CN105688209A - 新的抗-cMET抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的抗-cMET抗体，其能够以配体依赖和配体非依赖的方式特异地结合人c-Met受体和/或能够特异地抑制受体的酪氨酸激酶活性的新的二价抗体，以及编码抗体的氨基酸和核酸序列。抗体包括修饰的铰链区，并展示改善的拮抗剂活性。本发明的抗体能够抑制c-Met二聚化。还包括抗体作为预防和/或治疗癌症的药物的用途，用于以配体非依赖激活的c-Met为特征的癌症，或者与受体过度表达相关的病理，还涉及与c-Met过度表达相关疾病诊断的方法或试剂盒。

Description

新的抗-cMET抗体
本申请是申请号为201180035181.6，申请日为2011年6月1日，发明名称为“新的抗-cMET抗体”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及新的能够优选以配体依赖和配体非依赖形式特异性结合人c-Met受体和/或能够特异性抑制所述受体的酪氨酸激酶活性的二价抗体，以及编码所述抗体的氨基酸和核酸序列。更优选地，所述抗体包括修饰的铰链区并表现出改善的拮抗剂活性。更特别地，根据本发明的抗体能够抑制c-Met二聚化。本发明同样包括所述抗体作为癌症(优选特征在于c-Met的配体非依赖激活的癌症)或与所述受体的过度表达相关的任何病状的预防和/或治疗处理的药物的用途，以及用于与c-Met过度表达相关疾病的诊断的方法或试剂盒中的用途。本发明最后涉及包含这些抗体以及针对涉及肿瘤进展或转移的其他生长因子的其他抗体和/或化学化合物和/或化合物和/或抗癌剂或与毒素偶联的药剂的产品和/或组合物，及其用于特定癌症的预防和/或治疗的用途。
背景技术
受体酪氨酸激酶(RTK)靶向药剂，如曲妥珠单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、伊马替尼和吉非替尼抑制剂已经说明了将该蛋白类别用于选定癌症治疗的兴趣。
c-Met是还包括RON和SEA的RTK亚家族的原型成员。c-MetRTK家族在结构上不同于其他RTK家族，并且是唯一已知的肝细胞生长因子(HGF)(也称为散射因子(SF))的高亲和性受体[D.P.Bottaro等，Science1991，251:802-804；L.Naldini等，Eur.Mol.Biol.Org.J.1991，10:2867-2878]。c-Met和HGF在各种组织中广泛表达，并且它们的表达通常分别限于上皮和间叶来源的细胞[M.F.DiRenzo等，Oncogene1991，6:1997-2003；E.Sonnenberg等，J.Cell.Biol.1993，123:223-235]。它们都是正常的哺乳动物发育所需的，并且已经显示出在细胞迁移、形态分化和三维管构造的组织以及生长和血管生成中特别重要[F.Baldt等，Nature1995，376:768-771；C.Schmidt等，Nature.1995:373:699-702；Tsarfaty等，Science1994，263:98-101]。c-Met和HGF的受控调节已经显示出在哺乳动物发育、组织维持和修复中是重要的[NagayamaT.，NagayamaM.，KoharaS.，KamiguchiH.，ShibuyaM.，KatohY.，ItohJ.，ShinoharaY.，BrainRes.2004，5；999(2):155-66；TaharaY.，IdoA.，YamamotoS.，MiyataY.，UtoH.，HoriT.，HayashiK.，TsubouchiH.，JPharmacolExpTher.2003，307(1):146-51]，它们的调节异常涉及癌症的进展。
由c-Met的不当激活驱动的异常信号是在人癌症中观察到的最常见的变化之一并且在肿瘤发生和转移中起着关键作用[Birchmeier等，Nat.Rev.Mol.CellBiol.2003，4:915-925；L.Trusolino和ComoglioP.M.，NatRev.Cancer.2002，2(4):289-300]。
不当的c-Met激活可能由配体-依赖性和非依赖机制引起，其包括c-Met的过度表达和/或旁分泌或自分泌激活，或通过功能突变获得[J.G.Christensen，BurrowsJ.和SalgiaR.，CancerLatters.2005，226:1-26]。然而，在配体的存在或不存在下，c-Met受体的低聚是调节激酶对ATP和含酪氨酸的肽底物的结合亲和性和结合动力学所需的[HaysJL，WatowichSJ，Biochemistry，2004年8月17日，43:10570-8]。激活的c-Met募集信号效应物至其位于细胞质结构域中的多坞(multidocking)位点，导致几个关键信号途径的激活，包括Ras-MAPK、PI3K、Src和Stat3[GaoCF，VandeWoudeGF，CellRes.2005，15(1):49-51；FurgeKA，ZhangYW，VandeWoudeGF，Oncogene.2000，19(49):5582-9]。这些途径对于肿瘤细胞增殖、入侵和血管生成以及对于避免凋亡是必需的[FurgeKA，ZhangYW，VandeWoudeGF，Oncogene，2000，19(49):5582-9，GuH.，NeelBG，TrendsCellBiol.2003Mar，13(3):122-30，FanS.，MaYX，WangJA，YuanRQ，MengQ.，CaoY.，LaterraJJ，GoldbergID，RosenEM，Oncogene.2000年4月27日，19(18):2212-23]。此外，c-Met信号相对于其他RTK的独特方面是所报道的与焦点粘连复合物和非激酶结合伴侣的相互作用，非酶结合伴侣如α6β4整联蛋白[TrusolinoL.，BertottiA.，ComoglioPM，Cell.2001，107:643-54]、CD44v6[VanderVoortR.，TaherTE，WielengaVJ，SpaargarenM.，PrevoR.，SmitL.，DavidG.，HartmannG.，GherardiE.，PalsST，J.Biol.Chem.1999，274(10):6499-506]、丛蛋白B1或脑信号蛋白(semaphorin)[GiordanoS.，CorsoS.，ConrottoP.，ArtigianiS.，GilestroG.，BarberisD.，TamagnoneL.，ComoglioPM，NatCellBiol.2002，4(9):720-4；ConrottoP.，ValdembriD.，CorsoS.，SeriniG.，TamagnoneL.，ComoglioPM，BussolinoF.，GiordanoS.，Blood.2005，105(11):4321-9；ConrottoP.，CorsoS.，GamberiniS.，ComoglioPM，GiordanoS.，Oncogene.2004，23:5131-7]，其可以进一步增加这种受体对细胞功能调节的复杂性。最后，近期的数据证明c-Met可能涉及对吉非替尼或埃罗替尼的肿瘤抗性，表明同时靶向EGFR和c-Met的化合物的组合可能是非常令人感兴趣的[EngelmanJA等，Science，2007，316:1039-43]。
在过去的一些年中，已经研发了许多不同策略来削弱癌细胞系中的c-Met信号。这些策略包括i)中和对抗c-Met或HGF/SF的抗体[CaoB.，SuY.，OskarssonM.，ZhaoP.，KortEJ，FisherRJ，WangLM，VandeWoudeGF，ProcNatlAcadSciUSA.2001，98(13):7443-8；MartensT.，SchmidtNO，EckerichC，FillbrandtR.，MerchantM.，SchwallR.，WestphalM.，LamszusK.，ClinCancerRes.2006，12(20):6144-52]或使用HGF/SF拮抗剂NK4，以防止配体结合c-Met[KubaK.，MatsumotoK.，DateK.，ShimuraH.，TanakaM.，NakamuraT.，CancerRes.，2000，60:6737-43]，ii)阻断激酶活性的c-Met的小ATP结合位点抑制剂[ChristensenJG，SchreckR.，BurrowsJ.，KurugantiP.，ChanE,LeP.，ChenJ.，WangX.，RuslimL.，BlakeR.，LipsonKE，RamphalJ.，DoS.，CuiJJ，CherringtonJM，MendelDB，CancerRes.2003,63:7345-55]，iii)干扰接近多坞位点的工程化SH2结构域多肽和降低受体或配体表达的RNAi或核酶。这些方法中的大部分显示出c-Met的选择性抑制，这导致肿瘤抑制，并显示出c-Met对于癌症中的治疗干预是令人感兴趣的。
在对于c-Met靶向产生的分子内，一些是抗体。最广泛描述的是由Genentech产生的抗-c-Met5D5抗体[WO96/38557]，其在各种模型中单独加入时，表现为有效的激动剂，并且用作Fab片段时，表现为拮抗剂。描述为一臂5D5(OA5D5)并作为重组蛋白在大肠杆菌中产生的该抗体的单价工程化形式也是Genentech专利申请的主题[WO2006/015371]。然而，因为其特别的支架而不能认为是抗体的这种分子也展示出在人体中可能是免疫原性的突变。就活性而言，这种未糖基化的分子缺乏效应物功能，并且最后，没有明显的数据证明OA5D5抑制c-Met的二聚化。此外，在体内模型中在G55中测试时，G55是表达c-Met但不表达HGFmRNA和蛋白并且与配体无关地生长的成胶质细胞瘤细胞系，一臂抗-c-Met对G55肿瘤生长没有明显作用，表明OA5D5主要通过阻断HGF结合起作用，并且不能够靶向与HGF无关的被激活的肿瘤[MartensT.等，Clin.CancerRes.，2006，12(20):6144-6152]。
另一种靶向c-Met的抗体由Pfizer描述为“主要作为c-Met拮抗剂作用的抗体，并且在一些情况中，作为c-Met激动剂”[WO2005/016382]。在该申请中没有描述显示出Pfizer抗体在c-Met二聚化中的任何作用的数据。
发明内容
本发明的创造性方面之一是生产没有内在激动剂活性并抑制c-Met二聚化的嵌合和/或人源化单克隆抗体。更特别地，本发明的一个创造性方面是生产具有拮抗剂活性并抑制c-Met二聚化的嵌合和/或人源化单克隆抗体。
除了靶向配体-依赖性肿瘤，该方法还将削弱c-Met的配体非依赖激活，这种激活是由于胞内结构域的过度表达或突变引起的，该胞内结构域对于信号仍然依赖于低聚化。该抗体活性的另一个方面立体地阻碍c-Met与其伴侣相互作用，从而导致c-Met功能削弱。将抗体优选但不限于人源化和工程化为人IgG1，以获得除与c-Met受体的特定阻断相关的功能以外的效应物功能，如ADCC和CDC。
令人惊讶地，第一次，发明人设法生成了能够结合c-Met而且还能够抑制c-Met二聚化的嵌合和/或人源化单克隆拮抗剂抗体，所述单克隆抗体是二价的，这与现有的针对c-Met的拮抗剂抗体相反。在现有技术中，如果是真实的，有时候表明能够抑制c-Met与其伴侣二聚化的抗体是令人感兴趣的，但从未公开过，或清楚地表明能够进行这些的抗体。此外，关于抗体特异性，根本没有证据成功地产生了这样的活性二价抗体。
如之前所解释的，c-Met二聚化的抑制是本发明的重要方面，因为这些抗体将呈现出真实的对较大患者群的兴趣。通过本发明的方法产生的抗体不仅可以治疗配体依赖性激活的c-Met癌症，因为其是直至本发明的情况，而且还可以治疗配体非依赖激活的c-Met癌症。
通过对同时表达c-Met-RLuc/c-Met-YFP的细胞的BRET分析来评价抗体，并选择它们抑制至少40％，优选45％、50％、55％和最优选60％的BRET信号的能力。
BRET技术已知为代表性的蛋白二聚化[Angers等，PNAS，2000，97:3684-89]。
BRET技术是本领域技术人员公知的，并将在一些实施例中详述。更特别地，BRET(生物发光共振能量转移)是在生物发光供体(Renilla荧光酶(Rluc))和荧光受体(GFP(绿色荧光蛋白)或YFP(黄色荧光蛋白)的突变体)之间发生的非放射性能量转移。在本发明的情况中，使用了EYFP(增强的黄色荧光蛋白)。转移的效率取决于方向以及供体和受体之间的距离。然后，只有两个分子非常近(1-10nm)，才会发生能量转移。将这种特性用于产生蛋白-蛋白相互作用试验。实际上，为了研究两个伴侣之间的相互作用，通常将第一个与Renilla荧光酶融合，而将第二个于GFP的黄色突变体融合。融合蛋白通常但不必须在哺乳动物细胞中表达。在其膜渗透性底物(腔肠素(coelenterazine))存在下，Rluc发射出蓝光。如果GFP突变体离开Rluc近于10nm，将发生能量转移，并且可检测到另外的黄色信号。作为受体发射的光和供体发射的光之间的比例来测量BRET信号。因此，随着两个融合蛋白变近，或如果构象变化使得Rluc和GFP突变体更近，BRET信号将增加。
如果BRET分析存在于优选的实施方案中，本领域技术人员已知的任何方法可以用来测量c-Met二聚化。没有限制，可以提及以下的技术：FRET(荧光共振能量转移)、HTRF(均相时间分辨荧光)、FLIM(荧光寿命成像显微镜)或SW-FCCS单波长荧光交叉相关光谱学)。
也可以使用其他传统技术，如共同免疫沉淀、α筛选、化学交联、双杂交、亲和性色谱、ELISA或Far蛋白印迹。
术语“一种抗体”、“多种抗体”或“免疫球蛋白”以最宽意思互换使用，并且包括单克隆抗体(例如，全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体或多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们呈现出所需的生物活性)。
更特别地，这样的分子由糖蛋白组成，所述糖蛋白包含通过二硫键链间连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链。每个重链由重链可变区(或结构域)(在此缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区(在此缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成超可变性区，称为互补性决定区(CDR)，散布更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以以下顺序从氨基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和典型补体系统的第一成分(Clq)。
免疫球蛋白的重链可以分成三个功能区：Fd区、铰链区和Fc区(可结晶片段)。Fd区包含VH和CH1结构域，并且结合轻链，形成Fab—抗原结合片段。Fc片段负责免疫球蛋白效应物功能，其包括，例如，补体固定和结合效应物细胞的同源Fc受体。在IgG、IgA和IgD免疫球蛋白类别中发现的铰链区作为柔性间隔物，使Fab部分在相对于Fc区的空间中自由移动。铰链结构域在结构上是多变的，在免疫球蛋白类别和亚类中的序列和长度都有变化。
根据结晶研究，免疫球蛋白铰链区可以在结构和功能上进一步细分成三个区：上铰链、核心和下铰链(Shin等，ImmunologicalReviews130:87，1992)。上铰链包括从CH1羧基端至限制运动的铰链中第一个残基的氨基酸，通常为两个重链之间形成链间二硫键的第一个半胱氨酸残基。上铰链区的长度与抗体的片段柔性相关。核心铰链区含有重链间二硫桥键。下铰链区连接CH2结构域的氨基端，并包括CH2结构域中的残基。人IgG1的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，其通过二硫键形成二聚化时，形成环八肽，认为这作为枢轴，由此给予柔性。由免疫球蛋白铰链区多肽序列的结构和柔性产生的构象变化可能影响抗体Fc部分的效应物功能。
术语“单克隆抗体”根据其通常的意思来使用，并且表示从基本上同源的抗体群获得的抗体，即，构成群的单独抗体是相同的，除了可能少量存在的天然产生的突变。换句话说，单克隆抗体是从单个细胞克隆(例如，杂交瘤细胞、用编码同源抗体的DNA转染的真核宿主细胞、用编码同源抗体的DNA转化的原核宿主细胞等)的增殖产生的同源抗体组成，并且通常特征在于单个类别和亚类的重链以及单种类型的轻链。单克隆抗体是高度特异性的，针对单种抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇或表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。
在本发明的描述中，术语与抗体化合物或其序列相连的多肽、多肽序列、氨基酸序列、肽和蛋白质可互换。
本发明涉及能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，并且包含重链和轻链，重链包含各自具有氨基酸序列SEQIDNo.1、2和3或与序列SEQIDNO.1、2和3最佳比对后具有至少80％同一性的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；轻链包含各自具有氨基酸序列SEQIDNo.5、6和7或与序列SEQIDNO.5、6和7最佳比对后具有至少80％同一性的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述抗体进一步的特征在于其还包含铰链区，铰链区包含氨基酸序列SEQIDNo.56。
在一个优选的实施方式中，本发明涉及能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体、或其二价功能片段或衍生物，用于预防或治疗需要其的患有以配体非依赖激活的c-Met为特征的癌症的病人的用途，优选癌症进一步以c-Met的过度表达为特征，所述c-Met的过度表达更优选来自c-Met的基因扩增，且，还更优选地，导致c-Met的配体非依赖激活；
所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含分别具有氨基酸序列SEQIDNO:1、2和3的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；所述轻链包含分别具有氨基酸序列SEQIDNO:5、6和7的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述抗体进一步包含包含氨基酸序列SEQIDNO:56的铰链区。
在一个方面，本发明包括用于预防或治疗需要其的患有以配体非依赖激活的c-Met为特征的癌症的病人的方法，优选癌症进一步以c-Met的过度表达为特征，所述c-Met的过度表达更优选来自c-Met的基因扩增，且，还更优选地，导致c-Met的配体非依赖激活，所述方法包括投与包含能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体、或其二价功能片段或衍生物的组合物的步骤，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含分别具有氨基酸序列SEQIDNO:1、2和3的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；所述轻链包含分别具有氨基酸序列SEQIDNO:5、6和7的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述抗体进一步包含包含氨基酸序列SEQIDNO:56的铰链区。
在这个特别的方面，以及在一个更优选的实施方案中，以配体非依赖激活的c-Met为特征的所述癌症，优选地进一步以c-Met的过度表达为特征的、更优选地来自c-Met的基因扩增、且、还更优选地、导致c-Met的配体非依赖激活的所述癌症，选自肾细胞癌和胃癌。
更特别地，本发明涉及如上所述的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于所述铰链区包含氨基酸序列SEQIDNo.57。
换句话说，本发明涉及能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，并且包含重链和轻链，重链包含各自具有氨基酸序列SEQIDNo.1、2和3或与序列SEQIDNO.1、2和3最佳比对后具有至少80％同一性的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；轻链包含各自具有氨基酸序列SEQIDNo.5、6和7或与序列SEQIDNO.5、6和7最佳比对后具有至少80％同一性的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述抗体进一步的特征在于其还包含铰链区，铰链区包含氨基酸序列SEQIDNo.57。
更特别地，本发明涉及如上所述的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于还包含铰链区，铰链区包含氨基酸序列SEQIDNo.21。
换句话说，本发明涉及能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，并且包含重链和轻链，重链包含各自具有氨基酸序列SEQIDNo.1、2和3或与序列SEQIDNO.1、2和3最佳比对后具有至少80％同一性的序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；轻链包含各自具有氨基酸序列SEQIDNo.5、6和7或与序列SEQIDNO.5、6和7最佳比对后具有至少80％同一性的序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述抗体进一步的特征在于其还包含铰链区，铰链区包含氨基酸序列SEQIDNo.21。
如本领域技术人员将清楚的，共有序列(consensussequence)SEQIDNo.57和21包含在共有序列SEQIDNo.56中。
表1
对于SEQIDNo.56：
表述“功能性片段和衍生物”将在之后的本发明说明书中详细限定。
如通过IMGT限定的,CDR区或CDR，用来表示免疫球蛋白的重链和轻链的超变区。
无论哪一种抗原受体、链类型或物种,已经限定IMGT独特的编号来比较可变结构域[LefrancM.-P.，ImmunologyToday18,509(1997)；LefrancM.-P.，TheImmunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.-P.，Pommié，C，Ruiz，M.，Giudicelli，V.，Foulquier，E.，Truong，L.，Thouvenin-Contet，V.和Lefranc，Dev.Comp.Immunol，27，55-77(2003)]。在IMGT独特的编号中，保守氨基酸通常具有相同的位置，例如，半胱氨酸23(第一-CYS)、色氨酸41(保守的-TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104(第二-CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT独特的编号提供了框架区的标准化划界(FR1-IMGT：位置1至26，FR2-IMGT：39至55，FR3-IMGT：66至104和FR4-IMGT：118至128)和互补决定区的标准化划界：CDR1-IMGT：27至38，CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117。因为缺口表示未占据的位置，CDR-IMGT长度(显示于括号中并由点分开，例如，[8.8.13])成为关键信息。将IMGT独特的编号用于2D绘图表示中，称为IMGTColliersdePerles[Ruiz，M.和Lefranc，M.-P.，Immunogenetics，53，857-883(2002)；Kaas，Q.和Lefranc，M.-P.，CurrentBioinformatics，2，21-30(2007)]，和用于IMGT/3D结构-DB的3D结构中[Kaas,Q.，Ruiz，M.和Lefranc，M.-P.，TcellreceptorandMHCstructuraldata(T细胞受体和MHC结构数据)，Nucl.Acids.Res.，32，D208-D210(2004)]。
存在三个重链CDR和3个轻链CDR。在此使用术语CDR或CDRs为了根据情况来表示这些区域中的一个或这些区域中的几个或甚至全部，其含有负责通过抗体对其识别的抗原或表位的亲和性而结合的大部分氨基酸残基。
在本发明的意思中，两个核酸或氨基酸序列之间的“同一性百分比”用来表示最佳比对(最优比对)后获得的待比较的两个序列之间的核苷酸或相同的氨基酸残基的百分比，该百分比纯粹是统计学的并且两个序列之间的差异是随机分布的并在其整个长度中。传统上，通过以最优方式比对后比较这些序列来进行两个核酸或氨基酸序列之间的序列比较，所述比较能够通过片段或通过“比较窗口”来进行。除了人工地，可以通过Smith和Waterman(1981)[Ad.App.Math.2:482]的局部同源性算法、通过Neddleman和Wunsch(1970)[J.Mol.Biol.48:443]的局部同源性算法、通过Pearson和Lipman(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444]的相似性研究方法、通过使用这些算法的计算机软件(WisconsinGenetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup，575ScienceDr.，Madison，WI，或通过BLASTN或BLASTP比较软件)来进行用于比较的序列最优比对。
通过比较以最优方式比对的这两个序列来测定两个核酸或氨基酸序列之间的同一性百分比，并且其中相对于这两个序列之间的最优比对的参照序列，待比较的核酸或氨基酸序列可以包含添加或删除。通过测定两个序列之间相同的核苷酸或氨基酸残基的相同位置的数量，将该相同位置的数量除以比较窗口中位置的总数并将所获得的结果乘以100，来计算同一性百分比，以获得这两个序列之间的同一性百分比。
例如，可以使用BLAST程序，“BLAST2序列”(Tatusova等，“Blast2sequences-anewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequences”(Blast2序列-用于比较蛋白和核苷酸序列的新工具)，FEMSMicrobiolLett.174:247-250)，可在站点http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html获得，所用的参数是默认给出的那些(特别是对于参数“开放缺口惩罚”：5，和“延伸缺口惩罚”：2；所选的基质是，例如，由程序提出的基质“BLOSUM62”)，通过程序直接计算待比较的两个序列之间的同一性百分比。
与参照氨基酸序列具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的氨基酸序列，优选对于参照序列具有特定修饰的那些，特别是至少一个氨基酸的删除、添加或置换，平截或延伸。在一个或多个连续或非连续氨基酸置换的情况中，优选其中置换的氨基酸由“等价”氨基酸替代的置换。表述“等价氨基酸”在此针对描述能够用一个基础结构的氨基酸置换的任何氨基酸，然而没有实质性地改变相应抗体的生物活性，并且这将在此后限定，尤其是在实施例中。可以通过依赖于与它们替代的氨基酸的结构同源性或能够进行的不同抗体之间的生物活性的比较试验结果来确定这些等价氨基酸。
例如，提及能够进行的置换的可能性，而没有导致相应修饰的抗体的生物活性的明显改变。
作为非限制性实例，以下的表2给出了能想到的置换可能性，保持了修饰抗体的生物活性。当然，在相同的条件下，反过来的置换也是可能的。
表2
原始残基 置换
Ala(A) Val，Gly，Pro
Arg(R) Lys，His
Asn(N) Gln
Asp(D) Glu
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(G) Asp
Gly(G) Ala
His(H) Arg7 -->
Ile(I) Leu
Leu(L) Ile，Val，Met
Lys(K) Arg
Met(M) Leu
Phe(F) Tyr
Pro(P) Ala
Ser(S) Thr，Cys
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Phe，Trp
Val(V) Leu，Ala
在此必须理解本发明没有涉及天然形式的抗体，也就是说它们不在其天然环境中，但它们已经能够通过纯化从天然来源分离或获得，或通过遗传重组或通过化学合成获得，并且它们然后可以含有非天然的氨基酸，如将继续进一步描述的。
还必须理解，如之前所提及的，本发明更特别地涉及具有拮抗活性的嵌合和/或人源化二价抗体，或任何二价功能性片段或衍生物。现有技术的二价抗体是激动剂或部分激动剂。包括之前所述的修饰铰链，即，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.56、57或21的铰链区的本发明的单克隆抗体是新的，并且呈现出与没有这样修饰的铰链的嵌合或人源化抗体224G11相比提高的拮抗活性的特性，如从以下实施例将明显看出。
与现有技术相反，发明人已经获得了提高的拮抗活性，而没有改变抗体的形式。实际上，在由抗体5D5表示的最接近现有技术中，必需研发抗体的单价片段，以产生拮抗活性。在本申请中，通过使用本发明的铰链，第一次可以获得具有提高拮抗活性的全二价抗体，并且这与通常的知识相反。
在优选的实施方案中，本发明的抗体包含铰链区，其包含选自SEQIDNo.22至28和58至72的氨基酸序列，或在与序列SEQIDNo.22至28和58至72最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
为了更清楚，以下的表3和4重编了本发明的不同优选铰链的氨基酸和核苷酸序列。
表3
表4
根据第一种方法，将通过其重链序列来限定抗体。更特别地，本发明的抗体，或其功能性片段或衍生物之一，特征在于其包含重链，该重链包含至少一个选自包含氨基酸序列SEQIDNo.1至3的CDR的CDR。
提及的序列如下：
SEQIDNo.1：GYIFTAYT
SEQIDNo.2：IKPNNGLA
SEQIDNo.3：ARSEITTEFDY
根据优选的方面，本发明的抗体，或其功能性片段或衍生物之一，包含重链，该重链包含至少一个，优选两个，并且最优选三个选自CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的CDR，其中：
-CDR-H1包含氨基酸序列SEQIDNo.1，
-CDR-H2包含氨基酸序列SEQIDNo.2，
-CDR-H3包含氨基酸序列SEQIDNo.3。
在第二种方法中，现在将通过其轻链序列来限定抗体。更特别地，根据本发明的第二个特定方面，抗体，或其功能性片段或衍生物之一，特征在于其包含轻链，该轻链包含至少一个选自包含氨基酸序列SEQIDNo.5至7的CDR的CDR。
提及的序列如下：
SEQIDNo.5：ESVDSYANSF
SEQIDNo.6：RAS
SEQIDNo.7：QQSKEDPLT
根据另一个优选的方面，本发明的抗体，或其功能性片段或衍生物之一，包含轻链，该轻链包含至少一个，优选两个，并且最优选三个选自CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的CDR，其中：
-CDR-L1包含氨基酸序列SEQIDNo.5，
-CDR-L2包含氨基酸序列SEQIDNo.6，
-CDR-L3包含氨基酸序列SEQIDNo.7。
将能够分泌根据本发明的单克隆抗体的鼠杂交瘤，尤其是鼠来源的杂交瘤，于2007年3月14日依据编号CNCMI-3731(分类命名F50064-020(2bis)-224G11-Cl1A)保藏于法国微生物保藏中心(CNCM)(法国，巴黎市，DocteurRoux路25号，巴斯德研究所，邮箱15，邮政编码F-75724)。
在本申请中，IgG1优选获得效应物功能，最优选ADCC和CDC。
本领域技术人员将认识到效应物功能包括，例如，C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；和细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调。
根据本发明的抗体优选是特异性的单克隆抗体，尤其是鼠、嵌合或人源化来源的，其可以根据本领域技术人员公知的标准方法来获得。
通常，对于单克隆抗体或其功能性片段或衍生物的制备，尤其是鼠来源的，可以参考特别在手册“抗体”中描述的技术(Harlow和Lane，Antibodies:ALaboratoryManual(抗体：实验室手册)，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborNY，pp.726，1988)或Kohler和Milstein所述的从杂交瘤的制备技术(Nature，256:495-497，1975)。
例如，从c-Met或含有由所述根据本发明的单克隆抗体特异性识别的表位的片段之一免疫的动物细胞获得根据本发明的单克隆抗体。尤其是可以根据常用的工作方法生产所述c-Met，或其所述片段之一，通过遗传重组从编码c-Met的cDNA序列中所含的核酸序列开始或通过肽合成从c-Met肽序列中所含的氨基酸序列开始。
例如，根据本发明的单克隆抗体可以在亲和性柱上纯化，在柱上之前已经固定了c-Met或含有由所述根据本发明的单克隆抗体特异性识别的表位的片段之一。更特别地，所述单克隆抗体可以通过蛋白A和/或G的色谱来纯化，接着进行或不进行针对消除残余蛋白污染物以及DNA和LPS的离子交换色谱，本质上接着进行或不进行SepharoseTM凝胶上的排阻色谱，以消除由于二聚体或其他多聚体的存在引起的潜在聚集物。在甚至更优选的方式中，同时或连续使用这些技术的全部。
本发明的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，优选由嵌合抗体组成。
嵌合抗体用来表示含有源自给定物种抗体的天然可变(轻链和重链)区并结合与所述给定物种(例如，鼠、马、兔子、狗、牛、鸡等)异源物种的抗体的轻链和重链恒定区的抗体。
可以通过使用遗传重组技术来制备根据本发明的嵌合类型的抗体或其片段。例如，可以通过克隆含有启动子和编码非人(尤其是鼠)可变区的序列、根据本发明的单克隆抗体和编码人抗体恒定区的序列的重组DNA来生产嵌合抗体。通过这样的重组基因编码的本发明的嵌合抗体将是，例如，鼠-人嵌合体，通过源自鼠DNA的可变区来决定该抗体的特异性，并且通过源自人DNA的恒定区来决定其同种型。对于嵌合抗体制备的方法，例如，可以参考文献Verhoeyn等(BioEssays，8:74，1988)、Morrison等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:6851-6855，1984)或US专利No.4,816,567。
更特别地，所述抗体，或其功能性片段或衍生物，包含序列的嵌合重链可变结构域，该序列包含氨基酸序列SEQIDNo.46或与序列SEQIDNo.46最优比对后具有至少80％同一性的序列。
SEQIDNo.46:EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYIFTAYTMHWVRQSLGESLDWIGGIKPNNGLANYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCARSETTEFDYWGQGTALTVSS。
更特别地，所述抗体，或其功能性片段或衍生物，包含序列的嵌合轻链可变结构域，该序列包含氨基酸序列SEQIDNo.47或与序列SEQIDNo.47最优比对后具有至少80％同一性的序列。
SEQIDNo.47：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSmDPLTFGSGTKLEMKR
更特别地，根据本发明并称为[224G11][IgG2chim]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.22的铰链区。
在本申请中，方括号的使用不是必需的，并且作为实例，参考[224G11][IgG2chim]必须认为与224G11IgG2chim相同。以相同的方式，为了表示抗体是鼠抗体，可以增加表述鼠或字母m；为了表示抗体是嵌合抗体，可以增加表述chim或字母c；为了表示抗体是人源化抗体，可以增加表述hum、hz、Hz或字母h。作为实例，嵌合抗体224G1IgG2可以称为c224G11IgG2、c224G11[IgG2]、c[224G11]IgG2、c[224G11][IgG2]、224G11IgG2chim、224G11[IgG2chim]、[224G11]IgG2chim或[224G11][IgG2chim]。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][TH7chim]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.28的铰链区。
在本申请中，必须认为参照TH7与C7Δ6-9或TH7C7Δ6-9相同。符号Δ表示删除。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][MHchim]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.23的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][MUP9Hchim]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.26的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][MMCHchim]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.24的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][C1]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.58的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][C2]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.59的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][C3]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.60的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][C5]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.61的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][C6]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.62的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][C7]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.63的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][C9]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.64的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][Δ1-3]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.65的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][C7Δ6]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.66的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][C6Δ9]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.67的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][C2Δ5-7]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.68的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][C5Δ2-6]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.69的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][C9Δ2-7]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.70的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][Δ5-6-7-8]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.71的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][IgG1/IgG2]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.46的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.47的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.72的铰链区。
本发明的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，优选由人抗体组成。
术语“人抗体”包括具有源自人免疫球蛋白序列的具有一个或多个可变和恒定区的所有抗体。在优选的实施方案中，所有可变和恒定结构域(或区)源自人免疫球蛋白序列(完全人抗体)。换句话说，包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区(如果存在)的任何抗体，即，其具有对应于通过人产生的抗体的氨基酸序列和/或已经使用本领域技术人员已知的用于制备人抗体的任何技术制得的氨基酸序列。
在一个实施方案中，通过杂交瘤产生人单克隆抗体，该杂交瘤包括获自转基因非人动物(例如，转基因鼠)的B细胞，该转基因非人动物具有包含融合永生细胞的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
作为这种转基因鼠的实例，可以提及XENOMOUSETM，其是包含人免疫球蛋白基因座大片段并缺乏鼠抗体生产的工程化鼠株系(Green等，1994，NatureGenetics，7:13-21)。XENOMOUSETM产生全人抗体的成人样人库(repertoire)，并且产生抗原特异性人单克隆抗体。第二代XENOMOUSETM含有大约80％的人抗体库(Green&Jakobovits，1998，J.Exp.Med.，188:483-495)。
本领域技术人员已知的任何其他技术，如噬菌体展示技术，也可以用于产生根据本发明的人抗体。
本发明的抗体，或其二价功能性片段或衍生物，优选由人源化抗体组成。
表述“人源化抗体”用来表示其含有源自非人来源抗体的CDR区的抗体，抗体分子的其他部分源自一个(或几个)人抗体。此外，一些骨架(称为FR)片段的残基可以进行修饰，以保持结合亲和性(Jones等，Nature，321:522-525，1986；Verhoeyen等，Science，239:1534-1536，1988；Riechmann等，Nature，332:323-327，1988)。
可以通过本领域技术人员已知的技术(如，例如，文献Singer等，J.Immun.150:2844-2857，1992；Mountain等，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.，10:1-142，1992；或Bebbington等，Bio/Technology，10:169-175，1992中所述的那些)，来制备根据本发明的人源化抗体或其片段。
其他人源化方法是本领域技术人员已知的，例如，ProteinDesignLab(PDL)在专利申请EP0451261、EP0682040、EP09127、EP0566647或US5,530,101，US6,180,370，US5,585,089和US5,693,761中所述的“CDR嫁接”方法。还可以提及以下专利申请：US5,639,641；US6,054,297；US5,886,152和US5,877,293。
更特别地，所述抗体，或其功能性片段或衍生物，包含序列的人源化重链可变结构域，该序列包含氨基酸序列SEQIDNo.4或与序列SEQIDNo.4最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
SEQIDNo.4：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDYWGQGTLVTVSS
更特别地，所述抗体，或其功能性片段或衍生物，包含人源化轻链可变结构域，其选自包含氨基酸序列SEQIDNo.8、9或10的序列或与序列SEQIDNo.8、9或10最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
SEQIDNo.8:DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKR
SEQIDNo.9:DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKR
SEQIDNo.10:DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKR
更特别地，根据本发明并称为[224G11][IgG2Hz1]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.4的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.8的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.22的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][IgG2Hz2]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.4的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.9的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.22的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][IgG2Hz3]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.4的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.10的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.22的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][TH7Hz1]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.4的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.8的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.28的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][TH7z2]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.4的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.9的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.28的铰链区。
在另一个方面中，根据本发明并称为[224G11][TH7Hz3]的优选抗体，或其二价功能性片段或衍生物，包括包含氨基酸序列SEQIDNo.4的重链可变结构域，包含氨基酸序列SEQIDNo.10的轻链可变结构域和包含氨基酸序列SEQIDNo.28的铰链区。
在另一个方面中，可以分别通过它们的总的重链和轻链来描述本发明的抗体。
例如，本发明的抗体[224G11][IgG2chim]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.50或与序列SEQIDNo.50最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][TH7chim]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.51或与序列SEQIDNo.51最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][C1]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.88或与序列SEQIDNo.88最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][C2]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.89或与序列SEQIDNo.89最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][C3]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.90或与序列SEQIDNo.90最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][C5]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.91或与序列SEQIDNo.91最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][C6]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.92或与序列SEQIDNo.92最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][C7]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.93或与序列SEQIDNo.93最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][C9]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.94或与序列SEQIDNo.94最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][Δ1-3]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.95或与序列SEQIDNo.95最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][C7Δ6]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.96或与序列SEQIDNo.96最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][C6Δ9]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.97或与序列SEQIDNo.97最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][C2Δ5-7]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.98或与序列SEQIDNo.98最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][C5Δ2-6]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.99或与序列SEQIDNo.99最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][C9Δ2-7]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.100或与序列SEQIDNo.100最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][Δ5-6-7-8]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.101或与序列SEQIDNo.101最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][IgG1/IgG2]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.102或与序列SEQIDNo.102最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.52或与序列SEQIDNo.52最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][IgG2Hz1]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.36或与序列SEQIDNo.36最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.38或与序列SEQIDNo.38最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][IgG2Hz2]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.36或与序列SEQIDNo.36最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.39或与序列SEQIDNo.39最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][IgG2Hz3]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.36或与序列SEQIDNo.36最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.40或与序列SEQIDNo.40最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][TH7Hz1]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.37或与序列SEQIDNo.37最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.38或与序列SEQIDNo.38最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][TH7Hz2]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.37或与序列SEQIDNo.37最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.39或与序列SEQIDNo.39最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
作为另一个实例，本发明的抗体[224G11][TH7Hz3]包含完整的重链和完整的轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQIDNo.37或与序列SEQIDNo.37最佳比对后具有至少80％同一性的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQIDNo.40或与序列SEQIDNo.40最佳比对后具有至少80％同一性的序列。
根据本发明的抗体或其衍生物的其他实例包括完整的重链，其包含选自SEQIDNo.88至102的氨基酸序列(对应于SEQIDNo.103至117的核苷酸序列)。
根据本发明的抗体的“功能性片段”，特别用来表示抗体片段，如Fv、scFv(sc表示单链)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或二抗，或其半衰期已经通过化学修饰提高的任何片段，化学修饰如添加聚(烷撑)甘醇，如聚(乙烯)甘醇(“PEG化”)(称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG的PEG化片段)(“PEG”表示聚(乙烯)甘醇)，或通过将具有根据本发明的序列SEQIDNo.1至3和5至7的至少一个特征性CDR的所述片段掺入脂质体中，并且尤其是，因为其能够以一般的方式发挥出产生其的抗体的一致部分活性，如特别是识别并结合c-Met的能力，并且如果需要，抑制c-Met活性的能力。
优选，所述功能性片段将构成或将包含产生其的抗体的重链或轻链可变链的部分序列，对于c-Met，所述部分序列足以保持与产生其的抗体相同的结合特异性和足够的亲和性，优选至少等于产生其的抗体的1/100，在更优选的方式中，等于至少1/10。这样的功能性片段将含有产生其的抗体的序列的至少5个氨基酸，优选6、7、8、9、10、12、15、25、50和100个连续氨基酸。
优选，这些功能性片段将是Fv、scFv、Fab、F(ab’)2、F(ab’)、scFv-Fc类型或二抗的片段，其通常具有与产生其的抗体相同的结合特异性。在本发明的更优选实施方案中，这些片段选自二价片段，如F(ab’)2片段。根据本发明，本发明的抗体片段可以通过如酶消化的方法，如胃蛋白酶和/或木瓜蛋白酶，和/或通过化学还原的二硫桥键的分裂，从如上所述的抗体获得。在另一种方式中，本发明中包含的抗体片段可以通过本领域技术人员同样公知的遗传重组技术来获得，或者通过肽合成获得，例如通过自动化肽合成仪，如AppliedBiosystems等公司供应的那些。
“二价抗体”，必须理解为包含两个臂的任何抗体片段，更特别地，为F(ab’)2片段。
根据本发明的抗体的“衍生物”，意思是包含蛋白支架和至少一个选自原始抗体的CDR的结合蛋白，以维持结合能力。这样的化合物是本领域技术人员公知的，并且将在以下的说明书中更详细地描述。
更特别地，根据本发明的抗体，或其功能性片段或衍生物之一，特征在于所述衍生物为结合蛋白，其包含支架，在支架上已经嫁接了至少一个CDR，为保持原始抗体原位旁(paratopic)识别特性。
本发明中所述的通过6个CDR序列的一个或几个序列可以呈现于蛋白支架上。在这种情况下，蛋白支架复制具有嫁接的CDR适当折叠的蛋白主链，因此使其维持它们的抗原原位旁识别特性。
本领域技术人员已知怎样选择其上可以嫁接至少一个选自原始抗体的CDR的蛋白支架。更特别地，已知待选择的这样的支架应当展示出如下的几个特征(SkerraA.，J.Mol.Recogn.，13，2000，167-187)：
-系统发育上的良好保持，
-强健的结构，具有公知的三维分子构造(如，例如，结晶学或NMR)，
-小尺寸，
-无或仅有低程度的翻译后修饰，
-易于生产、表达和纯化。
这样的蛋白支架可以是，但不限于，选自纤连蛋白(并优选III型第十纤连蛋白结构域(FNfn10))、脂龙蛋白(lipocalin)、安提茶陵(anticalin)(SkerraA.，J.Biotechnol.，2001，74(4):257-75)、来自葡萄球菌蛋白A的结构域B的蛋白Z衍生物、硫氧还蛋白A或具有重复结构域的任何蛋白，重复如，“锚蛋白重复”(Kohl等，PNAS，2003，vol.100，No.4，1700-1705)、“犰狳重复”、“富含亮氨酸重复”或“三四肽重复”结构。
还可以提及来自毒素(如，例如，蝎子、昆虫、植物或软体动物毒素)或神经元一氧化合酶(PIN)的蛋白抑制剂的支架衍生物。
作为这样的杂交构造的非限制性实例，可以提及抗-CD4抗体(即，13B8.2抗体)的CDR-H1(重链)的插入PIN的一个暴露环中。所获得结合蛋白的结合特性保持与原始抗体相似(Bes等，BBRC343，2006，334-344)。还可以提及新制癌菌素环上抗-溶菌酶VHH抗体的CDR-H3(重链)的嫁接(Nicaise等，2004)。
如以上所提及的，这样的蛋白支架可以包含来自原始抗体的1至6个CDR。在优选的实施方案中，但没有任何限制，本领域技术人员将选择至少一个来自重链的CDR，已知所述重链特别涉及抗体特异性。使用已知方法选择目标CDR是本领域技术人员显而易见的(BES等，FEBSletters508，2001，67-74)。
作为证据，这些实例不是限制性的，而且任何其他已知或描述的支架必须包括在本发明的说明书中。
根据新的方面，本发明涉及分离的核酸，特征在于选自以下核酸：
a)编码根据本发明的抗体，或其功能性片段或衍生物之一的核酸、DNA或RNA；
b)包含序列SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13和序列SEQIDNo.15、SEQIDNo.16和SEQIDNo.17的核酸序列；
c)包含序列SEQIDNo.14和SEQIDNo.18、19或20的核酸序列；
d)如b)或c)所限定的核酸相应的RNA核酸；
e)如a)、b)和c)中限定的核酸的互补核酸；和
f)能够在高严谨条件下与序列SEQIDNo.11至13和15至17的至少一个CDR杂交的至少18个核苷酸的核酸。
根据再另一个方面，本发明涉及分离的核酸，其特征在于选自以下的核酸：
-编码根据本发明的抗体，或其功能性片段或衍生物之一的核酸、DNA或RNA，并且其中编码所述抗体铰链区的核酸序列包含或具有选自序列SEQIDNo.29至35和SEQIDNo.73至87的序列。
将在本发明中同等使用的术语核酸、核或核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸序列、核苷酸序列，用来表示核苷酸的精确连接，其是修饰或未修饰的，允许是待限定核酸的片段或区域，含有或不含非天然核苷酸，并且关于所述DNA的转录产物，能够正好对应于双链DNA、单链DNA。
在此还必须理解本发明不涉及在其天然染色体环境中的核苷酸序列，也就是说天然状态的。涉及已经分离和/或纯化的序列，也就是说它们已经得到直接或间接选择，例如，通过拷贝，它们的环境至少已经部分改变。因此，同样意在表示在此通过遗传重组方法获得的分离核酸，例如，通过宿主细胞的遗传重组，或通过化学合成获得。
在高严谨条件下杂交表示以允许维持两个互补DNA片段之间杂交的方式来选择温度条件和离子强度条件。作为说明，对于限定上述多核苷酸片段的目的，高严谨杂交步骤的条件有利地为以下的条件。
以两个步骤来进行DNA-DNA或DNA-RNA杂交：(1)在含有5×SSC(1×SSC对应于0.15MNaCl+0.015M柠檬酸钠溶液)、50％甲酰胺、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、10×Denhardt’s、5％葡聚糖硫酸酯和1％鲑鱼精子DNA的磷酸缓冲液(20mM，pH7.5)中，在42℃下，预杂交3小时；(2)在根据探针大小的温度下实际杂交20小时(即：对于探针大小>100个核苷酸，42℃)，接着在2×SSC+2％SDS中20℃洗涤2次20分钟，在0.1×SSC+0.1％SDS中20℃下洗涤1次20分钟。对于探针大小>100个核苷酸，最后一次洗涤在0.1×SSC+0.1％SDS中60℃下洗涤30分钟。根据Sambrook等的教导(1989，Molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆：实验室手册)，第2版，ColdSpringHarbor)，本领域技术人员可以将上述对于限定大小的多核苷酸的高严谨杂交条件用于更大或更小尺寸的寡核苷酸。
本发明同样涉及包含根据本发明的核酸的载体。
本发明尤其针对含有根据本发明的核苷酸序列的克隆和/或表达载体。
根据本发明的载体优选含有使翻译的核苷酸序列在确定的宿主细胞中表达和/或分泌的要素。因此，载体必须含有启动子、翻译启动和终止信号以及合适的转录调控区。其必须能够以稳定的方式在宿主细胞中维持并可以任选具有特定的信号，该信号指定所翻译蛋白的分泌。本领域技术人员按照所用宿主细胞的功能来选择和优化这些不同的元件。为了这种效果，可以将根据本发明的核苷酸序列插入选定宿主中的自主复制载体中，或是选定宿主的整合载体。
通过本领域技术人员常用的方法来制备这些载体，并且将所得到的克隆通过标准方法引入合适的宿主中，标准方法如脂转染、电穿孔、热冲击或化学方法。
例如，根据本发明的载体是质粒或病毒来源的载体。它们可用于转化宿主细胞，以克隆或表达根据本发明的核苷酸序列。
本发明同样包含通过根据本发明的载体转化的宿主细胞或包含根据本发明的载体的宿主细胞。
宿主细胞可以选自原核或真核系统，例如，细菌细胞，以及酵母细胞或动物细胞，特别是哺乳动物细胞。同样可以使用昆虫细胞或植物细胞。
本发明还涉及除人以外的动物，其包含至少一个根据本发明转化的细胞。
根据另一个方面，本发明的主题是生产根据本发明的抗体、或其功能性片段之一的方法，其特征在于包括以下阶段：
a)在培养基和根据本发明的宿主细胞的合适培养条件下培养；和
b)因此从培养基或所述培养细胞开始生产收集所述抗体、或其功能性片段之一。
根据本发明转化的细胞可以用于根据本发明的重组多肽的制备方法中。制备根据本发明的重组形式的多肽的方法，其特征在于它们使用载体和/或由根据本发明的载体转化的细胞，其自身包括在本发明中。优选，在允许所述多肽表达的条件下培养由根据本发明的载体转化的细胞，并收集所述的重组肽。
如所述的，可以从原核或真核系统选择宿主细胞。特别地，可以鉴定根据本发明的核苷酸序列，促进在该原核或真核系统中的分泌。因此，携带该序列的根据本发明的载体可以有利地用于企图被分泌的重组蛋白的生产。有效地，通过存在于细胞培养物上清液中而不是宿主细胞内部中这一事实，有助于这些目标重组蛋白的纯化。
同样可以通过化学合成来制备根据本发明的多肽。这样的制备方法同样是本发明的主题。本领域技术人员知道化学合成的方法，例如，使用固相的技术[Steward等，1984，Solidphasepeptidesynthesis(固相肽合成)，PierceChem.Company，Rockford，111，第2版，(1984)]或使用部分固相的技术，通过片段缩合或通过溶液中的传统合成。通过化学合成获得并能够含有相应的非天然氨基酸的多肽同样包括在本发明中。
能够通过根据本发明的方法获得的抗体，或其功能性片段或衍生物之一同样包括在本发明中。
本发明还涉及本发明的抗体作为药物。
本发明同样涉及药物组合物，其包含由根据本发明的抗体或其功能性片段组成的化合物作为活性成分，优选与赋形剂和/或药物学上可接受的载体混合。
本发明的另一个补充实施方案为如上所述的组合物，其另外包含抗肿瘤抗体作为联合产品，用于同时、分开或按序使用。
最优选，可以通过抗-IGF-IR、抗-EGFR、抗-HER2/neu、抗-VEGFR、抗-VEGF等抗体或本领域技术人员已知的抗体或任何其他抗肿瘤抗体来选择所述的第二种抗肿瘤抗体。清楚上述抗体的功能性片段或衍生物作为第二种抗体的使用是本发明的一部分。
作为最优选的抗体，选择抗-EGFR抗体，如，例如，抗体C225(Erbitux)。
“同时使用”理解为表示以单一并且相同的药物形式施用根据本发明的组合物的两种化合物。
“分开使用”理解为表示以不同的药物形式同时施用根据本发明的组合物的两种化合物。
“按序使用”理解为表示各自以不同的药物形式连续施用根据本发明的组合物的两种化合物。
以一般的方式，根据本发明的组合物显著提高了癌症治疗的功效。换句话说，通过施用细胞毒性剂以出乎意料地方式增强了根据本发明的抗-c-Met抗体的治疗功效。由根据本发明的组合物产生的另一个主要的随后优势涉及使用较低有效量的活性成分的可能性，这使得避免或降低了出现二次影响的风险，特别是细胞毒性剂的影响。
此外，根据本发明的这种组合物将使得更快地获得预期的治疗效果。
本发明组合物的特征还在于其另外包含细胞毒性/细胞抑制剂作为联合产品，用于同时、分开或按序使用。
“抗癌治疗剂”或“细胞毒性/细胞抑制剂”表示施用于患者时治疗或预防患者体内癌症发展的物质。作为这些物质的非限制性实例，可以提及烷化剂、抗代谢产物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄激素或免疫调节剂。
例如，在2001版的VIDAL中引用了这些物质，在癌学和血液学栏“细胞毒素类”相关化合物专用的那页中，关于该文献引用的这些细胞毒性化合物在此引用为优选的细胞毒性剂。
更特别地，根据本发明，以下物质是优选的。
“烷化剂”指的是可以交联或烷化细胞内任何分子(优选，核酸(例如，DNA))的任何物质。烷化剂的实例包括氮芥，如二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥(chlorambucol)、美法仑、氢氯化物(chlorydrate)、,哌泊溴烷片(pipobromen)、泼尼莫司汀(prednimustin)、焦亚(disodic)-磷酸盐或雌氮芥；oxazophorin(无对应中译文)，如环磷酰胺、六甲蜜胺(altretamine)、曲洛磷胺、硫代异环磷酰胺(sulfofosfamide)或异环磷酰胺；氮丙啶或亚胺-乙烯，如硫替派、三乙胺、altetramine(无对应中译文)、亚硝基脲，如卡氮芥、链脲霉素、佛替姆丁或环己亚硝脲；链烃-磺酸盐，如白消安、曲奥舒凡(treosulfan)或英丙舒凡(improsulfan)；三氮烯类，如氮烯唑胺；或铂复合物，如顺铂、奥克赛铂和卡波铂。
“抗代谢物”指的是通过干扰特定的活性(通常是DNA合成)阻断细胞生长和/或代谢的物质。抗代谢物的实例包括甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、5-氟尿嘧啶脱氧核苷、卡培他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤(6-MP)、6-硫鸟嘌呤(6-TG)、氯脱氧腺苷、5-氮胞苷、吉西他滨(gemcitabine)、克拉屈滨(cladribine)、脱氧柯福霉素和喷司他汀。
“抗肿瘤抗生素”指的是可以防止或抑制DNA、RNA和/或蛋白合成的化合物。抗肿瘤抗生素的实例包括阿霉素、道诺霉素、去甲氧正定霉素、戊柔比星、米托蒽醌、更生霉素、光神霉素、光辉霉素、丝裂霉素C、博来霉素和甲基苄肼。
“有丝分裂抑制剂”阻止细胞周期和有丝分裂的正常进程。通常，微管抑制剂或紫杉烷类(如，紫杉醇和多烯紫杉醇)能够抑制有丝分裂。长春花属生物碱，如长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨也能够抑制有丝分裂。
“染色质功能抑制剂”或“拓扑异构酶抑制剂”指的是抑制染色质建模蛋白(如，拓扑异构酶I或拓扑异构酶II)正常功能的物质。染色质功能抑制剂的实例包括，对于拓扑异构酶I，喜树碱及其衍生物，如托泊替康或伊立替康，对于拓扑异构酶II，依托泊甙、磷酸依托泊甙和替尼泊甙。
“抗血管生成剂”指的是抑制血管生长的任何药物、化合物、物质或药剂。示例性抗血管生成剂包括，但不限于，雷佐生、马立马司他、巴马司他、普啉司他、坦诺司他、伊洛马司他、CGS-27023A、卤夫酮、COL-3、新伐司他、BMS-275291、沙立度胺、CDC501、DMXAA、L-651582、角鲨胺、内皮他丁、SU5416、SU6668、干扰素-α、EMD121974、白细胞间介素-12、IM862、血管生成抑制因子和vitaxin(无对应中译文)。
“抗雌激素”或“抗雌激素”指的是降低、拮抗或抑制雌激素作用的任何物质。抗雌激素剂的实例是他莫西芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、iodoxyfene(无对应中译文)、阿那曲唑、来曲唑和依西美坦。
“抗雄激素”或“抗雄激素剂”指的是降低、拮抗或抑制雄激素作用的任何物质。抗雄激素剂的实例是氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、螺内酯(sprironolactone)、醋酸环丙孕酮、非那雄胺和甲腈咪胍。
“免疫调节剂”是刺激免疫系统的物质。
免疫调节剂的实例包括干扰素、白细胞间介素(如，阿地白细胞间介素、OCT-43、地尼白介素diflitox(无对应中译文)和白细胞间介素-2)、肿瘤坏死因子(如，他索纳明)或其他免疫调节剂，如蘑菇多糖、西索菲兰、罗喹美克、匹多莫德、培加酶、胸腺喷丁、聚I:C或左旋咪唑结合5-氟脲嘧啶。
对于更多的详细内容，本领域技术人员将参考“AssociationdesEnseignantsdeChimieThérapeutique”编辑和标题为“Traitédechimiethérapeutique”的手册，vol.6，Médicamentsantitumorauxetperspectivesdansletraitementdescancers，编辑TEC&DOC，2003的手册。
还可以提及化学剂或细胞毒性剂，所有激酶抑制剂，如，例如，吉非替尼或埃罗替尼。
在特别优选的实施方案中，作为根据本发明的联合产品的所述组合物的特征在于所述细胞毒性剂与所述抗体化学偶联，用于同时使用。
为了促进所述细胞毒性剂和根据本发明的所述抗体之间的偶联，尤其是可以在待偶联的两个化合物之间引入间隔物分子，如聚(烷撑)甘醇，如聚乙二醇，或其他氨基酸，或在另一个实施方案中，使用其中已经引入了能够与根据本发明的所述抗体反应的官能的所述细胞毒性剂的活性衍生物。这些偶联技术是本领域技术人员公知的，并且根据本发明的描述将不会详述。
在另一个方面中，本发明涉及一种组合物，其特征在于所述抗体或其功能性片段或衍生物中的至少一个与细胞毒素和/或放射性元素偶联。
优选，所述毒素或所述放射性元素能够抑制表达c-Met的细胞的至少一种细胞活性，在更优选的方式中，能够防止所述细胞的生长或增殖，尤其是完全灭活所述细胞。
还优选，所述毒素是肠细菌毒素，尤其是假单胞菌外毒素A。
优选与用于治疗的抗体偶联的放射性元素(或放射性同位素)是发射γ射线的放射性同位素，并优选碘131、钇90、金199、钯100、铜67、铋217和锑211。发射β和α射线的放射性同位素同样可以用于治疗。
根据本发明，与至少一个抗体或其功能性片段偶联的毒素或放射性元素，意在表示使所述毒素或所述放射性元素结合所述至少一个抗体的任何方式，尤其是通过两个化合物之间的共价偶联，引入或未引入连接分子。
在使得偶联物的全部或部分成分以化学(共价)、静电或非共价方式结合的试剂中，特别提及苯醌、碳二亚胺，更特别地，EDC(1-乙基-3-[3-二甲基-氨基丙基]-碳二亚胺盐酸盐)、二马来酰亚胺、二硫代二-硝基苯甲酸(DTNB)、N-琥珀酰S-乙酰硫代醋酸酯(SATA)，具有一个或多个与紫外线(U.V.)反应的苯基叠氮化物基团的桥键形成剂，并优选N-[-4-(叠氮水杨氨基)丁基]-3’-(2’-吡啶二硫代)-丙酰胺(APDP)、N-琥珀酰-基3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、6-肼基-烟酰胺(HYNIC)。
偶联的其他形式，尤其是对于放射性元素，可以在于使用双功能离子螯合剂。
在这些螯合物中，可以提及源自EDTA(乙二胺四乙酸)或DTPA(二乙烯三胺戊醋酸)的螯合物，已经将其研发用于结合金属，尤其是放射性金属，和免疫球蛋白。因此，DTPA及其衍生物可以被碳链上的不同基团置换，以提高配体-金属复合物的稳定性和刚性(Krejcarek等，(1977)；Brechbiel等，(1991)；Gansow(1991)；US专利4,831,175)。
例如，二乙烯三胺戊醋酸(DTPA)及其衍生物，其已经以游离形式或与金属离子的复合物形式广泛用于医学和生物学中很长时间，其具有与金属离子形成稳定螯合物和与治疗或诊断目标的蛋白(如，用于研发癌症治疗中的放射性免疫偶联物的抗体)偶联的显著特征(Meases等，1984；Gansow等，1990)。
同样优选，形成根据本发明的所述偶联物的所述至少一个抗体选自功能性片段，尤其是其Fc成分截断的片段，如scFv片段。
在本发明的优选实施方案中，如已经提及的，所述细胞毒性/细胞抑制剂或所述毒素和/或放射性元素与所述组合物的至少一种成分化学偶联，用于同时使用。
本发明包括作为药物的所述组合物。
此外，本发明包括根据本发明的组合物用于制备药物的用途。
在另一个方面中，本发明涉及如上所述的抗体或其功能性片段或衍生物之一和/或组合物用于制备打算用来抑制肿瘤细胞的生长和/或增殖的药物的用途。
本发明的另一个方面在于如上所述的抗体或其功能性片段或衍生物和/或组合物的用途，或如上所述的用途，用于制备打算用于预防或治疗癌症的药物。
本发明还包括用于抑制病人肿瘤细胞的生长和/或增殖的方法，包括将根据本发明的抗体或其功能性片段或衍生物之一、通过根据本发明的杂交瘤产生的抗体或根据本发明的组合物施用于有需要的病人。
本发明进一步包括预防或治疗有需要的病人的癌症的方法，包括将根据本发明的抗体或其功能性片段或衍生物之一、通过根据本发明的杂交瘤产生的抗体或根据本发明的组合物施用于有需要的病人。
在特别优选的方面中，所述癌症是选自前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宫内膜癌、成胶质细胞瘤或结肠癌的癌症。
如之前所解释的，本发明的一个优点是允许HGF依赖性和非依赖Met-激活相关癌症的治疗。
在一个特别的方面，本发明包括如上所述的抗体或其功能片段或衍生物之一或如上提及的用途在用于制备旨在预防或治疗需要其的患有以c-Met过度表达并导致所述c-Met受体配体非依赖构成地激活为特征的癌症(例如，由于c-Met的基因扩增)的病人的药物中的用途。
优选地，以导致所述c-Met受体配体非依赖构成地激活的c-Met的基因扩增为特征的所述癌症选自肾细胞癌和胃癌。
在另一个方面中，本发明包括疾病的体外诊断方法，该疾病由起源于其中推测到c-Met受体异常存在的生物样品的c-Met受体的过度表达或低表达诱导，所述方法的特征在于其包括其中将所述生物样品接触本发明抗体的步骤，如果需要，可以将所述抗体进行标记。
优选，与所述诊断方法中c-Met受体的异常存在相关的所述疾病将是癌症。
所述抗体，或其功能性片段之一，可以以免疫偶联物或标记抗体的形式存在，使得获得可检测和/或可定量信号。
例如，根据本发明标记的抗体或其功能性片段包括称为免疫偶联物的抗体，例如，其可以与酶(如，过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或葡萄糖6-磷酸脱氢酶)或通过分子(如生物素、异羟基洋地黄毒甙元或5-溴异羟基洋地黄毒甙元)偶联。荧光标记同样可以与根据本发明的抗体或其功能性片段偶联，尤其包括荧光素及其衍生物、荧光染料、若丹明及其衍生物、GFP(GFP表示“绿色荧光蛋白”)、丹酰、伞形酮等。在这样的偶联物中，可以通过本领域技术人员已知的方法制备本发明的抗体及其功能性片段。它们可以与酶或荧光标记直接偶联或通过间隔物基团或连接基团的介导连接，如聚醛，如戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺戊醋酸(DPTA)，或在偶联剂的存在下偶联，如以上对于治疗偶联物提及的那些。可以通过与异硫氰酸盐反应来制备含有荧光素类型标记的偶联物。
其他偶联物同样包括化学发光标记，如鲁米诺和二恶二酮，生物发光标记，如荧光素酶和虫荧光素，或放射性标记，如碘123、碘125、碘126、碘133、溴77、锝99m、铟111、铟113m、镓67、镓68、钌95、钌97、钌103、钌105、汞107、汞203、铼99m、铼101、铼105、钪47、碲121m、碲122m、碲125m、铥165、铥167、铥168、氟18、钇199、碘131。现有的本领域技术人员已知的用于将治疗放射性同位素与抗体直接偶联或通过螯合剂(如，以上提及的EDTA、DTPA)偶联的方法可以用于在诊断中可以使用的放射性元素。同样可以提及通过氯胺T方法用Na[I125][HunterW.M.和GreenwoodF.C.(1962)Nature194:495]或通过Crockford等的技术用锝99m(US专利4,424,200)或通过Hnatowich所述的DTPA连接(US专利4,479,930)来标记。
因此，根据本发明的抗体，或其功能性片段或衍生物可以用于检测和/或定量过度表达或低表达的方法中，优选生物样品中c-Met受体的过度表达，其特征在于包括以下步骤：
a)将生物样品接触根据本发明的抗体，或其功能性片段或衍生物；和
b)证明可能形成的c-Met/抗体复合物。
在特定的实施方案中，根据本发明的抗体，或其功能性片段或衍生物可以用于检测和/或定量生物样品中的c-Met受体的方法中，用于监控c-Met依赖性癌症的预防和/或治疗处理的功效。
更常见地，根据本发明的抗体或其功能性片段或衍生物可以有利地用于任何溶液中，其中必须以定性和/或定量方式观察到c-Met-受体的表达。
优选，生物样品由生物流体形成，如人来源的血清、全血、细胞、组织样品或活体切片。
可以使用任何程序或常规的测试，以进行这样的检测和/或定量。所述测试可以是竞争或三明治测试，或本领域技术人员根据抗体-抗原类型的免疫复合物的形成已知的任何测试。按照根据本发明的应用，可以将抗体或其功能性片段或衍生物固定化或标记。可以在本领域技术人员已知的各种支持物上进行固定化。这些支持物尤其包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙或天然或修饰的细胞。这些支持物可以是可溶性的或不溶性的。
例如，优选的方法是应用免疫荧光或放射性免疫试验(RIA)技术或等价技术的根据ELISA技术的免疫酶方法。
因此，本发明同样包括进行由c-Met受体的过度表达或低表达诱发疾病的诊断方法或进行检测和/或定量生物样品中c-Met受体的过度表达或低表达(优选所述受体的过度表达)需要的试剂盒或套组，特征在于所述试剂盒或套组包括以下元件：
a)根据本发明的抗体，或其功能性片段或衍生物；
b)任选，用于形成对免疫反应有利的介质的试剂；
c)任选，使得可以证明免疫反应产生的c-Met/抗体复合物的试剂。
本发明的主题还包括根据本发明的抗体或组合物的用途，该用途为用于制备打算用于将生物活性化合物特异性靶向表达或过度表达c-Met受体的细胞的药物。
在此确定生物活性化合物表示能够介导(尤其是抑制)细胞活性(特别是其生长、增殖、转录或基因翻译)的任何化合物。
本发明的主题还在于包含根据本发明的抗体，或其功能性片段或衍生物(优选标记的，尤其是放射性标记的)的体内诊断剂及其在医学成像中的用途，特别是用于检测与c-Met受体的细胞表达或过度表达相关的癌症。
本发明还涉及作为组合产品的组合物或作为药物的根据本发明的抗-c-Met/毒素偶联物或放射性元素。
优选，将作为组合产品或所述偶联物的本发明的组合物与赋形剂和/或药物学上可接受的载体混合。
在本发明的描述中，药物学上可接受的载体用来表示进入药物组合物中但没有引起次级反应的化合物或化合物的组合物，并且例如，其可以促进活性化合物的施用，提高在体内的寿命和/或功效，增加溶液中的溶解性、或改善保存。这些药物学上可接受的载体是公知的，并且被本领域技术人员根据所选活性化合物的性质和施用方式采纳。
优选，这些化合物将通过全身途径来施用，特别是通过静脉内途径，通过肌内，皮内，腹膜内或皮下途径，或通过口服途径。在更优选的方式中，将根据本发明的包含抗体的组合物以按序的方式给药几次。
可以根据通常在建立适于病人的治疗中考虑的标准来确定施用方式、剂量和最佳药物形式，如，例如，病人的年龄或体重、他/她一般状况的严重性、对治疗的耐受性和注意到的次级影响。
附图说明
本发明的其他特征和优点将在实施例和附图的继续描述中显现出来，其中：
图1：来自鼠和人来源的无关IgG1Mab和PBS对A549细胞上的c-Met受体磷酸化的作用。
图2A和2B：作为人IgG1/κ同种型产生的鼠和人源化224G11Mab对A549细胞上的c-Met受体磷酸化的作用。
图2A：作为百分比vs.由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激来计算激动剂作用。
图2B：作为由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激的抑制百分比来计算拮抗剂作用。
图3A和3B：含有各种工程化铰链区的鼠224G11Mab和嵌合224G11Mab之间对A549细胞上的c-Met受体磷酸化的比较。
图3A：作为百分比vs.由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激来计算激动剂作用。
图3B：作为由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激的抑制百分比来计算拮抗剂作用。
图4A和4B：作为人IgG2/κ同种型产生的鼠224G11Mab以及嵌合和人源化224G11Mab之间对A549细胞上的c-Met受体磷酸化的比较。
图4A：作为百分比vs.由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激来计算激动剂作用。
图4B：作为由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激的抑制百分比来计算拮抗剂作用。
图5A和5B：作为工程化铰链突变体TH7IgG/κ产生的鼠224G11Mab以及嵌合和人源化224G11Mab之间对A549细胞上的c-Met受体磷酸化的比较。
图5A：作为百分比vs.由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激来计算激动剂作用。
图5B：作为由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激的抑制百分比来计算拮抗剂作用。
图6A至10B：BRET模型，图6A、7A、8A、9A、10A：c-Met二聚化模型；和图6B、7B、8B、9B、10B:c-Met激活模型。
图11A和11B：通过嵌合和人源化224G11形式的c-Met识别。
图12：鼠和嵌合抗体对HGF诱导的NCI-H441细胞增殖的体外作用。将NCI-H441细胞涂布于无血清培养基中。涂布24小时后，在HGF不存在或存在下，加入m224G11和[224G11]chim。黑色箭头表示在HGF不存在或存在下仅用细胞涂布的孔。引入鼠IgG1(mIgG1)，作为同种型对照。
图13：鼠和IgG1嵌合224G11Mab对NCI-H441异种移植模型的体内比较。
图14A和14B：鼠224G11Mab以及该抗体的各种嵌合和人源化形式对HGF诱导的NCI-H441细胞增殖的体外作用。将NCI-H441细胞涂布于无血清培养基中。涂布二十四小时后，在HGF不存在或存在下，加入待测试的抗体。在图中(图14A)，显示了鼠m224G11、嵌合IgG1[224G11]chim、人源化IgG1[224G11][Hz1]、[224G11][Hz2]、[224G11][Hz3]形式。在图中(图14B)，呈现了鼠m224G11和各种嵌合IgG1形式([224G11]chim、[224G11][MHchim]、[224G11][MUP9Hchim]、[224G11][MMCHchim]、[224G11][TH7chim])。黑色箭头表示在HGF不存在或存在下仅用细胞涂布的孔。引入了鼠IgG1，作为激动剂活性的阴性对照。将m5D5用作剂量依赖性完全激动剂对照。
图15：鼠224G11Mab以及该抗体的各种嵌合和人源化形式对HGF诱导的NCI-H441细胞增殖的体外作用。将NCI-H441细胞涂布于无血清培养基中。涂布二十四小时后，在HGF不存在或存在下，加入待测试的抗体。呈现了鼠m224G11、[224G11]chim、[224G11][TH7chim]IgG1嵌合形式和[224G11][TH7Hz1]、[224G11][TH7Hz3]。黑色箭头表示在HGF不存在或存在下仅用细胞涂布的孔。引入了鼠IgG1，作为用于激动剂活性的阴性对照。将m5D5用作剂量依赖性完全激动剂对照。
图16A-16C：鼠、嵌合和人源化224G11Mab对NCI-H441异种移植模型的体内比较。
图17A：作为百分比vs.由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激来计算激动剂作用。
图17B：作为由HGF[100ng/ml]引起的c-Met磷酸化的最大刺激的抑制百分比来计算拮抗剂作用。
图18：BRET模型，使用c-Met激活模型。
图19A-19B：m224G11和h224G11对A549细胞上的c-Met降解的作用。图19A4个独立实验的平均+/-s.e.m.图19B所进行的4个独立实验的蛋白印迹图示。
图20A-20B：m224G11和h224G11对NCI-H441细胞上的c-Met降解的作用。图20A4个独立实验的平均+/-s.e.m.图20B所进行的4个独立实验的蛋白印迹图示。
图21：ELISA的设立，以评价c-Met脱落。
图22：用m224G11处理5天的NCI-H441细胞上c-Met脱落的体外评价。mIgG1是用作同种型对照的无关抗体。
图23A-23C：用m224G11处理5天的扩增Hs746T、MKN45和EBC-1细胞系c-Met脱落的体外评价。mIgG1是用作同种型对照的无关抗体。PMA是用作阳性对照的脱落诱导剂。
图24A-24D：NCI-H441和用m224G11处理5天的扩增Hs746T、MKN45和EBC-1细胞系c-Met脱落的体外评价。mIgG1是用作同种型对照的无关抗体。PMA是用作阳性对照的脱落诱导剂。
图25A-25B：Hs746T细胞系h224G11的内在磷酸化的研究。
图26A-26C：NCI-H441细胞系h224G11的内在磷酸化的研究。图26A磷酸-ELISA和图26B-26C蛋白分析。
图27A-27C：Hs578T细胞系h224G11的内在磷酸化的研究。图27A磷酸-ELISA和图27B-27C蛋白分析。
图28A-28C：NCI-H125细胞系h224G11的内在磷酸化的研究。图28A磷酸-ELISA和图28B-28C蛋白分析。
图29A-29C：T98G细胞系h224G11的内在磷酸化的研究。图29A磷酸-ELISA和图29B-29C蛋白分析。
图30A-30C：MDA-MB-231细胞系h224G11的内在磷酸化的研究。图30A磷酸-ELISA和图30B-30C蛋白分析。
图31A-31C：PC3细胞系上h224G11的内在磷酸化的研究。图31A磷酸-ELISA和图31B-31C蛋白分析。
图32A和32B：HUVEC细胞上h224G11的内在磷酸化的研究。
图33：野生型鼠224G11抗体与嵌合铰链工程化224G11[C2D5-7]Mab对NCI-H441异种移植模型的体内比较。
图34A-34B：h224G11对Hs746T和NCI-H441细胞的ADCC诱导。将装载(实心方块)或未装载(空心方块)h224G11的51Cr-标记的Hs746T(图34A)或NCI-H441(图34B)细胞与不同比例的人NK细胞混合，并培养4hr。收集细胞并计数由裂解释放的51Cr的cpm。根据效应/目标细胞比例的裂解百分比，将结果作出曲线。NL表示未装载的细胞。
图35A-35C：表达不同水平的c-Met的肿瘤异种移植物中的h224G1染色(图35A：对于c-Met，Hs746T扩增的细胞系，图35B：NCI-H441高水平的c-Met表达和图35C：MCF-7低水平的c-Met)。
图36A-36D：Hs746T异种移植模型上h224G11的体内活性。图36A表明与表达c-Met的其它细胞系相比的在Hs746T细胞上的c-Met表达的FACS分析。图36B表明c-Met扩增的QRTPCR。图36C在不存在或存在HGF时的c-Met磷酸化。图36D体内模型。
图37A-37D：MKN-45异种移植模型上h224G11的体内活性。图37A表明与表达c-Met的其它细胞系相比的在MKN45细胞上的c-Met表达的FACS分析。图37B表明c-Met扩增的QRTPCR。图37C在不存在或存在HGF时的c-Met磷酸化。图37D体内模型。
图38A-38D：EBC-1异种移植模型上h224G11的体内活性。图38A表明与表达c-Met的其它细胞系相比的在EBC-1细胞上的c-Met表达的FACS分析。图38B表明c-Met扩增的QRTPCR。图38C在不存在或存在HGF时的c-Met磷酸化。图38D体内模型。
图39，其中的A-H：与对照处理的肿瘤相比，用h224G11Mab处理的小鼠中Hs746T肿瘤的IHC检测。(A)和(B)组对应同种型对照抗体。(C)和(D)组表示分别来自PBS或h224G11处理的小鼠的肿瘤切片上的c-Met表达，表明用h224G11的慢性治疗诱导了c-Met显著的下调。与PBS对照样本(E)相比，处理肿瘤(F)上的Ki-67染色显著降低。在用h224G11处理的肿瘤(H)中观察到显著的凋亡，而在对照肿瘤(G)中没有观察到凋亡。
具体实施方式
实施例1：对抗c-Met抗体的产生
为了产生抗-c-Met抗体，用CHO转染的在其质膜上表达c-Met的细胞系(20×106细胞/剂/鼠)皮下免疫8周龄的BALB/c小鼠3至5次，或用c-Met胞外结构域融合蛋白(R&DSystems，目录#358MT)(10-15μg/剂/鼠)或该重组蛋白的片段免疫8周龄的BALB/c小鼠2至3次，对于第一次免疫，该重组蛋白的片段与完全Freund佐剂混合，对于以后的免疫，与不完全Freund佐剂混合。还进行了其中小鼠同时接受了CHO-cMet细胞和重组蛋白的混合实验方案。在细胞融合前三天，用重组蛋白或片段i.p.或i.v.加强小鼠。然后收集小鼠的脾脏，并与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞(ATCC)融合并接受HAT选择。进行了四次融合。通常，对于单克隆抗体或其功能性片段的产生，尤其是鼠来源的，可以参考特别在手册“抗体”中描述的技术(Harlow和Lane，Antibodies:ALaboratoryManual(抗体：实验室手册)，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborNY，pp.726，1988)或Kohler和Milstein所述的从杂交瘤的制备技术(Nature，256:495-497，1975)。
最初通过对c-Met重组蛋白的ELISA，接着对A549NSCLC、BxPC3胰腺和U87-MG成胶质细胞瘤细胞系的FACS分析来筛选所获得的杂交瘤，以确保所产生的抗体还能识别肿瘤细胞上的天然受体。对这2个测试的阳性反应物进行了扩增，克隆并收集了一组杂交瘤，纯化，并筛选其在BxPC3模型中抑制体外细胞增殖的能力。
对于该目的，将50000BxPC3细胞涂布于96孔平板中的RPMI培养基中，2mML.谷氨酰胺，无SVF。涂布24小时后，以0.0097至40μg/ml的终浓度加入待测试的抗体，60min后，加入100ng/mlhHGF。3天后，用0.5μCi的[3H]胸腺嘧啶将细胞脉冲16小时。通过液体闪烁计数定量结合至三氯乙酸-不溶性DNA中的[3H]胸腺嘧啶的幅度。结果以原始数据来表示，以真实地评价每种Mab的内在激动作用。
然后为了对c-Met二聚化的活性和对转染细胞的激活BRET分析，评价了抑制至少50％细胞增殖的抗体。通过测量激活的c-Met上聚集的Gab1信号分子来定量c-Met受体活性。为此，产生了表达C-Met-Rluc或C-Met-Rluc和C-Met-K1100A-YFP(用于c-Met二聚化)或C-Met-Rluc和融合YFP的Gab1[Maroun等，Mol.Cell.Biol.，1999，19:1784-1799]的突变形式(用于c-Met激活)的CHO稳定细胞系。在BRET实验前一天或两天，将细胞分布在白色96孔微量平板中的DMEM-F12/FBS5％培养基中。首先在37℃和5％CO2下培养细胞，使细胞粘附于平板。然后用200μlDMEM/孔使细胞饥饿过夜。就在实验前，除去DMEM，并用PBS将细胞快速洗涤。在待测试的抗体或参照化合物的存在或不存在下，在PBS中培养细胞，37℃，10min，接着添加含有或不含HGF的腔肠素(coelenterazine)至终体积50μl。在37℃下再培养10分钟后，使用Mithras光度计(Berthold)(1s/波长/孔，重复15次)启动485和530nm处的光-发射获取。
之前[Angers等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97:3684-3689]已经将BRET比例限定为：[(530nm的发射)-(485nm的发射)×Cf]/(485nm的发射)，其中Cf对应于相同实验条件下单独表达Rluc融合蛋白的细胞的(530nm的发射)/(485nm的发射)。简化该等式显示了BRET比例对应于存在两个伴侣时获得的530/485nm比，试验中只存在融合肾形肾状线虫(R.reniformis)荧光素酶的伴侣时通过相同实验条件下获得的540/485nm比来校正。为了可读性，以毫BRET单位(mBU)来表示结果；mBU对应于乘以1000的BRET比。
第二次体外测试后，选择了如下抗体224G11，i)在增殖的功能性测试中没有内在活性的完整分子，ii)显著抑制BxPC3增殖和iii)抑制c-Met二聚化。在实验中，作为用于内在拮抗活性的对照，加入由Genentech产生并在ATCC可获得的5D5Mab。
实施例2：通过CDR-嫁接的鼠224G11的人源化方法
1°)轻链可变结构域(VL)的人源化
作为预备步骤，将224G11VL的核苷酸序列与IMGT数据库(http://imgt.cines.fr)中包括的鼠种系基因序列相比。已经鉴定出分别对于V区显示出99.31％序列同一性和对于J区显示出94.28％序列同一性的鼠IGKV3-5*01和IGKJ4*01种系基因。由于这些高同源性，将224G11VL核苷酸序列直接用于搜索人同源性，替代相应的鼠种系。
在第二个步骤中，已经搜索出展示了与224G11VL最佳同一性的人种系基因，以鉴定用于CDR嫁接的最佳人候选物。为了选择的优化，进行了氨基酸序列之间的比对。人IGKV4-1*01种系基因提供了67.30％的序列同一性，但显示出CDR1的不同长度(在224G11VL中为10个氨基酸，在IGKV4-1*01中为12个氨基酸)。对于J区，选择了人IGKJ4*02种系基因(77.14％的序列同一性)。
在接下来的步骤中，将鼠224G11VLCDR区嫁接至以上选择的人框架序列中。用几个标准分析了每个氨基酸位置，如VH/VL接口、抗原结合或CDR构建的参与，可变结构域的3D结构中的残基、CDR锚、属于Vernier区的残基的定位。构建了对应于SEQIDNo.8、SEQIDNo.9和SEQIDNo.10的三个人源化形式，并且分别在对应于鼠224G11VL的FR区和CDR中含有四个(4、39、40、84)、两个(39、40)或一个(40)鼠残基。
2°)重链可变结构域(VH)的人源化
作为预备步骤，将224G11VH的核苷酸序列与IMGT数据库(http://imgt.cines.fr)中包括的鼠种系基因序列相比。
已经鉴定出分别对于V区显示出92.70％序列同一性，对于D区显示出75.00％序列同一性和对于J区显示出89.36％序列同一性的鼠IGHV1-18*01、IGHD2-4*01和IGHJ2*01种系基因。关于这些高同源性，决定将224G11VH核苷酸序列直接用于搜索人同源性，替代相应的鼠种系。
在第二个步骤中，已经搜索出展示了与224G11VH最佳同一性的人种系基因，以鉴定用于CDR嫁接的最佳人候选物。为此，已经将224G11VH的核苷酸序列与IMGT数据库的人种系基因序列进行了比对。人IGHV1-2*02V序列在核苷酸水平呈现出75.00％的序列同一性，在氨基酸水平呈现出64.30％序列同一性。寻找J区同源性导致了鉴定出具有78.72％序列同一性的人IGHJ4*04种系基因。
在接下来的步骤中，将鼠224G11VHCDR区嫁接至以上选择的人框架序列中。用几个标准分析了每个氨基酸位置，如VH/VL接点、抗原结合或CDR构建的参与，可变结构域的3D结构中的残基、CDR锚、属于Vernier区的残基的定位。构建了一个对应于SEQIDNo.4的完全人源化形式；其在对应于鼠224G11VH的FR区和CDR中只含有人残基。
实施例3：改良铰链突变体的工程化
本领域技术人员公知铰链区积极地参与免疫球蛋白可变结构域的柔性(参见Brekke等，1995；Roux等，1997)。在224G11Mab的嵌合过程中，鼠恒定结构域IGHG1由人来源的等价IGHG1部分替代。由于铰链区的氨基酸序列高度不同的，进行了铰链区的“鼠源化”，以保持其长度和刚性。由于人IGHG2铰链区对应于鼠IGHG1铰链的最接近同源物，也考虑了该序列。通过将鼠IGHG1和人IGHG2铰链的部分结合至人IGHG1铰链部分中，构建了一系列7个不同的铰链序列(SEQIDNo.22至28)。
设计并构建了另一系列的铰链突变体(SEQIDNo.58至72)，以评价附加半胱氨酸及其沿着铰链结构域的位置、沿着铰链结构域的1，2，3或4个氨基酸的删除和这两个参数的结合(半胱氨酸添加和氨基酸删除)的影响。
实施例4：人源化224G11Mab和工程化铰链Mab形式的产生
在瞬时转染时并通过使用含有pCEP4表达载体(InVitrogen，US)的HEK293/EBNA系统产生了所有上述含有嵌合、人源化和/或工程化铰链区的Mab形式。
通过通用基因合成(Genecust，Luxembourg)合成了对应于224G11Mab轻链(SEQIDNo.18、SEQIDNo.19和SEQIDNo.20)和重链(SEQIDNo.14)的可变结构域的人源化形式的完整核苷酸序列。将它们亚克隆至携带人IgG1或IgG2免疫球蛋白的恒定结构域[CH1-铰链-CH2-CH3]的完整编码序列的pCEP4载体(InVitrogen，US)中。通过将{Nhe1I-Bcl1}限制片段与携带所需修饰的等价部分交换来进行了铰链区的修饰，每个代表性的{Nhe1-Bcl1}片段通过通用基因合成(Genecust，LU)来合成。按照实验室手册(Sambrook和Russel，2001)所述的常规分子生物学技术或根据供应商的说明书进行了所有克隆步骤。使用BigDye终止子循环测序试剂盒(AppliedBiosystems，US)通过核苷酸测序来完全证实了每个遗传构建体，并使用3100遗传分析仪(AppliedBiosystems，US)来分析。
将悬浮液中的HEK293EBNA细胞(InVitrogen，US)常规生长于轨道摇床(110rpm转速)上的含有50ml补充了6mM谷氨酰胺的无血清培养基Excell293(SAFCBiosciences)的250ml烧瓶中。使用以1mg/ml混合的终浓度在水中制备的线性25kDa聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences)和质粒DNA(对于1:1的重链与轻链质粒比，终浓度为1.25μg/ml)，对2.106细胞/ml进行了瞬时转染。在转染后4小时，用一体积的新鲜培养基稀释培养物，以获得106细胞/ml的终细胞密度。基于细胞生活力和Mab生产来监控培养过程。通常，维持培养物4至5天。使用蛋白A树脂(GEHealthcare，US)上的常规色谱方法来纯化Mab。
在适于功能评价的水平生产了所有不同形式的Mab。生产力水平通常为15至30mg/l纯化Mab。
实施例5：通过磷酸-c-Met特异性ELISA试验评价c-Met磷酸化状态
该功能试验可以监控通过单独的Mab或在HGF的共同存在下对c-Met磷酸化状态的调节。
将A549细胞接种于12MW平板中的完全生长培养基中[F12K+10％FCS]。用HGF[100ng/ml]刺激前，将细胞饥饿16小时，并且在配体刺激前15分钟加入终浓度为30μg/ml的每种待测试Mab。在加入HGF停止磷酸化反应后15分钟，加入冰冷裂解缓冲液。机械刮除细胞，并通过在13000rpm和4℃下离心10min对应于上清液相，来收集细胞裂解物。使用BCA试剂盒(Pierce)定量蛋白含量并存储于-20℃直至使用。通过ELISA定量c-Met的磷酸化状态。将山羊抗-c-MetMab(R&D，refAF276)用作捕获抗体(在4℃下过夜覆盖)，并在使用TBS-BSA5％缓冲液的饱和步骤后(室温(RT)1小时)，将25μg蛋白裂解物加入被覆盖的96MW平板的每个孔中。在RT培养90分钟后，将平板洗涤四次，并加入检测抗体(抗-磷酸-c-MetMab，针对位置1230、1234和1235的磷酸化Tyr残基)。在另外1小时培养和4次洗涤后，加入偶联HRP(Biosource)的抗-兔子抗体，在RT下持续1小时，并通过加入鲁米诺进行了发光检测。发光阅读在MithrasLB920多模式平板阅读器上进行(Berthold)。
基础和HGF[100ng/ml]诱导的c-Met受体磷酸化水平都未受到PBS处理的影响，也未受到鼠或人Mab(其没有靶向人c-Met受体(图1))加入的影响。另一方面，鼠(m)224G11Mab强烈抑制了HGF[100ng/ml]-诱导的c-Met磷酸化(图2B)，没有通过自身改变受体磷酸化(图2A)。令人惊讶地，224G11Mab的嵌合形式(224G11chim/IgG1)，表示来自m224G11的可变结构域(VH+VL)结合人恒定结构域IgG1/κ，产生了强烈的(最大HGF作用的17％，图2A)激动剂活性，与降低的拮抗剂功效相关(HGF最大作用的54％抑制，与产生HGF最大作用的75％抑制的m224G11相比，图2B)。还在人IgG1/κ主链上构建了三个人源化形式的224G11Mab，[224G11]Hz1/IgG1、[224G11]Hz2/IgG1和[224G11]Hz3/IgG1，与鼠224G11相比，也产生了降低的拮抗剂功效和明显的激动剂活性(11至24％的最大HGF水平)(图2A和2B)。构建了一系列工程化形式的重链铰链结构域，并在c-Met受体磷酸化试验中进行了试验。如图3A所示，对于基于IgG2的构建体和工程化IgG1/κ构建体[MH、MUP9H和TH7]，都观察到与hIgG1/κ同种型相关的激动剂作用的明显降低。还获得了伴随的拮抗剂功效提高。选择具有最多人序列的基于hIgG1/κ的TH7铰链突变体来完成人源化过程。在接下来的步骤中，通过结合人IgG2/κ或基于IgG1/κ的TH7工程化铰链恒定结构域产生了三个人源化形式的224G11Mab可变结构域。对于hIgG2/κ人源化构建体，人源化形式Hz3产生了强烈的激动(图4A)，并且对于全部三个人源化形式，拮抗剂功效低于用鼠224G11Mab观察到的并且与基于嵌合hIgG1的Mab相当(HGF作用的56-57％抑制，图4B)。另一方面，就c-Met受体磷酸化的弱激动剂活性(5-6％的HGF作用)和强拮抗剂功效(HGF作用的68至72％抑制)而言(图5A和5B)，三个人源化形式Hz1、Hz2或Hz3与工程化IgG1/TH7突变体的结合几乎完全恢复了鼠224G11Mab的特性。与基于嵌合IgG1的224G11Mab以及基于IgG2的人源化形式相比，这些变体得到了明显提高。
构建了第二个系列的工程化形式的重链铰链结构域并在c-Met受体磷酸化试验中进行了试验。如图17A中所示，所有那些新形式(c224G11[C2]、c224G11[C3]、c224G11[C5]、c224G11[C6]、c224G11[C7]、c224G11[Δ1-3]、c224G11[C7Δ6]、c224G11[C6Δ9]、c224G11[C2Δ5-7]、c224G11[C5Δ2-6]、c224G11[C9Δ2-7]和c224G11[Δ5-6-7-8])呈现出比c224G11弱的激动剂作用，因为与c224G11的23％相比，它们的激动活性包括6至14％的HGF作用。如c224G11[TH7]那样，所有那些新的形式呈现出伴随的拮抗剂功效提高[图17B]。那些结果显示出通过点突变和/或删除工程化重链结构域将改变抗体的激动/拮抗特征。
实施例6：BRET分析
在第一组实验中，已经控制了无关鼠IgG1，人IgG1和人IgG2在两个BRET模型中(12个独立实验中的代表性实验；图6A和图6B)对HGF诱导的BRET信号没有作用。这些Mabs即刻被引做对照。
评价了IgG1嵌合形式的鼠224G11Mab([224G11]Chim)对c-Met二聚化和c-met激活BRET模型的作用。尽管鼠224G11Mab在c-Met二聚化模型中抑制了59.4％的HGF诱导的BRET信号，[224G11]chimMab只抑制了28.9％(图7A)。[224G11]chim抗体在抑制HGF诱导的c-Met激活中也不太有效，因为[224G11]chim和m224G11抗体分别抑制了34.5％和56.4％的HGF诱导的BRET信号(图7B)。此外，单独的m224G11对c-Met激活没有作用，而[224G11]chim对c-Met激活具有部分激动剂作用，对应于32.9％HGF诱导的信号。在c-Met二聚化BRET模型上也看到了[224G11]chim的这种部分激动剂作用，因为[224G11]chim单独诱导了BRET提高，对应于46.6％HGF诱导的信号，而m224G11为21.3％(图7A)。
在图8A和8B中，铰链突变嵌合形式的224G11抗体显示出比[224G11]chim更高的对HGF诱导的BRET信号的抑制作用，因为[224G11][MHchim]、[224G11][MUP9Hchim]、[224G11][MMCHchim]和[224G11][TH7chim]，分别显示出59.7％、64.4％、53.2％和73.8％的HGF诱导的激活BRET信号的抑制(图8B)和61.8％、64.4％、52.5％和64.4％的HGF诱导的c-Met二聚化BRET信号的抑制(图8A)。与[224G11]chim(其对c-Met激活具有部分激动剂作用)相反，铰链突变的嵌合形式的224G11抗体显示出对单独的c-Met激活没有明显作用(分别为5.1％、7.6％、-2.0％和-6.9％)，这与对m224G11观察的一样。
在图9B中，与[224G11][TH7chim]一样，具有TH7铰链的3个人源化形式的224G11IgG1抗体单独测试时，在激活模型中没有诱导明显的BRET信号的提高，并且显示出HGF诱导的BRET信号的强烈抑制：对于Hz1、Hz2和Hz3形式分别为59.9％、41.8％和57.9％。此外，[224G11][TH7Hz1]、[224G11][TH7Hz2]和[224G11][TH7Hz3]抑制了二聚化模型上HGF诱导的BRET信号，分别为52.2％、35.8％和49.4％(图9A)。
与[224G11]chim相反，嵌合形式的224G11IgG2抗体([224G11][IgG2chim])没有显示出单独的部分激动剂作用并抑制了66.3％对c-Met激活模型的HGF作用(图10B)。在c-Met二聚化模型上，[224G11][IgG2chim]抑制了62.4％的HGF诱导的BRET信号(图10A)。
在c-Met激活BRET模型中评价了第二个系列的重链铰链结构域的工程化形式的激动剂功效(图18)。与c224G11(其对c-Met激活具有部分激动剂作用)相反，c224G11[C2]、c224G11[C3]、c224G11[C5]、c224G11[C6]、c224G11[C7]、c224G11[Δ1-3]、c224G11[C7Δ6]、c224G11[C6Δ9]、c224G11[C2Δ5-7]、c224G11[C5Δ2-6]、c224G11[C9Δ2-7]和c224G11[Δ5-6-7-8]铰链突变嵌合形式的224G11抗体显示出对单独的c-Met激活没有明显作用。
实施例7：通过嵌合和人源化224G11形式的c-Met识别
设立了直接的ELISA，以测定各种嵌合和人源化形式对重组c-Met的结合能力。简而言之，将来自R&DSystems的重组二聚c-Met以1.25μg/ml覆盖于96-孔ImmunlonII平板上。在4℃培养过夜后，用0.5％明胶/PBS溶液使孔饱和。然后在加入2倍稀释的待测试抗体之前，将平板在37℃下培养1小时。将平板再培养一小时后，加入山羊抗鼠IgGHRP(用于测定鼠抗体)和山羊抗-人κ轻链HRP(用于嵌合和人源化抗体识别)。将平板培养一小时，并在用1MH2SO4中和之前，将过氧化物酶底物TMBUptima加入5mn。呈现于图11A和图11B中的结果显示了所有测试的形式对于c-Met识别是相当的。
实施例8：鼠和嵌合224G11对HGF诱导的NCI-H441细胞增殖的体外作用
将来自ATCC的NCI-H441细胞在RPMI1640培养基(InvitrogenCorporation，Scotland，UK)、10％FCS(InvitrogenCorporation)、1％L-谷氨酰胺(InvitrogenCorporation)中常规培养。对于增殖试验，在使用前3天将细胞分离，使得它们在涂布前处于生长的汇合期。将NCI-H441细胞以200μl无血清培养基(RPMI1640培养基加1％L-谷氨酰胺)中3.75x104细胞/孔的密度涂布于96-孔组织培养平板中。涂布后二十四小时，将待测试抗体加入NCI-H441中，并在37℃下培养三十分钟，接着加入HGF至终浓度为400ng/ml(5nM)，持续另外142个小时。对于每种抗体测试的剂量范围为10至0.0097μg/ml(每个孔中的终浓度)。在该实验中，加入鼠IgG1Mab，作为鼠同种型对照，并且测试的抗体是以下的几种：m224G11及其鉴定为[224G11]chim的人IgG1嵌合形式。还包括用单独的细胞-/+HGF涂布的孔。然后用0.25μCi的[3H]胸腺嘧啶核苷(AmershamBiosciencesAB，Uppsala，瑞典)将细胞脉冲7小时30分钟。通过液体闪烁计数来定量三氯醋酸不溶性DNA中结合的[3H]胸腺嘧啶核苷幅度。将结果表述为非转化cpm数据，以更好地评价将抗-c-MetMab单独加入肿瘤细胞时产生的潜在内在激动剂活性。
图12中所述的结果证明了如预期的，鼠抗体m224G11无论以任何测试剂量单独加入癌细胞中时没有展示出激动剂作用。考虑该实验中对于该化合物观察到的cpm变化，用同种型对照没有观察到HGF诱导的增殖的明显抑制。单独加入时，与mIgG1同种型对照Mab或单独的细胞相比，m224G11抗体没有显示出任何激动剂作用。对于m224G11观察到达到78％的剂量依赖性抗增殖活性(％抑制计算：100-[(cpm细胞+待测试Mab-平均cpm背景mIgG1)x100/(平均cpm细胞+HGF-单独的平均cpm细胞)])。令人惊讶地，单独加入时，嵌合形式的224G11Mab诱导了显著的、剂量依赖性的激动剂作用。这种激动剂作用对HGF-诱导的增殖的体外抑制具有影响，从鼠224G11的78％转变成嵌合形式的50％。为了确定这样“较低的”体外内在激动剂活性是否与未改变的体内作用相当，产生了m224G11和[224G11]chim，用于体内测试。因为在之前的研究中，30μg/鼠剂量证明了明显的体内活性，因此选择该剂量用于体内评价。
实施例9：鼠和嵌合224G11Mab对NCI-H441异种移植模型的体内比较
NCI-H441源自乳头肺腺癌，其表达高水平的c-Met，并且证明了c-MetRTK的组成型磷酸化。
为了评价抗体对NCI-H441异种移植物模型的体内作用，将六至八周大的无胸腺鼠圈养在无菌滤器拔顶笼子中，维持于无菌条件并根据法国和欧洲指导操作。给小鼠皮下注射9x106细胞。然后，细胞植入后六天，肿瘤是可测量的(大约100mm3)，将动物分成具有相当肿瘤大小的6只一组，首先用装载剂量60μg抗体/鼠处理，然后用30μg/剂的每种待测试抗体一周处理两次。接着观察小鼠的异种移植物生长速率。通过公式计算肿瘤体积：π(Pi)/6×长度×宽度×高度。图13中所述的结果证明了鼠Mab缺乏激动剂体内的活性行为，如预期的，即使在低的测试剂量下，作为有效的拮抗剂。与用鼠Mab观察到的相反，嵌合形式的展示出非常短暂的体内活性，肿瘤在细胞注射后D20完全可忽略处理。该实验清楚地证明了导致拮抗剂活性降低的体外激动剂作用的提高还引起了明显的拮抗剂活性的体内损耗。
实施例10：鼠224G11Mab以及该抗体的各种嵌合和人源化形式对HGF诱导的NCI-H441细胞增殖的体外作用
将来自ATCC的NCI-H441细胞在RPMI1640培养基(InvitrogenCorporation，Scotland，UK)、10％FCS(InvitrogenCorporation)、1％L-谷氨酰胺(InvitrogenCorporation)中常规培养。对于增殖试验，在使用前3天将细胞分离，使得它们在涂布前处于生长的汇合期。将NCI-H441细胞以200μl无血清培养基(RPMI1640培养基加1％L-谷氨酰胺)中3.75x104细胞/孔的密度涂布于96-孔组织培养平板中。涂布后二十四小时，将待测试抗体加入NCI-H441中，并在37℃下培养三十分钟，接着加入HGF至终浓度为400ng/ml(5nM)，持续另外142个小时。对于每种抗体测试的剂量范围为10至0.0097μg/ml(每个孔中的终浓度)。在该实验中，加入鼠IgG1Mab，作为鼠同种型对照和激动剂阴性对照，并且测试的抗体是以下的几种：i)m224G11，ii)各自鉴定为[224G11]chim、[224G11][MHchim]、[224G11][MUP9Hchim]、[224G11][MMCHchim]、[224G11][TH7chim]的人IgG1嵌合形式，iii)各自描述为[224G11][Hz1]、[224G11][Hz2]、[224G11][Hz3]的人源化IgG1形式。还包括了用单独的细胞-/+HGF涂布的孔。将作为杂交瘤细胞系从ATCC的Genentech可购得的5D5完整抗体引入作为完全激动剂阳性对照，并且此后称为m5D5。然后用0.25μCi的[3H]胸腺嘧啶核苷(AmershamBiosciencesAB，Uppsala，瑞典)将细胞脉冲7小时30分钟。通过液体闪烁计数来定量三氯醋酸不溶性DNA中结合的[3H]胸腺嘧啶核苷幅度。将结果表述为非转化cpm数据，以更好地评价将抗-c-MetMab单独加入肿瘤细胞时产生的潜在内在激动剂活性。
图14A中所述的结果证明了与预期的一样，同种型对照和m224G11对NCI-H441增殖都没有展示出任何激动剂活性。同种型对照对HGF诱导的细胞增殖没有作用，而m224G11以10μg/ml的终浓度加入时显示出66％的抑制。如预期的，用作激动剂对照的m5D5单独加入细胞时显示出完全剂量依赖性的激动剂作用。如已经观察到的，[224G11]chimMab展示出明显的剂量依赖性激动剂作用，并且观察到了该嵌合形式降低的抑制活性：19％而不是鼠形式的66％。单独加入时，3个IgG1人源化Mab证明了与m224G11形式相比的剂量依赖性激动剂作用。[224G11][Hz1]、[224G11][Hz2]和[224G11][Hz3]具有约46、30和35％的相当的拮抗剂活性。这些活性明显低于对m224G11观察到的。在图14B中，测试了各种IgG1嵌合形式。与[224G11]chim(其在单独加入NCI-H441细胞中时展示出剂量依赖性激动剂作用)相比，[224G11][MHchim]、[224G11][MUP9Hchim]、[224G11][MMCHchim]、[224G11][TH7chim]形式没有显著的内在激动剂作用。它们的拮抗剂活性高于对m224G11Mab观察到的(57％)，对于[22411][MHchim]、[224G11][MUP9Hchim]、[224G11][MMCHchim]和[224G11][TH7chim]，各自的抑制达到79、78、84和93％。
实施例11：224G11Mab的各种IgG1人源化形式的体外作用
将来自ATCC的NCI-H441细胞在RPMI1640培养基(InvitrogenCorporation，Scotland，UK)、10％FCS(InvitrogenCorporation)、1％L-谷氨酰胺(InvitrogenCorporation)中常规培养。对于增殖试验，在使用前3天将细胞分离，使得它们在涂布前处于生长的汇合期。将NCI-H441细胞以200μl无血清培养基(RPMI1640培养基加1％L-谷氨酰胺)中3.75x104细胞/孔的密度涂布于96-孔组织培养平板中。涂布后二十四小时，将待测试抗体加入NCI-H441中，并在37℃下培养三十分钟，接着加入HGF至终浓度400ng/ml(5nM)，持续另外142个小时。对于每种抗体测试的剂量范围为10至0.0097μg/ml(每个孔中的终浓度)。在该实验中，加入鼠IgG1Mab，作为激动剂活性的背景阴性对照，并且测试的抗体是以下的几种：i)m224G11，ii)各自鉴定为[224G11]chim、[224G11][TH7chim]的人IgG1嵌合形式，iii)各自鉴定为[224G11][TH7Hz1]、[224G11][TH7Hz3]的人源化IgG1形式。还包括了用单独的细胞-/+HGF涂布的孔。将作为杂交瘤细胞系从ATCC的Genentech可购得的5D5完整抗体引入作为完全激动剂阳性对照，并且此后称为m5D5。然后用0.25μCi的[3H]胸腺嘧啶核苷(AmershamBiosciencesAB，Uppsala，瑞典)将细胞脉冲7小时30分钟。通过液体闪烁计数来定量三氯醋酸不溶性DNA中结合的[3H]胸腺嘧啶核苷规模。将结果表述为非转化cpm数据，以更好地评价将抗-c-MetMab单独加入肿瘤细胞时产生的潜在内在激动剂活性。
图15显示了m224G11Mab展示出通常的抑制作用(74％的抑制)。嵌合IgG1形式[224G11]chim具有预期的剂量依赖性内在激动剂作用以及与鼠形式相比较低的拮抗剂作用：33％vs.74％抑制。[224G11][TH7chim]在该实验中具有非常弱的激动剂活性。然而，其展示出接近于对鼠Mab关注的高抑制活性(81％)。2个人源化形式不具有内在激动剂作用，并且具有接近于对鼠Mab或[224G11][TH7chim]观察到的拮抗剂活性，对于[224G11][TH7Hz1]和[224G11][TH7Hz3]各自具有67和76％的抑制。
实施例12：带有野生型或TH7-工程化铰链(NCI-H441异种移植物模型)的鼠、嵌合和人源化224G11Mab的体内比较
NCI-H441源自乳头肺腺癌，其表达高水平的c-Met，并且证明了c-MetRTK的组成型磷酸化。
为了评价铰链工程化对挽救224G11鼠抗体的体内活性的必要性，将六至八周大的无胸腺鼠圈养在无菌滤器拔顶笼子中，维持于无菌条件并根据法国和欧洲指导操作。给小鼠皮下注射9x106NCI-H441细胞。然后，细胞植入后六天，肿瘤是可测量的(大约100mm3)，将动物分成具有相当肿瘤大小的6只一组，首先用装载剂量2mg抗体/鼠处理，然后用1mg/剂的每种待测试抗体一周处理两次。在该实验中评价了十个抗体，包括m224G11、展示野生型铰链的嵌合形式(c224G11)、TH7工程化嵌合形式(224G11[TH7chim])、三个带有野生型铰链的人源化形式(224G11[IgG1Hz1]、224G11[IgG1Hz2]和224G11[IgG1Hz3])和三个相应的TH7工程化形式(224G11[TH7Hz1]、224G11[TH7Hz2]和224G11[TH7Hz3])。接着观察小鼠的异种移植物生长速率。
通过公式计算肿瘤体积：π(Pi)/6×长度×宽度×高度。
图16A-16C中所述的结果证明了鼠Mab缺乏任何体外激动剂活性行为，如预期的，作为有效的体内拮抗剂。与用鼠Mab观察到的相反，带有野生型铰链的嵌合和人源化形式都只展示出非常短暂的体内活性。在任一种情况中，由TH7工程化铰链置换野生型铰链导致了用鼠抗体观察到的体内活性的完全恢复。该实验清楚地证明了导致拮抗剂活性降低的体外激动剂作用的提高还引起了拮抗剂活性明显的体内丢失。还证明了使用TH7-工程化区域替代野生型区域是保持鼠Mab体内特性必需的。
实施例13：m224G11及其人源化形式h224G11对体外c-Met下调的作用
在以下的实施例中，为了避免疑问，表述h224G11指的是本发明抗体的人源化形式224G11[TH3Hz3]。
已经选择了两个细胞系来测定抗-c-Met抗体对c-Met受体降解的活性。A549(#HTB-174)和NCI-H441(#CCL-185)是来自ATCC收集的NSCLC细胞系。将NCI-H441细胞以3x104细胞/cm2接种于六孔平板中的RPMI1640+1％L-谷氨酰胺+10％热灭活的FBS中，在37℃和5％CO2气氛下持续24h。将A549细胞以2x104细胞/cm2接种于六孔平板中的F12K+10％热灭活FBS中，在37℃和5％CO2气氛下持续24h。
然后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将细胞洗涤两次，接着血清饥饿另外24小时。将抗-c-Met抗体(10μg/ml)、无关mIgG1(10μg/ml)或HGF(400ng/mL)加入37℃的无血清DMEM培养基中。在培养4小时或24小时后，温和地除去培养基并用冷PBS将细胞洗涤两次。用500μL冰冷裂解缓冲液[50mMTris-HCl(pH7.5)；150mMNaCl；1％NonidetP40；0.5％脱氧胆酸盐；和1片完全蛋白酶抑制剂混合物片加1％抗磷酸酶]裂解细胞。将细胞裂解物在4℃下振荡90min，并在15000rpm下澄清10分钟。在该阶段下，将细胞裂解物存储于-20℃直至蛋白印迹分析需要。使用BCA来定量蛋白浓度。通过SDS-PAGE分离全细胞裂解物(20μl中5μg)，并转移至硝基纤维素膜。将膜在RT下用TBS-吐温200.1％(TBST)；5％无脂奶粉下饱和1h，并用抗-c-Met抗体(稀释1/1000)在4℃下在TBST-5％无脂奶粉中过夜杂交。将抗体稀释于含有1％无脂奶粉的tris-缓冲的盐水-0.1％吐温20(v/v)(TBST)中。然后，用TBST洗涤膜并用过氧化物酶偶联的二抗(稀释1:1000)在RT下培养1h。用ECL(Pierce#32209)观察免疫反应性蛋白。在c-Met观察后，用TBST将膜再次洗涤一次并用TBST-5％无脂奶粉中的鼠抗-GAPDH抗体(稀释1/200000)在RT下培养1h。然后，将膜在TBST中洗涤并用过氧化物酶-偶联的二抗在RT下培养1h。将膜洗涤并使用ECL揭示GAPDH。通过密度测定法定量条带强度。
图19A和图20A中呈现的结果证明了m224G11和h224G11都能以剂量依赖性方式明显地下调A549和NCI-H441细胞系中的c-Met。在4小时培养时间后，下调已经明显，并在24小时时仍然提高。图19A和图20A中呈现的柱状图对应于平均值或各自4和3个独立实验。图19B和图20B中包括了对应于一个显著实验的蛋白印迹图像。
实施例14：m224G11及其人源化形式h224G11对c-Met脱落的体外作用
可溶性脱落形式的c-Met受体在用人肿瘤异种移植的鼠血清中或在携带表达c-Met的肿瘤的人病人血清中天然产生。此外，针对c-Met的抗体，如DN30Mab，描述为体外实验中的c-Met脱落诱导剂。为了确定m224G11是否具有该特性，将细胞接种于六孔平板中的10％FCS培养基中。当它们达到大约80％汇合时，除去培养基并加入新鲜完全培养基+/-待测试的化合物。用m224G11、同种型对照mIgG1或PBS将细胞再培养72小时。引入PMA(佛波醇肉豆蔻酸醋酸酯)作为脱落诱导剂。还对细胞测试了HGF，以确定c-Met配体对天然产生的脱落的影响。然后收集上清液并在0.2μm上过滤，然后用于ELISA测试中，其用不能识别与m224G11或c11E1一样的表位的抗-c-Met抗体捕获可溶形式的c-Met(图21)。此外，用PBS将来自每个孔的细胞洗涤一次并裂解来测定蛋白浓度。对于ELISA，将224D10用作捕获抗体，并在平板饱和后，在ELISA测试中加入来自六孔平板的过滤上清液。将单体c-Met形式用作阳性对照。上清液培养后，将平板洗涤以除去未结合的c-Met，并使用c11E1来检测由224G11Mab捕获的c-Met。通过加入HRP偶联的抗-hFc多克隆抗体来最终进行了测试的揭示。
图22中所示的结果表明细胞在体外培养72小时时产生的c-Met的天然脱落。没有观察到mIgG1的作用。然而，添加m224G11似乎抑制c-Met脱落。对于图23A-23C中的3个其他细胞系(Hs746T、EBC1和MKN45)，证实了这些结果。在第二个实验中，作为阳性脱落诱导剂加入的PMA如预期的明显提高了至少2个细胞系中(Hs746T和MKN45)的c-Met脱落。最终，在第三个实验中(图24A-24D)，引入HGF作为对照。与单独的细胞或细胞+mIgG1相比，HGF没有诱导另外的脱落。再一次，用m224G11观察到了c-Met脱落的明显抑制。
实施例15：h224G11Ab对各种细胞系的内在作用
在本专利中之前所述的实验中，已经证明了与用其他抗体(如5D5)观察到的相反，m224G11及其人源化形式h224G11没有展示出明显内在活性肿瘤细胞系。为了将这种特性延伸至其他细胞系，在一组具有不同c-Met表达的癌细胞系上，使用加入不同时间的单独的抗体进行了蛋白印迹和磷酸-ELISA实验，这些细胞系包括Hs746T、NCI-H441、Hs578T、NCI-H125、T98G、MDA-MB-231、PC3。在正常的细胞HUVEC中也进行了相同的测试。
在本发明专利申请的实施例5中已经描述了用于磷酸cMetELISA试验的方法。对于蛋白分析，通过用蛋白酶和磷酸酶抑制剂[10nMTris(pH7.4)、150mMNaCl、1mMEDTA、1mMEGTA、0.5％NonidetP40、100mM氟化钠、10mM焦磷酸钠、2mM原钒酸钠、2mMPMSF、10mg/ml亮肽素、10mg/ml抑肽酶]在4℃下在裂解缓冲液中培养，从片状沉淀的细胞制得蛋白裂解物。通过离心将蛋白裂解物除去细胞碎片，通过8％SDS-PAGE凝胶上的电泳来分解，并电转移至硝基纤维素膜。对于c-Met实验，在电泳和转移之前，对于特定的目标蛋白，将裂解物免疫沉淀。
图25A至图32B中呈现的结果再一次证明了在测试的细胞中未观察到h224G11抗体的内在活性。
实施例16：鼠野生型224G11与描述为224G11[C2D5-7]的嵌合铰链工程化224G11形式的体内比较(NCI-H441异种移植物模型)
NCI-H441源自乳头肺腺癌，其表达高水平的c-Met，并且证明了c-MetRTK的组成型磷酸化。
为了评价铰链工程化对挽救224G11鼠抗体的体内活性的必要性，将六至八周大的无胸腺鼠圈养在无菌滤器拔顶笼子中，维持于无菌条件并根据法国和欧洲指导操作。给小鼠皮下注射9x106NCI-H441细胞。然后，细胞植入后六天，肿瘤是可测量的(大约100mm3)，将动物分成具有相当肿瘤大小的6只一组，首先用装载剂量2mg抗体/鼠处理，然后用1mg/剂的每种待测试抗体一周处理两次。接着观察小鼠的异种移植物生长速率。通过公式计算肿瘤体积：π(Pi)/6×长度×宽度×高度。图33中所述的结果证明了鼠Mab没有任何体外激动剂活性行为，如预期的，作为有效的体内拮抗剂。如通过体外获得的结果所表明的，在磷酸化试验中，没有展示出明显激动剂作用的c224G11[C2D5-7]铰链工程化抗体证明了强烈的体内活性，与m224G11对NCI-H441异种移植物模型的活性相当。
实施例17：ADCC测试中h224G11的评价
因为h224G11是IgG1同种型，ADCC可能是其在人体中的体内活性的一部分。使用Hs746T或NCI-H441细胞作为目标细胞和从人外周血单核淋巴细胞纯化的NK细胞进行了体外[51Cr]释放细胞毒性试验。
简而言之，在100μCi的51铬(PerkinElmer)的存在下，用或不用20μg的h224G11Ab培养一百万个Hs746T或NCI-H441目标细胞一小时。然后，使用负选择(StemcellTechnologies)，用递增数量的分离自外周血单核细胞(PBMC)的人天然杀伤(NK)细胞涂布4×103个细胞。将细胞在37℃下一起再培养4小时。按照公式计算细胞裂解的百分比：[(实验51Cr释放-自发51Cr释放)/(全部51Cr释放-自发51Cr释放)]×100。自发释放表示在天然杀伤细胞不存在下培养目标细胞时获得的数量。全部释放表示用1％曲通X-100裂解目标细胞时获得的数量。在100的NK/目标细胞的比例下，h224G11将Hs746T(图34A)和NCI-H441(图34B)细胞的裂解各自明显地提高了62.9％和63.2％。
实施例18：免疫组织化学研究(IHC)
石蜡包埋肿瘤IHC染色的程序：将8至12μM的冷冻肿瘤切片立即固定于预先冷却的丙酮中，-20℃下，3分钟。然后将载玻片在室温下冷却30分钟至1小时。在PBS中洗涤2次后，使用过氧化物酶阻断剂(DakoK4007)将内源性过氧化物酶活性阻断五分钟。用PBS洗涤切片，并且就在4％的PBS-BSA中非特异性位点饱和前，在抗生素蛋白/生物素阻断剂(DakoX0590)中在室温下培养30分钟。然后，用生物素化的h224G11(50至10μg/ml)或人生物素化的IgG1/κ(50至10μg/ml，结合位点)作为阴性对照在室温下将载玻片培养2小时。
用PBS洗涤切片，并用抗生物素蛋白链菌素-过氧化物酶通用复合物(DakoK0679)培养30至45分钟。将3-氨基-9-乙基咔唑用于产生红色反应产物(Sigma)。将载玻片浸入苏木精中4分钟，以复染(DakoS3309)。
结果呈现于图35A-35C中。
h224G11将各种肿瘤类型的细胞膜不同地染色。在该免疫组织化学程序中，红色反应产物与细胞膜的阳性染色相关，缺乏红色反应产物与阴性染色相关，并且没有细胞膜的观察。IgG对照，人IgG1/κ是同种型相匹配的对照。
实施例19：抗c-MetMab对小鼠中c-Met扩增和异种移植的三个细胞系的体内活性
如图36A、37A和38A的FASC分析所示，Hs746T(ATCC)、MKN45(JCRB)(两个胃癌细胞)和EBC-1(JCRB)(一个肺鳞状细胞癌)是三个过度表达c-Met的细胞系。这些细胞系在文献中也被描述为c-Met的扩增细胞系。为了证明后一点，使用ΔΔCt方法通过定量实时PCR确定了c-Met基因扩增。使用QIAampDNAmidikit(Qiagen,LesUlis,FR)，从每个指定的细胞系提取50ng基因组DNA。参考基因是位于染色体17的DNA局部异构酶IIIα。用于c-Met基因的引物位于外显子14。二个基因相应的引物如Smolen等人(PNAS,2006,103:2316-2321)所描述的那些，并产生相似的PCR效率。QPCR步骤包括95℃一个10分钟的循环、随后为95℃、15秒/95℃、45秒的40个连续的循环。数据首先相对于参考基因标准化，然后将每个细胞系对每单倍体基因组含有一个c-Met基因拷贝的MCF-7细胞标准化。在图36B、37B和38B表示的结果证明3个细胞系展示出c-Met的显著扩增，排序从5至10倍基因扩增。
如所述的，这样的细胞结构地激活c-Met，进行蛋白印记分析(Westernblotassay)以确定在HGF(50ng/ml)不存在或存在时每个细胞系的c-Met磷酸化水平。为了那个目的，将细胞在无血清的培养基中过夜培养，然后用50ng/mlHGF处理2分钟，或不处理。用补充有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞。在4℃孵育细胞裂解物90分钟，然后离心，收集上清。使用BCA蛋白分析(Pierce)确定蛋白质浓度，样本进行免疫印迹。所用的抗体包括抗c-Met抗体、来自CellSignaling的克隆25H2、以及来自Biosource的抗P-c-MetY1230、1234、1235。用抗Y1230/1234/1235的磷酸特异的c-Met抗体的免疫印迹表明在每个扩增细胞系的强的受体磷酸化基线(图36C、37C和38C)。当HGF加入这些细胞时，没有观察到另外的磷酸化。这最后的观察确认了c-Met以HGF非依赖形式在Hs746T、MKN45和EBC-1细胞系中激活。
为了在配体非依赖的细胞系上体内检测我们的抗c-Met抗体，分别在完全的DMEM、RPMI1640或EMEM培养基中常规培养Hs746T、MKN45和EBC-1细胞。在植入前2天细胞分裂，从而其处于生长的指数期。将7百万个细胞植入到SCID(对于Hs746T和EBC-1)或CD1瑞士裸鼠(对于MKN45)。移植5至7天后，测量肿瘤，将动物分为具有相似肿瘤大小的6只的组。小鼠腹腔注射h224G11Mab，负载剂量2mg/小鼠，然后每周两次注射1mg抗体/小鼠。每周测量2次肿瘤大小，通过公式π/6×长×宽×高计算。用Mann-Whitney检测在每次测量的时间点进行统计分析。
该实验证明h224G11显著降低了Hs746T、MKN45和EBC1的肿瘤生长(图36D、37D和38D)，表明人源化抗体能够抑制胃的和肺的配体非依赖细胞系的肿瘤生长。在获得这些结果前，在这些人源化抗体中修饰铰链的存在如何影响其配体非依赖c-Met的失活是不明确的，因为改变的铰链也影响其激动剂/拮抗剂特征。
实施例20：SCID小鼠中Hs746T异种移植模型上h224G11活性的体外分析
为了确定导致Hs746T肿瘤异种移植抑制作用的更确切的机制，使用免疫组织化学(IHC)方法评估了h224G11的3次腹腔注射在肿瘤有丝分裂指数(Ki67)、凋亡(激活的半胱天冬酶3)和c-Met表达上的作用。分析了3只小鼠的每个状态。与对照相比，在处理的肿瘤上观察到了显著的c-Met下调(分别为图39中的C和D)。图39中的组(A)和(B)对应同种型对照。另外，在所有的处理肿瘤上观察到Ki67水平的显著降低(图39中的E和F)和激活的半胱天冬酶3染色的增加(图39中的G和H)，表明h224G11能够显著抑制细胞增殖并降低肿瘤内的细胞凋亡。
PCT/RO/134表(中译文)
仅供受理局使用
仅供国际局使用
国际申请该表格收到该表格 2011年6月14日
审定官员 WAGNER,Nathalie

Claims (22)

1.一种能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，用于预防或治疗需要其的患有以配体非依赖激活的c-Met为特征的癌症的病人的用途，
所述抗体包含重链和轻链，重链包含分别具有氨基酸序列SEQIDNo.1、2和3的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，轻链包含分别具有氨基酸序列SEQIDNo.5、6和7的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述抗体进一步包含包含氨基酸序列SEQIDNo.56的铰链区。
2.根据权利要求1所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于所述铰链区包含氨基酸序列SEQIDNo.57。
3.根据权利要求1所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于所述铰链区包含氨基酸序列SEQIDNo.21。
4.根据权利要求1所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于所述铰链区包含选自SEQIDNo.22至28和SEQIDNo.58至72的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，用于预防或治疗需要其的患有以c-Met过度表达为特征的癌症的病人的用途。
6.根据权利要求1所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，用于预防或治疗需要其的患有以来自c-Met基因扩增的c-Met过度表达为特征的癌症的病人的用途。
7.根据权利要求6所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，用于预防或治疗需要其的患有以来自c-Met基因扩增的c-Met过度表达，并导致配体非依赖激活的c-Met为特征的癌症的病人的用途。
8.根据权利要求6所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，用于预防或治疗需要其的患有以来自c-Met基因扩增的c-Met过度表达为特征的癌症的病人的用途，其中所述癌症选自肾细胞癌和胃癌。
9.根据权利要求1所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其由嵌合抗体组成。
10.根据权利要求1所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其由人抗体组成。
11.根据权利要求1所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其由人源化的抗体组成。
12.根据权利要求11所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQIDNo.4的序列的重链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQIDNo.8、9或10的序列的轻链可变结构域。
13.根据权利要求12所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQIDNo.4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQIDNo.8的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQIDNo.22的铰链区。
14.根据权利要求12所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQIDNo.4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQIDNo.9的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQIDNo.22的铰链区。
15.根据权利要求12所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQIDNo.4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQIDNo.10的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQIDNo.22的铰链区。
16.根据权利要求12所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQIDNo.4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQIDNo.8的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQIDNo.28的铰链区。
17.根据权利要求12所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQIDNo.4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQIDNo.9的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQIDNo.28的铰链区。
18.根据权利要求12所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，其特征在于其包括含有氨基酸序列SEQIDNo.4的序列的重链可变结构域；含有氨基酸序列SEQIDNo.10的序列的轻链可变结构域；和含有氨基酸序列SEQIDNo.28的铰链区。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体作为药物。
20.一种用于预防或治疗需要其的患有以配体非依赖激活的c-Met为特征的癌症的病人的组合物，所述组合物以活性成分方式包括由如权利要求1至19中任一项所要求的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物组成的化合物。
21.根据权利要求20所述的用于预防或治疗需要其的患有以配体非依赖激活的c-Met为特征的癌症的病人的组合物，作为药物。
22.根据权利要求1至19中任一项所述的能够抑制c-Met二聚化的单克隆抗体，或其二价功能性片段或衍生物，或如权利要求20或21所述的用于预防或治疗需要其的患有以配体非依赖激活的c-Met为特征的癌症的病人的组合物在制备用于预防或治疗需要其的患有以配体非依赖激活的c-Met为特征的癌症的病人的药物中的用途。
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