CN101643510A - 一种重组抗cd25人源化单克隆抗体的抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体，本发明公开的重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明公开的重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体具有灵敏度高的优点。

Description

一种重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体

技术领域

本发明涉及抗体药物技术领域。具体地说，本发明涉及一种新的重组抗人源化单克隆抗体的抗体。

背景技术

白细胞分化抗原CD25，又称Tac抗原，是白细胞介素-2(IL-2)受体的α亚单位(P55α，Rα亚单位)。T淋巴细胞表面IL-2受体由α(p55)、β(p75)、γ(p64)三个亚单位组成，α亚单位(又称Tac或CD25)仅表达于激活T淋巴细胞表面。

正常的IL-2受体是由三个亚单位α、β、γ三链以大量共价键组合而成，在静息T细胞表面表达率很低，活化的T细胞表面则有较充分的表达，其α亚单位是可诱导的，不能被其他受体分占，只能构成低亲和力受体；β和γ键则能构成中等亲和力受体，能被其他受体结合。α、β、γ三者的聚合体才能构成完整的高亲和力受体。作为IL-2的受体，CD25与IL-2结合后，虽不能传导信息，但能启动T细胞进入有丝分裂期。在肾移植受体内，由于异体移植肾刺激机体免疫系统，由免疫细胞如T细胞、NK细胞、LAK细胞产生的细胞因子IL-2能与经抗原活化的T淋巴细胞表面的受体(CD25)相结合，诱导T细胞的快速增殖，产生排斥反应。

由于CD25主要表达于激活的T淋巴细胞，因此，如果能够针对CD25分子，设计特异性的药物，仅抑制这群T细胞的活性，或清除该群T细胞，则能够在同种异体器官移植时，特异性地抑制针对移植物的免疫反应，单克隆抗体技术由于其高度的特异性和靶向性，很自然地被列为首选方案。

抗CD25单抗与Tac的特异性结合阻断了IL-2与IL-2受体复合物的结合，从而抑制了IL-2通过高亲和性IL-2受体诱导T细胞活化，也就抑制了排斥反应过程中细胞免疫的关键通道。其发挥免疫抑制的主要机制是：通过与IL-2受体Tac亚单位的结合竞争性地抑制IL-2依赖的T细胞增生；在体外可通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)引起抗Tac单抗介导的T细胞溶解(这可能是该药免疫抑制的另一种机制)。间接的免疫调理机制如IL-2表达水平下调；通过Fc段及Fc受体相互作用，选择性地灭活和破坏Tac阳性的淋巴细胞，导致反应性T细胞集落被清除，从而增强或放大选择性的免疫抑制效应。

然而，鼠源抗体在应用于人体时会引起强烈的免疫反应，严重阻碍了鼠源抗CD25单抗作为新型免疫抑制剂的疗效。随着人源化抗体技术的成熟，国外研究者对鼠源抗体进行了人源化改造，使其在保持原有特异性的同时，对人体的免疫原性大大降低，从而开发为理想的抗免疫排斥药物(Immunosuppression forneural xenografts：a comparison of cyclosporin and anti-CD25 monoclonal antibody.Honey CR，Shen H.J Neurosurg 1999 Jul；91(1)：109-13.Daclizumab.Linda R.W，Diana F.Drugs 1999，58(6)：1029-42.Placebo-controlled study of a humanizedanti-TAC monoclonal antibody in dual therapy for prevention of acute rejection afterrenal transplantation.Charpentier B，Thervet E.Transplant Proc 1998Jun；30(4)：1331-2)。目前，FDA及欧盟已批准2个抗CD25的单克隆抗体，一种是人源化单抗(Daclizumab)；另一种是人-鼠嵌合型抗CD25单抗(Basiliximab)，这两个抗体均已成功地用于防止肾移植后的急性排异反应，其治疗指数宽，不良反应小，半衰期长，Basiliximab半衰期约为6天，Daclizumab半衰期超过20天(Daclizumab：outcome of phase III trials and mechanism of action.DoubleTherapy and the Triple Therapy Study Groups.Vincenti F，Nashan B，Light S.Transplant Proc 1998 Aug；30(5)：2155-8 Reduction of acute renal allograftrejection by daclizumab.Daclizumab Double Therapy Study Group.Nashan B，LightS，Hardie IR，Lin A，Johnson JR.Transplantation 1999 Jan 15；67(1)：110-5 Thesafety and efficacy of a two-dose daclizumab(zenapax)induction therapy in livertransplant recipients.Eckhoff DE，McGuire B，Sellers M，Contreras J，Frenette L，Young C，Hudson S，Bynon JS.Transplantation 2000 May 15；69(9)：1867-72Results of 3-year phase III clinical trials with daclizumab prophylaxis for preventionof acute rejection after renal transplantation.Bumgardner GL，Hardie I，etc.Transplantation 2001 Sep 15；72(5)：839-45.Daclizumab：a review of its use inthe management of organ transplantation.Carswell CI，Plosker GL，Wagstaff AJ.BioDrugs2001；15(11)：745-73)，这两种抗体都是利用基因工程技术，采用哺乳动物细胞发酵技术表达的重组蛋白。

Daclizumab(商品名Zenapax)由美国Protein Design Labs公司开发，后将其授权给Hoffmann-La Roche(罗氏)公司生产，已于1997年获得FDA的批准，用于预防肾移植的急性排斥反应。该抗体包含90％的人IgG序列和10％的鼠序列，其中人序列由人IgG1的恒定区和Eu骨髓瘤抗体可变框架区组成，鼠序列由鼠抗Tac抗体的CDR构成，分子量144KDa。

在该单抗进行临床前研究及临床研究的过程中，以及将来获准上市后患者应用的过程中，均需要检测受试者(动物或人)或患者的血清中抗体的浓度，以监测血清中的抗体浓度是否达到有效的治疗浓度，从而指导临床治疗，W.Kenneth Washburn等(A Novel Three-Dose Regimen of Daclizumab in LiverTransplant Recipients With Hepatitis C：A Pharmacokinetic and PharmacodynamicStudy.W.Kenneth Washburn，Lewis W.Teperman，Thomas G.Heffron，David D.Douglas，Steven Gay，Eliezer Katz，and Goran B.G.Klintmalm LIVERTRANSPLANTATION 12：585-591，2006)报道了免疫荧光及ELISA方法检测抗CD25人源化单抗的方法，灵敏度分别是4μg/ml及6ng/ml，在进行血清药物浓度的检测时，仍然存在灵敏度无法达到检测要求，以及存在非特异性的检出干扰，所以迫切需要一种能有效、快速检测抗CD25单克隆抗体类药的产品。

发明内容

本发明公开了一种重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体，以达到能有效、快速检测抗CD25单克隆抗体药物的目的；

更进一步，本发明还公开了编码上述重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体的DNA分子；

本发明还公开了一种表达载体、一种真核宿主细胞；

最后，本发明还公开了该单克隆抗体的制备方法和其用途。

更详细地，本发明一方面提供了一种重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体，该抗体含有重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明另一方面提供了编码上述单克隆抗体的DNA分子，该DNA分子含有SEQID NO：3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQIDNO：4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。

本发明第三方面提供了一种表达载体，该表达载体含有上述DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其特征在于，它被上述表达载体转化。在一个较佳的实例中，该宿主细胞是CHO细胞。

本发明第五方而提供了一种重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体检测CD25人源化单抗浓度的方法，其特征在于，所述的方法为ELISA法。

本发明第六方面提供了一种制备上述单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括：

a)提供一表达载体，该表达载体含有上述DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；

b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞；

c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和

d)分离纯化获得所述单克隆抗体。

发明人利用本发明得到的抗体检测CD25人源化单抗灵敏度高，可以达到0.01ng/mL，特异性强，而文献报道的其他检测方法检测CD25人源化单抗其灵敏度只有6ng/ml，利用本发明抗体建立的ELISA方法检测抗CD25人源化单抗的方法，灵敏度提高10倍以上，特异性也获得显著改善，达到了本发明的目的。

附图说明

图1：载体pMG18，并且标明了其中的元件及酶切位点；其中，hCMV pro为人巨细胞病毒主要早期启动子；Ck为人κ链恒定区基因；IgG1constant为人γ1链恒定区基因；pA为多聚腺苷化信号；DHFR为二氢叶酸还原酶基因；AmpR为氨苄青霉素抗性基因。

图2：本发明所构建的pM载体，PCR法自小鼠脾细胞扩增IgG1重链恒定区序列，并将CH1起始氨基酸突变为Ala-Ser，同时含有了NheI酶切位点，3’端设计BamHI酶切位点，扩增后测序验证无误后，NheI和BamHI双酶切小鼠IgG1恒定区片段和pMG18，将小鼠IgG1恒定区连入pMG18，构建成pM载体。

图3：本发明所构建的pM(H+L)载体，含有重组抗CD25人源化单抗的重链全长和轻链全长基因。

图4：亲和力测定结果。

对说明的详细描述

本发明涉及一种重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

本发明中，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈p一折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分p折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体〔免疫球蛋白〕的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgGI，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、β、ε、μ、γ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是众所周知的。

单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256：495(1975)首先提出)制得，或用重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等，Nature，3 52：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。

本发明提供了编码本发明重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体的DNA分子。在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQ ID NO：3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。

在获得编码本发明重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体重链可变区和轻链可变区的核昔酸序列后，通常可通过以下方法来制备本发明的单克隆抗体。

首先，提供含有编码本发明单克隆抗体的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。

本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。

编码本发明单克隆抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来制得。例如，可根据本发明公开的序列人工合成或用PCR法扩增得到编码该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。然后，用本领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切位点将这些核苷酸序列插入合适的表达载体中，使它们分别在表达载体所携带的重链恒定区编码序列和轻链恒定区编码序列之前，并使它们在同一读框内。

本发明中所用的表达载体是本领域技术人员已知的各种市售的表达载体，例如购自Qiagen和Promega公司的表达载体pcDNA3.1，pET22等，以及可购得的表达载体pMG 18(《根据INCP-9质粒序列进行环境监测的工具的开发》(DEVELOPMENT OF TOOLS FOR ENVIRONMENTAL MONITORINGBASED ON INCP-9 PLASMIDS SEQUENCES)，A.Created，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.Thomas School of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston.Birmingham B 15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus State University Scoring Av.4，Minsk 220080 Belarus中公开的内容制备得到)。

随后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在本发明中，较佳的宿主细胞是CHO细胞。用表达载体转化宿主细胞的方法有很多种，所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核昔酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1，5一二甲基一1，5一二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。在本发明中，较佳的方法是电穿孔法或脂质体介导法等。例如可采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒来转染CHO细胞。

然后，在适合本发明单克隆抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose，羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体。

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析来测定。

下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。

具体实施方式

CD25人源化单抗：Zenapax，ROCHE公司产品，市售得到。

实施例1  从抗体库中筛选重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体基因可变区

1)鼠源抗体库的构建

CD25人源化单抗与弗氏佐剂免疫Balb/C小鼠，免疫4次后，小鼠血清1∶500稀释后与CD25人源化单抗显强阳性反应，取免疫后小鼠脾脏，按照Marks等人J.Mol.Biol.，222，581-597.Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227，381-388.Haidaris CG等人J Immunol Methods.2001 Nov 1；257(1-2)：185-202，Griffiths，A.D.等人EMBO J.，13，3245-3260(1994).Nissim，A.等人EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法，构建鼠源抗体库。

2)筛选

将复苏的抗体库菌株1毫升加入新鲜LB培养基(Peptone和Yeast Extract配制，均购自Oxide)14毫升，于50毫升三角瓶中37℃培养16小时。

12000rpm高速离心10分钟，将上清液转移至无菌的50毫升离心管中，保存备用。确保其滴度应在2×10¹¹以上。用人IgG1作为抗原，常规方法包被25毫升细胞培养瓶。包被后的细胞瓶中加入不少于3×10¹⁰噬菌体，37℃温育1小时。收集培养瓶中的上清液，备用。CD25人源化单抗作为抗原用常规方法包被25毫升细胞培养瓶。包被后的细胞瓶中加入上步收集的上清液，37℃温育1小时。倒掉瓶中的液体，用10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗涤培养瓶10次。在培养瓶中加入1毫升对数期的TG1细胞，37℃温育震荡培养16小时。

重复上段所述步骤4次。

将上述获得的细胞稀释至10⁵细胞/毫升后在加有0.1氨苄青霉素的1.5％琼脂平板上培养，获得单克隆。

取上述平板上的克隆在96孔深孔板上进行培养，每孔一个克隆，共作960个克隆(10块96孔板)。

将上述深孔板在96孔板离心机上5000RPM离心20分钟后，将上清转移到新的无菌深孔板，封口后保藏于4℃备用。

取96孔板10块，每孔中加入CD25人源化单抗10微升常规包被后，分别加入上述保存的上清10微升，37℃温育1小时后用含有1％Tween-20的PBS洗涤20次。加入1微升HRP标记的羊抗M13单抗(购自Pharmacia公司)，37℃温育30分钟后用1％Tween-20的PBS洗涤10次。

加入含有0.025％DAB(sigma D-5637)显色剂的PBS 200微升和1微升1％的H₂O₂37℃温育显色20分钟后在读板机上读取595纳米处的光吸收。

根据光吸收读数确定显色反应强的孔，这些孔相对应的克隆即为亲和力较强的抗体可变区克隆。本试验结果共筛选出311个阳性克隆，根据其读数确定其中5个亲和力最强的克隆。

3)抗体可变区编码序列向表达载体的克隆

使上述5个克隆的菌株在100毫升LB培养基中扩增，然后按照生产商说明书用Promega公司的质粒DNA抽提纯化试剂盒(

Plus SV Minipreps DNAPurification System)纯化质粒DNA。

用XbaI和NheI限制性酶酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取121bp左右的带进行胶回收，所得片段即为重链可变区。PCR扩增后，进行序列测定。用XbaI和BsiWI限制性酶酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取112bp左右的带进行胶回收，所得片段即为轻链可变区。PCR扩增后，进行序列测定。确定正确序列后，化学合成法合成轻链全长序列，5’端设计XbaI酶切位点，3’端设计BamHI酶切位点，恒定区为小鼠κ轻链恒定区序列。

PCR法自小鼠脾细胞扩增IgG1重链恒定区序列，并将CH1起始氨基酸突变为Ala-Ser，同时含有了NheI酶切位点，3’端设计BamHI酶切位点，扩增后测序验证无误后，NheI和BamHI双酶切IgG1恒定区片段和pMG18，将IgG1恒定区连入pMG18(如图1所示)，构建的新载体命名为pM，如图2所示。

用XbaI和NheI限制性酶酶切表达载体pM。该表达载体的酶切图谱如图2所示。然后将上述重链可变区插入该表达载体的XbaI/NheI位点中。同样，利用BsiWI和EcoRI限制性酶将抗体轻链全长cDNA插入到pM载体的BsiWI/EcoRI位点中，从而构建得到含有抗重组抗CD25人源化单抗的单克隆抗体重链全长和轻链全长基因的表达载体pM(H+L)，如图3所示。

4)CHO细胞的转染与重组克隆的筛选

上述构建的带有抗体基因的表达载体pM(H+L)分别转化大肠杆菌DH5α菌株中接种于100毫升LB培养基中进行扩增，用Qiagen公司的超纯质粒DNA纯化试剂盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)抽提纯化质粒DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒(lipofectamine 2000transfection reagent，11668-027)，将上述纯化的质粒DNA共转染CHO细胞，操作参照厂家的说明书进行。

转化的CHO细胞在MTX选择培养基(sigma A-6770)上进行连续9周的选择，最后在96孔板上进行极限稀释培养，连续进行3次，进行单克隆化。

挑出的单克隆细胞系在RPMI 1640培养基(Invitrogen)上进行培养，对上清进行Western印迹试验(Molecular Cloning 3)，根据染色反应判断表达强度，挑选出11个表达强的克隆作为候选细胞株。

5)单克隆抗体的纯化

用Protein A亲和层析柱从细胞培养上清中直接分离纯化出上述单克隆抗体，经SDA-PAGE电泳证明，所得产物纯度大于90％。亲和层析的产物再次经过分子筛层析，获得了纯度＞98％的样品。

实施例2  抗体基因在CHO细胞中的表达强度

将上述筛选得到的11个高表达候选克隆培养于10cm的组织培养皿中，如下所述用ELISA法测定抗体的表达量。将羊抗鼠IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，经2％BSA于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(鼠IgG1)，37℃孵育2小时，加入HRP-羊抗鼠κ)(上海优宁维生物科技有限公司GKBF-90P)进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB(sigma，T-8768)于37℃作用10分钟，最后用H₂SO₄终止反应，测A₄₅₀值。下表1中显示了上述筛选获得的11个候选克隆的表达量。

表1候选克隆在CHO细胞中的表达量

细胞株编号	1B5	1D9	2E2	3C7	3F6	5B4	5G7	7C1	8D9	8F2	9G5
												表达量(微克/毫升)	275	514	460	298	354	874	1026	511	937	429	371

从上表1可以看出，5B4，5G7和8D9具有很高的表达水平。

实施例3  重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体基因的DNA测序

根据系谱，对上述获得的5G7细胞株的抗CD25人源化单抗的抗体基因进行DNA测序。结果如下：5G7轻链可变区基因序列为SEQ ID NO：3(5′到3′)336bp其氨基酸序列为SEQ ID NO：1中；5G7重链可变区基因序列SEQ ID为NO：4((5′到3′)363bp)，其氨基酸序列显示为SEQ ID NO：2。

实施例4  单克隆抗体亲和力研究

按以下方法对实施例1得到三个高表达的细胞克隆：5B4，5G7和8D9进行纯化：10000rpm离心除去细胞和细胞碎片，50Kd截留分子量的滤膜超滤浓缩至1/10体积，超滤缓冲液是20mM磷酸盐缓冲液，pH7.2。过rProtein A-sepharose亲和层析柱，上样液为20mM磷酸盐缓冲液，pH7.2，洗脱液为20mM柠檬酸，pH3.5，100mM NaCl。分子筛(Sephadex G200)层析。洗脱液为20mM磷酸盐，pH7.2，得纯品。

亲和力测定采用Scatchard(Munson等人，1980，Anal.BioChem.，107：220)及Biacore分析法(Biacore T-100操作手册及Hosse RJ等Anal Biochem.2009 Feb15；385(2)：346-57.)进行。结果表明，5B4，5G7和8D9三种单抗的亲和力分别达到8.5×10^-9，5.5×10^-10和8×10^-8，详见附图4。

实施例5  重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体检测CD25人源化单抗

1.试剂和材料

1.1CD25人源化单抗：Zenapax

1.2市售anti human IgG kappa light chain单抗，上海优宁维生物科技有限公司，09-1042-1。

1.3市售anti human IgG Fc gamma多抗，HRP标记，上海优宁维生物科技有限公司，SJ18120。

1.4HRP显色底物：TMB，上海科华公司，分A液及B液，临用前，两者等体积混合。

1.5终止液：0.5mol/L硫酸。

1.6pH＝7.2的PBS：称取KH₂PO₄ 0.21g，NaCl 9.0g，Na₂HPO₄.12H₂O 0.97g，加注射用水溶解至1000ml。

1.7包被缓冲液：20mmol/l pH＝9.6的碳酸钠缓冲液。

1.8封闭缓冲液：称取3g牛血清白蛋白，加入pH7.2的PBS溶解至100ml。

1.9洗涤缓冲液：取1ml Tween20，加入PBS至1升。

2.方法：夹心ELISA法

2.1重组抗CD25人源化单抗的抗体(本发明抗体5G7，实施例4纯化获得)及市售抗kappa轻链抗体稀释于包被缓冲液中，浓度1μg/ml，包被96孔酶标板，0.1ml/well，37℃2h。

2.2洗涤：洗涤缓冲液洗涤2遍，每次均在吸水纸上拍干。

2.3封闭：封闭缓冲液加满孔后37℃2h。

2.4洗涤：洗涤缓冲液洗涤3遍，每次均在吸水纸上拍干。

2.5加抗原：加入用封闭缓冲液稀释至1000，500，250，125，62.5，31.25，15.625，7.8，3.9，1.95，0.98，0.49，0.245，0.12，0.06，0.03，0.015，0.0075(ng/mL)的CD25人源化单抗(Zenapax)，0.1ml/孔，设2复孔。

2.6 37℃2h。

2.7洗涤：洗涤缓冲液洗涤5遍，每次均在吸水纸上拍干。

2.8加入HRP标记的抗人IgG Fc gamma二抗：加入用PBS 1∶2000稀释的二抗，37℃1h。

2.9洗涤：洗涤缓冲液洗涤5遍，每次均在吸水纸上拍干。

2.10显色：加显色底物100μL/孔，避光显色5～20min(显色时间视显色情况而定)，加终止液50μL/孔。

2.11酶标仪读数：测量450nm光吸收，以630nm为参考波长(Molecular Device，Spectra MAX 190)。

2.12用标准品浓度(对数)与A450/630nm值做直线回归方程。

结果表明，本发明公开的抗体其检测CD25人源化单抗灵敏度高，可以达到0.01ng/mL，而市售抗体利用相同检测方法其灵敏度只有1ng/ml。本发明抗体的灵敏度为市售抗体的100倍，达到了本发明的目的。

序列表

<110>上海抗体药物国家工程研究中心有限公司

<120>一种重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体

<130>LIVER TRANSPLANTATION 12：585-591，2006

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>113

<212>PRT

<213>轻链可变区氨基酸序列

<400>

Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu

1               5                   10                  15

Gly Gln Ser Val Thr Val Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Asn

            20                  25                  30

Tyr Gly Thr Thr Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

        35                  40                  45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro

    50                  55                  60

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile

65                  70                  75                  80

His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser

                85                  90                  95

Arg Lys Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105                 110

Arg

<210>2

<211>120

<212>PRT

<213>重链可变区氨基酸序列

<400>2

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Glu Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Asp Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Ala Gln Ile Arg Trp Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

    50                  55                  60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65                  70                  75                  80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Ser Gly Ile Tyr

                85                  90                  95

Tyr Cys Thr Gly Gly Gly Ser Tyr Val Ala His Trp Gly Gln Gly Thr

            100                 105                 110

Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser

        115                 120

<210>3

<211>339

<212>DNA

<213>轻链可变区核苷酸序列

<400>3

ggtgacattg tgctcaccca atctccagct tctttggctg tgtctctagg gcagagtgtc     60

accgtctcct gcagagccag tgaaagtgtt gaaaattatg gcactacttt aatgcagtgg    120

taccaacaga aaccaggaca gccacccaaa ctcctcattt atggtgtatc caacgtagaa    180

tctggggtcc ctgccaggtt tagtggcagt gggtctggga cagacttcac cctcaacatc    240

catcctgtgg aggaggatga tattgcaatg tatttctgtc aacaaagtag gaaggttccg    300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgg                           339

<210>4

<211>360

<212>DNA

<213>重链可变区核苷酸序列

<400>4

gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggagcaac ctggaggatc catgaaactc     60

tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt aattattgga tgaactgggt ccgccagtct    120

ccagacaagg ggcttgagtg ggttgctcaa attagatgga aatctgataa ttatgcaaca    180

cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc agcatctcaa gagatgattc caaaagtagt    240

gtctacctgc aaatgaacaa cttaagggtt gaagactctg gaatttatta ctgcacaggc    300

gggggtagct acgtggctca ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgcagctagc    360

Claims (7)

1.一种重组抗CD25人源化单克隆抗体的抗体，包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种DNA分子，编码权利要求1所述的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的DNA分子，其特征在于含有SEQ ID NO：3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。

4.一种表达载体，含有权利要求2或3任一所述的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。

5.权利要求4所述的表达载体，为pM(H+L)。

6.一种真核宿主细胞，被权利要求4所述的表达载体转化。

7.权利要求6所述的真核宿主细胞为CHO细胞。

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