KR20070000507A

KR20070000507A - 바실러스 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균을 사용하여발효에 의해 퓨린 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를제조하는 방법

Info

Publication number: KR20070000507A
Application number: KR1020067022902A
Authority: KR
Inventors: 나탈리아 파블로브나 차카태바; 비탈리 아르카디에비치 리브쉬츠; 세르게이 비크토로비치 그론스키; 에카테리나 알렉산드로브나 쿠투코바; 안나 에브게니에브나 노비코바; 유리 이바노비치 코즈로브
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2007-01-02
Also published as: BRPI0509056A; EP1733038A2; US9012182B2; US20080241888A1; JP2007530011A; WO2005095627A2; JP4760711B2; EP1733038B1; KR101089559B1; WO2005095627A3

Abstract

바실러스(Bacillus) 속 또는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 세균을 사용함을 포함하여 퓨린 염기 유사체, 퓨린 뉴클레오사이드 및 퓨린 뉴클레오타이드(예를 들면, 이노신 및 5'-이노신산)를 제조하는 방법을 제공하며, 이때, 당해 세균의 퓨린 생산성은 YdhL 단백질의 활성을 증가시킴으로써 향상된다. 또한 바실러스 아밀로리퀘패시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터의 YdhL 단백질의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 유전자를 개시한다.

Description

바실러스 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균을 사용하여 발효에 의해 퓨린 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 제조하는 방법{Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus Bacillus or Escherichia}

본 발명은 5'-이노신산 및 5'-구아닐산의 합성의 원료로 중요한 퓨린 뉴클레오사이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 당해 생산 방법에 사용되는 신규한 미생물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 퓨린 염기 유사체 및 퓨린 뉴클레오사이드에 대한 신규한 DNA 내성을 발현하는 세균에 부여된 신규한 DNA 및 단백질 종에 관한 것이다.

통상적으로, 이노신과 같은 뉴클레오사이드는 아데닌 영양요구 균주 또는 퓨린 유사체 및 설파구아니딘과 같은 각종 약물에 대한 약물 내성이 부여된 균주를 사용하는 발효 방법을 통해 산업적으로 제조되어 왔다. 이러한 균주의 예로는 바실러스(Bacillus) 속{일본특허공보 제(소)54-17033호(1979), 제(소)55-2956호(1980), 및 제(소)55-45199호(1980), 일본공개특허출원 제(소)56-162988호(1981), 일본특허공보 제(소)57-14160호(1982) 및 제(소)57-41915호(1982), 및 일본공개특허출원 제(소)59-42895호(1984)}, 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속{일본특허공보 제(소)51-5075호(1976) 및 제(소)58-17592호(1972), 및 문헌[참조: Agric. Biol. Chem., 42, 399(1978)]}, 또는 에스케리키아(Escherichia) 속(국제공개공보 제WO9903988호) 등에 속하는 균주가 포함된다.

이러한 돌연변이 균주의 획득은 통상적으로 미생물에 UV 조사 또는 니트로소구아니딘(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘) 처리와 같은 돌연변이유발 처리를 가하는 단계, 및 목적하는 균주를 적합한 선별 배지를 통해 선별하는 단계를 포함한다. 반면, 유전자 조작 기법을 사용하는 이러한 돌연변이 균주의 육종이 또한 바실러스 속{일본특허공보 제(소)58-158197호(1983), 제(소)58-175493호(1983), 제(소)59-28470호(1984), 제(소)60-156388호(1985), 제(평)1-27477호(1989), 제(평)1-174385호(1989), 제(평)3-58787호(1991), 제(평)3-164185호(1991), 제(평)5-84067호(1993), 및 제(평)5-192164호(1993)}, 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속(일본공개특허출원 제(소)63-248394호(1988)}, 또는 에스케리키아 속(국제공개공보 제WO9903988호)에 속하는 균주에서 실행되어 왔다.

이들 이노신-생산 균주의 생산성은 추가로 이노신-분비능을 증가시킴으로써 개선할 수 있다. 현재, 세포질성 세포막을 통한 대사산물의 투과가 일반적으로 특이적 유출 수송인자 단백질에 의해 매개됨이 널리 받아들여지고 있다(문헌[참조: Pao, S.S. et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62 (1), 1-34, (1998) ; Paulsen, I. T. et al., J. Mol. Biol., 277, 573-592(1998); Saier, M. H. et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 257-279(1999]). 본 발명자는 이미 에스케리키아 속 또는 바실러스 속에 속하며, rhtA(ybiF) 유전자에 의해 암호화된 RhtA 단백질의 증강된 활성, yijE 유전자에 의해 암호화된 YijE 단백질의 증강된 활성, ydeD 유전자에 의해 암호화된 YdeD 단백질의 증강된 활성을 갖는 이노신- 또는 크산토신-생산 균주가 이들 각각의 모균주보다 더 많은 이노신 또는 크산토신을 생산하였음을 나타낸 바 있다(각각, 러시아 특허 제2002101666호, 제2002104463호 및 제2002104464호). 최근, 비. 서브틸리스(B. subtilis)로부터의 YdhL이 퓨린 유사체 2-플루오로아데닌에 대한 감수성을 낮춤이 밝혀졌다. 게다가, 간접적인 증거가 YdhL이 하이포크산틴의 내부 풀(pool)의 양을 감소시킴을 나타낸다(문헌[참조: Johansen et al, J. Bacteriol., 185, 5200-5209, 2003]). 그러나, 뉴클레오사이드 분비 및/또는 뉴클레오사이드 생산에 대한 YdhL 과발현의 영향은 밝혀져 있지 않다.

추가로, 바실러스 아밀로리퀘패시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터의 YdhL도 보고되어 있지 않으며, 뉴클레오사이드 분비 및/또는 뉴클레오사이드 생산에 대한 YdhL 과발현의 영향도 밝혀져 있지 않다.

발명의 개시

본 발명의 목적은 이노신-생산 균주에 의한 이노신의 생산을 향상시키고, 이들 균주를 사용하여 이노신 및 5'-이노신산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

이러한 목적은, 다중 복사체 벡터 상에 위치한 유전자의 야생형 대립유전자를 이. 콜라이(E. coli) 균주 내로 도입했을 시, 퓨린 염기 유사체(예를 들면, 8-아자아데닌, 6-메틸퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-머캅토퓨린, 8-아자구아닌) 및 퓨린 뉴클레오사이드(예를 들면, 이노신 및 구아노신)에 대한 내성을 부여하는 추정 막 단백질을 암호화하는 비. 서브틸리스의 ydhL 유전자를 동정함으로써 달성하였다. 또한, 바실러스 아밀로리퀘패시엔스로부터의 기존의 비공지된 ydhL 유전자를 분리하고 이의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 추가로, 당해 유전자의 추가의 복사체를 바실러스 속 또는 에스케리키아 속에 속하는 각각의 이노신-생산 균주의 세포 내로 도입한 경우, 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 아밀로리퀘패시엔스로부터의 ydhL 유전자가 뉴클레오사이드 생산을 향상시킬 수 있다고 결정하였다. 이로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 바실러스 속 또는 에스케리키아 속에 속하고, 이노신 생산능을 갖는 미생물을 제공한다.

본 발명의 목적은

(A) 서열 번호 2로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및

(B) 서열 번호 2로 나타낸 아미노산 서열에 하나 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 첨가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하며, 바실러스 속 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균에 퓨린 염기 유사체, 이노신 및 구아노신으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 퓨린에 대한 내성을 부여하는 활성을 갖는 단백질(당해 단백질의 활성을 당해 세균에서 증강시킨 경우)

로 이루어진 그룹 중에서 선택된 바실러스 아밀로리퀘패시엔스로부터의 YdhL 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 상기한 바와 같은 단백질을 암호화하는 DNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은,

(a) 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA, 및

(b) 엄격한 조건 하에 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열로부터 제조할 수 있는 프로브와 하이브리드화 가능하며, 바실러스 속 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균에 퓨린 염기 유사체, 이노신 및 구아노신으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 퓨린에 대한 내성을 부여하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA(당해 단백질의 활성을 당해 세균 내에서 증강시키는 경우)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 상기한 바와 같은 DNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 엄격한 조건이 60℃에서, 1 x SSC, 0.1% SDS를 포함하는 상기한 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 퓨린-생산능을 가지며,

(A) 바실러스 아밀로리퀘패시엔스로부터의 ydhL 유전자에 의해 암호화된 단백질,

(B) 바실러스 서브틸리스로부터의 ydhL 유전자에 의해 암호화된 단백질, 및

(C) (A) 또는 (B)의 ydhL 유전자의 오토로그(ortholog)에 의해 암호화된 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택된 단백질의 증강된 활성을 갖는, 바실러스 속 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 퓨린이 이노신 또는 구아노신인 상기한 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 단백질의 활성이 당해 단백질을 암호화하는 유전자의 복사체 수를 증가시키거나, 당해 세균의 염색체 상의 DNA의 발현 조절 서열을 변형시킴으로써 증강된 상기한 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 형질전환을 저 복사체 수 벡터를 사용하여 수행하는 상기한 바와 같은 세균을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 상기한 바와 같은 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계, 퓨린 뉴클레오사이드가 배양 배지로 분비되도록 하는 단계, 및 당해 퓨린 뉴클레오사이드를 배양 배지로부터 수집하는 단계를 포함하여 퓨린 뉴클레오사이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 퓨린 뉴클레오사이드가 이노신, 크산토신 또는 구아노신인 상기한 바와 같은 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 당해 세균이 퓨린 뉴클레오사이드 생합성 유전자의 증강된 발현을 갖도록 변형된 상기한 바와 같은 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 상기한 바와 같은 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계, 퓨린 뉴클레오사이드를 인산화시켜 퓨린 뉴클레오타이드를 생성시키는 단계, 퓨린 뉴클레오타이드가 배양 배지로 분비되도록 하는 단계, 및 퓨린 뉴클레오타이드를 수집하는 단계를 포함하여, 퓨린 뉴클레오타이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 퓨린 뉴클레오타이드가 5'-이노신산, 5'-크산틸산 또는 5'-구아닐산인 상기한 바와 같은 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은, 당해 세균이 퓨린 뉴클레오타이드 생합성 유전자의 증강된 발현을 갖도록 변형된 상기한 바와 같은 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 청구항 제5항에 따르는 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계, 크산토신을 인산화시켜 5'-크산틸산을 생성시키는 단계, 5'-크산틸산을 아민화하여 5'-구아닐산을 생성시키는 단계, 및 5'-구아닐산을 수집하는 단계를 포함하여, 5'-구아닐산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 pYDHL4 플라스미드에 포함된 DNA 단편에 의해 암호화된 비. 아밀로리퀘패시엔스 YdhL 단백질(YDHL BA; 서열 번호 2) 및 pYDHL1 플라스미드에 포함된 DNA 단편에 의해 암호화된 비. 서브틸리스 YdhL 단백질(YDHL BS; 서열 번호 4)의 배열을 나타낸다. 기호 "^*"는 YDHL_BA와 YDHL_BS 사이의 공통의 아미노산을 의미한다. 기호 ":"는 YDHL_BA와 YDHL_BS 사이의 아미노산의 유사성을 의미한다.

도 2는 pMWMX1 플라스미드의 구조를 나타낸다.

바람직한 양태의 기술

I. 본 발명의 단백질

본 발명의 단백질은 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질, 및 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 나타낸 아미노산 서열에 하나 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 첨가를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 바실러스 속 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균에 퓨린 염기 유사체 또는 퓨린 뉴클레오사이드(예를 들면, 이노신 또는 구아노신)에 대한 내성을 부여하는 활성을 갖는 단백질을 포함한다.

서열 번호 2로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질은 바실러스 아밀로리퀘패시엔스로부터의 YdhL 단백질이다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 ydhL 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 본원에 이르러서야 공지되었다.

바실러스 서브틸리스로부터의 YdhL 단백질은 퓨린 뉴클레오타이드의 생합성 경로에 관여하지 않으며, 주요 촉진인자 상위계열(Major Facilitator Superfamily)(문헌[참조: Pao, S.S., et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(1): 1-32, (1998)]), 및 오토로그 그룹의 아라비노스 유출 퍼미아제 클러스터 (COG) 2814(문헌[참조: Tatusov, R.L. et al., Nucleic Acids Res., 29:22-28(2001)])에 속한다. 상기 계열에 속하는 이. 콜라이 단백질, AraJ 및 YdeA 또한 아라비노스 유출에 관여한다(문헌[참조: Bost, S. et al., J. Bacteriol., 181:2185-2191(1999)]). 바실러스 서브틸리스의 게놈은 ydhL 유전자의 동족체를 암호화하는 다른 5개의 유전자: ybeL , yceJ , yfhI , ytbD , ywfA를 포함한다. 비. 서브틸리스의 YdhK 단백질은 388개의 아미노산으로 이루어진 고도의 소수성 단백질이며, 비공지된 기능을 갖는 12개의 추정 횡막 단편을 포함한다. YdhL 단백질은 ydhL 유전자에 의해 암호화된다. 바실러스 서브틸리스 아종(subsp.) 서브틸리스 균주 168(GenBank에서 번호 제624675호 내지 제625838호; 수탁 번호 제CAB12399.2호; GI:32468705)의 ydhL 유전자는 53.50°에서 ydhK 및 ydhM 유전자 사이의 염색체 상에 위치한다.

본 발명의 단백질에서 변형될 수 있는 "수개의" 아미노산의 수는 당해 단백질의 3차원 구조에서 아미노산 잔기의 위치 및/또는 유형에 따라 다르다. 이는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 나타낸 바와 같은 단백질에 대하여 2개 내지 40개, 바람직하게는 2개 내지 20개, 및 보다 바람직하게는 2개 내지 5개일 수 있다. 이는 일부 아미노산이 다른 아미노산에 고도로 상동성이고, 이 때문에 3차원 구조 또는 활성이 이러한 변화에 의해 영향을 받지 않는다는 사실 때문이다. 따라서, 서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 나타낸 아미노산 서열에 하나 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 첨가를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질은 YdhL 단백질의 전체 아미노산 서열에 관하여 30 내지 50% 이상, 바람직하게는 50 내지 70% 이상, 및 가장 바람직하게는 70 내지 90% 이상의 상동성을 가지며, 당해 단백질의 활성을 유지하는 단백질일 수 있다.

서열 번호 2 또는 서열 번호 4로 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가지며, YdhL 단백질의 활성을 유지하는 단백질이 본 발명에 포함되며, 가장 바람직하다.

상동성의 정도를 평가하기 위해, 수개의 널리 공지된 산출 방법(예를 들면, BLAST 검색, FASTA 검색 및 CrustalW)을 사용할 수 있다.

BLAST{기본 국소 배열 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool)}는 프로그램 blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn 및 tblastx에 의해 사용되는 발견적 검색 알고리즘이며; 이들 프로그램은 Karlin, Samuel 및 Stephen F. Altschul의 통계 방법(문헌[참조: Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-68 (1990);"Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-7 (1993])을 사용하여 이들의 발견에 의미를 할당한다. FASTA 검색 방법은 W.R.Pearson에 의해 기술되어 있다(문헌[참조: "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 183:63-98 (1990)]). ClustalW 방법은 Thompson J.D., Higgins D.G 및 Gibson T.J.에 의해 기술되어 있다(문헌[참조: CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 22: 4673- 4680 (1994)]).

상기한 바와 같은 본 발명의 단백질의 변화는 통상 당해 단백질의 활성을 유지하도록 하는 보존적 변화이다. 치환 변화는 아미노산 서열의 하나 이상의 잔기를 제거하고 상이한 잔기를 이의 자리에 삽입하는 변화를 포함한다. 상기한 단백질의 원래 아미노산을 치환할 수 있고, 보존적 치환으로 여겨지는 아미노산의 예에는 Ala의 ser 또는 thr로의 치환; arg의 gln, his 또는 lys로의 치환; asn의 glu, gln, lys, his, asp로의 치환; asp의 asn, glu 또는 gln로의 치환; cys의 ser 또는 ala로의 치환; gln의 asn, glu, lys, his, asp 또는 arg로의 치환; glu의 asn, gln, lys 또는 asp로의 치환; gly의 pro로의 치환; his의 asn, lys, gln, arg, tyr로의 치환; ile의 leu, met, val, phe로의 치환; leu의 ile, met, val, phe로의 치환; lys의 asn, glu, gln, his, arg로의 치환; met의 ile, leu, val, phe로의 치환; phe의 trp, tyr, met, ile 또는 leu로의 치환; ser의 thr, ala로의 치환; thr의 ser 또는 ala로의 치환; trp의 phe, tyr로의 치환; tyr의 his, phe 또는 trp로의 치환; 및 val의 met, ile, leu로의 치환이 포함된다.

본 발명의 단백질에 관한 "활성"은 퓨린 염기 유사체(예를 들면, 8-아자아데닌, 2,6-다이아미노퓨린, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌)에 내성을 갖고/거나 뉴클레오사이드(예를 들면, 이노신 및 구아노신)에 내성을 갖는 단백질을 보유하는 세균을 제조하는 것을 의미한다.

"퓨린 염기 유사체 및/또는 퓨린 뉴클레오사이드에 내성을 갖는"이란 표현은 야생형 또는 모균주는 유사한 조건 하에서 성장할 수 없는 반면, 퓨린 염기 유사체(예를 들면, 8-아자아데닌, 6-메틸퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 6-머캅토퓨린, 8-아자구아닌), 또는 퓨린 뉴클레오사이드(예를 들면, 이노신 또는 구아노신)을 농도 단위로 함유하는 최소 배지에서 성장하는 세균의 특성, 또는 퓨린 염기 유사체 또는 퓨린 뉴클레오사이드를 함유하는 배지에서 세균의 야생형 또는 모균주보다 더 빠르게 성장하는 세균의 특성을 의미한다. 퓨린 염기 유사체의 상기한 농도는 8-아자아데닌에 대하여 300㎍/㎖, 2,6-다이아미노퓨린의 경우에 400㎍/㎖; 6-머캅토퓨린에 대하여 400㎍/㎖; 및 퓨린계 뉴클레오사이드에 대하여는, 이노신에 대하여 300㎍/㎖, 바람직하게는 1000㎍/㎖, 및 구아노신에 대하여 10㎍/㎖이다.

II. 본 발명의 세균

본 발명의 세균은 당해 세균에 의한 퓨린 뉴클레오사이드 생산을 당해 단백질의 활성을 증가시킴으로써 증강시킨 세균이다. 보다 특히, 본 발명의 세균은 당해 세균에 의한 퓨린 뉴클레오사이드 생산을 본 발명의 단백질의 활성을 당해 세균 내에서 증가시킴으로써 증강시킨 세균이다. 보다 더 특히, 본 발명의 세균은 세균 내의 염색체 또는 플라스미드상에 ydhL 유전자 또는 이의 오토로그의 DNA를 보유한다. ydhL 유전자 또는 이의 오토로그의 DNA가 과발현되고, 그 결과로, 당해 세균은 보다 많은 양의 퓨린 뉴클레오사이드를 제조하는 능력을 갖는다.

ydhL 유전자 발현의 증강은 노던(northern) 블롯 또는 RT-PCR(문헌[참조: Molecular cloning: Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor(USA)])에 의해 본 발명의 세균 내에서 ydhL 유전자 발현에 의한 RNA의 양을 측정하고, 이를 야생형 또는 비-변형 균주의 것과 비교함으로써 확인할 수 있다. 본 발명의 미생물 내에서의 ydhL 유전자의 발현은 야생형 또는 비-변형 균주의 것보다 더 증강되며, 바람직하게는 이의 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 2배 이상, 및 가장 바람직하게는 3배 이상 증강된다.

본 발명의 세균은 바실러스 속 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균이다. 본 발명에 사용할 수 있는 에스케리키아 속에 속하는 미생물의 예는 에스케리키아 콜라이(이. 콜라이)이다. 본 발명에 사용할 수 있는 바실러스 속에 속하는 미생물의 예는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 균주 168(비. 서브틸리스 168) 또는 바실러스 아밀로리퀘패시엔스(비. 아밀로리퀘패시엔스)이다.

바실러스 속에 속하는 세균의 예에는 또한 다음이 포함된다:

바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)

바실러스 푸밀리스(Bacillus pumilis)

바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)

바실러스 브레비스(Bacillus brevis)

바실러스 폴리믹사(Bacillus polymixa)

바실러스 스테아로터모필러스(Bacillus stearothermophilus).

Neidhardt 등의 문헌[참조: Neidhardt, F. C. et al. , Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C. , 1208, 표 1])에 보고된 에스케리키아 속에 속하는 세균(예를 들면, 에스케리키아. 콜라이)를 사용할 수 있다. 에스케리키아 콜라이의 야생형 균주의 예에는 K12 균주 및 이의 유도체, 에스케리키아 콜라이 MG1655 균주(ATCC 제47076호), 및 W3110 균주(ATCC 제27325호)가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 이들 균주는 기관[American Type Culture Collection(ATCC, 주소: 미국 버지니아주 20108 마나사스, 우편번호 1549)]으로부터 입수가능하다.

이미 언급한 특성 이외에, 본 발명의 세균은 본 발명의 영역에서 벗어나지 않는 각종 영양 요구, 약물 내성, 약물 감수성, 및 약물 의존성과 같은 기타 특이적 특성을 가질 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "퓨린 뉴클레오사이드"이란 표현에는 이노신, 크산토신, 구아노신 및 아데노신이 포함되며, 바람직하게는 이노신이다.

본원에 사용된 바와 같은 "퓨린-뉴클레오사이드 생산능"이란 표현은 퓨린 뉴클레오사이드를 생산하고 이를 배지에 축적시키는 능력을 의미한다. "퓨린-생산능을 갖는"이란 표현은 에스케리키아 속 또는 바실러스 속에 속하는 미생물이 이. 콜라이의 야생형 균주(예를 들면, 이. 콜라이 W3110 및 MG1655 균주), 또는 비. 서브틸리스의 야생형 균주(예를 들면, 비. 서브틸리스 168)보다 더 많은 양의 퓨린(예를 들면, 퓨린 뉴클레오사이드)을 생산하고, 이를 배지에 축적할 수 있음을 의미한다. 바람직하게는 이러한 표현은 당해 미생물이 10mg/l 이상, 보다 바람직하게는 50mg/l 이상의 이노신, 크산토신, 구아노신 또는/및 아데노신을 생산하고 이를 배지에 축적시킬 수 있음을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 단백질의 활성이 세균 내에서 증강된 경우, 이는 세포 내의 당해 단백질의 분자량이 증가하거나, 단백질 분자 그 자체 당 활성이 증가함을 의미한다.

용어 "오토로그 유전자" 또는 "오토로그"는 공통의 조상 종을 통해 관련된 기타 종의 유전자(상동성 유전자)에 상응하지만, 다른 종의 유전자와는 상이하게 진화한 한 종으로부터의 유전자를 의미한다. 오토로그 유전자는 동일한 기능을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 생물체의 완전한 게놈이 서열화된 경우, 다음의 기법을 사용하여 오토로그를 검색할 수 있다. 한 생물체로부터의 유전자를 사용하여 BLAST 검색을 수행하여 다른 생물체 중의 최상의 오토로그를 발견해 낸다. 이어서, 초회 BLAST 검색에서 발견해낸 다른 생물체로부터의 최상의 동족체를 사용하여 제2회 역 BLAST 검색을 수행하여 최초의 생물체에서 최상의 동족체 또는 오토로그를 발견해낸다. 초회에 사용한 유전자 및 제2회의 결과에서 발견해낸 유전자가 일치하는 경우, 최초 생물체로부터의 유전자와 다른 생물체 중의 최상의 동족체는 오토로그이다. BLAST 검색의 과정에서, 관심 유전자에 의해 암호화된 단백질의 상동성을 결정한다.

본 발명의 목적을 위해, 오토로그 유전자에 의해 암호화된 단백질은 동일한 활성을 갖는 상동성 단백질이다. 이러한 오토로그에 대한 검색은 유전자 및 단백질의 서열, 및 단백질의 활성을 결정함으로써 수행한다(예를 들면, 도 1 및 실시예 2를 참조한다).

바실러스 아밀로리퀘패시엔스의 YdhL 단백질을 암호화하는 유전자, ydhL 유전자가 본 발명의 발명자에 의하여 서열화되어 있다(서열 번호 1). 바실러스 서브틸리스로부터의 YdhL 단백질을 암호화하는 유전자, 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 균주 168의 ydhL 유전자가 밝혀져 있다(EMBL에서 번호 제13042호 내지 14208호, 수탁 번호 제Z99107호)(서열 번호 3). 바실러스 서브틸리스로부터의 ydhL 유전자는 53.50°에서 ydhK와 ydhM 유전자 사이의 염색체 상에 위치한다. 따라서, 당해 ydhL 유전자는 당해 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 토대로 하여 제조한 프라이머를 사용하여 PCR(중합효소 연쇄반응; 문헌[White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989)을 참조]로 수득할 수 있다. 기타 미생물로부터의 YdhL 단백질을 암호화하는 유전자를 유사한 방식으로 수득할 수 있다(실시예 2 참조).

바실러스 아밀로리퀘패시엔스로부터 유래한 ydhL 유전자는 또한 본 발명의 단백질(예를 들면, 서열 번호 2로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질, 및/또는 서열 번호 2로 나타낸 아미노산 서열에 하나 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 첨가를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 바실러스 속 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균에 퓨린 염기 유사체, 이노신 및 구아노신에 대한 내성을 부여하는 활성을 갖는 단백질)을 암호화하는 DNA로 예시할 수 있으며, 당해 단백질의 활성을 당해 세균 내에서 증강시킨다.

바실러스 서브틸리스로부터 유래한 ydhL 유전자는 서열 번호 4로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질, 및/또는 서열 번호 4로 나타낸 아미노산 서열에 하나 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 첨가를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 바실러스 속 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균에 퓨린 염기 유사체, 이노신 및 구아노신에 대한 내성을 부여하는 활성을 갖는 단백질을 포함하는 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA를 포함한다.

상기한 YdhL 단백질과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 예를 들면, YdhL 단백질을 암호화하는 DNA의 뉴클레오타이드 서열을 변형시켜(예를 들면, 부위-지시적 돌연변이유발에 의해 특이적 부위에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 결실, 치환, 삽입 또는 첨가하여) 수득할 수 있다. 상기한 바와 같이 변형된 DNA는 통상적으로 공지된 돌연변이 처리에 의해 수득할 수 있다. 이러한 처리에는 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA의 하이드록실아민 처리, 또는 당해 DNA를 포함하는 세균의 UV 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 또는 질산과 같은 시약으로의 처리가 포함된다.

바실러스 아밀로리붸패시엔스로부터 유래한 YdhL 단백질과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 적합한 세포에서 상기한 바와 같은 돌연변이를 갖는 DNA를 발현시키고, 임의의 발현 생성물의 활성을 조사함으로써 수득할 수 있다. YdhL 단백질과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 또한 YdhL 단백질을 암호화하는 돌연변이 DNA 또는 엄격한 조건 하에, 예를 들면, 서열 번호 1로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, YdhL 단백질의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프로브와 하이브리드화 가능한 돌연변이체-포함 세포로부터 DNA를 분리함으로써 수득할 수 있다. 본원에서 언급한 "엄격한 조건"은 소위 특이적 하이브리드는 형성되고, 비-특이적 하이브리드는 형성되지 않는 조건이다. 이러한 조건을 임의의 수치를 사용하여 명확하게 표현하기는 어렵다. 그러나, 예를 들면, 엄격한 조건에는 고도로 상동성인 DNA, 예를 들면, 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA는 서로 하이브리드화할 수 있지만, 상기한 수치 이하의 상동성을 갖는 DNA는 서로 하이브리드화할 수 없는 조건이 포함된다. 대안적으로, 엄격한 조건은 DNA가 서던(Southern) 하이브리드화에서의 통상적인 세척 조건에 상응하는 염 농도, 즉, 대략, 1 x SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃에서, 0.1 x SSC, 0.1% SDS에서 하이브리드화할 수 있는 조건으로 예시할 수 있다. 세척 시간은 블롯팅에 사용하는 막의 종류에 따르며, 일반적으로, 제조자에 의해 권장된다. 예를 들면, 엄격한 조건 하의 HybondT^TMN+나일론막(제조사[Amersham])의 세척 시간은 15분이다. 바람직하게는 세척은 2회 내지 3회 수행할 수 있다.

서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열의 부분적 서열을 또한 프로브로 사용할 수 있다. 프로브는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 기초로 한 프라이머, 및 주형으로 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 단편을 사용하여 PCR로 제조할 수 있다. 약 300bp의 길이를 갖는 DNA 단편을 프로브로 사용하는 경우, 세척을 위한 하이브리드화 조건은 예를 들면, 50℃, 2 x SSC 및 0.1% SDS일 것이다.

상기한 바 모두 바실러스 서브틸리스로부터 유래한 YdhL 단백질에 적용가능하다. 본 발명의 단백질의 활성을 증강시키는 기법, 특히, 세균 세포 내에서 단백질 분자의 수를 증가시키는 기법에는 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA의 발현 조절 서열을 변형시키는 방법, 및 당해 유전자의 복사체 수를 증가시키는 방법이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA의 발현 조절 서열의 변형은 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA를 강력 프로모터의 제어 하에 배치함으로써 달성할 수 있다. 예를 들면, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, 람다 파지의 P_L 프로모터 모두가 이. 콜라이용의 공지된 강력 프로모터이다. 특히, veg 프로모터, spac 프로모터, xylE 프로모터는 바실러스용의 강력 프로모터로 공지되어 있다. 대안적으로, 프로모터의 활성은 예를 들면, 프로모터 내로 돌연변이를 도입하여 프로모터의 하류에 위치한 유전자의 전사 수준을 증가시킴으로써 증강시킬 수 있다(국제공개공보 제WO00/18935호). 추가로, mRNA 해독가능성은 리보솜 결합 부위(RBS)와 출발 코돈 사이의 스페이서(spacer)에 돌연변이를 도입함으로써 증강시킬 수 있다. 예를 들면, 발현 수준의 20배 범위가 출발 코돈 앞의 3개의 뉴클레오타이드의 성질에 따름이 밝혀졌다(문헌[참조: Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35,365-403, 1981; Hui et al. , EMBO J., 3,623-629, 1984]).

추가로, 유전자의 전사 수준을 증가시키기 위해, 인핸서(enhancer)를 신규히 도입할 수 있다. 유전자 또는 프로모터를 포함하는 DNA의 염색체 DNA로의 도입이예를 들면, 일본공개특허출원 제(평)1-215280호(1989)에 기술되어 있다.

대안적으로, 유전자의 복사체 수는 당해 유전자를 다중-복사체 벡터 내로 삽입시켜 재조합 DNA를 형성한 후, 재조합 DNA를 미생물 내로 도입함으로써 증가시킬 수 있다. 에스케리키아 콜라이에서 자동적으로 복제가능한 벡터의 예에는 pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184(pHSG 및 pACYC는 제조사[Takara Bio]에서 입수 가능함), RSF1010, pBR322, pMW219(pMW는 제조사[Nippon Gene]에서 입수가능함) 등이 포함된다. 바실러스 세균 내에서 자동적으로 복제가능한 벡터의 예에는 pUB110, pC194, pE194가 포함된다. 바람직하게는, 저-복사체 벡터를 사용한다. 저-복사체 벡터의 예에는 pSC101, pMW118, pMW119 등이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 용어 "저-복사체 벡터"는 세포 당 5개 이하의 복사체 수를 야기하는 벡터에 사용된다. 형질전환 방법에는 당해 분야의 임의의 공지된 방법이 포함된다. 예를 들면, 염화칼슘으로 수여체 세포를 처리하여 세포의 DNA에 대한 투과성을 증가시키는 방법이 에스케리키아 콜라이 K-12에 대하여 보고되어 있으며(문헌[참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol.Biol., 53, 159 (1970)]), 본 발명에 사용할 수 있다.

유전자 발현의 증강은 또한 유전자의 다중 복사체를 예를 들면, 상동성 재조합, Mu 삽입 등을 통해 세균 염색체로 도입함으로써 달성할 수 있다. 예를 들면, 1회 Mu 삽입의 행위는 유전자의 3개 이하의 복사체의 세균 염색체의 도입을 가능케 한다.

강력 프로모터 또는 인핸서를 사용하는 상기한 기법은 유전자의 복사체 수 또는 발현의 증가를 기초로 한 기법과 조합할 수 있다.

염색체 DNA의 제조, 하이브리드화, PCR, 플라스미드 DNA의 제조, DNA의 분해및 연결, 형질전환, 프라이머로서의 올리고뉴클레오타이드의 선택 등에 대한 당해 분야에 공지된 통상의 방법을 본 발명에 사용할 수 있다. 이들 방법은 문헌[참조: Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)]) 등에 기술되어 있다.

바실러스 속에 속하는 미생물을 본 발명의 단백질 또는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 유전자들의 증가된 발현을 야기하도록 육종하기 위해, 당해 유전자(들)의 필수 영역을 주로 비. 서브틸리스 유전자로부터의 입수가능한 정보를 토대로 하여, PCR(중합효소 연쇄반응)로 수득할 수 있다. 예를 들면, 수송인자를 암호화하는 것으로 보이는 유전자, ydhL 유전자를 PCR을 사용하여 비. 서브틸리스 균주의 염색체 DNA로부터 클로닝할 수 있다. 이에 사용되는 염색체 DNA는 비. 서브틸리스의 임의의 다른 균주로부터 유래한 것일 수 있다.

본 발명의 단백질은 자연적 다양성에 기인하여 존재하는 YdhL 단백질의 돌연변이체 및 변이체, 및 상이한 세균 내에 존재하는 YdhL의 상동성 단백질을 포함하며, 즉, 이들 돌연변이체, 변이체 또는 상동성 단백질은 퓨린 염기 유사체, 이노신 또는 구아노신에 대한 내성을 부여하는 YdhL 단백질의 기능적 특성을 입증한다.

본 발명의 세균은 본 발명의 단백질을 암호화하는 상기한 DNA를 이노신과 같은 퓨린 뉴클레오사이드의 생산능을 선천적으로 가진 세균 내로 도입함으로써 수득할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 세균은 이미 당해 DNA를 보유하는 세균에 이노신과 같은 퓨린 뉴클레오사이드의 제조능을 부여함으로써 수득할 수 있다.

본 발명에 사용할 수 있는 바실러스 속에 속하는 모균주의 예는 비. 서브틸리스 균주 KMBS16-1이다. 이러한 균주는 purA::erm 돌연변이가 purA::cat 돌연변이로 변경된 이노신-생산 균주 비. 서브틸리스 KMBS16의 유도체이다. 다음으로, 비. 서브틸리스 KMBS16은 석시닐-AMP 신타제를 암호화하는 purA 유전자(purA::erm), 퓨린 억제인자를 암호화하는 purR 유전자(purR::spc), 및 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제를 암호화하는 deoD 유전자(deoD:kan)로 도입한 돌연변이를 갖는, 공지된 비. 서브틸리스 trpC2의 유도체이다(미국 특허원 제2004-0166575A호). 본 발명에 사용할 수 있는 바실러스 속에 속하는 기타 모균주에는 비. 서브틸리스 균주 AJ12707(FERM 제P-12951호)(일본특허출원 제JP6113876A2호), 비. 서브틸리스 균주 AJ3772(FERM 제P-2555호)(일본특허출원 제JP62014794A2호), 6-에톡시퓨린-내성 균주 제AJ13937호(FERM 제BP-18665호)(미국 특허 제2004-0166575호)등이 포함된다.

이. 콜라이 속에 속하는 이노신-생산 균주의 예는 FADRaddedd(pMWKQ)이다. 당해 균주는 PRPP 아미도트랜서퍼라제를 암호화하는 purF 유전자, 퓨린 억제인자를 암호화하는 purR 유전자, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제를 암호화하는 deoD 유전자, 석시닐-AMP 신타제를 암호화하는 purA 유전자, 아데노신 데아미나제를 암호화하는 add 유전자, 6-포스포글루코네이트 데하이드라제를 암호화하는 edd 유전자 내로 도입한 돌연변이를 가지며(국제공개공보 제WO9903988호) 및 PRPP 아미도트랜서퍼라제를 암호화하는 purFKQ 유전자를 포함하고 GMP에 비감수적인 pMWKQ 플라스미드를 보유하는(국제공개공보 제WO9903988호) 공지된 균주 W3110의 유도체이다.

추가로, 당해 예는 또한 이노신 생합성에 관여하는 효소의 방출 조절, 특히, 이러한 효소의 피드백 억제를 삭제하는 방법을 포함한다((국제공개공보 제WO99/03988호). 이노신 생합성에 관여하는 상기한 바와 같은 효소의 조절을 삭제하는 방법의 예에는 예를 들면, 퓨린 억제인자의 결실(미국 특허 제6,284,495호)이 포함된다. 퓨린 억제인자의 결실 방법의 예에는 퓨린 억제인자를 암호화하는 유전자(purR, GenBank 수탁번호 제Z99104호)의 파쇄가 포함된다.

추가로, 이노신-생산능은 또한 이노신 생합성으로부터 분기하고, 기타 대사 생성물을 야기하는 반응을 차단함으로써 증가시킬 수 있다(국제공개공보 제WO99/03988호). 이노신 생합성으로부터 분기하고 기타 대사 생성물을 야기하는 반응의 예에는 예를 들면, 석시닐-아데노신 모노포스페이트(AMP) 신타제, 이노신-구아노신 키나제, 6-포스포글루코네이트 데하이드라제, 포스포글루코아이소머라제 등에 의해 촉진되는 반응이 포함된다. 석시닐 아데노신 모노포스페이트(AMP) 신타제는 purA(GenBank 수탁번호 제Z99104호)에 의해 암호화되어 있다.

추가로, 이노신 생산능은 이노신의 세포 내로의 혼입을 약화시킴으로써 증강시킬 수 있다. 이노신의 세포 내로의 혼입은 이노신의 세포로의 혼입에 관여하는 반응을 차단함으로써 약화시킬 수 있다. 이노신의 세포로의 혼입에 관여하는 상기한 반응의 예에는 예를 들면, 뉴클레오사이드 퍼미아제에 의해 촉진되는 반응이 포함된다. 본 발명의 단백질에서 단백질 분자 당 활성을 증가시키기 위해, 또한 단백질의 구조 유전자 내에 돌연변이를 도입하여 당해 단백질의 활성을 증강시킬 수 있다. 돌연변이를 유전자 내로 도입하기 위해, 부위-특이적 돌연변이유발(문헌[참조: Kramer, W. and Frits, H.J Methods in Enzymology, 154, 350(1987)]), 재조합 PCR(PCR Technology, Stockton Press(1989)]), DNA의 특정 부위의 화학적 합성, 관심 유전자의 하이드록실아민 처리, UV 조사 또는 니트로소구아니딘 또는 질산과 같은 화학적 제제에 의한 관심 유전자를 갖는 미생물 균주의 처리 등을 사용할 수 있다. 단백질의 활성이 증강된 미생물은 8-아자아데닌 또는 6-메틸퓨린, 또는 2,6-다이아미노퓨린, 또는 6-머캅토퓨린, 또는 8-아자구아닌 또는 이노신을 표 1(아래를 참조)에 나타낸 농도 단위로 함유하는 최소 배지에서 성장하는 균주로 선별할 수 있다.

본 발명의 세균은 퓨린 생합성에 관여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 증강시킴으로써 추가로 개선할 수 있다. 이러한 유전자에는 이. 콜라이의 pur 레굴론(regulon) (문헌[참조: Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D. C., 1996])이 포함된다. ADP 및 GMP에 의한 피드백 억제로부터 해방된 PRPP 아미도트랜스퍼라제를 암호화하는 돌연변이체 purF 유전자, 및 퓨린 뉴클레오타이드 생합성 시스템 내의 억제인자를 암호화하는 불활성화된 purR 유전자를 갖는 이노신-생산 이 콜라이 균주가 기술되어 있다(WO9903988호).

III. 퓨린 뉴클레오사이드의 제조 방법

본 발명의 방법은 본 발명의 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계, 세균이 퓨린 뉴클레오사이드를 생산 및 분비하게 하는 단계, 및 배양 배지로부터 퓨린 뉴클레오사이드를 수집하는 단계를 포함하여 퓨린 뉴클레오사이드를 제조하는 방법을 포함한다. 추가로, 본 발명의 방법은 본 발명의 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계, 세균이 이노신을 생산 및 분비케 하는 단계, 및 이노신을 배양 배지로부터 수집하는 단계를 포함하여, 이노신을 제조하는 방법을 포함한다. 추가로, 본 발명의 방법은 본 발명의 세균을 배양 배지에 배양하는 단계, 세균이 크산토신을 생산 및 분비케 하는 단계, 및 배양 배지에서 크산토신을 수집하는 단계를 포함하여, 크산토신을 제조하는 방법을 포함한다. 추가로, 본 발명의 방법은 본 발명의 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계, 세균이 구아노신을 생산 및 분비케 하는 단계, 및 구아노신을 배양 배지에서 수집하는 단계를 포함하여, 구아노신을 제조하는 방법을 포함한다.

본 발명에서, 배양, 배지로부터의 퓨린 뉴클레오사이드의 수집 및 정제 등을 통상적인 발효 방법과 유사한 방식으로 수행할 수 있으며, 여기서, 퓨린 뉴클레오사이드는 미생물을 이용하여 제조한다. 퓨린 뉴클레오사이드 제조용 배양 배지는 필요에 따라 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 기타 유기 성분을 함유하는 통상적인 배양 배지일 수 있다. 탄소원으로, 포도당, 젖당, 자당, 갈락토스, 과당, 아라비노스, 맥아당, 자일로스, 트레할로스, 리보오스, 전분의 가수분해물과 같은 사카라이드; 글리세롤, 만니톨 및 소르비톨과 같은 알콜; 글루콘산, 푸마르산, 시트르산 및 석신산과 같은 유기산 등을 사용할 수 있다.

질소원으로, 황산암모늄, 염화암모늄 및 인산암모늄과 같은 무기 암모늄 염; 대두 가수분해물과 같은 유기 질소; 암모니아 가스; 암모니아 수 등을 사용할 수 있다. 비타민 B1과 같은 비타민, 필수 물질, 예를 들면, 아데닌 및 RNA와 같은 핵산, 또는 효모 추출물 등을 미량 유기 영양물로서 적합한 양으로 함유시키는 것이 바람직하다. 이 외에, 소량의 인산칼슘, 황산마그네슘, 철 이온, 망간 이온 등을 필요에 따라 첨가할 수 있다.

배양은 바람직하게는 호기성 조건 하에 16시간 내지 72시간 동안 수행하며, 배양 중의 배양 온도는 30 내지 45℃로, 그리고 pH는 5 내지 8로 조절한다. pH는 무기 또는 유기산 또는 알칼리성 물질 및 암모니아 가스를 사용하여 적정할 수 있다.

배양 후, 세포와 같은 고형물은 원심분리 또는 막 여과로 액체 배지로부터 제거할 수 있으며, 이어서 표적 퓨린 뉴클레오사이드를 통상적 기법(예를 들면, 이온 교환 수지 및 침전)의 임의의 조합으로 발효액으로부터 회수할 수 있다.

4. 퓨린 뉴클레오타이드의 제조 방법

본 발명의 방법은 본 발명의 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계, 목적하는 퓨린 뉴클레오사이드를 인산화시켜 당해 퓨린 뉴클레오사이드에 상응하는 퓨린 뉴클레오타이드를 생성시키는 단계, 세균이 퓨린 뉴클레오타이드를 배양 배지로 분비케 하는 단계, 및 퓨린 뉴클레오타이드를 수집하는 단계를 포함하여, 퓨린 뉴클레오타이드를 제조하는 방법을 포함한다. 추가로, 본 발명의 방법은 본 발명의 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계, 이노신을 인산화시켜 5'-이노신산을 생성시키는 단계, 세균이 5'-이노신산을 배양 배지로 분비케 하는 단계, 및 5'-이노신산을 수집하는 단계를 포함하여, 5'-이노신산을 제조하는 방법을 포함한다. 추가로, 본 발명의 방법은 본 발명의 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계, 크산토신을 인산화시켜 5'-크산틸산을 생성시키는 단계, 세균이 5'-크산틸산을 배양 배지로 분비케 하는 단계, 및 5'-크산틸산을 수집하는 단계를 포함하여, 5'-크산틸산을 제조하는 방법을 포함한다. 추가로, 본 발명의 방법은 본 발명의 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계, 구아노신을 인산화시켜 5'-구아닐산을 생성시키는 단계, 세균이 5'-구아닐산을 배양 배지로 분비케 하는 단계, 및 5'-구아닐산을 수집하는 단계를 포함하여, 5'-구아닐산을 제조하는 방법을 포함한다. 그리고, 본 발명의 방법은 본 발명의 세균을 배양 배지에서 배양하는 단계, 크산토신을 인산화시켜 5'-크산틸산을 생성시키는 단계, 세균이 5'-크산틸산을 배양 배지로 분비케 하는 단계, 5'-크산틸산을 아민화시켜 5'-구아닐산을 생성시키는 단계, 및 5'-구아닐산을 수집하는 단계를 포함하여 5'-구아닐산을 제조하는 방법을 포함한다.

본 발명에서, 배양, 및 배지로부터의 이노신의 수집 및 정제를 통상적인 발효 방법과 유사한 방식으로 수행할 수 있으며, 여기서, 이노신은 미생물을 사용하여 제조한다. 추가로, 본 발명에서, 이노신 인산화 단계, 세균이 배양 배지로 분비케 하는 단계, 및 5'-이노신산을 수집하는 단계를 통상적인 발효 방법과 유사한 방식으로 수행할 수 있으며, 여기서, 5'-이노신산과 같은 퓨린 뉴클레오타이드는 이노신과 같은 퓨린 뉴클레오사이드로부터 제조한다.

퓨린 뉴클레오사이드의 인산화는 상이한 포스파타제, 뉴클레오사이드 키나제 또는 뉴클레오사이드 포스포트랜서퍼라제를 사용하여 효소학적으로 수행하거나, POCl₃ 등과 같은 인산화 제제를 사용하여 화학적으로 수행할 수 있다. 파이로포스페이트의 인산 그룹의 뉴클레오사이드로의 C-5'-위치 선택적 전달을 촉진할 수 있는 포스파타제(문헌[참조: Mihara et. al, Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganellamorganii. Appl. Environ. Microbiol., 66: 2811-2816 (2000)]), 또는 인산 공여체로서 폴리-인산(염), 페닐인산(염) 또는 카바밀인산(염) 등을 사용하는 산 포스파타제(국제공개공보 제WO 9637603A1호)를 사용할 수 있다. 또한 포스파타제의 예로서, 기질로 p-니트로페닐 인산염(문헌[참조: Mitsugi, K., et al, Agric. Biol. Chem., 28, 586-600(1964)]), 무기 인산염(일본특허출원 또는 일본공개특허출원 제JP42-1186호) 또는 아세틸 인산염(일본특허출원 또는 일본공개특허출원 제JP61-41555호) 등을 사용하는, 인산 그룹의 뉴클레오사이드의 C-2', 3', 또는 5'-위치로의 전달을 촉진할 수 있는 포스파타제를 사용할 수 있다. 뉴클레오사이드 키나제의 예로, 이. 콜라이로부터의 구아노신/이노신 키나제(문헌[참조: Mori, H. et. al. Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 177: 4921-4926 (1995); 국제공개공보 제W09108286호]) 등을 사용할 수 있다. 뉴클레오사이드 포스포트랜스퍼라제의 예로, Hammer-Jespersen, K.(문헌[참조: Nucleoside catabolism, p.203-258. In AMunch-Petesen(ed.), Metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York])에 의해 기술된 뉴클레오사이드 포스포트랜스퍼라제 등을 사용할 수 있다. 뉴클레오사이드의 화학적 인산화는 POCL₃(문헌[참조: Yoshikawa, K. et. al. Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 42: 3505-3508 (1969)]) 등과 같은 인산화 제제를 사용하여 수행할 수 있다.

5'-크산틸산의 아민화는 예를 들면, 이. 콜라이로부터의 GMP 신테타제(문헌[참조: Fujio et. al. High level of expression of XMP aminase in Escherichia coli and its application for the industrial production of 5'-guanylic acid. Biosci. Biotech. Biochem. 1997,61 : 840-845; 유럽 특허원 제EP0251489B1호])를 사용하여 효소학적으로 수행할 수 있다.

본 발명은 다음의 비-제한적 실시예에 관하여 아래에 보다 구체적으로 설명될 것이다.

실시예 1. 비. 서브틸리스의 ydhL 유전자의 클로닝

비. 서브틸리스 아종 서브틸리스 균주 168의 전체 뉴클레오타이드 서열이 결정되어 있다(문헌[참조: Kunst et al., Nature 390, 249-256 (1997)]). 보고된 뉴클레오타이드 서열을 토대로 하여, 프라이머 ydhL_N(서열 번호 5) 및 ydhL_C(서열 번호 6)을 합성하였고 PCR을 통한 비. 서브틸리스 균주로부터의 ydhL 유전자의 증폭에 사용하였다. 프라이머 ydhL_N은 ydhL 유전자의 출발 코돈 상류의 489 내지 467bp 서열과 동일하며, 이의 5'-말단에 도입한 제한 효소 SalI 인식 부위를 갖는다. 프라이머 ydhL_C는 ydhL 유전자의 종결 코돈에서 58 내지 80bp 하류의 서열과 상보적이며, 이의 5'말단에 도입한 제한 효소 BglII 인식 부위를 갖는다.

비. 서브틸리스 균주 168의 염색체 DNA를 통상의 방법으로 제조하였다. PCR은 다음의 조건 하에 "Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400"에서 수행하였다: 94℃에서 30초, 61℃에서 45초, 72℃에서 3분, PfuI 중합효소(제조사[Fermentas])를 사용하여 25회. ydhL 유전자와 그 자신의 프로모터를 포함하는 수득한 PCR 단편을 BglI 및 SalI으로 처리하고, 미리 BamHI 및 SalI 효소로 처리해 놓은 저 복사체 수 pMW118 내로 삽입하였다. 이렇게, 플라스미드 pYDHL1을 수득하였다.

pYDHL1 플라스미드 및 벡터를 사용하여 표준 기법을 통해 이. 콜라이 균주 TG1(제조사[Amersham Pharmacia Biotech])를 형질전환시켰다. 형질전환체를 앰피실린 100㎍/㎖을 가진 L-브로스 아가 플레이트 상에서 선별하였다. 이에 따라, 이. 콜라이 균주 TG1(pYDHL1) 및 TG1(pMW118)을 수득하였다. 이어서, 이들 균주의 퓨린 염기 유사체의 존재 하에서의 성장 능력을 구배화된 농도의 억제제를 함유하는 M9 포도당 최소 아가 플레이트 상에서 결정하였다. 당해 플레이트에 최소 배지(앰피실린 100㎍/㎖을 첨가한)에서 성장한 밤새 배양물로부터의 10⁵ 내지 10⁶개의 세포를 스폿팅하였다. 성장은 37℃에서 44시간 동안 항온처리한 후 평가하였다.

결과는 표 1에 나타내어져 있다.

주의. DAP: 2,6-다이아미노퓨린; MP: 6-머캅토퓨린; AzaA: 8-아자아데닌; +: 성장 양호; -: 비성장. 성장 양호는 퓨린 유사체를 가진 배지 상에서 성장한 콜로니의 크기가 퓨린 유사체가 없는 배지 상에서 성장한 대조군 균주의 콜로니의 크기와 유의하게 상이하지 않았음을 의미한다.

표 1에서 ydhL 유전자 증폭이 세균의 2,6-다이아미노퓨린, 6-머캅토퓨린 및 8-아자아데닌에 대한 내성을 증가시켰음을 알 수 있다.

pYDHL1 플라스미드 및 pMW118 벡터를 또한 이. 콜라이 균주 TG1 deoD gsk3으로 형질전환시킬 수 있다. 이. 콜라이 균주 TG1 deoD gsk3는 이노신 및 구아노신에 대한 내성을 확인하기 위해 사용하는 특수 제작된 모 균주이다. 당해 균주는 파지 P1-매개 형질도입을 사용하여, PCT 출원 제WO 9903988호에 기술된 바와 같은 deoD 돌연변이 및 Petersen C.(문헌[참조: J. Biol. Chem., 274, 5348-5356,1999])에 의해 기술된 gsk3 돌연변이를, 이의 퓨린 분해 능력으로 인하여 이노신 및 구아노신에 대하여 내성을 갖는 공지된 균주 TG1(VKPM 제B-5837호)로 순차적 도입하여 수득하였다. 당해 균주 TG1 deoD gsk3는 deoD 돌연변이 때문에 구아노신 및 이노신을 분해할 수 없으며(제WO 9903988호), gsk3 돌연변이 때문에 뉴클레오사이드에 감수적이다(문헌[참조: Petersen C. J. Biol. Chem., 274, 5348-5356, 1999]). 이에 따라, 균주 TG1 deoD gsk3(pYDHL1) 및 TG1 deoD gsk(pMW118)을 수득하였다. 이어서, 이들 균주의 이노신 및 구아노신의 존재 하에서의 성장 능력을 상기한 바와 같이 결정하였다.

결과는 표 2에 나타내어져 있다.

주의. +: 성장 양호; -: 비성장.

표 2에서 ydhL 유전자 과발현이 이노신에 대한 고수준의 내성 및 구아노신에 대한 저수준의 내성을 부여하였음을 알 수 있다. 따라서, ydhL 유전자가 퓨린 뉴클레오사이드의 분비, 보다 특히, 이노신의 분비에 관여함을 예측할 수 있다.

실시예 2. 바실러스 아밀로리퀘패시엔스의 ydhL 유전자의 클로닝

실시예 1에 나타낸 데이타는 2,6-다이아미노퓨린 및 6-머캅토퓨린이 M9 포도당 최소 아가로 동시에 도입된 경우, 비. 서브틸리스의 ydhL 유전자(이후: ydhL _Bs)의 과발현이 세포에 이에 대한 내성을 부여함을 나타낸다(표 1). 이러한 사실을 토대로 하여, 비. 아밀로리퀘패시엔스로부터의 ydhL _Bs 유전자의 오토로그(이후: ydhL _Ba)의 클로닝을 수행하였다. 비. 아밀로리퀘패시엔스 균주 BA1(IAM1523)의 염색체 DNA를 통상적인 방법으로 제조하였다. 당해 염색체 DNA를 EcoRI으로 절단하고 미리 동일한 효소로 절단해 놓은 pMW118 벡터와 연결시켰다. 수득한 DNA를 사용하여 이. 콜라이 균주 TG1을 형질전환시켰다. 형질전환체를 2,6-다이아미노퓨린 400㎍/㎖, 6-머캅토퓨린 400㎍/㎖ 및 앰피실린 100㎍/㎖을 함유하는 최소 아가 상에서 선별하였다. 당해 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 분석하였다. 이들로부터, 약 1.6kb의 최소 삽입된 DNA 단편을 포함하는 하이브리드 플라스미드 pYDHL2을 발견하였다. ydhL _Bs 유전자와 대조적으로, 이는 EcoRI 부위를 포함하지 않았다. 삽입된 단편을 보편적인 프라이머로부터 서열화하였고, ydhL _Bs 유전자와 높은 상동성(90% 이상)을 가졌음을 발견하였다(도 1). 비. 아밀로리퀘패시엔스로부터의 신규한 유전자를 ydhL 유전자(이후, 또한 ydhL _Ba 유전자로 표지함)로 명명하였다. TG1 및 TG1 deoD gsk3 균주로 도입하는 경우, pYDHL2 플라스미드는 pYDHL1 플라스미드가 그러했던 것과 동일한 방식으로, 세포에 각각 퓨린 염기 유사체 및 뉴클레오사이드에 대한 내성을 부여하였다. pYDHL2 플라스미드가 실제로 ydhL _Ba 유전자를 포함하는 것으로 결론지었다.

실시예 3. 이. 콜라이 이노신 생산 균주에 의한 이노신 생산에 대한 ydhL _Bs 및 ydhL _Bs 유전자의 증폭 효과

이노신-생산 이. 콜라이 균주 FADRaddedd(pMWKQ)를 각각 pMW18 벡터, 및 YDHK1 및 pYDHL2 플라스미드로 형질전환시켰다. 당해 형질전환체를 앰피실린 100㎎/l 및 카나마이신 75㎎/l를 함유하는 L-아가 상에서 선별하였다. 이에 따라, 균주 FADRaddedd(pMWKQ, pMW18), FADRaddedd(pMWKQ, pYDHL1) 및 FADRaddedd(pMWKQ, pYDHL2)를 수득하였다. 이들 균주를 각각 앰피실린 100㎎/l 및 카나마이신 75㎎/l를 갖는 L-브로스에서 18시간 동안 37℃에서 배양하였고, 20 x 200mm 시험 튜브에서, 수득한 배양물 0.3㎖를 앰피실린 100㎎/l 및 카나마이신 75㎎/l를 함유하는 발효 배지 3㎖에 접종하고, 회전교반기를 사용하여 37℃에서 72시간 동안 배양하였다.

당해 발효 배지의 조성물(g/l):

포도당 40.0

(NH₄)₂SO₄ 16.0

K₂HPO₄ 0.1

MgSO₄·7H₂O 1.0

FeSO₄·7H₂O 0.01

MnSO₄·5H₂O 0.01

효모 추출물 8.0

CaCO₃ 30.0

포도당 및 황산마그네슘을 개별적으로 멸균시켰다. CaCO₃를 180℃에서 2시간 동안 건식-가열 멸균시켰다. pH를 7.0으로 적정하였다. 멸균 후 배지에 항생제를 첨가하였다.

배양 후, 배지에 축적된 이노신의 양을 HPLC로 결정하였다. 배양 배지 샘플(500㎕)를 15,000rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 H₂O로 4회 희석하고 HPLC로 분석한다.

HPLC 분석 조건:

칼럼: Luna C18(2) 250x3mm, 5u(제조사[Phenomenex], 미국 소재). 완충액: 2% v/v C₂H₅OH; 0.8% v/v 트리에틸아민; 0.5% v/v 아세트산(빙초산); pH 4.5. 온도: 30℃. 유속: 0.3㎖/분. 주입 용적: 5㎕. 검출: UV 250nm.

체류 시간(분):

크산토신 13.7

이노신 9.6

하이포크산틴 5.2

구아노신 11.4

아데노신 28.2

결과는 표 3에 나타내어져 있다.

표 3으로 알 수 있는 바와 같이, ydhL _Bs 및 ydhL_Ba 유전자의 과발현은 FADRaddedd(pMWKQAp) 균주의 이노신 생산성을 개선하였다.

실시예 4. ydh L _Bs 유전자의 저 복사체 수 셔틀(shuttle) 벡터 pMWMX1 내로의 클로닝

그 자신의 프로모터의 제어 하에 ydhL_Bs 유전자를 포함하는 PCR 단편(실시예 1에서 수득한)을 BglI 및 SalI으로 처리하였고 미리 BamHI 및 SalI 효소로 처리해 놓은 저 복사체 수 셔틀 벡터 pMWMX1으로 삽입시켰다. 이에 따라, 플라스미드 pYDHL3를 수득하였다. pMWMX1 벡터(도 2)는 2가지 저 복사체 수 플라스미드: pMW118 및 pMX30의 유도체이다. 다음으로, pMX30 플라스미드(문헌[참조: Rabinovich et al., Mol. Biol(Moscow), 18, 189-196, 1984])는 pSM19035의 결실 유도체, inc18 계열의 광범위 숙주 플라스미드(문헌[참조: Brantl et al., Nucleic Acids Res., 18, 4783-4790])이다. pMW118 및 pMX30 플라스미드를 각각 EcoRI으로 절단하고 연결시켰다. 이에 따라 벡터 pMWMX1을 수득하였다.

실시예 5. ydh L _Ba 유전자를 포함하는 저 복사체 수 셔틀 플라스미드 pYDHL3의 작제

pYDHL2 플라스미드를 EcoRI으로 부분적으로 절단하여 단일 단편을 수득하고, 동일한 효소로 절단해 놓은 pMX30과 연결시켰다. 이렇게, ydhL_Ba 유전자를 포함하는 셔틀 플라스미드 pYDHL4를 수득하였다. 따라서, pYDHL4 플라스미드는 ydhL_Bs 유전자를 포함하는 pMWMX1 벡터를 ydhL_Ba 유전자로 대체한 것을 제외하고, pYDHL3 플라스미드와 동등하다.

실시예 6. ydh L _Bs 또는 ydh L _Ba 유전자 증폭의 비. 서브틸리스 균주 168의 퓨린 염기 유사체에 대한 내성에 대한 효과

pYDHL3, pYDHL4 플라스미드 및 pMWMX1 벡터를 사용하여 표준 기법을 통해 야생형 비. 서브틸리스 균주 168을 형질전환시켰다. 형질전환체를 에리트로마이신 10㎍/㎖을 가진 L-브로스 아가 플레이트 상에서 선별하였다. 이렇게, 균주 비. 서브틸리스 168(pMWMX1), 비. 서브틸리스 168(pYDHL3) 및 비. 서브틸리스 168(pYDHL4)를 수득하였다. 이어서, 이들 균주의 퓨린 염기 유사체의 존재 하의 성장 능력을 구배화된 농도의 퓨린 염기 유사체를 함유하는 M9 포도당 최소 아가 플레이트(최소 배지 M9, 포도당 - 2%, 비타민 검정 카사미노산(제조사[Difco])- 0.1%, 트립토판-100㎍/㎖) 상에서 결정하였다. 당해 플레이트에 당해 유사체가 없는 상기한 아가 플레이트 상에서 성장시킨 밤새 배양물의 10⁵ 내지 10⁶개의 세포를 스폿팅하였다. 성장은 34℃에서 48시간 동안 항온처리한 후 평가하였다.

결과는 표 4에 나타내어져 있다.

주의: AzaG - 8-아자구아닌; MePur - 6-메틸퓨린; AzaA - 8-아자아데닌; n.d.- 데이타 없음; +: 성장 양호; -: 비성장. 성장 양호는 퓨린 유사체를 가진 배지 상에서 성장한 콜로니의 크기가 퓨린 유사체가 없는 배지 상에서 성장한 대조군 균주의 콜로니의 크기와 유의하게 상이하지 않았음을 의미한다.

표 4에서, ydhL_Bs 또는 ydhL_Ba 유전자의 증폭이 8-아자구아닌, 6-메틸퓨린 및 8-아자아데닌에 대한 세균의 내성을 증가시켰음을 알 수 있다.

실시예 7: ydh L _Bs 또는 ydh L _Ba 유전자 증폭의 비. 서브틸리스 이노신 -생산 균주에 의한 이노신 생산에 대한 영향

이노신-생산 비. 서브틸리스 균주 KMBS16-1을 pMWMX1 벡터, pYDHL3 또는 pYDHL4 플라스미드로 형질전환시켰다. 이렇게, 균주 비. 서브틸리스 KMBS16-1(pMWMX1), 비. 서브틸리스 KMBS16-1(pYDHL3) 및 비. 서브틸리스 KMBS16-1(pYDHL4)을 수득하였다. 이들 균주를 각각 에리트로마이신 10㎎/l을 가진 L-브로스에서 18시간 동안 37℃에서 배양하였다. 수득한 배양물 0.3㎖을 20 x 200mm 시험 튜브에서, 에리트로마이신 10㎎/l을 함유하는 바실러스 발효 배지 3㎖로 접종하였고, 회전식 교반기를 사용하여 37℃에서 72시간 동안 배양하였다.

당해 발효 배지의 조성물: (g/l)

포도당 80.0

K₂HPO₄ 1.0

MgSO₄ 0.4

FeSO₄·7H₂O 0.01

MnSO₄·5H₂O 0.01

마메노(Mameno) TN(총 질소)의 1.35

(대두 가수분해물)

DL-메티오닌 0.3

NH₄Cl 32.0

아데닌 0.1

트립토판 0.02

CaCO₃ 50.0

배양 후, 배지에 축적된 이노신의 양을 상기한 바와 같이 HPLC로 결정하였다. 결과는 표 5에 나타내어져 있다.

표 5에서 알 수 있는 바와 같이, ydhL_Bs 또는 ydhL_Ba 유전자의 증폭은 비. 서브틸리스 균주 KMBS16-1의 이노신 생산성을 개선시켰다.

실시예 8. 비. 아밀로리퀘패시엔스 ydhL 유전자의 조절 영역의 변형

비. 서브틸리스 ydhL 조절 영역의 변형, 즉, 5'-비해독 RNA 영역의 G-박스 내의 변형은 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다(문헌[참조: Mandal, M. and Breaker, R.R., Nat. Struct. Mol. Biol., 11(1), 29-35(2004)]). 따라서, ydhL 유전자 발현 수준을 향상시키기 위해, QuickChange^TM 부위-지시적 돌연변이유발(제조사[Stratagene)])를사용하여 동일한 돌연변이(T를 C로 치환)를 비. 아밀로리퀘패시엔스로부터의 ydhL 유전자의 조절 영역(당해 유전자의 출발 지점으로부터 "-77" 위치)으로 도입하였다. 이러한 목적을 위하여, 2개의 프라이머 1 및 2(각각, 서열 번호 7 및 8)을 비. 아밀로리퀘패시엔스로부터의 ydhL 유전자의 조절 영역의 DNA 서열을 토대로 하여 설계하였다. DNA 플라스미드 pYDHL2(pMW118-ydhL _BA)를 주형으로 사용하였다. 전체 플라스미드를 상기한 프라이머를 사용하여 증폭시켰고, ydhL 유전자를 포함하는 수개의 플라스미드를 수득하였다. 이들 플라스미드를 프라이머 3(서열 번호 9)를 사용하여 서열화하였고, 목적하는 T 대 C 치환의 존재를 확인하였다. 조절 영역에 돌연변이를 갖는 비. 아밀로리퀘패시엔스로부터의 ydhL 유전자를 포함하는 신규한 pMW118-유도체 플라스미드를 pYDHL5로 나타내었다. pYDHL5 플라스미드를 EcoRI 제한효소로 절단하여 선형화시키고 미리 동일한 제한효소로 선형화시켜 놓은 pMX30과 연결시켰다. 이렇게, 이의 발현 수준을 향상시키는 돌연변이를 갖는 ydhL _Ba 유전자를 포함하는 셔틀 플라스미드 pYDHL6를 수득하였다.

실시예 9. 비. 아밀로리퀘패시엔스 이노신 -생산 균주에 의한 이노신 생산에 대한 ydhL _Ba 유전자의 증강된 발현의 효과

pYDHL6 플라스미드 및 pMWMX1 셔틀 벡터 각각을 널리 공지된 방법으로 비. 서브틸리스 168 균주 내로 형질전환시켰다(문헌[참조: Spizizen, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 44, 1072-1078(1958)]). 수득한 균주, 비. 서브틸리스(pYDHL6) 및 비. 서브틸리스(pMWMX1)를 파지 E40-매개 형질전달에서 공여체로 사용하여 pYDHL6 및 pMWMX1 플라스미드를 이노신 및 구아노신을 생산하는 균주 비. 서브틸리스 G1136A(제AJ1991호, VKPM 제B-8994호, 제ATCC19222호) 내로 도입하였다(미국 특허 제3,575,809호). 균주 비. 서브틸리스 G1136A는 기관[All-Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM)(러시아, 모스크바 113545 도로츠니 프뢰츠 1번 1)]에 의해 바실러스 아밀로리퀘패시엔스로 재동정되었으며, 수탁번호(VKPM 제B-8994호) 하에 기탁되어 있다. 따라서, 이후 당해 균주는 바실러스 아밀로리퀘패시엔스 G1136A로 명명될 것이다. 파지 E40은 비. 서브틸리스 및 비. 아밀로리퀘패시엔스 세포 상에서 증식할 수 있는 PBS1-형 파지(문헌[참조: Takanishi, R., J. Gen. Microbiol., 31, 211-217, (1963)])이다. 형질전달 후, 균주 비. 아밀로리퀘패시엔스 G1136A(pMWMX1) 및 비. 아밀로리퀘패시엔스 G1136A(pYDHL6)를 수득하였다.

이들 균주를 각각 에리트로마이신 10㎎/l을 가진 L-브로스에서 18시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이어서, 수득한 배양물 0.3㎖을 20 x 200mm 시험 튜브에서, 에리트로마이신 10㎎/l를 함유하는 바실러스 발효 배지 3㎖로 접종하였고, 회전식 교반기를 사용하여 37℃에서 72시간 동안 배양하였다.

당해 발효 배지의 조성물: (g/l)

포도당 80.0

K₂HPO₄ 1.0

MgSO₄ 0.4

FeSO₄·7H₂O 0.01

MnSO₄·5H₂O 0.01

NH₄Cl 15.0

아데닌 0.3

총 질소 0.8

(마메노 형태)

CaCO₃ 25.0

배양 후, 배지에 축적된 이노신 및 구아노신의 양을 상기한 바와 같이 HPLC로 결정하였다. 결과는 표 6에 나타내어져 있다.

표 6에서 알 수 있는 바와 같이, ydhL _Ba 유전자의 증강된 발현은 비. 아밀로리퀘패시엔스 균주 G1136A의 이노신 생산성을 개선한 조절 돌연변이에 기인한다.

본 발명을 이의 바람직한 양태에 관하여 상세히 기술하였지만, 당해 분야의 숙련가에게는 본 발명의 영역에서 벗어나지 않으면서, 다양한 변형이 가해질 수 있으며, 동등하게 사용될 수 있음이 명백할 것이다. 상기한 문헌 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 인용되어 있다.

<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus Bacillus or Escherichia <130> C256-PC4330 <150> RU 2004109599 <151> 2004-03-31 <150> RU 2005104627 <151> 2005-02-22 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1161 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <220> <221> CDS <222> (1)..(1161) <223> <400> 1 atg aat ttc aaa gta ttt ctg ctt gca gca tct act att gca gtc gga 48 Met Asn Phe Lys Val Phe Leu Leu Ala Ala Ser Thr Ile Ala Val Gly 1 5 10 15 ttg gtt gaa tta att gtg ggc ggt att ctc ccg caa atc gct tcc gac 96 Leu Val Glu Leu Ile Val Gly Gly Ile Leu Pro Gln Ile Ala Ser Asp 20 25 30 tta gac ata tcg atc gtc agc gcc ggg cag ctg atc agc gtg ttc gcg 144 Leu Asp Ile Ser Ile Val Ser Ala Gly Gln Leu Ile Ser Val Phe Ala 35 40 45 ctc ggt tac gcg gta tca ggc cct ctg ctt ttg gca gtg acg gca aaa 192 Leu Gly Tyr Ala Val Ser Gly Pro Leu Leu Leu Ala Val Thr Ala Lys 50 55 60 gct gaa cga aag cgg ctt tat tta atc gca ctt ttt gtt ttc ttc ctg 240 Ala Glu Arg Lys Arg Leu Tyr Leu Ile Ala Leu Phe Val Phe Phe Leu 65 70 75 80 agt aat ctg gtc gct tac ttc agt ccc aat ttc gcc gta ctt atg gtg 288 Ser Asn Leu Val Ala Tyr Phe Ser Pro Asn Phe Ala Val Leu Met Val 85 90 95 tca cga gtg ctc gct tcc atg agc aca ggg ctg att gtc gtc ctt tct 336 Ser Arg Val Leu Ala Ser Met Ser Thr Gly Leu Ile Val Val Leu Ser 100 105 110 tta acg att gct cct aaa atc gtg gcg ccg gaa tac aga gcg cgg gcg 384 Leu Thr Ile Ala Pro Lys Ile Val Ala Pro Glu Tyr Arg Ala Arg Ala 115 120 125 atc ggc atc att ttc atg ggc ttc agc tcc gca atc gct tta ggc gtg 432 Ile Gly Ile Ile Phe Met Gly Phe Ser Ser Ala Ile Ala Leu Gly Val 130 135 140 cct gtc ggc att atc atc agc aat gcc ttc gga tgg cgc gtg ctg ttt 480 Pro Val Gly Ile Ile Ile Ser Asn Ala Phe Gly Trp Arg Val Leu Phe 145 150 155 160 ttg gga atc ggc gta tta tct ctg gtt tcc atg ctg att atc agc gtc 528 Leu Gly Ile Gly Val Leu Ser Leu Val Ser Met Leu Ile Ile Ser Val 165 170 175 ttt ttt gaa aaa ata cct gct gaa aaa atg atc ccg ttc cgt gag cag 576 Phe Phe Glu Lys Ile Pro Ala Glu Lys Met Ile Pro Phe Arg Glu Gln 180 185 190 att aaa acg att ggg aac gcc aag att gcc agc gcg cat ctt gtt acc 624 Ile Lys Thr Ile Gly Asn Ala Lys Ile Ala Ser Ala His Leu Val Thr 195 200 205 tta ttt aca ttg gcg ggg cat tac aca cta tat gcc tac ttt gcg cct 672 Leu Phe Thr Leu Ala Gly His Tyr Thr Leu Tyr Ala Tyr Phe Ala Pro 210 215 220 ttt ttg gaa aca acg ctt cat ttg agt tct gtt tgg gtc agt gta tgc 720 Phe Leu Glu Thr Thr Leu His Leu Ser Ser Val Trp Val Ser Val Cys 225 230 235 240 tac ttt ttg ttc ggc ctg tca gcg gta tgc ggc ggc ccg ttc gga ggc 768 Tyr Phe Leu Phe Gly Leu Ser Ala Val Cys Gly Gly Pro Phe Gly Gly 245 250 255 tgg ctg tat gac cgt tta gga tca ttt aaa agc atc atg ctt gtg acc 816 Trp Leu Tyr Asp Arg Leu Gly Ser Phe Lys Ser Ile Met Leu Val Thr 260 265 270 gtt tct ttc gct ttg atc ctg ttt atc ctt ccg ctg tca acg gtt tct 864 Val Ser Phe Ala Leu Ile Leu Phe Ile Leu Pro Leu Ser Thr Val Ser 275 280 285 tta atc gtt ttc ctg cct gcg atg gtc att tgg gga ttg ctc agc tgg 912 Leu Ile Val Phe Leu Pro Ala Met Val Ile Trp Gly Leu Leu Ser Trp 290 295 300 agc ctt gcg ccg gcg cag caa agc tat ttg atc aaa atc gcg cct gag 960 Ser Leu Ala Pro Ala Gln Gln Ser Tyr Leu Ile Lys Ile Ala Pro Glu 305 310 315 320 tct tcc gat att cag caa agc ttc aat acg tcc gct ttg caa atc ggc 1008 Ser Ser Asp Ile Gln Gln Ser Phe Asn Thr Ser Ala Leu Gln Ile Gly 325 330 335 att gcg ctc ggg tca gcc atc ggc ggc ggc gtg atc gga caa acg ggt 1056 Ile Ala Leu Gly Ser Ala Ile Gly Gly Gly Val Ile Gly Gln Thr Gly 340 345 350 tct gtc aca gca acc gcc tgg tgc ggc ggt ttg att gtc att atc gca 1104 Ser Val Thr Ala Thr Ala Trp Cys Gly Gly Leu Ile Val Ile Ile Ala 355 360 365 gtc agc tta gcc gta ttc tct tta acg aga ccc gct ttg aaa aga aaa 1152 Val Ser Leu Ala Val Phe Ser Leu Thr Arg Pro Ala Leu Lys Arg Lys 370 375 380 tcc gca taa 1161 Ser Ala 385 <210> 2 <211> 386 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 2 Met Asn Phe Lys Val Phe Leu Leu Ala Ala Ser Thr Ile Ala Val Gly 1 5 10 15 Leu Val Glu Leu Ile Val Gly Gly Ile Leu Pro Gln Ile Ala Ser Asp 20 25 30 Leu Asp Ile Ser Ile Val Ser Ala Gly Gln Leu Ile Ser Val Phe Ala 35 40 45 Leu Gly Tyr Ala Val Ser Gly Pro Leu Leu Leu Ala Val Thr Ala Lys 50 55 60 Ala Glu Arg Lys Arg Leu Tyr Leu Ile Ala Leu Phe Val Phe Phe Leu 65 70 75 80 Ser Asn Leu Val Ala Tyr Phe Ser Pro Asn Phe Ala Val Leu Met Val 85 90 95 Ser Arg Val Leu Ala Ser Met Ser Thr Gly Leu Ile Val Val Leu Ser 100 105 110 Leu Thr Ile Ala Pro Lys Ile Val Ala Pro Glu Tyr Arg Ala Arg Ala 115 120 125 Ile Gly Ile Ile Phe Met Gly Phe Ser Ser Ala Ile Ala Leu Gly Val 130 135 140 Pro Val Gly Ile Ile Ile Ser Asn Ala Phe Gly Trp Arg Val Leu Phe 145 150 155 160 Leu Gly Ile Gly Val Leu Ser Leu Val Ser Met Leu Ile Ile Ser Val 165 170 175 Phe Phe Glu Lys Ile Pro Ala Glu Lys Met Ile Pro Phe Arg Glu Gln 180 185 190 Ile Lys Thr Ile Gly Asn Ala Lys Ile Ala Ser Ala His Leu Val Thr 195 200 205 Leu Phe Thr Leu Ala Gly His Tyr Thr Leu Tyr Ala Tyr Phe Ala Pro 210 215 220 Phe Leu Glu Thr Thr Leu His Leu Ser Ser Val Trp Val Ser Val Cys 225 230 235 240 Tyr Phe Leu Phe Gly Leu Ser Ala Val Cys Gly Gly Pro Phe Gly Gly 245 250 255 Trp Leu Tyr Asp Arg Leu Gly Ser Phe Lys Ser Ile Met Leu Val Thr 260 265 270 Val Ser Phe Ala Leu Ile Leu Phe Ile Leu Pro Leu Ser Thr Val Ser 275 280 285 Leu Ile Val Phe Leu Pro Ala Met Val Ile Trp Gly Leu Leu Ser Trp 290 295 300 Ser Leu Ala Pro Ala Gln Gln Ser Tyr Leu Ile Lys Ile Ala Pro Glu 305 310 315 320 Ser Ser Asp Ile Gln Gln Ser Phe Asn Thr Ser Ala Leu Gln Ile Gly 325 330 335 Ile Ala Leu Gly Ser Ala Ile Gly Gly Gly Val Ile Gly Gln Thr Gly 340 345 350 Ser Val Thr Ala Thr Ala Trp Cys Gly Gly Leu Ile Val Ile Ile Ala 355 360 365 Val Ser Leu Ala Val Phe Ser Leu Thr Arg Pro Ala Leu Lys Arg Lys 370 375 380 Ser Ala 385 <210> 3 <211> 1167 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(1167) <223> <400> 3 atg aat ttc aaa gtt ttc ctg ctt gca gct tct acg att gca gtc gga 48 Met Asn Phe Lys Val Phe Leu Leu Ala Ala Ser Thr Ile Ala Val Gly 1 5 10 15 ttg gtt gag tta att gtg ggg gga att ctt cct cag atc gca aat gat 96 Leu Val Glu Leu Ile Val Gly Gly Ile Leu Pro Gln Ile Ala Asn Asp 20 25 30 tta gac att tcc att gtt tca gcc gga cag ctg atc agt gtg ttt gcg 144 Leu Asp Ile Ser Ile Val Ser Ala Gly Gln Leu Ile Ser Val Phe Ala 35 40 45 ctg gga tat gca gta tct ggg ccg ctg ctt ttg gca ttg act gcg aag 192 Leu Gly Tyr Ala Val Ser Gly Pro Leu Leu Leu Ala Leu Thr Ala Lys 50 55 60 att gag cgg aag cgc tta tat cta att gct tta ttt gtt ttc ttc ctt 240 Ile Glu Arg Lys Arg Leu Tyr Leu Ile Ala Leu Phe Val Phe Phe Leu 65 70 75 80 agc aat ctt gtc gcc tat ttc agc cct aat ttc gca aca ctg atg gta 288 Ser Asn Leu Val Ala Tyr Phe Ser Pro Asn Phe Ala Thr Leu Met Val 85 90 95 tct agg gta ttg gca gca atg agt aca ggg ctg att gtt gtg ctt tct 336 Ser Arg Val Leu Ala Ala Met Ser Thr Gly Leu Ile Val Val Leu Ser 100 105 110 tta aca att gcc ccg aaa att gta gcg cct gaa tac aga gcc cgc gca 384 Leu Thr Ile Ala Pro Lys Ile Val Ala Pro Glu Tyr Arg Ala Arg Ala 115 120 125 atc gga att att ttt atg gga ttc agc tct gct atc gca tta ggc gtg 432 Ile Gly Ile Ile Phe Met Gly Phe Ser Ser Ala Ile Ala Leu Gly Val 130 135 140 ccg ctc gga atc tta atc agc gat tcc ttc ggg tgg cgg att ttg ttc 480 Pro Leu Gly Ile Leu Ile Ser Asp Ser Phe Gly Trp Arg Ile Leu Phe 145 150 155 160 ctt ggc atc ggc ctg ttg gca ctg atc tcc atg ctg att att tca atc 528 Leu Gly Ile Gly Leu Leu Ala Leu Ile Ser Met Leu Ile Ile Ser Ile 165 170 175 ttc ttt gaa aga ata ccg gcg gag aaa atg att cct ttc cgg gaa caa 576 Phe Phe Glu Arg Ile Pro Ala Glu Lys Met Ile Pro Phe Arg Glu Gln 180 185 190 ctc aag acg atc ggt aat ctg aaa atc gcg agt tca cac ctc gtc acg 624 Leu Lys Thr Ile Gly Asn Leu Lys Ile Ala Ser Ser His Leu Val Thr 195 200 205 atg ttt aca tta gct ggc cac tac acg ctt tac gct tac ttt gcg ccg 672 Met Phe Thr Leu Ala Gly His Tyr Thr Leu Tyr Ala Tyr Phe Ala Pro 210 215 220 ttt tta gaa gag act ctt cac ctg agc tct ttc tgg gtc agc att tgt 720 Phe Leu Glu Glu Thr Leu His Leu Ser Ser Phe Trp Val Ser Ile Cys 225 230 235 240 tat ttc ctt ttc ggg ata tct gct gta tgc gga ggc cct ttc gga gga 768 Tyr Phe Leu Phe Gly Ile Ser Ala Val Cys Gly Gly Pro Phe Gly Gly 245 250 255 gcg cta tct gac cgg ctt ggt tcc ttt aag agc att ttg ctg gtg acc 816 Ala Leu Ser Asp Arg Leu Gly Ser Phe Lys Ser Ile Leu Leu Val Thr 260 265 270 ggt tcc ttt gcc atc att atg ttc tta ctg ccg ctg tct aca tcg tct 864 Gly Ser Phe Ala Ile Ile Met Phe Leu Leu Pro Leu Ser Thr Ser Ser 275 280 285 atg att ttc ttt ttg cct gtc atg gtg att tgg ggt ctt ctg agc tgg 912 Met Ile Phe Phe Leu Pro Val Met Val Ile Trp Gly Leu Leu Ser Trp 290 295 300 agc ctc gcc ccg gct cag caa agc tat tta att gaa att gca cct gat 960 Ser Leu Ala Pro Ala Gln Gln Ser Tyr Leu Ile Glu Ile Ala Pro Asp 305 310 315 320 tcg tct gac att cag caa agc ttt aac aca tcg gcc ctc caa gtc gga 1008 Ser Ser Asp Ile Gln Gln Ser Phe Asn Thr Ser Ala Leu Gln Val Gly 325 330 335 att gcc ctt ggc tca gcc att ggc ggt gtt gtt ttg gat cag acg ggt 1056 Ile Ala Leu Gly Ser Ala Ile Gly Gly Val Val Leu Asp Gln Thr Gly 340 345 350 act gtg gtg tca acg gca tgg tgc ggc gga tcg att gtg atc atc gct 1104 Thr Val Val Ser Thr Ala Trp Cys Gly Gly Ser Ile Val Ile Ile Ala 355 360 365 gtc ctg ttt gct ttc att tct tta aca aga cct gtt caa aca gca aaa 1152 Val Leu Phe Ala Phe Ile Ser Leu Thr Arg Pro Val Gln Thr Ala Lys 370 375 380 aaa tcc tcc ttg taa 1167 Lys Ser Ser Leu 385 <210> 4 <211> 388 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 4 Met Asn Phe Lys Val Phe Leu Leu Ala Ala Ser Thr Ile Ala Val Gly 1 5 10 15 Leu Val Glu Leu Ile Val Gly Gly Ile Leu Pro Gln Ile Ala Asn Asp 20 25 30 Leu Asp Ile Ser Ile Val Ser Ala Gly Gln Leu Ile Ser Val Phe Ala 35 40 45 Leu Gly Tyr Ala Val Ser Gly Pro Leu Leu Leu Ala Leu Thr Ala Lys 50 55 60 Ile Glu Arg Lys Arg Leu Tyr Leu Ile Ala Leu Phe Val Phe Phe Leu 65 70 75 80 Ser Asn Leu Val Ala Tyr Phe Ser Pro Asn Phe Ala Thr Leu Met Val 85 90 95 Ser Arg Val Leu Ala Ala Met Ser Thr Gly Leu Ile Val Val Leu Ser 100 105 110 Leu Thr Ile Ala Pro Lys Ile Val Ala Pro Glu Tyr Arg Ala Arg Ala 115 120 125 Ile Gly Ile Ile Phe Met Gly Phe Ser Ser Ala Ile Ala Leu Gly Val 130 135 140 Pro Leu Gly Ile Leu Ile Ser Asp Ser Phe Gly Trp Arg Ile Leu Phe 145 150 155 160 Leu Gly Ile Gly Leu Leu Ala Leu Ile Ser Met Leu Ile Ile Ser Ile 165 170 175 Phe Phe Glu Arg Ile Pro Ala Glu Lys Met Ile Pro Phe Arg Glu Gln 180 185 190 Leu Lys Thr Ile Gly Asn Leu Lys Ile Ala Ser Ser His Leu Val Thr 195 200 205 Met Phe Thr Leu Ala Gly His Tyr Thr Leu Tyr Ala Tyr Phe Ala Pro 210 215 220 Phe Leu Glu Glu Thr Leu His Leu Ser Ser Phe Trp Val Ser Ile Cys 225 230 235 240 Tyr Phe Leu Phe Gly Ile Ser Ala Val Cys Gly Gly Pro Phe Gly Gly 245 250 255 Ala Leu Ser Asp Arg Leu Gly Ser Phe Lys Ser Ile Leu Leu Val Thr 260 265 270 Gly Ser Phe Ala Ile Ile Met Phe Leu Leu Pro Leu Ser Thr Ser Ser 275 280 285 Met Ile Phe Phe Leu Pro Val Met Val Ile Trp Gly Leu Leu Ser Trp 290 295 300 Ser Leu Ala Pro Ala Gln Gln Ser Tyr Leu Ile Glu Ile Ala Pro Asp 305 310 315 320 Ser Ser Asp Ile Gln Gln Ser Phe Asn Thr Ser Ala Leu Gln Val Gly 325 330 335 Ile Ala Leu Gly Ser Ala Ile Gly Gly Val Val Leu Asp Gln Thr Gly 340 345 350 Thr Val Val Ser Thr Ala Trp Cys Gly Gly Ser Ile Val Ile Ile Ala 355 360 365 Val Leu Phe Ala Phe Ile Ser Leu Thr Arg Pro Val Gln Thr Ala Lys 370 375 380 Lys Ser Ser Leu 385 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence: primer <400> 5 cccgtcgaca aaacggcatc cgcttttctc a 31 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence: primer <400> 6 cccagatctc gagcggcgaa aaagtgaaaa ac 32 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence: primer <400> 7 gaaccgtaaa atcctgacta caaaaaactg tccc 34 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence: primer <400> 8 gggacagttt tttgtagtca ggattttacg gttc 34 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence: primer <400> 9 atttgcggga gaataccgcc cac 23

Claims

퓨린-생산능 및 YdhL 단백질의 증강된 활성을 갖는 바실러스(Bacillus) 속 또는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 세균.
제1항에 있어서, ydhL 유전자의 복사체 수를 증가시키거나 ydhL 유전자의 발현 조절 서열을 변형시킴으로써 YdhL 단백질의 활성을 증강시킨 세균.
제1항에 있어서, ydhL 유전자가,

(a) 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA; 및

(b) 엄격한 조건 하에 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열로부터 제조할 수 있는 프로브와 하이브리드화 가능하고, 단백질 활성을 세균 내에서 증강시키는 경우, 바실러스 속 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균에 퓨린 염기 유사체, 이노신 및 구아노신으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 퓨린에 대한 내성을 부여하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA

로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세균.
제3항에 있어서, 엄격한 조건이 60℃에서, 1 x SSC, 0.1% SDS를 포함하는 세균.
제1항에 있어서, ydhL 유전자가,

(a) 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA; 및

(b) 엄격한 조건 하에 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 3의 뉴클레오타이드 서열로부터 제조할 수 있는 프로브와 하이브리드화 가능하고, 단백질의 활성을 세균 내에서 증강시키는 경우, 바실러스 속 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균에 퓨린 염기 유사체, 이노신 및 구아노신으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 퓨린에 대한 내성을 부여하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA

로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세균.
제5항에 있어서, 엄격한 조건이 60℃에서, 1 x SSC, 0.1% SDS를 포함하는 세균.
제1항에 있어서, 퓨린이 이노신, 크산토신 및 구아노신으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 세균.
a) 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 세균을 배양 배지 중에서 배양하는 단계,

b) 퓨린 뉴클레오사이드가 배양 배지로 분비되도록 하는 단계, 및

c) 배양 배지로부터 퓨린 뉴클레오사이드를 수집하는 단계

를 포함하여 퓨린 뉴클레오사이드를 제조하는 방법.
제8항에 있어서, 퓨린 뉴클레오사이드가 이노신인 방법.
제8항에 있어서, 퓨린 뉴클레오사이드가 크산토신인 방법.
제8항에 있어서, 퓨린 뉴클레오사이드가 구아노신인 방법.
제8항에 있어서, 세균이 퓨린 뉴클레오사이드 생합성 유전자의 증강된 발현을 갖도록 변형시킨 방법.
a) 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 세균을 배양 배지 중에서 배양하는 단계,

b) 퓨린 뉴클레오사이드를 인산화시켜 퓨린 뉴클레오타이드를 생성시키는 단계,

c) 퓨린 뉴클레오타이드가 배양 배지로 분비되도록 하는 단계, 및

d) 퓨린 뉴클레오타이드를 배양 배지로부터 수집하는 단계

를 포함하여 퓨린 뉴클레오타이드를 제조하는 방법.
제13항에 있어서, 퓨린 뉴클레오타이드가 5'-이노신산인 방법.
제13항에 있어서, 퓨린 뉴클레오타이드가 5'-크산틸산인 방법.
제14항에 있어서, 퓨린 뉴클레오타이드가 5'-구아닐산인 방법.
제13항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 세균이 퓨린 뉴클레오타이드 생합성 유전자의 증강된 발현을 갖도록 변형시킨 방법.
a) 제1항에 따르는 세균을 배양 배지 중에서 배양하는 단계,

b) 크산토신을 인산화시켜 5'-크산틸산을 생성시키는 단계,

c) 5'-크산틸산을 아민화시켜 5'-구아닐산을 생성시키는 단계, 및

d) 5'-구아닐산을 수집하는 단계

를 포함하여 5'-구아닐산을 제조하는 방법.
제18항에 있어서, 세균이 크산토신 생합성 유전자의 증강된 발현을 갖도록 변형시킨 방법.