닐바디핀의 라세미 혼합물 (N1+N2)이 저용량에서 Aβ1-42를 약간 자극한 반면, 거울상이성질체 닐바디핀 1은 이러한 효과가 없음을 주목해야 한다.
도 8은 닐바디핀의 거울상이성질체의 분리를 나타내는 키랄 크로마토그래프이다. Nilva_Peak_1은 (-)-닐바디핀 (닐바디핀 1)에 상응하고; Nilva_Peak_2는 (+)-닐바디핀 (닐바디핀 2)에 상응한다. 닐바디핀의 본래 라세미 혼합물을 지칭하는 Nilva_10은 예시 목적으로 포함된다.
도 9는 래트 대동맥에서 FPL64176 유도된 혈관수축에 대한 (-)-닐바디핀 (닐바디핀 1) 및 (+)-닐바디핀 (닐바디핀 2)의 효과를 나타낸다. 데이터는 (+)-닐바디핀은 FPL64176 유도된 혈관수축을 완전히 길항하는 반면, (-)-닐바디핀은 L-유형 칼슘 채널 효능제(agonist)의 혈관작용 효과에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타내며, 이는 (+)-닐바디핀은 L-유형 칼슘 채널 차단제인 반면 (-)-닐바디핀은 이러한 효과가 없다는 것을 나타낸다.
도 10은 93-주령 TgAPPsw 마우스에서 뇌 Aβ1-40 및 Aβ1-42 수준에 대한 (-)-닐바디핀의 효과를 예시하는 막대 그래프이다. 동물을 4일 동안 1일마다 복강내로 (-)-닐바디핀 (10 mg/체중 kg)에 의해 처리하였다.
도 11은 70-주령 TgAPPsw 마우스에서 뇌 Aβ1-42 수준에 대한 (-)-닐바디핀의 저속 방출의 효과를 예시하는 막대 그래프이다. 피하로 이식된 생분해성 펠렛을 사용하여 26일 동안 동물을 처리하였다.
도 12는 인간 뇌 미세혈관 내피 세포 (HBMEC)의 층을 함유하는 24-웰 반투명한 0.4 ㎛ 막 삽입물을 사용한 혈액 뇌 장벽의 시험관내 모델을 예시한다. 정점 구획으로의 플루오레세인-베타 아밀로이드 1-42의 이동을 다양한 시점에 평가하였다.
도 13은 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 뇌 Aβ의 청소율에 대한 (-)-닐바디핀의 시험관내 효과를 나타내는 막대 그래프이다. A=정점, B=기저측.
도 14는 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 뇌 Aβ의 청소율에 대한 (-)-닐바디핀 대 닐바디핀 라세미 혼합물의 시험관내 효과를 나타내는 막대 그래프이다. A=정점, B=기저측.
도 15는 마우스에서 혈장 Aβ 수준에 의해 측정되는, 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 뇌 Aβ의 청소율에 대한 (-)-닐바디핀의 생체내 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 16은 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 뇌 Aβ의 청소율에 대한 생분해성 (-)-닐바디핀 펠렛의 생체내 효과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 17a 및 17b는 일정 범위의 약물 투여량에 걸친 (+)-닐바디핀 대 (-)-닐바디핀의 혈관작용 특정을 나타낸다.
<바람직한 실시양태의 기재>
본 발명은 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀 (이소프로필-3-메틸-2-시아노-1,4-디히드로-6-메틸-4-(m-니트로페닐)-3,5-피리딘-디카르복실레이트; MW 385.4)을 투여함으로써, 동물 및 인간에서 알츠하이머병 (AD)과 같은 특정 뇌 아밀로이드형성 질병의 홀마크인 뇌 변성의 멈추지 않는 진행을 다루기 위한 예방 방법 및 치료 방법을 제공한다. 증상의 치료, 예방 및 완화는 본 발명에 따른 방법에 포함된다.
달리 명시하지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 닐바디핀은 라세미 혼합물을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "거울상이성질체상 풍부한"은 (-)-거울상이성질체가 과량으로 존재하고, 바람직하게는 90％ 이상, 95％ 이상, 및 보다 바람직하게는 98％ 이상 (100％ 포함), 검출가능한 순도 한계 이하의 정도로 존재하는 거울상이성질체들의 혼합물인 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 순도는 키랄 HPLC 방법에 의한 검출에 의해 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 거울상이성질체 과량은 주요 성분으로부터 미량 성분을 공제함으로써 계산된다. 예를 들어, 98％ (-)-거울상이성질체 및 2％ (+)-거울상이성질체를 갖는 거울상이성질체의 혼합물은 (-)-거울상이성질체의 96％ 거울상이성질체 과량으로서 계산될 것이다.
특히, 본 발명의 한 실시양태는 뇌 아밀로이드형성 질병 또는 병태로 고통받고 있는 동물 또는 인간에게 치료상 유효량의 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀을 투여함으로써, 뇌 아밀로이드형성 질병 또는 병태로 고통받고 있는 동물 또는 인간에서 Aβ-침착, Aβ 신경독성 및 소교세포증을 감소시키는 방법을 제공한다. AD와 같은 대부분의 뇌 아밀로이드형성 질병이 만성의 진행성의 다루기 힘든 뇌 치매이기 때문에, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀 치료의 지속시간은 최대 동물 또는 인간의 수명 동안 지속될 것으로 고려된다. 뇌 아밀로이드형성 질병 또는 병태에는 알츠하이머병, 외상성 뇌 손상 및 뇌 아밀로이드 혈관병증이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 전염성 해면상 뇌증, 스크라피 또는 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 증후군을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 외상성 뇌 손상 (TBI)을 앓고 있는 동물 또는 인간에게 TBI 후 치료상 유효량의 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀을 투여하고, 그후 소정의 기간 동안 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀 치료를 계속함으로써, 외상성 뇌 손상 (TBI)을 앓고 있는 동물 또는 인간에서 Aβ 침착, Aβ 신경독성 및 소교세포증의 위험을 감소시키는 방법이 제공된다. TBI를 앓고 있는 동물 또는 인간을 위해 고려되는 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀 치료의 지속시간은 약 1시간 내지 5년, 바람직하게는 약 2주 내지 3년, 가장 바람직하게는 약 6개월 내지 12개월 동안 지속될 수 있다.
다른 실시양태에서, 뇌 아밀로이드형성 질병과 관련된 하나 이상 또는 모든 인지 및 거동 성향을 포함하는 뇌 아밀로이드형성 질병의 임상 프로파일을 치료하는 방법이 제공된다. 예를 들어, AD에 관하여, 이러한 성향에는 최중증 기억 상실, 익숙한 일을 수행하는 것이 곤란함, 언어 장애, 지남력장애, 판단력 감소, 추상적 사고 손상, 성격, 기분 또는 거동의 변화, 및/또는 인지 시험 검사의 특징적인 스코어와 같은 비제한적인 증상 목록이 포함될 수 있다. 이러한 인지 시험에는 개정된 웩슬러 기억 척도 (WMS-R), 임상 치매 척도 (CDR), 간이 정신 상태 검사 (MMSE) 및/또는 알츠하이머병 평가 척도-인지 부척도 (ADAS)가 포함된다.
하나 이상의 실시양태에서, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀에 의한 치료는 특이적인 임상 결과를 제공할 수 있다. 한 치료 종점은 뇌 아밀로이드형성 질병에 의해 영향을 받는 환자에서 하나 이상의 질병 증상의 측정가능한 개선이다. 개선은 증상이 없는 환자에 이르게 할 수 있거나, 치료전 하나 이상의 증상과 비교하여 능력의 개선을 초래할 수 있다. 별법으로, 한 치료 종점은 기준선 증상 수준을 유지하는 것일 수 있다. 다시 말해서, 이 종점은 영구히 또는 일정 기간 동안 질병 또는 질병의 하나 이상의 증상의 안정화를 나타낸다. 또한, 한 치료 종점은 치료되지 않은 대조군과 비교하여 질병 진행 속도의 감소일 수 있다. 또한, 치료는 하나 이상의 증상의 임상 소견전 뇌 아밀로이드형성 질병의 발병 위험이 있는 것으로 고려되는 개인의 예비치료를 포함할 수 있다. 질병 치료에 대한 언급은 또한 하나 이상의 증상의 치료를 포함하며, 여기서 치료는 치유가 아닌 완화이다.
뇌 아밀로이드형성 질병으로 괴로워하거나 외상성 뇌 손상을 앓고 있는 동물 또는 인간에게 임의로 단위 투여형으로 투여될 뿐만 아니라 본 발명의 방법에 따라 동물 또는 인간에서 뇌 아밀로이드형성 질병의 발병 위험의 결정 및/또는 진단의 목적으로 투여되는 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 치료상 유효량은 1일당 약 0.05 mg 내지 20 mg, 바람직하게는 1일당 약 2 mg 내지 15 mg, 보다 바람직하게는 1일당 약 4 mg 내지 12 mg, 가장 바람직하게는 1일당 약 8 mg의 범위일 수 있다. 1일 투여량은 단일 단위 용량으로 투여되거나 1일당 2, 3 또는 4개의 단위 용량으로 분배될 수 있다. 다른 실시양태에서, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 치료상 유효량은 1일당 16 mg 초과, 최대 허용 용량의 한계 이하이다. 예를 들어, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 치료상 유효량은 1일당 16 mg 내지 약 20 mg의 범위일 수 있다. 별법으로, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 치료상 유효량은 1일당 약 20 mg, 1일당 약 30 mg, 1일당 약 40 mg, 1일당 약 50 mg, 1일당 약 75 mg, 1일당 약 100 mg, 1일당 약 125 mg, 1일당 약 150 mg, 1일당 약 175 mg, 1일당 약 200 mg, 1일당 약 225 mg, 1일당 약 250 mg, 1일당 약 275 mg, 1일당 약 300 mg, 1일당 약 325 mg, 1일당 약 350 mg, 1일당 약 375 mg, 1일당 약 400 mg, 1일당 약 425 mg, 1일당 약 450 mg, 1일당 약 475 mg, 1일당 약 500 mg 또는 1일당 최대 허용 용량 이하 및 상기 양들 사이의 임의의 양, 정수 또는 그 반대일 수 있다. 범위는 다양할 수 있다. 예를 들어, 비제한적인 범위는 1일당 20, 40, 60, 80 또는 100 mg의 더 낮은 종점 및 1일당 50, 100, 150, 200, 250, 300 및 500 mg의 더 높은 종점을 포함하고, 상기 언급된 양 내의 임의의 양, 정수 또는 그 반대가 종점으로서 작용할 수 있다.
이론에 얽매이는 것을 원하지 않지만, 항고혈압 효과가 라세미 닐바디핀의 최대 허용 양을 제한할 수 있는 것으로 여겨진다. 본 발명에 따른 한 실시양태에서, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 치료상 유효량은 혈압을 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 투여후 치료전 혈압의 약 30％ 미만, 약 20％ 미만, 약 10％ 미만, 약 5％ 미만 및 약 1％ 미만으로 이루어진 군에서 선택된 양만큼 감소시킨다. 혈압은 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 혈압은 수축기 혈압 또는 이완기 혈압 (수은 밀리미터)으로서 측정될 수 있다.
별법으로, 혈압은 2/3 이완기 + 1/3 수축기 혈압 판독식에 따라 계산될 수 있다. 한 실시양태에서, 혈압을 연속적으로 모니터링하고, 시간에 따라 적분하여 곡선하면적 (AUC)에 대한 단일 값을 제공한다. 혈압 변화를 정상적인 집단과 비교할 수 있거나, 치료된 개인의 치료전 혈압과 비교할 수 있다. 한 실시양태에서, 정상 상태 혈압 변화를 확립하기 위해 치료 기간 이후에 치료후 혈압을 측정한다. 예를 들어, 약 1주 치료, 약 4주 치료, 약 12주 치료, 약 6개월 치료 등 후에 치료후 혈압을 측정할 수 있다. 한 실시양태에서, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀은 정상적인 혈압을 갖거나 또는 저혈압인 인간 또는 동물에게 투여된다. 한 실시양태에서, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀은 고혈압인 인간 또는 동물에게 투여된다. 인간에서, 정상적인 혈압은 약 90/50 mm Hg 내지 약 135/90 mm Hg인 것으로 고려된다. 인간에서 정상적인 범위 미만의 혈압은 저혈압이라고 고려된다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 치료제는 고혈압인 환자에게 또는 그의 혈압 수준과 상관없이 환자에게 투여된다. 고혈압 환자는 항고혈압제로 동시에 치료될 수 있다. 인간에서 정상적인 범위 초과의 혈압은 고혈압으로 고려된다.
다양한 동물에 대한 정상적인 범위는 표준 수의학 핸드북에서 찾을 수 있다. 한 실시양태에서, 혈압은 자연적으로 또는 의료 개입, 예컨대 추가 항고혈압제의 투여로 인해 정상적인 범위 내에 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, AD와 같은 뇌 아밀로이드형성 질병으로 괴로워할 수 있는 동물 또는 인간의 중추 신경계의 세포 이식 전에 뉴런 줄기 세포에 치료상 유효량의 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀을 투여함으로써 이식가능한 인간 또는 이종 뉴런 줄기 세포를 예비처리하는 방법이 제공된다. 아마도, 뉴런 줄기 세포 자체는 Aβ의 상당한 침착을 갖지 않을 것이다. 그러나, 뉴런 이식이 Aβ-적재된 환경을 위해 의도된 경우에, 뉴런 줄기 세포의 예비처리는 Aβ 농도를 감소시켜 그러므로 Aβ-독성을 감소시킴으로써 새로운 환경에서 생존하는 이식된 뉴런의 능력을 향상시켜야 한다. 뉴런 줄기 세포의 예비처리를 위해 투여되는 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 치료상 유효량은 약 1 nM 내지 3 μM, 바람직하게는 약 10 nM 내지 2 μM, 가장 바람직하게는 약 100 nM 내지 1 μM의 범위일 수 있다. 줄기 세포는 뉴런 세포와 같은 특정 세포 유형으로 분화되도록 지정시 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 척수 손상과 같은 질병 및 상태의 치료를 위한 대체 세포 및 조직의 재생가능한 공급원의 가능성을 제공하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 세포가 환자에게 이식/임플란트된 경우에, 세포를 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀으로 예비처리할 뿐만 아니라 이식후 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀으로 환자의 치료학적 치료를 개시하는 것이 권장된다.
본 발명의 방법이 인간의 중추 신경계에서 아밀로이드 침착, Aβ 신경독성 및 소교세포증과 관련된 상태의 치료, 예방 및/또는 억제에서의 효능에 대한 시험전 PDAPP 및 TgAPPsw 마우스 모델과 같은 AD에 대한 공지된 트랜스제닉 동물 모델에서 시험될 수 있다는 것이 고려된다. AD에 대한 이러한 트랜스제닉 동물 모델은 당분야에 공지된 표준 방법 및 예를 들어 미국 특허 제5,487,992호, 제5,464,764호, 제5,387,742호, 제5,360,735호, 제5,347,075호, 제5,298,422호, 제5,288,846호, 제5,221,778호, 제5,175,385호, 제5,175,384호, 제5,175,383호 및 제4,736,866호에 나열된 것과 같은 방법을 사용하여 제작된다.
거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀은 다양한 경로를 통해 (비경구, 경구 또는 복강내 포함) 환자에게 투여될 수 있다. 비경구 투여에는 하기 경로가 포함된다: 정맥내; 근육내; 간질; 동맥내; 피하; 안내; 두개내; 경막내; 심실내; 활액낭내; 경피, 흡입을 통한 폐, 눈, 설하 및 협측을 포함하는 경상피; 눈, 피부, 안구, 직장, 또는 취입 또는 연무를 통한 코 흡입을 포함하는 국소.
경구로 투여되는 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀은 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 봉입되거나 정제로 압축될 수 있다. 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀은 또한 부형제와 함께 혼입되고, 섭취가능한 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 사셰, 로젠지, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀은 분말 또는 과립, 수성 액체 또는 비-수성 액체 중 용액 또는 현탁액, 또는 수중유 또는 유중수 에멀젼의 형태일 수 있다.
정제, 트로키, 환제, 캡슐 등은 또한 예를 들어, 결합제, 예컨대 트라가칸트 검, 아카시아, 옥수수 전분; 젤라틴화 부형제, 예컨대 인산이칼슘; 붕해제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘; 감미제, 예컨대 수크로스, 락토스 또는 사카린; 또는 향미제를 함유할 수 있다. 활성 성분은 단위 투여형 또는 비-단위 투여형으로 제제화되거나 투여될 수 있다. 단위 투여형이 캡슐인 경우에 상기 기재된 물질 이외에 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질은 코팅으로서 또는 투여량 단위의 물리적 형태를 달리 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캡슐은 쉘락, 당 또는 양자 모두에 의해 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 닐바디핀, 감미제로서 수크로스, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 향미제를 함유할 수 있다. 또한, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀은 지속-방출 제제 및 제형에 혼입될 수 있다.
거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀은 CNS로, 비경구로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 유리 염기 또는 제약상 허용되는 염으로서 닐바디핀의 용액은 적합한 계면활성제, 예컨대 히드록시프로필셀룰로스와 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 통상적인 저장 및 사용 조건 하에, 이들 제제는 미생물의 성장 또는 화학적 변성을 방지하기 위해 보존제 및/또는 항산화제를 함유할 수 있다.
원하는 (-)-닐바디핀 거울상이성질체는 키랄 중심에서 (R) 배위를 갖는다. 본원에서 제공된 화합물은 거울상이성질체상 순수하거나 일정량의 (+)(S)-닐바디핀을 갖는 입체이성질체 혼합물일 수 있다. 본원의 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 개시는, 바람직하게는 본원에 기재된 유용한 특성을 갖는 임의의 광학적 활성이거나 다형체이거나 또는 입체이성질체 형태 또는 이들의 혼합물을 포함한다는 것이 이해되는 바, 광학적 활성 형태의 제조 방법 및 본원에 기재된 표준 시험을 사용하여 또는 당분야에 익히 공지된 다른 유사한 시험을 사용하여 활성을 측정하는 방법은 당분야에 익히 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 용어 "거울상이성질체상 풍부한"은 (-)-거울상이성질체가 과량으로 존재하고, 바람직하게는 90％ 이상, 95％ 이상, 및 보다 바람직하게는 98％ 이상 (100％ 포함), 검출가능한 순도 한계 이하의 정도로 존재하는 거울상이성질체들의 혼합물인 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 순도는 키랄 HPLC 방법에 의한 검출에 의해 결정될 수 있다.
화합물의 광학 이성질체를 얻기 위해 사용될 수 있는 방법의 예에는 하기가 포함된다:
i) 결정의 물리적 분리 - 개별 거울상이성질체의 거시적 결정을 수동으로 분리하는 기술. 이 기술은 분리된 거울상이성질체 결정이 존재하고, 즉 물질이 고체라세미혼합물이고, 결정이 육안으로 구분되는 경우에 사용될 수 있다;
ii) 동시 결정화 - 라세미체 용액으로부터 개별 거울상이성질체를 개별적으로 결정화하는 기술로서, 라세미체가 고체 상태의 고체라세미혼합물일 경우에만 가능하다;
iii) 효소적 분할 - 거울상이성질체의 효소와의 구별되는 반응 속도에 의해 라세미체를 부분적으로 또는 완전히 분리하는 기술;
iv) 효소적 비대칭 합성 - 원하는 거울상이성질체의 거울상이성질체상 순수한 또는 풍부한 합성 전구체를 얻기 위해 하나 이상의 합성 단계에서 효소적 반응을 사용하는 합성 기술;
v) 화학적 비대칭 합성 - 키랄 촉매 또는 키랄 보조제를 사용하여 달성될 수 있는, 비대칭성 (즉, 키랄성)을 생성물에 생성하는 조건 하에 비키랄 전구체로부터 원하는 거울상이성질체를 합성하는 합성 기술;
vi) 부분입체이성질체 분리 - 개별 거울상이성질체를 부분입체이성질체로 전환하는 거울상이성질체상 순수한 시약 (키랄 보조제)과 라세미 화합물, 전구체 또는 반합성 중간체를 반응시키는 기술. 생성되는 부분입체이성질체는 그 후 그의 더 구분되는 구조적 차이를 이용하는 크로마토그래피 또는 결정화에 의해 분리하고, 키랄 보조제를 나중에 제거하여, 원하는 거울상이성질체를 얻는다 (예를 들어, 후지사와 파마슈티컬 캄파니, 리미티드(Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd)로 양도된 미국 특허 제5,508,413호 참조);
vii) 일차 및 이차 비대칭 변형 - 라세미체로부터의 부분입체이성질체를 원하는 거울상이성질체로부터의 부분입체이성질체의 용액이 우세하게 생성되도록 평형화하거나, 또는 원하는 거울상이성질체로부터의 부분입체이성질체를 우선적으로 결정화하여 결과적으로 원칙적으로 거의 모든 물질이 원하는 거울상이성질체로부터의 결정질 부분입체이성질체로 전환되도록 평형을 교란하는 기술. 원하는 거울상이성질체는 그 후 부분입체이성질체로부터 방출된다;
viii) 동역학적 분할 - 이 기술은 동역학적 조건 하에 거울상이성질체의 키랄 비-라세미 시약 또는 촉매와의 동일하지 않은 반응 속도를 이용하는 라세미체의 부분적 또는 완전한 분할 (또는 부분적으로 분할된 화합물의 추가 분할)의 달성을 지칭한다;
ix) 비-라세미 전구체로부터의 거울상이성질체특이적 합성 - 비키랄 출발 물질로부터 원하는 거울상이성질체를 얻는 합성 기술로서, 여기서 입체화학적 일체성은 합성 과정에 걸쳐 손상되지 않거나 최소한으로만 손상된다;
x) 키랄 액체 크로마토그래피 - 라세미체의 거울상이성질체를 정지상과의 구별되는 상호작용을 이용하여 액체 이동상에서 분리하는 기술. 정지상이 키랄 물질로 제조될 수 있거나, 이동상이 구별되는 상호작용을 일으키는 추가 키랄 물질을 함유할 수 있다;
xi) 키랄 기체 크로마토그래피 - 라세미체를 휘발하고, 거울상이성질체를 고정된 비-라세미 키랄 흡착상을 함유하는 컬럼과의 기체 이동상에서의 구별되는 상호작용을 이용하여 분리하는 기술;
xii) 키랄 용매에 의한 추출 - 특정 키랄 용매로의 한 거울상이성질체의 우선적 용해를 이용하여 거울상이성질체를 분리하는 기술; 및
xiii) 키랄 막을 횡단하는 수송 - 라세미체를 박막 장벽과 접촉시켜 위치시키는 기술. 장벽은 전형적으로 그중 하나는 라세미체를 함유하는 2종의 혼화성 유체를 분리하며, 농도 또는 압력 차이와 같은 구동력이 막 장벽을 횡단하는 우선적 수송을 야기한다. 분리는 막의 비-라세미 키랄성이 라세미체 중 하나의 거울상이성질체만을 통과하도록 하는 것의 결과로 발생한다.
xiv) 액체 크로마토그래피 - 키랄 정지상에 관하여 그의 분배 계수의 차이를 이용하여 정상적인 상 용매계에서 거울상이성질체를 분리하는 기술. 본원에 기재된 (-)-닐바디핀 및 (+)-닐바디핀의 광학적 활성 제제를 제조하기 위해 이 기술을 이용하였다 (도 8 참조).
닐바디핀의 거울상이성질체는 다음과 같이 분리되었다:
Figure pct00001
닐바디핀의 거울상이성질체의 광학적 회전에 대한 문헌 값은 문헌 [Satoh, Y.; Okumura, K.; Shiokawa, Y. Chem. Pharm. Bull. 42(4) 950-952 (1994)]에 보고되어 있다. 분리된 화합물의 거울상이성질체 순도에 대한 데이터에 대해서는 도 5를 참조한다.
용어 "약"은 언급된 양의 ±10％ 이내, 또는 측정 기술의 실험 오차 이내를 의미한다. 어구 "본질적으로 ~으로 구성된 조성물"은 활성 제약 성분이 나타낸 바와 같이 존재하는 조성물을 포함하는 것으로 의미된다. 한 실시양태에서, 어구 "본질적으로 ~으로 구성된"은 나열되지 않은 활성 제약 성분을 제외하나 제약상 허용되는 비히클, 담체 또는 희석제, 또는 활성 제약 성분을 제제화하는 방식을 제외하지 않는다. 한 실시양태에서, 예를 들어 치료 방법에서 어구 "본질적으로 ~으로 구성된"은 다른 원인 또는 적응증을 위해 투여되는 치료제를 제외하지 않으면서 상기 특정 적응증을 위한 단독 치료제(들)로서 1종 이상의 활성 제약 성분의 투여를 포함할 수 있다.
<실시예>
AD와 같은 아밀로이드증과 관련된 질병을 앓고 있는 동물 또는 인간에서 Aβ의 병리학적 효과를 감소시키는 본 발명의 방법은 하기 비제한적인 실시예에서 더 상세히 기재될 것이다. 실시예 1 내지 5는 비교 목적을 위해 라세미 닐바디핀에 대한 데이터를 제공한다.
닐바디핀 거울상이성질체의 크로마토그래피 정제
변형된 셀룰로스 (키랄 테크놀로지스(Chiral Technologies), 미국 펜실베니아주 웨스트 체스터 소재)의 정지상을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 통해 닐바디핀의 거울상이성질체 양자 모두의 크로마토그래피 정제를 달성하였다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같았다: 컬럼 내부 직경, 10 mm; 컬럼 길이, 250 mm; 이동상, 95:5 부피비의 헥산 대 에탄올; 유속, 2.5 ml/min; 컬럼 온도, 7℃. 신호-기재 분획 수집을 사용한 라세미 닐바디핀의 반복된 주사에 의해 본원에 기재된 실시예를 위한 정제된 거울상이성질체를 얻었다. 도 8을 참조한다.
실시예 1
Aβ 침착 (아밀로이드 적재)에 대한 닐바디핀의 만성 투여
4G8 항-Aβ 모노클로날 항체 면역염색 기술을 사용하여 TgAPPsw 마우스의 뇌의 상이한 영역에서 Aβ 침착 (아밀로이드 적재)에 대한 닐바디핀의 만성 투여의 효과를 시험하였다. Aβ 침착의 정량 분석을 위한 그의 강한 신호 및 최적의 결과 때문에 Aβ 적재를 결정하기 위해 4G8 면역염색 기술을 선택하였다. 간단히, 파라핀 섹션을 이전에 기재된 바와 같은 면역조직화학으로 처리하였다 (문헌 [Nakagawa, Y et al., Exp. Neurol., 163:244-252, 2000]). 섹션을 크실렌에서 탈파라핀화하고, 일련의 에탄올 및 탈이온수에서 수화하고, Aβ에 대한 면역조직화학 전 60분 동안 섹션을 88％ 포름산에 침지함으로써 항원 회수 단계로 처리하였다. 섹션을 물에서 세척하고, 메탄올 (150 ml) + 과산화수소 (33％, 30 ml)의 신선하게 제조된 혼합물을 사용하여 내인성 퍼옥시다제를 켄칭하였다. 매각자 (벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories), 미국 캘리포니아주 버링게임 소재)의 지시사항에 따라 아비딘-바이오틴 복합체 방법을 사용하였다. Aβ에 대해 양성으로 염색된 뇌 영역의 백분율을 결정함으로써 아밀로이드 적재를 평가하였다. 음성 대조군은 일차 항체 대신에 전면역 혈청을 적용한 것을 제외하고, 동일한 면역조직화학 프로토콜을 섹션에 적용한 것을 포함하였다. TgAPPsw 마우스를 닐바디핀의 유효량을 투여받은 실험군 (n=7) 및 비히클을 투여받은 대조군 (n=5)으로 나누었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 닐바디핀에 의한 처리는 Aβ 적재를 대조군과 비교하여 시각 피질에서 약 62％, 대조군과 비교하여 두정 피질에서 약 65％, 대조군과 비교하여 운동 피질에서 약 58％, 대조군과 비교하여 조롱박 피질에서 약 58％, 대조군과 비교하여 해마의 CA1 영역에서 약 52％ 및 대조군과 비교하여 해마의 CA2-CA3 영역에서 약 50％ 감소시켰다.
실시예 2
소교세포 활성화에 대한 닐바디핀의 만성 투여
CD45+소교세포의 수를 결정하는 CD45 면역염색 기술을 사용하여 마우스 뇌의 3개의 영역에서 TgAPPsw 마우스에서 소교세포 활성화에 대한 닐바디핀의 만성 투여의 효과를 시험하였다.
간단히, 소교세포의 특이적 마커인 CD45에 대한 면역조직화학을 저온유지장치 뇌 섹션 상에서 수행하였다. CD45-양성 소교세포를 밤새 4℃에서 CD45에 대한 마우스 모노클로날 항체 (케미콘 인터내셔널(Chemicon International))와 함께 인큐베이션한 후, 바이오티닐화된 토끼 항-마우스 이차 항체를 30분 동안 적용함으로써 면역국소화하였다. CD45의 검출을 디아미노벤지딘 크로모겐 기질에 의해 완료하였으며, 이는 CD45-양성 소교세포 상에 갈색 세포 표면 염색을 생성하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 유효한 투여량으로 투여된 닐바디핀 처리는 대조군과 비교하여 소교세포 활성화를 해마에서 약 33％, 두정 피질에서 약 43％, 및 운동 피질에서 약 27％ 감소시켰다.
실시예 3
소교세포 활성화에 대한 닐바디핀 투여의 효과
24시간 동안 지질다당류 (LPS)에 의해 시험관내에서 활성화된 N9 뮤린 소교세포에서 소교세포 활성화에 대한 닐바디핀의 효과를 시험하였다. N9 뮤린 소교세포를 배아 마우스 뇌로부터 유래된 스캐빈저 뮤린 소교세포 클론인 것으로 잘 특징화하였다. ELISA에 의해 측정된 TNF-α 생성 (pg/ml)에 의해 소교세포 활성화의 정도를 결정하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, LPS에 의해 활성화되지 않은 소교세포 (대조군 세포)는 약 40 pg/ml TNF-α를 생성하였다. 소교세포는 50 nM 닐바디핀의 존재하에 약 40 pg/ml TNF-α를 생성하였다. 닐바디핀 투여를 10배 (500 nM) 증가시키는 것은 TNF-α 생성을 변화시키지 않았다. 소교세포는 1 ㎍/ml LPS의 존재하에 대조군 세포 및 닐바디핀-투여된 세포로부터 약 95％의 증가인 약 820 pg/ml TNF-α를 생성하였다. 소교세포는 1 ㎍/ml LPS + 50 nM 닐바디핀 양자 모두의 존재하에 약 670 pg/ml TNF-α를 생성하였다. LPS + 500 nM 닐바디핀 투여는 TNF-α 생성을 약 610 pg/ml로 감소시켰다. 그러므로, 닐바디핀은 LPS-유도된 소교세포 활성화를 약 20 내지 25％만큼 방해하였다.
실시예 4
Aβ 신경독성에 대한 닐바디핀 투여의 효과
3일 동안 30 μM 예비응집된 Aβ1-40 (AgAβ)에 의해 처리된 인간 뉴런 선조 세포 (HNPC)를 사용하여 Aβ 신경독성에 대한 닐바디핀 투여 (10 nM 및 100 nM)의 효과를 시험하였다. HNPC 세포는 시클릭 AMP에 의해 처리시 뉴런으로 용이하게 분화하였다. 시클릭 AMP (1 mM) (시그마(Sigma))를 배양 배지에 첨가하고, HNPC 세포를 혈청이 없는 조건하에 37℃에서 48시간 이상 동안 인큐베이션하였다. 이 배지는 선조가 뉴런계의 세포로 분화하게 하였으며, 이는 세포의 대부분을 미세소관-관련 단백질인 MAP-2에 대한 항체에 의해 염색함으로써 확인하였다. 세포로부터 방출된 락트산 데히드로게나제 (LDH; 모든 세포에서 발견되는 세포내 효소)의 양을 측정함으로써 신경독성을 평가하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, AgAβ에 의한 세포 처리는 닐바디핀에 의한 세포 처리와 비교하여 LDH 방출의 약 44％ 증가를 유발하였다. 10 nM 닐바디핀을 AgAβ와 함께 첨가한 경우 LDH 방출에는 변화가 없었다. 그러나, 닐바디핀의 투여량을 100 nM로 10배 증가시킨 경우, LDH 방출량은 약 44％만큼 감소하였다.
실시예 5
APP 프로세싱에 대한 닐바디핀 투여의 효과
APPsw에 의해 형질감염된 인간 교모세포종 세포를 사용하여 APP 프로세싱에 대한 닐바디핀의 효과를 시험하였다. 세포를 50 nM 및 250 nM 닐바디핀에 의해 24시간 및 48시간 동안 처리하고, 시판되는 인간 Aβ1-40 ELISA (바이오소스(Biosource), 미국 캘리포니아주 소재)를 사용함으로써 배양 배지 중 Aβ1-40 생성을 측정하였다.
도 5a에 나타낸 바와 같이, 24시간 처리 후, 50 nM 닐바디핀은 Aβ1-40 생성을 약 9％만큼 감소시키고, 250 nM 닐바디핀은 Aβ1-40 생성을 약 15％만큼 감소시켰다. 48시간 처리 후 (도 5b), 50 nM 닐바디핀은 Aβ1-40 생성을 약 18％만큼 감소시키고, 250 nM 닐바디핀은 Aβ1-40 생성을 약 5％만큼 감소시켰다.
실시예 6
Aβ 수준에 대한 닐바디핀의 라세미 및 단리된 거울상이성질체의 다양한 용량의 효과
24시간 처리후 7W WT APP751 차이니즈 햄스터 난소 세포를 사용하여, Aβ1-40 및 Aβ1-42 생성에 대한 닐바디핀의 순수한 거울상이성질체 형태, (-)-닐바디핀 (닐바디핀 1) 및 (+)-닐바디핀 (닐바디핀 2) (도 8) 뿐만 아니라 2종의 거울상이성질체들의 혼합물 (동등한 비율)의 효과를 시험하였다. 시판되는 인간 Aβ1-40 ELISA (바이오소스, 미국 캘리포니아주 소재) 및 시판되는 인간 Aβ1-42 ELISA (바이오소스, 미국 캘리포니아주 소재)를 사용함으로써 배양 배지 중 Aβ1-40 및 Aβ1-42의 생성을 각각 측정하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 거울상이성질체 양자 모두는 유사한 방식으로 Aβ1-40 생성을 용량 의존적으로 억제하는 것으로 보인다. 그러나, (+)-닐바디핀 (닐바디핀 2) 뿐만 아니라 닐바디핀의 라세미 혼합물 (N1+N2)은 저용량에서 Aβ1-42를 약간 자극한 반면, (-)-닐바디핀 (닐바디핀 1)은 이 효과를 나타내지 않았다 (도 7).
실시예 7
래트 대동맥에서 혈관수축에 대한 닐바디핀의 단리된 거울상이성질체의 효과
래트 대동맥에서 FPL64176 유도된 혈관수축에 대한 닐바디핀의 순수한 거울상이성질체 형태, (-)-닐바디핀 (닐바디핀 1) 및 (+)-닐바디핀 (닐바디핀 2) (도 8)의 효과를 시험하였다. 정상적인 수컷 스프라그-돌리 래트 (7 내지 8월령)를 인도적으로 안락사시키고, 신선하게 절개된 래트 대동맥를 3-mm 고리로 절편화하고, 욕조 장치에서 후크 상에 크렙(Kreb) 완충액에서 현탁하였다. 이들 후크를 맥랩 시스템(MacLab system)에 연결된 등거리 변환기에 연결하였다. 대동맥 고리를 30분마다 변화된 크렙 완충액으로 2시간 동안 조직 조 시스템에서 평형화하였다. 2 g의 기준선 장력을 각 대동맥 고리에 가하였다. 1 μM FPL64176 (2,5-디메틸-4-[2-(페닐메틸)벤조일]-1H-피롤-3-카르복실산 메틸 에스테르) (L-유형 칼슘 채널의 강력하고 선택적인 효능제임)의 첨가 2분 전에 대동맥 고리를 100 nM (-)-닐바디핀 (닐바디핀 1), 100 nM (+)-닐바디핀 (닐바디핀 2)에 의해 예비처리하거나 처리하지 않았다. 대동맥 고리를 FPL64176에 의해 30분 동안 수축시켰다. 기준선과 비교하여 수축량 (g)을 결정하고, 이러한 값 모두의 평균 및 표준 편차를 계산하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, (+)-닐바디핀은 FPL64176 유도된 혈관수축을 완전히 길항한 반면, (-)-닐바디핀은 L-유형 칼슘 채널 효능제의 혈관작용 효과를 생성하지 않았으며, 이는 (+)-닐바디핀은 L-유형 칼슘 채널 차단제인 반면 (-)-닐바디핀은 이러한 효과가 없다는 것을 나타낸다. 본원에 제공된 데이터는 (-)-거울상이성질체에 대한 FPL64176에 의해 시도된 기준선 대동맥 수축을 나타내었고, 이는 혈관작용성 (즉, 유도된 혈관수축의 길항작용)을 나타내는 라세미 혼합물 또는 (+)-거울상이성질체와 비교하여 (-)-거울상이성질체에 대한 감소된 혈관작용성과 상관관계가 있다.
실시예 8
뇌 Aβ 수준에 대한 (-)-닐바디핀의 효과
뇌 Aβ1-40 및 Aβ1-42 수준에 대한 단리된 (-)-닐바디핀의 효과를 시험하였다. DMSO에 용해된 10 mg/체중 kg (-)-닐바디핀 (n=4) 또는 동일한 부피의 비히클 (100 ㎕) (n=4)을 93-주령 수컷 트랜스제닉 APPsw 마우스 (TgAPPsw 라인 2576)에 복강내로 매일 주사하였다. 4일 처리 후, 동물을 마지막 주사후 1시간에 인도적으로 안락사시키고, 그의 뇌를 수집하고, 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 4℃에서 프로테아제 억제제 칵테일 IV의 1X (칼바이오켐(Calbiochem), 미국 캘리포니아주 소재)를 함유하는 증류수에서 뇌를 균질화하고, 14,000 rpm에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 펠렛을 Tris HCl 완충액 (pH=8)에 용해된 구아니딘 5M의 동일한 부피에 재현탁하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 단백질 농도를 BCA 방법 (바이오라드(Biorad), 미국 캘리포니아주 소재)에 의해 구아니딘 처리된 샘플에서 결정하였다. Aβ1-40 및 Aβ1-42 수준을 ELISA (바이오소스, 미국 캘리포니아주 소재)에 의해 평가하고, 결과를 단백질 mg 당 Aβ1-40 또는 Aβ1-42의 pg으로 보고하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 4일 동안 매일 10 mg/체중 kg의 용량으로 TgAPPsw 마우스에게 (-)-닐바디핀의 투여는 대조군 동물과 비교하여 Aβ1-42의 뇌 수준 (pg/ml)의 26％ 감소 및 Aβ1-40의 뇌 수준의 43％ 감소를 초래하였다.
실시예 9
뇌 Aβ 수준에 대한 (-)-닐바디핀의 저속 방출의 효과
뇌 Aβ1-42 수준에 대한 (-)-닐바디핀의 저속 방출의 효과를 시험하였다. 30일의 기간 동안 30 mg (-)-닐바디핀/체중 kg/일의 연속적인 저속 방출을 보장하는 (-)-닐바디핀의 생분해성 펠렛 (n=5), 56 mg/Kg/일의 방출을 보장하는 (-)-닐바디핀의 생분해성 펠렛 (n=6) 또는 플라시보를 방출하는 펠렛 (n=6)을 66 주령 TgAPPsw (TgAPPsw 라인 2576)에 피하로 이식하였다. 펠렛 이식후 26일에 동물을 인도적으로 안락사시키고, 그의 뇌를 수집하고, 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 4℃에서 프로테아제 억제제 칵테일 IV의 1X (칼바이오켐, 미국 캘리포니아주 소재)를 함유하는 증류수에서 뇌를 균질화하고, 14,000 rpm에서 30분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상등액을 Tris HCl 완충액 (pH=8)에 용해된 구아니딘 5M의 동일한 부피에 재현탁하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 단백질 농도를 BCA 방법 (바이오라드, 미국 캘리포니아주 소재)에 의해 구아니딘 처리된 샘플에서 결정하였다. Aβ1-42 수준을 ELISA (바이오소스, 미국 캘리포니아주 소재)에 의해 평가하고, 결과를 단백질 mg 당 Aβ1-42의 pg으로 보고하였다.
도 11에 나타낸 바와 같이, TgAPPsw 마우스에게 저속 방출 (-)-닐바디핀의 투여는 30 mg/Kg/일 (-)-닐바디핀의 저속 방출 펠렛을 투여받은 마우스의 경우 뇌 Aβ1-42의 수준의 2배 감소를 초래한 반면, 플라시보 펠렛을 이식받은 마우스와 비교하여 56 mg/Kg/일 저속 방출 펠렛으로 처리된 동물에서 Aβ1-42의 2.5배 감소가 관찰되었다.
실시예 10
혈액 뇌 장벽을 가로지르는 뇌 Aβ 수준의 청소율에 대한 (-)-닐바디핀의 효과
시험관내 모델
시험관내 및 생체내 모델 양자 모두를 사용하여 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 가로지르는 뇌 Aβ 수준의 청소율에 대한 (-)-닐바디핀의 효과를 시험하였다. 시험관내 모델은 도 12에 나타낸다. 2 μM 플루오레세인-β-아밀로이드 (1-42)를 함유하는 내피 세포 배양물 배지 (ECM, 사이언셀 리서치 래보러토리즈(ScienCell Research Laboratories)) (3)를 기저측 (공여자) 구획에 위치시켰다. ECM (2) 중 다양한 디히드로피리딘 (DHP) 화합물 (1, 5, 및 10 μM)에 막의 정점 (수용자) 측면을 노출하였다. 각 군에서 플루오레세인-β-아밀로이드 (1-42)의 초기 농도를 확립하기 위해 공여자 구획을 0시에 샘플링하였다. 형광 아밀로이드를 함유하는 웰로의 삽입물의 노출 후, 90분까지의 다양한 시점에 정점 구획으로부터 샘플을 수집하여 (1), 인간 뇌 미세혈관 내피 세포 (HBMEC) 단일층 (4)을 가로지르는 플루오레세인-β-아밀로이드 (1-42)의 이동 (기저측에서 정점으로)을 평가하였다. 바이오테크 시너지(BioTek Synergy) HT 다중-검출 마이크로플레이트 판독기 (미국 버몬트주 위누스키 소재)를 사용하여 플루오레세인-β-아밀로이드 (1-42)에 대해 샘플을 분석하였다 (λex = 485 nm 및 λem = 516 nm). 식 Papp = 1/AC0 * (dQ/dt) (여기서, A는 막의 표면적을 나타내고, C0는 기저측 공여자 구획 중 플루오레세인-β-아밀로이드 (1-42)의 초기 농도이고, dQ/dt는 주어진 기간 내에 정점 수용자 구획에서 나타난 플루오레세인-β-아밀로이드 (1-42)의 양임 (polli))을 사용하여 겉보기 투과도 (Papp) 플루오레세인-β-아밀로이드 (1-42)를 결정하였다. (-)-닐바디핀의 존재하에 플루오레세인-β-아밀로이드 (1-42)의 Papp를 대조군 웰과 비교하고, 백분율로서 표현하였다.
도 13에 나타낸 바와 같이, (-)-닐바디핀은 혈액 뇌 장벽의 시험관내 모델에서 뇌 측면 (B)으로부터 말초 측면 (A)으로의 Aβ의 수송을 용량 의존적으로 자극한다.
시험관내 모델을 또한 사용하여, BBB를 가로지르는 뇌 Aβ의 청소율에 대한 (-)-닐바디핀 대 닐바디핀 라세미 혼합물의 시험관내 효과를 시험하였다. 상기 기재된 것과 유사한 프로토콜을 이 실험에서 사용하였으며, 주요 차이는 비교를 위한 라세미 혼합물의 첨가였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, (-)-닐바디핀 및 닐바디핀 라세미 혼합물 양자 모두는 시험관내 모델에서 뇌 (B)로부터 말초 (A)로 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 Aβ의 수송을 용량 의존적으로 자극한다.
생체내 모델
생체내 모델을 사용하여 BBB를 가로지르는 뇌 Aβ 수준의 청소율에 대한 (-)-닐바디핀의 효과를 시험하였다. 야생형 암컷 B6/SJL 마우스를 3％ 이소플루란/산소 혼합물을 사용하여 흡입을 통해 마취하였다. 마취 하에, 비히클 (DMSO) 또는 (-)-닐바디핀을 복강내로 (i.p.) 마우스에 주사하였다. i.p. 주사후 5분에, 뇌의 심실내 영역 (정수리점에 대한 3 mm 후방 및 1.0 mm 외측, 및 뇌의 표면 아래 4 mm)에서 인간 β-아밀로이드 (1-42) (DMSO 중 1 mM) 3 ㎕를 마우스에 정위고정적으로 주사하였다. 인간 β-아밀로이드 (1-42)의 주사후 10분에 마우스를 마취하였다. 혈장 샘플을 수집하고, 인간 β-아밀로이드 (1-42)에 대한 샌드위치 ELISA를 사용하여 인간 β-아밀로이드 (1-42)에 대해 분석하였다. (-)-닐바디핀 처리된 마우스로부터 수집된 혈장 샘플 중 β-아밀로이드 (1-42)의 수준을 비히클 단독을 투여받은 것과 비교하였다. 또한, (-)-닐바디핀 또는 플라시보의 생분해성 펠렛을 피하로 이식받고 펠렛 이식후 13일에 Aβ1-42의 뇌내 주사를 투여받은 동물을 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 동물을 사용한 모든 실험은 실험동물운영위원회에 의해 승인된 프로토콜 하에 수행하였다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 닐바디핀 라세미 혼합물 및 (-)-닐바디핀 양자 모두는 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 Aβ의 수송을 생체내에서 증가시켰다. 2 mg/체중 kg의 (-)-닐바디핀은 뇌로부터 혈액으로의 Aβ의 청소율을 2배만큼, 5 mg/체중 kg의 투여량에서는 4배만큼 자극한 반면, 닐바디핀 라세미 혼합물은 Aβ의 청소율을 2 mg/체중 kg의 투여량에서 4배만큼 증가시켰다.
도 16은 (-)-닐바디핀 또는 플라시보의 생분해성 펠렛을 피하로 이식받고 펠렛 이식후 13일에 Aβ1-42의 뇌내 주사를 투여받은 동물을 사용한, BBB를 가로지르는 뇌 Aβ 수준의 청소율에 대한 (-)-닐바디핀의 효과를 예시하는 막대 그래프이다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 30 mg/체중 kg/일의 투여량으로 생분해성 펠렛에 의해 보장된 (-)-닐바디핀의 저속 방출은 플라시보 펠렛을 이식받은 대조군 마우스와 비교하여 뇌내 Aβ의 청소율을 3배만큼 증가시켰다.
혈액 뇌 장벽 (BBB)을 가로지르는 뇌 Aβ 수준의 청소율에 대한 (-)-닐바디핀의 효과의 이들 시험관내 및 생체내 연구는 잠재적으로 치료학상-관련된 결과를 나타낸다. 데이터는 청소율에 대한 (-)-닐바디핀의 효과가 BBB를 가로지르는 뇌 Aβ의 이동을 증가시킨다는 것을 제안한다. 이는 (-)-닐바디핀의 투여후 혈청 Aβ 수준의 관찰된 증가로부터 기인한다.
도 17a 및 17b에 나타낸 바와 같이, (-)-닐바디핀은 (+)-닐바디핀과 비교하여 혈관작용 특성을 나타내기 전에 혈관수축의 FPL64176 래트 대동맥 모델에서 훨씬 더 많은 용량으로 투여할 수 있었다.
일반적인 결론
닐바디핀의 상이한 거울상이성질체의 효과에 관하여, 거울상이성질체 양자 모두는 유사한 양상으로 Aβ1-40 생성을 용량 의존적으로 억제하는 것으로 보이나, (+)-닐바디핀 및 라세미 닐바디핀은 저용량에서 Aβ1-42를 약간 자극하였다. Aβ1-42에 대한 (-)-닐바디핀의 효과는 더 낮고 통계적으로 유의하지 않았다. 예를 들어, 도 6 및 7을 참조한다. 또한, 놀랍게도 (+)-닐바디핀이 FPL64176-유도된 혈관수축을 완전히 길항하는 반면, (-)-닐바디핀이 L-유형 칼슘 채널 효능제의 FPL64176-유도된 혈관수축을 길항하지 않는다는 것이 발견되었다. 본원에 제공된 데이터는 (-)-거울상이성질체에 대한 FPL64176으로 시도된 기준선 대동맥 수축을 나타내며, 이는 혈관작용성 (즉, 유도된 혈관수축의 길항작용)을 나타내는 라세미 혼합물 또는 (+)-거울상이성질체와 비교하여 (-)-거울상이성질체에 대한 감소된 혈관작용성과 상관관계가 있다. 뇌 Aβ 수준에 대한 (-)-닐바디핀의 영향의 평가는 (-)-닐바디핀의 투여 (1일마다 10 mg/체중 kg)가 오직 4일 처리 후 TgAPPsw 마우스에서 Aβ1-42의 뇌 수준 (pg/ml)의 26％ 감소 및 Aβ1-40의 뇌 수준의 43％ 감소를 유발한다는 것을 나타내었다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 26일 동안 TgAPPsw 마우스에게 저속 방출 (-)-닐바디핀의 투여는 30 mg/Kg/일 (-)-닐바디핀의 저속 방출 펠렛을 투여받은 마우스의 경우 뇌 Aβ1-42의 수준의 2배 감소를 초래한 반면, 플라시보 펠렛을 이식받은 마우스와 비교하여 56 mg/Kg/일 저속 방출 펠렛으로 처리된 동물에서 Aβ1-42의 2.5배 감소가 관찰되었다.
혈액 뇌 장벽 (BBB)을 가로지르는 뇌 Aβ 수준의 청소율에 대한 (-)-닐바디핀의 효과의 시험관내 및 생체내 연구는 또한 예상치못한 유망한 결과를 생성하였다. 데이터는 이 청소율에 대한 (-)-닐바디핀의 효과가 BBB를 가로지르는 뇌 Aβ의 이동을 증가시킨다는 것을 제안하였다. 이는 (-)-닐바디핀의 투여후 혈청 Aβ 수준의 관찰된 증가로부터 기인한다.
상기 데이터에 관하여, AD와 같은 뇌 아밀로이드형성 질병으로 고통받고 있는 동물 또는 인간으로의 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀 투여가 풍부한 이러한 병리학적 침착물을 특징적으로 나타내는 뇌의 중대한 영역에서 Aβ 침착의 양을 상당히 감소시킬 뿐만 아니라 불필요하게 영향을 미치는 혈압 또는 다른 가능한 부작용 없이 뇌에 이미 침착된 Aβ의 양을 감소시킬 수 있다는 것을 추론할 수 있다. 또한, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀 투여는 AD와 함께 발견되는 광범위한 황폐 뉴런 파괴의 원인이 되는 것으로 여겨지는 Aβ의 신경독성 효과를 방해할 뿐만 아니라, 감소된 부작용으로 AD 환자의 뇌에서 발견되는 특징적 염증 반응을 유발하는 소교세포 활성화를 감소시킬 수 있다. 마지막으로, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀 치료는 원치않는 부작용을 유발하지 않고 AD와 같은 뇌 아밀로이드형성 질병으로 고통받고 있는 동물 또는 인간의 뇌에 이미 침착된 Aβ의 농도를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 방법에서 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 취지 또는 범위를 벗어나지 않고 수행될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로, 본 발명은 첨부된 청구의 범위 내에 포함되는 변형 및 변화 및 이들의 균등물을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 참고로 도입된다.

Claims (14)

  1. 뇌 아밀로이드형성 질병 또는 병태로 고통받고 있는 동물 또는 인간에게 치료상 유효량의 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀을 투여하는 것을 포함하는, 상기 동물 또는 인간에서 Aβ 침착, Aβ 신경독성 및 소교세포증(microgliosis)을 감소시키는 방법.
  2. 외상성 뇌 손상을 앓고 있는 동물 또는 인간에게 치료상 유효량의 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 투여는 급성 두부 손상 후에 시작하는 것인, 상기 동물 또는 인간에서 Aβ 침착, Aβ 신경독성 및 소교세포증으로부터 발생된 뇌 아밀로이드형성 질병 또는 병태의 위험을 감소시키는 방법.
  3. 뇌 아밀로이드형성 질병 또는 병태의 발병 위험이 있는 것으로 진단된 동물 또는 인간에게 치료상 유효량의 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀을 투여하는 것을 포함하는, 상기 동물 또는 인간에서 뇌 아밀로이드형성 질병 또는 병태의 발병 위험을 감소시키는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 뇌 아밀로이드형성 질병 또는 병태가 알츠하이머병, 외상성 뇌 손상 및 뇌 아밀로이드 혈관병증으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 치료상 유효량이 1일당 약 0.05-20 mg, 1일당 약 2-15 mg, 1일당 약 4-12 mg 및 1일당 약 8 mg으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 치료상 유효량이 1일당 16 내지 최대 허용 용량, 16 내지 50, 약 16, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 100, 약 300 및 약 500 mg으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 치료상 유효량이 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀의 투여 후에 치료전 혈압의 약 20％ 미만, 약 10％ 미만, 약 5％ 미만 및 약 1％ 미만으로 이루어진 군에서 선택된 양만큼 혈압을 감소시키며, 이 때 혈압은 연속적인 모니터링 및 곡선하면적에 대해 시간에 따른 적분으로 계산하고, 치료후 혈압은 정상-상태 결과를 달성하기에 충분한 치료 기간 후에 결정하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀을 정상 범위 또는 저혈압 범위의 혈압을 갖는 인간 또는 동물에게 투여하는 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀을 고혈압 범위의 혈압을 갖는 인간 또는 동물에게 투여하는 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 거울상이성질체 풍부율이 약 95％ 초과, 약 98％ 초과 및 약 100％, 검출 한계 이하로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 치료상 유효량의 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀에 의한 치료 지속시간이 동물 또는 인간의 수명 이하, 1시간 내지 5년, 1일 내지 12개월, 1주 내지 6개월, 2주 내지 4주, 2주 내지 3년, 및 6개월 내지 12개월로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀을 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐, 정제, 트로키, 사셰, 로젠지, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 분말, 과립, 용액 및 에멀젼으로 이루어진 군에서 선택된 단위 투여형으로 투여하는 방법.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 비경구, 경구 또는 복강내 투여를 통한 것이고, 임의로 비경구 투여 경로는 정맥내; 근육내; 간질; 동맥내; 피하; 안내; 두개내; 경막내; 심실내; 활액낭내; 경피, 흡입을 통한 폐, 눈, 설하 및 협측을 포함하는 경상피; 눈, 피부, 안구, 직장, 및 임의로 에어로졸, 미립화기 및 연무기로 이루어진 군에서 선택된 취입 또는 연무를 통한 코 흡입을 포함하는 국소 투여로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  14. 뇌 아밀로이드형성 질병 또는 병태로 고통받고 있는 동물 또는 인간에게 본질적으로 치료상 유효량의 거울상이성질체상-풍부한 (-)-닐바디핀 및 제약상 허용되는 담체로 이루어진 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 동물 또는 인간에서 뇌 아밀로이드형성 질병 또는 병태를 치료하는 방법.
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