KR20070107739A

KR20070107739A - 인간 항체들과 단백질들

Info

Publication number: KR20070107739A
Application number: KR1020077019951A
Authority: KR
Inventors: 티모시 데이비드 존스; 매튜 폴 바커
Original assignee: 안티토페 리미티드
Priority date: 2005-02-03
Filing date: 2006-02-03
Publication date: 2007-11-07
Also published as: CN101115771B; JP2014073128A; AU2006210724A1; US20170210820A1; WO2006082406A2; JP2013028616A; WO2006082406A3; EP1844074A2; US20150031860A1; CA2596833C; HK1109636A1; JP2008528668A; DK1844074T3; KR101385886B1; ES2417133T3; CN101115771A; US20150031550A1; JP5461643B2; EP2388271A3; JP2016210782A

Abstract

본 발명은 항체들을 포함하여 면역원성이 감소된 컴포지트 단백질들을 제공한다. 특히, 인간에의 사용 목적을 지니고 하나 이상의 T 세포 에피토프들을 제거하기 위하여 변형시킨 항체들을 제공한다. 그러한 단백질들을 발생시키는 방법들 또한 제공한다.

컴포지트 단백질, 면역원성, 무거운 사슬, 가벼운 사슬, 컴포지트 단백질

Description

인간 항체들과 단백질들{HUMAN ANTIBODIES AND PROTEINS}

본 발명은 최종 항체 또는 단백질 분자 내에서 인간 항체 또는 단백질로부터 나온 아미노산 서열의 둘 이상의 세그먼트들을 조합한 항체들 및 단백질들의 발생에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 최종 항체 또는 단백질 분자에서 T 세포 에피토프들(T cell epitopes)의 수를 감소시키거나 회피하도록 그러한 서열 세그먼트들의 조합을 제공한다. 본 발명은 특히, 인체 내의 약제(pharmaceutical agent) 또는 생체내(in vivo) 진단제로의 이용을 위한 항체들 및 단백질들의 발생에 관한 것이다.

지난 20년 동안 인간에의 가능성 있는 제약 용도로의 이용을 위한 재조합 단일클로날 항체들(monoclonal antibodies)의 생성에서 큰 진전을 보였다. 파아지 디스플레이(phage display) 또는 형질전환 쥐들 중 어느 하나에 의해 키메라화(chimerization), 인간화(humanization) 및 인간 항체 클로닝(human antibody cloning)의 기술들은 인체에 투여 시에 비인간 단일클로날 항체들(non-human monoclonal antibodies)보다 면역원성(immunogenicity)을 덜 지니고 통상적으로 잘 견디는 항체들을 제공한다. 그러나, 이러한 기술들에 의하여 발생된 몇몇 항체들은 그러한 항체들의 유전적 기원들이 인간일지라도 환자에 면역원성을 도출해 내는 것으로 보였다. 예를 들어, 인간 항체 Humira

는 류마티스성 관절염 환자들의 12 % 정도에서 면역원성을 이끌어내었고 인간화한 항체 CAMPATH

는 환자들의 대략 50%에서 면역원성을 도출해 내었다. 그러한 면역원성의 유도(induction of immunogenicity)는 항체 가변부위(variable region)내에서 어떤 경우에 면역원성으로 귀결되는 T 세포 반응들을 유도하는 T 세포 에피토프들(epitopes)을 생성시킬 수 있는 비-자가(non-self) 아미노산 서열의 경로(tract)들이 존재하는 것으로부터 기인한 듯하다. 그러므로 인간 기원(human origin)은 높지만, 가능하다면, T 세포 응답들을 유도할 수 있는 서열들의 생성을 회피하는 향상된 기술들 및 항체 조성들에 대한 필요성이 있다.

본 발명은 방법들 및 결과적으로 생성되는 항체 조성들을 제공하여 그에 의해 제약용 이용을 목적으로 그러한 항체들(여기서는 "컴포지트 항체들(composite antibodies)"이라고 칭함)이 최종 항체 분자내에서 인간 항체로부터 유도된 아미노산 서열의 2개 이상의 세그먼트들을 조합하게 한다.

그래서, 제1 국면에서, 본 발명은 변형된 항체 또는 항원 결합 단편의 무거운 사슬(heavy chain) 및 가벼운 사슬(light chain) 가변부위들은 하나 이상의 다른 항체들 또는 항원 결합 단편들로부터 유도된 둘 이상의 아미노산 서열의 세그먼트들로 각각 구성되어 있는 변형된 항체 또는 그 항원 결합 단편을 제공하여, 상기 세그먼트들이 전체 CDR도 골격 부분도 아니도록 하는 것이다.

본 발명의 문맥상, "세그먼트들"이라는 용어는 항체 분자내에서 발견되는 인접한(contiguous) 아미노산 서열을 뜻하는 것으로서, 그러한 세그먼트들의 크기가 2 내지 125 아미노산 길이의 범위이고, 바람직하게는 2 내지 31 아미노산 길이로서 그러한 세그먼트들은 전체 CDR도 전체 골격부위도 아닌 것을 가리킨다. 치료용 목적을 위해, 본 발명의 컴포지트 항체들은 주로 컴포지트 항체의 가변부위들내의 서로 다른 인간 항체들로부터 유도된 아미노산 서열의 둘 이상의 세그먼트들을 조합한다. 특히, 본 발명은 컴포지트 항체 무거운 사슬 및 가벼운 사슬 가변부위(각각 VH 및 VL로 표기)들에 관한 것으로 각각의 VH 및 VL은 둘 이상의 인간 항체 가변부위들로부터 유도된 서열의 세그먼트들로 전체가 구성되어 있고 통상적으로 각각의 컴포지트 VH 및 VL은 근원 인간 항체(source human antibody) VH들 및 VL들에서 그 위치들에 해당하는 인간 가변부위 서열 위치들의 세그먼트들을 제공한다. 예를 들어, 컴포지트 VH 서열에서의 1 내지 10의 아미노산들은 인간 항체 1 내지 10의 아미노산들로부터 유도된다. 또는, 컴포지트 항체에서의 인간 VH 또는 VL 서열의 세그먼트들은 근원 인간 항체 VH 또는 VL에서의 서열 위치에 관계 없이 어떠한 서열 자리(any sequence location)에도 위치할 수 있다. 근원 인간 항체 VH들 및 VL들은 예를 들어, 인간 단일클로날 항체 가변부위 서열들의 데이터베이스들에서 제공되는 것과 같은 어떠한 기존의 인간 항체 가변부위 아미노산 서열일 수 있고, 생식 계통(germ-line)과는 다른 가변부위 체세포 돌연변이(somatic mutations) 및 기타 변형들을 지닌 친화성 성숙 항체들(affinity matured antibodies)로부터 유도된 서열들, 생식 계통 가변부위들로부터 유도된 서열들, 일단의 고정된 가변부위 골격구조들로 되었지만, 가변 CDR들을 지닌 항체들과 같은 종류의 항체들로부터 유도된 서열의 세그먼트들로부터 생성된 인공적으로 구성된 항체 가변부위들로부터 유도된 서열들, 파아지 디스플레이 라이브러리들(phage display libraries)같은 인간 항체 라이브러리들(human antibody libraries)로부터 선택된 서열들 및 인간 항체들 또는 항체 단편들을 인코딩하는 유전자들을 발현하는 형질전환된 동물들로부터 유도된 인간 항체들의 서열들을 포함할 수 있다.

도 1(1A,1B,1C)/2(2A,2B,2C) - 합성 인간 항-HER2 항체용으로 이용되는 VH(도 1A~1C) 및 VL(도 2A~2C)의 서열.

도 3 - 8일간의 배양 후에 키메라화 4D5 IgG1/kappa, 컴포지트 인간 항-HER2 항체 및 키메라화 항-IgE 조절하는 에피토프 회피된 항-HER2 "Eachab"를 지닌 인간 SK-BR-3의 증식 억제.

도 4(4A,4B,4C)/5(5A,5B,5C) - 컴포지트 인간 항-Lewis Y 항체용으로 이용되는 VH(도 4A~4C) 및 VL(도 5A~5C) 유전자들의 서열.

도 6(6A,6B,6C)/7(7A,7B,7C) - 컴포지트 인간 항-인간 IgE 항체용으로 이용되는 VH(도 6A~6C) 및 VL(도 7A~7C) 유전자들의 서열.

도 8 - 인간 T 세포 에피토프들의 회피를 포함한 컴포지트 쥐 항-인간 TNFα용으로 이용되는 VH(도 6A~6C) 및 VL(도 7A~7C) 유전자들의 서열.

도 9 - 컴포지트 쥐 및 키메라화 항-인간 TNFα 항체에 의한 인간 TNFα에 결합 목적을 위한 ELISA.

도 10 - 항-TNFα 항체 A2의 가변부위 서열들.

도 11 - 컴포지트 인간 항-TNFα VH 변이체들의 서열들.

도 12 - 컴포지트 인간 항-TNFα VL 변이체들의 서열들.

도 13/14 - 키메라화 쥐:인간 항-TNFα VH(도 13) 및 VL(도 14)의 구축(construction)을 위한 올리고뉴클레오티드들.

도 15/16 - 제1 컴포지트 인간 항-TNFα VH(도 15; SEQ ID 번호. 3 도 11에 해당) 및 VL(도 16; SEQ ID 번호. 4 도 12에 해당)의 구축을 위한 올리고뉴클레오티드들.

도 17 - 제2 컴포지트 인간 항-TNFα VH 및 VL 변이체들의 구축을 위한 올리고뉴클레오티드들.

도 18 - 컴포지트 인간 항-TNFα 항체들을 위한 WEHI-164 단백질 시험.

도 19 - 주된 컴포지트 인간 항-TNFα의 시간-코스 인간 세포 시험.

도 20 - 삽입된 인간 서열 세그먼트들을 지닌 컴포지트 부가닌(bouganin) 분자들의 활동.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 치료용 목적을 위한 발명의 컴포지트 항체들은 최종 컴포지트 항체 가변부위들에서의 인간 T 세포 에피토프들을 제한하거나 회피하는 다중 인간 VH 및 VL 서열 세그먼트들을 조합하여 구축한다(construct).

이러한 측면에서 인간 T 세포 에피토프들은 인간 MHC 종류 II 분자들에 결합할 수 있고 CD4⁺ T 세포로의 발현을 통해, 보조 T 세포 반응을 유도할 수 있는 아미노산 서열들이다. 최종 컴포지트 항체에서 T 세포 에피토프들을 제한 하거나 회피 하는 인간 VH 및 VL 서열 세그먼트들과 세그먼트들의 조합들을 선택할 수 있다. 인간 생식 계통 서열들과 같은 것으로부터 유도된 T 세포 에피토프들을 포함하지 않는 세그먼트들을 이용하고, T 세포 에피토프들을 포함하지 않는 새로운 서열을 생성하는 인접한 세그먼트들의 조합에 의해, 예를 들어, 두 개의 세그먼트들이 접합하는 지점에서 비 MHC 결합 서열의 생성, 또 다른 인간 생식 계통 서열의 생성 또는 비 생식 계통 서열에도 불구하고 보조 T 세포 반응을 유도하지 않는 서열을 생성시킴으로써 이를 달성 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서, 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프들("Tr 에피토프들")을 제공하는 컴포지트 항체 분자들 내에서 추가로 아미노산 서열들을 첨가하거나 생성할 수 있다. 발명의 목적을 위해, Tr 에피토프들은 접촉 종속 메커니즘들(contact dependent mechanisms)뿐만 아니라 IL-10 및 TGF-β 같은 억제 사이토카인(cytokine)들의 분비에 의한 면역 반응들을 조절할 수 있는 능력을 지닌 CD4+ CD25+ T 세포들을 자극하는 MHC 결합 펩타이드들(MHC binding peptides)이다. 그 자체로는, 발명의 범위내에서, 조절 T 세포 에피토프들은 어떤 환경하에서 면역 반응들의 조절에 공헌할 수 있는 하나 이상의 시험관내 또는 생체내 활동들을 유도하는 것으로 관찰된 펩타이드들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조절 T 세포 에피토프들은 CD4+ CD25+ T 세포들을 유도하거나 활성화시키는 작용을 지니고, IL-10 및/또는 TGF-β와 같은 억제 사이토카인들의 방출을 유도하는 작용을 지니거나 시험관내 또는 생체내 중 어느 하나의 환경에서 기타 측정할 수 있는 면역억제 관련 작용들을 지닌 펩타이드들을 포함 할 수 있는데, 모든 경우에 그러한 작용들 은 CD4+ CD25+ T 세포들의 작용과 관련되어 있다. 그래서, 그러한 Tr 에피토프들은 컴포지트 항체에서 면역원성을 제한하거나 회피하는 수단을 추가로 제공할 수 있다. Tr 에피토프들은 이러한 에피토프들을 포함하는 인간 VH 및 VL의 세그먼트들을 포함(incorporation)시키거나 둘 이상의 인간 서열 세그먼트들의 조합을 통해 그러한 에피토프들의 생성에 의하거나 예를 들어, CD4+ CD25+ T 세포들의 유도 또는 활성화를 위해 인간 항체 또는 단백질 서열의 세그먼트들에 해당하는 펩타이드들로부터 유도된 새로운 Tr 에피토프들을 위한 스크리닝에 의하거나 예를 들어, IL-10 및/또는 TGF-β와 같은 억제 사이토카인들의 방출 측정(예. Hall et al., Blood, vol. 100(2002) p4529-36)에 의하여 Tr 에피토프들은 컴포지트 항체 VH 또는 VL로 유도될 수 있다. 또한, 공지된 Tr 에피토프들은 컴포지트 항체의 결합, 기능 또는 발현을 억제하지 않는 VH 및/또는 VL 내부의 위치들에 있는 컴포지트 항체 가변부위내에서 포함되거나 또는 컴포지트 VH 또는 VL 서열의 한쪽 말단에서, 예를 들어 VH의 N 말단에서 포함될 수 있다. 또한, Tr 에피토프들은 컴포지트 항체의 기능을 간섭하지 않는 자리들에서(예, 경첩부(hinge region) 내부에서) 컴포지트 항체의 한 쪽이나 양쪽 불변부위(constant region)로 포함될 수 있거나 발현 부족(lack of expression)과 같은 몇몇 다른 유해한 효과(deleterious effect)를 일으킬 수 있다. 또한, 항체 융합 단백질(antibody fusion proteins), 항체 짝들(antibody conjugates), Fab 및 Fv타입 유형들(VH 및 VL이 연결된 단일 사슬 항체들(SCAs)을 포함), 단일 영역 항체들(single domain antibodies) 또는 호모다이메릭(homodimeric) 항체 내부에서의 컴포지트 VH 및 VL의 한쪽이나 양쪽 모두에 대 해, Tr 에피토프들이 컴포지트 항체의 기능을 간섭하지 않는 자리들에서 포함되거나 발현 부족과 같은 몇몇 다른 유해한 효과를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 단일 사슬 항체들에서, Tr 에피토프에 특별히 바람직한 자리는 VH 및 VL을 이어주는 링커부(linker region)내 이다. 최적하게는 적절한 서열들로 Tr 에피토프들을 플랭킹(flanking)하여 MHC 종류 II 분자들에의 조절 T 세포 에피토프들의 방출 및 발현을 최적화한다. 예를 들어, 세포내기생성 프로테아제들(endocytic proteases)의 작용에 민감한 서열들을 지니 에피토프들을 플랭킹하여 조절 T 세포 에피토프들의 방출 및 제시(presentation)를 최적화한다. 통상적으로, P-20에서 P-30에 이르는 위치들(P1-P9로 정의되는 중심 모노머(core monomer))에서 항원 처리(antigen processing) 도중의 프로테아제들의 작용을 목표로 삼는 플랭킹 잔존물들을 필요하다면 인간 항체 서열의 세그먼트들을 추가로 이용하여 도입한다.

여기서 토론한 바와 같이, 본 발명은 또한 변형되거나 컴포지트 항체들의 제조를 위한 방법들을 제공한다. 그래서, 또 다른 국면에서 본 발명은 이하의 단계들을 포함하는 변형된 항체의 제조를 위한 방법을 제공한다;

(1) 상이한 가변부위 유전자들의 라이브러리를 발생하기 위하여 기타 항체 가변 부위들의 범위로부터 유도된 아미노산 서열의 세그먼트들을 조합하여 항체 가변 부 유전자들을 제조하는 단계;

(2) 항체 가변부위 유전자들의 라이브러리를 발현 벡터로 클로닝하는 단계; 및

(3) 항체 가변부위들의 라이브러리를 스크리닝하고 상기 라이브러리의 구성 요소들을 원하는 성질들로 회복시키는 단계.

본 발명의 제 1 바람직한 방법 'A'에서 컴포지트 인간 항체들의 라이브러리를 발생하고 특정 항원에 결합하는 것과 같은 원하는 성질들을 지닌 항체들의 존재여부를 위해 스크리닝 한다. 본 방법은 이하와 같은 6 단계들을 포함한다;

(1) 컴포지트 VH 및 VL 유전자들의 설계

(2) 컴포지트 VH 및 VL 유전자들의 클로닝

(3) 컴포지트 VH 및 VL 유전자들의 발현

(4) 원하는 성질들을 지닌 합성 항체들의 스크리닝 및 선택

(5) 주된 컴포지트 항체들의 최적화

(6) T 세포 에피토프들의 (최적) 회피

단계 (1)에 대해서는, Kabat 항체 데이터베이스(www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html)와 NCBI 데이터베이스(www.ncbi.nlm.nkh.gov)에서 입수가능한 공지된 인간 가변부위 서열들 및 UniProt(www.ebi.uniprot.org)과 PRF/SEQDB(www.prf.or.jp) 같은 단백질 데이터베이스들로부터 VH 및 VL 서열의 세그먼트들을 선택하여 컴포지트 VH 및 VL 서열들의 라이브러리를 설계한다. 또한, 하나 이상의 개별 제공자들(donors)로부터 증폭된 VH 및 VL mRNA의 직접 순서결정(direct sequencing)에 의하여 인간 VH 및 VL 서열들의 수집에 의하여 이러한 것들을 보충할 수 있다. 서열 세그먼트들의 다양한 조합들을 VH 및 VL 유전자들의 설계를 위해 고려할 수 있다. 이용한 방법으로는 컴포지트 VH 및 VL 서열들의 길이를 고정하고 상이한 인간 가변부위들에서 위치들을 해 당 Kabat 넘버링(Kabat numbering)으로부터 유도된 고정된 길이의 서열 세그먼트들을 이용하여 이들을 설계한다.

예를 들어, 라이브러리는 121 및 107 아미노산들의 VH 및 VL 부분들을 각각 포함하고 예를 들어, Kabat 넘버링을 이용하여 VH 아미노산 1-27에 대한 상이한 세그먼트들의 조합(assortment)을 포함할 수 있다. Kabat 넘버링 CDR1:30-35, CDR2:50-66 및 CDR3:95-106에 해당하는 CDR들을 지닌 VH에 대하여, 이하의 Kabat 위치들에 대한 서열 세그먼트들을 하나의 옵션으로 이용한다: 1-27, 28-31, 32-36, 37-42, 43-50, 51-56, 57-60, 61-63, 64-69, 70-82a, 82b-96, 97-98, 99-101, 102-117. Kabat 넘버링 CDR1:24-34, CDR2:50-56, CDR3:89-97에 해당하는 CDR들을 지닌 VL에 대하여, 이하의 Kabat 위치들에 대한 서열 세그먼트들을 하나의 옵션으로 이용한다: 1-22, 23-27, 28-30,31-33,34-35,36-47, 48-52, 53-55, 56-59, 60-87, 88-92, 93-94, 95-107. 그러므로, 본 예에서, 컴포지트 VH들은 14개의 인간 세그먼트들로 구성되어 있고 컴포지트 VL들은 13개의 인간 세그먼트들로 구성되어 있다. 실제로, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 이러한 세그먼트들의 조합들을 발생한다. 바람직하게는, 프로그램은 예를 들어, CDR들의 어떤 표준 구조들(canonical structures)을 회피할 수 있거나 VH 및/또는 VL 폴딩 또는 VH/VL 상호작용에 혼란을 줄 수 있는 어떤 세그먼트들의 바람직하지 않은 조합들을 회피하는 알고리즘을 포함한다. 선택적인 부가사항으로, 프로그램은 서열 세그먼트들의 조합에 의해 형성된 T 세포 에피토프들의 숫자를 제한하는 알고리즘을 포함할 수 있다(단계 (6) 이하의 in silico 방법 참조).

단계 (2)에 대해서, 컴포지트 인간 서열들의 라이브러리를 설계한 컴포지트 VH 및 VL 유전자들을 바람직하게는 합성 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 발생한다. 통상적으로, 가변부위 서열의 길이가 더 긴 세그먼트들을 인코딩하는 합성 뉴클레오티드들을 가변부위 서열의 둘 이상의 연속 세그먼트들을 인코딩하는 올리고뉴클레오티드들의 혼합물에 결찰(ligate)한다. 또한, PCR을 오버래핑하거나 기존의 인간 VH 및 VL 유전자들을 주형(template)으로 이용하는 다른 증폭 기법들과 같은 다른 방법에 의해 컴포지트 가변부위들을 조립(assemble)할 수 있다. 예를 들어, PCR을 이용하여 가변부위들의 작은 세그먼트들을 개별적으로 증폭하고 그러고 나서 PCR 반응들을 오버래핑시켜 결합할 수 있다.

기타 방법들에서, 특정 가볍부 세그먼트들을 인코딩하는 서열들로 엔리치(enrich)하게 하는 도핑 방법들을 이용하여 바람직하게는 서열 세그먼트들의 범위를 생성시키도록 혼합된 합성 올리고뉴클레오티드들을 제조할 수 있다. 인간 가변부위 세그먼트 제시(representation)의 광범위한 변이성을 지닌 컴포지트 인간 VH 및 VL 유전자들을 Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 3^rd Ed., vols. 1-3(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press에서 설명한 바와 같은 당업자에게 공지된 기법들을 이용하고 Orlandi et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 86(1989) 3833-3837에서 설명한 바와 같은 면역글로불린들에 대한 표준 PCR 방법들을 이용하여 여러 가지 방법으로 조립할 수 있다.

단계 (3)에 대해서, 컴포지트 인간 VH 및 VL 유전자들을 일단 발생하면, Fv, Fab, Fab2, SCA, 단일 영역 항체들(예, VH들만 포함) 및 이러한 것들 각각의 다중량체 유도체들(multimeric derivatives)과 같은 완전한 항체 분자 또는 항원 결합 단편들중 어느 하나의 생산을 위한 다양한 발현 벡터들로 이러한 것들이 클론된다(cloned). 또한, VH 및 VL 유전자들은 융합 단백질들을 발생하는 다른 분자들을 인코딩하는 유전자들에 융합될 수 있다. 또한 Fv 또는 Fab의 한쪽 사슬의 C 말단에서 폴리 히스티딘 태그(poly-histidine tag)같은 감지가능한 마커(detectable marker)를 인코딩하는 서열들을 포함할 수 있다. 발현 벡터들은 포유동물 세포, 박테리아 세포, 박테리오파지, 효모, 진균류(fungus) 및 기타 마이크로 유기체들에서의 발현을 위한 벡터들을 포함한다. 그러한 벡터들은 또한 형질전환된 동물로부터 유도된 생체내의 발현을 위한 벡터들과 리보솜 제조물들을 사용하여 시험관 내의 번역(in vitro translation)와 같은 시험관 내 시스템을 이용한 발현을 위한 벡터들을 포함한다.

단계 (4)에 대해서, 주로 관심 영역으로 이용되는 하나 이상의 특정 항원들에 결합을 위해 컴포지트 인간 항체들의 라이브러리들을 스크리닝하게 된다. 당업자에게 공지된 스크리닝 방법들이 많이 있는데, 그러한 방법들의 선택은 컴포지트 인간 항체들의 발현 형태 및 항체 분자 즉, 완전한 항체 또는 Fab, Fv, SCA, 단일 영역 항체 등의 항체 분자들의 조성에 달려 있다. 관심 영역이 되는 항원에 결합하는 기존 항체가 입수 가능한 몇 가지 경우에, 이러한 항체로부터 유도된 VH 또는 VL 중 어느 하나는 컴포지트 인간 VL 또는 VH에 각각 조합될 수 있고 결합을 위해 시험될 수 있다.

스크리닝 방법들에는 고체 상태에서 그러한 라이브러리의 개별 구성요소들 또는 구성요소들의 풀(pool)들을 고정시키는 것에서부터 개별적으로나 풀의 형태 어느 하나로 관심 영역의 항원을 고정화시키는 것에까지의 범위에 있다. 항체들을 고정화시킨 곳에, 관심 영역의 항원을 첨가하고 하나 이상의 시약들을 더 첨가하여 직접적으로나 간접적으로 감지가 가능할 수 있다. 예를 들어, 만약 항원이 융합 단백질이거나 알칼리 인산염과 같은 효소와 짝을 이룬다면, 색채, 형광 또는 화학발광 신호를 내는 광범위한 기질들로부터 후속적으로 첨가하여 감지할 수 있다. 항체 풀들이 한 자리(예, 마이크로타이터 접시(microtitre dish)의 웰(well))에 고정되고 신호가 항원을 첨가하여 발생되는 곳에서는, 풀이나 더 작은 풀의 개별 구성요소들을 재 스크리닝하기 전에 이러한 풀의 탈복제(dereplicate)를 할 수 있다. 관심 영역의 항원을 고정화하는 곳에, 컴포지트 항체 라이브러리를 개별 항체들의 첨가에서부터 특정 자리에 관심 영역의 항원을 고정시키고, 항체 풀의 첨가, 전체 컴포지트 라이브러리 및 관심 영역에 있는 항원에 결합된 항체들을 후속적으로 회복시키는 것에 이르기까지 다양한 방법으로 컴포지트 항체 라이브러리를 스크리닝 할 수 있다. 전체 컴포지트 라이브러리를 첨가하고 관심 영역의 항원에 결합된 항체들을 후속적으로 회복시키는 경우에는, 흔히 쓰는 전략으로 칼럼 속 또는 비드(bead) 위와 같은 고체상에 항원을 고정시키고, 라이브러리를 첨가하고, 후속적으로 예를 들어, 저농도 염 버퍼로 고체상을 세척하고(라이브러리의 느슨하게 관련된 구성요소를 떼어내기 위하여) 그러고 나서 예를 들어, 고농도 염 버퍼를 이용하여 항원에 결합된 항체들을 용출한다(elute). 이러한 목적을 위해서 라이브러리의 구성요소들 의 발현에 대한 공식들은 파아지 디스플레이, 효모 디스플레이, 리보솜 디스플레이 및 비드 디스플레이인데, 각각의 경우에 컴포지트 VH 및 VL 사슬들을 인코딩하는 핵산은 항원에 결합하는 컴포지트 가변부위에 부착된 상태를 유지한다.

스크리닝하는 방법은 또한 세포 성장, 세포 성장 억제, 세포 분화 또는 세포 이동에 관계된 시험관 내 시험들과 같은 기능성 또는 생물학적 활성이 측정되는 직접 항원 결합 시험 또는 유기체 전체의 수준에서 항원에 생기는 반응들을 측정하는 것과 관계된 대안적인 생체내 시험, 예를 들어, 쥐의 혈액 세포 적혈구수의 변화 또는 이식된 종양의 성장 억제 같은 시험으로 대체될 수 있는 기능성 또는 생물학적 시험을 포함할 수 있다.

단계 (5)에 대하여, 관심 영역의 항원에 결합하는 것과 같은 원하는 성질들을 지닌 하나 이상의 "주된(lead)" 컴포지트 인간 항체들을 선택 한 후에, 선택적으로는 주된 항체의 성질들을 예를 들어, 항원에 결합하는 친화도를 높이거나 항체를 추가 부분(additional moiety)에 융합 시킴으로써 개선할 수 있다. 친화도의 증가는 결합을 원하는 방식으로 증가시키거나 변화를 가지게 하는 선택된 컴포지트 가변부위 서열에서의 돌연변이를 선택하기 위하여 컴포지트 가변부위 서열들의 돌연변이유발(mutagenesis)에 의해 달성될 수 있다. 본 발명은 주된 항체로부터 유도된 하나 이상의 개별 가변부위 서열 세그먼트들을 하나 이상의 인간 항체 서열들로부터 유도된 해당 서열 세그먼트들로 대체함으로써 가변부위 서열의 돌연변이유발에 대한 신규한 방법들을 포함한다. 특히, CDR 부분과 또는 그 내부에서 오버래핑하는 세그먼트들이 길이가 다른 세그먼트들을 포함하는 다른 인간 항체들로부터 유 도된 하나 이상의 대안적인 세그먼트들에 의해 대체될 수 있다. 발명의 범위내에서, 특정한 세그먼트들을 선택된 주된 항체에 관련된 성질들을 지닌 인간 항체들로부터 예를 들어, 동일한 항원에 결합하는 항체들로부터 또는 관련된 성질들을 지닌 비인간 항체들로부터 또는 관련된 서열을 지닌 비인간 항체에서 기능에 중요하다고 보이는 어떤 핵심적인 아미노산들을 보유한 서열 세그먼트들을 지닌 인간 항체들로부터 유도된 특정 세그먼트들을 포함할 수 있다. 그러한 돌연변이유발을 받는 하나 이상의 컴포지트 인간 항체들은 개선된 성질들을 알아보기 위해 스크리닝될 수 있다.

선택적 단계 (6)에 대해서, 주된 컴포지트 인간 항체를 선택한 다음, T 세포 에피토트들을 필요한 경우에 T 세포 에피토프들에 공헌하는 가변부위 세그먼트들을 변화시키거나 T 세포 에피토프들을 회피하는 대안적인 세그먼트들을 지닌 T 세포 에피토프를 인코딩하여 제한하거나 회피한다. 여러 가지 방법들로 그러한 T 세포 에피토프들을 감지할 수 있다. 예를 들어, 컴포지트 가변부위 서열에서의 하나 이상의 유전자좌들(loci)에 해당하는 펩타이드들을 T 세포 에피토프들의 존재를 측정하기 위하여 합성하고 T 세포 분석에서 시험할 수 있다. 통상적으로 그러한 펩타이드들은 길이가 15 아미노산들이고, 길이가 더 긴 인접성 가변부위 서열의 시험이 바람직한 곳에서는 12 아미노산이 오버랩된 그러한 15량체(15mers)와 같은 서열로부터 유도된 오버래핑 펩타이드들을 사용한다. T 세포 에피토프들의 감지에 대해, 사이토킨 방출, 증식 (예를 들어, 3H-티미딘(thymidine)의 섭취(uptake)에 의함), Ca2+ 유량(Ca2+ flux), 표면 마커 발현(surface marker expression), 유전자 전사 등 CD4+ T 세포들의 활성 또는 증식을 측정하기위해 다양한 T 세포 시험들을 이용할 수 있다.

또한, 컴포지트 가변부위 서열에 해당하는 오버래핑 펩타이드들을 어느 경우에든 잠재적인 T 세포 에피토프들을 측정하기 위해 시험관내 방법들 또는 in silico 방법들중 어느 하나를 이용하여 인간 MHC 종류 II 분자들 즉, T 세포 반응을 유도할 수 있는 MHC 결합 펩타이드들에 결합하는지 여부를 분석한다. In silico 방법들에는 펩타이드-MHC 종류 II 결합 상호작용의 모델링에 관련된 방법들, MHC 종류 II에 결합된 공통된 모티프(motif)들의 식별에 관련된 방법들 및 공지된 시험관내 MHC 결합 성질들을 지닌 펩타이드들의 내부에 있는 펩타이드들 또는 특정 아미노산들의 데이터베이스들을 이용한 방법들을 포함한다. 컴포지트 가변부위 서열들로부터 유도된 길이가 더 긴 펩타이드들 또는 컴포지트 가변부위 서열들을 포함하는 전체 항체들을 생산하고 이러한 것들을 T 세포 시험 또는 MHC 결합 시험에서 시험하는 것, 예를 들어 MHC-펩타이드 테트라머(tetramer)들의 존재 여부를 시험하거나 공지된 인간 T 세포 에피토프들의 데이터베이스에서 제안되거나 구축된 서열들을 검색하는 것과 같은 기타 다른 방법들을 이용할 수 있다. 컴포지트 인간 가변부위들에서 T 세포 에피토프들의 회피는 또한 MHC 종류 II 결합 모티프들의 회피 또는 MHC 종류 II에 펩타이트들의 결합을 고정(anchor)시키는 특정 아미노산의 회피에 의하여 보조 받을 수 있다. 하나 이상의 주된 컴포지트 인간 항체들로부터 유도된 T 세포 에피토프들의 회피를 위한 바람직한 실시예에서, in silico 방법들을 컴포지트 인간 항체 가변부위들을 잠재적인 T 세포 에피토프들의 여부를 분석하기 위해 초기에 적용하고, 이러한 사항들을 확인한 곳에서, 인간 VH 또는 VL 서열의 새로운 세그먼트들을 도입하여 이러한 에피토프들을 회피하고 새로운 T 세포 에피토프들의 도입을 회피하게 된다.

새로운 인간 가변부위 세그먼트들의 어떠한 그런 도입과 원하는 성질들을 위해 변형시킨 주된 컴포지트 인간 항체들의 재 스크리닝한 후, 통상적으로 길이가 15 내지 45 아미노산의 오버래핑 펩타이드들, 예를 들어, 컴포지트 인간 가변부위 서열들(전체 가변부위들 또는 그의 부분들)로부터 유도된 12 아미노산 오버랩을 지닌 15량체 펩타이드들을 시험하거나 인간 T 세포 시험에서 직접적으로 전체 컴포지트 인간 항체들을 시험하거나 둘 중 하나에 의하여 인간 T 세포 시험에서 하나 이상의 최종 주된 컴포지트 인간 가변부위를 더 시험 할 수 있다. 전체 컴포지트 인간 항체의 시험을 위한 T 세포 시험을 이용하는 최종 분석은 전체 항체에 대한 T 세포 활성화 여부의 직접 시험을 허용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제2 바람직한 방법 'B'에서, 컴포지트 인간 항체들의 라이브러리를 발생시켜 원하는 성질들을 지닌 하나 이상의 기준 항체들(reference antibodies)로부터 유도된 원하는 아미노산을 포함한다. 이 방법은 이하와 같이 7 단계들로 관련되어 있다;

(1) 하나 이상의 기준 항체들의 서열 분석

(2) 컴포지트 VH 및 VL 유전자들의 설계

(3) T 세포 에피토프들의 (선택적) 회피

(4) 컴포지트 VH 및 VL 유전자들의 클로닝

(5) 컴포지트 VH 및 VL 유전자들의 발현

(6) 원하는 성질들을 지닌 컴포지트 항체들의 스크리닝 및 선택

(7) T 세포 에피토프들의 선택적 회피를 포함하는 주된 컴포지트 항체들의 최적화

단계 (1)에서, 통상적인 기준 항체들은 인간 형태의 항체에서 원하는 성질들 및/또는 결합 특이성들을 지닌 설치류로부터 기원되며, 특히 쥐가 이에 해당한다. 하나 이상의 기준 항체 가변부위 서열들이 입수 가능한 곳에서, 이러한 것들을 분석하여 CDR들의 서열들을 측정하고 결합 특이성(binding specificity)같은 항체의 원하는 성질들에 중요할 수 있는 아미노산들을 확인한다. 기준 항체에 대하여, 예를 들어, 동일한 종의 다른 서열들을 지닌 기준 가변부위 서열들의 정렬(alignment)에 의하여 그러한 분석을 실시하고, 또한 기준 항체가 비인간 기원이라면 인간 가변부위 서열들을 정렬하여 그러한 분석을 실시한다. 예를 들어, CLUSTAL 프로그램(Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22(1994) p4673-80)을 이용하여 그러한 정렬들을 수행한다. 그러한 정렬들로 인하여 기준 항체의 가변부위 및 상동 가변부위 패밀리들(homologous V region families)에서 흔하지 않거나 희귀한 아미노산들을 확인할 수 있다. 이에 더하여, CDR들의 표준 구조들과 같은 보존된 가변부위 구조들을 예를 들어, the Protein Data Bank(Berman et al.: The Protein Data Bank, Nucleic Acids Research, 28(2000))를 이용하여 확인할 수 있다. 이에 더하여, 기준 항체 가변부위들을 구조가 공지되지 않은 곳에서는 MODELLER(Sali and Blundell, J. Mol. Biol. 234(1993))과 같은 모델링 소프트웨어 를 이용하여 모델링 할 수 있고, 어떤 경우에는 항체-항원 상호작용들의 모델들을 발생시킬 수 있다. 기준 항체 가변부위들의 그러한 분석들을 이용하여 컴포지트 인간 항체에 대한 인간 가변부위 서열의 세그먼트들의 선택에 대한 가이드가 된다.

단계 (2)에서, 컴포지트 인간 항체의 원하는 성질들에 중요할 수 있는 아미노산들을 측정하여, 이러한 아미노산들의 일부나 전부를 포함할 수 있도록 인간 가변부위 서열들의 세그먼트들을 선택한다. 컴포지트 인간 항체의 성질들에 대한 그러한 세그먼트들의 영향이 불확실한 특정한 유전자좌들에서 통상적으로 하나 이상의 대안적인 인간 가변부위 세그먼트들을 지닌 선택된 세그먼트들을 포함하는 컴포지트 인간 가변부위 서열들을 그에 의해 설계한다. 그러한 컴포지트 인간 항체 서열들을 기준 항체(들)로서 다른 인간 항체 서열들 및 보존된 구조들과의 정렬에 의해 더 분석을 할 수 있으며, 이에 더하여, 필요하다면 컴포지트 인간 항체들에 이용된 인간 가변부위 세그먼트들의 조합을 정련(refine)하기 위하여 컴포지트 인간 항체 가변부위들의 구조의 모델링을 더 실시할 수 있게 되어 단백질 구조의 결손들, 컴포지트 가변부위들 내에서의 분자간 및 분자내 상호작용 및 중요한 아미노산들의 부정확한 구조적 배향(orientation)을 회피하게 된다.

선택적 단계 (3)에서, 세그먼트들의 선택을 위한 추가적인 기준으로 최종 컴포지트 인간 가변부위들에 T 세포 에피토프들을 제한하거나 회피하는 그러한 세그먼트들 또는 세그먼트들의 조합들을 선택한다. T 세포 에피토프들을 in silico 또는 시험관내 방법들을 이용하여 상기 방법 A의 단계 (6)에 설명된 방법들에 의하거나 바람직하게는 컴포지트 인간 가변부위 서열들을 설계하는 시기(stage)에서 in silico 방법들을 이용하여 분석할 수 있다.

단계 (4)에서, 컴포지트 인간 서열들의 라이브러리를 설계한 후, 컴포지트 VH 및 VL 유전자들을 바람직하게는 합성 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 발생한다. 통상적으로, 가변부위 서열의 길이가 더 긴 세그먼트들을 인코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드들은 컴포지트 인간 가변부위들의 라이브러리의 상이한 구성요소들을 발생하기 위하여 대안적인 서열 세그먼트들을 인코딩하는 올리고뉴클레오티드들의 혼합물에 결찰(ligate)된다. 또한, 컴포지트 인간 가변부위들의 라이브러리의 각 구성요소를 특정한 인간 가변부위의 서열을 인코딩하는 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 개별적으로 발생시킨다. 또한, PCR을 오버래핑하거나 기존의 인간 VH 및 VL 유전자들을 주형(template)으로 이용하거나 하나 이상의 기준 항체 가변부위 유전자들을 주형으로 이용하는 다른 증폭 기법들과 같은 다른 방법들에 의해 컴포지트 가변부위들을 조립할 수 있다.

방법 B를 위한 단계 (5) 및 (6)을 방법 A의 단계 (4) 및 (5)에서와 같이 설명하였다.

선택적 단계(7)을 주된 컴포지트 인간 항체(들)에서 T 세포 에피토프들의 회피가 더 필요한 곳인 방법 A, 단계 (6)에서와 같이 채용한다. 전체 컴포지트 인간 항체의 시험을 위한 T 세포 시험을 이용하는 최종 분석은 전체 항체로부터 T 세포 활성화 여부의 직접 시험을 허용하는 것이 바람직하다.

방법 A 및 B에 더하여, 컴포지트 인간 항체들을 생성하고 시험하고 그러한 항체들의 성질들을 최적화하는 다른 방법들이 있다는 것을 당업자는 알게 될 것이 다. 본 발명의 컴포지트 인간 항체들은 신규하고, 가변부위들의 전체 인간 기원의 결과로서 비인간 서열들을 포함하는 다른 항체들과는 인체에서 면역원성이 더 낮아야 한다. 컴포지트 인간 항체들의 추가적인 선택적 특성들, 즉 T 세포 에피토프들의 회피 및/또는 Tr 에피토프들의 첨가는 또한 낮은 면역원성에 공헌할 수 있다. 모든 인간 서열 세그먼트들이 없는 가변부위들을 포함하는 선호도가 떨어지는 컴포지트 항체들, 예를 들어, 근원 인간 항체에서 그 서열 위치들과는 다른 컴포지트 항체에서의 서열 위치들에서의 세그먼트들을 포함하는 컴포지트 인간 항체들, 인간 가변부위 서열의 세그먼트들의 부분적인 통합을 지닌 컴포지트 항체들, 비인간 서열의 세그먼트들을 지닌 컴포지트 항체들, 또는 돌연변이 되어 예를 들어, 항원에 대한 결합 친화도를 증가시키거나 T 세포 에피토프를 회피하게 되는 돌연변이된 인간 서열을 지닌 컴포지트 항체들을 이용하여 낮은 면역원성의 목적을 달성할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.

컴포지트 인간 항체들내에서 가변부위 서열 세그먼트들 및 그 조합들을 선택하여 상기에서 언급한 T 세포 에피토프들의 선택적 회피를 포함한 일련의 기준들을 만족 시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, B 세포 에피토프들 및 MHC 종류 I 제한 에피토프들과 같은 다른 에피토프들의 회피를 위해, 컴포지트 항체들의 발현에 해가 될 수 있는 아미노산 서열들의 회피를 위해, N-글리코실레이션(N-glycosylation)와 같은 컴포지트 항체들의 부적절한 변형을 지시할 수 있는 서열들의 회피를 위해, 보조 T 세포 에피토프들 및/또는 B 세포 에피토프들의 포함(예를 들어, 백신 응용들에서)과 같은 어떤 기능들의 포함을 위해, 하나 이상의 표면 리 신 잔존물들과 같은 다른 부분들에 후속적인 접합을 위해 그리고 일련의 다른 기준을 위해 인간 가변부위 서열의 세그먼트들 및 그 조합들을 선택할 수 있다.

인간에 더하여, 전체적으로나 부분적으로 간에 다른 종으로부터 유도된 가변부위 세그먼트들을 지닌 컴포지트 항체들을 발생시킬 수 있고 발명의 범위 내에서 고려되어야 한다는 알게 될 것이다. 예를 들어, 쥐의 연구를 위해, 전체적으로나 부분적으로 쥐의 기원을 지닌 가변부위 서열 세그먼트들을 포함하는 컴포지트 쥐 항체들을 발생시킬 수 있다.

본 발명은 또한 항체들 이외의 단백질들에도 적용되는데, 이에 의하여 치료용 목적으로 그러한 단백질들(여기서는 "컴포지트 단백질들"이라 칭함)이 최종 단백질 분자내에서 인간 단백질로부터 유도된 아미노산 서열의 둘 이상의 세그먼트들을 조합한다.

그래서, 추가적인 측면에서, 본 발명은 아미노산 서열의 하나 이상의 세그먼트들의 삽입을 통하여 개선된 면역원성을 가진 변형된 단백질을 제공한다.

단백질과 관련하여, "세그먼트들"이란 용어는 단백질 분자 내에서 발견되는 인접성 아미노산 서열을 의미하는데, 그러한 세그먼트들은 크기가 2 내지 250 아미노산에 이른다. 치료용 목적을 위해, 본 발명의 컴포지트 단백질들은 통상적으로 컴포지트 단백질 내에서 서로 다른 인간 단백질로부터 유도된 아미노산 서열의 둘 이상의 세그먼트들을 조합한다. 특히, 본 발명은 둘 이상의 인간 단백질들로부터 유도된 서열의 세그먼트들로 전체가 구성되어 있는 삽입된 컴포지트 단백질들에 관한 것이다. 인간 단백질들은 컴포지트 단백질에 상동성을 지니거나 컴포지트 단백 질 부위에 상동성의 부위를 지닌 상태로 존재하는 곳에서는 근원 인간 단백질에 서열 위치들에 해당하는 컴포지트 단백질 서열들에 있는 서열 위치들에서 인간 단백질 서열의 세그먼트들을 이용할 수 있는데, 예를 들어, 컴포지트 단백질 서열에 있는 1 내지 10개의 아미노산들은 근원 인간 단백질에 있는 1 내지 10개의 아미노산으로부터 유도된다. 또한, 인간 단백질 서열의 세그먼트들은 근원 인간 단백질에서의 서열 위치에 관계 없이 컴포지트 단백질에 있는 어떤 서열 자리에 있는 컴포지트 단백질에 위치할 수 있다. 근원 인간 단백질들은 어떠한 기존 인간 단백질 아미노산 서열인데, 예를 들어 인간 단백질 서열들의 데이터 베이스들에서 제공된 것 이고, 자연적으로 돌연변이 되거나 재배열된 형태의 인간 단백질 및 생식 계통과는 다른 기타 변형에서 유도된 서열들, 인공적으로 구축된 인간-유도 단백질들로부터 유도된 서열들 및 해당 단백질들이 발현되거나 그렇지 않든 간에 인간 유전자 또는 RNA로부터 유도된 서열들을 포함 할 수 있다.

본 발명의 이러한 측면의 바람직한 실시예에서, 최종 컴포지트 단백질에서 인간 T 세포 에피토프들을 제한하거나 회피하는 조합으로 인간 단백질 서열 세그먼트들을 조합하거나 삽입시켜 치료용 목적으로 컴포지트 단백질들을 구축한다. 컴포지트 단백질들에 적용되는 것과 같은 발명의 바람직한 측면은 최종 컴포지트 단백질에 있는 T 세포 에피토프들을 제한하거나 회피하기 위하여 인간 단백질 서열 세그먼트들의 삽입에 의해 그러한 비인간 단백질과 같은 기존의 기준 단백질을 변형시키는 것이다.

컴포지트 단백질들의 발생을 위한 본 발명의 바람직한 방법에서, 컴포지트 인간 단백질들의 라이브러리를 발생시켜 T 세포 에피토프들의 부재와 같은 원하는 성질들을 지닌 하나 이상의 기준 단백질들로부터 유도된 원하는 아미노산들을 포함한다. 이러한 방법은 이하와 같이 7 단계들을 포함한다;

(1) T 세포 에피토프들의 선택적 분석을 포함하는 하나 이상의 기준 단백질들의 서열 분석

(2) 컴포지트 단백질 유전자들의 설계

(3) T 세포 에피토프들의 (선택적) 회피

(4) 컴포지트 단백질 유전자들의 클로닝

(5) 컴포지트 단백질 유전자들의 발현

(6) 원하는 성질들을 지닌 컴포지트 단백질들의 스크리닝 및 선택

(7) T 세포 에피토프들의 선택적 회피를 포함하는 주된 컴포지트 단백질들의 최적화

단계 (1)에서, 통상적인 기준 단백질들은 컴포지트 단백질에서 원하는 성질들을 지닌 비인간 기원을 가진 단백질들이다. 치료용 응용을 위해 통상적으로 컴포지트 단백질에서 면역원성의 감소 또는 제거는 목적이 된다. 하나 이상의 기준 단백질 서열들이 입수가능한 곳에서, 단백질 서열들을 분석하여 단백질의 원하는 성질들에 중요할 수 있는 아미노산들을 확인한다. 이에 더 하여, 기준 단백질의 어떤 공지된 구조를 분석하거나, 또한 모델링 소프트웨어를 이용하여 구조를 모델링할 수 있다. 종간이든 같은 종내이든 기준 단백질의 동족체들(homologues)을 입수가능한 곳에서는, 이러한 동족체들을 자주 이용하여 서열 차이들 사이의 관계 및 동족 체들 사이의 성질들에서 차이들 사이의 관계들을 측정할 수 있다. 단백질들은 다른 분자와 상호작용하는데, 이러한 상호작용의 모델들 때때로 생성되고 상호작용에 대하여 중요한 아미노산들이 결정될 수 있다. (1)에 선택적으로 추가하는 사항으로, 기준 단백질에서의 T 세포 에피토프들의 서열 자리를 결정하는데, 특히 상기 컴포지트 인간 항체들을 목적으로 상세하게 설명한 시험관내 인간 T 세포 시험들을 이용하여 기준 단백질에서의 T 세포 에피토프들의 서열 자리를 결정한다. 또한, T 세포 에피토프들을 분석하기 위하여 in silico 방법들을 이용할 수 있다. 기준 단백질들의 그러한 분석들을 이용하여 컴포지트 단백질에 선택된 인간 단백질 서열의 세그먼트들에 대한 가이드가 된다. 특히, 비인간인 기준 단백질에 비교되는 면역원성의 감소 또는 제거가 목적이 되는 곳인 컴포지트 단백질들에 대해, T 세포 에피토프들의 자리들에 해당하는 공통되는 하나 이상의 인간 서열 세그먼트드를 T 세포 에피토프들이 없는 다른 자리들에서 유도된 기준 단백질로부터 유도된 서열의 세그먼트들과 조합하여 컴포지트 단백질에서 사용한다.

단계 (2)에서, 컴포지트 인간 항체의 원하는 성질들에 중요할 수 있는 아미노산들을 측정하여, 이러한 아미노산들의 일부나 전부를 포함할 수 있도록 단백질 서열들의 세그먼트들을 선택한다. 컴포지트 단백질의 성질들에 대한 그러한 세그먼트들의 영향이 불확실한 특정한 유전자좌들에서 통상적으로 하나 이상의 대안적인 인간 단백질 세그먼트들을 지닌 선택된 세그먼트들을 포함하는 컴포지트 인간 가변부위 서열들을 그에 의해 설계한다. 그러한 컴포지트 단백질 서열들을 기준 단백질로서 어떤 동족체들과의 정렬에 의하거나 컴포지트 단백질들의 구조를 모델링하거 나 더 분석을 할 수 있으며, 필요하다면 컴포지트 인간 단백질들에 이용된 인간 단백질 세그먼트들의 조합을 정련하기 위하여 다른 분석들에 의하여 더 분석을 할 수 있어서 단백질 구조의 결손들 및 중요한 아미노산들의 부정확한 구조적 배향을 회피하게 된다.

선택적 단계 (3)에서, 세그먼트들의 선택을 위한 추가적인 기준으로 최종 컴포지트 인간 가변부위들에 T 세포 에피토프들을 제한하거나 회피하는 그러한 세그먼트들 또는 세그먼트들의 조합들을 선택한다. T 세포 에피토프들을 in silico 또는 시험관내 방법들을 이용하여 상기 컴포지트 인간 항체들에 대해 설명된 방법들에 분석할 수 있다.

단계 (4)에서, 컴포지트 단백질들의 라이브러리를 설계한 후, 컴포지트 단백질 유전자들을 바람직하게는 합성 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 발생한다. 통상적으로, 단백질 서열의 길이가 더 긴 세그먼트들을 인코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드들은 컴포지트 단백질들의 라이브러리의 상이한 구성요소들을 발생하기 위하여 대안적인 서열 세그먼트들을 인코딩하는 올리고뉴클레오티드들의 혼합물에 결찰된다. 또한, 컴포지트 단백질들의 라이브러리의 각 구성요소를 특정한 컴포지트 단백질의 서열을 인코딩하는 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 개별적으로 발생시킨다. 또한, PCR을 오버래핑하거나 기존의 인간 단백질 유전자들을 주형(template)으로 이용하거나 하나 이상의 기준 단백질 유전자들을 주형으로 이용하는 다른 증폭 기법들과 같은 다른 방법들에 의해 컴포지트 단백질들을 조립할 수 있다.

단계 (5)에 대해서, 주로 컴포지트 단백질의 하나 이상의 성질들을 위해 컴 포지트 단백질들의 라이브러리들을 스크리닝하게 된다. 당업자에게 공지된 스크리닝 방법이 많이 있는데, 그러한 방법들의 선택은 컴포지트 단백질들의 발현 형태 및 단백질의 기능에 달려 있다. 스크리닝 방법들에는 고체 상태에서 그러한 구성원들의 라이브러리 또는 풀(pool)의 개별 구성요소들을 고정시키는 것에서부터 용액 상태에서 라이브러리의 구성요소를 스크리닝하고 개별적으로나 풀의 형태 어느 하나로 결합하여 합성 단백질이 다른 분자와 함께 상호작용을 일으키게 하도록 설계되어 그 다른 분자를 고정화시키는 것에까지의 범위에 있다. 스크리닝하는 방법은 또한 세포 성장, 세포 성장 억제, 세포 분화 또는 세포 이동에 관계된 시험관 내 시험과 같은 기능성 또는 생물학적 활성이 측정되는 시험 또는 유기체 전체의 수준에서 컴포지트 단백질에 생기는 반응을 측정하는 것과 관계된 대안적인 생체내 시험, 예를 들어, 쥐의 혈액 세포 적혈구수의 변화 또는 이식된 종양의 성장 억제 같은 시험을 포함할 수 있다.

단계 (6)에 대하여, 원하는 성질들을 지닌 하나 이상의 "주된" 컴포지트 단백질들의 선택을 한 후에, 선택적으로는 주된 단백질의 성질들을 예를 들어, 효소의 특정 활동을 높이거나 단백질 리간드의 수용체에의 결합을 증진시켜 개선시킬 수 있다. 성질들에서의 개선점은 컴포지트 단백질의 성질들을 원하는 방식으로 바꾸는 돌연변이를 선택하기 위하여 컴포지트 단백질 서열들의 돌연변이유발(mutagenesis)에 의해 달성될 수 있다. 본 발명은 단백질로부터 유도된 하나 이상의 개별 단백질 서열 세그먼트들을 하나 이상의 인간 단백질 서열들로부터 유도된 서열 세그먼트들로 대체함으로써 단백질 서열의 돌연변이유발에 대한 신규한 방 법들을 포함한다. 그러한 돌연변이유발을 받는 하나 이상의 컴포지트 단백질들은 개선된 성질들을 찾기 위해 스크리닝될 수 있다.

선택적 단계 (7)에 대해서, 주된 컴포지트 단백질을 선택한 다음, T 세포 에피토트들을 필요한 경우에 T 세포 에피토프들에 공헌하는 단백질 서열 세그먼트들을 변화시키거나 T 세포 에피토프들을 회피하는 대안적인 세그먼트들을 지닌 T 세포 에피토프를 인코딩하여 제한하거나 회피한다. 여러 가지 방법들로 그러한 T 세포 에피토프들을 감지할 수 있다. 예를 들어, 컴포지트 단백질에서의 하나 이상의 유전자좌들(loci)에 해당하는 펩타이드들을 T 세포 에피토프들의 존재를 측정하기 위하여 합성하고 T 세포 분석에서 시험할 수 있다. 통상적으로 그러한 펩타이드들은 길이가 15 아미노산들이고, 길이가 더 긴 인접성 가변부위 서열의 시험이 바람직한 곳에서는 12 아미노산이 오버랩된 그러한 15량체(15mers)와 같은 서열로부터 유도된 오버래핑 펩타이드들을 사용한다. 또한, 컴포지트 단백질 서열들에 해당하는 오버래핑 펩타이드들을 어느 경우에든 잠재적인 T 세포 에피토프들을 측정하기 위해 시험관내 방법들 또는 in silico 방법들중 어느 하나를 이용하여 인간 MHC 종류 II 분자들 즉, T 세포 반응을 유도할 수 있는 MHC 결합 펩타이드들에 결합하는지 여부를 분석한다. In silico 방법들에는 펩타이드-MHC 종류 II 결합 상호작용의 모델링에 관련된 방법들, MHC 종류 II에 결합된 공통된 모티프(motif)들의 식별에 관련된 방법들 및 공지된 시험관내 MHC 결합 성질들을 지닌 펩타이드들의 내부에 있는 펩타이드들 또는 특정 아미노산들의 데이터베이스들을 이용한 방법들을 포함한다. 컴포지트 단백질 서열들로부터 유도된 길이가 더 긴 펩타이드들 또는 전체 컴포지트 단백질들을 생산하고 이러한 것들을 T 세포 시험 또는 세포를 발현하는 항원에 대한 MHC 결합 시험에서 시험하는 것과 같은 기타 다른 방법들을 이용할 수 있다. 컴포지트 단백질들에서 T 세포 에피토프들의 회피는 또한 MHC 종류 II 결합 모티프들의 회피 또는 MHC 종류 II에 펩타이트들의 결합을 고정시키는 특정 아미노산의 회피에 의하여 보조 받을 수 있다. 하나 이상의 주된 컴포지트 단백질들로부터 유도된 T 세포 에피토프들의 회피를 위한 바람직한 실시예에서, in silico 방법들을 컴포지트 인간 단백질을 잠재적인 T 세포 에피토프들의 여부를 분석하기 위해 초기에 적용하고, 이러한 사항들을 측정한 곳에서, 인간 단백질 서열의 새로운 세그먼트들을 도입하여 이러한 에피토프들을 회피하고 새로운 T 세포 에피토프들의 도입을 회피하게 된다. 필요하다면 T 세포 에피토프들을 회피하기 위하여 새로운 인간 세그먼트들의 그런 도입과 원하는 성질들을 위해 변형시킨 주된 컴포지트 단백질들의 재 스크리닝한 후, 통상적으로 길이가 15 내지 45 아미노산의 오버래핑 펩타이드들, 예를 들어, 컴포지트 단백질 서열들(전체 단백질들 또는 그의 부분들)로부터 유도된 12 아미노산 오버랩을 지닌 15량체 펩타이드들을 시험하거나 인간 T 세포 시험에서 직접적으로 전체 컴포지트 단백질들을 시험하거나 둘 중 하나에 의하여 인간 T 세포 시험에서 하나 이상의 최종 주된 컴포지트 단백질들을 선택적으로 시험 할 수 있다. 전체 컴포지트 단백질의 시험을 위한 T 세포 시험을 이용하는 최종 분석은 전체 단백질로부터 T 세포 활성화 여부의 직접 시험을 허용하는 것이 바람직하다.

컴포지트 단백질들을 생성하고 시험하고 그러한 단백질들의 성질을 최적화하 는 다른 방법들이 있다는 것을 당업자는 알게 될 것이다. 본 발명의 컴포지트 단백질들은 신규하고, 치료용 목적들을 위해서 사용되는 곳에서, 일부 또는 전체 단백질 서열 세그먼트들의 인간 기원으로 인해 다른 필적할 만한 단백질 또는 비인간 서열들을 포함하는 비인간 기준 단백질들보다 컴포지트 단백질을 인간에게서 더 낮은 면역원성을 가지게 하여야 한다. 컴포지트 단백질들의 추가적인 선택적 특징들은, 즉 T 세포 에피토프들의 회피 및/또는 Tr 에피토프들의 첨가는 또한 낮은 면역원성에 공헌할 수 있다. 모든 인간 서열 세그먼트가 없고 T 세포 에피토프를 제거하기 위하여 돌연변이되는 인간 서열 세그먼트들 또는 기준 단백질에 상동인 비인간 단백질의 세그먼트들을 지닌 컴포지트 단백질들을 포함할 수 있는 컴포지트 단백질들을 이용하여 낮은 면역원성의 목적을 달성할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 컴포지트 단백질들내에서 단백질 세그먼트들 및 그 조합들을 선택하여 T 세포 에피토프들의 선택적 회피를 포함한 일련의 기준들을 만족 시킬 수 있다. 예를 들어, B 세포 에피토프들 및 MHC 종류 I 제한 에피토프들과 같은 다른 에피토프들의 회피를 위해, 컴포지트 단백질의 발현에 해가 될 수 있는 아미노산 서열의 회피를 위해, N-글리코실레이션(N-glycosylation)와 같은 컴포지트 단백질들의 부적절한 변형을 지시할 수 있는 서열들의 회피를 위해, 보조 T 세포 에피토프들 및/또는 B 세포 에피토프들의 포함(예를 들어, 백신 응용에서)과 같은 어떤 기능들의 포함을 위해, 다른 부분들에 연속적인 접합을 위해 그리고 일련의 다른 기준을 위해 인간 단백질 서열의 세그먼트들 및 그 조합들을 선택할 수 있다.

인간에 더하여, 전체적으로나 부분적으로 간에 다른 종으로부터 유도된 서열 세그먼트들을 지닌 컴포지트 단백질들을 발생시킬 수 있고 발명의 범위 내에서 고려되어야 한다는 것을 당업자는 또한 알게 될 것이다. 예를 들어, 쥐의 연구를 위해, 쥐의 단백질 서열 세그먼트들을 포함하는 컴포지트 단백질들을 발생시킬 수 있다. 컴포지트 단백질들은 동일한 종 내에서 상동 단백질들로부터 유도된 다른 단백질 서열 세그먼트들과 조합된 단백질 서열 세그먼트들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 입수 가능한 수많은 식물 I 형 리보솜 억제 단백질(RIP) 서열들로부터 유도된 서열 세그먼트들을 이용하여 RIP를 조립하는 곳에서 식물 I 형 리보솜 억제 단백질들의 조성(construction)을 포함한다는 것을 또한 이해할 것이다. RIP 활성을 유지하는 서열 세그먼트들의 조합들을 도입함으로써 그러한 컴포지트 RIP들을 조합하게 되고 인간에의 이용 목적이라면 최종 컴포지트 서열에서 인간 T 세포 에피토프들의 회피를 포함한다.

항체들인 경우에서처럼, 본 발명은 최종 단백질의 하나 이상의 성질들에서의 개선점을 더 달성하기위해서 컴포지트 단백질의 랜덤, 반랜덤 또는 지시된 돌연변이유발에 의해 컴포지트 단백질 서열들에 변경을 더 가하는 선택을 포함한다. 본 발명은 인간용으로 이용하거나 제약용의 단백질, 또는 식품으로 이용하는 단백질, 세제, 화장품 및 본 발명의 조성물들의 이용에 의해 알레르기 반응들을 제한하거나 제거하는 기타 소비재 제품을 인간이 사용시에 면역원성이 낮은 단백질들을 생산하기에 특히 적합하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 알레르기를 앓고 있는 개인들에서의 면역 반응들을 억제하기 위하여 비 알레르기성 에피토프들(예. TH1 T 세포-유도성 에피토프들을 위한 TH2) 및/또는 Tr 에피토프들의 첨가에 의하여 알레르 기성 T 세포 에피토프들을 제거되거나 대체된 상태의 단백질들을 생산하기에 특히 적합하다는 것을 알게 될 것이다. 본 발명은 염증 반응들을 억제하기 위하여 비 염증성 에피토프들(예 TH2 T 세포 유도성 에피토프들을 위한 TH1) 및/또는 Tr 에피토프들의 첨가에 의해 제거되거나 대체되는 염증 관련 T 세포 에피토프들을 지닌 단백질을 제조함으로써 특히 인간에게 염증을 주는 성질이 줄어든 단백질의 제조에 특히 적합하다.

여기서 토론한 바와 같이, 본 발명의 변형된/컴포지트 단백질들 및 항체들은 질병 처리에 유용하고 면역원성이 더 낮음을 보인다. 그러므로, 추가적인 측면에서 본 발명은 하나 이상의 약학적으로 수용가능한 부형제들(expients), 운반체들(carriers) 또는 희석제들(diluents)과 선택적으로 결합된 청구항 제1항 내지 18항 중 어느 한 항에서 정의한 변형된 항체, 항원 결합 단편 또는 단백질을 포함하는 약학적 제제(pharmaceutical formulation)를 제공한다.

매 투여시 각각의 활성 성분의 일정량을 포함하는 발명의 조성물들(compositions)을 단위 투여의 형태로 제시할 수 있다. 그러한 단위는 조성물의 5 - 100 ㎎/일로 맞출 수 있는데, 바람직하게는 5 - 15 ㎎/일, 10 - 30 ㎎/일, 25 - 50 ㎎/일, 40 - 80 ㎎/일 또는 60 - 100 ㎎/일 중 어느 하나로 조절할 수 있다. 식 I의 조성물들에 대해, 100 - 1000 ㎎/일의 범위에 있는 투여량을 제공하되, 바람직하게는 100 - 400 ㎎/일, 300 - 600 ㎎/일 또는 500 - 1000 ㎎/일의 범위에 있다. 1회 투여시 또는 여러 번의 개별 투여시에 그러한 투여량을 제공할 수 있다. 물론 궁극적인 투여량은 처리되는 상태, 처방 경로(route of administration) 및 환자의 연령, 체중 및 상태에 따라 다르며 의사의 재량에 달려 있다.

어떠한 적절한 경로, 예를 들어, 구강(볼 또는 혀 밑 포함), 직장(rectal), 비강, 국부(볼, 혀 밑 또는 경피(transdermal) 포함), 질 또는 비경구적(피하, 근내, 정맥 또는 피내 포함) 경로에 의한 처방용으로 맞출 수 있다. 그러한 제제들은 제약업계에서 공지된 어떠한 방법에 의해, 예를 들어, 활성 성분을 운반체(들) 또는 부형제(들)과 접촉하여 제조할 수 있다.

경구 처방용으로 맞춘 약학적 제제를 캡슐 또는 정제; 분말 또는 과립; 수용성 또는 비수용성 액체로의 용액 또는 현탁액; 식용 포말 또는 휘프(whip); 또는 물에서 기름(oil-in-water) 유화액 에멀션 또는 기름에서 물(water-in-oil) 유화액 에멀션과 같은 개별 단위로 제시할 수 있다.

경피 처방용으로 맞춘 약학적 제제를 오랜 시간동안 피이식자의 피하와 밀접한 접촉을 유지하기 위하여 개별적인 패치로 제시할 수 있다. 예를 들어, 활성 성분은 Pharmaceutical Research, 3(6), 318(1986)에서 전체적으로 서술된 바와 같이 이온영동법(iontophoresis)에 의해 패치로부터 유도될 수 있다.

비경구적 처방용으로 맞춘 약학적 제제를 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸 또는 오일 형태로 제제할 수 있다.

안구 또는 예를 들어, 입 및 피부 같은 기타 외부 조직(tissue)에 적용하기 위해, 바람직하게는 국부 연고 또는 크림으로 제제가 적용된다. 연고 형태로 제제되면, 활성 성분을 파라핀 또는 물에 섞일 수 있는 연고 베이스중 어느 하나의 형태와 함께 채용할 수 있다. 달리 말해, 활성 성분을 물에서 기름 유화 크림 베이스 도는 기름에서 물 유화 베이스와의 크림형태로 제제할 수 있다.

안구에 국부 처방용으로 조절한 약학적 제제들은 활성 성분이 적절한 운반체, 특히 수용성 용매에서 용해되거나 현탁되는 안약을 포함한다.

구강에 국부 처방용으로 조절한 약학적 제제들은 로젠지들(lozenge), 파스틸들(pastilles) 및 구강 세척제를 포함한다.

직장 처방용으로 조절한 약학적 제제들은 좌약 또는 관장제들로 제시될 수 있다.

운반체가 고체 형태인 비강 처방용으로 조절한 약학적 제제들은 예를 들어 코로 들이쉬는 방식으로 처방되는, 즉, 분말 용기를 코에 가까이 가져가 비강 통로를 통한 신속한 흡입에 의해 처방되는 입자 크기가 20 내지 500 마이크로 미터 범위를 가지는 가루가 굵은 분말을 포함한다. 비강 스프레이 또는 점비액(nasal drop)으로 처방용으로 운반체가 고체형태인 적절한 제제는 활성 성분의 수용성 또는 지용성 용액을 포함한다.

흡입에 의한 처방용으로 조절한 약학적 제제들은 다양한 형태의 계량화된 투여 압축 에어로졸, 분무기 또는 흡입기 등의 수단에 의하여 발생될 수 있는 미세 입자 먼지 또는 미스트(mist)들을 포함한다.

질 처방용으로 조절한 약학적 제제들은 질좌약, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포말 또는 스프레이 제제로 제시될 수 있다.

비경구적 처방용으로 조절한 약학적 제제들은 치료하고자 하는 피이식자의 혈액과 제제를 같은 농도가 되게 하는 항 산화제, 완충제, 정균제 및 용질을 포함 할 수 있는 수용성 및 비 수용성 무균 주입 용액들; 및 현탁화제들과 증점제들(suspending agents and thickening agents)을 포함할 수 있는 수용성 및 비 수용성 무균 주입 용액들 포함한다. 제제를 예를 들어, 밀봉한 앰플 및 바이알과 같은 단위 투여 또는 멀티 투여 용기로 제시할 수 있고 예를 들어, 사용 직전 주입용 물과 같은 무균 액체 운반체의 첨가만 필요로 하는 동결-건조 조건에서 저장될 수 있다. 일회성 주입 용액 및 현탁액들은 무균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

바람직한 단위 투여 제제들은 상기에서 반복한 바와 같이 활성 성분의 일일 투여 또는 서브 투여(sub-dose) 또는 그 적절한 분할을 포함하는 것들이다.

상기에서 특히 언급한 성분들에 더하여, 제제들은 또한 본 제제 형태에 대해 기존의 것과 다른 제제들, 예를 들어 향미료를 포함할 수 있는 경구 처방용에 적합한 제제들을 포함할 수 있다는 것을 알아야 할 것이다.

이하의 예들은 발명의 범위를 제한하는 것으로 고려해서는 안된다. 도면들과 표들은 이하에서 예들에 관한 것이고 아래와 같다;

도 1(1A,1B,1C)/2(2A,2B,2C) - 합성 인간 항-HER2 항체용으로 이용되는 VH(도 1A~1C) 및 VL(도 2A~2C)의 서열

도 3 - 8일간의 배양 후에 키메라화 4D5 IgG1/kappa, 컴포지트 인간 항-HER2 항체 및 키메라화 항-IgE 조절하는 에피토프 회피된 항-HER2 "Eachab"를 지닌 인간 SK-BR-3의 증식 억제

도 4(4A,4B,4C)/5(5A,5B,5C) - 컴포지트 인간 항-Lewis Y 항체용으로 이용되 는 VH(도 4A~4C) 및 VL(도 5A~5C) 유전자들의 서열

도 6(6A,6B,6C)/7(7A,7B,7C) - 컴포지트 인간 항-인간 IgE 항체용으로 이용되는 VH(도 6A~6C) 및 VL(도 7A~7C) 유전자들의 서열

도 8 - 인간 T 세포 에피토프들의 회피를 포함한 컴포지트 쥐 항-인간 TNFα용으로 이용되는 VH(도 6A~6C) 및 VL(도 7A~7C) 유전자들의 서열

도 9 - 컴포지트 쥐 및 키메라화 항-인간 TNFα 항체에 의한 인간 TNFα에 결합 목적을 위한 ELISA

도 10 - 항-TNFα 항체 A2의 가변부위 서열들

도 11 - 컴포지트 인간 항-TNFα VH 변이체들의 서열들

도 12 - 컴포지트 인간 항-TNFα VL 변이체들의 서열들

도 13/14 - 키메라화 쥐:인간 항-TNFα VH(도 13) 및 VL(도 14)의 구축(construction)을 위한 올리고뉴클레오티드들

도 15/16 - 제1 컴포지트 인간 항-TNFα VH(도 15; SEQ ID 번호. 3 도 11에 해당) 및 VL(도 16; SEQ ID 번호. 4 도 12에 해당)의 구축을 위한 올리고뉴클레오티드들

도 17 - 제2 컴포지트 인간 항-TNFα VH 및 VL 변이체들의 구축을 위한 올리고뉴클레오티드들

도 18 - 컴포지트 인간 항-TNFα 항체들을 위한 WEHI-164 단백질 시험

도 19 - 주된 컴포지트 인간 항-TNFα의 시간-코스 인간 세포 시험

도 20 - 삽입된 인간 서열 세그먼트들을 지닌 컴포지트 부가닌(bouganin) 분 자들의 활동

표 1-3 - 186 х 9 잔존-길이(residue-long) VH CDR3들(표 1), 77 х 8 잔존-길이 VL CDR3들(표 2) 및 153 х 10 잔존-길이 CDR3들(표 3)을 포함하는 컴포지트 인간 항체 scFv 라이브러리에 이용되는 CDR들

표 4 - 제1 컴포지트 인간 항-TNFα VH 및 VL 변이체들의 목적으로 이용된 인간 서열 세그먼트들

표 5 - 컴포지트 인간 항-TNFα 변이체들의 활동

표 6 - 부가닌 및 부가닌 변이체들에서 교체 인간 세그먼트들의 면역원성 펩티드 서열들

예 1 - 컴포지트 인간 항- HER2 항체의 구축

인간 가변부위 서열 세그먼트 라이브러리의 생성을 위해, 인간 면역글로블린들의 범위로부터 유도된 아미노산 서열들을 모아서 무거운 사슬 및 가벼운 사슬 가변부위 서열들을 포함하는 in silico 인간 가변부위 서열 라이브러리를 포함하는 단일한 데이터베이스화 하였다. 서열들의 소스로는 NCBI Igblast 데이터베이스(www.ncbi.nih.gov), Kabat 데이터베이스(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH publication 91-3242, 5^th ed.(1991)(및 후속 업데이트), Vbase(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt.doc), Genbank(Benson et al., Nucl. Acids Res. 25(1997) p1-6 or via www.bioinf.org.uk/abs) 데이터베이스들을 포함한다. 이용된 기준 항체 가변부위 서열은 Herceptin

(Carter etal., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol 89(1992) p4285, US5821337)로 알려진 인간화된 항-HER2 항체였다. in silico 인간 가변부위 서열 라이브러리로부터 유도된 세그먼트들을 상기 Herceptin

가변부위 서열에 있는 해당 아미노산들과의 식별(identity)을 위해 선택하였고 도 1(1A~1C) 및 도 2(2A~2C) 각각에서 보는 것과 같은 컴포지트 인간 VH 및 VL 서열들을 제조하기 위하여 결합하였다.

당업계에서 잘 알려진 방법들 및 적절하다면 이러한 방법들에 사용된 효소들을 이용하는 목적으로 공급자 지침서들을 이용하여 재조합 DNA 기법들을 실행하였다. 일반적인 방법들의 소스들로는 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3^rd edition, vols 1-3, eds. Sambrook and Russel(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press 및 Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, John Wiley and Sons 등이 포함된다. 자세한 실험실 방법들을 또한 아래 예 7에서 설명한다. 전체 컴포지트 인간 VH 및 VL 서열들을 부호화하는 길이가 30 내지 60 아미노산의 합성 올리고뉴클레오티드 8개를 각각의 사슬에 대해 사용하여 Herceptin

에 해당하는 컴포지트 인간 VH 및 VL 서열들을 생성하였다. 동시에, 조절 시약(control reagent)로 쥐의 단일클로날 항체 4D5의 키메라화된 형태(Hudziak et al., Mol. Cell. Biol., (March 1989) p1165-1172)를 사슬 마다 8개의 합성 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 또한 생성하였다. 우선 개별 VH 및 VH 올리고뉴클레오티드들을 인산화하고 몰비를 동일하게 하여 혼합하고 열 사이클러(thermal cycler)에서 5분 동안 94 ℃로 가열하고 65 ℃로 냉각시켜 65 ℃에서 2분 동안 항온배양하 였다. 그러고 나서 45 ℃에서 2분 동안, 35 ℃에서 2분 동안, 25 ℃에서 2분 동안 그리고 4 ℃에서 30분 동안 연속하여 항온배양하였다. 그리고 나서, 14 ℃에서 18시간 동안 T4 DNA 리가아제(Life Technologies, Paisley UK)을 사용하여 올리고뉴클레오티드들을 결찰하였다.

VH 및 VL 올리고뉴클레오티드 혼합물들 각각에 Kozak 서열, 리더 신호 펩티드 서열 및 리더 인트론을 포함하는 5' 플랭킹 서열 및 스플라이스 부위 및 인트론 서열을 포함하는 3' 플랭킹 서열을 첨가하여 상기에서와 같이 어닐링(anneal)한다. 이렇게 제조된 컴포지트 인간 V_H 및 V_K 와 4D5 발현 카세트(expression cassette) HindIII 내지 BamHI 단편들로 플라스미드 벡터 pUC19로 클로닝하고 전체 DNA 서열을 확인하였다. 이러한 것들을 인간 IgG1(VH) 또는 Kappa(VK) 불변 부위들을 각각 포함하는 발현 벡터 pSVgpt 및 pSVhyg와 포유류 세포들에서 선택을 목적으로 한 마커들(markers)에로 전이한다. 상기 DNA 서열이 발현 벡터들에서 컴포지트 인간 V_H 와 V_K 및 발현 벡터들에서의 4D5 V_H 와 V_K와 일치한다고 확인하였다.

항체 발현을 위한 숙주 세포 계통(host cell line)은 쥐의 골수종을 발생하는 비 면역글로불린인 NS0이고, 이는 European Collection of Animal Cell Cultures, Porton, UK(ECACC No. 85110503)으로부터 입수하였다. 전기천공법(electroporation)에 의해 무거운 사슬 발현 벡터 및 가벼운 사슬 발현 벡터들을 NS0 세포들로 공형질감염시켰다(co-transfected). gpt 유전자를 발현하는 군체들을 10% 소 태반 혈청(foetal bovine serum), 0.8 ㎍/㎖ 마이코페놀산(mycophenolic acid) 및 250 ㎍/㎖ 크산틴(xanthine)으로 보충한 둘베코가 변형한 독수리의 매체(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM)에 선택하였다. 형질감염된 세포 클론들을 ELISA에 의해 인간 IgG용으로 제조되었는지의 여부를 확인하기위해 스크리닝한다. 항체를 분비하는 세포 계통들을 확장시키고 가장 많이 만들어진 것을 선택하고 액체 질소 속에서 동결시켰다. Prosep

-A(Bioprocessing Ltd, Northumberland, UK)를 사용하여 변형된 항체들을 정제하였다(purified). 인간 IgGk 항체 목적으로 사용한 ELISA에 의하여 농도를 측정하였다.

Hudiziak 등(ibid)에 의해 정확히 서술된 바와 같은 음성 조절 비-Her-2 결합 인간 IgG1 / Kappa와 함께 HER2+ 인간 유방 종양 세포 계통 SK-BR-3의 증식을 억제하는지의 여부를 확인하기 위해 컴포지트 인간 항체 및 키메라화된 4D5 항체들을 시험하였다. 결과들(도 3)에 의하면 컴포지트 인간 항체 및 키메리화된 4D5 항체들은 SK-BR-3 세포들의 성장 억제면에서 동등한 잠재력을 가진다는 것을 보인다. 도 3은 또한 이하에서와 같이 제조된 대안적인 "에피토프 회피된" 컴포지트 인간 항체에 대한 데이터를 보여준다.

발명에서의 에피토프 회피 옵션을 시험하기 위하여, 펩타이드 스레딩(www.csd.abdn.ac.uk/~gjlk/MHC-thread)을 이용하여 비-자가 인간 MHC 종류 II 바인더들에 대해 컴포지트 인간 무거운 사슬 및 가벼운 사슬 가변부위들의 서열들을 분석하였다. 이 소프트웨어로 펩타이드의 아미노산 측면 사슬들과 MHC 종류 II 바인딩 홈(binding groove) 내부에서 특정한 바인딩 포켓들(binding pockets)과의 바람직한 상호작용을 예측한다. 컴포지트 인간 무거운 사슬 및 가벼운 사슬 가변부 위들로부터 유도된 모든 오버래핑 13량체들을 MHC 종류 II 동종이인자형들(allotypes)의 데이터베이스를 통해 스래드 시켰고(threaded) MHC 종류 II 분자들과의 피트(fit)와 상호 작용에 기준하여 기록을 하였다. MHC 종류 II를 결합한다고 예측된 펩타이드들은 VH에서 잔류물 16 및 67, VL에서 잔류물 9 및 44에서 시작하는 13량체들이었다. 그러한 결과로, 아미노산 변화 VH 18L-A/69I-G; VL 11L-A, 46L-A를 도입하기 위하여 도 1(1A~1C)의 컴포지트 인간 서열들에서 사용한 세그먼트들 대신에 새로운 인간 가변부위 서열 라이브러리의 세그먼트들을 선택하였다. 도 1에서 서열에 해당하는 항체를 제조하기 위해 사용한 몇몇 올리고뉴클레오티드들을 교체하여 해당 "에피토프 회피된" 컴포지트 인간 항체("EACHB"= Epitope Avoided Composite Human Antibody(에피토프 회피된 컴포지트 인간 항체))를 제조하였으며, 상기 에피토프 회피된 컴포지트 인간 항체를 상기에서 서술한 방법대로 제조하였고 표준 컴포지트 인간 항체(도 3)에 동등한 SK-BR-5의 억제를 보여주기 위하여 시험하였다. 이런 데이터는 키메라화된 항-Her-2 항체를 조절하는 것과 동일한 잠재력(potency)으로 성공적으로 구축할 수 있다는 것을 보여주고 컴포지트 인간 항체의 에피토프 회피된 컴포지트 인간 항체 버전(version)을 잠재력의 손실 없이 발생할 수 있다는 것을 보여준다.

예2 - 컴포지트 인간 항- HER2 항체의 면역원성

컴포지트 인간 항-HER2 항체, 에피토프 회피된 컴포지트 인간 항체 변이체 및 키메라화된 4D5 항체(도 1A~1C 참조)의 면역원성을 비교하기 위하여 T 세포 증 식 시험들을 실시하였다. 혈청이 제거되고, 동물 유도 구성원소가 제거되고, 단백질 제거된 배지, HyQ

LS1000 지질 보충제(Hyclone Cat No: SH30554)로 보충한 HyClone HyQ

ADCF-Mab^TM(Hyclone Cat No: Cat no: SH30349) 및 나트륨 피루브산염(sodium pyruvate)(Gibco Cat No: 11360-039)에서 성장시킨 NS0 세포들로부터 이러한 항체들을 제조하였다. 세파덱스 G25(Sephadex G25)(PD10 칼럼) 상에 50 mM MES pH6에로의 버퍼 교환을 한 후에, 항체들을 양이온 교환 칼럼(Mono-S 10/10)에 각각 통과시키고 염화 나트륨 구배(gradient)(0 내지 0.5 M)로 용출하였다. 그러고 나서 분율들(fractions)을 포함하는 항체를 PBS에서 세파덱스 200 제조 칼럼(XK16/60)실행에 적용한다. 픽 분율들(peak fractions)을 취합하여 4 ℃에서 보관한다. ELISA로 항체 농도를 측정하여 인간 IgG를 확인한다.

건강한 인간 기증자 혈액에서 분리하고 액체 질소에서 동결 보존한 PBMC들(주변부 혈액 단핵 세포들(peripheral blood mononuclear cells))을 사용하여 면역원성 분석을 실시하였다. 각각의 기증자는 Allset^TM PCR 베이스 조직-타이핑 키트(ALLset^TM PCR based tissue-typing kit)를 이용한 조직-타이핑 형태이고 개별 MHC 단상형(haplotype)에 의하여 20개의 건강한 기증자들을 선택하였다. AIM V(Invitrogen, Paisley, UK)에서 4 х 10⁶ PBMC를 포함하는 2 ㎖ 벌크 배양물들을 시험 펩타이드(최종 농도 5 μM)로 채운 24 well 조직 배양 플레이트에서 배양시켰고 벌크 배양물들을 서서히 재 현탁시키고 PBMC 100 ㎕ 3중 샘플들을 바닥이 U자 모양인 96 well 플레이트에 옮겨넣어 5일, 6일, 7일 및 8일에 대한 증식을 시험한다. 배양물들을 Tomtec Mach III 플레이트 하비스터(Receptor Technologies, UK)를 사용하여 유리 섬유 필터 매트상에 하비스트(harvest)하고 Wallac Microbeta TriLux 플레이트 리더를 사용하여(파라룩스 고 효율 카운팅 프로토콜을 사용하여) 신틸레이션 계수법(scintillation counting)으로 분당 개수(counts per minute(cpm))값들을 측정하였다. 각각의 시험 항체에 대해 자극 지수(SI, stimulation index)를 시험 항체의 분당 개수의 비율로 계산하였다: 네가티브 컨트롤의 분당 개수가 SI > 2를 지닌 경우에는 상당한 T 세포 에피토프 반응이 있는 것으로 간주된다. 키메라화된 4D5 항체는 시험한 20개의 건강한 기증자들 중 5개(25 %)에서 증식 시험의 4일자들 중 적어도 하나에서 상당한 증식 반응(SI 2 초과)을 유도하였고, 컴포지트 인간 항-HER2 항체는 20개의 기증자들 중에서 3개(15 %)에서 SI > 2를 유도한 반면, 컴포지트 인간 항체 항-HER2 항체는 20개의 기증자들 중에서 아무것도(0 %) SI > 2를 유도하지 않았음을 결과는 보여주었다. 이러한 결과들은 키메라화된 4D5> 컴포지트 인간 항-HER2 > EACHB 항-HER2 순서로 면역원성이 있다는 것을 나타내었고, 마지막 경우에는 어떠한 시험자 혈액 샘플에서도 면역원성의 증거를 보여주지 않았다.

예3 - 컴포지트 인간 항- Lewis Y 항체의 구축

시알릴(sialylated) Lewis Y 항원에 특이한 컴포지트 인간 항체를 인간화한 3S193 항체(Scott et al.; Cancer Res., 60 (2000) p3254-3261, US5874060)를 기준 항체 가변부위 서열처럼 이용하여 예 1에서 설명한 바와 같이 구축하였다. in silico 인간 가변부위 서열 라이브로부터 유도된 세그먼트들을 인간화된 3S193 가변부위 서열에 해당 아미노산과 동일여부를 알기 위해 선택하고 도 4(4A~4C) 및 도 5(5A~5C) 각각에서 보여준 바와 같이 컴포지트 인간 VH 및 VL을 만들어 내도록 결합한다. 동시에, 기준 키메라화된 항-Lewis Y 항체를 기준 가변부위 서열들로부터 제조해 내었다. 인간 IgG1(V_H) 및 Kappa(V_K) 상수부들을 컴포지트 인간 항-Lewis Y 항체 및 키메라화된 기준 항체 양쪽에 사용하였고 항체들을 US5874060에서 설명한 바와 같이 합성 Lewis Y-HAS 짝에 대항하여 ELISA로 시험하였다. 그러한 데이터로 최소 농도 0.1 ㎍/㎖ 키메라화된 항체가 US5874060의 데이터와 일치하는 0.15 ㎍/㎖ 컴포지트 인간 항체에 필적하는 시험에서 결합 신호를 준다는 것을 보여 주었다.

예 4 - 컴포지트 인간 항- IgE 항체의 구축

Xolair

(Presta et al., J. Immunol., 151(5)(1993) p2623-2632)로 알려진 인간화된 항-IgE 항체를 기준 항체 가변부위 서열들로 이용하여 예 1에서 설명한 바와 같이 컴포지트 인간 항-IgE 항체를 구축하였다. in silico 인간 가변부위 서열 라이브러리로부터 유도된 세그먼트들을 Xolair

가변부위 서열에서 해당 아미노산과 동일한 지 여부를 알기 위해 선택하였고 도 6(6A~6C) 및 도 7(7A~7C)에서 각각 보여준 컴포지트 인간 VH 및 VL 서열들을 만들어 내도록 조합하였다. 동시에, 기준 키메라화된 항-IgE 항체를 기준 가변부위 서열들로부터 제조하였다. 인간 IgG1(V_H) 및 Kappa(V_K) 불변부위들을 컴포지트 인간 항-TgE 항체 및 키메라화된 기준 항체 양쪽에 사용하였다.

표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonace)(BIAcore2000, Biacore AB, Uppsala, Sweden)에 의해 상기 Fab들의 특이성을 더 특징지웠다. 재조합 인간 IgE Fab를 Flicker 등(Flicker et al., J. Immunol., 165(2000) p3849-3859)에서 설명한 바와 같이 제조하였다. 시험 항체들을 정제하고 NHS/EDC 키트(Biacore)를 이용하여 CM 칩의 플로우 세포상들 상에 고정시켜서 키메라화된 항-IgE에 대한 2010 RU 및 컴포지트 인간 항-IgE에 대한 2029 RU를 얻는다. Hepes-완충 식염수(10 mM Hepes, 3.4 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.05 % (v/v) 계면활성제 P20, pH 7.4)에 10nM 및 25nM 재조합 인간 IgE Fab를 10분 동안 5 ㎕/min 유속으로 시험 항체들상에 통하게 하였다. 상기 10 nM 및 25 nM IgE Fab 양쪽 모두에 대해서, 키메라화된 항-IgE 및 컴포지트 인간 항-IgE 항체들에 대한 동등한 표면 플라스몬 공명(SPR, surface plasmon resonace) 커브를 감지하였는데, 이는 컴포지트 인간 항-IgE 항체들이 기준 항-IgE 항체에 동등한 결합 효과를 성공적으로 이루었다는 것을 보여준다.

예5 - 컴포지트 인간 scFv 라이브러리들의 발생 및 스크리닝

인간 scFv(단일-사슬 Fv) 라이브러리의 초기 구축을 위한 전략은 Knappik 등(Knappik et al., J Mol. Biol., 296(2000) 57-86)에서 상술한 바와 같이 7개의 총 인간 VH(consensus human VH) 및 4개의 총 인간 VL을 구축하고 인간 가변부위 데이터 베이스들로부터 얻은 수 많은 VH 및 VL CDR3 세그먼트들을 여기로 클론 하는 것이다. 이러한 CDR3들의 목록은 VH CDR3들로는 표 1에서, 8개의 아미노산의 VL CDR3들로는 표 2에서, 10개의 아미노산의 VL CDR3들로는 표 3에서 보였다. 마스터 VH 및 VL(master VH and VL)의 구축을 위해서 골격 3의 끝단에 VH 및 VL을 엔코딩하는 6개의 오버래핑 합성 올리고뉴클레오티드들을 Knappik들에 의해 상술한 바와 같이 합성하고 되풀이하는 중합효소 연쇄 반응(recursive PCR)(Prodromou and Pearl, Protein Engineering, 5(1992) 827-829)를 거치게 한다. 이러한 것들을 EcoRV 소화시킨 pZero-1 벡터(Invitrogen, Paisley, UK)에 결찰시킨다. 4D5 CDR3들로 초기에 CH1 및 C kappa 양쪽 모두를 첨가(Carter et al, Bio/Technology, 10 (1992) 163-167)한 것에 대하여, VH-CH1 SapI-EcoRI 및 VL-C kappa NsiI-SphI 단편들을 EcoRV 소화시킨 pZeo-1에 양쪽 무딘 끝을 클로닝 시킨 것을 제외하고는 Knappik등(Knappik et al., ibid)의 프로토콜이 뒤따라서 실시한다.

# 명칭 H3 길이-H3 서브그룹 (H)

MUCl-1 ' CL DFLSGYLDY 9 I

ALLl-1 ' CL VRGSGSFDY 9 III

ALL7-1 ' CL DRGGNYFDY 9 III

L36 ' CL MYNWNFFDY 9 I

5.M13 ' CL AGLGMIFDY 9 I

Au2.1 ' CL RGFNGQLIF 9 I

M71 ' CL ALTGDAFDI 9 II

VH6.N1 ' CL TKLDWYFDL 9 II

E55 6. X ' CL RYGGFYFDY 9 II

E55 6.11' CL GYSNEGMDV 9 II

VH6.A5 ' CL SWDGYSYIY 9 II

VH6-EX8 ' CL QMGAEYFQH 9 III

E54 4.2 ' CL DMSLDAFDI 9 II

RF-SJ4 ' CL GSVGATLGE 9 II

3. A290 ' CL YGDYHYFDY 9 III

A95 GVGSSGWDH 9 III

60P2 ' CL KGSLYYFDY 9 III

E55 3.6 ' CL PNWNDAFDI 9 III

E55 3.16 ' CL RGIPHAFDI 9 III

333 ' CL PPEVESLRS 9 III

1Hl ' CL PPEVESLRS 9 III

126 ' CL PPEVESLRS 9 III

1B1l ' CL PPEVESLRS 9 III

115 ' CL PPEVESLRS 9 III

112 ' CL PPEVESLRS 9 III

2C12 ' CL PPEVESLRS 9 III

2A12' CL PPEVESLRS 9 III

BUT DLAAARLF? 9 III

KOL-based QGTIAGIRH 9 III

resh.

CAMPATH-9

L2E8 ' CL EDYYYGMDV 9 III

s5D4 ' CL DPINWYFDL 9 III

ss4 ' CL DRAAGDRDY 9 III

P2-57 ' CL HQMYSNSDY 9 I

HuHMFGl ' CL SYDFAWFAY 9 I

NEW-based QGTIAGIRH 9 II

resh.

CAMPATH-9

TRl .10' CL VLGIIAADH 9 I

L3B2 - CL DLTGDAFDI 9 I

DAW SCGSQYFDY 9 II

ss7 ' CL LWNWDAFDI 9 I

ss6 ' CL DIMTWGFDY 9 I

s5A9 ' CL SNWYWYFDL 9 III

NEWM NLIAGCIDV 9 II

L2A12 ' CL GGKGGEFDD 9 I

B5G1OH ' CL DSGNYRIDY 9 II

E55 3.9 ' CL DPRLDAFDI 9 III

SpAl-29 ' CL GYSYPVWGR 9 III

AM28 ' CL LVGNSWLDY 9 III

BM2 ' CL DL?GLWEY 9 III

CM29 ' CL KVSLSAFDI 9 III

B-BlO MO ' CL RGDAMYFDV 9 I

HSVCBM8 ' CL DPNPWYFDL 9 III

HSVCD53 ' CL DYGDYAFDI 9 III

HSVCBG6 ' CL SAHSDAFDM 9 III

MICA 4 ' CL LEGLGWFDP 9 I

1/11 ' CL RSDYGAIDY 9 III

5/8' CL NLGFYHMDV 9 III

B6204 ' CL EARGGGGEY 9 III

VH CLONE EGWISALNG 9 III

l ' CL

VH CLONE EGEGEYFDY 9 III

32' CL

MG6-1 ' CL ERTSGDFDF 9 III

MG6-3 ' CL NSPGATFES 9 III

Daudi ' CL GNGQKCFDY 9 III

IE4 ' CL RGSLQYLDY 9 I

IFl0 ' CL NNGSYYFDY 9 I

hsighvml48 ' C GSDYSNFAY 9 III

L

E3-MPO ' CL STHRSAFDV 9 II

rev9Fd' CL EGVHKNFDH 9 III

NANUC-I ' CL LSRAGGFDI 9 III

Patient RMPAVAFDY 9 II

14 ' CL

14Gl ' CL RMPAVAFDY 9 II

14G2 ' CL RMRAVAFDY 9 II

14G3 ' CL RMPAVAFDY 9 II

A15 ' CL DYGGNPAEL 9 I

G15 ' CL GPTCSGGSC 9 I

M1l ' CL RKGAAHFDY 9 I

RF-DIl ' CL EEVGGYFQH 9 III

AC-18 ' CL DFDGGSFDY 9 III

AC-29 ' CL DFDGGSLDY 9 III

AC-40 ' CL DFDGGSFDY 9 III

TR35 ' CL KVPSHGMDY 9 III

TR36 ' CL KVPSHGMDY 9 III

TR37 ' CL KVPSHGMDY 9 III

TR38 ' CL KVPSHGMDY 9 III

L34 ' CL QPLARHFDP 9 III

Ll00 ' CL GPLMRWFDD 9 III

WGl ' CL VAVAGGFDP 9 III

RF-ET5 ' CL GVEVAGTAS 9 I

RF-Etl0 ' CL YYESSAGPP 9 III

EW-Dl ' CL EIPRGGSCY 9 III

EW-D3 ' CL EIPRGGSCY 9 III

KN-D6 ' CL KEKWDSSRC 9 III

HH-M2 ' CL GSAAAGTQG 9 III

AK-D8 ' CL DFSWAGPHF 9 III

BALL-1 ' CL GTHYYDIRV 9 III

YJ DGSGSYEGN 9 III

K2.2 GGAVAAFDY 9 III

E2.5 KPVTGGEDY 9 III

MSL5 DYDGAWFAY 9 I

Hb-2 WDGRLLVDY 9 III

b4 ' CL HKGLRYFDY 9 III

b3 ' CL HKGLRYFDY 9 III

b2 ' CL HKGLRYFDY 9 III

b5 ' CL HKGLRYFDY 9 III

bl7 ' CL HKGLRYFDY 9 III

bl9' CL HKGLRYFDY 9 III

A3-H2' CL YRGDTYDYS 9 III

A3-M9 ' CL WVGATTSDY 9 III

Tmu69 ' CL EDMDYGMDV 9 III

Amuld4-3 ' CL GGRDRYLVY 9 III

1946' CL VRVSYGMDV 9 V

GN901vl .0 MRKGYAMDY 9 III

GN901vl . l MRKGYAMDY 9 III

N901H/KOL MRKGYAMDY 9 III

N901H/G36005 MRKGYAMDY 9 III

N901H/PLO123 MRKGYAMDY 9 III

Patient RMPAVAFDY 9 II

14 ' CL

14Gl (2 ) ' CL RMPAVAFDY 9 II

14G2 ' CL RMRAVAFDY 9 II

14G3' CL RMPAVAFDY 9 II

CLL-8 ' CL TSIVRGFGP 9 II

BA-IF ' CL DFFRDYFDY 9 I

BA-2P ' CL DFFRDYFDY 9 III

L3055 4.6' CL GGTQPFDIR 9 II

15' CL SQASGPFDY 9 I

CL-G ' CL GLYQEEFDY 9 III

CL-O ' CL AGGRTSFDP 9 I

BA3 ' CL EGNTKAPDY 9 III

PS ' CL NGTSGDFDY 9 II

HNK20 hu7 YGTSYWFPY 9 I

HNK20 hul0 YGTSYWFPY 9 I

Amuld4-3 ' CL GGRDRYLVY 9 III

Amulel0-3' CL LRYQLLYNY 9 I

le8-3' CL YIAYDAFDI 9 I

If7-3 ' CL ITPRNAVDI 9 III

Agamma41- DGLLAATDY 9 III

3' CL

Agamma8-3' CL DRAYLDFWG 9 III

Amul0-3 ' CL DKEPAYFDY 9 I

Amu2-1 ' CL RGFNGQLIF 9 I

Amu40-2 ' CL LSVWPAAL 9 III

Amu70-l ' CL LADDDPEDF 9 I

Tmu69 ' CL EDMDYGMDV 9 III

B7-g2B01 ' CL SAGGSAWST 9 III

B8-g3Cll ' CL DRSYYGMDV 9 III

B8-g3F05 ' CL DKGTRYSDQ 9 III

BFlN- WLVEGSFDY 9 III

g3Cl2' CL

BFlN- GYVGSSLDY 9 III

g3H05 ' CL

BFlP- WHQLRGPDY 9 III

g2All ' CL

BF2P1- ENSDYYFDY 9 III

g3DlO ' CL

BF2P1- DGTYGSGVR 9 III

g3E12 ' CL

BF2P2- GGSMVPFDY 9 III

g3ClO ' CL

BF2P2- RGWNYYFDS 9 III

g3D05 ' CL

BF2P2- DAYYYGLDV 9 III

g3Dl2 ' CL

BF2P3- DGRYDPIDY 9 III

g3Cl0 ' CL

BF2P1- VGSSGWYDY 9 I

g7B02' CL

BF2N1- DLYDYYDEP 9 I

GlCl0 ' CL

BF2N2- DGAAASFDY 9 I

glAll ' CL

BF2N2- WGADYFDY 9 I

GlE0l ' CL

BF2N1- DQNWGYFDY 9 III

g3F03 ' CL

BF2N2- GVLRDAFDI 9 III

g3B07' CL

BF2N2- ASDGYGMDV 9 III

g3C03 ' CL

BF2N2- GVLRHALDI 9 III

g3F07' CL

BF2N1- GGCGWYKNY 9 III

g4A03 ' CL

BF2N1- GSNYAKTGY 9 III

g4Bl0 ' CL

BF2N1- GKFQLLFDY 9 III

g4Cll ' CL

BF2N1- ALHGGGMDV 9 III

g6A07 ' CL

BF2N1- ALHGGGMDV 9 II

g6F07' CL

BF2N2- VYPPDAFDL 9 III

g6D09 ' CL

mAbRWLl ' CL PWDYWFFDL 9 II

SV-10 DRVAAAGDY 9 III

SV-7 DKGTRYSDQ 9 III

SV-9 DRVATIPDY 9 III

DN6 ' CL ERGITLMDV 9 I

DN7 ' CL ERGITLMDV 9 I

SC12 ' CL LDWLLPIDY 9 I

SC13 ' CL LDWLLPIDY 9 I

D1l ' CL DDGDRAFGY 9 III

JON ' CL DPWPAAFDI 9 III

DEZ ' CL VRGSWSGDS 9 III

BAR RHSSDWYPY 9 III

KC13H ' CL SSPYGALDY 9 III

clone 15 ' CL GLDQYKTGH 9 II

B22 ' CL GAGAAPHDY 9 III

P13 ' CL GAGAAPHDY 9 III

PS ' CL NGTSGDFDY 9 II

Patient 2 ALRPATFDF 9 III

# 명칭 L3 길이- 클래스 L3

HIV-s8' CL QQYADLIT 8 IGGl-KAPPA

FOG1-A4 ' CL QQYYSTPT 8 -KAPPA

SA-4B ' CL QQYNTYPT 8 IGG-KAPPA

HIV-b5 ' CL QQGNSFPK 8 IGGl-KAPPA

HIV-loop8 ' CL QQYGYSLT 8 IGGl-KAPPA

Reg-A' CL QQFGGSFT 8 KAPPA

9Fl2Fab ' CL QQSSNTVT 8 KAPPA

GP68 ' CL QQYNSLIT 8 IGGl-KAPPA

C471' CL QQYNNWPT 8 IGM-KAPPA

B880V CL LQHNSYPF 8 IGM-KAPPA

B122 ' CL QQYNSQYT 8 IGM-KAPPA

B6204 ' CL QQYGSLWT 8 IGM-KAPPA

IM-9 ' CL QHYNRPWT 8 IGG-KAPPA

T48.16-G8 - CL QQYGSRLT 8 KAPPA

7F ' CL QHYGTPRT 8 IGGl-KAPPA

1A6 ' CL QQYNNWPT 8 IGM-KAPPA

1.69' CL MQATQFPT 8 IGM-KAPPA

antiTac HQASTYPL 8 KAPPA

WE QQYGRSPR 8 KAPPA

Dl .1 QQDDLPYT 8 KAPPA

K2.2 QNDNLPLT 8 KAPPA

El .1 QQESLPLT 8 KAPPA

E2.4 QQDNLPLT 8 KAPPA

E2.5 QQESLPCG 8 KAPPA

E2. ll QQDSLPLT 8 KAPPA

SSaPB QQYGSSRS 8 IGM-KAPPA

SEGaBM QQYGSSRT 8 IGM-KAPPA

SELcLN QQYCGSLS 8 IGM-KAPPA

mAb5.G3' CL QQSYSTLT 8 IGM

P7 ' CL QLYGSSLT 8 KAPPA

PA QQYNNLWT 8 KAPPA

CAR QQYNTFFT 8 KAPPA

Taykv322 ' CL QQYGSSPT 8 KAPPA

Taykv310 ' CL QQYGSSLT 8 KAPPA

Taykv320' CL QQYGSSLT 8 KAPPA

slkv22 ' CL QQYGSSKT 8 KAPPA

LES QQYNNWPP 8 KAPPA

RF-TMCl ' CL QHRNNWPP 8 IGM-KAPPA-III

slkv4 ' CL QQRSNWPS 8 KAPPA

MD3.13 ' CL QQYGSSPT 8 KAPPA

VJI ' CL QQYDTIPT 8 KAPPA

rsvl3L ' CL QASINTPL 8 IGGl-KAPPA

II.2' CL MQALQPWT 8 KAPPA

1.75' CL QQGFSDRS 8 KAPPA

II.14' CL MQATQFVT 8 KAPPA

III .7' CL QRCKGMFS 8 KAPPA

SPA3-l6 ' CL QQYGGSPW 8 KAPPA

VL CLONE 52 ' CL CRSHWPYT 8 KAPPA

6F5-01 ' CL QQYYSTPP 8 KAPPA

6F7-42 ' CL QQCNTNPP 8 KAPPA

6F8-01 ' CL QQYYSTPP 8 KAPPA

6F9-31 ' CL QQYYSVPP 8 KAPPA

D7 ' CL QQYDSLVT 8 IGGl-KAPPA

HuVK ' CL HQYLSSWT 8 KAPPA

BC-26 ' CL MQGIHLLT 8 KAPPA

VkLaE34 ' CL QHYYGTPH 8 KAPPA

FL9-K QQYNTYPT 8 KAPPA

HSC7 QEFGDSGT 8 IGG

HSC28 QQYGGSPW 8 IGG

SEGcPB QQYGSSRT 8 IGM-KAPPA

P3' CL QQYDSLPT 8 KAPPA

A5K3' CL QQYGSVFT 8 IGM

BZlKl ' CL QQYNSYCS 8 IGM

BZ2K1 ' CL QQYYSTPL 8 IGM

D11K3' CL QQYNDWPT 8 IGM

D17K2 ' CL MQNIQFPT 8 IGM

F2IKl ' CL QQYDNLPP 8 IGM

F22K3' CL QLLR?LRT 8 IGM

SCFV198 ' CL YQYNNGYT 8 KAPPA

KC25L ' CL QQRSNWPT 8 KAPPA

ASSYNl3 ' CL QQYGTSHT 8 KAPPA

BCPBLl ' CL QQYNHWPS 8 KAPPA

BCPBL4 ' CL QQYGSLYT 8 KAPPA

BCPBL6 ' CL QQNKDWPL 8 KAPPA

BCSYN6 ' CL QQFGTSLT 8 KAPPA

ITPBL14 ' CL QQRSNWWT 8 KAPPA

ITPBL2 ' CL QQCSNWPT 8 KAPPA

SPl0 ' CL QQYGSSPT 8 KAPPA

# 명칭 L3 길이- 클래스 L3

8El0 ' CL QQYGSSPSIT 10 IGM-KAPPA

III-2R ' CL QKYNSAPPST 10 IGM-KAPPA

II-I ' CL QEYNNWPLWT 10 KAPPA

35G6 - CL QQYGGSPPWT 10 IGM-KAPPA

GF4/1.1 ' CL HEYNGWPPWT 10 IGG3-KAPPA

RF-TS5 ' CL QQYNSYSPLT 10 IGM-KAPPA

0-81' CL MQHTHWSPIT 10 IGM-KAPPA

mAbll4 ' CL QHYNNWPPWT 10 IGM-KAPPA

HIV-B8 ' CL QQSYNTPPWT 10 IGGl-KAPPA

HIV-b8 ' CL QQSYNTPPWT 10 IGGl-KAPPA

TT117 ' CL QHYGSSPPWT 10 IGGl-KAPPA

HIV- QQHNNWPPLT 10 IGGl-KAPPA

1oop13 ' CL

HIV-s3' CL QVYGQSPVFT 10 IGGl-KAPPA

1-185-37' CL QQYGSSPMYT 10 IGM-KAPPA

1-187-29' CL QQYGSSPMYT 10 IGM-KAPPA

HIV-s5 ' CL QRFGTSPLYT 10 IGGl-KAPPA

HIV-b3 ' CL QQYGDSPLYS 10 IGGl-KAPPA

GER QQYDDWPPIT 10 IGG-KAPPA

BLI ' CL QQLNSYPPYT 10 IGM-KAPPA

2A4 ' CL QQSYSTPPDT 10 IGG

0-16' CL QHYNNWPPSS 10 KAPPA

mAb48 ' CL QHYNRLPPWT 10 IGG3-KAPPA

447.8H ' CL QQYDRSVPLT 10 KAPPA

GP13 ' CL QQYYTTPTYT 10 IGGl-KAPPA

M37GO37 ' CL QQYYTTPPLT 10 IGG-KAPPA

9500' CL QQLYSYPHLT 10 IGM-KAPPA

9702 ' CL CQQYGSSRWT 10 IGG-KAPPA

GSD2B5B1O ' CL MQALQTPMST 10 KAPPA

MD2F4 ' CL QQRSEWPPLT 10 KAPPA

GAN4B .5 ' CL QQYDTSPAWT 10 KAPPA

NANUC-2' CL QQYGSSQGFT 10 IgGl-kappa

SOLl0 ' CL MQSIQLPRWT 10 KAPPA

ABl/2 ' CL QHYGLSPPIT 10 IGGl-KAPPA

AB4 ' CL QEYGSSPPRT 10 IGGl-KAPPA

RH-14 ' CL SSYRSSSTRV 10 IGGl-LAMBDA

ABl/2 ' CL QHYGLSPPIT 10 IGGl-KAPPA

AB4 ' CL QEYGSSPPRT 10 IGGl-KAPPA

L55-81 ' CL QQYYTTLPLT 10 IGM-KAPPA

B3 SSYSSTTRW 10 IGG

HUL-mRF ' CL QQYGSSPQTF 10 IGM-KAPPA

25Cl ' CL FCQYNRYPYT 10 KAPPA

LC4aPB LQRSNWGEVT 10 IGM-KAPPA

LC4bPB QQRSNWGEVT 10 IGM-KAPPA

LC4cPB QQRSNWGEVT 10 IGM-KAPPA

mAb3. B6 ' CL QQYGSSPLFT 10 IGM

mAbl . C8 ' CL CSYTSSSTLV 10 IGM

P9 ' CL QQRSNWPPIT 10 KAPPA

21H9 ' CL QQSYNTLSLT 10 IGGl-KAPPA

19A5 ' CL QHYGNSPPYT 10 IGGl-KAPPA

43P10' CL QQSHKTLAWT 10 IGGl-KAPPA

FON ' CL MQGTYWPPYT 10 IGM-KAPPA

Hu PR1A3 HQYYTYPLFT 10 KAPPA

hu PR1A3 HQYYTYPLFT 10 KAPPA

CLL-412' CL QQSYSTPPWT 10 IGG-KAPPA

MEV QQSYTNPEVT 10 KAPPA

SON QQYGSSPPYT 10 IGM-KAPPA

HEW ' CL QQYGSSPRYT 10 KAPPA

JH ' QQFGNSPPL? 10 IGG2-KAPPA

HG2B1OK ' CL QQYAGSPPVT 10 IGG-KAPPA

CLL ' CL QQYNNWPPWT 10 IGM-KAPPA

slkvl2 ' CL QQYNNWPPWT 10 KAPPA

bkv6 ' CL QQRSNCSGLT 10 KAPPA

slkvll ' CL QQYNNWPPWT 10 KAPPA

slkvl3' CL QQYNNWPPWT 10 KAPPA

bkv7 ' CL QQYNNWPPCT 10 KAPPA

bkv22' CL QQYNNWPPWT 10 KAPPA

bkv35 ' CL QQRSFWPPLT 10 KAPPA

MD3.3 ' CL QQRSNWPSIT 10 KAPPA

MD3.1 ' CL QQRSNWPPLT 10 KAPPA

GA3.6 ' CL QQRTNWPIFT 10 KAPPA

M3.5N ' CL QQRSNWPPGT 10 KAPPA

MD3.4 ' CL QQYNNWPPLT 10 KAPPA

M3.1N ' CL QQYNNWPTWT 10 KAPPA

GA3.4 ' CL QQRMRWPPLT 10 KAPPA

MD3.7 ' CL QQYGSSPKWT 10 KAPPA

MD3.9 ' CL QQYGSSPQYT 10 KAPPA

GA3.1 ' CL QQYGSSPPYT 10 KAPPA

bkv32 ' CL QQYDRSLPRT 10 KAPPA

GA3.5 ' CL QQYGNSPLFS 10 KAPPA

GA3.8 ' CL QQYGGSPLFS 10 KAPPA

E29.1 QQYNNWPTWT 10 IGM-KAPPA

KAPPA ' CL

R5A3K ' CL MQALQTLGLT 10 IGM-KAPPA

R1C8K ' CL MQALQTLGLT 10 IGG-KAPPA

I.24' CL QQSHSAPPYT 10 KAPPA

III .12' CL QQYGSSPLFT 10 KAPPA

III.5' CL QQYNDWPPWT 10 KAPPA

I.18' CL QQYNGNSPLT 10 KAPPA

I.67' CL QQLNTYPPWT 10 KAPPA

III.6' CL HKYGGSPPYT 10 KAPPA

II.65 ' CL MQDTHWPPWT 10 KAPPA

III .14 ' CL QHYGRSPPLT 10 KAPPA

424. F6.24 ' CL QQYGNSPPYT 10 KAPPA

T33-5' CL QQYGSSPPYT 10 IGM-KAPPA

AL-MH QQYFNVPPVT 10 KAPPA

AL-Es305 QHYHNLPPTT 10 KAPPA

L47 ' CL IQGTHWPQYT 10 IGM-KAPPA AND LAMBDA

F29 ' CL QQYGSSRALT 10 IGM-KAPPA AND

LAMBDA

G28 ' CL QQYYSTPSYT 10 IGM-KAPPA AND

LAMBDA

G21 ' CL MQALQTLMCS 10 IGM-KAPPA AND

LAMBDA

VL CLONE QQSYSTPPLT 10 KAPPA

45 ' CL

VL CLONE QQSYSTPPIT 10 KAPPA

48' CL

VL CLONE QQYGGSLPIT 10 KAPPA

56 ' CL

C9 ' CL QQYGSSTPLT 10 IGGl-KAPPA

ITC88 ' CL QQRSSWPPLT 10 KAPPA

AC18 ' CL QQRYSWPPLT 10 KAPPA

AC31 ' CL QQRYNWPPLT 10 KAPPA

AC32 ' CL QQRSNWPPLT 10 KAPPA

AC37 ' CL QQRSSWPPLT 10 KAPPA

B ' 20 QQYNNWPPWT 10 IgM-VkIIIa

(Humkv328-JkI ) ' CL

B9601 (Vg- QQRSNWPPYT 10 IgM-VkIIIa

Jk2 ) ' CL

MF8 QQYNNWPPWT 10 IgM-VkIIIa

(Humkv328-JkI ) ' CL

B ' 2 QQYNNWPPWT 10 IgM-VkIIIa

(Humkv328-JkI) ' CL

kappal ' CL QQYGSSPPIT 10 IGG2-KAPPA

kappa2 ' CL QQYNNWPPIT 10 IGG2-KAPPA

kappa3 ' CL QQRSSWPPIT 10 IGG2-KAPPA

kappa4 ' CL QQYGSSPRVT 10 IGG2-KAPPA

kappa5 ' CL QQYNTNSPIS 10 IGG2-KAPPA

kappa7 ' CL QNYGSSPRIT 10 IGG2-KAPPA

kappa8 ' CL QQYGSSPPIT 10 IGG2-KAPPA

ToP218 ' CL MQSIQLPRFT 10 KAPPA

ToP241 ' CL MQSVQLPRFT 10 KAPPA

ToP309 ' CL MQSVQLPRFT 10 KAPPA

L1236K3 ' CL QQYDKWPPVT 10 KAPPA

SOLI ' CL MQSIQFPRWT 10 KAPPA

BC-2 ' CL MQGIHLPPYI 10 KAPPA

P3' CL NQGTQWLLYT 10 KAPPA

P5 ' CL QQYNSYAPYT 10 KAPPA

ABl/2 ' CL QHYGLSPPIT 10 IGG-KAPPA

AB4 ' CL QEYGSSPPRT 10 IGG-KAPPA

MH QQYFNVPPVT 10 KAPPA

FL6-K QQLTSYPPWT 10 KAPPA

FL2-K QQVNSYPGLT 10 KAPPA

FL4-K QQVFSYPGIT 10 KAPPA

FLl-K QQYTSLPGIT 10 KAPPA

MM4-K QHSYSTLPLT 10 KAPPA

MM9-K QQYYNIPYIT 10 KAPPA

HSC4 QLYGSSPRVT 10 IGG

HSC1l QQYANWPPIT 10 IGG

HSC13 QQYNISPRDT 10 IGG

HSC23 QQFGSSPLIT 10 IGG

HSC35 QQYGDFPRVT 10 IGG

REV QQYGDWPPYT 10 KAPPA

BLU QQYYTTLSWT 10 KAPPA

BK2 ' CL QQYNKWPPLT 10 KAPPA

GK6 ' CL MQGTHWLPVT 10 IGG-KAPPA

L1236K3' CL QQYDKWPPVT 10 KAPPA

Pl ' CL QQYDNLPPIH 10 KAPPA

H0l ' CL QQLNNYPPFT 10 KAPPA

I01' CL QQSYSTPPYT 10 KAPPA

I10 ' CL QQSYSTPPYS 10 KAPPA

I12' CL QQSYSTPPYT 10 KAPPA

126TP14K ' CL QQYNNWLPFT 10 IGG-KAPPA

L32 ' CL AAWDDSLTLM 10 IGM-KAPPA

CDR3들의 삽입에 대하여, 플러스 가닥(plus strand)으로부터 표 H의 CDR3들 각각을 인코딩하는 단일 올리고뉴클레오티드들을 컨센서스(consensus) VH 및 VL 유전자들에 어닐링하기 위하여 12개의 상동 뉴클레오티드들을 각각의 말단에 첨가하여 합성하였다. 이러한 CDR 서열들에 더하여 항체 E25(예 4 참조)로부터 유도된 CDR들을 포함하였다. 이러한 프라이머들을 연장하고 제2 프라이머들을 첨가하여 VH 및 VL 유전자들(C 부분이 없음)의 N과 C 말단들에 직접 인접하게 VH대하여 5'NotIbaI 자리를 VL에 대하여 5'SpeI-3'BamHI 자리를 도입한다. 클로닝을 하기전에, 보충 프라이머들(complementary primers) 한 쌍을 더 사용하여 VH 및 VL 사이의 연결 서열(Gly4Ser)3을 삽입하는 반면, XbaI 및 SpeI 사이트들을 유지한다. 완전한 크기의 VH-연결-VL 프래그먼트들(VH-linker-VL fragments)을 NotI 및 BamHI로 소화시키고 NotI-BamHI 소화시킨 pBluescript II KS(+/-)에로 클로닝하였다(Stratagene, Amsterdam, Netherlands).

개별 Bluescript 클론들을 선택하고, 플라스미드 DNA를 정제하고 WO99/11777에서 설명한 바와 같이 로보트를 이용하여 96 웰 플레이트들에 분배하였다. 그러고 나서, DNA들을 tRNA-biotinyl-lysine을 포함하는 IVTT를 거치게 하고 WO99/11777에서 설명한 바와 같이 스트렙타비딘(streptavidin) 표면상으로 로보트를 더 이용하여 정렬하였다. 그러고 나서 10,000개의 독립된 클론들의 고정된 최초 scFv 라이브러리를 재조합 인간 IgE Fab로 배양시켜서 스크리닝을 한다(예 4 참조). 상온에서 1시간 동안 PBS/3% BSA로 웰들을 차단하고, PBS에서 3번 세척하고 1시간 동안 PBS/3% BSA에서 5 ㎍/㎖ 인간 IgE Fab로 처리하였다. 그러고 나서, 웰들을 PBS에서 3번 더 세척을 하고 1시간 30분 동안 PBS/3% BSA에서 5 ㎍/㎖ 알칼리성 포스파타아제-라벨을 단 키메라화된 항-IgE(예 4)로 처리하였다. 웰들은 PBS에서 5번 더 세척하였고 시각으로 관찰하기 위해 5-브로모-1-클로로-3-인돌릴 인산염(5-bromo-1- chloro-3-indolyl phosphate) 및 니트로 블루 테트라졸륨(nitro blue tetrazolium)(Roche Molecular) 기질들을 사용하여 색깔이 발현되도록 하였다. 9600 웰들중 1개의 진동수에서 관찰된 강력한 신호가 E25 CDR3들을 포함하는 VH 및 VL 짝에서 유도된 것으로 보였다.

예 6 - 컴포지트 쥐 항- TNF α 항체의 구축

NCBI Igblast, Kabat 및 Genbank 데이터베이스들을 이용하여 인간 라이브러리에 대해 예 1에서 설명한 바와 같이 쥐 가변부위 서열 라이브러리를 생성하였다. 여기에 이용한 기준 항체 가변부위 서열들은 쥐 cA2 항체의 가변부위들을 이용하여 Remicade

(Le et al., US6277969)로 알려진 키메라화된 항-TNFα 항체였다. 부분적으로 Remicade

가변부위의 해당 아미노산들에 해당하지만 예 1에서 측정한 바와 같은 비-자가 인간 MHC 종류 II 바인더들의 형태로 서열에 인간 T 세포 에피토프들을 회피하도록 설계된 변이들을 포함하는 in silico 쥐 가변부위 서열 라이브러리로부터 유도된 세그먼트들을 선택하였다. 키메라화된 항체들에 사용된 세그먼트들과 비교하여 컴포지트 쥐 VH 및 VL 서열들을 도 8에서 도시하였는데, 컴포지트 쥐 항체에서 에피토프 회피를 위한 세그먼트 선택의 결과로 두 항체들사이에 각각 VH 및 VL에서 9와 16 아미노산의 차이들을 나타내고 있다.

컴포지트 쥐 및 키메라화된 항-TNFα 항체들을 예 1에서 설명한 바와 같이 발생시켰다. 표준 ELISA(WO 03/042247A2에서 서술)에서 고정된 인간 TNFα에 결합하기 위해서 정제된 항체들의 비교를 통해 컴포지트 쥐 항체가 키메라화된 항-TNFα 항체의 완전한 결합 능력을 유지하는 것으로 관찰되었다(도 9). 이러한 항체들의 면역원성을 T 세포 시험용으로 24 HLA-DR 형 인간 혈액 샘플들을 사용하여 예 2에서 설명한 바와 같이 비교하였다. 키메라화된 항-TNFα 항체가 24개의 기증자 중 하나도 SI 가 2를 초과하지 않는(0 %) 컴포지트 인간 항-TNFα 항체에 비교하여 24개의 건강한 기증자중 9개(37.5 %)에서 키메라화된 항-TNFα 항체가 상당한 증식 반응들을(SI 2 초과) 유도하였다는 결과를 보였다. 이러한 결과들은 인간 T 세포 에피토프들을 회피하기 위하여 그러한 세그먼트들의 선택으로 쥐 가변부위들로부터 전체가 유되된 가변부위 서열의 세그먼트들을 포함하는 컴포지트 쥐 항체가 어떠한 에피토프 회피 수단들 없이도 해당 키메라화된 항체가 보이는 인간 T 세포 시험에서 면역원성을 제거할 수 있다는 것을 보여준다.

예 7 : 컴포지트 인간 항- TNF α 항체의 구축

인간 TNFα에 대항하여 지시된 항체 A2의 기준 쥐 가변부위 무거운 사슬 및 가벼운 사슬 서열들을 미합중국 특허 5656272(도 10. 각각 SEQ. IDs No. 1 및 2)로부터 취득하였다. 쥐 기준 가변부위들로 구조 모델을 제작하였고 CDR 확인을 위해 중요한 아미노산들을 CDR로부터의 거리(< 3 Å)와 CDR들에 가까운 그들의 패킹(packing)을 기준으로 하여 확인하였다. 중요한, 덜 치명적인(critical) 잔존물들은 CDR들로부터의 잔존물들의 거리(>3Å <6Å)와 CDR들에 더 가까운 패킹된 더 치명적인 잔존물들에 대한 덜 치명적인 잔존물들의 있을만한 영향에 기초하여 정의된다. 항체 서열 즉, 1 % 미만의 발생 빈도로 특정한 자리에서 발견되는 아미노산의 발생 빈도를 기준으로 하여 잔존물들의 집합을 더 확인하였다.

완전한 길이의 VH 및 VL 서열들을 생성하기 위하여 가능한 한 많은 잔존물들을 포함하는 인간 가변부위 서열 세그먼트들을 선택하였다(표 4). 이러한 서열들에 변화를 주어서 에피토프 회피 및 컴포지트 인간 항체 설계를 위한 주형으로 작용할 서열들을 생성하기 위하여 확인된 구조적으로 중요한 잔존물들을 모두 포함하였다. 각각의 컴포지트 VH 및 VL에 대한 바람직한 서열을 설계하여 기준 쥐 항체로부터 유도된 중요한 잔존물들을 포함하였다. 이러한 가변 무거운 사슬 및 가벼운 사슬 아미노산 서열들을 도 11 및 도 12 SEQ IDs No.3 및 No.4에 각각 도시하였다.

제1 CHAB 변이체들을 위한 서열 세그먼트들의 인간 항체 데이터베이스 유도

(a) 무거운 사슬

Genbank

접근번호( Accession No .) 서열 세그먼트

CAA61442 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSC

CAD88676 LSCVASGFIFS

CAB37182 FSNHWM

AAS86088 HWMNWVRQAPGKGLEWVA

CAC43592 AEI

ABB54411 IRSKS

AAL96548 SIN

AAK51359 NSA

CAA67405 SAT

CAB87447 ATHYA

AAD30769 HYAESVKGRFTISRD

CAC15703 RFTISRDDSKSI

AAQ05509 IVYLQM

AAT96742 YLQMTDLR

AAD20526 LRTEDTGVYYC

CAB44788 VYYCSRNY

AAO38724 NYYGS

AAK14004 GSTY

AAD20470 TYDYWGQGT

AAB32435 DYWGQGTTVTVSS

(b) 가벼운 사슬

Genbank

접근번호 서열 세그먼트

CAC06686 DILLTQ

AAX57564 LTQSPAILSLSPGERATLSC

X72820 LSLSPGERATLSCRASQ

AAC15439 QFV

AAZ09058 VGSS

Z84907 SSI

AALl 0835 IHWYQQK

AAQ21835 QQKPNQSPKLLIK

M27751 LLIKYAS

AAY16612 YASE

AAR89591 ES

AAD19534 SM

AAV71416 MSG

AAZ09098 GIP

CAG27043 PSRFSGSGSGTDFTLTINSLE

AAQ21937 SLESEDAA

AAC41988 ADYYCQQ

AAY33370 YYCQQSHS

AAD19457 HSWP

AAQ55271 WPFTFGQGT

AAW69118 TFGQGTNLEIK

컴포지트 무거운 사슬 및 가벼운 사슬 가변부위 서열들을 다양한 in silico 방법들(예,프로프레드(Propred)[http://imtech.res.in/raghava/propred/index.html], 펩타이드 스레딩(Peptide Threading)[www.csd.abdn.ac.uk/~gjlk/MHC-thread], SYFPEITHI(www.syfpeithi.de), MHCpred(www.jenner.ac.uk/MHCPred/)을 이용하여 잠재적인 T 세포 에피토프들의 존재를 확인하기 위해 스캐닝하였고 기준 쥐 CDR들에 관련하여 상동 인간 생식 계통 골격 부분 서열과 비교하였다.

이하의 무거운 사슬 가변부위 변이체들을 제작하였다(도 11 참조):

SEQ. ID. No. 5는 SEQ. ID. No. 3에 대한 이하의 변화들을 포함한다: T82aN + R83K.

SEQ. ID. No.6는 SEQ. ID. No. 3에 대한 이하의 변화들을 포함한다: T82aN + R83K + D82bS.

SEQ. ID. No. 7은 SEQ. ID. No. 3에 대한 이하의 변화들을 포함한다: T82aN + R83K + D82bS + V23A.

SEQ. ID. No. 8은 SEQ. ID. No. 3에 대한 이하의 변화들을 포함한다: T82aN + R83K + D82bS + V23A + V78A.

이하의 가벼운 사슬 가변부위 변이체들을 제작하였다(도 12 참조):

SEQ. ID. No. 9는 SEQ. ID. No. 4에 대한 이하의 변화들을 포함한다: I10T + N103R.

SEQ. ID. No. 10은 SEQ. ID. No. 4에 대한 이하의 변화들을 포함한다: I10T + N103R + S80A.

SEQ. ID. No. 11은 SEQ. ID. No. 4에 대한 이하의 변화들을 포함한다: I10T + N103R + S80A + N41D

조절 키메라화된 항체의 구축을 위해, SEQ. ID들 No. 1 및 No. 2를 나타내는 것으로 번역하는 뉴클레오티드 서열들을 일련의 오버래핑 40량체 합성 올리고뉴클레오티드들을 이용하여 구축하였다. 가변부위 서열들을 추가로 5' 및 3' 서열들을 플랭크하여 포유류 발현 벡터들로의 클로닝을 용이하게 하였다. 올리고뉴클레오티드들의 서열들을 도 13 및 도 14에서 도시한다.

올리고뉴클레오티드들을 Sigma-Genosys(Poole, UK)로부터 구입하였고 100 μM의 농도로 재현탁하였다. 대부분의 5' 올리고뉴클레오티드를 제외한 무거운 사슬 센스 가닥 올리고뉴클레오티드들 각각의 1 ㎕를 함께 혼합하여 혼합물 1.5 ㎕(대략 1 ㎍)를 추가적으로: 2 ㎕ 10 х 폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK) 완충용액, 2 ㎕ 10 mM ATP, 14 ㎕ H₂O, 0.5 ㎕ (5 단위) PNK을 포함한 20 ㎕ 반응 용액에 폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK, Invitrogen, Paisley UK)로 처리하였다. 37 ℃에서 30분 동안 배양하였고 70 ℃에서 20분 동안 가열하여 효소를 비활성화 시켰다. 무거운 사슬 안티센스, 가벼운 사슬 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 유사한 방법으로 인산화 하였다. 각각의 셋으로부터 유도된 5 뉴클레오티드를 H₂O로 1:9로 희석하였고 적절한 반응 혼합물에 1.5 ㎕를 첨가하였다. 그러고나서 각각의 반응을 0.5 ㎖로 희석하였고 Amicon microcon YM3 농축기에서 8000 rpm의 속도로 90 분 동안 스핀 투석을 하여 부피가 44 ㎕가 되지 않도록 하였다.

무거운 사슬에 대한 센스 및 안티센스 혼합물과 가벼운 사슬에 대한 혼합물들을 조합하여 H₂O로 희석하여 부피가 88 ㎕가 되도록 제조하였다. 10 ㎕ 10 х 리가아제 사슬 반응(LCR) 완충용액 및 2 ㎕ Pfu 리가아제(8 단위, Stratagene, Cambridge UK)를 각각의 반응에 첨가하여 프로그래밍이 가능한 가열 블록에서 이하와 같이 배양하였다: 94 ℃에서 4분 동안, 이후 60 ℃에서 3분 동안 1 사이클, 94 ℃에서 30 초 동안 20 사이클, 그리고 나서 60 ℃에서 2분 동안 가열하였다. 최종적으로 60 ℃에서 5분 동안 반응물들을 배양하였다. 각각의 LCR 10 ㎕를 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 얼룩지게 한 1 % 아가로스(agarose) 겔에 통하게 하고 1 Kb 래더마커들(Invitrogen)과 비교한다. 결찰시킨 DNA의 도말표본은 각각의 레인(lane)에서 관찰되었는데, 대략 400 bp의 희미한 특정 밴드를 감싸고 있다.

무거운 사슬과 가벼운 사슬 LCR들을 무거운 사슬에는 SEQ. ID. No. 12와 22를 가벼운 사슬에는 SEQ. ID. No. 33과 43을 프라이머로 사용하여 PCR를 거쳐 증폭한다. 이하의 사항들을 각각의 반응에 포함하였다: 5 ㎕ LCR, 5 ㎕ 10 х Expand HiFi 완충용액(Roche, Lewes UK), 1 ㎕ 10 mM NTP 혼합물, 0.25 ㎕ 각각의 프라이머(100 μM 스탁 용액들), 0.5 ㎕ Expand HiFi 중합효소(3 단위, Roche) 및 38 ㎕ H₂O. 이하와 같이 반응들을 한 사이클로 돌린다: 94 ℃, 2 분 후에 94 ℃에서 30초 동안 20 사이클, 60 ℃에서 30 초 동안 그리고 72 ℃에서 30 초 동안 유지하였다. 최종적으로 72 ℃에서 5 분 동안 배양한다. 반응의 수율과 특정성을 상기에서 본 바와 같이 아가로스 겔 전기영동(electrophoresis)에 의해 확인하였다. 각 반응마다 대략 400 bp 에서 특정한 밴드가 뚜렷이 관찰되었다.

Qiagen PCR 정화 키트를 사용하여 반응 생성물을 정화하고 각각은 30 ㎕ H₂O에서 용출시켰다. 무거운 사슬 생성물을 표준 반응에서 제한 효소 Mlu I 및 Hind III로 소화시키고 가벼운 사슬 생성물을 BssH II 및 BamH I로 소화시켰다. 반응 생성물들을 다시 Qiagen PCR 정화 키트를 사용하여 정화하고 각각은 30 ㎕ H₂O에서 용출시켰다.

가벼운 사슬 발현 벡터 pANT08은 pAT153 뼈대(backbone) 기준으로 하였고 이하의 순서대로 포함한다: CMV 직접/초기(immediate/early) 증폭제 프로모터 - 590 내지 +7, 고도로 발현된 쥐 항체 가벼운 사슬 RNA로부터 유도된 30nt 5 UTR, 가변부위 시작 코돈 근처의 BssH II 제한 사이트를 포함하는 쥐 컨센서스 가벼운 사슬 신호 서열, 가변부위 스플라이스 부위에서부터 BamH I 제한 사이트로의 33 nt를 포함하는 인간 컴포지트 인트론에 짧은 링커(가변부위를 대신함) 이후에 인간 불변부위 Kappa(CK) 부분 유전자, CK 유전자 및 CK polyA 보다 선행하는 인트론의 343 nt를 포함하는 인간 게놈 DNA의 절편.

무거운 사슬 발현 벡터 pANT09는 프로모터 부분을 통한 pANT08과 유사하고, 이하의 사항들이 뒤따른다: 상기에서 서술한 것의 무거운 사슬 카운터파트에서 유도된 62 nt5` UTR, 가변부위 시작 코돈 근처의 Mlu I 제한 사이트를 포함하는 쥐 무거운 사슬 컨센서스 신호 서열, 가변부위 스플라이스 부위에 접한 짧은 링커(가변부위를 대신함), 상기 가변부위 스플라이스 부위에 CH1 유전자의 인트론 211 nt 상부(upstream)에 위치한 Hind III 제한 사이트에서부터 CH 부분 poly A 사이트의 끝까지 이어진 인간 게놈 DNA의 절편. 이러한 절편은 인간 IgG1의 CH1, 경첩(hinge), CH2 및 CH3 인트론 및 엑손을 포함한다. 이러한 벡터는 또한 SV40 프로모터와 poly A 신호가 조절하여 메토트렉세이트에 저항하는 디 히드로폴레이트 리덕타아제(dihydrofolate reductase)를 포함한다.

총 부피가 30 ㎕인 표준 반응물에 적당한 제한 효소들로 2 ㎍ 각각의 벡터를 소화하였다. 각각의 반응은 상기와 같이 1 % 아가로스 겔을 통과시켰고, 벡터 특이성 밴드들(6.0 Kbp 무거운 사슬 및 4.2 Kbp 가벼운 사슬)을 겔로부터 절제하고(excised) Qiagen 겔 추출 키트를 사용하여 정제하고 30 ㎕ H₂O에서 용출시켰다.

Ligafast 키트(Promega, Southampton UK)를 이용하여 해당 소화된 가변 유전자 PCR 생성물 3 ㎕에 소화시킨 벡터 각각 1 ㎕를 결찰하였다. 결찰 반응물 2.5 ㎕ 각각을 제작자가 지시한 바와 같이 서브-클로닝 효율 수용성(efficiency competent) XL1-블루(Stragene)로 변형시키고 100 ㎍/㎖ 암피실린(ampicillin)을 포함하는 LB 아가르(agar) 플레이트 상에 플레이트화 하고 37 ℃에서 하룻밤동안 배양한다. 각각의 결찰로부터 유도된 10개의 박테리아 군체를 100 ㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 10 ㎖ 2х YT 배양액(broth)에 접종하고 37 ℃에서 흔들어 섞으면서 하룻밤동안 성장시킨다. Qiagen 플라스미드 제조 키트를 이용하여 하룻밤동안 배양한 배양액 1.5 ㎖ 각각으로부터 플라스미드를 정제하고 50 ㎕ H₂O에서 용출시켰다. 상기 플라스미드들을 컨트렉트(contract) 시퀀싱 설비로 보내어 표준 CMV 프로모터 프라이머로 서열화시키고 정확한 가변부위 유전자 서열을 지닌 클론들로 확인하였다.

컴포지트 인간 항체들의 구축을 위해, SEQ. ID No. 3 및 No.4를 나타내는 것으로 번역하는 뉴클레오티드 서열들을 일련의 오버래핑 40량체 합성 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 구축하였다. 올리고뉴클레오티드들의 서열들을 도 15 및 도 16에서 도시하였다. 올리고뉴클레오티드 플라이머들 SEQ. ID. No. 94 및 95(도 17)를 올리고뉴클레오티드들 SEQ. ID. No. 53 및 63과 제1 컴포지트 인간 항체 무거운 사슬 변이체 플라스미드 DNA를 주형으로 함께 사용하여 오버랩 PCR을 통해 SEQ. ID. No. 5를 나타내는 것으로 번역하는 뉴클레오티드 서열을 구축하였다. SEQ. ID. No. 53 과 95 또는 SEQ. ID. No. 94 및 63 중 어느 하나를 프라이머 짝으로 사용하여 2 가지의 PCR 반응들을 실시하였다. 각각의 반응에 이하의 사항을 포함한다: 1 ㎕ (100㎎) 플라스미드 주형, 5 ㎕ 10х Expand HiFi 완충용액(Roche), 1 ㎕ 10 mM NTP 혼합물, 0.25 ㎕ 각각의 프라이머(100 μM 스탁 용액들로부터), 0.5 ㎕ Expand HiFi 폴리머중합체(3 단위, Roche) 및 42 ㎕ H₂O. 반응들의 사이클을 이하와 같이 실시하였다: 94 ℃에서 2분 동안, 94 ℃에서 30 초 동안 20 사이클, 그리고 나서 60 ℃에서 30초 동안 그리고 72 ℃에서 30 초 동안 배양하였다. 최종적으로 72 ℃에서 5분 동안 반응물들을 배양하였다. 전체 반응물들을 1 % 아가로스 겔에 통하여 전기영동 하였고 295 bp 및 126 bp의 특정 밴드들을 절제하였고 Qiagen 겔 추출 키트를 사용하여 정제하였다. DNA들을 30 ㎕ H₂O에서 용출시켰다.

사용한 주형은 1 ㎕ 295 bp 생성물 및 1 ㎕ 126 bp 생성물인 것을 제외하고는 상기에서 설명한 바와 같은 PCR 조건하에서 올리고뉴클레오티드 프라이머 SEQ. ID. No. 53 및 63을 사용하여 2개의 정제된 단편들을 PCR 반응에서 결합시켰고, 그래서 H₂O의 양이 41 ㎕로 줄어들었다. 396 bp 결합된 PCR 생성물을 Qiagen PCR 정화 키트를 사용하여 정제하였고 30 ㎕ H₂O에서 용출시켰다.

올리고뉴클레오티드 플라이머들 SEQ. ID. No. 96 및 97(도 17)를 올리고뉴클레오티드들 SEQ. ID. No. 53 및 63과 제1 컴포지트 인간 항체 무거운 사슬 변이체의 플라스미드 DNA를 주형으로 함께 사용하여 오버랩 PCR을 통해 SEQ. ID. No. 6를 나타내는 것으로 번역하는 뉴클레오티드 서열을 구축하였다. SEQ. ID. No. 53 과 97 또는 SEQ. ID. No. 96 및 63 중 어느 프라이머 짝으로 하나를 사용하여 2 가지의 PCR 반응들을 실시하였다. 상기에서 설명한 바와 같이 첫번째 단계의 PCR들을 실시하였고 295 bp 및 126 bp의 단편들이 나오게 되었다. 이러한 단편들을 정제하고, 함께 결합시키고 상기에서 설명한 바와 같이 재 정화하였다.

올리고뉴클레오티드 플라이머들 SEQ. ID. No. 98 및 99(도 17)를 올리고뉴클레오티드들 SEQ. ID. No. 53 및 63과 SEQ. ID. No.6에 대한 PCR 생성물을 주형으로 함께 사용하여 오버랩 PCR을 통해 SEQ. ID. No. 7을 나타내는 것으로 번역하는 뉴클레오티드 서열을 구축하였다. SEQ. ID. No. 53 과 99 또는 SEQ. ID. No. 98 및 63 중 어느 하나를 프라이머 짝으로 사용하여 2 가지의 PCR 반응들을 실시하였다. 상기에서 설명한 바와 같이 첫번째 단계의 PCR들을 실시하였고 98 bp 및 318 bp의 단편들이 나오게 되었다. 이러한 단편들을 정제하고, 함께 결합시키고 상기에서 설명한 바와 같이 재 정화하였다.

올리고뉴클레오티드 플라이머들 SEQ. ID. No. 100 및 101(도 17)을 올리고뉴클레오티드들 SEQ. ID. No. 53 및 63과 SEQ. ID. No. 7에 대한 PCR 생성물을 주형으로 함께 사용하여 오버랩 PCR을 통해 SEQ. ID. No. 8을 나타내는 것으로 번역하는 뉴클레오티드 서열을 구축하였다. SEQ. ID. No. 53 과 101 또는 SEQ. ID. No. 100 및 63 중 어느 하나를 프라이머 짝으로 사용하여 2 가지의 PCR 반응들을 실시하였다. 상기에서 설명한 바와 같이 첫번째 단계의 PCR들을 실시하였고 270 bp 및 155 bp의 단편들이 나오게 되었다. 이러한 단편들을 정제하고, 함께 결합시키고 상기에서 설명한 바와 같이 재 정화하였다.

상기 PCR 생성물들의 각각을 Mlu I 및 Hind III으로 소화시키고 유사한 방법으로 소화시킨 pANT09에 결찰시켰다. 결찰들을 변형시켜 플레이트화하였고, 군체들을 선택하였고 모두 상기에서 설명한 바와 같이 플라스미드을 제조하고 서열화시켰다.

올리고뉴클레오티드 플라이머들 SEQ. ID. No. 102 및 103(도 17) 및 제1 컴포지트 인간 항체 가벼운 사슬 변이체의 플라스미드 DNA를 주형으로 사용하여 PCR을 통해 SEQ. ID. No. 9를 나타내는 것으로 번역하는 뉴클레오티드 서열을 구축하였다. 무거운 사슬 변이체들에서 설명한 바와 같은 383 bp의 생성물을 나오게 한 PCR 반응을 한 번 실시하였다. 전체 반응물을 1 % 아가로스 겔에 통하여 전기영동 하였고 특정 밴드들을 절제하였고 Qiagen 겔 추출 키트를 사용하여 정제하였다. DNA를 30 ㎕ H₂O에서 용출시켰다.

올리고뉴클레오티드 플라이머들 SEQ. ID. No. 104 및 105(도 17)를 올리고뉴클레오티드들 SEQ. ID. No. 74 및 84와 SEQ. ID. No. 9에 대한 PCR 생성물을 주형으로 함께 사용하여 오버랩 PCR을 통해 SEQ. ID. No. 10을 나타내는 것으로 번역하는 뉴클레오티드 서열을 구축하였다. SEQ. ID. No. 74 와 105 또는 SEQ. ID. No. 104 및 84 중 어느 하나를 프라이머 짝으로 사용하여 2 가지의 PCR 반응들을 실시하였다. 상기에서 설명한 바와 같이 첫번째 단계의 PCR들을 실시하였고 265 bp 및 139 bp의 단편들이 나오게 되었다. 이러한 단편들을 정제하고, 함께 결합시켜 383 bp의 생성물을 생성하였고 무거운 사슬 변이체들에 대하여 상기에서 설명한 바와 같이 재 정화하였다.

올리고뉴클레오티드 플라이머들 SEQ. ID. No. 106 및 107(도 17)을 올리고뉴클레오티드들 SEQ. ID. No. 74 및 84와 SEQ. ID. No. 10에 대한 PCR 생성물을 주형으로 함께 사용하여 오버랩 PCR을 통해 SEQ. ID. No. 11을 나타내는 것으로 번역하는 뉴클레오티드 서열을 구축하였다. SEQ. ID. No. 74 과 107 또는 SEQ. ID. No. 106 및 84 중 어느 하나를 프라이머 짝으로 사용하여 2 가지의 PCR 반응들을 실시하였다. 상기에서 설명한 바와 같이 무거운 사슬 변이체들에 대하여 첫번째 단계의 PCR들을 실시하였고 148 bp 및 256 bp의 단편들이 나오게 되었다. 이러한 단편들을 정제하고, 383bp 생산물을 만들기 위해서 함께 결합시키고 무거운 사슬 변이체들에 대하여 상기에서 설명한 바와 같이 재 정화하였다.

상기 PCR 생성물들의 각각을 BssH II 및 BamH I으로 소화시키고 유사한 방법으로 소화시킨 pANT08에 결찰시켰다. 결찰들을 변형시켜 플레이트화하였고, 군체들을 선택하였고 모두 상기에서 설명한 바와 같이 플라스미드을 제조하고 서열화시켰다.

10 % FCS, L-글루타민, 나트륨 피루브산염 및 L-프롤린을 포함하는 고 글루코스 DMEM에서 CHO-K1 세포(ATCC#CCL-61)들을 전개시켰다. 근처에 있는 융합성 배양물들(confluent cultures)을 제작자(Invitrogen)가 지시한 바와 같이 Lipofectamine 2000을 사용하여 트랜스팩션을 하기 위하여 가까운 융합 배양액들(Near confluent cultures)을 하비스트하였다(harvest). 0.3 ㎍ 무거운 사슬 구조와 0.2 ㎍ 가벼운 사슬 구조를 포함하는 총 0.5 ㎍ 의 플라스미드 DNA를 사용하여 3 х 10⁵ cells/㎖ 농도의 용액에서 200 ㎕을 씨드(seed)한 48 웰 플레이트들에서 트랜스팩션을 실시하였다.

상청액(supernatant)을 하비스트하기 전에 트랜스팩션물들을 37 ℃/5 % 이산화탄소에서 48 시간 내지 72 시간 동안 배양하였다. 이하의 것들을 이용하여 ELISA에 의해 항체 발현을 측정하였다: 쥐 모노클로날 항-인간 IgG 캡쳐(capture) 항체, 인간 IgG1/Kappa 가닥들 및 HRP 짝 염소 항-인간 Kappa 가벼운 사슬들을 검출 항체(detection antibody)로 사용하였다(모든 시약들은 Sigma 사로부터 구입).

무거운 사슬 및 가벼운 사슬들의 모든 조합들을 트랜스팩션시켰다(즉, 6 개의 무거운 사슬 х 5 개의 가벼운 사슬들 = 30 개의 트랜스팩션들). 항체 발현 수준들은 대체적으로 0.5 내지 2.0 ㎍/㎖ 범위에 있지만, 무거운 사슬 SEQ. ID. No. 8을 지닌 발현은 어떠한 것도 관찰할 수 없었다.

TNF-민감성 WEHI-164 세포들(Espevik et al., J. Immunol. Methods 1986, 95, 99-105)을 이용하여 인간 TNFα의 활성을 중화시키는 능력을 알아보기 위해 발현된 항체들을 시험하였다. 96-웰 마이크로타이터 플레이터들에서 3 내지 4 시간 동안 웰당 5 х 10⁴ 세포수의 농도로 1 ㎍/㎖ 악티노마이신에 플레이트시켰다. 세포들을 40 pM 인간 TNFα에 노출시켰고 키메라화된 항체의 농도들을 변화시켜(1 ng/㎖ 내지 500 ng/㎖ 의 범위) 표준 곡선을 생성시켰다. 무거운 사슬들과 가벼운 사슬들을 다양한 조합을 키메라화된 항체의 ED₅₀으로 이전에 측정되었던 25 ng/㎖의 단일한 농도점에서 시험하였다. 모든 시험들은 3번에 걸쳐서 실시하였다.

혼합물들을 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 3-[4,5-디메틸-티아졸-2-일]-2, 5-디페닐테트라졸륨브로마이드 염료(3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide dye, MTT)를 첨가하여 최종 농도를 0.5 ㎎/㎖ 로 맞추고, 37 ℃에서 4 시간 동안 배양하고, 세포들을 0.1 M HCL, 0.1 % SDS에서 용해시키고 550 nm 파장에서 그 광 밀도를 측정하여 세포 생존 능력을 측정하였다.

무거운 사슬 및 가벼운 사슬 조합으로부터 얻은 광 밀도들을 이용하여 표준 곡선으로부터 겉보기 항체 농도들(apparent antibody concentrations)을 구했다. 키메라화된 항체의 농도를 각각의 변이체 조합들로 나누어서 1배 차이값 (a fold difference value)을 내었다. 키메라화된 항체에 대한 값 보다 낮은 값들은 그러한 조합들이 TNFα 세포독성으로부터 세포의 보호에 더 효과적이라는 반면에 더 높은 값들은 그러한 조합들이 효과적이지 않다라는 것을 의미하였다. 모든 조합들에 대한 그러한 값들을 표 5에 도시하였다.

키메라화된 항체와 비교된 컴포지트 인간 항체 변이체들의 활동 비율

SEQ .

ID . No . 1 3 5 6 7 8

2 1.00 1.38 1.24 1.20 1.02 ND

4 1.51 2.28 1.28 1.38 1.05 ND

9 1.28 2.14 1.32 1.77 0.95 ND

10 1.31 2.51 1.17 1.63 0.98 ND

11 16.90 15.15 196.49 134.08 105.61 ND

이하의 컴포지트 인간 항체 무거운 사슬 및 가벼운 사슬 조합들은 1.0에 가까운 배 차이들을 보였다: SEQ. ID. No.s 5/10, SEQ. ID. No.s 7/4, SEQ. ID. No.s 7/9, SEQ. ID. No.s 7/10. 연구를 더 하기 위하여 이러한 조합들을 선택하였다.

상기에서 선택된 서열들을 옮기는 발현 플라스미드들을 NS0 세포들(ECACC No. 85110503)으로 트랜스팩션시켰다. L-글루타민, 나트륨 피루브산염, 5 % 초저 IgG FCS 및 펜/스트렙(pen/strep)을 포함하는 고 글루코스 DMEM에서 세포들을 성장시켰다. 세포가 로그 페이스 성장을 하는 동안 하비스트하고, 스핀다운 시킨 후에 새로운 성장 배지에 5 х 10⁶ cells/㎖ 농도로 재 현탁시켰다. 50 ㎕ H₂O에 750 ㎍ 세포들을 Ssp I로 직선화시켰던 각각의 플라스미드 짝 총 30 ㎍으로 혼합하였다. 세포/플라스미드 혼합물을 4 ㎜ 갭 쿠베트(gap cuvette)에 옮겨 넣고 Equibio Easyject Plus를 250 V, 1500 ㎌, 무한 저항에서 사용하여 전기천공(electroporate)시켰다. 전기천공된 시료를 사전에 데운 성장 배지에 옮겨 넣고 5 х 96 웰 바닥이 평평한 플레이트들에 100 ㎕/well로 플레이트 시켰다. 37 ℃/5 % CO₂에서 플레이트들을 배양하였다. 48 시간 사후 전기천공법을 한 후, 300 nM 메토트렉세이트(methotrexate)를 포함하는 50 ㎕ 배지를 각각의 웰에 첨가하여 최종 농도가 100 nM를 내도록 하였다. 7일간 사후 전기천공법(electroporation)을 한 후 100 nM 메토트렉세이트를 포함하는 50 ㎕ 배지를 각각의 웰에 첨가하였다.

대략 2 주간의 사후 전기천공법을 한 후에, 몇몇 웰에 있는 배지들은 노란색으로 변하기 시작하는데, 이는 트랜스팩션된 군체 성장을 나타낸다. 항-인간 IgG Fc 캡쳐/항-인간 Ig Kappa 가벼운 사슬 HRP 짝 검출 ELISA를 사용하여 항체 발현여부에 대하여 이러한 웰들로부터 나온 배지들을 시험하였다. 시험 샘플들을 인간 IgG1/Kappa 표준과 비교하고 항체 발현 수준들을 예측하였다. 200 nM 메토트렉세이트를 포함하는 배지에 항체의 유용한 양을 발현하는 군체들을 전개시켰다.

단백질 A 친화 크로마토그래피(protein A affinity chromatography)를 통해 500 ㎖ 배양 배지로부터 항체들을 정제시키고 이후 Sephacryl S200을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 실시하였다. 정제된 항체들을 OD280 = 1.4 ㎎/㎖ 라고 가정하고 280 ㎚에서 UV 흡광도로 수치화하였다.

정제된 키메라화되고 컴포지트 항체들을 상기 예 4에서 설명한 바와 같이 WEHI-164 보호 시험을 통해 활성여부에 대해 시험하였다. 표준 곡선을 생성시키기 위해 사전에 사용했던 전 농도 범위에 걸쳐 각각의 항체를 시험하였다(도 18 참조). 컴포지트 인간 항체 7/10(즉 SEQ. ID. No.s 7 및 10을 포함)이 가장 활발한 변이체이고 키메라화된 항체와 같은 활동성을 지녔다. 컴포지트 인간 항체들 7/9 및 5/10은 키메라화된 항체와 비교해서 약간 감소된 비슷한 활동성을 지녔고, 컴포지트 인간 항체 7/4는 활동성이 가장 낮았다.

그러므로, 컴포지트 인간 항체 7/10은 MHC 종류 II 바인딩 프로파일이 가장 좋은 것으로 예상되고 가장 활발한 변이체이기 때문에, 시간 코스 T 세포 증식 시험에서의 시험을 위해 이를 선택하였다. 인간 혈액 기증으로부터 유도된 담황갈색의 외피들(buffy coats)을 피콜 밀도 원심분리(Ficoll density centrifugation)를 2회 작동하여 인간 PBMC들을 제조하였다. 제조된 PBMC를 90 % 인간 AB 혈청/10 % DMSO에서 1 ㎖ 양에 3 х 10⁷ cells/ml 밀도로 재 현탁하였고 액체 질소에서 저장하였다. PBMC를 Dynal Allset

PCR 타이핑 키트를 사용하여 조직 타이프하였다.

주된 컴포지트 인간 항체를 20개의 건강한 기증자들로부터 추출한 인간 PBMC를 이용하여 전체 단백질 T 세포 시험들에서 키메라화된 항체와 비교하였다. 각각의 기증자로부터 온 PBMC를 해동하고, 세척하여 AIM V 혈청이 없는 임파구 성장 배지에서 재 현탁하였다. 1 일에 24 웰 플레이트에 있는 4 х 10⁶ PBMC의 2 ㎖ 벌크 배양액들에 50 ㎍ 단백질을 첨가하였고, 100 ㎕ 분량을 3 벌씩으로 하여 6 일 내지 9 일에 96 웰 플레이트로 옮겨 넣는다. 하비스트하여 방사성 통합을 측정하기 전에 1 μCi 삼중수소화한 티미딘(tritiated thymidine)을 포함한 75 ㎕ 배지로 24 시간 동안 펄스를 가하였다(pulse). 자극 지수(Stimulation Index, SI)를 계산하여 결과를 정규화하였다. 개별 MHC 동종이인자형들에 의하여 기증자들을 선택하여 광범위한 HLA DR 동종이인자형들의 포함이 가능하게 되었다.

시간-코스 시험의 결과들을 도 19에서 도시하였고 20개의 기증자들중에 10개에서 적어도 1일에 키메라화된 항체(도 19(a))가 T 세포 반응(SI >= 2)을 도출하였다는 것을 알게되었다. 반면, 컴포지트 인간 항체(도 19(b))는 어떠한 시간대에서도 어떠한 어떠한 기증자들에서도 반응을 유도하지 못하였다. 그러므로 쥐 항-TNFα 항체를 기준으로 이용하여 인간 항체들의 세그먼트들로부터 비면역원성 컴포지트 인간 항체를 성공적으로 구축하였다.

예 8 : 컴포지트 형 I 리보솜 억제 단백질의 구축

식물형 I 리보솜 억제 단백질(RIP) 부가닌(Bougainvillea spectabilis에서 유도됨)을 WO2005090579에서 설명한 것과 같은 방법들을 이용하여 발생시켰다. 부가닌에서의 T 세포 에피토프들의 자리를 WO2005090579에서와 같이 오버래핑 15량체 펩타이드들을 분석하여 시험하였고 표 6에 있는 SEQ ID 11-13의 펩타이드들(잔존물들 121-135, 130-144 및 148-162에 해당)은 에피토프들인것으로 확인 되었다. 부가닌은 Bougainvillea spectabilis 식물에서 나온 잎의 조직으로부터 클론을 하였다. mRNA를 제작자가 지시한 바와 같이 polyA Tract System 1000 키트(Promega)를 이용하여 100 mg 조직으로부터 추출하였다. 이하의 프라이머들을 가지고 AccessQuick RT-PCR 시스템(Promega)을 이용하여 mRNA 주형으로부터 cDNA를 합성하였다: ATGTACAACACTGTGTCATTTAAC 및 TTATTTGGAGCTTTTAAACTTAAGGATACC. 제1 프라이머는 추가로 ATG 시작 코돈을 포함하고 제2 프라이머는 추가로 TAA 종결 코돈을 포함한다. T/A 클로닝 시스템(pGEM T Easy, Promega)을 이용하여 PCR 생성물을 클론하였고 벡터내에 포함된 T7 프로모터의 전사 방향으로 배향된 정확한 클론을 확인하기 위하여 클론들을 서열화하였다.

부가닌 및 교체 인간 서열 세그먼트들의 면역원성 펩타이드 서열들

SEQ ID No . 11 : ¹²¹AKVDRKDLELGVYKL¹³⁵

AAKAD-CAD39157

AKADR-AAHO1327

KADRK-XP_372046

AAKSDR-AAH47411

KSDRKD-NP_002678

AAKTD-BAA23704

AKTDR-AADO0450

KTDRK-CAH18368

SEQ ID No .12 : ¹³⁰LGVYKLEFSIEAIHG¹⁴⁴

ELGPQ-BAC04852

LGPQK-NP_056013

GPQKLE-XP_370607

ELGGK-AAIO0815

LGGKKL-BAD96533

GGKKLE-AAK68690

ELGNS-BAB14022

LGNSKL-BAD98114

GNSKLE-CAG46875

ELGQAKL-AAF42325

LGQAKLE-AAN63^'404

ELGQD-CAH71404

LGQDK-BACO4773

QDKLE-NP_004000

SEQ ID No . 13 : ¹⁴⁸NGQEIAKFFLIVIQM¹⁶²

GQEQA-CAI95134

QEQAK-AAH55427

EQAKF-NP_079390

GQERA-AAHl0634

QERAK-NP_003153

ERAKF-AAH14009

표 6에서 도시된 바와 같이 확인된 인간 서열 세그먼트들을 포함하는 일련의 변이체들을 제조하였다. 고충실도 중합효소(Expand Hi-Fi, Roche)를 지닌 오버랩 PCR을 이용하여 이러한 변이체들을 구축하였다. 5' 3' 프라이머들은 상기와 같고 PCR 생성물들을 상기와 같이 T/A 클로닝 벡터에로 클론하였고 T7 프로모터의 전사 방향으로 배향된 것으로 클론들이 정확히 확인되었다. 루시페라아제 유전자(Luciferase T7 Control, Promega)를 발현하는 조절 DNA를 포함하는 전사 및 번역이 짝을 이룬 반응에서 활성여부를 확인하기 위해 클론들을 시험하였다. 부가닌은 리보솜 비활성 단백질이기 때문에, 루시페라아제 유전자의 번역 수준들을 상당히 감소시키고 Steady-Glo(Promega)와 같은 루시페라아제 검출 시스템을 이용하여 이러한 감소현상을 간편하게 시험하였다. 정제한 야생형 또는 돌연변이 부가닌 플라스미드들을 Not I 로 직선화 시키고 10 ng/㎕로 희석하였다. 루시페라아제 T7 조절 DNA를 125 ng/㎕로 희석하였다. 각각의 DNA 1 ㎕을 10 ㎕ TnT 믹스(Promega), 0.25 ㎕ 메티오닌 및 0.25 ㎕ 뉴클레아제가 없는 물(TnT 키트에서 공급됨)과 혼합하였다. 부가닌 중량 및 루시페라아제 T7에만 조절을 실시하였다. 반응을 3벌씩 실시하였고 30 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 각각의 반응물 5 ㎕를 벽이 검은 96 웰 루미노미터 플레이트(black walled 96 well luminometer plate)로 옮겨 넣고 45 ㎕ 및 50 ㎕ Steady-Glo 시약으로 혼합하였다. Wallac Microbeta Trilux 루미노미터에서 루미네선스를 측정하였다. 활성은 루시페라아제 T7 조절 DNA만으로 관찰된 루미네선스의 퍼센티지로 발현되었다.

도 20은 수많은 다양한 변이체들의 활성 프로파일을 도시한다. 이는 가장 활발한 변이체들이: 펩타이드 41에 V123T; 펩타이드 44에 V132P/Y133Q; 펩타이드 50에 V132P/Y133Q임을 보인다. 조합된 돌연변이체들이 이러한 4가지 돌연변이들을 포함하도록 제조하였고 활성 시험에서 재 시험하였다. 이러한 돌연변이체의 활성은 도 20에 있는 COMB에 의하여 표시되고 중량비 대략 75 %의 단백질이 활성을 유지한다.

잔존물들 121-135, 130-144 및 148-162에 해당하는 활성 COMB 변이체 내에서 인간 서열 세그먼트들을 포함하는 펩타이드들을 합성하여 예 7에서 설명한 바와 같이 20개의 건강한 기증자로부터 얻은 인간 PBMC들로 시간-코스 T 세포 시험에서 해당 야생형 펩타이드들과 비교하였다. 인간 서열 세그먼트를 포함하는 펩타이드들은 어떠한 기증자 및 어떠한 시간지점에서도 T 세포 증식을 유도하지 않았지만 야생형 펩타이드들 각각은 모든 기증자들의 10 % 및 적어도 한 시간지점에서 SI > 2의 증식을 유도하였음을 보였다.

예 9 : 컴포지트 히루딘의 구축

표 7에 있는 야생형인 SEQ ID. 14를 지닌 단백질을 사용하고 WO2004113386에서 설명한 방법들을 이용하여 트롬빈 억제제 히루딘(Hirudo medicinalis로부터 유도됨)의 컴포지트 변이체들을 발생시켰다. 히루딘에 있는 T 세포 에피토프들의 자리를 WO2004113386에 있는 것과 같은 오버래핑 15량체 펩타이드들을 분석하여 시험하였고 펩타이드 27-41 CILGSDGEKNQCVTG는 20개의 건강한 기증자들로부터 얻은 인간 PBMC들과 상당한 T 세포 반응을 일으키는 것으로 관찰되었다. WO2004113386에서 설명한 시험들을 이용하여 야생형의 완전한 활성을 유지하는 28/29RH로 변환하는 28/29IL을 지닌 변형 히루딘 분자를 제조하였다 예 8에서와 같이 오버랩 PCR을 이용하여 26-29에서 히루딘 잔존물들을 교체하기 위하여 인간 멜라노마-관련(melanoma-associated) 항원(AAN40504.1)으로부터 얻은 인간 서열 세그먼트 KCRH를 사용하였다. 변형된 펩타이드 27-41 CRHGSDGEKNQCVTG를 예 8에서와 같이 T 세포 시험들에서 야생형 펩타이드 27-41 CILGSDGEKNQCVTG와 함께 혼합하였는데 변형된 펩타이드에서 T 세포 에피토프 활성이 상실된 것을 보여주었다.

예 10 : Tr 에피토프들을 지닌 컴포지트 인간 항- IgE 항체의 구축

예 4의 컴포지트 인간 항-IgE 항체로부터 VH 및 VL 유전자들을 Orlandi등의 표준 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 방법들에 의하여 올리고뉴클레오티드 프라이머 짝들을 이용하여 VL- 및 VH-특정 PCR을 제조하기 위한 주형들로서 개별 플라스미드 벡터들로 클론시켰다. 오버래핑 보조 서열들을 후속 융합 PCR이 일어나는 동안 조합되는 PCR 생성물들로 도입시켜서 20 개 아미노산(C4S1)4 링커 또는, 다르게는 아스파라긴 잔존물들 2개 및 GGS 트리플렛 1개로 양쪽 측면을 플랭크시킨 C형 간염 중심 단백질(P19, MacDonald et al., Journal of Infectious Disease, 185(2002) p720-727)로부터 유도된 10 아미노산 Tr 에피토프를 포함하는 20 아미노산 서열 GGSNNLSCLTIPASANNGGS 중 어느 하나의 코딩 서열을 형성한다. 제한 효소들 EcoRV 및 BspE1으로 후속 쪼개짐(subsequent cleavage) 및 블루스크립트 KS 벡터(Stratagene)로 클로닝하기 위하여 프라이머 짝들로 이러한 최종 증폭 단계를 실시하였다. 그러고 나서 컴포지트 인간 항-IgE 단일 사슬 항체들(scFvs)의 2량체 형태들을 Mack 등(Mack etal., Proc Natl Acad Sci U S A., 92(1995) p7021-7025)의 방법에 의하여 구축하였다. 2량체 VL-링커-VH-VL-링커-VH 단편을 발현 벡터 pEF-DHFR(Mack 등(Mack et al., ibid))의 EcoR1/Sal1 사이트들로 서브클론시켰고 전기천공법에 의하여 DHFR-부족 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포들로 트랜스팩션시켰다. Mack 등(Mack et al., ibid)이 설명한 바와 같이 선택, 유전자 증폭 및 단백질 제조를 실시하였다. 니켈-니트릴로트리아세트산(nickel-nitrilotriacetic acid;Ni-NTA) 칼럼(Qiagen)상에 친화도 크로마토 그래피에 의하여 C-말단 히스티딘(histidine) 꼬리들을 통해 정제하여 2량체 Fvs 지정 CHABIgEG4S1 х 4(VL 및 VH 사이의 (G₄S₁)₄ 링커) 및 CHABIgEHCVP19(VL 및 VH 사이의 HCV Tr 에피토프)를 산출하였다.

2량체 scFvs Hall 등(Hall et al., Blood 100(2002) p4529-4536)이 설명한 것과 같은 방법으로 20개의 건강한 기증자에서 나온 PBMC들을 이용하여 인간 T 세포 시험들에서 50 ㎍/㎖의 농도로 후속 시험을 실시하였다. CHABIgEG4S1 х 4 또는 CHABIgEHCVP19 중 어느 하나에 대한 T 세포의 상당한 증식을 볼 수 없었지만, CHABIgEG4S1 х 4 이 아닌(20 개의 기증자들 중 어느 것에서도 SI > 2을 볼 수 없음) CHABIgEHCVP19로 자극한 20 개의 기증자들 중에 4개에서 상당한 수준의 IL-10 생산(SI > 2)되는 결과를 보였다. 이것은 면역억제성의 시토카인 IL-10의 유도를 위해 항체 분자내에 포함된 Tr 에피토프의 영향을 실증한 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> ANTITOPE LIMITED BAKER, Matthew Paul JONES, Timothy David <120> Human Antibodies and Proteins <130> P40089WO <140> PCT/GB2006/000355 <141> 2006-02-03 <150> GB0502201.7 <151> 2005-02-03 <150> GB0506945.5 <151> 2005-04-05 <150> GB0503190.1 <151> 2005-02-17 <160> 600 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ile Leu Leu 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<213> Homo sapiens <400> 553 His Ser Trp Pro 1 <210> 554 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 554 Trp Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr 1 5 <210> 555 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 555 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 556 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 556 atgtacaaca ctgtgtcatt taac 24 <210> 557 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 557 ttatttggag cttttaaact taaggatacc 30 <210> 558 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 558 Ala Lys Val Asp Arg Lys Asp Leu Glu Leu Gly Val Tyr Lys Leu 1 5 10 15 <210> 559 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 559 Ala Ala Lys Ala Asp 1 5 <210> 560 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 560 Ala Lys Ala Asp Arg 1 5 <210> 561 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 561 Lys Ala Asp Arg Lys 1 5 <210> 562 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 562 Ala Ala Lys Ser Asp Arg 1 5 <210> 563 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 563 Lys Ser Asp Arg Lys Asp 1 5 <210> 564 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 564 Ala Ala Lys Thr Asp 1 5 <210> 565 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 565 Ala Lys Thr Asp Arg 1 5 <210> 566 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 566 Lys Thr Asp Arg Lys 1 5 <210> 567 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 567 Leu Gly Val Tyr Lys Leu Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly 1 5 10 15 <210> 568 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 568 Glu Leu Gly Pro Gln 1 5 <210> 569 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 569 Leu Gly Pro Gln Lys 1 5 <210> 570 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 570 Gly Pro Gln Lys Leu Glu 1 5 <210> 571 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 571 Glu Leu Gly Gly Lys 1 5 <210> 572 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 572 Leu Gly Gly Lys Lys Leu 1 5 <210> 573 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 573 Gly Gly Lys Lys Leu Glu 1 5 <210> 574 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 574 Glu Leu Gly Asn Ser 1 5 <210> 575 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 575 Leu Gly Asn Ser Lys Leu 1 5 <210> 576 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 576 Gly Asn Ser Lys Leu Glu 1 5 <210> 577 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 577 Glu Leu Gly Gln Ala Lys Leu 1 5 <210> 578 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 578 Leu Gly Gln Ala Lys Leu Glu 1 5 <210> 579 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 579 Glu Leu Gly Gln Asp 1 5 <210> 580 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 580 Leu Gly Gln Asp Lys 1 5 <210> 581 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 581 Gln Asp Lys Leu Glu 1 5 <210> 582 <211> 15 <212> PRT <213> Bougainvillea spectabilis <400> 582 Asn Gly Gln Glu Ile Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile Gln Met 1 5 10 15 <210> 583 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 583 Gly Gln Glu Gln Ala 1 5 <210> 584 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 584 Gln Glu Gln Ala Lys 1 5 <210> 585 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 585 Glu Gln Ala Lys Phe 1 5 <210> 586 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 586 Gly Gln Glu Arg Ala 1 5 <210> 587 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 587 Gln Glu Arg Ala Lys 1 5 <210> 588 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 588 Glu Arg Ala Lys Phe 1 5 <210> 589 <211> 15 <212> PRT <213> Hirudo medicinalis <400> 589 Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly 1 5 10 15 <210> 590 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 590 Lys Cys Arg His 1 <210> 591 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified Peptide <400> 591 Cys Arg His Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly 1 5 10 15 <210> 592 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 592 Gly Gly Ser Asn Asn Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Asn 1 5 10 15 Asn Gly Gly Ser 20 <210> 593 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 593 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 594 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 594 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 595 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 595 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Met Ser Asn Val Gly Ala Ile Thr Asp Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr Arg Asp Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Ala Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 596 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 596 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr 100 105 110 <210> 597 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 597 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 598 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 598 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 599 <211> 192 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 599 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asp Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Glu 85 90 95 Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 100 105 110 Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His Trp 115 120 125 Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 130 135 140 Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser 145 150 155 160 Val Lys Gly Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala 165 170 175 Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 180 185 190 <210> 600 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 600 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ile Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Phe Gly Ser Ser Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys 35 40 45 Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val 100 105 110 Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val 115 120 125 Gly Ser Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg 130 135 140 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg 145 150 155 160 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr 165 170 175 Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser 180 185 190 Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly 195 200

Claims

변형된 항체 또는 항원 결합 단편의 무거운 사슬 및 가벼운 사슬 가변부위들은 하나 이상의 다른 항체들 또는 항원 결합 단편들로부터 유도된 둘 이상의 아미노산 서열의 세그먼트들로 각각 구성되어 있고, 이에 의하여 상기 세그먼트들이 전체 CDR도 골격부위도 아닌 변형된 항체 또는 그 항원 결합 단편.
제1항에 있어서,

상기 아미노 서열의 세그먼트들은 단일종으로부터 유도된 것을 특징으로 하는 변형된 항체 또는 항원 결합 단편.
제2항에 있어서,

상기 아미노산 서열의 세그먼트들은 인간으로부터 기원된(human) 것을 특징으로 하는 변형된 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서,

각각의 골격부위는 둘 이상의 세그먼트들을 포함하고/포함하거나 각각의 CDR은 둘 이상의 세그먼트들을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 항체 또는 항원 결합 단편.
결합 친화도가 향상되며, 상기 가변 부위로 삽입된 하나 이상의 아미노산 서열의 세그먼트들을 포함하는 변형된 항체 또는 항원 결합 단편.
제5항에 있어서,

상기 삽입된 아미노산 서열의 세그먼트들이 인간으로부터 기원된 것을 특징으로 하는 변형된 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

하나 이상의 T 세포 에피토프들은 하나 이상의 아미노산 서열의 세그먼트들을 하나 이상의 가변 부위들로 삽입하여 제거되는 것을 특징으로 하는 변형된 항체 또는 항원 결합 단편.
제7항에 있어서,

하나 이상의 삽입된 아미노산 서열의 세그먼트들이 인간으로부터 기원된 것을 특징으로 하는 변형된 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,

면역 응답(response)들을 억제하는 조절 T 세포 에피토프들을 인코딩하는(encoding) 하나 이상의 세그먼트들을 포함하는 변형된 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,

항 HER2, 항 Lewis Y 항원, 항 IgE 또는 항 TNF 항체인 것을 특징으로 하는 변형된 항체.
하나 이상의 아미노산 서열의 세그먼트들의 삽입을 통해 면역원성이 개선된 변형된 단백질.
제11항에 있어서,

상기 삽입된 아미노산 서열의 세그먼트들은 인간으로부터 기원된 것을 특징으로 하는 변형된 단백질.
제11항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서,

하나 이상의 T 세포 에피토프들은 상기 하나 이상의 아미노산 서열의 세그먼트의 삽입에 의하여 제거되는 것을 특징으로 하는 변형된 단백질.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,

면역 응답들을 억제하는 조절 T 세포 에피토프들을 인코딩하는 하나 이상의 세그먼트들을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 단백질.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,

변형된 유형 I 리보솜 억제 단백질 또는 변형된 히루딘인 것을 특징으로 하는 변형된 단백질.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 기원(original) 항체 또는 단백질이 비인간 기원인 것을 특징으로 하는 변형된 항체, 항원 결합 단편 또는 단백질.
제16항에 있어서,

상기 기원 항체가 쥐 항체인 것을 특징으로 하는 변형된 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항 내지 제17항 중 한 항에 있어서,

상기 변형된 항체의 모든 가변부위들은 기원이 인간인 것을 특징으로 하는 변형된 항체.
하나 이상의 의약적으로 허용된 부형제들, 운반체들 또는 희석제들과 선택적으로 함께, 제1항 내지 18항 중 어느 한 항에서 정의된 변형된 항체, 항원 결합 단편 또는 단백질을 포함하는 약학 제제.
(1) 상이한 가변부위 유전자들의 라이브러리를 발생하기 위하여 기타 항체 가변 부위들의 범위로부터 유도된 아미노산 서열의 세그먼트들을 조합하여 항체 가변 부 유전자들을 제조하는 단계;

(2) 항체 가변부위 유전자들의 라이브러리를 발현 벡터로 클로닝하는 단계; 및

(3) 항체 가변부위들의 라이브러리를 스크리닝하고 상기 라이브러리의 구성요소들을 원하는 성질들로 회복시키는 단계를 포함하는 변형된 항체를 제조하는 방법.
(1) 상이한 가변부위 유전자들의 라이브러리를 발생하기 위하여 원하는 성질들을 지닌 하나 이상의 기준 항체들로부터 유도된 원하는 아미노산들을 포함하는 기타 항체 가변부위들의 범위로부터 유도된 아미노산 서열의 세그먼트들을 조합하여 항체 가변부위 유전자들을 제조하는 단계;

(2) 항체 가변부위 유전자들의 라이브러리를 발현 벡터로 클로닝하는 단계; 및

(3) 항체 가변부위들의 라이브러리를 스크리닝하고 상기 라이브러리의 구성요소들을 원하는 성질들로 회복시키는 단계를 포함하는 변형된 항체를 생산하는 방법.
제20항 또는 제21항에 있어서,

상기 아미노산 서열의 세그먼트들은 단일종으로부터 유도된 것을 특징으로 하는 방법.
제22항에 있어서,

상기 아미노산 서열의 세그먼트들은 인간으로부터 기원된 것을 특징으로 하는 방법.
제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 항체 가변부위들은 둘 이상의 세그먼트들에서 유도된 골격 부위들 및/또는 둘 이상의 세그먼트들에서 유도된 CDR들로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 라이브러리로부터 회복된 하나 이상의 구성요소들이 하나 이상의 아미노산 서열의 세그먼트들의 가변부위들로의 치환을 통해 더 변화를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,

T 세포 에피토프를 감소시키거나 제거하기 위하여 상기 라이브러리로부터 회복된 하나 이상의 구성요소들이 하나 이상의 아미노산 서열의 세그먼트들의 치환을 통해 더 변화를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 라이브러리로부터 회복된 하나 이상의 구성요소들이 면역 응답들을 억제하는 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프들의 삽입 또는 첨가를 통해 더 변화를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
(1) 상이한 단백질 유전자들의 라이브러리를 생성시키기 위하여 원하는 성질들을 지닌 하나 이상의 기준 단백질들로부터 유도된 원하는 아미노산들을 포함하는 기타 단백질들의 범위로부터 유도된 아미노산 서열의 세그먼트들을 조합하여 단백질 유전자들을 제조하는 단계;

(2) 단백질 유전자들의 라이브러리를 발현 벡터로 클로닝하는 단계; 및

(3) 단백질들의 라이브러리를 스크리닝하고 상기 라이브러리의 구성요소들을 원하는 성질들로 회복시키는 단계를 포함하는 변형된 단백질을 제조하는 방법.
제28항에 있어서,

아미노산 서열의 세그먼트들은 단일종으로부터 유도된 것을 특징으로 하는 방법.
제29항에 있어서,

아미노산 서열의 세그먼트들은 인간으로부터 기원된 것을 특징으로 하는 방 법.
제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 라이브러리로부터 회복된 하나 이상의 구성요소들은 하나 이상의 아미노산 서열의 세그먼트들을 가변부위들로의 치환을 통해 더 변화를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제28항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서,

T 세포 에피토프를 감소시키거나 제거하기 위하여 상기 라이브러리로부터 회복된 하나 이상의 구성요소들은 하나 이상의 아미노산 서열의 세그먼트들의 치환을 통해 더 변화를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 라이브러리로부터 회복된 하나 이상의 구성요소들은 면역 응답들을 억제하는 하나 이상의 조절 T 세포 에피토프들의 삽입 또는 첨가를 통해 더 변화를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
(1) 상이한 항체 또는 단백질 유전자들의 라이브러리를 생성시키기 위하여 기존의 아미노산 서열의 세그먼트들을 기타 항체들 및 단백질들의 세그먼트들로 대체하여 항체 또는 단백질 유전자들을 제조하는 단계;

(2) 항체 또는 단백질 유전자들의 라이브러리를 발현 벡터로 클로닝하는 단계; 및

(3) 항체들 또는 단백질들의 라이브러리를 스크리닝하고 상기 라이브러리의 구성요소들을 개선된 성질들로 회복하는 단계를 포함하는 개선된 성질들을 가지는 변형된 항체 또는 단백질을 생산하는 방법.
제20항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,

변형되는 항체는 비인간 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제35항에 있어서,

변형되는 상기 항체는 쥐의 항체인 것을 특징으로 하는 방법.