CN101115771A - 人类抗体和蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包括抗体的复合蛋白质，其显示降低的免疫原性。尤其是，提供了用于人类的复合抗体，特别是经过修饰而除去一个或多个T细胞表位的抗体。还提供了用于生成这种蛋白质的方法。

Description

人类抗体和蛋白质
本发明涉及生成抗体和蛋白质，其在最终的抗体或蛋白质分子中结合了两个或多个来自人类抗体或蛋白质的氨基酸序列的片段。尤其是，本发明提供了这样的序列片段组合，以使最终抗体或蛋白质分子中的T细胞表位数目得到减少或消除。本发明尤其涉及生成作为药剂或体内诊断试剂在人类中应用的抗体和蛋白质。
过去20年，已经在生成作为潜在药物在人中应用的重组单克隆抗体中取得了巨大进步。通过嵌合、人源化和噬菌体展示或转基因小鼠的人类抗体克隆技术已经提供了在施用至人时一般良好耐受的抗体，且比使用非人类单克隆抗体具有更小的免疫原性。然而，即使当所述抗体的遗传起源是人类时，通过这些技术生成的几种抗体已经显示在患者中引发免疫原性。例如，人类抗体Humira_在12％的类风湿性关节炎患者引发免疫原性，而人源化抗体CAMPATH_在约50％的患者中引发免疫原性。这种免疫原性的诱导有可能起因于抗体可变区内存在痕量的非自身氨基酸序列，在一些情况下，所述非自身氨基酸序列可以形成诱导T细胞反应的T细胞表位，导致免疫原性。因此，需要改进的技术和抗体组合物，所述抗体具有高度的人类起源，但尽可能避免形成可能诱导T细胞反应的序列。
本发明提供了方法以及由此所得的用于治疗用途的抗体组合物，例如在最终抗体分子中结合了两个或多个来自人类抗体的氨基酸序列片段的抗体(本文称为“复合抗体”)。
因此，第一方面，本发明提供了经修饰的抗体或其抗原结合片段，其中所述修饰抗体或抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区各自由来自一种或多种其他抗体或抗原结合片段的两个或多个氨基酸序列片段组成，从而所述片段既不是完整的CDR也不是完整的框架区。
在本发明的上下文中，术语“片段”指抗体分子内存在的连续的氨基酸序列，这种片段的大小范围从2至125个氨基酸长，优选从2至31个氨基酸长，其中这种片段既不是完整的CDR也不是完整的框架区。为治疗用途，本发明的复合抗体通常将在所述复合抗体的可变区结合两个或多个来自不同人类抗体的氨基酸序列片段。尤其是，本发明涉及复合抗体的重链可变区和轻链可变区(分别为VH和VL)，其中VH和VL各自完全由来自两个或多个人类抗体可变区的序列片段组成，其中复合的VH和VL通常各自包括人类可变区序列片段，其位置相应于其起源的人类抗体VH和VL的位置，例如，所述复合VH序列中的氨基酸1至10将来源于人类抗体的氨基酸1至10。或者，不论所述序列在所述起源人类抗体VH或VL中的位置，所述复合抗体中的人类VH或VL序列的片段可以位于任何序列位置。例如，如人类单克隆抗体V区序列的数据库中所提供的，所述起源的人类抗体VH和VL将是任何现有的人类抗体可变区(V)氨基酸序列，并可以包括：来自具有V区体细胞突变和其他非种系变异的亲和力成熟的抗体的序列；来自种系V区的序列；来自人工构建抗体V区的序列，所述V区产生于来自所述物种的抗体的序列片段，所述抗体例如具有一组固定V区框架但具有可变CDR的抗体；选自人类抗体文库(例如噬菌体展示文库)的序列；和衍生自转基因动物的人类抗体序列，所述动物表达编码人类抗体或抗体片段的基因。
在本发明的优选实施方案中，通过结合多个人类VH和VL序列片段于组合物中来构建本发明的治疗用途的复合抗体，所述组合物限制或消除了最终复合抗体V区中的人类T细胞表位。
该方面的人类T细胞表位是可以结合人类II类MHC分子并通过呈递至CD4+T细胞来诱导辅助T细胞反应的氨基酸序列。可以选择在最终复合抗体中限制或消除了T细胞表位的人类VH和VL序列片段及片段组合。其可以通过使用不含T细胞表位的片段(例如来自人类种系序列)实现，并通过连接相邻的片段来生成不含T细胞表位的新序列，例如：通过在两个片段接头处生成非MHC结合序列，通过生成另一人类种系序列，或通过生成不诱导辅助T细胞反应的序列，不论是否为非种系序列。
在本发明的另一优选实施方案中，可以在所述复合抗体分子中增加或形成其他氨基酸序列，其供给一个或多个调节T细胞表位(“Tr表位”)。为本发明的目的，Tr表位是刺激CD4+CD25+T细胞的MHC结合肽，所述细胞通过分泌抑制性细胞因子(例如IL-10和TGF-β)以及接触依赖性机制而具有调节免疫反应的能力。像这样，在本发明的范围内，调节T细胞表位可以包括已知在体外或体内诱导一种或多种活性的肽，所述活性可促进在某些条件下的免疫反应调节。例如，调节T细胞表位将包括：具有诱导或激活CD4+CD25+T细胞的作用的肽，具有诱导抑制性细胞因子(如IL-10和/或TGF-β)释放的作用的肽，或者在体外或体内具有其他可测的免疫抑制相关活性的肽，在所有情况下，所述作用与CD4+CD25+T细胞的作用有关。因此，这样的Tr表位可以提供限制或消除所述复合抗体中免疫原性的附加量度。可以通过掺入含有这些表位的人类VH和VL片段、或者通过组合两个或多个人类序列片段而生成这样的表位、或者例如从相应于人类抗体或蛋白质序列片段的肽筛选新Tr表位，将Tr表位导入所述复合抗体VH或VL，用于诱导或激活CD4+CD25+T细胞，例如通过检测抑制性细胞因子(例如IL-10和/或TGF-β)的释放(例如Hall等，Blood，vol.100(2002)p4529-36)。或者，已知的Tr表位可以掺入复合抗体V区的VH和/或VL内，其不抑制所述复合抗体的结合或功能或表达，或者可以掺入复合VH或VL序列的一个末端，例如在VH的N端。或者，Tr可以掺入复合抗体的一个或两个恒定区，其掺入位置不干扰所述复合抗体的功能(例如，在铰链区内)或导致其他有害作用，例如表达缺乏。或者，对于抗体融合蛋白、抗体轭合物、Fab和Fv-型式(包括具有连接的VH和VL的单链抗体(SCA))、单结构域抗体或同型二聚体抗体内的一个或两个复合VH和VL，Tr表位可以掺入不干扰所述复合抗体功能或导致其他有害作用(例如表达缺乏)的位置。例如，在SCA中，用于Tr表位的特别优选的位置是连接VH和VL的连接区。最佳地，Tr表位的侧翼将使用适当序列，以优化调节T细胞表位在II类MHC分子上的释放和展示，例如通过在所述表位的侧翼使用对内吞蛋白酶作用敏感的序列。通常，侧翼残基的位置从P-20至P30(具有定义为P1-P9的核心单体)，如果需要使用其它的人类抗体序列片段，其将在引入抗原加工过程中靶向蛋白酶的作用。
如本文所讨论的，本发明还提供了生成经修饰的抗体或复合抗体的方法。因此，在另一方面，本发明提供了用于生成修饰抗体的方法，该方法包括步骤：
(1)通过结合来自一系列其他抗体可变区的氨基酸序列片段来制备抗体可变区基因，以生成不同可变区基因文库；
(2)将所述抗体可变区基因文库克隆入表达载体；
(3)筛选所述抗体可变区基因文库并回收具有期望性质的所述文库成员。
在本发明的第一优选的方法‘A’中，生成复合人类抗体的文库并筛选具有期望性质(例如与特异抗原结合)的抗体。该方法涉及如下6个步骤：
(1)设计复合的VH和VL基因
(2)克隆复合的VH和VL基因
(3)表达复合的VH和VL基因
(4)筛选和选择具有期望性质的复合抗体
(5)优化前导的复合抗体
(6)(任选的)消除T细胞表位
关于步骤(1)，复合VH和VL序列文库的设计是通过从已知的人类V区序列(例如可以在Kabat抗体数据库(www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html)、NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)获得的那些序列)和蛋白质数据库(例如UniProt(www.ebi.uniprot.org)和PRF/SEQDB(www.prf.or.jp))中选取VH和VL序列片段。另外，可以通过收集人类VH和VL序列来补充这些文库，通过直接测序来自一个或多个个体供体的扩增VH和VL的mRNA。可以考虑序列片段的各种组合来设计VH和VL基因。所使用的一个方法是固定所述复合VH和VL序列的长度，并使用来自不同人类V区中相应Kabat编号位置的固定长度的序列片段来设计这些基因。
例如，所述文库将分别包括121和107个氨基酸的VH和VL区，例如，将包括使用Kabat编号的VH氨基酸1-27的不同片段的分配。对于具有相应于Kabat编号CDR1：30-35、CDR2：50-66和CDR3：95-106的CDR的VH，下述Kabat位置的序列片段作为一个选择：1-27、28-31、32-36、37-42、43-50、51-56、57-60、61-63、64-69、70-82a、82b-96、97-98、99-101、102-117。对于具有相应于Kabat编号CDR1：24-34、CDR2：50-56、CDR3：89-97的CDR的VL，下述Kabat位置的序列片段作为一个选择：1-22、23-27、28-30、31-33、34-35、36-47、48-52、53-55、56-59、60-87、88-92、93-94、95-107。因此，在该例中，复合VH由14个人类片段组成，复合VL由13个人类片段组成。在实践中，使用计算机程序来产生这些片段的组合。优选地，所述程序包括避免某些片段的非优选组合的算法，例如，所述非优选组合可能消除CDR的某些极限结构(canonicalstructures)或可能破坏VH和/或VL折叠或VH/VL相互作用。作为任选的补充，所述程序可以包括限制所述序列片段组合形成的T细胞表位数目的算法(参见下述步骤(6)中的计算机模拟(in silico)方法)。
关于步骤(2)，已经设计了复合人类序列的文库，然后优选使用合成寡核苷酸生成了复合VH和VL基因。通常，编码较长的V区序列片段的合成寡核苷酸将与编码两个或多个连续的V区序列片段的寡核苷酸混合物相连接。或者，可使用现有的人类VH和VL基因作为模板，通过其他方法(例如重叠PCR或其他扩增技术)装配复合V区。例如，使用PCR，可以分别扩增小的V区片段，然后通过重叠PCR反应连接。
在其他方法中，可以生成混合的合成寡核苷酸以生成一系列序列片段，优选使用掺杂方法以富集编码特定V区片段的序列。使用本领域技术人员已知的技术(例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual；3rd Ed.，vols.1-3(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press中公开的那些技术)并使用用于免疫球蛋白的标准PCR方法(例如Orlandi等，Proc Natl Acad SciU S A.，86(1989)3833-3837描述的那些方法)，可以许多方式装配具有广泛的人类V区片段表现度变异性的复合人类VH和VL基因。
关于步骤(3)，复合人类VH和VL基因一经生成，其可以被克隆入多种表达载体，用于生成完整抗体分子或抗原结合片段，例如Fv′s、Fab′s、Fab2、SCA、单结构域抗体(例如仅含有VH)及其各自的多聚体衍生物。或者，VH和VL基因可融合至编码其他分子的基因，以生成融合蛋白。还可以包括编码可测标志(例如在Fv或Fab的一条链的C端的聚组氨酸标签)的序列。表达载体包括那些用于在哺乳动物细胞、细菌细胞、细菌噬菌体、酵母、真菌和其他微生物中表达的载体。这样的载体还包括那些经由转基因动物体内表达的载体和那些使用体外系统(例如使用核糖体制品体外翻译)表达的载体。
关于步骤(4)，通常从复合人类抗体文库中筛选结合至一个或多个感兴趣的特异抗原的复合人类抗体。有许多本领域技术人员已知的筛选方法，其选择将依赖于所述复合人类抗体的表达形式和所述抗体分子的组成，即完整抗体或Fab、Fv、SCA、单结构域抗体等。在可获得与兴趣抗原结合的现有抗体的一些情况下，来自该抗体的VH或VL可以分别与复合人类VL或VH组合，并检测结合。
筛选方法的范围从固定这类成员的文库或池的单个成员至固相，到或单独或以池来固定兴趣抗原。其中抗体是固定的，然后添加兴趣抗原，并可通过添加一种或多种其他试剂直接或间接检测所述抗原。例如，如果所述抗原是与酶(例如碱性磷酸酶)的融合蛋白或轭合物，则可通过随后添加各种底物(其产生颜色、荧光或化学发光信号)来实现检测。当抗体池固定于一个位置(例如，微量滴定盘的孔)且经由添加抗原而产生信号时，则该池可以在再次筛选所述池的单个成员或更小的池之前被再次复制(dereplicated)。当兴趣抗原被固定时，可通过几种方式筛选所述复合抗体文库，所述方式范围从添加单个抗体至固定于特定位置的兴趣抗原，到添加抗体池，到添加完整的复合体文库，和随后回收与所述兴趣抗原结合的抗体。在最后的情况下，普通策略是：固定抗原于固相上(例如柱中或小珠上)，添加所述文库，随后例如使用低盐缓冲液洗涤所述固相(以除去松散结合的文库成员)，然后例如使用高盐缓冲液洗脱结合至所述抗原的抗体。用于表达为此目的的文库成员的常用形式是噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示和珠展示，在每种情况下，编码复合VH和VL链的核酸与结合所述抗原的复合V区保持连接。
筛选方法还将包括功能或生物学试验，其可替代直接抗原结合试验，其中例如在体外试验或者体内试验中检测功能活性或生物学活性，所述体外试验涉及细胞生长、细胞生长抑制、细胞分化或细胞迁移，所述体内试验涉及在完整生物体水平上检测针对抗原的反应，例如小鼠中血细胞数目的变化或移植肿瘤的生长抑制。
关于步骤(5)，选择一个或多个具有期望性质(例如结合至兴趣抗原)的“前导”复合人类抗体之后，任选地可以例如通过提高与抗原结合的亲和力或者将所述抗体融合至其他部分来改进所述前导抗体的性质。可通过诱变复合可变区序列来实现提高的亲和力，以选择在选定复合V区序列中以期望的方式提高或改变结合的突变。本发明包括用于诱变可变区序列的新方法，通过使用来自一个或多个人类抗体序列的相应序列片段取代来自前导抗体的一个或多个单个V区序列片段。特别地，与CDR区域重叠的片段或CDR区域内重叠的片段可以被一个或多个来自其它人类抗体的包含不同长度的替代片段所取代。在本发明的范围内，可以包括来自具有与选定的前导抗体相关性质的人类抗体的特定片段，例如来自与相同抗原结合的抗体，或者来自具有相关性质的非人类抗体，或者来自具有保持某些关键氨基酸的序列片段的人类抗体，所述关键氨基酸显示对具有相关序列的非人类抗体功能是重要的。然后，可以根据改进的性质来筛选经受这种诱变的一个或多个复合人类抗体。
关于任选的步骤(6)，在选择前导复合人类抗体之后，当需要时，通过将促进或编码T细胞表位的V区片段替换为消除T细胞表位的替代片段来限制或消除T细胞表位。这样的T细胞表位可以通过一系列方法检测。例如，相应于复合V区序列中的一个或多个基因座的肽可以被合成并在T细胞测定中测试以测定T细胞表位的存在。通常，这样的肽长度为15个氨基酸，并且，当期望测试较长的连续V区序列时，使用来自例如具有12个氨基酸重叠的15mers序列的重叠肽。为检测T细胞表位，可以使用一系列不同的T细胞测定法来检测CD4+T细胞的活化或增殖，例如那些检测细胞因子释放、增殖(例如，通过3H-胸苷摄取)、Ca2+通量、表面标志表达、基因转录等的方法。
或者，在每种情况下，使用体外方法或计算机模拟方法来分析相应于复合V区序列的重叠肽对人类II类MHC分子的结合，以测定可以诱导T细胞反应的潜在T细胞表位，即MHC结合肽。计算机模拟方法将包括：涉及模拟肽-II类MHC结合相互作用的方法；涉及鉴定普遍用于结合II类MHC的基序的方法；和，使用具有已知的体外MHC结合性质的肽或肽内特定氨基酸数据库的方法。可以使用其他方法，例如从复合V区序列或含有复合V区序列的完整抗体生成较长的肽并在T细胞测定或MHC结合测定中测试这些肽，例如通过测试MHC-肽四聚体，或者通过在已知的人类T细胞表位数据库中检索所提出或构建的序列。还可以通过消除II类MHC结合基序或消除将肽与II类MHC的结合锚定的特定氨基酸，来辅助消除复合人类V区中的T细胞表位。在从一个或多个前导复合人类抗体消除T细胞表位的优选方法中，计算机模拟方法被最初用以分析复合人类抗体V区的潜在T细胞表位，当其被鉴定时，导入人类VH或VL序列的新片段以消除这些表位并避免新T细胞表位的引入。
随着任何新人类V区片段的这种导入和再次筛选期望性质的这种修饰前导复合人类抗体，则可以通过测试长度通常为15至45个氨基酸的重叠肽(例如来自复合人类V区序列(完整V区或其部分)的具有12个氨基酸重叠的15mer肽)或者通过直接在人类T细胞测定中测试完整的复合人类抗体，在人类T细胞测定中进一步测试一个或多个最终的前导复合人类V区。考虑到针对完整抗体的T细胞活化的直接测试，优选使用T细胞测定的最终分析用于测试完整的复合人类抗体。
在本发明第二优选的方法‘B’中，生成复合人类抗体文库以包括来自一个或多个具有期望性质的参考抗体的期望氨基酸。该方法涉及如下7个步骤：
(1)一个或多个参考抗体的序列分析
(2)设计复合VH和VL基因
(3)(任选的)消除T细胞表位
(4)克隆复合VH和VL基因
(5)表达复合VH和VL基因
(6)筛选和选择具有期望性质的复合抗体
(7)优化前导复合抗体，包括任选消除T细胞表位
在步骤(1)中，通常的参考抗体是啮齿类动物特别是小鼠的，具有在人类形式的抗体中所期望的性质和/或结合特异性。当可获得一个或多个参考抗体V区序列时，分析这些序列以确定CDR序列并鉴定可能对抗体的期望性质(例如结合特异性)重要的氨基酸。对于参考抗体，这样的分析可以例如通过参考V区序列与同物种的其他序列的比对来进行，并且如果所述参考抗体是非人类的，则与人类V区序列比对。例如，使用CLUSTAL程序(Thompson等，Nucleic Acids Res.22(1994)p4673-80)进行这种比对。这种比对可以鉴定参考抗体的V区和同源V区家族中的非普通或稀有氨基酸。另外，可以使用例如Protein Data Bank(Berman等：The Protein Data Bank，Nucleic Acids Research，28(2000)235-242)来鉴定保守的V区结构，例如CDR的典型结构。另外，当结构未知时，可以使用模拟软件(例如MODELLER(Sali 和Blundell，J.MoI.Biol.234(1993)p779-815))模拟参考抗体可变区，并且在一些情况下，可以产生抗体-抗原相互作用的模型。这种参考抗体V区的分析可用以指导为复合人类抗体选择人类V区序列片段。
关于步骤(2)，已经确定了可能对复合人类抗体的期望性质重要的氨基酸，然后选择人类V区序列的片段，以包括这些氨基酸的一些或全部。从而设计复合人类V区序列的文库包括在特定基因座具有通常一个或多个替代人类V区片段的选定片段，其中所述片段对所述复合人类抗体的性质的作用是不确定的。与参考抗体一样，可通过与其他人类抗体序列和保守结构的比对来进一步分析这种复合人类抗体序列，另外，如果需要，可以进行进一步的复合人类抗体V区结构模拟以精制用于复合人类抗体的人类V区片段的组合，以消除蛋白质结构缺陷、复合V区中的分子间和分子内相互作用和重要氨基酸的不正确结构定向。
关于任选的步骤(3)，作为片段选择的附加标准，选择限制或消除了最终的复合人类V区内T细胞表位的那些片段。使用计算机模拟或体外方法，通过方法A步骤(6)中描述的方法分析T细胞表位，优选通过在设计复合人类V区序列的阶段使用计算机模拟方法。
关于步骤(4)，已经设计了复合人类序列的文库，然后优选使用合成寡核苷酸生成复合VH和VL基因。通常，编码较长的V区序列片段的合成寡核苷酸将与编码替代序列片段的寡核苷酸混合物相连接，以生成复合人类V区文库的不同成员。或者，将使用编码特定人类V区序列的寡核苷酸分别生成所述复合人类V区文库的每个成员。或者，可使用现有的人类VH和VL基因作为模板或者使用一个或多个参考抗体V区基因作为模板，通过其他方法(例如重叠PCR或其他扩增技术)装配复合V区。
方法B的步骤(5)和(6)如方法A的步骤(4)和(5)中所描述的。
任选的步骤(7)将如方法A步骤(6)进行，其中在前导复合人类抗体中要求进一步消除T细胞表位。考虑到直接检测经由整个抗体的T细胞活化，使用T细胞测定的最终分析用于测试整个复合人类抗体是优选的。
本领域技术人员应该理解，除了方法A和B之外，还有其他用于生成并测试复合人类抗体和用于优化这类抗体的性质的方法。本发明的复合人类抗体是新的，并且作为V区的完全人类来源的结果，其应该比含有非人类序列的其他抗体在人类中具有较小的免疫原性。复合人类抗体的附加任选特征，即T细胞表位的消除和/或Tr表位的添加也可以促成较低的免疫原性。本领域技术人员应该理解：可以使用次优选的含有非全部人类序列片段的V区的复合抗体来实现较低免疫原性的目的，例如：在复合人类抗体中包括在不同于在其起源人类抗体序列位置的序列位置的片段的复合人类抗体；仅部分掺入人类V区序列片段的复合抗体；具有非人类序列的复合抗体；或具有已经突变了的人类序列的复合抗体，所述突变例如以增加对抗原的结合亲和力或消除T细胞表位。
应该理解，复合人类抗体中的V区序列片段及其组合可以被选择以符合上述包括任选消除T细胞表位的一系列标准。例如，可以选择人类V区序列片段及其组合，为避免B细胞表位和其他表位(例如I类MHC限制的表位)，为避免可能对复合抗体表达有害的氨基酸序列，为避免可能导致复合抗体不适当修饰(例如N-糖基化)的序列，为加入某些功能(例如加入辅助T细胞表位和/或B细胞表位(例如，在疫苗应用中))，为随后结合至其他部分(例如一个或多个表面赖氨酸残基)，和为一系列其他标准。
本领域技术人员还应理解，除了人类，还可以生成具有全部或部分来自其他物种的V区片段的复合抗体，并应该视为本发明的范围之内。例如，有关小鼠的研究，可以生成包含全部或部分小鼠来源的V区序列片段的复合小鼠抗体。
从而，本发明还应用于用于治疗用途的不同于抗体的蛋白质，这种蛋白质(本文称为“复合蛋白质”)在最终的蛋白质分子中组合了来自人类蛋白的两个或多个氨基酸序列片段。
因此，在进一步的方面，本发明提供了通过插入一个或多个氨基酸序列片段而具有改进的免疫原性的修饰蛋白质。
关于蛋白质，术语“片段”指蛋白质分子中存在的连续氨基酸序列，例如大小范围从2至250个氨基酸长度的片段。为治疗用途，本发明的复合蛋白质通常将在所述复合蛋白质中组合两个或多个来自不同人类蛋白的氨基酸序列片段。特别地，本发明涉及具有完全由来自两个或多个人类蛋白的序列片段组成的插入物的复合蛋白质。当人类蛋白质存在与所述复合蛋白质的同源性或者存在所述复合蛋白质的区的同源区时，可以使用相应于其在来源人类蛋白中序列位置的复合蛋白质中序列位置处的人类蛋白序列片段，例如复合蛋白质序列中的氨基酸1至10将来自起源人类蛋白的氨基酸1至10。或者，人类蛋白序列片段可以所述复合蛋白中任何位置处置于所述复合蛋白质，而不论所述序列在起源人类蛋白中的位置。所述起源人类蛋白可以是任何现有人类蛋白氨基酸序列，例如人类蛋白质序列数据库中所提供的，并且可以包括来自天然突变或重排形式的人类蛋白质和不同于种系的其他变异的序列、来自人工构建的人类衍生蛋白质的序列和来源于人类基因或RNA的序列，不论相应的蛋白质是否被表达。
在本发明该方面的优选实施方案中，用于治疗用途的复合蛋白质的构建是通过在组合物中组合或插入人类蛋白质序列片段，其限制或消除了最终复合蛋白质中的人类T细胞表位。如应用至复合蛋白质的本发明的优选方面是通过插入人类蛋白序列片段来修饰现有的参考蛋白质(例如非人类蛋白质)，目的是限制或消除最终复合蛋白质中的T细胞表位。
在本发明用于生成复合蛋白质的优选方法中，生成复合人类蛋白质文库，以包括来自一个或多个具有期望性质(例如不含T细胞表位)的参考蛋白质的期望的氨基酸序列。该方法涉及如下7个步骤：
(1)一个或多个参考蛋白质的序列分析，包括任选的T细胞表位分析
(2)设计复合蛋白质基因
(3)(任选的)消除T细胞表位
(4)克隆复合蛋白质基因
(5)表达复合蛋白质基因
(6)筛选和选择具有期望性质的复合蛋白质
(7)优化前导复合蛋白质，包括任选消除T细胞表位
在步骤(1)中，通常的参考蛋白是非人类的，具有在复合蛋白质中期望的性质。为治疗用途，通常减少或消除复合蛋白质中的免疫原性是目的。当可获得一个或多个参考蛋白序列时，分析这些序列以鉴定可能对所述蛋白质的期望性质重要的氨基酸。另外，可以分析所述参考蛋白的任何已知结构，或者，使用模拟软件模拟结构。当可获得所述参考蛋白质的同系物时，种间或种内，这些同系物有时可用以确定同系物间序列差异和性质差异之间的关系。当所述蛋白质与另一分子相互作用时，有时可以产生该相互作用的模型并确定对该相互作用重要的氨基酸。作为步骤1的任选的补充，特别使用上述关于复合人类抗体所具体描述的体外人类T细胞测定法来测定所述参考蛋白质中T细胞表位的序列位置。或者，可以使用用于分析T细胞表位的计算机模拟方法。所述参考蛋白的这种分析用以指导为复合蛋白质选择人类蛋白质序列片段。对于复合蛋白质，当目的为减少或消除与参考蛋白质(特别是非人类的)相比较的免疫原性时，通常在所述复合蛋白质中使用一个或多个相应于T细胞表位位置的人类序列片段，结合来自参考蛋白没有T细胞表位的位置的序列片段。
关于步骤(2)，已经确定了可能对复合蛋白质的期望性质重要的氨基酸，然后选择蛋白质序列的片段以包括这些氨基酸的一些或全部。从而设计复合蛋白质序列的文库包括在特定基因座具有通常一个或多个替代蛋白质片段的选定片段，其中所述片段对所述复合蛋白质的性质的作用是不确定的。与参考抗体一样，可通过与任何同系物的比对或通过复合蛋白质结构的模拟或通过其他分析来进一步分析这种复合蛋白质序列，目的是精制(如果需要)用于复合人类蛋白质的人类蛋白质片段的组合，以消除蛋白质结构缺陷和重要氨基酸的不正确结构定向。
关于任选的步骤(3)，作为片段选择的附加标准，选择限制或消除最终复合蛋白质内T细胞表位的那些片段或片段组合。使用计算机模拟或体外方法，通过上述针对复合人类抗体所描述的方法来分析T细胞表位。
关于步骤(4)，已经设计了复合蛋白质的文库，然后优选使用合成寡核苷酸生成复合蛋白质基因。通常，编码较长的蛋白质序列片段的合成寡核苷酸将与编码替代序列片段的寡核苷酸混合物相连接，以生成复合蛋白质文库的不同成员。或者，将使用编码特定复合蛋白质序列的寡核苷酸分别生成复合蛋白质文库的每个成员。或者，可使用现有的人类蛋白质基因作为模板或者使用一个或多个参考蛋白质基因作为模板，通过其他方法(例如重叠PCR或其他扩增技术)装配复合蛋白质。
关于步骤(5)，根据所述复合蛋白质的一个或多个期望的性质，筛选复合蛋白质文库。有许多本领域技术人员已知的筛选方法，其选择将依赖于所述复合蛋白质的表达形式和蛋白质功能。筛选方法的范围从固定这类成员的文库或池的单个成员至固相，到在溶液相中筛选所述文库的成员，到单独或以池来固定所述蛋白质被设计通过结合与之相互作用的另一分子。筛选方法还可以包括功能或生物学试验，其中例如在体外试验或者体内试验中检测功能活性或生物学活性，所述体外试验涉及细胞生长、细胞生长抑制、细胞分化或细胞迁移，所述体内试验涉及在完整生物体水平上检测针对所述复合蛋白质的反应，例如小鼠中血细胞数目的变化或移植肿瘤的抑制。
关于步骤(6)，在选择一个或多个具有期望性质的“前导”复合蛋白质之后，任选地，可以例如通过增加酶的特异活性或通过增加蛋白质配基与受体的结合来改进所述前导蛋白质的性质。可通过诱变复合蛋白质序列来实现提高的亲和力，以选择以期望的方式改变所述复合蛋白质性质的突变。本发明包括用于诱变可变区序列的新方法，通过用来自一个或多个人类蛋白质的序列片段取代来自所述蛋白质的一个或多个单个蛋白质序列片段。然后，可以根据改进的性质来筛选属于这种突变的一个或多个复合蛋白质。
关于步骤(7)，在选择前导复合蛋白质之后，当需要时，通过将促成或编码T细胞表位的蛋白质序列片段替换为消除T细胞表位的替代片段，来限制或消除T细胞表位。这样的T细胞表位可以通过一系列方法检测。例如，相应于复合蛋白质中的一个或多个位置的肽可以被合成并在T细胞测定中测试，以测定T细胞表位的存在。通常，这样的肽长度为15个氨基酸，并且，当期望测试较长的连续序列时，使用来自例如具有12个氨基酸重叠的15mers序列的重叠肽。或者，在每种情况下，使用体外方法或计算机模拟方法来分析相应于所述复合蛋白质序列的重叠肽对人类II类MHC分子的结合，以测定可以诱导T细胞反应的潜在T细胞表位，即MHC结合肽。计算机模拟方法将包括：涉及模拟肽-II类MHC结合相互作用的方法；涉及鉴定普遍用于结合II类MHC的基序的方法；和，使用具有已知的体外MHC结合性质的肽或肽内特定氨基酸数据库的方法。可以使用其他方法，例如从复合蛋白质序列或完整的复合蛋白质生成较长的肽并在T细胞测定或MHC结合测定中测试抗原递呈细胞上的这些肽。还可以通过消除II类MHC结合基序或消除将肽与II类MHC的结合锚定的特定氨基酸，来辅助消除复合蛋白质中的T细胞表位。在从一个或多个前导复合蛋白质消除T细胞表位的优选方法中，计算机模拟方法被最初用以分析复合蛋白质的潜在T细胞表位，当其被鉴定时，导入新的人类蛋白质序列片段以消除这些表位并避免新T细胞表位的引入。在任何新人类片段的这种导入(如果需要消除T细胞表位)和筛选期望性质的修饰前导复合蛋白质之后，可以通过测试长度通常为15至45个氨基酸的重叠肽(例如来自复合蛋白质序列(完整蛋白质或其部分)的具有12个氨基酸重叠的15mer肽)或者通过直接在人类T细胞测定中测试完整的复合蛋白质，任选地在人类T细胞测定中进一步测试一个或多个最终的前导复合蛋白质。考虑到针对完整蛋白质的T细胞活化的直接测试，优选使用T细胞测定的最终分析，用于测试完整的复合蛋白质。
本领域技术人员应该理解，还有其他用于生成并测试复合蛋白质和用于优化这类蛋白质的性质的方法。本发明的复合蛋白质是新的，并且当用于治疗目的时，人类来源的一些或全部蛋白质序列片段应该比含有非人类序列的其他可比的或非人类参考蛋白质在人类中具有较小的免疫原性。复合蛋白质的附加任选特征，即T细胞表位的消除和/或Tr表位的添加也可以促成较低的免疫原性。本领域技术人员应该理解：可以使用含有非全部人类序列片段的复合蛋白质实现较低免疫原性的目的，并且可以包括具有已经突变了的人类序列的复合蛋白质，所述突变以消除T细胞表位或与参考蛋白同源的非人类蛋白质片段。应该理解，复合蛋白质中的序列片段及其组合可以被选择以符合上述包括任选消除T细胞表位的一系列标准。例如，可以选择人类蛋白质序列片段及其组合，为避免B细胞表位和其他表位(例如I类MHC限制的表位)，为避免可能对复合蛋白质表达有害的氨基酸序列，为避免可能导致复合蛋白质不适当修饰(例如N-糖基化)的序列，为加入某些功能(例如加入辅助T细胞表位和/或B细胞表位(例如，在疫苗应用中))，为随后结合至其他部分，和为一系列其他标准。
本领域技术人员还应理解，除了人类，还可以生成具有全部或部分来自其他种的序列片段的复合蛋白质，并应该视为本发明的范围之内。例如，有关小鼠内的研究，可以生成包含全部或部分小鼠来源的蛋白质序列片段的复合蛋白质。还应该理解，复合蛋白质可以包括来自一个物种的蛋白质序列片段，其与来自相同种物内同源蛋白质的其他蛋白质序列片段相组合。例如，本发明将包括植物I型RIP(核糖体抑制蛋白)的构建，其中使用来自可获得的多个植物I型RIP序列的序列片段来装配RIP。这种复合RIP将通过引入保持RIP活性的序列片段的组合来装配，并且如果用于人类，则将包括在最终的复合序列中消除人类T细胞表位。
在抗体情况下，本发明包括这样的选择：通过复合蛋白质的随机、半随机或定向诱变来对复合蛋白质序列进一步修饰，以获得最终蛋白质的一个或多个其他性质的进一步改善。应该理解，本发明特别适合于生成在用于人类或由人类使用时具有低免疫原性的蛋白质，例如用于药物用途的蛋白质，或者用于食物、去污剂、化妆品和其他消费产品中的蛋白质，其中通过使用本发明的组合物限制或消除了变态反应。应该理解，本发明特别适合于生成在人类中具有低免疫原性的蛋白质，特别是通过生成变态反应相关的T细胞表位由非变态反应相关的表位所取代的蛋白质(例如，TH2取代TH1 T细胞诱导表位)和/或添加Tr表位以抑制变态反应性个体中的免疫反应。应该理解，本发明特别适合于生成在人类中具有减少的炎性性质的蛋白质，特别是通过生成炎症相关的T细胞表位由非炎症相关的表位所取代的蛋白质(例如，TH2取代TH1 T细胞诱导表位)和/或添加Tr表位以抑制炎性反应。
如本文所讨论的，本发明的修饰的/复合的蛋白质和抗体用于治疗疾病，并表现出较小的免疫原性。因此，在进一步的方面，本发明提供了包含如权利要求1至18任一项所限定的修饰的抗体、抗原结合片段或蛋白质的药物制剂，任选含有一种或多种药物可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
本发明的组合物可以每剂量含有预定量的各活性成分的单位剂量形式存在。这样的单位可适以提供5-100mg/天的化合物，优选5-15mg/天、10-30mg/天、25-50mg/天、40-80mg/天或60-100mg/天。对于式I的化合物，提供了范围100-1000mg/天的剂量，优选100-400mg/天、300-600mg/天或500-1000mg/天。这样的剂量可以单次剂量或者作为多个分开剂量提供。当然，最终剂量将取决于治疗的疾患、给药途径和患者的年龄、体重和状态，并将在医生的指导下进行。
本发明的组合物可适以通过任何适当途径给药，例如通过经口(包括口腔或舌下)、直肠、鼻、表面(包括口腔、舌下或经皮)、阴道或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉或皮内)途径。这样的制剂可以通过药学领域已知的任何方法制备，例如通过将活性成分与载体或赋形剂形成结合。
适于经口给药的药物制剂可以分开的单位存在，例如胶囊或片剂；粉剂或颗粒剂；水或非水液体中的溶液剂或悬浮剂；可食用的泡沫或霜(whips)；或者水包油型液体乳剂或油包水型液体乳剂。
适于经皮给药的药物制剂可以分开的贴剂存在，目的是保持与受体表皮的长期紧密接触。例如，如Pharmaceutical Research，3(6)，318(1986)中总体描述的，可以通过离子电渗疗法从所述贴剂递送活性成分。
适于表面给药的药物制剂可以是软膏、乳油、悬浮剂、洗剂、粉剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气溶胶或油剂。
为应用至眼或其他外部组织(例如口和皮肤)，制剂优选作为表面软膏或乳油应用。当制成软膏时，活性成分可以与石蜡或水混溶性乳油基质一起使用。或者，活性成分可以与水包油乳油基质或油包水基质制成乳油。
适于表面给药至眼的药物制剂包括滴眼剂，其中活性成分溶解或分散于适当的载体中，特别是水溶剂中。
适于在口中表面给药的药物制剂包括糖剂、锭剂和漱口剂。
适于直肠给药的药物制剂可以栓剂或灌肠剂(enemas)存在。
适于鼻内给药的药物制剂(其中载体是固体)包括颗粒大小范围例如20微米至500微米的粗粉，其给药方式中使用鼻烟，即，通过鼻道从靠近鼻的粉末容器快速吸入。作为鼻腔喷雾或作为滴鼻剂给药的适当制剂(其中载体是液体)包括活性成分的水溶液或油溶液。
适于吸入给药的药物制剂包括精细颗粒的粉剂或雾剂，其可以通过各种类型的预定剂量的增压气溶胶、喷雾器或吸入器所生成。
适于阴道给药的药物制剂可作为阴道栓剂、棉塞、乳油、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾剂存在。
适于胃肠外给药的药物制剂包括：水和非水的无菌注射溶液剂，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与预期受体的血液等渗的溶质；和水和非水的无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以存在于单位剂量或多次剂量的容器中(例如密封的安瓿和管形瓶)，并可以冷冻干燥(低压冻干)状态保存，只需要在即将使用之前添加用于注射的无菌液体载体(例如水)。可以从无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。
优选单位剂量的制剂是含有如上文所述的日剂量或亚剂量或者其适当分数的活性成分的制剂。
应该理解，除了上面特别提到的成分，所述制剂还可以包括与讨论的制剂类型有关的本领域其他常规物质，例如那些适于经口给药的物质可以包括调味剂。
下述实施例不应被视为对本发明范围的限制。附图和表格与下述实施例有关，并如下：
图1/2-用于复合人类抗HER2抗体的VH(图1)和VL(图2)基因序列
图3-人类SK-BR-3细胞在使用嵌合4D5 IgG1/κ、复合人类抗HER2抗体和表位消除的抗HER2“EACHAB”培养8天后的增殖抑制，对照为嵌合抗IgE(参见实施例4)
图4/5-用于复合人类抗Lewis Y抗体的VH(图4)和VL(图5)基因序列
图6/7-用于复合人类抗人类IgE抗体的VH(图6)和VL(图7)基因序列
图8-用于复合小鼠抗人类TNFα抗体的VH和VL基因序列，包括人类T细胞表位的消除
图9-ELISA检测复合小鼠和嵌合抗人类TNFα抗体对人类TNFα的结合
图10-抗TNFα抗体A2的V区序列
图11-复合人类抗TNFα变体的序列
图12-复合人类抗TNFαVL变体的序列
图13/14-用于构建嵌合小鼠：人类抗TNFαVH(图13)和VL(图14)的寡核苷酸
图15/16-用于构建初级复合人类抗TNFαVH(图15；相应于SEQ IDNo.3图11)和VL(图16；相应于SEQ ID No.4图12)的寡核苷酸
图17-用于构建二级复合人类抗TNFα VH和VL变体的寡核苷酸
图18-针对复合人类抗TNFα抗体的WEHI-164保护测定
图19-前导复合人类抗TNFα的时间-过程人类T细胞测定
图20-具有插入的人类序列片段的复合bouganin分子的活性
表1-3-复合人类抗体scFv文库中使用的CDR，包括186×9残基长的VH CDR3(表1)、77×8残基长的VL CDR3(表2)和153×10残基长的VL CDR3(表3)。
表4-用于初级复合人类抗TNFα VH和VL变体的人类序列片段
表5-复合人类抗TNFα变体的活性
表6-bouganin的免疫原性肽序列和bouganin变体中的人类片段的取代
实施例1-复合人类抗-HER2抗体的构建
为生成人类可变区序列片段文库，来自一系列人类免疫球蛋白的氨基酸序列被收集入一个包含计算机模拟人类可变区序列文库的数据库，所述文库包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列。序列来源包括了NCBIIgblast数据库(www.ncbi.nih.gov)、Kabat数据库(Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，NIH publication 91-3242，5th ed.(1991)(及其之后的最新资料))、Vbase(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt.doc)、Genbank(Benson等，Nucl.Acids Res.25(1997)p1-6或通过www.bioinf.org.uk/abs)数据库。使用的参考抗体可变区序列是人源化的抗HER2抗体，已知为Herceptin_(Carter等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，vol 89(1992)p4285，US5821337)。根据与Herceptin_可变区序列中相应氨基酸的同一性来选择来自计算机模拟人类可变区序列文库的片段并组合生成分别在图1和2中所示的复合人类VH和VL序列。
使用现有技术公知的方法，以及适当地，使用供应商针对这些方法中使用的酶的使用说明书，进行重组DNA技术。一般的方法来源包括：Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版，第1-3卷，eds.Sambrook和Russel(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press；和Current Protocolsin Molecular Biology，ed.Ausubel，John Wiley和Sons。下述实施例7中还描述了详细的实验室方法。针对每条链，使用长度为30-60个氨基酸的编码完整复合人类VH和VL序列的8个合成寡核苷酸生成了相应于Herceptin_的复合人类VH和VL序列。平行地，作为对照试剂，还使用每链8个合成寡核苷酸生成了嵌合形式的小鼠单克隆抗体4D5(Hudziak等，Mol.Cell.Biol.，(March 1989)p1165-1172))。分开的VH和VL寡核苷酸首先被磷酸化，等摩尔比例混合，在热循环仪中加热至94℃持续5分钟，随后冷却至65℃，然后在65℃下保温2分钟。然后继续保温在45℃下2分钟、35℃下2分钟、25℃下2分钟和4℃下30分钟。然后使用T4DNA连接酶(Life Technologies，Paisley UK)在14℃下连接寡核苷酸，持续18小时。
向VH和VL寡核苷酸混合物各添加编码5′侧翼序列和3′侧翼序列的附加寡核苷酸并如上退火，所述5′侧翼序列包括Kozak序列、前导信号肽序列和前导内含子，所述3′侧翼序列包括剪接位点和内含子序列。将所生成的复合人类VH和VK和4D5表达盒从HindIII至BamHI片段克隆入质粒载体pUC19，并确证了完整的DNA序列。这些被转移至表达载体pSVgpt和pSVhyg，其分别包括人类IgG1(VH)或κ(VK)恒定区和哺乳动物细胞中的筛选标记。在表达载体中证实了复合人类VH和VK和4D5VH和VK的DNA序列是正确的。
用于抗体表达的宿主细胞系是NS0(无免疫球蛋白生成的小鼠骨髓瘤)，其获自欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of AnimalCell Cultures)，Porton，UK(ECACC No 85110503)。通过电穿孔将重链和轻链的表达载体共转染进入NS0细胞。在补加了10％胎儿牛血清、0.8μg/ml麦考酚酸和250μg/ml黄嘌呤的达尔伯克改进伊格尔培养基(DMEM)中选取表达gpt基因的集落。通过针对人类IgG的ELISA筛选用于生成人类抗体的共转染细胞克隆。扩增分泌抗体的细胞系，选取最高产者并在液氮中冷冻。使用Prosep_-A(Bioprocessing Ltd，Northumberland，UK)纯化经修饰的抗体。通过针对人类IgGκ抗体的ELISA测定浓度。
严格按照Hudziak等(同上)描述的来测试复合人类抗体和嵌合4D5抗体对HER2+人类胸腺肿瘤细胞系SK-BR-3增殖的抑制，结合阴性对照非-Her-2结合人类IgG1/κ抗体。结果(图3)显示，复合人类抗体和嵌合4D5抗体在抑制SK-BR-3细胞生长中是等效的。图3还显示了如下生成的“表位消除的”复合人类抗体替代物的数据。
为测试本发明的表位消除选择，使用Peptide Threading(www.csd.abdn.ac.uk/～gjlk/MHC-thread)分析了复合人类重链可变区和轻链可变区序列的非自身人类II类MHC黏合剂。该软件预测肽的氨基酸侧链与II类MHC结合槽(binding groove)内特异结合袋(binding pocket)之间的有利相互作用。通过II类MHC异型数据库延展所有来自复合人类重链和轻链可变序列的重叠13mers，并根据其与II类MHC分子的匹配和相互作用评分。预测结合II类MHC的肽是开始于VH中残基16和67以及VL中残基9和44的13mers。作为结果，选择人类可变区序列文库的新片段代替那些在图1的复合人类序列中使用的片段，以引入氨基酸改变VH 18L-A/69I-G；VL 11L-A，46L-A。通过取代用以制备相应于图1序列的抗体的一些寡核苷酸来制备相应的“表位消除的”复合人类抗体(“EACHAB”＝表位消除的复合人类抗体)，并且EACHAB如上述方法制备并测试表明对SK-BR-5的抑制等效于标准的复合人类抗体(图3)。该数据表明，复合人类抗体可以被成功构建，且等效于对照嵌合抗Her-2抗体，并且表明可以生成复合人类抗体的EACHAB版本，且没有效价损失。
实施例2-复合人类抗HER2抗体的免疫原性
进行了T细胞增殖测定来比较复合人类抗HER2抗体、EACHAB变体和嵌合4D5抗体的免疫原性(参见实施例1)。从NS0细胞制备这些抗体，所述NS0细胞培养于不含血清的、不含动物衍生组分的、不含蛋白质的培养基，补加了HyQ_LS1000 Lipid Supplement(Hyclone Cat No：SH30554和丙酮酸钠(Gibco Cat No：11360-039)的HyCloneHyQ_ADCF-MabTM(Hyclone Cat No：Cat no：SH30349)。缓冲液在Sephadex G25(PD10柱)上更换为50mM MES pH6后，抗体各自穿过阳离子交换柱(Mono-S 10/10)，并使用氯化钠梯度(0至0.5M)洗脱。然后将含有馏分的抗体应用至Superdex 200制备柱(XK16/60)，PBS洗脱。收集峰馏分并在4℃下贮存。通过针对人类IgG的ELISA测定抗体浓度。
使用从健康人类供体血液分离并冷藏于液氮中的PBMC(外周血单核细胞)进行免疫原性分析。使用基于AllsetTM PCR的组织分型试剂盒(Dynal，Wirral，UK)对各供体进行组织分型，并根据单个MHC单倍型选择20个健康供体。使用测试肽(终浓度5μM)于24孔组织培养板中培养2ml含有4×106 PPMC于AIM V(Invitrogen，Paisley，UK)的大块培养物，并在第5、6、7和8天通过轻轻重悬所述大块培养物并转移三份100μl的PBMC样品至U底的96孔板来评价增殖。使用Tomtec Mach III板收集器(Receptor Technologies，UK)将培养物收集入玻璃纤维滤网，并使用WallacMicrobeta TriLux读板器通过闪烁计数测定每分钟计数(cpm)值(使用paralux高效计数方案)。计算各测试抗体的刺激指数(SI)为测试抗体每分钟计数(cpm)：阴性对照cpm的比值，且认为SI＞2是显著的T细胞表位反应。结果显示：在20个健康受试供体中基于至少一个四天增殖测试中，嵌合4D5抗体5个受试供体(25％)中诱导了显著的增殖反应(SI大于2)，复合人类抗HER2抗体在3个受试供体(15％)中诱导了SI＞2，而EACHAB抗HER2抗体没有在一个受试供体(0％)中诱导了SI＞2。这些结果表明，免疫原性的次序为嵌合4D5＞复合人类抗HER2＞EACHAB抗HER2，且后者在任何受试供体血样中显示无免疫原性迹象。
实施例3-复合人类抗Lewis Y抗体的构建
如实施例1所描述的，使用人源化3S193抗体(Scott等，Cancer Res.，60(2000)p3254-3261，US5874060)作为参考抗体可变区序列构建了特异性针对唾液酸化的Lewis Y抗原的复合人类抗体。从计算机模拟人类可变区序列文库选择了与人源化3S193抗体可变区序列中相应氨基酸同一性的片段，并组合以分别生成如图4和5所示的复合人类VH和VL序列。平行地，从参考V区序列制备了参考嵌合抗Lewis Y抗体。在复合人类抗Lewis Y抗体和嵌合参考抗体上都使用了人类IgG1(VH)或κ(VK)恒定区，并如US5874060所述，通过针对合成Lewis Y-HSA复合物的ELISA测试了抗体。数据显示，与0.15μg/ml复合人类抗体相比，在测定中产生结合信号的嵌合抗体的最小浓度为0.1μg/ml，这与US5874060的数据一致。
实施例4-复合人类抗IgE抗体的构建
如实施例1所述，使用已知为Xolair_的人源化抗IgE抗体(Presta等，J.Immunol.，151(5)(1993)p2623-2632)作为参考抗体可变区序列构建了复合人类抗IgE抗体。从计算机模拟人类可变区序列文库选择了与Xolair_可变区序列中相应氨基酸同一性的片段，并组合以分别生成如图6和7所示的复合人类VH和VL序列。平行地，从参考V区序列制备了参考嵌合抗IgE抗体。在复合人类抗IgE抗体和嵌合参考抗体上都使用了人类IgG1(VH)或κ(VK)恒定区。
通过表面等离子共振(BIAcore 2000，Biacore AB，Uppsala，Sweden)进一步表征了Fab的特异性。如Flicker等，J.Immunol.，165(2000)p3849-3859所描述的，生成了重组人类IgE Fab。使用NHS/EDC试剂盒(Biacore)将测试抗体纯化并固定于CM芯片流动细胞上，以获得2010 RU的嵌合抗IgE和2029 RU的复合人类抗IgE。于Hepes缓冲的盐水(10mMHepes，3.4mM EDTA，150mM NaCl，0.05％(v/v)表面活性剂P20，pH 7.4)中的10和25nM重组人类IgE Fab以5μl/分钟的流速在受试抗体上流过10分钟。结果显示，对于10和25nM IgE Fab两者而言，都检测到了针对嵌合抗IgE和复合人类抗IgE抗体的等效的SPR(表面等离子共振)曲线，表明后者成功获得了等效于参考抗IgE抗体的结合效力。
实施例5-复合人类scFv文库的生成和筛选
开始构建人类scFv(单链Fv)文库的策略是构建7个共有的人类VH基因和4个共有的人类VL(κ)基因(如Knappik等，J.MoI.Biol.，296(2000)57-86所描述的)，并将来自人类可变区数据库的大量VH和VL的CDR3片段克隆入这些基因。该系列CDR3显示于：表1为VH的CDR3，表2为VL的8个氨基酸的CDR3，表3为VL的10个氨基酸的CDR3。对于主要的VH和VL构建，合成了编码VH和VL至框架3末端的6个重叠合成寡核苷酸(如Knappik等，同上所详细描述的)，并使其经受回归PCR(Prodromou和Pearl，Protein Engineering，5(1992)827-829)。这些被连接入EcoRV消化的pZero-1载体(Invitrogen，Paisley，UK)。关于添加CH1和Cκ，开始都使用4D5 CDR3(Carte等，Bio/Technology，10(1992)163-167)，按照Knappik等，同上的方案，除了VH-CH1 SapI-EcoRI和VL-CκNsiI-SphI片段都是平末端克隆入EcoRV消化的pZero-1。
表1
  #名称  H3   长度-H3 亚组(H)
  MUC1-1′CLALL1-1′CLALL7-1′CLL36′CL5.M13′CLAu2.1′CLM71′CLVH6.N1′CLE55 6.X′CLE55 6.11′CLVH6.A5′CLVH6-EX8′CLE54 4.2′CLRF-SJ4′CL3.A290′CLA9560P2′CLE55 3.6′CLE55 3.16′CL333′CL1H1′CL126′CL1B11′CL115′CL112′CL2C12′CL2A12′CLBUTKOL-basedresh.CAMPATH-9L2E8′CLs5D4′CLss4′CLP2-57′CLHuHMFG1′CLNEW-basedresh.CAMPATH-9TR1.10′CLL3B2′CLDAWss7′CLss6′CLs5A9′CLNEWML2A12′CLB5G10H′CLE55 3.9′CLSpA1-29′CLAM28′CLBM2′CLCM29′CL  DFLSGYLDYVRGSGSFDYDRGGNYFDYMYNWNFFDYAGLGMIFDYRGFNGQLIFALTGDAFDITKLDWYFDLRYGGFYFDYGYSNEGMDVSWDGYSYIYQMGAEYFQHDMSLDAFDIGSVGATLGEYGDYHYFDYGVGSSGWDHKGSLYYFDYPNWNDAFDIRGIPHAFDIPPEVESLRSPPEVESLRSPPEVESLRSPPEVESLRSPPEVESLRSPPEVESLRSPPEVESLRSPPEVESLRSDLAAARLF？QGTIAGIRHEDYYYGNDVDPINWYFDLDRAAGDRDYHQMYSNSDYSYDFAWFAYQGTIAGIRHVLGIIAADHDLTGDAFDISCGSQYFDYLWNWDAFDIDIMTWGFDYSNWYWYFDLNLIAGCIDVGGKGGEFDDDSGNYRIDYDPRLDAFDIGYSYPVWGRLVGNSWLDYDL？GLVVEYKVSLSAFDI   9999999999999999999999999999999999999999999999999 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
 B-B10 M0′CLHSVCBM8′CLHSVCD53′CLHSVCBG6′CLMICA 4′CL1/11′CL5/8′CLB6204′CLVH CLONE1′CLVH CLONE32′CLMG6-1′CLMG6-3′CLDaudi′CLIE4′CLIF10′CLhsighvm148′CLE3-MPO′CLrev9Fd′CLNANUC-1′CLPatient14′CL14G1′CL14G2′CL14G3′CLA15′CLG15′CLM11′CLRF-DI1′CLAC-18′CLAC-29′CLAC-40′CLTR35′CLTR36′CLTR37′CLTR38′CLL34′CLL100′CLWG1′CLRF-ET5′CLRF-ET10′CLEW-D1′CLEW-D3′CLKN-D6′CLHH-M2′CLAK-D8′CLBALL-1′CLYJK2.2  RGDAMYFDVDPNPWYFDLDYGDYAFDISAHSDAFDMLEGLGWFDPRSDYGAIDYNLGFYHMDVEARGGGGEYEGWISALNGEGEGEYFDYERTSGDFDFNSPGATFESGNGQKCFDYRGSLQYLDYNNGSYYFDYGSDYSNFAYSTHRSAFDVEGVHKNFDHLSRAGGFDIRMPAVAFDYRMPAVAFDYRMRAVAFDYRMPAVAFDYDYGGNPAELGPTCSGGSCRKGAAHFDYEEVGGYFQHDFDGGSFDYDFDGGSLDYDFDGGSFDYKVPSHGMDYKVPSHGMDYKVPSHGMDYKVPSHGMDYQPLARHFDPGPLMRWFDDVAVAGGFDPGVEVAGTASYYESSAGPPEIPRGGSCYEIPRGGSCYKEKWDSSRCGSAAAGTQGDFSWAGPHFGTHYYDIRVDGSGSYEGNGGAVAAFDY     99999999999999999999999999999999999999999999999 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
 E2.5MSL5Hb-2b4′CLb3′CLb2′CLb5′CLb17′CLb19′CLA3-H2′CLA3-M9′CLTmu69′CLAmu1d4-3′CL1946′CLGN901v1.0GN901v1.1N901H/KOLN901H/G36005N901H/PLO123Patient14′CL14G1(2)′CL14G2′CL14G3′CLCLL-8′CLBA-1F′CLBA-2P′CLL3055 4.6′CL15′CLCL-G′CLCL-O′CLBA3′CLPS′CLHNK20 hu7HNK20 hu10Amu1d4-3′CLAmu1e10-3′CL1e8-3′CL1f7-3′CLAgamma41-3′CLAgamma8-3′CLAmu10-3′CLAmu2-1′CLAmu40-2′CLAmu70-1′CLTmu69′CLB7-g2B01′CLB8-g3C11′CLB8-g3F05′CLBF1N- KPVTGGEDYDYDGAWFAYWDGRLLVDYHKGLRYFDYHKGLRYFDYHKGLRYFDYHKGLRYFDYHKGLRYFDYHKGLRYFDYYRGDTYDYSWVGATTSDYEDMDYGMDVGGRDRYLVYVRVSYGMDVMRKGYAMDYMRKGYAMDYMRKGYAMDYMRKGYAMDYMRKGYAMDYRMPAVAFDYRMPAVAFDYRMRAVAFDYRMPAVAFDYTSIVRGFGPDFFRDYFDYDFFRDYFDYGGTQPFDIRSQASGPFDYGLYQLLFDYAGGRTSFDPEGNTKAPDYNGTSGDFDYYGTSYWFPYYGTSYWFPYGGRDRYLVYLRYQLLYNYYIAYDAFDIITPRNAVDIDGLLAATDYDRAYLDFWGDKEPAYFDYRGFNGQLIFLSVVVPAALLADDDPEDFEDMDYGMDVSAGGSAWSTDRSYYGMDVDKGTRYSDQWLVEGSFDY     9999999999999999999999999999999999999999999999999 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIVIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
  g3C12′CLBF1N-g3H05′CLBF1P-g2A11′CLBF2P1-g3D10′CLBF2P1-g3E12′CLBF2P2-g3C10′CLBF2P2-g3D05′CLBF2P2-g3D12′CLBF2P3-g3C10′CLBF2P1-g7B02′CLBF2N1-g1C10′CLBF2N2-g1A11′CLBF2N2-g1E01′CLBF2N1-g3F03′CLBF2N2-g3B07′CLBF2N2-g3C03′CLBF2N2-g3F07′CLBF2N1-g4A03′CLBF2N1-g4B10′CLBF2N1-g4C11′CLBF2N1-g6A07′CLBF2N1-g6F07′CLBF2N2-g6D09′CLmAbRWL1′CLSV-10SV-7SV-9DN6′CLDN7′CL GYVGSSLDYWHQLRGPDYENSDYYFDYDGTYGSGVRGGSMVPFDYRGWNYYFDSDAYYYGLDVDGRYDPIDYVGSSGWYDYDLYDYYDEPDGAAASFDYVVGADYFDYDQNWGYFDYGVLRDAFDIASDGYGMDVGVLRHALDIGGCGWYKNYGSNYAKTGYGKFQLLFDYALHGGGMDVALHGGGMDVVYPPDAFDLPWDYWFFDLDRVAAAGDYDKGTRYSDQDRVATIPDYERGITLMDVERGITLMDV 9999999999999999999999999999 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
  SC12′CLSC13′CLD11′CLJON′CLDEZ′CLBARKC13H′CLclone 15′CLB22′CLP13′CLPS′CLPatient 2   LDWLLPIDYLDWLLPIDYDDGDRAFGYDPWPAAFDIVRGSWSGDSRHSSDWYPYSSPYGALDYGLDQYKTGHGAGAAPHDYGAGAAPHDYNGTSGDFDYALRPATFDF     999999999999 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
表2
  #名称   L3     长度-L3 类别
  HIV-s8′CLFOG1-A4′CLSA-4B′CLHIV-b5′CLHIV-loop8′CLReg-A′CL9F12Fab′CLGP68′CLC471′CLB8807′CLB122′CLB6204′CLIM-9′CLT48.16-G8′CL7F′CL1A6′CL1.69′CLantiTacWED1.1K2.2E1.1E2.4E2.5E2.11SSaPBSEGaBMSELcLN   QQYADLITQQYYSTPTQQYNTYPTQQGNSFPKQQYGYSLTQQFGGSFTQQSSNTVTQQYNSLITQQYNNWPTLQHNSYPFQQYNSQYTQQYGSLWTQHYNRPWTQQYGSRLTQHYGTPRTQQYNNWPTMQATQFPTHQASTYPLQQYGRSPRQQDDLPYTQNDNLPLTQQESLPLTQQDNLPLTQQESLPCGQQDSLPLTQQYGSSRSQQYGSSRTQQYCGSLS     8888888888888888888888888888 IGG1-KAPPA-KAPPAIGG-KAPPAIGG1-KAPPAIGG1-KAPPAKAPPAKAPPAIGG1-KAPPAIGM-KAPPAIGM-KAPPAIGM-KAPPAIGM-KAPPAIGG-KAPPAKAPPAIGG1-KAPPAIGM-KAPPAIGM-KAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAIGM-KAPPAIGM-KAPPAIGM-KAPPA
 mAb5.G3′CLP7′CLPACARTaykv322′CLTaykv310′CLTaykv320′CLslkv22′CLLESRF-TMC1′CLslkv4′CLMD3.13′CLVJI′CLrsv13L′CLII.2′CLI.75′CLII.14′CLIII.7′CLSPA3-16′CLVL CLONE 52′CL6F5-01′CL6F7-42′CL6F8-01′CL6F9-31′CLD7′CLHuVK′CLBC-26′CLVkLaE34′CLFL9-KHSC7HSC28SEGcPBP3′CLA5K3′CLBZ1K1′CLBZ2K1′CLD11K3′CLD17K2′CLF21K1′CLF22K3′CLSCFV198′CLKC25L′CLASSYN13′CLBCPBL1′CLBCPBL4′CLBCPBL6′CLBCSYN6′CLITPBL14′CLITPBL2′CLSP10′CL  QQSYSTLTQLYGSSLTQQYNNLWTQQYNTFFTQQYGSSPTQQYGSSLTQQYGSSLTQQYGSSKTQQYNNWPPQHRNNWPPQQRSNWPSQQYGSSPTQQYDTIPTQASINTPLMQALQPWTQQGFSDRSMQATQFVTQRCKGMFSQQYGGSPWCRSHWPYTQQYYSTPPQQCNTNPPQQYYSTPPQQYYSVPPQQYDSLVTHQYLSSWTMQGIHLLTQHYYGTPHQQYNTYPTQEFGDSGTQQYGGSPWQQYGSSRTQQYDSLPTQQYGSVFTQQYNSYCSQQYYSTPLQQYNDWPTMQNIQFPTQQYDNLPPQLLR？LRTYQYNNGYTQQRSNWPTQQYGTSHTQQYNHWPSQQYGSLYTQQNKDWPLQQFGTSLTQQRSNWWTQQCSNWPTQQYGSSPT     88888888888888888888888888888888888888888888888888  IGMKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAIGM-KAPPA-IIIKAPPAKAPPAKAPPAIGG1-KAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAIGG1-KAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAIGGIGGIGM-KAPPAKAPPAIGMIGMIGMIGMIGMIGMIGMKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPA
表3
 #名称   L3    长度-L3 类别
 8E10′CLIII-2R′CLII-1′CL35G6′CLGF4/1.1′CLRF-TS5′CLO-81′CLmAb114′CLHIV-B8′CLHIV-b8′CLTT117′CLHIV-loop13′CLHIV-s3 ′CL1-185-37′CL1-187-29′CLHIV-s5′CLHIV-b3′CLGERBLI′CL2A4′CL0-16′CLmAb48′CL447.8H′CLGP13′CLM37GO37′CL9500′CL9702′CLGSD2B5B10 ′CLMD2F4′CLGAN4B.5′CLNANUC-2 ′CLSOL10′CLAB1/2′CLAB4′CLRH-14′CLAB1/2′CLAB4′CLL55-81′CL  QQYGSSPSITQKYNSAPPSTQEYNNWPLWTQQYGGSPPWTHEYNGWPPWTQQYNSYSPLTMQHTHWSPITQHYNNWPPWTQQSYNTPPWTQQSYNTPPWTQHYGSSPPWTQQHNNWPPLTQVYGQSPVFTQQYGSSPMYTQQYGSSPMYTQRFGTSPLYTQQYGDSPLYSQQYDDWPPITQQLNSYPPYTQQSYSTPPDTQHYNNWPPSSQHYNRLPPWTQQYDRSVPLTQQYYTTPTYTQQYYTTPPLTQQLYSYPHLTCQQYGSSRWTMQALQTPMSTQQRSEWPPLTQQYDTSPAWTQQYGSSQGFTMQSIQLPRWTQHYGLSPPITQEYGSSPPRTSSYRSSSTRVQHYGLSPPITQEYGSSPPRTQQYYTTLPLT    1010101010101010101010101010101010101010101010101010101010101010101010101010 IGM-KAPPAIGM-KAPPAKAPPAIGM-KAPPAIGG3-KAPPAIGM-KAPPAIGM-KAPPAIGM-KAPPAIGG1-KAPPAIGG1-KAPPAIGG1-KAPPAIGG1-KAPPAIGG1-KAPPAIGM-KAPPAIGM-KAPPAIGG1-KAPPAIGG1-KAPPAIGG-KAPPAIGM-KAPPAIGGKAPPAIGG3-KAPPAKAPPAIGG1-KAPPAIGG-KAPPAIGM-KAPPAIGG-KAPPAKAPPAKAPPAKAPPAIgG1-kappaKAPPAIGG1-KAPPAIGG1-KAPPAIGG1-LAMBDAIGG1-KAPPAIGG1-KAPPAIGM-KAPPA
 B3HUL-mRF′CL25C1′CLLC4aPBLC4bPBLC4cPBmAb3.B6′CLmAb1.C8′CLP9′CL21H9′CL19A5′CL43F10′CLFON′CLHu PR1A3hu PR1A3CLL-412′CLMEVSONHEW′′CLHEW′CLJH′HG2B10K′CLCLL′CLslkv12′CLbkv6′CLslkv11′CLslkv13′CLbkv7′CLbkv22′CLbkv35′CLMD3.3′CLMD3.1′CLGA3.6′CLM3.5N′CLMD3.4′CLM3.1N′CLGA3.4′CLMD3.7′CLMD3.9′CLGA3.1′CLbkv32′CLGA3.5′CLGA3.8′CLE29.1KAPPA′CLR5A3K′CLR1C8K′CLI.24′CLIII.12′CLIII.5′CLI.18′CL  SSYSSTTRVVQQYGSSPQTFFCQYNRYPYTLQRSNWGEVTQQRSNWGEVTQQRSNWGEVTQQYGSSPLFTCSYTSSSTLVQQRSNWPPITQQSYNTLSLTQHYGNSPPYTQQSHKTLAWTMQGTYWPPYTHQYYTYPLFTHQYYTYPLFTQQSYSTPPWTQQSYTNPEVTQQYGSSPPYTQQYGSSPRYTQQYGSSPRYTQQFGNSPPL？QQYAGSPPVTQQYNNWPPWTQQYNNWPPWTQQRSNCSGLTQQYNNWPPWTQQYNNWPPWTQQYNNWPPCTQQYNNWPPWTQQRSFWPPLTQQRSNWPSITQQRSNWPPLTQQRTNWPIFTQQRSNWPPGTQQYNNWPPLTQQYNNWPTWTQQRMRWPPLTQQYGSSPKWTQQYGSSPQYTQQYGSSPPYTQQYDRSLPRTQQYGNSPLFSQQYGGSPLFSQQYNNWPTWTMQALQTLGLTMQALQTLGLTQQSHSAPPYTQQYGSSPLFTQQYNDWPPWTQQYNGNSPLT     1010101010101010101010101010101010101010101010101010101010101010101010101010101010101010101010101010 IGGIGM-KAPPAKAPPAIGM-KAPPAIGM-KAPPAIGM-KAPPAIGMIGMKAPPAIGG1-KAPPAIGG1-KAPPAIGG1-KAPPAIGM-KAPPAKAPPAKAPPAIGG-KAPPAKAPPAIGM-KAPPAKAPPAKAPPAIGG2-KAPPAIGG-KAPPAIGM-KAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAIGM-KAPPAIGM-KAPPAIGG-KAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPA
    I.67′CLIII.6′CLII.65′CLIII.14′CL424.F6.24′CLT33-5′CLAL-MHAL-Es305L47′CLF29′CLG28′CLG21′CLVL CLONE45′CLVL CLONE48′CLVL CLONE56′CLC9′CLITC88′CLAC18′CLAC31′CLAC32′CLAC37′CLB′20(Humkv328-Jk1)′CLB9601(Vg-Jk2)′CLMF8(Humkv328-Jk1)′CLB′2(Humkv328-Jk1)′CLkappa1′CLkappa2′CLkappa3′CLkappa4′CLkappa5′CLkappa7′CLkappa8′CLToP218′CLToP241′CLToP309′CLL1236K3′CLSOL1′CL  QQLNTYPPWTHKYGGSPPYTMQDTHWPPWTQHYGRSPPLTQQYGNSPPYTQQYGSSPPYTQQYFNVPPVTQHYHNLPPTTIQGTHWPQYTQQYGSSRALTQQYYSTPSYTMQALQTLMCSQQSYSTPPLTQQSYSTPPITQQYGGSLPITQQYGSSTPLTQQRSSWPPLTQQRYSWPPLTQQRYNWPPLTQQRSNWPPLTQQRSSWPPLTQQYNNWPPWTQQRSNWPPYTQQYNNWPPWTQQYNNWPPWTQQYGSSPPITQQYNNWPPITQQRSSWPPITQQYGSSPRVTQQYNTNSPISQNYGSSPRITQQYGSSPPITMQSIQLPRFTMQSVQLPRFTMQSVQLPRFTQQYDKWPPVTMQSIQFPRWT     10101010101010101010101010101010101010101010101010101010101010101010101010 KAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAIGM-KAPPAKAPPAKAPPAIGM-KAPPA ANDLAMBDAIGM-KAPPA ANDLAMBDAIGM-KAPPA ANDLAMBDAIGM-KAPPA ANDLAMBDAKAPPAKAPPAKAPPAIGG1-KAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAIgM-VkIIIaIgM-VkIIIaIgM-VkIIIaIgM-VkIIIaIGG2-KAPPAIGG2-KAPPAIGG2-KAPPAIGG2-KAPPAIGG2-KAPPAIGG2-KAPPAIGG2-KAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPA
  BC-2′CLP3′CLP5′CLAB1/2′CLAB4′CLMHFL6-KFL2-KFL4-KFL1-KMM4-KMM9-KHSC4HSC11HSC13HSC23HSC35REVBLUBK2′CLGK6′CLL1236K3′CLP1′CLH01′CLI01′CLI10′CLI12′CL126TP14K′CLL32′CL   MQGIHLPPYINQGTQWLLYTQQYNSYAPYTQHYGLSPPITQEYGSSPPRTQQYFNVPPVTQQLTSYPPWTQQVNSYPGLTQQVFSYPGITQQYTSLPGITQHSYSTLPLTQQYYNIPYITQLYGSSPRVTQQYANWPPITQQYNISPRDTQQFGSSPLITQQYGDFPRVTQQYGDWPPYTQQYYTTLSWTQQYNKWPPLTMQGTHWLPVTQQYDKWPPVTQQYDNLPPIHQQLNNYPPFTQQSYSTPPYTQQSYSTPPYSQQSYSTPPYTQQYNNWLPFTAAWDDSLTLM     1010101010101010101010101010101010101010101010101010101010  KAPPAKAPPAKAPPAIGG-KAPPAIGG-KAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAIGGIGGIGGIGGIGGKAPPAKAPPAKAPPAIGG-KAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAKAPPAIGG-KAPPAIGM-KAPPA
为插入CDR3，编码来自正链的表H的各CDR3的单个寡核苷酸使用12个同源核苷酸合成，添加至各末端，用于退火至共有的VH和VL基因。除了这些CDR序列以外，还包括来自抗体E25的CDR(参见实施例4)。这些引物被延长并添加二级引物，以在邻近VH和VL基因(无C区)的N和C末端为VH引入5′NotI-3′XbaI位点和为VL引入5′SpeI-3′BamHI位点。在克隆之前，进一步使用一对互补引物将连接物序列(Gly4Ser)3插入VH和VL之间，同时保持XbaI和SpeI位点。完整大小的VH-连接物-VL片段经NotI和BamHI消化并克隆入NotI-BamHI消化的pBluescript II KS(+/-)(Stratagene，Amsterdam，Netherlands)。
如WO99/11777所描述，挑选单个Bluescript克隆，质粒DNA经纯化后机器分散入96孔板。然后，如WO99/11777所描述，使DNA经受包含tRNA-生物素基-赖氨酸的IVTT，并进一步机器阵列至链霉抗生物素蛋白表面。然后，通过与重组人类IgE Fab培养来筛选10000个独立克隆的固定化的初始scFv文库(参见实施例4)。使用PBS/3％BSA室温下封闭孔1小时，PBS中洗涤3次，并使用于PBS/3％BSA的5μg/ml人类IgEFab处理1小时。然后将孔在PBS中进一步洗涤3次，并使用于PBS/3％BSA的5μg/ml碱性磷酸酶标记的嵌合抗IgE(实施例4)处理1.5小时。孔在PBS中进一步洗涤5次，并使用底物5-溴-1-氯-3-吲哚基磷酸酯和氮蓝四唑(Roche Molecular)显色，用于成像。显示：以1/9600孔的频率观察到的强力信号来自都含有E25 CDR3的VH和VL对。
实施例6-复合鼠抗TNFα抗体的构建
如实施例1关于人类文库所述的，使用NCBI Igblast、Kabat和Genbank数据库生成鼠可变区序列。使用的参考抗体可变区序列是嵌合抗TNFα抗体，已知为使用了鼠cA2抗体可变区的Remicade_(Le等，US6277969)。来自计算机模拟鼠可变区序列文库的片段部分选择为Remicade_可变区中的相应氨基酸，但包括有意避免序列(以非自身人类II类MHC黏合剂的形式)中的人类T细胞表位的变化，如实施例1中所检测的。图8中显示了与嵌合抗体中使用的序列相比较的复合鼠VH和VL序列，表明了两种抗体间VH和VL中各自9和16个氨基酸的差异，这是为消除复合鼠抗体中表位的片段选择的结果。
如实施例1所述，生成了复合鼠和嵌合抗TNFα抗体。纯化抗体在标准ELISA中对结合固定化人类TNFα的比较(WO 03/042247 A2中描述)显示，复合鼠抗体保留了嵌合抗TNFα抗体的全部结合能力(图9)。然后，如实施例2所描述，比较了这些抗体的免疫原性，使用24 HLA-DR型人类血液样品用于T细胞测定。结果显示，嵌合抗TNFα抗体在在24名健康受试供体的9名(37.5％)中诱导了显著的增殖反应(SI大于2)，复合鼠抗TNFα抗体与之比较，其中24名供体中没有一名(0％)被诱导SI＞2。这些结果表明，包含完全来自鼠V区的可变区序列片段(选择这样的片段以消除人类T细胞表位)的复合鼠抗体可以除去在人类T细胞测定中没有任何表位消除措施的相应嵌合抗体所展示的免疫原性。
实施例7：复合人类抗TNFα抗体的构建
根据美国专利5656272获得了靶向针对人类TNFα的抗体A2的参考鼠可变区重链和轻链序列(图10.分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)。结构模型由鼠参考可变区构成，对CDR构象关键的氨基酸基于其与CDR的距离(＜3_)和其靠近CDR的可能的堆积而被鉴定。重要但次关键的残基基于其与CDR的距离(＞3_＜6_)和其对更靠近CDR堆积的更关键残基的可能的影响而被鉴定。其他组的残基基于其在鼠抗体序列中的出现频率而被鉴定，即特定位置的氨基酸出现频率小于1％。
包含尽可能多的这些残基的人类V区序列片段被选择(表4)以生成全长的VH和VL序列。对这些序列进行改变以包括所有经鉴定的结构上重要的残基，以生成作为模板的序列，用于表位消除和复合人类抗体设计。用于各复合VH和VL的优选序列被设计以包括来自参考鼠抗体的重要残基。这些可变重链和轻链氨基酸序列显示于图11和12。分别为SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4。
表4：用于初级CHAB变体的序列片段的人类抗体数据库衍生
(a)重链
Genbank
登录号         序列片段
CAA61442     EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSC
CAD88676     LSCVASGFIFS
CAB37182     FSNHWM
AAS86088     HWMNWVRQAPGKGLEWVA
CAC43592     AEI
ABB54411     IRSKS
AAL96548     SIN
AAK51359     NSA
CAA67405     SAT
CAB87447     ATHYA
AAD30769     HYAESVKGRFTISRD
CAC15703     RFTISRDDSKSI
AAQ05509     IVYLQM
AAT96742     YLQMTDLR
AAD20526     LRTEDTGVYYC
CAB44788     VYYCSRNY
AAO38724     NYYGS
AAK14004     GSTY
AAD20470     TYDYWGQGT
AAB32435     DYWGQGTTVTVSS
(b)轻链
Genbank
登录号      序列片段
CAC06686    DILLTQ
AAX57564    LTQSPAILSLSPGERATLSC
X72820      LSLSPGERATLSCRASQ
AAC15439    QFV
AAZ09058    VGSS
Z84907      SSI
AAL10835    IHWYQQK
AAQ21835    QQKPNQSPKLLIK
M27751      LLIKYAS
AAY16612    YASE
AAR89591    ES
AAD19534    SM
AAV71416    MSG
AAZ09098    GIP
CAG27043    PSRFSGSGSGTDFTLTINSLE
AAQ21937    SLESEDAA
AAC41988    ADYYCQQ
AAY33370    YYCQQSHS
AAD19457    HSWP
AAQ55271    WPFTFGQGT
AAW69118    TFGQGTNLEIK
复合重链和轻链可变区序列使用多种计算机模拟方法(例如Propred[http://imtech.res.in/raghava/propred/index.html]、Peptide Threading[www.csd.abdn.ac.uk/～gjlk/MHC-thread]、SYFPEITHI(www.syfpeithi.de)、MHCpred(www.jenner.ac.uk/MHCPred/)扫描潜在T细胞表位的存在，并与同源人类种系框架区序列(结合了参考鼠CDR)相比较。
制成了下述重链可变区变体(参见图11)：
SEQ ID No.5与SEQ ID No.3相比含有下述改变：T82aN+R83K
SEQ ID No.6与SEQ ID No.3相比含有下述改变：T82aN+R83K+D82bS
SEQ ID NO.7与SEQ ID No.3相比含有下述改变：T82aN+R83K+D82bS+V23A
SEQ ID No.8与SEQ ID No.3相比含有下述改变：T82aN+R83K+D82bS+V23A+V78A
制成了下述轻链可变区变体(参见图12)：
SEQ ID No.9与SEQ ID No.4相比含有下述改变：I10T+N103R
SEQ ID No.10与SEQ ID No.4相比含有下述改变：I10T+N103R+S80A
SEQ ID No.11与SEQ ID No.4相比含有下述改变：I10T+N103R+S80A+N41D
为构建对照嵌合抗体，使用一系列重叠40mer合成寡核苷酸构建了翻译生成SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的核苷酸序列。V区序列侧翼具有附加的5′和3′序列，以促进克隆入哺乳动物表达载体。所述寡核苷酸的序列显示于图13和图14。
寡核苷酸购自Sigma-Genosys(Poole，UK)并以100μM的浓度悬浮。1μl的各重链有义链寡核苷酸(除了多数5′寡核苷酸)混合在一起，使用多核苷酸激酶(PNK，Invitrogen，Paisley UK)在20μl反应物中处理1.5μl(约1μg)所述混合物，所述20μl反应物还含有：2μl 10×PNK缓冲液、2μl 10mM ATP、14μl H2O、0.5μl(5单位)PNK。所述反应在37℃下进行30分钟，并且通过在70℃下加热20分钟失活所述酶。反义重链、有义轻链和反义寡核苷酸类似地被磷酸化。来自各组的5′寡核苷酸以1∶9稀释于水中，添加1.5μl至适当的反应混合物。然后将各反应物稀释至0.5ml，并在Amicon microcon YM3浓缩器中于8000rpm下旋转透析90分钟，直至体积不超过44μl。
重链的有义和反义混合物以及轻链的有义和反义混合物被合并，并加水至88μl。向各反应添加10μl的10×连接酶链式反应(LCR)缓冲液和2μl Pfu连接酶(8单位，Stratagene，Cambridge UK)，如下在程序控制的加热块中保温：94℃、4分钟然后60℃、3分钟，持续一个循环；随后94℃、39秒然后60℃、2分钟，持续20个循环。最后，反应物在60℃下保温5分钟。10μl的各LCR跑过溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶，与1Kb梯状标准参照(Invitrogen)相比较。在各泳道观察到连接DNA的成片条带，围绕着约400bp的暗特异性条带。
通过PCR扩增重链和轻链LCR，使用SEQ ID No.12和SEQ ID No.22作为重链的引物，并使用SEQ ID No.33和SEQ ID No.43作为轻链的引物。各反应中包括下述：5μl LCR、5μl 10×Expand HiFi buffer(Roche，LewesUK)、1μl 10mM NTP混合物、0.25μl各引物(来自100μM原液)、0.5μlExpand HiFi聚合酶(3单位，Roche)和38μl H2O。反应循环如下：94℃、2分钟，随后20个循环的94℃、30秒，60℃、30秒和72℃、30秒。最后反应物在72℃下保温5分钟。如上，通过琼脂糖凝胶电泳确认反应的产率和特异性。各反应在约400bp观察到特异性尖锐条带。
使用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化所述反应产物，各稀释于30μl H2O中。在标准反应中使用限制酶MluI和Hind III消化重链产物，并使用BssHII and BamH I消化轻链产物。使用Qiagen PCR纯化试剂盒再次纯化反应产物，各稀释于30μl H2O中。
轻链表达载体pANT08基于pAT153骨架并含有下述次序：CMV直接/早期增强启动子-590至+7，来自高表达鼠抗体轻链RNA的30nt 5′UTR，靠近可变区起始密码子加入BssH II限制位点的鼠共有轻链信号序列，连接至人类复合内含子的含有从可变区剪接位点至Bam HI限制位点33nt的短连接体(替代可变区)，随后是含有343nt内含子的人类基因组DNA，前面的人类恒定κ(CK)区基因、CK基因和CK聚腺苷酸。
重链表达载体pANT09类似pANT08穿过启动子区，其跟随有：来自上述的重链相似物的62nt 5′UTR，靠近可变区起始密码子加入Mlu I限制位点的鼠重链共有信号序列，连接至紧随有人类基因组片段的可变区剪接位点的短连接体(替代可变区)，从位于CH1基因上游内含子211nt的Hind III限制位点至CH区聚腺苷酸位点末端。该片段包括人类IgG1的CH1、铰链、CH2和CH3内含子和外显子。该载体还包括受S V40启动子和聚腺苷酸信号控制的二氢叶酸还原酶基因，用于抵抗氨甲喋呤。
在总体积为30μl的标准反应中使用相关限制酶消化2μg各载体。各反应物如上跑过1％琼脂糖凝胶，从凝胶切出载体特异性条带(6.0Kbp重链和4.2Kbp轻链)，使用Qiagen凝胶提取试剂盒纯化并稀释于30μlH2O中。
使用Ligafast试剂盒(Promega，Southampton UK)将1μl各消化载体连接至3μl相应的消化可变基因PCR产物。如生产商说明，将2.5μl各连接反应物转化入亚克隆效率感受态XL1-blue(Stratagene)，并铺板于含有100μg/ml氨苄西林的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。来自各连接的10个细菌菌落接种入10ml含有100μg/ml氨苄西林的2×YT肉汤培养基，37℃振荡培养过夜。使用Qiagen质粒制备试剂盒从1.5ml各过夜培养物中纯化质粒并各自稀释于50μl H2O中。所述质粒被送至合同(contract)测序装置，并使用标准CMV启动子引物测序并鉴定具有正确V区基因序列的克隆。
为构建复合人类抗体，使用一系列重叠40mer合成寡核苷酸构建了翻译生成SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核苷酸序列。所述寡核苷酸的序列显示于图15和图16。通过重叠PCR构建了翻译生成SEQ ID No.5的核苷酸序列，使用了寡核苷酸引物SEQ ID No.94和SEQ ID No.95(图17)以及寡核苷酸SEQ ID No.53和SEQ ID No.63和初级复合人类抗体重链变体的质粒DNA作为模板。使用SEQ ID No.53和SEQ ID No.95或者SEQID No.94和SEQ ID No.63作为引物对，完成了两个PCR反应。各反应中包括下述：1μl(100ng)质粒模板、5μl 10×Expand HiFi缓冲液(Roche)、1μl 10mM NTP混合物、0.25μl各引物(来自100μM原液)、0.5μl ExpandHiFi聚合酶(3单位，Roche)和42μl H2O。反应循环如下：94℃、2分钟，随后20个循环的94℃、30秒，60℃、30秒和72℃、30秒。最后反应物在72℃下保温5分钟。全部反应物电泳迁移通过1％琼脂糖凝胶，切出295bp和126bp的特异性条带，并使用Qiagen凝胶提取试剂盒纯化。DNA稀释于30μl H2O中。
使用寡核苷酸引物SEQ ID No.53和SEQ ID No.63在PCR反应中连接两个纯化的片段，使用上述PCR条件，除了使用的模板是1μl 295bp产物和1μl 126bp产物，因此H2O量减至41μl。使用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化396bp的结合PCR产物，并稀释于30μl H2O中。
通过重叠PCR构建了翻译生成SEQ ID No.6的核苷酸序列，使用了寡核苷酸引物SEQ ID No.96和SEQ ID No.97(图17)以及寡核苷酸SEQID No.53和SEQ ID No.63和初级复合人类抗体重链变体的质粒DNA作为模板。使用SEQ ID No.53和SEQ ID No.97或者SEQ ID No.96和SEQ IDNo.63作为引物对，完成了两个PCR反应。如上所述完成第一阶段PCR并生成295bp和126bp片段。还如上所述，这些片段经纯化、结合在一起和再次纯化。
通过重叠PCR构建了翻译生成SEQ ID No.7的核苷酸序列，使用了寡核苷酸引物SEQ ID No.98和SEQ ID No.99(图17)以及寡核苷酸SEQID No.53和SEQ ID No.63和SEQ ID No.6的PCR产物作为模板。使用SEQ ID No.53和SEQ ID No.99或者SEQ ID No.98和SEQ ID No.63作为引物对，完成了两个PCR反应。如上所述完成第一阶段PCR并生成98bp和318bp片段。还如上所述，这些片段经纯化、结合在一起和再次纯化。
通过重叠PCR构建了翻译生成SEQ ID No.8的核苷酸序列，使用了寡核苷酸引物SEQ ID No.100和SEQ ID No.101(图17)以及寡核苷酸SEQID No.53和SEQ ID No.63和SEQ ID No.7的PCR产物作为模板。使用SEQ ID No.53和SEQ ID No.101或者SEQ ID No.100和SEQ ID No.63作为引物对，完成了两个PCR反应。如上所述完成第一阶段PCR并生成270bp和155bp片段。还如上所述，这些片段经纯化、结合在一起和再次纯化。
使用Mlu I和Hind III消化上述各PCR产物，并连接入同样消化的pANT09。全部如上所述，所述连接经转化和铺板，挑选菌落，质粒制备和测序。
通过重叠PCR构建了翻译生成SEQ ID No.9的核苷酸序列，使用了寡核苷酸引物SEQ ID No.102和SEQ ID No.103(图17)和初级复合人类抗体轻链变体的质粒DNA作为模板。如上针对重链变体所描述的，完成一个PCR反应，并生成383bp的产物。全部反应物电泳迁移通过1％琼脂糖凝胶，切出特异性条带，并使用Qiagen凝胶提取试剂盒纯化。DNA稀释于30μl H2O中。
通过重叠PCR构建了翻译生成SEQ ID No.10的核苷酸序列，使用了寡核苷酸引物SEQ ID No.104和SEQ ID No.105(图17)以及寡核苷酸SEQID No.74和SEQ ID No.84和SEQ ID No.9的PCR产物作为模板。如上针对重链变体所描述的，使用SEQ ID No.74和SEQ ID No.105或者SEQ IDNo.104和SEQ ID No.84作为引物对，完成了两个PCR反应并生成265bp和139bp片段。还如上针对重链变体所述的，这些片段经纯化、结合在一起以生成383bp的产物，并再次纯化。
通过重叠PCR构建了翻译生成SEQ ID No.11的核苷酸序列，使用了寡核苷酸引物SEQ ID No.106和SEQ ID No.107(图17)以及寡核苷酸SEQID No.74和SEQ ID No.84和SEQ ID No.10的PCR产物作为模板。如上针对重链变体所描述的，使用SEQ ID No.74和SEQ ID No.107或者SEQID No.106和SEQ ID No.84作为引物对，完成了两个PCR反应。如上针对重链变体所描述的，完成第一阶段PCR并生成148bp和256bp片段。还如上针对重链变体所述的，这些片段经纯化、结合在一起以生成383bp的产物，并再次纯化。
使用Bss HII和Bam HI消化上述各PCR产物，并连接入同样消化的pANT08。全部如上所述，所述连接经转化和铺板，挑选菌落，质粒制备和测序。
在含有10％FCS、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和L-脯氨酸的DMEM中增殖CHO-K1细胞(ATCC#CCL-61)。收集接近融合的培养物，用于如生产商(Invitrogen)所教导的使用Lipofectamine 2000转染。在接种了200μl细胞(3×105细胞/ml)的48孔板中进行转染，使用了包含0.3μg重链构建物和0.2μg轻链构建物的0.5μg质粒DNA。
在收集上清液之前，转染在37℃/5％CO2下培养48至72小时。通过ELISA定量抗体表达，使用：鼠单克隆抗人类IgG捕获抗体、人类IgG1/к标准和HRP结合山羊抗人类к轻链作为检测抗体(所有试剂来自Sigma)。
所有重链和轻链组合都被转染(即6重链×5轻链＝30转染)。抗体表达水平一般范围为0.5至2.0μg/ml，然而没有观察到重链SEQ ID No.8的表达。
使用TNF-敏感的WEHI-164细胞(Espevik等，J.Immunol.Methods1986，95，99-105)测试了所表达的抗体中和人类TNFα的能力。细胞铺板于1μg/ml防线菌素D的96孔微孔滴定板中(每孔5×104细胞)，至3-4小时。细胞暴露于40pM人类TNFα，并改变嵌合抗体浓度(从1ng/ml至500ng/ml)，以生成标准曲线。在25ng/ml的单一浓度点测试重链和轻链的各种组合，之前所述浓度点已经被测定为嵌合抗体的ED50。所有测定进行三次。混合物在37℃培养过夜。测定细胞存活力，通过：添加3-[4，5-二甲基-噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑翁染料(MTT)至终浓度为0.5mg/ml，37℃培养4小时，0.1M HCl、0.1％SDS中裂解细胞，和在550nm波长处检测光密度。
重链和轻链组合的光密度用以从标准曲线计算表观抗体浓度。各变体组合的表观浓度除以嵌合表观浓度生成倍差值(fold difference value)。低于嵌合的值表明那些组合更有效保护细胞免受TNFα细胞毒性，而较高值表明其较不有效。所有组合的值显示于表5。
表5：复合人类抗体变体与嵌合抗体活性比例
    SEQ ID No.     1     3     5     6     7   8
    24     1.001.51     1.382.28     1.241.28     1.201.38     1.021.05   NDND
    91011     1.281.3116.90   2.142.5115.15   1.321.17196.49   1.771.63134.08   0.950.98105.61   NDNDND
下述复合人类抗体重链和轻链组合倍差值接近1.0：SEQ ID No.5/SEQ ID No.10、SEQ ID No.7/SEQ ID No.4、SEQ ID No.7/SEQ ID No.9、SEQ ID No.7/SEQ ID No.10。选择这些组合用于进一步研究。
带有上述选择序列的表达质粒转染进入NS0细胞(ECACCNo.85110503)。在含有L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、5％超低IgG FCS和pen/strep的高葡萄糖DMEM中培养细胞。在对数生长期收集细胞并以5×106细胞/ml悬浮于新鲜生长培养基中。750μl细胞与总共30μg的各质粒对(其已经用Ssp I线性化)混合于50μl H2O中。细胞/质粒混合物转至4mm间距电击杯(gap cuvette)，并使用Equibio Easyject Plus在250V、1500μF、无限电阻下电穿孔。所述电穿孔立即转至25ml预热的生长培养基，并铺板于5×96孔平底板(100μl/孔)。平板在37℃/5％CO2下培养。电穿孔后48小时，将50μl含有300nM氨甲喋呤的培养基添加至各孔，以形成终浓度为100nM。电穿孔7天后，将另外50μl含有100nM氨甲喋呤的培养基添加至各孔。
电穿孔后约2周，一些孔内的培养基开始变黄，表明了转染的集落生长。使用抗人类IgG Fc捕获/抗人类Igκ轻链HRP结合物检测ELISA来测试这些孔的培养基的抗体表达。测试样品与人类IgG1/κ标准和估计的抗体表达水平相比较。将表达有用量的抗体的集落在含有200nM氨甲喋呤的培养基中扩增。
通过蛋白质A亲和层析并随后使用Sephacryl S200尺寸排阻层析从500ml培养基中纯化抗体。通过280nm处的UV吸收定量所述纯化的抗体，假设OD280 1＝1.4mg/ml。
通过上述实施例4中描述的WEHI-164保护测定来测试纯化的嵌合和复合抗体的活性。测试了之前用以生成标准曲线的所有浓度范围的各抗体(见图18)。发现复合人类抗体7/10(即，含有SEQ ID No.7和SEQ ID No.10)是最有效的变体并具有与嵌合抗体相同的活性。复合人类抗体7/9和5/10具有类似活性，其比嵌合抗体略有减少，并且复合人类抗体7/4活性最小。
因此，由于复合人类抗体7/10被预测具有最有利的II类MHC特征并且是最有效的变体，所以其被选择用于在时间过程T细胞增殖测定中测试。通过两圈Ficoll密度离心从来自人类捐赠血液的血沉棕黄层制备人类PBMC。所制备的PBMC以3×107细胞/ml的密度重悬于90％人类AB血清/10％DMSO中(1ml分装)，并保存于液氮下。使用Dynal Allset_ PCR分型试剂盒对PBMC组织分型。
使用来自20名健康供体的人类PBMC在全蛋白T细胞测定中比较前导复合人类抗体和嵌合抗体。来自各供体的PBMC经融化、洗涤并悬浮于不含AIM V血清的淋巴细胞生长培养基中。在第1天，将50μg蛋白质添加至2ml大块培养物(4×106PBMC于24孔板中)，在第6天至第9天移出三份100μl分装，并转至96孔板。在收集和检测放射活性掺入之前，使用75μl含有1μCi氚标记的胸腺嘧啶脉冲各分装。通过计算刺激指数(SI)来标准化结果。通过根据单个MHC单倍型选择供体来实现宽范围的HLA DR异型覆盖。
时间-过程测定的结果显示于图19，并且证明嵌合抗体(图19(a))在至少1天在20名供体的10名中引发了T细胞反应(SI＞＝2)。相反，复合人类抗体(图19(b))未能在任何时间点的任何供体中引发反应。因此，使用鼠抗TNFα抗体(A2)作为参考，成功地从人类抗体片段构建了无免疫原性的复合人类抗体。
实施例8：复合I型核糖体抑制蛋白的构建
使用WO2005090579中描述的方法生成了植物I型核糖体抑制蛋白(RIP)bouganin(来自叶子花(Bougainvillea spectabilis))的复合变体。如WO2005090579，通过分析重叠15mer肽测试了bouganin中的T细胞表位的位置，并且表6中SEQ ID 11-13的肽(相应于残基121-135、130-144和148-162)被鉴定为表位。从来自叶子花植物的叶组织克隆了Bouganin。如生产商所教导的，使用聚腺苷酸Tract System 1000试剂盒(Promega)从100mg组织中提取了mRNA。使用AccessQuick RT-PCR系统(Promega)从mRNA模板合成了cDNA，且引物如下：ATGTACAACACTGTGTCATTTAAC和TTATTTGGAGCTTTTAAACTTAAGGATACC。第一引物额外含有ATG起始密码子，且第二引物额外含有TAA终止密码子。使用T/A克隆系统(pGEM T Easy，Promega)克隆了PCR产物，并测序了几个克隆以鉴定取向为载体中含有的T7启动子的转录方向的正确克隆。
表6：bouganin的免疫原性肽序列和取代人类序列片段
SEQ ID No.11：121AKVDRKDLELGVYKL135
                AAKAD-CAD39157
                 AKADR-AAH01327
                  KADRK-XP_372046
                AAKSDR-AAH47411
                  KSDRKD-NP_002678
                AAKTD-BAA23704
                 AKTDR-AAD00450
                  KTDRK-CAH18368
SEQ ID No.12：130LGVYKLEFSIEAIHG144
                ELGPQ-BAC04852
                 LGPQK-NP_056013
                  GPQKLE-XP_370607
                ELGGK-AAI00815
                 LGGKKL-BAD96533
                  GGKKLE-AAK68690
                ELGNS-BAB14022
                 LGNSKL-BAD98114
                  GNSKLE-CAG46875
                ELGQAKL-AAF42325
                 LGQAKLE-AAN63404
                ELGQD-CAH71404
                 LGQDK-BAC04773
                   QDKLE-NP_004000
SEQ ID No.13：148NGQEIAKFFLIVIQM162
                  GQEQA-CAI95134
                   QEQAK-AAH55427
                    EQAKF-NP_079390
                  GQERA-AAH10634
                   QERAK-NP_003153
                    ERAKF-AAH14009
一系列变体被制成含有表6中所示的经鉴定的人类序列片段。这些使用具有高保真聚合酶(Expand Hi-Fi，Roche)的重叠PCR构建。5′和3′引物如上，且PCR产物如上被克隆入T/A克隆载体，并且鉴定了取向为T7启动子转录方向的正确克隆。在配对的转录和翻译反应中测定克隆的活性，所述反应包括表达荧光素酶基因的对照DNA(Luciferase T7 Control，Promega)。由于bouganin是核糖体失活蛋白，其显著降低荧光素酶基因的翻译水平，这种降低常规使用荧光素酶检测系统(例如Steady-Glo(Promega))测定。纯化的野生型或突变体bouganin质粒用Not I线性化，并稀释至10ng/μl。荧光素酶T7对照DNA被稀释至125ng/μl。1μl各DNA与10μl TnT混合物(Promega)、0.25μl蛋氨酸和0.25μl不含核酸酶的水(TnT试剂盒中提供的)混合。对照仅是wt(野生型)bouganin和荧光素酶T7对照。反应进行三份，并于30℃下培养1小时。5μl各反应物转至黑色围壁的96孔发光计板，并与45μl水和50μl Steady-Glo试剂。在Wallac Microbeta Trilux发光计中读取发光。活性表示为从单独荧光素酶对照DNA观察到的发光的百分比。
图20描绘了许多不同变体的活性特征。这显示最有效的变体是：肽41中的V123T；肽44中的132P/Y133Q；肽50中的I152Q。组合的突变体被制成含有这4种突变，并在活性测定中再次测试。该突变体的活性由图20中的COMB表示，并保留了约75％的wt蛋白活性。
活性COMB变体中含有相应于残基121-135、130-144和148-162的人类序列片段的肽被合成，并如实施例7所述，在使用来自20个健康供体的人类PBMC的时间-过程T细胞测定中与相应的野生型肽比较。结果表明，含有人类序列片段的肽没有在任何供体中的任何时间点诱导T细胞增殖，而各野生型肽在至少一个时间点在＞10％的所有供体中诱导了SI＞2的增殖。
实施例9：复合水蛭素(Hirudin)的构建
使用表7中SEQ ID No.14的蛋白质作为野生型，使用WO2004113386中描述的方法生成了凝血酶抑制剂水蛭素(来自医蛭(Hirudo medicinalis))的复合变体。如WO2004113386中，通过分析重叠15mer肽检测了水蛭素中T细胞表位的位置，并显示肽27-41 CILGSDGEKNQCVTG产生与来自20名健康供体的人类PBMC显著的T细胞反应。来自黑素瘤相关抗原(AAN40505.1)的人类序列片段KCRH被用以取代水蛭素26-29残基，如实施例8中使用重叠PCR，生成28/29IL变为28/29RH的变体水蛭素分子，其保留了野生型水蛭素的全部活性，使用WO2004113386中描述的测定法。与野生型肽27-41 CILGSDGEKNQCVTG一起，在如实施例8中的T细胞测定中测试修饰肽27-41 CRHGSDGEKNQCVTG，证明了修饰肽中T细胞表位活性的丢失。
实施例10：带有Tr表位的复合人类抗IgE抗体的构建
根据Orlandi等，同上的标准聚合酶链式反应(PCR)方法，将来自实施例4的复合人类抗IgE抗体的VH和VL基因克隆入分离的质粒载体，作为用于使用寡核苷酸引物对的VL-和VH-特异性PCR的模板。重叠互补序列被导入PCR产物，其在后续融合PCR中组合以形成20个氨基酸(G4S1)4连接体或者20个氨基酸序列GGSNNLSCLTIP ASANNGGS的编码序列，所述20个氨基酸序列GGSNNLSCLTIP ASANNGGS含有来自丙型肝炎核心蛋白(P19，MacDonald等，Journal of Infectious Diseases，185(2002)p720-727)的10个氨基酸Tr表位，每侧具有两个天冬酰胺残基和GGS三联体。该最终扩增步骤使用引物对进行，用于限制酶EcoRV和BspE1的随后剪切并克隆入bluescript KS载体(Stratagene)。然后通过Mack等，ProcNatl Acad Sci U S A.，92(1995)p7021-7025的方法构建了二聚体形式的复合人类抗IgE单链抗体(scFvs)。二聚的VL-连接体-VH-VL-连接体-VH片段被亚克隆入表达载体pEF-DHFR(Mack等，同上)的EcoR1/Sal1位点，并通过电穿孔转染入DHFR缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。如Mach等，同上描述的进行筛选、基因扩增和蛋白质生成。经由C末端组氨酸尾通过在镍-氨基三乙酸(Ni-NTA)柱上的亲和层析纯化二聚的scFv′s，以产生二聚Fvs指定的CHABIgEG4S1x4(VL和VH之间的(G4S1)4连接体)和CHABIgEHCVP19(VL和VH之间的HCV Tr表位)。
使用来自20名健康供体的PBMC，严格如Hall等，Blood 100(2002)p4529-4536所描述的，随后在50μg/ml人类T细胞测定中测试二聚scFvs。结果显示，CHABIgEG4S1x4或CHABIgEHCVP19都没有显著的T细胞增殖，但显示了经CHABIgEHCVP19刺激的20名供体中的4名有显著水平的IL-10生成(SI＞2)，而用CHABIgEG4S1x4刺激的则没有(20名供体中没有一个SI＞2)。这说明抗体分子中包含的Tr表位用于诱导免疫抑制细胞因子IL-10的作用。
序列表
<110>安迪拓普有限公司
     马太.保罗.贝克
     蒂莫西.大卫.琼斯
<120>人类抗体和蛋白质
<130>P40089WO
<140>PCT/GB2006/000355
<141>2006-02-03
<150>GB0502201.7
<151>2005-02-03
<150>GB0506945.5
<151>2005-04-05
<150>GB0503190.1
<151>2005-02-17
<160>600
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>120
<212>PRT
<213>人类
<400>1
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala
65                  70                  75                  80
Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>2
<211>107
<212>PRT
<213>人类
<400>2
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys
            100                 105
<210>3
<211>120
<212>PRT
<213>人类
<400>3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>4
<211>107
<212>PRT
<213>人类
<400>4
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>5
<211>120
<212>PRT
<213>人类
<400>5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asp Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>6
<211>120
<212>PRT
<213>人类
<400>6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>7
<211>120
<212>PRT
<213>人类
<400>7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
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<212>PRT
<213>人类
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
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<212>PRT
<213>人类
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Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
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<210>10
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<212>PRT
<213>人类
<400>10
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
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Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105
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<213>人类
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Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
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<212>DNA
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<212>DNA
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<212>DNA
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<212>DNA
<213>人类
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<212>DNA
<213>人类
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<213>人类
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<213>人类
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<212>DNA
<213>人类
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tagactcaga agcatacttt atgagaagct ttggagactg                           40
<210>90
<211>40
<212>DNA
<213>人类
<400>90
atttgttttc tgctgatacc agtgtatgct tgagccaacg                           40
<210>91
<211>40
<212>DNA
<213>人类
<400>91
aactgactgg ccctgcagga gagagtggct ctttctcctg                           40
<210>92
<211>40
<212>DNA
<213>人类
<400>92
gactcagaga caggatggct ggagattgtg tcagcaggat                           40
<210>93
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>93
gtcacatcgc gcgcctggga                                                 20
<210>94
<211>25
<212>DNA
<213>人类
<400>94
caaatgaacg acttaaaaac tgaag                                           25
<210>95
<211>25
<212>DNA
<213>人类
<400>95
cttcagtttt taagtcgttc atttg                                           25
<210>96
<211>25
<212>DNA
<213>人类
<400>96
caaatgaaca gcttaaaaac tgaag                                           25
<210>97
<211>25
<212>DNA
<213>人类
<400>97
cttcagtttt taagctgttc atttg                                           25
<210>98
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>98
ctctcctgtg ctgcctctgg                                                 20
<210>99
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>99
ccagaggcag cacaggagag                                                 20
<210>100
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>100
caaaagtatt gcctacctgc                                                 20
<210>101
<211>20
<212>DNA
<213>人类
<400>101
cgaggtaggc aatacttttg                                                 20
<210>102
<211>54
<212>DNA
<213>人类
<400>102
tcccaggcgc gcgatgtgac atcctgctga cacaatctcc agccaccctg tctc           54
<210>103
<211>66
<212>DNA
<213>人类
<400>103
ctgccaggat ccaactgagg aagcaaagtt taaattctac tcacgtttta tttccaatct     60
tgtccc                                                                66
<210>104
<211>21
<212>DNA
<213>人类
<400>104
cagtctggag gctgaagatg c                                               21
<210>105
<211>21
<212>DNA
<213>人类
<400>105
cgatcttcag cctccagact g                                               21
<210>106
<211>21
<212>DNA
<213>人类
<400>106
gcagaaaaca gatcagtctc c                                               21
<210>107
<211>21
<212>DNA
<213>人类
<400>107
ggagactgat ctgttttctg a                                               21
<210>108
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>108
Asp Phe Leu Ser Gly Tyr Leu Asp Tyr
1               5
<210>109
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>109
Val Arg Gly Ser Gly Ser Phe Asp Tyr
1               5
<210>110
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>110
Asp Arg Gly Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>111
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>111
Met Tyr Asn Trp Asn Phe Phe Asp Tyr
1               5
<210>112
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>112
Ala Gly Leu Gly Met Ile Phe Asp Tyr
1               5
<210>113
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>113
Arg Gly Phe Asn Gly Gln Leu Ile Phe
1               5
<210>114
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>114
Ala Leu Thr Gly Asp Ala Phe Asp Ile
1               5
<210>115
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>115
Thr Lys Leu Asp Trp Tyr Phe Asp Leu
1               5
<210>116
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>116
Arg Tyr Gly Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr
l               5
<210>117
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>117
Gly Tyr Ser Asn Glu Gly Met Asp Val
1               5
<210>118
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>118
Ser Trp Asp Gly Tyr Ser Tyr Ile Tyr
1               5
<210>119
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>119
Gln Met Gly Ala Glu Tyr Phe Gln His
1               5
<210>120
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>120
Asp Met Ser Leu Asp Ala Phe Asp Ile
1               5
<210>121
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>121
Gly Ser Val Gly Ala Thr Leu Gly Glu
1               5
<210>122
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>122
Tyr Gly Asp Tyr His Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>123
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>123
Gly Val Gly Ser Ser Gly Trp Asp His
1               5
<210>124
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>124
Lys Gly Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1                   5
<210>125
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>125
Pro Asn Trp Asn Asp Ala Phe Asp Ile
1               5
<210>126
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>126
Arg Gly Ile Pro His Ala Phe Asp Ile
1               5
<210>127
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>127
Pro Pro Glu Val Glu Ser Leu Arg Ser
1               5
<210>128
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>128
Pro Pro Glu Val Glu Ser Leu Arg Ser
1               5
<210>129
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>129
Pro Pro Glu Val Glu Ser Leu Arg Ser
1               5
<210>130
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>130
Pro Pro Glu Val Glu Ser Leu Arg Ser
1               5
<210>131
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>131
Pro Pro Glu Val Glu Ser Leu Arg Ser
1               5
<210>132
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>132
Pro Pro Glu Val Glu Ser Leu Arg Ser
1               5
<210>133
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>133
Pro Pro Glu Val Glu Ser Leu Arg Ser
1               5
<210>134
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>134
Pro Pro Glu Val Glu Ser Leu Arg Ser
1               5
<210>135
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>135
Asp Leu Ala Ala Ala Arg Leu Phe
1               5
<210>136
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>136
Gln Gly Thr Ile Ala Gly Ile Arg His
1               5
<210>137
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>137
Glu Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5
<210>138
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>138
Asp Pro Ile Asn Trp Tyr Phe Asp Leu
1               5
<210>139
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>139
Asp Arg Ala Ala Gly Asp Arg Asp Tyr
1               5
<210>140
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>140
His Gln Met Tyr Ser Asn Ser Asp Tyr
1               5
<210>141
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>141
Ser Tyr Asp Phe Ala Trp Phe Ala Tyr
1               5
<210>142
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>142
Gln Gly Thr Ile Ala Gly Ile Arg His
1               5
<210>143
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>143
Val Leu Gly Ile Ile Ala Ala Asp His
1               5
<210>144
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>144
Asp Leu Thr Gly Asp Ala Phe Asp Ile
1               5
<210>145
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>145
Ser Cys Gly Ser Gln Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>146
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>146
Leu Trp Asn Trp Asp Ala Phe Asp Ile
1               5
<210>147
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>147
Asp Ile Met Thr Trp Gly Phe Asp Tyr
1               5
<210>148
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>148
Ser Asn Trp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
1               5
<210>149
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>149
Asn Leu Ile Ala Gly Cys Ile Asp Val
1               5
<210>150
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>150
Gly Gly Lys Gly Gly Glu Phe Asp Asp
1               5
<210>151
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>151
Asp Ser Gly Asn Tyr Arg Ile Asp Tyr
1               5
<210>152
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>152
Asp Pro Arg Leu Asp Ala Phe Asp Ile
1               5
<210>153
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>153
Gly Tyr Ser Tyr Pro Val Trp Gly Arg
1               5
<210>154
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>154
Leu Val Gly Asn Ser Trp Leu Asp Tyr
1               5
<210>155
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>未知
<222>(3)..(3)
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>Xaa可为任何天然产生的氨基酸
<400>155
Asp Leu Xaa Gly Leu Val Val Glu Tyr
1               5
<210>156
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>156
Lys Val Ser Leu Ser Ala Phe Asp Ile
1               5
<210>157
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>157
Arg Gly Asp Ala Met Tyr Phe Asp Val
1               5
<210>158
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>158
Asp Pro Asn Pro Trp Tyr Phe Asp Leu
1               5
<210>159
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>159
Asp Tyr Gly Asp Tyr Ala Phe Asp Ile
1               5
<210>160
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>160
Ser Ala His Ser Asp Ala Phe Asp Met
1               5
<210>161
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>161
Leu Glu Gly Leu Gly Trp Phe Asp Pro
1               5
<210>162
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>162
Arg Ser Asp Tyr Gly Ala Ile Asp Tyr
1               5
<210>163
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>163
Asn Leu Gly Phe Tyr His Met Asp Val
1               5
<210>164
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>164
Glu Ala Arg Gly Gly Gly Gly Glu Tyr
1               5
<210>165
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>165
Glu Gly Trp Ile Ser Ala Leu Asn Gly
1               5
<210>166
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>166
Glu Gly Glu Gly Glu Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>167
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>167
Glu Arg Thr Ser Gly Asp Phe Asp Phe
1               5
<210>168
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>168
Asn Ser Pro Gly Ala Thr Phe Glu Ser
1               5
<210>169
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>169
Gly Asn Gly Gln Lys Cys Phe Asp Tyr
1               5
<210>170
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>170
Arg Gly Ser Leu Gln Tyr Leu Asp Tyr
1               5
<210>171
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>171
Asn Asn Gly Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>172
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>172
Gly Ser Asp Tyr Ser Asn Phe Ala Tyr
1               5
<210>173
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>173
Ser Thr His Arg Ser Ala Phe Asp Val
1               5
<210>174
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>174
Glu Gly Val His Lys Asn Phe Asp His
1               5
<210>175
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>175
Leu Ser Arg Ala Gly Gly Phe Asp Ile
1               5
<210>176
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>176
Arg Met Pro Ala Val Ala Phe Asp Tyr
1               5
<210>177
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>177
Arg Met Pro Ala Val Ala Phe Asp Tyr
1               5
<210>178
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>178
Arg Met Arg Ala Val Ala Phe Asp Tyr
1               5
<210>179
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>179
Arg Met Pro Ala Val Ala Phe Asp Tyr
1               5
<210>180
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>180
Asp Tyr Gly Gly Asn Pro Ala Glu Leu
1               5
<210>181
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>181
Gly Pro Thr Cys Ser Gly Gly Ser Cys
1               5
<210>182
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>182
Arg Lys Gly Ala Ala His Phe Asp Tyr
1               5
<210>183
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>183
Glu Glu Val Gly Gly Tyr Phe Gln His
1               5
<210>184
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>184
Asp Phe Asp Gly Gly Ser Phe Asp Tyr
1               5
<210>185
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>185
Asp Phe Asp Gly Gly Ser Leu Asp Tyr
1               5
<210>186
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>186
Asp Phe Asp Gly Gly Ser Phe Asp Tyr
1               5
<210>187
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>187
Lys Val Pro Ser His Gly Met Asp Tyr
1               5
<210>188
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>188
Lys Val Pro Ser His Gly Met Asp Tyr
1               5
<210>189
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>189
Lys Val Pro Ser His Gly Met Asp Tyr
1               5
<210>190
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>190
Lys Val Pro Ser His Gly Met Asp Tyr
1               5
<210>191
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>191
Gln Pro Leu Ala Arg His Phe Asp Pro
1               5
<210>192
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>192
Gly Pro Leu Met Arg Trp Phe Asp Asp
1               5
<210>193
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>193
Val Ala Val Ala Gly Gly Phe Asp Pro
1               5
<210>194
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>194
Gly Val Glu Val Ala Gly Thr Ala Ser
1               5
<210>195
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>195
Tyr Tyr Glu Ser Ser Ala Gly Pro Pro
1               5
<210>196
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>196
Glu Ile Pro Arg Gly Gly Ser Cys Tyr
1               5
<210>197
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>197
Glu Ile Pro Arg Gly Gly Ser Cys Tyr
1               5
<210>198
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>198
Lys Glu Lys Trp Asp Ser Ser Arg Cys
1               5
<210>199
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>199
Gly Ser Ala Ala Ala Gly Thr Gln Gly
1               5
<210>200
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>200
Asp Phe Ser Trp Ala Gly Pro His Phe
1               5
<210>201
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>201
Gly Thr His Tyr Tyr Asp Ile Arg Val
1               5
<210>202
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>202
Asp Gly Ser Gly Ser Tyr Glu Gly Asn
1               5
<210>203
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>203
Gly Gly Ala Val Ala Ala Phe Asp Tyr
1               5
<210>204
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>204
Lys Pro Val Thr Gly Gly Glu Asp Tyr
1               5
<210>205
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>205
Asp Tyr Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr
1               5
<210>206
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>206
Trp Asp Gly Arg Leu Leu Val Asp Tyr
1                   5
<210>207
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>207
His Lys Gly Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>208
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>208
His Lys Gly Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>209
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>209
His Lys Gly Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>210
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>210
His Lys Gly Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>211
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>211
His Lys Gly Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>212
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>212
His Lys Gly Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>213
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>213
Tyr Arg Gly Asp Thr Tyr Asp Tyr Ser
1               5
<210>214
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>214
Trp Val Gly Ala Thr Thr Ser Asp Tyr
1               5
<210>215
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>215
Glu Asp Met Asp Tyr Gly Met Asp Val
1               5
<210>216
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>216
Gly Gly Arg Asp Arg Tyr Leu Val Tyr
1               5
<210>217
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>217
Val Arg Val Ser Tyr Gly Met Asp Val
1               5
<210>218
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>218
Met Arg Lys Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5
<210>219
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>219
Met Arg Lys Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5
<210>220
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>220
Met Arg Lys Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5
<210>221
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>221
Met Arg Lys Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5
<210>222
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>222
Met Arg Lys Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5
<210>223
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>223
Arg Met Pro Ala Val Ala Phe Asp Tyr
1               5
<210>224
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>224
Arg Met Pro Ala Val Ala Phe Asp Tyr
1               5
<210>225
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>225
Arg Met Arg Ala Val Ala Phe Asp Tyr
1               5
<210>226
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>226
Arg Met Pro Ala Val Ala Phe Asp Tyr
1               5
<210>227
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>227
Thr Ser Ile Val Arg Gly Phe Gly Pro
1               5
<210>228
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>228
Asp Phe Phe Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr
1           5
<210>229
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>229
Asp Phe Phe Arg Asp Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>230
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>230
Gly Gly Thr Gln Pro Phe Asp Ile Arg
1               5
<210>231
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>231
Ser Gln Ala Ser Gly Pro Phe Asp Tyr
1               5
<210>232
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>232
Gly Leu Tyr Gln Leu Leu Phe Asp Tyr
1               5
<210>233
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>233
Ala Gly Gly Arg Thr Ser Phe Asp Pro
1               5
<210>234
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>234
Glu Gly Asn Thr Lys Ala Pro Asp Tyr
1               5
<210>235
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>235
Asn Gly Thr Ser Gly Asp Phe Asp Tyr
1               5
<210>236
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>236
Tyr Gly Thr Ser Tyr Trp Phe Pro Tyr
1               5
<210>237
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>237
Tyr Gly Thr Ser Tyr Trp Phe Pro Tyr
1               5
<210>238
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>238
Gly Gly Arg Asp Arg Tyr Leu Val Tyr
1               5
<210>239
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>239
Leu Arg Tyr Gln Leu Leu Tyr Asn Tyr
1               5
<210>240
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>240
Tyr Ile Ala Tyr Asp Ala Phe Asp Ile
1               5
<210>241
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>241
Ile Thr Pro Arg Asn Ala Val Asp Ile
1               5
<210>242
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>242
Asp Gly Leu Leu Ala Ala Thr Asp Tyr
1               5
<210>243
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>243
Asp Arg Ala Tyr Leu Asp Phe Trp Gly
1               5
<210>244
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>244
Asp Lys Glu Pro Ala Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>245
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>245
Arg Gly Phe Asn Gly Gln Leu Ile Phe
1               5
<210>246
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>246
Leu Ser Val Val Val Pro Ala Ala Leu
1               5
<210>247
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>247
Leu Ala Asp Asp Asp Pro Glu Asp Phe
1               5
<210>248
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>248
Glu Asp Met Asp Tyr Gly Met Asp Val
1               5
<210>249
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>249
Ser Ala Gly Gly Ser Ala Trp Ser Thr
1               5
<210>250
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>250
Asp Arg Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1               5
<210>251
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>251
Asp Lys Gly Thr Arg Tyr Ser Asp Gln
1               5
<210>252
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>252
Trp Leu Val Glu Gly Ser Phe Asp Tyr
1               5
<210>253
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>253
Gly Tyr Val Gly Ser Ser Leu Asp Tyr
1               5
<210>254
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>254
Trp His Gln Leu Arg Gly Pro Asp Tyr
1               5
<210>255
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>255
Glu Asn Ser Asp Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>256
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>256
Asp Gly Thr Tyr Gly Ser Gly Val Arg
1               5
<210>257
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>257
Gly Gly Ser Met Val Pro Phe Asp Tyr
1               5
<210>258
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>258
Arg Gly Trp Asn Tyr Tyr Phe Asp Ser
1               5
<210>259
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>259
Asp Ala Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
1               5
<210>260
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>260
Asp Gly Arg Tyr Asp Pro Ile Asp Tyr
1               5
<210>261
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>261
Val Gly Ser Ser Gly Trp Tyr Asp Tyr
1               5
<210>262
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>262
Asp Leu Tyr Asp Tyr Tyr Asp Glu Pro
1               5
<210>263
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>263
Asp Gly Ala Ala Ala Ser Phe Asp Tyr
1               5
<210>264
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>264
Val Val Gly Ala Asp Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>265
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>265
Asp Gln Asn Trp Gly Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>266
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>266
Gly Val Leu Arg Asp Ala Phe Asp Ile
1               5
<210>267
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>267
Ala Ser Asp Gly Tyr Gly Met Asp Val
1               5
<210>268
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>268
Gly Val Leu Arg His Ala Leu Asp Ile
1               5
<210>269
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>269
Gly Gly Cys Gly Trp Tyr Lys Asn Tyr
1               5
<210>270
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>270
Gly Ser Asn Tyr Ala Lys Thr Gly Tyr
1               5
<210>271
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>271
Gly Lys Phe Gln Leu Leu Phe Asp Tyr
1               5
<210>272
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>272
Ala Leu His Gly Gly Gly Met Asp Val
1               5
<210>273
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>273
Ala Leu His Gly Gly Gly Met Asp Val
1               5
<210>274
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>274
Val Tyr Pro Pro Asp Ala Phe Asp Leu
1               5
<210>275
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>275
Pro Trp Asp Tyr Trp Phe Phe Asp Leu
1               5
<210>276
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>276
Asp Arg Val Ala Ala Ala Gly Asp Tyr
1               5
<210>277
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>277
Asp Lys Gly Thr Arg Tyr Ser Asp Gln
1               5
<210>278
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>278
Asp Arg Val Ala Thr Ile Pro Asp Tyr
1               5
<210>279
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>279
Glu Arg Gly Ile Thr Leu Met Asp Val
1               5
<210>280
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400> 280
Glu Arg Gly Ile Thr Leu Met Asp Val
1               5
<210>281
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>281
Leu Asp Trp Leu Leu Pro Ile Asp Tyr
1               5
<210>282
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>282
Leu Asp Trp Leu Leu Pro Ile Asp Tyr
1               5
<210>283
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>283
Asp Asp Gly Asp Arg Ala Phe Gly Tyr
1               5
<210>284
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>284
Asp Pro Trp Pro Ala Ala Phe Asp Ile
1               5
<210>285
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>285
Val Arg Gly Ser Trp Ser Gly Asp Ser
1               5
<210>286
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>286
Arg His Ser Ser Asp Trp Tyr Pro Tyr
1               5
<210>287
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>287
Ser Ser Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Tyr
1               5
<210>288
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>288
Gly Leu Asp Gln Tyr Lys Thr Gly His
1               5
<210>289
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>289
Gly Ala Gly Ala Ala Pro His Asp Tyr
1               5
<210>290
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>290
Gly Ala Gly Ala Ala Pro His Asp Tyr
1               5
<210>291
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>291
Asn Gly Thr Ser Gly Asp Phe Asp Tyr
1               5
<210>292
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>292
Ala Leu Arg Pro Ala Thr Phe Asp Phe
1               5
<210>293
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>293
Gln Gln Tyr Ala Asp Leu Ile Thr
1               5
<210>294
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>294
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Thr
1               5
<210>295
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>295
Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Thr
1               5
<210>296
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>296
Gln Gln Gly Asn Ser Phe Pro Lys
1               5
<210>297
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>297
Gln Gln Tyr Gly Tyr Ser Leu Thr
1               5
<210>298
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>298
Gln Gln Phe Gly Gly Ser Phe Thr
1               5
<210>299
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>299
Gln Gln Ser Ser Asn Thr Val Thr
1               5
<210>300
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>300
Gln Gln Tyr Asn Ser Leu Ile Thr
1               5
<210>301
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>301
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Thr
1               5
<210>302
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>302
Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Phe
1               5
<210>303
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>303
Gln Gln Tyr Asn Ser Gln Tyr Thr
1               5
<210>304
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>304
Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Trp Thr
1               5
<210>305
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>305
Gln His Tyr Asn Arg Pro Trp Thr
1               5
<210>306
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>306
Gln Gln Tyr Gly Ser Arg Leu Thr
1               5
<210>307
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>307
Gln His Tyr Gly Thr Pro Arg Thr
1               5
<210>308
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>308
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Thr
1               5
<210>309
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>309
Met Gln Ala Thr Gln Phe Pro Thr
1               5
<210>310
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>310
His Gln Ala Ser Thr Tyr Pro Leu
1               5
<210>311
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>311
Gln Gln Tyr Gly Arg Ser Pro Arg
1               5
<210>312
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>312
Gln Gln Asp Asp Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210>313
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>313
Gln Asn Asp Asn Leu Pro Leu Thr
1               5
<210>314
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>314
Gln Gln Glu Ser Leu Pro Leu Thr
1               5
<210>315
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>315
Gln Gln Asp Asn Leu Pro Leu Thr
1               5
<210>316
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>316
Gln Gln Glu Ser Leu Pro Cys Gly
1               5
<210>317
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>317
Gln Gln Asp Ser Leu Pro Leu Thr
1               5
<210>318
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>318
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Arg Ser
1               5
<210>319
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>319
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Arg Thr
1               5
<210>320
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>320
Gln Gln Tyr Cys Gly Ser Leu Ser
1               5
<210>321
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>321
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Thr
1               5
<210>322
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>322
Gln Leu Tyr Gly Ser Ser Leu Thr
1               5
<210>323
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>323
Gln Gln Tyr Asn Asn Leu Trp Thr
1               5
<210>324
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>324
Gln Gln Tyr Asn Thr Phe Phe Thr
1               5
<210>325
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>325
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Thr
1               5
<210>326
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>326
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu Thr
1               5
<210>327
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>327
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Leu Thr
1               5
<210>328
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>328
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Lys Thr
1               5
<210>329
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>329
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro
1               5
<210>330
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>330
Gln His Arg Asn Asn Trp Pro Pro
1               5
<210>331
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>331
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ser
1               5
<210>332
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>332
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Thr
1               5
<210>333
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>333
Gln Gln Tyr Asp Thr Ile Pro Thr
1               5
<210>334
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>334
Gln Ala Ser Ile Asn Thr Pro Leu
1               5
<210>335
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>335
Met Gln Ala Leu Gln Pro Trp Thr
1               5
<210>336
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>336
Gln G1n Gly Phe Ser Asp Arg Ser
1               5
<210>337
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>337
Met Gln Ala Thr Gln Phe Val Thr
1               5
<210>338
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>338
Gln Arg Cys Lys Gly Met Phe Ser
1               5
<210>339
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>339
Gln Gln Tyr Gly Gly Ser Pro Trp
1           5
<210>340
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>340
Cys Arg Ser His Trp Pro Tyr Thr
1               5
<210>341
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>341
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro
1               5
<210>342
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>342
Gln Gln Cys Asn Thr Asn Pro Pro
1               5
<210>343
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>343
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro
1               5
<210>344
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>344
Gln Gln Tyr Tyr Ser Val Pro Pro
1               5
<210>345
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>345
Gln Gln Tyr Asp Ser Leu Val Thr
1               5
<210>346
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>346
His Gln Tyr Leu Ser Ser Trp Thr
1               5
<210>347
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>347
Met Gln Gly Ile His Leu Leu Thr
1               5
<210>348
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>348
Gln His Tyr Tyr Gly Thr Pro His
1               5
<210>349
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>349
Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Thr
1               5
<210>350
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>350
Gln Glu Phe Gly Asp Ser Gly Thr
1               5
<210>351
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>351
Gln Gln Tyr Gly Gly Ser Pro Trp
1               5
<210>352
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>352
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Arg Thr
1               5
<210>353
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>353
Gln Gln Tyr Asp Ser Leu Pro Thr
1               5
<210>354
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>354
Gln Gln Tyr Gly Ser Val Phe Thr
1               5
<210>355
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>355
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Cys Ser
1               5
<210>356
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>356
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu
1               5
<210>357
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>357
Gln Gln Tyr Asn Asp Trp Pro Thr
1               5
<210>358
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>358
Met Gln Asn Ile Gln Phe Pro Thr
1               5
<210>359
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>359
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro
1               5
<210>360
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>未知
<222>(5)..(5)
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(5)
<223>Xaa可为任何天然产生的氨基酸
<400>360
Gln Leu Leu Arg Xaa Leu Arg Thr
1               5
<210>361
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>361
Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
1               5
<210>362
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>362
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Thr
1               5
<210>363
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>363
Gln Gln Tyr Gly Thr Ser His Thr
1               5
<210>364
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>364
Gln Gln Tyr Asn His Trp Pro Ser
1               5
<210>365
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>365
Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Tyr Thr
1               5
<210>366
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>366
Gln Gln Asn Lys Asp Trp Pro Leu
1               5
<210>367
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>367
Gln Gln Phe Gly Thr Ser Leu Thr
1               5
<210>368
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>368
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Trp Thr
1               5
<210>369
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>369
Gln Gln Cys Ser Asn Trp Pro Thr
1               5
<210>370
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>370
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Thr
1               5
<210>371
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>371
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Ser Ile Thr
1               5                   10
<210>372
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>372
Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Pro Ser Thr
1               5                   10
<210>373
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>373
Gln Glu Tyr Asn Asn Trp Pro Leu Trp Thr
1               5                   10
<210>374
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>374
Gln Gln Tyr Gly Gly Ser Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>375
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>375
His Glu Tyr Asn Gly Trp Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>376
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>376
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>377
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>377
Met Gln His Thr His Trp Ser Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>378
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>378
Gln His Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>379
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>379
Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>380
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>380
Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>381
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>381
Gln His Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>382
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>382
Gln Gln His Asn Asn Trp Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>383
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>383
Gln Val Tyr Gly Gln Ser Pro Val Phe Thr
1               5                   10
<210>384
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>384
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Met Tyr Thr
1               5                   10
<210>385
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>385
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Met Tyr Thr
1               5                   10
<210>386
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>386
Gln Arg Phe Gly Thr Ser Pro Leu Tyr Thr
1               5                   10
<210>387
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>387
Gln Gln Tyr Gly Asp Ser Pro Leu Tyr Ser
1               5                   10
<210>388
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>388
Gln Gln Tyr Asp Asp Trp Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>389
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>389
Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>390
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>390
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Asp Thr
1               5                   10
<210>391
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>391
Gln His Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Ser Ser
1               5                   10
<210>392
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>392
Gln His Tyr Asn Arg Leu Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>393
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>393
Gln Gln Tyr Asp Arg Ser Val Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>394
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>394
Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Thr Tyr Thr
1               5                   10
<210>395
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>395
Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>396
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>396
Gln Gln Leu Tyr Ser Tyr Pro His Leu Thr
1               5                   10
<210>397
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>397
Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Arg Trp Thr
1               5                   10
<210>398
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>398
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Met Ser Thr
1               5                   10
<210>399
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>399
Gln Gln Arg Ser Glu Trp Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>400
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>400
Gln Gln Tyr Asp Thr Ser Pro Ala Trp Thr
1               5                   10
<210>401
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>401
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Gln Gly Phe Thr
1               5                   10
<210>402
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>402
Met Gln Ser Ile Gln Leu Pro Arg Trp Thr
1               5                   10
<210>403
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>403
Gln His Tyr Gly Leu Ser Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>404
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>404
Gln Glu Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Arg Thr
1               5                   10
<210>405
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>405
Ser Ser Tyr Arg Ser Ser Ser Thr Arg Val
1               5                   10
<210>406
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>406
Gln His Tyr Gly Leu Ser Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>407
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>407
Gln Glu Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Arg Thr
1               5                   10
<210>408
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>408
Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Leu Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>409
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>409
Ser Ser Tyr Ser Ser Thr Thr Arg Val Val
1               5                   10
<210>410
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>410
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Thr Phe
1               5                   10
<210>411
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>411
Phe Cys Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>412
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>412
Leu Gln Arg Ser Asn Trp Gly Glu Val Thr
1               5                   10
<210>413
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>413
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Gly Glu Val Thr
1               5                   10
<210>414
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>414
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Gly Glu Val Thr
1               5                   10
<210>415
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>415
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Phe Thr
1               5                   10
<210>416
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>416
Cys Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Val
1               5                   10
<210>417
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>417
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>418
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>418
Gln Gln Ser Tyr Asn Thr Leu Ser Leu Thr
1               5                   10
<210>419
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>419
Gln His Tyr Gly Asn Ser Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>420
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>420
Gln Gln Ser His Lys Thr Leu Ala Trp Thr
1               5                   10
<210>421
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>421
Met Gln Gly Thr Tyr Trp Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>422
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>422
His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr
1               5                   10
<210>423
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>423
His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr
1               5                   10
<210>424
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>424
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>425
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>425
Gln Gln Ser Tyr Thr Asn Pro Glu Val Thr
1               5                   10
<210>426
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>426
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>427
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>427
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Tyr Thr
1               5                   10
<210>428
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>428
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Tyr Thr
1               5                   10
<210>429
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>未知
<222>(10)..(10)
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>Xaa可为任何天然产生的氨基酸
<400>429
Gln Gln Phe Gly Asn Ser Pro Pro Leu Xaa
1               5                   10
<210>430
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>430
Gln Gln Tyr Ala Gly Ser Pro Pro Val Thr
1               5                   10
<210>431
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>431
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>432
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>432
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>433
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>433
Gln Gln Arg Ser Asn Cys Ser Gly Leu Thr
1               5                   10
<210>434
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>434
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>435
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>435
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>436
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>436
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Cys Thr
1               5                   10
<210>437
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>437
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>438
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>438
Gln Gln Arg Ser Phe Trp Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>439
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>439
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ser Ile Thr
1               5                   10
<210>440
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>440
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>441
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>441
Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Ile Phe Thr
1               5                   10
<210>442
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>442
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Gly Thr
1               5                   10
<210>443
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>443
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>444
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>444
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Thr Trp Thr
1               5                   10
<210>445
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>445
Gln Gln Arg Met Arg Trp Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>446
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>446
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Lys Trp Thr
1               5                   10
<210>447
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>447
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Tyr Thr
1               5                   10
<210>448
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>448
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>449
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>449
Gln Gln Tyr Asp Arg Ser Leu Pro Arg Thr
1               5                   10
<210>450
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>450
Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro Leu Phe Ser
1               5                   10
<210>451
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>451
Gln Gln Tyr Gly Gly Ser Pro Leu Phe Ser
1               5                   10
<210>452
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>452
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Thr Trp Thr
1               5                   10
<210>453
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>453
Met Gln Ala Leu Gln Thr Leu Gly Leu Thr
1               5                   10
<210>454
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>454
Met Gln Ala Leu Gln Thr Leu Gly Leu Thr
1               5                    10
<210>455
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>455
Gln Gln Ser His Ser Ala Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>456
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>456
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Phe Thr
1               5                   10
<210>457
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>457
Gln Gln Tyr Asn Asp Trp Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>458
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>458
Gln Gln Tyr Asn Gly Asn Ser Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>459
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>459
Gln Gln Leu Asn Thr Tyr Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>460
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>460
His Lys Tyr Gly Gly Ser Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>461
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>461
Met Gln Asp Thr His Trp Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>462
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>462
Gln His Tyr Gly Arg Ser Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>463
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>463
Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>464
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>464
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>465
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>465
Gln Gln Tyr Phe Asn Val Pro Pro Val Thr
1               5                   10
<210>466
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>466
Gln His Tyr His Asn Leu Pro Pro Thr Thr
1               5                   10
<210>467
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>467
Ile Gln Gly Thr His Trp Pro Gln Tyr Thr
1               5                   10
<210>468
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>468
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Arg Ala Leu Thr
1               5                   10
<210>469
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>469
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Ser Tyr Thr
1               5                   10
<210>470
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>470
Met Gln Ala Leu Gln Thr Leu Met Cys Ser
1               5                   10
<210>471
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>471
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>472
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>472
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>473
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>473
Gln Gln Tyr Gly Gly Ser Leu Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>474
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>474
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Thr Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>475
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>475
Gln Gln Arg Ser Ser Trp Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>476
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>476
Gln Gln Arg Tyr Ser Trp Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>477
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>477
Gln Gln Arg Tyr Asn Trp Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>478
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>478
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>479
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>479
Gln Gln Arg Ser Ser Trp Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>480
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>480
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>481
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>481
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>482
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>482
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>483
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>483
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>484
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>484
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>485
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>485
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>486
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>486
Gln Gln Arg Ser Ser Trp Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>487
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>487
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Val Thr
1               5                   10
<210>488
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>488
Gln Gln Tyr Asn Thr Asn Ser Pro Ile Ser
1               5                   10
<210>489
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>489
Gln Asn Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Ile Thr
1               5                   10
<210>490
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>490
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>491
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>491
Met Gln Ser Ile Gln Leu Pro Arg Phe Thr
1               5                   10
<210>492
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>492
Met Gln Ser Val Gln Leu Pro Arg Phe Thr
1               5                   10
<210>493
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>493
Met Gln Ser Val Gln Leu Pro Arg Phe Thr
1               5                   10
<210>494
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>494
Gln Gln Tyr Asp Lys Trp Pro Pro Val Thr
1               5                   10
<210>495
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>495
Met Gln Ser Ile Gln Phe Pro Arg Trp Thr
1               5                   10
<210>496
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>496
Met Gln Gly Ile His Leu Pro Pro Tyr Ile
1               5                   10
<210>497
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>497
Asn Gln Gly Thr Gln Trp Leu Leu Tyr Thr
1               5                   10
<210>498
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>498
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ala Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>499
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>499
Gln His Tyr Gly Leu Ser Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>500
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>500
Gln Glu Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Arg Thr
1               5                   10
<210>501
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>501
Gln Gln Tyr Phe Asn Val Pro Pro Val Thr
1               5                   10
<210>502
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>502
Gln Gln Leu Thr Ser Tyr Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>503
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>503
Gln Gln Val Asn Ser Tyr Pro Gly Leu Thr
1               5                   10
<210>504
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>504
Gln Gln Val Phe Ser Tyr Pro Gly Ile Thr
1               5                   10
<210>505
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>505
Gln Gln Tyr Thr Ser Leu Pro Gly Ile Thr
1               5                   10
<210>506
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>506
Gln His Ser Tyr Ser Thr Leu Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>507
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>507
Gln Gln Tyr Tyr Asn Ile Pro Tyr Ile Thr
1               5                   10
<210>508
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>508
Gln Leu Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Val Thr
1               5                   10
<210>509
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>509
Gln Gln Tyr Ala Asn Trp Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
<210>510
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>510
Gln Gln Tyr Asn Ile Ser Pro Arg Asp Thr
1               5                   10
<210>511
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>511
Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro Leu Ile Thr
1               5                   10
<210>512
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>512
Gln Gln Tyr Gly Asp Phe Pro Arg Val Thr
1               5                   10
<210>513
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>513
Gln Gln Tyr Gly Asp Trp Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>514
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>514
Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Trp Thr
1               5                   10
<210>515
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>515
Gln Gln Tyr Asn Lys Trp Pro Pro Leu Thr
1               5                   10
<210>516
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>516
Met Gln Gly Thr His Trp Leu Pro Val Thr
1               5                   10
<210>517
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>517
Gln Gln Tyr Asp Lys Trp Pro Pro Val Thr
1               5                   10
<210>518
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>518
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro Ile His
1               5                   10
<210>519
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>519
Gln Gln Leu Asn Asn Tyr Pro Pro Phe Thr
1               5                   10
<210>520
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>520
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>521
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>521
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Tyr Ser
1               5                   10
<210>522
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>522
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>523
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>523
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Leu Pro Phe Thr
1               5                   10
<210>524
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>524
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Thr Leu Met
1               5                   10
<210>525
<211>22
<212>PRT
<213>人类
<400>525
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys
            20
<210>526
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>526
Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser
1               5                   10
<210>527
<211>6
<212>PRT
<213>人类
<400>527
Phe Ser Asn His Trp Met
1               5
<210>528
<211>18
<212>PRT
<213>人类
<400>528
His Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
1               5                   10                  15
Val Ala
<210>529
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>529
Ile Arg Ser Lys Ser
1               5
<210>530
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>530
Ala Thr His Tyr Ala
1               5
<210>531
<211>15
<212>PRT
<213>人类
<400>531
His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
1               5                   10                  15
<210>532
<211>12
<212>PRT
<213>人类
<400>532
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
1               5                   10
<210>533
<211>6
<212>PRT
<213>人类
<400>533
Ile Val Tyr Leu Gln Met
1               5
<210>534
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>534
Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg
1               5
<210>535
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>535
Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
1               5                   10
<210>536
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>536
Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr
1               5
<210>537
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>537
Asn Tyr Tyr Gly Ser
1               5
<210>538
<211>4
<212>PRT
<213>人类
<400>538
Gly Ser Thr Tyr
1
<210>539
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>539
Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
1               5
<210>540
<211>13
<212>PRT
<213>人类
<400>540
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>541
<211>6
<212>PRT
<213>人类
<400>541
Asp Ile Leu Leu Thr Gln
1               5
<210>542
<211>20
<212>PRT
<213>人类
<400>542
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Cys
            20
<210>543
<211>17
<212>PRT
<213>人类
<400>543
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
1               5                   10                  15
Gln
<210>544
<211>4
<212>PRT
<213>人类
<400>544
Val Gly Ser Ser
1
<210>545
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>545
Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys
1               5
<210>546
<211>13
<212>PRT
<213>人类
<400>546
Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys
1               5                   10
<210>547
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>547
Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser
1               5
<210>548
<211>4
<212>PRT
<213>人类
<400>548
Tyr Ala Ser Glu
1
<210>549
<211>21
<212>PRT
<213>人类
<400>549
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
1               5                   10                  15
Ile Asn Ser Leu Glu
            20
<210>550
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>550
Ser Leu Glu Ser Glu Asp Ala Ala
1               5
<210>551
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>551
Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln
1               5
<210>552
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>552
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser
1               5
<210>553
<211>4
<212>PRT
<213>人类
<400>553
His Ser Trp Pro
1
<210>554
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>554
Trp Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr
1               5
<210>555
<211>11
<212>PRT
<213>人类
<400>555
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>556
<211>24
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>引物
<400>556
atgtacaaca ctgtgtcatt taac                                            24
<210>557
<211>30
<212>DNA
<213>人造
<220>
<223>引物
<400>557
ttatttggag cttttaaact taaggatacc                                      30
<210>558
<211>15
<212>PRT
<213>叶子花
<400>558
Ala Lys Val Asp Arg Lys Asp Leu Glu Leu Gly Val Tyr Lys Leu
1               5                   10                  15
<210>559
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>559
Ala Ala Lys Ala Asp
1               5
<210>560
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>560
Ala Lys Ala Asp Arg
1               5
<210>561
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>561
Lys Ala Asp Arg Lys
1               5
<210>562
<211>6
<212>PRT
<213>人类
<400>562
Ala Ala Lys Ser Asp Arg
1               5
<210>563
<211>6
<212>PRT
<213>人类
<400>563
Lys Ser Asp Arg Lys Asp
1               5
<210>564
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>564
Ala Ala Lys Thr Asp
1               5
<210>565
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>565
Ala Lys Thr Asp Arg
1               5
<210>566
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>566
Lys Thr Asp Arg Lys
1               5
<210>567
<211>15
<212>PRT
<213>叶子花
<400>567
Leu Gly Val Tyr Lys Leu Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly
1               5                   10                  15
<210>568
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>568
Glu Leu Gly Pro Gln
1               5
<210>569
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>569
Leu Gly Pro Gln Lys
1               5
<210>570
<211>6
<212>PRT
<213>人类
<400>570
Gly Pro Gln Lys Leu Glu
1               5
<210>571
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>571
Glu Leu Gly Gly Lys
1               5
<210>572
<211>6
<212>PRT
<213>人类
<400>572
Leu Gly Gly Lys Lys Leu
1               5
<210>573
<211>6
<212>PRT
<213>人类
<400>573
Gly Gly Lys Lys Leu Glu
1               5
<210>574
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>574
Glu Leu Gly Asn Ser
1               5
<210>575
<211>6
<212>PRT
<213>人类
<400>575
Leu Gly Asn Ser Lys Leu
1               5
<210>576
<211>6
<212>PRT
<213>人类
<400>576
Gly Asn Ser Lys Leu Glu
1               5
<210>577
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>577
Glu Leu Gly Gln Ala Lys Leu
1               5
<210>578
<211>7
<212>PRT
<213>人类
<400>578
Leu Gly Gln Ala Lys Leu Glu
1               5
<210>579
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>579
Glu Leu Gly Gln Asp
1               5
<210>580
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>580
Leu Gly Gln Asp Lys
1               5
<210>581
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>581
Gln Asp Lys Leu Glu
1               5
<210>582
<211>15
<212>PRT
<213>叶子花
<400>582
Asn Gly Gln Glu Ile Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile Gln Met
1               5                   10                  15
<210>583
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>583
Gly Gln Glu Gln Ala
1               5
<210>584
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>584
Gln Glu Gln Ala Lys
1               5
<210>585
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>585
Glu Gln Ala Lys Phe
1               5
<210>586
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>586
Gly Gln Glu Arg Ala
1               5
<210>587
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>587
Gln Glu Arg Ala Lys
1               5
<210>588
<211>5
<212>PRT
<213>人类
<400>588
Glu Arg Ala Lys Phe
1               5
<210>589
<211>15
<212>PRT
<213>医蛭
<400>589
Cys Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly
1               5                   10                  15
<210>590
<211>4
<212>PRT
<213>人类
<400>590
Lys Cys Arg His
1
<210>591
<211>15
<212>PRT
<213>人造
<220>
<223>修饰肽
<400>591
Cys Arg His Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly
1               5                   10                  15
<210>592
<211>20
<212>PRT
<213>人类
<400>592
Gly Gly Ser Asn Asn Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Asn
1               5                   10                  15
Asn Gly Gly Ser
            20
<210>593
<211>120
<212>PRT
<213>人类
<400>593
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>594
<211>108
<212>PRT
<213>人类
<400>594
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>595
<211>121
<212>PRT
<213>人类
<400>595
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ser Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Tyr Met Ser Asn Val Gly Ala Ile Thr Asp Tyr Pro Asp Thr Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Thr Arg Asp Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Ala Val Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>596
<211>112
<212>PRT
<213>人类
<400>596
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Arg Ile Val His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
                85                  90                  95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
            100                 105                 110
<210>597
<211>120
<212>PRT
<213>人类
<400>597
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
            20                  25                  30
Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Val Ala Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>598
<211>111
<212>PRT
<213>人类
<400>598
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
            20                  25                  30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
        35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
    50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
                85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>599
<211>192
<212>PRT
<213>人类
<400>599
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Met Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn His
            20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65                  70                  75                  80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asp Leu Lys Thr Glu Asp Thr Gly Val Glu
                85                  90                  95
Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
            100                 105                 110
Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His Trp
        115                 120                 125
Met Asn Trp Tyr Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
    130                 135                 140
Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser
145                 150                 155                 160
Val Lys Gly Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala
                165                 170                 175
Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr
            180                 185                 190
<210>600
<211>200
<212>PRT
<213>人类
<400>600
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ile Gln Ser Val Thr Pro Lys
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Phe Gly Ser Ser Ile
            20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys
        35                  40                  45
Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                 55                   60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ser Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val
            100                 105                 110
Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val
        115                 120                 125
Gly Ser Ser Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg
    130                 135                 140
Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg
145                 150                 155                 160
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr
                165                 170                 175
Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser
            180                 185                 190
Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly
        195                 200

Claims (36)

1.一种修饰抗体或其抗原结合片段，其中所述修饰抗体或抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区各自由来自一种或多种其他抗体或抗原结合片段的两个或多个氨基酸序列片段组成，从而所述片段既不是完整的CDR也不是完整的框架区。
2.如权利要求1所述的修饰抗体或抗原结合片段，其中所述氨基酸序列片段来自单一物种。
3.如权利要求2所述的修饰抗体或抗原结合片段，其中所述氨基酸序列片段是人类的。
4.如权利要求1至3的任一项所述的修饰抗体或抗原结合片段，其中各框架区包括两个或多个片段，和/或各CDR包括两个或多个片段。
5.一种具有改进的结合亲和力的修饰抗体或抗原结合片段，其具有插入可变区的一个或多个氨基酸序列片段。
6.如权利要求5所述的修饰抗体或抗原结合片段，其中所述插入的氨基酸序列片段是人类的。
7.如权利要求1至6的任一项所述的修饰抗体或抗原结合片段，其中通过在一个或多个可变区中插入一个或多个氨基酸序列片段而除去一个或多个T细胞表位。
8.如权利要求7所述的修饰抗体或抗原结合片段，其中所述一个或多个插入的氨基酸序列片段是人类的。
9.如权利要求1至8的任一项所述的修饰抗体或抗原结合片段，其含有一个或多个编码抑制免疫反应的调节T细胞表位的片段。
10.如权利要求1至9的任一项所述的修饰抗体或抗原结合片段，其是抗HER2抗体、抗Lewis Y抗原抗体、抗IgE抗体或抗TNF抗体。
11.一种修饰蛋白质，其通过一个或多个氨基酸序列片段的插入而具有改进的免疫原性。
12.如权利要求11所述的修饰蛋白质，其中所述插入的氨基酸序列片段是人类的。
13.如权利要求11或12所述的修饰蛋白质，其中通过一个或多个氨基酸序列片段的插入而除去一个或多个T细胞表位。
14.如权利要求11至13的任一项所述的修饰蛋白质，其含有一个或多个编码抑制免疫反应的调节T细胞表位的片段。
15.如权利要求11至14的任一项所述的修饰蛋白质，其是经修饰的I型核糖体抑制蛋白或经修饰的水蛭素。
16.如权利要求1至15的任一项所述的修饰抗体、抗原结合片段或蛋白质，其中初始的抗体或蛋白质是非人类来源的。
17.如权利要求16所述的修饰抗体或抗原结合片段，其中所述初始抗体是小鼠抗体。
18.如权利要求1至17的任一项所述的修饰抗体，其中所述修饰抗体的全部V区是人类来源的。
19.一种药物制剂，其包含如权利要求1至18的任一项所述的修饰抗体、抗原结合片段或蛋白质，及任选一种或多种药学可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
20.一种用于生成修饰抗体的方法，其包括步骤：
(1)通过组合来自一系列其他抗体可变区的氨基酸序列片段来制备抗体可变区基因，以生成不同可变区基因文库；
(2)将所述抗体可变区基因文库克隆入表达载体；
(3)筛选所述抗体可变区文库并回收具有期望性质的所述文库成员。
21.一种用于生成修饰抗体的方法，其包括步骤：
(1)通过组合来自一系列其他抗体可变区的氨基酸序列片段来制备抗体可变区基因以生成不同可变区基因文库，所述其他抗体可变区包括来自一种或多种具有期望性质的参考抗体的期望的氨基酸；
(2)将所述抗体可变区基因文库克隆入表达载体；
(3)筛选所述抗体可变区文库并回收具有期望性质的所述文库成员。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述氨基酸序列片段来自单一物种。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述氨基酸序列片段是人类的。
24.如权利要求20至23的任一项所述的方法，其中所述抗体可变区由衍生自两个或多个片段的框架区和/或衍生自两个或多个片段的CDR组成。
25.如权利要求20至24的任一项所述的方法，其中通过置换一个或多个氨基酸序列片段进入所述可变区来进一步改变从所述文库回收的所述一个或多个成员。
26.如权利要求20至25的任一项所述的方法，其中通过置换一个或多个氨基酸序列片段以减少或除去T细胞表位，来进一步改变从所述文库回收的所述一个或多个成员。
27.如权利要求20至26的任一项所述的方法，其中通过插入或添加一个或多个抑制免疫反应的调节T细胞表位来进一步改变从所述文库回收的所述一个或多个成员。
28.一种用于生成修饰蛋白质的方法，其包括步骤：
(1)通过组合来自一系列其他蛋白质的氨基酸序列片段来制备蛋白质基因以生成不同蛋白质基因文库，所述其他蛋白质包括来自一种或多种具有期望性质的参考蛋白质的期望的氨基酸；
(2)将所述蛋白质基因文库克隆入表达载体；
(3)筛选所述蛋白质基因文库并回收具有期望性质的所述文库成员。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述氨基酸序列片段来自单一物种。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述氨基酸序列片段是人类的。
31.如权利要求28至30的任一项所述的方法，其中通过置换一个或多个氨基酸序列片段进入所述可变区来进一步改变从所述文库回收的一个或多个成员。
32.如权利要求28至29的任一项所述的方法，其中通过置换一个或多个氨基酸序列片段以减少或除去T细胞表位，来进一步改变从所述文库回收的一个或多个成员。
33.如权利要求28至32的任一项所述的方法，其中通过插入或添加一个或多个抑制免疫反应的调节T细胞表位来进一步改变从所述文库回收的一个或多个成员。
34.一种用于生成具有改进的性质的修饰抗体或蛋白质的方法，其包括步骤：
(1)通过用来自其他抗体和蛋白质的可选片段置换现有氨基酸序列片段来制备抗体基因或蛋白质基因，以生成不同的抗体基因文库或蛋白质基因文库；
(2)将所述抗体基因文库或蛋白质基因文库克隆入表达载体；
(3)筛选所述抗体文库或蛋白质文库，并回收具有改进性质的所述文库成员。
35.如权利要求20至34的任一项所述的方法，其中所述待修饰的抗体是非人类抗体。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述待修饰的抗体是小鼠抗体。
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