KR20080070005A - 조건부 불멸화 장기 줄기 세포 및 상기 세포의 제조 및사용 방법 - Google Patents

조건부 불멸화 장기 줄기 세포 및 상기 세포의 제조 및사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20080070005A
KR20080070005A KR1020087011791A KR20087011791A KR20080070005A KR 20080070005 A KR20080070005 A KR 20080070005A KR 1020087011791 A KR1020087011791 A KR 1020087011791A KR 20087011791 A KR20087011791 A KR 20087011791A KR 20080070005 A KR20080070005 A KR 20080070005A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
stem cells
cell
stem
nucleic acid
Prior art date
Application number
KR1020087011791A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101441693B1 (ko
Inventor
존 캠비어
요세프 레파엘리
사라 존슨
브라이언 커티스 터너
Original Assignee
내셔날 쥬이쉬 메디칼 앤드 리서치 센터
더 리젠트스 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 내셔날 쥬이쉬 메디칼 앤드 리서치 센터, 더 리젠트스 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도 filed Critical 내셔날 쥬이쉬 메디칼 앤드 리서치 센터
Publication of KR20080070005A publication Critical patent/KR20080070005A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101441693B1 publication Critical patent/KR101441693B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4738—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclin, CDC, INK-CCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/113—Acidic fibroblast growth factor (aFGF, FGF-1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/48—Regulators of apoptosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Abstract

성체 및 배아 줄기 세포를 비롯한, 줄기 세포의 조건부 불멸화 방법, 상기 방법에 의해 제조된 세포, 상기 세포를 이용하는 실험실 또는 조사 방법, 및 상기 세포를 이용하여 세포 분화 및 발생과 관련된 화합물을 동정하거나 또는 질환을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 급성 골수성 백혈병 (AML)의 마우스 모델 및 상기 마우스 모델과 관련된 세포 및 방법도 기술되어 있다.
급성 골수성 백혈병, 줄기 세포, 조건부 불멸화, 세포 분화

Description

조건부 불멸화 장기 줄기 세포 및 상기 세포의 제조 및 사용 방법{CONDITIONALLY IMMORTALIZED LONG-TERM STEM CELLS AND METHODS OF MAKING AND USING SUCH CELLS}
본 발명은 일반적으로 조건부 불멸화 장기(long term) 줄기 세포, 상기 세포의 제조 방법, 및 상기 세포의 사용 방법, 예컨대 치료 방법 및 약물 발견 방법에 관한 것이다.
각종 혈구의 골수 산출물을 조작하는 능력은 여러 질환의 관리에서의 중요한 도구가 되어 왔다. 혈액 악성 종양의 최상의 새로운 치료제 중 일부는 백혈병 세포를, 형질전환 사건 이전에 결정되는(committed) 계통으로 분화시키는 화합물의 개발에 기초한 것이다. 하나의 상기 예는 급성 전골수구성 백혈병의 경우이다. 환자를 삼산화비소로 치료시, 악성 세포는 골수단핵구 경로를 따라 밀어내어져 이들 종양의 완화를 야기한다. 또다른 예는 방사선 조사된 개체에 이식된 골수 줄기 세포 (장기 재구성 조혈 줄기 세포, 또는 lt-HSC)의 성공적 생착의 촉진에 있다. 분화된 혈구의 출현은 적혈구 발생 (에리스로포이에틴, 또는 Epo), 또는 골수 세포 발생 (과립구-대식구 콜로니 자극 인자, 또는 GM-CSF)을 특이적으로 유도하는 것으로 공지된 사이토카인의 전신 투여에 의해 가속될 수 있다. 마지막으로, 기증자로 부터 lt-HSC를 적출하는 것은 "동원" 과정에 의해 크게 단순화되어 왔고, 여기서 상기 세포는 G-CSF로 불리는 사이토카인의 전신 투여에 의해 이것이 일반적으로 존재하는 골수 부위로부터 말초 혈액으로 이동하도록 유도된다. 그 후, 줄기 세포는 말초 혈액으로부터 적출됨으로써 골수 생검의 고통스럽고 복잡한 수집을 미연에 방지할 수 있다. 상기 과정 모두는 lt-HSC의 생물학적 거동을 프로그래밍하고 조절하는 능력에 의존한다.
따라서, 골수 (줄기 세포) 이식은 방사선 및/또는 화학 요법을 겪은 개체 (예를 들어, 암 환자이거나, 또는 높은 수준의 방사선에 노출됨)의 혈액 및 면역 재구성을 위한 매우 귀중한 치료 도구이고, 또한 면역 결핍 및 혈액 악성 종양의 치료를 위한 필수 양식이다. 또한, 골수 이식은 면역계, 뿐만 아니라 기타 세포 및 조직에 대한 노화의 부정적 효과에 대항하기 위한 매우 유용한 요법이다. 줄기 세포 이식은 해마다 35,000 명 초과의 아이 및 성인에게 이점을 제공할 수 있는 것으로 추산된다.
골수 이식 이면의 작동 원리는 모든 혈구 유형을 발생시키는 방사선 감응성 lt-HSC의 대체이다. 최근 연구는 골수 이식이 심장 질환의 치료에 가치를 가질 수 있음을 나타낸다. 비록 상기 효과의 근거는 공지되어 있지 않지만, 상기 및 기타 발견은, 조혈 줄기 세포 (lt-HSC)가 기타 조직을 발생시키도록 재프로그래밍될 수 있는 가능성을 제기한다. 이것이 사실인 경우, lt-HSC는 훨씬 더 넓은 이용가능성을 가지며 논란이 되는 배아 줄기 세포 치료에 대한 대안을 제공할 수 있다.
골수 이식의 임상적 적용에 맞서는 주요 방해물은 우선 적절하게 조직적합성 인 골수 기증자를 동정하는 것에 있다. 이는 일반적으로 등록된 6 백만 명 초과의 잠재적 기증자를 갖는 등록소의 이용으로 달성된다. 선택된 기증자는 줄기 세포의 혈액으로의 유도된 동원의 힘든 체험을 겪어야 하고, 이어서 희박한 lt-HSC를 단리하기 위한 4 ∼ 5 일의 백혈구 성분 채집술이 실시되어야 한다. 상기 세포의 이식에 이어서 일과성 림프구에 의해 야기된 이식편 대 숙주 반응을 최소화하기 위한 수혜자의 주의 깊은 모니터링 및 치료가 수행되어야 한다.
조혈계 발생에서의 장애의 분자 토대의 설명은, 신호전달 및 다운스트림 반응의 생화학적 분석을 방해하는, 적절한 세포군의 낮은 빈도에 의해 역사적으로 복잡했었다. 사실상, 이는 모든 조혈 연구에 있어서 주요 제한 인자가 되어 왔다. 또한, 장기 조혈 줄기 세포 (LT-HSC)의 제한된 이용가능성도 인간의 다수의 유형의 암 뿐만 아니라 여러 종류의 면역 결핍을 치료하는 데 주요 방해물이 되어 왔다. 본 발명자가 아는 한, lt-HSC와 유사하게 자발적으로 생성되어 시험관내에서 정상 계통으로 분화될 수 있거나, 또는 치명적으로 방사선 조사된 마우스 또는 반-치명적으로 방사선 조사된 인간을 재구성할 수 있는 이용가능한 세포주가 현재 존재하지 않고, 상기 세포주를 고의로 제조하는 어떠한 방법도 기술되어 있지 않다. 더욱이, 상기 세포가 필요시마다 기증자로부터 입수될 필요가 있도록, lt-HSC를 연속적으로 증가시키는 실행가능한 기술도 현재 존재하지 않는다.
또한, 혈액 악성 종양 및 면역 결핍을 치료하기 위한 추가의 양식, 및 이식된 lt-HSC의 생산을 증가시키기 위한 신규한 사이토카인에 대한 절실한 필요성이 존재한다. 또한, 표적 동정 및 약물 발견에 대한 적절한 기반은 현재 존재하지 않 는다. 결핍된 요소는 조혈계에서 상이한 발생 단계를 나타내는 세포주이다. 최선으로, 상기 세포는 특정 계통에서 추가로 분화를 겪는 능력을 보유해야 한다. 상기 세포주는 세포 발생, 증식 및 생존의 조절에 수반되는, 유전자 생성물, 및 이에 따라 새로운 약이 될 수 있는 표적의 동정에 필수적이다. 또한, 상기 세포주는 신규한 약물의 조사에 있어서, 기능 상실 연구를 위한 소 분자 및 shRNA 라이브러리, 뿐만 아니라 기능 획득 연구를 위한 cDNA 라이브러리의 선별에 필수적이다.
이러한 분야에 있어서 현행 약물 발견에 대한 장벽은 하기를 포함한다: (a) 충분한 수의 세포를 특정 발생 단계로부터 단리함; (b) 충분한 시간의 길이 동안 세포를 시험관내에서 증식시킴; 및 (c) 백혈병 세포에 영향을 미칠 수 있으나, 정상 HSC 또는 전구 세포에는 영향을 미치지 않는 약물을 선별하기 위하여 조건부 종양유전자를 이용하는 능력.
따라서, 기증자로부터의 이후 적출 없이, 광범위하게 증가시키고, 동결시키며 필요할 때마다 다시 사용할 수 있는 lt-HSC 세포주를 생성하기 위한 방법에 대한 현저한 필요성이 종래 기술에 존재한다.
발명의 개요
본 발명의 하나의 실시양태는 조건부 불멸화 성체 줄기 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 증가시킨 성체 줄기 세포군을 수득하는 단계; (b) 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원종양유전자 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 상동체를 포함하는 핵산 분자로 상기 줄기 세포를 트랜스펙션하는 단계로서, 여기서 원종양유전자는 유도성인 단계; (c) 세포의 아폽토시스를 억제하는 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 상기 줄기 세포를 트랜스펙션하는 단계; 및 (d) 원종양유전자가 활성화 되는 조건 하에 줄기 세포 성장 인자의 조합물의 존재 하에 상기 트랜스펙션된 세포를 증가시켜 조건부 불멸화 성체 줄기 세포를 제조하는 단계. 상기 실시양태의 하나의 측면에서, (b) 및/또는 (c)의 핵산 분자는 통합 벡터에 포함된다. 하나의 측면에서, (b) 및/또는 (c)의 핵산 분자는 하기 중에서 선택되는 바이러스 또는 바이러스 벡터의 이용으로 세포에 트랜스펙션된다: 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 파르보바이러스, 우두 바이러스, 코로나바이러스, 칼리시바이러스, 유두종 바이러스, 플라비바이러스, 오르소믹소바이러스, 토가바이러스, 피코르나바이러스, 아데노바이러스 벡터, 변형 및 약독화된 헤르페스바이러스. 하나의 측면에서, (b) 및/또는 (c)의 핵산 분자는 직접적인 전기천공의 이용으로 세포에 트랜스펙션된다. 하나의 측면에서, 핵산 분자 또는 (b) 및/또는 (c)는 약물 감응성 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터에 포함된다. 하나의 측면에서, 핵산 분자 또는 (b) 및/또는 (c)는 (b) 또는 (c)의 핵산 분자에 측접한 재조합 효소에 대한 인식 기질 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터에 포함된다.
하나의 측면에서, 상기 실시양태는 하기 추가의 단계를 포함한다: (e) 원종양유전자가 활성화되는 (d)의 조건을 제거하는 단계; 및 (f) 세포의 분화를 유도하는 성장 인자를 포함하는 배지 중 (e)의 세포를 배양하는 단계. 상기 방법은 하기 단계를 더 포함할 수 있다: (g) (f)의 세포에, 원종양유전자가 활성화되는 (d)의 조건을 추가하여 세포 분화의 중간 단계에 있는 조건부 불멸화 세포를 제조하는 단계.
본 발명의 또다른 실시양태는 하기 단계를 포함하는, 조건부 불멸화 성체 줄기 세포의 제조 방법에 관한 것이다: (a) 증가시킨 성체 줄기 세포군을 수득하는 단계; (b) (1) 줄기 세포 성장 인자의 조합물; (2) 제 1 Tat-융합 단백질 (여기서, Tat는 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원종양유전자 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 상동체에 의해 코딩되는 단백질에 융합됨); 및 (3) 제 2 Tat-융합 단백질 (여기서, Tat는 줄기 세포의 아폽토시스를 억제하는 단백질에 융합됨)의 존재 하에 줄기 세포를 배양하는 단계.
본 발명의 더욱 또다른 실시양태는 하기 단계를 포함하는, 조건부 불멸화 배아 줄기 세포의 제조 방법에 관한 것이다: (a) 증가시킨 배아 줄기 세포군을 수득하는 단계; (b) 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원종양유전자 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 상동체를 포함하는 핵산 분자로 상기 줄기 세포를 트랜스펙션하는 단계; (c) 세포의 아폽토시스를 억제하는 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 상기 줄기 세포를 트랜스펙션하는 단계; 및 (d) 원종양유전자가 활성화되는 조건 하에 줄기 세포 성장 인자의 조합물의 존재 하에 상기 트랜스펙션된 세포를 증가시켜, 조건부 불멸화 배아 줄기 세포를 제조하는 단계.
본 발명의 또다른 실시양태는 하기 단계를 포함하는, 조건부 불멸화 줄기 세포의 제조 방법에 관한 것이다: (a) 증가시킨 줄기 세포군을 수득하는 단계; (b) (1) 줄기 세포 성장 인자의 조합물; (2) 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원종양유전자 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 상동체에 의해 코딩되는 단백질; 및; (3) 줄기 세포에서의 아폽토시스를 억제는 단백질의 존재 하에 줄기 세포를 배양하는 단계. (2) 및 (3)의 단백질은 임의의 적절한 전달 시스템, 비제한적인 예로서, Tat 융합, 압타머 (aptamer) 기술, 또는 CHARIOT™ 기술의 이용으로 줄기 세포에 전달된다.
본 발명의 더욱 또다른 실시양태는 하기 단계를 포함하는, 조건부 불멸화 줄기 세포의 제조 방법에 관한 것이다: (a) 증가시킨 줄기 세포군을 수득하는 단계; (b) 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원종양유전자 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 상동체에 의해 코딩되는 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 세포에 전달하는 단계로서, 여기서 원종양유전자는 유도성인 단계; (c) 세포의 아폽토시스를 억제하는 단백질, 세포의 아폽토시스를 억제하는 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 또는 세포 중 프로아폽토시스 (proapoptotic) 단백질을 억제하는 핵산 분자 또는 단백질을 세포에 전달함으로써 줄기 세포에서의 아폽토시스를 억제하는 단계; 및 (d) 원종양유전자가 활성화되는 조건 하에 줄기 세포 성장 인자의 조합물의 존재 하에 세포를 증가시켜, 조건부 불멸화 성체 줄기 세포를 제조하는 단계.
상기 기술한 실시양태 중 임의의 것에서, 원종양유전자는 MYC-ER 및 ICN-1-ER 중에서 선택될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 상기 기술한 실시양태 중 임의의 것에서, 아폽토시스를 억제하는 단백질은 아폽토시스을 억제하는 Bcl-2 패밀리의 구성원, 예컨대 Bcl-2, Bcl-X, Bcl-w, BclXL, Mcl-1, Dad-1, 또는 hTERT 중에서 선택될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 원종양유전자가 MYC-ER 또는 ICN-1-ER인 경우, 원종양유전자가 활성화되는 조건은 타목시펜 또는 이의 아고니스트의 존재를 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 세포는 (단백질로서) MYC-ER 및 Bcl-2; MYC-ER 및 hTERT; ICN-1-ER 및 Bcl-2; ICN-1-ER 및 hTERT; 또는 MYC-ER 및 ICN-1-ER로 트랜스펙션되거나 전달된다.
상기 기술한 실시양태 중 임의의 것에서, 증가 단계는 (1) 인터루킨-6 (IL-6), IL-3 및 줄기 세포 인자 (SCF); (2) 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), 인슐린 유사 성장 인자 2 (IGF-2) 및 섬유아세포 성장 인자 1 (FGF-1)을 포함하는 무혈청 배지를 포함하나 이에 국한되지는 않는 배지 중에서 수행될 수 있다:
상기 기술한 실시양태 중 임의의 것에서, 성체 줄기 세포의 비제한적인 예로서 하기를 들 수 있다: 조혈 줄기 세포, 장 줄기 세포, 골모 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 심근 세포 전구 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 골격근 줄기 세포, 및 간 줄기 세포. 하나의 측면에서, 중간엽 줄기 세포는 폐 중간엽 줄기 세포 및 골수 간질 세포 중에서 선택된다. 하나의 측면에서, 상피 줄기 세포는 폐 상피 줄기 세포, 심장 상피 줄기 세포, 혈관 상피 줄기 세포 및 장 상피 줄기 세포로 이루어진 군 중에서 선택된다. 하나의 측면에서, 피부 줄기 세포는 표피 줄기 세포 및 소포 줄기 세포 (모낭 줄기 세포)로 이루어진 군 중에서 선택된다. 하나의 측면에서, 신경 세포는 뉴런 도파민성 줄기 세포 및 운동 뉴런 줄기 세포 중에서 선택된다. 하나의 측면에서, 줄기 세포는 새로운 또는 냉동보존된 제대혈이다. 하나의 측면에서, 줄기 세포는 정상 또는 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)로 처리된 환자의 말초혈로부터 얻어진 조혈 전구 세포가다.
상기 기술한 실시양태 중 임의의 것에서, 상기 방법은 줄기 세포를 유전자 변형하여 세포에서의 유전적 결함을 보정하고, 줄기 세포를 유전자 변형하여 유전자의 발현을 침묵시키고/거나 줄기 세포를 유전자 변형하여 유전자를 과발현시키는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 기술한 실시양태 중 임의의 것에서, 상기 방법은 세포를 저장하는 것을 더 포함할 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 방법은 세포를 저장으로부터 재생시키고 세포를 배양하는 것을 더 포함한다.
본 발명의 또다른 실시양태는 상기 또는 본원의 다른 곳에 기술된 임의의 방법에 의해 제조된 세포에 관한 것이다.
본 발명의 더욱 또다른 실시양태는 하기 단계를 포함하는, 성체 줄기 세포, 또는 그로부터 분화된 세포를 개체에게 제공하는 방법에 관한 것이다: (a) 상기 또는 본원의 다른 곳에 기술된 임의의 방법에 의해 제조된 조건부 불멸화 성체 줄기 세포의 공급원을 제공하는 단계; (b) (a)의 줄기 세포가 조건부 불멸화되는 조건을 제거하는 단계; 및 (c) 줄기 세포 또는 그로부터 분화된 세포를 개체에게 투여하는 단계. 하나의 측면에서, 세포는 (c)에서 개체로부터 미리 얻어진 것이었다. 하나의 측면에서, 세포는 상기 세포의 미리 동결된 저장물로부터 얻어진다. 하나의 측면에서, 세포는 개체로부터 새롭게 얻어지고 상기 또는 본원의 다른 곳에 기술된 임의의 방법에 의해 조건부 불멸화된다. 하나의 측면에서, 개체는 암을 갖는다. 또다른 측면에서, 개체는 백혈병을 갖는다. 또다른 측면에서, 개체는 면역 결핍 장애를 갖는다. 또다른 측면에서, 개체는 빈혈 장애를 갖는다. 또다른 측면에서, 개체는 재건 수술을 받는다. 또다른 측면에서, 개체는 선택적인 미용 수술을 받는다. 또다른 측면에서, 개체는 이식 수술을 받는다. 하나의 측면에서, 개체는 하기 중에서 선택되는 줄기 세포, 또는 그로부터 분화된 세포를 필요로 한다: 조혈 줄기 세포, 장 줄기 세포, 골모 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 심근 세포 전구 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 골격근 줄기 세포, 및 간 줄기 세포. 또다른 측면에서, 개체는 개선된 면역 세포 기능을 필요로 한다. 또다른 측면에서, 개체는 줄기 세포에 의해 보정되는 유전적 결함을 갖는다.
본 발명의 더욱 또다른 실시양태는 하기 단계를 포함하는, 계통 결정 및/또는 세포 분화 및 발생을 조절하는 화합물의 동정 방법에 관한 것이다: (a) 상기 또는 본원의 다른 곳에 기술된 임의의 방법에 의해 제조된 성체 줄기 세포를 접촉시키는 단계; 및 (b) 화합물의 부재 하의 줄기 세포와 비교시, (a)의 줄기 세포에서의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 검출하는 단계로서, 여기서 화합물의 존재 하에 특징에서의 차이의 검출은 화합물이 줄기 세포에서의 특징에 영향을 미침을 나타내는 단계.
본 발명의 또다른 실시양태는, 상기 또는 본원의 다른 곳에 기술된 임의의 방법에 의해 제조된 성체 줄기 세포, 또는 그로부터 분화된 세포를 평가하여, 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 검출하는 것을 포함하는, 계통 결정 및/또는 세포 분화 및 발생의 연구 방법에 관한 것이다.
본 발명의 더욱 또다른 실시양태는 줄기 세포의 이식이 유용한 상태 또는 질환의 치료를 위한 약제에서의 상기 또는 본원의 다른 곳에 기술된 임의의 방법에 의해 제조된 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제공된 마우스를 포함하는, 급성 골수성 백혈병 (AML)의 마우스 모델에 관한 것이다; (a) 마우스에 치명적인 방사선 조사를 실시하는 단계; (b) 상기 또는 본원의 다른 곳에 기술된 임의의 방법에 의해 제조된 조건부 불멸화 장기 줄기 세포 및 Rag-/- 마우스로부터의 전 골수 세포를 상기 마우스에게 전달하는 단계; 및 (c) 마우스가 AML의 임상 징후를 나타낼 때까지 상기 마우스에게 타목시펜 또는 이의 아고니스트의 주기적 투여량을 주사하는 단계. 하나의 측면에서, 세포는 (단백질로서) MYC-ER 및 Bcl-2로 트랜스펙션되거나 전달된다.
본 발명의 또다른 실시양태는 상기 기술한 AML의 마우스 모델로부터 얻어진 종양 세포에 관한 것이다.
본 발명의 더욱 또다른 실시양태는 AML의 진단, 연구, 또는 치료에 사용하기 위한 화합물을 동정, 개발, 및/또는 시험하기 위한; 또는 AML의 진단, 연구, 또는 치료에 사용하기 위한 표적을 동정, 개발, 및/또는 시험하기 위한, 인간 단백질에 특이적인 약물 후보의 임상전 시험을 위한 AML의 마우스 모델의 용도에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 형질도입된 세포의 골수 이식 및 생체내, 4OHT에 의한 MYC 기능의 활성화 이후 사망률 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 2는 시험관내 형질도입 이후, 어린 마우스 및 노령 마우스 유래의 HSC의 산포 특징 및 GFP 발현 수준을 도시하는 산포도이다. 점 플롯은 IL-3, IL-6 및 SCF를 갖는 배양물 중 3 일 이후 HSC의 전방 (FSC) 및 측면 (SSC) 산포 특징에 대한 흐름 세포측정 데이터를 나타낸다. 상기 2 가지 기준은 세포 크기 (FSC) 및 입도 (SSC)와 상호관련된다.
도 3은 노령 (>60% ID 레퍼토리) 및 어린 3-83 μδ트랜스제닉 마우스로부터의 BCL-2, MYC-ER 및 EGFP-형질도입된 조혈 줄기 세포를 이용하여 재구성된 방사선 조사된 수용자 유래의 세포주의 표현형 비교를 도시하는 산포도이다. 배양의 개시 이후 대표적 클론 3개 (어린) 및 3개 (노령)의 표현형이 도시되어 있다.
도 4는 타목시펜의 투여 중지 이후 시험관내 노령 LT-HSC 주 (ABM46)의 자발적 분화를 도시하는 산포도이다 (줄기 세포 및 B 계통 마커 발현이 흐름 세포측정에 의해 분석됨).
도 5는 방사선 조사된 어린 수용자에 대한 입양 전달 이후 6 주째 LT-HSC 주 유래의 조혈 세포 구획의 분석을 도시하는 산포도이다. 3 마리의 마우스로부터의 데이터가 상기 도면에 제공되어 있고, 여기서 한 마리의 마우스는 노령 HSC 주 ABM42를 투여받고, 2 마리의 마우스는 노령 HSC 주 ABM46을 투여받았다.
도 6은 B-세포 구획의 발생이 ABM42 및 ABM46 세포주로 재구성된 마우스에서 손상됨을 도시하는 산포도이다. 3 마리의 마우스로부터의 데이터가 상기 도면에 제공되어 있고, 여기서 한 마리의 마우스는 노령 HSC 주 ABM42를 투여받고, 2 마리의 마우스는 노령 HSC 주 ABM46을 투여받았다.
도 7은 ABM42 및 ABM46 세포주로 재구성된 마우스에서의 T-세포 발생을 도시하는 산포도이다. 3 마리의 마우스로부터의 데이터가 상기 도면에 제공되어 있고, 여기서 한 마리의 마우스는 노령 HSC 주 ABM42를 투여받고, 2 마리의 마우스는 노령 HSC 주 ABM46을 투여받았다.
도 8은 레트로바이러스에 의해 BCL-2 및 MYC-ER로 형질도입되고 연속 시험관내 배양물 중 >90 일 동안 유지된 어린 C57/BL6 마우스로부터 얻어진 HSC 유래의 세포주의 표현형 비교를 도시하는 산포도 및 그래프이다. 패널은 바이러스 발현 마커 (GFP 및 Thy1.1)의 발현, 뿐만 아니라 마우스에서의 장기 HSC를 한정하기 위해 필요한 4 가지 마커 Sca-1, c-kit, CD34 및 Flk-2의 발현에 대한 흐름 세포측정 분석 결과를 나타낸다. 4개의 세포주는 lt-HSC의 표현형 (Sca-1+, c-kit+, CD34-, flk-2-)을 보유한 하위 집단을 포함하였다.
도 9는 레트로바이러스에 의해 종양유전자의 상이한 조합물로 형질도입되고 연속 시험관내 배양물 중 >90 일 동안 유지된 어린 C57/BL6 마우스로부터 얻어진 HSC 유래의 세포주의 표현형 비교를 도시하는 산포도 및 그래프이다 (pMIG-MYC 및 pMIT-Bcl-2 (상부 패널), pMIG-MYC.ER 및 pMIG-hTERT (중간 패널), 또는 pMIG-ICN.1.ER 및 pMIT-Bcl-2 (하부 패널)).
도 10은 레트로바이러스에 의해 종양유전자의 상이한 조합물로 형질도입되고 연속 시험관내 배양물 중 >90 일 동안 유지된 어린 C57/BL6 마우스로부터 얻어진 HSC 유래의 세포주의 표현형 비교를 도시하는 산포도 및 그래프이다 (pMIG-ICN.1.ER 및 pMIT-Bcl-2 (상부 패널), pMIG-ICN.1 및 pMIT-Bcl-2 (두번째 열의 패널), 또는 pMIG-ICN.1 및 pMIG-Bcl-2 (세번째 열의 패널), 또는 pMIG-hTERT 및 pMIT-Bcl-2 (하부 패널)).
도 11은 레트로바이러스에 의해 종양유전자의 상이한 조합물로 형질도입되고 연속 시험관내 배양물 중 >90 일 동안 유지된 어린 C57/BL6 마우스로부터 얻어진 HSC 유래의 세포주의 표현형 비교를 도시하는 산포도 및 그래프이다 (pMIG-MYC 및 pMIG-ICN.1 (상부 패널), pMIG-MYC.ER 및 pMIG-ICN.1 (중간 패널), 또는 pMIG-ICN.1.ER 및 pMIG-MYC (하부 패널)).
도 12는 레트로바이러스에 의해 종양유전자의 상이한 조합물로 형질도입되고 연속 시험관내 배양물 중 >90 일 동안 유지된 어린 C57/BL6 마우스로부터 얻어진 HSC 유래의 세포주로부터의 T 세포 및 B 세포 구획의 생체내 재구성을 도시하는 산포도이다.
도 13은 이식 이전에 본 발명의 조건부 불멸화 장기 줄기 세포로부터의 재조합 DNA의 절제를 보장하기 위한 재조합 효소에 대한 인식 기질 서열 (RSS)의 이용을 도시하는 개략도이다.
도 14는 본 발명의 조건부 불멸화 장기 줄기 세포로부터 분화된 NK 및 적혈구 계통의 세포의 검출을 도시하는 그래프이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 장기 줄기 세포, 및 특히, 장기 조혈 줄기 세포 (lt-HSC) 유래의 안정한 세포주를 생성하고, 적절한 조건 하에 놓이는 경우 상기 세포로부터 일반적으로 발생하는 모든 세포 계통을 발생시킬 수 있는 세포주를 생성하고, 유지하며 조작할 수 있는 문제점에 대한 해결책을 제공한다. 본 발명은 일반적으로 조건부 불멸화, 장기 줄기 세포의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 줄기 세포, 및 상기 줄기 세포의 사용 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 장기 조혈 줄기 세포를 대표적 줄기 세포군으로서 사용하여, 본 발명자는 조건부 불멸화된 (예를 들어, 가역적으로 불멸화되거나 또는 상기 조건이 제거되는 경우 되돌아갈 수 있는 명시된 조건 하에 불멸화된) 줄기 세포를 제조하는 강력한 방법을 확립하였고, 상기 줄기 세포는 시험관내 및 생체내에서 정상 세포 계통으로 분화가능하고, 상기 세포를 필요로 하는 대상체를 재구성할 수 있다. 실제로, 본 발명은 골수 기증자에 대한 필요성을 제거할 수 있는데, 왜냐하면 본 발명은 시술 (예를 들어, 화학 요법, 방사선 등) 이전에 환자로부터 줄기 세포를 적출하고, 상기 세포를 증가시키며, 이를 환자에게 반환하는 능력을 제공하기 때문이다. 더욱이, 상기 줄기 세포를 광범위하게 증가시키고, 저장하며 (예를 들어, 냉동됨), 그 후 재생시켜서 다시 증가시키고, 조작하고/거나 필요시 또는 요구시 반복 사용할 수 있다. 상기 줄기 세포는 조작되어, 예를 들어, 유전적 결함을 보정하거나 또는 대상체에게 이점 (치료 또는 예방)을 제공하거나, 또는 소정의 세포 유형으로 분화될 수 있다. 마지막으로, 상기 세포는 세포 발생, 증식 및 생존의 조절에 수반되는 새로운 표적의 동정을 위한 각종 어세이, 및 세포 발생, 증식 및/또는 생존의 조절로부터 이점을 얻는 질환 및 상태를 개선하거나 치료하는 데 유용한 약물의 동정 및 개발에 이용될 수 있다.
본 발명자는, 본원에서 장기 조혈 줄기 세포 (lt-HSC)에 의해 대표되는, 장기 줄기 세포의 조건부 불멸화를 가능하게 하는 신규한 기술을 개발하였다. 생성되는 세포주는 시험관내에서 무한정하게 기하급수적으로 증가(전파)되고/거나 냉동보존(저장)될 수 있고, 치사적으로 방사선 조사된 마우스를 구조하고 상기 동물 내의 모든 혈구 계통을 재구성하는 능력을 갖는다. 더욱이, 본 발명자는 종양유전자를 형질전환하는 기능을 없앰으로써 시험관내에서 분화된 혈구를 생성할 수 있었다. 본원에 기술된 상기 세포 및 이의 제조 방법은 어떠한 재조합 DNA도 보유하지 않는 이식가능한 인간 줄기 세포의 생성을 가능하게 하여, 이에 따라 수혜자에게 어떠한 장기적 위험도 부과하지 않는다. 본 발명의 상기 조건부 불멸화 lt-HSC는 확립된 이의 성숙한 표현형 및 세포주로 안정화될 수 있고, 여기서 성숙한 표현형은 종양유전자의 재활성화 이후 보존된다. 예를 들어, 본 발명자는 CD4+ αβ+ T 세포, 뿐만 아니라 가지 세포주를 발생시킬 수 있었다.
임상 환경에 적용시, 상기 기술은 골수 이식에 비하여 하기 이점을 갖는다:
1. 클론을 확립하기 위하여 매우 적은 lt-HSC가 요구됨;
2. 클론은 무기한 저장되고 신속히 이용될 수 있는 재생가능한 자원을 나타냄;
3. 상기 치료의 가격은 통상의 골수 이식보다 훨씬 더 저렴함;
4. lt-HSC의 사용은 이식편 대 숙주 질환의 위협, 및 관련 비용을 덜어줄 것임;
5. 상기 기술은, 적어도 일부 경우, 골수 기증자에 대한 필요성을 덜어줄 수 있음.
또한, 본 발명은 분화된 계통을 나타내는 세포 (예를 들어, 중간 발생 단계의 조혈계를 비롯한, 분화된 조혈계)를 생성하기 위한, 조건부 형질전환된 장기 줄기 세포, 예컨대 lt-HSC 세포의 용도를 제공한다. 예를 들어, 수많은 치료 및 예방 용도에 추가하여, 상기 세포주는 악성 세포의 분화를 유도하고, 이의 성장을 저지하거나, 또는 아폽토시스를 유도할 수 있는 신규한 화합물의 동정을 가능하게 한다. 상기 세포는 또한 특정 경로로 줄기 세포의 분화를 유도하는 신규한 사이토카인 및 성장 인자의 선별을 가능하게 한다. 상기 세포주는 단순히 존재하는 것이 아니라 약물 발견에 필수적인 것이다.
더 구체적으로, 성체 유래의 줄기 세포 (비록 본 발명이, 하기 기술되는 바와 같이, 성체 유래의 줄기 세포에 국한되는 것은 아니나)의 장기 군의 제공 및 사용에 관한 종래 기술의 제약을 극복하기 위한 노력으로, 본 발명자는 초기 조혈 줄기 세포 전구 세포를 나타내는 조건부 형질전환된 세포주의 신규한 제조 방법을 개발하여 왔다. 본원에 설명되고 예시된 기술의 구체적, 비제한적인 예에서, 상기 전략은 5-플루오로우라실 (5-FU)-처리된 3-83μδ 마우스로부터의 골수 줄기 세포의 트랜스펙션 (예를 들어, 레트로바이러스 형질도입에 의해)을 수반하였다. 본 발명자는 Bcl-2를 코딩하는 삽입체 및 녹색 형광 단백질 (GFP) (리포터 유전자로서)을 갖는 pMSCV 비시스트로닉 (bisistronic) 레트로바이러스 벡터, 및 MYC-ER 및 GFP (역시 리포터 유전자로서)를 이용하였다. MYC는 림프구에서의 사이토카인 유래의 생존 및 증식 신호를 대신하는 이의 능력으로 인하여 선택되었다. 표적 세포를 제한함으로써, 본 발명자는 줄기 세포 종양이 형성될 것으로 가정하였다. 중요하게는, MYC-ER 기능은 이의 환경에서 타목시펜 의존적이어서, 타목시펜을 동물 또는 배양물로부터 투여 중지함으로써 MYC 기능 및 형질전환의 종결을 가능하게 한다. MYC-ER에 의해 형질도입된 세포에 있어서, 융합 단백질이 생성되나, 타목시펜에 노출될 때까지 세포질 중 보유되지 않는다. Bcl-2는, MYC 신호에 대한 노출의 결과로서 및 더 구체적으로는, MYC가 세포로부터 타목시펜의 투여 중지에 의해 "불활성화" 또는 제거된 경우 일반적으로 발생하는 세포의 아폽토시스를 억제하는 능력으로 인하여 선택되었다. 유전자 유형의 상기 신규한 조합물 (즉, 본 발명은, 하기 더 상세히 기술되는 바와 같이, 이들 특정 유전자에 국한되지 않음)은 본 발명에 따른 조건부 불멸화 줄기 세포의 성공적 제조에 대한 부분적인 원인이 되고, 하기 상세히 기술되는 바와 같이, 유전자의 기타 유사한 조합물에 용이하게 확대될 수 있다.
상기 기술한 형질도입된 줄기 세포의 수혜자는 종양을 생성하였고 (4OHT의 존재 하에), 골수, 비장 및 림프절로부터의 종양 세포가 적출되어 타목시펜 및 줄기 세포 성장 인자 칵테일을 갖는 배양물에 위치되었다. 본 발명자는, 줄기 세포 성장 인자의 적절한 조합물의 부해 하에, 본 방법에 의해 생성된 줄기 세포가 성장을 멈추고 짧은 기간 내에 사멸할 것임을 발견하였다. 따라서, 세포를 상기 기술한 유전자의 조합물로 트랜스펙션한 이후의 줄기 세포 성장 인자 "칵테일" (즉, 줄기 세포에 대해 적절하거나 적합한 성장 인자의 조합물의 사용)의 사용은 본 발명의 방법의 두번째 중요한 측면이다. 줄기 세포의 성장을 촉진하거나 유지하는 일반적 특징을 갖는 상기 칵테일은 성장 인자의 특정 조합물에 국한되지 않으며, 상기 인자의 선택에 대한 파라미터는 하기 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 줄기 세포는 배양물 중에서 증가시킬 수 있고, 예를 들어, Sca1에 대하여 균일하게 양성이고, 엔도글린 및 ckit에 대하여 양성이며, CD34, Flt3, B220, CD19 및 mIgM에 대하여 음성이었고, 이는 종래 기술에서 잘 특징지어진, lt-HSC의 표현형을 나타내는 것이다. 상기 세포는 동결되고 (냉동보존되거나, 또는 저장됨), 그 후 용이하게 회수되며 동결 이후 배양될 수 있었다. 중요하게는, 회수된 세포는 표현형에 있어서 균일하였고 lt-HSC의 표현형을 나타내었다 (예를 들어, 다시, 균일한 GFP 밝기의 세포는 Sca1, 엔도글린 및 ckit에 대하여 양성이고, CD34, Flt3, B220, CD19 및 mIgM에 대하여 음성이었다). 상기 표현형은 마우스에서의 모든 장기 재구성을 제공하는 장기 재증식성 다능성 줄기 세포의 공개된 특징에 완벽하게 부합된다 (Reya 등, 2003, Nature 423:409-14).
본 발명자는 상기 방법을 더 개발하여 이는 시험관내에서 완벽하게 수행될 수 있었다 (즉, 초기 절차는 상기 기술한 바와 같이 부분적으로 생체내에서 수행되었다). 본 발명자는 또한 상기 기술한 것과 유사한 특징을 갖는 유전자의 기타 조합물도 lt-HSC의 조건부 불멸화를 야기할 것임을 입증하였다. 더욱이, 세포주는 타목시펜을 제거하고 적절한 성장 인자를 제공함으로써 시험관내에서 조혈계로 분화될 수 있고, 타목시펜이 투여 중지된 수혜자 동물 내에서 모든 조혈계로 생체내 분화될 것이다. 또한, 세포는 안정된 표현형을 갖는 중간 발생 수준으로 분화될 수 있고, 적절한 신호 (상기 기술됨)의 적용 또는 제거시 이의 결정된 경로를 따라 더 분화되는 능력을 보유한다. 상기 세포는 각종 치료 용도에 매우 귀중하다. 상기 실험 모두는 하기 및 실시예에 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 방법 및 세포주는 각종 세포 계통에 대한 성체 줄기 세포의 결정과 관련된 분자, 생화학, 및 세포 사건을 상세히 연구하고 줄기 세포의 각종 세포 계통으로의 분화 및 발생을 연구할 유일한 능력을 제공할 뿐만 아니라, 유일한 치료 및 약물 발견 도구도 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 줄기 세포주는 각종 이식, 치료 및 예방 전략, 예컨대 암, 및 특히 방사선에 의해 치료되는 암의 치료에 사용하기 위한 증가가능한 줄기 세포의 유일한 공급원을 제공한다. 백혈병의 현행 치료에 있어서, 예를 들어, 골수 기증자에 대한 제한된 접근 및 상기 기증자로부터의 줄기 세포의 한정된 공급은 방사선 치료 이후의 환자의 재구성을 위한 선택을 심각하게 제한한다. 본 발명은 저장되고 필요에 따라 회수될 수 있는 자가조직 줄기 세포 또는 조직적합성 줄기 세포의 연속적으로 증가가능하고 재생가능한 공급물을 생성하는 수단을 제공함으로써 상기 문제를 해결한다. 상기 기술은 궁극적으로 골수 기증자에 대한 필요성을 완전히 제거할 수 있었다. 또한, 각종 면역 결핍 장애 및 빈혈 장애 (예를 들어, 재생불량성 빈혈 또는 용혈성 빈혈)는 또한 상기 기술로부터 크게 이익을 얻을 것인데, 왜냐하면 본 발명은 개체에 의해 필요시 개체에게 조혈 세포를 재증식시키는 능력을 제공하기 때문이다. 더욱이, 노화 과정은 조혈 구획에서의 몇몇 중요한 변화, 예컨대 특히 생산적 면역 반응을 착수할 수 없는 것이 증가되는 것과 관련된다. 노령 마우스로부터의 조혈 줄기 세포는 DNA-복구 문제를 위해 더 높은 수준의 mRNA를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이는 궁극적으로 골수 사이토카인에 반응하여 자가 재생하고, 분화를 겪고, 증식을 겪으며 생존하는 이의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 노화되는 개체는, 건강한 조혈 세포의 연속적 공급물이 제공되어 상기 결핍을 보정하거나 개선할 수 있다는 점에서, 본 발명으로부터 이익을 얻을 수 있다.
본 발명의 기술은 골수 줄기 세포에 국한되지 않고, 실질적으로 임의의 유형의 줄기 세포에 적용될 수 있고, 성체 유래의 세포를 넘어서 배아 줄기 세포까지 확장될 수 있다.
하나의 예에서, 본 발명의 또다른 용도는 연속적으로 증가가능하고 재생가능한 모낭 줄기 세포의 생성에 관한 것이다. 상기 계통으로부터의 조건부 불멸화 줄기 세포의 발생은 화상 피해자, 화학 요법 및/또는 방사선 요법을 받아서 모발 성장의 비가역적 상실이 초래된 임의의 개체, 뿐만 아니라 두개골에 영향을 미치는 임의의 수술 절차 이후의 환자에 대한 재건 수술의 문맥에서 이용될 수 있다. 더욱이, 상기 세포는 유전형 대머리에 의해 영향을 받은 개체에서의 모발 성장의 유도를 수반하는 예정 수술에 이용될 수 있다. 유사하게, 본 발명을 피부의 줄기 세포에 적용하는 것은 상처 치유 및 화상 피해자의 치료, 뿐만 아니라 외상 및 기타 환자에 대한 성형 재건 수술, 뿐만 아니라, 예정 수술, 비제한적인 예로서, 미용 수술에 사용하기에 매우 가치있다. 상기 세포는 추가로 유전자 조작되어 어린 개체 및 노령 개체에서의 선천적 또는 후천적 유전적 결함을 보정할 수 있다. 당업자는 상기 개시 내용에 기초하여 각종 기타 줄기 세포군, 비제한적인 예로서, 몇몇을 들면, 폐, 심장, 및 장 상피 유래의 줄기 세포 및 신경 및 심장 조직 유래의 줄기 세포에 대한 본 발명의 이용으로부터 이점이 얻어질 수 있다는 점을 이해할 것이다. 기타 줄기 세포 유형이 본원의 다른 곳에 언급되어 있다.
또한, 본 발명은 개체의 일생에 걸쳐 필요시 개체로 하여금 자가조직 줄기 세포 및 그로부터 분화된 세포의 증가가능한 공급물에 대하여 접근하게 하는 유일한 기회를 제공한다. 예를 들어, 신체가 노화됨에 따라, 면역 기능 및 면역 기억은 퇴화하는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 본 발명에 의해 제공된 기술의 이용으로 개체를 조혈계의 모든 세포로 분화될 수 있는 새로운, 자가조직 줄기 세포로 재증식시켜, 이에 따라 노령 개체에게 "어린" 면역계를 제공하는 것이 가능하다. 또한, 본 방법에 의해 생성된 줄기 세포는 저장되어 개체의 일생 동안 필요시에 (예를 들어, 개체에게 암 또는 면역 결핍 질환이 발생되거나 또는 개체가 실질적으로 임의의 유형의 새롭게 생성된, 자가조직 세포에 대한 필요성을 갖는 경우) 치료 프로토콜의 일부로서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 유전자 치료를 위한 유일한 기회를 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 방법의 이용에 의해 조건부 불멸화되고 증가된 개체로부터 얻어진 자가조직 줄기 세포를 조작함으로써 유전적 결함은 이제 보정될 수 있거나 또는 이로운 유전자 변형이 체세포에 도입될 수 있다. 그 후, 줄기 세포는 이것이 얻어진 개체로 재도입될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 줄기 세포는 또한 각종 약물 발견 어세이에도 이용될 수 있다. 용이하게 저장되고, 회수되고, 증가되며 조작될 수 있는 균질한 줄기 세포의 실질적으로 비제한적인 공급물을 이제 제조할 수 있으므로, 상기 줄기 세포는 줄기 세포로서 이용될 수 있거나 또는 각종 세포 계통으로 분화되어 세포 분화, 유전자 발현, 및 세포 과정에 영향을 미치는 각종 화합물의 시험을 위한 어세이에 이용될 수 있다. 세포는, 예컨대 유전자 조작에 의해, 화합물과 접촉되기 이전에 조작될 수 있다. 유전적 결함을 갖는 개체로부터의 줄기 세포가 상기 어세이로 평가되어 치료 화합물 (예를 들어, 암 치료제)을 동정하고 유전자 교환 치료를 평가할 수 있다. 실제로, 본 발명의 기술은 특정 개체의 세포를 표적하여 개체의 세포에 "맞추어진" 약물 후보 및 치료 후보 및 전략을 동정하는 기회를 제공한다. 상기 어세이의 예는 하기 상세히 기술되어 있다.
계통 결정 및 세포 분화 및 발생의 분야에서의 조사 및 발견에 대하여, 본 발명 이전에, 상기 연구는 소정의 실험을 수행하기 위해 충분한 수의 소정의 세포군을 생성하기 위한 접근의 부족 및 무능력에 의해 심각하게 방해되었다. 예를 들어, 특정 전구 세포주의 분화에서의 중간체를 동정하거나 선별하기 위하여, 충분한 수의 세포가 수득되어 의미있고 재생가능한 결과를 제공해야 한다. 전구 세포주는 또한, 이것이 이미 결정된 계통에서 더 분화되는 능력을 보유하여, 이에 따라 현존하지 않고, 기술에 대한 다른 설명도 되어 있지 않은 신규한 도구가 상기 세포를 생성하게 만들어야 한다. 본 발명의 시점에서 이용가능한 기술의 이용으로, 이는 가능하지 않았다. 본 발명은 각종 실험에 이용될 수 있는 균질한 줄기 세포의 증가가능하고 본질적으로 비제한적인 공급물을 제공함으로써 상기 문제를 해결한다. 상기 기술은 세포 분화 및 발견의 분야에서의 조사 능력을 크게 증진시킨다.
상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 lt-HSC를 조건부 불멸화하는 방법은 기타 조직 유래의 추가의 줄기 세포에 맞추어질 수 있다. 예를 들어, 유전자 전달 및 성장 인자를 채택함으로써, 필요에 따라, 본 발명은 하기 기술되는 바와 같은 각종 상이한 줄기 세포에 적용될 수 있다. 상기 세포는 또한, 조혈 줄기 세포에 대하여 본원에서 기술한 바와 같이, 시험관내에서 증가되고, 종양유전자의 불활성화시 분화까지 나아갈 수 있다. 그 후, 상기 세포는 조직 복구 및 조직 재생/조작을 포함하는 치료 용도에 이용될 수 있다. 따라서, 유전자의 MYC-ER 및 Bcl-2 조합물, 또는 본원에 기술한 임의의 기타 조합물이 본원에 기술되어 있거나 또는 본 개시 내용에 따라 (예컨대 각종 바이러스-매개의 방법에 의해) 당업자에 의해 적절한 것으로 생각되는 임의의 방법에 의해 세포, 비제한적인 예로서, 중간엽 줄기 세포 (비제한적인 예로서, 폐 중간엽 줄기 세포, 골수 간질 세포), 신경 줄기 세포 (비제한적인 예로서, 뉴런 도파민성 줄기 세포 및 운동 뉴런 줄기 세포), 상피 줄기 세포 (비제한적인 예로서, 폐 상피 줄기 세포, 심장 상피 줄기 세포, 및 장 상피 줄기 세포), 심근 세포 전구 줄기 세포, 피부 줄기 세포 (비제한적인 예로서, 표피 줄기 세포 및 소포 줄기 세포), 골격근 줄기 세포, 내피 줄기 세포 (예를 들어, 폐 내피 줄기 세포), 및 간 줄기 세포로 트랜스펙션되어, 시험관내에서 증가되고 종양유전자의 불활성화시 분화로 나아갈 수 있는 조건부 불멸화 세포주를 생성할 수 있다. 상기 세포주의 치료 잠재성에 추가하여, 상기 주는 시험관내 (또는 생체외)에서 더 변형되어 선천적 유전적 결함을 보정할 수 있고, 초기 계통 결정 및 분화의 분자 기반의 연구에 이용될 수 있다. 상기 세포는 잠재적으로 적절한 치료 표적의 신규한 공급원일 수 있는 한편, 상기 세포주는 또한 분화를 방지하거나 유도하는 소 분자의 선별, 및 각종 치료, 비제한적인 예로서, 암 치료 및 면역 결핍 치료를 위한 신규한 화합물 및 분자 표적의 동정에도 유용하다.
일반적 정의
본 발명에 따르면, 단리된 핵산 분자는 본원에서 그 천연 환경으로부터 제거된 (즉, 인간 조작이 실시된) 핵산 분자를 일컫고, 그 천연 환경은 핵산 분자가 천연에서 발견되는 게놈 또는 염색체이다. 이로써, "단리된"은 핵산 분자가 정제된 정도를 반드시 반영하지는 않으며, 핵산 분자가 천연에서 발견되는 전 게놈 또는 전 염색체를 분자가 포함하지 않음을 나타낸다. 단리된 핵산 분자는 유전자를 포함할 수 있다. 유전자를 포함하는 단리된 핵산 분자는 상기 유전자를 포함하는 염색체의 단편이 아니며, 그보다는 유전자와 관련된 코딩 부위 및 조절 부위를 포함하나, 동일한 염색체 상에 천연적으로 발견되는 추가의 유전자는 포함하지 않는다. 단리된 핵산은 또한 천연에서 명시된 핵산 서열 (즉, 이종 서열)에 일반적으로 인접하지 않는 추가의 핵산에 인접한 (즉, 서열의 5' 및/또는 3' 말단의) 명시된 핵산 서열도 포함할 수 있다. 단리된 핵산 분자는 DNA, RNA (예를 들어, mRNA), 또는 DNA 또는 RNA의 유도체 (예를 들어, cDNA, siRNA, shRNA)를 포함할 수 있다. 비록 문구 "핵산 분자"는 주로 물리적 핵산 분자를 일컫고, 문구 "핵산 서열"은 주로 핵산 분자 상의 뉴클레오티드의 서열을 일컬으나, 두 문구는, 특히 단백질 또는 단백질의 도메인을 코딩할 수 있는, 핵산 분자, 또는 핵산 서열에 대하여 혼용하여 사용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 재조합 DNA 기술 (예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성법의 이용으로 제조된다. 단리된 핵산 분자는 천연 핵산 분자 및 이의 상동체, 비제한적인 예로서, 뉴클레오티드가 변형에 의해 소정의 효과를 제공 (예를 들어, 본원에 기술한 바와 같은 유도성 원종양유전자의 제공)하는 방식으로 삽입, 결실, 치환 및/또는 역전된 천연 대립유전자 변이체 및 변형된 핵산 분자를 포함한다.
핵산 분자 상동체는 당업자에게 공지된 다수의 방법의 이용으로 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press (1989)]을 참고하라). 예를 들어, 핵산 분자는 각종 기술, 비제한적인 예로서, 전통적 돌연변이 유발 기술 및 재조합 DNA 기술, 예컨대 부위 특이적 돌연변이 유발, 돌연변이를 유도하기 위한 핵산 분자의 화학적 처리, 핵산 단편의 제한 효소 절단, 핵산 단편의 결찰, PCR 증폭 및/또는 핵산 서열의 선택된 부위의 돌연변이 유발, 올리고뉴클레오티드 혼합물의 합성, 및 핵산 분자 및 이의 조합물의 혼합물을 "구축 (build)"하기 위한 혼합 기의 결찰의 이용으로 변형될 수 있다. 핵산 분자 상동체는 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 기능에 대한 선별 및/또는 야생형 유전자와의 하이브리드 형성에 의해 변형된 핵산의 혼합물 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 최소 크기는 본 발명에 유용한 단백질, 예컨대 원종양유전자 또는 이의 기능적 부분 (즉, 전장 단백질의 생물학적 활성을 갖고 본 발명의 방법에 이용하기에 충분한 부분), 또는 항아폽토시스 단백질 또는 이의 기능적 부분 (즉, 전장 단백질의 생물학적 활성을 갖고 본 발명의 방법에 이용하기에 충분한 부분)을 코딩하기에 충분한 크기이다. 본 발명에 유용할 수 있는 기타 핵산 분자는, 전형적으로 길이가 5개의 뉴클레오티드 이상, 및 바람직하게는 약 5개 내지 약 50개 또는 약 500개의 뉴클레오티드 이상의 범위, 예컨대 전체 숫자 증분 중, 그 사이의 임의의 길이 (즉, 5, 6, 7, 8, 9, 10,...33, 34,...256, 257,...500개)인, 천연 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 상보적 서열과 안정하게 하이브리드 형성될 수 있는 (예를 들어, 온화한, 높은 또는 매우 높은 엄중성 조건 하에) 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 형성하기에 충분한 크기의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 본원에 기술된 본 발명의 실시양태 중 임의의 것에 유용할 충분한 서열 또는 서열들을 포함할 수 있다는 점에서, 본 발명의 핵산 분자의 최적의 크기에 대하여, 실질적 제한 이외에 어떠한 제한도 없다.
본원에서 사용시, 엄중한 하이브리드 형성 조건은 그 조건 하에 핵산 분자가 사용되어 유사한 핵산 분자를 동정하는 표준 하이브리드 형성 조건을 일컫는다. 상기 표준 조건은, 예를 들어, 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. Sambrook 등, 동서]에 개시되어 있고, 이는 그 전문을 본원에서 참고로 인용한다 (예를 들어, 구체적으로, 페이지 9.31-9.62를 참고하라). 또한, 핵산의 다양한 정도의 불일치를 가능하게 하는 하이브리드 형성을 달성하는 적절한 하이브리드 형성 및 세정 조건을 계산하기 위한 화학식은, 예를 들어, 그 전문을 본원에서 참고로 인용하는 문헌 [Meinkoth 등, 1984, Anal . Biochem . 138, 267-284; Meinkoth 등, 동서]에 기술되어 있다.
더 구체적으로, 본원에서 언급시, 중간 엄중성의 하이브리드 형성 및 세정 조건은 하이브리드 형성 반응을 프로브 검사하는 데 사용되는 핵산 분자와 약 70% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자의 단리를 가능하게 하는 조건 (즉, 뉴클레오티드의 약 30% 이하의 불일치를 가능하게 하는 조건)을 일컫는다. 본원에서 언급시, 높은 엄중성의 하이브리드 형성 및 세정 조건은 하이브리드 형성 반응을 프로브 검사하는 데 사용되는 핵산 분자와 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자의 단리를 가능하게 하는 조건 (즉, 뉴클레오티드의 약 20% 이하의 불일치를 가능하게 하는 조건)을 일컫는다. 본원에서 언급시, 매우 높은 엄중성의 하이브리드 형성 및 세정 조건은 하이브리드 형성 반응을 프로브 검사하는 데 사용되는 핵산 분자와 약 90% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자의 단리를 가능하게 하는 조건 (즉, 뉴클레오티드의 약 10% 이하의 불일치를 가능하게 하는 조건)을 일컫는다. 상기 기술한 바와 같이, 당업자는 문헌 [Meinkoth 등, 상동]에서의 화학식을 이용하여 뉴클레오티드 불일치의 상기 특정 수준을 달성하는 적절한 하이브리드 형성 및 세정 조건을 계산할 수 있다. 상기 조건은, DNA:RNA 또는 DNA:DNA 하이브리드가 형성되는 지의 여부에 따라 다를 것이다. DNA:DNA 하이브리드에 대하여 계산된 융점은 DNA:DNA 하이브리드에 대해서보다 10℃ 더 낮다. 특정 실시양태에서, DNA:DNA 하이브리드에 대한 엄중한 하이브리드 형성 조건은, 적절한 세정 조건과 함께, 약 20℃ 내지 약 35℃ (더 낮은 엄중성), 더 바람직하게는, 약 28℃ 내지 약 40℃ (더 높은 엄중성), 및 더욱 더 바람직하게는, 약 35℃ 내지 약 45℃ (훨씬 더 높은 엄중성)의 온도에서 6X SSC (0.9 M의 Na+)의 이온 강도에서의 하이브리드 형성을 포함한다. 특정 실시양태에서, DNA:RNA 하이브리드에 대한 엄중한 하이브리드 형성 조건은, 유사한 엄중한 세정 조건과 함께, 약 30℃ 내지 약 45℃, 더 바람직하게는, 약 38℃ 내지 약 5O℃, 및 더욱 더 바람직하게는, 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 6X SSC (0.9 M의 Na+)의 이온 강도에서의 하이브리드 형성을 포함한다. 상기 값은 약 100개의 뉴클레오티드보다 더 큰 분자, 0%의 포름아미드 및 약 40%의 G + C 함량에 대한 융점의 계산에 기초한 것이다. 대안으로, Tm은 문헌 [Sambrook 등, 상동, 페이지 9.31 내지 9.62]에 제공된 바와 같이 실험적으로 계산될 수 있다. 일반적으로, 세정 조건은 가능한 엄중해야 하고, 선택된 하이브리드 형성 조건에 적절해야 한다. 예를 들어, 하이브리드 형성 조건은 특정 하이브리드의 계산된 Tm보다 대략 20 ∼ 25℃ 미만인 온도 조건 및 염의 조합을 포함할 수 있고, 세정 조건은 전형적으로 특정 하이브리드의 계산된 Tm보다 대약 12 ∼ 20℃ 미만인 온도 조건 및 염의 조합을 포함한다. DNA:DNA 하이브리드와 함께 이용하기에 적절한 하이브리드 형성 조건의 하나의 예로서 약 42℃에서 6X SSC (50%의 포름아미드) 중 2 ∼ 24 시간의 하이브리드 형성, 이어서 약 2X SSC 중 실온에서 1 회 이상의 세정, 이어서 더 고온 및 더 낮은 이온 강도에서의 추가의 세정 (예를 들어, 약 0.1X ∼ 0.5X의 SSC 중 약 37℃에서 1 회 이상의 세정, 이어서 약 0.1X ∼ 0.5X의 SSC 중 약 68℃에서 1 회 이상의 세정)을 포함하는 세정 단계를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 본원에 기술된 임의의 아미노산, 예컨대 끝이 잘린 형태 (단편 또는 부분) 및 상기 서열의 상동체가 기정 아미노산 서열의 C- 및/또는 N-말단 각각에 인접한 1개 이상, 및 약 20개 이하의, 추가의 이종 아미노산으로부터 제조될 수 있다. 생성되는 단백질 또는 폴리펩티드는 기정 아미노산 서열로 "본질적으로 이루어짐"으로서 일컬어질 수 있다. 본 발명에 따르면, 이종 아미노산은 기정 아미노산 서열에 인접하여 천연적으로 관측되지 않거나 (즉, 천연에서 생체내에서 관측되지 않음) 또는 이것이 유전자 중 발생하는 경우, 천연 발생 서열 중 상기 뉴클레오티드가 기정 아미노산 서열이 유래하는 유기체에 대한 표준 코돈 용법의 이용으로 번역되는 경우, 기정 아미노산 서열을 코딩하는 천연 발생 핵산 서열에 인접한 뉴클레오티드에 의해 코딩되지 않는 아미노산의 서열이다. 유사하게, 본원에서 핵산 서열에 관하여 사용시, 문구 "본질적으로 이루어짐"은 기정 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 5' 및/또는 3' 말단의 각각에서 1개 이상, 및 약 60개 이하만큼 다수의, 추가의 이종 뉴클레오티드에 인접할 수 있는 기정 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 일컫는다. 이종 뉴클레오티드는 이것이 천연 유전자 중 발생하는 경우 기정 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열에 인접하여 천연적으로 관측되지 않는다 (즉, 천연에서 생체내에서 관측되지 않음).
본 발명에 따르면, 재조합 벡터 (또한, 특히 이것이 본 발명에 따라 관심을 갖는 핵산 서열을 함유하는 경우, 재조합 핵산 분자로서 일컬어짐)는 선택한 핵산 서열을 조작하고 상기 핵산 서열을 숙주 세포로 도입하기 위한 도구로서 사용되는 조작된 (즉, 인공적으로 제조된) 핵산 분자이다. 따라서, 재조합 벡터는, 예컨대 선택된 핵산 서열을 숙주 세포로 발현시키고/거나 전달함으로써, 선택된 핵산 서열의 클로닝, 서열 분석, 및/또는 조작에 사용하기에 적절하다. 상기 벡터는 전형적으로 이종 핵산 서열, 즉 클로닝되거나 전달될 핵산 서열에 인접하여 천연적으로 또는 일반적으로 발견되지 않는 핵산 서열을 포함하나, 상기 벡터는 또한 본 발명의 핵산 분자에 측접하여 천연적으로 발견되거나, 또는 본 발명의 핵산 분자 (하기 상세히 기술됨)의 발현에 유용한 조절 핵산 서열 (예를 들어, 프로모터, 비번역 부위)도 함유할 수 있다. 벡터는 원핵 생물 또는 진핵 생물의 RNA 또는 DNA일 수 있고, 전형적으로 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 벡터는 염색체외 성분 (예를 들어, 플라스미드)으로서 유지될 수 있거나, 또는 숙주 세포의 염색체에 통합될 수 있다. 전 벡터가 숙주 세포 내부의 적소에서 유지될 수 있거나, 특정 조건 하에, 플라스미드 DNA가 제거되어, 본 발명의 핵산 분자를 남길 수 있다. 기타 조건 하에, 벡터는 선택된 시간에 숙주 세포의 게놈으로부터 절제 (제거)되도록 디자인된다 (하기 더 상세히 기술됨). 통합된 핵산 분자는, 염색체 프로모터 조절 하에, 천연 또는 플라스미드 프로모터 조절 하에, 또는 몇몇 프로모터 조절의 조합 하에 존재할 수 있다. 핵산 분자의 단일 또는 복수 개의 사본이 염색체에 통합될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 1종 이상의 선택적 마커를 함유할 수 있다.
본 발명에 따르면, 문구 "작동적으로 연결된"은 핵산 분자가 발현 조절 서열 (예를 들어, 전사 조절 서열 및/또는 번역 조절 서열)에, 상기 분자가 숙주 세포로 트랜스펙션 (즉, 형질전환, 형질도입, 트랜스펙션, 컨쥬게이션 또는 전도)되는 경우 발현될 수 있는 방식으로 연결되는 것을 일컫는다. 전사 조절 서열은 전사의 개시, 연장, 또는 종결을 조절하는 서열이다. 특히 중요한 전사 조절 서열은 전사의 개시를 조절하는 서열, 예컨대 프로모터, 증강자, 작동자 및 억제자 서열이다. 적절한 전사 조절 서열로서 재조합 핵산 분자가 도입되는 숙주 세포 또는 유기체 내에서 기능할 수 있는 임의의 전사 조절 서열을 들 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "트랜스펙션"은 외인성 핵산 분자 (즉, 재조합 핵산 분자)가 그에 의해 세포로 삽입될 수 있는 임의의 방법을 일컫기 위해 사용된다. 용어 "형질도입"은 유전 물질이, 예컨대 바이러스 (예를 들어, 레트로바이러스) 또는 형질도입 박테리오파지에 의해 하나의 공급원으로부터 또다른 공급원으로 전달되는 트랜스펙션의 특정 유형이다. 용어 "형질전환"은, 상기 용어가 핵산 분자의 미생물 세포, 예컨대 박테리아 및 효모로의 도입을 일컫기 위해 사용되는 경우, 용어 "트랜스펙션"과 혼용하여 사용할 수 있다. 미생물 시스템에 있어서, 용어 "형질전환"은 미생물에 의한 외인성 핵산의 획득으로 인해 유전된 변화를 기술하기 위해 사용되고, 용어 "트랜스펙션"과 본질적으로 동의어이다. 그러나, 동물 세포에 있어서, 형질전환은 세포가, 예를 들어, 암성이 된 이후 배양물 중 이의 성장 특성에서의 변화를 일컬을 수 있는 2차적 의미를 얻었다. 따라서, 혼란을 피하기 위해, 용어 "트랜스펙션"은 바람직하게는 본원에서 외인성 핵산의 동물 세포로의 도입에 대하여 사용된다. 따라서, 용어 "트랜스펙션"은, 상기 용어가 외인성 핵산의 세포로의 도입에 관한 것인 범위까지, 동물 세포의 트랜스펙션 또는 형질도입, 및 미생물 세포의 형질전환 또는 형질도입을 일반적으로 포괄하기 위해 본원에서 사용될 것이다. 트랜스펙션 기술의 비제한적인 예로서, 형질전환, 형질도입, 입자 충격, 확산, 능동 수송, 바스 초음파처리, 전기천공, 미세 주입, 리포펙션 (lipofection), 흡착, 감염 및 원형질체 융합을 들 수 있다.
본원에서 사용시, 본 발명에 있어서 단리된 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 언급은 전장 단백질, 융합 단백질, 키메라 단백질, 또는 상기 단백질의 임의의 단편 (끝이 잘린 형태, 부분) 또는 상동체를 포함한다. 더 구체적으로, 본 발명에 따른 단리된 단백질은, 이의 천연 환경으로부터 제거된 (즉, 인간 조작이 실시된) 단백질 (예컨대, 폴리펩티드 또는 펩티드)이고, 이의 비제한적인 예로서, 정제된 단백질, 부분 정제된 단백질, 재조합으로 제조된 단백질, 막 결합 단백질, 지질과 복합체화된 단백질, 가용성 단백질, 합성으로 제조된 단백질, 및 기타 단백질과 결합된 단리된 단백질을 들 수 있다. 이로써, "단리된"은 단백질이 정제된 정도를 반영하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 단리된 단백질은 재조합으로 제조된다. 또한, 특정 단백질 (Bcl-2)의 명명에 대한 예로서 다시, "인간 Bcl-2 단백질" 또는 인간 Bcl-2 "유래의" 단백질은 인간 (호모 사피엔스) 유래의 Bcl-2 단백질 (예컨대, 천연 발생 Bcl-2 단백질의 상동체 또는 부분) 또는 호모 사피엔스 유래의 천연 발생 Bcl-2 단백질의 구조 (예를 들어, 서열) 및 아마도 기능에 대한 지식으로부터 다른 방법으로 제조된 Bcl-2 단백질을 일컫는다. 다시 말해, 인간 Bcl-2 단백질은 호모 사피엔스 유래의 천연 발생 Bcl-2 단백질과 실질적으로 유사한 구조 및 기능을 갖거나 또는 본원에서 상세하게 설명한 바와 같은 호모 사피엔스 유래의 천연 발생 Bcl-2 단백질의 생물학적 활성 (즉, 생물학적 활성을 갖는) 상동체인 임의의 Bcl-2 단백질을 포함한다. 이로써, 인간 Bcl-2 단백질은 정제되고, 부분 정제된, 재조합, 돌연변이/변형된 합성 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "변형" 및 "돌연변이"는, 특히 본원에 기술된 단백질의 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)에 대한 변형/돌연변이에 대하여, 혼용하여 사용할 수 있다.
본원에서 사용시, 용어 "상동체"는 천연 발생 단백질 또는 펩티드에 대한 변형, 예컨대 작은 변형에 의해 천연 발생 단백질 또는 펩티드 (즉, "원형" 또는 "야생형" 단백질)와 상이하나, 천연 발생 형태의 기본 단백질 및 측쇄 구조를 유지하는 단백질 또는 펩티드를 일컫기 위해 사용된다. 상기 변화의 비제한적인 예로서: 하나 또는 몇 개 (즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)의 아미노산 측쇄에서의 변화; 하나 또는 몇 개의 아미노산에서의 변화, 예컨대 결실 (예를 들어, 단백질 또는 펩티드의 하나의 단백질 또는 끝이 잘린 형태), 삽입 및/또는 치환; 하나 또는 몇 개의 원자의 화학량론에서의 변화; 및/또는 작은 유도체화, 비제한적인 예로서: 메틸화, 글리코실화, 인산화, 아세틸화, 미리스토일화, 프레닐화, 팔미트화, 아미드화 및/또는 글리코실포스파티딜 이노시톨의 첨가를 들 수 있다. 상동체는 천연 발생 단백질 또는 펩티드와 비교시 증강된, 감소된, 또는 실질적으로 유사한 특성을 가질 수 있다. 상동체로서 단백질의 아고니스트 또는 단백질의 안타고니스트를 들 수 있다.
상동체는 천연 대립유전자 변형 또는 천연 돌연변이의 결과일 수 있다. 단백질을 코딩하는 핵산의 천연 발생 대립유전자 변이체는 게놈 중 상기 단백질을 코딩하는 유전자와 본질적으로 동일한 유전자좌 (또는 유전자좌들)에서 발생하나, 예를 들어, 돌연변이 또는 재조합에 의해 야기된 천연 변형으로 인하여, 유사하나 동일하지 않은 서열을 갖는 유전자이다. 대립유전자 변이체는 전형적으로 이것이 비교될 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성과 유사한 활성을 갖는 단백질을 코딩한다. 대립유전자 변이체의 하나의 종류는 동일한 단백질을 코딩하나 유전자 코드의 축퇴로 인하여 상이한 핵산 서열을 가질 수 있다. 대립유전자 변이체는 또한 유전자의 5' 또는 3' 비번역 부위에서의 (예를 들어, 조절 제어 부위에서의) 변화를 포함할 수 있다. 대립유전자 변이체는 당업자에게 잘 공지되어 있다.
상동체는 단백질의 제조에 대하여 종래 기술에서 공지되어 있는 기술, 비제한적인 예로서, 예를 들어, 랜덤 또는 표적화된 돌연변이 유발을 실행하기 위한 전통적 또는 재조합 DNA 기술의 이용으로, 단리된, 천연 발생 단백질에 대한 직접적 변형, 직접적 단백질 합성, 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 대한 변형의 이용으로 제조될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 기정 단백질의 상동체는 기준 단백질의 아미노산 서열에 대하여, 약 45% 이상, 또는 약 50% 이상, 또는 약 55% 이상, 또는 약 60% 이상, 또는 약 65% 이상, 또는 약 70% 이상, 또는 약 75% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상 동일하거나, 또는 약 95% 이상 동일하거나, 또는 약 96% 이상 동일하거나, 약 97% 이상 동일하거나, 또는 약 98% 이상 동일하거나, 또는 약 99% 이상 동일한 (또는, 전체 정수 증분 중, 45% 내지 99% 사이의 임의의 백분율 동일성) 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 하나의 실시양태에서, 상동체는 기준 단백질의 천연 발생 아미노산 서열에 대하여, 100% 미만 동일하고, 약 99% 미만 동일하고, 약 98% 미만 동일하고, 약 97% 미만 동일하고, 약 95% 미만 동일하고, 약 95% 미만 동일하고, 1%의 증분으로 기타 등등으로 하여 약 70% 미만까지 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
본원에서 사용시, 달리 명시하지 않는 한, 백분율 (%) 동일성에 대한 언급은 하기의 이용으로 수행되는 상동성에 대한 평가를 일컫는다: (1) 표준 디폴트 파라미터에 의해, 아미노산 서치에 대하여 blastp 그리고 핵산 서치에 대하여 blastn을 이용하는 BLAST 2.0 Basic BLAST 상동성 서치로서, 여기서 의문 서열은 디폴트에 의해 저 복잡성 부위에 대하여 걸러짐 (본원에서 그 전문을 참고로 인용하는, 문헌 [Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, DJ. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기술되어 있음); (2) BLAST 2 배열 (하기 기술된 파라미터를 이용함); (3) 및/또는 표준 디폴트 파라미터에 의한 PSI-BLAST (위치 특이적 반복 BLAST). BLAST 2.0 Basic BLAST 및 BLAST 2 간의 표준 파라미터에서의 일부 차이로 인하여, 두 특이적 서열은 BLAST 2 프로그램의 이용시 유의한 상동성을 갖는 것으로 인식되는 한편, 의문 서열로서의 서열 중 하나를 이용하여 BLAST 2.0 Basic BLAST으로 수행된 서치는 탑 매치에서 두번째 서열을 동정하지 않을 수 있음이 주목된다. 또한, PSI-BLAST는 서열 상동체를 찾는 민감한 방법인, "프로파일" 서치의 자동화된, 사용하기 쉬운 버전을 제공한다. 프로그램은 먼저 갭 도입된 (gapped) BLAST 데이터베이스 서치를 수행한다. PSI-BLAST 프로그램은 임의의 유의한 배열이 제출되어 위치 특이적 점수 행렬을 구축하는 정보를 이용하고, 상기 행렬은 데이터베이스 검색의 다음 회에 대한 의문 서열을 대체한다. 따라서, 백분율 동일성은 상기 프로그램 중 임의의 것의 이용에 의해 결정될 수 있음이 이해될 것이다.
두 특이적 서열은 본원에서 그 전문을 참고로 인용하는, 문헌 [Tatusova 및Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett . 174:247-250]의 이용으로 서로에 대하여 배열될 수 있다. BLAST 2 서열 배열은 BLAST 2.0 알고리즘의 이용으로 blastp 또는 blastn으로 수행되어, 생성되는 배열 중 갭의 도입 (결실 및 삽입)을 가능하게 하는 두 서열 간의 갭 도입된 BLAST 서치 (BLAST 2.0)를 수행한다. 본원에서 명료성의 목적을 위하여, BLAST 2 서열 배열은 하기와 같은 표준 디폴트 파라미터의 이용으로 수행된다.
blastn에 대하여, 0 BLOSUM62 행렬의 이용으로:
일치에 대한 보상 = 1
불일치에 대한 벌점 = -2
개방 갭 (5) 및 연장 갭 (2) 벌점
갭 x_쇠퇴 (dropoff) (50) 예상치 (10) 단어 크기 (11) 필터 (온)
blastp에 대하여, 0 BLOSUM62 행렬의 이용으로:
개방 갭 (11) 및 연장 갭 (1) 벌점
갭 x_쇠퇴 (50) 예상치 (10) 단어 크기 (3) 필터 (온).
본 발명에 따르면, 단리된 단백질, 예컨대 이의 생물학적 활성 상동체 또는 단편은 야생형, 또는 천연 (자연) 단백질의 생물학적 활성의 한 가지 이상의 특징을 갖는다. 일반적으로, 단백질의 생물학적 활성 또는 생물학적 작용은 생체내 (즉, 단백질의 천연 생리학적 환경 중) 또는 시험관내 (즉, 실험실 조건 하에) 측정되거나 관측되는 천연 발생 형태의 단백질로 인하여 단백질에 의해 나타내어지거나 수행되는 임의의 기능(들)을 일컫는다. 단백질 발현의 감소 또는 단백질 활성의 감소를 야기하는 변형, 활성 또는 상호 작용은 단백질의 불활성화 (완전 또는 부분적), 하향 조절, 축소된 작용, 또는 감소된 작용 또는 활성으로서 일컬어질 수 있다. 유사하게는, 단백질 발현의 증가 또는 단백질 활성의 증가를 야기하는 변형, 활성 또는 상호 작용은 단백질의 증폭, 과다 발현, 활성화, 증강, 상향 조절 또는 증가된 작용으로서 일컬어질 수 있다.
본 발명의 조건부 불멸화 방법
본 발명의 하나의 실시양태는 조건부 불멸화된, 성체 줄기 세포, 및 바람직하게는 장기 줄기 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 일반적으로 하기 단계를 포함한다: (a) 증가시킨 성체 줄기 세포군을 수득하는 단계; (b) 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원종양유전자를 포함하는 벡터로 줄기 세포를 트랜스펙션 (형질도입)하는 단계로서, 여기서 원종양유전자는 조절가능한 (유도성, 제어가능한) 것인 단계, (c) 세포의 아폽토시스를 억제하는 단백질을 코딩하는 벡터로 줄기 세포를 트랜스펙션 (형질도입)하는 단계; 및 (d) 원종양유전자가 활성화되는 조건 하에 줄기 세포 성장 인자의 조합물의 존재 하에 트랜스펙션된 세포를 증가시키는 단계. 하나의 실시양태에서, 벡터는 통합 벡터이다. 상기 방법에 의해 생성된 세포는 배양되고, 증가되고, 저장되고, 회수되고, 치료 방법에 사용되고, 서치 및 발견 방법에 사용되고, 유전자 조작되고, 원종양유전자가 활성화되는 조건을 제거함으로써 분화하도록 유도되고/거나 본원에 기술되거나 본 개시 내용에 의해 당업자에게 명백한 임의의 기타 방법에 사용될 수 있다. 단계 (b) 및 (c)는 임의의 순서로 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 문구 "조건부 불멸화"는 가역적 방식으로 불멸화된 (예를 들어, 사이토카인 의존적 양식으로 분화 없이 무한정 성장하면서, 적절한 조건 하에 수많은 상이한 계통으로 분화되는 이의 능력 및 잠재성을 유지하는) 세포를 일컬으며, 이로써 세포는 특정 조건 집합 하에 불멸화되며, 상기 조건이 제거되거나 변화되는 경우 (또는 기타 조건이 첨가되는 경우), 세포는 더이상 불멸화되지 않고 기타 세포 유형으로 분화될 수 있다. 문구 "조건부 불멸화"는 문구 "가역적 불멸화"와 혼용하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 언급하는 경우, 세포 생존 및 증식을 촉진하는 조절가능한 원종양유전자의 존재는, 줄기 세포가 원종양유전자로 하여금 활성화되게 하는 조건 하에 놓이는 경우 (예를 들어, MYC-ER의 경우 타목시펜 또는 이의 아고니스트) 세포가 불멸화된 표현형을 보유하도록 야기한다. 다시 말해, 세포는 배양물 중 무한정 성장 및 증가되고, 상기 특정 조건 하에 미분화된 상태로 유지된다. 상기 조건이 제거되는 경우 (예를 들어, MYC-ER의 경우 타목시펜이 제거됨), 줄기 세포는 더 이상 불멸화되지 않고 적절한 환경 (예를 들어, 성장 인자의 적절한 조합물)이 주어지는 경우 각종 세포 계통으로 분화될 수 있다.
본원에서 사용시, "줄기 세포"에 대한 언급은 이것이 종래 기술에서 일반적으로 이해되는 바와 같은 용어를 일컫는다. 예를 들어, 줄기 세포는, 이의 공급원과 관계없이, 장기간 동안 분열되고 스스로 재생될 수 있고, 비특수화되고 (미분화되고), 특수화된 세포 유형을 발생시킬 수 있는 (이로 분화되는) 세포이다 (즉, 이는 각종 상이한, 특수화된 세포 유형에 대한 기원 또는 전구 세포이다). 줄기 세포와 관련하여 사용시, "장기"는 줄기 세포의 특정 유형에 따라 줄기 세포가 장기 간 (예를 들어, 수 개월, 예컨대 3 개월 이상 내지 수 년)에 걸쳐 동일한 비특수화된 세포 유형으로 분열됨으로써 그 자신을 재생하는 능력을 일컫는다. 본원에서 기술되는 바와 같이, 상이한 동물 종 유래의 각종 장기 줄기 세포, 예컨대 장기 조혈 줄기 세포 (lt-HSC)의 표현형 특징은 종래 기술에 공지되어 있다. 예를 들어, 뮤린 lt-HSC는 하기 세포 표면 마커 표현형의 존재에 의해 동정될 수 있다: c-kit+, Sca-1+, CD34-, flk2- (실시예 참고). 성체 줄기 세포는 임의의 비-배아 조직 또는 공급원으로부터 얻어지고, 이들이 존재하는 조직의 세포 유형을 전형적으로 발생시킬 수 있는 줄기 세포를 포함한다. 용어 "성체 줄기 세포"는 용어 "신체 줄기 세포"와 혼용하여 사용할 수 있다. 배아 줄기 세포는 임의의 배아 조직 또는 공급원으로부터 얻어진 줄기 세포이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명에 사용된 줄기 세포는 임의의 공급원으로부터 얻어진 임의의 성체 줄기 세포를 포함할 수 있다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포를 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 줄기 세포의 비제한적인 예로서, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 (비제한적인 예로서, 폐 중간엽 줄기 세포, 골수 간질 세포), 신경 줄기 세포, 상피 줄기 세포 (비제한적인 예로서, 폐 상피 줄기 세포, 심장 상피 줄기 세포, 혈관 상피 줄기 세포, 및 장 상피 줄기 세포), 장 줄기 세포, 심근 세포 전구 줄기 세포, 피부 줄기 세포 (비제한적인 예로서, 표피 줄기 세포 및 소포 줄기 세포 (모낭 줄기 세포)), 골격근 줄기 세포, 골모 전구 줄기 세포, 및 간 줄기 세포를 들 수 있다.
조혈 줄기 세포는 모든 유형의 혈구, 비제한적인 예로서, 적혈구(에리스로사이트), B 림프구, T 림프구, 자연 살세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단핵구, 대식구, 및 혈소판을 발생시킬 수 있다.
중간엽 줄기 세포 (예컨대, 골수 간질 세포)는 각종 세포 유형, 비제한적인 예로서, 골 세포, 연골 세포, 지방 세포, 폐 세포, 및 기타 종류의 결합 조직 세포, 예컨대 건에서의 것을 발생시킨다.
뇌의 신경 줄기 세포는 이의 3 가지 주요 세포 유형을 발생시킨다: 신경 세포 (뉴런) 및 2 가지 카테고리의 비-뉴런 세포, 성상 세포 및 희소돌기아교세포.
각종 조직의 내면의 상피 줄기 세포는 조직 중 상피를 형성하는 몇몇 세포 유형을 발생시킨다.
피부 줄기 세포는 표피의 기저층 및 모낭의 기저에서 발생한다. 표피 줄기 세포는 케라티노사이트를 발생시키고, 이는 피부의 표면으로 이주하여 보호층을 형성하며, 소포 줄기 세포는 모낭 및 표피 모두를 발생시킬 수 있다. 성체 줄기 세포의 기타 공급원은 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
배아 줄기 세포는 신체의 모든 조직 및 세포를 발생시킬 수 있다.
상기 줄기 세포를 수득하고 초기 배양 조건, 예컨대 액체 배양물 또는 반-고체 배양 배지를 제공하는 방법은 종래 기술에 공지되어 있다. 세포는, 줄기 세포의 공급원을 조직 공급원 또는 배양물 중 상기 세포를 증가시키거나 이것이 풍부한 적절한 시약과 접촉시킴으로써, 생체내 또는 시험관내에서 초기에 증가된다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포의 경우, 기증자 개체는 조혈 줄기 세포를 풍부하게 하고 상기 세포가 분화 없이 증식되게 하는 작용제, 예컨대 5-플루오로우라실로 처리될 수 있다. 소정의 줄기 세포 유형의 증가를 위한 기타 적절한 작용제는 당업자에게 공지어 있을 것이다. 대안으로, 및 바람직하게는, 성체 줄기 세포는 조직 공급원으로부터 단리된 후 적절한 작용제에 대한 노출에 의해 시험관내 증가되거나 풍부해진다. 예를 들어, 조혈 줄기 세포에 대하여, 성체 조혈 전구 세포의 증가된 배양물의 제조 방법은 문헌 [Van Parijs 등, (1999; Immunity, 11, 763-70)]에 기술되어 있다. 세포는 동물로부터 세포 샘플을 수득하기 위한 임의의 적절한 방법, 비제한적인 예로서, 체액 (예를 들어, 혈액)의 골수 수집물의 수집, 제대혈의 수집, 조직 천공 (tissue punch), 및 조직 절개, 예컨대 특히, 비제한적인 예로서, 피부, 장, 각막, 척수, 뇌 조직, 두피, 위, 심장, 폐 (예를 들어, 세척 및 기관지경 검사를 포함함), 골수의 미세침 흡인물, 양수, 태반 및 난황낭의 임의의 생검에 의해 개체로부터 수득된다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 유용한 세포는 또한 신선하거나 냉동보존된 (저장된) 제대혈, 시험관내 배아 줄기 (ES) 세포의 유도된 분화로부터 유래할 수 있는 조혈 전구 세포군, 말초 순환으로 이의 lt-HSC를 동원하도록 유도된 정상 또는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF)-처리된 환자의 말초혈로부터 얻어진 조혈 줄기 세포 (HSC)로부터 수득될 수 있다.
일단 증가시킨 줄기 세포군이 얻어지면 (이용가능하게 되거나, 제공되거나, 또는 제조됨), 세포는 하기에 의해 순차적으로 (임의의 순서로) 또는 동시에 트랜스펙션된다: (1) 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원종양유전자를 포함하는 벡터로서, 여기서 원종양유전자는 조절가능한 (유도성, 조절가능한) 것인 벡터, 및 (2) 세포의 아폽토시스를 억제하는 단백질을 코딩하는 벡터. 바람직하게는, 벡터는 본원에서 세포의 게놈으로 통합되는 능력을 갖는 임의의 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터)로서 정의되는, 통합 벡터이다. 각종 벡터 및 트랜스펙션 방법은 하기 상세히 기술되어 있다. 원종양유전자는 조절가능하여 (유도성이거나 또는 조절가능함), 원종양유전자는 줄기 세포를 불멸화된 상태로 유지시키거나 또는 이것이 소정의 세포 유형으로 분화되도록 하는 것을 원하는 경우 활성화되고 불활성화될 수 있다 (즉, 켜지거나 꺼짐).
원종양유전자는 임의의 조건, 예컨대 화합물 또는 작용제의 유무, 온도, 또는 임의의 기타 적절한 조건에 대한 반응을 비롯한 임의의 적절한 방법에 의해 조절되도록, 선택되거나 또는 고안될 수 있다. 예로서, 본원에 기술된 원종양유전자 MYC-ER (에스트로겐 수용체 (ER)-조절된 MYC) 및 ICN-1-ER (노치-1의 ER-조절된 세포내 부분)은 타목시펜의 존재 하에 모두 유도성이다. 상기 유전자는 또한 기타 이합체화 약물, 예컨대 FK1012, 라파마이신의 변형된 형태에 반응성이도록 조작될 수 있거나, 또는 테트라사이클린 반응성 성분을 함유하는 벡터로부터 발현될 수 있다. 후자의 시나리오는 세포 중 존재하는 폴리펩티드의 기능이 아니라, 단백질의 발현을 조절한다. 상기 기반 기술의 기타 유사한 변형은 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 방법에 유용한 원종양유전자는 세포 생존 및 증식을 촉진하는 임의의 원종양유전자이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 원종양유전자의 비제한적인 예로서, MYC, ICN-1, hTERT (인간 텔로머라아제의 역 전사효소 성분), NMYC, S-MYC, L-MYC, Akt (미리스틸화됨)를 들 수 있다. 또한, 사용하기 위한 기타 적절한 유전자 또는 소정의 결과를 달성하기 위해 유전자를 변형시키는 본 발명의 방법 또는 방식의 비제한적인 예로서, 다운스트림 신호전달 효과기, 예컨대 피루베이트 디히드로게나아제 키나아제 1 (PDK-1); 라파마이신의 포유동물 표적 (mTOR); shRNA에 의한 포스파타아제 및 텐신 상동체 (PTEN)의 상실; Bcl-3, 사이클린 D1, 사이클린 D3, Bcl-10, Bcl-6, BCL-ABL (ABL과의 중지점 (breakpoint) 클러스터 부위 융합) 및 이의 각종 돌연변이 형태, Stat5 및 Stat3의 항시적 활성 형태, AML1-ETO (급성 골수성 백혈병 1 및 왜소병 관련 전사 인자 1의 융합), MLL-ENL (혼성 계통 백혈병 및 11 19 백혈병 (eleven nineteen leukemia)), 혹스 유전자, 인터루킨-3 (IL-3) 수용체 β 사슬의 활성화된 형태, 및 기타 사이토카인 수용체 사슬 (상피 성장 인자 수용체 (EGFR), c-kit, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR) 등), 뿐만 아니라 wnt (모든 포유동물 형태), β-카테닌, 소닉 헤지호그 (sonic hedgehog, shh-1 및 모든 포유동물 형태), bmi-1 및 c-jun (및 모든 포유동물 형태)의 이용을 들 수 있다. 또한, 본 발명은 shRNA, 비제한적인 예로서, p16, p19, p21 및 p27에 의한 사이클린 키나아제 억제제의 소실 (또는 억제)을 유도하는 것을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 임의의 또는 상기 원종양유전자 (예를 들어, MYC-ER 또는 ICN-1-ER) 또는 기타 유전자의 조절가능한 상동체의 사용을 포함한다. 실시예는 본 발명의 방법을 이용하여 조건부 불멸화 lt-HSC를 성공적으로 생성하기 위한 MYC-ER 또는 ICN-1-ER 모두의 용도를 기술한다.
인간 MYC를 코딩하는 핵산 서열은 본원에서 서열 1로서 표시되고, 상기 서열은 본원에서 서열 2로서 표시되는 아미노산 서열을 코딩한다. hTERT를 코딩하는 핵산 서열은 본원에서 서열 3으로서 표시되고, 상기 서열은 본원에서 서열 4로서 표시되는 아미노산 서열을 코딩한다. 인간 ICM-1을 코딩하는 핵산 서열은 본원에서 서열 11로서 표시되고, 상기 서열은 본원에서 서열 12로서 표시되는 아미노산 서열을 코딩한다. ICN-1은 노치-1의 일부, 및 구체적으로는, 노치-1로부터의 아미노산 1757-2555이다 (본원에서 그 전문을 참고로 인용하는, 문헌 [Aster 등, Mol Cell Biol . 2000 Oct;20(20):7505-15]을 참고하라). MYC-ER에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 종래 기술에 공지되어 있고 MYC-ER 단백질은 본원에서 그 전문을 참고로 인용하는, 문헌 [Soloman 등, Oncogene . 1995 Nov 2; 11 (9): 1893-7]에 기술되어 있다. ICN-1-ER은 본 발명자에 의해 생성되었고, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 본원에서 서열 13으로서 표시되며, 상기 서열은 서열 14에 의해 표시되는 아미노산 서열을 코딩한다.
유사하게, 바람직한 항아폽토시스 유전자는 Bcl-2이나, 원종양유전자가 줄기 세포 중 불활성화되는 경우 아폽토시스를 억제하고, 특히 세포 생존을 유지하는 단백질을 코딩하는 기타 유전자가 본 발명에 포함된다. Bcl-2 알파를 코딩하는 핵산 서열은 본원에서 서열 5로서 표시되고, 상기 서열은 서열 6의 아미노산 서열을 코딩한다. Bcl-2 베타는 본원에서 서열 7로서 표시되고, 상기 서열은 서열 8의 아미노산 서열을 코딩한다. "항아폽토시스" 유전자는, 아폽토시스를 유도할 수 있는 조건 하에서도, 세포에서의 아폽토시스와 관련된 과정을 억제 (축소, 방지, 감소)시키거나 또는 세포 생존을 촉진 (증진, 증가, 자극, 허용)시킬 수 있는 단백질을 코딩하는 임의의 유전자로서 본원에서 정의된다. 아폽토시스와 관련된 단백질, 및 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 종래 기술에 잘 공지되어 있다. 상기 기타 유전자의 비제한적인 예로서, 성체 줄기 세포 (즉, 단지 조혈 줄기 세포만이 아닌)의 조건부 형질전환의 설정에 아마도 중요할 것인 Bcl-2 패밀리의 임의의 유전자를 들 수 있다. 상기 유전자의 비제한적인 예로서, Bcl-2 패밀리의 기타 전-생존 구성원, 예컨대 Bcl-X, Bcl-w, BclXL, Mcl-1, Dad-1, 또는 hTERT (증식을 억제하는 것으로 밝혀진, 인간 텔로머라아제의 역 전사효소 성분)를 들 수 있다. 상기 유전자는, 본원의 작동예에서 Bcl-2에 대하여 기술되는 바와 같이, 조절된 종양유전자의 존재 하에 이소에서 과발현된다. 또한, 본 발명의 상기 측면은 프로아폽토시스성인 bcl-2 패밀리의 BH3-유일의 (only) 구성원 (예를 들어, Bim, PUMA, NOXA, Bax, Bak, BclXS, Bad, Bar 등)에 대한 shRNA 매개의 유전자 녹다운 (또는 임의의 기타 방법에 의한 파괴 또는 억제), 뿐만 아니라 카스파아제 3, 9, 10, MLL-1 (및 모든 포유동물 형태), Enl-1 (무배유-1) 및 모든 포유동물 형태, Apaf-1 및 아폽토좀의 일부를 형성하는 기타 성분을 이용하는 것을 포함한다.
상기 기술한 유전자 또는 이의 코딩 부위 각각에 대한 핵산 서열은 종래 기술에 공지되어 있고, 예컨대 인간에 대하여 공개적으로 이용가능하다. 유사하게, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 아미노산 서열은 종래 기술에 공지되어 있고, 공개적으로 이용가능하다.
본 발명자는 본 발명의 방법을 이용하고 원종양유전자 및 항아폽토시스 유전자의 상이한 조합물, 예컨대 하기의 조합물: MYC-ER 및 Bcl-2; MYC-ER 및 hTERT (인간 텔로머라아제의 역 전사효소 성분); ICN-1-ER 및 Bcl-2; ICN-1-ER 및 hTERT; 및 MYC-ER 및 ICN-1-ER을 이용하여 몇몇 상이한 장기, 조건부 불멸화 줄기 세포를 제조하였다.
본 발명의 방법에 이용되는 원종양유전자 또는 항아폽토시스 단백질을 코딩하는 유전자 중 어느 하나에 대하여, 전 유전자가 본원에 기술된 구조체에 사용될 것이 요구되지 않음이 주목되는데, 왜냐하면 소정의 기능성 단백질 생성물, 이의 기능적 부분, 또는 이의 기능적 상동체를 코딩하는 유전자 또는 핵산 서열 (예를 들어, cDNA)의 임의의 부분은 본 발명에 포괄되기 때문이다. 따라서, 줄기 세포를 트랜스펙션하기 위해 사용되는 유전자 또는 형질전환 유전자에 대한 본원의 일반적인 언급은 대표적이고, 상기 핵산 서열이 본 발명에 사용하기에 적절한 기능적 단백질을 코딩하는 한, 전 유전자를 코딩하는 임의의 핵산 분자, 유전자의 전 코딩 부위, 또는 유전자 또는 이의 상동체의 부분의 사용을 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 방법은 추가로 프로아폽토시스 단백질, 예컨대 Bcl-2 패밀리의 프로아폽토시스 구성원, 즉 BH3-유일의 유형의 것 (Bim, Bax, Bak, Puma, Noxa 등)을 코딩하는 RNA에 대해 유도된 shRNA 또는 siRNA의 사용을 포함한다. 조절된 종양유전자의 문맥에서 프로아폽토시스 유전자의 파괴는 특정 줄기 세포군의 더 효과적인 불멸화를 야기할 것으로 기대된다. RNA 간섭 (RNAi)은 이중 가닥 RNA, 및 포유동물 시스템에 있어서, 짧은 간섭 RNA (siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)가 이용되어 상보적 유전자의 발현을 억제하거나 침묵시키는 과정이다. 표적 세포에 있어서, siRNA는 감겨져 있지 않고 RNA 유도 침묵 복합체 (RISC)와 결합되며, 이는 그 후 siRNA에 상보적인 mRNA 서열로 인도되어, 이에 따라 RISC는 mRNA를 절단한다. shRNA는 벡터 중 표적 세포로 트랜스펙션되고, 여기서 이는 전사된 후, DICER 효소에 의해 처리되어 RISC를 활성화하는 siRNA 유사 분자를 형성하고, 그 후 이는, siRNA에서와 같이, shRNA에 상보적인 mRNA 서열로 인도되어, 이에 의해 RISC는 mRNA를 절단한다.
줄기 세포는 세포, 및 특히 포유동물 세포에 대한 임의의 적절한 방법의 이용으로, 예컨대 기술의 조합을 이용함으로써 원종양유전자를 포함하고 항아폽토시스 단백질을 코딩하는 벡터로 트랜스펙션될 수 있다. 본 발명자는 본원에 기술된 조건부 불멸화, 장기 줄기 세포의 생성을 야기하는 것은 발현되는 유전자 (또는 구조체) 간의 특정 공동 작용임을 발견하였다. 실시예는 레트로바이러스 벡터의 용도를 증명하였으나, 기타 방법은 기타 바이러스 및 그로부터 형성된 바이러스 벡터, 비제한적인 예로서, 렌티바이러스 벡터, 파르보바이러스, 우두 바이러스, 코로나바이러스, 칼리시바이러스, 유두종 바이러스, 플라비바이러스, 오르소믹소바이러스, 토가바이러스, 피코르나바이러스, 아데노바이러스 벡터, 변형되고 약독화된 헤르페스바이러스의 사용을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다. 임의의 상기 바이러스는 이를 HSC 또는 기타 줄기 세포, 예컨대 막 결합 SCF, 또는 기타 줄기 세포 특이적 성장 인자 리간드로 표적하는 특정 표면 발현된 분자에 의해 더 변형될 수 있다. 포유동물 세포의 트랜스펙션의 기타 방법의 비제한적인 예로서, 예컨대 NUCLEOFECTOR™ 기술 (AMAXA 바이오시스템스 (AMAXA Biosystems))을 이용함에 의한 포유동물 발현 벡터의 직접적인 전기천공을 들 수 있다. 상기 기술은 대부분의 1차 세포 및 트랜스펙션하기 어려운 세포주에 대한 매우 효과적인 비-바이러스 유전자 전달 방법이고, 이는, 다중음이온 거대분자를 핵에 직접 전달하기 위한 전류 및 용액의 세포 유형 특이적 조합물의 사용에 기초한, 오랫동안 공지된 전기천공 방법에 대한 개선이다. 추가로, 트랜스펙션의 적절한 방법은 종래 기술에 공지된 유전자 전달의 임의의 박테리아, 효모 또는 기타 인공적 방법을 포함할 수 있다.
적절한 성장 인자의 존재 하에 트랜스펙션된 줄기 세포를 증가시키거나 또는 줄기 세포 및 외인성 융합 단백질 (예를 들어, 하기 기술된 본 방법의 별형에 기술된 Tat-융합 단백질)을 배양시키는 단계는 임의의 적절한 배양 조건, 예컨대 본원에 구체적으로 기술된 조건의 이용을 포함할 수 있다. 적절한 줄기 세포 성장 인자의 조합물은 본 발명의 트랜스펙션된 (예를 들어, 형질도입된) 세포가 배양물 중 성장하고, 생존하며 증식되게 하는 임의의 줄기 세포 인자를 포함할 수 있다. 특정 조합물이 본원에 기술되어 있고, 이는 본 방법의 중요한 단계인 한편, 상기 단계는 줄기 세포의 성장, 증식 및 생존에 적절한 성장 인자의 임의의 조합물을 제공하는 것으로서 간단히 기술될 수 있고, 종래 기술에 공지된 임의의 조합물을 포함한다. 따라서, 본 발명은 특정 조합물에 국한되지 않는다. 성장 인자의 하나의 바람직한 조합물로서 하기를 들 수 있다: 인터루킨-6 (IL-6), IL-3 및 줄기 세포 인자 (SCF). 성장 인자의 또다른 바람직한 조합물로서 무혈청 배지 중 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), 인슐린 유사 성장 인자 2 (IGF-2) 및 섬유아세포 성장 인자 1 (FGF-1)를 들 수 있다. 상기 후자의 조합물은 최근 문헌 [Zhang 및 Lodich (2005; Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion, Blood 105, 4314-20)]에 기술되었다. 본원에 기술된 조합 단백질을 코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, 실시예에 기술된 MYC-ER 및 Bcl-2)로 트랜스펙션된 줄기 세포는, 상기 실시예에 기술된 칵테일에서와 같이 (IL-3, IL-6 및 SCF를 이용하여), 성장 인자의 상기 칵테일 내에서 역시 조건부 불멸화될 것으로 예상된다. 본 발명에 사용하기 위한 기타 성장 인자의 비제한적인 예로서, 안지오포이에틴 유자 단백질 (예를 들어, Agptl2, Angptl3, Angptl5, Angptl7 등), 프포리페린-2 (PLF2), 글리코겐 합성효소 키나아제-3 억제제, wnt 및 노치 신호전달 경로의 유도제, Flt3L 및 관련 사이토카인, 섬유아세포 성장 인자 2 (FGF2) 및 관련 사이토카인, wnt-1 및 Wnt 경로의 기타 활성제, 소닉 헤지호그 (shh-1) 및 그 경로의 기타 활성제를 들 수 있다. 성장 인자의 기타 적절한 조합물이 본 발명의 방법에 적용가능할 것이고 당업자에게 명백할 것이다. 실제로, 본 발명의 방법의 이용으로 생성된 세포주는, 중립 또는 유도된 조건 하에, 장기 줄기 세포, 또는 이것이 유래하는 전구 세포 중 임의의 것의 증가에 이용될 수 있는 추가의 사이토카인 및 성장 인자를 선별하기 위해 용이하게 이용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 동물 세포의 배양에 적절한 배지는 동물 세포 및 특히, 포유동물 세포의 배양을 위해 개발되거나, 또는 동물 세포 성장에 필요한 적절한 성분, 예컨대 동화성 탄소, 질소 및/또는 미량 영양소와 함께 실험실 내에서 제조될 수 있는 임의의 이용가능한 배지를 포함할 수 있다. 상기 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지, 비제한적인 예로서, 이스코브 변형된 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM), 둘베코 변형된 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagles medium, DMEM), 알파 MEM (지브코, Gibco), RPMI 1640, 또는 임의의 기타 적절한 시판 배지를 포함한다. 기본 배지에, 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 비제한적인 예로서, 혈청 공급원, 성장 인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 환원제, 및/또는 당 공급원이 첨가된다. 기본 배지 및 동물 세포 성장에 필요한 다수의 추가의 성분을 포함하는 완전 배지가 시판되며, 일부 배지는 특정 유형의 세포 배양물에 이용가능함이 주목된다. 또한, 다수의 무혈청 배지가 이용가능하며 본 발명에 따른 줄기 세포의 배양에 특히 적절할 수 있다.
세포 및 조성물
본 발명의 또다른 실시양태는 본원에 기술된 본 발명의 방법에 따라 제조된 세포, 세포주, 또는 세포군에 관한 것이다. 또한 상기 세포, 세포주 또는 세포군을 포함하는 조성물도 본 발명에 포함된다. 치료 방법에 있어서, 상기 조성물은, 세포, 세포주, 또는 세포군을 환자에게 전달하기 위한 약학적 허용 부형제 및/또는 전달 비히클을 포함하는, 약학적 허용 담체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용시, 약학적 허용 담체는 본 발명의 방법에 유용한 치료 조성물을 적절한 생체내 부위에 전달하기에 적절한 임의의 물질을 일컫는다.
중간 발생 단계의 세포 계통을 생성하기 위한 본 발명의 방법의 개조
본 발명의 또다른 실시양태는 조혈계에 대하여 중간 발생 단계를 포획하는 세포주를 생성하기 위한 본원에 기술된 신규한 방법의 개조에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 발생 또는 분화의 "중간" 단계는, "중간체" 세포가 유래하는 줄기 세포의 발생 또는 분화 단계의 다운스트림이나, 세포 분화의 최종, 또는 종결 시점의 업스트림인 줄기 세포의 발생 또는 분화의 다능성 단계를 일컫는다. 예를 들어, 전구-B 세포는, 성숙한 B 세포로 여전히 분화가능한, 조혈 줄기 세포의 중간 단계이다. 발생 또는 분화의 중간 단계는 당업자에 의해 이해될 것이다.
더 구체적으로는, 다수의 치료 및 발견 또는 서치 용도, 뿐만 아니라 세포주의 저장을 위하여, 세포주는 안정한 표현형을 가지고, 일단 세포가 트랜스펙션된 활성 종양유전자가 꺼지면 이의 결정된 경로를 따라 더 분화되는 이의 능력을 보유하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 완전히 분화되지 않고 (최종적으로 분화되지 않고), 그보다는, 분화의 중간 단계에 존재하는 세포의 추가의 제조 단계를 포괄한다. 상기 실시양태의 하나의 비제한적인 예에서, 상기 기술한 방법의 이용으로 제조된 장기 줄기 세포는 원종양유전자 또는 세포 생존 및 증식을 촉진하는 기타 유전자의 활성을 유지하는 조건 (예를 들어, 타목시펜 의존적 원종양유전자의 경우 4-OHT)의 제거 이후, 또는 원종양유전자/종양유전자를 끄는 (불활성화시키는) 적절한 조건을 적용함으로써, 시험관내에서 무작위로 분화된다. 상기 단계는 중립 사이토카인 성장 조건 (예를 들어, IL-3, IL-6 및 SCF) 내에 배양물을 유지하면서, 또는 특정 계통으로의 분화를 특이적으로 유도하는 상기 사이토카인 (예를 들어, 림포이드 계통의 경우 IL-7 및 노치 리간드, 수지상 세포의 경우 GM-CSF 및 IL-4, 골수 단핵구세포의 경우 G-CSF 등)을 분화에 중립인 (세포의 분화를 유도하거나 유발하지 않는) 사이토카인으로 대체함으로써 수행될 수 있다. 일단 배양물이 특정 계통과 일치하는 분화 마커를 나타내기 시작하면, 배양 배지는 원종양유전자를 활성화하는 조건 (예를 들어, 4-OHT)으로 다시 보충되거나 또는 원종양유전자를 다른 방법으로 재활성화하는 조건에 노출되어, 표현형을 안정화시키고, 안정한, 중간 분화 표현형을 갖는 세포주를 생성시킨다.
상기 방법의 예시로서, 본 발명자는 배지로부터 4-OHT를 제거하고 분화 이후 4-OHT를 제첨가함으로써 ABM42 세포 (본 발명의 방법에 의해 생성된 lt-HSC; 실시예 참고)로부터 CD4+, αβ+ T 세포를 시험관내에서 생성하였다. 본 발명자는 또한 ABM46 세포 (실시예 참고)를 GM-CSF, IL-4 및 FLT3L 중 항온배양한 후 상기 배양물을 분화 이후 4-OHT의 존재 하에 다시 배양물에 위치시킴으로써 수지상 세포주를 생성시켰다.
상기 세포주를 생성하는 또다른 접근법은 ctlt-HSC 세포를 마우스에 도입하여 4-OHT의 주사 이후 분화, 및 정지, 또는 표현형의 생체내 안정화를 가능하게 하는 것을 포함한다. 성가 방법은 실시예 8에 상세히 기술되어 있다. 간략히, 그리고 예로서, 본 방법에 의해 생성된 lt-HSC는 면역 손상된 동물 (예를 들어, 면역 손상된 마우스)에 주사된다. lt-HSC 중 종양유전자는 활성제 (예를 들어, 4-OHT)의 주사의 이용으로 재활성화되고, 세포는 이후 수집된 후, 세포는 시험관내에서 배양되어 세포를 분화시키고, 그 후 저장하거나 필요에 따라 사용할 수 있다. 상기 접근법, 및 상기 기술한 기타 접근법은, 예컨대 수혜자로서 NOD/SCID 마우스, 또는 간내 주사가 제공될 신생아 Rag-1-/- 마우스를 이용함으로써, 뮤린 및 인간 ctlt-HSC 세포주 모두에 이용될 수 있다.
배아 줄기 세포에 대한 본 발명의 방법의 적용
본 발명의 또다른 실시양태는 조건부 불멸화 줄기 세포의 방법을 배아 줄기 (ES) 세포에 적용하는 것에 관한 것이다. 상기 방법은 ES 세포, 예컨대 뉴런 줄기 세포를 비롯한 뉴런 계통의 세포로부터 더 쉽게 유도되는 세포주의 생성에 유용하다.
상기 실시양태에서, 세포 (상기 경우, ES 세포)를 원종양유전자 및 아폽토시스를 억제하는 유전자 (예를 들어, MYC-ER 및 Bcl-2)로 형질도입하는 것을 포함하는 본 발명의 방법은 ES 세포에 적용되어 상기 세포의 유도된 분화를 더 조절할 수 있다. 상기 실시양태에서, 상기 세포는, 예를 들어, 트랜스제닉 마우스를 생성하기 위해 이용될 수 있고, 또한, ES 세포 및 그로부터 형성된 임의의 적절한 전구 세포군에는 활성제에 대한 노출에 의한 원종양유전자의 활성화가 시행되어, 이에 따라 신규한 조건부 형질전환된 줄기 세포주 (상이한 조직 유형), 또는 관심을 갖는 조직 유형에 대한 성숙한 세포주의 생성을 가능하게 할 수 있다. 또한, 시험관내 형질도입된 ES 세포의 유도된 분화가 또한 상기 기술한 바와 같이 분화의 중간 단계를 포획하기 위해 이용될 수 있다. 상기 방식에 있어서 ES 세포 또는 ES 유래의 세포의 이용은 상이한 질환의 배경에서의 약물 발견 및 표적 동정에 대한 신규한 기반을 제공한다.
예를 들어, 뉴런 줄기 세포가 본 발명의 상기 실시양태, 뿐만 아니라 본 발명의 방법의 이용에 의한 ES 세포의 뉴런 경로로의 유도된 분화에 이용될 수 있다. 해마로부터의 뉴런 줄기 세포의 단리 및 형질도입은 마우스에 대하여 앞서 기술한 바와 같다. 신경구에 대한 배양 조건은 상기 세포의 증식을 가능하게 하여, 이를 본 발명의 유전자 (예를 들어, MYC-ER 및 Bcl-2)의 바이러스 매개의 형질도입에 감수성이 되게 하여, 조건부 형질전환된 뉴런 줄기 세포주를 생성한다. 이식 이후 이의 시험관내 뿐만 아니라 생체내 분화는 바이러스 코딩된 리포터 유전자 뿐만 아니라 뉴런 분화에 대하여 앞서 정의된 마커에 의해 모니터링될 수 있다. 또한, 조건부 형질전환된 뉴런 줄기 세포주의 이식 이후 마우스에 대한 활성제 (예를 들어, 4-OHT)의 투여는 신경 악성 종양 (신경아세포종, 교모세포종 등)의 발생을 유도할 수 있다. 상기 종양은 임상 연구 및 표적 동정에 대한 신규한 모델을 제공한다.
예를 들어, MYC-ER 및 Bcl-2로 형질도입된 ES 세포의 유도된 분화는 앞서 정의된 성장 배지, 뿐만 아니라 사이토카인의 존재 하에 수행될 수 있다. 배양 동안 임의의 시점에 활성제 (예를 들어, 4-OHT)의 첨가는 중간 표현형의 세포의 안정화를 가능하게 하고, 추가의 분화를 겪을 수 있는 능력을 여전히 보유하는 세포주의 생성을 유도한다. 예를 들어, ES 세포로부터의 도파민 뉴런의 생성은 일반적으로 레티노산 및 FGF8의 첨가에 의해 일반적으로 수행된다. 상기 유형의 뉴런은 알츠하이머병 환자에서 관측되는 뇌 병변의 복구에 이상적이다. 그러나, 완전 분화된 뉴런 세포의 이식은 이의 성공적 이식 및 생착을 방해할 수 있다. 본원에서 계획되는 바와 같이, 도파민 뉴런 경로에 결정되었으나, 이식 이후 더 분화되는 이의 능력을 여전히 보유하는 조건부 형질전환된 세포주는 이식 및 성공적 생착의 가능성을 크게 증가시킬 것으로 예상된다. 레티노산 및 소닉 헤지호그 아고니스트를 배양물에 첨가함으로써, ES 세포로부터 운동 뉴런을 생성하기 위한 유사한 시나리오가 제안될 수 있다. 이들 뉴런 세포는 척수 손상을 복구하는 것을 도울 수 있다. 다시 한번, 완전 분화된 세포는 본 실시양태에 이용되지 않고, 그보다는 분화되는 능력을 보유하는 (본 발명의 방법에 의해 생성된) 결정된 전구 세포가 이용된다.
형질전환 유전자의 제거를 위한 조건부 불멸화 방법의 변형 또는 수정
본 발명의 하나의 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 형질전환 유전자 (예를 들어, MYC-ER)를 지니는 줄기 세포를 인간 및/또는 마우스에 도입하는 위험을 피하기 위하여, 재조합 구조체는 DNA 단편이 절제되도록 고안된다. 상기 실시양태는 본 발명의 방법에 따라 장기 줄기 세포를 먼저 확립한 후, 상기 세포 (또는 환자)를 재조합 DNA가 제거, 절제 또는 완전히 침묵될 조건에 노출시키는 임의의 적절한 방법의 이용으로 달성될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 하나의 측면에서, 박테리아 재조합 효소 접근법이 이용된다. 본 발명의 상기 측면에서, 바람직하게는, 2 가지 상이한 재조합 효소가 사용되어 2개의 유전자 중 하나가 임의의 적절한 시점에서 절제되는 조절을 가능하게 한다. 상기 재조합 효소 중 2 가지 예는 Cre 및 Flp 재조합 효소이고, 이는 종래 기술에 잘 공지되어 있다. 간략히, 재조합 효소 중 하나에 대한 인식 기질 서열 (RSS)이 레트로바이러스 구조체에 도입되어 이것이 종양유전자, 뿐만 아니라 리포터 유전자 (예를 들어, GFP 또는 Thy1.1)의 열린 해독틀에 인접하게 한다. 상기 경우, 세포는 Tat-Cre 융합 단백질 (즉, Cre에 융합된 HIV 또는 기타 레트로바이러스 Tat 단백질)을 함유하는 배지 중 항온배양된다. 상기 재조합 단백질은 앞서 기술되었고, 세포에 수동적으로 유입되어, 게놈 DNA의 loxP 부위 특이적 재조합을 매개하는 것으로 밝혀졌다. 유전자 (핵산 분자) 절제의 기타 방법이 당업자에게 공지되어 있고 본 발명에 용이하게 적용될 수 있다. 실시예 5 및 13은 본 발명의 상기 실시양태를 예시한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서, 본원에 기술된 것과 같은 형질전환 유전자를 지니는 줄기 세포를 인간 및/또는 기타 동물 (예를 들어, 마우스)에 도입하는 위험을 피하는 또다른 방법을 제공하기 위하여, 줄기 세포를 원종양유전자에 대한 재조합 구축물 또는 항아폽토시스 단백질의 조합물로 트랜스펙션하는 대신, 본 발명은 형질전환 유전자를 세포로 도입해야 할 필요 없이 Tat-융합 단백질을 단백질의 세포의 내부로의 접근을 가능하게 하는 방법으로서 이용함으로써 수행된다. tat-원종양유전자 또는 tat-항아폽토시스 유전자 (예를 들어, Tat-MYC-ER 또는 Tat-Bcl-2)를 코딩하는 재조합 구축물이 이용되어 줄기 세포를 조건부 불멸화시킬 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서, 표적 줄기 세포는, 선택된 특정 유전자 조합물 (예를 들어, MYC-ER 및 Bcl-2)에 의해 코딩되는 정제된 재조합 Tat-융합 단백질을 함유하는 배지 중, 적절한 배양 조건 하에서 배양될 것이다. 본 발명의 상기 실시양태에서, 원종양유전자 생성물 또는 유사한 유전자 산물은, 상기 실시양태에서와 같이, 유도성일 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 상기 단백질의 작용은 배양물에 단백질을 제공하거나 그로부터 제거함으로써 간단히 조절될 수 있다. 상기 접근법으로 생성된 세포주는 외인성 Tat-융합 단백질의 첨가에 지속적으로 의존하는 한편, 이는 이에 도입된 특정 외인성 뉴클레오티드 서열을 갖지 않는다. 외래 종양유전자 서열의 부재는 본 발명의 방법의 임상 개발을 개선할 것으로 예측된다. 인간 면역결핍 바이러스-1 (HIV-1) Tat는 하나의 대표적 Tat 단백질이나, 기타 레트로바이러스 Tat 단백질이 종래 기술에 공지되어 있다. 비제한적인 예로서, HIV-1 Tat를 코딩하는 핵산 서열은 본원에서 서열 9로서 나타내어지고, 상기 서열은 본원에서 서열 10에 의해 나타내어지는 아미노산 서열을 코딩한다.
또다른 실시양태에서, 예컨대 본원에 기술된 것과 같은 형질전환 유전자를 지니는 줄기 세포를 인간 및/또는 기타 동물 (예를 들어, 마우스)에 도입하는 위험을 피하는 또다른 방법을 제공하기 위하여, 줄기 세포를 원종양유전자에 대한 재조합 구축물 또는 항아폽토시스 단백질의 조합물로 트랜스펙션하는 대신, 본 발명은 압타머 기술을 이용하여 단백질 (예를 들어, MYC 및 Bcl-2)을 세포로 도입함으로써 수행된다. 압타머는 고 친화성 및 특이성으로 예정된 특이적 표적 분자에 결합되는 이의 능력에 의해 무작위로 조합된 핵산 라이브러리 중에서 선택되는 합성 핵산 (일반적으로 RNA 뿐만 아니라 DNA)의 짧은 가닥이다. 압타머는 정의된 3차원 구조로 가정되고 구조에서의 매우 작은 차이에 의해 화합물을 구별할 수 있다. 따라서, 압타머는, 예를 들어, 본 발명에 사용되는 단백질 또는 단백질을 코딩하는 비-통합 cDNA와 컨쥬게이션되어, 단백질 또는 DNA를 세포로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 압타머는, 예를 들어, 본 발명에 따른 프로아폽토시스 단백질을 파괴하는 경우, siRNA를 세포로 전달하기 위해 용이하게 이용될 수 있다. 압타머 기술은, 예를 들어, 문헌 [Davidson, 2006, Nature Biotechnol . 24(8): 951-952]; 및 [McNamara 등, 2006, Nature Biotechnol . 24(8): 1005-1015)]에 기술되어 있다. 다시, 외래 종양유전자 서열의 부재는 본 발명의 방법의 임상 전개를 개선할 것으로 기대된다.
또다른 실시양태에서, 본원에 기술된 것과 같은 형질전환 유전자를 지니는 줄기 세포를 인간 및/또는 기타 동물 (예를 들어, 마우스)에 도입하는 위험을 피하기 위한 또다른 방법을 제공하기 위해, 줄기 세포를 원종양유전자에 대한 재조합 구조체 또는 항아폽토시스 단백질의 조합물로 트랜스펙션하는 대신, 본 발명은 CHARIOT™ 기술 (뉴욕주, 알파니 소재의 크래켈러 사이언티픽, 인코포레이티드 (Krackeler Scientific, Inc))의 이용으로 원종양유전자 및/또는 항아폽토시스 단백질을 세포로 도입함으로써 수행된다. 상기 기술에 의해, CHARIOT™ 펩티드 및 관심을 갖는 단백질 간의 비공유 결합이 형성된다. 이는 단백질을 분해로부터 보호하고 트랜스펙션 과정 동안 이의 천연 특징을 보존한다. 세포로 전달시, 복합체는 해리되고 CHARIOT™은 핵으로 운반되는 한편, 전달된 단백질은 생물학적 활성이고 이의 세포 표적으로 자유롭게 나아간다. 효과적 전달은 혈청의 유무 하에 발생할 수 있고, 내재화 동안 거대분자를 변형시킬 수 있는, 엔도솜 경로에 독립적이다. 상기 전달 시스템은 또한 전사-번역 과정을 우회한다. 따라서, 본 발명에 유용한 단백질은, 세포로 원종양유전자 또는 종양유전자를 도입할 필요 없이, 세포로 전달되고 방출되어 세포를 조건부 불멸화시킬 수 있다. 이로써, 외래 종양유전자 서열의 부재는 본 발명의 방법의 임상 전개를 개선할 것으로 기대된다.
본원에 기술된 각종 바이러스 접근법에 의해 원종양유전자가 숙주 세포 게놈에 삽입되는 가능성을 제어하여, 이에 따라 형질전환 사건을 피하기 위하기 위한 더욱 또다른 대안적 (또는 추가의) 수단으로서, 약물 감응성(약물 감수성) 카세트가 사용될 바이러스 구조체로 도입되어 이것이 모든 형질도입된 세포 및 이의 분화된 자손 중 발현되도록 할 수 있다. 약물 감응성 카세트 또는 약물 감수성 카세트는 특정 약물의 존재에 감수성 또는 감응성이어서, 약물에 대한 노출시, 세포 활성이 억제되고, 바람직하게는 아폽토시스를 겪는 세포를 제공하는 단백질을 코딩하는 핵산이다. 특정 혈구군의 수준이 명백한 원인 (예를 들어, 감염, 외상, 스트레스 등) 없이 증가하는 환자에게, 감응성이 도입된 약물의 과정이 제공되어, 상기 세포를 제거하며 유전자 삽입이 종양유전자 돌연변이를 의도하지 않게 야기할 있는 세포를 수반하는 임의의 가능한 추가의 합병증을 완화할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, HPRT에 대한 cDNA를 코딩하는 카세트를 본 발명의 방법에 사용된 구조체에 도입하여 6-티오구아닌에 감수성인 형질도입된 세포를 제공할 수 있다. 또다른 비제한적인 예는 단순 헤르페스 바이러스 패밀리 구성원 (HSV-TK)으로부터 티미딘 키나아제 cDNA를 도입하여, 형질도입된 세포가 적절한 억제제, 예컨대 간시클로버, 아시클로버, 및 임의의 적절한 유도체에 감수성이 되도록 하는 것이다. 또한, 임의의 기타 상기 약물 감응성 카세트 및 이의 적절한 아고니스트가 상기 문맥에서 작용한다.
본 발명에 따른 핵산 또는 단백질을 세포에 도입하는 기타 방법은 당업장에게 명백할 것이다. 재조합 DNA가 숙주 세포 게놈으로 도입되는 위험을 최소화하거나 제거하는 것이 본 발명에 의해 바람직하며, 다수의 상기 예는 상기 기술되어 있다.
본 발명의 조건부 불멸화 세포의 사용 방법
본 발명의 또다른 실시양태는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 임의의 줄기 세포군, 예컨대 혼합 및 클론 군, 뿐만 아니라 본원에 기술된 임의의 방법, 예컨대 소정의 세포 유형으로의 분화, 및 본원에 기술된 바와 같은 이식, 세포 교환, 질환 치료, 유전자 조작, 약물 발견, 및 세포 발생 및 분화의 조사에서의 본 발명의 줄기 세포의 용도를 포함한다.
용이하게 저장되고, 회수되고, 증가되고 조작될 수 있는 균질한 줄기 세포의 실질적으로 비제한적인 공급물을 이제 제조할 수 있으므로, 상기 줄기 세포는 줄기 세포로서 사용되거나 또는 각종 세포 계통으로 분화되어 세포 분화, 유전자 발현, 및 세포 과정에 대한 각종 화합물의 효과를 시험하는 어세이에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시양태는 세포 분화, 유전자 발현, 및/또는 세포 과정에 영향을 미치는 화합물의 동정 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 일반적으로 본 발명의 방법에 의해 제조된 줄기 세포를 시험될 화합물과 접촉시키는 단계, 및 화합물의 부재 하에서와 비교시, 특정 결과, 및 특히 바람직한 결과, 예컨대 유전자 발현, 생물학적 활성, 세포 분화, 세포 성장, 세포 증식 등 (하기 참고)을 측정하여, 시험 화합물이 줄기 세포에 대하여 소정의 효과를 갖는 지의 여부를 측정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 세포 분화, 세포 활성 또는 유전자 발현의 실질적으로 임의의 측면을 시험하기 위하여 이용될 수 있다. 하나의 측면에서, 줄기 세포는 화합물과의 접촉 이전에, 예컨대 유전자 조작에 의해 조작된다. 유전적 결함을 갖는 개체로부터의 줄기 세포가 상기 어세이에서 평가되어, 예를 들어, 치료 화합물 (예를 들어, 암 치료제)을 동정하고 유전자 교환 치료를 평가할 수 있다. 실제로, 본 발명의 기술은 개체의 세포에 "맞추어진" 약물 후보 및 치료 후보 및 전략을 동정하기 위해 특정 개체의 세포를 표적하는 기회를 제공한다. 더욱이, 상기 기술한 바와 같이, 상기 어세이는 배양물 중 본 발명의 줄기 세포를 유지시키기에 적절한 기타 성장 인자 또는 배양 조건을 동정하기 위해 이용될 수 있다. 상기 어세이의 예는 하기 실시예 7에 상세히 기술되어 있으나, 본 발명이 이러한 어세이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 또다른 실시양태는 줄기 세포로부터의 세포 계통 결정 및/또는 세포의 분화 및 발생의 연구 방법에 관한 것이고, 이는 일반적으로 본 발명의 조건부 불멸화 줄기 세포를 배양하고, 세포 계통 결정 또는 분화에 영향을 미칠 수 있는 화합물 또는 작용제의 유무 하에 각종 조건 하에 세포 발생 및 분화에 관련된 유전적 및 생물학적 마커에 대하여 상기 세포를 평가하는 것을 포함한다. 상기 기술한 바와 같이, 본 발명 이전에, 상기 연구는 소정의 실험을 수행하기 위해 충분한 수의 소정의 세포군을 생성하기 위한 접근의 부족 및 무능력에 의해 심각하게 방해되었다. 예를 들어, 특정 전구 세포주의 분화에서의 중간체를 동정하거나 선별하기 위하여, 충분한 수의 세포가 수득되어 의미있고 재생가능한 결과를 제공해야 한다. 본 발명의 시점에서 이용가능한 기술의 이용으로, 이는 가능하지 않았다. 그러나, 본 발명은 각종 실험에 이용될 수 있는 균질한 줄기 세포의 증가가능하고 본질적으로 비제한적인 공급물을 제공함으로써 상기 문제를 해결한다. 상기 기술은 세포 분화 및 발견의 분야에서의 조사 능력을 크게 증진시킨다. 하나의 측면에서, 본 발명의 조건부 불멸화 줄기 세포는 증가된 후, 아집단은 세포를 조건부 불멸화 상태로 유지시키는 조건의 부재 하에 (예를 들어, 본원에 예시된 대표적 방법에 따라, 타목시펜의 부재 하에) 배양된다. 세포는 유전자 발현에서의 변화, 세포 표면 마커, 생체 분자의 분비, 또는 임의의 기타 유전자형 또는 표현형 마커에 대하여 평가되어, 세포 분화 및 계통 결정의 과정을 연구할 수 있다. 성장 인자 또는 기타 인자가 배양물에 첨가되어, 예를 들어, 특정 세포 계통 경로로의 분화를 유발하고, 세포에서의 변화가 상기 인자의 유무 하에 평가될 수 있다. 더욱이, 세포는 세포 분화 및 발생에 영향을 미치는 (조절하는) 배양 조건, 생체내 조건, 인자, 및 작용제를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 어세이 중 임의의 것에서의 세포의 유전자형 또는 표현형 특징에서의 변화의 검출에 대한 각종 방법은 종래 기술에 공지되어 있다. 유전자 서열 또는 발현을 측정하거나 검출하기 위해 이용될 수 있는 방법의 비제한적인 예로서, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 역 전사효소-PCR (RT-PCR), 제자리 PCR, 정량적 PCR (q-PCR), 제자리 하이브리드 형성, 서던 블롯, 노던 블롯, 서열 분석, 마이크로어레이 분석, 리포터 유전자의 검출, 또는 기타 DNA/RNA 하이브리드 형성 기반을 들 수 있다. 단백질 수준의 측정 방법의 비제한적인 예로서 하기를 들 수 있다: 웨스턴 블롯, 면역블롯, 효소 결합 면역흡수 측정법 (ELISA), 방사선면역측정법 (RIA), 면역침전, 표면 플라스몬 공명, 화학발광, 형광 편광, 인광, 면역조직화학 분석, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 (MALDI-TOF) 질량 분석법, 미세흐름세포측정, 마이크로어레이, 현미경검사, 형광 활성화 세포 분류법 (FACS), 흐름 세포측정, 및 DNA 결합, 리간드 결합, 기타 단백질 파트너와의 상호 작용, 세포 신호 형질도입, 효소 활성, 및 가용성 인자 또는 단백질의 분비를 포함하지만 이에 국한되지는 않는 단백질의 특성에 기초한 어세이.
약물 선별 어세이에서, 용어 "시험 화합물", "잠정적 억제 화합물" 또는 "잠정적 조절 화합물"은 특정 과정에서 공지되어 있지 않거나 앞서 예기치 못했던 조절 활성을 갖는 화합물을 일컫는다. 이로써, 화합물의 동정 방법에 있어서 용어 "동정"은 모든 화합물을 포함하기 위한 것이고, 특정 목적 (예를 들어, 세포 분화의 조절)에 대한 화합물로서의 유용성은, 바람직하게는 상기 화합물의 유무 하에, 본 발명의 방법에 의해 측정된다. 본 발명의 방법에서 선별될 화합물로서 공지된 유기 화합물, 예컨대 항체, 펩티드 라이브러리의 생성물, 및 화학적 조합 라이브러리의 생성물을 들 수 있다. 화합물은 또한 합리적 약물 설계의 이용으로 동정될 수 있다. 상기 방법은 당업자에게 공지되어 있고 3차원 영상 소프트웨어 프로그램의 이용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 방법에 유용한 모방체 또는 기타 치료 화합물을 설계하거나 선택하는 데 유용한, 각종 약물 설계 방법은, 본원에서 그 전문을 참고로 인용하는, 문헌 [Maulik 등, 1997, Molecular Biotechnology : Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc.]에 개시되어 있다.
상기 기술한 어세이 중 임의의 것에 있어서, 본 발명의 세포, 세포 용해물, 핵산 분자 또는 단백질이, 예컨대 혼합에 의해, 잠정적 조절 화합물에 노출되거나 또는 이와 접촉되는 조건은 임의의 적절한 배양 또는 어세이 조건이며, 이는 세포가 배양 될 수 있거나 (예를 들어, 상기 기술한 바와 같이) 또는 세포 용해물이 잠정적 조절 화합물의 유무 하에 평가될 수 있는 유효 배지의 사용을 포함할 수 있다. 본 발명의 세포는 각종 용기, 비제한적인 예로서, 조직 배양 플라스크, 시험관, 미량역가 접시, 및 페트리 판 중 배양될 수 있다. 배양은 세포에 적절한 온도, pH 및 이산화탄소 함량에서 수행된다. 상기 배양 조건은 또한 종래 기술의 범위 이내에 있으며, 본 발명의 조건부 불멸화 줄기 세포의 배양에 특히 적절한 조건은 본원의 다른 곳에 상세히 설명되어 있다. 세포는 접촉될 용기당 세포의 수, 세포에 투여되는 잠정적 조절 화합물(들)의 농도, 잠정적 조절 화합물과 세포와의 항온배양 시간, 및 세포에 투여될 화합물의 농도를 고려한 조건 하에 잠정적 조절 화합물과 접촉된다. 유효 프로토콜의 결정은 용기의 크기, 용기 중 액체의 부피, 어세이에 사용되는 특정 세포 유형의 배양에 적절한 것으로 공지된 조건, 및 시험될 잠정적 조절 화합물의 화학적 조성 (즉, 크기, 전하 등)과 같은 변수에 기초하여 당업자에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명의 세포 및 방법은 인간 제대혈 유래의 ctlt-HSC, 말초혈로부터 단리된 CD34+ 세포, 또는 성체 CD34+ 세포의 다능성의 대한 방법에 유용하다. 상기 방법은 실시예 11에 기술되어 있다.
본 발명의 더욱 또다른 실시양태는 급성 골수성 백혈병 (AML)의 신규한 모델을 생성하기 위한 기반으로서의 ctlt-HSC 세포주의 용도에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명자는 본 발명의 ctlt-HSC를 이용하여 급성 골수성 백혈병의 마우스 모델을 생성하였다. 이는 이의 표면 마커 발현에 기초하여, HSC와 유사한 세포로 이루어진 백혈병이다. 마우스 중 백혈병을 촉진하는 ctlt-HSC를 생성하기 위하여, 103 ∼ 105개의 ctlt-HSC가 105개의 Rag-1-/- 전 골수 세포와 함께 치사적으로 방사선 조사된 수혜자 마우스에 전달된다. 마우스에게 4-OHT의 투여량을 매주 제공하여 종양유전자 활성을 유지하고, 종래 기술에 공지된 바와 같은, 백혈병과 관련된 임상 징후를 모니터링한다. 종양은 상기 동물로부터 회수되었고 이는 4-OHT의 부재 하에 배양물 중 증식될 수 있다. 상기 세포는 이의 HSC 유사 표현형을 보유하며, 이는 증식, 생존, 및 정지된 분화를 위해 상기 세포가 더이상 MYC 과다활성에 예민하게 의존하지 않는다는 점을 나타낸다. 백혈병 세포주는 또한 방사선 조사된 수혜자 마우스에 대한 2차 이식시 질환을 줄 수 있다. 상기 도구는 생물학을 연구하고 AML 및 관련 질환에 대한 새로운 치료 방법을 수출하는 신규한 기반을 제공한다. 더욱이, ctlt-HSC 세포주의 4-OHT로 치료된 마우스로의 도입은 치료를 위한 우수한 고유의 양성 대조군: 4-OHT의 투여 중지를 제공할 것이다. 생체내 종양의 확립 이후 발생하는 2차 세포주가 또한 이용되어 AML의 약물 저항성 형태에 대한 적절한 치료 표적을 이해할 수 있다.
본 발명의 기타 실시양태는 본 발명의 방법에 의해 생성된 줄기 세포, 뿐만 아니라 상기 줄기 세포로부터 분화된 세포의 각종 치료 및 건강 관련 방법에서의 용도에 관한 것이다. 상기 방법은 일반적으로 본 발명의 방법에 의해 제조된 조건부 불멸화 줄기 세포의 군, 배양물 또는 주를 수득하는 단계, 상기 세포가 조건부 불멸화되는 조건을 제거하는 단계, 및 그 후 세포를 치료 프로토콜에 이용하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 세포는 세포를 필요로 하는 개체에게 직접 투여될 수 있거나, 세포는 시험관내에서 소정의 세포 유형으로 분화된 후 개체에게 투여될 수 있다. 또한, 세포가 불멸화되는 조건의 제거 이전 또는 직후에, 세포는, 제어된 환경 하에서의 유전자 치료의 신규한 방법으로서, 시험관내 유전자 변형되어 유전자 또는 유전자들을 발현시키거나 침묵시킬 수 있다. 그 후, 세포는 개체에게 줄기 세포로서 투여되거나 또는 먼저 소정의 세포 계통으로 시험관내 분화될 수 있다.
줄기 세포를 수득하기 위하여, 하나의 실시양태에서, 줄기 세포는 치료될 개체로부터 수득된 후, 본 발명의 방법에 따라 조건부 불멸화된다. 상기 세포는 광범위하게 증식되고, 저장되며 (예를 들어, 냉동되거나 냉동보존됨), 그 후 재생되어 다시 증가되고, 조작되고/거나 필요시 반복 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 치료될 개체로부터 조건부 불멸화된 줄기 세포의 미리 저장된 공급원을 입수함으로써 줄기 세포를 얻는다. 더욱 또다른 실시양태에서, 줄기 세포는 미리 생성되고 "일치하는" 기증자를 동정하기 위해 이용되는 현재 기준에 따라 유의한 백분율의 집단에 적용되는 인간 줄기 세포주의 명부로부터 얻어진다. 하나의 실시양태에서, 세포는 새로운, 또는 냉동 보존된 제대혈, 시험관내 ES 세포의 유도된 분화로부터 유래할 수 있는 조혈 전구 세포군, 정상, 또는 말초 순환으로 이의 lt-HSC를 동원하도록 유도된 G-CSF 처리된 환자의 말초혈로부터 얻어진 HSC로부터 얻어진다. 줄기 세포의 기타 공급원은 당업자에게 명백할 것이다. 세포는 본원에서 앞서 기술한 방법에 따라 배양되고, 불멸화를 조절하는 조건은 적절한 시기에 제거될 수 있다. 또한, 개체에 대한 세포의 투여 이전에, 세포는 조건부 불멸화의 원인이 되는 유전자 또는 구조체 (즉, 원종양유전자 및/또는 항아폽토시스 코딩 유전자)를 절제하도록 조작될 수 있거나, 또는, Tat-융합에 대하여 상기 기술한 바와 같이, 배양 배지 중 가용성 융합 단백질의 사용을 통해 세포가 유지되는 경우, 상기 가용성 단백질은 배양물로부터 점차 또는 즉시 제거될 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 줄기 세포 (예컨대, 상기 줄기 세포를 포함하는 조성물), 또는 상기 세포로부터 분화된 세포를 개체 (이는 임의의 동물을 포함할 수 있음)에게 전달하는 것을 포함한다. 상기 방법에 이용된 줄기 세포는 시험관내에서 제조되므로, 비록 줄기 세포가 환자로부터 초기에 단리되었더라도, 세포의 전 투여 과정은 본질적으로 생체외 투여 프로토콜이다. 생체외 투여는 환자의 외부에서 조절 단계의 일부를 수행하고, 개체로부터 제거된 조건부 불멸화 줄기 세포를 제조하며 (이는 본질적으로 정상 줄기 세포 이외의 유전자 변형된 줄기 세포를 제조하는 것을 포함할 수 있음), 세포, 또는 상기 세포로부터 분화된 세포를 환자에게 반환하는 것을 일컫는다. 본 발명에 따라 제조된 줄기 세포 또는 그로부터 분화된 세포는, 임의의 적절한 투여 방식에 의해, 개체에게 반환되거나, 또는 개체에게 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신, 점막 및/또는 표적 부위의 위치에 근접한 것일 수 있다. 바람직한 투여 경로는, 예방되거나 치료될 상태의 유형 또는 투여 이유에 따라, 당업자에게 명백할 것이다. 바람직한 투여 방법의 비제한적인 예로서, 정맥내 투여, 복막내 투여, 근육내 투여, 결절내 (intranodal) 투여, 관상내 투여, 동맥내 투여 (예를 들어, 경동맥으로), 피하 투여, 경피 전달, 기관내 투여, 피하 투여, 관절내 투여, 심실내 투여, 수강내, 폐 투여, 카테터의 주입, 및 조직으로의 직접 주사 (예를 들어, 예컨대 간의 삽관술)를 들 수 있다.
세포는 담체 또는 약학적 허용 부형제와 함께 투여될 수 있다. 담체는 전형적으로 치료되는 개체 내에서 치료 조성물의 반감기를 증가시키는 화합물이다. 적절한 담체의 비제한적인 예로서, 중합 조절된 방출 제형물, 생분해성 이식물, 리포솜, 오일, 에스테르, 및 글리콜을 들 수 있다. 본원에서 사용시, 약학적 허용 담체는 본 발명의 방법에 의해 제조된 세포를 적절한 생체내 부위에 전달하기에 적절한 임의의 물질을 일컫는다. 바람직한 약학적 허용 부형제는, 세포가 신체 내 표적 조직 또는 부위에 도달시, 세포가 개체에게 유용한 방식으로 기능할 수 있는 형태로 세포를 유지시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 유효 투여 프로토콜은 환자에게 일시적 또는 장기간 이점을 제공하기 위하여 환자에게 유용한 수의 기능적 세포의 전달을 제공하는 적절한 투여 파라미터 및 투여 방식을 포함한다. 유효 투여 파라미터는 특정 상태 또는 질환에 대한 종래 기술의 표준 방법의 이용으로 결정될 수 있다. 상기 방법의 비제한적인 예로서, 생존율, 부작용 (즉, 독성) 및 질환의 진행 또는 퇴행의 측정을 들 수 있다.
본 발명에 따른 줄기 세포 또는 그로부터 분화된 세포의 적절한 단회 투여량은, 적절한 기간에 걸쳐 1 회 이상 투여되는 경우, 환자에게 유용한 수의 세포를 제공할 수 있는 투여량이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 줄기 세포의 바람직한 단회 투여량은 투여당 개체당 약 0.5 x 104 내지 약 5.5 x 108, 또는 약 0.5 x 105 내지 약 5.5 x 107, 또는 약 0.5 x 106 내지 약 5.5 x 1010개의 줄기 세포이고, 이때 약 1 x 108 내지 약 5.5 x 1010개의 투여량이 더욱 더 바람직하다. 102개의 세포의 증분으로, 0.5 x 104 내지 약 5.5 x 1010개 사이의 임의의 투여량이 본 발명에 포함된다. 더 높거나 낮은 투여량은 투여될 줄기 세포 또는 분화된 세포의 유형, 및 또한 투여 경로에 따라 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 동물에게 투여될 투여의 횟수는 상태 또는 질환의 정도 및 치료될 개별 환자의 반응에 의존함이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 적절한 투여 횟수는 기정 질환의 치료에 요구되는 임의의 횟수를 포함함이 본 발명의 범위 이내에 있다.
본원에서 사용시, 문구 "질환으로부터 보호됨"은 질환의 증상의 감소; 질환의 발생의 감소, 및/또는 질환의 심각성의 감소를 일컫는다. 동물 (개체, 대상체)의 보호는 본 발명에 따라 제조된 세포가, 동물에게 투여되는 경우, 질환이 발생하는 것을 방지하고/거나 질환 증상, 징후 또는 원인을 치료하거나 완화시키는 능력을 일컬을 수 있다. 이로써, 질환으로부터 동물을 보호하는 것은 질환 발생의 예방 (예방 처치) 및 질환을 갖거나 질환의 초기 증상을 경험하는 동물의 치료 (치료 처치) 모두를 포함한다. 용어, "질환"은 포유동물의 정상 건강으로부터의 임의의 일탈을 일컬으며, 질환 증상이 존재할 때의 상태, 뿐만 아니라 일탈 (예를 들어, 감염, 유전자 돌연변이, 유전적 결함 등)이 발생하나, 증상이 아직 표명되지 않은 상태도 포함한다.
상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 줄기 세포는 각종 상태를 치료 또는 예방하기 위하여 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 줄기 세포는 각종 이식 및 치료 전략, 예컨대 암, 및 특히, 방사선에 의해 치료되는 암의 치료에 사용하기 위한 증가가능한 줄기 세포의 유일한 공급원을 제공한다. 또한, 각종 면역 결핍 장애 및 빈혈 장애 (예를 들어, 재생불량성 빈혈 또는 용혈성 빈혈)도 상기 기술로부터 크게 이점을 얻을 것인데, 왜냐하면 본 발명은 개체에 의해 필요시 상기 개체에게 조혈 세포를 재증식시키는 능력을 제공하기 때문이다. 본 발명의 또다른 용도는, 예를 들어, 화상 피해자, 화학 요법 및/또는 방사선 요법을 받아서 모발 성장의 비가역적 상실이 초래된 임의의 개체, 뿐만 아니라 두개골에 영향을 미치는 임의의 수술 절차 이후의 환자에 대한 재건 수술의 문맥에서, 또는 유전형 대머리에 의해 영향을 받은 개체에서의 모발 성장의 유도를 수반하는 예정 수술에 사용하기 위한, 연속적으로 증가가능하고 재생가능한 모낭 줄기 세포의 생성에 관한 것이다. 유사하게, 본 발명을 피부의 줄기 세포에 적용하는 것은 상처 치유 및 화상 피해자의 치료, 뿐만 아니라 외상 및 기타 환자에 대한 성형 재건 수술, 뿐만 아니라, 예정 수술, 비제한적인 예로서, 미용 수술에 사용하기에 매우 가치있다. 상기 세포는 추가로 유전자 조작되어 어린 개체 및 노령 개체에서의 선천적 또는 후천적 유전적 결함을 보정할 수 있다. 당업자는 상기 개시 내용에 기초하여 각종 기타 줄기 세포군, 비제한적인 예로서, 몇몇을 들면, 폐, 심장, 및 장 상피 유래의 줄기 세포 및 신경 및 심장 조직 유래의 줄기 세포에 대한 본 발명의 이용으로부터 이점이 얻어질 수 있다는 점을 이해할 것이다.
또한, 상기 기술한 바와 같이, 본 발명은 개체의 일생에 걸쳐 필요시 개체로 하여금 자가조직 줄기 세포 및 그로부터 분화된 세포의 증가가능한 공급물에 대하여 접근하게 하는 유일한 기회를 제공한다. 본 방법에 의해 생성된 상기 줄기 세포는 저장되어 개체의 일생 동안 필요시에 (예를 들어, 개체에게 암 또는 면역 결핍 질환이 발생되는 경우) 치료 프로토콜의 일부로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법의 이용으로 조건부 불멸화되고 증가된 개체로부터 얻어진 자가조직 줄기 세포를 조작함으로써 유전적 결함이 이제 보정될 수 있거나 또는 이로운 유전자 변형이 체세포에 도입될 수 있다. 그 후, 줄기 세포는 이것이 얻어진 개체로 재도입될 수 있다.
본 발명의 추가의 적용은 COPD, IPF, 기종, 천식 및 흡연의 결과로서 발생하는 폐 손상을 복구하기 위한 줄기 세포주의 용도를 포함한다. 또한, 상기 세포는 심장에서의 혈관 손상을 치료하고, 치사적 방사선 조사 이후의 자가면역 질환 (예를 들어, SLE, 당뇨병, RA)을 돕기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 세포 및 상기 세포를 포함하는 조성물은 임의의 동물, 예컨대 포유류, 척추동물 강의 임의의 구성원, 비제한적인 예로서, 영장류, 설치류, 가축류 및 가정의 애완동물에 투여될 수 있다. 치료될 바람직한 포유동물은 인간이다.
본 발명의 각종 측면은 하기 실시예 및 첨부되는 도면에 더 상세히 기술된다. 그러나, 본 발명이 본 발명의 이들 실시예 및 예시에 국한되지는 것은 아니다.
실시예 1
하기 실시예는 장기 조혈 줄기 세포 (lt-HSC)를 가역적으로 불멸화하는 방법의 개발을 기술한다.
조혈계 발생 장애의 분자 기준의 해명은, 신호전달 및 다운스트림 반응의 생화학적 분석을 방해하는, 적절한 세포군의 낮은 빈도에 의해 역사적으로 복잡하였다. 사실상, 이는 조혈의 모든 연구에 있어서 주요 제한 인자가 되어 왔다. 또한, LT-HSC의 제한된 이용가능성 또한 인간에서의 다수의 유형의 암 뿐만 아니라 여러 종류의 면역 결핍의 치료에서의 주요 방해물이 되어 왔다.
상기 제약을 극복하기 위한 노력으로, 본 발명자는 초기 조혈 줄기 세포 전구 세포를 나타내는 조건부 형질전환된 세포주를 제조하는 방법을 개발하였다. 초기 전략은 5FU 처리된 어린 및 면역학적 노령 3 ∼ 83 마리의 마우스의 레트로바이러스 형질도입을 포함하였다. 본 발명자는 Bcl-2 및 GFP, 및 MYC-ER 및 GFP를 코 딩하는 삽입체를 갖는 pMSCV 비시스트론 레트로바이러스 벡터를 이용하였다 (문헌 [Van Parijs, L., Y. Refaeli, A.K. Abbas, 및 D. Baltimore. (1999) Autoimmunity as a consequence of retrovirus-mediated expression of C-FLIP JJin lymphocytes. Immunity, 11, 763-70]). 본 발명자는 MYC가 림프구에서의 사이토카인 유래의 생존 및 증식 신호를 대체하는 능력을 가짐을 알았으므로 상기 유전자를 선택하였다. 표적 세포를 제한함으로써, 본 발명자는 줄기 세포 종양이 형성될 수 있음을 가정하였다. 중요하게는, MYC-ER 기능은 상기 환경에서 타목시펜 의존적이어서, 타목시펜을 동물 또는 배양물로부터 투여 중지함으로써 MYC 기능 및 형질전환이 종결되게 한다. MYC-ER로 형질도입된 세포 중, 융합 단백질이 생성되나, 타목시펜에 노출될 때까지 세포질 중 보유된다.
더 구체적으로는, 5FU 처리된 마우스로부터의 줄기 세포군을 양쪽 레트로바이러스 (MYC-ER 및 Bcl-2를 코딩함)로 형질도입하고 치사적으로 방사선 조사된 수혜자 마우스 (1200 라드)에 전달하였다. 10 일 이후, 마우스당 1 ㎎의 오일에 유화된 4-히드록시타목시펜 (4OHT)의 매주 복막내 주사를 개시하여 MYC 기능을 활성화시켰다 (도 1). 4 주 이내에, 어린 (노령이 아닌) 형질도입된 줄기 세포의 수혜자에서 종양이 발생되었다. 종양을 골수, 비장 및 림프절로부터 적출하고 타목시펜과 함께, 그러나 사이토카인을 첨가하지 않고 시험관내 배양하였다. 상기 세포는 약 10 일 동안 성장하였으나, 그 후 성장이 멈추었고 세포는 결국 사멸하였다.본 발명자는 아마 세포가 분화하고 있으며 이는 세포 성장을 위한 사이토카인의 필요성으로 인한 것일 수 있다고 생각하였다. 도 1을 살펴보면, 곡선은 생체내 이식 및 MYC 기능의 활성화 이후 사망 속도를 나타낸다. 마우스는 한결같이 백혈병으로 사망하였다. MYC의 과발현은 사이토카인 의존적 증식 및 생존 기능을 대체할 수 있는 한편, 이는 사이토카인 유래의 분화 신호에는 수반되지 않는 것으로 보인다.
병든 경우, 마우스를 안락사시켰다. 골수, 비장 및 림프절 세포를 적출하고 타목시펜 및 줄기 세포 성장 인자 칵테일 (IL-6, IL-3 및 줄기 세포 인자 (SCF))과 함께 배양물 중 위치시켰다. 동시에, 세포를 흐름 세포측정에 의해 분석하였다 (도 2). 도 2를 살펴보면, 점 플롯은 IL-3, IL-6 및 SCF를 갖는 배양물 중 3 일 이후 HSC의 전방 (FSC) 및 측면 (SSC) 산포 특징에 대한 흐름 세포측정 데이터를 나타낸다. 상기 2 가지 기준은 세포 크기 (FSC) 및 입도 (SSC)와 상호관련된다. 두 군은 유사한 프로파일을 갖는다. 막대 그래프는 각 세포군 중 발현된 GFP의 수준을 나타낸다. 이는 MYC-ER 및 Bcl-2에 대한 cDNA를 코딩하는 레트로바이러스로 시험관내 레트로바이러스 형질도입하는 효능을 반영한다.
모든 경우, 생체외 GFP+ 세포는 >90% Sca-1+였고 계통 마커 음성이었다. 배양물 중 수 일 이후, 세포는 성장하기 시작하였고 대략 400개의 주를 이후 연구를 위해 냉동시켰다. 증식 이후, 상기 세포는 EGFP의 발현을 보유하였고 SCA1에 대하여 균일하게 양성이고 CD34, Flk2 및 계통 마커에 대하여 음성이었다 (도 3). 어린 마우스 유래 및 노령 마우스 유래의 마커 간의 마커 발현에서의 유일한 차이는 어린 것의 경우 c-kit의 증가된 발현이었다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자는 이것이 마커가 분석되기 이전에 c-kit 리간드 중 노령 주의 더 긴 배양 (3 개월 대 3 주)으로부터 발생할 수 있을 것으로 믿는다. 마지막으로, 본 발명자는 상기 주가 냉동 이후 쉽게 회수되고 이의 원래 표현형을 보유할 수 있음을 발견하였다. 중요하게는, 상기 세포주는 표현형이 균일하고 마우스에서 모든 장기 재구성을 제공하는 lt-HSC의 표현형을 나타낸다. (문헌 [Reya, T., Duncan, A. W., Ailles, L., Domen, J., Scherer, D.C., Willert, K., Hintz, L., Nusse, R., 및 Weissman, I.L. (2003). A role for Wnt signaling in self-renewal of hematopoietic stem cells. Nature 423, 409-14]).
최근, 본 발명자는 상기 기술한 바와 같이 제조된 주 유래의 10개의 골수를 해동하였고, 사이토카인 칵테일 및 4OHT 중 배양시킴으로써 상기 10개의 주 중 9개를 용이하게 회수할 수 있었다. 본 발명자는 상기 종양의 표현형을 검사하였고, 그 결과는 매우 유망하였다. 구체적으로, 각 주는 전방 및 90°의 광 산란에 기초하여 2개의 뚜렷한 세포군을 함유하였다. 9개의 주는 상기 군의 비율에서만 상이하였다. 세포 크기가 더 큰 상기 군은 균일한 GFP 밝기였고, Sca1, 엔도글린 및 ckit에 대하여 양성이나 Flt3, B220, CD19 및 mIgM에 대하여 음성이었다. CD34-도 음성인 것으로 보였으나, 이는 확인을 요구하였다 (도 3). 상기 표현형은 장기 재증식성 다능성 줄기 세포의 공개된 특징에 완벽하게 부합된다 (문헌 [Reya 등, 상동]). 본 발명자는 어린 기증자 마우스로부터 얻은 형질도입된 HSC로부터 발생된 백혈병으로부터 최근 얻은 세포주에서 동일한 초기 표현형을 관측하였다 (도 3).
상기 셀이 분화되는 능력을 시험하기 위하여, 대표적 주를 타목시펜의 유무 하에 그리고 IL-3, IL-6 및 SCF의 존재 하에 배양하여 7 일 동안 MYC-ER 기능을 종결시킨 후 표현형 마커를 분석하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 유의한 비율의 세포가 B220 (∼ 12%), CD19 (∼ 10%) 및 mIgM (∼ 10%)을 포함하는 B 계통 마커를 달성하였다. 또한, 본 발명자는 배양물로부터 4OHT를 제거함으로써 하기 계통을 시험관내 생성할 수 있었다: CD4+ ab T-세포, 골수 세포 (Mac-1+), ter-119+ 적혈구 전구 세포, NK1.1 발현 세포, 호중구 (Gr-1+ 세포). 추가의 실험은 상기 세포가 기타 계통을 발생시키는 능력, 뿐만 아니라 사이토카인 요법의 변화가 분화에 미치는 효과를 평가한다. 비록 비교를 수행하지 않았지만, 본 발명자는, 노령 동물과 비교시, 어린 동물로부터의 분화는 B 세포 생성에 있어서 훨씬 더 효과적일 것으로 예상한다. 본 발명자가 아는 한, 이는 시험관내에서 분화되도록 유도될 수 있는 조건부 불멸 조혈 줄기 세포주의 최초의 예이다.
실시예 2
하기 실시예는 LT-HSC 주의 치사적으로 방사선 조사된 수혜자로의 입양 전달 결과를 기술한다.
실시예 1에 기술된 HSC 주가 노령 동물에서의 불완전한 B 세포 림프구 생성의 근거의 분석을 위한 적절한 대상체일 경우, 이는 생체내 상기 결점을 반복해야한다. 본 발명자는 LT-HSC 주를 치사적으로 방사선 조사된 수혜자에게 입양 전달함으로써 상기 문제점을 해결하기 시작하였다. 초기 실험에서, 노령 동물로부터의 주 (>60% ID-)를 RAG2-/- 골수와 함께 전달하였고, 수혜자를 타목시펜으로 처리하여 MYC-ER을 침묵시켰다. 6 주 이후 수혜자 골수 및 비장 세포를 적출하고 GFP+ 세포의 회수 및 표현형 (HSC 주 유래의 GFP 마커 세포)을 분석하였다 (도 5).
도 5에 제공된 3 마리의 마우스로부터의 데이터에서, 한 마리의 마우스는 노령 HSC 주 ABM42를 투여받고, 2 마리의 마우스는 노령 HSC 주 ABM46을 투여받았다. 전달되는 주에 따라, 림프구 산포 게이트에서 30 내지 70%의 세포가 GFP+였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 시험된 양쪽 주 (ABM46 및 ABM42)는 B (CD19+) 및 T (TCR+, CD4+, CD8+) 세포, 대식구 (CD11b+) 및 과립구 (GR1+)를 발생시켰다. 상기 계통의 비율에 있어서 수혜자마다 약간의 차이가 있었다. 그러나, 중요하게는, 시험된 양쪽 주는 성숙한 CD4 및 CD8 단일 양성 T 세포를 발생시킨 한편 (도 7), B 세포 발생은 기원 단계를 넘어서 진행되지 않았다 (도 6). B220+, CD19+ 세포가 발생된 한편, 이는 mIg+ 단계로 진행되지 않았다. 이는 정확하게는 면역학적 노령 마우스로부터의 BM HSC를 이용한 자가재구성 및 양자 재구성을 수반하는 실험의 결과에 의해 예측된 결론이다. (문헌 [Johnson, S.A., SJ. Rozzo, 및 J.C. Cambier, Aging-dependent exclusion of antigen-inexperienced cells from the peripheral B cell repertoire. J Immunol, 2002. 168(10): p. 5014-23]). 다시 말해, 면역학적 노령 마우스로부터의 전 골수가 이식에 이용되는 경우 동일한 발생 정지가 관측된다.
본 발명자는 상기 시스템이 원래의 HSC 주의 양자 수혜자의 골수로부터 LT- HSC 주를 성공적으로 재확립하는 추가의 단계로 취해질 수 있음을 발견하였다 (데이터는 도시되지 않음). 이는 골수 세포를 줄기 세포 사이토카인 + 타목시펜 중 배양하여 MYC를 재활성화시킴으로써 간단히 달성되었다. 상기 세포는 이제 성장하여 원래의 표현형을 나타낸다.
실시예 3
하기 실시예는 전적으로 시험관내에서 수행된 방법의 이용으로 HSC를 가역적으로 불멸화시키는 방법을 기술한다.
본원에서 앞서 기술한 조건부 불멸화 장기 HSC 세포주를 생성하는 방법에 추가하여, 본 발명자는 상기 절차를 완전히 시험관내에서 수행할 수 있었다. 상기 기술된 방법은 형질도입된 HSC를 마우스에 도입하여, 이의 생체내 형질전환을 유도하는 것에 의존한다. 상기 절차를 시험관내에서 수행하는 이점은 상기 과정의 모든 측면이 제어된 환경에서 수행된다는 점이다.
상기 방법은 먼저 기증자 마우스를 5-플루오로우라실 (5-FU)로 처리하여 HSC를 풍부하게 하고 상기 세포가 증식되게 하는 것을 포함한다. 마우스의 경골 및 대퇴골로부터의 5FU 농후 조혈 줄기 세포를 수집한 후, 15%의 열 불활성화된 소 태아 혈청 및 IL-3, IL-6 및 SCF를 함유하는 DMEM 배지 중 24 웰의 조직 배양 플레이트에, 웰당 1.8 ∼ 2.0 x 106 세포의 밀도로 평판배양하였다. 상기 세포에 3 회 의 스핀 감염을 실시하여 MYC-ER 및 Bcl-2를 코딩하는 레트로바이러스 벡터로 세포를 레트로바이러스 형질도입하였다. 간략히, 세포를 pMIG-MYC.ER 또는 pMIT-Bcl2 로 트랜스펙션하였다. 바이러스를 함유하는 상청액을 수집하고 4 ㎍/㎖의 폴리브렌 및 1O mM의 HEPES로 보충하고, 0.45 ㎛의 필터를 통해 통과시켰다. 2개의 상이한 바이러스 상청액을 1:1의 비로 혼합하고 웰에 첨가하였다. 그 후, 세포를 2000 rpm에서 1 시간 동안 원심분리하였다. 바이러스 상청액을 각 스핀 감염의 말기에 대체하였다. 마지막 회의 감염 이후 24 시간째, 흐름 세포측정 분석에 의해 형질도입의 수준을 측정하여 형질도입 효율을 측정하였다. 그 후, 형질도입된 세포를 IL-3, IL-6, SCF 및 1O nM의 4OHT를 함유하는 DMEM 배지 중 항온배양하였다. 배지를 매 3 일마다 대체하고 사이토카인 및 4OHT의 새로운 공급을 확보하는 데 특히 중점을 두었다. 세포를 서서히, 필요시마다 계대배양한다.
상기 시험관내 접근법의 이용으로, 본 발명자는 하기 유전자 조합물을 갖는 조건부 불멸화 세포주를 생성할 수 있었다: MYC-ER 및 Bcl-2; MYC-ER 및 hTERT (인간 텔로머라아제의 역 전사효소 성분); ICN-1-ER (노치-1의 세포내 부분의 ER-조절된 활성 성분) 및 Bcl-2; ICN-1-ER 및 hTERT; 및 MYC-ER 및 ICN-1-ER. 도 8 ∼ 11에 제공된 데이터는 상기 세포주 중 대부분의 초기 특성화를 보여준다. 이는, 정상 장기 조혈 줄기 세포에 의해 제공된 것과 일치하는 표현형인, c-kit+, Sca-1+, CD34-, flk2- 세포로 이루어진 주를 제공하였다. 도 8 ∼ 11에 제공된 데이터는 레트로바이러스 코딩된 리포터 유전자 (GFP 및 Thy1.1), 뿐만 아니라 줄기 세포에 대한 4 가지 마커: c-kit, sca-1, CD34 및 flk-2의 흐름 세포측정 분석으로부터 유도된다. 도 8 ∼ 11에 도시된 세포주는 표현형 검사 이전에 5 주 동안 배양물 중 존재하였다. 상기 세포를 증가시키고 연속 배양물 중 35 일에 걸쳐 현재까지 분열 시켰다.
도 8을 언급하면, 상기 도면은 레트로바이러스에 의해 BCL-2 및 MYC-ER로 형질도입되고 연속 시험관내 배양물 중 >90 일 동안 유지된 어린 C57/BL6 마우스로부터 얻어진 HSC 유래의 세포주의 표현형 비교를 도시한다. 90 일의 연속 배양 이후 수 개월째 대표적 클론 3개 (어린)의 표현형이 도시되어 있다.
도 9를 언급하면, 상기 도면은 레트로바이러스에 의해 종양유전자의 상이한 조합물로 형질도입되고 연속 시험관내 배양물 중 >90 일 동안 유지된 어린 C57/BL6 마우스로부터 얻어진 HSC 유래의 세포주의 표현형 비교를 도시한다. 5FU 농후 HSC를 pMIG-MYC 및 pMIT-Bcl-2 (상부 패널), pMIG-MYC.ER 및 pMIG-hTERT (중간 패널), 또는 pMIG-ICN.1.ER 및 pMIT-Bcl-2로 레트로바이러스 형질도입하였다. 세포를 15%의 소 태아 혈청, 및 IL-6, IL-3 및 SCF의 칵테일이 보충된 DMEM 중 유지시켰다. 90 일의 연속 배양 이후 수 개월째 대표적 클론 3개 (어린)의 표현형이 도시되어 있다. 패널은 바이러스 발현 마커 (GFP 및 Thy1.1), 뿐만 아니라 마우스 중 장기 HSC를 정의하기 위해 필요한 4 가지 마커, Sca-1, c-kit, CD34 및 Flk-2의 발현의 흐름 세포측정 분석 결과를 나타낸다. 4개의 세포주는 lt-HSC의 표현형 (Sca-1+, c-kit+, CD34-, flk-2-)을 보유한 하위 집단을 포함하였다.
도 10을 언급하면, 상기 도면은 레트로바이러스에 의해 종양유전자의 상이한 조합물로 형질도입되고 연속 시험관내 배양물 중 >90 일 동안 유지된 어린 C57/BL6 마우스로부터 얻어진 HSC 유래의 세포주의 표현형 비교를 도시한다. 5FU 농후 HSC를 pMIG-ICN.1.ER 및 pMIT-Bcl-2 (상부 패널), pMIG-ICN.1 및 pMIT-Bcl-2 (두번째 열의 패널), 또는 pMIG-ICN.1 및 pMIG-Bcl-2 (세번째 열의 패널), 또는 pMIG-hTERT 및 pMIT-Bcl-2 (하부 패널)로 레트로바이러스 형질도입하였다. 상기 세포를 15%의 소 태아 혈청, 및 IL-6, IL-3 및 SCF의 칵테일이 보충된 DMEM 중 유지시켰다. 90 일의 연속 배양 이후 수 개월째 대표적 클론 3개 (어린)의 표현형이 도시되어 있다. 패널은 바이러스 발현 마커 (GFP 및 Thy1.1), 뿐만 아니라 마우스 중 장기 HSC를 정의하기 위해 필요한 4 가지 마커, Sca-1, c-kit, CD34 및 Flk-2의 발현의 흐름 세포측정 분석 결과를 나타낸다. 4개의 세포주는 lt-HSC의 표현형 (Sca-1+, c-kit+, CD34-, flk-2-)을 보유한 하위 집단을 포함하였다.
도 11을 언급하면, 상기 도면은 레트로바이러스에 의해 종양유전자의 상이한 조합물로 형질도입되고 연속 시험관내 배양물 중 >90 일 동안 유지된 어린 C57/BL6 마우스로부터 얻어진 HSC 유래의 세포주의 표현형 비교를 도시한다. 5FU 농후 HSC를 pMIG-MYC 및 pMIG-ICN.1 (상부 패널), pMIG-MYC.ER 및 pMIG-ICN.1 (중간 패널), 또는 pMIG-ICN.1.ER 및 pMIG-MYC로 레트로바이러스 형질도입하였다. 상기 세포를 15%의 소 태아 혈청, 및 IL-6, IL-3 및 SCF의 칵테일이 보충된 DMEM 중 유지시켰다. 90 일의 연속 배양 이후 수 개월째 대표적 클론 3개 (어린)의 표현형이 도시되어 있다. 패널은 바이러스 발현 마커 (GFP 및 Thy1.1), 뿐만 아니라 마우스 중 장기 HSC를 정의하기 위해 필요한 4 가지 마커, Sca-1, c-kit, CD34 및 Flk-2의 발현의 흐름 세포측정 분석 결과를 나타낸다. 4개의 세포주는 lt-HSC의 표현형 (Sca-1+, c-kit+, CD34-, flk-2-)을 보유한 하위 집단을 포함하였다.
상기 세포주는 또한 생체내 세포 구획을 재구성하기 위해 사용되어 왔다. 도 12를 언급하면, 상기 도면은 레트로바이러스에 의해 종양유전자의 상이한 조합물로 형질도입되고 연속 시험관내 배양물 중 >90 일 동안 유지된 어린 C57/BL6 마우스로부터 얻어진 HSC 유래의 T 세포 및 B 세포 구획의 생체내 재구성 결과를 도시한다. 간략히, 5FU 농후 HSC를 pMIG-ICN.1-ER 및 pMIG-hTERT (상부 패널), pMIG-MYC.ER 및 pMIG-hTERT (중간 패널), 또는 pMIG-MYC-ER 및 pMIT-Bcl-2 (하부 패널)로 레트로바이러스 형질도입하였다. 상기 세포를 15%의 소 태아 혈청, 및 IL-6, IL-3 및 SCF의 칵테일이 보충된 DMEM 중 유지시켰다. 치사적으로 방사선 조사된 어린 C57/BL6 마우스를 시험관내에서 생성된 Rag2-/- 마우스 및 LT-HSC 주로부터의 골수 줄기 세포를 이용하여 재구성하였다. 6 주 이후, 골수를 적출하여 특정 계통 마커의 패널로 염색하였다. 성숙한 CD4 및 B220 양성/GFP 양성 세포의 발생이 용이하게 관측될 수 있었다. 4 마리의 대표적 마우스로부터의 데이터가 상기 도면에 제공되어 있다. 각 군에 있어서, 마우스 중 대략 30%가 GFP 마커를 보유한다.
실시예 4
하기 실시예는 HSC 유래의 인간 제대혈 및 골수를 시험관내에서 가역적으로 불멸화시키는 방법의 연장을 기술한다.
상기 기술의 하나의 추가의 적용은 이의 조건부 불멸화를 통해 인간 장기 조혈 줄기 세포를 시험관내에서 증식시키는 능력이다. 따라서, 본 발명자는 앞선 실시예에 기술된 시험관내 방법을 몇 가지 변화에 의해 인간 세포에 대하여 수정하였다. 먼저, 레트로바이러스를 바람직하게는 양친화성 외피로 패키징하여 인간 세포 의 효과적 형질도입을 가능하게 한다. 또한, 세포의 공급원은, 발명자 협회의 임상시험 심사 위원회에 의해 제시된 모든 규칙 및 규정에 따라, 제대혈 은행으로부터 익명으로 얻어진 인간 제대혈이다. 생성되는 세포는 고속 세포 분류에 의해 순수한 군으로 단리시키기에 궁극적으로 유용할 수 있는 리포터 유전자를 발현할 것이다. 본 발명자는 뮤린 lt-HSC 세포주로부터 발생하는 다수의 성숙한 세포가, 잠재적으로는 계통 결정 및 분화시 레트로바이러스 게놈의 메틸화로 인하여, 표면 마커의 발현을 상실한다는 점에 주목하였다. 본 발명자는 인간 세포에 있어서 유사한 거동을 관측할 것으로 기대하는데, 상기 경우 lt-HSC 및 이식 수혜자에서의 이의 보급은 세포군에 대한 세포 표면 마커와 함께, 상기 세포에서의 리포터 유전자의 존재에 의해 모니터링될 수 있다.
실시예 5
하기 실시예는 조건부 불멸화 HSC 세포로부터 MYC-ER 및 Bcl-2를 코딩하는 DNA 단편의 순차적 절제에 대한 접근법을 기술한다.
MYC .ER 및 Bcl-2를 코딩하는 형질전환 유전자를 지니는 HSC를 인간 및/또는 마우스에 도입하는 위험을 피하기 위하여, 상기 2개의 DNA 단편은 박테리아 재조합 효소 접근법의 이용으로 절제된다. 2 가지 상이한 재조합 효소가 이용되어 2개의 유전자 중 하나가 임의의 적절한 시점에서 절제되는 것에 대한 조절을 가능하게 한다. 상기 재조합 효소의 2 가지 예는 Cre 및 Flp 재조합 효소이다. 간략히, 재조합 효소 중 하나에 대한 인식 기질 서열 (RSS)이 레트로바이러스 구축물에 도입되어 이것이 종양유전자, 뿐만 아니라 리포터 유전자 (GFP 또는 Thy1.1)의 열린 해독 틀에 인접되도록 한다. 상기 경우, 세포는 Tat-Cre 융합 단백질을 함유하는 배지 중 항온배양된다. 상기 재조합 단백질은 앞서 기술되어 있고 세포로 수동으로 유입되어, 게놈 DNA의 loxP 부위 의존적 재조합을 매개할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
상기 접근법은 시험관내 및 생체내 분화를 위한 다수의 HSC의 생성을 가능하게 하기 위한 다수의 사건의 달성을 가능하게 한다. 먼저, 세포는 조건부 형질전환 과정 동안 이것이 익숙해진 높은 수준의 증식 및 생존 신호로부터 점차 떼어질 수 있다. 두번째로, 세포는 이의 항상성 기능 및 분화를 위해 정상 사이토카인에 의존하도록 재적응될 수 있다. 세번째로, 리포터 발현의 순차적 상실은 해당 유전자 각각의 결실의 상태 및 정도의 정의를 가능하게 한다. 따라서, 양쪽 리포터 유전자 (GFP 및 Thy1.1)를 발현하는 세포는 양쪽 서열 (각각, MYC 및 Bcl-2)을 지니고, Thy1.1를 발현하나 GFP를 발현하지 않는 세포는 MYC 코딩 서열을 성공적으로 결실시켰으나, 여전히 Bcl-2 유전자를 포함하며, 마지막으로 GFP 또는 Thy1.1 중 어떤 것도 발현하지 않는 세포는 상기 대립유전자 양쪽을 결실시켰다. 도 13은 상기 접근법을 도면에 나타낸다.
또한, 상기 접근법은, 인간 MYC 형질전환 유전자의 발현이 테트라사이클린의 제거 및 tTA (테트라사이클린 트랜스활성자 단백질)로 불리는 박테리아 단백질의 존재에 의해 유도될 수 있는 마우스 균주로부터 5FU 농후 BM-HSC를 얻음으로써 마우스 중 시험된다. 인간 MYC cDNA는 테트라사이클린 조절 전사 요소 (TRE)의 다운스트림에서 클로닝되었다. TRE-MYC 마우스를 5FU로 처리하고 이를 이용하여 BM-HSC를 적출하였다. 상기 세포를 Bcl-2 및 tTA를 발현하는 레트로바이러스 (pMIT- Bcl2 및 pMIG-tTA)로 시험관내 형질도입한다. 상기 세포를 독시사이클린의 지속적 존재 하에 배양하여 MYC 형질전환 유전자를 침묵 상태로 유지시킨다. 흐름 세포측정에 의해 일단 세포가 분석되면, 이는 독시사이클린 (이는 생채내에서 일반적으로 사용되는 테트라사이클린의 더 안정한 형태임) 함유 식이로 유지되지 않을 마우스로 다시 이식하기 위해 사용될 수 있다.
일단 lt-HSC 세포주가 생성되면, 이를 시험관내 독시사이클린의 존재 하에 배양하는 효과를, 4OHT의 부재 하에 배양되는 세포주를 지니는 MYC.ER과 함께 시험할 것이다. MYC의 단백질 수준을 웨스턴 블롯 및 세포내 염색 접근법에 의해 시종일관 모니터링한다.
실시예 6
하기 실시예는 액체 조직 배양 배지로부터 4OHG를 제거한 이후, 다수의 조혈계의 시험관내 생성을 기술한다.
HSC의 효능을 측정하기 위해 이용된 통상의 방법은 정의된 사이토카인을 갖는 반-고체 배지 (메틸셀룰로오스)를 이용하여 HSC의 특정 계통으로의 분화를 강력하게 하는 것을 포함한다. 본 발명자는 본 발명의 방법의 이용으로 시험관내 생성된 상기 세포군의 다능성을 측정하는 것에 관심을 가졌다. 상기 쟁점을 검사하기 위하여, 본원에 기술된 ABM42 및 ABM46 세포주를, IL-3, IL-6 및 SCF를 함유하나, 4OHT가 부재하는 배지 중 유지시켰다. 본 발명자가 재구성된 마우스 내에서 검출할 수 있었던 계통 (즉, 림프구, 골수 및 과립구)에 추가하여, NK1.1 또는 ter-119를 발현하는 GFP+ 세포가 또한 검출될 수 있었다 (도 14). NK1.1 세포는 NK-세포, 또는 NK-T 세포 중 어느 하나일 수 있었다. ter-119 발현 세포는 적혈구 계통이다. 상기 발견은 상기 세포주가 정상 조혈계의 요소 전부를 발생시킬 수 있고 세포가 수동적 치료에 사용될 특정 요소의 다량 생성에 유용할 것임을 나타낸다. 또한, 이는 조혈에서의 초기 사건을 연구하고 유전적 장애, 또는 화학 요법의 일반적 과정에 기인하는 합병증, 또는 심지어 감염성 질환에서의 치료적 중재를 위한 신규한 치료법을 동정하는 데 있어서의 용도 및 중요성이 크다.
실시예 7
하기 실시예는 조건부 형질전환된 장기 HSC에서의 분화를 유도하거나 억제하는 소 분자 또는 생물학적 작용제의 고 처치량 선별 방법을 기술한다.
하기는 HSC 분화를 유도하거나 억제하는 소 분자 또는 생물학적 작용제의 일반적 선별 방법이다. 앞서, 이러한 유형의 큰 선별은 다수의 줄기 세포가 얻어질 수 없다는 사실에 의해 방해되었다. 본 발명자가 장기 HSC를 조건부 불멸화시키는 현재의 능력에 의해, 상기 기술을 제안하는 것이 이제 가능하다.
예로서, 하나의 상기 방법은 문헌 [Schneider, 등 (Schneider, T., 및 Issekutz, A.C. (1996). Quantitation of eosinophil and neutrophil infiltration into rat lung by basic assays for eosinophil peroxidase and myeloperoxidase. Application in a Brown Norway rat model of allergic pulmonary inflammation. J Immunol Methods 198, 1-14]으로부터 수정된 골수 분화 판독이다. 간략히, 조건부 형질전환된 장기 HSC를 각종 농도의 세포수 (보통 2 x 104 ∼ 5 x 104 세포/웰)로 96 웰의, 평평한 바닥의 플레이트에 평판배양한다. 완전 배지 (DMEM + 15%의 가열 불활성화된 소 태아 혈청, IL-3, IL-6 및 SCF가 보충된 1X 페니실린/스트렙토마이신, 1X 1-글루타민 및 1X 비필수 아미노산)에 4OHT를 첨가하여 세포를 미분화된 상태로 유지시키거나, 또는 첨가된 4OHT의 부재 하에 분화를 유도하여 선별을 수행한다. 상기 상태는 Mac-1+ 세포를 발생시키는 것으로 밝혀졌고, 이는 골수 분화 패턴과 일치한다. 추가의 사이토카인을 첨가하여 특정 경로로의 분화를 유도할 수 있으나, 상기 시스템은 사이토카인의 패널의 특정 기능의 선별에도 이용될 수 있다. 상기 예에서, 완전 배지는 IL-3, IL-6 및 SCF가 보충되지 않으나, 그러나 대신 시험되거나 분화를 유도하기 위해 사용되는 기정 사이토카인 (예를 들어, CSF-1, G-CSF, GM-CSF, EPO, TEPO 등)이 보충되어 첨가된다.
소 분자, 생물학적 작용제 또는 양성 조절 물질 (예를 들어, 비소 O3)을 96 웰 플레이트에 걸쳐 적정하고, 필요에 따라 그리고 시험될 작용제 또는 분자에 기초하여 결정된, 24 ∼ 72 시간 이상의 범위의 시간틀 동안 lt-HSC와 함께 항온배양한다. 항온배양 이후, 세포를 PBS로 세정하고 -80℃에서 밤새 저장되는 동안 PBS에 재현탁하여 세포를 용해시킨다. 그 후, 세포를 실온에서 해동하고 플레이트를 3,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한다. 그 후, 상청액을 새로운 96 웰 플레이트에 옮기고 테트라메틸벤지딘 (TMB)과 40 분 동안 혼합한다. 4N H2SO4에 의해 반응을 정지시키고 450 nm에서 O.D.를 판독한다. 상기 유형의 고 처리량 어세이를 이용하여 소 분자 또는 생물학적 작용제를 조건부로 형질전환된 장기 HSC의 광범위한 세포 유형으로의 분화를 유도하거나 차단하는 능력에 대하여 시험할 수 있다. 그 후, 상기 선별 결과를 생체내 HSC 분화를 유도하거나 억제하는 능력에 대하여 더 시험할 수 있다. 상기 어세이 포맷에 대한 변형은 당업자에게 명백할 것이며 본 발명에 의해 포함된다.
실시예 8
하기 실시예는 중간 조혈계의 세포주를 생성하기 위한 본 발명의 방법의 용도를 기술한다.
하기 프로토콜을 이용하여 조건부로 불멸화된 lt-HSC 세포주의 치사적으로 방사선 조사된 마우스로의 이식 이후 조혈계 발생의 중간 단계를 나타내는 세포주의 발생을 유도할 수 있다. 먼저, 본 발명에 따라 생성된 103 ∼ 105개의 조건부 형질전환된 lt-HSC 세포주를 치사적으로 방사선 조사된 수혜자 마우스 일단에 전달한다. 이식물은 운반체로서 105개의 Rag-1-/- 세포도 포함하여 방사선 조사된 마우스의 초기 생존을 보장한다. 마우스를 1 ㎎의 타목시펜의 주사액으로 매주 복막내 처리하여, 조건부 형질전환된 lt-HSC 세포주 유래의 부분 분화된 세포를 불멸화시킨다. 일단 마우스가 조건부 형질전환된 lt-HSC 세포주에 의해 완전히 재구성되면, 주사를 초기 이식 이후 3 일 ∼ 1 주, 또는 이식 이후 8 주에 개시한다. 타목시펜으로 처리한 이후 3 일째, 또는 마우스가 백혈병과 관련된 임상 징후를 나타낼 때, 마우스로부터의 비장 및 골수 세포로부터 세포를 수집한다. 세포를 4-OHT를 갖는 표준 골수 배양 조건 (DMEM, 15%의 소 태아 혈청, pen/strep, L-glut, 비필수 아미노산, IL-3, IL-6 및 SCF), 또는 상이한 조혈 세포 유형에 이용되는 기타 사이토카인 및 배지의 존재 하에 배양시킨다. 세포주는 냉동되고/거나 증가되며, 세포주는 또한 희석을 제한함으로써 클로닝되고 프로파이러스 통합의 PCR 증폭에 의해 정의되고, 냉동되며, 그 후 흐름 세포측정에 의해 표면 마커 발현에 대하여 특성화된 단일 세포이다. 이러한 유형의 접근법은, 수혜자로서 NOD/SCID 마우스, 또는 간내 주사가 제공될 신생아 Rag-1-/- 마우스를 이용하여, 뮤린 및 인간 ctlt-HSC 세포주 모두에 대하여 이용된다.
실시예 9
하기 실시예는 T-세포 발생의 중간 단계를 나타내는 세포주를 발생시키기 위해 성숙한 CD4+ αβ T-세포를 시험관내 생성하기 위해 이용되는 프로토콜의 채택 및 본 발명의 용도를 기술한다.
본 실험에서, 본 발명의 방법에 따라 생성된 조건부 불멸화 lt-HSC 세포주를, IL-7이 보충되고 타목시펜이 부재하는, 정상 사이토카인 칵테일의 존재 하에 평판배양한다. Jagged, 노치-1 리간드를 발현하는 OP-9 간질 세포의 층 상에 평행 배양물을 확립한다. 배양물을 T-세포 발생의 징후에 대하여 모니터링하기 시작한 후 매 48 시간마다 T-세포 계통 마커에 대하여 세포를 염색한다. T-계통 결정 및 발생의 징후를 보여주는 웰을 타목시펜을 함유하는 배지로 교환하여 표현형을 안정화하고 세포주를 확립한다. 생성되는 세포주를 도 8에 기술된 바와 같이 증가되시키고, 클로닝하며, 특성화한다. 세포주를 개별 TCR-Vβ 대립유전자에 대하여 특이 적으로 염색하여 T-세포 수용체 레퍼토리 용법을 결정한다. 일부 성숙한 T-세포주, 또는 전구 세포군을 나타내는 세포주를 Rag-1-/- 마우스로 이식하여 이것이 생체내 정상 내성 및 항상성 메커니즘에 부합되는 능력, 뿐만 아니라 이것이, 적절한 경우, 생체내에서 더 분화되는 능력을 평가한다. 마지막으로, 이것이 항원 자극에 반응하는 능력을 시험관내 및 생체내에서 평가한다.
실시예 10
하기 실시예는 중간 발생 세포주 및 골수 백혈병 모델을 발생시키기 위해 HSC의 골수 세포 계통으로의 유도된 분화에 이용되는 프로토콜의 채택 및 본 발명의 방법의 용도를 기술한다.
본 실험에서, 본 발명의 방법에 따라 생성된 조건부 불멸화 lt-HSC 세포주를, G-CSF가 보충되고 타목시펜이 부재하는, 정상 사이토카인 칵테일의 존재 하에 평판배양한다. 배양물을 골수 발생의 징후에 대하여 모니터링하기 시작한 후 매 48 시간마다 골수 계통 마커에 대하여 세포를 염색한다. 골수 계통 결정 및 발생의 징후를 보여주는 웰을 타목시펜을 함유하는 배지로 교환하여 표현형을 안정화하고 세포주를 확립한다. 생성되는 세포주를 도 8에 기술된 바와 같이 증가시키고, 클로닝하며, 특성화한다. 생성되는 세포주의 일부를 마우스에게 다시 이식하여 Op/Op 마우스 (천연적으로 대식구가 결핍된 돌연변이 마우스)를 재증식시키는 이의 능력을 모니터링한다. 상기 세포주를 또한 시종일관 타목시펜으로 유지될 야생형 마우스에 이식하여, 상기 세포주가 또한 인간 AML, CML 및 APL과 유사한 골수 백혈 병을 발생시키는 지의 여부를 측정한다. 상기 새로운 종양은 임상전 치료제에 대한 신규한 모델을 제공한다.
실시예 11
하기 실시예는 인간 성체 ctlt-HSC 세포주의 생성 및 NOD/SCID 또는 RAG-/-이종 이식 모델을 이용한 생체내 이의 다능성의 검사를 기술한다.
본 실험에서, CD34+ 세포 (동원된 혈액 또는 제대혈 유래)를, 양친화성 외피의 이용으로 패키징된 (본 발명의 방법에 따라), MYC-ER, Bcl-2 및 GFP를 코딩하는 레트로바이러스 벡터로 시험관내 형질도입한다 (이식된 세포의 이후 검출을 위해). lt-HSC는, 뮤린 HSC를 이용하여 상기 기술한 바와 같이, 4OHT 및 성장 인자의 존재 하에 시험관내 증식에 의해 선택된다. 선택된 세포의 다능성을, 면역형광 흐름 세포측정에 의한 모든 혈액 세포 계통의 분석에 의해 6 ∼ 12 주 이후, 반치사적으로 방사선 조사된 NOD/SCID 또는 NOD/SCID/β-2M-/- 또는 Rag-1-/- 또는 Rag-2-/- 마우스로의 lt-HSC 주의 이식에 의해 평가한다. 더 구체적으로는, 본 발명의 방법의 이용으로 ctlt-HSC 세포주를 생성한 후, 이의 다능성을 검사하기 위하여 2 가지 상이하고 우대적인 접근법을 이용할 수 있다. 첫번째 접근법에서, 다양한 양의 클론 ctlt-HSC 세포주를 반치사적으로 방사선 조사된 NOD/SCID 마우스 또는 NOD/SCID/β-2M-/- 마우스에 도입한다. 이 경우, 마우스에 반치사적 방사선 요법 (0.3 Gy)을 시행한 이후, 인간 ctlt-HSC 세포주 유래의 103 ∼ 105개의 세포를 정맥내 전달한 다. 이식 이후 6 ∼ 12 주째 재구성에 대하여 마우스를 분석한다. 두번째로, 인간 ctlt-HSC 세포주 유래의 103 ∼ 105개의 세포를 직접 주사에 의해 신생아 Rag-1-/- 또는 Rag-2-/- 마우스의 간으로 도입한다. 이식 이후 6 ∼ 12 주째 상기 이종 이식물을 또한 적절한 재구성에 대하여 분석할 것이다.
실시예 12
하기 실시예는 이식 이후 ctlt-HSC로부터 MYC 및 Bcl-2의 발현을 폐기하는 조건부 접근법의 용도를 기술한다.
본 실험에서, 줄기 세포를 형질전환하기 위해 이용된 바이러스 (바이러스 벡터)를 재조작하여 MYC-ER, Bcl-2 및 GFP 열린 해독틀 (ORFS)에 인접한 2개의 loxP 부위를 함유하게 한다. 세포를 이식하는 경우, Cre 또는 CRE-TAT 융합 단백질의 조절된 형태를 이용하여 종양유전자 코딩 서열을 결실시켜, 이에 따라 수혜자에서의 삽입물 유도의 악성 종양의 위험을 제거한다. 이러한 접근법은 마우스에서 먼저 개발된 후, 인간 lt-HSC에 적용된다.
두번째 접근법에서, TRE-MYC 마우스 유래의 lt-HSC를 이용하여 Bcl-2 또는 rtTA를 코딩하는 레트로바이러스를 갖는 세포주를 생성한다. 이를 마우스에 이식한다. 마우스에 독시사이클린을 공급하여 MYC의 발현을 폐기한다. pMIG-rtTA 레트로바이러스로 형질도입될 수 있는 TRE-MYCxTRE-Bcl-2 이중유전자 (bigenic) 마우스로부터 얻어진 lt-HSC를 이용하여 MYC 및 Bcl2 발현을 제거할 수 있다.
실시예 13
하기 실시예는 lt-HSC의 유전자 변형 없이 조건부 형질전환을 달성하기 위한 MYC 및/또는 Bcl-2를 갖는 HIV-1 Tat 단백질 융합의 용법을 기술한다.
MYC-Tat 및 Bcl-2-Tat 융합 단백질을 생성하고 확립된 프로토콜의 이용으로 정제한다. 융합 단백질을 세포의 처리에 의해 시험하며, 여기서 과발현된 Bcl-2의 효과 (예를 들어, 활성화된 T-세포, BCMA-Fc에 저항성이 부여된 B-세포 림프종 세포주 등) 또는 MYC의 효과 (예를 들어, 아네르기 B-세포, 미접촉 (naive) T-세포, 활성화된 T-세포)를 용이하게 분석할 수 있다. MYC-Tat 및 Bcl-2-Tat 단백질의 조합물을 이용하여 이식 이전에 lt-HSC의 증식을 가능하게 한다. 이러한 접근법은 용이하게 개발되어 마우스 시스템에서 시험된 후, 인간에게 적용된다.
미국 가 특허 출원 제 60/728,131호 및 미국 가 특허 출원 제 60/765,993호 각각의 전 개시내용은 본원에서 참고로 인용한다.
본 발명의 각종 실시양태는 상세히 설명된 한편, 상기 실시양태의 변형 및 수정은 당업자에게 실행될 수 있음이 명백하다. 그러나, 상기 변형 및 수정은, 하기 특허청구범위에 제시되는 바와 같은, 본 발명의 범위 이내에 있을 것임이 명백히 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> National Jewish Medical and Research Center The Regents of the University of Colorado <120> Conditionally Immortalized Long-Term Stem Cells and Methods of Making and Using Such Cells <130> 2879-117-PCT <150> 60/728,131 <151> 2005-10-18 <150> 60/765,993 <151> 2006-02-06 <160> 14 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2377 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 acccccgagc tgtgctgctc gcggccgcca ccgccgggcc ccggccgtcc ctggctcccc 60 tcctgcctcg agaagggcag ggcttctcag aggcttggcg ggaaaaagaa cggagggagg 120 gatcgcgctg agtataaaag ccggttttcg gggctttatc taactcgctg tagtaattcc 180 agcgagaggc agagggagcg agcgggcggc cggctagggt ggaagagccg ggcgagcaga 240 gctgcgctgc gggcgtcctg ggaagggaga tccggagcga atagggggct tcgcctctgg 300 cccagccctc ccgctgatcc cccagccagc ggtccgcaac ccttgccgca tccacgaaac 360 tttgcccata gcagcgggcg ggcactttgc actggaactt acaacacccg agcaaggacg 420 cgactctccc gacgcgggga ggctattctg cccatttggg gacacttccc cgccgctgcc 480 aggacccgct tctctgaaag gctctccttg cagctgctta gacgctggat ttttttcggg 540 tagtggaaaa ccagcagcct cccgcgacga tgcccctcaa cgttagcttc accaacagga 600 actatgacct cgactacgac tcggtgcagc cgtatttcta ctgcgacgag gaggagaact 660 tctaccagca gcagcagcag agcgagctgc agcccccggc gcccagcgag gatatctgga 720 agaaattcga gctgctgccc accccgcccc tgtcccctag ccgccgctcc gggctctgct 780 cgccctccta cgttgcggtc acacccttct cccttcgggg agacaacgac ggcggtggcg 840 ggagcttctc cacggccgac cagctggaga tggtgaccga gctgctggga ggagacatgg 900 tgaaccagag tttcatctgc gacccggacg acgagacctt catcaaaaac atcatcatcc 960 aggactgtat gtggagcggc ttctcggccg ccgccaagct cgtctcagag aagctggcct 1020 cctaccaggc tgcgcgcaaa gacagcggca gcccgaaccc cgcccgcggc cacagcgtct 1080 gctccacctc cagcttgtac ctgcaggatc tgagcgccgc cgcctcagag tgcatcgacc 1140 cctcggtggt cttcccctac cctctcaacg acagcagctc gcccaagtcc tgcgcctcgc 1200 aagactccag cgccttctct ccgtcctcgg attctctgct ctcctcgacg gagtcctccc 1260 cgcagggcag ccccgagccc ctggtgctcc atgaggagac accgcccacc accagcagcg 1320 actctgagga ggaacaagaa gatgaggaag aaatcgatgt tgtttctgtg gaaaagaggc 1380 aggctcctgg caaaaggtca gagtctggat caccttctgc tggaggccac agcaaacctc 1440 ctcacagccc actggtcctc aagaggtgcc acgtctccac acatcagcac aactacgcag 1500 cgcctccctc cactcggaag gactatcctg ctgccaagag ggtcaagttg gacagtgtca 1560 gagtcctgag acagatcagc aacaaccgaa aatgcaccag ccccaggtcc tcggacaccg 1620 aggagaatgt caagaggcga acacacaacg tcttggagcg ccagaggagg aacgagctaa 1680 aacggagctt ttttgccctg cgtgaccaga tcccggagtt ggaaaacaat gaaaaggccc 1740 ccaaggtagt tatccttaaa aaagccacag catacatcct gtccgtccaa gcagaggagc 1800 aaaagctcat ttctgaagag gacttgttgc ggaaacgacg agaacagttg aaacacaaac 1860 ttgaacagct acggaactct tgtgcgtaag gaaaagtaag gaaaacgatt ccttctaaca 1920 gaaatgtcct gagcaatcac ctatgaactt gtttcaaatg catgatcaaa tgcaacctca 1980 caaccttggc tgagtcttga gactgaaaga tttagccata atgtaaactg cctcaaattg 2040 gactttgggc ataaaagaac ttttttatgc ttaccatctt ttttttttct ttaacagatt 2100 tgtatttaag aattgttttt aaaaaatttt aagatttaca caatgtttct ctgtaaatat 2160 tgccattaaa tgtaaataac tttaataaaa cgtttatagc agttacacag aatttcaatc 2220 ctagtatata gtacctagta ttataggtac tataaaccct aatttttttt atttaagtac 2280 attttgcttt ttaaagttga tttttttcta ttgtttttag aaaaaataaa ataactggca 2340 aatatatcat tgagccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2377 <210> 2 <211> 454 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Phe Phe Arg Val Val Glu Asn Gln Gln Pro Pro Ala Thr Met 1 5 10 15 Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp 20 25 30 Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln 35 40 45 Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp Ile 50 55 60 Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser Arg 65 70 75 80 Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe Ser 85 90 95 Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala Asp 100 105 110 Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln 115 120 125 Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile 130 135 140 Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu Val 145 150 155 160 Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly Ser 165 170 175 Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr 180 185 190 Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val 195 200 205 Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala 210 215 220 Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser 225 230 235 240 Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His 245 250 255 Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu 260 265 270 Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro 275 280 285 Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys 290 295 300 Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His 305 310 315 320 Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro Ala 325 330 335 Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile Ser 340 345 350 Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn 355 360 365 Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu 370 375 380 Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu 385 390 395 400 Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala 405 410 415 Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 420 425 430 Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln 435 440 445 Leu Arg Asn Ser Cys Ala 450 <210> 3 <211> 51552 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (31450)..(31450) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 acttgagccc aagagttcaa ggctacggtg agccatgatt gcaacaccac acgccagcct 60 tggtgacaga atgagaccct gtctcaaaaa aaaaaaaaaa aattgaaata atataaagca 120 tcttctctgg ccacagtgga acaaaaccag aaatcaacaa caagaggaat tttgaaaact 180 atacaaacac atgaaaatta aacaatatac ttctgaatga ccagtgagtc aatgaagaaa 240 ttaaaaagga aattgaaaaa tttatttaag caaatgataa cggaaacata acctctcaaa 300 acccacggta tacagcaaaa gcagtgctaa gaaggaagtt tatagctata agcagctaca 360 tcaaaaaagt agaaaagcca ggcgcagtgg ctcatgcctg taatcccagc actttgggag 420 gccaaggcgg gcagatcgcc tgaggtcagg agttcgagac cagcctgacc aacacagaga 480 aaccttgtcg ctactaaaaa tacaaaatta gctgggcatg gtggcacatg cctgtaatcc 540 cagctactcg ggaggctgag gcaggataac cgcttgaacc caggaggtgg aggttgcggt 600 gagccgggat tgcgccattg gactccagcc tgggtaacaa gagtgaaacc ctgtctcaag 660 aaaaaaaaaa aagtagaaaa acttaaaaat acaacctaat gatgcacctt aaagaactag 720 aaaagcaaga gcaaactaaa cctaaaattg gtaaaagaaa agaaataata aagatcagag 780 cagaaataaa tgaaactgaa agataacaat acaaaagatc aacaaaatta aaagttggtt 840 ttttgaaaag ataaacaaaa ttgacaaacc tttgcccaga ctaagaaaaa aggaaagaag 900 acctaaataa ataaagtcag agatgaaaaa agagacatta caactgatac cacagaaatt 960 caaaggatca ctagaggcta ctatgagcaa ctgtacacta ataaattgaa aaacctagaa 1020 aaaatagata aattcctaga tgcatacaac ctaccaagat tgaaccatga agaaatccaa 1080 agcccaaaca gaccaataac aataatggga ttaaagccat aataaaaagt ctcctagcaa 1140 agagaagccc aggacccaat ggcttccctg ctggatttta ccaatcattt aaagaagaat 1200 gaattccaat cctactcaaa ctattctgaa aaatagagga aagaatactt ccaaactcat 1260 tctacatggc cagtattacc ctgattccaa aaccagacaa aaacacatca aaaacaaaca 1320 aacaaaaaaa cagaaagaaa gaaaactaca ggccaatatc cctgatgaat actgatacaa 1380 aaatcctcaa caaaacacta gcaaaccaaa ttaaacaaca ccttcgaaag atcattcatt 1440 gtgatcaagt gggatttatt ccagggatgg aaggatggtt caacatatgc aaatcaatca 1500 atgtgataca tcatcccaac aaaatgaagt acaaaaacta tatgattatt tcactttatg 1560 cagaaaaagc atttgataaa attctgcacc cttcatgata aaaaccctca aaaaaccagg 1620 tatacaagaa acatacaggc caggcacagt ggctcacacc tgcgatccca gcactctggg 1680 aggccaaggt gggatgattg cttgggccca ggagtttgag actagcctgg gcaacaaaat 1740 gagacctggt ctacaaaaaa cttttttaaa aaattagcca ggcatgatgg catatgcctg 1800 tagtcccagc tagtctggag gctgaggtgg gagaatcact taagcctagg aggtcgaggc 1860 tgcagtgagc catgaacatg tcactgtact ccagcctaga caacagaaca agaccccact 1920 gaataagaag aaggagaagg agaagggaga agggagggag aagggaggag gaggagaagg 1980 aggaggtgga ggagaagtgg aaggggaagg ggaagggaaa gaggaagaag aagaaacata 2040 tttcaacata ataaaagccc tatatgacag accgaggtag tattatgagg aaaaactgaa 2100 agcctttcct ctaagatctg gaaaatgaca agggcccact ttcaccactg tgattcaaca 2160 tagtactaga agtcctagct agagcaatca gataagagaa agaaataaaa ggcatccaaa 2220 ctggaaagga agaagtcaaa ttatcctgtt tgcagatgat atgatcttat atctggaaaa 2280 gacttaagac accactaaaa aactattaga gctgaaattt ggtacagcag gatacaaaat 2340 caatgtacaa aaatcagtag tatttctata ttccaacagc aaacaatctg aaaaagaaac 2400 caaaaaagca gctacaaata aaattaaaca gctaggaatt aaccaaagaa gtgaaagatc 2460 tctacaatga aaactataaa atgttgataa aagaaattga agagggcaca aaaaaagaaa 2520 agatattcca tgttcataga ttggaagaat aaatactgtt aaaatgtcca tactacccaa 2580 agcaatttac aaattcaatg caatccctat taaaatacta atgacgttct tcacagaaat 2640 agaagaaaca attctaagat ttgtacagaa ccacaaaaga cccagaatag ccaaagctat 2700 cctgaccaaa aagaacaaaa ctggaagcat cacattacct gacttcaaat tatactacaa 2760 agctatagta acccaaacta catggtactg gcataaaaac agatgagaca tggaccagag 2820 gaacagaata gagaatccag aaacaaatcc atgcatctac agtgaactca tttttgacaa 2880 aggtgccaag aacatacttt ggggaaaaga taatctcttc aataaatggt gctggaggaa 2940 ctggatatcc atatgcaaaa taacaatact agaactctgt ctctcaccat atacaaaagc 3000 aaatcaaaat ggatgaaagg cttaaatcta aaacctcaaa ctttgcaact actaaaagaa 3060 aacaccggag aaactctcca ggacattgga gtgggcaaag acttcttgag taattccctg 3120 caggcacagg caaccaaagc aaaaacagac aaatgggatc atatcaagtt aaaaagcttc 3180 tgcccagcaa aggaaacaat caacaaagag aagagacaac ccacagaatg ggagaatata 3240 tttgcaaact attcatctaa caaggaatta ataaccagta tatataagga gctcaaacta 3300 ctctataaga aaaacaccta ataagctgat tttcaaaaat aagcaaaaga tctgggtaga 3360 catttctcaa aataagtcat acaaatggca aacaggcatc tgaaaatgtg ctcaacacca 3420 ctgatcatca gagaaatgca aatcaaaact actatgagag atcatctcat cccagttaaa 3480 atggctttta ttcaaaagac aggcaataac aaatgccagt gaggatgtgg ataaaaggaa 3540 acccttggac actgttggtg ggaatggaaa ttgctaccac tatggagaac agtttgaaag 3600 ttcctcaaaa aactaaaaat aaagctacca tacagcaatc ccattgctag gtatatactc 3660 caaaaaaggg aatcagtgta tcaacaagct atctccactc ccacatttac tgcagcactg 3720 ttcatagcag ccaaggtttg gaagcaacct cagtgtccat caacagacga atggaaaaag 3780 aaaatgtggt gcacatacac aatggagtac tacgcagcca taaaaaagaa tgagatcctg 3840 tcagttgcaa cagcatgggg ggcactggtc agtatgttaa gtgaaataag ccaggcacag 3900 aaagacaaac ttttcatgtt ctcccttact tgtgggagca aaaattaaaa caattgacat 3960 agaaatagag gagaatggtg gttctagagg ggtgggggac agggtgacta gagtcaacaa 4020 taatttattg tatgttttaa aataactaaa agagtataat tgggttgttt gtaacacaaa 4080 gaaaggataa atgcttgaag gtgacagata ccccatttac cctgatgtga ttattacaca 4140 ttgtatgcct gtatcaaaat atctcatgta tgctatagat ataaacccta ctatattaaa 4200 aattaaaatt ttaatggcca ggcacggtgg ctcatgtccg taatcccagc actttgggag 4260 gccgaggcgg gtggatcacc tgaggtcagg agtttgaaac cagtctggcc accatgatga 4320 aaccctgtct ctactaaaga tacaaaaatt agccaggcgt ggtggcacat acctgtagtc 4380 ccaactactc aggaggctga gacaggagaa ttgcttgaac ctgggaggcg gaggttgcag 4440 tgagccgaga tcatgccact gcactgcagc ctgggtgaca gagcaagact ccatctcaaa 4500 acaaaaacaa aaaaaagaag attaaaattg taatttttat gtaccgtata aatatatact 4560 ctactatatt agaagttaaa aattaaaaca attataaaag gtaattaacc acttaatcta 4620 aaataagaac aatgtatgtg gggtttctag cttctgaaga agtaaaagtt atggccacga 4680 tggcagaaat gtgaggaggg aacagtggaa gttactgttg ttagacgctc atactctctg 4740 taagtgactt aattttaacc aaagacaggc tgggagaagt taaagaggca ttctataagc 4800 cctaaaacaa ctgctaataa tggtgaaagg taatctctat taattaccaa taattacaga 4860 tatctctaaa atcgagctgc agaattggca cgtctgatca caccgtcctc tcattcacgg 4920 tgcttttttt cttgtgtgct tggagatttt cgattgtgtg ttcgtgtttg gttaaactta 4980 atctgtatga atcctgaaac gaaaaatggt ggtgatttcc tccagaagaa ttagagtacc 5040 tggcaggaag caggtggctc tgtggacctg agccacttca atcttcaagg gtctctggcc 5100 aagacccagg tgcaaggcag aggcctgatg acccgaggac aggaaagctc ggatgggaag 5160 gggcgatgag aagcctgcct cgttggtgag cagcgcatga agtgccctta tttacgcttt 5220 gcaaagattg ctctggatac catctggaaa aggcggccag cgggaatgca aggagtcaga 5280 agcctcctgc tcaaacccag gccagcagct atggcgccca cccgggcgtg tgccagaggg 5340 agaggagtca aggcacctcg aagtatggct taaatctttt tttcacctga agcagtgacc 5400 aaggtgtatt ctgagggaag cttgagttag gtgccttctt taaaacagaa agtcatggaa 5460 gcacccttct caagggaaaa ccagacgccc gctctgcggt catttacctc tttcctctct 5520 ccctctcttg ccctcgcggt ttctgatcgg gacagagtga cccccgtgga gcttctccga 5580 gcccgtgctg aggaccctct tgcaaagggc tccacagacc cccgccctgg agagaggagt 5640 ctgagcctgg cttaataaca aactgggatg tggctggggg cggacagcga cggcgggatt 5700 caaagactta attccatgag taaattcaac ctttccacat ccgaatggat ttggatttta 5760 tcttaatatt ttcttaaatt tcatcaaata acattcagga ctgcagaaat ccaaaggcgt 5820 aaaacaggaa ctgagctatg tttgccaagg tccaaggact taataaccat gttcagaggg 5880 atttttcgcc ctaagtactt tttattggtt ttcataaggt ggcttagggt gcaagggaaa 5940 gtacacgagg agaggcctgg gcggcagggc tatgagcacg gcagggccac cggggagaga 6000 gtccccggcc tgggaggctg acagcaggac cactgaccgt cctccctggg agctgccaca 6060 ttgggcaacg cgaaggcggc cacgctgcgt gtgactcagg accccatacc ggcttcctgg 6120 gcccacccac actaacccag gaagtcacgg agctctgaac ccgtggaaac gaacatgacc 6180 cttgcctgcc tgcttccctg ggtgggtcaa gggtaatgaa gtggtgtgca ggaaatggcc 6240 atgtaaatta cacgactctg ctgatgggga ccgttccttc catcattatt catcttcacc 6300 cccaaggact gaatgattcc agcaacttct tcgggtgtga caagccatga caaaactcag 6360 tacaaacacc actcttttac taggcccaca gagcacggsc cacacccctg atatattaag 6420 agtccaggag agatgaggct gctttcagcc accaggctgg ggtgacaaca gcggctgaac 6480 agtctgttcc tctagactag tagaccctgg caggcactcc cccagattct agggcctggt 6540 tgctgcttcc cgagggcgcc atctgccctg gagactcagc ctggggtgcc acactgaggc 6600 cagccctgtc tccacaccct ccgcctccag gcctcagctt ctccagcagc ttcctaaacc 6660 ctgggtgggc cgtgttccag cgctactgtc tcacctgtcc cactgtgtct tgtctcagcg 6720 acgtagctcg cacggttcct cctcacatgg ggtgtctgtc tccttcccca acactcacat 6780 gcgttgaagg gaggagattc tgcgcctccc agactggctc ctctgagcct gaacctggct 6840 cgtggccccc gatgcaggtt cctggcgtcc ggctgcacgc tgacctccat ttccaggcgc 6900 tccccgtctc ctgtcatctg ccggggcctg ccggtgtgtt cttctgtttc tgtgctcctt 6960 tccacgtcca gctgcgtgtg tctctgcccg ctagggtctc ggggttttta taggcatagg 7020 acgggggcgt ggtgggccag ggcgctcttg ggaaatgcaa catttgggtg tgaaagtagg 7080 agtgcctgtc ctcacctagg tccacgggca caggcctggg gatggagccc ccgccaggga 7140 cccgcccttc tctgcccagc actttcctgc ccccctccct ctggaacaca gagtggcagt 7200 ttccacaagc actaagcatc ctcttcccaa aagacccagc attggcaccc ctggacattt 7260 gccccacagc cctgggaatt cacgtgacta cgcacatcat gtacacactc ccgtccacga 7320 ccgacccccg ctgttttatt ttaatagcta caaagcaggg aaatccctgc taaaatgtcc 7380 tttaacaaac tggttaaaca aacgggtcca tccgcacggt ggacagttcc tcacagtgaa 7440 gaggaacatg ccgtttataa agcctgcagg catctcaagg gaattacgct gagtcaaaac 7500 tgccacctcc atgggatacg tacgcaacat gctcaaaaag aaagaatttc accccatggc 7560 aggggagtgg ttaggggggt taaggacggt gggggcggca gctgggggct actgcacgca 7620 ccttttacta aagccagttt cctggttctg atggtattgg ctcagttatg ggagactaac 7680 cataggggag tggggatggg ggaacccgga ggctgtgcca tctttgccat gcccgagtgt 7740 cctgggcagg ataatgctct agagatgccc acgtcctgat tcccccaaac ctgtggacag 7800 aacccgcccg gccccagggc ctttgcaggt gtgatctccg tgaggaccct gaggtctggg 7860 atccttcggg actacctgca ggcccgaaaa gtaatccagg ggttctggga agaggcgggc 7920 aggagggtca gaggggggca gcctcaggac gatggaggca gtcagtctga ggctgaaaag 7980 ggagggaggg cctcgagccc aggcctgcaa gcgcctccag aagctggaaa aagcggggaa 8040 gggaccctcc acggagcctg cagcaggaag gcacggctgg cccttagccc accagggccc 8100 atcgtggacc tccggcctcc gtgccatagg agggcactcg cgctgccctt ctagcatgaa 8160 gtgtgtgggg atttgcagaa gcaacaggaa acccatgcac tgtgaatcta ggattatttc 8220 aaaacaaagg tttacagaaa catccaagga cagggctgaa gtgcctccgg gcaagggcag 8280 ggcaggcacg agtgatttta tttagctatt ttattttatt tacttacttt ctgagacaga 8340 gttatgctct tgttgcccag gctggagtgc agcggcatga tcttggctca ctgcaacctc 8400 cgtctcctgg gttcaagcaa ttctcgtgcc tcagcctccc aagtagctgg gatttcaggc 8460 gtgcaccacc acacccggct aattttgtat ttttagtaga gatgggcttt caccatgttg 8520 gtcaagctga tctcaaaatc ctgacctcag gtgatccgcc cacctcagcc tcccaaagtg 8580 ctgggattac aggcatgagc cactgcacct ggcctattta accattttaa aacttccctg 8640 ggctcaagtc acacccactg gtaaggagtt catggagttc aatttcccct ttactcagga 8700 gttaccctcc tttgatattt tctgtaattc ttcgtagact ggggatacac cgtctcttga 8760 catattcaca gtttctgtga ccacctgtta tcccatggga cccactgcag gggcagctgg 8820 gaggctgcag gcttcaggtc ccagtggggt tgccatctgc cagtagaaac ctgatgtaga 8880 atcagggcgc aagtgtggac actgtcctga atctcaatgt ctcagtgtgt gctgaaacat 8940 gtagaaatta aagtccatcc ctcctactct actgggattg agccccttcc ctatcccccc 9000 ccaggggcag aggagttcct ctcactcctg tggaggaagg aatgatactt tgttattttt 9060 cactgctggt actgaatcca ctgtttcatt tgttggtttg tttgttttgt tttgagaggc 9120 ggtttcactc ttgttgctca ggctggaggg agtgcaatgg cgcgatcttg gcttactgca 9180 gcctctgcct cccaggttca agtgattctc ctgcttccgc ctcccatttg gctgggatta 9240 caggcacccg ccaccatgcc cagctaattt tttgtatttt tagtagagac gggggtgggt 9300 ggggttcacc atgttggcca ggctggtctc gaacttctga cctcagatga tccacctgcc 9360 tctgcctcct aaagtgctgg gattacaggt gtgagccacc atgcccagct cagaatttac 9420 tctgtttaga aacatctggg tctgaggtag gaagctcacc ccactcaagt gttgtggtgt 9480 tttaagccaa tgatagaatt tttttattgt tgttagaaca ctcttgatgt tttacactgt 9540 gatgactaag acatcatcag cttttcaaag acacactaac tgcacccata atactggggt 9600 gtcttctggg tatcagcaat cttcattgaa tgccgggagg cgtttcctcg ccatgcacat 9660 ggtgttaatt actccagcat aatcttctgc ttccatttct tctcttccct cttttaaaat 9720 tgtgttttct atgttggctt ctctgcagag aaccagtgta agctacaact taacttttgt 9780 tggaacaaat tttccaaacc gcccctttgc cctagtggca gagacaattc acaaacacag 9840 ccctttaaaa aggcttaggg atcactaagg ggatttctag aagagcgacc tgtaatccta 9900 agtatttaca agacgaggct aacctccagc gagcgtgaca gcccagggag ggtgcgaggc 9960 ctgttcaaat gctagctcca taaataaagc aatttcctcc ggcagtttct gaaagtagga 10020 aaggttacat ttaaggttgc gtttgttagc atttcagtgt ttgccgacct cagctacagc 10080 atccctgcaa ggcctcggga gacccagaag tttctcgccc ccttagatcc aaacttgagc 10140 aacccggagt ctggattcct gggaagtcct cagctgtcct gcggttgtgc cggggcccca 10200 ggtctggagg ggaccagtgg ccgtgtggct tctactgctg ggctggaagt cgggcctcct 10260 agctctgcag tccgaggctt ggagccaggt gcctggaccc cgaggctgcc ctccaccctg 10320 tgcgggcggg atgtgaccag atgttggcct catctgccag acagagtgcc ggggcccagg 10380 gtcaaggccg ttgtggctgg tgtgaggcgc ccggtgcgcg gccagcagga gcgcctggct 10440 ccatttccca ccctttctcg acgggaccgc cccggtgggt gattaacaga tttggggtgg 10500 tttgctcatg gtggggaccc ctcgccgcct gagaacctgc aaagagaaat gacgggcctg 10560 tgtcaaggag cccaagtcgc ggggaagtgt tgcagggagg cactccggga ggtcccgcgt 10620 gcccgtccag ggagcaatgc gtcctcgggt tcgtccccag ccgcgtctac gcgcctccgt 10680 cctccccttc acgtccggca ttcgtggtgc ccggagcccg acgccccgcg tccggacctg 10740 gaggcagccc tgggtctccg gatcaggcca gcggccaaag ggtcgccgca cgcacctgtt 10800 cccagggcct ccacatcatg gcccctccct cgggttaccc cacagcctag gccgattcga 10860 cctctctccg ctggggccct cgctggcgtc cctgcaccct gggagcgcga gcggcgcgcg 10920 ggcggggaag cgcggcccag acccccgggt ccgcccggag cagctgcgct gtcggggcca 10980 ggccgggctc ccagtggatt cgcgggcaca gacgcccagg accgcgctcc ccacgtggcg 11040 gagggactgg ggacccgggc acccgtcctg ccccttcacc ttccagctcc gcctcctccg 11100 cgcggacccc gccccgtccc gacccctccc gggtccccgg cccagccccc tccgggccct 11160 cccagcccct ccccttcctt tccgcggccc cgccctctcc tcgcggcgcg agtttcaggc 11220 agcgctgcgt cctgctgcgc acgtgggaag ccctggcccc ggccaccccc gcgatgccgc 11280 gcgctccccg ctgccgagcc gtgcgctccc tgctgcgcag ccactaccgc gaggtgctgc 11340 cgctggccac gttcgtgcgg cgcctggggc cccagggctg gcggctggtg cagcgcgggg 11400 acccggcggc tttccgcgcg ctggtggccc agtgcctggt gtgcgtgccc tgggacgcac 11460 ggccgccccc cgccgccccc tccttccgcc aggtgggcct ccccggggtc ggcgtccggc 11520 tggggttgag ggcggccggg gggaaccagc gacatgcgga gagcagcgca ggcgactcag 11580 ggcgcttccc ccgcaggtgt cctgcctgaa ggagctggtg gcccgagtgc tgcagaggct 11640 gtgcgagcgc ggcgcgaaga acgtgctggc cttcggcttc gcgctgctgg acggggcccg 11700 cgggggcccc cccgaggcct tcaccaccag cgtgcgcagc tacctgccca acacggtgac 11760 cgacgcactg cgggggagcg gggcgtgggg gctgctgctg cgccgcgtgg gcgacgacgt 11820 gctggttcac ctgctggcac gctgcgcgct ctttgtgctg gtggctccca gctgcgccta 11880 ccaggtgtgc gggccgccgc tgtaccagct cggcgctgcc actcaggccc ggcccccgcc 11940 acacgctagt ggaccccgaa ggcgtctggg atgcgaacgg gcctggaacc atagcgtcag 12000 ggaggccggg gtccccctgg gcctgccagc cccgggtgcg aggaggcgcg ggggcagtgc 12060 cagccgaagt ctgccgttgc ccaagaggcc caggcgtggc gctgcccctg agccggagcg 12120 gacgcccgtt gggcaggggt cctgggccca cccgggcagg acgcgtggac cgagtgaccg 12180 tggtttctgt gtggtgtcac ctgccagacc cgccgaagaa gccacctctt tggagggtgc 12240 gctctctggc acgcgccact cccacccatc cgtgggccgc cagcaccacg caggcccccc 12300 atccacatcg cggccaccac gtccctggga cacgccttgt cccccggtgt acgccgagac 12360 caagcacttc ctctactcct caggcgacaa ggagcagctg cggccctcct tcctactcag 12420 ctctctgagg cccagcctga ctggcgctcg gaggctcgtg gagaccatct ttctgggttc 12480 caggccctgg atgccaggga ctccccgcag gttgccccgc ctgccccagc gctactggca 12540 aatgcggccc ctgtttctgg agctgcttgg gaaccacgcg cagtgcccct acggggtgct 12600 cctcaagacg cactgcccgc tgcgagctgc ggtcacccca gcagccggtg tctgtgcccg 12660 ggagaagccc cagggctctg tggcggcccc cgaggaggag gacacagacc cccgtcgcct 12720 ggtgcagctg ctccgccagc acagcagccc ctggcaggtg tacggcttcg tgcgggcctg 12780 cctgcgccgg ctggtgcccc caggcctctg gggctccagg cacaacgaac gccgcttcct 12840 caggaacacc aagaagttca tctccctggg gaagcatgcc aagctctcgc tgcaggagct 12900 gacgtggaag atgagcgtgc gggactgcgc ttggctgcgc aggagcccag gtgaggaggt 12960 ggtggccgtc gagggcccag gccccagagc tgaatgcagt aggggctcag aaaagggggc 13020 aggcagagcc ctggtcctcc tgtctccatc gtcacgtggg cacacgtggc ttttcgctca 13080 ggacgtcgag tggacacggt gatctctgcc tctgctctcc ctcctgtcca gtttgcataa 13140 acttacgagg ttcaccttca cgttttgatg gacacgcggt ttccaggcgc cgaggccaga 13200 gcagtgaaca gaggaggctg ggcgcggcag tggagccggg ttgccggcaa tggggagaag 13260 tgtctggaag cacagacgct ctggcgaggg tgcctgcagg ttacctataa tcctcttcgc 13320 aatttcaagg gtgggaatga gaggtgggga cgagaacccc ctcttcctgg gggtgggagg 13380 taagggtttt gcaggtgcac gtggtcagcc aatatgcagg tttgtgttta agatttaatt 13440 gtgtgttgac ggccaggtgc ggtggctcac gccggtaatc ccagcacttt gggaagctga 13500 ggcaggtgga tcacctgagg tcaggagttt gagaccagcc tgaccaacat ggtgaaaccc 13560 tatctgtact aaaaatacaa aaattagctg ggcatggtgg tgtgtgcctg taatcccagc 13620 tacttgggag gctgaggcag gagaatcact tgaacccagg aggcggaggc tgcagtgagc 13680 tgagattgtg ccattgtact ccagcctggg cgacaagagt gaaactctgt ctttaaaaaa 13740 aaaaagtgtt cgttgattgt gccaggacag ggtagaggga gggagataag actgttctcc 13800 agcacagatc ctggtcccat ctttaggtat gaagagggcc acatgggagc agaggacagc 13860 agatggctcc acctgctgag gaagggacag tgtttgtggg tgttcagggg atggtgctgc 13920 tgggccctgc cgtgtcccca ccctgttttt ctggatttga tgttgaggaa cctccgctcc 13980 agcccccttt tggctcccag tgctcccagg ccctaccgtg gcagctagaa gaagtcccga 14040 tttcaccccc tccccacaaa ctcccaagac atgtaagact tccggccatg cagacaagga 14100 gggtgacctt cttggggctc ttttttttct ttttttcttt ttatggtggc aaaagtcata 14160 taacatgaga ttggcactcc taacaccgtt ttctgtgtac agtgcagaat tgctaactcg 14220 gcggtgttta cagcaggttg cttgaaatgc tgcgtcttgc gtgactggaa gtccctaccc 14280 atcgaacggc agctgcctca cacctgctgc ggctcaggtg gaccacgccg agtcagataa 14340 gcgtcatgca acccagtttt gctttttgtg ctccagcttc cttcgttgag gagagtttga 14400 gttctctgat caggactctg cctgtcattg ctgttctctg acttcagatg aggtcacaat 14460 ctgcccctgg cttatgcagg gagtgaggcg tggtccccgg gtgtccctgt cacgtgcagg 14520 gtgagtgagg cgttgccccc aggtgtccct gtcacgtgta gggtgagtga ggcgcggccc 14580 ccgggtgtcc ctgtcccgtg cagcgtgatt gaggtgtggc ccccgggtgt ccctgtcacg 14640 tgtagggtga gtgaggcgcc atccccgggt gtccctgtca cgtgtagggt gagtgaggcg 14700 tggtccccgg gtgtccctgt cccgtgcagg gtgagtgagg cactgtcccc gggtgtccct 14760 gtcacgtgca gggtgagtga ggcgcggtcc ccgggtgtcc ctctcaggtg tagggtgagt 14820 gaggcgcggc cccagggtgt ccctgtcacg tgtagggtga gtgaggcacc gtccctgggt 14880 gtccctccca ggtatagggt gagtgaggca ctgtccccgg gtgtccctgt cacgtgcagg 14940 gtgagtgagg cgcggccccc gggtgtccct ctcaggtgca gggtgagtga ggcgctgtcc 15000 ctgggtgtcc ctgtctcgtg tagggtgagt gaggctctgt ccccaggtgt ccttggcgtt 15060 tgctcacttg agcttgctcc tgaatgtttg ctctttctat agccacagct gcgccggttg 15120 cccattgcct gggtagatgg tgcaggcgca gtgctggtcc ccaagcctat cttttctgat 15180 gctcggctct tcttggtcac ctctccgttc cattttgcta cggggacacg ggactgcagg 15240 ctctcgcctc ccgcgtgcca ggcactgcag ccacagcttc aggtccgctt gcctctgttg 15300 ggcctggctt gctcaccacg tgcccgccac atgcatgctg ccaatactcc tctcccagct 15360 tgtctcatgc cgaggctgga ctctgggctg cctgtgtctg ctgccacgtg ttgctggaga 15420 catcccagaa agggttctct gtgccctgaa ggaaagcaag tcaccccagc cccctcactt 15480 gtcctgtttt ctcccaagct gcccctctgc ttggccccct tgggtgggtg gcaacgcttg 15540 tcaccttatt ctgggcacct gccgctcatt gcttaggctg ggctctgcct ccagtcgccc 15600 cctcacatgg attgacgtcc agccacaggt tggagtgtct ctgtctgtct cctgctctga 15660 gacccacgtg gagggccggt gtctccgcca gccttcgtca gacttccctc ttgggtctta 15720 gttttgaatt tcactgattt acctctgacg tttctatctc tccattgtat gctttttctt 15780 ggtttattct ttcattcctt ttctagcttc ttagtttagt catgcctttc cctctaagtg 15840 ctgccttacc tgcaccctgt gttttgatgt gaagtaatct caacatcagc cactttcaag 15900 tgttcttaaa atacttcaaa gtgttaatac ttcttttaag tattcttatt ctgtgatttt 15960 tttctttgtg cacgctgtgt tttgacgtga aatcattttg atatcagtga cttttaagta 16020 ttctttagct tattctgtga tttctttgag cagtgagtta tttgaacact gtttatgttc 16080 aagatatgta gagtatcaag atacgtagag tattttaagt tatcatttta ttattgattt 16140 ctaactcagt tgtgtagtgg tctgtataat accaattatt tgaagtttgc ggagccttgc 16200 tttgtgatct agtgtgtgca tggtttccag aactgtccat tgtaaatttg acatcctgtc 16260 aatagtgggc atgcatgttc actatatcca gcttattaag gtccagtgca aagcttctgt 16320 ctccttctag atgcatgaaa ttccaagaag gaggccatag tccctcacct gggggatggg 16380 tctgttcatt tcttctcgtt tggtagcatt tatgtgaggc attgttaggt gcatgcacgt 16440 ggtagaattt ttatcttcct gatgagtgaa tcttttggag acttctatgt ctctagtaat 16500 ctagtaattc tttttttaaa ttgctcttag tactgccaca ctgggcttct tttgattagt 16560 attttcctgc tgtgtctgtt ttctgccttt aatttatata tatatatata tttttttttt 16620 ttttgagaca gagtcttggt ctgtcgccca gggtgagtgc agtggtgtga tcacaggtca 16680 gtgtaacttt taccttctgg cctgagccgt cctctcacct cagcctcctg agtagctgga 16740 actgcagaca cgcaccgcta cacctggcta atttttaaat tttttctgga gacagggtct 16800 tgctgtgttg cccaggctgg tctcaaactc ttggactcaa gggatccatc tacctcggct 16860 tcccaaagtg ctgaattaca ggcatgagcc accatgtctg gcctaatttt caacactttt 16920 atattcttat agtgtgggta tgtcctgtta acagcatgta ggtgaatttc caatccagtc 16980 tgacagtcgt tgtttaactg gataacctga tttattttca tttttttgtc actagagacc 17040 cgcctggtgc actctgattc tccacttgcc tgttgcatgt cctcgttccc ttgtttctca 17100 ccacctcttg ggttgccatg tgcgtttcct gccgagtgtg tgttgatcct ctcgttgcct 17160 cctggtcact gggcatttgc ttttatttct ctttgcttag tgttaccccc tgatcttttt 17220 attgtcgttg tttgcttttg tttattgaga cagtctcact ctgtcaccca ggctggagtg 17280 taatggcaca atctcggctc actgcaacct ctgcctcctc ggttcaagca gttctcattc 17340 ctcaacctca tgagtagctg ggattacagg cgcccaccac cacgcctggc taatttttgt 17400 atttttagta gagataggct ttcaccatgt tggccaggct ggtctcaaac tcctgacctc 17460 aagtgatctg cccgccttgg cctcccacag tgctgggatt acaggtgcaa gccaccgtgc 17520 ccggcatacc ttgatctttt aaaatgaagt ctgaaacatt gctacccttg tcctgagcaa 17580 taagaccctt agtgtatttt agctctggcc accccccagc ctgtgtgctg ttttccctgc 17640 tgacttagtt ctatctcagg catcttgaca cccccacaag ctaagcatta ttaatattgt 17700 tttccgtgtt gagtgtttct gtagctttgc ccccgccctg cttttcctcc tttgttcccc 17760 gtctgtcttc tgtctcaggc ccgccgtctg gggtcccctt ccttgtcctt tgcgtggttc 17820 ttctgtcttg ttattgctgg taaaccccag ctttacctgt gctggcctcc atggcatcta 17880 gcgacgtccg gggacctctg cttatgatgc acagatgaag atgtggagac tcacgaggag 17940 ggcggtcatc ttggcccgtg agtgtctgga gcaccacgtg gccagcgttc cttagccagt 18000 gagtgacagc aacgtccgct cggcctgggt tcagcctgga aaaccccagg catgtcgggg 18060 tctggtggct ccgcggtgtc gagtttgaaa tcgcgcaaac ctgcggtgtg gcgccagctc 18120 tgacggtgct gcctggcggg ggagtgtctg cttcctccct tctgcttggg aaccaggaca 18180 aaggatgagg ctccgagccg ttgtcgccca acaggagcat gacgtgagcc atgtggataa 18240 ttttaaaatt tctaggctgg gcgcggtggc tcacgcctgt aatcccagca ctttgggagg 18300 ccaaggcggg tggatcacga ggtcaggagg tcgagaccat cctggccaac atgatgaaac 18360 cccatctgta ctaaaaacac aaaaattagc tgggcgtggt ggcgggtgcc tgtaatccca 18420 gctactcggg aggctgaggc aggagaattg cttgaacctg ggagttggaa gttgcagtga 18480 gccgacattg caccactgca ctccagcctg gcaacacagc gagactctgt ctcaaaaaaa 18540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aattctagta gccacattaa aaaagtaaaa aagaaaaggt 18600 gaaattaatg taataataga ttttactgaa gcccagcatg tccacacctc atcattttag 18660 ggtgttattg gtgggagcat cactcacagg acatttgaca ttttttgagc tttgtctgcg 18720 ggatcccgtg tgtaggtccc gtgcgtggcc atctcggcct ggacctgctg ggcttcccat 18780 ggccatggct gttgtaccag atggtgcagg tccgggatga ggtcgccagg ccctcagtga 18840 gctggatgtg cagtgtccgg atggtgcacg tctgggatga ggtcgccagg ccctgctgtg 18900 agctggatgt gtggtgtctg gatggtgcag gtcaggggtg aggtctccag gccctcggtg 18960 agctggaggt atggagtccg gatgatgcag gtccggggtg aggtcgccag gccctgctgt 19020 gagctggatg tgtggtgtct ggatggtgca ggtcaggggt gaggtctcca ggccctcggt 19080 aagctggagg tatggagtcc ggatgatgca ggtccggggt gaggtcgcca ggccctgctg 19140 tgagctggat gtgtggtgtc tggatggtgc aggtctgggg tgaggtcacc aggccctgcg 19200 gtgagctggg tgtgcggtgt ctggatggtg caggtctgga gtgaggtcgc cagacggtgc 19260 cagaccatgc ggtgagctgg atatgcggtg tccggatggt gcaggtctgg ggtgaggttg 19320 ccaggccctg ctgtgagttg gatgtggggt gtccggatgc tgcaggtccg gtgtgaggtc 19380 accaggccct gctgtgagct ggatgtgtgg tgtctggatg gtgcaggtct ggggtgaagg 19440 tcgccaggcc cctgcttgtg agctggatgt gtggtgtctg gatggtgcag gtctggagtg 19500 aggtcgccag gccctcggtg agctggatgt gcagtgtcca gatggtgcag gtccggggtg 19560 aggtcgccag accctgcggt gagctggatg tgcggtgtct ggatggtgca ggtctggagt 19620 gaggtcgcca ggccctcggt gagctggatg tatggagtcc ggatggtgcc ggtccggggt 19680 gaggtcgcca gaccctgctg tgagctggat gtgcggtgtc tggatggtac aggtctggag 19740 tgaggtcgcc agaccctgct gtgagctgga tatgcggtgt ccggatggtg caggtcaggg 19800 gtgaggtctc caggccctcg gtgagctgga ggtatggagt ccggatgatg caggtccggg 19860 gtgaggtcgc caggccctgc tgtgaactgg atgtgcggcg tctggatggt gcaggtctgg 19920 ggtgtggtcg ccaggccctc ggtgagctgg aggtatggag tccggatgat gcaggtccgg 19980 ggtgaggtcg ccaggccctg ctgtgagctg gatgtgcggc gtctggatgg tgcaggtctg 20040 gggtgtggtc gccaggccct cggtgagctg gaggtatgga gtccggatga tgcaggtccg 20100 gggtgaggtt gccaggccct gctgtgagct ggatgtgctg tatccggatg gtgcagtccg 20160 gggtgaggtc gccaggccct gctgtgagct ggatgtgctg tatccggatg gtgcaggtct 20220 ggggtgaggt caccaggccc tgcggtgagc tggttgtgcg gtgtccggtt gctgcaggtc 20280 cggggtgagt tcgccaggcc ctcggtgagc tggatgtgcg gtgtccccgt gtccggatgg 20340 tgcaggtcca gggtgaggtc gctaggccct tggtgggctg gatgtgccgt gtccggatgg 20400 tgcaggtctg gggtgaggtc gccaggcctt tggtgagctg gatgtgcggt gtctgcatgg 20460 tgcaggtctg gggtgaggtc gccaggccct tggtgggctg gatgtgtggt gtccggatgg 20520 tgcaggtccg gcgtgaggtc gccaggccct gctgtgagct ggatgtgcgg tgtctggatg 20580 gtgcaggtcc ggggtgaggt agccaaggcc ttcggtgagc tggatgtggg gtgtccggat 20640 ggtgcaggtc cggggtgagg tcgccaggcc ctgcggttag ctggatatgc ggtgtccgga 20700 tggtgcaggt ccggggtgag gtcaccaggc cctgcggtta gctggatgtg cggtgtctgg 20760 atggtgcagg tccggggtga ggtcgccagg ccctgctgtg agctggatgt gctgtatccg 20820 gatggtgcag gtccggggtg aggtcgccag gccctgcagt gagctggatg tgctgtatcc 20880 ggatggtgca ggtctggcgt gaggtcgcca ggccctgcgg ttagctggat atgcggtgtc 20940 ggatggtgca ggtccggggt gaggtcacca ggccctgcgg ttagctggat gtgcggtgtc 21000 cggatggtgc aggtctgggg tgaggtcgcc aggccctgct gtgagctgga tgtgctgtat 21060 ccggatggtg caggtccggg gtgaggtcgc caggccctgc ggtgagctgg atgtgctgta 21120 tccggatggt gcaggtctgg cgtgaggtcg ccaggccctg cggtgagctg gatgtgcagt 21180 gtacggatgg tgcaggtccg gggtgaggtc gccaggccct gcggtgggct gtatgtgtgt 21240 tgtctggatg gtgcaggtcc ggggtgagtt cgccaggccc tgcggtgagc tggatgtgtg 21300 gtgtctggat gctgcaggtc cggggtgagt tcgccaggcc ctcggtgagc tggatatgcg 21360 gtgtccccgt gtccgaatgg tgcaggtcca gggtgaggtc gccaggccct tggtgggctg 21420 gatgtgccgt gtccggatgg tgcaggtctg gggtgaggtc gccaggccct tggtgagctg 21480 gatgtgcggt gtccggatgg tgcaggtccg gggtgaggtc accaggccct cggtgatctg 21540 gatgtggcat gtccttctcg tttaaggggt tggctgtgtt ccggccgcag agcaccgtct 21600 gcgtgaggag atcctggcca agttcctgca ctggctgatg agtgtgtacg tcgtcgagct 21660 gctcaggtct ttcttttatg tcacggagac cacgtttcaa aagaacaggc tctttttcta 21720 ccggaagagt gtctggagca agttgcaaag cattggaatc aggtactgta tccccacgcc 21780 aggcctctgc ttctcgaagt cctggaacac cagcccggcc tcagcatgcg cctgtctcca 21840 cttgcctgtg cttccctggc tgtgcagctc tgggctggga gccaggggcc ccgtcacagg 21900 cctggtccaa gtggattctg tgcaaggctc tgactgcctg gagctcacgt tctcttactt 21960 gtaaaatcag gagtttgtgc caagtggtct ctagggtttg taaagcagaa gggatttaaa 22020 ttagatggaa acactaccac tagcctcctt gcctttccct gggatgtggg tctgattctc 22080 tctctctttt ttttttcttt tttgagatgg agtctcactc tgttgcccag gctggagtgc 22140 agtggcataa tcttggctca ctgcaacctc cacctcctgg gtttaagcga ttcaccagcc 22200 tcagcctcct aagtagctgg gattacaggc acctgccacc acgcctggct aatttttgta 22260 cttttaggag agacggggtt tcaccatgtt ggccaggctg gtctcgaact catgacctca 22320 ggtgatccac ccaccttggc ctcccaaagt gctgggttta caggctaagc caccgtgccc 22380 agcccccgat tctcttttaa ttcatgctgt tctgtatgaa tcttcaatct attggattta 22440 ggtcatgaga ggataaaatc ccacccactt ggcgactcac tgcagggagc acctgtgcag 22500 ggagcacctg gggataggag agttccacca tgagctaact tctaggtggc tgcatttgaa 22560 tggctgtgag attttgtctg caatgttcgg ctgatgagag tgtgagattg tgacagattc 22620 aagctggatt tgcatcagtg agggacggga gcgctggtct gggagatgcc agcctggctg 22680 agcccaggcc atggtattag cttctccgtg tcccgcccag gctgactgtg gagggcttta 22740 gtcagaagat cagggcttcc ccagctcccc tgcacactcg agtccctggg gggccttgtg 22800 acaccccatg ccccaaatca ggatgtctgc agagggagct ggcagcagac ctcgtcagag 22860 gtaacacagc ctctgggctg gggaccccga cgtggtgctg gggccatttc cttgcatctg 22920 ggggagggtc agggctttcc ctgtgggaac aagttaatac acaatgcacc ttacttagac 22980 tttacacgta tttaatggtg tgcgacccaa catggtcatt tgaccagtat tttggaaaga 23040 atttaattgg ggtgaccgga aggagcagac agacgtggtg gtccccaaga tgctccttgt 23100 cactactggg actgttgttc tgcctggggg gccttggagg cccctcctcc ctggacaggg 23160 taccgtgcct tttctactct gctgggcctg cggcctgcgg tcagggcacc agctccggag 23220 cacccgcggc cccagtgtcc acggagtgcc aggctgtcag ccacagatgc ccaggtccag 23280 gtgtggccgc tccagccccc gtgcccccat gggtggtttt gggggaaaag gccaagggca 23340 gaggtgtcag gagactggtg ggctcatgag agctgattct gctccttggc tgagctgccc 23400 tgagcagcct ctcccgccct ctccatctga agggatgtgg ctctttctac ctgggggtcc 23460 tgcctggggc cagccttggg ctaccccagt ggctgtacca gagggacagg catcctgtgt 23520 ggaggggcat gggttcacgt ggccccagat gcagcctggg accaggctcc ctggtgctga 23580 tggtgggaca gtcaccctgg gggttgaccg ccggactggg cgtccccagg gttgactata 23640 ggaccaggtg tccaggtgcc ctgcaagtag aggggctctc agaggcgtct ggctggcatg 23700 ggtggacgtg gccccgggca tggccttcag cgtgtgctgc cgtgggtgcc ctgagccctc 23760 actgagtcgg tgggggcttg tggcttcccg tgagcttccc cctagtctgt tgtctggctg 23820 agcaagcctc ctgaggggct ctctattgca gacagcactt gaagagggtg cagctgcggg 23880 agctgtcgga agcagaggtc aggcagcatc gggaagccag gcccgccctg ctgacgtcca 23940 gactccgctt catccccaag cctgacgggc tgcggccgat tgtgaacatg gactacgtcg 24000 tgggagccag aacgttccgc agagaaaaga gggtggctgt gctttggttt aacttccttt 24060 ttaaacagaa gtgcgtttga gccccacatt tggtatcagc ttagatgaag ggcccggagg 24120 aggggccacg ggacacagcc agggccatgg cacggcgcca acccatttgt gcgcacagtg 24180 aggtggccga ggtgccggtg cctccagaaa agcagcgtgg gggtgtaggg ggagctcctg 24240 gggcagggac aggctctgag gaccacaaga agcagccggg ccagggcctg gatgcagcac 24300 ggcccgaggt cctggatccg tgtcctgctg tggtgcgcag cctccgtgcg cttccgctta 24360 cggggcccgg ggaccaggcc acgactgcca ggagcccacc gggctctgag gatcctggac 24420 cttgccccac ggctcctgca ccccacccct gtggctgcgg tggctgcggt gaccccgtca 24480 tctgaggaga gtgtggggtg aggtggacag aggtgtggca tgaggatccc gtgtgcaaca 24540 cacatgcggc caggaacccg tttcaaacag ggtctgagga agctgggagg ggttctaggt 24600 cccgggtctg ggtggctggg gacactgggg aggggctgct tctcccctgg gtccctatgg 24660 tggggtgggc acttggccgg atccactttc ctgactgtct cccatgctgt ccccgccagg 24720 ccgagcgtct cacctcgagg gtgaaggcac tgttcagcgt gctcaactac gagcgggcgc 24780 ggcgccccgg cctcctgggc gcctctgtgc tgggcctgga cgatatccac agggcctggc 24840 gcaccttcgt gctgcgtgtg cgggcccagg acccgccgcc tgagctgtac tttgtcaagg 24900 tgggtgccgg ggacccccgt gagcagccct gctggacctt gggagtggct gcctgattgg 24960 cacctcatgt tgggtggagg aggtactcct gggtgggccg cagggagtgc aggtgaccct 25020 gtcactgttg aggacacacc tggcacctag ggtggaggcc ttcagccttt cctgcagcac 25080 atggggccga ctgtgcaccc tgactgcccg ggctcctatt cccaaggagg gtcccactgg 25140 attccagttt ccgtcagaga aggaaccgca acggctcagc caccaggccc cggtgccttg 25200 caccccagtc ctgagccagg ggtctcctgt cctgaggctc agagagggga cacagcccgc 25260 cctgcccttg gggtctggag tggtgggggt cagagagaga gtgggggaca ccgccaggcc 25320 aggccctgag ggcagaggtg atgtctgagt ttctgcgtgg ccactgtcag tctcctcgcc 25380 tccactcaca caggtggatg tgacgggcgc gtacgacacc atcccccagg acaggctcac 25440 ggaggtcatc gccagcatca tcaaacccca gaacacgtac tgcgtgcgtc ggtatgccgt 25500 ggtccagaag gccgcccatg ggcacgtccg caaggccttc aagagccacg taaggttcac 25560 gtgtgatagt cgtgtccagg atgtgtgtct ctgggatatg aatgtgtcta gaatgcagtc 25620 gtgtctgtga tgcgtttctg tggtggaggt acttccatga tttacacatc tgtgatatgc 25680 gtgtgtggca cgtgtgtgtc gtggtgcatg tatctgtggc gtgcatattt gtggtgtgtg 25740 tgtgtgtggc acgtgtgtgt ccatggtgtg tgtgcctgtg gtgtgcatgt gtgtgtgtct 25800 gtgacacgtg catgttcatg ctgtgtgctg catgtctgtg atgtgcctat ttgtggtgtg 25860 tgtgtgcatg tgtccgtgac atatgcgtgt ctatggcatg ggtgtgtgtg gccccttggc 25920 cttactcctt cctcctccag gcatggtccg caccattgtc ctcacgctct cgggtgctgg 25980 tttggggagc tccacattca gggtcctcac ttctagcatg ggtgcccctg tcctgtcaca 26040 gggctgggcc ttggagactg taagccaggt ttgagaggag agtagggatg ctggtggtac 26100 cttcctggac ccctggcacc cccaggaccc cagtctggcc tatgccggct ccatgagata 26160 taggaaggct gattcaggcc tcgctccccg ggacacactc ctcccagagc ggccgggggc 26220 cttggggctc ggcaggggtg aaaggggccc tgggcttggg ttcccaccca gtggtcatga 26280 gcacgctgga ggggtaagcc ctcaaagtcg tgccaggccg gggtgcagag gtgaagaagt 26340 atccctggag cttcggtctg gggagaggca catgtggaaa cccacaagga cctctttctc 26400 tgacttcttg agcttgtggg attggttttc atgtgtggga taggtgggga tctgtgggat 26460 tggtttttat gagtggggta acacagagtt caaggcgagc tttcttcctg tagtgggtct 26520 gcaggtgctc caacagcttt attgaggaga ccatatcttc ctttgaacta tggtcgggtt 26580 tatagtaagt caggggtgtg gaggcctccc ctgggctccc tgttctgttt cttccactct 26640 ggggtcgtgt ggtgcctgct gtggtgtgtg gccggtgggc agggcttcca ggcctccttg 26700 tgttcattgg cctggatgtg gccctggcta cgctccgtcc ttggaattcc cctgcgagtt 26760 ggaggctttc tttctttctt tttttctttc tttttttttt tttttgataa cagagtctcg 26820 ctcttttttg cccaggctgg agtggtttgg cgtgatcttg gctcactgca acctgtgctt 26880 cctgagttca agcaattctc ttgcctcagc ctcccaagta gctggaatta taggcgccca 26940 ccaccatgct gactaatttt tgtaatttta gtagagacga ggtttctcca tgttggccag 27000 gctggtctcg aactcctgac ctcaggtgat cctcccacct cggcctccca aagtgctggg 27060 atgacaggtg tgaaccgccg cgcccggccg agactcgctt cctgcagctt ccgtgagatc 27120 tgcagcgata gctgcctgca gccttggtgc tgacaacctc cgttttcctt ctccaggtct 27180 cgctaggggt ctttccattt catgactctc ttcacagaag agtttcacgt gtgctgattt 27240 cccggctgtt tcctgcgtaa ttggtgtctg ctgtttatcg atggcctcct tccatttcct 27300 ttaggctttg tttattgttg tttttccggc tccttgaagg aaaagtttcg attatggatg 27360 tttgaacttt cttttctaaa caagcatctg aagttgccgt tttccctcta aagcagggat 27420 cccgaggccc ctggctgtgg agtggcaccg gtctggggcc tgttaggaac ccggcgcaca 27480 gcgggaggct aggtggggtg tggggagcca gcgttcccgc ctgagccccg cccctctcag 27540 atcagcagtg gcatgcggtg ctcagaggcg cacacaccct actgagaact gtgcgtgaga 27600 ggggtctaga ttctgtgctc cttatgggaa tctaatgcct gatgatctga ggtggaaccg 27660 tttgctccca aaaccatccc cttccccact gctgtcctgt ggaaaaatcg tcttccacga 27720 aaccagtccc tggtaccaca atggttgggg accctgtgct aaagacctgc ttcagcagcc 27780 tctcgtcagt gttgatatat tggcttttct gtgttgagtc cagaataatt acggatttct 27840 gtgatgcttt ccgccgacct cagacccatg ggctatttgt gggcgtgttg cctgctcctg 27900 ggttgggaag ggtgcaggcc ccatgtacct tcctgttact gccttccagg ttggttctca 27960 gggttgaatc gtactcgatg tggttttagc ccacggccct gccgccagct cctgggggct 28020 ggggaacatg ctgaagcaca gagtcaccgt gcgcgtcttt tgatgcctca caagctcgag 28080 gcctcctgtg tccgtgttag tgtgtgtcac gtgcctgctc acatcctgtc ttggggacgc 28140 aggggcttag caggtcccgt agtaaatgac aagcgtcctg ggggagtctg cagaatagga 28200 ggtgggggtg ccggtctctc tcccgcgtct tcagactctt ctcctgcctg tgctgtggct 28260 gcacctgcat ccctgcaatc cctccagcac tgggctggag aggcccggga gctcgagtgc 28320 cacttgtgcc acgtgactgt ggatggcagt cggtcacggg ggtctgatgt gtggtgactg 28380 tggatggcgg ttggtcacag gggtctgatg tgtggtgact gtggatggcg gtcgtggggt 28440 ctgatgtggt gactgtggat ggcggtcgtg gggtctgatg tgtggtgact gtggatggcg 28500 gtcgtggggt ctgatgtggt gactgtggat ggcggtcgtg gggtctgatg tggtgactgt 28560 ggatggcggt cgtggggtct gatgtggtga ctgtggatgg cagtcgtggg gtctgatgtg 28620 tggtgactgt ggatggcggt cgtggggtct gatgtggtga ctgtggatgg cagtcgtggg 28680 gtctgatgtg tggtgactgt ggatggcggt cgtggggtct gatgtgtggt gactgtggat 28740 ggcggtcgtg gggtctgatg tgtggtgact gtggatggcg gtcgtggggt ctgatgtgtg 28800 gtgactgtgg atggcggtcg tggggtctga tgtggtgact gtggatggcg gtcgtggggt 28860 ctgatgtgtg gtgactgtgg atggtgatcg gtcacagggg tctgatgtgt ggtgactgtg 28920 gatggcggtc gtggggtctg atgtgtggtg actgtggatg gtgatcggtc acaggggtct 28980 gatgtgtggt gactgtggat ggcggtcgtg gggtctgatg tgtggtgact gtggatggcg 29040 gttggtcccg ggggtctgat gtgtggtgac tgtggatggc gatcggtcac aggggtctga 29100 tgtgtggtga ctgtggatgg cggtcgtggg gtctgatgtg tggtgactgt ggatggcggt 29160 cgtggggtct gatgtgtggt gactgtggat ggcggtcgtg gggtctgatg tggtgactgt 29220 ggatggcggt cgtggggtct gatgtggtga ctgtggatgg cggtcgtggg gtctgatgtg 29280 tggtgactgt ggatggcggt tggtcccggg ggtctgatgt gtggtgactg tggatggcgg 29340 tcgtggggtc tgatgtggtg actgtggatg gcagtcgtgg ggtctgatgt gtggtgactg 29400 tggatggcgg tcgtggggtc tgatgtgtgg tgactgtgga tggcggtcgt ggggtctgat 29460 gtgtggtgac tgtggatggc ggtcgtgggg tctgatgtgt ggtgactgtg gatggcggtc 29520 gtggggtctg atgtggtgac tgtggatggc ggtcgtgggg tctgatgtgt ggtgactgtg 29580 gatggtgatc ggtcacaggg gtctgatgtg tggtgactgt ggatggcggt cgtggggtct 29640 gatgtgtggt gactgtggat ggcggtcgtg gggtctgatg tggtgactgt ggatggcggt 29700 cgtggggtct gatgtgtggt gactgtggat ggcggtcgta gggtctgatg tgtggtgact 29760 gtggatggca gtcggtcaca ggggtctgat gtgtggtgac tgtggatggc ggtcgtgggg 29820 tctgatgtgt ggtgactgtg gatggcggtc gtggggtctg atgtgtggtg actgtggatg 29880 gcggtcgtgg ggtctgatgt gtggtgactg tggatggcgg tcgtggggtc tgatgtggtg 29940 actgtggatg gtgatcggtc acaggggtct gatgtgtggt agctgcaggt ggagtcccag 30000 gtgtgtctgt agctactttg cgtcctcggc cccccggccc ccgtttccca aacagaagct 30060 tcccaggcgc tctctgggct tcatcccgcc atcgggcttg gccgcaggtc cacacgtcct 30120 gatcggaaga aacaagtgcc cagctctggc cggggcaggc cacatttgtg gctcatgccc 30180 tctcctctgc cggcaggtct ctaccttgac agacctccag ccgtacatgc gacagttcgt 30240 ggctcacctg caggagacca gcccgctgag ggatgccgtc gtcatcgagc aggtctgggc 30300 actgccctgc agggttgggc acggactccc agcagtgggt cctcccctgg gcaatcactg 30360 ggctcatgac cggacagact gttggccctg gggggcagtg gggggaatga gctgtgatgg 30420 gggcatgatg agctgtgtgc cttggcgaaa tctgagctgg gccatgccag gctgcgacag 30480 ctgctgcatt caggcacctg ctcacgtttg actgcgcggc ctctctccag ttccgcagtg 30540 cctttgttca tgatttgcta aatgtcttct ctgccagttt tgatcttgag gccaaaggaa 30600 aggtgtcccc ctcctttagg agggcaggcc atgtttgagc cgtgtcctgc ccagctggcc 30660 cctcagtgct gggtctgagg ccaaaggaaa cgtgtccccc ttcttaggag gacgggccgt 30720 gtttgagcca cgccccgctg agcgggcctc tcagtgctgg gtctgtccac gtggccctgt 30780 ggccctttgc agatgtggtc tgtccacgtg gccctgtggc tctttgcaga tgcctgttag 30840 cacttgctcg gctctagggg acagtcgtgt ccaccgcatg aggctcagag acctctgggc 30900 gaatttcctt ggctcccagg gtgggggtgg aggtggcctg ggctgctggg acccagaccc 30960 tgtgcccggc agctgggcag caactcctgg atcacatatg ccatccgggc cacggtgggc 31020 tgtgtgggtg tgagcccagc tggacccaca ggtggcccag aggagacgtt ctgtgtcaca 31080 cactctgcct aagcccatgt gtgtctgcag agactcggcc cggccagccc acgatggccc 31140 tgcattccag cccagccccg cacttcatca caaacactga ccccaaaagg gacggagggt 31200 cttggccacg tggtcctgcc tgtctcagca cccaccggct cactcccatg tgtctcccgt 31260 ctgctttcgc agagctcctc cctgaatgag gccagcagtg gcctcttcga cgtcttccta 31320 cgcttcatgt gccaccacgc cgtgcgcatc aggggcaagt gagtcaggtg gccaggtgcc 31380 attgccctgc gggtggctgg gcgggctggc agggcttctg ctcacctctc tcctgcccct 31440 tccccactgn ccttctgccc ggggccacca gagtctcctt ttctggcccc cgccccctcc 31500 ggctcctggg ctgcaggctc ccgaggcccc ggaaacatgg ctcggcttgc ggcagccgga 31560 gcggagcagg tgccacacga ggcctggaaa tggcaagcgg ggtgtggagt tgctcctgcg 31620 tggaggacga ggggcggggg gtgtgtctgg gtcaggtgtg cgccgagcgt ttgagcctgc 31680 agcttgtcag ctccaagtta ctactgacgc tggacacccg gctctcacac gcttgtatct 31740 ctctctcccg atacaaaagg attttatccg attctcattc ctgtccctgt cgtgtgaccc 31800 ccgcgagggc gcgggctctt ctctctgtga ctagatttcc catctggaaa gtgcggggtt 31860 gaccgtgtag tttgctcctc tcggggggcc tgtggtggcc atggggcagg cggcctggga 31920 gagctgccgt cacacagcca ctgggtgagc cacactcacg gtggtagagc cacagtgcct 31980 ggtgccacat cacgtcctct ggattttaag taaaaccaca cacctcccgg caggcatctg 32040 cctgcgaccc tgtgtgtgcc tggggagagt ggtagcacgg aggaaattcg tgcacactca 32100 aggtcatcag caaggtcatc cgcagtcagg tggaacgtgg aggcctctct ctgggatcgt 32160 ctccagcgga taaaggactg tgcacagctt cggaagcttt tatttaaaaa tataactatt 32220 aattattgca ttataagtaa tcactaatgg tatcagcaat tataatattt attaaagtat 32280 aattagaaat attaagtagt acacacgttc tggaaaaaca caaattgcac atggcagcag 32340 agtgaatttt ggccgaggga cacgtgtgca catgtgtgta agcggccccc aggcccacag 32400 aattcgctga caaagtcacc tccccagaga agccaccacg ggcctccttc gtggtcgtga 32460 attttattaa gatggatcaa gtcacgtacc gtccacgtgt ggcagggctt tggggaatgt 32520 gaggtgatga ctgcgtcctc atgccctgac agacaggagg tgactgtgtc tgtcctgtcc 32580 ctaggacacg gacaggcccg aagctctagt ccccatcgtg gtccagtttg gcctctgaat 32640 aaaaacgtct tcaaaacctg ttgccccaaa aactaagaac agagagagtt tcccatccca 32700 tgtgctcaca ggggcgtatc tgcttgcgtt gactcgctgg gctggccgga ctcctagagt 32760 tggtgcgtgt gcttctgtgc aaaaagtgca gtcctcttgc ccatcactgt gatatctgca 32820 ccagcaagga aagcctcttt tcttttcttt cttttttttt ttttgagacg gaacgtcact 32880 gttgtctgcc tgggcttgag tgcagtggcg cgatctcaac tcactgcaac ctccgcctcc 32940 cgggttccag catttctcct gcctcagcct cccgagcagc tgagattaca ggcacccacc 33000 ccctgcgcct ggctaatttt tgtattttta gtagagaggg gtttttgcca tgttggccag 33060 gctggtctcg aactcctgac ctcaggtgat ccacccacct cggcctccca aagtgctggg 33120 attacaggtg tgagccatca cgcccagccg gaaagcctct ttttaaggtg accacctata 33180 gcgcttcccg aaaataacag gtcttgtttt tgcagtaggc tgcaagcgtc tcttagcaac 33240 aggagtggcg tcctgtgggc tctggggatg gctgagggtc gcgtggcagc catgccttct 33300 gtgtgcacct ttaggttcca cggggctatt ctgctctcac tgtttgtctg aaaacgcacc 33360 cttggcatcc ttgtttggag agtttctgct tctcgttggt catgctgaaa ctaggggcaa 33420 ggttgtatcc gttggcgcgc agcggctaca tgtagggtca tgagtctttc accgtggaca 33480 aattccttga aaaaaaaaaa aggagtccgg ttaagcattc attccgggtc aagtgtctgg 33540 ttctgtgaat aaactctaag atttaagaaa ccttaatgaa agaaaacctt gatgattcag 33600 agcaaggatg tggtcacacc tgtggctgga tctgtttcag ccgccccagt gcatggtgag 33660 agtggggagc agggattgtt tgttcagagg tctcatctgg tatgtttctg aggtgtttgc 33720 cggctgaatg gtagacgtgt cgtttgtgtg tatgaggttc tgtgtctgtg tgtggctcgg 33780 tttgagtgta cgcatgtcca gcacatgccc tgcccgtctc tcacctgtgt cttcccgccc 33840 caggtcctac gtccagtgcc aggggatccc gcagggctcc atcctctcca cgctgctctg 33900 cagcctgtgc tacggcgaca tggagaacaa gctgtttgcg gggattcggc gggacgggtg 33960 aggcctcctc ttccccaggg gggcttgggt gggggttgat ttgcttttga tgcattcagt 34020 gttaatattc ctggtgctct ggagaccatg actgctctgt cttgaggaac cagacaaggt 34080 tgcagcccct tcttggtatg aagccgcacg ggaggggttg cacagcctga ggactgcggg 34140 ctccacgcag gctctgtcca gcggccatgt ccagaggcct cagggctcag caggcgggag 34200 ggccgctgcc ctgcatgatg agcatgtgaa ttcaacaccg aggaagcaca ccagcttctg 34260 tcacgtcacc caggttccgt tagggtcctt ggggagatgg ggctggtgca gcctgaggcc 34320 ccacatctcc cagcaggccc tcgacaggtg gcctggactg ggcgcctctt cagcccattg 34380 cccatcccac ttgcatgggg tctacaccca aggacgcaca cacctaaata tcgtgccaac 34440 ctaatgtggt tcaactcagc tggcttttat tgacagcagt tacttttttt tttttaatac 34500 tttaagttct agggtacatg tgcacgacgt gcaggttagt tacatatgta tacatgtgcc 34560 atgttggtgt gctgcaccca ttaactcatc atttacatta ggtatatctc ctaatgctat 34620 ccctccccac tccccccatc ccatgacagg ccctggtgtg tgatgttccc caccctgtgt 34680 ccaagtgttc tcattgttca gttcccacct gtgagtgaga acatgtggtg tttggttttc 34740 tttccttgca atagtttgct cagagtgatg gtttccagct tcgtccatgt ccctacaaag 34800 gacatgaact catccttttt tatgactgca tagtattccg tggtgtatat gtgccacatt 34860 ttcttaatcc agtctatcat cgatggacat ttgggttggt tgcaagtctt tgctactgtg 34920 aatagtgccg caataaacat acgtgtgcat gtgtctttat agcagcatga tttataatcc 34980 tttgggtata tacccagtaa tgggatggct gggtcaaatg gtatttctag ttctagatcc 35040 ttgaggaatc accacactgt cttccacaat ggttgaacta gtttacactc ccaccaacag 35100 tgtaaaagtg ttctggtgct ggagaggatg tggacagcag ttattttttt atgaaaatag 35160 tatcactgaa caagcagaca gttagtgaag gatgcgtcag gaagcctgca ggccacacag 35220 ccatttctct cgaagactcc gggtttttcc tgtgcatctt ttgaaactct agctccaatt 35280 atagcatgta cagtggatca aggttcttct tcattaaggt tcaagttcta gattgaaata 35340 agtttatgta acagaaacaa aaatttcttg tacacacaac ttgctctggg atttggagga 35400 aagtgtcctc gagctggcgg cacactggtc agccctctgg gacaggatac ctctggccca 35460 tggtcatggg gcgctgggct tgggcctgag ggtcacacag tgcaccatgc ccagcttcct 35520 gtggatagga tctgggtctc ggatcatgct gaggaccaca gctgccatgc tggtaaaggg 35580 caccacgtgg ctcagagggg gcgaggttcc cagccccagc tttcttaccg tcttcagtta 35640 tttttcccta agagtctgag aagtggggcc gcgcctgatg gccttcgttc gtcttcagct 35700 ggcacagaat tgcacaagct gatggtaaac actgagtact tataatgaat gaggaattgc 35760 tgtagcagtt aactgtagag agctcgtctg ttggaaagaa atttaagttt ttcatttaac 35820 cgctttggag aatgttactt tatttatggc tgtgtaaatt gtttgacatt cagtccctcg 35880 tagacagata ctacgtaaaa agtgtaaagt taaccttgct gtgtattttc ccttatttta 35940 ggctgctcct gcgtttggtg gatgatttct tgttggtgac acctcacctc acccacgcga 36000 aaaccttcct caggtgaggc ccgtgccgtg tgtctgtggg gacctccaca gcctgtgggc 36060 tttgcagttg agccccccgt gtcctgcccc tggcaccgca gcgttgtctc tgccaagtcc 36120 tctctctctg ccggtgctgg atccgcaaga gcagaggcgc ttggccgtgc acccaggcct 36180 gggggcgcag gggcaccttc gggagggagt gggtaccgtg caggccctgg tcctgcagag 36240 acgcacccag gttacacacg tggtgagtgc aggcggtgac ctggctcctg ctgctctttg 36300 gaaagtcaag agtggcggct cctggggccc cagtgagacc cccaggagct gtgcacaggg 36360 cctgcagggc cgaggcggca gcctcctccc cagggtgcac ctgagcctgc ggagagcagg 36420 agctgctgag tgagctggcc cacagcgttc gctgcggtca cgttcctgcg tggggttgtt 36480 tgggatcggt gggagaattt ggatttgctg agtgctgctg tcttgaacca cggagatggc 36540 taggagtggg tttcagagtt gatttttgtg aatcaaacta aaatcaggca caggggacct 36600 ggcctcagca caggggattg tccaatgtgg tccccctcaa gggcgcccca cagagccggt 36660 gggcttgttt taaagtgcga tttgacgagg gacgagaaac cttgaaagct gtaaagggaa 36720 ccctcagaaa atgtggccgc caggggtggt ttcaggtgct ttgctgggct gtgtttgtga 36780 aaacccattt ggacccgccc tccaagtcca ccctccaggt ccaccctcca gggccgccct 36840 gggctggggg tatgcctggc gttccttgtg ccgcagcccg gagcacagca ggctgtgcac 36900 atttaaatcc actaagattc actcgggggg agcccaggtc ccaagcaact gagggctcag 36960 gagtcctgag gctgctgagg ggacagagca gacggggaac gctgcttctg tgtggcaagt 37020 tcctgagggt gctggccagg gaggtggctc agagtgtatg ttggggtccc accgggggca 37080 gaactctgtc tctgatgagt cggcagccat gtaacaggaa ggggtggcca cagggagctg 37140 ggaatgcacc aggggagctg cgcagctggc cgaggtccca gggccaggcc acaggaaggg 37200 cagggggacg cccggggcca cagcagaggc cgcaggaagg gaaggggatg cccaggccag 37260 agcagaggct accgggcaca ggggggctcc ctgagctggg tgagcgaggc tcatgactcg 37320 gcgagggaac ctccttgacg tgaagctgac gactggtgtt gcccagctca cagcccagcc 37380 aggtcccgcg cctgagcagg aactcagaac cctccccttt gtctaaagca cagcagatgc 37440 cttcagggca tctaggagaa aacaggcaaa gtcgttgaga aacgtcttaa aagaaggtgg 37500 gatggtggca atttcttgtc cagattttag tctgccccgg accacagatg agtctataac 37560 gggattgtgg tgttgccatg gggacacatg agatggacca tcacagaggc cactggggct 37620 gcacctccca tctgagtcct ggctgtcccg ggtccaggcc aggttcttgc atgctcacct 37680 acctgtcctg cccgggagac agggaaagca ccccgaagtc tggagcaggg ctgggtccag 37740 gctcctcaga gctcctgcca ggcccagcac cctgctccaa atcaccactt ctctggggtt 37800 ttccaaagca tttaacaagg gtgtcaggtt acctcctggg tgacggcccc gcatcctggg 37860 gctgacattg cccctctgcc ttaggaccct ggtccgaggt gtccctgagt atggctgcgt 37920 ggtgaacttg cggaagacag tggtgaactt ccctgtagaa gacgaggccc tgggtggcac 37980 ggcttttgtt cagatgccgg cccacggcct attcccctgg tgcggcctgc tgctggatac 38040 ccggaccctg gaggtgcaga gcgactactc caggtgagcg cacctggccg gaagtggagc 38100 ctgtgcccgg ctggggcagg tgctgctgca gggccgttgc gtccacctct gcttccgtgt 38160 ggggcaggcg actgccaatc ccaaagggtc agaggccaca gggtgcccct cgtcccatct 38220 ggggctgagc agaaatgcat ctttctgtgg gagtgagggt gctcacaacg ggagcagttt 38280 tctgtgctat tttggtaaaa ggaaatggtg caccagacct gggtgcactg aggtgtcttc 38340 agaaagcagt ctggatccga acccaagacg cccgggccct gctgggcgtg agtctctcaa 38400 acccgaacac aggggccctg ctgggcatga gtccctctga acccgagacc ctggggccct 38460 gctgggcgtg agtctctccg aacccagaga cttcagggcc cttttgggcg tgagtctctc 38520 cgctgtgagc cccacactcc aaggctcatc cacagtctac aggatgccat gagttcatga 38580 tcacgtgtga cccatcaggg gacagggcca tggtgtgggg ggggtctcta caaaattctg 38640 gggtcttgtt tccccagagc ccgagagctc aaggccccgt ctcaggctca gacacaaatg 38700 aattgaagat ggacacagat gcagaaatct gtgctgtttc ttttatgaat aaaaagtatc 38760 aacattccag gcagggcaag gtggctcaca cctataatcc cagcactttg ggaggccgag 38820 gtgggtggat cacttgaggc caggagtttg aggccaacct aaccaacata gtgaaattcc 38880 atttctactt aaaaaataca aaaattagcc tggcctggtg gcacacgcct gtagtccccg 38940 ctatgcggga ggctgaggca ggagaatcat ttgaacccag gaggcagagg ttgcagtgag 39000 ccgagatcac accactgcac tccagcctgg gcaacagagt gagacttcat cttaaaaaaa 39060 aaaaaaaaag tatcagcatt ccaaaaccat agtggacagg tgttttttta ttctgtcctt 39120 cgataatatt tactggtgct gtgctagagg ccggaactgg gggtgccttc ctctgaaagg 39180 cacaccttca tgggaagaga aataagtggt gaatggttgt taaaccagag gtttaaactg 39240 gggtcctgtc gttctgagtt aacagtccag atctggactt tgcctctttc cagaatgctc 39300 cctggggttt gcttcatggg ggagcagcag gtgtggacac cctcgtgatg ggggagcagc 39360 aggtgcagac gccctcatga tgggggagtg gcaggtgcag acacccttgt gcatggtgcc 39420 cagcatgtcc ctgttgcagc tccctcccca caaggatgcc ggtctcctgt gctccccaca 39480 gtccctgctt ccctctcaca gccttacctg gtcctggcct ccactggctt tgtctgcatg 39540 atttccacat ttcctgggct cccagcacct cttcgcctct cccaggcacc tctgcagtgc 39600 tggccatacc agtcagctgt gaactgtcca ctgcttattt tgctccccat gaaatgtatt 39660 ttttaggaca ggcacccctg gttccagcct ctggcacagc atcagtgaat gttattgaag 39720 gacaaaggac agacaaacaa atcaggaaaa tgggttctct ctaaacacat tgcaaagcca 39780 cagaggctag tgcaggatgg gtgggcatca ggtcatcaga tgtgggtcca atgccagaat 39840 attctgtgct cccaaaggcc acttggtcag agtgtgtgct tgcagaggtg gctctaaaag 39900 ctcagcagtg gaggcagtgg ttcgccatac tcagggtgaa ctcacatcct ctgtgtctga 39960 agtatacagc agaggcttga agggcatctg ggagaagaaa acaggcaaaa tgattaagaa 40020 aagtgaaaaa ggaaaagtgg taagatggga attttcttgt ccagatttta gtctcccaaa 40080 ccacagctca gatggtagaa tgtggtcaga actgatggac agaacaatag aacaaaacgg 40140 aagccctatc tctcagaaac gtgtgttaat gtggtatgtg gcacagctga tggaaaagag 40200 agtgtgtgtg taattttttt ttctgagaaa actgactgga agcaaataag ttgtgtcttt 40260 acagcatata ccagagcaga ttctaggtag aagaggagac acatgcaaac aacaccagca 40320 acagaaataa aacaaaagac tcaaagggaa gggaggtgaa cgttccctgg tttggtgttg 40380 gggaaggaca cacagggagg cggatgaaac cagtgaggca acgggcattg ctttcactgc 40440 agagaaactc agcttgcctg agccacagtg aaaatggcca ttccctggag cgtttgtgca 40500 cgtgatttat ttaaggcgcc ctgtgaggtc ctgcacattc atcctctcac tttgttctcc 40560 taaccacctg agaggtagag gaggaaaggc tccaggggag cagccgccct tggtcaccca 40620 gctggcaaag ggcatgcatg attgcagcct ggcctcctgc tccggggccc ttgctctgcc 40680 cgaggacccc acacaagtca gacccatagg ctcagggtga gccggagccc aaggtcgtgt 40740 tggggatggc tgtgaaagaa gaaatggacg tctgatgcac acttgggaag gtcctaccag 40800 cagcgtcaaa gaaatgcatg tgaaactgac agcgagaccc atccctcaaa gaaacgcacg 40860 tgaaactgat ggcgagacct gtccccatcc ctcatgctgg ctccttttct gggcttgcca 40920 agagccagca tcaggttgag gcaagctgga aagacttttc tggaaagcag cttgtttgca 40980 tggaagtcct cacaatgtcc tgtgtcttcc cagtaattcc acttctgaag tgaccagaca 41040 ttatcacggg tcttatttac catttccagt gttccaggca gggggacttg ccacagcaag 41100 tcacgaacct gcccaaatac agggctaagg agatattatg catcacaaaa cttgctctgc 41160 cattaaacat ttttcaaaga atttttgaag aatgtttaat ggcacaaaac gtttatttca 41220 atgtagcagt gttcaaagct ggatgtaaaa gaacacaccc caggagcctg ccgtgaatgt 41280 catgtgtgtt catctttgga catggacata catgggcagt gagtggtggt gaggccctgg 41340 aggacatcgg tgggatgcct ccatcctgcc cctctggaga caccatgtgt gccacgtgca 41400 ctcactggag ccctgtttag ctggtgccac ctggctcttc catccctgag attcaaacac 41460 agtgagattc cccacgccca actcagtgtt ctcccacaaa aaacctgagt cacacctgtg 41520 ttcactcgag ggacgcccgg gagccagggc tccacagttt attatgtgtt tttggctgag 41580 ttatgtgcag atctcatcag ggcagatgat gagtgcacaa acacggccgt gcgaggtttg 41640 gatacactca acatcactag ccaggtcctg gtggagtttg gtcatgcaga gtctggatgg 41700 catgtagcat ttggagtcca tggagtgagc acccagcccc ctcgggctgc agcgcatgcc 41760 ccaggcagga caaggaagcg ggaggaaggc aggaggctct ttggagcaag ctttgcagga 41820 gggggctggg tgtggggcag gcacctgtgt ctgacattcc cccctgtgtc tcagctatgc 41880 ccggacctcc atcagagcca gtctcacctt caaccgcggc ttcaaggctg ggaggaacat 41940 gcgtcgcaaa ctctttgggg tcttgcggct gaagtgtcac agcctgtttc tggatttgca 42000 ggtgagcagg ctgatggtca gcacagagtt cagagttcag gaggtgtgtg cgcaagtatg 42060 tgtgtgtgtg tgtgcgcgcg tgcctgcaag gctgatggtg actggctgca cgtaagagtg 42120 cacatgtacg catatacacg tgagcacata catgtgtgca tgtgtgtaca tgaaggcatg 42180 gcagtgtgtg cacaggtgtg caagggcaca agtgtgtgca catgcgaatg cacacctgac 42240 atgcatgtgt gttcgtgcac agtcgtgtgg gcattcacgt gaggtgcatg cgtgtgggtg 42300 tgcagtgtga gtagcatgtg tgcacataac atgtattgag gggtcctcgt gttcaccccg 42360 ctaggtcctc agcaccagtg ccactcctta caggatgaga cggggtccca ggccttggtg 42420 ggctgaggct ctgaagctgc agccctgagg gcattgtccc atctgggcat ccgcgtccac 42480 tccctctcct gtgggcttct gtgtccactc cccctctcct gtgggcattt acatccactc 42540 cactccctct ctcctgtggg catccgcgtc cactccccct ctctgtgggc atctgcgtcc 42600 acctcccctc tctgtgggca tttgcgtcca ctccctctcc tggttccttc ctgtcttggc 42660 cgagcctcgg gggcaggcag atgacacaga gtcttgactc gcccagggtg gttcgcagct 42720 gccgggtgag ggccaggccg gatttcactg ggaagaggga tagtttcttg tcaaaatgtt 42780 cctctttctt gttccatctg aatggatgat aaagcaaaaa gtaaaaactt aaaatcccag 42840 agaggtttct accgtttctc actctttctt ggcgactcta ggtgaacagc ctccagacgg 42900 tgtgcaccaa catctacaag atcctcctgc tgcaggcgta caggtgagcc gccaccaagg 42960 ggtgcaggcc cagcctccag ggaccctccg cgctctgctc acctctgacc cggggcttca 43020 ccttggaact cctgggtttt aggggcaagg aatgtcttac gttttcagtg gtgctgctgc 43080 ctgtgcacag ttctgttcgc gtggctctgt gcaaagcacc tgttctccat ctctgggtag 43140 tggtaggagc cggtgtggcc ccaggtgtcc ccactgtgcc tgtgcactgg ccgtgggacg 43200 tcatggaggc catcccaggg cagcaggggc atggggtaaa gagatgttta tggggagtct 43260 tagcagagga ggctgggaag gtgtctgaac agtagatggg agatcagatg cccggaggat 43320 ttggggtctc agcaaagagg gccgaggtgg gtgcaggtga gggtcgctgg ccccaccccc 43380 gggaaggtgc agcagagctg tggctcccca cacagcccgg ccagcacctg tgctctgggc 43440 atggctgtgc tcctggaacg ttccctgtcc tggctggtca gggggtgccc ctgccaagaa 43500 tcgacaactt tatcacagag ggaagggcca atctgtggag gccacagggc cagcttctgc 43560 ctggagtcag ggcaggtggt ggcacaagcc tcggggctgt accaaagggc agtcgggcac 43620 cacaggcccg ggcctccacc tcaacaggcc tcccgagcca ctgggagctg aatgccagga 43680 ggccgaagcc ctcgccccat gagggctgag aaggagtgtg agcatttgtg ttacccaggg 43740 ccgaggctgc gcgaattacc gtgcacactt gatgtgaaat gaggtcgtcg tctatcgtgg 43800 aaacccagca agggctcacg ggagagtttt ccattacaag gtcgtaccat gaaaatggtt 43860 tttaacccga gtgcttgcgc cttcatgctc tggcagggag ggcagagcca cagctgcatg 43920 ttaccgcctt tgcaccagct ccagaggctt gggaccaggc tgtctcagtt ccagggtgcg 43980 tccggctcag accgccctcc tctctgcctt ctctctctgc ctcaaatctt ccctcgtttg 44040 catctccctg acgcgtgcct gggccctcgt gcaagctgct tgactccttt ccggaaaccc 44100 ttggggtgtg ctggatacag gtgccactga ggactggagg tgtctgacac tgtggttgac 44160 cccagggtcc agctggcgtg cttggggcct ccttgggcca tgatgaggtc agaggagttt 44220 tcccaggtga aaactcctgg gaaactccca gggccatgtg acctgccacc tgctcctccc 44280 atattcagct cagtcttgtc ctcatttccc caccagggtc tctagctccg aggagctccc 44340 gtagagggcc tgggctcagg gcagggcggc tgagtttccc cacccatgtg gggacccttg 44400 ggtagtcgct tgattgggta gccctgagga ggccgagatg cgatgggcca cgggccgttt 44460 ccaaacacag agtcaggcac gtggaaggcc caggaatccc cttccctcga ggcaggagtg 44520 ggagaacgga gagctgggcc ccgatttcac ggcagccagg ctgcagtggg cgaggctgtg 44580 gtggtccacg tggcgctggg ggcggggtct gattcaaatc cgctggggct cggccttcct 44640 ggcccgtgct ggccgcgcct ccacacgggc ttggggtgga cgccccgacc tctagcaggt 44700 ggctatttct ccctttggaa gagagcccct cacccatgct aggtgtttcc ctcctgggtc 44760 aggagcgtgg ccgtgtggca accccgggac cttaggctta tttatttgtt taaaaacatt 44820 ctgggcctgg cttccgttgt tgctaaatgg ggaaaagaca tcccacctca gcagagttac 44880 tgagaggctg aaaccggggt gctggcttga ctggtgtgat ctcaggtcat tccagaagtg 44940 gctcaggaag tcagtgagac caggtacatg gggggctcag gcagtgggtg agatgaggta 45000 cacggggggc tcaggcagtg ggtgaggcca ggtacatggg gggctcaggc actgggtgag 45060 atgaggtaca cggggggctc aggcagaggg tcagaccagg tacacggggg ctctgatcac 45120 acgcacatat gagcacatgt gcacatgtgc tgtttcatgg tagccaggtc tgtgcacacc 45180 tgccccaaag tcccaggaag ctgagaggcc aaagatggag gctgacaggg ctggcgcggt 45240 ggctcacacc tgtagtccca gcactttggg aggccgaggc gagaggatcc cttgagccca 45300 ggagtttaag accagcctga gcaacatagt agaaccccat ctctatgaaa aataaaaaca 45360 aaaattagct gaacatggtg gtgtgcgcct gtagttccaa tacttgggag gctgaagtgg 45420 gaggatcact tgagcccagg aggtggaagc tgcagtgagc tgagattgca ccactgtact 45480 gcagcctggg tgacagagtg agagcccatc tcaacaacaa caaagaagac tgacaaatgc 45540 agtttcttgg aaagaaacat ttagtaggaa cttaacctac acacagaagc caagtcggtg 45600 tctcggtgtc agtgagatga gatgatgggt cctcacacca tcaccccaga cccagggttt 45660 atgcaccaca ggggcgggtg gctcagaagg gatgcgcagg acgttgatat acgatgacat 45720 caaggttgtc tgacgaaggg caggattcat gataagtacc tgctggtaca caaggaacaa 45780 tggataaact ggaaacctta gaggccttcc cggaacaggg gctaatcaga agccagcatg 45840 gggggctggc atccaggatg gagctgcttc agcctccaca tgcgtgttca tacagatggt 45900 gcacagaaac gcagtgtacc tgtgcacaca cagacacgca gctactcgca cacacaagca 45960 cacacacaga catgcatgca tgcatccgtg tgtgtgcacc tgtgcccatg aggaaaccca 46020 tgcatgtgca ttcatgcacg cacacaggca ccggtgggcc catgcccaca cccacgagca 46080 ccgtctgatt aggaggcctt tcctctgacg ctgtccgcca tcctctcagg tttcacgcat 46140 gtgtgctgca gctcccattt catcagcaag tttggaagaa ccccacattt ttcctgcgcg 46200 tcatctctga cacggcctcc ctctgctact ccatcctgaa agccaagaac gcaggtatgt 46260 gcaggtgcct ggcctcagtg gcagcagtgc ctgcctgctg gtgttagtgt gtcaggagac 46320 tgagtgaatc tgggcttagg aagttcttac cccttttcgc atcaggaagt ggtttaaccc 46380 aaccactgtc aggctcgtct gcccgccctc tcgtggggtg agcagagcac ctgatggaag 46440 ggacaggagc tgtctgggag ctgccatcct tcccaccttg ctctgcctgg ggaagcgctg 46500 gggggcctgg tctctcctgt ttgccccatg gtgggatttg gggggcctgg cctctcctgt 46560 ttgccctgtg gtgggattgg gctgtctccc gtccatggca cttagggccc ttgtgcaaac 46620 ccaggccaag ggcttaggag gaggccaggc ccaggctacc ccacccctct caggagcaga 46680 ggccgcgtat caccacgaca gagccccgcg ccgtcctctg cttcccagtc accgtcctct 46740 gcccctggac actttgtcca gcatcaggga ggtttctgat ccgtctgaaa ttcaagccat 46800 gtcgaacctg cggtcctgag cttaacagct tctactttct gttctttctg tgttgtggaa 46860 atttcacctg gagaagccga agaaaacatt tctgtcgtga ctcctgcggt gcttgggtcg 46920 ggacagccag agatggagcc accccgcaga ccgtcgggtg tgggcagctt tccggtgtct 46980 cctgggaggg gagctgggct gggcctgtga ctcctcagcc tctgttttcc cccagggatg 47040 tcgctggggg ccaagggcgc cgccggccct ctgccctccg aggccgtgca gtggctgtgc 47100 caccaagcat tcctgctcaa gctgactcga caccgtgtca cctacgtgcc actcctgggg 47160 tcactcagga caggcaagtg tgggtggagg ccagtgcggg ccccacctgc ccaggggtca 47220 tccttgaacg ccctgtgtgg ggcgagcagc ctcagatgct gctgaagtgc agacgccccc 47280 gggcctgacc ctgggggcct ggagccacgc tggcagccct atgtgattaa acgctggtgt 47340 ccccaggcca cggagcctgg cagggtcccc aacttcttga acccctgctt cccatctcag 47400 gggcgatggc tccccacgct tgggagcctt ctgacccctg acctgtgtcc tctcacagcc 47460 tcttccctgg ctgctgccct gagctcctgg ggtcctgagc aagttctctc cccgccccgc 47520 cgctccagcg tcactgggct gcctgtctgc tcgccccggt ggaggggtgt ctgtcccttc 47580 actgaggttc ccaccagcca gggccacgag gtgcaggccc tgcctgcccg gccacccaca 47640 cgtcctagga gggttggagg atgccacctc tggcctcttc tggaacggag tctgattttg 47700 gccccgcagc ccagacgcag ctgagtcgga agctcccggg gacgacgctg actgccctgg 47760 aggccgcagc caacccggca ctgccctcag acttcaagac catcctggac tgatggccac 47820 ccgcccacag ccaggccgag agcagacacc agcagccctg tcacgccggg ctctacgtcc 47880 cagggaggga ggggcggccc acacccaggc ccgcaccgct gggagtctga ggcctgagtg 47940 agtgtttggc cgaggcctgc atgtccggct gaaggctgag tgtccggctg aggcctgagc 48000 gagtgtccag ccaagggctg agtgtccagc acacctgccg tcttcacttc cccacaggct 48060 ggcgctcggc tccaccccag ggccagcttt tcctcaccag gagcccggct tccactcccc 48120 acataggaat agtccatccc cagattcgcc attgttcacc cctcgccctg ccctcctttg 48180 ccttccaccc ccaccatcca ggtggagacc ctgagaagga ccctgggagc tctgggaatt 48240 tggagtgacc aaaggtgtgc cctgtacaca ggcgaggacc ctgcacctgg atgggggtcc 48300 ctgtgggtca aattgggggg aggtgctgtg ggagtaaaat actgaatata tgagtttttc 48360 agttttgaaa aaaatctcat gtttgaatcc taatgtgcac tgcatagaca ccactgtatg 48420 caattacaga agcctgtgag tgaacggggt ggtggtcagt gcgggcccat ggcctggctg 48480 tgcatttacg gaagtctatg agtgaatggg gttgtggtca gtgcgggccc atggcctggc 48540 tgggcctggg aggtttctga tgctgtgagg caggagggga aggagggtag gggatagaca 48600 gtgggagccc ccaccctgga agacataaca gtaagtccag gcccgaaggg cagcagggat 48660 gctgggggcc cagcttgggc ggcggggatg atggagggcc tggccagggt ggcagggatg 48720 atgggggccc cagctggggt ggcaggggtg atgggggggg ctggtctggg tggcggggaa 48780 gatggggaag cctggctggg ccccctcctc ccctgcctcc cacctgcagc cgtggatccg 48840 gatgtgcttc cctggtgcac atcctctggg ccatcagctt tcatggaggt ggggggcagg 48900 ggcatgacac catcctgtat aaaatccagg attcctcctc ctgaacgccc caactcaggt 48960 tgaaagtcac attccgcctc tggccattct cttaagagta gaccaggatt ctgatctctg 49020 aagggtgggt agggtggggc agtggagggt gtggacacag gaggcttcag ggtggggctg 49080 gtgatgctct ctcatcctct tatcatctcc cagtctcatc tctcatcctc ttatcatctc 49140 ccagtctcat ctgtcttcct cttatctccc agtctcatct gtcatcctct taccatctcc 49200 cagtctcatc tcttatcctc ttatctccta gtctcatcca gacttacctc ccagggcggg 49260 tgccaggctc gcagtggagc tggacatacg tccttcctca ggcagaagga actggaagga 49320 ttgcagagaa caggaggggc ggctcagagg gacgcagtct tggggtgaag aaacagcccc 49380 tcctcagaag ttggcttggg ccacacgaaa ccgagggccc tgcgtgagtg gctccagagc 49440 cttccagcag gtccctggtg gggccttatg gtatggccgg gtcctactga gtgcaccttg 49500 gacagggctt ctggtttgag tgcagcccgg acgtgcctgg tgtcggggtg ggggcttatg 49560 gccactggat atggcgtcat ttattgctgc tgcttcagag aatgtctgag tgaccgagcc 49620 taatgtgtat ggtgggccca agtccacaga ctgtgtcgta aatgcactct ggtgcctgga 49680 gcccccgtat aggagctgtg aggaaggagg ggctcttggc agccggcctg ggggcgcctt 49740 tgccctgcaa actggaaggg agcggccccg ggcgccgtgg gcggacgacc tcaagtgaga 49800 ggttggacag aacagggcgg ggacttccca ggagcagagg ccgctgctca ggcacacctg 49860 ggtttgaatc acagaccaac aggtcaggcc attgttcagc tatccatctt ctacaaagct 49920 ccagattcct gtttctccgg gtgttttttg ttgaaatttt actcaggatt acttatattt 49980 tttgctaaag tattagaccc ttaaaaaagg tatttgcttt gatatggctt aactcactaa 50040 gcacctactt tatttgtctg tttttattta ttattattat tattattaga gatggtgtct 50100 actctgtcac ccaggttgtt agtgcagtgg cacagtcatg gctcgctgta gccgcaaacc 50160 cccaggctca agtgatcctc cggcctcagc ttcccagagt gctgggatta caggtgtgag 50220 ccactgccct tgcctggcac ttttaaaaac cactatgtaa ggtcaggtcc agtggcttcc 50280 acacctgtca tcccagtagt ttgggaagcc gaggcagaag gattgtctga ggccaggagt 50340 ttgagaccag catgggtaac atagggagac cccatctcta caaaaaatgc aaaaagttat 50400 ccgggcgtgg ggtccagcat ctgtagtccc agctgctcgg gaggctgagt gggaggatcg 50460 cttgagcccg ggaggtcatg gctgcagtga gctgtgattg taccatcgca ctccagcctg 50520 ggcaacagag tgagaccctg tctcaaaaaa aaaaaaaaaa aaagaaggag aaggagaaga 50580 gaagaagaag gaagaaggaa agagaagaag aaggaagaag gaagaaagaa ggagaaggag 50640 gcctgctagg tgctaggtag actgtcaaat ctcagagcaa aatgaaaata acaaagtttt 50700 aaagggaaag aaaaacccca gctctttgga cttccttagg cctgaacttc atctcaagca 50760 gcttccttcc acagacaagc gtgtatggag cgagtgagtt caaagcagaa agggaggaga 50820 agcaggcaag ggtggaggct gtgggtgaca ccagccagga cccctgaaag ggagtggttg 50880 ttttcctgcc tcagccccac gctcctgccg gtcctgcacc tgctgtaacc gtcgatgttg 50940 gtgccaggtg cccacctggg aaggatgctg tgcagggggc ttgccaaact ttggtgggtt 51000 tcagaagccc caggcacttg tggcaggcac aattacagcc cctccccaaa gatgcccacg 51060 tccttctcct ggaacctgtg aatgtgtcac ccgcaaggca gaggctggtg aaggctgcag 51120 gtggaatcac ggctgccagt cagccgatct taaggtcatc ctggattatc tggtgggcct 51180 gatatggcca caagggtccc tagaagtgag agagggaggc aggggagagt cagagagggg 51240 acgtgagaag gaccactggc cactgctggc tttgagatgg aggagggggt ccccagccaa 51300 ggaatggggg cagccgctcc atgctggaaa agcaagcaat cctccccggt cctgagggca 51360 cacggccctg cccacgcctc gatttcaggc cagtgggacc tgtttcagct ttccggcctc 51420 cagagctgta agatgatgcg tttgtgttca gccactaagc tgcagtgatt cgtcacagca 51480 gcaaatggaa tagcagtaca gggaaatgaa tacagggaca gttctcagag tgactctcag 51540 cccacccctg gg 51552 <210> 4 <211> 1132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser 1 5 10 15 His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly 20 25 30 Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg 35 40 45 Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60 Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 70 75 80 Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val 85 90 95 Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro 100 105 110 Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr 115 120 125 Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val 130 135 140 Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160 Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr 165 170 175 Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly 180 185 190 Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg 195 200 205 Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg 210 215 220 Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240 Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp 245 250 255 Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val 260 265 270 Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala 275 280 285 Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His 290 295 300 Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320 Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly 325 330 335 Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro 340 345 350 Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser 355 360 365 Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln 370 375 380 Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His 385 390 395 400 Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg 405 410 415 Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln 420 425 430 Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu 435 440 445 Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe 450 455 460 Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 480 Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser 485 490 495 Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met 500 505 510 Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys 515 520 525 Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe 530 535 540 Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560 Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr 565 570 575 Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His 580 585 590 Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln 595 600 605 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 610 615 620 Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val 625 630 635 640 Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser 645 650 655 Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg 660 665 670 Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg 675 680 685 Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro 690 695 700 Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile 705 710 715 720 Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln 725 730 735 Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His 740 745 750 Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp 755 760 765 Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser 770 775 780 Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu 785 790 795 800 Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His 805 810 815 Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro 820 825 830 Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp 835 840 845 Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu 850 855 860 Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala 865 870 875 880 Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys 885 890 895 Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu 900 905 910 Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe 915 920 925 Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser 930 935 940 Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe 945 950 955 960 Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 965 970 975 Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn 980 985 990 Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln 995 1000 1005 Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln 1010 1015 1020 Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp 1025 1030 1035 Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly 1040 1045 1050 Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu 1055 1060 1065 Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr 1070 1075 1080 Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr 1085 1090 1095 Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr 1100 1105 1110 Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys 1115 1120 1125 Thr Ile Leu Asp 1130 <210> 5 <211> 6492 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tttctgtgaa gcagaagtct gggaatcgat ctggaaatcc tcctaatttt tactccctct 60 ccccgcgact cctgattcat tgggaagttt caaatcagct ataactggag agtgctgaag 120 attgatggga tcgttgcctt atgcatttgt tttggtttta caaaaaggaa acttgacaga 180 ggatcatgct gtacttaaaa aatacaacat cacagaggaa gtagactgat attaacaata 240 cttactaata ataacgtgcc tcatgaaata aagatccgaa aggaattgga ataaaaattt 300 cctgcatctc atgccaaggg ggaaacacca gaatcaagtg ttccgcgtga ttgaagacac 360 cccctcgtcc aagaatgcaa agcacatcca ataaaatagc tggattataa ctcctcttct 420 ttctctgggg gccgtggggt gggagctggg gcgagaggtg ccgttggccc ccgttgcttt 480 tcctctggga aggatggcgc acgctgggag aacagggtac gataaccggg agatagtgat 540 gaagtacatc cattataagc tgtcgcagag gggctacgag tgggatgcgg gagatgtggg 600 cgccgcgccc ccgggggccg cccccgcacc gggcatcttc tcctcccagc ccgggcacac 660 gccccatcca gccgcatccc gggacccggt cgccaggacc tcgccgctgc agaccccggc 720 tgcccccggc gccgccgcgg ggcctgcgct cagcccggtg ccacctgtgg tccacctgac 780 cctccgccag gccggcgacg acttctcccg ccgctaccgc cgcgacttcg ccgagatgtc 840 cagccagctg cacctgacgc ccttcaccgc gcggggacgc tttgccacgg tggtggagga 900 gctcttcagg gacggggtga actgggggag gattgtggcc ttctttgagt tcggtggggt 960 catgtgtgtg gagagcgtca accgggagat gtcgcccctg gtggacaaca tcgccctgtg 1020 gatgactgag tacctgaacc ggcacctgca cacctggatc caggataacg gaggctggga 1080 tgcctttgtg gaactgtacg gccccagcat gcggcctctg tttgatttct cctggctgtc 1140 tctgaagact ctgctcagtt tggccctggt gggagcttgc atcaccctgg gtgcctatct 1200 gggccacaag tgaagtcaac atgcctgccc caaacaaata tgcaaaaggt tcactaaagc 1260 agtagaaata atatgcattg tcagtgatgt accatgaaac aaagctgcag gctgtttaag 1320 aaaaaataac acacatataa acatcacaca cacagacaga cacacacaca cacaacaatt 1380 aacagtcttc aggcaaaacg tcgaatcagc tatttactgc caaagggaaa tatcatttat 1440 tttttacatt attaagaaaa aaagatttat ttatttaaga cagtcccatc aaaactcctg 1500 tctttggaaa tccgaccact aattgccaag caccgcttcg tgtggctcca cctggatgtt 1560 ctgtgcctgt aaacatagat tcgctttcca tgttgttggc cggatcacca tctgaagagc 1620 agacggatgg aaaaaggacc tgatcattgg ggaagctggc tttctggctg ctggaggctg 1680 gggagaaggt gttcattcac ttgcatttct ttgccctggg ggctgtgata ttaacagagg 1740 gagggttcct gtggggggaa gtccatgcct ccctggcctg aagaagagac tctttgcata 1800 tgactcacat gatgcatacc tggtgggagg aaaagagttg ggaacttcag atggacctag 1860 tacccactga gatttccacg ccgaaggaca gcgatgggaa aaatgccctt aaatcatagg 1920 aaagtatttt tttaagctac caattgtgcc gagaaaagca ttttagcaat ttatacaata 1980 tcatccagta ccttaagccc tgattgtgta tattcatata ttttggatac gcacccccca 2040 actcccaata ctggctctgt ctgagtaaga aacagaatcc tctggaactt gaggaagtga 2100 acatttcggt gacttccgca tcaggaaggc tagagttacc cagagcatca ggccgccaca 2160 agtgcctgct tttaggagac cgaagtccgc agaacctgcc tgtgtcccag cttggaggcc 2220 tggtcctgga actgagccgg ggccctcact ggcctcctcc agggatgatc aacagggcag 2280 tgtggtctcc gaatgtctgg aagctgatgg agctcagaat tccactgtca agaaagagca 2340 gtagaggggt gtggctgggc ctgtcaccct ggggccctcc aggtaggccc gttttcacgt 2400 ggagcatggg agccacgacc cttcttaaga catgtatcac tgtagaggga aggaacagag 2460 gccctgggcc cttcctatca gaaggacatg gtgaaggctg ggaacgtgag gagaggcaat 2520 ggccacggcc cattttggct gtagcacatg gcacgttggc tgtgtggcct tggcccacct 2580 gtgagtttaa agcaaggctt taaatgactt tggagagggt cacaaatcct aaaagaagca 2640 ttgaagtgag gtgtcatgga ttaattgacc cctgtctatg gaattacatg taaaacatta 2700 tcttgtcact gtagtttggt tttatttgaa aacctgacaa aaaaaaagtt ccaggtgtgg 2760 aatatggggg ttatctgtac atcctggggc attaaaaaaa aaatcaatgg tggggaacta 2820 taaagaagta acaaaagaag tgacatcttc agcaaataaa ctaggaaatt tttttttctt 2880 ccagtttaga atcagccttg aaacattgat ggaataactc tgtggcatta ttgcattata 2940 taccatttat ctgtattaac tttggaatgt actctgttca atgtttaatg ctgtggttga 3000 tatttcgaaa gctgctttaa aaaaatacat gcatctcagc gtttttttgt ttttaattgt 3060 atttagttat ggcctataca ctatttgtga gcaaaggtga tcgttttctg tttgagattt 3120 ttatctcttg attcttcaaa agcattctga gaaggtgaga taagccctga gtctcagcta 3180 cctaagaaaa acctggatgt cactggccac tgaggagctt tgtttcaacc aagtcatgtg 3240 catttccacg tcaacagaat tgtttattgt gacagttata tctgttgtcc ctttgacctt 3300 gtttcttgaa ggtttcctcg tccctgggca attccgcatt taattcatgg tattcaggat 3360 tacatgcatg tttggttaaa cccatgagat tcattcagtt aaaaatccag atggcaaatg 3420 accagcagat tcaaatctat ggtggtttga cctttagaga gttgctttac gtggcctgtt 3480 tcaacacaga cccacccaga gccctcctgc cctccttccg cgggggcttt ctcatggctg 3540 tccttcaggg tcttcctgaa atgcagtggt gcttacgctc caccaagaaa gcaggaaacc 3600 tgtggtatga agccagacct ccccggcggg cctcagggaa cagaatgatc agacctttga 3660 atgattctaa tttttaagca aaatattatt ttatgaaagg tttacattgt caaagtgatg 3720 aatatggaat atccaatcct gtgctgctat cctgccaaaa tcattttaat ggagtcagtt 3780 tgcagtatgc tccacgtggt aagatcctcc aagctgcttt agaagtaaca atgaagaacg 3840 tggacgtttt taatataaag cctgttttgt cttttgttgt tgttcaaacg ggattcacag 3900 agtatttgaa aaatgtatat atattaagag gtcacggggg ctaattgctg gctggctgcc 3960 ttttgctgtg gggttttgtt acctggtttt aataacagta aatgtgccca gcctcttggc 4020 cccagaactg tacagtattg tggctgcact tgctctaaga gtagttgatg ttgcattttc 4080 cttattgtta aaaacatgtt agaagcaatg aatgtatata aaagcctcaa ctagtcattt 4140 ttttctcctc ttcttttttt tcattatatc taattatttt gcagttgggc aacagagaac 4200 catccctatt ttgtattgaa gagggattca catctgcatc ttaactgctc tttatgaatg 4260 aaaaaacagt cctctgtatg tactcctctt tacactggcc agggtcagag ttaaatagag 4320 tatatgcact ttccaaattg gggacaaggg ctctaaaaaa agccccaaaa ggagaagaac 4380 atctgagaac ctcctcggcc ctcccagtcc ctcgctgcac aaatactccg caagagaggc 4440 cagaatgaca gctgacaggg tctatggcca tcgggtcgtc tccgaagatt tggcaggggc 4500 agaaaactct ggcaggctta agatttggaa taaagtcaca gaattaagga agcacctcaa 4560 tttagttcaa acaagacgcc aacattctct ccacagctca cttacctctc tgtgttcaga 4620 tgtggccttc catttatatg tgatctttgt tttattagta aatgcttatc atctaaagat 4680 gtagctctgg cccagtggga aaaattagga agtgattata aatcgagagg agttataata 4740 atcaagatta aatgtaaata atcagggcaa tcccaacaca tgtctagctt tcacctccag 4800 gatctattga gtgaacagaa ttgcaaatag tctctatttg taattgaact tatcctaaaa 4860 caaatagttt ataaatgtga acttaaactc taattaattc caactgtact tttaaggcag 4920 tggctgtttt tagactttct tatcacttat agttagtaat gtacacctac tctatcagag 4980 aaaaacagga aaggctcgaa atacaagcca ttctaaggaa attagggagt cagttgaaat 5040 tctattctga tcttattctg tggtgtcttt tgcagcccag acaaatgtgg ttacacactt 5100 tttaagaaat acaattctac attgtcaagc ttatgaaggt tccaatcaga tctttattgt 5160 tattcaattt ggatctttca gggatttttt ttttaaatta ttatgggaca aaggacattt 5220 gttggagggg tgggagggag gaagaatttt taaatgtaaa acattcccaa gtttggatca 5280 gggagttgga agttttcaga ataaccagaa ctaagggtat gaaggacctg tattggggtc 5340 gatgtgatgc ctctgcgaag aaccttgtgt gacaaatgag aaacattttg aagtttgtgg 5400 tacgaccttt agattccaga gacatcagca tggctcaaag tgcagctccg tttggcagtg 5460 caatggtata aatttcaagc tggatatgtc taatgggtat ttaaacaata aatgtgcagt 5520 tttaactaac aggatattta atgacaacct tctggttggt agggacatct gtttctaaat 5580 gtttattatg tacaatacag aaaaaaattt tataaaatta agcaatgtga aactgaattg 5640 gagagtgata atacaagtcc tttagtctta cccagtgaat cattctgttc catgtctttg 5700 gacaaccatg accttggaca atcatgaaat atgcatctca ctggatgcaa agaaaatcag 5760 atggagcatg aatggtactg taccggttca tctggactgc cccagaaaaa taacttcaag 5820 caaacatcct atcaacaaca aggttgttct gcataccaag ctgagcacag aagatgggaa 5880 cactggtgga ggatggaaag gctcgctcaa tcaagaaaat tctgagacta ttaataaata 5940 agactgtagt gtagatactg agtaaatcca tgcacctaaa ccttttggaa aatctgccgt 6000 gggccctcca gatagctcat ttcattaagt ttttccctcc aaggtagaat ttgcaagagt 6060 gacagtggat tgcatttctt ttggggaagc tttcttttgg tggttttgtt tattatacct 6120 tcttaagttt tcaaccaagg tttgcttttg ttttgagtta ctggggttat ttttgtttta 6180 aataaaaata agtgtacaat aagtgttttt gtattgaaag cttttgttat caagattttc 6240 atacttttac cttccatggc tctttttaag attgatactt ttaagaggtg gctgatattc 6300 tgcaacactg tacacataaa aaatacggta aggatacttt acatggttaa ggtaaagtaa 6360 gtctccagtt ggccaccatt agctataatg gcactttgtt tgtgttgttg gaaaaagtca 6420 cattgccatt aaactttcct tgtctgtcta gttaatattg tgaagaaaaa taaagtacag 6480 tgtgagatac tg 6492 <210> 6 <211> 239 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met 1 5 10 15 Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala 20 25 30 Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile 35 40 45 Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp 50 55 60 Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr 85 90 95 Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe 100 105 110 Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly 115 120 125 Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp 130 135 140 Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu 145 150 155 160 Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp 165 170 175 Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn 180 185 190 Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro Ser Met Arg Pro 195 200 205 Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala 210 215 220 Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Ala Tyr Leu Gly His Lys 225 230 235 <210> 7 <211> 1207 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tttctgtgaa gcagaagtct gggaatcgat ctggaaatcc tcctaatttt tactccctct 60 ccccgcgact cctgattcat tgggaagttt caaatcagct ataactggag agtgctgaag 120 attgatggga tcgttgcctt atgcatttgt tttggtttta caaaaaggaa acttgacaga 180 ggatcatgct gtacttaaaa aatacaacat cacagaggaa gtagactgat attaacaata 240 cttactaata ataacgtgcc tcatgaaata aagatccgaa aggaattgga ataaaaattt 300 cctgcatctc atgccaaggg ggaaacacca gaatcaagtg ttccgcgtga ttgaagacac 360 cccctcgtcc aagaatgcaa agcacatcca ataaaatagc tggattataa ctcctcttct 420 ttctctgggg gccgtggggt gggagctggg gcgagaggtg ccgttggccc ccgttgcttt 480 tcctctggga aggatggcgc acgctgggag aacagggtac gataaccggg agatagtgat 540 gaagtacatc cattataagc tgtcgcagag gggctacgag tgggatgcgg gagatgtggg 600 cgccgcgccc ccgggggccg cccccgcacc gggcatcttc tcctcccagc ccgggcacac 660 gccccatcca gccgcatccc gggacccggt cgccaggacc tcgccgctgc agaccccggc 720 tgcccccggc gccgccgcgg ggcctgcgct cagcccggtg ccacctgtgg tccacctgac 780 cctccgccag gccggcgacg acttctcccg ccgctaccgc cgcgacttcg ccgagatgtc 840 cagccagctg cacctgacgc ccttcaccgc gcggggacgc tttgccacgg tggtggagga 900 gctcttcagg gacggggtga actgggggag gattgtggcc ttctttgagt tcggtggggt 960 catgtgtgtg gagagcgtca accgggagat gtcgcccctg gtggacaaca tcgccctgtg 1020 gatgactgag tacctgaacc ggcacctgca cacctggatc caggataacg gaggctgggt 1080 aggtgcactt ggtgatgtga gtctgggctg aggccacagg tccgagatgc gggggttgga 1140 gtgcgggtgg gctcctgggg caatgggagg ctgtggagcc ggcgaaataa aatcagagtt 1200 gttgcta 1207 <210> 8 <211> 205 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ala His Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met 1 5 10 15 Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala 20 25 30 Gly Asp Val Gly Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ile 35 40 45 Phe Ser Ser Gln Pro Gly His Thr Pro His Pro Ala Ala Ser Arg Asp 50 55 60 Pro Val Ala Arg Thr Ser Pro Leu Gln Thr Pro Ala Ala Pro Gly Ala 65 70 75 80 Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr 85 90 95 Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe 100 105 110 Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly 115 120 125 Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp 130 135 140 Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val Met Cys Val Glu 145 150 155 160 Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn Ile Ala Leu Trp 165 170 175 Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile Gln Asp Asn 180 185 190 Gly Gly Trp Val Gly Ala Leu Gly Asp Val Ser Leu Gly 195 200 205 <210> 9 <211> 2594 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus 1 <400> 9 atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60 gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca 120 aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcatcag 180 aacagtcaga ctcatcaagc ttctctatca aagcagtaag tagtacatgt aatgcaacct 240 ataccaatag tagcaatagt agcattagta gtagcaataa taatagcaat agttgtgtgg 300 tccatagtaa tcatagaata taggaaaata ttaagacaaa gaaaaataga caggttaatt 360 gatagactaa tagaaagagc agaagacagt ggcaatgaga gtgaaggaga aatatcagca 420 cttgtggaga tgggggtgga gatggggcac catgctcctt gggatgttga tgatctgtag 480 tgctacagaa aaattgtggg tcacagtcta ttatggggta cctgtgtgga aggaagcaac 540 caccactcta ttttgtgcat cagatgctaa agcatatgat acagaggtac ataatgtttg 600 ggccacacat gcctgtgtac ccacagaccc caacccacaa gaagtagtat tggtaaatgt 660 gacagaaaat tttaacatgt ggaaaaatga catggtagaa cagatgcatg aggatataat 720 cagtttatgg gatcaaagcc taaagccatg tgtaaaatta accccactct gtgttagttt 780 aaagtgcact gatttgaaga atgatactaa taccaatagt agtagcggga gaatgataat 840 ggagaaagga gagataaaaa actgctcttt caatatcagc acaagcataa gaggtaaggt 900 gcagaaagaa tatgcatttt tttataaact tgatataata ccaatagata atgatactac 960 cagctataag ttgacaagtt gtaacacctc agtcattaca caggcctgtc caaaggtatc 1020 ctttgagcca attcccatac attattgtgc cccggctggt tttgcgattc taaaatgtaa 1080 taataagacg ttcaatggaa caggaccatg tacaaatgtc agcacagtac aatgtacaca 1140 tggaattagg ccagtagtat caactcaact gctgttaaat ggcagtctag cagaagaaga 1200 ggtagtaatt agatctgtca atttcacgga caatgctaaa accataatag tacagctgaa 1260 cacatctgta gaaattaatt gtacaagacc caacaacaat acaagaaaaa gaatccgtat 1320 ccagagagga ccagggagag catttgttac aataggaaaa ataggaaata tgagacaagc 1380 acattgtaac attagtagag caaaatggaa taacacttta aaacagatag ctagcaaatt 1440 aagagaacaa tttggaaata ataaaacaat aatctttaag caatcctcag gaggggaccc 1500 agaaattgta acgcacagtt ttaattgtgg aggggaattt ttctactgta attcaacaca 1560 actgtttaat agtacttggt ttaatagtac ttggagtact gaagggtcaa ataacactga 1620 aggaagtgac acaatcaccc tcccatgcag aataaaacaa attataaaca tgtggcagaa 1680 agtaggaaaa gcaatgtatg cccctcccat cagtggacaa attagatgtt catcaaatat 1740 tacagggctg ctattaacaa gagatggtgg taatagcaac aatgagtccg agatcttcag 1800 acctggagga ggagatatga gggacaattg gagaagtgaa ttatataaat ataaagtagt 1860 aaaaattgaa ccattaggag tagcacccac caaggcaaag agaagagtgg tgcagagaga 1920 aaaaagagca gtgggaatag gagctttgtt ccttgggttc ttgggagcag caggaagcac 1980 tatgggcgca gcctcaatga cgctgacggt acaggccaga caattattgt ctggtatagt 2040 gcagcagcag aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa cagcatctgt tgcaactcac 2100 agtctggggc atcaagcagc tccaggcaag aatcctggct gtggaaagat acctaaagga 2160 tcaacagctc ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc atttgcacca ctgctgtgcc 2220 ttggaatgct agttggagta ataaatctct ggaacagatt tggaatcaca cgacctggat 2280 ggagtgggac agagaaatta acaattacac aagcttaata cactccttaa ttgaagaatc 2340 gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga attattggaa ttagataaat gggcaagttt 2400 gtggaattgg tttaacataa caaattggct gtggtatata aaattattca taatgatagt 2460 aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt tctatagtga atagagttag 2520 gcagggatat tcaccattat cgtttcagac ccacctccca accccgaggg gacccgacag 2580 gcccgaagga atag 2594 <210> 10 <211> 86 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus 1 <400> 10 Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser 1 5 10 15 Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe 20 25 30 His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly 35 40 45 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln Asn Ser Gln Thr 50 55 60 His Gln Ala Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Pro Arg Gly Asp 65 70 75 80 Pro Thr Gly Pro Lys Glu 85 <210> 11 <211> 2397 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ctgtcccgca agcgccggcg gcagcatggc cagctctggt tccctgaggg cttcaaagtg 60 tctgaggcca gcaagaagaa gcggcgggag cccctcggcg aggactccgt gggcctcaag 120 cccctgaaga acgcttcaga cggtgccctc atggacgaca accagaatga gtggggggac 180 gaggacctgg agaccaagaa gttccggttc gaggagcccg tggttctgcc tgacctggac 240 gaccagacag accaccggca gtggactcag cagcacctgg atgccgctga cctgcgcatg 300 tctgccatgg cccccacacc gccccagggt gaggttgacg ccgactgcat ggacgtcaat 360 gtccgcgggc ctgatggctt caccccgctc atgatcgcct cctgcagcgg gggcggcctg 420 gagacgggca acagcgagga agaggaggac gcgccggccg tcatctccga cttcatctac 480 cagggcgcca gcctgcacaa ccagacagac cgcacgggcg agaccgcctt gcacctggcc 540 gcccgctact cacgctctga tgccgccaag cgcctgctgg aggccagcgc agatgccaac 600 atccaggaca acatgggccg caccccgctg catgcggctg tgtctgccga cgcacaaggt 660 gtcttccaga tcctgatccg gaaccgagcc acagacctgg atgcccgcat gcatgatggc 720 acgacgccac tgatcctggc tgcccgcctg gccgtggagg gcatgctgga ggacctcatc 780 aactcacacg ccgacgtcaa cgccgtagat gacctgggca agtccgccct gcactgggcc 840 gccgccgtga acaatgtgga tgccgcagtt gtgctcctga agaacggggc taacaaagat 900 atgcagaaca acagggagga gacacccctg tttctggccg cccgggaggg cagctacgag 960 accgccaagg tgctgctgga ccactttgcc aaccgggaca tcacggatca tatggaccgc 1020 ctgccgcgcg acatcgcaca ggagcgcatg catcacgaca tcgtgaggct gctggacgag 1080 tacaacctgg tgcgcagccc gcagctgcac ggagccccgc tggggggcac gcccaccctg 1140 tcgcccccgc tctgctcgcc caacggctac ctgggcagcc tcaagcccgg cgtgcagggc 1200 aagaaggtcc gcaagcccag cagcaaaggc ctggcctgtg gaagcaagga ggccaaggac 1260 ctcaaggcac ggaggaagaa gtcccaggac ggcaagggct gcctgctgga cagctccggc 1320 atgctctcgc ccgtggactc cctggagtca ccccatggct acctgtcaga cgtggcctcg 1380 ccgccactgc tgccctcccc gttccagcag tctccgtccg tgcccctcaa ccacctgcct 1440 gggatgcccg acacccacct gggcatcggg cacctgaacg tggcggccaa gcccgagatg 1500 gcggcgctgg gtgggggcgg ccggctggcc tttgagactg gcccacctcg tctctcccac 1560 ctgcctgtgg cctctggcac cagcaccgtc ctgggctcca gcagcggagg ggccctgaat 1620 ttcactgtgg gcgggtccac cagtttgaat ggtcaatgcg agtggctgtc ccggctgcag 1680 agcggcatgg tgccgaacca atacaaccct ctgcggggga gtgtggcacc aggccccctg 1740 agcacacagg ccccctccct gcagcatggc atggtaggcc cgctgcacag tagccttgct 1800 gccagcgccc tgtcccagat gatgagctac cagggcctgc ccagcacccg gctggccacc 1860 cagcctcacc tggtgcagac ccagcaggtg cagccacaaa acttacagat gcagcagcag 1920 aacctgcagc cagcaaacat ccagcagcag caaagcctgc agccgccacc accaccacca 1980 cagccgcacc ttggcgtgag ctcagcagcc agcggccacc tgggccggag cttcctgagt 2040 ggagagccga gccaggcaga cgtgcagcca ctgggcccca gcagcctggc ggtgcacact 2100 attctgcccc aggagagccc cgccctgccc acgtcgctgc catcctcgct ggtcccaccc 2160 gtgaccgcag cccagttcct gacgcccccc tcgcagcaca gctactcctc gcctgtggac 2220 aacaccccca gccaccagct acaggtgcct gagcacccct tcctcacccc gtcccctgag 2280 tcccctgacc agtggtccag ctcgtccccg cattccaacg tctccgactg gtccgagggc 2340 gtctccagcc ctcccaccag catgcagtcc cagatcgccc gcattccgga ggccttc 2397 <210> 12 <211> 799 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Gln His Gly Gln Leu Trp Phe Pro Glu 1 5 10 15 Gly Phe Lys Val Ser Glu Ala Ser Lys Lys Lys Arg Arg Glu Pro Leu 20 25 30 Gly Glu Asp Ser Val Gly Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ala Ser Asp Gly 35 40 45 Ala Leu Met Asp Asp Asn Gln Asn Glu Trp Gly Asp Glu Asp Leu Glu 50 55 60 Thr Lys Lys Phe Arg Phe Glu Glu Pro Val Val Leu Pro Asp Leu Asp 65 70 75 80 Asp Gln Thr Asp His Arg Gln Trp Thr Gln Gln His Leu Asp Ala Ala 85 90 95 Asp Leu Arg Met Ser Ala Met Ala Pro Thr Pro Pro Gln Gly Glu Val 100 105 110 Asp Ala Asp Cys Met Asp Val Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Phe Thr 115 120 125 Pro Leu Met Ile Ala Ser Cys Ser Gly Gly Gly Leu Glu Thr Gly Asn 130 135 140 Ser Glu Glu Glu Glu Asp Ala Pro Ala Val Ile Ser Asp Phe Ile Tyr 145 150 155 160 Gln Gly Ala Ser Leu His Asn Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu Thr Ala 165 170 175 Leu His Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu 180 185 190 Leu Glu Ala Ser Ala Asp Ala Asn Ile Gln Asp Asn Met Gly Arg Thr 195 200 205 Pro Leu His Ala Ala Val Ser Ala Asp Ala Gln Gly Val Phe Gln Ile 210 215 220 Leu Ile Arg Asn Arg Ala Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met His Asp Gly 225 230 235 240 Thr Thr Pro Leu Ile Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu Gly Met Leu 245 250 255 Glu Asp Leu Ile Asn Ser His Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Asp Leu 260 265 270 Gly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Asp Ala 275 280 285 Ala Val Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asn Lys Asp Met Gln Asn Asn 290 295 300 Arg Glu Glu Thr Pro Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Glu 305 310 315 320 Thr Ala Lys Val Leu Leu Asp His Phe Ala Asn Arg Asp Ile Thr Asp 325 330 335 His Met Asp Arg Leu Pro Arg Asp Ile Ala Gln Glu Arg Met His His 340 345 350 Asp Ile Val Arg Leu Leu Asp Glu Tyr Asn Leu Val Arg Ser Pro Gln 355 360 365 Leu His Gly Ala Pro Leu Gly Gly Thr Pro Thr Leu Ser Pro Pro Leu 370 375 380 Cys Ser Pro Asn Gly Tyr Leu Gly Ser Leu Lys Pro Gly Val Gln Gly 385 390 395 400 Lys Lys Val Arg Lys Pro Ser Ser Lys Gly Leu Ala Cys Gly Ser Lys 405 410 415 Glu Ala Lys Asp Leu Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ser Gln Asp Gly Lys 420 425 430 Gly Cys Leu Leu Asp Ser Ser Gly Met Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu 435 440 445 Glu Ser Pro His Gly Tyr Leu Ser Asp Val Ala Ser Pro Pro Leu Leu 450 455 460 Pro Ser Pro Phe Gln Gln Ser Pro Ser Val Pro Leu Asn His Leu Pro 465 470 475 480 Gly Met Pro Asp Thr His Leu Gly Ile Gly His Leu Asn Val Ala Ala 485 490 495 Lys Pro Glu Met Ala Ala Leu Gly Gly Gly Gly Arg Leu Ala Phe Glu 500 505 510 Thr Gly Pro Pro Arg Leu Ser His Leu Pro Val Ala Ser Gly Thr Ser 515 520 525 Thr Val Leu Gly Ser Ser Ser Gly Gly Ala Leu Asn Phe Thr Val Gly 530 535 540 Gly Ser Thr Ser Leu Asn Gly Gln Cys Glu Trp Leu Ser Arg Leu Gln 545 550 555 560 Ser Gly Met Val Pro Asn Gln Tyr Asn Pro Leu Arg Gly Ser Val Ala 565 570 575 Pro Gly Pro Leu Ser Thr Gln Ala Pro Ser Leu Gln His Gly Met Val 580 585 590 Gly Pro Leu His Ser Ser Leu Ala Ala Ser Ala Leu Ser Gln Met Met 595 600 605 Ser Tyr Gln Gly Leu Pro Ser Thr Arg Leu Ala Thr Gln Pro His Leu 610 615 620 Val Gln Thr Gln Gln Val Gln Pro Gln Asn Leu Gln Met Gln Gln Gln 625 630 635 640 Asn Leu Gln Pro Ala Asn Ile Gln Gln Gln Gln Ser Leu Gln Pro Pro 645 650 655 Pro Pro Pro Pro Gln Pro His Leu Gly Val Ser Ser Ala Ala Ser Gly 660 665 670 His Leu Gly Arg Ser Phe Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gln Ala Asp Val 675 680 685 Gln Pro Leu Gly Pro Ser Ser Leu Ala Val His Thr Ile Leu Pro Gln 690 695 700 Glu Ser Pro Ala Leu Pro Thr Ser Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Pro 705 710 715 720 Val Thr Ala Ala Gln Phe Leu Thr Pro Pro Ser Gln His Ser Tyr Ser 725 730 735 Ser Pro Val Asp Asn Thr Pro Ser His Gln Leu Gln Val Pro Glu His 740 745 750 Pro Phe Leu Thr Pro Ser Pro Glu Ser Pro Asp Gln Trp Ser Ser Ser 755 760 765 Ser Pro His Ser Asn Val Ser Asp Trp Ser Glu Gly Val Ser Ser Pro 770 775 780 Pro Thr Ser Met Gln Ser Gln Ile Ala Arg Ile Pro Glu Ala Phe 785 790 795 <210> 13 <211> 814 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ccttcacctg cctctgccgc ccaggctaca cgggccacca ctgcgagacc aacatcaacg 60 agtgctccag ccagccctgc cgcctacggg gcacctgcca ggacccggac aacgcctacc 120 tctgcttctg cctgaagggg accacaggac ccaactgcga gatcaacctg gatgactgtg 180 ccagcagccc ctgcgactcg ggcacctgtc tggacaagat cgatggctac gagtgtgcct 240 gtgagccggg ctacacaggg agcatgtgta acagcaacat cgatgagtgt gcgggcaacc 300 cctgccacaa cgggggcacc tgcgaggacg gcatcaatgg cttcacctgc cgctgccccg 360 agggctacca cgaccccacc tgcctgtctg aggtcaatga gtgcaacagc aacccctgcg 420 tccacggggc ctgccgggac agcctcaacg ggtacaagtg cgactgtgac cctgggtgga 480 gtgggaccaa ctgtgacatc aacaacaacg agtgtgaatc caacccttgt gtcaacggcg 540 gcacctgcaa agacatgacc agtggcatcg tgtgcacctg ccgggagggc ttcagcggtc 600 ccaactgcca gaccaacatc aacgagtgtg cgtccaaccc atgtctgaac aagggcacgt 660 gtattgacga cgttgccggg tacaagtgca actgcctgct gccctacaca ggtgccacgt 720 gtgaggtggt gctggccccg tgtgccccca gcccctgcag aaacggcggg gagtgcaggc 780 aatccgagga ctatgagagt tgtcactatg tcct 814 <210> 14 <211> 799 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Gln His Gly Gln Leu Trp Phe Pro Glu 1 5 10 15 Gly Phe Lys Val Ser Glu Ala Ser Lys Lys Lys Arg Arg Glu Pro Leu 20 25 30 Gly Glu Asp Ser Val Gly Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ala Ser Asp Gly 35 40 45 Ala Leu Met Asp Asp Asn Gln Asn Glu Trp Gly Asp Glu Asp Leu Glu 50 55 60 Thr Lys Lys Phe Arg Phe Glu Glu Pro Val Val Leu Pro Asp Leu Asp 65 70 75 80 Asp Gln Thr Asp His Arg Gln Trp Thr Gln Gln His Leu Asp Ala Ala 85 90 95 Asp Leu Arg Met Ser Ala Met Ala Pro Thr Pro Pro Gln Gly Glu Val 100 105 110 Asp Ala Asp Cys Met Asp Val Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Phe Thr 115 120 125 Pro Leu Met Ile Ala Ser Cys Ser Gly Gly Gly Leu Glu Thr Gly Asn 130 135 140 Ser Glu Glu Glu Glu Asp Ala Pro Ala Val Ile Ser Asp Phe Ile Tyr 145 150 155 160 Gln Gly Ala Ser Leu His Asn Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu Thr Ala 165 170 175 Leu His Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu 180 185 190 Leu Glu Ala Ser Ala Asp Ala Asn Ile Gln Asp Asn Met Gly Arg Thr 195 200 205 Pro Leu His Ala Ala Val Ser Ala Asp Ala Gln Gly Val Phe Gln Ile 210 215 220 Leu Ile Arg Asn Arg Ala Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met His Asp Gly 225 230 235 240 Thr Thr Pro Leu Ile Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu Gly Met Leu 245 250 255 Glu Asp Leu Ile Asn Ser His Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Asp Leu 260 265 270 Gly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Asp Ala 275 280 285 Ala Val Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asn Lys Asp Met Gln Asn Asn 290 295 300 Arg Glu Glu Thr Pro Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Glu 305 310 315 320 Thr Ala Lys Val Leu Leu Asp His Phe Ala Asn Arg Asp Ile Thr Asp 325 330 335 His Met Asp Arg Leu Pro Arg Asp Ile Ala Gln Glu Arg Met His His 340 345 350 Asp Ile Val Arg Leu Leu Asp Glu Tyr Asn Leu Val Arg Ser Pro Gln 355 360 365 Leu His Gly Ala Pro Leu Gly Gly Thr Pro Thr Leu Ser Pro Pro Leu 370 375 380 Cys Ser Pro Asn Gly Tyr Leu Gly Ser Leu Lys Pro Gly Val Gln Gly 385 390 395 400 Lys Lys Val Arg Lys Pro Ser Ser Lys Gly Leu Ala Cys Gly Ser Lys 405 410 415 Glu Ala Lys Asp Leu Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ser Gln Asp Gly Lys 420 425 430 Gly Cys Leu Leu Asp Ser Ser Gly Met Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu 435 440 445 Glu Ser Pro His Gly Tyr Leu Ser Asp Val Ala Ser Pro Pro Leu Leu 450 455 460 Pro Ser Pro Phe Gln Gln Ser Pro Ser Val Pro Leu Asn His Leu Pro 465 470 475 480 Gly Met Pro Asp Thr His Leu Gly Ile Gly His Leu Asn Val Ala Ala 485 490 495 Lys Pro Glu Met Ala Ala Leu Gly Gly Gly Gly Arg Leu Ala Phe Glu 500 505 510 Thr Gly Pro Pro Arg Leu Ser His Leu Pro Val Ala Ser Gly Thr Ser 515 520 525 Thr Val Leu Gly Ser Ser Ser Gly Gly Ala Leu Asn Phe Thr Val Gly 530 535 540 Gly Ser Thr Ser Leu Asn Gly Gln Cys Glu Trp Leu Ser Arg Leu Gln 545 550 555 560 Ser Gly Met Val Pro Asn Gln Tyr Asn Pro Leu Arg Gly Ser Val Ala 565 570 575 Pro Gly Pro Leu Ser Thr Gln Ala Pro Ser Leu Gln His Gly Met Val 580 585 590 Gly Pro Leu His Ser Ser Leu Ala Ala Ser Ala Leu Ser Gln Met Met 595 600 605 Ser Tyr Gln Gly Leu Pro Ser Thr Arg Leu Ala Thr Gln Pro His Leu 610 615 620 Val Gln Thr Gln Gln Val Gln Pro Gln Asn Leu Gln Met Gln Gln Gln 625 630 635 640 Asn Leu Gln Pro Ala Asn Ile Gln Gln Gln Gln Ser Leu Gln Pro Pro 645 650 655 Pro Pro Pro Pro Gln Pro His Leu Gly Val Ser Ser Ala Ala Ser Gly 660 665 670 His Leu Gly Arg Ser Phe Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gln Ala Asp Val 675 680 685 Gln Pro Leu Gly Pro Ser Ser Leu Ala Val His Thr Ile Leu Pro Gln 690 695 700 Glu Ser Pro Ala Leu Pro Thr Ser Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Pro 705 710 715 720 Val Thr Ala Ala Gln Phe Leu Thr Pro Pro Ser Gln His Ser Tyr Ser 725 730 735 Ser Pro Val Asp Asn Thr Pro Ser His Gln Leu Gln Val Pro Glu His 740 745 750 Pro Phe Leu Thr Pro Ser Pro Glu Ser Pro Asp Gln Trp Ser Ser Ser 755 760 765 Ser Pro His Ser Asn Val Ser Asp Trp Ser Glu Gly Val Ser Ser Pro 770 775 780 Pro Thr Ser Met Gln Ser Gln Ile Ala Arg Ile Pro Glu Ala Phe 785 790 795

Claims (55)

  1. (a) 증가시킨 성체 줄기 세포군을 수득하는 단계;
    (b) 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원종양유전자 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 상동체를 포함하는 핵산 분자로 상기 줄기 세포를 트랜스펙션하는 단계로서, 여기서 원종양유전자는 유도성인 단계;
    (c) 세포의 아폽토시스를 억제하는 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 상기 줄기 세포를 트랜스펙션하는 단계; 및
    (d) 원종양유전자가 활성화되는 조건 하에 줄기 세포 성장 인자의 조합물의 존재 하에서 상기 트랜스펙션된 세포를 증가시켜 조건부 불멸화 성체 줄기 세포를 제조하는 단계
    를 포함하는, 조건부 불멸화 성체 줄기 세포의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, (b) 및/또는 (c)의 핵산 분자는 통합 벡터에 포함된 방법.
  3. 제1항에 있어서, (b) 및/또는 (c)의 핵산 분자는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 파르보바이러스, 우두 바이러스, 코로나바이러스, 칼리시바이러스, 유두종 바이러스, 플라비바이러스, 오르소믹소바이러스, 토가바이러스, 피코르나바이러스, 아데노바이러스 벡터, 변형 및 약독화된 헤르페스바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 바이러스 또는 바이러스 벡터를 이용하여 세포에 트랜스펙션된 방 법.
  4. 제1항에 있어서, (b) 및/또는 (c)의 핵산 분자는 직접 전기천공을 이용하여 세포에 트랜스펙션된 방법.
  5. 제1항에 있어서, (b) 및/또는 (c)의 핵산 분자는 약물 감응성 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터에 포함된 방법.
  6. 제1항에 있어서, (b) 및/또는 (c)의 핵산 분자가 (b) 또는 (c)의 핵산 분자에 측접한 재조합 효소에 대한 인식 기질 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터에 포함된 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    (e) 원종양유전자가 활성화되는 (d)의 조건을 제거하는 단계; 및
    (f) 세포의 분화를 유도하는 성장 인자를 포함하는 배지에서 (e)의 세포를 배양하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    (g) (f)의 세포에, 원종양유전자가 활성화되는 (d)의 조건을 추가하여 세포 분화의 중간 단계에 있는 조건부 불멸화 세포를 제조하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  9. (a) 증가된 성체 줄기 세포군을 수득하는 단계;
    (b) (1) 줄기 세포 성장 인자의 조합물;
    (2) 제 1 Tat-융합 단백질(여기서, Tat는 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원종양유전자 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 상동체에 의해 코딩되는 단백질에 융합됨); 및
    (3) 제 2 Tat-융합 단백질(여기서, Tat는 줄기 세포의 아폽토시스를 억제하는 단백질에 융합됨)
    의 존재 하에서 줄기 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는, 조건부 불멸화 성체 줄기 세포의 제조 방법.
  10. (a) 증가된 배아 줄기 세포군을 수득하는 단계;
    (b) 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원종양유전자 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 상동체를 포함하는 핵산 분자로 상기 줄기 세포를 트랜스펙션하는 단계로서, 원종양유전자는 유도성인 단계;
    (c) 세포의 아폽토시스를 억제하는 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 상기 줄기 세포를 트랜스펙션하는 단계; 및
    (d) 원종양유전자가 활성화되는 조건 하에 줄기 세포 성장 인자의 조합물의 존재 하에서 상기 트랜스펙션된 세포를 증가시켜, 조건부 불멸화 배아 줄기 세포를 제조하는 단계
    를 포함하는, 조건부 불멸화 배아 줄기 세포의 제조 방법.
  11. 제1항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 원종양유전자가 MYC-ER 및 ICN-1-ER로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  12. 제1항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 아폽토시스를 억제하는 단백질이 아폽토시스를 억제하는 Bcl-2 패밀리의 구성원인 방법.
  13. 제1항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 아폽토시스를 억제하는 단백질이 Bcl-2, Bcl-X, Bcl-w, BclXL, Mcl-1, Dad-1, 또는 hTERT로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  14. 제1항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 원종양유전자가 MYC-ER인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 원종양유전자가 활성화되는 조건이 타목시펜 또는 이의 아고니스트의 존재를 포함하는 방법.
  16. 제1항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 아폽토시스를 억제하는 단백질이 Bcl-2인 방법.
  17. 제1항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 MYC-ER 및 Bcl-2; MYC-ER 및 hTERT; ICN-1-ER 및 Bcl-2; ICN-1-ER 및 hTERT; 또는 MYC-ER 및 ICN-1-ER로 트랜스펙션된 방법.
  18. 제1항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 MYC-ER 및 Bcl-2로 트랜스펙션된 방법.
  19. 제1항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 증가 단계가 인터루킨-6 (IL-6), IL-3 및 줄기 세포 인자 (SCF)를 포함하는 배지에서 수행되는 방법.
  20. 제1항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 증가 단계가 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), 인슐린 유사 성장 인자 2 (IGF-2) 및 섬유아세포 성장 인자 1 (FGF-1)을 포함하는 무혈청 배지에서 수행되는 방법.
  21. 제1항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 성체 줄기 세포가 조혈 줄기 세포, 장 줄기 세포, 골모 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 심근 세포 전구 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 골격근 줄기 세포, 및 간 줄기 세포로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 중간엽 줄기 세포가 폐 중간엽 줄기 세포 및 골수 간질 세포로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상피 줄기 세포가 폐 상피 줄기 세포, 유방 상피 줄기 세포, 혈관 상피 줄기 세포 및 장 상피 줄기 세포로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  24. 제21항에 있어서, 피부 줄기 세포가 표피 줄기 세포 및 소포 줄기 세포 (모낭 줄기 세포)로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  25. 제21항에 있어서, 신경 줄기 세포가 뉴런 도파민성 줄기 세포 및 운동 뉴런 줄기 세포로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  26. 제21항에 있어서, 줄기 세포가 새로 공급된 것이거나 또는 냉동보존된 제대혈 유래인 방법.
  27. 제21항에 있어서, 줄기 세포가 정상 또는 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)로 처리된 환자의 말초혈로부터 얻어진 조혈 전구 세포인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포를 유전자 변형하여 세포에서의 유전적 결함을 보정하는 단계를 더 포함하는 방법.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포를 유전자 변형하여 유전자의 발현을 침묵시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  30. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 세포를 유전자 변형하여 유전자를 과발현시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 저장하는 단계를 더 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 저장된 세포를 재생시키고 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 세포.
  34. a) 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 조건부 불멸화 성체 줄기 세포의 공급원을 제공하는 단계;
    b) (a)의 줄기 세포가 조건부 불멸화되는 조건을 제거하는 단계; 및
    c) 줄기 세포 또는 그로부터 분화된 세포를 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 성체 줄기 세포, 또는 그로부터 분화된 세포를 개체에게 제공하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 세포가 (c)의 개체로부터 미리 얻어진 방법.
  36. 제34항에 있어서, 세포가 상기 세포의 미리 냉동된 저장물로부터 얻어진 방법.
  37. 제34항에 있어서, 세포가 개체로부터 새롭게 얻어지고 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법에 의해 조건부 불멸화된 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 암을 갖는 방법.
  39. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 백혈병을 갖는 방법.
  40. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 면역 결핍 질환을 갖는 방법.
  41. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 빈혈 질환을 갖는 방 법.
  42. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 재건 수술을 받는 것인 방법.
  43. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 선택적인 미용 수술을 받는 것인 방법.
  44. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 이식 수술을 받는 것인 방법.
  45. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 조혈 줄기 세포, 장 줄기 세포, 골모 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 심근 세포 전구 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 골격근 줄기 세포, 및 간 줄기 세포로 이루어진 군에서 선택되는, 줄기 세포, 또는 그로부터 분화된 세포를 필요로 하는 방법.
  46. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 개선된 면역 세포 기능을 필요로 하는 방법.
  47. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 줄기 세포에 의해 보정되는 유전적 결함을 갖는 방법.
  48. a) 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 성체 줄기 세포를 시험할 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    b) 화합물 부재 하의 줄기 세포와 비교하여, (a)의 줄기 세포에서 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 검출하는 단계로서, 이때 화합물 존재 하에서 특징 차이가 검출되는 것은 화합물이 줄기 세포의 특징에 영향을 주는 것을 의미하는 단계
    를 포함하는, 계통 결정(commitment) 및/또는 세포 분화 및 발생을 조절하는 화합물의 동정 방법.
  49. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 성체 줄기 세포, 또는 그로부터 분화된 세포를 평가하여, 세포의 하나 이상의 유전자형 또는 표현형 특징을 검출하는 단계를 포함하는, 계통 결정 및/또는 세포 분화 및 발생의 연구 방법.
  50. 줄기 세포의 이식이 이로운 병태 또는 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 세포의 용도.
  51. a) 마우스에 치명적인 방사선 조사를 실시하는 단계;
    b) 제18항의 방법에 의해 제조된 조건부 불멸화 장기(long-term) 줄기 세포 및 Rag-/- 마우스 유래 전 골수 세포를 상기 마우스에게 전달하는 단계; 및
    c) 마우스가 급성 골수성 백혈병(AML)의 임상 징후를 나타낼 때까지 상기 마우스에게 타목시펜 또는 이의 아고니스트를 주기적인 투여량으로 주사하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 제공된 마우스를 포함하는, 급성 골수성 백혈병 (AML) 마우스 모델.
  52. 제50항의 AML의 마우스 모델로부터 얻은 종양 세포.
  53. AML의 진단, 연구, 또는 치료에 사용하기 위한 화합물을 동정, 개발, 및/또는 시험하기 위한; 또는 AML의 진단, 연구, 또는 치료에 사용하기 위한 표적을 동정, 개발, 및/또는 시험하기 위한, 인간 단백질에 특이적인 약물 후보의 임상전 시험에서의 AML 마우스 모델의 용도.
  54. a) 증가된 줄기 세포군을 수득하는 단계;
    b) (1) 줄기 세포 성장 인자의 조합물;
    (2) 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원종양유전자 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 상동체에 의해 코딩되는 단백질; 및;
    (3) 줄기 세포의 아폽토시스를 억제는 단백질
    의 존재 하에서 줄기 세포를 배양하는 단계로서, 이때 (2) 및 (3)의 단백질이 줄기 세포에 전달되는 것인 단계
    를 포함하는, 조건부 불멸화 줄기 세포의 제조 방법.
  55. a) 증가된 성체 줄기 세포군을 수득하는 단계;
    b) 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원종양유전자 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 상동체에 의해 코딩되는 단백질, 또는 이를 코딩하는 핵산 분자를 세포에 전달하는 단계로서, 여기서 원종양유전자는 유도성인 단계;
    c) 세포의 아폽토시스를 억제하는 단백질, 세포의 아폽토시스를 억제하는 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 또는 세포 내 프로아폽토시스 단백질을 억제하는 핵산 분자 또는 단백질을 세포에 전달하여 줄기 세포의 아폽토시스를 억제하는 단계; 및
    d) 원종양유전자가 활성화 되는 조건 하에 줄기 세포 성장 인자의 조합물의 존재 하에서 세포를 증가시켜, 조건부 불멸화 성체 줄기 세포를 제조하는 단계
    를 포함하는, 조건부 불멸화 성체 줄기 세포의 제조 방법.
KR1020087011791A 2005-10-18 2006-10-18 조건부 불멸화 장기 줄기 세포 및 상기 세포의 제조 및사용 방법 KR101441693B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72813105P 2005-10-18 2005-10-18
US60/728,131 2005-10-18
US76599306P 2006-02-06 2006-02-06
US60/765,993 2006-02-06
PCT/US2006/040379 WO2007047583A2 (en) 2005-10-18 2006-10-18 Conditionally immortalized long-term stem cells and methods of making and using such cells

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137028338A Division KR101441843B1 (ko) 2005-10-18 2006-10-18 조건부 불멸화 장기 줄기 세포 및 상기 세포의 제조 및 사용 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080070005A true KR20080070005A (ko) 2008-07-29
KR101441693B1 KR101441693B1 (ko) 2014-09-25

Family

ID=37963171

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087011791A KR101441693B1 (ko) 2005-10-18 2006-10-18 조건부 불멸화 장기 줄기 세포 및 상기 세포의 제조 및사용 방법
KR1020137028338A KR101441843B1 (ko) 2005-10-18 2006-10-18 조건부 불멸화 장기 줄기 세포 및 상기 세포의 제조 및 사용 방법

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137028338A KR101441843B1 (ko) 2005-10-18 2006-10-18 조건부 불멸화 장기 줄기 세포 및 상기 세포의 제조 및 사용 방법

Country Status (13)

Country Link
US (7) US8883507B2 (ko)
EP (1) EP1942739B1 (ko)
JP (8) JP2009511081A (ko)
KR (2) KR101441693B1 (ko)
CN (2) CN105483088B (ko)
AT (1) ATE491022T1 (ko)
AU (1) AU2006304392B2 (ko)
CA (2) CA3065947C (ko)
DE (1) DE602006018768D1 (ko)
HK (2) HK1126623A1 (ko)
IL (7) IL286053B2 (ko)
IN (1) IN2014DN06624A (ko)
WO (1) WO2007047583A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150009682A (ko) * 2013-07-17 2015-01-27 아주대학교산학협력단 RGMc를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 유도용 배지 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 유도방법

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN2014DN06624A (ko) 2005-10-18 2015-07-10 Univ Colorado
EP2772535B1 (en) 2006-05-31 2022-04-06 Children's Medical Center Corporation ABC5 positive mesenchymal stem cells as immunomodulators
GB0619500D0 (en) * 2006-10-03 2006-11-08 Univ Keele Treatment of fibrosis
JP2010521170A (ja) 2007-03-13 2010-06-24 ナショナル ジューイッシュ ヘルス 抗体の生成方法
AU2009246876B2 (en) 2008-05-16 2015-04-02 Taiga Biotechnologies, Inc. Antibodies and processes for preparing the same
DK2313496T3 (en) 2008-07-21 2014-12-15 Taiga Biotechnologies Inc Anukleære differentiated cells, and method for preparation thereof
DK2966084T3 (en) 2008-08-28 2018-08-06 Taiga Biotechnologies Inc MODULATORS OF MYC, PROCEDURES FOR USING SAME AND PROCEDURES FOR IDENTIFYING SUBSTANCES MODULATING MYC
EP3978928A1 (en) 2008-11-14 2022-04-06 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Therapeutic and diagnostic methods relating to cancer stem cells
US11542328B2 (en) 2008-11-14 2023-01-03 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Therapeutic and diagnostic methods relating to cancer stem cells
JP2012531894A (ja) * 2009-06-29 2012-12-13 レスコフ，イリヤ，ビー． ヒト血液癌の非ヒト哺乳動物モデル
DK2500418T3 (en) * 2009-09-15 2018-04-30 Univ Tokyo UNKNOWN PROCEDURE FOR DIFFERENTIATED CELL MANUFACTURING
AU2014240253B2 (en) * 2009-09-15 2017-08-03 The University Of Tokyo Novel Method for Producing Differentiated Cells
EP2498796B1 (en) 2009-11-09 2017-12-27 AAL Scientifics, Inc. Treatment of heart disease
EP2566955A4 (en) * 2010-05-06 2014-10-29 Stem Cell Medicine Ltd STEM CELL BANK FOR PERSONALIZED MEDICINE
US10034900B2 (en) 2010-09-30 2018-07-31 National University Corporation Kumamoto University Method of producing myeloid blood cells
US8889630B2 (en) 2011-12-23 2014-11-18 Carlos Lopez Method for hair regrowth using Granulocyte-Colony Stimulating Factor
US20130171115A1 (en) * 2011-12-30 2013-07-04 Gang Li Cell-mediated gene therapy for cancer using mesenchymal stem cells expressing a suicide gene
SG11201500429QA (en) * 2012-07-20 2015-03-30 Taiga Biotechnologies Inc Enhanced reconstitution and autoreconstitution of the hematopoietic compartment
AU2014219026B2 (en) 2013-02-19 2018-11-29 Children's Medical Center Corporation ABCB5(+) stem cells for treating ocular disease
US10272115B2 (en) 2013-03-11 2019-04-30 Taiga Biotechnologies, Inc. Production and use of red blood cells
US9365825B2 (en) * 2013-03-11 2016-06-14 Taiga Biotechnologies, Inc. Expansion of adult stem cells in vitro
WO2014182994A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Children's Medical Center Corporation Wound healing and tissue engineering
WO2015020993A2 (en) * 2013-08-05 2015-02-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNAi COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF FRIEDREICH'S ATAXIA
CN103509101B (zh) * 2013-08-12 2016-11-02 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种扩增脐带血造血干细胞的细胞因子及其培养基
US20180051253A1 (en) 2015-03-18 2018-02-22 The Regents Of The University Of California Methods of preventing and reversing stem cell aging
CN106148266A (zh) * 2015-04-20 2016-11-23 烟台赛泽生物技术有限公司 一种免疫细胞用培养基及该培养基的添加剂
CN104928247B (zh) * 2015-07-02 2018-03-23 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种神经干细胞培养基及神经干细胞贴壁培养方法
KR20180033537A (ko) 2015-07-21 2018-04-03 더 칠드런스 메디칼 센터 코포레이션 Pd-l1 발현 조혈 줄기 세포 및 용도
CA2997912A1 (en) * 2015-09-09 2017-03-16 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Genetic engineering of macrophages for immunotherapy
US11534466B2 (en) 2016-03-09 2022-12-27 Aal Scientifics, Inc. Pancreatic stem cells and uses thereof
CN105695511A (zh) * 2016-04-13 2016-06-22 中国人民解放军第三军医大学 一种永生化毛囊干细胞系及其制备方法
CN105713880A (zh) * 2016-04-20 2016-06-29 广东艾时代生物科技有限责任公司 一种造血干细胞体外扩增培养的无血清培养基及其应用
CN106279403B (zh) * 2016-08-16 2019-06-11 长春市海兰深生物医学技术有限公司 一种检测天然肺癌相关抗体的组合物、试剂盒和方法
KR20190092472A (ko) 2016-12-02 2019-08-07 타이가 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 나노입자 제제
CN106754728B (zh) * 2016-12-30 2020-05-15 中国人民解放军总医院 后肾间充质细胞系及其制备方法与应用
FR3068366B1 (fr) * 2017-06-30 2023-11-24 Francais Du Sang Ets Procede de production de progeniteurs erythroides
US10149898B2 (en) 2017-08-03 2018-12-11 Taiga Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for the treatment of melanoma
US20200155600A1 (en) * 2017-08-03 2020-05-21 Taiga Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for the treatment of cancer
WO2019060708A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 The Children's Medical Center Corporation TREATMENT OF TYPE 1 DIABETES AND AUTOIMMUNE DISEASES OR DISORDERS
CN107937342B (zh) * 2017-11-06 2021-07-06 中国人民解放军第四军医大学 一种通过内皮细胞来源的外泌体扩增神经干细胞的方法
CN108070567A (zh) * 2018-01-19 2018-05-25 皓昇莱生物制药有限公司 一种永生化的尿液来源细胞株及其构建方法
WO2021015584A1 (ko) * 2019-07-24 2021-01-28 주식회사 에스엘바이젠 불사화된 줄기세포주의 제조 방법 및 이의 용도
CN110622921B (zh) * 2019-09-29 2021-06-15 江苏大学 阿尔茨海默病病变区FoxG1过表达小鼠模型的构建方法及应用
GB202005494D0 (en) * 2020-04-15 2020-05-27 Reneuron Ltd Induced pluripotent cell comprising a contollable transgene for conditional immortalisation
KR20220057859A (ko) 2020-10-30 2022-05-09 전상수 펜터리
JPWO2022097716A1 (ko) 2020-11-06 2022-05-12
CN113444730A (zh) * 2021-03-17 2021-09-28 昆明市延安医院 一种原发性肝细胞klotho基因转导干细胞筛选构建方法
EP4365283A1 (en) * 2021-06-30 2024-05-08 National University Corporation Chiba University Method for improving proliferative properties of common myeloid progenitor cells (cmp) or myelocytic progenitor cells
CN113583965A (zh) * 2021-08-05 2021-11-02 大连干细胞与精准医学创新研究院 一种条件永生化人神经干细胞来源细胞膜纳米囊泡制剂及其制备方法和应用

Family Cites Families (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
EP0207147A4 (en) * 1984-12-21 1988-07-14 Techniclone Res Partners METHOD OF ELECTRICAL IMMORTALIZATION OF LYMPHOID CELLS.
DE3531430A1 (de) 1985-09-03 1987-03-05 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur gewinnung von komponenten aus einer fluessigkeit mit in raeumlich getrennten bereichen vorliegenden komponenten
US4963489A (en) * 1987-04-14 1990-10-16 Marrow-Tech, Inc. Three-dimensional cell and tissue culture system
US4900322A (en) 1986-09-22 1990-02-13 Adams James D Blood component pooling valve and kit
US5476996A (en) * 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5399493A (en) 1989-06-15 1995-03-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures
US5652122A (en) * 1989-12-21 1997-07-29 Frankel; Alan Nucleic acids encoding and methods of making tat-derived transport polypeptides
US5804604A (en) 1989-12-21 1998-09-08 Biogen, Inc. Tat-derived transport polypeptides and fusion proteins
US5849288A (en) * 1990-01-15 1998-12-15 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method for production of monoclonal antibodies in chimeric mice or rats having xenogeneic antibody-producing cells
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US6753162B1 (en) 1991-03-07 2004-06-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
US5851828A (en) 1991-03-07 1998-12-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
US6004811A (en) 1991-03-07 1999-12-21 The Massachussetts General Hospital Redirection of cellular immunity by protein tyrosine kinase chimeras
US5843728A (en) 1991-03-07 1998-12-01 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US5912170A (en) 1991-03-07 1999-06-15 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by protein-tyrosine kinase chimeras
NZ241855A (en) 1991-03-07 1994-04-27 Gen Hospital Corp Use of therapeutic cells to obtain cellular response to infection, tumours or autoimmune-generated cells, cells with chimaeric receptors (with binding component and destruction signal), dna encoding the receptor, vectors and antibodies to receptor
AU781922B2 (en) 1991-12-17 2005-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5289858A (en) 1991-12-18 1994-03-01 Abbott Laboratories System for accommodating withdrawal of liquid from a bulk supply
US8211422B2 (en) 1992-03-18 2012-07-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric receptor genes and cells transformed therewith
EP0656950B1 (en) 1992-08-21 1998-11-04 Biogen, Inc. Tat-derived transport polypeptides
US5580760A (en) 1993-02-22 1996-12-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services FUSE binding protein and cDNA therefor
EP0710283A4 (en) * 1993-07-22 1997-07-02 Merck & Co Inc THE EXPRESSION OF HUMAN INTERLEUKIN-1-g (b) IN A TRANSGENIC ANIMAL
US5599705A (en) 1993-11-16 1997-02-04 Cameron; Robert B. In vitro method for producing differentiated universally compatible mature human blood cells
EP0750458B1 (en) 1994-03-03 2003-08-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Terminal complement inhibitor fusion genes and proteins
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
US6713247B1 (en) * 1996-09-03 2004-03-30 Signal Pharmaceuticials, Inc. Human CNS cell lines and methods of use therefor
JP2002502376A (ja) 1997-05-21 2002-01-22 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 生物学的膜を横切る輸送を増強するための組成物および方法
EP0893493A3 (de) * 1997-07-21 2002-12-04 Aventis Pharma Deutschland GmbH Genetisch veränderte Zellen und deren Verwendung in der Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen
GB9720585D0 (en) 1997-09-26 1997-11-26 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
JP2002505077A (ja) 1997-12-10 2002-02-19 ワシントン大学 抗病原体システムおよびその使用方法
AU3056299A (en) 1998-04-08 1999-11-01 Shionogi & Co., Ltd. Methods for isolating osteoclast precursor cells and inducing the differentiation of the same into osteoclasts
US6835567B1 (en) * 1998-04-14 2004-12-28 Signal Pharmaceuticals, Inc. PNS cell lines and methods of use therefor
US6451558B1 (en) * 1998-08-03 2002-09-17 Novartis Ag Genes in the control of hematopoiesis
US6913925B1 (en) 1998-08-12 2005-07-05 Signal Pharmaceuticals Llc Human mesencephalon cell lines and methods of use therefor
CA2364690A1 (en) 1999-02-28 2000-10-19 Washington University Novel transduction molecules and methods for using same
WO2000059540A1 (en) * 1999-04-05 2000-10-12 Biocrystal Ltd. Assay kits and methods for immune complex-mediated activation involving shed antigens
JP2002541786A (ja) * 1999-04-12 2002-12-10 モデックス テラピューティク ソシエテ アノニム 遺伝子治療における使用のための一過性不死化細胞
US6451601B1 (en) * 1999-04-12 2002-09-17 Modex Therapeutiques, S.A. Transiently immortalized cells for use in gene therapy
US6358739B1 (en) 1999-04-12 2002-03-19 Modex Therapeutiques, S.A. Transiently immortalized cells
US7135287B1 (en) * 1999-10-02 2006-11-14 Biosite, Inc. Human antibodies
US7311920B1 (en) * 1999-10-08 2007-12-25 University Of Maryland Biotechnology Institute Virus coat protein/receptor chimeras and methods of use
AU1482101A (en) 1999-11-10 2001-06-06 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising renilla gfp
EP1103615A1 (en) 1999-11-25 2001-05-30 Universite De Geneve Vectors capable of immortalizing non-dividing cells and cells immortalized with said vectors
US20010049393A1 (en) * 1999-12-07 2001-12-06 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for defining MYC target genes and uses thereof
US20040016007A1 (en) * 2000-05-15 2004-01-22 Sonoko Habu Chimeric mouse having immunity constructed by using human cd34-positive cells and use thereof
US20020155127A1 (en) 2000-06-02 2002-10-24 Danher Wang Genetic vaccine against human immunodeficiency virus
US20030072794A1 (en) * 2000-06-09 2003-04-17 Teni Boulikas Encapsulation of plasmid DNA (lipogenes™) and therapeutic agents with nuclear localization signal/fusogenic peptide conjugates into targeted liposome complexes
US20070248618A1 (en) * 2004-03-16 2007-10-25 Cohen David I Tat-Based vaccine Compositions and Methods of Making and Using Same
CA2423093C (en) 2000-09-25 2013-09-17 Valentis, Inc. Improved system for regulation of transgene expression
JP2004521616A (ja) 2000-10-30 2004-07-22 カロバイオス， インコーポレイテッド 競合的選択による親和性成熟
AU2872202A (en) 2000-11-01 2002-05-15 Us Gov Health & Human Serv Expression vectors able to elicit improved immune response and methods of using same
EP1338198B1 (en) * 2000-12-01 2007-11-28 Central Institute For Experimental Animals Method of constructing mouse suitable for the take, differentiation and proliferation of heterogenous cells, mouse constructed by this method and use of the mouse
WO2002057436A2 (en) 2001-01-19 2002-07-25 Gendel Limited Red blood cell from a transgenic animal as vehicle for polypeptide delivery
JP3454818B1 (ja) * 2001-03-16 2003-10-06 直哉 小林 肝臓細胞の増殖方法、該方法により得られる肝臓細胞、およびその用途
DE60228082D1 (de) * 2001-05-31 2008-09-18 Novartis Ag Nten und neue liganden und pharmazeutische zusammensetzungen
MXPA04001974A (es) 2001-08-31 2004-07-16 Avidex Ltd Receptor de celula t soluble.
CN1408850A (zh) * 2001-09-18 2003-04-09 王虹 人血树突状细胞永生化技术
CN100506978C (zh) 2001-09-21 2009-07-01 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种新的造血干/祖细胞的富集方法及其体外定向诱导分化
GB0124391D0 (en) 2001-10-11 2001-11-28 Gene Expression Technologies L Control of gene expression
US20030147887A1 (en) 2001-11-02 2003-08-07 Shen-Wu Wang B-cell lymphoma specific antigen for use in diagnosis and treatment of B-cell malignancies
EP1321034A1 (en) * 2001-12-21 2003-06-25 Pfizer Products Inc. Disruption of the phosphodieterase 10 gene
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
US7670781B2 (en) 2002-01-03 2010-03-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an agent that provides a primary activation signal and another agent that provides a co-stimulatory signal
EP1572933A4 (en) 2002-02-13 2007-09-05 Univ Duke MODULATION OF IMMUNE RESPONSE BY POLYPEPTIDES OF RESPONSE TO STRESS BINDING TO NON PEPTIDES
CN1240439C (zh) 2002-03-28 2006-02-08 南京凯基生物科技发展有限公司 肿瘤基因开关药物
US7211191B2 (en) 2004-09-30 2007-05-01 Thermogenesis Corp. Blood component separation method and apparatus
WO2003089580A2 (en) 2002-04-16 2003-10-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cancer models
GB2387599B (en) 2002-04-17 2005-08-10 Jason Peter Brown Methods for producing antibodies
ATE453669T1 (de) 2002-05-10 2010-01-15 New Century Pharmaceuticals Ferritinfusionsproteine zur verwendung für impfstoffe und andere anwendungen
KR101196178B1 (ko) * 2002-05-16 2012-11-01 버베리안 노딕 에이/에스 Ｈｉｖ 조절/부속 단백질의 융합 단백질
EP1531666B1 (en) * 2002-05-29 2013-10-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Inducible eukaryotic expression system
AU2003265948B8 (en) 2002-09-06 2009-09-03 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Immunotherapy with in vitro-selected antigen-specific lymphocytes after nonmyeloablative lymphodepleting chemotherapy
CA2501870C (en) 2002-10-09 2013-07-02 Avidex Limited Single chain recombinant t cell receptors
EP1408114B1 (de) * 2002-10-11 2007-01-03 Imvision GmbH Moduläre Antigen-Transporter Moleküle (MAT-Moleküle) zur Modulierung von Immunreaktionen, zugehörige Konstrukte, Verfahren und Verwendungen
AU2003274633A1 (en) * 2002-10-15 2004-05-04 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Erythrocyte differentiation factor, gene encoding same, and methods of use thereof
NZ570811A (en) 2002-11-09 2009-11-27 Immunocore Ltd T cell receptor display
EP1570061A2 (en) 2002-12-05 2005-09-07 Imperial College Innovations Limited Control of apoptosis using a complex of an oligonucleotide and a regulatory peptide
GB0304068D0 (en) 2003-02-22 2003-03-26 Avidex Ltd Substances
US7482016B2 (en) 2003-03-19 2009-01-27 The J. David Gladstone Institutes Immunogenic compositions comprising HIV-1 acetylated Tat polypeptides
TW200502391A (en) 2003-05-08 2005-01-16 Xcyte Therapies Inc Generation and isolation of antigen-specific t cells
WO2005014785A2 (en) 2003-06-18 2005-02-17 The George Washington University Conditionally-immortalized hematopoietic progenitor cell lines
CA2529752A1 (en) * 2003-06-20 2005-09-15 The Regents Of The University Of California Polypeptide transduction and fusogenic peptides
IL161903A0 (en) 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
US7705049B2 (en) * 2004-01-21 2010-04-27 New York University Methods for treating non-melanoma cancers with PABA
JP2005232148A (ja) * 2004-02-03 2005-09-02 Technion Research & Development Foundation Ltd 神経保護剤としてプロパルギルアミンの使用
DE602005011617D1 (de) 2004-05-19 2009-01-22 Medigene Ltd Hochaffiner ny-eso-t-zellen-rezeptor
DE602005009825D1 (de) 2004-05-19 2008-10-30 Medigene Ltd Verfahren zur verbesserung von t-zellrezeptoren
ATE475669T1 (de) 2004-06-29 2010-08-15 Immunocore Ltd Einen modifizierten t-zellen-rezeptor exprimierende zellen
WO2006137836A2 (en) 2004-08-17 2006-12-28 Research Development Foundation Bacterial vector systems
GB0420963D0 (en) * 2004-09-21 2004-10-20 Reneuron Ltd Hepatocyte
US7767453B2 (en) * 2004-10-20 2010-08-03 Whitehead Institute For Biomedical Research Cultured hematopoietic stem cells and method for expansion and analysis thereof
WO2007067183A1 (en) 2005-12-09 2007-06-14 The Regents Of The University Of California Derivation of unlimited quantities of neutrophils or monocyte/dendritic cells
US20060156422A1 (en) * 2005-01-10 2006-07-13 Medical Research Council Methods and compositions for the generation of antibodies
US20070098715A1 (en) 2005-03-25 2007-05-03 Seth Ettenberg Antibodies against the tenascin major antigens
US8207136B2 (en) 2005-04-26 2012-06-26 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nucleoside compounds and methods of use thereof
WO2006125962A2 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Medigene Limited T cell receptors which specifically bind to vygfvracl-hla-a24
EP2056800B1 (en) * 2005-08-26 2015-12-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Therapy procedure for drug delivery for trigeminal pain
US20070047583A1 (en) 2005-08-29 2007-03-01 Siemens Aktiengesellschaft Method for using a short address in a packet header
IN2014DN06624A (ko) 2005-10-18 2015-07-10 Univ Colorado
JP4929288B2 (ja) * 2005-11-04 2012-05-09 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｎａｖ１．８遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法
EP1792627A1 (en) 2005-12-05 2007-06-06 ImVisioN AG Modulation of the immune response by administration of intralymphatic transduction allergen (ITAG-)-molecules
WO2008039818A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Modified t cell receptors and related materials and methods
EP2087000A2 (en) 2006-09-29 2009-08-12 Immunocore Ltd. T cell therapies
JP2010521170A (ja) 2007-03-13 2010-06-24 ナショナル ジューイッシュ ヘルス 抗体の生成方法
CA2699312A1 (en) 2007-11-02 2009-05-07 Taiga Biotechnologies, Inc. Compounds for treating abnormal cellular proliferation
EP3409762A1 (en) 2008-03-17 2018-12-05 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
AU2009246876B2 (en) 2008-05-16 2015-04-02 Taiga Biotechnologies, Inc. Antibodies and processes for preparing the same
WO2009149956A2 (en) 2008-06-13 2009-12-17 Life & Brain Gmbh Fusion protein and use thereof
DK2313496T3 (en) * 2008-07-21 2014-12-15 Taiga Biotechnologies Inc Anukleære differentiated cells, and method for preparation thereof
DK2966084T3 (en) 2008-08-28 2018-08-06 Taiga Biotechnologies Inc MODULATORS OF MYC, PROCEDURES FOR USING SAME AND PROCEDURES FOR IDENTIFYING SUBSTANCES MODULATING MYC
CN107523587A (zh) 2008-11-06 2017-12-29 印第安纳大学研究与技术公司 增强造血干细胞植入过程的材料和方法
CA2743669C (en) 2008-11-24 2018-10-16 Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Fuer Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) High affinity t cell receptor and use thereof
WO2011100477A2 (en) 2010-02-10 2011-08-18 Taiga Biotechnologies, Inc. Antibodies and processes for preparing the same
US20120107317A1 (en) 2010-10-27 2012-05-03 The University Of Hong Kong Use of cytoplasmic c-myc for regulating immune responses
US20120244133A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Methods of growing tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable containers
CA2848209C (en) 2011-09-15 2021-06-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services T cell receptors recognizing hla-a1- or hla-cw7-restricted mage
JP6251734B2 (ja) 2012-05-03 2017-12-27 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター 親和性増強型ｔ細胞受容体およびその作製方法
DE102012209673A1 (de) 2012-06-08 2013-12-24 Artcline Gmbh Verfahren zum Herstellen einer Leukozytenpräparation und Leukozytenpräparation
SG11201500429QA (en) 2012-07-20 2015-03-30 Taiga Biotechnologies Inc Enhanced reconstitution and autoreconstitution of the hematopoietic compartment
SG10201700442QA (en) 2012-07-27 2017-03-30 Univ Illinois Engineering t-cell receptors
US20140109246A1 (en) 2012-09-24 2014-04-17 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods of generating xenochimaeric mice with tumor and hematopoietic system from the same heterologous species
GB2508414A (en) 2012-11-30 2014-06-04 Max Delbrueck Centrum Tumour specific T cell receptors (TCRs)
JP6257655B2 (ja) 2013-03-01 2018-01-10 アメリカ合衆国 末梢血から腫瘍反応性ｔ細胞の濃縮された集団を作製する方法
RU2671897C2 (ru) 2013-03-01 2018-11-07 Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари, Департмент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез Способы получения из опухоли обогащенных популяций реактивных в отношении опухоли т-клеток
US9365825B2 (en) 2013-03-11 2016-06-14 Taiga Biotechnologies, Inc. Expansion of adult stem cells in vitro
US10272115B2 (en) 2013-03-11 2019-04-30 Taiga Biotechnologies, Inc. Production and use of red blood cells
KR20160145186A (ko) 2014-04-24 2016-12-19 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 입양 세포 요법 생성물을 생성하기 위한 유도 만능 줄기 세포의 응용
ES2897707T3 (es) 2014-12-24 2022-03-02 Neximmune Inc Composiciones de nanopartículas y procedimientos para la inmunoterapia
EP3402814B1 (en) 2016-01-15 2021-04-21 Berkeley Lights, Inc. Methods of producing patient-specific anti-cancer therapeutics and methods of treatment therefor
US10149898B2 (en) 2017-08-03 2018-12-11 Taiga Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for the treatment of melanoma

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150009682A (ko) * 2013-07-17 2015-01-27 아주대학교산학협력단 RGMc를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 유도용 배지 조성물 및 이를 이용한 줄기세포의 유도방법

Also Published As

Publication number Publication date
JP6655050B2 (ja) 2020-02-26
US20150240205A1 (en) 2015-08-27
IL286053B (en) 2022-11-01
CN105483088A (zh) 2016-04-13
JP2017221219A (ja) 2017-12-21
IL266009B (en) 2021-06-30
JP2022065146A (ja) 2022-04-26
AU2006304392B2 (en) 2014-05-01
US20190024051A1 (en) 2019-01-24
US20220145253A1 (en) 2022-05-12
JP6797221B2 (ja) 2020-12-09
US20100297763A1 (en) 2010-11-25
IL286053A (en) 2021-10-31
US9796961B2 (en) 2017-10-24
IL286053B2 (en) 2023-03-01
IN2014DN06624A (ko) 2015-07-10
CA3065947A1 (en) 2007-04-26
US9150831B2 (en) 2015-10-06
CA2626525A1 (en) 2007-04-26
IL190946A (en) 2016-09-29
ATE491022T1 (de) 2010-12-15
CN105483088B (zh) 2021-05-28
IL266009A (en) 2019-05-30
US10760055B2 (en) 2020-09-01
IL256512B (en) 2019-05-30
KR101441693B1 (ko) 2014-09-25
IL224494B (en) 2018-01-31
JP5726148B2 (ja) 2015-05-27
WO2007047583A3 (en) 2007-11-22
JP6302356B2 (ja) 2018-03-28
CA3065947C (en) 2023-03-07
KR20130131488A (ko) 2013-12-03
EP1942739B1 (en) 2010-12-08
IL278426B (en) 2021-09-30
JP2014158503A (ja) 2014-09-04
EP1942739A4 (en) 2009-09-16
JP2009511081A (ja) 2009-03-19
DE602006018768D1 (de) 2011-01-20
IL296832A (en) 2022-11-01
IL190946A0 (en) 2008-12-29
CN101330830A (zh) 2008-12-24
HK1126623A1 (zh) 2009-09-11
EP1942739A2 (en) 2008-07-16
WO2007047583A2 (en) 2007-04-26
CN101330830B (zh) 2016-01-20
JP2016129515A (ja) 2016-07-21
JP2013017486A (ja) 2013-01-31
US20160040129A1 (en) 2016-02-11
JP2019062916A (ja) 2019-04-25
US20070116691A1 (en) 2007-05-24
KR101441843B1 (ko) 2014-09-17
HK1222890A1 (zh) 2017-07-14
JP2020174675A (ja) 2020-10-29
US8883507B2 (en) 2014-11-11
US20200308545A1 (en) 2020-10-01
JP7078673B2 (ja) 2022-05-31
CA2626525C (en) 2020-03-10
AU2006304392A1 (en) 2007-04-26
AU2006304392A8 (en) 2008-05-29
IL256512A (en) 2018-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101441843B1 (ko) 조건부 불멸화 장기 줄기 세포 및 상기 세포의 제조 및 사용 방법
Domen et al. Self-renewal, differentiation or death: regulation and manipulation of hematopoietic stem cell fate
US6555318B2 (en) Method for identification of cell growth or differentiation factors
KR101985271B1 (ko) Trail 및 cd를 발현하는 중간엽줄기세포 및 이의 용도
JPH05504066A (ja) 遺伝子導入動物、それから得られる細胞および細胞系、およびその使用
KR101966057B1 (ko) 간세포성장인자를 발현하는 중간엽줄기세포 및 이의 용도
US6777203B1 (en) Telomerase promoter driving expression of therapeutic gene sequences
CN115715203A (zh) 对细胞进行基因修饰以递送治疗性蛋白质的方法
KR20200013753A (ko) 뇌유래-신경영양인자를 발현하는 중간엽줄기세포 및 이의 용도
Niyibizi et al. Potential implications of cell therapy for osteogenesis imperfecta
KR20220077916A (ko) 세포를 형질세포양 수지상 세포 또는 인터페론 유형 i-생산 세포로 재프로그래밍하기 위한 조성물, 방법 및 이의 용도
US20060057718A1 (en) Stem cell and progenitor cell expansion
CN111565731B (zh) 治疗缺血性疾病的方法
CN115803435A (zh) 用于在细胞基因组中靶向插入外源序列的方法
CN116783284A (zh) 用于细胞重编程的组合物、构建体和载体
Yang Analyses of terminal deoxynucleotidyl transferase: Probing the enzyme active site and gene promoter

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
A107 Divisional application of patent
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170901

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180831

Year of fee payment: 5