KR20060084456A - 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법 - Google Patents

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KR20060084456A
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Abstract

본 발명은 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법을 제공한다. 이 제조 방법에 의하면 의약품 개발 등의 분야에서 유용한 각종 단리된 당쇄 아스파라긴 유도체를 종래에 비하여 매우 용이하고 또한 대량으로 얻을 수 있다. 또 본 발명은 상기 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 공정을 통하는, 당쇄 아스파라긴의 제조 방법 및 당쇄의 제조 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 신규 당쇄 아스파라긴 유도체, 당쇄 아스파라긴 및 당쇄를 제공한다.

Description

당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법 {PROCESS FOR PRODUCING SUGAR CHAIN ASPARAGINE DERIVATIVE}
도 1 내지 12 는 본 발명에 의해 얻어질 수 있는 당쇄 아스파라긴 유도체의 1군의 구조를 나타내는 도면이다.
도 13 내지 25 는 본 발명에 의해 얻어질 수 있는 당쇄 아스파라긴 유도체의 1군의 구조를 나타낸 도면이다.
도 26 내지 37 은 본 발명에 의해 얻어질 수 있는 당쇄 아스파라긴의 1군의 구조를 나타내는 도면이다.
도 38 내지 50 은 본 발명에 의해 얻어질 수 있는 당쇄 아스파라긴의 1군의 구조를 나타내는 도면이다.
도 51 내지 62 은 본 발명에 의해 얻어질 수 있는 당쇄의 1군의 구조를 나타내는 도면이다.
도 63 내지 75 는 본 발명에 의해 얻어질 수 있는 당쇄의 1군의 구조를 나타내는 도면이다.
도 76 내지 86 은 본 발명의 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법에서의 공정의 일례를 나타내는 도면이다.
도 87 내지 94 는 각종 당 가수분해 효소를 사용한 당쇄 아스파라긴 유도체 의 변환공정의 일례를 나타내는 도면이다.
도 95 내지 98 은 각종 당 가수분해 효소를 사용한 당쇄 아스파라긴 유도체의 변환공정의 일례를 나타내는 도면이다.
도 99 내지 106 은 각종 당 가수분해 효소를 사용한 당쇄 아스파라긴 유도체의 변환공정의 일례를 나타내는 도면이다.
도 107 내지 112 는 각종 당 가수분해 효소를 사용한 당쇄 아스파라긴 유도체의 변환공정의 일례를 나타내는 도면이다.
도 113 내지 115 는 당쇄 아스파라긴 유도체로부터의 보호기 (Fmoc 기) 의 제거공정 및 당쇄 아스파라긴으로부터의 아스파라긴 잔기의 제거공정의 일례를 나타내는 도면이다.
본 발명은 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법 및 당쇄 아스파라긴 유도체에 관한 것이다.
최근 당쇄를 당 가수분해 효소로 분해하여 유도체화하는 기술이 당쇄의 구조해석 등, 수밀리그램 스케일의 분석연구에서 이용되고 있다. 그러나 개개의 당쇄의 유도체를 대량으로 얻을 수는 없었기 때문에, 그램 스케일에서의 연구 기술의 진전은 느렸었다. 이 때문에 당쇄의 유도체를 약품을 제조하는 합성 연구에 응용하기는 어려웠다.
한편 난황에서 당 펩티드가 대량으로 얻어지는 것은 알려져 있었다 (Biochimicaet Biophysica Acta 1335 (1997) p23∼32). 그러나 도 1 에 나타낸 화합물 1 및 이 화합물 1 에서 분기 당쇄의 일방의 비환원 말단의 시알산이나 갈락토오스 등 몇개의 당잔기가 결실된 일련의 화합물에 대한 플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 화된 당쇄의 유도체를 대량으로 얻은 예는 없다. 또 사람의 혈액중의 단백질 등으로부터 몇가지 종류의 당쇄가 소량 단리된 예는 있으나, 당해 당쇄를 약품 제조에 사용하면 당해 약품에 인체에 유해한 에이즈 바이러스나 간염 바이러스 등이 혼입될 위험성이 있기 때문에, 당해 당쇄를 약품에 응용하는 기술은 문제시되었다.
그런데 분기형 당쇄로 그 분기부분의 구조가 동일한 것을 갖는 당쇄의 제조예는 많이 있다. 그 종래 기술은 3종류의 방법이 존재한다. 첫번째 천연적으로 존재하는 당 단백질로부터 아스파라긴 결합 복합형 당쇄를 단리정제하는 방법이다. 그 대표예로서는 T. Tamura, et al. Anal, Biochem., 1994, 216, p335-344, V. H. Thomas, et al. Carbohydr. Res., 1998, 306, p387-400, K.G. RICE, et al., Biochemistry, 1993, 32, p 7264-7270 등에 기재된 방법이 있다. 이들 방법의 이점은 당쇄를 합성할 필요가 없다는 것이다. 그러나 결점이 몇가지 존재한다. 예를 들어 상기 당 단백질 유래의 당쇄는 비환원 말단부분에서 당잔기가 랜덤하게 몇개 결실된 당쇄의 혼합물로서 얻어지고, 당해 혼합물에 함유되는 당쇄는 그 물리적ㆍ화학적 성질이 유사하여 개개의 당쇄로 분리하기는 매우 곤란하므로, 단일 당쇄를 대량으로 얻는 것은 실질적으로 불가능하였다. 또 비교적 대 량으로 얻기 위해 사람 혈중의 단백질 (Fibrinogen 으로부터의 단리 : C. H. Hokke, et al, Carbohydr. Res., 305(1997), p463-468, Human Serum Transferrin 으로부터의 단리 : M. Mizuno et al., J. Am. Chem Soc., 1999, 121, p284-290) 로부터 당쇄를 단리하는 예가 있다. 상기 서술한 바와 같이 사람 혈중의 단백질에는 에이즈나 간염바이러스가 혼입되어 있을 가능성이 있어, 조작을 신중하게 할 필요가 있다. 따라서 얻어지는 당쇄나, 그 유도체를 의약품 개발에 이용하는 것은 곤란하다. 또 당쇄가 대량으로 얻어졌다고 해도 그 구조는 한정되어 있어, 다종류의 구조의 당쇄나 그 유도체가 얻어진 예는 실질적으로 존재하지 않는다.
K. G. Rice, et al., Biochemistry, 1993, 32, p7264-7270, 혹은 Rice, et al., Neoglycoconjugate, Academic Press, 1994, ISBN 0-12-440585-1 p286∼321 에서는, 당 가수분해 효소를 사용하여 당쇄의 비환원 말단에서 당잔기를 제거하고 있으나, 원료가 되는 단일구조의 당쇄를 대량으로 얻을 수 없으므로 분석 스케일에서만 실시된다. E. Meinjohanns (J. Chem. Soc. Perkin Transl, 1998, p549-560) 들은, Bovine Fetuin (소 유래의 당 단백질) 로부터 도 5 에 나타낸 화합물 56 을 얻은 후, 도 3 에 나타내는 화합물 33 을 경유하여 도 1 에 나타낸 화합물 10 을 합성하고 있다. 최초의 원료인 화합물 56 을 얻기 위해 히드라진 분해반응을 이용하고 있다. 이 히드라진은 독성이 높고, 얻어지는 당쇄의 유도체를 의약품에 응용하는 경우, 미량의 히드라진이 혼입될 가능성이 있기 때문에 안전성 면에서 문제가 있다. 또 시알산이 결합되어 있지 않은 화합물 56, 33 및 10 의 당쇄의 유도체를 소량으로밖에 얻을 수 없다.
두번째 방법은 화학적으로 당쇄를 합성하는 방법이다. 현재 화학합성에 의해, 당쇄를 조합하여 10당 정도로 구축하는 것은, J. Seifert et al. Angew Chem Int. Ed. 2000, 39, p531-534 의 보고예에 있는 바와 같이 가능하다. 이 방법의 이점으로는 모든 당쇄의 유도체를 얻는 것이 물리적으로는 가능한 것이다. 그러나 그 공정수가 방대하기 때문에 대량합성이 곤란하다는 결점이 있다. 또 10개 정도의 당잔기가 결합된 당쇄를 수밀리그램 합성하는 경우에도, 1년 가까운 기간이 필요하다. 지금까지 몇개의 당쇄가 화학적으로 합성된 예는 있으나, 그 대부분이 목적물인 당쇄를 수밀리그램 합성할 수 있었다는 것이 현실정이다.
세번째 방법으로는 효소반응과 화학반응을 조합하여 당쇄를 합성하는 방법이다. 그 대표예로서는 Carlo Unverzagt, Angew Chem Int. Ed. 1996, 35, p2350-2353 과 같은 보고가 있다. 이 방법은 화학적 합성에 의해 어느 정도의 당쇄를 구축한 후, 효소반응에 의해 당잔기를 당쇄에 부가시키고, 당쇄를 신장시켜가는 수법이다. 그러나 당을 신장시킬 때에 사용하는 효소에 기질특이성이 있기 때문에, 당쇄에 도입할 수 있는 당의 종류에 제한이 있다. 또 화학합성의 공정수가 방대하기 때문에 대량합성이 곤란하여 최종목적물을 소량으로밖에 얻을 수 없다. 또 C. H. Lin (Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1995, p1625-1630) 들은 M. Koketsu 들이 보고한 방법 (J. Carbohydrate Chemistry, 1995, 14(6), p833-841) 을 이용하여, 난황에서 시알릴올리고당 펩티드를 얻고, 그리고 당 가수분해 효소, 당전이효소를 사용하여 당쇄의 비환원 말단부분의 구조의 개변을 실시하고 있다. 이 논문중의 도면에서는, 비환원 말단부분에 아스파라긴 (Asn) 잔기만이 1개 결합된 당쇄가 기재되어 있으나, J. Carbohydrate Chemistry, 1995, 14(6), p833-841 에서 보고되어 있는 방법에 의하면, 당쇄의 비환원 말단에 아스파리긴 이외에 리신 등 몇개의 아미노산이 평균 2.5개 결합된 것의 혼합물이 얻어진다. 따라서 단일 화합물로서 당쇄의 유도체를 얻을 수 없고, 또 분기형 당쇄의 분기 당쇄의 당잔기가 임의로 결실된 화합물에 대한 개개의 유도체를 대량으로 얻는 것에 대한 시사도 없다. C.H. Lin 등의 논문에는 당쇄 펩티드가 단일 생성물로서 얻어진다는 근거도 나타나 있지 않다. Y. Ichikawa 는, Glycopeptide and Related Compounds (Marcel Dekker, Inc., 1997, ISBN 0-8247-9531-8, p.79∼205) 중에서, 3분기형의 복합형 당쇄를 말단에서 순차적으로 당 가수분해 효소로 처리하면 당쇄의 비환원 말단에서 당쇄를 순차적으로 제거할 수 있어, 각종 당쇄의 유도체가 얻어진다고 서술되어 있다. 그러나 효소처리 후, 어떻게 하여 개개의 당쇄를 분리하는지에 대해서는 서술되어 있지 않고, 또 분지가 균일한 것만의 합성이다. 따라서 당해 방법에 의해서도 분기형 당쇄의 분기 당쇄의 당잔기가 임의로 결실된 화합물에 대한 개개의 유도체를 대량으로 얻을 수는 없을 것으로 생각된다.
본 발명은 의약품 개발 등의 분야에서 유용한 각종 단리된 당쇄 아스파라긴 유도체를 종래에 비하여 매우 용이하고 대량으로 얻을 수 있는, 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또 본 발명은 당쇄 아스파라긴 유도체와 함께 유용한 각종 단리된 당쇄 아스파라긴 및 당쇄를 각각 종래에 비하여 매우 용이하고 대량으로 얻을 수 있는, 당쇄 아스파라긴 유도체를 제조하는 공정을 통한, 당쇄 아스파라긴의 제조 방법 및 당쇄의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 신규 당쇄 아스파라긴 유도체, 당쇄 아스파라긴 및 당쇄를 제공하는 것을 목적으로 한다.
즉, 본 발명은,
(1) (a) 1 종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물에 함유되는 이 당쇄 아스파라긴에 지용성의 보호기를 도입하여 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻는 공정,
(b) 이 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물 또는 이 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물에 함유되는 당쇄 아스파라긴 유도체를 가수분해하여 얻어지는 혼합물을 크로마토그래피를 사용하여 각 당쇄 아스파라긴 유도체를 분리하는 공정,
을 포함하는, 당쇄 아스파라긴 유래의 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법,
(2) (b') 공정 (b) 에서 분리된 당쇄 아스파라긴 유도체를 당 가수분해 효소를 사용하여 가수분해하는 공정을 추가로 포함하는 상기 (1) 에 기재된 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법,
(3) 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물이,
Figure 112006048558965-PAT00001
및/또는 이 화합물에 있어서 1 이상의 당잔기가 결실된 화합물을 함유하는 것인, 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법,
(4) 지용성의 보호기가 플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 기인 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법,
(5) 공정 (a) 가, 비환원 말단에 시알산 잔기를 갖는 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물에 함유되는 이 당쇄 아스파라긴에 Fmoc 기를 도입하고, 또한 시알산 잔기에 벤질기를 도입하여 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻는 공정인, 상기 (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법,
(6) (a) 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물에 함유되는 이 당쇄 아스파라긴에 지용성의 보호기를 도입하여 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻는 공정,
(b) 이 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물 또는 이 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물에 함유되는 당쇄 아스파라긴 유도체를 가수분해하여 얻어지는 혼합물을 크로마토그래피를 사용하여 각 당쇄 아스파라긴 유도체를 분리하는 공정, 및
(c) 공정 (b) 에서 분리된 당쇄 아스파라긴 유도체의 보호기를 제거하여 당쇄 아스파라긴을 얻는 공정,
을 포함하는 당쇄 아스파라긴의 제조 방법,
(7) (b') 공정 (b) 에서 분리된 당쇄 아스파라긴 유도체를 당 가수분해 효소를 사용하여 가수분해하는 공정, 및/또는
(c') 공정 (c) 에서 얻어진 당쇄 아스파라긴을 당 가수분해 효소를 사용하여 가수분해하는 공정,
을 추가로 포함하는, 상기 (6) 에 기재된 당쇄 아스파라긴의 제조 방법,
(8) 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물이,
Figure 112006048558965-PAT00002
및/또는 이 화합물에 있어서 1 이상의 당잔기가 결실된 화합물을 함유하는 것인, 상기 (6) 또는 (7) 에 기재된 당쇄 아스파라긴의 제조 방법,
(9) 지용성의 보호기가 Fmoc 기인 상기 (6)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 당쇄 아스파라긴의 제조 방법,
(10) 공정 (a) 가 비환원 말단에 시알산 잔기를 갖는 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물에 함유되는 이 당쇄 아스파라긴에 Fmoc 기를 도입하고, 또한 시알산 잔기에 벤질기를 도입하여 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻는 공정인, 상기 (6)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 당쇄 아스파라긴의 제조 방법,
(11) (a) 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물에 함유되는 이 당쇄 아스파라긴에 지용성의 보호기를 도입하여 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻는 공정,
(b) 이 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물 또는 이 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물에 함유되는 당쇄 아스파라긴 유도체를 가수분해하여 얻어지는 혼합물을 크로마토그래피를 사용하여 각 당쇄 아스파라긴 유도체를 분리하는 공정,
(c) 공정 (b) 에서 분리된 당쇄 아스파라긴 유도체의 보호기를 제거하여 당쇄 아스파라긴을 얻는 공정, 및
(d) 공정 (c) 에서 얻어진 당쇄 아스파라긴의 아스파라긴 잔기를 제거하여 당쇄를 얻는 공정,
을 포함하는 당쇄의 제조 방법,
(12) (b') 공정 (b) 에서 분리된 당쇄 아스파라긴 유도체를 당 가수분해 효소를 사용하여 가수분해하는 공정 및/또는
(c') 공정 (c) 에서 얻어진 당쇄 아스파라긴을 당 가수분해 효소를 사용하여 가수분해하는 공정 및/또는,
(d') 공정 (d) 에서 얻어진 당쇄를 당 가수분해 효소를 사용하여 가수분해하는 공정을 추가로 포함하는, 상기 (11) 에 기재된 당쇄의 제조 방법,
(13) 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물이,
Figure 112006048558965-PAT00003
및/또는 이 화합물에서 1 이상의 당잔기가 결실된 화합물을 함유하는 것인, 상기 (11) 또는 (12) 에 기재된 당쇄의 제조 방법,
(14) 지용성의 보호기가 Fmoc 기인 상기 (11)∼(13) 중 어나 하나에 기재된 당쇄의 제조 방법,
(15) 공정 (a) 가 비환원 말단에 시알산 잔기를 갖는 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물에 함유되는 이 당쇄 아스파라긴에 Fmoc 기를 도입하고, 또한 시알산 잔기에 벤질기를 도입하여 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻는 공정인, 상기 (11)∼(13) 중 어느 하나에 기재된 당쇄의 제조 방법,
(16) 일반식 :
Figure 112006048558965-PAT00004
(식 중, R1 및 R2 는 H,
Figure 112006048558965-PAT00005
Figure 112006048558965-PAT00006
또는
Figure 112006048558965-PAT00007
이고, 동일하거나 달라도 된다. 단,
R1 및 R2 가 모두
Figure 112006048558965-PAT00008
인 경우를 제외함)
를 갖는 당쇄 아스파라긴 유도체,
(17) 일반식 :
Figure 112006048558965-PAT00009
(식 중, RX 및 RY 는, 일방이
Figure 112006048558965-PAT00010
이고,
타방이, H,
Figure 112006048558965-PAT00011
또는
Figure 112006048558965-PAT00012
임)
을 갖는 당쇄 아스파라긴 유도체,
(18) 일반식 :
Figure 112006048558965-PAT00013
(식 중, R3 및 R4 는 H,
Figure 112006048558965-PAT00014
Figure 112006048558965-PAT00015
또는
Figure 112006048558965-PAT00016
이고,
동일하거나 달라도 된다. 단, R3 및 R4 가 모두
Figure 112006048558965-PAT00017
또는
Figure 112006048558965-PAT00018
인 경우를 제외함)
을 갖는 당쇄 아스파라긴, 및
(19) 일반식 :
Figure 112006048558965-PAT00019
(식 중, R5 및 R6 은, H,
Figure 112006048558965-PAT00020
Figure 112006048558965-PAT00021
또는
Figure 112006048558965-PAT00022
이고,
동일하거나 달라도 된다. 단, R5 및 R6 이 모두
Figure 112006048558965-PAT00023
또는
Figure 112006048558965-PAT00024
이거나, 혹은 R5 또는 R6 의 일방이 H 이고,
또한 타방이
Figure 112006048558965-PAT00025
인 경우를 제외함)
을 갖는 당쇄,
에 관한 것이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명의 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법은, 예를 들어 천연 당 단백질에서 유래하는 당쇄 아스파라긴, 바람직하게는 아스파라긴 결합형 당쇄로부터 얻어지는 당쇄 아스파라긴의 혼합물에 함유되는 당해 당쇄 아스파라긴에 지용성의 보호기를 도입 (결합) 하여 당쇄 아스파라긴 유도체의 혼합물을 얻은 후에 당해 혼합물을 각 당쇄 아스파라긴 유도체로 분리하는 것을 하나의 큰 특징으로 한다. 또한 본 명세서에 있어서, 「당쇄 아스파라긴」이란 아스파라긴이 결합된 상태의 당쇄를 말한다. 또 「아스파라긴 결합형 당쇄」란 단백질의 폴리펩티드 중의 아스파라긴 (Asn) 의 산아미노기에, 환원말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민이 N-글리코시드 결합된 당쇄군으로, Man (β1-4)GlcNac(β1-4)GlcNac 를 모핵으로 하는 당쇄군을 말한다. 「당쇄 아스파라긴 유도체」란 아스파라긴 잔기에 지용성의 보호기가 결합된 상태의 당쇄 아스파라긴을 말한다. 또 화합물의 구조식 중, 「AcHN」은 아세트아미드기를 나타낸다.
상기 서술한 바와 같이 천연의 당 단백질에서 유래하는 당쇄는 비환원 말단의 당잔기가 랜덤하게 결실된 당쇄의 혼합물이다. 본 발명자들은, 뜻밖에도 천연 당 단백질에서 유래하는 당쇄, 구체적으로는 당쇄 아스파라긴의 혼합물에 함유되는 당해 당쇄 아스파라긴에 지용성의 보호기를 도입함으로써, 당해 보호기가 도입된 당쇄 아스파라긴 유도체의 혼합물을 공지된 크로마토그래피의 수법을 사용하여 용이하게 개개의 당쇄 아스파라긴 유도체로 분리할 수 있는 것을 발견하였다. 이에 의해 각종 구조를 갖는 당쇄 아스파라긴 유도체를 각각 대량으로 조제할 수 있었다. 예를 들어 종래 분리가 곤란하였던, 도 1 에 나타내는 화합물 2 와 6 또는 도 2 에 나타내는 화합물 3 과 7 과 같은 유사한 구조의 당쇄 아스파라긴 유도체끼리의 분리가 가능해져, 이들 화합물을 각각 용이하고 대량으로 조제할 수 있다. 또 얻어진 당쇄 아스파라긴 유도체를 토대로, 예를 들어 당쇄 가수분해 효소를 순차적으로 작용시켜 당잔기를 제거함으로써, 더욱 각종 당쇄 아스파라긴 유도체를 합성할 수도 있다.
이와 같이 당쇄 아스파라긴에 지용성의 보호기를 도입하여 유도체화함으로써 개개의 당쇄 아스파라긴 유도체의 분리가 가능해졌으나, 이것은 지용성의 보호기를 도입함으로써 당쇄 아스파라긴 유도체의 전체의 지용성이 높아지고, 예를 들어 바람직하게 사용되는 역상계 컬럼과의 상호작용이 훨씬 향상되어, 그 결과, 보다 예민하게 당쇄 구조의 차를 반영하여 개개의 당쇄 아스파라긴 유도체가 분리되도록 된 것에 의한 것으로 생각된다. 예를 들어 본 발명에서 적합하게 사용되는 지용성의 보호기인 Fmoc 기의 지용성은 매우 높다. 즉, Fmoc 기의 플루오레닐 골격은, 중심의 오원환에 벤젠환이 2개 결합된 매우 지용성이 높은 성질의 구조를 취하고 있고, 예를 들어 역상계 컬럼의 하나인 ODS 컬럼의 옥타데실기와 매우 강한 상호작용을 낳고, 유사한 구조의 당쇄 아스파라긴 유도체의 분리가 가능하게 된 것으로 생각된다.
또한 본 발명에 의하면, 후술하는 바와 같이, 얻어진 당쇄 아스파라긴 유도체의 보호기를 제거함으로써 각종 당쇄 아스파라긴을, 또 얻어진 당쇄 아스파라긴의 아스파라긴 잔기를 제거함으로써 각종 당쇄를 용이하고 대량으로 얻을 수 있다.
본 발명의 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법은 구체적으로는
(a) 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물에 함유되는 이 당쇄 아스파라긴에 지용성의 보호기를 도입하여 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻는 공정, 및
(b) 이 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물 또는 이 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물에 함유되는 당쇄 아스파라긴 유도체를 가수분해하여 얻어지는 혼합물을 크로마토그래피를 사용하여 각 당쇄 아스파라긴 유도체를 분리하는 공정,
을 포함하는 것이다.
공정 (a) 에서 사용되는 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물로서는, 아스파라긴이 결합된 상태의 당쇄를 1종 혹은 2종 이상 함유하는 혼합물이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 아스파라긴이 1 또는 복수개 결합된 당쇄를 1종 혹은 2종 이상을 함유하는 혼합물이어도 된다. 그 중에서도 입수 용이성의 관점에서, 환원말단에 아스파라긴이 결합된 당쇄를 1종 혹은 2종 이상 함유하는 혼합물이 적합하다. 또한 본 명세서에서 「당쇄」란 임의의 단당이 2 이상 결합된 것을 말한다.
이와 같은 당쇄 아스파라긴의 혼합물은, 공지된 방법에 의해 바람직하게는 천연 원료, 예를 들어 유즙, 소 유래 휴츄인 또는 알에서 당 단백질 및/또는 당 펩티드의 혼합물을 얻고, 당해 혼합물에 예를 들어 단백질분해효소, 예컨대 프로나아제 (와꼬우 순약사 제조), 액티나아제 E (카켄 제약사 제조) 나, 일반의 카르복시펩티다아제, 아미노펩티다아제 등의 효소를 첨가하여, 공지된 반응조건하에 반응을 실행하여 펩티드 부분을 절단하고, 당해 반응후의 반응액으로 하거나 또는 반응액 으로부터 당쇄 아스파라긴 이외의 성분을 공지된 방법, 예를 들어 겔여과컬럼, 이온교환컬럼 등을 사용한 각종 크로마토그래피나, 고속액체크로마토그래피 (HPLC) 를 사용한 정제법에 따라 제거함으로써 얻을 수 있다. 조제의 용이성의 관점에서, 공지된 난유래의 당 펩티드 [Biochimica et Biophysica Acta 1335 (1997) p23∼32 : 조정제(粗精製) SPG (난황 중의 단백질, 무기염 등을 함유하고, 당 펩티드가 10∼80중량% 정도 함유되는 혼합물)] 를 사용하여 상기 혼합물을 조제하는 것이 바람직하다.
또 원하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄 아스파라긴 유도체를 효율적으로 얻는다는 관점에서, 다시 당해 혼합물에 함유되는 당쇄 아스파라긴을 가수분해하여 일부 당 잔기를 미리 절단해 두는 것이 바람직하다. 또한 당해 절단의 정도는, 적어도 본 명세서에서 말하는 「당쇄」로서의 구조를 유지하는 범위내이면 특별히 한정되지 않는다. 이와 같이 하여 얻어지는 혼합물로서는 예를 들어 도 3 에 나타낸 화합물 24 및/또는 이 화합물에서 1 이상의 당잔기가 결실된 화합물을 함유하는 혼합물을 들 수 있다. 또한 이와 같은 경우, 이 당잔기가 결실된 화합물이, 본 명세서에서 말하는 「당쇄」의 구조를 유지하는 관점에서, 당잔기의 결실은 상한이 9 이다.
예를 들어 도 3 에 나타낸 화합물 25 및 29 는, 화합물 24 를 함유하는 당쇄 아스파라긴의 혼합물 (이하 화합물 24 혼합물이라고 함) 을 이하와 같이 하여 산가수분해함으로써 당해 혼합물 중에 효율적으로 얻어지고, 나아가서는 대응하는 당쇄 아스파라긴 유도체인 도 1 에 나타낸 화합물 2 및 6 을 효율적으로 얻을 수 있다.
예를 들어 화합물 24 혼합물에 대해 0.1 규정 정도의 산수용액을 적량 첨가하고, 예를 들어 4∼100℃ 에서 반응을 실행한다. 이 때, 가수분해반응의 진행을 박층 크로마토그래피 (예를 들어 실리카겔 60F254 (메르크사 제조) 와, 전개용매로서 아세트산에틸:메탄올:물=4:4:3을 사용함) 로 추적하면서, 화합물 25 및 29 가 가장 많이 얻어지는 시점에서 반응을 정지시킨다. 예를 들어 25℃ 의 조건에서는 5∼10 시간 정도로, 100℃ 의 조건에서는 수분 정도에서 반응을 정지시키면 된다. 바람직하게는 70℃ 에서 반응을 실행하고, 반응개시후, 35분에서 반응을 정지시켜 신속하게 빙냉시킨다. 또한 반응은 반응액을 중화함으로써 정지시킬 수 있다. 또 상기 산으로서는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 트리플루오로아세트산 등의 무기산 및 유기산, 양이온교환수지, 불용성 고체시약 등을 사용할 수 있다.
마찬가지로 화합물 24 내지 화합물 33 을 상기 혼합물 중에 효율적으로 얻을 수도 있다. 예를 들어 화합물 24 혼합물에 대해 상기 산수용액을 적량 첨가하고, 바람직하게는 80℃ 에서 반응을 실행하여, 반응개시후, 바람직하게는 60분에서 반응을 정지시킨다.
또 가수분해는 효소적으로 실행할 수도 있다. 이 때에 사용할 수 있는 효소로서는 당 가수분해 효소가 바람직하고, 엔도형, 엑소형의 어느 반응양식의 효소도 사용할 수 있다. 예를 들어 상기와 마찬가지로, 화합물 24 내지 화합물 25 및 29 를 얻는 경우, 시알산을 말단으로부터 절단하는 활성을 갖는 시알산 가수분해 효소를 사용할 수 있다. 이와 같은 효소로서는 특별히 한정되지 않고, 당 해 활성을 갖는 것이면, 시판되는 효소, 새로 단리된 효소, 유전자공학적으로 창제된 효소이어도 된다. 효소반응은 공지된 조건에 따르면 되고, 이 때, 상기와 동일하게 반응의 진행을 박층 크로마토그래피로 추적하여, 화합물 25 및 29 가 가장 많이 얻어지는 시점에서 반응을 적절하게 정지시키면 된다.
이상과 같이 하여 얻어진 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물을 사용하고, 이것에 함유되는 당쇄 아스파라긴에 지용성의 보호기의 도입을 실행한다. 당해 보호기로서는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 Fmoc 기나 t-부틸옥시카르보닐 (Boc) 기, 벤질기, 알릴기, 알릴옥시카보네이트기, 아세틸기 등의, 카보네이트계 또는 아미드계의 보호기 등을 사용할 수 있다. 얻어지는 당쇄 아스파라긴 유도체를 바로 원하는 당 펩티드의 합성에 사용할 수 있다는 관점에서, 당해 보호기로서는 Fmoc 기 또는 Boc 기 등이 바람직하고, Fmoc 기가 보다 바람직하다. Fmoc 기는 시알산 등 비교적 산성조건에 불안정한 당이 당쇄에 존재하는 경우에 특히 유효하다. 또 보호기의 도입은 공지된 방법 (예를 들어 Protecting groups in Organic chemistry, John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301-6 을 참조) 에 따라 실행하면 된다.
예를 들어 Fmoc 기를 사용하는 경우, 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물에 대해 아세톤을 적량 첨가한 후, 추가로 9-플루오레닐메틸-n-숙시니미딜카보네이트와 탄산수소나트륨을 첨가하여 용해하고, 25℃ 에서 아스파라긴 잔기로의 Fmoc 기의 결합반응을 실행함으로써, 당해 당쇄 아스파라긴의 아스파라긴 잔기의 Fmoc 기를 도입할 수 있다.
이상의 조작에 의해 지용성의 보호기가 도입된 당쇄 아스파라긴 유도체의 혼합물이 얻어진다.
이어서 공정 (b) 에서 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물을 공지된 크로마토그래피, 특히 분취형 크로마토그래피를 사용하여 각 당쇄 아스파라긴 유도체로 분리한다. 또한 이와 같은 공정에서는, 상기 공정 (a) 에서 얻어진 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물을 직접 사용할 수 있으나, 원하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄 아스파라긴 유도체를 효율적으로 얻는다는 관점에서, 추가로 당해 혼합물에 함유되는 당쇄 아스파라긴 유도체를 가수분해하여 일부 당잔기를 미리 절단하여 얻어지는 당쇄 아스파라긴 유도체의 혼합물을 사용해도 된다. 또한 당잔기의 절단의 정도는 상기와 동일하다. 또 가수분해는 상기와 동일하게 하여 실행할 수 있다.
예를 들어 화합물 3 및 7 을 얻는 경우, 화합물 2 및 6 의 혼합물로부터 이들을 분리하기 보다도, 당해 혼합물을 갈락토오스 가수분해 효소를 사용하는 가수분해처리함으로써, 얻어진 혼합물로부터 화합물 3 및 7 을 HPLC 로 다시 용이하게 분리할 수 있고, 또한 대량으로 각각의 화합물을 단일 화합물로 하여 대량으로 얻어진다.
각 당쇄 아스파라긴 유도체의 크로마토그래피에 의한 분리는, 적절하게 공지된 크로마토그래피를 단독 또는 복수 조합하여 사용함으로써 실행할 수 있다.
예를 들어 얻어진 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물을 겔여과컬럼크로마토그래피로 정제한 후, HPLC 를 사용하여 정제한다. HPLC 에서 사용할 수 있는 컬럼으로서는 역상계 컬럼이 적합하고, 예를 들어 ODS, Phenyl계, 니트릴계나 음이온교 환계의 컬럼, 구체적으로는 예를 들어 팔마시아사 제조의 모노Q 컬럼, 이야트론사 제조의 아야트로비즈컬럼 등을 이용할 수 있다. 분리조건 등은 적절하게, 공지된 조건을 참조하여 조정하면 된다. 이상의 조작에 의해, 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물로부터 원하는 각 당쇄 아스파라긴 유도체를 얻을 수 있다. 도 7 에 본 발명의 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법에서의 공정의 일례를 모식적으로 나타낸다.
또한 공정 (b) 에서 분리된 당쇄 아스파라긴 유도체를 가수분해함으로써, 원하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄 아스파라긴 유도체를 효율적으로 얻을 수 있다 [공정 (b')]. 예를 들어 당쇄 아스파라긴 유도체를 분리하는 단계에서는 혼합물에 함유되는 당쇄 아스파라긴 유도체의 종류를 제한하여 당쇄 아스파라긴 유도체를 대강 분리하고, 이어서 가수분해, 예를 들어 당 가수분해 효소를 사용하여 가수분해함으로써 원하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄 아스파라긴 유도체를 효율적으로 얻을 수 있다. 또한 가수분해는 상기와 동일하게 하여 실행할 수 있다. 특히 원하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄 아스파라긴 유도체를 보다 효율적으로 얻는 관점에서, 당잔기의 절단양식이 명확한 당 가수분해 효소를 사용하여 가수분해하는 것이 바람직하다.
예를 들어 갈락토오스 잔기의 제거에 의한 화합물 2 와 6 의 화합물 3 과 7 로의 변환 (도 8) 은, 화합물 2 와 6 을 완충액 (예를 들어 인산완충용액, 아세트산완충용액, 굿완충용액 등) 에 녹여, 공지된 조건에 따라 갈락토오스 가수분해 효소를 사용하여 갈락토오스 잔기의 절단반응을 행함으로써 이룰 수 있다. 또한 화합물 2 와 6 은 이들의 혼합물이거나 각각 단리된 것이어도 된다. 이 반응에서 사용하는 갈락토오스 가수분해 효소는 시판되고 있는 공지된 엑소형의 효소를 이용하는 것이 바람직하다. 또 동일한 활성을 갖는 것이면 새로 단리된 효소, 유전자공학적으로 창제된 효소이어도 된다. 이어서 상기와 동일하게 하여, 반응후에 얻어지는 반응액 (당잔기가 절단된 당쇄 아스파라긴 유도체의 혼합물) 을 크로마토그래피를 사용하여 각 당쇄 아스파라긴 유도체를 얻으면 된다. 예를 들어 분리는 HPLC (ODS 컬럼, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄수용액:아세토니트릴=82:15) 로 실행하는 것이 바람직하다.
N-아세틸글루코사민 잔기의 제거에 의한 화합물 3 과 7 의 화합물 4 와 8 로의 변환 (도 8) 은, 화합물 3 과 7 을 완충액 (예를 들어 인산완충용액, 아세트산완충용액, 굿완충용액 등) 에 녹여, 공지된 조건에 따라 N-아세틸글루코사민 가수분해 효소를 사용하여 N-아세틸글루코사민 잔기의 절단반응을 실행함으로써 이룰 수 있다. 또 N-아세틸헥소사미니다아제 가수분해 효소를 사용해도 된다. 또한 화합물 3 과 7 은 이들 혼합물이거나, 각각 단리된 것이어도 된다. 이 반응에서 사용하는 각 효소는 시판되고 있는 엑소형 효소를 이용하는 것이 바람직하다. 또 동일한 활성을 갖는 것이면, 새로 단리된 효소, 유전자공학적으로 창제된 효소이어도 된다. 이어서 상기와 동일하게 하여, 반응후에 얻어지는 반응액 (당잔기가 절단된 당쇄 아스파라긴 유도체의 혼합물) 을 크로마토그래피를 사용하여, 각 당쇄 아스파라긴 유도체를 얻으면 된다. 예를 들어 분리는 HPLC (ODS 컬럼, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄수용액:메탄올=65:35 또는 50mM 아세트산암 모늄수용액:아세토니트릴=82:15) 로 실행하는 것이 바람직하다.
만노오스 잔기의 제거에 의한 화합물 4 와 8 의 화합물 5 와 9 로의 변환 (도 8) 은, 화합물 4 와 8 을 완충액 (예를 들어 인산완충용액, 아세트산완충용액, 굿완충용액 등) 에 녹여, 공지된 조건에 따라 만노오스 가수분해 효소를 사용하여 만노오스 잔기의 절단반응을 실행함으로써 이룰 수 있다. 또한 화합물 4 와 8 은 이들 혼합물이어도 각각 단리된 것이어도 된다. 이 반응에서 사용하는 만노오스 가수분해 효소는 시판되고 있는 엑소형 효소를 이용하는 것이 바람직하다. 또 동일한 활성을 갖는 것이면, 새로 단리된 효소, 유전자공학적으로 창제된 효소이어도 된다. 이어서 상기와 동일하게 하여, 반응후에 얻어지는 반응액 (당잔기가 절단된 당쇄 아스파라긴 유도체의 혼합물) 을 크로마토그래피를 사용하여, 각 당쇄 아스파라긴 유도체를 얻으면 된다. 예를 들어 분리는 HPLC (ODS 컬럼, 전개용매는 10-200mM 정도의 아세트산암모늄 등의 완충용액과 아세토니트릴, 혹은 에탄올, 혹은 메탄올, 혹은 부탄올, 혹은 프로판올 등의 지용성이 있는 수용성 유기용제를 적절하게 혼합하여 사용할 수 있다. 여기에 예시하는 경우, 전개용매로서는 50mM 아세트산암모늄수용액:아세토니트릴=82:18 이 적합함) 로 행하는 것이 바람직하다.
갈락토오스 잔기의 제거에 의한 화합물 10 의 화합물 11 로의 변환 (도 9) 은, 화합물 10 을 완충액 (예를 들어 인산완충용액, 아세트산완충용액, 굿완충용액 등) 에 녹여, 상기와 동일하게 공지된 조건에 따라 갈락토오스 가수분해 효소를 사용하여 갈락토오스 잔기의 절단반응을 실행함으로써 이룰 수 있다. 반응후의 반응액 (당잔기가 절단된 당쇄 아스파라긴 유도체의 혼합물) 으로부터의 당쇄 아스파라긴 유도체의 분리는, 예를 들어 HPLC (ODS 컬럼, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄수용액:아세토니트릴=85:15) 로 실행하는 것이 바람직하다.
또 화합물 11 을 추가로 임의의 당 가수분해 효소를 사용하여 가수분해함으로써 각종 당쇄 아스파라긴 유도체 (예를 들어 화합물 11, 12 및 13 등) 로 변환할 수 있다.
N-아세틸글루코사민 잔기의 제거에 의한 화합물 11 의 화합물 12 로의 변환 (도 9) 은, 화합물 11 을 완충액 (예를 들어 인산완충용액, 아세트산완충용액, 굿완충용액 등) 에 녹여, 상기와 동일하게 공지된 조건에 따라 N-아세틸글루코사민 가수분해 효소 등을 사용하여 N-아세틸글루코사민 잔기의 절단반응을 실행함으로써 이룰 수 있다. 반응후의 반응액 (당잔기가 절단된 당쇄 아스파라긴 유도체의 혼합물) 으로부터의 당쇄 아스파라긴 유도체의 분리는 예를 들어 HPLC (ODS 컬럼, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄수용액:아세토니트릴=85:18) 로 실행하는 것이 바람직하다.
만노오스 잔기의 제거에 의한 화합물 12 의 화합물 13 으로의 변환 (도 9) 은, 화합물 12 를 완충액 (예를 들어 인산완충용액, 아세트산완충용액, 굿완충용액 등) 에 녹여, 상기와 동일하게 공지된 조건에 따라 만노오스 가수분해 효소를 사용하여 만노오스 잔기의 절단반응을 실행함으로써 이룰 수 있다. 반응후의 반응액 (당잔기가 절단된 당쇄 아스파라긴 유도체의 혼합물) 으로부터의 각 당쇄 아스파라긴 유도체의 분리는, 예를 들어 고속액체컬럼크로마토그래피 (ODS 컬럼, 전개 용매는 50mM 아세트산암모늄수용액:아세토니트릴=82:18) 로 실행하는 것이 바람직하다.
화합물 3 과 7 의 화합물 14 와 19 로의 변환 (도 10) 은, 화합물 3 과 7 을 완충액 (예를 들어 인산완충옹액, 아세트산완충용액, 굿완충용액 등) 에 녹여, 공지된 조건에 따라 시알산 가수분해 효소를 사용하여 시알산 잔기의 절단반응을 실행함으로써 이룰 수 있다. 또한 화합물 3 과 7 은 이들의 혼합물이거나 각각 단리된 것이어도 된다. 이 반응에서 사용하는 시알산 가수분해 효소는 시판되고 있는 엑소형 효소를 이용하는 것이 바람직하다. 또 동일한 활성을 갖는 것이면 새로 단리된 효소, 유전자공학적으로 창제된 효소이어도 된다. 이어서 상기와 동일하게 하여, 반응후에 얻어지는 반응액 (당잔기가 절단된 당쇄 아스파라긴 유도체의 혼합물) 을 크로마토그래피를 사용하여, 각 당쇄 아스파라긴 유도체를 얻으면 된다. 예를 들어 분리는 고속액체크로마토그래피 (ODS 컬럼, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄수용액:아세토니트릴=85:15) 로 실행하는 것이 바람직하다.
N-아세틸글루코사민 잔기의 제거에 의한 화합물 14 와 19 의 화합물 15 와 20 으로의 변환 (도 10) 은, 화합물 14 와 19 를 완충액 (예를 들어 인산완충액, 아세트산완충용액, 굿완충용액 등) 에 녹여, 상기와 동일하게 공지된 조건에 따라 N-아세틸글루코사민 가수분해 효소 등을 사용하여 N-아세틸글루코사민 잔기의 절단반응을 실행함으로써 이룰 수 있다. 반응후의 반응액 (당잔기가 절단된 당쇄 아스파라긴 유도체의 혼합물) 으로부터의 각 당쇄 아스파라긴 유도체의 분리는, 예를 들어 고속액체컬럼크로마토그래피 (ODS 컬럼, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=82:18) 로 실행하는 것이 바람직하다.
만노오스 잔기의 제거에 의한 화합물 15 와 20 의 화합물 16 과 21 로의 변환 (도 10) 은, 화합물 15 와 20 을 완충액 (예를 들어 인산완충용액, 아세트산완충용액, 굿완충용액 등) 에 녹여, 상기와 동일하게 공지된 조건에 따라 만노오스 가수분해 효소를 사용하여 만노오스 잔기의 절단반응을 실행함으로써 이룰 수 있다. 반응후의 반응액 (당잔기가 절단된 당쇄 아스파라긴 유도체의 혼합물) 으로부터의 각 당쇄 아스파라긴 유도체의 분리는, 예를 들어 고속액체컬럼크로마토그래피 (ODS 컬럼, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄수용액:아세토니트릴=82:18) 로 실행하는 것이 바람직하다.
갈락토오스 잔기의 제거에 의한 화합물 16 과 21 의 화합물 17 과 22 로의 변환 (도 11) 은, 화합물 16 과 21 을 완충액 (예를 들어 인산완충용액, 아세트산완충용액, 굿완충용액 등) 에 녹여, 상기와 동일하게 공지된 조건에 따라 갈락토오스 가수분해 효소를 사용하여 갈락토오스 잔기의 절단반응을 실행함으로써 이룰 수 있다. 반응후의 반응액 (당잔기가 절단된 당쇄 아스파라긴 유도체의 혼합물) 으로부터의 각 당쇄 아스파라긴 유도체의 분리는, 예를 들어 고속액체컬럼크로마토그래피 (ODS 컬럼, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄수용액:아세토니트릴=85:15) 로 실행하는 것이 바람직하다.
N-아세틸글루코사민 잔기의 제거에 의한 화합물 17 과 22 의 화합물 18 과 23 으로의 변환 (도 11) 은, 화합물 17 과 22 를 완충액 (예를 들어 인산완충용액, 아세트산완충용액, 굿완충용액 등) 에 녹여, 상기와 동일하게 공지된 조건에 따라 N-아세틸글루코사민 가수분해 효소 등을 사용하여 N-아세틸글루코사민 잔기의 절단반응을 실행함으로써 이룰 수 있다. 반응후의 반응액 (당잔기가 절단된 당쇄 아스파라긴 유도체의 혼합물) 으로부터의 각 당쇄 아스파라긴 유도체의 분리는, 예를 들어 고속액체컬럼크로마토그래피 (ODS 컬럼, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄수용액:아세토니트릴=82:18) 로 실행하는 것이 바람직하다.
이와 같이 각 당쇄 아스파라긴 유도체를 얻은 후, 다시 각종 당 가수분해 효소 등을 사용하여 당해 유도체를 가수분해하고, 당쇄의 비환원 말단의 당잔기를 제거함으로써, 예를 들어 당쇄의 말단의 분기구조가 불균일한 각종 당쇄 아스파라긴 유도체를 각각 단일 화합물로서 얻을 수 있다. 또 각종 당 가수분해 효소를 사용하여, 가수분해하는 순서나 그 종류를 변경함으로써 보다 많은 종류의 당쇄 아스파라긴 유도체를 제조할 수 있다.
종래의 방법에 의하면, 국한된 당쇄 구조를 갖는 당쇄 아스파라긴 유도체를 분석 스케일로 얻는데에 조차 막대한 시간과 비용이 필요하였으나, 본 발명에 의하면, 특별한 장치나 시약을 필요로 하지 않고, 관용의 겔여과컬럼, HPLC 컬럼이나, 적어도 3종류의 당 가수분해 효소 (예를 들어 갈락토오스 가수분해 효소, 만노오스 가수분해 효소, N-아세틸글루코사민 가수분해 효소) 등을 사용하여, 2주간 정도로 원하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄 아스파라긴 유도체를 1그램 정도 조제할 수 있다.
이상의 조작에 의해 예를 들어 보호기가 Fmoc 기인 경우,
일반식 :
Figure 112006048558965-PAT00026
(식 중, R1 및 R2 는 H,
Figure 112006048558965-PAT00027
또는
Figure 112006048558965-PAT00028
이고, 동일하거나 달라도 된다. 단,
R1 및 R2 가 모두
Figure 112006048558965-PAT00029
인 경우를 제외함)
을 갖는 당쇄 아스파라긴 유도체를 효율적으로 얻을 수 있다. 이와 같은 당쇄 아스파라긴 유도체로서는, 구체적으로는 예를 들어 도 1 및 도 2 에 나타내는 각 화합물을 들 수 있다. 그 중에서도 화합물 1, 화합물 2∼9, 11∼23, 70 및 71 은 본 발명에서 처음으로 제조된 화합물이다. 본 발명은 당해 화합물을 포함한다.
또 본 발명의 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법의 바람직한 태양으로서, 공정 (a) 가 비환원 말단에 시알산 잔기를 갖는 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물을 사용하고, 이 혼합물에 함유되는 당쇄 아스파라긴에 Fmoc 기를 도입하고, 또한 시알산 잔기에 벤질기를 도입하여 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻는 공정인, 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법을 제공한다. 이와 같은 제조 방법에 의하면 더욱 효율적으로 각종 형태의 당쇄 아스파라긴 유도체를 대량으로 얻을 수 있다. 예를 들어 도 1 에 나타낸 화합물 2 와 6 의 분리효율을 향상시켜, 양 화합물의 제조를 효율적으로 실행할 수 있다. 즉, 화합물 2 와 6 의 혼합물로부터 직접적으로 양 화합물을 명확하게 분리하는 것은 효울적으로 불리하지만, 본 태양에서는 양 화합물의 시알산 잔기에 벤질기를 도입하여, 일단 이하의 화합물 76 과 77 :
Figure 112006048558965-PAT00030
Figure 112006048558965-PAT00031
의 혼합물로서 상기 공정 (b) 에 사용하게 되어, 화합물 76 과 77 의 분리는 비교적 용이하게 실행할 수 있기 때문에 양 화합물을 분리할 수 있고, 이어서 벤질기를 후술하는 방법에 의해 탈리시키면 화합물 2 와 6 의 혼합물로부터 양 화합물을 효율적으로 분리하여 얻을 수 있다.
화합물 2 와 6 의 분리가 약간 곤란한 반면, 이들 시알산 잔기에 벤질기를 도입하여 얻어지는 화합물 76 과 77 의 분리를 용이하게 실행할 수 있는 것은, 시알산 잔기의 카르복실기에 지용성이 높은 벤질기를 도입하여, HPLC (고속액체컬럼크로마토그래피) 의 역상 컬럼과의 소수성 상호작용을 더욱 높인 것에 의한 것으로 생각된다. 따라서 분리공정 (b) 에서 적합하게 사용되는 역상계 컬럼과의 상호작용이 훨씬 향상되고, 그 결과, 보다 예민하게 당쇄 구조의 차를 반영하여 양 화합물이 분리되게 된 것으로 추정된다.
비환원 말단에 시알산 잔기를 갖는 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물로서는 이와 같은 구조를 갖는 당쇄 아스파라긴을 1종 혹은 2종 이상 함유하는 혼합물이면 특별히 한정되지 않는다. 입수용이성의 관점에서, 비환원 말단에 시알산 잔기를 갖고, 환원말단에 아스파라긴이 결합된 당쇄를 1종 혹은 2종 이상 함유하는 혼합물이 적합하다. 당해 혼합물로서는 상기 도 3 에 나타낸 화합물 24 및/또는 이 화합물에서 1 이상의 당잔기가 결실된 화합물을 함유하는 혼합물이 적합하다.
또 원하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄 아스파라긴 유도체를 더욱 효과적으로 얻는 관점에서, 상기 공정 (b') 을 실시하는 것이 바람직하다.
또한 본 태양에서는 당쇄 아스파라긴 유도체는 벤질기와 Fmoc 기가 도입된 것, 및 Fmoc 기만이 도입된 것이 각각 얻어지게 된다.
당쇄 아스파라긴의 시알산 잔기로의 벤질기의 도입은 공지된 방법 (예를 들어 Protecting groups in Organic chemistry, John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301-6 을 참조) 을 따르면 된다.
이상의 조작에 의해 예를 들어 일반식 :
Figure 112006048558965-PAT00032
(식 중, RX 및 RY 는 일방이
Figure 112006048558965-PAT00033
이고,
타방이 H,
Figure 112006048558965-PAT00034
또는
Figure 112006048558965-PAT00035
임)
을 갖는, 벤질기와 Fmoc 기가 도입된 당쇄 아스파라긴 유도체를 효율적으로 얻을 수 있다. 이와 같은 당쇄 아스파라긴 유도체로서는 구체적으로 상기 화합물 76 및 77 이나 이하의 화합물 78 :
Figure 112006048558965-PAT00036
을 들 수 있다. 본 태양에 의해 얻어진 당쇄 아스파라긴 유도체는 당 펩티드의 고상합성에 직접 사용할 수 있다. 이 당쇄 아스파라긴 유도체의 시알산 잔기에 존재하는 카르복실기는 벤질기에 의해 보호되고 있는 점에서, 벤질기를 도입하고 있지 않은 당쇄 아스파라긴 유도체와 비교하여, 당 펩티드의 고상합성에서 는 이 카르복실기가 관여하는 부반응이 발생하지 않고 효율적으로 원하는 당 펩티드를 얻을 수 있다는 이점을 갖는다.
또 본 발명은 각종 단리된 당쇄 아스파라긴을 대량으로 얻을 수 있는 당쇄 아스파라긴의 제조 방법을 제공한다. 당해 방법은, 상기 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법에 따른 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 공정에 계속해, 추가로 얻어진 당쇄 아스파라긴 유도체로부터 보호기를 제거하는 공정을 포함하는 것이다.
즉, 본 발명의 당쇄 아스파라긴의 제조 방법은,
(a) 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물에 함유되는 이 당쇄 아스파라긴에 지용성의 보호기를 도입하여 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻는 공정,
(b) 이 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물 또는 이 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물에 함유되는 당쇄 아스파라긴 유도체를 가수분해하여 얻어지는 혼합물을 크로마토그래피를 사용하여 각 당쇄 아스파라긴 유도체를 분리하는 공정, 및
(c) 공정 (b) 에서 분리된 당쇄 아스파라긴 유도체의 보호기를 제거하여 당쇄 아스파라긴을 얻는 공정,
을 포함하는 것이다.
공정 (a) 및 (b) 는, 상기 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법의 경우와 동일하고, 사용되는 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물 및 지용성의 보호기도 상기와 동일하다.
공정 (c) 에서의 당쇄 아스파라긴 유도체로부터의 보호기의 제거는, 공지된 방법에 따라 실행할 수 있다 (예를 들어 Protecting groups in Organic chemistry, John Willey & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301-6 을 참조). 예를 들어 보호기가 Fmoc 기인 경우, 도 12 에 모식적으로 나타낸 바와 같이 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 중, 당쇄 아스파라긴 유도체에 모르폴린을 첨가하여 반응을 행함으로써 Fmoc 기를 제거할 수 있다. 또 Boc 기는 약산을 반응시킴으로써 제거할 수 있다. 보호기를 제거한 후, 필요에 따라 적절하게 공지된 방법, 예를 들어 겔여과컬럼, 이온교환컬럼 등을 사용하는 각종 크로마토그래피나, HPLC에 의한 분리와 같은 방법에 의해 정제함으로써, 당쇄 아스파라긴을 얻어도 된다.
또 상기 당쇄 아스파라긴 유도체의 제조 방법과 동일하게, 본 발명의 당쇄 아스파라긴의 제조 방법의 바람직한 태양으로서, 공정 (a) 가 비환원 말단에 시알산 잔기를 갖는 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물을 사용하고, 이 혼합물에 함유되는 당쇄 아스파라긴에 Fmoc 기를 도입하고, 또한 시알산 잔기에 벤질기를 도입하여 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻는 공정인, 당쇄 아스파라긴의 제조 방법을 제공한다. 이와 같은 태양에서는 공정 (c) 에서 Fmoc 기의 제거에 추가하여 벤질기를 제거한다. 벤질기의 제거는 공지된 방법에 따라 실행할 수 있다 (예를 들어 Protecting groups in Organic chemistry, John Willey & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-471-62301-6 을 참조).
또한 상기와 동일하게 원하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄 아스파라긴을 효율적으로 얻는 관점에서, 공정 (b) 에서 분리된 당쇄 아스파라긴 유도체를 가수분해하거나, 및/또는 공정 (c) 에서 얻어진 당쇄 아스파라긴을 가수분해하는 것이 바람직하 다. 또한 가수분해는 상기와 동일하게 하여 실행할 수 있다. 원하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄 아스파라긴을 보다 효율적으로 얻는 관점에서, 당 가수분해 효소를 사용하여 가수분해하는 [공정 (b') 및/또는 공정 (c')] 이 보다 바람직하다.
이상의 조작에 의해 예를 들어
일반식 :
Figure 112006048558965-PAT00037
(식 중, R3 및 R4 는 H,
Figure 112006048558965-PAT00038
Figure 112006048558965-PAT00039
또는
Figure 112006048558965-PAT00040
이고,
동일하거나 달라도 된다. 단, R3 및 R4 가 모두
Figure 112006048558965-PAT00041
또는
Figure 112006048558965-PAT00042
인 경우를 제외함)
을 갖는 당쇄 아스파라긴을 효율적으로 얻을 수 있다. 이와 같은 당쇄 아스파라긴으로서는 구체적으로는 예를 들어 도 3 및 도 4 에 나타낸 각 화합물을 들 수 있다. 이 중에서도 화합물 25∼32, 34∼46, 72 및 73 은 본 발명에서 처음으로 제조된 화합물이다. 본 발명은 당해 화합물을 포함한다.
또한 본 발명은, 각종 단리된 당쇄를 대량으로 얻을 수 있는 당쇄의 제조 방법을 제공한다. 당해 방법은, 상기 당쇄 아스파라긴의 제조 방법에 따른 당쇄 아스파라긴의 제조 공정에 계속해서, 또한 얻어진 당쇄 아스파라긴으로부터 아스파라긴 잔기를 제거하는 공정을 포함하는 것이다.
즉, 본 발명의 당쇄의 제조 방법은,
(a) 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물에 함유되는 이 당쇄 아스파라긴에 지용성의 보호기를 도입하여 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻는 공정,
(b) 이 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물 또는 이 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물에 함유되는 당쇄 아스파라긴 유도체를 가수분해하여 얻어지는 혼합물을 크로마토그래피를 사용하여 각 당쇄 아스파라긴 유도체를 분리하는 공정,
(c) 공정 (b) 에서 분리된 당쇄 아스파라긴 유도체의 보호기를 제거하여 당쇄 아스파라긴을 얻는 공정, 및
(d) 공정 (c) 에서 얻어진 당쇄 아스파라긴의 아스파라긴 잔기를 제거하여 당쇄를 얻는 공정,
을 포함하는 것이다.
공정 (a)∼(c) 는, 상기 당쇄 아스파라긴의 제조 방법의 경우와 동일하고, 사용되는 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물 및 지용성의 보호기도 상기와 동일하다.
또 본 발명의 당쇄의 제조 방법에 있어서도, 그 바람직한 태양으로서, 공정 (a) 가, 비환원 말단에 시알산 잔기를 갖는 1종 혹은 2종 이상의 당쇄 아스파라긴을 함유하는 혼합물을 사용하고, 이 혼합물에 함유되는 당쇄 아스파라긴에 Fmoc 기를 도입하고, 또한 시알산 잔기에 벤질기를 도입하여 당쇄 아스파라긴 유도체 혼합물을 얻는 공정인, 당쇄 아스파라긴의 제조 방법을 제공한다. 이와 같은 태양에서는 공정 (c) 에서 Fmoc 기의 제거에 추가하여, 벤질기를 제거한다. 벤질기 의 제거는 상기 방법에 따라 실행할 수 있다.
공정 (d) 에서의 당쇄 아스파라긴으로부터의 아스파라긴 잔기의 제거는, 공지된 방법에 따라 실행할 수 있다. 예를 들어 도 12 에 모식적으로 나타낸 바와 같이 당쇄 아스파라긴을 무수 히드라진과 반응시킨 후, 아세틸화함으로써 아스파라긴 잔기를 제거하여 당쇄를 얻을 수 있다. 또 당쇄 아스파라긴을 염기성 수용액으로 가열환류한 후, 아세틸화함으로써도 아스파라긴 잔기를 제거하여 당쇄를 얻을 수 있다. 아스파라긴 잔기 제거후, 원하는 대로 적절하게 공지된 방법, 예를 들어 겔여과컬럼, 이온교환컬럼 등을 사용하는 각종 크로마토그래피나 HPLC 에 의한 분리와 같은 방법에 의해 정제해도 된다.
또한 상기와 동일하게 원하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄를 효율적으로 얻는 관점에서, 공정 (b) 에서 분리된 당쇄 아스파라긴 유도체를 가수분해하거나, 및/또는 공정 (c) 에서 얻어진 당쇄 아스파라긴을 가수분해하거나, 및/또는 공정 (d) 에서 얻어진 당쇄를 가수분해하는 것이 바람직하다. 또한 가수분해는 상기와 동일하게 하여 실행할 수 있다. 원하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄를 보다 효율적으로 얻는 관점에서, 당 가수분해 효소를 사용하여 가수분해하는 [공정 (b') 및/또는 공정 (c') 및/또는 공정 (d')] 가 보다 바람직하다.
이상의 조작에 의해 예를 들어
일반식 :
Figure 112006048558965-PAT00043
(식 중, R5 및 R6 은, H,
Figure 112006048558965-PAT00044
Figure 112006048558965-PAT00045
또는
Figure 112006048558965-PAT00046
이고,
동일하거나 달라도 된다. 단, R5 및 R6 이 모두
Figure 112006048558965-PAT00047
또는
Figure 112006048558965-PAT00048
이거나, 혹은 R5 또는 R6 의 일방이 H 이고,
또한 타방이
Figure 112006048558965-PAT00049
인 경우를 제외함)
을 갖는 당쇄를 효율적으로 얻을 수 있다. 이와 같은 당쇄로서는 구체적으로는 예를 들어 도 5 및 도 6 에 나타내는 각 화합물을 들 수 있다. 이 중에서도 화합물 48∼55, 57∼69, 74 및 75 는 본 발명에서 처음으로 제조된 화합물이 다. 본 발명은 당해 화합물을 포함한다.
이와 같이 본 발명에 의하면 원하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄 아스파라긴 유도체, 당쇄 아스파라긴 및 당쇄 (이하 3개 모두 당쇄류라고 하는 경우가 있음) 를 저가이고 효율적으로 대량으로 제조할 수 있다.
이와 같은 당쇄류는 의약품 개발 등의 분야에서 매우 유용하다. 예를 들어 의약품 개발에서의 응용예로서는 예를 들어 암의 왁친 합성을 들 수 있다. 세포가 암화되면 체내에는 없었던 당류가 발현되는 것이 알려져 있다. 또 당해 당쇄를 화학적으로 합성하고, 왁친으로서 개체에 투여하면, 암의 증식이 억제되는 것도 알려져 있다. 따라서 본 발명에 의해 원하는 당쇄류를 제조할 수 있으면, 암의 치료에 유효한 왁친의 합성을 실행할 수 있다. 또 본 발명에 의해 얻어지는 당쇄류를, 다시 화학적인 반응 및 당전이효소에 의한 반응 등을 조합하여 새로운 당잔기를 결합시켜 유도체화하고, 신규 왁친의 합성을 행할 수도 있다.
또 예를 들어 당 단백질인 에리스로포에틴 (EPO) 가, 그 적혈구 증식능에 의해 빈혈의 치료약으로서 사용되고 있으나, 이 EPO 는 당쇄가 결합되어 있지 않은 활성이 나오지 않는 것이 판명되고 있다. 이와 같이 단백질에는 당쇄의 결합에 의해 생리활성을 발현하는 것이 있으므로, 예를 들어 당쇄를 결합시킬 수 없는 대장균 발현계에 의해 단밸질만을 대량으로 조제하고, 이어서 원하는 당쇄 구조를 갖는, 본 발명에 의해 제조한 당쇄를 도입함으로써 생리활성의 발현을 부여하거나, 또 임의의 단밸질에 각종 당쇄 구조를 갖는, 본 발명에 의해 제조한 당쇄를 도입함으로써, 새로운 생리활성을 갖는 신규 당 단백질을 합성할 수도 있다.
또 천연 당 단백질에 존재하는 당쇄를 본 발명에 의해 제조한 당쇄와 치환함으로써 새로운 생리활성을 부여할 수도 있다. 당 단백질이 갖는 당쇄를 본 발명에 의해 얻어진 당쇄와 치환하는 기술로서는, 예를 들어 P.Sears and C.H. Wong, Science, 2001, vol291, p2344∼2350 에 기재된 방법을 들 수 있다. 즉, 당 단백질을 β-N-아세틸글루코사미니다아제 (Endo-H) 로 처리하여 단백질 표면의 아스파라긴 잔기에는 N-아세틸글루코사민 잔기가 1개만 결합된 상태로 한다. 이어서 본 발명에 의해 얻어진 당쇄 아스파라긴 (예를 들어 도 3 및 도 4 의 각 화합물) 중의 원하는 당쇄를 β-N-아세틸글루코사미니다아제 (Endo-M) 를 사용하여, 상기 N-아세틸글루코사민 잔기에 결합시킨다는 방법을 들 수 있다. 또 tRNA 에 N-아세틸글루코사민을 결합시켜 두고, 대장균 등의 발현계를 이용하여 N-아세틸글루코사민 잔기를 갖는 당 단백질을 합성한 후, 본 발명에 의해 얻어진 당쇄 아스파라긴 중의 원하는 당쇄를 Endo-M 을 사용하여 도입할 수도 있다.
또 현재 당 단백질을 치료약으로 이용할 때의 문제로서, 투여된 당 단백질의 대사속도가 빠른 것을 들 수 있다. 이것은 당 단백질의 당쇄말단에 존재하는 시알산이 생체내에서 제거되면 바로 당해 당 단백질이 간장에 의해 대사되는 것에 의한다. 이 때문에 어느 정도의 양의 당 단백질을 투여할 필요가 있다. 따라서 본 발명에 의해 당쇄의 말단에 제거되기 어려운 시알산을 새로 삽입한 당쇄를 제조하고, 대상 단백질에 당해 당쇄를 Endo-M 을 이용하여 도입하면, 생체내에서의 당 단백질의 대사속도를 억제할 수 있게 되어, 투여하는 당 단백질의 양을 낮게 할 수도 있다.
이하 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이와 같은 실시예에 한정되는 것은 아니다. 각 화합물의 구조식 및 번호를 도 1∼도 6 에 나타낸다. 또한 1H-NMR 의 데이터는 실시예 1∼7 에 대해서는 30℃ 에서 HOD 를 4.8ppm 으로 하여, 실시예 8∼45 에 대해서는 30℃ 에서 내부표준으로서 아세톤의 메틸기의 시그널을 2.225ppm, HOD 를 4.718ppm 으로 하여 측정하여 얻어진 값이다. 또 Fmoc 기가 제거된 화합물에 대해서는 측정용매 중에 50mM 의 탄산수소암모늄을 공존시켜 측정하였다.
<실시예>
실시예 1 화합물 24 의 합성
난유래 조정제 SGP (시알릴글리코펩티드) 2.6g을 트리스-염산ㆍ염화칼슘 완충용액 (TRIZMA BASE 0.05㏖/ℓ, 염화칼슘 0.01㏖/ℓ, pH7.5) 100㎖ 에 용해시켰다. 이것에 아지화나트륨 58㎎ (772μ㏖) 과 아크티나아제 E (카겐 제약사 제조) 526㎎ 을 첨가하고, 37℃ 에서 정치하였다. 65 시간 후, 다시 악티나아제-E 를 263㎎ 첨가하고, 다시 37℃ 에서 24 시간 정치하였다. 이 용액을 동결건조시킨 후, 잔류물을 겔여과컬럼크로마토그래피 (Sephadex G-25, 2.5Φ×1m, 전개용매는 물, 유속은 1.0㎖/min) 로 2회 정제하여, 목적의 도 3 에 나타낸 화합물 24 를 1.3g (555μ㏖) 얻었다. SGP 에 함유되는 당쇄의 구조를 이하에 나타낸다.
Figure 112006048558965-PAT00050
또 얻어지는 화합물 24 의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00051
실시예 2 화합물 1, 2, 6 및 10 의 합성
실시예 1 에서 얻어진 화합물 24 (609㎎, 261μ㏖) 를 물 20.7㎖ 에 용해시키고, 다시 0.1 규정 염산 13.8㎖ 를 첨가하였다. 이 용액을 70℃ 에서 35분간 가열한 후 신속하게 빙냉시키고, 포화탄산수소나트륨 수용액을 첨가하여 pH7로 하였다. 이것을 동결건조시킨 후, 잔류물을 겔여과컬럼크로마토그래피 (Sephadex G-25, 2.5Φ×1m, 전개용매는 물, 유속은 1.0㎖/min) 로 정제한 결과, 도 3 에 나타낸 화합물 24, 화합물 25 및 29, 화합물 33 의 혼합물 534㎎ 을 얻었다. 이 4성분은 각각을 단리하지 않고 다음 공정으로 진행하였다.
또한 얻어진 당쇄혼합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00052
얻어진 당쇄의 혼합물 429㎎ 을 아세톤 16.3㎖ 와 물 11.2㎖ 에 용해시켰다. 여기에 9-플루오레닐메틸-N-숙시니미딜카보네이트 (155.7㎎, 461.7μ㏖) 와 탄산수소나트륨 (80.4㎎, 957μ㏖) 을 첨가하고, 실온에서 2시간 교반하였다. 이 용액을 이배포레이터를 사용하여 아세톤을 제거하고, 남은 용액을 겔여과컬럼크로마토그래피 (Sephadex G-25, 2.5Φ×1m, 전개용매는 물, 유속은 1.0㎖/min) 로 정제한 결과, 도 1 에 나타내는 화합물 1, 화합물 2 및 6, 화합물 10 의 혼합물 309㎎ 이 얻어졌다. 이 혼합물을 HPLC (ODS 컬럼, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄수용액:메탄올=65:35, 2.0Φ×25㎝, 유속 3㎖/min) 를 사용하여 정제한 결과, 51분후에 화합물 1 이, 67분후에 화합물 2 및 6 의 혼합물이, 93분후에 화합물 10 이 용출되었다. 각각을 분리해 동결건조시킨 후, 겔여과컬럼크로마토그래피 (Sephadex G-25, 2.5Φ×30㎝, 전개용매는 물, 유속은 1.0㎖/min) 로 탈염함으로써 목적의 화합물 2 및 6 의 혼합물 150㎎ 을 얻었다.
또한 얻어진 화합물 1 의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00053
또 얻어진 화합물 2 및 6 의 혼합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00054
또 얻어진 화합물 10 의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00055
실시예 3 화합물 3 및 7 의 합성
실시예 2 에서 얻어진 화합물 2 및 6 의 혼합물 (224㎎, 97μ㏖) 과 소 혈청 알부민 24㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH6.0) 22㎖ 에 용해시키고, 다시 Diplococcus pneumoniae 유래 β-갈락토시다아제 (1.35U) 를 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 15시간 정치한 후 동결건조시켰다. 잔류물을 HPLC (ODS 컬럼, 2.0Φ×25㎝, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=85:15, 유속 3㎖/min) 로 정제한 결과, 129분후에 도 2 에 나타낸 화합물 3 이, 134분후에 화합물 7 이 용출되었다. 각각을 분리하여 동결건조시켰다. 이어서 HPLC (ODS 컬럼, 2.0Φ×25㎝, 전개용매는 최초의 15분간이 물, 16분후부터 30분후까지는 물:아세토니트릴 (용량비)=10:0 에서 85:15, 31분후부터 45분후까지는 물:아세토니트릴=85:15 에서 80:20 이 되도록 그라디엔트를 만들었다. 유속은 3.0㎖/min) 을 사용하여 탈염처리를 실행한 결과, 목적으로 하는 화합물 3 이 81㎎, 화합물 7 이 75㎎ 얻어졌다.
또한 얻어진 화합물 3 의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00056
또 얻어진 화합물 7 의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00057
실시예 4 화합물 4 및 8 의 합성
실시예 3 에서 얻어진 화합물 3 및 7 의 혼합물 (90㎎, 47.3μ㏖) 을 각각 분리하지 않고, 소 혈청 알부민 8㎎ 과 함께 HEPES 완충용액 (50mM, pH6.0) 8.1㎖ 에 용해시키고, 다시 Bovine kidney 유래 β-글루코사미니다아제 (시그마알도리치사 제조, from Bovine kidney) 를 2.88U 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 18시간 정치한 후 동결건조시켜, 잔류물을 HPLC (ODS 컬럼, 2.0Φ×25㎝, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:메탄올=65:35, 유속 3㎖/min) 로 정제한 결과, 117분 후에 도 2 에 나타낸 화합물 4 가, 127분후에 화합물 8 이 용출되었다. 각각을 분리하여 동결건조시켰다. 이어서 HPLC (ODS 컬럼, 2.0Φ×25㎝, 전개용매는 최초의 15분간이 물, 16분후부터 30분후까지는 물:아세토니트릴=10:0 에서 85:15, 31분후부터 45분후까지는 물:아세토니트릴=85:15 에서 80:20 이 되도록 그라디엔트를 만들었다. 유속은 3.0㎖/min) 을 사용하여 탈염처리를 실행한 결과, 목적으로 하는 화합물 4 가 40㎎, 화합물 8 이 37㎎ 얻어졌다.
또한 얻어진 화합물 4 의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00058
또 얻어진 화합물 8 의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00059
실시예 5 화합물 5 의 합성
실시예 4 에서 얻어진 화합물 4 (30㎎, 473μ㏖) 과 소 혈청 알부민 3㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH6.0) 6㎖ 에 용해시키고, 다시 Jack Beans 유래 α-만노시다아제를 10U 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 21시간 정치한 후 동결건조시켜, 계속해서 HPLC (ODS 컬럼, 2.0Φ×25㎝, 전개용매는 최초의 15분간이 물, 16분후부터 30분후까지는 물:아세토니트릴=10:0 에서 85:15, 31분후부터 45분후까지는 물:아세토니트릴=85:15 에서 80:20 이 되도록 그라디엔트를 만들었다. 유속은 3.0㎖/min) 을 사용하여 정제한 결과, 목적으로 하는 도 1 에 나타내는 화합물 5 가 20㎎ 얻어졌다.
또한 얻어진 화합물 5 의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00060
실시예 6 화합물 9 의 합성
실시예 4 에서 얻어진 화합물 8 (40㎎, 630μ㏖) 과 소 혈청 알부민 5㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH6.0) 7.8㎖ 에 용해시키고, Jack Beans 유래 α-만노시다아제를 38U 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 63시간 정치한 후 동결건조시켜, 계속해서 HPLC (ODS 컬럼, 2.0Φ×25㎝, 전개용매는 최초의 15분간이 물, 16분후부터 30분후까지는 물:아세토니트릴=10:0 에서 85:15, 31분후부터 45분후까지는 85:15 에서 80:20 이 되도록 그라디엔트를 만들었다. 유속은 3.0㎖/min) 을 사용하여 정제한 결과, 목적으로 하는 화합물 9 가 30㎎ 얻어졌다.
또한 얻어진 화합물 9 의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00061
실시예 7 Fmoc 기의 탈보호 (화합물 33 의 합성)
실시예 2 에서 얻어진 화합물 10 (10.5㎎, 5.27μ㏖) 을 50% 모르폴린/N,N-디메틸포름아미드용액 1.4㎖에 용해시키고, 실온ㆍ아르곤 분위기하에서 2시간 반응시켰다. 이 용액에 톨루엔 3㎖ 를 첨가하고, 35℃ 에서 이배포레이터에 사용하였다. 이 조작을 3회 반복하여 반응용매를 제거하였다. 잔류물을 겔여과컬럼크로마토그래피 (Sephadex G-25, 2.5Φ×30㎝, 전개용매는 물, 유속은 1.0㎖/min) 로 정제한 결과, 목적으로 하는 도 3 에 나타내는 화합물 33 이 7㎎ 얻어졌다 (수율은 76%). 또한 얻어진 화합물의 구조는 실시예 2 에서 얻어지는 화합물 33 과 1H-NMR 스펙트럼이 일치한 것으로부터 확인하였다.
화합물 33 의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00062
실시예 8 화합물 14 의 합성
화합물 3 (28㎎, 21.3μ㏖) 과 소 혈청 알부민 1.0㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH5.0, 454㎕) 에 용해시켜, 노이라미니다아제 (시그마알도리치사 제조, from Viblio Cholerae, 198mU) 를 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 20시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 HPLC (YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4㎖/min) 로 정제하였다. 또한 ODS 컬럼 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 처음에 H2O 를 50㎖ 넣고, 다음에 25% 아세토니트릴을 넣어 용출시켰음) 으로 탈염한 결과, 목적하는 화합물 14 (17㎎, 수율 70%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00063
실시예 9 화합물 19 의 합성
화합물 7 (20㎎, 9.4μ㏖) 과 소 혈청 알부민 1.6㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH5.0, 323㎕) 에 용해시켜, 노이라미니다아제 (시그마알도리치사 제조, from Viblio Cholerae, 141mU) 를 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 18시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 이어서 HPLC (YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4㎖/min) 로 정제하였다. 또한 ODS 컬럼 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 처음에 H2O 를 50㎖ 넣고, 다음에 25% 아세토니트릴을 넣어 용출시켰음) 으로 탈염한 결과, 목적하는 화합물 19 (13㎎, 수율 76%) 을 얻었다. 얻어진 화합물의 구조는 1H-NMR 이 표품과 일치한 것으로부터 확인하였다.
실시예 10 화합물 15 의 합성
화합물 4 (45㎎, 24μ㏖) 과 소 혈청 알부민 1.7㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH5.0, 820㎕) 에 용해시켜, 노이라미니다아제 (시그마알도리치사 제조, from Viblio Cholerae, 134mU) 를 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 14시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 이어서 HPLC (YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4㎖/min) 로 정제하였다. 또한 ODS 컬럼 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 최초에 H2O 를 50㎖ 넣고, 다음에 25% 아세토니트릴을 넣어 용출시켰음) 으로 탈염한 결과, 목적하는 화합물 15 (28㎎, 수율 74%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00064
실시예 11 화합물 70 의 합성
화합물 15 (11㎎, 6.8μ㏖) 과 소 혈청 알부민 1.5㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH5.0, 269㎕) 에 용해시켜, β-갈락토시다아제 (세이가가꾸고교샤 제조, from Jack Beans, 11㎕, 275mU) 를 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 14시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 HPLC (YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4㎖/min) 로 정제하였다. 또한 ODS 컬럼 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 최초에 H2O 를 50㎖ 넣고, 다음에 25% 아세토니트릴을 넣어 용출시켰음) 으로 탈염한 결과, 목적하는 화합물 70 (6.3㎎, 수율 64%) 을 얻었다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00065
실시예 12 화합물 20 의 합성
화합물 8 (47㎎, 25μ㏖) 과 소 혈청 알부민 1.9㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH5.0, 840㎕) 에 용해시켜, 노이라미니다아제 (시그마알도리치사 제조, from Viblio Cholerae, 369mU) 를 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 37시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 동결건조시키고, 이어서 HPLC (YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4㎖/min) 로 정제하였다. 또한 ODS 컬럼 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 최초에 H2O 를 50㎖ 넣고, 다음에 25% 아세토니트릴을 넣어 용출시켰음) 으로 탈염한 결과, 목적하는 화합물 20 (26㎎, 수율 65%) 을 얻었다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00066
실시예 13 화합물 71 의 합성
화합물 20 (12㎎, 7.4μ㏖) 과 소 혈청 알부민 1.0㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH5.0, 330㎕) 에 용해시켜, β-갈락토시다아제 (세이가가꾸고교샤 제조, from Jack Beans, 12㎕, 297mU) 를 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 46시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 이어서 HPLC (YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4㎖/min) 로 정제하였다. 또한 ODS 컬럼 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 최초에 H2O 를 50㎖ 넣고, 다음에 25% 아세토니트릴을 넣어 용출시켰음) 으로 탈염한 결과, 목적하는 화합물 71 (6.6㎎, 수율 61%) 을 얻었다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00067
실시예 14 화합물 16 의 합성
화합물 5 (32㎎, 18.4μ㏖) 과 소 혈청 알부민 2.5㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH5.0, 713㎕) 에 용해시켜, 노이라미니다아제 (시그마알도리치사 제조, from Viblio Cholerae, 134mU) 를 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 17시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 이어서 반응용액을 HPLC (YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4㎖/min) 로 정제하였다. 또한 ODS 컬럼 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 최초에 H2O 를 50㎖ 넣고, 다음에 25% 아세토니트릴을 넣어 용출시켰음) 으로 탈염한 결과, 목적하는 화합물 16 (13㎎, 수율 52%) 을 얻었다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00068
실시예 15 화합물 17 의 합성
화합물 16 (9㎎, 6.2μ㏖) 과 소 혈청 알부민 1.6㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH5.0, 613㎕) 에 용해시켜, β-갈락토시다아제 (세이가가꾸고교샤 제조, from Jack Beans, 186mU) 를 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 32시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 HPLC (YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4㎖/min) 로 정제하였다. 또한 ODS 컬럼 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 최초에 H2O 를 50㎖ 넣고, 다음에 25% 아세토니트릴을 넣어 용출시켰음) 으로 탈염한 결과, 목적하는 화합물 17 (5.4㎎, 수율 68%) 을 얻었다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00069
실시예 16 화합물 18 의 합성
화합물 17 (3.4㎎, 2.6μ㏖) 과 소 혈청 알부민 1.1㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH5.0, 257㎕) 에 용해시켜, N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제 (시그마알도리치사 제조, from Jack Beans, 144mU) 를 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 24시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 HPLC (YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4㎖/min) 로 정제하였다. 또한 ODS 컬럼 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 최초에 H2O 를 50㎖ 넣고, 다음에 25% 아세토니트릴을 넣어 용출시켰음) 으로 탈염한 결과, 목적하는 화합물 18 (2.1㎎, 수율 75%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00070
실시예 17 화합물 21 의 합성
화합물 9 (28㎎, 16μ㏖) 과 소 혈청 알부민 1.7㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH5.0, 624㎕) 에 용해시켜, 노이라미니다아제 (시그마알도리치사 제조, from Viblio Cholerae, 117mU) 를 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 17시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 이어서 반응용액을 HPLC (YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4㎖/min) 로 정제하였다. 또한 ODS 컬럼 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 최초에 H2O 를 50㎖ 넣고, 다음에 25% 아세토니트릴을 넣어 용출시켰음) 으로 탈염한 결과, 목적하는 화합물 21 (14.6㎎, 수율 68%) 을 얻었다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00071
실시예 18 화합물 22 의 합성
화합물 21 (10㎎, 6.9μ㏖) 과 소 혈청 알부민 1.6㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH5.0, 672㎕) 에 용해시켜, β-갈락토시다아제 (세이가가꾸고교샤 제조, from Jack Beans, 205mU) 를 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 20시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 HPLC (YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4㎖/min) 로 정제하였다. 또한 ODS 컬럼 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 최초에 H2O 를 50㎖ 넣고, 다음에 25% 아세토니트릴을 넣어 용출시켰음) 으로 탈염한 결과, 목적하는 화합물 22 (5.6㎎, 수율 64%) 을 얻었다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00072
화합물 19 화합물 23 의 합성
화합물 22 (3.6㎎, 2.8μ㏖) 과 소 혈청 알부민 1.2㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH5.0, 277㎕) 에 용해시켜, N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제 (시그마알도리치사 제조, from Jack Beans, 195mU) 를 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 24시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 HPLC (YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4㎖/min) 로 정제하였다. 또한 ODS 컬럼 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 최초에 H2O 를 50㎖ 넣고, 다음에 25% 아세토니트릴을 넣어 용출시켰음) 으로 탈염한 결과, 목적하는 화합물 23 (2.3㎎, 수율 77%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00073
실시예 20 화합물 11 의 합성
화합물 10 (123㎎, 62μ㏖) 과 소 혈청 알부민 (1.1㎎) 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH5.0, 2.5㎖) 에 용해시켜, β-갈락토시다아제 (세이가가꾸고교샤 제조, from Jack Beans, 24㎕, 612mU) 를 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 61시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 동결건조시키고, 이어서 HPLC (YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 3.5㎖/min) 로 정제하였다. 또한 ODS 컬럼 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 최초에 H2O 를 50㎖ 넣고, 다음에 25% 아세토니트릴을 넣어 용출시켰음) 으로 탈염한 결과, 목적하는 화합물 11 (71㎎, 수율 70%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00074
실시예 21 화합물 12 의 합성
화합물 11 (50㎎, 30μ㏖) 과 소 혈청 알부민 2.0㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH5.0, 920㎕) 에 용해시켜, N-아세틸-β-D-글루코사미니다아제 (시그마알도리치사 제조, from Jack Beans, 2.1U) 를 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 48시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 반응용액을 HPLC (YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4㎖/min) 로 정제하고, 동결건조시켰다. 이 잔류물을 ODS 컬럼 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 최초에 H2O 를 50㎖ 넣고, 다음에 25% 아세토니트릴을 넣어 용출시켰음) 으로 탈염한 결과, 목적하는 화합물 12 (25㎎, 수율 66%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00075
실시예 22 화합물 13 의 합성
화합물 12 (10㎎, 11μ㏖) 과 소 혈청 알부민 0.9㎎ 을 HEPES 완충용액 (50mM, pH5.0, 440㎕) 에 용해시켜, α-만노시다아제 (시그마알도리치사 제조, from Jack Beans, 30㎕, 3.2U) 를 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 에서 21시간 정치한 후, HPLC 분석에 의해 반응종료를 확인하였다. 이어서 HPLC (YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=80:20, 유속 4㎖/min) 로 정제하였다. 또한 ODS 컬럼 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 최초에 H2O 를 50㎖ 넣고, 다음에 25% 아세토니트릴을 넣어 용출시켰음) 으로 탈염한 결과, 목적하는 화합물 13 (3㎎, 수율 43%) 을 얻었다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00076
(당쇄 아스파라긴 유도체의 Fmoc 기의 탈보호)
이하 모든 당쇄 아스파라긴 유도체에 있어서, 이하의 수순으로 Fmoc 기의 탈보호를 실행하였다. 먼저 당쇄 아스파라긴 Fmoc체 1μ㏖ 당 240㎕ 의 N,N-디메틸포름아미드, 160㎕ 의 모르폴린을 첨가하여, 실온ㆍ아르곤 분위기하에서 반응시켰다. TLC (전게용매로서 1M 아세트산암모늄:이소프로판올=8:5 를 사용하였음) 로 반응종료를 확인한 후, 빙수로 냉각시켰다. 여기에 디에틸에테르를 반응용액의 10배량 첨가하여 15분간 교반한 후, 석출된 침전물을 여과분리하였다. 얻어진 잔사를 물에 용해시키고 35℃ 에서 증발시켰다. 다시 톨루엔을 3㎖ 첨가하여 증발시키는 조작을 3회 반복하였다. 잔류물을 역상 컬럼 크로마토그래피 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 전개용매는 물) 에 의해 정제하였다.
실시예 23 화합물 33 의 합성
화합물 10 (10.5㎎, 5.3μ㏖) 을 상기 조작으로 7시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 33 (7㎎, 수율 76%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물은 1H-NMR 이 표품과 일치한 것으로부터 확인하였다.
실시예 24 화합물 26 의 합성
화합물 3 (8.0㎎, 3.8μ㏖) 을 상기 조작으로 21시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 26 (6.3㎎, 수율 88%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00077
실시예 25 화합물 27 의 합성
화합물 4 (11.0㎎, 5.8μ㏖) 을 상기 조작으로 23시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 27 (8.5㎎, 수율 88%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00078
실시예 26 화합물 28 의 합성
화합물 5 (7.0㎎, 4.0μ㏖) 을 상기 조작으로 21시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 28 (5.3㎎, 수율 87%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00079
실시예 27 화합물 30 의 합성
화합물 7 (13.9㎎, 6.6μ㏖) 을 상기 조작으로 7시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 30 (8.0㎎, 수율 64%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00080
실시예 28 화합물 31 의 합성
화합물 8 (8.0㎎, 4.2μ㏖) 을 상기 조작으로 12시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 31 (6.0㎎, 수율 86%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00081
실시예 29 화합물 32 의 합성
화합물 9 (7.7㎎, 4.4μ㏖) 을 상기 조작으로 23시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 32 (5.2㎎, 수율 78%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터 는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00082
실시예 30 화합물 37 의 합성
화합물 14 (9.1㎎, 5.0μ㏖) 을 상기 조작으로 13시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 37 (6.5㎎, 수율 77%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00083
실시예 31 화합물 42 의 합성
화합물 19 (9.8㎎, 5.4μ㏖) 을 상기 조작으로 13시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 42 (8.0㎎, 수율 88%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00084
실시예 32 화합물 38 의 합성
화합물 15 (5.1㎎, 3.2μ㏖) 을 상기 조작으로 11시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 38 (4.0㎎, 수율 91%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00085
실시예 33 화합물 72 의 합성
화합물 70 (4.0㎎, 2.8μ㏖) 을 상기 조작으로 13시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 72 (2.9㎎, 수율 85%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00086
실시예 34 화합물 43 의 합성
화합물 20 (5.4㎎, 3.3μ㏖) 을 상기 조작으로 11시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 43 (4.1㎎, 수율 87%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00087
실시예 35 화합물 73 의 합성
화합물 71 (4.0㎎, 2.8μ㏖) 을 상기 조작으로 13시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 73 (2.9㎎, 수율 85%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00088
실시예 36 화합물 39 의 합성
화합물 16 (2.2㎎, 1.5μ㏖) 을 상기 조작으로 7시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 39 (1.6㎎, 수율 84%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00089
실시예 37 화합물 40 의 합성
화합물 17 (1.5㎎, 1.2μ㏖) 을 상기 조작으로 14시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 40 (1.1㎎, 수율 89%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00090
실시예 38 화합물 41 의 합성
화합물 18 (1.3㎎, 1.2μ㏖) 을 상기 조작으로 14시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 41 (0.8㎎, 수율 80%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00091
실시예 39 화합물 44 의 합성
화합물 21 (2.3㎎, 1.6μ㏖) 을 상기 조작으로 7시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 44 (1.6㎎, 수율 84%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00092
실시예 40 화합물 45 의 합성
화합물 22 (1.6㎎, 1.3μ㏖) 을 상기 조작으로 14시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 45 (1.1㎎, 수율 85%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00093
실시예 41 화합물 46 의 합성
화합물 23 (1.6㎎, 1.5μ㏖) 을 상기 조작으로 14시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 46 (1.1㎎, 6.4μ㏖, 수율 85%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00094
실시예 42 화합물 34 의 합성
화합물 11 (12.4㎎, 7.5μ㏖) 을 상기 조작으로 11시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 34 (9.2㎎, 수율 86%) 가 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00095
실시예 43 화합물 35 의 합성
화합물 12 (12.0㎎, 8.4μ㏖) 을 상기 조작으로 11시간 반응시킨 결과, 목적하는 화합물 35 (7.0㎎, 수율 81%) 이 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00096
실시예 44 화합물 76, 77 의 합성 및 단리
화합물 2, 6 (5.0㎎, 2.2μ㏖) 을 220㎕ 의 물에 용해시키고, 22mM 의 탄산세슘 수용액을 100㎕ 첨가하고, pH7.0 으로 하였다. 이 용액을 동결건조시켰다. 건조후의 고형물에 N,N-디메틸포름아미드를 430㎕ 첨가하고, 다시 6.6μ㏖ 의 벤질브로마이드/N,N-디메틸포름아미드 용액을 20㎕ 첨가하였다. 이 용액을 아르곤 분위기하에서 교반하였다. 48시간 후, TLC (전개용매는 1M H4OAc:이소프로판올=2:1 을 사용하였음) 로 원료의 소실을 확인한 후, 4.4㎖ 의 디에틸에테르를 첨가하여 화합물을 침전시켰다. 침전한 당쇄를 여과하고, 남은 당쇄를 물에 용해시켜 동결건조시켰다. 동결건조 후의 잔류물을 분취 HPLC (YMC Packed Column D-ODS-5 S-5 120A ODS No.2020178, 20×250㎜, 전개용매는 50mM 아세트산암모늄 수용액:아세토니트릴=78:22, 유속 4.0㎖/min) 로 정제한 결과, 88분후에 화합물 77이, 91분 후에 화합물 76이 용출되었다. 각각을 분리하여 다시 ODS 컬럼 (코스모실 75C18-OPN, 15×100㎜, 최초에 H2O 를 50㎖ 넣고, 다음에 25% 아세토니트릴을 넣어 용출시켰음) 으로 탈염한 결과, 목적하는 화합물 76 이 1.6㎎, 화합물 77 이 1.8㎎ 얻어졌다. 얻어진 화합물의 물리적 데이터는 이하와 같다.
화합물 76 의 데이터
Figure 112006048558965-PAT00097
화합물 77 의 데이터
Figure 112006048558965-PAT00098
실시예 45 화합물 78 의 합성
4℃로 차갑게 한 Dowex-50Wx8(H+) 의 컬럼 (Φ0.5㎝×5㎝) 에 화합물 1 (20 ㎎) 의 냉수용액을 넣고, 용출된 수용액을 동결건조시켰다. 얻어진 동결건조물을 4℃의 냉수에 녹여, 이것에 Cs2CO3 수용액 (2.5㎎/1㎖) 을 첨가하여 수용액의 pH가 5∼6 이 되도록 조정하고, 그 후, 이 수용액을 동결건조시켰다. 동결건조후의 Fmoc-디시아로 당쇄시료를 DryDMF (1.3㎖) 에 녹여, 벤질브로미드 (5.1㎕) 를 첨가하여 아르곤기류하 실온에서 45시간 교반하였다. TLC로 반응종료를 확인한 후, 반응용액을 0℃ 로 차갑게 하여 디에틸에테르 10㎖ 를 첨가하여 목적물을 석출시켰다. 이들을 여과지로 여과하였다. 남은 목적물에 증류수를 첨가하여 여과액으로서 용출시켜, 계속해서 이것을 감압농축하였다. 얻어진 잔사를 ODS 컬럼 (Φ1.6㎝×14㎝, 용출액:H2O→40% MeOH 수용액) 을 이용하여 정제하여 화합물 78 (18.2㎎, 수율 85%) 을 얻었다. 얻어진 화합물 78 의 물리적 데이터는 이하와 같다.
Figure 112006048558965-PAT00099
본 발명에 의하면 원하는 당쇄 구조를 갖는 각종 당쇄류를 매우 용이하고 대량으로 얻을 수 있다. 따라서 암, 염증, 인플루엔저 등의 치료약으로의 이용이 기대된다. 특히 본 발명에 의해 얻어질 수 있는 당쇄 아스파라긴 유도체, 당쇄 아스파라긴은 제조 공정에서의 독성성분의 혼입 등의 위험성은 없고 안정성이 우수한 것이다.

Claims (1)

  1. 일반식 :
    Figure 112006048558965-PAT00100
    (식 중, Asn 은 아스파라긴을 나타내고,
    R1 및 R2
    Figure 112006048558965-PAT00101
    이다)
    를 갖는 당쇄 아스파라긴 유도체.
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