KR20050113217A - 식물에서의 아밀로스 생산 증강 방법 - Google Patents

식물에서의 아밀로스 생산 증강 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전분 생합성 증강 단백질을 발현시킴으로써, 식물, 바람직하게는 감자 식물에서 아밀로스 함량을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 감자 식물, 바람직하게는 괴경에서 폴리펩티드를 발현하는 발현 카세트, 이러한 폴리펩티드를 발현하는 형질전환성 식물, 및 특히 본래의 전분 이외의 정밀 화학물질을 생성시키기 위한, 상기 형질전환성 식물의 용도에 관한 것이다.

Description

식물에서의 아밀로스 생산 증강 방법 {Enhanced Amylose Production in Plants}
본 발명은 신규한 전분 생합성 증강 단백질; 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 핵산; 야생형 또는 유전적으로 변형된 식물 자체와 비교해서 증가된 아밀로스 생합성을 나타내는 유전적으로 변형된 식물을 배양함으로써 아밀로스를 고 효율로 생성시키는 방법 뿐만 아니라 아밀로스를 생성시키기 위해, 하나 이상의 전분 생합성 증강 단백질을 과발현하는 상기 형질전환성 식물 (transgenic plant)의 용도에 관한 것이다.
전분은 식물의 주요 저장 탄수화물이고, 이는 주로 종자와 괴경 (tuber)에 축적된 다음, 식물의 생식 조직에 축적되어 상기 유형의 기관을 형성한다. 전분은 또한, 일간 주기 (diurnal basis)로 축적되는데, 이때 전분이 광합성 생성물로부터 그린 조직 내에 강화되고, 이어서 암기 (dark period) 동안 에너지 생성을 위해 대사 변환된다. 저장 전분이 모여 반-결정성 과립을 형성한다. 아밀로펙틴과 아밀로스가 전분의 2가지 구성 분자이다. 아밀로펙틴은 α-1,6 결합에 의해 연결된 선형 α-1,4 글루칸 쇄로 이루어진 분지된 분자이다. 아밀로스는 필수적으로 선형 α-1,4 글루칸 쇄로 이루어진다.
전분은 기술 공업 뿐만 아니라 식품 산업 내의 수 많은 응용 분야에 활용되고 있다. 전분 처리 장치에 의해 사용되는 주요 작물은 옥수수와 감자이다. 감자의 경우에는, 고 함량의 전분 생산을 위해 품종 개량시킨 바 있는 특정 품종들이 전분 생산을 위해 활용되고 있다. 이는 전분 함량과 수율이 전분 가공 산업에 있어 중요한 경제적 구동 요인이라는 것을 의미한다. 생산된 무수 전분의 상당 부분이 종이 생산에 사용된다. 전분 성분에 대한 명세와 요구 사항은 응용 분야 마다 다양하고, 특정 응용 분야에 목적하는 특성을 제공해주기 위해서는 전분을 수 차례 화학적으로 개질시킨다. 상이한 질의 전분을 만들기 위한 또 다른 방식은 전분 생합성에 있어 돌연변이의 이점을 취하는 것이고, 보다 최근에는 전분을 생성시키는 경로를 유전적으로 변형시키는 것이다. 첫 번째 주요 변형은 2가지 전분 성분인 아밀로펙틴과 아밀로스의 생산을 분리시켜 상이한 품종으로 만드는 것이었다. 왁스상 또는 "아밀로스 무함유" 품종은 아밀로펙틴 유형 만의 전분을 함유하는 반면, 옥수수에서는 "아밀로스 증량제"와 같은 아밀로스 고함량의 유전자형이 있기도 하다.
아밀로스 전분은 필름 형성제로서 또는 생산물 팽창을 위한 몇 가지 잠재적 산업 용도를 지니고 있다. 아밀로스 고함량 전분은 전분 분지화 효소를 억제시킴으로써 감자 및 기타 전분 함유 식물에서 달성시킬 수 있다. 이로써, 아밀로펙틴 분지화가 동시에 감소 또는 제거됨으로써, 아밀로스 분획이 증가된다.
US 5,856,467에는 아밀로펙틴-유형 전분의 형성을 억제하기 위해 전분을 유전 공학적으로 변형시키는 방안이 기재되어 있다. 이러한 특허에는 감자에서 전분 분지화 효소의 형성을 암호화하는 유전자 (SBE 유전자)의 발현을 다양한 정도로 억제시키기 위한 안티센스 작제물이 기재되어 있는데, 이러한 안티센스 작제물은 안티센스 방향으로 삽입된, 괴경 특이적 프로모터, 전사 출발 및 SBE 유전자의 제1 엑손을 포함하고 있다.
US 6,169,226은 감자의 제2 전분 분지화 효소 (SBE II)의 아미노산 서열 및 이의 단편 뿐만 아니라 상응하는 분리된 DNA 서열에 관한 것이다. 이에는 형질전환성 감자의 생성 방법과, 아밀로스-유형 전분을 생성하기 위한 이들 형질전환성 전분의 용도가 기재되어 있다.
WO 97/20040 및 WO 98/20145에는 상동 유전자가 SBE I 또는 SBE II 활성을 지닌 폴리펩티드를 암호화하는 적합한 프로모터에 대해 센스 또는 안티센스 배향으로 작동적으로 연결된 핵산 서열을 식물 세포 내로 도입함으로써, 이러한 식물 세포의 아밀로펙틴/아밀로스 전분 함량을 변화시키는 방법이 기재되어 있다.
아밀로스 과생산에 따른 부작용은 감자 내의 전분 총 함량이 감소된다는 것이다. 이러한 감소는 아밀로스 분획이 증가함에 따라 보다 더 두드러진다.
아밀로펙틴과 아밀로스를 생산하기 위한 기본 효소는 선형 α-1,4 글루칸 쇄를 만드는 전분 신타제, 및 α-1,4 글루칸 쇄를 파괴시키고 이들을 α-1,6 결합에 의해 재부착시키는 분지화 효소이다. 몇 가지 기타 효소, 예를 들면, 탈분지화 효소 또한, 전분 구조와 조성에 영향을 미치긴 하지만, 초기에는 전분 신타제와 전분 분지화 효소의 발현에 영향을 미치는 것에 대해 대부분의 논의가 집중되었다. 이로써, 전분 합성의 특색을 이루는데 중요한 효소가 무엇인지에 관해 광범위하고도 상세한 분석이 이루어졌다. 그러나, 아밀로스를 개시시키는지 아니면 아밀로펙틴을 개시시키는지를 나타내는 식물에서의 전분의 합성 방법에 관해서는 설득력있는 수준으로 밝혀내지 못하였다.
전분 생합성 개시에 관한 제안들이 몇몇 과학지의 주제가 되었는데, 이는 인공적인 시험관내 조건 이외의 조건 하에서는 프라이머-독립적 기능을 전분 신타제의 탓으로 돌리는 것이 곤란하였기 때문이다. 프라이머 독립적 기능이란, 단독 출발점 및 빌딩 블록으로서 ADP-글루코스를 수반한 신규한 α-1,4 글루칸 쇄의 형성을 의미한다. 말토올리고삭카라이드의 존재가 전분 신타제에 의해 추가의 글루코스 단위를 부가하기 위한 프라이머로서 작용한다는 한 가지 경로가 제안되긴 하였지만, 농도가 전분 합성을 위한 토대를 제공하기에 충분한지에 대한 논쟁이 있었고 이들 말토올리고삭카라이드가 색소체 (plastid)에서 어떻게 형성될 수 있었는지에 관해서도 논쟁이 있었다.
전분은 식물 내에서 에너지 저장 분자로서 합성된다. 전분 생합성에 참여하는 효소에 관해서는 상당 부분이 공지되어 있긴 하지만, 전분 분자의 개시에 관해서는 여전히 해결되지 못한 채로 있다. 포유류와 효모에서는, 전분과 극히 유사한 에너지 저장 분자, 즉 글리코겐이 합성된다. 각각의 분자를 합성하기 위한 효소적 단계는 유사하다. 글리코겐 생합성에서는 분자의 개시가 공지되어 있고 효소 글리코게닌 (glycogenin)에 의해 합성된다. 글리코게닌은 그 자체 상에서 대략 8개의 글루코스 분자의 선형 쇄를 중합시키는 자가-글루코실화 효소이다. 활동하기 위해 글루코스를 글리코겐 분자에 지속적으로 혼입시키는 것을 촉매하는 효소에 대해서는 약 8개 글루코스 잔기의 프라이머가 필요하다.
문헌 [참조: Cheng et al., 1995, Mol. and Cell. Biol. 6632-6640]에서는 2개의 효모 단백질을 토끼 (rabbit) 근육 글리코게닌과 비교하였다.
문헌 [참조: Roach et al., 1997, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology Vol 57]에는 자가 글리코실화 개시인자 단백질 및 이들의 글리코겐 생합성에서의 역할이 기재되어 있다.
문헌 [참조: Mu et al., 1997, Journal of Biological Chemistry 272 (44), 27589-27597]에서는 포유류 글리코게닌을 효모 및 씨. 엘레간스 (C. elegans) 글리코게닌과 비교하였다.
전분 질에 있어 중요한 요소들이 연구 개발되었으며, 기질 공급량을 증가시키거나, 생합성 활성을 증가시키거나 또는 기질 전환 경로를 폐쇄시키는 연구 분야에서 각종 효소 활성을 억제 또는 과발현시킴으로써 전분 형성과 함량을 증가시키기 위한 수 많은 주도적 권한들이 특히 감자에서 취해졌지만, 지금까지 제한적인 성공 만을 거두게 되어 상업적으로 적용하지 못하였으며, 몇몇 과학 공보에만 발표되었다 [참조: Regierer, B. et al., Starch content and yield increase as a result of altering adenylate pools in transgenic plants. Nat Biotechnol. 20 (12): 1256-60, (2002).
Sweetlove, LJ et al., Starch synthesis in transgenic potato tubers with increased 3-phosphoglyceric acid content as a consequence of increased 6-phosphofructokinase activity. Planta 213 (3):478-82 (2001).
Veramendi, J et al., Antisense repression of hexokinase 1 leads to an overaccumulation of starch in leaves of transgenic potato plants but not to significant changes in tuber carbohydrate metabolism. Plant Physiol. 121(1): 123-34 (1999).
Geigenberger, P et al., Overexpression of pyrophosphatase leads to increased sucrose degradation and starch synthesis, increased activities of enzymes for sucrose-starch interconversions, and increased levels of nucleotides in growing potato tubers. Planta. 205 (3): 428-37 (1998).
Sweetlove, LJ et al., Starch metabolism in tubers of transgenic potato (Solanum tuberosum) with increased ADPglucose pyrophosphorylase. Biochem J. 320 (2): 493-8 (1996)].
기타 연구에서는, 동물에서 글리코겐 생산을 개시하는 것과 피상적으로 유사한 생화학적 기능을 조사하였다. 이어서, 몇 가지 식물로부터 특정 부류의 유전자를 분리하였으며, 이러한 유전자가 자가-글리코실화 효소로서 작용하고 식물에서 전분 생합성에 대한 프라이머를 제공해주는 글리코게닌의 식물 등가물이라고 생각하고, 이에 아밀로게닌이란 명칭을 부여하였다 [참조: W094/04693; Sing, D. et al, β-Glucosylarginin: a new glucose-protein bond in a self-glucosylating protein from sweet corn, FEBS Letters 376: 61-64, (1995)]. 이들 유전자는 구조적 관점에서 보면 글리코게닌을 암호화하는 유전자와 전혀 유사하지 않으며, 전분 생합성에 있어 일정한 기능을 하지 않고, 오히려 세포벽 형성에 중요할 수도 있는 것으로 나중에 밝혀졌다 [참조: Bocca, S. N et al., Molecular cloning and characterization of the enzyme UDP-glucose: protein transglucosylase from potato. Plant Physiology and Biochemistry 37 (11):809-819 (1999)].
WO 98/50553에는 식물 글리코게닌 또는 수분 스트레스 단백질을 암호화하는 핵산 단편이 기재되어 있다. WO 98/50553은 또한, 센스 또는 안티센스 배향으로 식물 글리코게닌의 전부 또는 일부를 암호화하는 키메라 유전자를 작제하는 것에 관한 것인데, 이러한 키메라 유전자를 발현시키면, 형질전환된 숙주 세포 내에서 변화된 수준의 식물 글리코게닌이 생성된다.
따라서, 많은 효소와 경로들이 식물에서 연구 조사되었지만, 전분 형성을 어떤 방법으로 개시시키는지와, 전분 함량을 결정하는 것이 무엇인지에 관한 의문은 여전히 해결되지 않은 채로 있다.
아밀로스는 용도가 다양한 상업적으로 중요한 전분 생성물이지만, 불행하게도 형질전환성 감자 식물에서 아밀로스 함량이 증가하는 것은 전분 함량의 상당한 감소와 연관이 있다 [도 1 참조].
형질전환성의 고 아밀로스 감자 계통을 분석한 결과, 이들 계통에서 과량의 가용성 당이 존재하는 것으로 나타났다 [도 2 참조]. 이는 이들 형질전환성 계통에서의 전분 생합성이, 유효 (available) 당을 혼입시킬 정도로 충분히 효율적이지 못하다라는 것을 지시해준다.
아밀로스 전분은 본래의 전분과 비교해서 극히 적은 수의 환원성 말단으로 이루어진다. 따라서, 아밀로스 생합성을 추가로 증강시키고, 이용 가능한 과량의 글루코스 잔기를 혼입시킬 수 있으며 아밀로스를 다량 생산하는 식물에서의 전분 함량 감소를 상쇄시켜줄 수 있는 유전자를 동정하는 것이 상업적으로 중요하다.
본 발명은 형질전환된 식물에서 전분 생합성을 증강시키는 유전자를 과발현함으로써 아밀로스 생합성 수율을 증강시키는 것을 목적으로 한다.
본 발명에는 전분 생산을 증강시키는 단백질을 암호화하는 유전자가 기재되어 있다.
본 발명에는 새로운 전분 생합성을 증강시키는 효소를 암호화하는 감자로부터의 서열 번호 1 및 3의 핵산 서열이 기재되어 있다.
실시예 1에는 서열 번호 1 또는 3의 핵산 서열이, 자가-글리코실화 단백질 Glg1p 및 Glg2p에 대한 녹-아웃 (knock-out) 돌연변이를 함유하는 효모 세포에서 결핍된 글리코게닌 기능을 보완할 수 있다고 기재되어 있다.
감자에서 2개 유전자 서열 번호 1 또는 3의 과발현과 유전자-억제를 위한 유전자 작제물을 제조하였다. 전분 함량에 대한 유전자 영향력에 관해서는, 과발현되었거나 억제된 효소 활성을 지닌 형질전환성 계통을 분석하였다.
양 유전자를 센스 및 안티센스 방향으로 식물 프로모터 요소의 하단에 삽입하면, 형질전환 이원 벡터 pHS1, pHS2, pHS3 및 pHS4가 생성되었다 [도 3 내지 7 참조].
안티센스 작제물을 실시예 2에 기재된 바와 같은 형질전환 방법에 따라서, 감자 식물 품종 "프레발렌트 (Prevalent)" 및 "프로듀센트 (Producent)"로 형질전환시키고, 센스 작제물은 감자 품종 "데시레 (Desiree)" 및 형질전환성 식물 AM99-2003으로 형질전환시켰다. 이러한 형질전환성 식물 AM99-2003은 실시예 3에 기재된 바와 같이 생성되었다.
"프레발렌트" 및 "프로듀센트"는 전분 함량이 대략 20％인 전분 품종이다. "데시레"는 전분 함량이 대략 16％인 감자 품종이고 AM99-2003은 전분을 갖고 있고 아밀로스 함량이 대략 13％인 형질전환성의 고 아밀로스 계통이다.
솔라눔 튜베로숨 (Solanum tuberosum) ("프레발렌트" 품종)의 괴경 특이적 cDNA 라이브러리로부터 추정상의 유전자를 분리하였다. 이러한 라이브러리는 람다ZAP 방향 키트 (Stratagene)로부터 만들었다.
분리시킨 양 cDNA는 개개 유전자의 완전한 길이의 클론이었으며, 이들은 StGH1 및 StGH2로 명명되었는데, 핵산 서열에 대해서는 서열 번호 1 및 서열 번호 3을 참조할 수 있다.
pHS1
StGH1 유전자로부터의 1300 bp PCR 단편을 gbss 프로모터에 의해 구동된 안티센스 방향으로 작제하였다. 이러한 PCR 단편을, EcoRI (평활 처리됨) 및 XbaI을 사용하여 이의 클로닝 벡터 pCR4-TOPO (공급처: Invitrogen)로부터 절단하였다. 이 단편을, SalI (평활 처리됨) 및 XbaI 부위에서 gbss 프로모터 (WO 92/11376)와 nos 종결인자 간의 이원 벡터 pHo3.1에 기초하여 pGPTV-kan [참조: Becker, D. et al., Plant Molecular Biology 20: 1195-1197 (1992)]에 연결하였다. 상기 이원 벡터는 또한, nos 프로모터에 의해 구동된 선별 마커로서 nptII를 포함한다 [참조: Herrera, L. et al., 1983]. 이 작제물은 pHS1로 명명되었으며, 상세 내역은 도 3a 및 4를 참조할 수 있다.
pHS2
StGH2의 2300 bp의 완전한 길이의 cDNA 클론을, XbaI 및 XhoI를 사용하여 클로닝 벡터 pBluescript (공급처: Stratagene)로부터 절단하였다. 유전자를 gbss 프로모터와 nos 종결인자 간의 안티센스 방향으로 XbaI 및 SalI에서 이원 벡터 pHo3.1에 연결하였다. pHS1 하에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 벡터는 선별 시스템으로서 nptII를 갖는다. 이 벡터는 pHS2로 명명되었으며, 상세 내역에 대해서는 도 3b 및 5를 참조할 수 있다.
pHS3
완전한 길이의 StGH1 cDNA (1780 bp)를, EcoRI (평활 처리됨) 및 BglII를 사용하여 숙주 벡터 pBluescript로부터 절단하고, 이를 gbss 프로모터와 nos 종결인자를 수반한 pUC19를 함유하는, pUCgbssprom (3886 bp)의 BamHI 및 SmaI 부위에 연결하였다. 이 플라스미드는 pUCGH1로 명명되었다.
gbss 프로모터, StGH1 유전자 및 nos 종결인자를 수반한 단편을, EcoRI (평활 처리됨) 및 HindIII (2980 bp)를 사용하여 pUCGH1로부터 이동시키고, 이를 PstI (평활 처리됨) 및 HindIII 개방된 pSUN1에 연결하였다 [참조: WO 02/00900]. 이 플라스미드는 pSUNGH1로 명명되었다.
nos 프로모터 [참조: Herrera-Estrella, L. et al., Nature 303: 209-213 (1983)]와 OCS 종결인자 [참조: Wesley, S. V. et al., Plant J. 27 (6): 581-590 (2001)]를 수반한 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)로부터의 AHAS 내성 유전자를 함유하는 3600 bp 단편 [참조: Sathasivan, K. et al., Plant Physiology 97 (1991), 1044-1050]을 SmaI 부위에서 pSUNGH1 (9000 bp)에 연결하였다. 이 벡터는 pHS3로 명명되었으며, 상세 내역에 대해서는 도 3c 및 6을 참조할 수 있다.
pHS4
gbss 프로모터와 nos 종결인자를, EcoRI 및 HindIII를 사용하여 pBR322에 연결하였다. 상기 프로모터와 종결인자 사이에, EcoRI-HindIII 완전한 길이의 유전자 pStGH2를 XbaI 부위에서 클로닝하였다. EcoRI (부분 분해) 및 EcoRV를 사용하여, 3366 bp 프로모터-유전자-종결인자 복합체를 절단하고, 이를 EcoRI-EcoRV에서 pSUN1에 연결하고, 이를 pSUNGH2로 명명하였다. AHAS 유전자 (Arabidopsis thaliana), nos 프로모터 및 OCS 종결인자를 수반한 XbaI 단편을, XbaI (부분 분해)로 개방시킨 pSUNGH2에 연결하였다. AHAS 유전자가 선별 마커로서 사용된다. 이 작제물은 pHS4로 명명되었으며, 상세 내역에 대해서는 도 3d 및 7을 참조할 수 있다.
실시예 2에는 pHS1, pHS2, pHS3 또는 pHS4를 사용하여, 본래의 전분 또는 고 아밀로스 유형 전분을 생산하는 상이한 감자 식물 품종을 형질전환시키는 일반적인 방법이 기재되어 있다.
StGH1 및 StGH2 유전자를, 실시예 4 및 6에 기재된 바와 같은 식물 조절성 요소와 관련하여 안티센스 방향으로 상기 유전자로 형질전환시킴으로써 감자 식물 품종 "프레발렌트" 및 "프로듀센트"에서 하향 조절하였다. 이러한 두 유전자를 하향 조절시키면, 형질전환성 계통에서의 유전자 발현이 이의 모 품종과 비교해서 50 내지 95％ 정도 저하되었다 [실시예 7 및 표 3 참조]. 유전자 발현이 저하된 것으로 확인된, pHS1 및 pHS2로 형질전환시킨 형질전환성 계통은 무수 성분이 이의 모 품종과 비교해서 7 내지 11％ 감소하였다 [실시예 8 및 표 5 참조].
StGH1 및 StGH2 유전자를 실시예 5에 기재된 바와 같이, 괴경 특이적 프로모터 gbss에 의해 구동된 감자에서 과발현되었다. 돌연변이시킨 AHAS 유전자를 선별 마커로서 사용하여, 이마자목스 (Imazamox) 제초제에 대한 내성을 생성시켰다. 2가지 감자 품종인 "데시레"와 AM99-2003 형질전환성 고 아밀로스 계통을 형질전환시켜, 전분 함량을 이의 모 계통과 비교해서 40％ 감소시켰다. StGH1 및 StGH2를 과발현하는 형질전환된 계통을 실시예 6에 기재된 바와 같이 선별하였다. 유전자 발현 수준을 실시간 PCR로 분석하였다 [실시예 7 및 표 3 참조]. 유전자 StGH1 및 StGH2를 과발현시키면, 유전자 발현이 이들의 모 계통과 비교해서 2 내지 10배 정도 증가하였다. 더우기, StGH1 및 StGH2를 과발현하는 계통은 실시예 8 및 표 5에 기재된 바와 같이 무수 성분이 36％ 정도까지 증가한 것으로 밝혀졌다.
아밀로스 유형 전분을 생산하는 형질전환성 감자 식물에서 StGH1 및 StGH2를 과발현시키면, 무수 성분 함량이 증가하였는데, 이는 아밀로펙틴이 전혀 생성되지 않았기 때문에 아밀로스 함량이 증가하였다는 것을 의미한다 [실시예 8 내지 12 참조].
RNA 간섭 (RNAi)은 이본쇄 RNA (dsRNA)를 세포 내로 도입함으로써 기능하는데, 이는 상동 RNA의 분해를 유발시킨다. 이러한 dsRNA를 절단하여, Dicer로 지칭되는 리보뉴클레아제에 의해 21 내지 25개 뉴클레오티드의 작은 간섭 RNA (siRNA)로 만든다. siRNA는 단백질 복합체와 연결하여 RNA-유도된 침묵 (silencing) 복합체 RISC를 형성한다. 이러한 RISC는 siRNA의 ATP 발생 풀림에 의해 활성화되는데, 이는 상동 전사체와 결합하고 mRNA를 절단시켜 유전자 제어를 야기시킨다 [참조: Mc Manus MT and Sharp PA., Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Rev Genet 3: 737-747 (2002);
Dillin A., The specifics of small interfering RNA specificity. Proc Natl Acad Sci USA 100(11): 6289-6291 (2003);
Tuschl T., Expanding small RNA interference. Nature Biotechnol 20: 446-448 (2002)]
고 아밀로스 계통의 생성은 안티센스 작제물 pHAbe12A를 사용하는 경우 보다 RNAi 작제물 pHAS3 (도 23) 및 pHAS8b (도 20)를 사용하는 경우에 보다 효율적이었다. 예를 들어, pHAS8b 및 pHAS3을 사용한 경우에 생성된 총 형질전환성 어린 가지의 고 아밀로스 계통의 빈도는, 생성된 총 형질전환성 어린 가지의 대략 1％ 고 아밀로스 계통의 빈도와 비교해서 25％를 초과한다 [실시예 15 내지 17 참조].
고 아밀로스 감자 생산을 위해 사용된 RNAi 작제물 pHAS8b (도 20) 및 pHAS3 (도 23) (서열 번호 24)는 역직렬식 (inverted tandem)으로 클로닝된 be1 및 be2 단편 (서열 번호 19)을 함유하고 있다. 이들 작제물은 역위 반복 서열 (inverted repeat) 사이에 위치하여 사용되는 스페이서에 있어서만 상이하였는데, pHAS8b의 경우에는 be2 프로모터의 단편이 사용된 반면 (서열 번호 18), pHAS3의 경우에는 pBluescript으로부터의 클로닝 잔기가 사용되었다 (서열 번호 23). RNAi 작제물은 분지화 효소 유전자를 효율적으로 하향 조절시켜 주었다.
더우기, 각각의 be1 및 be2 유전자의 단편은 보다 짧거나 보다 길 수 있으며, 분지화 효소 유전자의 다른 부분을 표적화할 수 있었다. be1 및 be2의 RNAi에 대한 보다 짧은 단편이 서열 번호 21 및 22에 기재되어 있다.
본 발명에 따르는 전분 생합성 증강 단백질은 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 아미노산 수준에 있어 서열 번호 2 또는 4의 서열과 50％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 보다 바람직하게는 70％ 이상, 보다 바람직하게는 80％ 이상, 보다 더 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상 동일한, 서열 번호 2 또는 4로부터 유도된 서열을 포함하는 단백질을 포함하고, 전분 생합성 증강 단백질의 특성을 지니고 있다. 이러한 전분 생합성 증강 단백질은 서열 번호 2 또는 4로부터 출발하여, 예를 들어, 아미노산을 치환, 삽입 또는 결실시킴으로써 인공적으로 변이시켜 제조할 수도 있다.
이러한 단백질을 사용하여 비-형질전환성 또는 형질전환성 식물에서 아밀로스 또는 아밀로펙틴의 생산을 증가시킬 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "치환"은 하나 이상의 아미노산이 하나 이상의 아미노산으로 대체되는 것을 의미한다. 대체된 아미노산이 본래의 아미노산과 유사한 특성을 지니는 "보존적" 대체를 수행하는 것이 바람직한데, 예를 들면, Glu를 Asp로 대체, Gln을 Asn으로 대체, Val을 Ile로 대체, Leu를 Ile로 대체, Ser를 Thr로 대체시킨다.
"결실"은 아미노산(들)을 직접 결합으로 대체시키는 것이다. 결실에 바람직한 위치는 폴리펩티드 말단과, 개개 단백질 도메인 간의 접합부이다.
"삽입"은 아미노산을 폴리펩티드 쇄 내로 삽입하는 것인데, 직접 결합이 형식적으로 하나 이상의 아미노산으로 대체되는 것이다.
두 단백질 간의 "동일률"은 각 경우에 있어 단백질의 전체 길이에 걸친 아미노산의 동일률을 의미하는데, 특히 다음과 같이 설정된 파라이미터를 수반한 클러스탈 (Clustal) W 방법을 사용하여 Informax (USA) 회사의 벡터 NTI Suite 7.1 소프트웨어의 도움 하에 비교함으로써 산정된 동일률을 의미한다 [참조: Thompson, JD et al., Nucleic Acid Research, 22 (22): 4673-4680, 1994]:
다중 정렬 파라미터:
갭 개방 페널티 15
갭 연장 페널티 6.66
갭 분리 페널티 범위 8
갭 분리 페널티 온 (on)
정렬 지연에 대한 동일률 (％) 40
잔기 특이적 갭 온 (on)
친수성 잔기 갭 오프 (off)
전이 칭량 0
쌍별 (pairwise) 정렬 파라미터:
FAST 알고리듬 오프 (off)
K-튜플 크기 2
갭 페널티 5
윈도우 (Window) 크기 4
우수한 대각선의 수 4
따라서, 아미노산 수준에 있어 서열 번호 2 또는 4의 서열과 50％ 이상 동일한 단백질은, 특히 상기 파라미터 세트를 사용하여 상기 프로그램 알고리듬에 따라서, 서열 번호 2 또는 4의 서열과 비교한 경우에 50％ 이상이 동일한 단백질을 의미한다.
본 발명에 따르는 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 유전자의 추가의 천연 예는, 특히 상기 파라미터 세트를 사용하여 상기 프로그램 알고리듬에 따라서, 아미노산 서열 또는 데이터베이스로부터의 상응하는 역-해독된 핵산 서열과 서열 번호 2 또는 4의 서열과의 동일률을 비교함으로써, 예를 들어, 게놈 서열이 공지되어 있는 각종 유기체, 특히 식물에서 용이하게 발견할 수 있다.
아라비도프시스 탈리아나의 완결된 게놈 서열에서는, 엑손/인트론 경계를 조사하고 이를 서열 번호 2 또는 4의 역해독 서열과 비교함으로써 5개의 추정상의 암호화 서열을 추론할 수 있다.
아라비도프시스 탈리아나의 다음 핵산 서열인 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11 및 서열 번호 13을 사용하여 본 발명을 수행할 수 있었고, 이들은 전분 생합성 증강 단백질 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12 및 서열 번호 14를 암호화한다.
더우기, 다음 핵산 서열 또는 EST를 사용하여, 식물 유기체로부터의 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 유전자를 동정 및 클로닝할 수 있다:
유전자은행으로부터의 토마토 EST: AW216407, BE450055, BF097262, BE450557, BF097173
유전자은행으로부터의 밀 EST: BJ292476, BJ278875, BJ283925, BE442966, CA666180, BQ483228
유전자은행으로부터의 옥수수 EST: BG319971
유전자은행으로부터의 벼 EST: AL606633, CA752890, BI813265.
전분 생합성 증강 단백질 및 상응하는 유전자의 천연 예는 예를 들어, 핵산 서열인 서열 번호 1 또는 서열 번호 3, 또는 서열 번호 5, 7, 9, 11 또는 13 중의 어느 하나, 또는 상기 언급된 EST 서열 중의 어느 하나로부터 출발하여, 자체 공지된 방식으로 하이드리드화 기술에 의해 이의 게놈 서열이 공지되어 있지 않은 각종 유기체, 특히 식물에서 추가로 용이하게 발견할 수 있다.
하이브리드화는 적당한 조건 (낮은 엄격도), 또는 바람직하게는 엄격한 조건 (높은 엄격도) 하에 수행할 수 있다.
이러한 하이브리드화 조건은 특히 다음 문헌에 기재되어 있다 [참조: Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57 or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, N. Y.(1989), 6.3.1-6.3.6].
예시하자면, 세척 단계 동안의 조건은 엄격도가 낮은 조건 (50℃ 하에 2X SSC를 사용함) 내지 엄격도가 높은 조건 (50℃, 바람직하게는 65℃ 하에 0.2X SSC를 사용함) (20X SSC: 0.3 M 나트륨 시트레이트, 3 M 염화나트륨, pH 7.0)으로써 제한되는 조건 범위 중에서 선택될 수 있다.
또한, 온도는 세척 단계 동안 실온 22℃ 하의 적당한 조건에서부터 65℃ 하의 엄격한 조건으로 상승될 수 있다.
염 농도와 온도 파라미터 둘 다를 동시에 변화시킬 수 있고, 이들 2가지 파라미터 중의 하나를 일정하게 유지시키고 다른 하나 만을 변화시키는 것도 가능하다. 또한, 하이브리드화 동안에 변성제, 예를 들면, 포름아미드 또는 SDS를 사용하는 것도 가능하다. 50％ 포름아미드의 존재 하에서는 하이브리드화를 42℃ 하에 수행하는 것이 바람직하다.
하이브리드화 및 세척 단계에 대한 몇 가지 예시 조건이 다음에 열거되어 있다:
(1) 예를 들어, 다음을 사용하는 하이브리드화 조건
(i) 65℃ 하에 4X SSC, 또는
(ii) 45℃ 하에 6X SSC, 또는
(iii) 68℃ 하에 6X SSC, 100 mg/ml 변성 어류 정액 DNA, 또는
(iv) 68℃ 하에 6X SSC, 0.5％ SDS, 100 mg/ml 변성 단편화 연어 정액 DNA, 또는
(v) 42℃ 하에 6X SSC, 0.5％ SDS, 100 mg/ml 변성 단편화 연어 정액 DNA, 50％ 포름아미드, 또는
(vi) 42℃ 하에 50％ 포름아미드, 4X SSC, 또는
(vii) 42℃ 하에 50％ (vol/vol) 포름아미드, 0.1％ 소 혈청 알부민, 0.1％ 피콜 (Ficoll), 0.1％ 폴리비닐피롤리돈, 50 mM 인산나트륨 완충제 pH 6.5, 750 mM NaCl, 75 mM 나트륨 시트레이트, 또는
(viii) 50℃ 하에 2X 또는 4X SSC (적당한 조건), 또는
(ix) 42℃ 하에 30 내지 40％ 포름아미드, 2X 또는 4X SSC (적당한 조건).
(2) 예를 들어, 각각 다음을 이용하는 10분의 세척 단계
(i) 50℃ 하에 0.015 M NaCl/0.0015 M 나트륨 시트레이트/0.1％ SDS, 또는
(ii) 65℃ 하에 0.1X SSC, 또는
(iii) 68℃ 하에 0.1X SSC, 0.5％ SDS, 또는
(iv) 42℃ 하에 0.1X SSC, 0.5％ SDS, 50％ 포름아미드, 또는
(v) 42℃ 하에 0.2X SSC, 0.1％ SDS, 또는
(vi) 65℃ 하에 2X SSC (적당한 조건).
전분 생합성 증강 활성을 지니는 바람직한 단백질은 식물, 시아노박테리아, 이끼 (mosses) 또는 조류 (algae)로부터의 단백질이고, 특히 바람직한 것은 식물로부터의 단백질이다. 특히 바람직한 단백질은 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함한다.
예를 들어, 단백질을 식물에서 발현시켜야 하는 경우에는, 이러한 식물의 코돈 활용에 따라서 유전자의 역해독과 재합성을 위해 상기 식물의 코돈 활용을 이용하는 것이 종종 유리하다.
본 발명은 추가로, 본 발명에 따르는 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 본 명세서에 언급된 핵산 모두는, 예를 들어, RNA 서열, DNA 서열 또는 cDNA 서열일 수 있다.
적합한 핵산 서열은, 예를 들어, 유전 암호에 따라서 폴리펩티드 서열을 역해독함으로써 수득할 수 있다. 이를 위해서는, 유기체-특이적 코돈 활용에 따라서 종종 사용되고 있는 코돈을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 코돈 활용은 문제의 유기체의 기타 공지된 유전자를 컴퓨터 분석하는 것을 근거로 하여 용이하게 결정할 수 있다.
더우기, 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 상기 언급된 유전자 모두는 화학적 합성법, 예를 들면, 이중 나선의 개개 중복성 상보 핵산 빌딩 블록을 단편 축합시킴으로써 뉴클레오티드 빌딩 블록으로부터 자체 공지된 방식으로 제조할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성은 예를 들어, 포스포르아미디트 방법에 따라서 공지된 방식으로 수행할 수 있다 [참조: Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897]. 합성 올리고뉴클레오티드를 어닐링시키는 방법, DNA 폴리머라제의 클레노우 (Klenow) 단편의 보조 하에 갭을 충진시키는 방법, 연결 반응 및 일반적인 클로닝 방법이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참조: Sambrook et al.(1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press].
이러한 기능을 암호화하는 유전자를 식물 염색체에 통합시킬 수 있고, 발현시 이는 전분/아밀로스 생합성이 일어나는 소기관인 색소체를 국재시키기 위한 전이 펩티드를 활용하거나, 또는 색소체 게놈 내로 직접적으로 통합됨으로써 국재화 시그널에 대한 필요성을 능가할 수 있다. 이러한 유전자는 구성성 또는 기관 특이적으로 발현될 수 있다. 기관 특이적 발현의 경우에는, 괴경 특이적 발현을 나타내는 프로모터가 감자에서 바람직하긴 하지만, 옥수수 또는 밀과 같은 곡류에서는, 저장 전분이 축적되는 기관 내에서 고도의 발현을 달성하기 위해 내유 (endosperm) 특이적 발현이 바람직할 것이다. 색소체 게놈으로 형질전환된 경우에는, 상기 소기관에 적합한 특이적 조절성 요소를 적용한다.
본 발명의 유전자는 동일한 유전자 작제물 상에 위치할 수 있거나, 또는 공동-형질전환 또는 초형질전환에 의해 전이 및 결합될 수 있는 기타 유전자와 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 유전자와 조합하는 것으로 관심있는 유전자 및 형질들은 농경학적 또는 유입물 형질, 예를 들면, 제초제 내성, 질병 및 해충 내성 또는 스트레스 관용이지만, 전분 구조 변형 또는 수율과 같은 산출물 형질일 수도 있다. 본 발명에 기재된 유전자와 조합하여 사용되는 유전자 및 형질들은 변형된 식물 종에 존재하지 않는 기능을 부가하거나, 이미 존재하는 기능을 과발현시키거나, 또는 안티센스, RNAi 또는 항체를 사용함으로써 기능을 억제하기 위한 것일 수있다.
본 발명은 감자 괴경 내의 전분 또는 아밀로스 함량을 증가시키기 위해 사용될 수 있지만, 본원 맥락에서 감자로만 제한되지 않으며 기타 전분 생산 및 저장 식물, 예를 들면, 옥수수, 카사바, 밀, 보리, 귀리 및 벼에도 적용 가능할 것이다.
본 발명은 α-1,6 분지 형성의 저하 또는 제거로 인해 α-1,4 글루칸 쇄 비-환원성 말단의 수가 현저하게 감소되는 상이한 식물에서 아밀로스 함량 증가와 연관된 낮은 전분 함량 문제를 제거하는데 특히 적합하다. 아밀로펙틴은 글리코겐과 마찬가지로 폴리삭카라이드 생산을 위한 극도로 효율적인 구조물인데, 이는 이것이 매우 분지되어 있으므로, 비-환원성 말단이 존재하는 것 처럼 전분 합성을 위해 접근 가능한 많은 지점을 함유하고 있기 때문이다. 주로 아밀로스로 구성된 전분은 훨씬 더 적은 수의 분지를 함유하므로, 생합성 능력은 떨어진다. 아밀로펙틴을 전혀 생산하지 않는 경우의 전분 생합성을 증강시키기 위해서는, 본 발명에 기재된 바와 같은 유전자의 발현이, 예를 들어, 전분 생합성 능력에 대한 공급원으로서 아밀로펙틴을 대체할 수 있음으로써 상실된 전분 합성 능력을 저하 또는 제거할 수 있는 신규한 프라이머를 형성시킬 수 있었다. 이러한 상황을 추가로 예시하자면, 통상의 감자 전분 내의 분지화도는 대략 3.1％인 반면, 고 아밀로스 전분에서는 아밀로스 함량에 따라서 0.3 내지 1.0％이다. 이러한 분지화도와 전분 함량의 감소는 글루코스 및 프럭토스 함량 증가와 추가로 연관이 있다.
아밀로스 함량 증가와, 이에 따른 고형물 함량 증가는 각종 응용 분야에 있어 가공 특성, 예를 들면, 프렌치 프라이, 감자 크리스프 및 감자를 이용한 기타 제품에 대해 유리하기도 하다. 고형물 함량 증가 이외에도, 본 발명의 서열 번호 1 또는 3이 삽입된 유전자는 과량의 당을 α-1,4-글루칸 쇄로 형질전환시켜 줌으로써, 프라이드 감자 제품의 갈변 반응, 즉 마일라드 반응 (Maillard reaction) (여기서, 아미노산이 자유 당과 반응한다)을 저하시켜 준다.
더우기,
(i) 언급된 활성을 지닌 식물 기원의 모든 유전자는 아밀로스 함량과 고형물을 증가시키기 위해 사용될 있다.
(ii) 상기 유전자는 식물에서 기능적인 모든 조절성 프로모터 요소에 의해 제어될 수 있다.
(iii) 모든 품종의 모든 전분 생산 작물을, 상기 언급된 유전자를 사용하여 형질전환시킬 수 있다.
(iiii) 어떠한 식물 형질전환 방법도 사용할 수 있다.
(iiiii) 상기 언급된 유전자를 삽입시키기 위해서 어떠한 이원 벡터도 사용할 수 있다.
(iiiiii) 상기 언급된 유전자를, 형질전환적으로 삽입된 기타 목적하는 모든 형질들과 조합할 수 있다.
본 발명은 추가로, 야생형 또는 이미 아밀로스 유형 전분을 생산하고 있는 유전적으로 변형된 식물과 비교해서, 아밀로스 생합성 활성이 증가된 식물을 배양함으로써, 아밀로스를 생성시키는 방법에 관한 것으로, 상기 단백질이 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 아미노산 수준에 있어 서열 번호 2 또는 4의 서열과 50％ 이상 동일하고, 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 이들 서열들 중의 하나로부터 유도되는 서열을 포함한다.
야생형 또는 형질전환성 계통과 비교해서 아밀로스 생합성 활성이 증가되었다는 것은, 형성된 아밀로스의 양이 야생형 또는 형질전환성 계통과 비교해서 전분 생합성 증강 단백질에 의해 증가된다는 것을 의미한다.
이러한 전분 또는 아밀로스 생합성 활성 상의 증가는 바람직하게는 야생형 또는 형질전환성 계통의 단백질 활성의 5％ 이상, 추가로 바람직하게는 10％ 이상, 추가로 바람직하게는 20％ 이상, 추가로 바람직하게는 50％ 이상, 보다 바람직하게는 100％ 이상, 보다 더 바람직하게는 200％ 이상, 특히 500％ 이상이다.
"야생형"은 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 출발 식물을 의미한다. 이러한 식물은 바람직하게는 솔라눔 튜베로숨이다.
본 맥락에 따라서, 용어 "식물"은 야생형 출발 식물 또는 유전적으로 변형된 출발 식물을 의미한다.
"형질전환성 식물" 또는 "유전적으로 변형된 식물"은, 이러한 식물이 식물 종에 대해 외래이거나 내인성일 수 있는 부가의 삽입된 유전자 세그먼트; 다음 폴리펩티드에 상응하고 전분 분지화 효소 I, 전분 분지화 효소 II 및(또는) 서열 번호 1 또는 3에 명시된 바와 같은 전분 생합성 증강 단백질의 효소적 활성을 나타내는 적합한 프로모터에 대해 센스 및(또는) 안티센스 배향의 부가 유전자 또는 부가 유전자 단편; 또는 서열 동일률이 60％ 이상인 폴리뉴클레오티드를 함유한다는 것을 의미한다.
"아밀로스 유형 전분"은 전분의 아밀로스 함량이 야생형 식물, 특히 야생형 감자 식물에 의해 생산된 전분의 아밀로스 함량과 비교해서 증가된다는 것을 의미한다.
전분 또는 아밀로스 생합성 활성은 각종 방식으로 증가시킬 수 있는데, 예를 들면, 해독 및 단백질 수준에서 억제 조절성 기전을 제거시키거나, 또는 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 핵산의 유전자 발현을 야생형 또는 형질전환성 식물과 비교해서 증가시킴으로써, 예를 들어, 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 유전자를 활성화제를 통하여 유도시키거나 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 핵산을 해당 식물 내로 도입함으로써 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 핵산의 유전자 발현을 증가시키는 것은, 식물, 특히 감자 식물에 내재된 (고유한) 내인성 전분 생합성 증강 단백질의 발현을 조작하는 것을 의미할 수도 있다. 이는, 예를 들어, 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터 DNA 서열을 변형시킴으로써 달성할 수 있다. 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현 속도를 변형시키거나 또는 바람직하게는 증가시켜 주는 상기와 같은 변형은 DNA 서열을 결실 또는 삽입함으로써 수행할 수 있다.
외인성 자극을 적용함으로써 하나 이상의 내인성 전분 생합성 증강 단백질의 발현을 변형시키는 것이 또한 가능하다. 이는 특정한 생리학적 조건에 의해, 즉 외래 물질을 적용함으로써 수행할 수 있다.
더우기, 변형되거나 또는 형질전환되지 않은 식물에는 존재하지 않는 조절성 단백질의 상호 작용에 의해 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 변형 또는 증가시킬 수 있다.
바람직한 양태에서는, 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 핵산의 유전자 발현을 증가시킴으로써, 전분 생합성 증강 단백질 활성을 야생형 또는 형질전환성 식물에 비해 증가시키는데, 이러한 전분 생합성 증강 단백질은 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 아미노산 수준에 있어 서열 번호 2 또는 4의 서열과 50％ 이상 동일하고, 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 이들 서열로부터 유도되는 서열을 포함한다.
인트론을 함유하는, 진핵성 공급원으로부터의 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 게놈 핵산 서열의 경우에는, 숙주 유기체가 상응하는 전분 생합성 증강 단백질을 발현할 능력이 없다면, 바람직하게는 이미 프로세싱된 핵산 서열, 예를 들면, 상응하는 cDNA를 사용해야 한다.
이러한 바람직한 양태에서는, 본 발명의 형질전환성 식물이 야생형 또는 형질전환성 식물과 비교해서, 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 하나 이상의 추가의 유전자를 함유한다. 따라서 이러한 바람직한 양태에서는, 본 발명의 유전적으로 변형된 식물이 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 하나 이상의 형질전환성의 내인성 또는 외인성 핵산을 갖는다.
적합하고 바람직한 핵산은 상기 언급된 것이다. 특히 바람직한 양태에서는, 서열 번호 1 또는 3의 서열을 포함하는 핵산을 식물 내로 도입한다.
본 발명에 따르면, 유기체는 바람직하게는, 야생형으로서 또는 유전적 변형될 수 있는 것으로서 전분 또는 아밀로스를 생산할 수 있는 진핵성 유기체, 예를 들면, 효모, 조류, 이끼, 진균 또는 식물을 의미한다. 바람직한 유기체는 광합성적으로 활성인 유기체, 예를 들면, 야생형으로서도 전분 또는 아밀로스 유형 전분을 생산할 수 있는 식물이다.
특히 바람직한 유기체는 감자 식물이다.
본 발명은 추가로, 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 아미노산 수준에 있어 서열 번호 2 또는 4의 서열과 50％ 이상 동일하고, 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 이들 서열로부터 유도되는 서열을 포함하며 전분 생합성 증강 활성을 지니고 있는 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 식물에서 전분 생합성 증강 활성을 지니고 있는 단백질을 암호화하는 서열 번호 5, 7, 9, 11 또는 13 중의 하나 또는 서열 번호 1 또는 3의 핵산의 용도에 관한 것이다.
형질전환성 유기체, 특히 식물은 이러한 유기체에서의 전사와 해독을 보장해 주는 하나 이상의 조절성 시그널에 기능적으로 연결되어 있는 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는, 상기 언급된 핵산을 함유하는 핵산 작제물을 사용하여, 출발 유기체, 특히 식물을 형질전환시킴으로써 제조하는 것이 바람직하다.
암호화 핵산 서열이, 유기체, 특히 식물에서의 전사와 해독을 보장해 주는 하나 이상의 조절성 시그널에 기능적으로 연결되어 있는 상기 핵산 작제물은 하기 본원에서 발현 카세트로서 지칭되기도 한다.
따라서, 본 발명은 추가로, 유기체, 특히 식물에서의 전사와 해독을 보장해 주는 하나 이상의 조절성 시그널에 기능적으로 연결되어 있는 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 작제물, 특히 발현 카세트로서 기능하는 핵산 작제물에 관한 것이다.
조절성 시그널은 바람직하게는, 유기체, 특히 식물에서의 전사와 해독을 보장해 주는 하나 이상의 프로모터를 포함한다.
발현 카세트는 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 제어시켜 주는 조절성 시그널, 즉 조절성 핵산 서열을 포함한다. 바람직한 양태에 따르면, 발현 카세트는 상단, 즉 암호화 서열의 5' 말단에 프로모터를 포함하고, 하단, 즉 3' 말단에 폴리아데닐화 시그널을 포함하며, 경우에 따라 이들 사이에 위치한 상기 언급된 유전자들 중의 하나 이상에 대해 암호화 서열에 작동적으로 연결되어 있는 추가의 조절성 요소를 포함한다. 작동적 연결은 조절성 요소 각각이 암호화 서열의 발현에 있어 자신의 기능을 적절히 수행할 수 있는 방식으로, 프로모터, 암호화 서열, 종결인자, 및 경우에 따라 추가의 조절성 요소가 순차적으로 배열되는 것을 의미한다.
사용된 유기체가 식물인 경우에는, 본 발명의 핵산 작제물 및 발현 카세트가 바람직하게는, 색소체에서의 국재화를 보장해 주는 색소체 전이 펩티드를 암호화하는 핵산을 함유한다.
식물에 대한 바람직한 핵산 작제물, 발현 카세트 및 벡터, 및 형질전환성 식물의 제조 방법 및 또한 형질전환성 식물 그 자체가 다음 실시예 2 내지 6에 기재되어 있다.
작동적 연결을 위해 바람직하긴 하지만, 이에 제한되지 않는 서열은 색소체, 예를 들면, 아밀로플라스트 또는 엽록체에 대한 아세포성 국재를 보장하기 위해서긴 하지만, 아포플라스트 (apoplast), 액포, 미토콘드리아, 소포체 (ER), 세포 핵, 일라이오플라스트 (elaioplast) 또는 기타 구획에서의 아세포성 국재를 보장하기 위한 표적화 서열, 및 해독 증강인자, 예를 들면, 담배 모자이크 바이러스로부터의 5'-리더 서열이다 [참조: Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711].
발현 카세트에 적합한 프로모터는 원칙적으로, 식물에서 외래 유전자의 발현을 제어할 수 있는 모든 프로모터이다.
"구성성" 프로모터는 비교적 긴 식물 발생 기간에 걸쳐, 바람직하게는 식물 발생의 전 기간 동안에 수 많은 조직, 바람직하게는 모든 조직에서의 발현을 보장해주는 프로모터를 의미한다.
바람직하게 사용되는 것은 특히, 식물 기원 프로모터, 또는 식물 바이러스로부터 유래된 프로모터이다. 특히 바람직한 것은 CaMV 콜리플라워 모자이크 (cauliflower mosaic) 바이러스의 35S 전사체의 프로모터 [참조: Franck et al. (1980) Cell 21:285-294; Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; Shewmaker et al. (1985) Virology 140:281-288; Gardner et al. (1986) Plant Mol Biol 6:221-228] 또는 19S CaMV 프로모터 [참조: US　5,352,605; WO　84/02913; Benfey et al. (1989) EMBO J 8:2195-2202]이다.
또 다른 적합한 구성성 프로모터는 루비스코 작은 소단위체 (SSU) 프로모터 [참조: US　4,962,028], 레구민 (legumin)　B 프로모터 [유전자은행 승인 번호　X03677], 아그로박테륨 노팔린 신타제 프로모터, TR 이중 프로모터, 아그로박테륨 OCS [옥토핀 신타제 (octopine synthase)] 프로모터, 유비퀴틴 프로모터 [참조: Holtorf　S et al. (1995) Plant Mol Biol 29:637-639], 유비퀴틴 1 프로모터 [참조: Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9692-9696], Smas 프로모터, 신나밀 알코올 데하이드로게나제 프로모터 (US　5,633,439), 액포성 ATPase 소단위체의 프로모터 또는 프롤린-풍부한 밀 단백질의 프로모터 (WO　91/13991), Pnit 프로모터 [참조: Y07648.L, Hillebrand et al. (1998), Plant. Mol. Biol. 36, 89-99, Hillebrand et al. (1996), Gene, 170, 197-200], 및 식물에서의 구성성 발현이 당업자에게 공지되어 있는 유전자의 기타 프로모터이다.
발현 카세트는 화학적 유도성 프로모터 [참조: Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108]를 포함할 수도 있는데, 이를 사용하여 식물에서의 전분 생합성 증강 단백질 유전자의 발현을 특정 시점에서 제어할 수 있다. 이러한 종류의 프로모터, 예를 들면, PRP1 프로모터 [참조: Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22:361-366], 살리실산-유도성 프로모터 (WO　95/19443), 벤젠설폰아미드-유도성 프로모터 (EP　0　388　186), 테트라사이클린-유도성 프로모터 [참조: Gatz et al. (1992) Plant J　2:397-404], 아브시스산-유도성 프로모터 (EP　0　335　528) 또는 에탄올- 또는 시클로헥산온-유도성 프로모터 (WO　93/21334)를 사용할 수도 있다.
적합한 프로모터의 추가 예는 과실 숙성-특이적 프로모터, 예를 들면, 토마토로부터의 과실 숙성-특이적 프로모터 (WO　94/21794, EP　409 625)이다. 발생-의존적 프로모터에는 부분적으로, 조직-특이적 프로모터가 포함되는데, 이는 개개의 조직이 본래 발생-의존적 방식으로 형성되기 때문이다.
추가로, 특히 바람직한 것은, 예를 들어, 전분 또는 아밀로스의 생합성 또는 이의 전구체의 생합성이 일어나는 식물 조직 또는 식물 일부분에서의 발현을 보장해 주는 프로모터이다. 바람직한 예는 잎, 꽃자루, 뿌리, 종자 및 괴경에 대한 특이성을 지닌 프로모터이다.
종자-특이적 프로모터는, 예를 들어, 파세올린 (phaseoline) 프로모터 [참조: US 5,504,200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1(9): 839-53], 2S 알부민 유전자의 프로모터 [참조: Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201], 레구민 프로모터 [참조: Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331], USP (공지되지 않은 종자 단백질) 프로모터 [참조: Baumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225(3): 459-67], 나핀 (napin) 유전자의 프로모터 [참조: US 5,608,152; Stalberg K et al. (1996) L Planta 199: 515-519], 슈크로스-결합 단백질 프로모터 [참조: WO 00/26388] 및 레구민 B4 프로모터 [참조: LeB4; Baumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baeumlein et al. (1992) Plant Journal 2(2): 233-9; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13(10): 1090f], 아라비도프시스 올레오신 (Arabidopsis oleosin) 프로모터 [참조: WO 98/45461], 브라시카 Bce4 프로모터 [참조: WO 91/13980] 및 빈실린 프로모터 [참조: Weschke et al. 1988, Biochem. Physio. Pflanzen 183, 233-242; Baumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225 (3): 459-67]이다.
추가의 적합한 종자-특이적 프로모터는 고분자량 글루테닌 (HMWG), 글리아딘, 분지화 효소, ADP 글루코스 피로포스파타제 (AGPase) 및 전분 신타제를 암호화하는 유전자의 프로모터이다. 추가로 바람직한 것은 외떡잎 식물, 예를 들면, 옥수수, 보리, 밀, 호밀, 벼 등에서의 종자-특이적 발현을 허용해 주는 프로모터이다. 또한, Ipt2 또는 Ipt1 유전자의 프로모터 [참조: WO 95/15389, WO 95/23230] 또는 WO 99/16890에 기재된 프로모터 (호르데인 유전자, 글루텔린 유전자, 오리진 유전자, 프로라민 유전자, 글리아딘 유전자, 글루텔린 유전자, 제인 유전자, 카시린 유전자 및 세칼린 유전자의 프로모터)를 유리하게 사용할 수도 있다.
괴경, 저장 뿌리 또는 뿌리에 대해 특이적인 프로모터의 예는 파타틴 프로모터 부류 I (B33), 감자 카텝신 D 억제제 프로모터, 및 EP-A 0 921 191에 기재된 바와 같은 감자 과립상 결합된 전분 신타제 (GBSS) 프로모터이다.
잎-특이적 프로모터의 예는 감자로부터의 시토졸성 FBPase 프로모터 [참조: WO　97/05900], 루비스코 (리불로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제) SSU (작은 소단위체) 프로모터 및 감자 ST-LSI 프로모터 [참조: Stockhaus et　al. (1989) EMBO J 8: 2445-2451]이다.
식물에서의 발현에 적합한 추가의 프로모터는 다음 문헌에 기재되어 있다 [참조: Rogers et al. (1987) Meth in Enzymol 153:253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61: 1-11; Berger et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 8402-8406].
감자 식물에서 전분 및 아밀로스 생합성 부위는 아밀로플라스트이다. 따라서, 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 서열 번호 1 또는 3의 본 발명의 핵산의 유전자 생성물의 아밀로플라스트-특이적 표적화 및 활성이 요망된다.
발현은 식물의 모든 부위에서 조직-특이적 방식으로 일어날 수도 있다.
따라서, 추가의 바람직한 양태는 서열 번호 1 또는 3의 핵산의 괴경-특이적 발현에 관한 것이다.
또한, 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 유전자의 구성성 발현이 유리하다. 그러나, 한편으론, 상기 유전자의 유도성 발현도 또한 요망될 수 있다.
발현 카세트는 바람직하게는, 적합한 프로모터를, 예를 들어, 다음 문헌에 기재된 바와 같은 통상적인 재조합 및 클로닝 기술에 따라서, 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 상기 언급된 바와 같은 핵산, 및 바람직하게는 프로모터와 핵산 서열 사이에 삽입되고 아밀로플라스트-특이적 전이 펩티드를 암호화하는 핵산, 및 또한 폴리아데닐화 시그널에 융합시킴으로써 제조된다 [참조: T.　Maniatis, E.F.　Fritsch and J.　Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J.　Silhavy, M.L.　Berman and L.W.　Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel,　F.M. et　al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)].
특히 바람직한 것은 아밀로플라스트에서의 표적화를 보장해 주는 삽입된 핵산 서열이다.
핵산 서열이 전분 생합성 증강 단백질 융합 단백질 (이러한 융합 단백질의 한 부분은 폴리펩티드의 전위를 제어시키는 전이 펩티드이다)를 암호화하는 발현 카세트를 사용하는 것도 가능하다. 전분 생합성 증강 단백질을 아밀로플라스트 내로 전위시킨 후에 전분 생합성 증강 단백질 일부분으로부터 효소적으로 제거되는 아밀로플라스트-특이적 전이 펩티드가 바람직하다.
특히 바람직한 것은 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) 색소체 트랜스케토라제 또는 또 다른 전이 펩티드 [예를 들면, 루비스코 작은 소단위체의 전이 펩티드, 또는 페레독신 NADP 옥시도리덕타제 뿐만 아니라 이소펜테닐-피로포스페이트 이소머라제-2의 전이 펩티드] 또는 이의 기능적 등가물로부터 유래된 전이 펩티드이다.
색소체 전이 펩티드의 추가의 예는 아라비도프시스 탈리아나로부터의 색소체 이소펜테닐-피로포스페이트 이소머라제-2 (IPP-2)의 전이 펩티드, 및 완두로부터의 리불로스 비스포스페이트 카복실라제 작은 소단위체 (rbcS)의 전이 펩티드이다 [참조: Guerineau,　F, Woolston,　S, Brooks,　L, Mullineaux,　P (1988) An expression cassette for targeting foreign proteins into the chloroplasts. Nucl. Acids Res. 16: 11380].
식물 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 본 발명의 식물 유전자는 색소체 전이 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 이미 함유할 수 있다. 이러한 경우, 추가의 전이 펩티드가 요구되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 서열 번호 1 또는 3의 전분 생합성 증강 단백질의 솔라눔 튜베로숨 서열은 전이 펩티드 서열을 이미 함유하고 있다.
본 발명의 핵산은 합성적으로 제조하거나 천연적으로 수득할 수 있거나, 또는 합성 핵산 성분과 천연 핵산 성분의 혼합물을 포함하고 각종 유기체의 각종 이종 유전자 절편으로 구성될 수도 있다.
상기 언급된 바와 같이, 바람직한 것은 식물에 의해 선호되는 코돈을 수반한 합성 뉴클레오티드 서열이다. 식물에 의해 선호되는 이들 코돈은 관심있는 대부분의 식물 종에서 발현되고 단백질에서 가장 높은 빈도를 나타내는 코돈으로부터 결정할 수 있다.
발현 카세트를 제조하는 경우에는, 각종 DNA 단편을 조작하여, 정확한 방향으로 적절하게 판독될 수 있고 정확한 판독 프레임이 제공된 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. 적응인자 또는 링커를 상기 단편에 부착시켜, 상기 DNA 단편들을 서로 연결시킬 수 있다.
더우기, 적당한 제한 절단 부위를 제공하거나 또는 과량의 DNA 또는 제한 절단 부위를 제거시켜 주는 조작법을 이용하는 것이 가능하다. 삽입, 결실 또는 치환, 예를 들면, 전이 및 염기변환이 적합한 경우에는, 시험관내 돌연변이 유발, 프라이머 수복, 제한 또는 연결을 사용할 수 있다.
바람직한 폴리아데닐화 시그널은 식물에서 기능적인 폴리아데닐화 시그널, 예를 들면, 아그로박테륨 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)로부터의 T-DNA 폴리아데닐화 시그널에 본질적으로 상응하는 시그널, 특히 T-DNA 유전자 3 (옥토핀 신타제) 또는 OCS 종결인자, Ti 플라스미드 pTiACH5의 완전한 서열 [참조: Gielen et al., EMBO J. 3, 835-846 (1984)], 또는 기능적 등가물의 시그널이다.
본 발명은 추가로, 야생형으로서 전분 또는 아밀로스를 생산할 수 있는 식물 (예를 들면, 감자 식물)에서 전분 또는 아밀로스 함량을 증가시키기 위한, 서열 번호 1 또는 3의 핵산의 용도에 관한 것이다 (실시예 2 내지 13 참조).
본 발명은 식물, 특히 감자 식물에서 서열 번호 1 또는 서열 번호 3의 핵산 서열의 과발현으로만 제한되지 않는다.
식물에서 서열 번호 1 및 3의 양 핵산 서열을 과발현시키는 것은 아밀로스 생합성을 증강시키기 위해 사용할 수 있다 (실시예 14 내지 16 참조). 서열 번호 1 및 서열 번호 3의 핵산을 함유하는 작제물은 식물에서 전분 함량 또는 아밀로펙틴 함량을 증가시키기 위해 사용할 수도 있다. 이들 작제물은 각각 하나의 프로모터에 의해 구동된 동일한 T-DNA 상에서 만들어질 수 있다. 이들 작제물은 또한, 동일한 프로모터에 의해 구동되어 직렬식으로 동일한 T-DNA 상에서 만들어질 수도 있따. 이들 작제물은 하나 이상의 작제물을 사용하여 동시에 형질전환시킬 수 있거나 (동시 형질전환) 또는 상이한 형질전환 사건으로 형질전환시킬 수 있다.
상기 언급된 단백질 및 핵산은 형질전환성 식물에서 전분 또는 아밀로스를 생성시키기 위해 사용할수 있다.
외래 유전자를 특정 유기체, 특히 식물의 게놈 내로 전이시키는 것이 형질전환으로서 지칭된다.
이를 위해, 일시적 또는 안정적인 형질전환을 위해 식물 조직 또는 식물 세포로부터 식물을 형질전환 및 재생시키는 것으로 공지된 방법을 특히 식물에서 사용할 수 있다.
식물을 형질전환시키는데 적합한 방법은 폴리에틸렌 글리콜-유도된 DNA 흡수에 의한 원형질체 형질전환, 유전자 총을 이용한 바이오리스틱 (biolistic) 방법 (입자 충격 방법으로서 공지됨), 전기천공, 무수 배아를 DNA-함유 용액 중에서 항온 배양하는 방법, 미세주사법, 및 상기 언급된 아그로박테륨에 의해 매개된 유전자 전이법이다. 상기 방법은, 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다 [참조: B.　Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol.　1, Engineering and Utilization, edited by S.D.　Kung and R.　Wu, Academic Press (1993), 128-143 and in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225].
발현시키고자 하는 작제물은 바람직하게는, 아그로박테륨 투메파시엔스를 형질전환시키는데 적합한 벡터, 예를 들면, pBin19 [참조: Bevan et　al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711] 또는 바람직하게는 pSUN2 (WO　02/00900) 내로 클로닝시킨다.
따라서, 본 발명은 추가로, 상기 언급된 핵산, 핵산 작제물 또는 발현 카세트를 함유하는 벡터에 관한 것이다.
발현 카세트로 형질전환시킨 아그로박테리아는 식물을 형질전환시키는 것으로 공지된 방식으로 사용할 수 있는데, 예를 들면, 상처난 잎 또는 잎 절편을 아그로박테륨 용액에 담근 다음, 이들을 적합한 배지 중에서 배양할 수 있다.
식물에서 형질전환을 수행하는 것과는 별개로, 세균, 특히 시아노박테리아, 이끼, 효모, 섬유상 진균 및 조류를 형질전환시키기 위해 발현 카세트를 사용할 수도 있다.
유전적으로 변형된 식물 (형질전환성 식물로서 후술되기도 함)은 바람직하게는, 전분 생합성 증강 단백질을 발현하는 융합된 발현 카세트를, 아그로박테륨 투메파시엔스 내로의 형질전환에 적합한 벡터, 예를 들면, pBin19 내로 클로닝함으로써 제조한다.
이어서, 이러한 벡터로 형질전환시킨 아그로박테리아는, 예를 들어, 상처난 잎 또는 잎 절편을 아그로박테륨 용액에 담근 다음, 적합한 배지 중에서 후속 배양함으로써, 식물, 특히 농작물을 형질전환시키는 것으로 공지된 방식으로 사용할 수 있다.
아그로박테리아에 의한 식물의 형질전환은 특히 문헌 [참조: F.F.　White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol.　1, Engineering and Utilization, edited by S.D.　Kung and R.　Wu, Academic Press, 1993, pages　15-38]에 기재되어 있다. 발현 카세트 내로 통합된, 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 핵산 발현용 유전자를 함유하는 형질전환성 식물은 상처난 잎 또는 잎 절편의 형질전환된 세포로부터 공지된 방식으로 재생시킬 수 있다.
발현 카세트를 재조합 벡터 (이의 벡터 DNA는 부가의 기능적 조절성 시그널, 예를 들면, 복제 또는 통합을 위한 서열을 포함한다) 내로 혼입 및 삽입시킴으로써, 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 서열 번호 1 또는 3의 핵산으로 숙주 세포를 형질전환시킨다. 적합한 벡터는 특히 문헌 [참조: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC　Press), chapter　6/7, pages　71-119 (1993)]에 기재되어 있다.
예시하자면, 식물 발현 카세트를 35s 프로모터를 수반한 형질전환용 벡터 pBin-19의 유도체 내로 혼입시킬 수 있다 [참조: Bevan, M., Nucleic Acids Research 12: 8711-8721 (1984)].
상기 인용된 재조합 및 클로닝 기술을 사용하여, 예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli)에서 유전 물질을 유지 및 증식시키는데 적합한 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 적합한 클로닝 벡터는 특히, pBR322, pUC 시리즈, M13mp 시리즈, pBluescript 및 pACYC184이다. 이. 콜라이와 아그로박테리아 둘 다에서 복제할 수 있는 이원 벡터가 특히 적합하다.
따라서, 본 발명은 추가로, 유전적으로 변형된 식물을 제조하기 위한, 또는 식물, 식물 세포, 식물 조직 또는 식물 부분을 형질전환시키기 위한, 상기 언급된 핵산의 용도, 또는 상기 언급된 핵산 작제물, 특히 발현 카세트의 용도에 관한 것이다.
이러한 용도는 바람직하게는, 식물, 식물의 괴경 또는 식물의 기타 부분에서 전분 또는 아밀로스 함량을 증가시키는 것을 목표로 한다.
상기 용도는 가장 바람직하게는, 야생형 또는 형질전환성 감자 식물, 특히 야생형 또는 형질전환성 감자 식물의 괴경의 전분 또는 아밀로스 함량을 증가시키는 것을 목표로 한다.
따라서, 본 발명은 추가로, 상기 언급된 핵산 또는 상기 언급된 핵산 작제물을 출발 유기체의 게놈 내로 도입함으로써, 유전적으로 변형된 식물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 유전적으로 변형된 유기체에 관한 것인데, 유전적 변형은 야생형 또는 형질전환성 식물과 비교해서 전분 생합성 증강 단백질의 활성을 증가시키는 것이고, 이러한 전분 생합성 증강 단백질은 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 아미노산 수준에 있어 서열 번호 2 또는 4의 서열과 50％ 이상 동일하고, 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 이들 서열로부터 유도되는 서열을 포함한다.
상기 예시된 바와 같이, 전분 생합성 증강 단백질 활성은, 바람직하게는 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 핵산의 유전자 발현을 증가시킴으로써, 야생형 또는 형질전환성 식물에 비해 증가된다.
추가의 바람직한 양태에서는, 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 핵산의 유전자 발현은, 상기 예시된 바와 같이, 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 핵산을 유기체 내로 도입함으로써 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 핵산을 과발현시킴으로써 증가된다.
이러한 형질전환성 식물, 이들의 증식 물질 및 이들의 식물 세포, 식물 조직, 식물 부분 또는 괴경은 본 발명의 추가의 주제이다.
전분 또는 아밀로스 함량이 증가되고 사람과 동물에 의해 소비될 수 있는, 본 발명의 유전적으로 변형된 식물은 예를 들어, 직접적으로 또는 자체 공지된 가공 처리 후에 식품 또는 식료품으로서 또는 사료 및 식품 보충물로서 사용될 수도 있다. 더우기, 본 발명의 유전적으로 변형된 식물은 이러한 식물의 전분 또는 아밀로스 함유 추출물을 생산하기 위해 및(또는) 사료 및 식품 보충물을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로, 다음에 관한 것이다:
I. 서열 번호 1 또는 3의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
II. 서열 번호 1 또는 3의 30개 이상의 연속되는 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
III. 전체 암호화 서열을 기준으로 하여, 서열 번호 1 또는 3과의 서열 동일률이 60％ 이상인 폴리뉴클레오티드.
IV. 전체 서열을 기준으로 하여, 서열 번호 1 또는 3과의 서열 동일률이 60％ 이상인 폴리뉴클레오티드.
V. 엄격한 조건 및 50℃ 하에 2X SSC 중에서의 세척 조건 하에서, 서열 번호 1 또는 3에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열로부터 유도 가능하거나 또는 게놈 서열로부터 유도 가능한 하이브리드화 프로브와 선택적으로 하이브리드화되는 폴리뉴클레오티드.
VI. V의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드.
VII. 전분 또는 아밀로스 생합성 증강 폴리뉴클레오티드가 솔라눔 튜베로숨으로부터 유래되는, I의 폴리뉴클레오티드.
VIII. 식물 세포에서의 과발현 후에 전분 또는 아밀로스 함량이 증가되는, 폴리펩티드를 암호화하는 I의 폴리뉴클레오티드.
IX. 식물 세포에서의 발현 후에 전분 또는 아밀로스 함량이 감소되는, 안티센스 배향의 I의 폴리뉴클레오티드.
X. I의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
XI. 프로모터에 작동적으로 연결된 I의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 [이러한 폴리뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 배향이다] 발현 카세트.
XII. X의 하나 이상의 발현 카세트가 도입된 숙주 세포.
XIII. 식물 세포인 XI의 숙주 세포.
XIV. XI의 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 형질전환성 식물.
XV. 솔라눔 튜베로숨인, XIII의 형질전환성 식물.
XVI. XIV의 형질전환성 식물로부터의 괴경.
XVII. (a) 서열 번호 2 또는 4의 10개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드,
(b) 식물 전분 생합성 증강 단백질인 폴리펩티드,
(c) 서열 번호 2 또는 4와의 서열 동일률이 55％ 이상인 폴리펩티드 [여기서, 서열 동일률은 전체 서열을 기준으로 한 것이고 전분 생합성 증강 단백질과 공통으로 하나 이상의 에피토프를 갖는다],
(d) 서열 번호 1 또는 3 중에서 선택된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드, 및
(e) 서열 번호 2 또는 4의 폴리펩티드
로 이루어진 군 중에서 선택된 구성원을 포함하는 분리된 단백질.
XVIII. 폴리펩티드가 촉매적으로 활성인, XVII의 단백질.
XIX. XVIII의 단백질을 암호화하는 리보핵산 서열.
XX. (a) 프로모터에 작동적으로 연결된 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 [이러한 폴리뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 배향이다]를 사용하여 특정 식물 세포를 안정적으로 형질전환시키는 단계; 및
(b) 이러한 식물 세포를, 상기 폴리뉴클레오티드을 발현시킬 수 있는 재생 식물을 생성시키는 식물 성장 조건 하에, 식물에서 전분 생합성 증강 단백질의 수준을 조정하기에 충분한 시간 동안 성장시키는 단계
를 포함하여, 식물에서 전분 생합성 증강 단백질의 수준을 조정하는 방법.
XXI. 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 1 또는 3 중에서 선택되는, XX의 방법.
XXII. 식물이 솔라눔 튜베로솜인, XX의 방법.
XXIII. 전분 생합성 증강 단백질의 활성이 증가되는, XX의 방법.
XXIV. (a) 프로모터에 작동적으로 연결된 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 [이러한 폴리뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 배향이다]를 사용하여 특정 식물 세포를 안정적으로 형질전환시키는 단계; 및
(b) 이러한 식물 세포를, 상기 폴리뉴클레오티드을 발현시킬 수 있는 재생 식물을 생성시키는 식물 성장 조건 하에, 식물에서 전분 또는 아밀로스의 수준을 조정하기에 충분한 시간 동안 성장시키는 단계
를 포함하여, 식물에서 전분 또는 아밀로스의 수준을 조정하는 방법.
XXV. (a) 프로모터에 작동적으로 연결된 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 [이러한 폴리뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 배향이다]를 사용하여 특정 식물 세포를 안정적으로 형질전환시키는 단계; 및
(b) 이러한 식물 세포를, 상기 폴리뉴클레오티드을 발현시킬 수 있는 재생 식물을 생성시키는 식물 성장 조건 하에, 식물에서 전분 또는 아밀로스의 수준을 조정하기에 충분한 시간 동안 성장시키는 단계
를 포함하여, 식물에서 전분 또는 아밀로스의 수준을 조정하는 방법.
XXVI. 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 서열 번호 1 또는 3 중에서 선택되는, XXIV의 방법.
본 명세서 상에 추가로 사용된 몇몇 용어들은 다음과 같이 규정된다.
"효소적 활성/활성 검정": 용어 효소적 활성은 특정 기질을 생성물로 전환시킬 수 있는 효소의 능력을 서술한 것이다. 이러한 맥락에서, 효소의 천연 기질과 천연 기질의 합성 변형 동족체 둘 다를 사용할 수 있다. 효소적 활성은 규정된 시간의 함수로서, 생성물의 증가, 출발 물질의 감소, 특이적 조인자의 감소 또는 증가, 또는 전술된 파라미터 중의 둘 이상의 조합을 통하여 활성 검정으로서 공지된 방식으로 결정할 수 있다.
본 맥락에서 "기능적 등가물"은 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 또는 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 일정 부분과 표준 조건 하에서 하이브리드화되고, 특정 세포 또는 유기체에서 효소적 활성 식물 전분 생합성 증강 단백질을 발현시킬 수 있는 핵산 서열을 서술한 것이다.
당업자에게 공지된 하이브리드화 방식으로 기타 관련 유전자와 비교함으로써 결정될 수 있는, 예를 들어, 보존된 영역 또는 기타 영역의 10 내지 50 bp, 바람직하게는 15 내지 40 bp 길이의 짧은 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 유리하다. 또 다른 한편, 본 발명에 따르는 핵산 또는 하이브리드화시키기 위한 완전한 서열의 보다 긴 단편을 사용하는 것도 가능하다. 이들 표준 조건은 사용된 핵산, 즉 올리고뉴클레오티드, 보다 긴 단편 또는 완전한 서열에 따라서 다양하거나, 또는 하이브리드화에 사용되는 핵산의 유형, 즉 DNA 또는 RNA인지에 따라서 다양하다. 따라서, 예를 들어, DNA:DNA 하이브리드에 대한 융점은 동일한 길이의 DNA:RNA 하이브리드의 융점 보다 대략 10℃ 정도 더 낮다. 적합한 하이브리드화 조건은 상기 언급되어 있다.
더우기, 기능적 등가물은 특히, 식물 전분 생합성 증강 단백질의 관련 핵산 서열의 천연 또는 인공 돌연변이물, 및 특정 세포 또는 유기체에서 효소적 활성 식물 전분 생합성 증강 단백질을 발현시킬 수 있는 기타 유기체로부터의 이들의 상동체를 의미한다.
따라서, 본 발명의 범주는 예를 들어, 전분 생합성 증강 단백질의 핵산 서열을 변형시킴으로써 수득되는 뉴클레오티드 서열로 연장되기도 한다. 이러한 변형의 목적은 예를 들어, 제한 효소에 대한 추가의 절단 부위를 삽입하거나, 과도한 DNA를 제거하거나, 또는 추가의 서열을 부가하는 것일 수 있다. 상기 핵산 서열을 통하여 암호화되는 단백질은 핵산 서열 상의 편위에도 불구하고 목적하는 기능을 여전히 유지해야 한다.
용어 기능적 등가물은 문제의 핵산 서열에 의해 암호화된 단백질을 지칭할 수도 있다. 이러한 경우, 용어 기능적 등가물은 아미노산 서열이 전분 생합성 증강 단백질의 서열과 특정 비율까지의 동일률을 나타내는 단백질을 서술한 것이다.
따라서, 기능적 등가물은 본원에 기재된 서열의 천연 변이체, 및 코돈 활용에 맞도록 적응시킨 인공적, 예를 들면, 화학적으로 합성된 핵산 서열, 또는 이로부터 유도된 아미노산 서열을 포괄한다.
일반적으로, 문제의 아미노산 서열 (상응하는 핵산 서열에 의해 암호화됨)과 독립적인 기능적 등가물은 각 경우에 있어 전분 생합성 증강 단백질의 효소적 활성을 지니고 있는 것으로 간주될 수 있다.
"리포터 (reporter) 유전자"는 정량화 가능한 단백질을 용이하게 암호화한다. 이들 유전자를 사용하여, 성장, 형광, 화학발광, 생물발광 또는 내성 검정을 통하여, 또는 광도측정 (고유 색상) 또는 효소 활성을 통하여, 형질전환 효능이나 발현 부위 또는 시간을 평가할 수 있다. 이와 관련하여 특히 바람직한 것은 리포터 단백질 [참조: Schenborn E, Groskreutz D. Mol. Biotechnol. 1999; 13(1): 29-44], 예를 들면, "그린 형광 단백질" (GFP) [참조: Gerdes HH and Kaether C, FEBS Lett. 1996; 389(1): 44-47; Chui WL et al., Curr. Biol. 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5): 912-8, 1997], 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 루시퍼라제 [참조: Giacomin, Plant Sci. 1996, 116: 59-72; Scikantha, J. Bact. 1996, 178: 121; Millar et al., Plant Mol. Biol. Rep. 1992 10: 324-414], 및 루시퍼라제 유전자, 일반적으로 b-갈락토시다제 또는 b-글루쿠로니다제 [참조: Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907], Ura3 유전자, liv2 유전자, 2-데속시글루코스-6-포스페이트 포스파타제 유전자, b-락타마제 유전자, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 또는 BASTA (= 글루포시네이트) 내성 유전자이다.
효소적 활성을 지칭하는 "상당한 증가"는 측정 오차 범위를 벗어난, 후보 화합물과 함께 항온 배양하지 않은 효소의 활성과 비교해서, 후보 화합물과 함께 항온 배양된 효소의 효소적 활성 상의 증가를 의미한다.
"기질": 기질은 본래 기능의 효소에 의해 인식되고 효소에 의해 촉매된 반응을 통하여 생성물로 전환되는 화합물이다.
바람직하게는, 식물 전분 생합성 증강 단백질은
a) 서열 번호 1 또는 3에 제시된 핵산 서열; 또는
b) 유전 암호의 다의성 (degeneracy)으로 인해, 역해독에 의해 서열 번호 2 또는 4에 제시된 아미노산 서열로부터 추론될 수 있는 핵산 서열; 또는
c) 유전 암호의 다의성으로 인해, 서열 번호 2 또는 4와의 동일률이 50％ 이상인, 역해독에 의해 서열 번호 2 또는 4에 제시된 아미노산 서열의 기능적 등가물로부터 추론될 수 있는 핵산 서열
을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된다.
c)에 제시된 서열 번호 2 또는 4의 기능적 등가물은 서열 번호 2 또는 4와의 동일률이 50％, 51％, 52％, 53％, 54％, 55％, 56％, 57％ 이상, 바람직하게는 58％, 59％, 60％, 61％, 62％, 63％, 64％, 65％, 66％, 67％, 68％, 69％, 및 70％ 이상, 보다 바람직하게는 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 가장 바람직하게는 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상이다.
전분 생산을 위해 사용된 감자 품종 뿐만 아니라 고 아밀로스 함량을 지닌 유전자형을, 전분 생합성 증강 단백질의 과발현을 위해 상기 언급되고 실시예 17에 기재된 바와 같은 유전자 작제물로 형질전환시킨다. 감자 식물에서 StGH1 또는 StGH2를 과발현시키면, 출발 식물과 비교해서 형질전환성 식물의 전분 또는 아밀로스 함량이 증가될 것이다. 이러한 형질전환성 계통에서의 전분 함량의 증가는 표 9를 참조할 수 있다. 상기 계통은 또한, 온실에서 성장시킨 경우에 수확 중량 증가를 나타내므로 (표 6), 전분 수율이 증가된다.
실시예 1
효모에서의 상보성 연구
효모는 글리코겐 합성을 개시하기 위한 프라이머를 생산하는 2개의 자가-글리코실화 단백질 Glg1p 및 Glg2p를 함유하고 있다. 효모에서 글리코겐 합성을 수행하기 위해서는, 어느 한 유전자가 기능적이어야 한다. 효모 균주 CC9는 양 유전자에 대한 녹-아웃 돌연변이물을 함유하므로, 이러한 특이적 생합성 기능에 관한 기능없는 (null) 돌연변이체이고, 이에 따라 글리코겐을 생산할 수가 없다 [참조: Cheng, C. et al., Molecular and Cellular Biology (1995), 6632-6640]. CC9는 CC9 균주에서 글리코겐 생합성을 복원함으로써 이들의 기능을 실증하기 위해 분리된 감자 유전자를 이용한 상보성 실험에 대한 기준물로서 사용되었다. 이러한 감자 유전자를 효모 플라스미드 pRS414 (공급처: Stratagene)에서 클로닝하고, 각종 효모 제어 요소, 예를 들면, Gal1, Adh1 및 Glg2p 프로모터를 사용하여 발현시켰다. CC9를 LiCl 및 전기천공 (Multiporator, Eppendorf)을 사용하여 상기와 같이 생성된 플라스미드에 의해 형질전환시켰다. 적당한 배지 판 상에서 성장하는 형질전환된 효모 콜로니를 요오드 용액에 침지시킴으로써 스크리닝하였다. 글리코겐을 생산하는 야생형 효모는 요오드에 의해 적갈색으로 염색되는 반면, 기능없는 돌연변이체 CC9는 염색되지 않았다. 분리된 유전자가 효모에서 글리코게닌 기능을 보완하여 목적하는 기능을 수반하는 경우에는, 감자 유전자 StGH1 및 StGH2를 발현하는 CC9가 적갈색으로 염색될 것이다.
실시예 2
형질전환 방법
시험관내 증식된 감자 식물로부터의 완전히 팽창된 잎을 대각선으로 2 내지 4 조각으로 절단시키고, 23 내지 24℃ 하에 MC-판 상에서 2 내지 3일 동안 예비배양하였다.
pHS1, pHS2, pHS3 pHS4, pHASHS2, pHASHS4, pHASHS5, pHASHS6, pHASHS7 또는 pHASHS8을 함유하는 아그로박테륨 투메파시엔스 균주 LBA4404를, 28℃ 하에 일정하게 진탕시키면서 (200 rpm) 100 ㎍ 리팜피신과 25 ㎍/ml 카나마이신이 보충된 YEB 배지에서 밤새 성장시켰다.
상기 아그로박테륨 배양물은 MS10 배지를 사용하여 1:20으로 희석시킴으로써 감염용으로 준비하였다. 잎 팽창물을 상기 세균성 용액 중에서 8 내지 10분 동안 감염시킨 후, 필터지 상에서 5 내지 20분 동안 배수시켰다. 잎 세그먼트를 23 내지 24℃ 하의 적당한 광 조사 하에 MS300 판 위에 놓아 두어 2일 동안 동시 배양시켰다. 동시 배양이 끝날 무렵, 잎 세그먼트를, 400 g/l 클라포란 (Claforan)을 함유하는 M400 판으로 옮겨 세균 성장을 억제시켰다. 4 내지 5일 후, 상기 팽창물을, 400 g/l 클라포란이 보충된 선별 배지 MS400에 옮겼다. pHS1 및 pHS2로 형질전환시킨 팽창물의 경우에는, 50 μM 카나마이신을 상기 배지에 포함시켰고, pHS3, pHS4, pHASHS2, pHASHS4, pHASHS5, pHASHS6, pHASHS7 및 pHASHS8로 형질전환시킨 팽창물의 경우에는, 0.5 M 이마자목스를 상기 배지에 부가하였다. 잎 세그먼트를 2주마다 신선한 MS 400 선별 배지에 옮겨 놓았다. 추정상의 재생 형질전환성 어린 가지를 수집하고, 어린 가지 신장을 위해 200 g/l 클라포란을 수반한 MS300 판 상에서 배양하였다.
어린 가지의 길이가 3 내지 5 cm로 되면, 1 내지 2 cm를 절단시켜 제거하고, 이를 25℃ 하의 암실에서 미소-괴경 (microtuber) 배지 상에서 성장시켰다. 2 내지 5주 후, 미소-괴경이 생성되었다.
MC 플레이트액체 MS 100 배지 1.5 내지 2 ml를 함유하며, 멸균 여과지 1장으로 덮은 MS 300 플레이트 MS300MS-배지 4.4 g/ℓ나프틸 아세트산 2 mg/ℓ6-벤질 아미노 피리딘 1 mg/ℓ3 중량/부피％ 슈크로스pH 5.2
MS10MS-배지 (무라시게 및 수쿠그(murashige and Skoog)) 4.4 g/ℓ1 중량/부피％ 슈크로스pH 5.8 MS400MS-배지 4.4 g/ℓ제아틴 2 g/ℓ나프틸 아세트산 0.01 mg/ℓ지베렐산 0.1 mg/ℓ10 중량/부피％슈크로스 클라포란 400 mg/ℓ0.5 μM 이마자목스 또는 50 μM 카나마이신pH.8
MS30MS-배지 4.4 g/ℓ3 중량/부피％ 슈크로스pH 5.8 미소-괴경 배지MS-배지 4.4 g/ℓ키네틴 2.5 mg/ℓ아브시스산 0.5 mg/ℓ8％ 슈크로스200 mg/클라포란
MS100MS-배지 4.4 g/ℓ슈크로스 30/ℓ티아민-HCl 0.5 mg/ℓ피리독신-HCl 0.5 mg/ℓ니코틴산 1 mg/ℓ키네틴 0.5 mg/ℓ황화제일철 7수화물 29.8 mg/ℓ2,4-디클로로페녹시아세트산 1 mg/ℓ카세인가수분해물 2 g/ℓpH 5.2
실시예 3
형질전환성 식물 AM 99-2003
예를 들어, 2개의 전분 분지화 효소인 전분 분지화 효소 1 (SBE1) 및 전분 분지화 효소 2 (SBE2)를 표적으로 하는 안티센스, RNAi 또는 항체 기술을 사용함으로써, 고 아밀로스 감자 계통을 생성시킬 수 있다.
고 아밀로스 감자 계통 AM99-2003은 모 계통 디나모 (Dinamo)에서 전분 분지화 효소 활성을 억제함으로써 생성시켰다. 형질전환은 gbss 프로모터에 의해 구동된 안티센스 배향으로 SBE1 및 SBE2의 작제물을 이용하여 이루어졌다.
EcoRV와 SpeI 사이의 Sbe1의 3' 말단의 1620 bp 단편을 함유하는 pBluescript를 SpeI (평활) 및 XbaI로 절단시켜 개방시키고, Sbe2의 3' 말단의 1243 bp SstI (평활) 및 XbaI 단편에 연결시켰다. Sbe2 및 Sbe1 복합체를 EcoRV 및 XbaI로 절단시키고, SmaI 및 XbaI로 개방시킨 이원 벡터 pHo3.1에 연결시켰다 (도 8 참조). 최종 벡터는 pHAbe12A로 명명하였다 (도 9 및 서열 번호 15의 핵산 서열 참조). pHo3.1은 pGPTVKan의 HindIII에서 클로닝된 987 bp gbss 프로모터가 부가된 pGPTVKan [참조: Becker, D. et al., Plant Molecular Biology 20 (1992), 1195-1197]에 기초한 것이고, uidA 유전자는 SmaI 및 SstI에 의해 결실시켰다.
모 계통 디나모는 실시예 2에 기재된 바와 같이 작제물 pHAbe12A를 사용하여 형질전환시켰다.
실시예 4
안티센스에 의한 감자에서의 StGH1 및 StGH2 유전자의 하향-조절
StGH1 및 StGH2 유전자는, 식물 조절성 요소에 관해 안티센스 방향으로 이들 유전자로 형질전환시킴으로써 감자에서 하향 조절하였다. 각각의 안티센스 유전자를, 괴경 특이적 gbss 프로모터에 의해 구동된 이원 벡터에서 클로닝하였다. 항생제 카나마이신에 대한 내성을 야기시키는 NptII을 선별 마커로서 사용하였다. 2개의 품종 "프레발렌트"와 "프로듀센트"를 형질전환시켰다. 감자 형질전환을 위해 사용된 표준 카나마이신 농도인 50 μM 카나마이신 상에서 어린 가지를 선별하였다 [참조: Ooms, G et al., Theoretical and Applied Genetics 73: 744-750 (1987) and Tavazza, R. et al., Plant Science 59 (1988), 175-181].
실시예 5
감자에서 StGH1 및 StGH2 유전자의 과발현
StGH1 및 StGH2 유전자를 괴경 특이적 프로모터 gbss에 의해 구동된 감자에서 과발현시켰다. 이마자목스 제초제에 대한 내성을 야기시키는 선별 마커로서, 돌연변이된 AHAS 유전자를 사용하였다. 모 계통과 비교해서 전분 함량이 40％ 감소된 형질전환성의 고 아밀로스 계통인 2개의 감자 품종 AM99-2003 및 "데시레"를 형질전환시켰다.
실시예 6
형질전환성 계통의 선별
비-형질전환성의 야생화한 것 (escapes)를 동정하고, PCR 스크리닝 방법에 의해 경사 제거하였다. DNA를 DNeasy 96 플랜트 프로토콜 (Qiagen)에 따라서 추출하였다. 96 웰 미세역가 판에서, 10 내지 15 mg 잎 조직을 5 mm 강철 볼과 함께 각 웰에 부가하였는데, 이때 각 웰은 1개의 개별적인 어린 가지를 나타낸다. 균질화시키기 전에, 상기 판을 N2(I)에서 동결시켰다. 믹서밀 (Mixermi11)300에서 30 Hz 하에 1분 동안 균질화를 수행하였다. DNA는 추출 프로토콜이 끝날 무렵에 75 ㎕ H2O에서 용출시켰다.
성공적으로 형질전환된 계통을 선별하기 위한 509 bp 단편 각각에 대해 246 bp 단편을 증폭시키기 위해, nptII 및 AHAS에 특이적인 프라이머를 사용하였다.
Npt2_정배향 5'-AGCAAGGTGAGATGACAGGAGATC-3'
Npt2_역배향 5'CAGACAATCGGCTGCTCTGATG-3'
AHAS1_정배향: 5'-AACAACAACATCTTCTTCGATC-3'
AHAS1_역배향: 5'-TAACGAGATTTGTAGCTCCG-3'.
추출된 DNA 구성과 수행을 이용하여 다음과 같이 PCR 반응시켰다:
반응:
10x PCR 혼합물 2.0 ㎕
정배향 프라이머 (25μM) 0.4 ㎕
역배향 프라이머 (25μM) 0.4 ㎕
dNTP (10 mM) 0.4 ㎕
RedTAQ (Sigma) 1.0 ㎕
주형 (약 20 ng/㎕) 4.0 ㎕
H2O 11.8 ㎕.
PCR 프로그램:
94℃ 30s
59℃ 30s x29 주기
72℃ 30s
72℃ 7분
8℃ 방치
실시예 7
유전자 발현 분석
StGH1 및 StGH2 유전자의 유전자 발현 수준을 형질전환성 감자 계통에서 실시간 PCR (ABI 프리즘 7900HT, Applied Biosystems)로 분석하였다. 실시간 PCR을 사용하여, RNA 발현 수준에 관한 유전자 발현 변화를 분석할 수 있다. pHS1 및 pHS2 형질전환성 계통에 대해서는, StGH1 및 StGH2의 센스 RNA와 안티센스 RNA 둘 다의 발현을 측정한 반면, pHS3 및 pHS4 형질전환성 계통에 대해서는, StGH1 및 StGH2 mRNA 발현 상의 변화를 분석하였다.
pHS1 및 pHS2에 대한 표적은 StGH1 및 StGH2 각각의 전사체 수준을 감소시키는 것인 반면, pHS3 및 pHS4에 대한 표적은 각각의 유전자의 전사체 수준을 증가시키는 것이다.
인비소르브 (Invisorb) 스핀 플랜드-RNA 미니 키트 (Invitek)를 사용하여 형질전환성 감자 계통과 모 품종의 미소-괴경으로부터 RNA를 분리하였다. TaqMan 역전사 시약 (공급처: Applied Biosystems)을 사용하여 총 25 ㎕의 RNA 반응 용적 중의 250 ng 총 RNA을 이용하여 역전사 반응을 수행하였다. 별개의 특이적 프라이머 (표 1 참조)를 고안하고 역전사 반응에 사용하여, 내인성 발현을 각각의 유전자의 안티센스 RNA 발현과 구별할 수 있게 되었다.
5 ㎕의 역전사 반응물을 특이적 서열 탐지용 프라이머, TaqMan MGB 프로브 (표 2 참조) 및 UMM 마스터믹스 (mastermix) (공급처: Appiied Biosystems)와 함께 삼중 분석에 사용하고, 공급업자의 지시에 따라서 실시간 PCR로 결정하였다.
상기 2가지 유전자를 하향 조절시키면, 형질전환성 계통에서의 유전자 발현이 이들의 모 품종과 비교해서 50 내지 95％ 정도 저하되었다.
2가지 유전자를 과발현시키면, 형질전환성 계통에서의 유전자 발현이 이들의 모 품종과 비교해서 2 내지 10배 정도 증가하였다.
실시예 8
무수 성분 분석
유전자의 과발현 또는 하향 조절을 나타내는 pHS1, pHS2, pHS3 및 pHS4로 형질전환시킨 형질전환성 계통으로부터의 미소-괴경 상에서 무수 성분을 분석하였다. 전분은 통상적으로, 감자 괴경에서 무수 성분의 80％ 이상에 기여하기 때문에, 전분 함량의 증가 또는 감소가 무수 성분 함량에 또한 영향을 미칠 것이다.
각 계통으로부터의 2개의 미소-괴경이 성숙기에 도달하게 되면, 이들을 수확하였다. 60℃ 하에 건조시키기 전 및 72시간 후에 칭량된 성숙한 미소괴경에 대한 무수 성분을 산정하였다. 품종 디나모로부터의 미소괴경과 비교하기 위하여, 전분 함량이 13 내지 28％ (야외에서 성장시킨 경우)인 "데시레", "프레발렌트", "프로듀센트" 및 P737을 사용하였다. 미소괴경의 전분 함량은 야외에서 성장한 괴경의 전분 함량 만큼 높지 않았다. 그러나, 무수 성분 함량은 미소괴경에서 용이하게 비교할 수 있으며, 이러한 값은 야외에서 성장한 괴경에서 측정한 전분 함량과 상관 관계가 높았다. 표 4에서는 10개 이상의 미소괴경을 대상으로 하여 산정한, 상이한 품종에 대한 평균 무수 성분 함량이 제시되었다:
유전자 발현이 저하된 것으로 확인된 각 pHS1 및 pHS2 중의 하나를 대상으로 하여 무수 성분에 대해 분석하였다. 이들은 이들의 모 품종과 비교해서 무수 성분이 7 및 11％ 정도 감소하였다.
과발현된 것으로 확인된 9가지 계통 중의 8개의 pHS3 계통에 대해서는 무수 성분이 36％ 정도까지 증가한 것으로 나타났다 (표 5 참조).
실시예 9
전분 함량 분석
전분 함량을 분석하기 위해, 공급업자 [Megazyme Interational Ireland Ltd., Bray, Co. Wicklow, Ireland (AOAC Method 996.1; AACC method 76.13; ICC standard method No. 168)]의 지시에 따라서 총 전분 검정 과정을 사용하였다.
pHS1, pHS2, pHS3 및 pHS4로 형질전환시킨 모든 형질전환성 계통으로부터의 미소괴경 상에서 전분 함량을 분석하였다. 미소괴경이 성숙기에 도달하게 되면 이들을 수확하였다. 성숙한 미소괴경을 분쇄시키고 말토삭카라이드와 자유 글루코스 잔기를 에탄올로 세척 제거하였다. 미소괴경 전분을 DMSO로 처리하여, 고 아밀로스 클론으로서 고 수준의 내성 전분을 지닌 샘플의 완전한 가용화를 보장하였다.
표준 분광광도 검정 과정을 이용하여 샘플을 분석하였다. 형질전환성 계통을, 전분 함량이 8 내지 30％인 것으로 공지된 감자 품종과 비교하였다. 그 결과, 전분 함량 상의 변화는 상이한 형질전환성 계통의 유전적 변형과 관계가 있는 것으로 나타났다.
실시예 10
온실 시도
온실에서 성장한 pHS3 및 pHS4 형질전환성 계통과 이들의 모 품종을 대상으로 하여 수확 중량과 무수 성분 함량을 측정하였다. 10개의 온실 성장한 화분으로부터 수확한 중량을 측정하였다 (표 6 참조).
수확 중량은 모 품종과 비교해서 형질전환성 계통에서 43％ 까지 증가하였다. 이 결과는 StGH1과 StGH2를 과발현시키면 총 수확 중량이 증가한다는 것을 보여주었다.
온실에서 성장한 계통을 대상으로 하여 무수 성분 함량을 분석하였다. 각 계통의 3개 괴경 박편을 건조시키기에 앞서 및 건조시킨 후에 칭량하면서, 이들 박편을 동결 건조기에서 72시간 동안 건조시켰다. 무수 성분 결과는 표 7에 제시되었고, 이는 3회 분석의 평균값으로 나타내었다.
StGH1 또는 StGH2 유전자를 과발현하는 형질전환성 계통의 분석 결과는 무수 성분 함량이 이들 각각의 모 계통과 비교해서 증가하였다는 것을 보여주었다. 표 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 무수 성분은 StGH1 유전자를 과발현하는 계통에서 26％ 정도까지 증가하였다. 이러한 무수 성분 상의 증가는 모 계통으로서 AM99-2003을 사용하는 경우에 보다 더 두드러졌다. 이는 AM99-2003이 고 아밀로스 형질의 결과로서 상당 량의 유효 당을 함유하고 있다는 사실 때문이다 (도 2 참조). 또한, StGH2를 과발현하는 계통에서는 무수 함량이 증가하였다. 이러한 증가 역시 AM99-2003을 모 계통으로서 사용하는 경우에 보다 높았다. StGH2를 과발현하는 계통은 무수 함량이 10％ 정도까지 증가하였다.
실시예 11
형질전환성 감자 계통의 야외-시도
실시예 5 내지 10에서 언급된 바와 같은 형질전환성 계통을 대상으로 하여, 이들의 모 계통과 전분 생산을 위해 사용된 기타 품종과 관련하여 농경학적 성능을 결정하기 위해 야외 시도로 시험하였다. 전분 가공 처리을 위해 사용되는 농작물에 대해 중요한 농경학 요인인 전분 함량은 몇 가지 상이한 방법에 의해 측정할 수 있다.
물 속에서 괴경을 칭량하는 것은 욕조 (목욕통)에서 일정 규모로 수행하였다. 표준 과정에 따라서 전분 함량을 결정하였다. 본 측정을 위해 5 kg의 감자를 사용하였고 전분 함량은 식: 전분 함량 (％) = (전분 밀도 - 1.01506)/0.0046051에 따라서 산정하였다. 전분 함량의 증가는 샘플의 밀도 증가와 연관이 있었다. 괴경에서의 전분 증가는 무수 성분 함량 증가와 연관이 있었는데, 이는 조직의 신선한 중량을 105℃ 하의 오븐 속에서 16시간 동안 광범위하게 탈수시킨 후의 조직 무수 중량과 비교함으로써 측정할 수 있다.
전분 함량은 실시예 9 및 12에서 전분 함량 분석 항목에 기재된 바와 같은 효소적 방법에 의해 측정할 수도 있다.
실시예 12
야외-시도 결과
StGH1 또는 StGH2를 과발현하는 5가지 계통을 삽목 (cuttings)으로서 야외에서 성장시켰다. 성장 기간은 6월에서부터 9월까지이다. 수확 후, 상기 계통을 대상으로 하여 무수 성분 함량, 전분 함량 및 당 함량을 분석하였다 (표 8 내지 10의 결과 참조).
15 g의 으깬 감자 (블렌더에서 제조됨)를 105℃ 하의 팬 가열 오븐 속에서 16 내지 18시간 동안 건조시킴으로써 무수 성분 함량을 분석하였다. 측정하기 전에 샘플을 엑시케이터 (exicator)에서 실온이 되도록 냉각시켰다.
야외에서 성장한 괴경으로부터의 전분 함량은 열안정한 α-아밀라제를 사용함으로써 문헌 [참조: P. Aman et al. Methods in Carbohydrate Chemistry Vol. X. 1994, pp.111-115]에 기재된 효소적 방법에 따라서 분석하였다. 에탄올 (80％)에서 희석시키고 열안정한 α-아밀라제 및 아밀로글루코시다제에 의해 분해시킨 괴경의 분쇄 및 건조된 샘플 상에서 이중 분석을 수행하였다. 전분 양은 글루코스 옥시다제 반응에 의해 결정하였다.
문헌 [참조: Georg Fuchs et al., Swedish J. Agric. Res. 4: 49-52, 1974, Quantitative determination of low-molecular carbohydrates in foods by gas-liquid chromatography]에 기재된 방법에 의해 기체-액체 크로마토그래피함으로써, 프럭토스, 글루코스 및 슈크로스의 농도를 결정하였다.
표 8에서 알 수 있는 바와 같이, StGH1 또는 StGH2를 과발현하는, 야외에서 성장한 형질전환성 계통은 무수 성분이 7％ 정도까지 증가하였다. 이러한 계통은 또한 표 9에서 알 수 있는 바와 같이 전분 함량의 증가를 나타내었다. 모 계통으로서 AM99-2003을 사용한 계통에 대해서 가장 높은 증가가 관찰될 수 있었다. 이는 고 아밀로스 모 계통에서 유효 당을 입수하였기 때문이다 (도 2).
추가로, 모 계통으로서 AM99-2003을 수반한 계통에서 당 농도를 분석하였다. AM99-2003은 고 아밀로스 형질로 인해 고 분획의 유효 당을 함유하고 있다. StGH1 또는 StGH2 유전자를 과발현하는 계통에서는 글루코스의 농도가 모 계통에서 분석된 양의 1/3로 감소하였으며, 슈크로스 농도는 3/4로 감소되었다 (표 10 참조). StGH1 또는 StGH2 유전자를 과발현하는 계통에서 보다 낮은 당 농도는, 보다 많은 양의 글루코스와 슈크로스가 전분 생합성 과정에 혼입되어 이들 형질전환성 계통에서 전분 함량의 증가를 가져다 준다는 것을 나타낸다.
실시예 13
StGH1 또는 StGH2 유전자를 과발현하는 계통의 현미경적 검사
모 계통으로서 AM99-2003을 수반한 StGH1 또는 StGH2 유전자를 과발현하는 형질전환성 계통의 야외 성장한 괴경을 대상으로 하여, 전분을 요오드로 염색함으로써 [Lugol's 용액 (6.7 g/l KI + 3.3 g/l I2) 및 글리세롤 1: 1] 전분 과립 형태에 대해 검사하였다. 괴경 조각을 파쇄시키고, 몇 방울의 요오드 용액을 가하였다. 전분 과립 구조를 현미경으로 검사하였다. 도 10으로부터 알 수 있는 바와 같이, 전분 과립은 고 아밀로스 모 품종 AM99-2003 내의 과립 내부를 향해 부서졌다. 이와는 대조적으로, StGH1 또는 StGH2 유전자를 과발현하는 형질전환성 계통으로부터의 전분 과립 (도 11 및 12 참조)은 보다 크고 외형이 원형이었다. 이는 StGH1 또는 StGH2 유전자의 과발현에 따른 결과로서 과립 내에 혼입된 전분 양이 증가하였기 때문이다.
실시예 14
전분 개시와 관련된 유전자의 조합 발현
StGH1과 StGH2를 상이한 방식으로 조합할 수 있다. 이들 유전자는 동일한 T-DNA 상에서 조합할 수 있거나, 또는 별개의 T-DNAs 상에 위치시킬 수 있다. 이들 유전자를 동시-형질전환시키기 위해 사용할 수 있거나, 또는 형질전환성 계통을 교잡함으로써 조합할 수 있다.
실시예 15
SBE1 및 SBE2를 억제시키고 StGH1 또는 StGH2를 과발현시키기 위한 조합 작제물
고 전분 함량을 함유하는 고 아밀로스 계통을 생산하기 위한 작제물을 제조하였다. StGH1 또는 StGH2를 과발현시키기 위한 작제물 pHASHS2, pHASHS4, pHASHS5 및 pHASHS6을 제조하였다. 모드 pHASHS 작제물은 또한, 안티센스 기술 또는 RNA 간섭 기술 (RNAi)을 사용하여 각각의 유전자를 하향 조절하기 위해 be1 및 be2 단편을 함유하고 있다. SBE1 및 SBE2 유전자의 하향 조절은 아밀로펙틴 생합성을 억제시키고, 아밀로스 생산이 증가되는 방식으로 전분 생합성이 이루어지게 하였다. 모든 작제물은 이원 벡터 pSUNA-HASmodb에 기초하였다. RNAi 작제물은 벡터 pHAS8b에 기초하였고, 안티센스 작제물은 벡터 pHAS4b에 기초하였다.
pHASHS2, pHASHS4, pHASHS5 또는 pHASHS6을 사용하여 전이시킨 식물은 고 아밀로스 계통을 생산하였다. 이로써 생성된 형질전환성 계통에서의 전분 함량은 StGH1 또는 StGH2 유전자를 과발현하지 않는 고-아밀로스 계통에서의 전분 함량 보다 높았다. 상기 언급된 pHS3 및 pHS4 계통에 대해 알 수 있는 바와 같이 전분 함량은 동일한 범위 내였다.
실시예 16
SBE1 및 SBE2를 억제시키고 StGH1 및 StGH2를 과발현시키기 위한 조합 작제물
고 전분 함량을 함유하는 고 아밀로스 계통을 생산하기 위한 작제물을 제조하였다. StGH1 및 StGH2를 과발현시키기 위한 작제물 pHASHS7 및 pHASHS8을 하나의 식물에서 함께 제조하였다. 모든 pHASHS 작제물은 또한, 안티센스 기술 또는 RNA 간섭 기술 (RNAi)을 사용하여 각각의 유전자를 하향 조절하기 위해 SBE1 및 SBE2 단편을 함유하고 있다. SBE1 및 SBE2 유전자의 하향 조절은 아밀로펙틴 생합성을 억제시키고, 아밀로스 생산이 증가되는 방식으로 전분 생합성이 이루어지게 하였다. 모든 작제물은 이원 벡터 pSUNA-HASmodb에 기초하였다. RNAi 작제물은 벡터 pHAS8b에 기초하였고고, 안티센스 작제물은 벡터 pHAS4b에 기초하였다.
pHASHS7 및 pHASHS8을 사용하여 형질전환시킨 식물은 고 아밀로스 계통을 생산하였다. 이로써 생성된 형질전환성 계통에서의 전분 함량은 StGH1 및 StGH2 유전자를 함께 과발현하지 않는 고-아밀로스 계통에서의 전분 함량 보다 높았다.
실시예 17
벡터 작제
pSUNAHASmodb의 작제
선별 마커로서 돌연변이된 AHAS 유전자를 수반한 pSUN1에 기초한 이원 벡터를 작제하였다. 이 벡터는 형질 유전자를 추가로 클로닝하기 위해 사용하였다.
nos 프로모터를 함유하는 608 bp 단편을, HindIII 및 BglII를 사용하여 pGPTV-kan으로부터 절단시키고, 이를 HindIII 및 BamHI로 절단 개방시킨 pUC19 (Invitrogen)에 연결하였다. nos 종결인자 (275 bp)를, SstI 및 EcoRI을 사용하여 pGPTV-kan으로부터 절단시키고, SstI 및 EcoRI 부위 사이에 연결하였다. QuikChange 멀티 부위 지시된 돌연변이유발 키트 (Stratagene)를 사용하여 제한 부위 HindIII, EcoRV, BamHI, EcoRI 및 SstI을 제거함으로써, 문헌 [참조: Sathasivan et al (1991)]에 기재된 AHAS 유전자 (S653N)를 최적화하였다. 부가의 제한 부위 KpnI 및 SstI을 상기 유전자의 3' 및 5' 말단에 부가하였다. 이 유전자는 AtAHASmod로 명명되었다 (도 22, 서열 번호 16). AtAHASmod를 KpnI 및 SstI (약 2019 bp)로 절단시키고, KpnI-SstI에서 nos 프로모터와 nos 종결인자 사이에 연결하였다. 상기 복합체를 HindIII (평활) 및 EcoRI (2900 bp)를 사용하여 pUC19로부터 절단시키고, EcoRI 및 SmaI에서 pSUN1에 연결하였다. 이 벡터는 pSUNAHASmodb로 명명되었다 (도 19 참조).
pHAS8b의 작제
분지화 효소 유전자를 하향 조절하기 위한 be1 및 be2 단편 (서열 번호 20)을 수반한 RNAi 작제물 pHAS8b는, 선별 마커로서 돌연변이된 AHAS 유전자 (서열 번호 16)를 수반한 pSUN1에 기초한 이원 벡터 pSUNAHASmodb (도 19)에서 작제하였다. 스페이서로서 be2 프로모터의 단편을 사용하였다 (서열 번호 18). 이 벡터는 StGH1 (서열 번호 1) 및 StGH2 (서열 번호 3) 유전자를 이용하여 클로닝 확대하기 위해 사용하였다.
RNAi420be2be1로 명명된 pBluescript에서 합성적으로 생성된 400 bp (서열 번호 19)의 be2 (200 bp) 및 be1 (200 bp) 단편을 HindIII (평활) 및 SalI (3331 bp)으로 개방시켰다. 스페이서로서 사용하기 위한, be2 프로모터의 262 bp 단편 (서열 번호 18)을 BglII (평활) 및 SalI로 분해시키고, 상기 벡터에 연결시키고, 이를 pMA17로 명명하였다.
400 bp RNAi420be2be1 단편을 다시 사용하고, 이를 XhoI (평활) 및 KpnI (3582 bp)로 개방시킨 pMA17에 역방향으로 연결하였다. 이 작제물은 pMAl8로 명명하였다. pMAl8을 SpeI 및 KpnI (1120 bp)로 분해시키고 이 단편을 XbaI 및 KpnI (3924 bp)에서 pUC19 내의 gbss 프로모터와 nos 종결인자 사이에 연결시켰다. 이 작제물은 pMA19b로 명명되었다. pMA19b를 PvulI 및 HindIII (2390 bp)로 분해시키고, SphI (평활) 및 HindIII (8932 bp) 사이에서 이원 벡터 pSUNAHASmodb (도 19)에 연결하였다. 이 작제물은 pHAS8b로 명명되었다 (도 20 참조).
pHAS4bA의 작제
SBE1 및 SBE2를 하향 조절하기 위한 안티센스 단편을 수반한 벡터 pHAS4b를, 선별 마커로서 돌연변이된 AHAS 유전자 (서열 번호 16)을 수반한 pSUN1에 기초한 이원 벡터 pSUNAHASmodb (도 19)에서 작제하였다. 이 벡터는 StGH1 및 StGH2 유전자의 클로닝을 확대시키기 위해 사용하였다.
gbss 프로모터 및 nos 종결인자와 함께 be1 및 be2의 안티센스 단편을, BsrBI 및 HindIII (4299 bp)를 사용하여 pHAbe12A (도 9, 서열 번호 15)로부터 절단시키고, SphI (평활) 및 HindIII (8932 bp)로 분해시킨 pSUNAHASmodb (도 19)에 연결하였다. 이 작제물은 pHAS4b로 명명되었다 (도 21 참조).
pHASHS5의 작제
StGH1 유전자, gbss 프로모터 및 nos 종결인자를 pHS3 (도 6)으로부터 분해시키고, 이를 be1 및 be2의 단편을 함유하는 RNAi 작제물 pHAS8b (도 20) 내로 클로닝하였다.
StGH1 유전자, gbss 프로모터 및 nos 종결인자를, DraI 및 EcoRV (3160 bp)를 사용하여 pHS3으로부터 절단시켰다. 이 단편을 EcoRV (1140 bp)로 개방시킨 pHAS8b에 연결하였다. 이 작제물은 pHASHS5로 명명되었다 (도 15 참조).
pHASHS6의 작제
StGH2 유전자, gbss 프로모터 및 nos 종결인자를 pHS4 (도 7)로부터 분해시키고, 이를 be1 및 be2의 단편을 함유하는 RNAi 작제물 pHAS8b (도 20) 내로 클로닝하였다.
pHS4를 SpeI 및 EcoRI로 분해시켰다. 추가의 클로닝을 위해 2개의 단편, 즉 2486 bp EcoRI-EcoRI 단편과 1169 bp SpeI-EcoRI 단편을 수집하였다. pBluescript를 SpeI 및 EcoRI로 분해시켰다. 이와 같이 분해시킨 pBluescript를 1169 bp (SpeI-EcoRI) 단편과 함께 연결시켰다. 이 작제물은 pMA15로 명명되었다. pMA15를 EcoRI (4127 bp)로 분해시키고, pHS4로부터 2486 bp EcoRI-EcoRI 단편에 연결시켰다. 이 작제물은 pMA16으로 명명하였다. 3689 bp 단편을, EcoRV로 분해시킨 pMAl6으로부터 절단시키고, EcoRV (11403 bp)로 개방시킨 pHAS8b에 연결시켰다. 이 작제물은 pHASHS6으로 명명하였다 (도 16 참조).
pHASHS2의 작제
StGH1 유전자, gbss 프로모터 및 nos 종결인자를 pHS3 (도 6)으로부터 분해시키고, 이를 be1 및 be2의 안티센스 단편을 함유하는 pHAS4b (도 21) 내로 클로닝하였다.
pHS3을 DraI 및 EcoRV (3160 bp)로 분해시키고, 이를 EcoRV (13224 bp)로 개방시킨 pHAS4b에 연결시켰다. 이 작제물은 pHASHS2로 명명되었다 (도 13 참조).
pHASHS4의 작제
StGH2 유전자, gbss 프로모터 및 nos 종결인자를 pHS4 (도 7)로부터 분해시키고, 이를 be1 및 be2의 안티센스 단편을 함유하는 pHAS4b (도 21) 내로 클로닝하였다.
3689 bp 단편을, EcoRV (6613 bp)를 사용하여 pMA16으로부터 분해시켰다 (pMA16에 대해서는 pHASHS3의 작제 전략을 참조할 수 있다). pHAS4b를 EvoRV (13224 bp)로 분해시키고, 이를 상기 단편과 함께 연결시켰다. 이 작제물은 pHASHS4로 명명하였다 (도 14 참조).
pHASHS7의 작제
pHASHS7은 2개의 아밀로스 생합성 증강 유전자 StGH1 및 StGH2와 함께 각각의 유전자를 억제하기 위한 be1 및 be2의 안티센스 단편을 함유하도록 고안하였다.
pMA16 (pMA16에 대해서는 pHASHS3의 작제 전략을 참조할 수 있다)를 EcoRV로 분해시켰다. 이로써 생성된 3649 bp 단편을 PstI (평활 처리됨)으로 개방시킨 pHASHS2 (도 5)에 연결시켰다. 이 작제물은 pHASHS7로 명명하였다 (도 17 참조).
pHASHS8의 작제
pHASHS8은 RNAi (서열 번호 19 내지 22)를 사용하여 각각의 유전자를 억제하기 위한 be1 및 be2의 단편을 함유하도록 고안하고, 2개의 아밀로스 생합성 증강 유전자 StGH1 및 StGH2와 함께 스페이서 (서열 번호 18 또는 23)에 의해 연결하였다.
pMA16 (pMA16에 대해서는 pHASHS3의 작제 전략을 참조할 수 있다)를 EcoRV로 분해시키고, PstI로 개방시키고 평활 처리시킨 pHASHS5 (도 15)에 연결시켰다. 이 작제물은 pHASHS8로 명명하였다 (도 18 참조).
실시예 18
감자의 고형물 증가 및 가공 처리 질 향상
또 다른 국면에서는 본 발명을 사용하여, 가공 처리된 감자 제품을 위해 사용되거나 또는 평판 감자 품종으로서 사용하기 위해 감자 품종의 고형분을 증가시킬 수 있다. 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현시키기 위해 상기 언급된 바와 같은 유전자 작제물을 사용하여 감자 유전자형을 형질전환시켰다. 이러한 전분 생합성 증강 단백질은 상기 언급된 유전자, 또는 동일한 기능적 도메인을 함유하는 기타 식물 유전자로부터 유래될 수 있다.
감자 식물에서 StGH1 및(또는) StGH2 유전자를 과발현시키면, 표 7 및 8에서 알 수 있는 바와 같이 고형분이 증가되었다.
<110> BASF Plant Science GmbH <120> Enhanced Amylose Production in Plants <130> AE884-02 <140> PF0000054331 <141> 2003-03-07 <160> 24 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2084 <212> DNA <213> Solanum tuberosum <220> <221> CDS <222> (302)..(1696) <400> 1 ttttcataaa cttcttcaac tttattccat actcttttat ttatcagctc ctagatcttc 60 ttttttgttt gttgatattc tcttgaaaat tgttcagtga agagttgatc aaagctaaga 120 cacaggggct gcggccattt tttcaccgga atcttcttct ttattttccg gtgaaagttt 180 gaacgcacac cgttatttct agacagtaga caatgtcaag tgaaaaacat cacaagtttt 240 tgaagatttg taattaatta gttgagattt ttaatttgga ggaaagagaa aaacagagaa 300 g atg ata ggg cgg gtg ggc ttg ttg ttg gta ttg ttg ata gca acg acg 349 Met Ile Gly Arg Val Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Ile Ala Thr Thr 1 5 10 15 gtg act att ggg gct gaa acg acg acg tta aaa ggg gta aac aga aat 397 Val Thr Ile Gly Ala Glu Thr Thr Thr Leu Lys Gly Val Asn Arg Asn 20 25 30 gcg tat gcg act atg atg tat atg gga act ccg aga gac tac gag ttc 445 Ala Tyr Ala Thr Met Met Tyr Met Gly Thr Pro Arg Asp Tyr Glu Phe 35 40 45 tac gtg gcg act cga gta atg ctc cga tca ctt acc cgg cta gga gtt 493 Tyr Val Ala Thr Arg Val Met Leu Arg Ser Leu Thr Arg Leu Gly Val 50 55 60 gaa gcc gat ctc gtc gtt att gct tca ctt gac gtt cct ctt cgc tgg 541 Glu Ala Asp Leu Val Val Ile Ala Ser Leu Asp Val Pro Leu Arg Trp 65 70 75 80 gtt caa act cta gaa cag gaa gat ggt gct aag gtg gtg aga gtt aaa 589 Val Gln Thr Leu Glu Gln Glu Asp Gly Ala Lys Val Val Arg Val Lys 85 90 95 aat ctg aac aat ccg tat tgt atc aac cct aat tgg aga ttc aag ctc 637 Asn Leu Asn Asn Pro Tyr Cys Ile Asn Pro Asn Trp Arg Phe Lys Leu 100 105 110 aca ctg aac aaa ctt tat gcg tgg agc ctc gta aat tat gac agg gtt 685 Thr Leu Asn Lys Leu Tyr Ala Trp Ser Leu Val Asn Tyr Asp Arg Val 115 120 125 gtc atg ctt gat gct gac aac ctt ttc ctc cag aaa act gat gaa ctg 733 Val Met Leu Asp Ala Asp Asn Leu Phe Leu Gln Lys Thr Asp Glu Leu 130 135 140 ttc caa tgt ggc cag ttt tgt gct gtc ttc att aat ccc tgc atc ttc 781 Phe Gln Cys Gly Gln Phe Cys Ala Val Phe Ile Asn Pro Cys Ile Phe 145 150 155 160 cac act ggt ctc ttt gta ttg cag cca tca aaa aag gtg ttc aat gac 829 His Thr Gly Leu Phe Val Leu Gln Pro Ser Lys Lys Val Phe Asn Asp 165 170 175 atg atc cat gag ata gag att ggg agg gaa aat caa gac ggt gca gac 877 Met Ile His Glu Ile Glu Ile Gly Arg Glu Asn Gln Asp Gly Ala Asp 180 185 190 caa ggt ttt att gga ggc cac ttc cca gat tta ctt gat cgg cca atg 925 Gln Gly Phe Ile Gly Gly His Phe Pro Asp Leu Leu Asp Arg Pro Met 195 200 205 ttc cac cct cct ctt aat ggt acc cag ctc cag gga agt tac agg ctt 973 Phe His Pro Pro Leu Asn Gly Thr Gln Leu Gln Gly Ser Tyr Arg Leu 210 215 220 cct cta gga tac caa atg gac gcc tct tat tat tat ctc aaa ctc cat 1021 Pro Leu Gly Tyr Gln Met Asp Ala Ser Tyr Tyr Tyr Leu Lys Leu His 225 230 235 240 tgg tcg gta cct tgt gga cct aat agt gtc att aca ttt cct ggt gct 1069 Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Asn Ser Val Ile Thr Phe Pro Gly Ala 245 250 255 cca tgg tta aaa cca tgg tat tgg tgg tca tgg cct gtc tta ccc ttg 1117 Pro Trp Leu Lys Pro Trp Tyr Trp Trp Ser Trp Pro Val Leu Pro Leu 260 265 270 ggc atc cag tgg cat gaa cag cga cgt cta act gtt ggg tat ggt gct 1165 Gly Ile Gln Trp His Glu Gln Arg Arg Leu Thr Val Gly Tyr Gly Ala 275 280 285 gag atg ata gca gtg ttg atc caa tct ata ttt tac cta gga ata att 1213 Glu Met Ile Ala Val Leu Ile Gln Ser Ile Phe Tyr Leu Gly Ile Ile 290 295 300 gca gtg aca cgc cta gca cgc cca aat tta tca aag ttg tgc tat cgc 1261 Ala Val Thr Arg Leu Ala Arg Pro Asn Leu Ser Lys Leu Cys Tyr Arg 305 310 315 320 cat gat gat agc aag agt gcc ttc tta cta cga act ggc ctt aaa ttg 1309 His Asp Asp Ser Lys Ser Ala Phe Leu Leu Arg Thr Gly Leu Lys Leu 325 330 335 att gct ata tgg tcc att ctt gct gcc tac aca gtt cct tat ttc gtg 1357 Ile Ala Ile Trp Ser Ile Leu Ala Ala Tyr Thr Val Pro Tyr Phe Val 340 345 350 att cct tgt aca gtt cat cca cta gtt ggc tgg agt ctc tac tta ctc 1405 Ile Pro Cys Thr Val His Pro Leu Val Gly Trp Ser Leu Tyr Leu Leu 355 360 365 ggc tct ttt tca cta tcc tgt ata aca gtg aat gca ttt ctt ttg ccg 1453 Gly Ser Phe Ser Leu Ser Cys Ile Thr Val Asn Ala Phe Leu Leu Pro 370 375 380 atg cta cct gtt tta gtc cca tgg att ggg atc ctt ggg gcc ctt ttg 1501 Met Leu Pro Val Leu Val Pro Trp Ile Gly Ile Leu Gly Ala Leu Leu 385 390 395 400 gtg atg gct tac cct tgg tac aac gac ggt gtt gta aga gca atg gct 1549 Val Met Ala Tyr Pro Trp Tyr Asn Asp Gly Val Val Arg Ala Met Ala 405 410 415 gta ttt aca tac gcc ttc tgt gct tct cca gca tta tgg atg gca ttg 1597 Val Phe Thr Tyr Ala Phe Cys Ala Ser Pro Ala Leu Trp Met Ala Leu 420 425 430 gtt aaa atc aag tgt tct ctt cat gtt tca ctt gag agg gaa gga ttc 1645 Val Lys Ile Lys Cys Ser Leu His Val Ser Leu Glu Arg Glu Gly Phe 435 440 445 ttg ccc aag ata agt gaa tct aca gca cct gct ggt tct aac aaa ctg 1693 Leu Pro Lys Ile Ser Glu Ser Thr Ala Pro Ala Gly Ser Asn Lys Leu 450 455 460 tat tgaaagttga aaagttaaag gaatcaacag gagaactaat gcttcagaaa 1746 Tyr 465 catctccaaa cgttttgctt aggagacttg gagtctgctt gtgctatcct agctagttgc 1806 ttcagtctgt gctcttaatt agaatggaat tctgtgagtg ggtttagaat tgggaggatg 1866 ttttgtgttg tacatggact atctctggtc tcttgaatgc tactccagga aaaagattgt 1926 ttctcactta attttttctg ttactaaatt gtatgtggaa taggttcttt aaaatttatt 1986 catggattta tgttatgtat gctaacagtg taaatattaa gtcctggtga aataagtaat 2046 tccttattca tacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2084 <210> 2 <211> 465 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 2 Met Ile Gly Arg Val Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Ile Ala Thr Thr 1 5 10 15 Val Thr Ile Gly Ala Glu Thr Thr Thr Leu Lys Gly Val Asn Arg Asn 20 25 30 Ala Tyr Ala Thr Met Met Tyr Met Gly Thr Pro Arg Asp Tyr Glu Phe 35 40 45 Tyr Val Ala Thr Arg Val Met Leu Arg Ser Leu Thr Arg Leu Gly Val 50 55 60 Glu Ala Asp Leu Val Val Ile Ala Ser Leu Asp Val Pro Leu Arg Trp 65 70 75 80 Val Gln Thr Leu Glu Gln Glu Asp Gly Ala Lys Val Val Arg Val Lys 85 90 95 Asn Leu Asn Asn Pro Tyr Cys Ile Asn Pro Asn Trp Arg Phe Lys Leu 100 105 110 Thr Leu Asn Lys Leu Tyr Ala Trp Ser Leu Val Asn Tyr Asp Arg Val 115 120 125 Val Met Leu Asp Ala Asp Asn Leu Phe Leu Gln Lys Thr Asp Glu Leu 130 135 140 Phe Gln Cys Gly Gln Phe Cys Ala Val Phe Ile Asn Pro Cys Ile Phe 145 150 155 160 His Thr Gly Leu Phe Val Leu Gln Pro Ser Lys Lys Val Phe Asn Asp 165 170 175 Met Ile His Glu Ile Glu Ile Gly Arg Glu Asn Gln Asp Gly Ala Asp 180 185 190 Gln Gly Phe Ile Gly Gly His Phe Pro Asp Leu Leu Asp Arg Pro Met 195 200 205 Phe His Pro Pro Leu Asn Gly Thr Gln Leu Gln Gly Ser Tyr Arg Leu 210 215 220 Pro Leu Gly Tyr Gln Met Asp Ala Ser Tyr Tyr Tyr Leu Lys Leu His 225 230 235 240 Trp Ser Val Pro Cys Gly Pro Asn Ser Val Ile Thr Phe Pro Gly Ala 245 250 255 Pro Trp Leu Lys Pro Trp Tyr Trp Trp Ser Trp Pro Val Leu Pro Leu 260 265 270 Gly Ile Gln Trp His Glu Gln Arg Arg Leu Thr Val Gly Tyr Gly Ala 275 280 285 Glu Met Ile Ala Val Leu Ile Gln Ser Ile Phe Tyr Leu Gly Ile Ile 290 295 300 Ala Val Thr Arg Leu Ala Arg Pro Asn Leu Ser Lys Leu Cys Tyr Arg 305 310 315 320 His Asp Asp Ser Lys Ser Ala Phe Leu Leu Arg Thr Gly Leu Lys Leu 325 330 335 Ile Ala Ile Trp Ser Ile Leu Ala Ala Tyr Thr Val Pro Tyr Phe Val 340 345 350 Ile Pro Cys Thr Val His Pro Leu Val Gly Trp Ser Leu Tyr Leu Leu 355 360 365 Gly Ser Phe Ser Leu Ser Cys Ile Thr Val Asn Ala Phe Leu Leu Pro 370 375 380 Met Leu Pro Val Leu Val Pro Trp Ile Gly Ile Leu Gly Ala Leu Leu 385 390 395 400 Val Met Ala Tyr Pro Trp Tyr Asn Asp Gly Val Val Arg Ala Met Ala 405 410 415 Val Phe Thr Tyr Ala Phe Cys Ala Ser Pro Ala Leu Trp Met Ala Leu 420 425 430 Val Lys Ile Lys Cys Ser Leu His Val Ser Leu Glu Arg Glu Gly Phe 435 440 445 Leu Pro Lys Ile Ser Glu Ser Thr Ala Pro Ala Gly Ser Asn Lys Leu 450 455 460 Tyr 465 <210> 3 <211> 2230 <212> DNA <213> Solanum tuberosum <220> <221> CDS <222> (143)..(2086) <400> 3 tatccccaga gaatcagctg aatcaagaac tgatttttag attatgtttt cttgattctt 60 tgaaatggga acttgatttt cagtttttca actcagatgt tgtgttcctt tagctggaaa 120 acttgaaaaa ggaaagccca ga atg aga gga agt tta gct ggt gga cca cct 172 Met Arg Gly Ser Leu Ala Gly Gly Pro Pro 1 5 10 agt cct att gaa cct aga cag agg ctt tct gta ttc act gag gaa aca 220 Ser Pro Ile Glu Pro Arg Gln Arg Leu Ser Val Phe Thr Glu Glu Thr 15 20 25 agc aaa aga agg ttc ttg aga agt aaa gtt ttc aga gat ggg gag aga 268 Ser Lys Arg Arg Phe Leu Arg Ser Lys Val Phe Arg Asp Gly Glu Arg 30 35 40 gct ctt cat agt ccc acc aaa aac agg aat ttt acc tgc aag ttc cca 316 Ala Leu His Ser Pro Thr Lys Asn Arg Asn Phe Thr Cys Lys Phe Pro 45 50 55 act gtg aag ctt ata ttg ggt gtt att gct ctg gtt gca att tgg tca 364 Thr Val Lys Leu Ile Leu Gly Val Ile Ala Leu Val Ala Ile Trp Ser 60 65 70 ctc tgg cat tct cca gca att tat aac acg gaa tac ata tct agt tca 412 Leu Trp His Ser Pro Ala Ile Tyr Asn Thr Glu Tyr Ile Ser Ser Ser 75 80 85 90 ggc tct cgg gct gct ttg atg cac aga gag tta agt ggt cat tct tca 460 Gly Ser Arg Ala Ala Leu Met His Arg Glu Leu Ser Gly His Ser Ser 95 100 105 gct gat caa cgt tat aca tca ctt tta gat att gac tgg gac caa att 508 Ala Asp Gln Arg Tyr Thr Ser Leu Leu Asp Ile Asp Trp Asp Gln Ile 110 115 120 tcc caa gtt att gag aaa ctg gcc gat agg cat gag tat cag ggc gta 556 Ser Gln Val Ile Glu Lys Leu Ala Asp Arg His Glu Tyr Gln Gly Val 125 130 135 ggg ata tta aac ttc aat gac agt gaa att gat cag ttg aag gag tta 604 Gly Ile Leu Asn Phe Asn Asp Ser Glu Ile Asp Gln Leu Lys Glu Leu 140 145 150 cta ccg gac gct gag cat gta atc ttg aac ctg gat cac gtc ccg aat 652 Leu Pro Asp Ala Glu His Val Ile Leu Asn Leu Asp His Val Pro Asn 155 160 165 170 aat ata aca tgg gaa aca ata tat cct gaa tgg ata gat gaa gaa gaa 700 Asn Ile Thr Trp Glu Thr Ile Tyr Pro Glu Trp Ile Asp Glu Glu Glu 175 180 185 gaa ttt gag gtc ccc act tgt cct tct ctg ccc aaa att cag ttt ccg 748 Glu Phe Glu Val Pro Thr Cys Pro Ser Leu Pro Lys Ile Gln Phe Pro 190 195 200 ggt aaa cca agg att gat ctc ata gtt gta aag ctt cca tgc aag aag 796 Gly Lys Pro Arg Ile Asp Leu Ile Val Val Lys Leu Pro Cys Lys Lys 205 210 215 tct aag gac tgg tat aga gat gta gct cgt ttt cac ttg cag ctg gca 844 Ser Lys Asp Trp Tyr Arg Asp Val Ala Arg Phe His Leu Gln Leu Ala 220 225 230 gca gca agg ctg gct gcc agt aat aaa ggg tat cat cca ata cat gtg 892 Ala Ala Arg Leu Ala Ala Ser Asn Lys Gly Tyr His Pro Ile His Val 235 240 245 250 ctt ctg gtt act gag cat ttc cca acc ccc aat ctg ttc acc tgt aaa 940 Leu Leu Val Thr Glu His Phe Pro Thr Pro Asn Leu Phe Thr Cys Lys 255 260 265 gag tta gtt gta cgt gaa ggc aat gca tgg cta tat gaa cct aat ctg 988 Glu Leu Val Val Arg Glu Gly Asn Ala Trp Leu Tyr Glu Pro Asn Leu 270 275 280 aac act tta aga gag aag ctc cac ctc cct gtt ggg tca tgt gaa ctt 1036 Asn Thr Leu Arg Glu Lys Leu His Leu Pro Val Gly Ser Cys Glu Leu 285 290 295 gca gtt cct ctc aag gct aaa gca aat tgg cac tct gga aat gta aga 1084 Ala Val Pro Leu Lys Ala Lys Ala Asn Trp His Ser Gly Asn Val Arg 300 305 310 cga gaa gcc tat gca act att ctc cac tca gca aat ttt tat gta tgt 1132 Arg Glu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu His Ser Ala Asn Phe Tyr Val Cys 315 320 325 330 gga gcc ata gct gca gca cag agt att cgc ttg gca ggt tca acc cga 1180 Gly Ala Ile Ala Ala Ala Gln Ser Ile Arg Leu Ala Gly Ser Thr Arg 335 340 345 gat ctt gtg ata ctt gtt gat gag act atc agt gac tac cac agg ggt 1228 Asp Leu Val Ile Leu Val Asp Glu Thr Ile Ser Asp Tyr His Arg Gly 350 355 360 ggt tta gag gct gcc gga tgg aag atc cac acg ata aag aga ata agg 1276 Gly Leu Glu Ala Ala Gly Trp Lys Ile His Thr Ile Lys Arg Ile Arg 365 370 375 aat cct aaa gct gaa cag gat gcc tac aat gag tgg aac tat agc aaa 1324 Asn Pro Lys Ala Glu Gln Asp Ala Tyr Asn Glu Trp Asn Tyr Ser Lys 380 385 390 ttt cgt ctc tgg cag ctg aca gat tat gac aaa atc atc ttc att gat 1372 Phe Arg Leu Trp Gln Leu Thr Asp Tyr Asp Lys Ile Ile Phe Ile Asp 395 400 405 410 gcg gat ttg ttg ata ctg aga aat att gat ttt ctc ttt gag atg cct 1420 Ala Asp Leu Leu Ile Leu Arg Asn Ile Asp Phe Leu Phe Glu Met Pro 415 420 425 gaa ata act gca ata gga aat aat gca acc ctt ttt aat tca ggc gtg 1468 Glu Ile Thr Ala Ile Gly Asn Asn Ala Thr Leu Phe Asn Ser Gly Val 430 435 440 atg gtc gtt gaa cca tca aat tgc aca ttt cag ctg ttg atg gat cat 1516 Met Val Val Glu Pro Ser Asn Cys Thr Phe Gln Leu Leu Met Asp His 445 450 455 atc aat gag att gaa tca tac aat ggt ggg gat cag ggg tat ttg aac 1564 Ile Asn Glu Ile Glu Ser Tyr Asn Gly Gly Asp Gln Gly Tyr Leu Asn 460 465 470 gaa ata ttc acc tgg tgg cat agg atc cca aaa cac atg aac ttt ttg 1612 Glu Ile Phe Thr Trp Trp His Arg Ile Pro Lys His Met Asn Phe Leu 475 480 485 490 aaa cat tat tgg gaa ggt gat gag gag gag aag aag caa atg aaa aca 1660 Lys His Tyr Trp Glu Gly Asp Glu Glu Glu Lys Lys Gln Met Lys Thr 495 500 505 cgt ctt ttt ggt gct gat cct cca gtt ctc tat gtt ctg cac tac tta 1708 Arg Leu Phe Gly Ala Asp Pro Pro Val Leu Tyr Val Leu His Tyr Leu 510 515 520 ggc ctg aaa cct tgg tta tgc ttc agg gac tac gat tgc aac tgg aat 1756 Gly Leu Lys Pro Trp Leu Cys Phe Arg Asp Tyr Asp Cys Asn Trp Asn 525 530 535 gtg ggt aag ttg cag gag ttt gca agt gat gtg gca cac agg acg tgg 1804 Val Gly Lys Leu Gln Glu Phe Ala Ser Asp Val Ala His Arg Thr Trp 540 545 550 tgg aag gtc cat gat gcc atg cca gat aac tta cat aaa tat tgt ttg 1852 Trp Lys Val His Asp Ala Met Pro Asp Asn Leu His Lys Tyr Cys Leu 555 560 565 570 ctt agg tct aaa cag aag gct gca cta gag tgg gat cga aga gaa gct 1900 Leu Arg Ser Lys Gln Lys Ala Ala Leu Glu Trp Asp Arg Arg Glu Ala 575 580 585 gag aaa gct aac ttt tca gat ggt cat tgg aag atc aaa ata aag gac 1948 Glu Lys Ala Asn Phe Ser Asp Gly His Trp Lys Ile Lys Ile Lys Asp 590 595 600 cca cgt ttg gag act tgt tat gaa gaa ttt tgc ttc tgg gaa agc atg 1996 Pro Arg Leu Glu Thr Cys Tyr Glu Glu Phe Cys Phe Trp Glu Ser Met 605 610 615 tta tgg cac tgg ggt gaa aca aac tgg aca gat aat gcc acc tct tca 2044 Leu Trp His Trp Gly Glu Thr Asn Trp Thr Asp Asn Ala Thr Ser Ser 620 625 630 cca aca cct ccc atg gtc aat act gct tca ctt tct tct ttg 2086 Pro Thr Pro Pro Met Val Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ser Leu 635 640 645 taactaggag gttctgttac tatacctcgc tagtctgtaa gtaatacaga gtcacaactt 2146 gaatgtcaac cagtgccatt agtatacatg gtgtcaacac tttccccacc cttgaaaaaa 2206 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2230 <210> 4 <211> 648 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 4 Met Arg Gly Ser Leu Ala Gly Gly Pro Pro Ser Pro Ile Glu Pro Arg 1 5 10 15 Gln Arg Leu Ser Val Phe Thr Glu Glu Thr Ser Lys Arg Arg Phe Leu 20 25 30 Arg Ser Lys Val Phe Arg Asp Gly Glu Arg Ala Leu His Ser Pro Thr 35 40 45 Lys Asn Arg Asn Phe Thr Cys Lys Phe Pro Thr Val Lys Leu Ile Leu 50 55 60 Gly Val Ile Ala Leu Val Ala Ile Trp Ser Leu Trp His Ser Pro Ala 65 70 75 80 Ile Tyr Asn Thr Glu Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Arg Ala Ala Leu 85 90 95 Met His Arg Glu Leu Ser Gly His Ser Ser Ala Asp Gln Arg Tyr Thr 100 105 110 Ser Leu Leu Asp Ile Asp Trp Asp Gln Ile Ser Gln Val Ile Glu Lys 115 120 125 Leu Ala Asp Arg His Glu Tyr Gln Gly Val Gly Ile Leu Asn Phe Asn 130 135 140 Asp Ser Glu Ile Asp Gln Leu Lys Glu Leu Leu Pro Asp Ala Glu His 145 150 155 160 Val Ile Leu Asn Leu Asp His Val Pro Asn Asn Ile Thr Trp Glu Thr 165 170 175 Ile Tyr Pro Glu Trp Ile Asp Glu Glu Glu Glu Phe Glu Val Pro Thr 180 185 190 Cys Pro Ser Leu Pro Lys Ile Gln Phe Pro Gly Lys Pro Arg Ile Asp 195 200 205 Leu Ile Val Val Lys Leu Pro Cys Lys Lys Ser Lys Asp Trp Tyr Arg 210 215 220 Asp Val Ala Arg Phe His Leu Gln Leu Ala Ala Ala Arg Leu Ala Ala 225 230 235 240 Ser Asn Lys Gly Tyr His Pro Ile His Val Leu Leu Val Thr Glu His 245 250 255 Phe Pro Thr Pro Asn Leu Phe Thr Cys Lys Glu Leu Val Val Arg Glu 260 265 270 Gly Asn Ala Trp Leu Tyr Glu Pro Asn Leu Asn Thr Leu Arg Glu Lys 275 280 285 Leu His Leu Pro Val Gly Ser Cys Glu Leu Ala Val Pro Leu Lys Ala 290 295 300 Lys Ala Asn Trp His Ser Gly Asn Val Arg Arg Glu Ala Tyr Ala Thr 305 310 315 320 Ile Leu His Ser Ala Asn Phe Tyr Val Cys Gly Ala Ile Ala Ala Ala 325 330 335 Gln Ser Ile Arg Leu Ala Gly Ser Thr Arg Asp Leu Val Ile Leu Val 340 345 350 Asp Glu Thr Ile Ser Asp Tyr His Arg Gly Gly Leu Glu Ala Ala Gly 355 360 365 Trp Lys Ile His Thr Ile Lys Arg Ile Arg Asn Pro Lys Ala Glu Gln 370 375 380 Asp Ala Tyr Asn Glu Trp Asn Tyr Ser Lys Phe Arg Leu Trp Gln Leu 385 390 395 400 Thr Asp Tyr Asp Lys Ile Ile Phe Ile Asp Ala Asp Leu Leu Ile Leu 405 410 415 Arg Asn Ile Asp Phe Leu Phe Glu Met Pro Glu Ile Thr Ala Ile Gly 420 425 430 Asn Asn Ala Thr Leu Phe Asn Ser Gly Val Met Val Val Glu Pro Ser 435 440 445 Asn Cys Thr Phe Gln Leu Leu Met Asp His Ile Asn Glu Ile Glu Ser 450 455 460 Tyr Asn Gly Gly Asp Gln Gly Tyr Leu Asn Glu Ile Phe Thr Trp Trp 465 470 475 480 His Arg Ile Pro Lys His Met Asn Phe Leu Lys His Tyr Trp Glu Gly 485 490 495 Asp Glu Glu Glu Lys Lys Gln Met Lys Thr Arg Leu Phe Gly Ala Asp 500 505 510 Pro Pro Val Leu Tyr Val Leu His Tyr Leu Gly Leu Lys Pro Trp Leu 515 520 525 Cys Phe Arg Asp Tyr Asp Cys Asn Trp Asn Val Gly Lys Leu Gln Glu 530 535 540 Phe Ala Ser Asp Val Ala His Arg Thr Trp Trp Lys Val His Asp Ala 545 550 555 560 Met Pro Asp Asn Leu His Lys Tyr Cys Leu Leu Arg Ser Lys Gln Lys 565 570 575 Ala Ala Leu Glu Trp Asp Arg Arg Glu Ala Glu Lys Ala Asn Phe Ser 580 585 590 Asp Gly His Trp Lys Ile Lys Ile Lys Asp Pro Arg Leu Glu Thr Cys 595 600 605 Tyr Glu Glu Phe Cys Phe Trp Glu Ser Met Leu Trp His Trp Gly Glu 610 615 620 Thr Asn Trp Thr Asp Asn Ala Thr Ser Ser Pro Thr Pro Pro Met Val 625 630 635 640 Asn Thr Ala Ser Leu Ser Ser Leu 645 <210> 5 <211> 1485 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1)..(1485) <400> 5 atg gat tta caa aga act ttg atg ttc tct tgt tgg gtt ctg tct ctt 48 Met Asp Leu Gln Arg Thr Leu Met Phe Ser Cys Trp Val Leu Ser Leu 1 5 10 15 ttg atc atc aaa acg aca gcg tat aac gag aaa cag ctg ttc cag ccg 96 Leu Ile Ile Lys Thr Thr Ala Tyr Asn Glu Lys Gln Leu Phe Gln Pro 20 25 30 ctt gaa acg gaa aac gca aac gcg atg acc gcg gtt atg gag cga gga 144 Leu Glu Thr Glu Asn Ala Asn Ala Met Thr Ala Val Met Glu Arg Gly 35 40 45 tta aag acg cag cgg cgg ccg gag cac aag aac gct tat gcg acg atg 192 Leu Lys Thr Gln Arg Arg Pro Glu His Lys Asn Ala Tyr Ala Thr Met 50 55 60 atg tac atg gga aca cca aga gac tac gag ttc tac gtt gcg aca cgt 240 Met Tyr Met Gly Thr Pro Arg Asp Tyr Glu Phe Tyr Val Ala Thr Arg 65 70 75 80 gtc ttg atc aga tcg ctt aag agt ctc cac gtg gac gct gat atc gtc 288 Val Leu Ile Arg Ser Leu Lys Ser Leu His Val Asp Ala Asp Ile Val 85 90 95 gtt ata gcc tcc ctc gac gtt cct atc aac tgg att cac gct ctg gaa 336 Val Ile Ala Ser Leu Asp Val Pro Ile Asn Trp Ile His Ala Leu Glu 100 105 110 gaa gaa gat gga gct aaa gta gtg aga gta gag aat ctt gag aat cca 384 Glu Glu Asp Gly Ala Lys Val Val Arg Val Glu Asn Leu Glu Asn Pro 115 120 125 tac aag aaa caa acc aac ttc gac aac aga ttc aag ctt agt cta aac 432 Tyr Lys Lys Gln Thr Asn Phe Asp Asn Arg Phe Lys Leu Ser Leu Asn 130 135 140 aag ctc tac gct tgg tct ctc tct gat tat gac cgt gtt gta atg ctt 480 Lys Leu Tyr Ala Trp Ser Leu Ser Asp Tyr Asp Arg Val Val Met Leu 145 150 155 160 gat gtc gac aat ctc ttt ctc aag aac acc gac gag ctc ttc cag tgt 528 Asp Val Asp Asn Leu Phe Leu Lys Asn Thr Asp Glu Leu Phe Gln Cys 165 170 175 ggc caa ttt tgt gct gtc ttc atc aac cct tgc atc ttc cac act ggt 576 Gly Gln Phe Cys Ala Val Phe Ile Asn Pro Cys Ile Phe His Thr Gly 180 185 190 ctc ttt gtg ttg cag cca tca atg gag gtc ttt aga gac atg ctt cat 624 Leu Phe Val Leu Gln Pro Ser Met Glu Val Phe Arg Asp Met Leu His 195 200 205 gag ctt gaa gta aag aga gat aac cct gat gga gct gat caa ggc ttt 672 Glu Leu Glu Val Lys Arg Asp Asn Pro Asp Gly Ala Asp Gln Gly Phe 210 215 220 ctt gtc agc tac ttc tct gat tta ctc aat cag cct ctc ttt cgt cct 720 Leu Val Ser Tyr Phe Ser Asp Leu Leu Asn Gln Pro Leu Phe Arg Pro 225 230 235 240 cct ccc gat aac cgc acc gcg ctt aag gga cat ttt agg ctt cct ttg 768 Pro Pro Asp Asn Arg Thr Ala Leu Lys Gly His Phe Arg Leu Pro Leu 245 250 255 gga tat caa atg gac gca tct tat tac tac ctt aag ctc aga tgg aac 816 Gly Tyr Gln Met Asp Ala Ser Tyr Tyr Tyr Leu Lys Leu Arg Trp Asn 260 265 270 gta cca tgt gga cca aac agt gtg ata acg ttc cca gga gca gta tgg 864 Val Pro Cys Gly Pro Asn Ser Val Ile Thr Phe Pro Gly Ala Val Trp 275 280 285 tta aag cca tgg tat tgg tgg tca tgg cct gtt ctt cct tta ggc ctt 912 Leu Lys Pro Trp Tyr Trp Trp Ser Trp Pro Val Leu Pro Leu Gly Leu 290 295 300 tca tgg cac cac caa cgc cgc tac acg att agt tat tca gca gag atg 960 Ser Trp His His Gln Arg Arg Tyr Thr Ile Ser Tyr Ser Ala Glu Met 305 310 315 320 cct tgg gtc cta acc caa gca gtg ttc tac cta gga att ata cta gtc 1008 Pro Trp Val Leu Thr Gln Ala Val Phe Tyr Leu Gly Ile Ile Leu Val 325 330 335 aca cgt cta gcg cgt ccc aac atg acc aag cta tgt tac cga cgt tct 1056 Thr Arg Leu Ala Arg Pro Asn Met Thr Lys Leu Cys Tyr Arg Arg Ser 340 345 350 gat aag aat cta agc atg atc cag aca gct ttc aag ttt gtt gca ctc 1104 Asp Lys Asn Leu Ser Met Ile Gln Thr Ala Phe Lys Phe Val Ala Leu 355 360 365 ctc ttt atc ctc tca gcc tac att ata cca ttc ttc atc atc cca cag 1152 Leu Phe Ile Leu Ser Ala Tyr Ile Ile Pro Phe Phe Ile Ile Pro Gln 370 375 380 acg atc cac ccg ctc att ggt tgg tct ctc tac tta acc ggc tcc ttt 1200 Thr Ile His Pro Leu Ile Gly Trp Ser Leu Tyr Leu Thr Gly Ser Phe 385 390 395 400 gct ctc tct acc ata ccc atc aac gcc ttc ttg ctt ccc att ctc cct 1248 Ala Leu Ser Thr Ile Pro Ile Asn Ala Phe Leu Leu Pro Ile Leu Pro 405 410 415 gtc ata aca ccg tgg ctt ggc att ttc ggg aca ctc ctc gtg atg gct 1296 Val Ile Thr Pro Trp Leu Gly Ile Phe Gly Thr Leu Leu Val Met Ala 420 425 430 ttt cct tct tat cct gat ggc gtt gtt aga gca ttg tcg gtt ttc ggg 1344 Phe Pro Ser Tyr Pro Asp Gly Val Val Arg Ala Leu Ser Val Phe Gly 435 440 445 tat gca ttt tgt tgt gca ccg ttt cta tgg gtc tcc ttt gtg aag atc 1392 Tyr Ala Phe Cys Cys Ala Pro Phe Leu Trp Val Ser Phe Val Lys Ile 450 455 460 aca tcg cat ctt cag att atg att gac aaa gag gtt ttg ttt ccg cgg 1440 Thr Ser His Leu Gln Ile Met Ile Asp Lys Glu Val Leu Phe Pro Arg 465 470 475 480 ttg ggt gaa tcc gga gtc act tct ggt ctc agc aaa ttg tac tga 1485 Leu Gly Glu Ser Gly Val Thr Ser Gly Leu Ser Lys Leu Tyr 485 490 495 <210> 6 <211> 494 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 6 Met Asp Leu Gln Arg Thr Leu Met Phe Ser Cys Trp Val Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ile Ile Lys Thr Thr Ala Tyr Asn Glu Lys Gln Leu Phe Gln Pro 20 25 30 Leu Glu Thr Glu Asn Ala Asn Ala Met Thr Ala Val Met Glu Arg Gly 35 40 45 Leu Lys Thr Gln Arg Arg Pro Glu His Lys Asn Ala Tyr Ala Thr Met 50 55 60 Met Tyr Met Gly Thr Pro Arg Asp Tyr Glu Phe Tyr Val Ala Thr Arg 65 70 75 80 Val Leu Ile Arg Ser Leu Lys Ser Leu His Val Asp Ala Asp Ile Val 85 90 95 Val Ile Ala Ser Leu Asp Val Pro Ile Asn Trp Ile His Ala Leu Glu 100 105 110 Glu Glu Asp Gly Ala Lys Val Val Arg Val Glu Asn Leu Glu Asn Pro 115 120 125 Tyr Lys Lys Gln Thr Asn Phe Asp Asn Arg Phe Lys Leu Ser Leu Asn 130 135 140 Lys Leu Tyr Ala Trp Ser Leu Ser Asp Tyr Asp Arg Val Val Met Leu 145 150 155 160 Asp Val Asp Asn Leu Phe Leu Lys Asn Thr Asp Glu Leu Phe Gln Cys 165 170 175 Gly Gln Phe Cys Ala Val Phe Ile Asn Pro Cys Ile Phe His Thr Gly 180 185 190 Leu Phe Val Leu Gln Pro Ser Met Glu Val Phe Arg Asp Met Leu His 195 200 205 Glu Leu Glu Val Lys Arg Asp Asn Pro Asp Gly Ala Asp Gln Gly Phe 210 215 220 Leu Val Ser Tyr Phe Ser Asp Leu Leu Asn Gln Pro Leu Phe Arg Pro 225 230 235 240 Pro Pro Asp Asn Arg Thr Ala Leu Lys Gly His Phe Arg Leu Pro Leu 245 250 255 Gly Tyr Gln Met Asp Ala Ser Tyr Tyr Tyr Leu Lys Leu Arg Trp Asn 260 265 270 Val Pro Cys Gly Pro Asn Ser Val Ile Thr Phe Pro Gly Ala Val Trp 275 280 285 Leu Lys Pro Trp Tyr Trp Trp Ser Trp Pro Val Leu Pro Leu Gly Leu 290 295 300 Ser Trp His His Gln Arg Arg Tyr Thr Ile Ser Tyr Ser Ala Glu Met 305 310 315 320 Pro Trp Val Leu Thr Gln Ala Val Phe Tyr Leu Gly Ile Ile Leu Val 325 330 335 Thr Arg Leu Ala Arg Pro Asn Met Thr Lys Leu Cys Tyr Arg Arg Ser 340 345 350 Asp Lys Asn Leu Ser Met Ile Gln Thr Ala Phe Lys Phe Val Ala Leu 355 360 365 Leu Phe Ile Leu Ser Ala Tyr Ile Ile Pro Phe Phe Ile Ile Pro Gln 370 375 380 Thr Ile His Pro Leu Ile Gly Trp Ser Leu Tyr Leu Thr Gly Ser Phe 385 390 395 400 Ala Leu Ser Thr Ile Pro Ile Asn Ala Phe Leu Leu Pro Ile Leu Pro 405 410 415 Val Ile Thr Pro Trp Leu Gly Ile Phe Gly Thr Leu Leu Val Met Ala 420 425 430 Phe Pro Ser Tyr Pro Asp Gly Val Val Arg Ala Leu Ser Val Phe Gly 435 440 445 Tyr Ala Phe Cys Cys Ala Pro Phe Leu Trp Val Ser Phe Val Lys Ile 450 455 460 Thr Ser His Leu Gln Ile Met Ile Asp Lys Glu Val Leu Phe Pro Arg 465 470 475 480 Leu Gly Glu Ser Gly Val Thr Ser Gly Leu Ser Lys Leu Tyr 485 490 <210> 7 <211> 1494 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1)..(1494) <400> 7 atg gat ttg cag aga ggc ttt gtg ttc ttg tct ttg gtt cta tct ttt 48 Met Asp Leu Gln Arg Gly Phe Val Phe Leu Ser Leu Val Leu Ser Phe 1 5 10 15 atg ata atc gaa acg acg gcg tat cga gag aga cag ctg ctg ctg ctg 96 Met Ile Ile Glu Thr Thr Ala Tyr Arg Glu Arg Gln Leu Leu Leu Leu 20 25 30 caa cca ccg caa gaa acg gcg ata gat acc gca aac gcg gtg gtg acg 144 Gln Pro Pro Gln Glu Thr Ala Ile Asp Thr Ala Asn Ala Val Val Thr 35 40 45 gtt caa gat cga ggt ttg aag acg cgg cga ccg gag cat aag aac gca 192 Val Gln Asp Arg Gly Leu Lys Thr Arg Arg Pro Glu His Lys Asn Ala 50 55 60 tac gca acg atg atg tac atg ggg acg cca aga gac tac gag ttc tac 240 Tyr Ala Thr Met Met Tyr Met Gly Thr Pro Arg Asp Tyr Glu Phe Tyr 65 70 75 80 gtt gcg aca cgt gtt ttg atc aga tcg ttg aga agt ctt cac gtg gaa 288 Val Ala Thr Arg Val Leu Ile Arg Ser Leu Arg Ser Leu His Val Glu 85 90 95 gct gat ctc gtc gtc atc gct tct ctc gac gtt cct ctc cga tgg gtt 336 Ala Asp Leu Val Val Ile Ala Ser Leu Asp Val Pro Leu Arg Trp Val 100 105 110 caa acc ttg gaa gag gaa gat gga gct aaa gtg gtg aga gtt gaa aat 384 Gln Thr Leu Glu Glu Glu Asp Gly Ala Lys Val Val Arg Val Glu Asn 115 120 125 gtg gat aat cca tac agg aga cag acc aac ttc aac agt aga ttc aag 432 Val Asp Asn Pro Tyr Arg Arg Gln Thr Asn Phe Asn Ser Arg Phe Lys 130 135 140 ctt act cta aac aag ctc tac gct tgg gct ttg tct gat tac gac cgt 480 Leu Thr Leu Asn Lys Leu Tyr Ala Trp Ala Leu Ser Asp Tyr Asp Arg 145 150 155 160 gtg gtc atg cta gat gcc gat aac ctc ttt ctt aag aaa gcc gac gag 528 Val Val Met Leu Asp Ala Asp Asn Leu Phe Leu Lys Lys Ala Asp Glu 165 170 175 ttg ttc cag tgt ggg cgc ttc tgt gcg gtc ttc att aac cct tgt atc 576 Leu Phe Gln Cys Gly Arg Phe Cys Ala Val Phe Ile Asn Pro Cys Ile 180 185 190 ttc cac act ggt ctc ttc gtg ttg cag cca tca gtg gaa gtg ttc aag 624 Phe His Thr Gly Leu Phe Val Leu Gln Pro Ser Val Glu Val Phe Lys 195 200 205 gac atg ctc cat gag cta caa gtt gga aga aag aat cct gat gga gct 672 Asp Met Leu His Glu Leu Gln Val Gly Arg Lys Asn Pro Asp Gly Ala 210 215 220 gat caa ggt ttt ctt gtc agt tac ttc tct gat ctt ctt gac caa cct 720 Asp Gln Gly Phe Leu Val Ser Tyr Phe Ser Asp Leu Leu Asp Gln Pro 225 230 235 240 ctc ttt agt cct ccg agt aac gga tct gta ctt aat ggt cac ttg aga 768 Leu Phe Ser Pro Pro Ser Asn Gly Ser Val Leu Asn Gly His Leu Arg 245 250 255 ctt ccc tta ggc tac caa atg gac gct tct tat ttc tat ctt aag cta 816 Leu Pro Leu Gly Tyr Gln Met Asp Ala Ser Tyr Phe Tyr Leu Lys Leu 260 265 270 aga tgg aac ata ccc tgt gga cca aac agt gtg att aca ttc ccg gga 864 Arg Trp Asn Ile Pro Cys Gly Pro Asn Ser Val Ile Thr Phe Pro Gly 275 280 285 gct gtt tgg tta aag cca tgg tac tgg tgg tca tgg cct gtt ctt cca 912 Ala Val Trp Leu Lys Pro Trp Tyr Trp Trp Ser Trp Pro Val Leu Pro 290 295 300 cta ggt ttc tca tgg cac gag cag cgt cgc gcc act ata ggg tac tca 960 Leu Gly Phe Ser Trp His Glu Gln Arg Arg Ala Thr Ile Gly Tyr Ser 305 310 315 320 gcc gaa atg cct ttg gtt ata atc caa gca atg ttt tac ctt gga atc 1008 Ala Glu Met Pro Leu Val Ile Ile Gln Ala Met Phe Tyr Leu Gly Ile 325 330 335 ata gtg gtt aca cga cta gct cgt cct aac ata acc aag cta tgt tat 1056 Ile Val Val Thr Arg Leu Ala Arg Pro Asn Ile Thr Lys Leu Cys Tyr 340 345 350 cgc cgc tct gac cgc aac tta aca acg atc caa gct ggt ttt aag ttg 1104 Arg Arg Ser Asp Arg Asn Leu Thr Thr Ile Gln Ala Gly Phe Lys Leu 355 360 365 atc gcg ctt ctc tct gta gtt gca gcc tac atc ttc cca ttc ttc acc 1152 Ile Ala Leu Leu Ser Val Val Ala Ala Tyr Ile Phe Pro Phe Phe Thr 370 375 380 atc cct cac act atc cac cca ctc atc ggc tgg tcg ctc tac ttg atg 1200 Ile Pro His Thr Ile His Pro Leu Ile Gly Trp Ser Leu Tyr Leu Met 385 390 395 400 gct tct ttt gct ctc tct tcc att tca atc aac act ctc ctc ctc cca 1248 Ala Ser Phe Ala Leu Ser Ser Ile Ser Ile Asn Thr Leu Leu Leu Pro 405 410 415 acg ctc cct gtt ctc act cca tgg cta gga att ctc ggc act ctc ctt 1296 Thr Leu Pro Val Leu Thr Pro Trp Leu Gly Ile Leu Gly Thr Leu Leu 420 425 430 gtc atg gcc ttc cct tgg tac cct gat gga gtg gtc aga gcc ttg tca 1344 Val Met Ala Phe Pro Trp Tyr Pro Asp Gly Val Val Arg Ala Leu Ser 435 440 445 gtt ttc gca tac gca ttt tgt tgc gca ccc ttt gtg tgg gtt tca ttc 1392 Val Phe Ala Tyr Ala Phe Cys Cys Ala Pro Phe Val Trp Val Ser Phe 450 455 460 cgc aaa atc aca tcg cac ctc cag gtt ttg att gag aaa gag gtg ttg 1440 Arg Lys Ile Thr Ser His Leu Gln Val Leu Ile Glu Lys Glu Val Leu 465 470 475 480 ttc ccg cga ttg gga gac tca ggg gtc act tca ggc ttc agc aaa ttg 1488 Phe Pro Arg Leu Gly Asp Ser Gly Val Thr Ser Gly Phe Ser Lys Leu 485 490 495 tat tag 1494 Tyr <210> 8 <211> 497 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 8 Met Asp Leu Gln Arg Gly Phe Val Phe Leu Ser Leu Val Leu Ser Phe 1 5 10 15 Met Ile Ile Glu Thr Thr Ala Tyr Arg Glu Arg Gln Leu Leu Leu Leu 20 25 30 Gln Pro Pro Gln Glu Thr Ala Ile Asp Thr Ala Asn Ala Val Val Thr 35 40 45 Val Gln Asp Arg Gly Leu Lys Thr Arg Arg Pro Glu His Lys Asn Ala 50 55 60 Tyr Ala Thr Met Met Tyr Met Gly Thr Pro Arg Asp Tyr Glu Phe Tyr 65 70 75 80 Val Ala Thr Arg Val Leu Ile Arg Ser Leu Arg Ser Leu His Val Glu 85 90 95 Ala Asp Leu Val Val Ile Ala Ser Leu Asp Val Pro Leu Arg Trp Val 100 105 110 Gln Thr Leu Glu Glu Glu Asp Gly Ala Lys Val Val Arg Val Glu Asn 115 120 125 Val Asp Asn Pro Tyr Arg Arg Gln Thr Asn Phe Asn Ser Arg Phe Lys 130 135 140 Leu Thr Leu Asn Lys Leu Tyr Ala Trp Ala Leu Ser Asp Tyr Asp Arg 145 150 155 160 Val Val Met Leu Asp Ala Asp Asn Leu Phe Leu Lys Lys Ala Asp Glu 165 170 175 Leu Phe Gln Cys Gly Arg Phe Cys Ala Val Phe Ile Asn Pro Cys Ile 180 185 190 Phe His Thr Gly Leu Phe Val Leu Gln Pro Ser Val Glu Val Phe Lys 195 200 205 Asp Met Leu His Glu Leu Gln Val Gly Arg Lys Asn Pro Asp Gly Ala 210 215 220 Asp Gln Gly Phe Leu Val Ser Tyr Phe Ser Asp Leu Leu Asp Gln Pro 225 230 235 240 Leu Phe Ser Pro Pro Ser Asn Gly Ser Val Leu Asn Gly His Leu Arg 245 250 255 Leu Pro Leu Gly Tyr Gln Met Asp Ala Ser Tyr Phe Tyr Leu Lys Leu 260 265 270 Arg Trp Asn Ile Pro Cys Gly Pro Asn Ser Val Ile Thr Phe Pro Gly 275 280 285 Ala Val Trp Leu Lys Pro Trp Tyr Trp Trp Ser Trp Pro Val Leu Pro 290 295 300 Leu Gly Phe Ser Trp His Glu Gln Arg Arg Ala Thr Ile Gly Tyr Ser 305 310 315 320 Ala Glu Met Pro Leu Val Ile Ile Gln Ala Met Phe Tyr Leu Gly Ile 325 330 335 Ile Val Val Thr Arg Leu Ala Arg Pro Asn Ile Thr Lys Leu Cys Tyr 340 345 350 Arg Arg Ser Asp Arg Asn Leu Thr Thr Ile Gln Ala Gly Phe Lys Leu 355 360 365 Ile Ala Leu Leu Ser Val Val Ala Ala Tyr Ile Phe Pro Phe Phe Thr 370 375 380 Ile Pro His Thr Ile His Pro Leu Ile Gly Trp Ser Leu Tyr Leu Met 385 390 395 400 Ala Ser Phe Ala Leu Ser Ser Ile Ser Ile Asn Thr Leu Leu Leu Pro 405 410 415 Thr Leu Pro Val Leu Thr Pro Trp Leu Gly Ile Leu Gly Thr Leu Leu 420 425 430 Val Met Ala Phe Pro Trp Tyr Pro Asp Gly Val Val Arg Ala Leu Ser 435 440 445 Val Phe Ala Tyr Ala Phe Cys Cys Ala Pro Phe Val Trp Val Ser Phe 450 455 460 Arg Lys Ile Thr Ser His Leu Gln Val Leu Ile Glu Lys Glu Val Leu 465 470 475 480 Phe Pro Arg Leu Gly Asp Ser Gly Val Thr Ser Gly Phe Ser Lys Leu 485 490 495 Tyr <210> 9 <211> 1944 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1)..(1944) <400> 9 atg cat cca gct tca tgt agt ctc tca ctc agg aaa gtc aaa ctt aat 48 Met His Pro Ala Ser Cys Ser Leu Ser Leu Arg Lys Val Lys Leu Asn 1 5 10 15 att ctt aca gtg aga atg aag ctc tct tct gaa agt ccc atg gcg ccg 96 Ile Leu Thr Val Arg Met Lys Leu Ser Ser Glu Ser Pro Met Ala Pro 20 25 30 tca agt cag tca agt cat cga ctt tac att tcc agt gag aaa aca aaa 144 Ser Ser Gln Ser Ser His Arg Leu Tyr Ile Ser Ser Glu Lys Thr Lys 35 40 45 acg aag aga ttc caa aga aac gga tac act ctc gat gtt gaa atg tgt 192 Thr Lys Arg Phe Gln Arg Asn Gly Tyr Thr Leu Asp Val Glu Met Cys 50 55 60 gtc aac ttc tct agt ctg aaa ctt gtt ttg ttt ctt atg atg ctg gtt 240 Val Asn Phe Ser Ser Leu Lys Leu Val Leu Phe Leu Met Met Leu Val 65 70 75 80 gct atg ttc aca ctc tac tgt tct cca ccg ttg caa att cct gaa gat 288 Ala Met Phe Thr Leu Tyr Cys Ser Pro Pro Leu Gln Ile Pro Glu Asp 85 90 95 cca tca agt ttt gca aac aaa tgg ata cta gaa cct gct gta acc aca 336 Pro Ser Ser Phe Ala Asn Lys Trp Ile Leu Glu Pro Ala Val Thr Thr 100 105 110 gat cct cgc tat ata gct aca tct gag atc aac tgg aac agt atg tca 384 Asp Pro Arg Tyr Ile Ala Thr Ser Glu Ile Asn Trp Asn Ser Met Ser 115 120 125 ctt gtt gtt gag cat tac tta tct ggc aga agc gag tat caa gga att 432 Leu Val Val Glu His Tyr Leu Ser Gly Arg Ser Glu Tyr Gln Gly Ile 130 135 140 ggc ttt cta aat ctc aac gat aac gag att aat cga tgg cag gtg gtc 480 Gly Phe Leu Asn Leu Asn Asp Asn Glu Ile Asn Arg Trp Gln Val Val 145 150 155 160 ata aaa tct cac tgt cag cat ata gct ttg cat cta gac cat gct gca 528 Ile Lys Ser His Cys Gln His Ile Ala Leu His Leu Asp His Ala Ala 165 170 175 agt aac ata act tgg aaa tct tta tac ccg gaa tgg att gac gag gaa 576 Ser Asn Ile Thr Trp Lys Ser Leu Tyr Pro Glu Trp Ile Asp Glu Glu 180 185 190 gaa aaa ttc aaa gtc ccc act tgt cct tct ctt cct tgg att caa gtt 624 Glu Lys Phe Lys Val Pro Thr Cys Pro Ser Leu Pro Trp Ile Gln Val 195 200 205 cct gac aag tct cga atc gat ctt atc att gcc aag ctc cca tgt aac 672 Pro Asp Lys Ser Arg Ile Asp Leu Ile Ile Ala Lys Leu Pro Cys Asn 210 215 220 aag tca gga aaa tgg tca aga gat gtg gct aga ttg cac tta caa ctt 720 Lys Ser Gly Lys Trp Ser Arg Asp Val Ala Arg Leu His Leu Gln Leu 225 230 235 240 gca gca gct cga gtg gcg gca tct tct gaa ggg ctt cat gat gtt cat 768 Ala Ala Ala Arg Val Ala Ala Ser Ser Glu Gly Leu His Asp Val His 245 250 255 gtg att ttg gta tca gat tgc ttt cca ata ccg aat ctt ttt acg ggt 816 Val Ile Leu Val Ser Asp Cys Phe Pro Ile Pro Asn Leu Phe Thr Gly 260 265 270 caa gaa ctt gtt gcc cgt caa gga aac ata tgg ctg tat aag cct aaa 864 Gln Glu Leu Val Ala Arg Gln Gly Asn Ile Trp Leu Tyr Lys Pro Lys 275 280 285 ctt cac cag tta aga caa aag tta caa ctt cct gtt ggt tcc tgt gaa 912 Leu His Gln Leu Arg Gln Lys Leu Gln Leu Pro Val Gly Ser Cys Glu 290 295 300 ctt tct gtt cct ctt caa gct aaa gat aat ttc tac tcg gca aat gcc 960 Leu Ser Val Pro Leu Gln Ala Lys Asp Asn Phe Tyr Ser Ala Asn Ala 305 310 315 320 aag aaa 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420 425 430 ccc gaa atc tcc aca act gga aac gac ggt acg ctc ttc aac tcc ggt 1344 Pro Glu Ile Ser Thr Thr Gly Asn Asp Gly Thr Leu Phe Asn Ser Gly 435 440 445 cta atg gtg att gaa cca tca aat tca aca ttc cag tta cta atg gat 1392 Leu Met Val Ile Glu Pro Ser Asn Ser Thr Phe Gln Leu Leu Met Asp 450 455 460 cac atc aac gat atc aat tcc tac aat gga gga gac caa ggt tac ctt 1440 His Ile Asn Asp Ile Asn Ser Tyr Asn Gly Gly Asp Gln Gly Tyr Leu 465 470 475 480 aac gag ata ttc aca tgg tgg cat cgg att cca aaa cac atg aat ttc 1488 Asn Glu Ile Phe Thr Trp Trp His Arg Ile Pro Lys His Met Asn Phe 485 490 495 ttg aag cat ttc tgg gaa gga gac aca cct aag cac agg aaa tct aag 1536 Leu Lys His Phe Trp Glu Gly Asp Thr Pro Lys His Arg Lys Ser Lys 500 505 510 acg aga cta ttt gga gct gat cct ccg ata ctc tac gtt ctt cat tac 1584 Thr Arg Leu Phe Gly Ala Asp Pro Pro Ile Leu Tyr Val Leu His Tyr 515 520 525 cta ggt tac aac aaa cca tgg gta tgc ttc aga gac tac gat tgc aat 1632 Leu Gly Tyr Asn Lys Pro Trp Val Cys Phe Arg Asp Tyr Asp Cys Asn 530 535 540 tgg aat gtc gtt gga tac cat caa ttc gcg agc gat gaa gca cac aaa 1680 Trp Asn Val Val Gly Tyr His Gln Phe Ala Ser Asp Glu Ala His Lys 545 550 555 560 act tgg tgg aga gtg cac gac gcg atg cct aag aaa ttg cag agg ttt 1728 Thr Trp Trp Arg Val His Asp Ala Met Pro Lys Lys Leu Gln Arg Phe 565 570 575 tgt cta ctg agt tcg aaa caa aag gcg caa ctt gag tgg gat cgg aga 1776 Cys Leu Leu Ser Ser Lys Gln Lys Ala Gln Leu Glu Trp Asp Arg Arg 580 585 590 caa gct gag aaa gcg aat tac aga gac gga cat tgg agg att aag atc 1824 Gln Ala Glu Lys Ala Asn Tyr Arg Asp Gly His Trp Arg Ile Lys Ile 595 600 605 aaa gat aag aga ctt acg act tgt ttt gaa gat ttc tgt ttc tgg gag 1872 Lys Asp Lys Arg Leu Thr Thr Cys Phe Glu Asp Phe Cys Phe Trp Glu 610 615 620 agt atg ctt tgg cat tgg ggt gag act cag acc aac tcc acc gtc gct 1920 Ser Met Leu Trp His Trp Gly Glu Thr Gln Thr Asn Ser Thr Val Ala 625 630 635 640 gct gat tct tcc tcc acc gcg taa 1944 Ala Asp Ser Ser Ser Thr Ala 645 <210> 10 <211> 647 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 10 Met His Pro Ala Ser Cys Ser Leu Ser Leu Arg Lys Val Lys Leu Asn 1 5 10 15 Ile Leu Thr Val Arg Met Lys Leu Ser Ser Glu Ser Pro Met Ala Pro 20 25 30 Ser Ser Gln Ser Ser His Arg Leu Tyr Ile Ser Ser Glu Lys Thr Lys 35 40 45 Thr Lys Arg Phe Gln Arg Asn Gly Tyr Thr Leu Asp Val Glu Met Cys 50 55 60 Val Asn Phe Ser Ser Leu Lys Leu Val Leu Phe Leu Met Met Leu Val 65 70 75 80 Ala Met Phe Thr Leu Tyr Cys Ser Pro Pro Leu Gln Ile Pro Glu Asp 85 90 95 Pro Ser Ser Phe Ala Asn Lys Trp Ile Leu Glu Pro Ala Val Thr Thr 100 105 110 Asp Pro Arg Tyr Ile Ala Thr Ser Glu Ile Asn Trp Asn Ser Met Ser 115 120 125 Leu Val Val Glu His Tyr Leu Ser Gly Arg Ser Glu Tyr Gln Gly Ile 130 135 140 Gly Phe Leu Asn Leu Asn Asp Asn Glu Ile Asn Arg Trp Gln Val Val 145 150 155 160 Ile Lys Ser His Cys Gln His Ile Ala Leu His Leu Asp His Ala Ala 165 170 175 Ser Asn Ile Thr Trp Lys Ser Leu Tyr Pro Glu Trp Ile Asp Glu Glu 180 185 190 Glu Lys Phe Lys Val Pro Thr Cys Pro Ser Leu Pro Trp Ile Gln Val 195 200 205 Pro Asp Lys Ser Arg Ile Asp Leu Ile Ile Ala Lys Leu Pro Cys Asn 210 215 220 Lys Ser Gly Lys Trp Ser Arg Asp Val Ala Arg Leu His Leu Gln Leu 225 230 235 240 Ala Ala Ala Arg Val Ala Ala Ser Ser Glu Gly Leu His Asp Val His 245 250 255 Val Ile Leu Val Ser Asp Cys Phe Pro Ile Pro Asn Leu Phe Thr Gly 260 265 270 Gln Glu Leu Val Ala Arg Gln Gly Asn Ile Trp Leu Tyr Lys Pro Lys 275 280 285 Leu His Gln Leu Arg Gln Lys Leu Gln Leu Pro Val Gly Ser Cys Glu 290 295 300 Leu Ser Val Pro Leu Gln Ala Lys Asp Asn Phe Tyr Ser Ala Asn Ala 305 310 315 320 Lys Lys Glu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu His Ser Asp Asp Ala Phe Val 325 330 335 Cys Gly Ala Ile Ala Val Ala Gln Ser Ile Arg Met Ser Gly Ser Thr 340 345 350 Arg Asn Leu Val Ile Leu Val Asp Asp Ser Ile Ser Glu Tyr His Arg 355 360 365 Ser Gly Leu Glu Ser Ala Gly Trp Lys Ile His Thr Phe Gln Arg Ile 370 375 380 Arg Asn Pro Lys Ala Glu Ala Asn Ala Tyr Asn Gln Trp Asn Tyr Ser 385 390 395 400 Lys Phe Arg Leu Trp Glu Leu Thr Glu Tyr Asn Lys Ile Ile Phe Ile 405 410 415 Asp Ala Asp Met Leu Ile Leu Arg Asn Met Asp Phe Leu Phe Glu Tyr 420 425 430 Pro Glu Ile Ser Thr Thr Gly Asn Asp Gly Thr Leu Phe Asn Ser Gly 435 440 445 Leu Met Val Ile Glu Pro Ser Asn Ser Thr Phe Gln Leu Leu Met Asp 450 455 460 His Ile Asn Asp Ile Asn Ser Tyr Asn Gly Gly Asp Gln Gly Tyr Leu 465 470 475 480 Asn Glu Ile Phe Thr Trp Trp His Arg Ile Pro Lys His Met Asn Phe 485 490 495 Leu Lys His Phe Trp Glu Gly Asp Thr Pro Lys His Arg Lys Ser Lys 500 505 510 Thr Arg Leu Phe Gly Ala Asp Pro Pro Ile Leu Tyr Val Leu His Tyr 515 520 525 Leu Gly Tyr Asn Lys Pro Trp Val Cys Phe Arg Asp Tyr Asp Cys Asn 530 535 540 Trp Asn Val Val Gly Tyr His Gln Phe Ala Ser Asp Glu Ala His Lys 545 550 555 560 Thr Trp Trp Arg Val His Asp Ala Met Pro Lys Lys Leu Gln Arg Phe 565 570 575 Cys Leu Leu Ser Ser Lys Gln Lys Ala Gln Leu Glu Trp Asp Arg Arg 580 585 590 Gln Ala Glu Lys Ala Asn Tyr Arg Asp Gly His Trp Arg Ile Lys Ile 595 600 605 Lys Asp Lys Arg Leu Thr Thr Cys Phe Glu Asp Phe Cys Phe Trp Glu 610 615 620 Ser Met Leu Trp His Trp Gly Glu Thr Gln Thr Asn Ser Thr Val Ala 625 630 635 640 Ala Asp Ser Ser Ser Thr Ala 645 <210> 11 <211> 1857 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1)..(1857) <400> 11 atg ata cct tcc tca agt ccc atg gag tca aga cat cga ctc tcg ttc 48 Met Ile Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu Ser Arg His Arg Leu Ser Phe 1 5 10 15 tca aaa gag aag aca agt agg agg aga ttt caa aga att gag aag ggt 96 Ser Lys Glu Lys Thr Ser Arg Arg Arg Phe Gln Arg Ile Glu Lys Gly 20 25 30 gtc aag ttc aac act ctg aaa ctt gtg ttg att tgt ata atg ctt gga 144 Val Lys Phe Asn Thr Leu Lys Leu Val Leu Ile Cys Ile Met Leu Gly 35 40 45 gct ttg ttc acg atc tac cgt ttt cgt tat cca ccg cta caa att cct 192 Ala Leu Phe Thr Ile Tyr Arg Phe Arg Tyr Pro Pro Leu Gln Ile Pro 50 55 60 gaa att cca act agt ttt ggt ctt act act gat cct cgc tat gta gct 240 Glu Ile Pro Thr Ser Phe Gly Leu Thr Thr Asp Pro Arg Tyr Val Ala 65 70 75 80 aca gct gag atc aac tgg aac cat atg tca aat ctt gtt gag aag cac 288 Thr Ala Glu Ile Asn Trp Asn His Met Ser Asn Leu Val Glu Lys His 85 90 95 gta ttt ggt aga agc gag tat caa gga att ggt ctt ata aat ctt aac 336 Val Phe Gly Arg Ser Glu Tyr Gln Gly Ile Gly Leu Ile Asn Leu Asn 100 105 110 gat aac gag att gat cga ttc aag gag gta acg aaa tct gac tgt gat 384 Asp Asn Glu Ile Asp Arg Phe Lys Glu Val Thr Lys Ser Asp Cys Asp 115 120 125 cat gta gct ttg cat cta gat tat gct gca aag aac ata aca tgg gaa 432 His Val Ala Leu His Leu Asp Tyr Ala Ala Lys Asn Ile Thr Trp Glu 130 135 140 tct tta tac ccg gaa tgg att gat gaa gtt gaa gaa ttc gaa gtc cct 480 Ser Leu Tyr Pro Glu Trp Ile Asp Glu Val Glu Glu Phe Glu Val Pro 145 150 155 160 act tgt cct tct ctg cct ttg att caa att cct ggc aag cct cgg att 528 Thr Cys Pro Ser Leu Pro Leu Ile Gln Ile Pro Gly Lys Pro Arg Ile 165 170 175 gat ctt gta att gcc aag ctt ccg tgt gat aaa tca gga aaa tgg tct 576 Asp Leu Val Ile Ala Lys Leu Pro Cys Asp Lys Ser Gly Lys Trp Ser 180 185 190 aga gat gtg gct cgc ttg cat tta caa ctt gca gca gct cga gtg gcg 624 Arg Asp Val Ala Arg Leu His Leu Gln Leu Ala Ala Ala Arg Val Ala 195 200 205 gct tct tct aaa gga ctt cat aat gtt cat gtg att ttg gta tct gat 672 Ala Ser Ser Lys Gly Leu His Asn Val His Val Ile Leu Val Ser Asp 210 215 220 tgc ttt cca ata ccg aat ctt ttt acg ggt caa gaa ctt gtt gcc cgt 720 Cys Phe Pro Ile Pro Asn Leu Phe Thr Gly Gln Glu Leu Val Ala Arg 225 230 235 240 caa gga aac ata tgg ctg tat aag cct aat ctt cac cag cta aga caa 768 Gln Gly Asn Ile Trp Leu Tyr Lys Pro Asn Leu His Gln Leu Arg Gln 245 250 255 aag tta cag ctt cct gtt ggt tcc tgt gaa ctt tct gtt cct ctt caa 816 Lys Leu Gln Leu Pro Val Gly Ser Cys Glu Leu Ser Val Pro Leu Gln 260 265 270 gct aaa gat aat ttc tac tcc gca ggt gca aag aaa gaa gct tac gcg 864 Ala Lys Asp Asn Phe Tyr Ser Ala Gly Ala Lys Lys Glu Ala Tyr Ala 275 280 285 act atc ttg cat tct gcc caa ttt tat gtc tgt gga gcc att gca gct 912 Thr Ile Leu His Ser Ala Gln Phe Tyr Val Cys Gly Ala Ile Ala Ala 290 295 300 gca cag agc att cga atg tca ggc tct act cgt gat ctg gtc ata ctt 960 Ala Gln Ser Ile Arg Met Ser Gly Ser Thr Arg Asp Leu Val Ile Leu 305 310 315 320 gtt gat gaa acg ata agc gaa tac cat aaa agt ggc ttg gta gct gct 1008 Val Asp Glu Thr Ile Ser Glu Tyr His Lys Ser Gly Leu Val Ala Ala 325 330 335 gga tgg aag att caa atg ttt caa aga atc agg aac ccg aat gct gta 1056 Gly Trp Lys Ile Gln Met Phe Gln Arg Ile Arg Asn Pro Asn Ala Val 340 345 350 cca aat gcc tac aac gaa tgg aac tac agc aag ttt cgt ctt tgg caa 1104 Pro Asn Ala Tyr Asn Glu Trp Asn Tyr Ser Lys Phe Arg Leu Trp Gln 355 360 365 ctg act gaa tac agt aag atc atc ttc atc gat gca gac atg ctt atc 1152 Leu Thr Glu Tyr Ser Lys Ile Ile Phe Ile Asp Ala Asp Met Leu Ile 370 375 380 ctg aga aac att gat ttc ctc ttc gag ttc cct gag ata tca gca act 1200 Leu Arg Asn Ile Asp Phe Leu Phe Glu Phe Pro Glu Ile Ser Ala Thr 385 390 395 400 gga aac aat gct acg ctc ttc aac tct ggt cta atg gtg gtt gag cca 1248 Gly Asn Asn Ala Thr Leu Phe Asn Ser Gly Leu Met Val Val Glu Pro 405 410 415 tct aat tca aca ttc cag tta cta atg gat aac att aat gaa gtt gtg 1296 Ser Asn Ser Thr Phe Gln Leu Leu Met Asp Asn Ile Asn Glu Val Val 420 425 430 tct tac aac gga gga gac caa ggt tac ctt aac gag ata ttc aca tgg 1344 Ser Tyr Asn Gly Gly Asp Gln Gly Tyr Leu Asn Glu Ile Phe Thr Trp 435 440 445 tgg cat cgg att cca aaa cac atg aat ttc ttg aag cat ttc tgg gaa 1392 Trp His Arg Ile Pro Lys His Met Asn Phe Leu Lys His Phe Trp Glu 450 455 460 gga gac gaa cct gag att aaa aaa atg aag acg agt cta ttt gga gct 1440 Gly Asp Glu Pro Glu Ile Lys Lys Met Lys Thr Ser Leu Phe Gly Ala 465 470 475 480 gat cct ccg atc cta tac gtt ctt cat tac cta ggt tat aac aaa ccc 1488 Asp Pro Pro Ile Leu Tyr Val Leu His Tyr Leu Gly Tyr Asn Lys Pro 485 490 495 tgg tta tgc ttc aga gac tat gac tgc aat tgg aat gtc gat att ttc 1536 Trp Leu Cys Phe Arg Asp Tyr Asp Cys Asn Trp Asn Val Asp Ile Phe 500 505 510 cag gaa ttt gct agt gac gag gct cat aaa acc tgg tgg aga gtg cac 1584 Gln Glu Phe Ala Ser Asp Glu Ala His Lys Thr Trp Trp Arg Val His 515 520 525 gac gca atg cct gaa aac ttg cat aag ttc tgt cta cta aga tcg aaa 1632 Asp Ala Met Pro Glu Asn Leu His Lys Phe Cys Leu Leu Arg Ser Lys 530 535 540 cag aag gcg caa ctt gaa tgg gat agg aga caa gca gag aaa ggg aac 1680 Gln Lys Ala Gln Leu Glu Trp Asp Arg Arg Gln Ala Glu Lys Gly Asn 545 550 555 560 tac aaa gat gga cat tgg aag ata aag atc aaa gac aag aga ctt aag 1728 Tyr Lys Asp Gly His Trp Lys Ile Lys Ile Lys Asp Lys Arg Leu Lys 565 570 575 act tgt ttc gaa gat ttc tgc ttt tgg gag agt atg ctt tgg cat tgg 1776 Thr Cys Phe Glu Asp Phe Cys Phe Trp Glu Ser Met Leu Trp His Trp 580 585 590 ggt gag acg aac tct acc aac aat tct tcc acc acc acc act tca tca 1824 Gly Glu Thr Asn Ser Thr Asn Asn Ser Ser Thr Thr Thr Thr Ser Ser 595 600 605 ccg ccg cat aaa acc gct ctc cct tcc ctg tga 1857 Pro Pro His Lys Thr Ala Leu Pro Ser Leu 610 615 <210> 12 <211> 618 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 12 Met Ile Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu Ser Arg His Arg Leu Ser Phe 1 5 10 15 Ser Lys Glu Lys Thr Ser Arg Arg Arg Phe Gln Arg Ile Glu Lys Gly 20 25 30 Val Lys Phe Asn Thr Leu Lys Leu Val Leu Ile Cys Ile Met Leu Gly 35 40 45 Ala Leu Phe Thr Ile Tyr Arg Phe Arg Tyr Pro Pro Leu Gln Ile Pro 50 55 60 Glu Ile Pro Thr Ser Phe Gly Leu Thr Thr Asp Pro Arg Tyr Val Ala 65 70 75 80 Thr Ala Glu Ile Asn Trp Asn His Met Ser Asn Leu Val Glu Lys His 85 90 95 Val Phe Gly Arg Ser Glu Tyr Gln Gly Ile Gly Leu Ile Asn Leu Asn 100 105 110 Asp Asn Glu Ile Asp Arg Phe Lys Glu Val Thr Lys Ser Asp Cys Asp 115 120 125 His Val Ala Leu His Leu Asp Tyr Ala Ala Lys Asn Ile Thr Trp Glu 130 135 140 Ser Leu Tyr Pro Glu Trp Ile Asp Glu Val Glu Glu Phe Glu Val Pro 145 150 155 160 Thr Cys Pro Ser Leu Pro Leu Ile Gln Ile Pro Gly Lys Pro Arg Ile 165 170 175 Asp Leu Val Ile Ala Lys Leu Pro Cys Asp Lys Ser Gly Lys Trp Ser 180 185 190 Arg Asp Val Ala Arg Leu His Leu Gln Leu Ala Ala Ala Arg Val Ala 195 200 205 Ala Ser Ser Lys Gly Leu His Asn Val His Val Ile Leu Val Ser Asp 210 215 220 Cys Phe Pro Ile Pro Asn Leu Phe Thr Gly Gln Glu Leu 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Phe Thr Trp 435 440 445 Trp His Arg Ile Pro Lys His Met Asn Phe Leu Lys His Phe Trp Glu 450 455 460 Gly Asp Glu Pro Glu Ile Lys Lys Met Lys Thr Ser Leu Phe Gly Ala 465 470 475 480 Asp Pro Pro Ile Leu Tyr Val Leu His Tyr Leu Gly Tyr Asn Lys Pro 485 490 495 Trp Leu Cys Phe Arg Asp Tyr Asp Cys Asn Trp Asn Val Asp Ile Phe 500 505 510 Gln Glu Phe Ala Ser Asp Glu Ala His Lys Thr Trp Trp Arg Val His 515 520 525 Asp Ala Met Pro Glu Asn Leu His Lys Phe Cys Leu Leu Arg Ser Lys 530 535 540 Gln Lys Ala Gln Leu Glu Trp Asp Arg Arg Gln Ala Glu Lys Gly Asn 545 550 555 560 Tyr Lys Asp Gly His Trp Lys Ile Lys Ile Lys Asp Lys Arg Leu Lys 565 570 575 Thr Cys Phe Glu Asp Phe Cys Phe Trp Glu Ser Met Leu Trp His Trp 580 585 590 Gly Glu Thr Asn Ser Thr Asn Asn Ser Ser Thr Thr Thr Thr Ser Ser 595 600 605 Pro Pro His Lys Thr Ala Leu Pro Ser Leu 610 615 <210> 13 <211> 2130 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1)..(1980) <400> 13 atg gca aac tct ccc gct gct cct gca ccc acc acc aca acc ggt 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Pro Arg Tyr Phe Ser Asp Leu Asp Ile Asn Trp Asp Asp Val Thr Lys 115 120 125 acc ctt gag aac atc gaa gaa ggc cgt acg atc ggt gtc ttg aat ttt 432 Thr Leu Glu Asn Ile Glu Glu Gly Arg Thr Ile Gly Val Leu Asn Phe 130 135 140 gat tcg aac gag atc caa cga tgg aga gaa gta tcc aag agc aag gac 480 Asp Ser Asn Glu Ile Gln Arg Trp Arg Glu Val Ser Lys Ser Lys Asp 145 150 155 160 aat ggg gat gaa gaa aaa gtt gtt gta ttg aat cta gat tac gca gac 528 Asn Gly Asp Glu Glu Lys Val Val Val Leu Asn Leu Asp Tyr Ala Asp 165 170 175 aag aat gtg act tgg gac gca cta tat cca gag tgg atc gat gag gag 576 Lys Asn Val Thr Trp Asp Ala Leu Tyr Pro Glu Trp Ile Asp Glu Glu 180 185 190 caa gaa aca gag gtc cct gtt tgt cct aat atc ccg aac att aag gta 624 Gln Glu Thr Glu Val Pro Val Cys Pro Asn Ile Pro Asn Ile Lys Val 195 200 205 cct aca aga aga ctc gat ctg atc gtc gtg aaa ctt cct tgt cgg aaa 672 Pro Thr Arg Arg Leu Asp Leu Ile Val Val Lys Leu Pro Cys Arg Lys 210 215 220 gaa ggg aat tgg tcg aga gac gtc ggg aga ttg cat cta cag cta gcg 720 Glu Gly Asn Trp Ser Arg Asp Val Gly Arg Leu His Leu Gln Leu Ala 225 230 235 240 gct gca act gtg gcg gct tcg gcc aaa ggg ttt ttc agg gga cat gtg 768 Ala Ala Thr Val Ala Ala Ser Ala Lys Gly Phe Phe Arg Gly His Val 245 250 255 ttt ttt gta tct aga tgc ttt ccg att ccg aat ctt ttc cgg tgt aaa 816 Phe Phe Val Ser Arg Cys Phe Pro Ile Pro Asn Leu Phe Arg Cys Lys 260 265 270 gat ctt gtg tct cgg aga ggc gat gtt tgg ttg tac aaa cct aat ctt 864 Asp Leu Val Ser Arg Arg Gly Asp Val Trp Leu Tyr Lys Pro Asn Leu 275 280 285 gat acc ttg aga gac aag ctt cag ctg cct gta ggg tct tgt gag cta 912 Asp Thr Leu Arg Asp Lys Leu Gln Leu Pro Val Gly Ser Cys Glu Leu 290 295 300 tct ctt cct ctt ggc atc caa gat agg cca agc tta gga aac cct aaa 960 Ser Leu Pro Leu Gly Ile Gln Asp Arg Pro Ser Leu Gly Asn Pro Lys 305 310 315 320 aga gaa gct tac gca aca att ctt cac tca gct cac gtt tac gtc tgc 1008 Arg Glu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu His Ser Ala His Val Tyr Val Cys 325 330 335 ggt gca atc gcc gcg gct cag agc ata aga cag tct ggt tcg acg aga 1056 Gly Ala Ile Ala Ala Ala Gln Ser Ile Arg Gln Ser Gly Ser Thr Arg 340 345 350 gac ctt gtt atc ctt gtt gat gac aac atc agc ggt tac cac cgg agt 1104 Asp Leu Val Ile Leu Val Asp Asp Asn Ile Ser Gly Tyr His Arg Ser 355 360 365 gga cta gaa gcc gcg ggt tgg caa atc cgg acg ata cag agg att cga 1152 Gly Leu Glu Ala Ala Gly Trp Gln Ile Arg Thr Ile Gln Arg Ile Arg 370 375 380 aac cct aag gca gag aaa gat gct tac aac gaa tgg aac tac agc aag 1200 Asn Pro Lys Ala Glu Lys Asp Ala Tyr Asn Glu Trp Asn Tyr Ser Lys 385 390 395 400 ttc cgg cta tgg cag ctg act gat tac gac aaa atc att ttc atc gac 1248 Phe Arg Leu Trp Gln Leu Thr Asp Tyr Asp Lys Ile Ile Phe Ile Asp 405 410 415 gcg gat ctc tta atc ttg aga aac atc gat ttc ttg ttc tcg atg cct 1296 Ala Asp Leu Leu Ile Leu Arg Asn Ile Asp Phe Leu Phe Ser Met Pro 420 425 430 gag atc tca gct aca gga aac aat gga act ctg ttt aat tca gga gtt 1344 Glu Ile Ser Ala Thr Gly Asn Asn Gly Thr Leu Phe Asn Ser Gly Val 435 440 445 atg gtg atc gag cct tgc aac tgt acg ttt cag ctt ctg atg gaa cat 1392 Met Val Ile Glu Pro Cys Asn Cys Thr Phe Gln Leu Leu Met Glu His 450 455 460 ata aac gag att gag tct tat aac ggt gga gat caa ggt tac tta aac 1440 Ile Asn Glu Ile Glu Ser Tyr Asn Gly Gly Asp Gln Gly Tyr Leu Asn 465 470 475 480 gag gta ttc aca tgg tgg cac cgg att cca aaa cat atg aat ttc ttg 1488 Glu Val Phe Thr Trp Trp His Arg Ile Pro Lys His Met Asn Phe Leu 485 490 495 aag cat ttt tgg att ggc gat gaa gat gac gcg aaa cgc aag aaa aca 1536 Lys His Phe Trp Ile Gly Asp Glu Asp Asp Ala Lys Arg Lys Lys Thr 500 505 510 gag ctt ttt gga gca gag cct cct gtt ctt tat gtt ctt cat tac ctt 1584 Glu Leu Phe Gly Ala Glu Pro Pro Val Leu Tyr Val Leu His Tyr Leu 515 520 525 ggg atg aag ccg tgg tta tgt tac cgt gac tac gac tgt aac ttc aac 1632 Gly Met Lys Pro Trp Leu Cys Tyr Arg Asp Tyr Asp Cys Asn Phe Asn 530 535 540 tcc gac ata ttc gtt gag ttt gct acc gat atc gct cat cga aaa tgg 1680 Ser Asp Ile Phe Val Glu Phe Ala Thr Asp Ile Ala His Arg Lys Trp 545 550 555 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gccaagtttt ccgcgaggta tccacaacgc cggcggccgc ggtgtctcgc 540 acacggcttc gacggcgttt ctggcgcgtt tgcagggcca tagacggccg ccagcccagc 600 ggcgagggca accagcccgg tgagcgtcgc aaaggcgctc ggtcttgcct tgctcgtcgg 660 tgatgtactt caccagctcc gcgaagtcgc tcttcttgat ggagcgcatg gggacgtgct 720 tggcaatcac gcgcaccccc cggccgtttt agcggctaaa aaagtcatgg ctctgccctc 780 gggcggacca cgcccatcat gaccttgcca agctcgtcct gcttctcttc gatcttcgcc 840 agcagggcga ggatcgtggc atcaccgaac cgcgccgtgc gcgggtcgtc ggtgagccag 900 agtttcagca ggccgcccag gcggcccagg tcgccattga tgcgggccag ctcgcggacg 960 tgctcatagt ccacgacgcc cgtgattttg tagccctggc cgacggccag caggtaggcc 1020 gacaggctca tgccggccgc cgccgccttt tcctcaatcg ctcttcgttc gtctggaagg 1080 cagtacacct tgataggtgg gctgcccttc ctggttggct tggtttcatc agccatccgc 1140 ttgccctcat ctgttacgcc ggcggtagcc ggccagcctc gcagagcagg attcccgttg 1200 agcaccgcca ggtgcgaata agggacagtg aagaaggaac acccgctcgc gggtgggcct 1260 acttcaccta tcctgcccgg ctgacgccgt tggatacacc aaggaaagtc tacacgaacc 1320 ctttggcaaa atcctgtata tcgtgcgaaa aaggatggat ataccgaaaa aatcgctata 1380 atgaccccga agcagggtta tgcagcggaa aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 1440 ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 1500 gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 1560 atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 1620 tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 1680 tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 1740 aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgccaga aggccgccag 1800 agaggccgag cgcggccgtg aggcttggac gctagggcag ggcatgaaaa agcccgtagc 1860 gggctgctac gggcgtctga cgcggtggaa agggggaggg gatgttgtct acatggctct 1920 gctgtagtga gtgggttgcg ctccggcagc ggtcctgatc aatcgtcacc ctttctcggt 1980 ccttcaacgt tcctgacaac gagcctcctt ttcgccaatc catcgacaat caccgcgagt 2040 ccctgctcga acgctgcgtc cggaccggct tcgtcgaagg cgtctatcgc ggcccgcaac 2100 agcggcgaga gcggagcctg ttcaacggtg ccgccgcgct cgccggcatc gctgtcgccg 2160 gcctgctcct caagcacggc 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gcgtttgcaa tgcaccaggt catcattgac ccaggcgtgt tccaccaggc cgctgcctcg 11460 caactcttcg caggcttcgc cgacctgctc gcgccacttc ttcacgcggg tggaatccga 11520 tccgcacatg aggcggaagg tttccagctt gagcgggtac ggctcccggt gcgagctgaa 11580 atagtcgaac atccgtcggg ccgtcggcga cagcttgcgg tacttctccc atatgaattt 11640 cgtgtagtgg tcgccagcaa acagcacgac gatttcctcg tcgatcagga cctggcaacg 11700 ggacgttttc ttgccacggt ccaggacgcg gaagcggtgc agcagcgaca ccgattccag 11760 gtgcccaacg cggtcggacg tgaagcccat cgccgtcgcc tgtaggcgcg acaggcattc 11820 ctcggccttc gtgtaatacc ggccattgat cgaccagccc aggtcctggc aaagctcgta 11880 gaacgtgaag gtgatcggct cgccgatagg ggtgcgcttc gcgtactcca acacctgctg 11940 ccacaccagt tcgtcatcgt cggcccgcag ctcgacgccg gtgtaggtga tcttcacgtc 12000 cttgttgacg tggaaaatga ccttgttttg cagcgcctcg cgcgggattt tcttgttgcg 12060 cgtggtgaac agggcagagc gggccgtgtc gtttggcatc gctcgcatcg tgtccggcca 12120 cggcgcaata tcgaacaagg aaagctgcat ttccttgatc tgctgcttcg tgtgtttcag 12180 caacgcggcc tgcttggcct cgctgacctg ttttgccagg tcctcgccgg 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gtctcccagg tcgccgtggg 13080 aaaagacaag ttcctcttcg ggcttttccg tctttaaaaa atcatacagc tcgcgcggat 13140 ctttaaatgg agtgtcttct tcccagtttt cgcaatccac atcggccaga tcgttattca 13200 gtaagtaatc caattcggct aagcggctgt ctaagctatt cgtataggga caatccgata 13260 tgtcgatgga gtgaaagagc ctgatgcact ccgcatacag ctcgataatc ttttcagggc 13320 tttgttcatc ttcatactct tccgagcaaa ggacgccatc ggcctcactc atgagcagat 13380 tgctccagcc atcatgccgt tcaaagtgca ggacctttgg aacaggcagc tttccttcca 13440 gccatagcat catgtccttt tcccgttcca catcataggt ggtcccttta taccggctgt 13500 ccgtcatttt taaatatagg ttttcatttt ctcccaccag cttatatacc ttagcaggag 13560 acattccttc cgtatctttt acgcagcggt atttttcgat cagttttttc aattccggtg 13620 atattctcat tttagccatt tattatttcc ttcctctttt ctacagtatt taaagatacc 13680 ccaagaagct aattataaca agacgaactc caattcactg ttccttgcat tctaaaacct 13740 taaataccag aaaacagctt tttcaaagtt gttttcaaag ttggcgtata acatagtatc 13800 gacggagccg attttgaaac cacaattatg ggtgatgctg ccaacttact gatttagtgt 13860 atgatggtgt ttttgaggtg ctccagtggc 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cat agt gat ttg ttg ttg 1104 Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu 355 360 365 gcg ttt ggg gta agg ttt gat gat cgt gtc acg ggt aaa ctt gag gct 1152 Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala 370 375 380 ttt gct agt agg gct aag att gtt cat att gat att gac tcg gct gag 1200 Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu 385 390 395 400 att ggg aag aat aag act cct cat gtg tct gtg tgt ggt gat gtt aag 1248 Ile Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys 405 410 415 ctg gct ttg caa ggg atg aat aag gtt ctt gag aac cga gcg gag gag 1296 Leu Ala Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu 420 425 430 ctt aaa ctt gat ttt gga gtt tgg agg aat gag ttg aac gta cag aaa 1344 Leu Lys Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Asn Glu Leu Asn Val Gln Lys 435 440 445 cag aag ttt ccg ttg agc ttt aag acg ttt ggg gaa gct att cct cca 1392 Gln Lys Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro 450 455 460 cag tat gcg att aag gtc ctt gat gag ttg act gat gga aaa gcc ata 1440 Gln Tyr Ala Ile Lys Val Leu Asp Glu Leu Thr Asp Gly Lys Ala Ile 465 470 475 480 ata agt act ggt gtc ggg caa cat caa atg tgg gcg gcg cag ttc tac 1488 Ile Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr 485 490 495 aat tac aag aaa cca agg cag tgg cta tca tca gga ggc ctt gga gct 1536 Asn Tyr Lys Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Gly Gly Leu Gly Ala 500 505 510 atg gga ttt gga ctt cct gct gcg att gga gcg tct gtt gct aac cct 1584 Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro 515 520 525 gat gcg ata gtt gtg gat att gac gga gat gga agt ttt ata atg aat 1632 Asp Ala Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn 530 535 540 gtg caa gag cta gcc act att cgt gta gag aat ctt cca gtg aag gta 1680 Val Gln Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Val 545 550 555 560 ctt tta tta aac aac cag cat ctt ggc atg gtt atg caa tgg gaa gat 1728 Leu Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Trp Glu Asp 565 570 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His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Asn Gly Gly Thr 645 650 655 Phe Asn Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Ile Lys Tyr 660 665 670 <210> 18 <211> 259 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> promoter <222> (1)..(259) <220> <223> Description of Artificial Sequence:be2promoter fragment <400> 18 gatctctaaa taattcgaaa tatctttgtt attatttttt tctattcaaa ttgcaattag 60 acataagtca ttttaactga agctgcattg atgaaaaatt atactatgtc tttatgtata 120 tatattaatg ttttaaattc ctttatagtg ataaagatgg ttcgaaacat gctacaaatt 180 attatacgaa gttacttttt ttaatctact ttaacaattt tctaatttca ctattgaaca 240 tagataccag cccgggccg 259 <210> 19 <211> 400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:RNAi420be2be1 <220> <400> 19 gaattgttgt tctcatggac atcgttcaca gccatgcatc aaataatact ttagatggac 60 tgaacatgtt tgacggcacc gatagttgtt actttcactc tggagctcgt ggttatcatt 120 ggatgtggga ttcccgcctc tttaactatg gaaactggga ggtacttagg tatcttctct 180 caaatgcgag atggtggttg ccatttcaca tcaccagaag 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Claims (27)

  1. 하나 이상의 전분 생합성 증강 단백질의 발현 또는 활성이 증강된 식물을 배양하는 것을 포함하여, 식물에서 전분 생산을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 전분이 고 아밀로스 함량을 갖는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아밀로스 생산이 증가되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 전분 생합성 증강 단백질을 과발현시키는 것을 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단백질이 서열 번호 2 또는 4의 서열을 포함하거나, 또는 아미노산 수준에 있어 서열 번호 2 또는 4와 50％ 이상 동일하고, 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실에 의해 상기 서열로부터 유도된 단백질을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 전분 생합성 증강 단백질이
    a) 서열 번호 1 또는 3의 핵산 서열과의 동일률이 60％ 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열;
    b) 서열 번호 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열의 30개 이상의 뉴클레오티드 단편을 포함하는 핵산 서열;
    c) 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열과 약 60％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열; 및
    d) 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열의 10개 이상의 연속되는 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드 단편을 암호화하는 핵산 서열
    로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열에 의해 암호화되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 전분 생합성 증강 단백질이 서열 번호 1 또는 서열 번호 3으로서 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 활성 결핍 또는 저하가
    a) 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 녹-아웃시키는 방법;
    b) 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 돌연변이 유발시키는 방법 [이러한 돌연변이는 상기 유전자의 암호화, 비-암호화 또는 조절성 영역에서 유도될 수 있다]; 및
    c) 상기 단백질을 암호화하는 RNA의 적어도 일부분과 상보적인 안티센스 RNA를 발현시키는 방법
    으로 이루어진 군 중에서 선택된 방법에 의해 달성되는 것인 방법.
  9. 식물이 증가 량의 아밀로스 유형 전분을 생성시키는 조건 하에, 서열 번호 1 또는 3을 과발현시키거나 전분 생합성 증강 활성이 증가된 식물을 배양함으로써, 아밀로스 유형 전분을 생성시키는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 식물이 솔라눔 속 (genus Solanum)에 속하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 식물이 솔라눔 튜베로숨 (Solanum tuberosum)인 방법.
  12. 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 서열 번호 1의 핵산 서열.
  13. 전분 생합성 증강 단백질을 암호화하는 서열 번호 3의 핵산 서열.
  14. 전분 생합성 증강 활성을 지닌 서열 번호 2의 아미노산 서열.
  15. 전분 생합성 증강 활성을 지닌 서열 번호 4의 아미노산 서열.
  16. a) 서열 번호 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열과의 동일률이 60％ 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열;
    b) 서열 번호 1 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열의 30개 이상의 뉴클레오티드 단편을 포함하는 핵산 서열;
    c) 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열과 약 60％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열; 및
    d) 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 2 또는 4의 아미노산 서열의 10개 이상의 연속되는 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드 단편을 암호화하는 핵산 서열
    로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을, 식물에서 상기 핵산 서열의 발현을 매개할 수 있는 조절성 서열과 조합하여 포함하는 형질전환성 발현 카세트.
  17. 제16항에 있어서, 조절성 서열이 상기 핵산 서열에 대해 이종인 (heterologous) 프로모터 서열인 형질전환성 발현 카세트.
  18. 제16항에 있어서, 조절성 서열이 괴경 (tuber) 특이적 프로모터 서열인 형질전환성 발현 카세트.
  19. 제16항, 제17항 및 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열이 상기 프로모터 서열에 대해 안티센스 또는 센스 배향으로 배열되어 있는 형질전환성 발현 카세트.
  20. 제16항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 것인 형질전환성 발현 카세트.
  21. 제16항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 형질전환성 발현 카세트.
  22. 제16항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 천연 변이체를 암호화하는 것인 형질전환성 발현 카세트.
  23. 제16항 내지 제22항 중의 어느 한 항의 발현 카세트로 형질전환시킨 형질전환성 숙주 세포.
  24. 제23항에 있어서, 솔라눔 속에 속하는 형질전환성 숙주 세포.
  25. 제16항 내지 제22항 중의 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 형질전환성 식물.
  26. 제16항 내지 제22항 중의 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 형질전환성 감자 식물.
  27. 제16항 내지 제22항 중의 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 형질전환성 감자 식물, 식물 부분, 종자 또는 괴경.
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