KR20070110106A - 비타민 ｋ 의존성 단백질 발현의 개선을 위한 비타민 ｋ에폭사이드 환원효소 소단위 １의 재조합 동시발현 - Google Patents

비타민 ｋ 의존성 단백질 발현의 개선을 위한 비타민 ｋ에폭사이드 환원효소 소단위 １의 재조합 동시발현 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비타민 K 환원효소 복합체 소단위 1(vitamin K reductase complex subunit 1, VKORC1)을 코딩하는 재조합 핵산, 및 비타민 K 의존성(vitamin K dependent, VKD) 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 함유하는, 재조합 VKORC1 및 재조합 VKD 단백질이 둘다 발현되는 숙주 유기체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 핵산을 함유하는 세포를 포함하는 세포 배양 시스템, 및 적합한 시스템에서 배양되는 숙주 유기체에서 재조합 VKD 단백질 발현의 생산성을 개선하기 위한 방법에 관한 것이다.
비타민 케이 의존성 단백질, 비타민 케이 환원효소 복합체 소단위 1, VKKORC1, VKD

Description

비타민 Ｋ 의존성 단백질 발현의 개선을 위한 비타민 Ｋ 에폭사이드 환원효소 소단위 １의 재조합 동시발현{RECOMBINANT CO-EXPRESSION OF VITAMIN K EPOXIDE REDUCTASE SUBUNIT 1 TO IMPROVE VITAMIN K DEPENDENT PROTEIN EXPRESSION}
본 발명은 비타민 K 환원효소 복합체 소단위 1(vitamin K reductase complex subunit 1, VKORC1)를 코딩하는 재조합 핵산 및 비타민 K 의존성(vitamin K dependent, VKD) 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 함유하며, 재조합 VKORC1 및 재조합 VKD 단백질을 둘다 발현하는 숙주 유기체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 핵산을 함유하는 세포를 포함하는 세포 배양 시스템, 및 적합한 시스템에서 배양되는 숙주 유기체에서 발현된 재조합 VKD 단백질 발현의 생산성을 개선하기 위한 방법에 관한 것이다.
비타민 K 에폭사이드 환원효소 복합체(VKORC)는 비타민 K 의존성(VKD) 단백질의 번역후 γ-카르복실화에 필수적인 보조인자인 비타민 K의 환원된 형태를 재순환시킨다(문헌[Nelsestuen, G. L., Zytkovicz, T. H., & Howard, J. B. (1974) The mode of action of vitamin K. Identification of gamma-carboxyglutamic acid as a component of prothrombin. J. Biol. Chem., 249, 6347-6350]). VKORC1 유전자는 최근에 밝혀졌으며, 문헌[Rost, S., Fregin, A., Ivaskevicius, V., Conzelmann, E., Hotnagel, K. Pelz, H. J., Lappegard, K., Seifried, E., Scharrer, I., Tuddenham, E. G., Muller, C. R., Strom, T. M., & Oldenburg, J. (2004) Mutations in VKORC1 cause warfarin resistance and multiple coagulation factor deficiency type 2. Nature, 427, 537-541])에 기재되어 있다.
VKD 단백질은 혈액 응고 인자의 경우에서 음전하를 띤 인지질 막에 대한 Ca-의존성 결합과 같은 특정한 생화학적 및 생리학적 특성을 부여하는 γ-카르복실화 글루타메이트(gla) 잔기를 함유한다(문헌[Mann, K. G., Jenny, R. J., & Krishnaswamy, S. (1988) Cofactor proteins in the assembly and expression of blood clotting enzyme complexes. Annu. Rev. Biochem., 57, 915-956]). VKD 단백질은 전구응고제 인자 II, VII, IX 및 X, 및 항응고제 단백질 C, S 및 Z를 포함한다. 하나의 공지된 효소 반응에 제한되는 것이 아니라, γ-카르복실라제 활성은 모든 포유동물 조직에 존재한다(문헌[Vermeer, C. & de Boer-van den Berg MA(1985) Vitamin K-dependent carboxylase. Haematologia(Budap.), 18, 71-97]). γ-카르복실라제는 보조인자로서 환원된 비타민 K를 사용하여 카르복실화 반응을 촉진한다.
글루탐산 잔기의 비타민 K 의존성(VKD) 감마 카르복실화는 지혈, 성장 조절, 칼슘 지혈 및 신호전달에서 역할을 하는 생물학적으로 활성있는 VKD 단백질의 생성에 요구되는 번역후 단백질 변형이다(문헌[Furie, B., Bouchard, B. A., & Furie, B. C.(1999) Vitamin K-denpendent biosynthesis of gamma-carboxyglutamic acid. Blood, 93, 1798-1808; Berkner, K. L.(2000) The vitamin K-dependent carboxylase. J. Nutr., 130, 1877-1880]). 이들 단백질의 N-말단 Gla-도메인의 몇몇 글루탐산 잔기는 카르복실화에 의해 변형되어 칼슘-의존성 인지질 막 상호작용이 가능해진다(문헌[Stenflo, J. & Suttie, J. W.(1977) Vitamin K-dependent formation of gamma-carboxyglutamic acod. Annu. Rev. Biochem., 46, 157-172; Suttie, J. W. (1980) Mechanism of action of vitamin K: synthesis of gamma-carboxyglutamic acid. CRC Crit Rev. Biochem., 8, 191-223]). 이들 다중 감마-글루타메이트(Gla) 잔기는 Gla 도메인이 인지질 막 표면에 결합하면서 VKD 단백질의 활성에 필요한 입체형태 변화를 겪도록 한다(문헌[Nelsestuen, G. L., Broderius, M., & Martin, G. (1976) Role of gamma-carboxyglutamic acid. Cation specificity of prothrombin and factor X-phospholipid binding. J. Biol. Chem., 251, 6886-6893; Zwaal, R. F., Comfurius, P., & Bevers, E. M. (1998) Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim. Biophys. Acta, 1376, 433-453]).
VKD 혈액 응고 단백질은 칼슘 이온의 존재하에 막 표면에 결합하기 위하여 완전한 또는 거의 완전한 카르복실화를 필요로 한다(문헌[Furie, B. & Furie, B. C. (1988) The molecular basis of blood coagulation. Cell, 53, 505-518]). 비타민 K 길항제는 감마 카르복실화를 저해하면, 카르복실화되지 않은 VKD 단백질은 칼슘 의존성 구조를 형성할 수 없어서 인지질 막에 대한 친화성이 낮아지고 활성이 낮아진다(문헌[Esmon, C. T., Sadowski, J. A., & Suttie, J. W.(1975a) A new carboxylation reaction. The vitamin K-dependent incorporation of H-14-CO3- into prothrombin. J. Biol. Chem., 250, 4744-4748; Esmon, C. T., Suttie, J. W., & Jackson, C. M.(1975b) The functional significance of vitamin K action. Difference in phospholipid binding between normal and abnormal prothrombin. J. Biol. Chem., 250, 4095-4099; Malhotra, O. P., Nesheim, M. E., & Mann, K. G.(1985) The kinetics of activation of normal and gamma-carboxyglutamic acid-deficient prothrombins. J. Biol. Chem., 260, 279-287]). 예를 들어, 전체 단백질 활성 손실에 대한 기여는 VKD 단백질 활성화된 인간 단백질 C의 10개의 각 Gla-잔기의 부재를 원인으로 할 수 있다(문헌[Zhang, L., Jhingan, A., & Castellino, F. J. (1992) Role of individual gamma-carboxyglutamic acid residues of activated human protein C in defining its in vitro anticoagulant activity. Blood, 80, 942-952]). B형 혈우병 환자에서 발견되는 비카르복실화 인자 IX 돌연변이체의 전구응고 활성의 결손에 의해, 손상된 칼슘-유도성 입체형태가 변화하고 인지질 소포체에 결합하는 능력이 손실될 수 있다(문헌[Ware, J., Diuguid, D. L., Liebman, H. A., Rabiet, M. J., Kasper, C. K., Furie, B. C., Furie, B., & Stafford, D. W.(1989) Factor IX San Dimas. Substitution of glutamine for Arg-4 in the propeptide leads to incomplete gamma-carboxylation and altered phospholipid binding properties. J. Biol. Chem., 264, 11401-11406]).
재조합 인자 IX의 경우에, 차이니즈 햄스터(Chinese hamster) 난소 세포에서 카르복실화 능력이 더 높은 생산 수준에서 포화된다는 사실에 의해 기능성 인자 IX의 발현이 제한되는 것으로 나타났다(문헌[Kaufman, R. J., Wasley, L. C., Furie, B. C., Furie, B., & Shoemaker, C. B.(1986) Expression, purificaiton, and characterization of recombinant gamma-carboxylated factor IX synthesized in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem., 261, 9622-9628; Derian, C. K., VanDusen, W., Przysiecki, C. T., Walsh, P. N., Berkner, K. L., Kaufman, R. J., & Friedman, P. A. (1989) Inhibitors of 2-ketoglutarate-dependent dioxygenases block aspartyl beta-hydroxylation of recombinant human factor IX in several mammalian expression systems. J. Biol. Chem., 264, 6615-6618]).
인간 인자 IX의 경우에 γ-카르복실화된 단백질의 재조합 과발현은 더 높은 분비율에서 프로펩티드 절단 및 γ-카르복실화를 제한시키므로, 비타민 K가 나머지 배양 배지에서 이용가능한 경우에도 gla 잔기가 일부 존재하는 단백질이 생성된다. 이로 인해 활성이 감소된 VKD 재조합 단백질의 변이체가 분비된다. 배지에 비타민 K를 첨가하는 것은 인자 IX 활성을 높은 발현 수준으로 개선시키지 않았다. 활성 인자 IX를 유도하기 위해 필요한 세포 배지에 존재하는 비타민 K는 5 ㎍/㎖에서 포화에 이르는 것으로 나타났다. 이 수준 아래에서는, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포로부터 얻은 활성 인자 IX의 분비량이 비타민 K 농도에 의존하였다(문헌[Kaufman, R. J., Wasley, L. C., Furie, B. C., Furie, B., & Shoemaker, C. B. (1986) Expression, purification, and characterization of recombinant gamma-carboxylated factor IX synthesized in Chinese hamster ovary cell. J. Bio. Chem., 261, 9622-9628]).
지금까지 VKD 단백질을 번역후에 변형하는 세포 용량에 대한 상기 제한을 극 복하기 위하여, 낮은 발현 수준을 갖는 세포주를 선택하여야 했다. 효소를 절단하는 프로펩디드인 푸린을 동시발현시키면 이 프로펩디드의 완전 절단이 일어나지만(문헌[Wasley, L. C., Rehemtulla, A., Bristol, J. A., & Kaufman, R. J.(1983) PACE/furin can process the vitamin K-dependent pro-factor IX precursor within the secretory pathway. J. Biol. Chem., 268, 8458-8465]), γ-카르복실화 개선에는 관련되지 않는다. 다른 접근법으로서 γ-카르복실라제의 과발현은 인자 IX의 경우에 단백질 분비를 개선시키지 않았다(문헌[Rehemtulla, A., Roth, D. A., Wasley, L. C., Kuliopuols, A., Walsh, C. T., Furie, B., Furie, B. C., & Kaufman, R. J. (1993) In vitro and in vivo functional characterization of bovine vitamin K-dependent gamma-carboxylase expressed in Chinese hamster ovary cells., Proc. Natl. Aca. Sci. U.S.A., 90, 4611-4615]). 카르복실화 반응에서 카르복실라제에 결합되는 인자 IX 분자는 효과적으로 방출되지 않는다. 이로부터 γ-카르복실화 부위에서의 환원된 비타민 K 형태의 공급이 이 반응의 제한 단계라고 결론지어졌다(문헌[Hallgren, K. W., Hommema, E. L., McNally, B. A., & Berkner, K. L.(2002) Carboxylase overexpression effects full carboxylation but poor release and secretion of factor IX: implications for the release of vitamin K-dependent protens. Biochemistry, 41, 15045-15055]).
따라서, 숙주 유기체에서의 발현, 특히 VKD 단백질의 재조합 발현을 안정화하여 발현된 VKD 단백질의 분비율 및/또는 분비 활성을 개선시키는 것이 매우 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 VKORC1의 동시발현에 의해 (특히 재조합) VKD 단백질 발현의 생산성을 개선시키기 위한 신규한 시스템 및 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 비타민 K 환원효소 복합체 소단위 1(VKORC1) 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산, 및 비타민 K 의존성(VKD) 단백질 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산을 함유하며, 재조합 VKORC1 및 재조합 VKD 단백질을 둘다 발현하는 숙주 유기체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 VKORC1 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산 및 VKD 단백질 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산을 함유하는 세포를 포함하는 세포 배양 시스템(이 세포에서 재조합 VKORC1 및 재조합 VKD 단백질이 둘다 발현됨), 숙주 유기체에서 VKORC1을 재조합에 의해 동시발현함으로써 재조합 VKD 단백질 발현 또는 그의 기능적 활성 유도체의 생산성을 개선시키는 방법, 및 숙주 유기체 또는 세포 배양 시스템에서 재조합 VKD 발현의 생산성을 개선시키기 위한, VKORC1의 재조합 발현의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 양상은 비타민 K 환원효소 복합체 소단위 1(VKORC1) 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산, 및 비타민 K 의존성(VKD) 단백질 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산을 함유하며, 재조합 VKORC1 및 재조합 VKD 단백질을 둘다 발현하는 숙주 유기체에 관한 것이다.
본원에 사용된 "기능적 활성 유도체"란 용어는 VKORC1 및 VKD 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩티드를 뜻한다. 기능적 활성 유도체의 폴리펩디드 서열은 아미노산의 결손, 첨가 및/또는 치환을 함유할 수 있는데, 아미노산의 부재, 존재 및/또는 치환은 각각 폴리펩디드, 예컨대 단백질의 생물학적 활성에 기여하지 않는 폴리펩디드 서열의 일부분에 존재하는 아미노산의 활성에는 임의의 실질적인 불리한 영향을 주지 않는다. 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성을 변화시키지 않는 개개의 폴리펩티드 서열의 아미노산의 소수의 결손, 첨가 및/또는 치환도 또한 기능적 활성 유도체로서 본 출원에 포함된다.
하기에서 "(재조합) VKORC1 또는 그의 기능적 활성 유도체" 및 "(재조합) VKD 단백질 또는 그의 기능적 활성 유도체"란 표현은 또한 각각 "(r)VKORC1" 및 "(r)VKD 단백질"로 부를 것이다.
본 발명의 재조합 핵산은, 예컨대 재조합 DNA-기술, RNA의 역전사 및/또는 DNA의 증폭에 의해 또는 세균 번식에 의해, 재조합 핵산의 생산 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 얻어질 수 있다.
본 발명의 숙주 유기체는 생물학적으로 활성있는 rVKORC1 및 생물학적으로 활성있는 rVKD 단백질을 발현할 수 있는, 재조합 숙주 유기체를 포함한 임의의 숙주 유기체로부터 유도될 수 있다. 특히, 본 발명의 숙주 유기체는 약리학적으로 활성있는 rVKD 단백질을 생성함을 특징으로 하는, 다세포 균주를 포함한 진핵 숙주 유기체일 수 있다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 숙주 유기체는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포, HEK293 세포, NSO 세포, Sp20 세포, Perc.6 세포, SkHep 세포, HepG2 세포, BHK 세포, HeLa 세포, Vero 세포 및 COS 세포로 이루어진 군에서 선택되는 포유동물 세포주로부터 유도되는 세포이다. 본 발명의 특정한 예에서, 숙주 유기체는 CHO 세포 또는 HEK293 세포로부터 유도되는 세포이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명의 숙주 유기체에 함유되어 있는 rVKORC1을 코딩하는 핵산 또는 rVKD 단백질을 코딩하는 핵산, 또는 이들 둘다는 유도 발현, 일시 발현 및 영구 발현으로 이루어진 군에서 선택되는 발현 방식에 의해 발현된다. VKORC1 및/또는 VKD 단백질을 코딩하는 재조합 핵산의 발현을 위하여, 적합한, 바람직하게는 제어가능한 프로모터(promoter), 증강자(enhancer) 등과 같은 조절 시스템의 사용을 포함한, 당업계에 공지되어 있거나 상업적으로 입수가능한 임의의 발현 시스템을 사용할 수 있다.
본 발명의 숙주 유기체의 바람직한 실시양태에서, VKORC1을 코딩하는 재조합 핵산 또는 VKD 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 또는 이들 둘다를 본 발명의 숙주 유기체의 유전 물질에 안정하게 일체화한다.
본 발명의 숙주 유기체는 혈액 인자 또는 그의 기능적 활성 유도체와 같은 rVKD 단백질, 바람직하게는 인간 전구응고제 또는 항응고제 혈액 인자 또는 그의 기능적 활성 유도체의 개선된 발현에 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, rVKD 단백질은 출혈성 질병의 치료에 사용될 수 있는 약리학적으로 허용가능한 인간 전구응고제 혈액 인자이다.
본 발명의 일례로서 rVKD 단백질은 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 바람직하게는 인간 인자 IX, 및 인자 X를 포함한 전구응고제 혈액 인자; 또는 단백질 C, 단백질 S 및 단백질 Z를 포함한 항응고제 혈액 인자이다.
본 발명에 따라, 숙주 유기체는 VKORC1을 코딩하는 재조합 핵산 및 VKD 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 함유하는데, 이때 rVKORC1 및 rVKD 단백질이 둘다 숙주 유기체에서 발현되고, 재조합 VKD 단백질 발현의 생산성이 실질적으로 개선된다.
본원에 사용된 "재조합 VKD 단백질 발현의 생산성이 실질적으로 개선된다"라는 말은, 재조합 발현된 VKD 단백질 또는 그의 기능적 활성 유도체의 양, 분비율, 활성 및/또는 안정성이, rVKORC1을 동시발현하지 않는 숙주 유기체에서의 rVKD의 발현에 비하여 실질적으로 증가함을 뜻한다.
재조합 VKD 단백질 발현의 생산성의 개선은, 예컨대 배양 배지로부터 단리하거나 또는 숙주 유기체를 수획하고 발현된 단백질을, 예컨대 전기영동, 크로마토그래피 또는 면역흡착에 의해 분석함을 포함한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, rVKD 단백질의 발현은 효소면역측정법(enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA)과 같은 임의의 공지된 효소 면역 분석에 의해 검츨된다. 또 다르게는, rVKD 단백질의 보전성 및 활성은 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplasin time, APTT)을 측정함으로써 평가될 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 VKORC1을 코딩하는 재조합 핵산 및 VKD 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 함유하는 세포를 포함하며, rVKORC1 및 rVKD 단백질을 둘다 발현하는 세포 배양 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 세포 배양 시스템은 생물학적으로 활성있는 rVKORC1 및 생물학적으로 활성있는 rVKD 단백질을 발현할 수 있는 세포를 함유하는 임의의 세포 배양 시스템을 포함할 수 있다. 적합한 세포의 예는 전술되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 시스템은 1종 이상의 약리학적으로 활성있는 rVKD 단백질을 생성함을 특징으로 하는 진핵세포 시스템이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 시스템은 상기 정의된 숙주 유기체를 포함한다.
세포를 연속식 또는 회분식으로 배양함을 포함하는, 본 발명의 세포 배양 시스템에서 세포를 배양하는데 사용되는 배지, 시약 및 조건에는 특별한 제한이 없다. 본 발명의 하나의 실시양태에서 세포는 혈청 비함유 또는 혈청 함유, 및 단백질 비함유 조건하에 배양된다. 본 발명의 또 하나의 실시양태에서, VKORC1 또는 VKD 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 함유하는 세포를, 예컨대 선택적 배지를 사용함으로써 선택적으로 증식시키는 조건을 사용한다.
선택된 숙주 유기체의 세포에 의해 발현되고, 사용된 형질감염/벡터 시스템에 의존하여 세포에 함유되어 있거나 세포를 배양하기 위한 배지에 분비되는 바람직한 rVKD 단백질을, 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 세포 배양 시스템으로부터 단리/회수할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양상은, (a) 숙주 유기체를 제공하는 단계; (b) 단계 (a)의 숙주 유기체에 VKD 단백질 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산을 삽입하는 단계; (c) 단계 (a)의 숙주 유기체에 VKORC1을 코딩하는 재조합 핵산을 삽입하는 단계; 및 (d) 단계 (b) 및 (c)의 재조합 핵산을 발현하는 단계를 포함하는, 숙주 유기체에서 발현되는 재조합 VKD 단백질의 비활성을 개선하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, VKORC1 또는 VKD 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 동시 형질감염을 통해 동시에 숙주 유기체에 삽입한다. 또 다르게는, 상기 재조합 핵산을 후속 형질감염에 의해 순차적으로 숙주 유기체에 삽입한다.
본 발명에 따라 사용되는 재조합 핵산은 숙주 유기체내로의 형질감염에 적합한, 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함한 임의의 형태 및 시스템에 함유될 수 있다. VKORC1 및 VKD 단백질을 각각 코딩하는 재조합 핵산은 하나의 벡터 분자에 둘다 존재하거나 또는 하나의 벡터 분자에 각각 존재할 수 있고, 이때 상이한 두 벡터 분자는 동일하거나 상이할 수 있다. 재조합 핵산의 형질감염은 사용되는 형질감염 시스템에 좌우되고, 숙주 유기체(예를 들어, 진핵 세포)를 형질감염시키기 위하여 당업계에 공지되어 있거나 상업적으로 입수가능한, 전기영동, 침전 또는 현미주사를 포함한 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 양상은, (a) 숙주 유기체의 유전 물질, 바람직하게는 숙주 유기체의 게놈에 일체화되는 VKD 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 갖는 숙주 유기체를 제공하는 단계; (b) 단계 (a)의 숙주 유기체에 VKORC1을 코딩하는 재조합 핵산을 삽입하는 단계; 및 (c) 단계 (a) 및 (b)의 핵산을 발현하는 단계를 포함하는, 숙주 유기체에서의 재조합 VKD 단백질 발현의 생산성을 개선하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, VKD 단백질을 코딩하는 재조합 핵산은 안정하게 발현된다.
본 발명의 또 하나의 양상은, (a) 숙주 유기체의 게놈에 일체화되는 VKORC1을 코딩하는 재조합 핵산을 갖는 숙주 유기체를 제공하는 단계; (b) 단계 (a)의 숙주 유기체에 VKD 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 삽입하는 단계; 및 (c) 단계 (a) 및 (b)의 핵산을 발현하는 단계를 포함하는, 숙주 유기체에서의 재조합 VKD 단백질 발현의 생산성을 개선하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, VKORC1을 코딩하는 재조합 핵산이 안정하게 발현된다.
본 발명에 따라, 상기 정의된 숙주 유기체 또는 상기 정의된 세포 배양 시스템을, 재조합 VKD 단백질 발현의 생산성을 rVKORC1의 동시발현에 의해 놀라울 정도로 개선시키는데 사용할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 목적은, VKORC1을 코딩하는 재조합 핵산 및 rVKD 단백질을 코딩하는 재조합 핵산을 삽입하고, 이들 핵산을 발현하고, rVKD 단백질을 회수함으로써 얻을 수 있는 rVKD 단백질을 제공하는 것이다.
도 1은 CHO-유도된 rFIX 생성 세포주를 rVKORC1(1) 또는 빈 벡터(2)로 일시 형질감염시킨 후, ELISA 값을 토대로 계산된 rFIX의 농도(ng/㎖)(수직 축)(도 1A) 및 응고 활성(APTT) 값을 토대로 계산된 rFIX의 비활성(mU/㎖)(수직 축)(도 1B)을 나타낸다. 24 시간 후에 혈청 비함유 세포 배양 상층액을 모았다.
도 2는 CHO-유도된 rFIX 생성 세포주를 rVKORC1(1) 또는 빈 벡터(2)로 일시 형질감염시킨 후, ELISA 값을 토대로 계산된 rFIX의 비생산성(ng rFIX/106 세포/일)(수직 축)(도 2A) 및 응고 활성(APTT) 값을 토대로 계산된 rFIX의 비활성(mU rFIX/106 세포/일)(수직 축)(도 2B)을 나타낸다. 24 시간 후에 혈청 비함유 세포 배양 상층액을 모았다.
도 3은 HEK293-유도된 rFIX 생성 세포주를 rVKORC1(1) 또는 빈 벡터(2)로 일시 형질감염시킨 후, ELISA 값을 토대로 계산된 rFIX의 농도(ng/㎖)(수직 축)(도 3A) 및 응고 활성(APTT) 값을 토대로 계산된 rFIX의 비활성(mU/㎖)(도 3B)을 나타낸다. 24 시간 후에 혈청 비함유 세포 배양 상층액을 모았다.
도 4는 HEK293-유도된 rFIX 생성 세포주를 rVKORC1(1) 또는 빈 벡터(2)로 일시 형질감염시킨 후, ELISA 값을 토대로 계산된 rFIX의 비생산성(ng rFIX/106 세포/일)(수직 축)(도 4A) 및 응고 활성(APTT) 값을 토대로 계산된 rFIX의 비활성(mU rFIX/106 세포/일)(수직 축)(도 4B)을 나타낸다. 24 시간 후에 혈청 비함유 세포 배양 상층액을 모았다.
도 5는 CHO-유도된 rFIX 생성 세포주를 rVKORC1(1) 또는 빈 벡터(2)로 일시 형질감염시킨 후(도 5A) 및 HEK293-유도된 rFIX 생성 세포주를 rVKORC1(1) 또는 빈 벡터(2)로 일시 형질감염시킨 후(도 5B), rFIX의 응고 비활성(%)을 나타낸다.
도 6은 rFVII를 안정하게 발현하는 CHO-유도된 세포주에서의 rVKORC1의 일시 발현을 나타낸다. 이 세포주는 VKORC1을 코딩하는 벡터 또는 대조물로서 VKORC1이 없는 동일한 벡터("빈 벡터")에 의해 일시 형질감염된다. 형질감염은 중복 수행하고, 그 후 5 가지의 상이한 비타민 K1 농도를 사용한다. 비타민 K 농도에 대한 배양물 상층액내 rFVII-생산성 및 rFVII-활성의 측정 결과를 나타내었다. 도 6A는 ELISA 측정에 근거한 생산성 값을 나타내고, 도 6B는 응고 활성 측정에 근거한 생산성 값을 나타내고, 도 6C는 ELISA에 의해 결정된, ㎍당 FVII-응고 단위에 근거한 FVII 비활성 계산을 나타낸다.
도 7은 rFVII을 안정하게 발현하는 CHO-유도 및 HEK293-유도 세포주내에서의 rVKORC1의 일시 발현을 나타낸다. 이들 세포주는 rVKORC1을 코딩하는 벡터 또는 대조물로서 rVKORC1이 없는 동일한 벡터("빈 벡터")에 의해 일시 형질감염된다. 형질감염은 중복 수행한다. 배양물 상층액의 ELISA, 및 FVII-응고 및 FVIIa-응고에 근거한 rFVII-생산성 및 rFVII-활성의 측정 결과가 나타나 있다. 도 7A: CHO-유도된 세포주. 도 7B: HEK293-유도된 세포주.
도 8은 CHO-DHFR- 숙주 유기체내 rFVII 및 rVKORC의 안정한 비시스트로닉(bicistronic) 동시발현을 나타낸다. 선택된 클론의 rFVII-생산성은 MTX 양의 증가에 따른 유전자 동시 증폭에 의해 일어난다. 두 상이한 인간 rFVII-코딩 발현 벡터를 DHFR-코딩 선택 플라스미드로 동시 형질감염시켰다. 도 8A: rFVII 및 rVKORC1의 비시스트로닉 동시발현을 일으키는 벡터 구조물로 형질감염된 83 개의 클론. 도 8B: rFVII-코딩 벡터로 동시 형질감염된 133 개의 클론.
도 9는 서브클로닝(subcloning) 및 유전자 증폭에 의한 안정한 형질감염 후 생성되는 rVKORC1 비시스트로닉 동시발현의 존재하 및 부재하에 rFVII을 생성하는 CHO-유도된 클론의 생산성 및 비활성 값을 나타낸다. rVKORC1 동시발현의 부재하의 133 개의 클론과 rVKORC1 동시발현의 존재하의 83 개의 클론을, 분비된 rFVII의 ELISA 및 FVII-응고 측정에 근거한 rFVII 생산성 및 응고 비활성에 관하여 비교한다.
도 10은 CHO-유도된 세포주로부터 단리된 mRNA 수준에서의 유전자 발현의 노던 블롯(northern blot) 분석의 예를 나타낸다. 레인 1: CHO-DHFR_ 비형질감염 세포주. 레인 2: rFVII 클론. 레인 3 및 4: 실시예 4에 기술된 바와 같이 rFVII- 및 rVKORC1-코딩 플라스미드 벡터로 후속 형질감염된 두 클론. 레인 5 내지 7: 실시예 3에 기술된 바와 같이 IRES에 의해 결합된 rFVII 및 rVKORC1 서열을 갖는 비시스트로닉 mRNA를 코딩하는 하나의 벡터로 형질감염된 클론. 패널(panel) A, B 및 C는 3 가지의 상이한 프로브로 혼성화한 후에 전개된 동일한 블롯을 나타낸다. A) 인간 VKORC1에 대한 프로브. B) 인간 FVII에 대한 프로브. C) 햄스터 GAPDH에 대한 프로브. 동정된 mRNA의 명칭 및 크기가 제공되어 있다.
도 11은 rFVII-생성 세포주를 rVKORC1-코딩 플라스미드 또는 대조물 플라스미드로 2차 형질감염시킨 후 단리한, 안정하게 형질감염된 CHO- 및 HEK293-유도된 세포 클론의 rFVII 발현 수준을 나타낸다. 대조물은 빈 숙주 벡터이다. 생산성 값은 분비된 rFVII의 ELISA 측정값에 근거한다. 도 11A: CHO-유도된 세포 클론. 도 11B: HEK293-유도된 세포 클론.
도 12는 rFVII-생성 세포주를 rVKORC1-코딩 플라스미드 또는 대조물 플라스미드로 2차 형질감염시킨 후 단리한, 안정하게 형질감염된 CHO- 및 HEK293-유도된 세포 클론의 비활성 값에 대하여 비교한 rFVII 발현 수준을 나타낸다. 대조물은 빈 숙주 벡터이다. 생산성 값은 분비된 rFVII의 ELISA 측정값에 근거한다. 비활성 값은 ELISA에 의해 결정된 FVII ㎍당 FVII-응고 단위로서 계산된다. 도 12A: CHO-유도된 세포 클론. 도 12B: HEK293-유도된 세포 클론.
본 발명을 하기 실시예에서 더 설명하는데, 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: rFIX-생성 HEK293- 및 CHO-유도 세포주의 일시 형질감염 및 동시발현
재조합 인자 IX(rFIX)의 발현은 강력한 바이러스 프로모터의 제어하에 DNA 서열을 코딩하는 인간 인자 IX(FIX)를 함유하는 발현 플라스미드를 적당한 형질감염 방법에 의해 포유동물 숙주 세포주에 도입하여 그의 게놈에 안정하게 일체화된 도입 서열을 갖는 세포를 생성함으로써 달성되었다. 플라스미드는 또한 적절한 내성 유전자(들)를 전달함으로써 선택가능한 표지 약물에 내성을 제공한다. 뉴클로타이드 드-노보(de-novo) 합성 경로의 효소 결함 때문에 배지내에 뉴클레오타이드 선구물질이 존재하는 경우에만 자랄 수 있는 CHO 세포의 경우에는, 이 효소, 즉 디히드로폴레이트-환원효소(DHFR)의 발현이 요구된다. 이는 세포의 게놈내 메토트렉세이트(MTX)의 농도를 점차 증가시켜 DHFR 및 rFIX를 코딩하는 두 유전자의 카피 수(copy number)를 증가시킴으로써 FIX 유전자의 동시 증폭이 가능해진다. 이를 위하여, CHO 유도된 세포 클론은 또한 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 선구물질이 결여된 선택 배지에서 증식시켜야 한다.
인간 rFIX 생성 세포의 동정을 위하여, 형질감염시키고 배지에 선택 약물(들)을 첨가한 후, 단일 세포 유도된 클론을 단리할 수 있도록 세포 현탁액을 희석하였다. 단리 후, 이들 세포 클론을 컨플루언시(confluency)에 이르도록 배양하여 효소면역측정(ELISA) 기술에 의해 세포 배양물 상층액의 rFIX 함량을 측정할 수 있었다. 이를 위하여, 세포에 의해 분비된 rFIX의 동정을 확실히 하기 위하여 세포를 임의의 성장 촉진성 소 태아 혈청 또는 그의 성분의 부재하에 증식시켜야 한다. 완전 기능성 rFIX 단백질을 보장하기 위하여, 비타민 K를 첨가하였다. 상층액을 24 시간 후에 수획하여 rFIX-특이성 ELISA 기술에 의해 분석하였다. 또한, 단백질의 보전성 및 활성을 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)을 측정함으로써 평가하였다.
rVKORC1의 동시발현은, rFIX 발현의 경우에 이미 선택된 세포주를 사용하여 일시 발현 기술에 의해 성취하였다. 추가의 클론 선택 없이, rVKORC1 cDNA를 포함하는 발현 플라스미드를 이들 세포에 형질감염시켰다. 형질감염된 전 세포 풀(pool)로부터 상층액을 모으고, rFIX와 활성을 음성 대조물과 비교하고 rFIX 비분비율에 대하여 정규화하여 rVKORC1 활성의 효과를 평가하였다.
물질 및 방법:
발현 벡터
발현 벡터는 표준의 클로닝 기술에 따라 클로닝하였다. 간단하게, pSV-DHFR은, 마우스 DHFR을 함유하는 벡터 pAdD26SV(A)-3의 PstI 1.5 kbp 단편(문헌[Schahill, S. J., Devos, R., Van der, H. J., & Fiers, W.(1983) Expression and characterization of the product of a human immune interferon cDNA gene in Chinese hamster ovary cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 80, 4654-4658]; 벡터는 독일 GBF, 하우저(Hauser) 박사가 제공하였음)을 SV40 증강자, 초기 프로모터 및 인트론을 제공하는 pSVβ 벡터(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론테크(Clontech))에 삽입함으로써 생성하였고, 이때 NotI 분해에 의해 β-갈락토시다제 유전자를 제거하고, 폴리링커(polylinker)를 삽입하였다. 이 벡터는 또한 EcoRI/HindIII 단편을 phβAPr-1βgal의 EcoRI/HindIII 단편(이 또한 하우저 박사가 제공함)으로 바꿈으로써 인간 액틴(actin) 프로모터 및 인트론을 함유하는 phact를 생성하는데 사용되었다. ala148 다형태를 갖는 야생형 인간 FIX cDNA를 함유하는 phact-FIX(문헌[McGraw, R. A., Davis, L. M. Noyes, C. M., Lundblad, R. L., Roberts, H. R., Graham, J. B., & Stafford, D. W.(1985) Evidence for a prevalent dimorphism in the activation peptide of human coagulation factor IX. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 2847-2851])는 pFIX-bluescript의 EcoRI 분해에 의해 생성되는데, 이는 무작위 시발된 인간 간 cDNA 라이브러리(library)로부터의 인간 FIX를 pBluescript(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진(Stratagene))에 삽입하고, 생성된 단편을 EcoRI로 부분 분해시킨 phact에 삽입함으로써 생성되었다.
벡터 pCMV-FIX-neo는 벡터 pFIX-bluescript의 EcoRI 단편을 pCMVβ(클론테크)에 삽입함으로써 생성되었는데, 이때 β-gal cDNA가 제거되었다. 이 벡터내에서, PCR에 의한 부위-특이성 돌연변이에 의해 ala의 코돈을 thr로 바꾸어, ala148의 천연 다형태를 thr148로 바꾸었다. PCR 생성물을 동일한 벡터에 다시 재삽입하였다. 이 벡터의 EcoRI 단편을 pcDNA3.1(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로젠)에 삽입하여 pCMV-FIX-neo를 얻었다.
벡터 pcMV-VKORC1-EDHpro는 PCR의 주형으로서 벡터 pCEP4-VKORC1(올덴부르크(Oldenburg) 교수로부터 제공받음, 이에 대한 설명은 문헌[Rost et al., 2004]을 참조함)을 사용하여 생성하였다. rVKORC1 cDNA를 함유하는 PCR 생성물을 pCMV-EDHpro 벡터에 클로닝하였다(문헌[Herlitschka, S. E., Falkner, F. G., Schlokat, U., & Dorner, F.(1996) Overexpression of human prothrombin in permanent cell lines using a dominant selection/amplification fusion marker. Protein Expr. Purif., 8, 358-364]).
세포 배양 및 형질감염
CHO DUKX/DXB11 세포를 콜럼비아 대학(미국 뉴욕주 뉴욕 소재)으로부터 얻어서, 5 % 소 태아 혈청(오스트리아 린츠 소재의 PAA), 데속시-아데노신, 아데노신 및 티미딘(이들 모두 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마(Sigma) 제품) 및 L-글루타민(인비트로젠) 및 페니실린/스트렙토마이신(인비트로젠)이 첨가된 DMEM/Ham's F12(1:1) 혼합물(인비트로젠)내에서 배양하였다. HEK293 세포(ATCC 번호 CRL-1573)는 5 % 소 태아 혈청 및 L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 첨 가된 DMEM/Ham's F12(1:1) 혼합물내에서 배양하였다. 안정한 형질감염을 위하여, 칼슘-포스페이트 동시 침전 방법이 사용되었다. 선형화된 플라스미드 phact-FIX 및 pSV-DHFR로 동시 형질감염하고 5 % 투석 FBS(PAA)가 첨가된, 히폭산틴, 글리신 및 티미딘(인비트로젠) 부재하의 DMEM/Ham's F12(1:1) 혼합물내에서 선택함으로써 CHOrFIX 세포를 생성하였다. 유전자 증폭을 위하여, MTX(오스트리아 운테라흐 소재의 에베베(Ebewe))를 농도를 10 nM로부터 시작하여 200 nM까지 단계적으로 증가시키면서 첨가하였다. HEK293 세포는 선형화된 플라스미드 pCMV-FIX-neo로 형질감염시키고, 500 ㎍/㎖ G418(인비트로젠)을 함유하는 배지에서 선택하였다. 세포 클론은 수동으로 또는 흐름 세포측정 세포 분류 기술을 사용하여 제한 희석 클로닝 기술에 의해 단리하였다.
세포 배양 상층액내로의 FIX 분비는 증식 배지를 10 ㎍/㎖ 비타민 K1(시그마)이 첨가된 혈청 비함유 배지로 바꿈으로써 검출하였다. 상층액을 모으고, ELISA 및 응고 분석(활성화 부분 트롬보플라스틴 시간, APTT)에 의해 FIX 농도를 결정하였다. 비분비율의 계산을 위하여, CASY 세포 계수기(독일 로이틀링겐 소재의 쉐르페 시스템스(Scharfe Systems))를 사용하여 계수하였다.
일시 동시발현 실험을 위하여, 비선형화된 플라스미드 pCMV-VKORC1-EDHPro를 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 시약(인비트로젠)을 사용하여 형질감염시켰다. rVKORC1 cDNA가 없는 동일한 벡터를 음성 대조물로서 사용하였다.
분석 방법
ELISA는 1차 항체로서 1:40000 희석률의 다클론성 토끼 항-인간 FIX(미국 뉴 욕주 웨스트베리 소재의 애큐리트 케미컬(Accurate Chemical)), 및 검출 항체로서 다클론성 염소 항-인간 FIX 양고추냉이 과산화효소 콘쥬게이트를 사용하여 수행하였다. APTT는 FIX-샘플을 FIX 결핍 플라스마에 희석하여 STA 컴팩트 자동 응고기(프랑스 아스니에레 소재의 디아그노스티카 스타고(Diagnostica Stago))를 사용하여 결정하였다.
결과
CHO- 및 HEK293-유도된, 두 안정한 rFIX-생성 세포주를 VKORC1을 코딩하는 cDNA를 지니는 발현 벡터 pCMV-VKORC1-EDHpro로 일시 형질감염시켰다. 대조물로서, 빈 벡터 pCMV-EDHpro 및 안정한 rFIX-발현 세포주를 사용하였다. 일시 형질감염 후, 세포를 혈청-함유 배지에서 밤새 놔두었다. 세포를 PBS로 세척하고 혈청 비함유 배지에서 24 시간동안 배양한 다음, 상층액을 수획하였다. rFIX 발현 및 배지내로의 분비는 항원 수준 또는 응고 활성을 측정하는 면역화학적 및 응고 진단 방법에 의해 감시하였다. 세포 생산성에 대한 영향을 정하기 위하여, 세포수당 24 시간당 생성물 농도에 근거하여 분비율을 계산하였다(도 1 내지 도 4).
rFIX를 발현하는 HEK293 세포는, rVKORC1 형질감염 후 빈 벡터 대조물에 비하여, 비분비율의 평균 2.7 배 증가 및 rFIX-농도의 2.9 배 증가를 나타내었다. 이러한 값은 APTT 측정값에 근거한다. ELISA 값은 농도의 2.0 배 증가 및 비생산성의 1.8 배 증가를 나타내었다.
CHO-유도된 rFIX-생산자 세포주의 경우, ELISA 역가의 1.5 배 증가 및 ELISA 기반 비분비율의 1.2 배 증가가 관찰되었다. APTT-계산된 분비율은 1.4 배 높았 고, APTT-측정된 FIX 농도는 1.7 배이었다.
이들 값으로부터, 두 상이한 세포 유형에 있어서 rVKORC1의 존재하에 더 높은 rFIX 생성물 농도가 달성될 수 있는 것으로 결론내릴 수 있는데, 이는 주로 더 높은 세포 특이성 rFIX 분비율 때문이다. 완전 γ-카르복실화된 rFIX 분자의 더 높은 분비율의 이유는 이 번역후 변형의 세포 품질관리 메카니즘일 것이다(문헌[Lin, P. J., Straight, D. L., & Stafford, D. W. (2004) Binding of the factor IX gamma-carboxyglutamic acid domain to the vitamin K-dependent gamma-glutamyl carboxylase active site induces an allosteric effect that may ensure processive carboxylation and regulate the release of carboxylated product. J. Biol. Chem., 279, 6560-6565]). 두 세포주의 경우에서 ELISA 값보다 APTT 값이 더 많이 증가한 것도 또한 더 우수한 FIX-응고 활성을 나타낸다.
rVKORC1이 CHO 세포에서보다 HEK293-유도된 세포에서 rFIX 동시발현에 더 강력한 효과를 나타내는 것은 더 높은 세포 rFIX-생산성에 의해 설명할 수 있다. 일시 VKORC1 형질감염 전에, HEK293-유도된 클론은 APTT 값에 있어서 CHO-클론보다 생산성이 3.5 배 컸지만, ELISA 값에 있어서는 생산성이 5 배 더 컸다. 이는 더 높은 생산성 때문에 HEK293-유도된 세포에서 번역후 가공 정도가 더 낮음을 나타낸다. 따라서, rVKORC1 동시발현에 의해 γ-카르복실화 용량이 회복되는 경우 이 세포주에서 활성 rFIX 동형이 더 많이 얻어졌다.
실시예 2: 재조합 인간 응고 인자 VII(rFVII)을 안전하게 생성하는 CHO- 및 HEK293-유도된 포유동물 세포주에서의 재조합 인간 VKORC1의 일시 동시발현
rFVII의 활성 및/또는 분비율에 대한 rVKORC1의 임의의 영향을 인간 재조합 응고 인자 VII(rFVII) 생성 세포에서의 일시 동시발현에 의해 연구하였다. 따라서, rFVII 생성 세포 집단의 주요 부분은 또한 단시간에 VKORC1을 동시발현하였다. 이 시간동안, 분비된 rFVII을 샘플 채취하고, 특징화하고, 빈 벡터 대조물과 동시에 형질감염된 동일한 세포주에 의해 분비되는 rFVII과 비교하였다.
포유동물 세포에서의 rFVII의 안정한 발현은 인간 rFVII cDNA를 함유하는 플라스미드 벡터를 형질감염시키고, 내성 유전자를 선택하고, 후속 생산자 클론을 선택함으로써 달성될 수 있다. rFVII의 안정한 발현을 위하여 실시예 1에 기재된 것과 동일한 숙주 세포주를 사용할 수 있다. 유전학적 서택 및 유전자 증폭 과정, 및 생산자 클론의 선별은 유추적으로 수행되어야 한다.
그 후, 인간 VKORC1 cDNA를 지니는 발현 벡터를 일시 형질감염시켜, 실시예 1에 기술된 것과 동일한 방식으로 재조합 VKORC1(rVKORC1)의 동시발현을 달성하였다.
물질 및 방법
발현 벡터
인간 rFVII 유전학적 정보를 포함하는 발현 벡터는 주형으로서 백시니아(vaccinia) 발현 벡터 pselp/huFVII(문헌[Himly et al., 1998])과 같은 적당한 공급원으로부터 PCR에 의해 인간 FVII cDNA를 단리함으로써 구성할 수 있다. PCR-생성물은 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터의 강력한 바이러스 프로모터 및 네오마이신 또는 하이그로마이신 내성 유전자와 같은 추가의 항생물질 선택 표지를 제공 하는 포유동물 발현 벡터, 예를 들어 pcDNA3.1/hyg+ 또는 pcDNA3.1/neo+(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로젠)내로 제한 부위를 통해 삽입될 수 있다.
CHO-DHFR- 발현 시스템에서의 안정한 유전자 발현을 위하여, 실시예 1에 기술된 것과 같은 추가의 플라스미드를 사용하여 DHFR-함유 세포 클론의 선택 및 MTX-유전자 증폭이 가능할 수 있다.
rVKORC1의 일시 발현에 실시예 1에 기술된 벡터 pCMV-VKORC1-EDHpro를 사용할 수 있다.
세포 배양 및 형질감염
실시예 1에 기술된 것과 동일한 세포주 및 배양 프로토콜을 사용할 수 있다. 안정한 형질감염체를 생성하기 위하여, 칼슘-포스페이트 동시침전 방법을 사용할 수 있다. 플라스미드는 형질감염하기 전에 제한 효소 분해에 의해 선형화하여야 한다. CHO 또는 HEK293 숙주 세포주의 안정한 형질감염을 위하여 FVII cDNA를 함유하는 포유동물 발현 벡터를 사용할 수 있다. CHO DUKX DXB11 세포는 pSV-DHFR로 동시 형질감염되어야 한다. 선택 시약으로서 하이그로마이신 B가 사용되는 경우, 그의 농도는 HEK293-유도된 형질감염체를 선택하기 위하여 배지내에서 100 ㎍/㎖이고, CHO-형질감염체의 경우에는 250 ㎍/㎖이어야 한다. 선택 표지로서 네오마이신 내성이 사용되는 경우, G418의 농도는 각 세포 유형에 대하여 실시예 1에 기술된 것과 같이 조절되어야 한다.
일시 형질감염 프로토콜은 실시예 1에 기술된 리포펙타민 200 시약의 사용을 포함한다. 일시적으로 rVKORC1을 발현하는 세포와 적당한 음성 대조물의 비교를 가능하게 하기 위하여, 벡터 pCMV-VKORC1-EDHpro 및 VKORC1 cDNA 서열이 없는 동일한 벡터를 동시에 수회 반복하여, 바람직하게는 6웰 플레이트에서 형질감염시켜야 한다. 동일한 집단으로부터 유도된 세포는 웰에 대하여 같은 세포 밀도로 분포되었다. 컨플루언시에서, 모든 형질감염이 동시에 수행되었다.
세포 배양물 상층액내로의 rFVII 분비는 증식 배지를 0.1 내지 10 ㎍/㎖로 농도가 변하는 비타민 K1이 첨가된 혈청 비함유 배지로 바꿈으로써 검출할 수 있다. 상층액은 24 시간 후에 모을 수 있었고, 이후 기술되는 적당한 방법에 의해 rFVII 농도를 결정할 수 있었다. rFVII 비분비율의 계산을 위하여, 예를 들어 CASY 세포 계수기(독일 오리틀링겐 소재의 쉐르페 시스템스)를 사용하거나 또는 트립판-블루 제외 방법에 의해 세포를 계수하여야 한다.
분석 방법
rFVII 생산자 클론을 선별하고, FVII-활성을 항원 수준과 관련시키기 위하여, 하기 방법이 적당하였다.
FVII 활성은 응고 분석에서 프로트롬빈 응고 시간(PT)으로서 또는 유럽 약전(유럽 약전 5, 2005)에 따른 발색 분석에서 발색성 FXa 기질의 변환에 의해 정량화된 응고 인자 Xa(FXa)의 양으로서 측정될 수 있다. FVII 항원 수준은 적당한 항체 짝, 예를 들어 포획을 위하여 1:3000으로 희석된 친화성 정제 다클론성 양 항-인간 FVII 항혈청(캐나다 앤캐스터 소재의 어피니티 바이올로지컬스(Affinity Biologicals)), 및 검출을 위하여 다클론성 양 항-인간 FVII 양고추냉이 과산화효 소 콘쥬게이트(캐나다 온타리오 소재의 세달레인(Cedarlane); 1:2000 희석됨)를 사용한 후, 광도계 검출에 적당한 발색제를 첨가함으로써 결정될 수 있다.
모든 분석에서, 표준 물질로서 플라스마-유도성 FVII 표본을 사용하여야 하는데, 이는 국제 FVII 규격 97/592에 대하여 분석된다. 관련 응고 비활성은 측정된 항원 대 활성 값의 비를 계산하고 이를 내적으로 또는 플라스마-유도성 또는 FVII 표본의 값과 비교하여 정할 수 있다.
분비된 총 rFVII의 일부로서 FVIIa 수준을 평가하기 위하여, 하기 분석을 사용할 수 있다. FVIIa 프로트롬빈 응고 시간을 선택적으로 특정하기 위하여 스타클로트(Staclot, 등록상표) 분석(프랑스 아스니에레 소재의 디아그노스티카 스타고)이 적절하다. FVIIa 수준은 국제 FVII 규격 89/688에 대하여 분석되어야 한다.
결과
안정한 rFVII-생성 CHO-유도 세포주를 VKORC1 코딩 발현 벡터 pCMV-VKORC1-EDHpro로 형질감염시켰다. 대조물로서, VKORC1-코딩 cDNA가 없는 빈 벡터 pCMV-EDHpro를 사용할 수 있다. 세포를 6-웰 플레이트에 웰당 1×106 세포의 세포 농도로 접종하였다. 컨플루언시에 도달되면, 일시 형질감염 과정을 중복 수행하였다. 밤새 배양한 후, 세포를 비타민 K1이 없는 혈청 비함유 배지에서 배양하여 FBS-공급으로부터 세포의 내부 비타민 K1 저장소를 고갈시켰다. 24 시간 후, 배지를 0 내지 5 ㎍/㎖의 다양한 농도로 비타민 K1을 함유하는 혈청-비함유 배지로 바꾸었다. 추가의 분석을 위하여 상층액을 모았다. 24 시간당 생산율은 ELISA 및 1단계 응고 분석에 의해 측정된 rFVII-항원 및 활성 농도 값으로부터 결정하였다. FVII 응고 비활성은 항원 ㎍당 FVII-응고-단위로서 계산되었다. rFVIIa의 rFVIIa의 자동 활성화 정도를 정하기 위하여, 스타클로트 분석을 사용할 수 있다. 도 6A, 도 6B 및 도 6C에, 이들 실험의 결과를 나타내었다.
두 벡터 구성물에 의한 형질감염 후, ELISA(도 6A) 및 FVII-응고(도 6B)에 의해 rFVII-발현 수준을 결정하였다. 세포주에 의해 생성된 rFVIIa가 거의 없으므로, rFVll 활성은 rFVII-생산성과 상호관련 있을 수 있다.
배지내에 비타민 K1이 없는 경우, 생산된 rFVII의 세포 생산성 및 비활성은 rVKORC1 동시발현의 존재하 및 부재하에 상당히 낮아진다. rVKORC1-동시발현의 경우에서, rFVII 생산성은 응고 및 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 0.1 ㎍/㎖로부터 빈 벡터에 의한 대조물 형질감염 경우의 4배 더 큰 값에 이른다. rVKORC1-동시발현은 비타민 K1-농도와 상관없이 세포 배양 배지에 첨가된 비타민 K1의 사용을 개선시킨다. 일반적으로, 두 상이한 방법에 의해 결정된 rFVII-생산성은 rVKORC1 동시발현의 모든 비타민 K1 농도에서 대조물보다 4배까지 더 크다. 생성된 rFVII ㎍당 응고 단위로 표현된 비활성은 0 ㎍/㎖의 비타민 K1에서만 상당히 더 낮은 값을 나타내고, rVKORC1의 존재 및 부재가 거의 차이를 나타내지 않았다.
유사한 실험에서 일시 rVKORC1-동시발현 후 rFVII를 안정하게 발현시키는 HEK293-유도된 세포주와 CHO-유도된 세포주를 비교하였을 때, 두 경우에서 대조 형질감염으로서 상당히 더 높은 생산성을 발견할 수 있었다(도 7). 이 실험에서, 0.5 ㎍/㎖의 비타민 K1이 사용되었다. CHO-rFVII 세포의 경우, 응고 및 ELIS에 의 해 결정하였을 때, rVKORC1의 동시발현의 경우 대조물보다 2.5배 더 높은 rFVII 발현 수준을 발견할 수 있었다.
γ-카르복실화는 이 반응에 필요한 환원된 비타민 K 형태를 충분한 양으로 이용할 수 없는 경우 rFVII 생산성의 속도 제한 단계이다. 추정되는 세포 제어 메카니즘은 세포내의 불완전 γ-카르복실화가 있는 rFVII-분자를 보유한다(문헌[Lin et al., 2004]). 일시 rVKORC1 동시발현은 환원된 비타민 K의 더 우수한 공급을 제공하여 완전 γ-카르복실화를 확보함으로써 광범위한 비타민 K1 농도에서 rFVII 생산성을 개선시킨다.
이러한 발견은 다시 기존의 연구와 일치하는데, γ-카르복실라제의 동시발현은 포유동물 세포에서 재조합 인간 인자 IX 생산성의 감소를 일으켰다(문헌[Hallgren et al., 2002]). 지금까지 세포 대사내에서 VKORC1의 알려진 유일한 기능은 비타민 K-2,3 에폭사이드를 γ-카르복실화 반응에 필요한 히드로퀴논 형태로 환원시키는 것이다. 비록 포유동물 세포주가 본질적으로 우수하게 기능하는 γ-카르복실화 절차를 갖고 있더라도, rVKORC1 동시발현은 γ-카르복실화를 이루기에 바람직한 rFVII 단백질 품질을 보장한다고 결론내릴 수 있다.
실시예 3: 비-바이러스성 유전자 형질감염 후 CHO-유도 세포주에서의 rVKORC1 및 rFVII의 안정한 비시스트로닉 동시발현
rFVII 생성을 위한 안정한 포유동물 세포주를 생성하는 범위내에서 γ-카르복실화에 대한 rVKORC1 동시발현의 임의의 효과를 이용하기 위하여, 비시스트로닉 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 시스템의 경우, 하나의 발현 벡터를 전달한 후 진핵 세포에서 두 단백질의 동시발현이 달성될 수 있었다. 게다가, 동일한 mRNA 분자로부터 동시에 두 단백질이 번역되었다. 이는 두 형질감염 유전자를 코딩하는 cDNA 사이에 내부 리보솜 진입 서열(internal ribosome entry sequence, IRES)이란 바이러스성 유전 요소를 발현 벡터 구성물에 도입함으로써 가능해졌다(문헌[Mountford and Smith, 1995]). 숙주 세포 염색체내로 안정하게 일체화된 DNA 벡터 구성물로부터 mRNA가 전사된 후, 가공된 mRNA에 두 리보솜이 결합하여 두 폴리펩티드 쇄의 동시 신장이 일어날 수 있었다.
벡터는 포유동물 발현을 위한 요소, 예를 들어 강력한 바이러스성 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 클론 선택을 가능케 하는 내성 유전자를 제공하도록 구성되어야 한다. 바람직한 단백질을 코딩하는 두 cDNA를 IRES 서열을 중간에 갖는 벡터내로 클로닝하였다.
rFVII 발현을 비시스트로닉 rFVII 및 rVKORC1 동시발현과 비교하기 위하여, rFVII cDNA만을 지닌 정확하게 동일한 숙주 벡터로부터 유도된 대조물 발현 벡터를 구성할 수 있다. 이들 두 벡터를 동일한 숙주 세포주, 예를 들어 CHO-DHFR- 세포주 CHO DUXK DXB11에 동시에 형질감염시킬 수 있었다. 이 세포주는 유전자 증폭에 의해 단백질 발현 수준을 증가시키는 기회를 제공한다. 이는 실시예 1에 기술된 배양중에 DHFR 유전자를 지닌 플라스미드의 동시 형질감염 및 약물 MTX의 수준을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 이 발현 및 동시증폭 시스템에서 동시발현 벡터와 모노시스트로닉(monocystronic) rFVII 벡터를 비교함으로써, 도움 단백질로서 rVKORC1의 존재 또는 부재하에 rFVII 발현 수준 및 활성에 대한 유전자 증폭의 영향을 관찰할 수 있다. rFVII 생산자 클론의 선택 및 생성된 rFVII의 특징화는 실시예 2에 설명된 바와 같이 달성할 수 있다. 두 발현 시스템을 비교할 때 클론-특이성 치우침을 피하기 위하여, 동일한 방법에 의해 선별된 다수의 클론을 특징화하여야 한다.
물질 및 방법
발현 벡터
실시예 2에 설명된 것과 동일한 숙주 벡터로부터 유도된 플라스미드 벡터 구성물을 표준의 클로닝 기술에 의해 구성할 수 있다. 벡터 pCMV-rFVII의 구성은 실시예 2에 기술된 바와 같이 이루어질 수 있고, 유사체 벡터 pCMV-rFVII-IRES-VKORC1은 다음과 같이 구성될 수 있다. 인간 FVII cDNA는 실시예 2에 사용된 것과 동일한 공급원으로부터 PCR에 의해 증폭될 수 있다. IRES 요소는 벡터원 plRES2-EGFP(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론테크)로부터 단리될 수 있고, VKORC1 cDNA는 실시예 1에 기술된 동일한 벡터원(pCEP4-VKORC1)으로부터 클로닝할 수 있다. 3가지의 모든 요소를 pCMV-rFVII의 구성에 사용된 것과 동일한 숙주 벡터에 클로닝할 수 있다(실시예 2 참조). 자세하게는, 코작(Kozak) 서열 및 EcoRI 제한 부위가 첨가된 FVII cDNA PCR 생성물을 중간 벡터(예컨대, pBluescript; 미국 캘리포니아주 라졸라 소재의 스트라타진)에 클로닝하여 적당한 제한 부위를 통해 절단할 수 있다. FVII cDNA를 함유하는 이러한 중간 벡터의 HindIII/BamHI 단편을 pcDNA3.1/Hyg+(인비트로젠)에 클로닝할 수 있다. 이러한 중간 구성물을 BamHI 및 Xhol로 분해하여, 하나의 연결 반응에서 plRES2-EGFP로부터의 BamHI/BstXI 단편(IRES 함유)과 함께 VKORC1 cDNA(주형 pCEP4-VKORC1로부터 얻어짐)과 5' 및 3' 말단의 BstXI 및 Xhol 부위의 PCR 생성물을 삽입하여, pCMV-rFVII-IRES-VKORC1을 얻을 수 있다.
CHO-DHFR_ 발현 시스템에서 유전자를 발현하고 증폭시키기 위하여, 실시예 1에 기술된 또 하나의 선택 플라스미드 pSV-DHFR을 사용할 수 있다.
세포 배양 및 형질감염
바람직한 rFVII 생산자 클론의 생성 및 선택을 위하여 CHO-DHFR_ 숙주 세포주 및 실시예 1에 기술된 것과 동일한 물질 및 형질감염 및 배양 프로토콜을 사용할 수 있다. MTX에 의한 유전자 증폭을 유사하게 달성할 수 있다.
분석 방법
rFVII의 클론 및 상층액 또는 활성 및 농도를 특징화하고 세포-특이성 생산성을 결정하기 위하여, 실시예 2에 기술된 것과 동일한 분석을 사용할 수 있다. FVIIa 활성을 유사하게 감시하여야 한다.
노던 블롯
이 기술은 특히 mRNA 수준에서 도입된 유전자의 전사를 검출하고, 정확한 mRNA 크기를 확인하기 위하여 사용할 수 있다. 세포 집단으로부터 단리 및 제조된 총 세포 RNA를 아가로즈 겔에서 분리하고 나일론 막 위에 블로팅(blotting)할 수 있다. 특정 RNA 서열은 DIG-표지된 프로브의 혼성화에 의해 검출될 수 있고, 혼성 화된 프로브를 x선 필름에 화학발광시켜 결합시킨 후, 알칼리성 포스파타제-표지된 항DIG 항체(스위스 바즐 소제의 롯슈(Roche))에 의해 발달시킬 수 있다. 하우스-키핑(house-keeping) 유전자(예컨대, 햄스터 글리세르알데히드-포스페이트-디히드로게나제(GAPDH))에 대하여 목표 mRNA-수준(rVKORC1 및 rFVII)을 비교하여야 한다.
결과
CHO-DHFR- 발현 시스템으로부터 유도된 안정한 세포 클론을 생성하고 ELISA 및 프로트롬빈 시간(PT) 응고 기술에 의해 rFVII 생산성에 대하여 분석하였다. 발현 플라스미드 pCMV-rFVII-IRES-VKORC1 또는 pCMV-rFVII을 칼슘-포스페이트 동시침전 기술에 의해 선택 플라스미드 pSV-DHFR로 동시 형질감염시킬 수 있고, 히폭산틴, 글리신 및 티미딘이 결여된 선택 배지 및 항생물질 선택에 노출시킴으로써 클론을 얻을 수 있다. 단일 세포 유도된 클론은 제한 희석 클로닝 후에 선별되고, MTX 농도를 증가시키면서 수차례 배양하여 유전자 증폭을 달성하였다. 클론을 매 서브클로닝 단계마다 320 nM 이하의 MTX 농도에 노출시켰다. 모든 서브클로닝 단계에서, pCMV-rFVII 형질감염으로부터 유도된 총 133개의 클론 및 rVKORC1 동시발현 구성물을 사용한 형질감염으로부터 유도된 83개의 클론을 확대하고 상세히 특징화하였다. 세포 배양 상층액의 경우, rFVII 농도는 ELISA에 의해 결정될 수 있고, rFVII 및 rFVIIa 활성은 PT 응고 분석에 의해 동시에 측정되었다. FVlla로 활성화된 rFVII를 10 % 미만으로 갖는 클론만이 인공적으로 높은 FVII-응고 비활성 값을 피하도록 특징화되는 것으로 생각된다(데이터는 나타내지 않음). 발현 수준은 ELISA 농도 값으로부터 24 시간당 106 세포당 ng로서 계산되었다. FVII-응고 비활성은 ㎍당 응고 단위로서 계산되었다.
도 8에서, ELSIA에 근거한 비생산성 값을, rFVII만 발현하는 클론(도 8B), 및 rFVII-rVKORC1 동시발현 클론(도 8A)의 경우에 MTX 농도에 대하여 그래프화하였다. 두 선에서 MTX 수준과 발현 수준 사이에 관계있음을 볼 수 있다. MTX의 부재하에 초기 클론은 rFVII만 발현하는 클론의 동등하거나 더 높은 수준에서 시작하였다. 특히, MTX를 20 내지 40 nM의 낮은 출발 수준으로 증가시키는 경우, rFVII-rVKORC1 동시발현 클론의 발현 수준이 가파르게 동반 증가하는 패턴을 도 8A 대 도 8B에서 분명하게 볼 수 있다. 80 nM의 MTX에서, 모든 rFVII-rVKORC1 동시발현 클론은 초기 클론보다 2 내지 80 배 더 많은 rFVII를 발현하지만, rFVII만 발현하는 클론의 경우에는 초기 클론에 유사한 발현 수준을 갖는 클론이 다소 발견되었다. 20 mM 이상일 때, 모든 MTX 수준에서 rFVII만 발현하는 클론보다 rFVII-rVKORC1에서 더 우수한 생산자 클론이 발견되었다. 유전자 증폭 후 더 우수한 rFVII-생산자 클론의 발현 수준은 특히 MTX 증가의 초기 단계에서 rVKORC1-동시발현보다 2배 더 높았다.
FVII-응고 비활성에 관하여는, 상기 모든 클론에 대하여 계산된 값을 생산성에 대하여 그래프화하여 단백질을 기능적으로 비교하였다. 도 9에서, 두 경우를 비교하였는데, 유사한 생산성 범위에서 거의 동일한 활성 값을 나타내면서 두 경우 모두 더 높은 생산성에서 전체적으로 감소하였다. 생산성이 2배 이상 커진 rFVII- rVKORC1 동시 생산자가 발견되었지만, 1일 106 세포당 4 ㎍ 더 큰 범위에서의 활성 값은 비교할 수 없었다. rFVII-rVKORC1 클론의 이 발현 수준 이상에서, 플라스마-유도된 FVII(문헌[Moor et al., 1995])에 유사한 ㎍당 2 U의 일정한 활성 값이 유지될 수 있었다.
IRES 요소를 포함한 벡터 구성물의 기능성 및 기능적 게놈 일체화에 의해 rFVII 및 rVKORC1 코딩 서열을 함유하는 하나의 비시스트로닉 mRNA를 전사하는 것은, 특히 이용할 수 있는 VKORC1-특이성 분석이 없는 경우, 노던 블롯 기술에 의해 증명될 수 있다.
도 10은 노던 블롯의 예를 나타내는데, 세포 용해 후 CHO-유도된 형질감염체 또는 대조 세포의 모든 mRNA를 단리하여, 전기영동 분리 후 나일론 막에 블로팅하였다. 막을, 인간 VKORC1, 인간 FVII 및 대조 유전자인 햄스터 GAPDH에 특이성인 DIG-표지 DNA 프로브로 3번 혼성화하였다. 샘플은 형질감염되지 않은 CHO-DHFR_ 세포, rFVII만을 발현하는 하나의 CHO-유도된 클론, 실시예 3에 기술된 것과 같이 rFVII- 및 rVKORC1-코딩 벡터로 형질감염된 두 클론, 및 비시스트로닉 rFVII 및 rVKORC1이 동시발현된 세 클론이었다. 3가지 모든 브로브에서 크기가 rFVII-IRES-rVKORC1 구성물의 경우 약 2.4 kb, rFVII 구성물의 경우 1.4 kb, rVKORC1 mRNA의 경우 0.5 kb, 및 GAPDH 대조 mRNA의 경우 1.0kb인 mRNA 전사물을 검출할 수 있었다. GAPDH는 모든 클론에서 발견할 수 있었지만, rVKORC1 및 rFVII은 개개의 세포주에서 형질감염된 플라스미드 벡터에 따라 존재하였다.
요약하면, rVKORC1의 안정한 비시스트로닉 동시발현은, 특히 유전자 증폭이 적용된 경우에, 포유동물에서 rFVII의 생산성에 대하여 증진 효과를 나타내었다. 유전자 전이 후의 rFVII-고생산자 클론의 수율은 rVKORC1 동시발현의 경우에 더 높았다. 검색된 클론의 수의 절반을 가지고, 동일한 MTX 농도 수준에서 2 배 더 높은 발현 수준을 달성할 수 있었다. 단백질 활성은 높은 세포 단백질 분비 수준으로 유지될 수 있었다. 두 효과 모두 γ-카르복실화 반응에 필요한 환원된 비타민 K 형태의 충분한 공급에 의해 설명될 수 있는데, 이는 완전 카르복실화된 단백질의 시기적절한 방출을 보장하기 위하여 높은 단백질 분비 수준으로 높은 턴오버(turnover) 속도로 일어나야 한다.
실시예 4: CHO 또는 HEK293 포유동물 세포에서의 두 후속 비-바이러스성 형질감염 후의 rFVII 및 rVKORC1의 안정한 동시발현
포유동물 세포 배양물에서 rFVII 재조합 발현에 대한 도움 단백질로서의 rVKORC1 효과를 확인하기 위하여, rFVII과 함께 rVKORC1의 동시발현을 달성하는데 다른 접근법을 사용할 수 있다. 2차 형질감염 후 안정한 rFVII 및 rVKORC1 동시발현을 나타내는 클론을 선택하는 전략이 사용될 수 있다. 안정한 형질감염 후 rFVII 발현을 위해 선택된 클론을, 인간 VKORC1을 코딩하는 다른 플라스미드 벡터로 2차 형질감염시킬 수 있다. 제2 내성 표지를 도입하여 다른 항생물질에 대한 내성에 의해 선택 단계를 확실하게 할 수 있다. 적당한 대조물로서, VKORC1 cDNA가 없는 동일한 벡터를 동시에 동일 세포 집단내로 형질감염시킬 수 있다. 이러한 형질감염으로부터, 클로닝 단계에서의 두 항생물질에 의한 동시 선택 후에 안정한 클론을 단리할 수 있고 이를 실시예 2 및 3에 기술된 바와 같이 특징화할 수 있다. 이렇게 새로 단리된 클론들을 비교하여 rFVII 생산성 및 활성에 대한 rVKORC1 동시발현 효과가 있음을 결론내릴 수 있다.
물질 및 방법
발현 벡터
rFVII를 생성하는 클론을 생성하기 위하여, 실시예 2에 기재된 것과 동일한 발현 벡터 및 rFVII cDNA의 공급원을 사용할 수 있었다. CHO-DHFR- 시스템의 경우, 추가의 선택 플라스미드 pSV-DHFR을 사용할 수 있었다.
2차 형질감염 후 rVKORC1 동시발현을 달성하기 위하여, 인간 VKORC1을 코딩하는 벡터, 및 1차 형질감염에 사용된 상이한 항생물질 선택 표지를 취할 수 있다. 이 벡터는 실시예 1에 기술된 것과 동일한 주형으로부터 생성된 PCR 생성물을 pcDNA3.1 기반 벡터(인비트로젠)내로 삽입함으로써 구성할 수 있었다. 이 경우에서, 삽입물 없는 동일한 pcDNA3.1 벡터를 2차 대조 형질감염에 사용하여야 한다. 또 다르게는, 실시예 1에 기술된 벡터 pCMV-VKORC1-EDHpro를 동일 형질감염을 위한 발현 벡터로서 사용할 수 있다. 대조 플라스미드로서, 빈 벡터 pCMV-EDHpro(실시예 1 참조)를 사용할 수 있다.
세포 배양 및 형질감염
실시예 1에 사용된 것과 동일한 세포주, CHO 및 HEK293을 사용하여 rFVII을 생성하는 안정한 세포주를 생성할 수 있다. 따라서, 모든 세포 배양 배지, 형질감 염 및 배양 프로토콜을 사용할 수 있다. 이들 세포주에서 rVKORC1의 안정한 동시발현을 달성하기 위하여, 칼슘-포스페이트 동시침전을 사용한 2차 형질감염을 사용할 수 있다. 추가의 항생물질 선택 약물을 사용하는 다른 클로닝 단계는 rFVII 및 rVKORC1을 동시발현하는 클론을 얻는데 필수적이다.
분석 방법
실시예 2 및 3에 기술된 것과 동일한 농도 및 활성 측정 방법을 사용하여 rFVII 발현을 확인할 수 있었다. mRNA 수준에서의 rVKORC1 전사는 실시예 3에 기술된 노던 블롯 기술에 의해 나타낼 수 있다.
결과
rFVII의 발현에 대한 rVKORC1 도움 단백질의 효과를 증명하기 위하여, 두 후속 형질감염 및 클로닝 단계의 접근법을 사용할 수 있다. 제1 단계에서, rFVII을 발현하는 세포 클론은 안정한 형질감염 및 항생물질 선택 후 적당한 선별 기술에 의해 단리될 수 있다. 이들 클론 중 하나를 확대하여 인간 VKORC1-코딩 플라스미드 또는 빈 대조물 플라스미드에 의한 2차 형질감염에 사용할 수 있다. 다른 선택 표지를 도입할 수 있다. 다시, 배지에 제2 항생물질 선택 약물을 첨가하여 형질감염되지 않은 세포를 확실히 고갈시킨 후, 적당한 기술에 의해 rFVII 발현에 대하여 클론을 검색할 수 있다. rVKORC1- 또는 대조물 형질감염으로부터 기원하는 클론을 rFVII 생산성 또는 활성의 면에서 비교할 수 있다. 빈 대조물 벡터는 동일한 배양 조건에 노출된 클론을 rFVII 발현, 특히 이중 항생물질 선택에 대한 영향과 확실히 비교한다.
전형적으로, 성공적으로 형질감염된 세포로부터 유도된 모든 클론으로부터, 이들의 rFVII 생산성에 따라 소수의 클론을 선택하여 추가의 특징화를 위하여 확대하였다. 이러한 특징화는 항원 ELISA 기술, 및 rFVII 및 rFVIIa 응고 활성의 측정에 의해 분비된 rFVII 농도를 결정함을 포함한다. rVKORC1 및 rFVII의 동시발현은 도 10의 레인 3 및 4의 두 CHO-유도 클론의 경우 나타낸 노던 블롯 기술에 의해 mRNA 수준에서 확인할 수 있다.
도 11에서, 배양물 상층액의 ELISA 역가에 근거한 비생산성 값을, CHO-유도된 rFVII-생성 세포주(도 11A) 및 HEK293-유도된 rFVII-생성 세포주(도 11B)의 rVKORC1 2차 형질감염 또는 대조 형질감염으로부터 기원하는 범위의 선택된 클론에 대하여 나타내었다. 두 세포 유형의 경우, rVKORC1 형질감염으로부터 유도된 클론은 대조 형질감염으로부터 기원하는 것보다 더 많은 rFVII을 생성함을 알 수 있다. 모든 생산성의 중앙값은 두 경우에서 rVKORC1 클론보다 약 2배 더 높다.
도 12A 및 도 12B에서, ELISA ㎍당 FVII 응고 단위로서 주어진 rFVII 응고 비활성을, 2차 형질감염 후 두 세포 유형으로부터 유도된 클론에 대하여 나타내었다. 비활성 계산에 있어서, rFVII이 rFVIIa로 다량 활성화된 클론(이는 FVLLa-특이성 응고 분석에 의해 측정될 수 있음)은 고려하지 않아야 한다. 상당량의 rFVII를 rFVIIa로 활성화하는 클론을 제외시키기 위하여 FVII 응고 단위당 10 %의 FVIIa 응고 단위의 값을 선택할 수 있다. 따라서, 도 11에서보다 도 12에서 더 적은 클론을 볼 수 있다.
FVII-응고 비활성의 차이는 rVKORC1 동시발현 보다는 발현 수준과 상호관련 될 수 있다. 그러나, CHO-유도된 클론의 경우에, 유사한 발현 수준을 갖는 클론은 rVKORC1 동시발현의 존재하에 더 높은 활성을 나타낸다. CHO- 및 HEK293-유도된 세포 클론의 생산성을 생각할 때, rVKORC1 동시발현에 의해 대조물에 비하여 2 배의 평균 개선이 일어났다고 결론내릴 수 있다. 게다가, rVII 활성은 또한 γ-카르복실화 이외에 세포의 대사성 단백질 분비 및 변형 용량에 의해 영향받는 다른 인자에 의해 영향받는 것으로 결론내릴 수 있다. 생산성 및 활성 값은 실시예 2 및 3에 기술된 rFVII/rVKORC1 동시발현 실험의 결과와 일치하였다.
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Claims (19)

  1. 비타민 K 환원효소 복합체 소단위 1(vitamin K reductase complex subunit 1, VKORC1) 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산, 및 비타민 K 의존성(vitamin K dependent, VKD) 단백질 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산을 함유하며, 재조합 VKORC1 및 재조합 VKD 단백질을 둘다 발현하는 숙주 유기체.
  2. 제1항에 있어서, 재조합 VKORC1을 코딩하는 핵산 또는 재조합 VKD 단백질을 코딩하는 핵산 또는 둘다를, 유도 발현, 일시 발현 및 영구 발현으로 이루어진 군에서 선택되는 발현 방식에 의해 발현하는 숙주 유기체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포유동물 세포인 숙주 유기체.
  4. 제3항에 있어서, 포유동물 세포가 CHO 세포 및 HEK293 세포로 이루어진 군에서 선택되는 포유동물 세포주로부터 유도된 세포인 숙주 유기체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 VKD 단백질이 전구응고제 혈액 인자 또는 그의 기능적 활성 유도체인 숙주 유기체.
  6. 제5항에 있어서, 전구응고제 혈액 인자가 인자 II, 인자 VII, 인자 IX 및 인자 X으로 이루어진 군에서 선택되는 숙주 유기체.
  7. 제6항에 있어서, 전구응고제 혈액 인자가 인간 인자 IX인 숙주 유기체.
  8. 비타민 K 환원효소 복합체 소단위 1(VKORC1) 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산, 및 비타민 K 의존성(VKD) 단백질 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산을 함유하며, 재조합 VKORC1 및 재조합 VKD 단백질이 둘다 발현하는 세포를 포함하는 세포 배양 시스템.
  9. 제8항에 있어서, 배양된 세포가 포유동물 세포인 세포 배양 시스템.
  10. 제9항에 있어서, 포유동물 세포가 CHO 세포 및 HEK293 세포로 이루어진 군에서 선택되는 세포 배양 시스템.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 VKD 단백질이 전구응고제 혈액 인자 또는 그의 기능적 활성 유도체인 세포 배양 시스템.
  12. 제11항에 있어서, 전구응고제 혈액 인자가 인자 II, 인자 VII, 인자 IX 및 인자 X으로 이루어진 군에서 선택되는 세포 배양 시스템.
  13. 제12항에 있어서, 전구응고제 혈액 인자가 인간 인자 IX인 세포 배양 시스템.
  14. (a) 숙주 유기체를 제공하는 단계;
    (b) 단계 (a)의 숙주 유기체에 VKD 단백질 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산을 삽입하는 단계;
    (c) 단계 (a)의 숙주 유기체에 비타민 K 환원효소 복합체 소단위 1(VKORC1) 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산을 삽입하는 단계; 및
    (d) 단계 (b) 및 (c)의 재조합 핵산을 발현하는 단계
    를 포함하는, 숙주 유기체에서 재조합 비타민 K 의존성(VKD) 단백질 또는 그의 기능적 활성 유도체 발현의 생산성을 개선하기 위한 방법.
  15. (a) 숙주 유기체의 게놈으로 일체화되는 VKD 단백질 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산을 갖는 숙주 유기체를 제공하는 단계;
    (b) 단계 (a)의 숙주 유기체에 비타민 K 환원효소 복합체 소단위 1(VKORC1) 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산을 삽입하는 단계; 및
    (c) 단계 (a) 및 (b)의 핵산을 발현하는 단계
    를 포함하는, 숙주 유기체에서 재조합 비타민 K 의존성(VKD) 단백질 또는 그의 기능적 활성 유도체 발현의 생산성을 개선하기 위한 방법.
  16. 제15항에 있어서, VKD 단백질 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산이 안정하게 발현되는 방법.
  17. (a) 숙주 유기체의 게놈으로 일체화되는 비타민 K 환원효소 복합체 소단위 1(VKORC1) 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산을 갖는 숙주 유기체를 제공하는 단계;
    (b) 단계 (a)의 숙주 유기체에 VKD 단백질 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산을 삽입하는 단계; 및
    (c) 단계 (a) 및 (b)의 핵산을 발현하는 단계
    를 포함하는, 숙주 유기체에서 재조합 비타민 K 의존성(VKD) 단백질 또는 그의 기능적 활성 유도체 발현의 생산성을 개선하기 위한 방법.
  18. 제17항에 있어서, VKORC1 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산이 안정하게 발현되는 방법.
  19. 비타민 K 환원효소 복합체 소단위 1(VKORC1) 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산, 및 재조합 VKD 단백질 또는 그의 기능적 활성 유도체를 코딩하는 재조합 핵산을 숙주 유기체에 삽입하고, 이들 핵산을 발현하고, VKD 단백질을 회수함으로써 얻을 수 있는 재조합 비타민 K 의존성(VKD) 단백질.
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