BRPI0607751A2 - organismo hospedeiro, sistema de cultura de célula, método para melhorar a produtividade da expressão de proteìna dependente da vitamina k recombinante ou de um derivado desta funcionalmente ativo em um organismo hospedeiro, e, proteìna dependente da vitamina k recombinante - Google Patents

Abstract

ORGANISMO HOSPEDEIRO, SISTEMA DE CULTURA DE CéLULA, MéTODO PARA MELHORAR A PRODUTIVIDADE DA EXPRESSãO DE PROTEìNA DEPENDENTE DA VITAMINA K RECOMBINANTE OU DE UM DERIVADO DESTA FUNCIONALMENTE ATIVO EM UM ORGANISMO HOSPEDEIRO, E, PROTEINA DEPENDENTE DA VITAMINA K RECOMBINANTE. A presente invenção diz respeito a um organismo hospedeiro contendo ácidos nucleicos recombinantes que codificam a subunidade 1 do complexo de vitamina K redutase (VKORC 1) e ácidos nucleicos recombinantes que codificam uma proteína dependente de vitamina K (VKD), em que tanto a VKORC1 recombinante quanto a proteína VKD recombinante são expressadas no dito organismo hospedeiro. Além disso, a presente invenção diz respeito a um sistema de cultura de célula que compreende células contendo os ditos ácidos nucleicos recombinantes e aos métodos para melhorar a produtividade de expressão de proteína VKD recombinante em um organismo hospedeiro que é cultivado em sistemas adequados.

Description

"ORGANISMO HOSPEDEIRO, SISTEMA DE CULTURA DE CÉLULA,MÉTODO PARA MELHORAR A PRODUTIVIDADE DA EXPRESSÃODE PROTEÍNA DEPENDENTE DA VITAMINA K RECOMBINANTE OUDE UM DERIVADO DESTA FUNCIONALMENTE ATIVO EM UM ORGANISMO HOSPEDEIRO, E, PROTEÍNA DEPENDENTE DAVITAMINA K RECOMBINANTE"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a um organismo hospedeirocontendo ácidos nucleicos recombinantes que codificam a subunidade 1 docomplexo de vitamina K redutase (VKORC1) e ácidos nucleicosrecombinantes que codificam uma proteína dependente de vitamina K (VKD),em que tanto o VKORC1 recombinante quanto a proteína VKD recombinantesão expressadas no dito organismo hospedeiro. Além disso, a presenteinvenção diz respeito a um sistema de cultura de célula que compreendecélulas contendo os ditos ácidos nucleicos recombinantes e a métodos paramelhorar a produtividade de expressão de proteína VKD recombinante em umorganismo hospedeiro que é cultivado em sistemas adequados.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O complexo da vitamina K epóxido redutase (VKORC) reciclaa forma reduzida de vitamina K que é um co-fator essencial para a y-carboxilação pós traducional de proteínas dependentes de vitamina K (VKD)(Nelsestuen, G. L., Zytkovicz, T. H., & Howard, J. B. (1974) The mode ofaction of vitamin K. Identification of gamma-carboxyglutamic acid as acomponent of prothrombin. J. Biol. Chem., 249, 6347-6350).

O gene VKORC 1 foi recentemente identificado, e está descrito em detalhes em Rostet al., 2004 (Rost, S., Fregin, A., Ivaskevicius, V., Conzelmann, E.,Hortnagel, K., Pelz, H. J., Lappegard, K., Seifried, E., Scharrer, I.,Tuddenham, E. G., Muller, C. R., Strom, T. M., & Oldenburg, J. (2004)Mutations in VKORC 1 cause warfarin resistance and multiple coagulationfactor deficiency type 2. Nature, 427, 537-541).

As proteínas VKD contêm resíduos de glutamato (gla) y-carboxilado que dão a elas propriedades bioquímicas e fisiológicas específicascomo ligação dependente de Ca às membranas fosfolipídicas negativamentecarregadas no caso de fatores de coagulação de sangue (Mann, K. G., Jenny,R. J., & Krishnaswamy, S. (1988) Cofactor proteins in the assembly andexpression of blood clotting enzyme complexes. Annu. Rev. Biochem., 57,915-956). As proteínas VKD incluem fatores pró coagulantes II, VII, IX e X,e proteínas anticoagulantes C, S e Z. Embora restrito a uma única reaçãoenzimática conhecida, a atividade de y-carboxilase é encontrada em todos ostecidos mamíferos (Vermeer, C. & de Boer-van den Berg MA (1985) VitaminK-dependent carboxilase. Haematologia (Budap.), 18, 71-97). A y-carboxilasecatalisa uma reação de carboxilação usando vitamina K reduzida como co-fator.

A gama carboxilação dependente de vitamina K (VKD) deresíduos de ácido glutâmico é uma modificação de proteína pós traducionalrequerida para a geração de proteínas VKD biologicamente ativas quedesempenham papéis na hemostase, controle do crescimento, homeostase decálcio, e transdução de sinal (Furie, B., Bouchard, B. A., & Furie, B. C.(1999) Vitamin K-dependent biosynthesis of gamma-carboxyglutamic acid.Blood, 93, 1798-1808; Berkner, K. L. (2000) The vitamina K-dependentcarboxilase. J. Nutr., 130, 1877-1880). Diversos resíduos de ácido glutâmicono domínio Gla do terminal N destas proteínas são modificados pelacarboxilação para possibilitar as interações de membrana fosfolipídicadependente de cálcio (Stenflo, J. & Suttie, J. W. (1977) Vitamin K-dependentformation of gamma-carboxyglutamic acid. Annu. Rev. Biochem., 46, 157-172; Suttie, J. W. (1980) Mechanism of action of vitamin K: synthesis ofgamma-carboxyglutamic acid. CRC Crit Rev. Biochem., 8, 191-223). Estesresíduos de gama-glutamato (Gla) múltiplos possibilitam que o domínio Glasofra mudanças conformacionais que são requeridas para a atividade dasproteínas VKD em combinação com ligação às superfícies de membranafosfolipídicas (Nelsestuen, G. L., Broderius, M., & Martin, G. (1976) Role ofgammacarboxyglutamic acid. Cation specificity of prothrombin and factor X- phospholipid ligação. J. Biol. Chem., 251, 6886-6893; Zwaal, R. F.,Comfurius, P., & Bevers, E. M. (1998) Lipid-protein interactions in bloodcoagulation. Biochim. Biophys. Acta, 1376, 433-453).

As proteínas de coagulação sangüínea VKD requeremcarboxilação completa ou quase completa para ligar-se às superfícies demembrana na presença de íons cálcio (Furie, B. & Furie, B. C. (1988) Themolecular basis of blood coagulation. Cell, 53, 505-518). Se antagonistas devitamina K inibem a gama carboxilação, assim as proteínas VKDsubcarboxiladas não podem formar a estrutura dependente de cálcio queresulta em baixa afinidade às membranas fosfolipídicas e menos atividade(Esmon, C. T., Sadowski, J. A., & Suttie, J. W. (1975a) A new carboxylationreaction. The. vitamin K-dependent incorporation of H-14-003- intoprothrombin. J. Biol. Chem., 250, 4744-4748; Esmon, C. T., Suttie, J. W., &Jackson, C. M; (1975b) The functional signifícance of vitamin K action.Difference in phospholipid binding between normal and abnormalprothrombin. J. Bio. Chem., 250, 4095-4099; Malhotra, O. P., Nesheim, M.E., & Mann, K. G. (1985) The kinetics of activation of normal and gamma-carboxyglutamic acid-deficient prothrombins. J. Biol. Chem., 260, 279-287).Por exemplo, as contribuições para as perdas de atividade da proteína globalpodem ser atribuídas à ausência de cada um dos 10 resíduos Gla da proteína C humana ativada pela proteína VKD (Zhang, L., Jhingan, A., & Castellino, F.J. (1992) Role of individual gamma-carboxyglutamic acid residues ofactivated humân protein C in defíning its in vitro anticoagulant activity.Blood, ,80, 942-952). A atividade pró coagulante perdida de mutantes do fatorIX subcarboxilados encontrados em pacientes de hemofilia B pode seratribuída às mudanças conformacionais induzidas pelo cálcio prejudicadas e aperda na capacidade para ligar vesícuias fosfolipídicas (Ware, J., Diuguid, D.L., Liebman, H. A., Rabiet, M. J., Kasper, C. K., Furie, B. C, Furie, B., &Stafford, D. W. (1989) Factor IX San Dimas. Substitution of glutamine forArg-4 in the propeptide leads to incomplete gamma-carboxilation and alteredfosfolipid binding properties. J. Biol. Chem., 264, 11401-11406).

No caso de fator IX recombinante, foi mostrado que aexpressão de fator IX funcional em células de ovário de hamster chinês élimitada pelo fato de que capacidade de carboxilação é saturada em níveis deprodução mais altos (Kaufman, R. J., Wasley, L. C, Furie, B. C, Furie, B., &Shoemaker, C. B. (1986) Expression, purification, and characterization ofrecombinant gamma-carboxilated factor IX synthesized in Chinese hamsterovary cells. J. Biol. Chem., 261, 9622-9628; Derian, C. K., VanDusen, W.,Przysiecki, C. T., Walsh, P. N., Berkner, K. L., Kaufman, R. J., & Friedman,P. A. (1989) Inhibitors of 2-ketoglutarate-dependent dioxygenases blockaspartil beta-hydroxilation of recombinant human factor IX in severalmammalian expression systems. J. Biol. Chem., 264, 6615-6618).

A super-expressão recombinante de proteínas y-carboxiladasfoi mostrada no caso de fator IX humano levar a uma limitação de clivagemde pró-peptídeo e y-carboxilação em taxas de secreção mais altas, produzindoassim proteínas que são apenas parcialmente ocupadas com resíduos glatambém quando a vitamina K é disponível no meio de cultura em excesso.Isto leva à secreção de variantes de proteínas recombinantes VKD comatividades reduzidas. A adição de vitamina K ao meio não melhoram aatividade de fator IX em níveis de alta expressão. A exigência de vitamina Kpresente no meio de cultura celular para eliciar o fator IX ativo foi mostradoatingir saturação em 5 ug/ml. Abaixo deste nível, a quantidade secretada defator IX ativo a partir de células do ovário do hamster chinês (CHO) foidependente da concentração de vitamina K (Kaufman, R. J., Wasley, L. C,Furie, B. C, Furie, B., & Shoemaker, C. B. (1986) Expression, purification,and characterization of recombinant gamma-carboxilated factor IXsynthesized in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem., 261, 9622-9628).

Até agora as linhagens de célula com níveis de expressão baixos foram escolhidas para a produção de modo a superar estas limitaçõesde capacidade celular para modificar proteínas VKD pós transacionalmente.A co-expressão de Furin, a enzima que cliva pró-peptídeo, leva à clivagemcompleta deste pró-peptídeo (Wasley, L. C, Rehemtulla, A., Bristol, J. A., &Kaufman, R. J. (1993) PACE/furin can process the vitamin K-dependent pro- factor IX precursor within the secretory pathway. J. Biol. Chem., 268, 8458-8465), mas não está envolvida na melhora da y-carboxilação. Um outrométodo, a superexpressão de y-carboxilase, não levou à secreção de proteínamelhorada no caso de fator IX (Rehemtulla, A., Roth, D. A., Wasley, L. C,Kuliopulos, A., Walsh, C. T., Furie, B., Furie, B. C, & Kaufman, R. J. (1993)

In vitro and in vivo functional characterization of bovine vitamin K-dependent gamma-carboxilase expressed in Chinese hamster ovary cells.Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 90, 4611-4615). As moléculas do Fator IX, quesão ligadas à carboxilase durante a reação de carboxilação não sãoeficazmente liberadas. Foi concluído que o fornecimento da forma reduzida de vitamina K no sítio de 7-carboxilação é a etapa limitante desta reação(Haligren, K. W, Hommema, E. L., McNally, B. A., & Berkner, K. L. (2002)Carboxilase overexpression effects fUll carboxilation but poor release andsecretion of factor IX: implications for the release of vitamin K-dependentproteins. Biochemistry, 41, 15045-15055).

Portanto, uma forte necessidade existe quanto à estabilizaçãoda expressão, particularmente a expressão recombinante de proteínas VKDem organismos hospedeiros produzindo em taxas de secreção e/ou atividadesmelhoradas das proteínas VKD expressadas.

Assim, é um objetivo da presente invenção fornecer novossistemas e métodos para melhorar a produtividade da expressão da proteínaVKD (particularmente recombinante) por intermédio da co-expressão deVKORC1.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a um organismo hospedeirocontendo um ácido nucleico recombinante que codifica uma subunidade 1 docomplexo da vitamina K redutase (VKORC1) ou um derivado destafuncionalmente ativa, e um ácido nucleico recombinante que codifica umaproteína dependente de vitamina K (VKD) ou um derivado destafuncionalmente ativo, em que tanto a VKORC1 recombinante quanto aproteína VKD recombinante são expressadas no dito organismo hospedeiro.

Além disso, a presente invenção diz respeito a um sistema decultura de célula que compreende células que contenham um ácido nucleicorecombinante que codifique VKORC1 ou um derivado desta funcionalmenteativo e um ácido nucleico recombinante que codifique uma proteína VKD ouum derivado desta funcionalmente ativo, em que tanto a VKORC1recombinante quanto a proteína VKD recombinante são expressadas nas ditascélulas, aos métodos para melhorar a produtividade de expressão de proteínaVKD recombinante ou de um derivado desta funcionalmente ativos em umorganismo hospedeiro co-expressando-se recombinantemente VKORC1, e aouso de uma expressão recombinante de VKORC1 em um organismohospedeiro ou sistema de cultura de célula para melhorar a produtividade daexpressão de VKD recombinante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Um aspecto da presente invenção diz respeito a um organismohospedeiro contendo um ácido nucleico recombinante que codifica umasubunidade 1 do complexo de vitamina K redutase (VKORC1) ou umderivado desta funcionalmente ativo, e um ácido nucleico recombinante quecodifique uma proteína dependente de vitamina K (VKD) ou um derivadodesta funcionalmente ativo, em que tanto o VKORC1 recombinante quanto aproteína VKD recombinante são expressadas no dito organismo hospedeiro.

O termo "derivado funcionalmente ativo" como aqui usadosignifica qualquer polipeptídeo com substancialmente a mesma funçãobiológica como as proteínas VKORC1 e VKD respectivamente. Asseqüências de polipeptídeo dos derivados funcionalmente ativos podem conterdeleções, adições e/ou substituições de aminoácidos cuja ausência, presençae/ou substituição, respectivamente, não tem nenhum impacto negativosubstancial sobre a atividade do polipeptídeo, por exemplo, aminoácidos queestão localizados em uma parte da seqüência de polipeptídeo que nãocontribui para a atividade biológica da proteína. Deleções, adições e/ousubstituições menores de aminoácidos das respectivas seqüências depolipeptídeo que não alteram a atividade biológica do dito polipeptídeotambém estão incluídas no presente pedido como derivados funcionalmenteativos.

No que segue as expressões "VKORC1 (recombinante) ou umderivado desta funcionalmente ativo" e "proteína VKD (recombinante) ou umderivado desta funcionalmente ativo" também serão designados como"(r)VKORCl" e "proteína (r)VKD", respectivamente.

Os ácidos nucleicos recombinantes da presente invençãopodem ser obtidos por qualquer método conhecido na técnica para a produçãode ácidos nucleicos recombinantes, por exemplo, por intermédio datecnologia de DNA recombinante, transcrição reversa de RNA e/ouamplificação de DNA, ou por intermédio da reprodução bacteriana.

O organismo hospedeiro da presente invenção pode serderivado de qualquer organismo hospedeiro, incluindo organismoshospedeiros recombinantes, que seja capaz de expressar uma rVKORClbiologicamente ativa e uma proteína rVKD biologicamente ativa. Emparticular, o organismo hospedeiro da presente invenção pode ser umorganismo hospedeiro eucariótico, incluindo organismos multicelulares,caracterizados pela produção de uma proteína rVKD farmacologicamenteativa.

Em uma forma de realização da presente invenção oorganismo hospedeiro é uma célula de mamífero, por exemplo uma céluladerivada de uma linhagem de célula de mamífero selecionada do grupo queconsiste de células CHO, células HEK293, células NSO, células Sp20, célulasPérc.6, células SkHep, células HepG2, células BHK, células HeLa, célulasVero, e células COS. Em exemplos específicos da presente invenção oorganismo hospedeiro é uma célula derivada de células CHO ou célulasHEK293.

Em uma forma de realização da presente invenção o ácidonucleico que codifica rVKORCl ou o ácido nucleico que codifica a proteínarVKD ou ambas contido no organismo hospedeiro da presente invenção sãoexpressadas por intermédio de um mode de expressão selecionado do grupoque consiste de expressão induzida, transitória, e permanente. Qualquersistema de expressão conhecido na técnica ou comercialmente disponívelpode ser utilizado para a expressão dos ácidos nucleicos recombinantes quecodificam VKORC1 e/ou a proteína VKD, incluindo o uso de sistemasreguladores tais como promotores, realçadores etc, adequados,preferivelmente controlável.

Em uma forma de realização preferida do organismohospedeiro da presente invenção o ácido nucleico recombinante que codificaVKORC1 ou o ácido nucleico recombinante que codifica uma proteína VKDou ambos são estavelmente integrados no material genético do organismohospedeiro da presente invenção.

O organismo hospedeiro da presente invenção pode ser usadopara a expressão melhorada de proteínas rVKD tais como fatores sangüíneosou derivados funcionalmente ativos destes, preferivelmente fatoressangüíneos pró-coagulantes ou anticoagulantes humanos ou derivadosfuncionalmente ativos destes. Em uma forma de realização preferida dapresente invenção a proteína rVKD é um fator sangüíneo pró-coagulantehumano farmacologicamente aceitável que pode ser usado no tratamento dedistúrbios de hemorragia.

Como um exemplo da presente invenção a proteína rVKD éum fator sangüíneo pró-coagulante, incluindo o fator II, fator VII, fator IX,preferivelmente fator IX humano, e fator X, ou um fator sangüíneoanticoagulante, incluindo a proteína C, proteína S e proteína Z.

De acordo com a presente invenção o organismo hospedeirocontém um ácido nucleico recombinante que codifica VKORC1 e um ácidonucleico recombinante que codifica uma proteína VKD, em que tanto arVKORCl quanto a proteína rVKD são expressadas no dito organismohospedeiro e em que a produtividade de expressão da proteína VKDrecombinante é substancialmente melhorada.

O termo "em que a produtividade de expressão de proteínaVKD recombinante é substancialmente melhorada" como aqui usado significaque a quantidade, taxa de secreção, atividade e/ou estabilidade de umaproteína VKD recombinantemente expressada ou um derivado destafuncionalmente ativo são substancialmente aumentadas quando comparadascom a expressão da proteína rVKD em um organismo hospedeiro que não co-expressa rVKORCl.

A melhora da produtividade de expressão da proteína VKDrecombinante pode ser determinada por qualquer método conhecido natécnica incluindo a isolação, por exemplo, a partir de um meio de cultura oupela colheita do organismo hospedeiro, e análise, por exemplo, por intermédioda eletroforese, cromatografia, ou imunoadsorção, das proteínas expressadas.Em uma forma de realização preferida da presente invenção a expressão dasproteínas rVKD é detectada por intermédio de qualquer imuno ensaio deenzima conhecidos tais como um ensaio imuno-sorvente ligado a enzima(ELISA). Alternativamente, a integridade e atividade da proteína rVKDpodem ser avaliadas medindo-se o tempo de tromboplastina parcial ativada(APTT).

Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a umsistema de cultura de célula que compreende células que contém um ácidonucleico recombinante que codifica VKORC1 e um ácido nucleicorecombinante que codifica uma proteína VKD, em que tanto a rVKORClquanto a proteína rVKD são expressadas nas ditas células.

O sistema de cultura de célula da presente invenção podecompreender qualquer sistema de cultura de célula que contenha célulascapazes de expressar uma rVKORCl biologicamente ativa e uma proteínarVKD biologicamente ativa. Os exemplos de células adequadas são listadasacima. Em uma forma de realização preferida o sistema de cultura de célulada presente invenção é um sistema de célula eucariótico caracterizado pelaprodução de uma ou mais proteínas rVKD farmacologicamente ativas.

Em uma forma de realização da presente invenção o sistemade cultura de célula da presente invenção compreende um organismohospedeiro como definido acima.

Não existe nenhuma limitação particular para o meio,reagentes e condições usados para cultivar as células no sistema de cultura decélula da presente invenção incluindo cultivar as células em uma maneiracontínua ou por batelada. Em uma forma de realização da presente invençãoas células são cultivadas sob condições isentas de soro ou isentas de soro eproteína. Em uma outra forma de realização da presente invenção ascondições são utilizadas sob as quais as células que contêm um ácido nucleicorecombinante que codifique VKORC1 ou uma proteína VKD sãoseletivamente proliferadas, por exemplo, usando-se um meio seletivo.

A proteína rVKD desejada que foi expressada pelas células doorganismo hospedeiro selecionado e que, dependente do sistema detransfecção/vetor usado, está contida nas células ou secretadas no meio paracultivar células, pode ser isolada/recuperada do sistema de cultura de célulausando métodos conhecidos na técnica.

É um outro aspecto da presente invenção fornecer um métodopara melhorar a atividade específica da proteína VKD recombinanteexpressada em um organismo hospedeiro que compreende as etapas de:

(a) fornecer um organismo hospedeiro;

(b) inserir um ácido nucleico recombinante que codifica umaproteína VKD ou um derivado desta funcionalmente ativo no organismohospedeiro da etapa (a);

(c) inserir um ácido nucleico recombinante que codifiqueVKORC1 no organismo hospedeiro da etapa (a); e

(d) expressar os ácidos nucleicos recombinantes das etapas (b) e(c).

Em uma forma de realização da presente invenção os ácidosnucleicos recombinantes que codificam VKORC1 ou uma proteína VKD sãoinseridos no organismo hospedeiro simultaneamente por intermédio da co-transfecção. Alternativamente, os ditos ácidos nucleicos recombinantes sãoinseridos no organismo hospedeiro seqüencialmente por intermédio detransfecções subseqüentes.

Os ácidos nucleicos recombinantes usados de acordo com apresente invenção podem estar contidos em qualquer forma e sistemaadequados para a transfecção em um organismo hospedeiro incluindoplasmídeos e vetores virais. Os ácidos nucleicos recombinantes que codificamVKORC1 e uma proteína VKD, respectivamente podem estar ambospresentes em uma molécula de vetor ou cada um em uma molécula de vetor,em que as duas moléculas de vetor diferentes podem ser as mesmas oudiferente. A transfecção dos ácidos nucleicos recombinantes depende dosistema de transfecção usado e pode ser realizada por qualquer métodoconhecido na técnica ou comercialmente disponível para transfectar umorganismo hospedeiro como por exemplo uma célula eucariótica incluindoeletroporação, precipitação, ou microinjeção.

É um outro aspecto da presente invenção fornecer um métodopara melhorar a produtividade de expressão da proteína VKD recombinanteem um organismo hospedeiro que compreende as etapas de:

(a) fornecer um organismo hospedeiro tendo um ácidonucleico recombinante que codifique uma proteína VKD integrada no seumaterial genético, preferivelmente seu genoma;

(b) inserir um ácido nucleico recombinante que codifiqueVKORC1 no organismo hospedeiro da etapa (a); e

(c) expressar os ácidos nucleicos das etapas (a) e (b).

Em uma forma de realização preferida da presente invenção oácido nucleico recombinante que codifica uma proteína VKD é estavelmenteexpressado.

É um outro aspecto da presente invenção fornecer um métodopara melhorar a produtividade de expressão da proteína VKD recombinanteem um organismo hospedeiro que compreende as etapas de:

(a) fornecer um organismo hospedeiro tendo um ácidonucleico recombinante que codifique VKORC 1 integrado no seu genoma;

(b) inserir um ácido nucleico recombinante que codifique umaproteína VKD no organismo hospedeiro da etapa (a); e

(c) expressar os ácidos nucleicos das etapas (a) e (b).

Em uma forma de realização preferida da presente invenção oácido nucleico recombinante que codifica VKORC 1 é estavelmenteexpressado.

De acordo com a presente invenção o organismo hospedeirodefinido acima ou o sistema de cultura de célula definido acima pode serusado para melhorar surpreendentemente a produtividade de expressão daproteína VKD recombinante pela co-expressão de rVKORCl.

É ainda um objetivo da presente invenção fornecer umaproteína rVKD obtenível pela inserção de um ácido nucleico recombinanteque codifique VKORC1 e um ácido nucleico recombinante que codifique adita proteína rVKD, expressar os ditos ácidos nucleicos, e recuperar a ditaproteína rVKD.

As figuras mostram:

A Figura 1 mostra as concentrações de rFIX em ng/ml (eixovertical) calculadas com base de valores ELISA (Fig. IA) e as atividadesespecíficas de rFIX calculadas com base nos valores da atividade decoagulação (APTT) em mU/ml (eixo vertical) (Fig. 1 B) depois dastransfecções transitórias de uma linhagem de célula que produz rFIX derivadade CHO com rVKORCl (1) ou um vetor vazio (2). sobrenadantes de culturade célula isentos de soro foram coletados depois de 24 horas.

A Figura 2 mostra as produtividades específicas de rFIX emng de rFIX/106 células/dia (eixo vertical) calculadas com base me valores deELISA (Fig. 2A) e as atividades específicas de rFIX calculada com base nosvalores de atividade de coagulação (APTT) em mU de rFIX/106 células/dia(eixo vertical) (Fig. 2B) depois das transfecções transitórias de uma linhagemde célula que produz rFIX derivado de CHO com rVKORCl (1) ou um vetorvazio (2). Os sobrenadantes de cultura de célula isentos de soro foramcoletados depois de 24 horas.

A Figura 3 mostra as concentrações de rFIX em ng/ml (eixovertical) calculadas com base em valores de Elisa (Fig. 3A) e as atividadesespecíficas de rFIX calculadas com base em valores de atividade decoagulação em mU/ml (eixo vertical) (Fig. 3B) depois das transfecçõestransitórias de uma Linhagem de célula que produz rFLX derivada de HEK293com rVKORCl (1) ou um vetor vazio (2). Os sobrenadantes cultura de célulaisenta de soro foram coletados depois de 24 horas.

A Figura 4 mostra as produtividades específicas de rFIX emng de rFLX/106 células/dia (eixo vertical) calculadas com base em valores deElisa (Fig. 4A) e as atividades específicas de rFLX calculadas com base emvalores de atividade de coagulação em mU rFLX/106 células/dia (eixo vertical)(Fig. 4B) depois das transfecções transitórias de uma linhagem de célula queproduz rFIX derivada de HEK293 com rVKORCl (1) ou um vetor vazio (2).Os sobrenadantes da cultura de célula isenta de soro foram coletados depois24 horas.

A Figura 5 mostra as atividades de coagulação específicas derFIX em % depois das transfecções transitórias de uma linhagem de célulaque produz rFIX derivada de CHO com rVKORCl (1) ou um vetor vazio (2)(Fig. 5A) e depois das transfecções transitórias de uma linhagem de célulaque produz rFIX derivada de HEK293 com rVKORCl (1) ou um vetor vazio(2)(Fig.5B).

A Figura 6 mostra a expressão transitória de rVKORCl emuma linhagem de célula derivada de CHO que expressa estavelmente rFVII.Esta linhagem de célula é transitoriamente transfectada com um vetor quecodifica VKORC1 ou o mesma vetor sem VKORC1 ("vetor vazio") como umcontrole. As transfecções são realizadas em duplicata, e com usosubseqüente de 5 concentrações de vitamina Kl diferentes. Os resultadosdas medições de produtividade e atividade de rFVII em sobrenadantes decultura contra concentrações de vitamina K são mostrados. Fig. 6A)Valores de produtividade com base nas medições de ELISA. Fig. 6B)Valores de produtividade com base nas medições de atividade decoagulação. Fig. 6C) cálculo da atividade de FVII específica com base nasunidades de coagulação de FVII por ug como determinado pelo ELISA.

A Figura 7 mostra a expressão transitória de rVKORCl emuma linhagem de célula derivada de CHO e uma de HEK293 queestavelmente expressa rFVII. Estas linhagens de célula são transfectadastransitoriamente com um vetor que codifica rVKORCl ou o mesmo vetor semrVKORCl ("vetor vazio") como um controle. As transfecções são realizadasem duplicata. Os resultados das medições de produtividade e atividade derFVII com base no ELISA e a coagulação de FVII e FVIIa em sobrenadantesde cultura são mostrados. A) linhagem de célula derivada de CHO. B)linhagem de célula derivada de HEK293.

A Figura 8 mostra a co-expressão bicistrônica estável de rFVIIe rVKORC em células hospedeiras CHODHFR'. Produtividades em rFVII declones selecionados gerados pela co-amplificação de gene com quantidadescrescentes de MTX. Dois vetores de expressão que codificam rFVII humanosdiferentes foram co-transfectados com um plasmídeo de seleção que codificaDUFR. Fig. 8A) 83 clones transfectados com uma construção de vetorcausando a co-expressão bicistrônica de rFVII e rVKORCl. Fig. 8B) 133clones co-transfectados com um vetor que codifica rFVII.

A Figura 9 mostra os valores de produtividade e atividadeespecífica de clones derivados de CHO que produzem rFVII com e sem a co-expressão bicistrônica de rVKORC 1 gerada depois da transfecção estável pelasubclonagem e amplificação de gene. 133 clones sem co-expressão e 83clones com co-expressão de rVKORCl são comparados em termos deprodutividade de rFVII e atividade de coagulação específica com base emELISA e medições de coagulação de FVII de rFVII secretado.

A Figura 10 mostra um exemplo de uma análise de northernblot da expressão de gene ao nível de mRNA isolado de linhagens de céluladerivada de CHO. Linha 1: linhagem de célula não transfectada CHO-DHFRLinha 2: clone rFVII Linhas 3 e 4: dois clones que foram subseqüentementetransfectados com vetores plasmídicos que codificam rFVII e rVKORClcomo descrito no Exemplo 4. Linhas 5 a 7: clones que foram transfectadoscom um vetor único que codifica um mRNA bicictrônico com seqüências derFVII e rVKORCl ligadas por intermédio de IRES como descrito noExemplo 3. Os Painéis A, B e C mostram a mesma mancha desenvolvidadepois da hibridização com três sondas diferentes. A) sonda para VKORC1humana. B) sonda para FVII humano. C) sonda para GAPDH de hamster. Asdesignações e tamanhos de mRNAs identificados são dados.

A Figura 11 mostra os níveis de expressão em rFVII de clonesde célula derivados de CHO e HEK293 estavelmente transfectados isoladosdepois da 2a transfecção de linhagens de célula que produz rFVII com umplasmídeo que codifica rVKORCl ou um de controle. O controle é o vetor hospedeiro vazio. Os valores de produtividade são fundamentados nasmedições por ELISA de rFVII secretado. Fig. 1 IA) clones de célula derivadosde CHO. Fig. 11 B) clones de célula derivados de HEK293.

A Figura 12 mostra os níveis de expressão de rFVIIcomparados contra os valores de atividade específica de clones de céluladerivados de CHO e HEK293 estavelmente transfectados isolados depois da2a transfecção de linhagens de célula que produzem rFVII com um plasmídeoque codifica rVKORCl ou um plasmídeo de controle. O controle é o vetorhospedeiro vazio. Os valores de produtividade são fundamentados nasmedições de ELISA de rFVII secretado. Os valores de atividade específicossão calculados como unidades de coagulação de FVII por ug de FVII comodeterminado pelo ELISA. Fig. 12A) mostra clones de célula derivados deCHO, Fig. 12B) clones de célula derivados de HEK293.

A presente invenção será ainda ilustrada nos seguintesexemplos sem qualquer limitação à mesma.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Transfecção transitória e co-expressão de rVKORCl emlinhagens de célula derivadas de HEK293 e CHO que produzem rFIX

A expressão de fator IX recombinante (rFLX) é obtida pelaintrodução de plasmídeos de expressão contendo a seqüência de DNA quecodifica o fator IX humano (FIX) sob o controle de um promotor viral forteem linhagens de célula hospedeira de mamífero por um método detransfecção apropriado que resulta em células tendo as seqüênciasestavelmente integradas introduzidas nos seus genomas. Os plasmídeostambém conferem resistência a um medicamento marcador selecionável pelaliberação do(s) gene(s) de resistência adequado(s). No caso de células CHO,que são capazes de crescer apenas na presença de precursores de nucleotídeono meio por causa de um defeito na enzima do caminho da síntese de novo denucleotídeo, a expressão desta enzima, a diidrofoliato-redutase (DHFR), é requerida. Isto possibilita a co-amplificação do gene FIX aumentando-segradualmente a concentração de metotrexato (MTX), que leva a um aumentode números de cópia de ambos os genes, codificando DHFR e rFIX, dentro dogenoma da célula. Para este propósito, os clones de célula derivadas de CHOtiveram que ser cultivados também em meio seletivo carecendo de nucleotídeos e precursores de nucleotídeo.

Para a identificação de células que produzem rFIX humanas,depois da transfecção e adição do(s) medicamento(s) seletivo(s) ao meio, asuspensão de célula é diluída para possibilitar a isolação de clones derivadosde célula única. Depois da isolação, estes clones de célula são cultivados até aconfluência para possibilitar a medição do teor de rFIX do sobrenadante decultura de célula pela técnica de ensaio imuno-sorvente ligado a enzima(ELISA). Para este propósito, as células têm que ser cultivadas na ausência dequalquer soro bovino fetal que promova o crescimento ou componentes destepara garantir a identificação pelas células de rFIX secretadas. Para garantir uma proteína rFIX totalmente funcional, a vitamina K é adicionada. Osobrenadante é colhido depois de 24 horas e analisada pela técnica de ELISAespecíficas para rFLX. Alem disso, a integridade e atividade da proteína éavaliada medindo-se o tempo de tromboplastina parcial ativado (APTT).

A co-expressão de rVKORCl é realizada pelas técnicas deexpressão transitória usando linhagens de célula, que já são selecionadas paraa expressão de rFIX. Um plasmídeo de expressão que compreende cDNA derVKORCl é transfectado nestas células sem outra seleção de clone. Ossobrenadantes são coletados dos agrupamentos de célula transfectada integral, e o teor e atividade de rFIX são comparados com controles negativos enormalizados quanto as taxas de secreção de rFIX específicas para avaliar osefeitos da atividade de rVKORCl.

Materiais e Métodos:

Vetores de Expressão

Os vetores de expressão são clonados de acordo com astécnicas de clonagem padrão. Em resumo, pSV-DHFR é gerado pela inserçãodo fragmento PstI de 1,5 kbp do vetor pAdD26SV(a)-3 (Scahill, S. J., Devos,R., Van der, H. J., & Fiers, W. (1983) Expression and characterization of theproduct of a human immune interferon cDNA gene in Chinese hamster ovarycells. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 80, 4654-4658; o vetor é um presente doDr. Hauser, GBF Alemanha) contendo DHFR de murino em um vetor pSVp(Clontech, Paio Alto, CA) fornecendo o realçador SV40, promotor inicial eintron, onde o gene da (3-galactosidase foi removido pela digestão com Notl, eum poliligador foi inserido. Este vetor também foi usado para gerar phactcontendo o promotor e o intron da actina humana trocando-se o fragmentoEcoRI/HindIII com o fragmento EcoRI/HindIII de phpAPr-l-pgal, quetambém é um presente do Dr. Hauser. phact-FIX contendo cDNA de FIXhumano do tipo selvagem com o polimorfismo alal48 (McGraw, R. A.,Davis, L. M., Noyes, C. M., Lundblad, R. L., Roberts, H. R., Graham, J. B., & Stafford, D. W. (1985) Evidence for a prevalent dimorphism in the activationpeptide of human coagulation factor IX. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A, 82,2847-2851) é gerado pela digestão com EcoRI de pFIX-bluescript, que foigerado pela inserção de FIX humano a partir de uma biblioteca de cDNA defígado humano aleatoriamente iniciada em pBluescript (Stratagene, La Jolla,CA), e inserindo o fragmento resultante no phact parcialmente digerido comEcoRI.

O vetor pCMV-FIX-neo é gerado pela inserção do fragmentoEcoRI de vetor pFIX-bluescript no pCMV13 (Clontech), onde o cDNA de p-gal foi removido. Dentro deste vetor, o códon para ala é trocado para thrpela mutagênese específica de sítio por intermédio da PCR, trocando opolimorfismo que ocorre naturalmente de alal48 para thrl48. O produtode PCR é re-inserido novamente no mesmo vetor. O fragmento de EcoRIdeste vetor é clonado em pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para produzir pCMV-FIX-neo.

O vetor pCMV-VKORCl-EDHpro é gerado usando-se o vetorpCEP4-VKORCl (gentilmente fornecido pelo Prof. Oldenburg, paradescrição ver Rost et ai, 2004) como um padrão para a PCR. O produto dePCR contendo o cDNA de rVKORCl é clonado no vetor pCMV-EDHpro(Herlitschka, S. E., Falkner, F. G., Schlokat, U., & Dorner, F. (1996)Overexpression of human prothrombin in permanente cell lines using adominant selection/amplification fusion marker. Protein Expr. Purif, 8, 358-364).

Cultura e transfecções de célula

As células CHO DUKX/DXB11 são obtidas da ColumbiaUniversity (Nova Iorque, NY) e são cultivadas em mistura de DMEM/Ham'sF12 (1:1) (Invitrogen) suplementada com 5 % de soro bovino fetal (PAA,Linz, Áustria), desóxi-adenosina, adenosina e timidina (todos da Sigma, St.Louis, MO) e L-Glutamina (Invitrogen) e penicilina/estreptomicina(Invitrogen). As células HEK293 (ATCC N2 CRL-1573) são cultivadas emmistura de DMEM/Ham's F12 (1:1) suplementada com 5 % de soro bovinofetal e L-Glutamina e penicilina/estreptomicina. Para as transfecções estáveis,um método de co-precipitação com fosfato de cálcio é usado. As célulasCHOrFIX são geradas pela co-transfecção com os plasmídeos linearizadosphact-FTX e pSV-DHFR e pela seleção em mistura de DMEM/Ham's F12(1:1) sem hipoxantina, glicina e timidina (Invitrogen) suplementada com 5 %de FBS dialisado (PAA). Para a amplificação de gene, MTX (Ebewe,Unterach, Áustria) é adicionado em concentrações aumentadasescalonadamente começando com 10 nM até 200 nM. As células HEK293 sãotransfectadas com plasmídeo linearizado pCMV-FIX-neo e selecionadas emmeio contendo 500 ng/ml de G418 (Invitrogen). Os clones de célula sãoisolados pelas técnicas de clonagem de diluição limitada manualmente ouusando uma técnica de classificação de célula citométrica de fluxo.

A secreção de FIX em sobrenadantes de cultura de célula édetectada trocando-se o meio de cultivo para meio isento de sorosuplementado com 10 ug/ml de vitamina Kl (Sigma). Os sobrenadantes sãocoletados e as concentrações de FIX são determinadas pelo ELISA e ensaiode coagulação (tempo de tromboplastina parcial ativado, APTT). Para o cálculo de taxas de secreção específicas, os números de célula são contadosusando um contador de célula CASY (Scharfe Systems, Reutlingen,Alemanha).

Para experimentos de co-expressão transitória, o plasmídeonão linearizado pCMVVKORCl-EDHPro é transfectado usando reagente de Lipofectamina 2000 (Invitrogen). O mesmo vetor sem cDNA de rVKORCl éusado como controle negativo.

Métodos analíticos

ELISAs são realizados usando um FIX anti-humano de coelhopoliclonal (Accurate Chemical, Westbury, NY) em uma diluição 1:40000como anticorpo primário, e um conjugado de FIX rábano-peroxidase anti-humano de cabra policlonal como anticorpo de detecção. Como um padrão,um FIX derivado de plasma humano (Enzyme Research Laboratories, S.Lafayette, IN) é usado. APTT é determinado usando um coagulômetroautomatizado STA Compact (Diagnostica Stago, Asnieres, França) peladiluição das amostras de FIX em plasma deficiente em FIX. Todos osreagentes para a coagulação são adquiridos da Baxter, Viena, Áustria.

Resultados

Duas linhagens de célula que produz rFIX estável, uma derivada de CHO e uma de HEK293, são submetidas às transfecçõestransitórias com o vetor de expressão pCMV-VKORCl-EDHpro que carregaum cDNA que codifica VKORC1 humana. Como controles, o vetor vaziopCMV-EDHpro e a linhagem de célula que expressa rFIX estável são usados.Depois das transfecções transitórias, as células são deixadas durante a noite em meio contendo soro. As células são lavadas com PBS e cultivadas por 24horas em meio isento de soro, depois os sobrenadantes são colhidos. Aexpressão e secreção de rFIX no meio são monitoradas pelos métodos dediagnóstico imunoquímica e coagulação que medem o nível de antígeno ou aatividade de coagulação. Para estimar efeitos sobre a produtividade celular,As taxas de secreção são calculadas com base na concentração de produto pornúmero de célula e 24 horas (Fig. 1 a Fig. 4).

As células HEK293 que expressam rFIX mostram um aumentomédio de 2,7 vezes de taxas de secreção específicas e um aumento de 2,9vezes de concentrações de rFIX depois da transfecção com rVKORCl emcomparação como o controle de vetor vazio. Estes valores são fundamentadosem medições APTT. Os valores de ELISA mostram um aumento de 2,0 vezesde concentrações, e um aumento de 1,8 vezes de produtividades específicas.

Para a linhagem de célula que produz rFLX derivada de CHO,um aumento de 1,5 vezes de títulos de ELISA, e um aumento de 1,2 vezes de taxas de secreção específicas com base em ELISA são observados. As taxasde secreção calculadas com APTT são 1,4 vezes mais altas, e asconcentrações de FIX medidas com APTT 1,7 vezes.

A partir destes valores pode ser concluído que para ambos ostipos de célula diferentes concentrações de produto de rFIX mais altos napresença de rVKORCl podem ser obtidas, principalmente por causa de umataxa de secreção de rFLX específica de célula mais alta. Uma razão para umataxa de secreção mais alta de moléculas rFIX com y-carboxilação completapode ser um mecanismo de controle de qualidade celular para estamodificação pós traducional (Lin, P. J., Straight, D. L., & Stafford, D. W.(2004) Binding of the factor IX gamma-carboxiglutamic acid domain to thevitamin K-dependent gamma-glutamil carboxilase active site induces aallosteric effect that may ensure processive carboxilation and regulate therelease of carboxilated product. J. Biol. Chem., 279, 6560-6566). Aumentos mais altos de valores APTT do que valores ELISA no caso de ambas aslinhagens de célula indicam também uma melhor atividade de coagulação deFIX.

Efeitos mais fortes de rVKORCl sobre a co-expressão de rFDCem células derivadas de HEK293 do que em células CHO podem serexplicados por uma produtividade de rFIX celular mais alta. Antes dastransfecções de VKORC1 transitórias, o clone derivado de 293 tem umaprodutividade 3,5 vezes mais alta do que o clone de CHO com respeito aosvalores de APTT, mas uma produtividade 5 vezes mais alta com respeito aoscélulas derivadas de 293 por causa de uma produtividade mais alta. Portanto,um rendimento mais alto da isoforma de rFIX ativa quando da restauração dacapacidade de y-carboxilação pela co-expressão de rVKORCl é encontradanesta linhagem de célula.

Exemplo 2: Co-expressão transitória de VKORC1 recombinante humana emlinhagens de célula de mamífero derivadas de CHO e HEK293 que produzemestavelmente o fator VII de coagulação recombinante humano (rFVII)

Qualquer influência da rVKORCl sobre a atividade e/ou taxade secreção de rFVII pode ser estudada pela co-expressão transitória emcélulas que produzem o fator VII de coagulação recombinante humano(rFVII). Assim, uma parte maior da população de célula que produz rFVIItambém co-expressa VKORC1 por um período curto de tempo. Durante esteperíodo, o rFVII secretado pode ser amostrado, caracterizado e comparadocom o rFVII secretado pelas mesmas linhas de célula transfectadas emparalelo com um controle de vetor vazio.

A expressão estável de rFVII em células de mamífero pode serobtida transfectando-se vetores plasmídicos contendo o cDNA de rFVIIhumano e seleção de genes de resistência e subseqüente seleção de cloneprodutor. As mesmas linhagens de célula hospedeiras como listado noExemplo 1 podem ser usadas para a expressão estável de rFVII. Osprocedimentos genéticos de seleção e amplificação de gene, e a triagemquanto aos clones produtores têm que ser realizadas analogicamente.

Depois disso, um vetor de expressão que carrega o cDNA deVKORC1 humana pode ser transfectado transitoriamente para se obter a co-expressão de VKORC 1 recombinante (rVKORCl) do mesmo modo comodescrito no Exemplo 1.

Materiais e métodos

Vetores de Expressão

Um vetor de expressão que compreende informação genéticade rFVII humano pode ser construído isolando-se cDNA de FVII humanopela PCR a partir de uma fonte apropriada como o vetor de expressão davacínia pselp/huFVII (Himly et al., 1998) como padrão. O produto de PCRpode ser inserido por intermédio de sítios de restrição em um vetor deexpressão de mamífero que ofereça um promotor viral forte como decitomegalovírus (CMV) e um marcador de seleção de antibiótico adicionalcomo o gene da resistência à neomicina ou higromicina, por exemplopcDNA3.1/hyg+ ou pcDNA3.1/neo+ (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Para a expressão de gene estável no sistema de expressãoCHO-DHFR' um plasmídeo adicional como pSV-DHFR como descrito noExemplo 1 pode ser usado para possibilitar a seleção de clones de célulacontendo DHFR e amplificação do gene MTX.

O vetor pCMV-VKORCl-EDHpro como descrito no Exemplo1 pode ser usado para a expressão transitória de rVKORCl.

Cultura e transfecções de célula

As mesmas linhagens de célula e protocolos de cultivo podemser usados como descrito no Exemplo 1. Para gerar transfectantes estáveis,um método de co-precipitação com fosfato de cálcio pode ser usado. Osplasmídeos têm que ser linearizados pela digestão com enzima de restrição antes das transfecções. Um vetor de expressão de mamífero contendo cDNAde FVII pode ser usado para a transfecção estável de linhagens de célulahospedeira CHO ou HEK293. As células CHO DUKX DXB11 devem ser co-transfectadas com pSV-DHFR. Se higromicina B é usada como agente deseleção, a sua concentração deve ser 100 ug/ml no meio para selecionartransfectantes derivados de HEK293, e 250 ug/ml no caso de transfectantesde CHO. Se a resistência à neomicina é usado como marcador de seleção, asconcentrações de G418 devem ser ajustadas como descrito no Exemplo 1 paracada tipo de célula.

Os protocolos de transfecção transitória incluem o uso de reagente de Lipofectamina® 2000 como descrito no Exemplo 1. Parapossibilitar a comparação de células que expressam rVKORCltransitoriamente com um controle negativo adequado, o vetor pCMV-VKORC1- EDHpro e o mesmo vetor sem a seqüência de cDNA VKORC1deve ser transfectado em paralelo em diversas replicações, preferivelmenteem placas de 6 reservatórios. As células derivadas da mesma população sãodistribuídas em densidades de célula iguais por reservatório. Na confluência,todas as transfecções são realizadas simultaneamente.

A secreção de rFVII em sobrenadantes de cultura de célulapode ser detectada trocando-se o meio de cultivo por meio isento de sorosuplementado com concentrações de vitamina K variáveis variando de 0,1 a10 Ug/ml. Os sobrenadantes podem ser coletados depois de 24 horas e asconcentrações de rFVII podem ser determinadas por métodos apropriadoscomo descrito abaixo. Para o cálculo de taxas de secreção de rFVIIespecíficas, as células devem ser contadas por exemplo usando-se umcontador de célula CASY (Scharfe Systems, Reutlingen, Alemanha), ou ométodo de exclusão de azul de tripano.Ensaios analíticos

Para triar quanto a clones produtores de rFVII, e pararelacionar as atividades de FVII com os níveis de antígeno, os seguintesensaios são apropriados:

A atividade de FVII pode ser medida em um ensaio decoagulação como tempo de coagulação de protrombina (PT) ou em um ensaiocromogênico de acordo com a Farmacopéia Européia (EuropeanPharmacopeia 5, 2005) como quantidade de geração do fator de coagulaçãoXa (FXa) quantificado pela conversão de um substrato FXa cromogênico. Osníveis de antígeno FVII podem ser determinados pelo ELISA usando pares deanticorpo apropriados, por exemplo um anti-soro FVII anti-humano de ovelhapoliclonal purificado por afinidade (Affinity Biologicals, Ancaster, Canadá)diluído 1:3000 para captura, e um conjugado de rábano peroxidase anti-humano de ovelha FVII policlonal (Cedarlane, Ontário, Canadá; diluído1:2000) para a detecção, seguido pela adição de um reagente cromogênicoapropriado para a detecção fotométrica.

Para todos os ensaios, as preparações de FVII derivadas deplasma devem ser usadas como material padrão, que são ensaiados contra opadrão FVII internacional 97/592. As atividades de coagulação específicasrelativas podem ser estimadas calculando-se as razões de antígeno medidopara os valores de atividade e comparando estas internamente ou com valoresde preparações derivadas de plasma ou FVII.Para estimar os níveis de FVIIa como parte de rFVII secretadototal, os seguintes ensaios podem ser usados: O ensaio Staclot® (DiagnosticaStago, Asnieres, França) é adequado para medir um tempo de coagulação deprotrombina FVIIa seletivamente (Morrissey et ai, 1993). Os níveis de FVIIadevem ser ensaiados contra o padrão de FVIIa internacional 89/688.

Resultados

Uma linhagem de célula derivada de CHO que produz rFVIIestável é submetida às transfecções transitórias com um vetor de expressãoque codifica VKORC1 pCMV-VKORCl-EDHpro. Como um controle, o vetor vazio pCMV-EDHpro sem o cDNA que codifica VKORC1 pode serusado. As células são semeadas em placas de 6 reservatórios nasconcentrações de célula de 1 x IO6 células por reservatório. Quando aconfluência é atingida, o procedimento de transfecção transitória é realizadoem duplicata. Depois da incubação durante a noite, as células são incubadas em meio isento de soro sem qualquer vitamina Kl para esgotar osreservatórios de vitamina Kl interno das células de fornecimentos de FBS.Depois de 24 horas, o meio é trocado por meio isento de soro contendovitamina Kl em várias concentrações variando de 0 a 5 jug/ml. Ossobrenadantes são coletados para mais análise. As produtividades por 24 horas são determinadas a partir dos valores de concentração de antígeno derFVII e atividade como medido pelo ELISA e ensaios de coagulação deestágio único. A atividade de coagulação de FVII específica é calculada comounidades de coagulação de FVII por ug de antígeno. Para estimar o grau deauto-ativação de rFVIIa para rFVIIa, o ensaio Staclot® pode ser usado. Nas

Figs. 6A, 6B e 6C, os resultados destes experimentos são mostrados.

Depois da transfecção transitória com ambas as construções devetor, os níveis de expressão de rFVII são determinados pelo ELISA (Fig.6A) e coagulação de FVII (Fig. 6B). Não há nenhuma quantidade significantede rFVIIa produzida pela linhagem de célula, portanto a atividade de rFVIIpode estar correlacionada com a produtividade de rFVII.

Sem vitamina Kl no meio, a produtividade celular e aatividade específica do rFVII produzido são significantemente mais baixascom e sem a co-expressão de rVKORCl. No caso da co-expressão derVKORCl, a produtividade de rFVII recupera em 0,1 ug/ml para uma valor 4vezes mais alto como a transfecção de controle com vetor vazio, comomedido tanto pela coagulação quanto por ELISA. A co-expressão derVKORCl melhora o uso de vitamina Kl adicionada ao meio de cultura decélula independente da concentração de vitamina Kl. no geral, aprodutividade de rFVII, determinada por dois métodos diferentes, é até quatrovezes mais alta do que o controle em todas as concentrações de vitamina Klcom a co-expressão de rVKORCl. A atividade específica como expressadaem unidades de coagulação por ug de rFVII produzido mostra valoressignificantemente mais baixos apenas em 0 ug/ml de vitamina Kl, e nãomostra diferenças significantes com e sem rVKORC 1.

Quando da comparação das linhagens de células derivadas deCHO com as derivadas de HEK293 estavelmente expressando rFVII depoisda co-expressão rVKORCl transitória em um experimento similar, asprodutividades significantemente mais altas podem ser encontradas como atransfecção de controle em ambos os casos (Fig. 7). Neste experimento, 0,5ug/ml de vitamina Kl é usado. Para as células CHO-rFVII, um nível deexpressão de rFVII 2,5 vezes mais alto com a co-expressão de rVKORCl doque o controle pode ser encontrado como determinado pela coagulação eELISA.

Pode ser concluído que a y-carboxilação é uma taxa limitantepara a produtividade de rFVII, quando a forma de vitamina K reduzidarequerida para esta reação não está disponível em quantidades suficientes. Ummecanismo de controle celular putativo retém moléculas de rFVII com y-carboxilação incompleta dentro da célula (Lin et ai, 2004). A co-expressãorVKORCl transitória melhora a produtividade de rFVII em uma ampla faixade concentrações de vitamina Kl pelo fornecimento de melhor suprimento daforma de vitamina K reduzida garantindo a y-carboxilação completa.

Estas descobertas mais uma vez estão de acordo com trabalhosanteriores, onde a co-expressão de y-carboxilase levou a uma diminuição daprodutividade de fator IX humano recombinante em células de mamífero(Hallgren et ai, 2002). A única função conhecida de VKORC1 dentro dometabolismo celular até agora é a redução de vitamina K-2,3 epóxido para aforma de hidroquinona necessária para a reação de y-carboxilação. Mesmo selinhagens de célula de mamífero possuíssem um mecanismo de y-carboxilação que funcionasse bem por si, pode ser concluído que a co-expressão de rVKORCl garante a qualidade da proteína de rFVII desejada dey-carboxilação completa.

Exemplo 3: Co-expressão bicistrônica estável de rVKORCl e rFVII emlinhagens de célula derivadas de CHO depois da transfecção de gene não viralPara fazer uso de qualquer efeito da co-expressão derVKORCl sobre a y-carboxilação dentro do escopo de gerar linhagens decélula de mamífero estáveis para a produção de rFVII, um sistema deexpressão bicistrônico pode ser usado. Com um tal sistema, a expressãosimultânea de duas proteínas em células eucarióticas depois da liberação deum único vetor de expressão pode ser obtido. Além disso, as duas proteínassão traduzidas da mesma molécula de mRNA simultaneamente. Isto épossibilitado pela introdução de um elemento genético viral chamado deseqüência de entrada de ribossoma interno (IRES) entre os cDNAs quecodificam os dois transgenes na construção de vetor de expressão (Mountforde Smith, 1995). Depois da transcrição do mRNA da construção de vetor deDNA, que foi integrado estavelmente no cromossoma da célula hospedeira,dois ribossomas podem ligar ao mRNA processado levando ao alongamentosimultâneo de ambas as cadeias de polipeptídeo.Um vetor tem que ser construído para fornecer elementos paraa expressão de mamífero, por exemplo promotores virais fortes, sinais depoliadenilação e genes de resistência que possibilitam a seleção de clone.Ambos os cDNAs que codificam as proteínas desejadas são clonados no vetorcom uma seqüência IRES no meio.

Para comparar a expressão de rFVII com rFVII bicistrônico eco-expressão de rVKORCl, um vetor de expressão de controle derivadoexatamente do mesmo vetor hospedeiro que carrega apenas o cDNA de rFVIIpode ser construído. Estes dois vetores podem ser transfectados em paralelona mesma linhagem de célula hospedeira, por exemplo a linhagem de célulaCHO-DHFR" CHO DUXK DXB11. Esta linhagem de célula oferece aoportunidade para realçar os níveis de expressão de proteína pelaamplificação de gene. Isto pode ser obtido pela co-transfecção de umplasmídeo que carrega o gene DHFR e pelos níveis crescentes domedicamento MTX durante o sub-cultivo como descrito no Exemplo 1. Pelacomparação do vetor de co-expressão com o vetor monocistrônico rFVII noseu sistema de expressão e co-amplificação, os efeitos da amplificação degene sobre os níveis de expressão de rFVII e as atividades na presença ouausência de rVKORC 1 como uma proteína auxiliar podem ser observados. Aseleção de clones que produzem rFVII e a caracterização de rFVII produzidopodem ser obtidos como explicado no Exemplo 2. Para evitar tendênciasespecíficas de clone quando da comparação dos dois sistemas de expressão,um número grande de clones, que foram triados pela mesma metodologia,deve ser caracterizado.

Materiais e métodos

Vetores de Expressão

As construções de vetor plasmídico, que são derivadas domesmo vetor hospedeiro como explicado no Exemplo 2, pode ser construídopelas técnicas de clonagem padrão. A construção do vetor pCMV-rFVII podeser realizada como descrito no Exemplo 2, o vetor análogo pCMV-rFVII-IRES-VKORC1 pode ser construído como segue: o cDNA de FVII humanopode ser amplificado por intermédio da PCR a partir da mesma fonte comousada no Exemplo 2. O elemento IRES pode ser isolado do vetor fontepIRES2-EGFP (Clontech, Paio Alto, CA), e o cDNA VKORC1 pode serclonado a partir do mesmo vetor fonte como descrito no Exemplo 1 (pCEP4-VKORC1). Todos os três elementos podem ser clonados no mesmo vetorhospedeiro como usado para a construção de pCMV-rFVII (ver o Exemplo 2).Em detalhes, o produto de PCR do cDNA de FVII com uma seqüência deKozak adicionada e sítios de restrição EcoRI podem ser clonados em umvetor intermediário (por exemplo, pBluescript; Stratagene, LaJolla, CA) parapossibilitar a clivagem por intermédio de sítios de restrição apropriados. Umfragmento HindIII/BarnFfl deste vetor intermediário contendo o cDNA deFVII pode ser clonado no pcDNA3.1/Hyg+ (Invitrogen). Esta construçãointermediária pode ser digerida com BamHI e Xhol para possibilitar ainserção de um fragmento BamHI/BstXI de pIRES2-EGFP (contendo IRES)junto com um produto de PCR com cDNA de VKORC1 (obtido do pCEP4-VKORC1 padrão) e sítios BstXI e Xhol nas extremidades 5' e 3'simultaneamente em uma reação de ligação para obter pCMV-rFVII-IRES-VKORC1.

Para possibilitar a expressão e amplificação de gene no sistemade expressão de CHO-DHFR", um segundo plasmídeo de seleção pSV-DHFRcomo descrito no Exemplo 1 pode ser usado.Cultura e transfeccões de célula

A linhagem de célula hospedeira CHO-DHFR" e os mesmosmateriais e protocolos de transfecção e cultivo como descrito no Exemplo 1podem ser usados para a geração e seleção de clones produtores de rFVIIdesejados. A amplificação de gene com MTX pode ser realizadaanalogicamente.Ensaios analíticos

Para caracterizar clones e sobrenadantes quanto a rFVII ouatividade e concentração, e para determinar a produtividade específica decélula, os mesmos ensaios como descritos no Exemplo 2 podem ser usados. A atividade de FVIIa tem que ser analogicamente monitorada.

Northern blots

Esta técnica pode ser usada para detectar a transcrição dosgenes introduzidos especificamente ao nível de mRNA, e para checar quantoaos tamanhos do mRNA corretos. O RNA celular total isolado e preparado apartir de uma população de célula pode ser separado em um gel de agarose emanchado sobre uma membrana de náilon. As seqüências de RNA específicaspodem ser detectadas por intermédio da hibridização de uma sonda rotuladacom DIG e desenvolvida com um anticorpo anti DIG rotulado com fosfatasealcalina (Roche, Basel, Suíça) depois da ligação à sonda hibridizada pela quimioluminescência em película de raios X. Os níveis de mRNA alvo(rVKORCl e rFVII) devem ser comparados contra um gene de manutenção(por exemplo, gliceraldeído fosfato desidrogenase de hamster (GAPDH)).Resultados

Os clones de célula estável derivados dos sistemas deexpressão CHO-DHFR" podem ser gerados e ensaiados quanto aprodutividade de rFVII pelas técnicas de ELISA e coagulação pelo tempo deprotrombina (PT). Os plasmídeos de expressão pCMV-rFVII-IRES-VKORClou pCMV-rFVII podem ser co-transfectados com o plasmídeo de seleçãopSV-DHFR pela técnica de co-precipitação com fosfato de cálcio e os clonespodem ser obtidos pela exposição ao meio de seleção que careça dehipoxantina, glicina e timidina e pela seleção de antibiótico. Os clonesderivados de célula única são triados depois da clonagem pela diluiçãolimitada e são subcultivados diversas vezes com concentrações de MIXcrescentes para se obter a amplificação de gene. Os clones são expostos àsconcentrações de MTX de até 320 nM com cada etapa de subclonagem. A partir de todas as rodadas de subclonagem, um total de 133 clones derivados de transfecções de pCMV-rFVII e 83 clones derivados de transfecções com a construção da co-expressão de rVKORCl são expandidos e caracterizados em detalhes. Para os sobrenadantes de cultura de célula, as concentrações de rFVII podem ser determinadas pelas atividades de ELISA, rFVII e rFVIIa são medidas pelos ensaios de coagulação PT em paralelo. Apenas os clones com menos do que 10 % de rFVII ativados para FVIIa são considerados para caracterização para evitar valores de coagulação de FVII específicos artificialmente altos (dados não mostrados). Os níveis de expressão são calculados a partir dos valores de concentração de ELISA como ng por IO6 células por 24 horas. A atividade de coagulação de FVII específica é calculada como unidades de coagulação por ug.

Na Fig. 8, os valores de produtividade específicos com base no ELISA são plotados contra concentrações de MTX para clones que expressam apenas rFVII (Fig. 8A), e clones que co-expressam rFVII-rVKORCl (Fig. 8B) respectivamente. Em ambas as linhagens uma relação entre os níveis de MTX e os níveis de expressão é visível. Os clones iniciais em nenhum MTX começam em níveis comparáveis, ou mesmo mais altos em relação aos clones apenas de rFVII. Especialmente, quando MTX é aumentado a níveis de partida baixos de 20 a 40 nM, um padrão de aumento concomitante mais excessivo dos níveis de expressão para os clones que co-expressam rFVII-rVKORCl é claramente visível na Fig. 8A versus Fig. 8B. Em 80 nM de MTX, todos os clones que co-expressam rFVII-rVKORCl expressam 2 a 80 vezes mais rFVII do que os clones iniciais, ao passo que para os clones apenas de rFVII, ainda alguns clones são encontrados com níveis de expressão similares aos clones iniciais. A partir de 20 nM para cima, clones produtores melhores são encontrados dentro de rFVII-rVKORCl do que clones apenas de rFVII em todos os níveis de MTX. Pode ser observado, queo nível de expressão de clones que produzem rFVII melhor depois da amplificação de gene é duas vezes mais alta com a co-expressão de rVKORC 1 especialmente em rodadas iniciais de aumento de MTX.

Com respeito à atividade de coagulação de FVII específica, os valores calculados para todos estes clones podem ser plotados contra a produtividade para comparar a funcionalidade da proteína. Na Fig. 9, ambas as linhagens são comparadas mostrando cerca de valores de atividade iguais em faixas de produtividade similares com um declínio global na produtividade mais alta para ambos. Como rFVII-rVKORCl co-produtores com produtividade mais do que duas vezes mais alta são encontrados, os valores de atividade em uma faixa mais alta que 4 ug por 106 células por dia não podem ser comparadas. Acima deste nível de expressão em clones rFVII-rVKORCl, um valor de atividade constante de 2 U por ug similar ao FVII derivado de plasma (Moor et al., 1995) pode ser mantida.

A funcionalidade e a integração genômica funcional da construção de vetor incluindo o elemento IRES que leva à transcrição de um único mRNA bicistrônico contendo seqüências que codificam rFVII e rVKORCl pode ser demonstrado pela técnica de northern blotting, especialmente se não existe nenhum ensaio específico de VKORC1 disponível.

A Fig. 10 mostra um exemplo de um northern blot, onde o mRNA total de transfectante derivado de CHO ou células de controle foram isoladas depois da lise de célula, e foram manchadas em uma membrana de náilon depois da separação eletroforética. A membrana foi hibridizada três vezes subseqüentemente com sondas de DNA rotuladas com DIG específicas para VKORC1 humana, para FVII humana, e para um gene de referência, GAPDH de hamster. As sondas são detectadas com anticorpos rotulados específicos de DIG. As amostras são: células CHO-DHFR" não transfectadas, um clone derivado de CHO que expressa apenas rFVII, dois clones, queforam transfectados com vetores que codificam rFVII e rVKORCl subseqüentemente como descrito no Exemplo 3, e três clones com co-expressão de rFVII e rVKORCl bicistrônico. Os transcritos de mRNA com tamanhos de aproximadamente 2,4 kb para a construção de rFVII-IRES-rVKORCl, de 1,4 kb para a construção de rFVII, 0,5 kb para o mRNA de rVKORCl, e 1,0 kb para o mRNA de controle GAPDH, pode ser detectado com todas as três sondas. GAPDH pode ser encontrado em todos os clones, ao passo que rVKORCl e rFVII estão presentes de acordo com vetores plasmídicos transfectados nas respectivas linhagens de célula.

Em resumo, a co-expressão bicistrônica estável de rVKORCl tem um efeito realçador sobre a produtividade de rFVII em células de mamífero, especialmente quando a amplifícação de gene é aplicada. O rendimento de clones produtores altos de rFVII depois da transferência de gene é mais alta com a co-expressão de rVKORCl. Com metade dos números de clones triados, níveis de expressão duas vezes mais altos podem ser obtidos nos mesmos níveis de concentração de MTX. A atividade de proteína pode ser mantida em altos níveis de secreção de proteína celular. Ambos os efeitos podem ser explicados pelo fornecimento suficiente da forma reduzida de vitamina K requerida para a reação de y-carboxilação, que tem que ocorrer em uma taxa de metabolização alta em níveis de secreção de proteína altos para garantir a liberação adequada da proteína completamente carboxilada. Exemplo 4: Co-expressão estável de rFVII e rVKORCl depois de duas transfecções não virais subseqüentes em células de mamífero CHO ou HEK293

Para verificar os efeitos de rVKORCl como proteína auxiliar sobre a expressão recombinante de rFVII em cultura de célula de mamífero, um outro método pode ser usado para se obter a co-expressão de rVKORCl junto com rFVII. Uma estratégia para selecionar quanto aos clones que mostram a co-expressão de rFVII e rVKORCl estável depois de uma segundatransfecção pode ser utilizada. Um clone, que foi selecionado quanto a expressão de rFVII depois da transfecção estável, pode ser transfectado uma 2a vez com um outro vetor plasmídico que codifique a VKORC1 humana. Um segundo marcador de resistência pode ser introduzido para garantir uma etapa de seleção pela resistência a um outro antibiótico. Como um controle apropriado, o mesmo vetor sem cDNA de VKORC1 pode ser transfectado em paralelo na mesma população de célula. A partir destas transfecções, clones estáveis podem ser isolados depois da seleção simultânea com dois antibióticos dentro de uma etapa de clonagem e caracterizados como descrito nos Exemplos 2 e 3. Uma comparação destes clones recém isolados deve possibilitar conclusões de efeitos da co-expressão de rVKORCl sobre a produtividade e atividade de rFVII. Materiais e Métodos Vetores de expressão

Para gerar clones que produzem rFVII, os mesmos vetores de expressão e fonte de cDNA de rFVII como listado no Exemplo 2 pode ser usado. Para o sistema CHO-DHFR", um plasmídeo de seleção adicional pSV-DHFR pode ser usado.

Para se obter a co-expressão de rVKORCl depois de uma segunda transfecção, um vetor que codifica VKORC1 humana e um marcador de seleção de antibiótico diferente como usado para a primeira transfecção podem ser tomados. Este vetor pode ser construído pela inserção de um produto de PCR gerado a partir do mesmo padrão como descrito no Exemplo 1 em um vetor com base em pcDNA3.1 (Invitrogen). Neste caso, o mesmo vetor pcDNA3.1 sem inserto deve ser tomado para a 2a transfecção de controle. Alternativamente, o vetor pCMWKORCl-EDHpro como descrito no Exemplo 1 pode ser tomado como vetor de expressão para a mesma transfecção. Como plasmídeo de controle, o vetor vazio pCMV-EDHpro (referência ver o Exemplo 1) pode ser usado.Cultura de célula e transfecções

As mesmas linhagens de célula como usadas no Exemplo 1, CHO e HEK293, podem ser usadas para gerar linhagens de célula estáveis que produzem rFVII. Todos os meios de cultura de célula, protocolos de 5 transfecção e cultivo podem ser usados conseqüentemente. Para se obter a co-expressão estável de rVKORCl nestas linhagens de célula, uma segunda transfecção usando co-precipitação com fosfato de cálcio pode ser usada. Uma outra etapa de clonagem usando um medicamento de seleção de antibiótico adicional é necessário para se obter clones com a co-expressão derFVII e rVKORCl. Ensaios Analíticos

Os mesmos ensaios para a medição de concentração e atividade como descritos nos Exemplos 2 e 3 podem ser usados para verificar a expressão de rFVII. A transcrição de rVKORCl ao nível do mRNA pode ser mostrada pela técnica de northern blot como descrito no Exemplo 3. Resultados

Para demonstrar um efeito da proteína auxiliar rVKORCl sobre a expressão de rFVII, um método de duas transfecções subseqüentes e rodadas de clonagem pode ser utilizado. Na primeira rodada, os clones decélula que expressam rFVII podem ser isolados pelas técnicas de triagem apropriadas depois da transfecção estável e seleção de antibiótico. Um destes clones pode ser expandido e usado para uma segunda transfecção com um plasmídeo que codifica VKORC1 humano ou um plasmídeo de controle vazio. Um outro marcador de seleção pode ser introduzido. Mais uma vez,clones podem ser triados quanto a expressão de rFVII pelas técnicas apropriadas, depois da adição do segundo medicamento de seleção de antibiótico ao meio, garantindo assim o esgotamento de células não transfectadas. Os clones que se originam de transfecções de rVKORCl ou de controle podem ser comparados em termos da produtividade ou atividade derFVII. O vetor de controle vazio garante a comparação de clones que são expostos às mesmas condições de cultivo com influência sobre a expressão de rFVII, especialmente seleção de antibiótico duplo.

Tipicamente, de todos os clones derivados de células 5 transfectadas com sucesso, um pequeno número de clones é selecionado de acordo com a sua produtividade de rFVII e expandido para outra caracterização. Esta caracterização inclui a determinação de concentrações de rFVII secretadas pela técnica de ELISA de antígeno e pela medição de atividades de coagulação de rFVII e rFVIIa. A co-expressão de rVKORCl e rFVII pode ser verificada ao nível de mRNA pela técnica de northern blot como mostrada para dois clones derivados de CHO na Fig. 10, linhas 3 e 4.

Na Fig. 11, valores de produtividade específicos com base nos títulos de ELISA em sobrenadantes de cultura são mostrados para uma faixa de clones selecionados que se originam de rVKORCl 2a5 transfecções ou transfecções de controle de uma linhagem de célula que produz rFVII derivada de CHO (Fig. 11 A) e uma derivada de HEK293 (Fig. 11 B). Pode ser observado para ambos os tipos de célula, que clones derivados da transfecção de rVKORCl produz mais rFVII do que aqueles que se originam da transfecção de controle. O valor médio de todas as produtividades éaproximadamente duas vezes mais alta para os clones rVKORCl em ambos os casos.

Nas Figs. 12A e 12B, as atividades de coagulação de rFVII específicas dadas como unidades de coagulação FVII por micrograma no ELISA são mostrados para os clones derivados de ambos os tipos de célula 25 depois das 2a5 transfecções. Para os cálculos de atividade específicas, os clones com uma alta quantidade de ativação de rFVII para rFVIIa, que pode ser medida pelo ensaio de coagulação específica de FVIIa, não deve ser considerados. Um valor de 10 % de unidades de coagulação de FVIIa por unidades de coagulação de FVII pode ser escolhido para excluir clones queproduzem uma quantidade significante de rFVII ativado para rFVIIa. Portanto menos clones são mostrados na Fig. 12 do que na Fig. 11.

Diferenças na atividade de coagulação de FVII específica podem ser correlacionada melhor com o nível de expressão do que com a co-expressão de rVKORCl. Entretanto, no caso de clones derivados de CHO, clones com níveis de expressão similares mostram atividade mais alta na presença da co-expressão de rVKORCl. Com respeito à produtividade para clones de célula derivados tanto de CHO quanto de HEK293, pode ser concluído que a co-expressão de rVKORCl leva a uma melhora média deduas vezes em comparação a um controle. Além disso, pode ser concluído, que a atividade de rFVII também é afetada por outros fatores influenciados pela secreção da proteína metabólica da célula e capacidade de modificação além da y-carboxilação. Os valores de produtividade e atividade estão de acordo com os resultados de experimentos da co-expressão de rFVII/rVKORCl como descrito nos Exemplos 2 e 3. Lista de referências

European Pharmacopeia 5. Assay of Human Coagulation Factor VIL 5a Edição 2.7.10, 203.2005. Ref Tipo: GenéricaHallgren, K. W., Hommema, E. L., McNally, B. A., e Berkner, K. L., 2002. Carboxylase overexpression effects full carboxylation but poor release and secretion of factor IX: implications for the release of vitamin K-dependent proteins. Biochemistry 41, 15045-15055.

Himly, M., Pfleiderer, M., Holzer, G., Fischer, U., Hannak, E., Falkner, F. G., e Dorner, F., 1998. Defective vaccinia virus as a biologically safe tool for the overproduction of recombinant human secretory proteins. Protein Expr. Purif. 14,317-326.

Lin, P. L, Straight, D. L., e Stafford, D. W., 2004. Binding of the factor LX gamma-carboxyglutamic acid domain to the vitamin K-dependent gamma-glutamyl carboxylase active site induces an allosteric effect that may ensure processive carboxylation and regulate the release of carboxylated product. J. Biol. Chem. 279, 6560-6566.

Moor, E., Silveira, A., van't Hooft, F., Suontaka, A. M., Eriksson, P., Blomback, M, e Hamsten, A., 1995. Coagulation factor VII mass and activity in young men with myocardial infarction at a young age. Role of plasma lipoproteins and factor VII genotype. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15, 655-664.

Morrissey, J. H., Macik, B. G., Neuenschwander, P. F., e Comp, P. C., 1993. 1

Quantitation of activated factor VII leveis in plasma using a tissue factor mutant selectively deficient in promoting factor VII activation. Blood 81, 734-744.

Mountford, P. S. e Smith, A. G., 1995. Internai ribosome entry sites and dicistronic RNAs in mammalian transgenesis. Trends Genet. 11, 179-184.

Claims (19)

1. Organismo hospedeiro, caracterizado pelo fato de que contém um ácido nucleico recombinante que codifique uma subunidade 1 do complexo de vitamina K redutase (VKORC1) ou um derivado desta funcionalmente ativo, e um ácido nucleico recombinante que codifique uma proteína dependente de vitamina K (VKD) ou um derivado desta funcionalmente ativo, em que tanto o VKORC1 recombinante quanto a proteína VKD recombinante são expressadas no dito organismo hospedeiro.

2. Organismo hospedeiro de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica VKORC1 recombinante ou o ácido nucleico que codifica a proteína VKD recombinante ou ambos são expressados por intermédio de um modo de expressão selecionado do grupo que consiste de expressão induzida, transitória e permanente.

3. Organismo hospedeiro de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o organismo hospedeiro é uma célula de mamífero.

4. Organismo hospedeiro de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula derivada de uma linhagem de célula de mamífero selecionada do grupo que consiste de células CHO e células HEK293.

5. Organismo hospedeiro de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a proteína VKD recombinante é um fator sangüíneo pró-coagulante ou um derivado deste funcionalmente ativos.

6. Organismo hospedeiro de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o fator sangüíneo pró-coagulante é selecionado do grupo que consiste de fator II, fator VII, fator DC e fator X.

7. Organismo hospedeiro de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que o fator sangüíneo pró-coagulante é o fator IX humano.

8. Sistema de cultura de célula, caracterizado pelo fato de que compreende células que contêm um ácido nucleico recombinante que codifica 5 uma subunidade 1 do complexo de vitamina K redutase (VKORC1) ou um derivado desta funcionalmente ativo e um ácido nucleico recombinante que codifica uma proteína dependente de vitamina K (VKD) ou um derivado desta funcionalmente ativo, em que tanto a VKORC1 recombinante quanto a proteína VKD são expressadas nas ditas células.

9. Sistema de cultura de célula de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as células cultivadas são células de mamífero.

10. Sistema de cultura de célula de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as células de mamífero são selecionadas do grupo que consiste de células CHO e células HEK293.

11. Sistema de cultura de célula de acordo com as reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a proteína VKD recombinante é um fator sangüíneo pró-coagulante ou um derivado desta funcionalmente ativo.

12. Sistema de cultura de célula de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o fator sangüíneo pró-coagulante é selecionado do grupo que consiste de fator II, fator VII, fator IX e fator X.

13. Sistema de cultura de célula de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o fator sangüíneo pró-coagulante é o fator IX humano.

14. Método para melhorar a produtividade da expressão de proteína dependente da vitamina K recombinante (VKD) ou de um derivado desta funcionalmente ativo em um organismo hospedeiro, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) fornecer um organismo hospedeiro;(b) inserir um ácido nucleico recombinante que codifique a proteína VKD ou um derivado desta funcionalmente ativo no organismo hospedeiro da etapa (a);(c) inserir um ácido nucleico recombinante que codifique umasubunidade 1 do complexo de vitamina K redutase (VKORC1) ou um derivado desta funcionalmente ativo no organismo hospedeiro da etapa (a); e (d) expressar os ácidos nucleicos recombinantes das etapas (b) e(c).

15. Método para melhorar a produtividade da expressão de proteína dependente da vitamina K recombinante (VKD) ou de um derivado desta funcionalmente ativa em um organismo hospedeiro, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) fornecer um organismo hospedeiro tendo um ácido nucleico recombinante que codifique uma proteína VKD ou um derivadodesta funcionalmente ativo integrados no seu genoma;(b) inserir um ácido nucleico recombinante que codifique uma subunidade 1 do complexo de vitamina K redutase (VKORC1) ou um derivado desta funcionalmente ativo no organismo hospedeiro da etapa (a); e(c) expressar os ácidos nucleicos das etapas (a) e (b).

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico recombinante que codifique uma proteína VKD ou um derivado desta funcionalmente ativo é estavelmente expressado.

17. Método para melhorar a produtividade da expressão de proteína dependente da vitamina K recombinante (VKD) ou de um derivado desta funcionalmente ativo em um organismo hospedeiro, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) fornecer um organismo hospedeiro tendo um ácido nucleico recombinante que codifique uma subunidade 1 do complexo devitamina K redutase (VKORC1) ou um derivado desta funcionalmente ativo integrados no seu genoma;(b) inserir um ácido nucleico recombinante que codifique uma proteína VKD ou um derivado desta funcionalmente ativo no organismo hospedeiro da etapa (a); e(c) expressar os ácidos nucleicos das etapas (a) e (b).

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico recombinante que codifica VKORC1 ou um derivado desta funcionalmente ativo é estavelmente expressado.

19. Proteína dependente da vitamina K recombinante (VKD)caracterizada pelo fato de ser obtenível pela inserção de um ácido nucleico recombinante que codifique uma subunidade 1 do complexo de vitamina K redutase (VKORC1) ou um derivado desta funcionalmente ativo e um ácido nucleico recombinante que codifique a dita proteína VKD recombinante ou um derivado desta funcionalmente ativo em um organismo hospedeiro, expressar os ditos ácidos nucleicos, e recuperar a dita proteína VKD recombinante.