KR20050096115A - 케톤 또는 관련 관능기를 함유하는 중합체성 시약 - Google Patents

케톤 또는 관련 관능기를 함유하는 중합체성 시약 Download PDF

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Abstract

직접적으로 또는 하나 이상의 원자에 의해 케톤 또는 관련 관능기, 예컨대 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오헤드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 또는 디테오케탈에 결합된 PEG 와 같은 중합체를 포함하는 중합체성 시약을 제공한다. 상기 중합체성 시약은 다른 것 중, 중합체-활성제 콘쥬게이트의 형성에 유용하다. 관련 방법, 조성물, 제제 등 또한 제공된다.

Description

케톤 또는 관련 관능기를 함유하는 중합체성 시약{POLYMERIC REAGENTS COMPRISING A KETONE OR A RELATED FUNCTIONAL GROUP}
본 발명은 케톤 또는 예컨대, 케톤 하이드레이트, 티온, 모노티오하이드레이트, 디티오하이드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케날과 같은 관련 관능기를 함유하는 중합체성 시약에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 여기에 기재하는 중합체성 시약을 활성제(active agent)와 같은 다른 물질에 부착함으로써 형성되는 콘쥬게이트에 관한 것이다. 더 나아가, 본 발명은 중합체성 시약을 합성하는 방법, 중합체성 시약을 또 다른 물질에 콘쥬게이션 방법, 중합체성 시약을 함유하는 조성물 등에 관한 것이다.
과학자 및 임상의들은 활성제를 환자에게 전달하는데 적합한 형태로 개발하려는 시도에 있어서 많은 도전에 직면하고 있다. 예컨대, 폴리펩티드인 활성제는 구강투여 보다는 종종 주사로 투여된다. 이런 방법으로 위의 단백질 가수분해 환경에 노출됨 없이 펩티드가 체순환으로 도입된다.
그러나 폴리펩티드의 주사는 몇가지 단점을 갖는다. 예컨대, 많은 폴리펩티드는 상대적으로 짧은 반감기를 가지며 그럼으로써 반복투여를 필요로 하고 이는 종종 불편하고 고통스럽다. 또한, 어떤 폴리펩티드는 하나 이상의 면역반응을 유도하고 그 결과로 환자의 면역체계가 활성화되어 폴리펩티드를 분해시키거나 불활성화시키게 된다. 따라서, 폴리펩티드 및 기타 활성제의 전달은 종종 이들 제제가 주사로 투여되었을 때조차 문제가 있다.
활성제를 주사로 전달하는 문제를 성공적으로 해결한 경우가 일부 있다. 예컨대, 활성제를 수용성 중합체에 콘쥬게이트시키면 면역원성(immunogenicity)과 항원성(antigenicity)이 감소된 중합체-활성 제제 콘쥬게이트를 얻을 수 있다. 또한, 이들 콘쥬게이트는 종종 콘쥬게이트 되지 않은 이들의 대조물에 비하여 신장을 통한 청소율(clearance)의 감소 및/또는 생체 내 효소적 분해의 감소의 결과로 반감기가 크게 증가한다. 반감기가 더 길기 때문에, 콘쥬게이트는 투여 횟수가 줄어들게 되고 이에 따라 고통스러운 주사의 총 회수 및 의료전문인을 방문하는 불편이 감소된다. 또한, 물에 잘 녹지 않는 활성제가 수용성 중합체에 콘쥬게이트 되었을 때 수용성이 현저히 증가하는 경우가 종종 있다.
폴리(에틸렌 글리콜)은 그 문서화된 안전성 및 FDA 승인으로 국소용 및 내복용 모두에서 활성제에 콘쥬게이트되고 있다. 활성제가 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체에 콘쥬게이트되는 경우, 콘쥬게이트된 활성제는 통상적으로 "PEG화" 되었다고 한다. PEG화 활성제의 상업적 성공은 그 가치를 증명한다. 상용화된 PEG화 폴리펩티드의 예로는 PEGASYS® PEG화 인터페론 알파-2a (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ), PEG-INTRON® PEG화 인터페론 알파-2b (Schering Corp. , Kennilworth, NJ), SOMAVERT® PEG화 인간성장호르몬수용체 길항제, 및 NEULASTAW® PEG-과립구집락자극인자 (Amgen Inc. , Thousand Oaks, CA) 가 있다. 디스테아롤포스파티딜에탄올아민(Zalipsky (1993) Bioconjug. Chem. 4 (4): 296-299)과 같은 PEG화 소분자 및 플루오로우라실 (Ouchi et al. (1992) Drug Des. Discov.9(1) : 93-105) 이 또한 제조되었다.
이들의 성공에도 불구하고, 활성제에 대한 중합체의 콘쥬게이션은 여전히 어렵다. 특히, 콘쥬게이트 반응은 상대적으로 분산된 생성물의 혼합물이 얻어진다는 점에서 상대적으로 부정확하다. 예컨대, 콘쥬게이션 반응은 종종 단일치환, 이중치환, 및 다중치환된 콘쥬게이트 형태의 혼합물을 얻는다. 또한, 활성제의 상이한 부착 부위가 상이한 부착 배열의 결과를 가져올 수 있는 한, 상이한 콘쥬게이트 형태의 가능한 수는 증가한다.
예컨대, 세개의 상이한 중합체에 대한 부착 부위를 갖는 단일치환 활성제는 세개의 상이한 형태를 가질 수 있다: 각각의 형태는 상이한 세개의 부착부위 중 하나에 부착된 하나의 중합체를 갖는다. 각각의 콘쥬게이트 형태가 독특한 약역학적(pharmacodynamic) 또는 약동학적(pharmacokinetic) 프로필을 가질 수 있다는 것을 인식는 것은 치료제로서의 사용에 적합한 중합체 활성제 콘쥬게이트를 제공하는 것과 관련된 복잡성을 예고한다. 따라서, 원하는 콘쥬게이트를 보다 예측가능하게 형성할 수 있도록 "부위지향적(site-directed)"인 중합체성 시약을 제공하고자 하는 요구가 있다.
콘쥬게이트 반응에서의 어느 정도의 선택성은 중합체성 시약에 존재하는 특정 관능기의 존재에 근거하여 달성될 수 있다.
예컨대, 알데히드 유도체를 갖는 하기 폴리(에틸렌 글리콜) 유도체는, 예컨대, 폴리펩티드의 1차 아민과 환원성 아미노화 반응을 한다.
알데히드 유도체를 갖는 하기 폴리(에틸렌 글리콜) 유도체.
[식에서, (n)은 반복되는 에틸렌 옥사이드 단위의 수를 나타낸다].
결과적으로, 콘쥬게이트가 상대적으로 반응성이 좋고 용이하게 접근 가능한 1차 아민기와 중합체성 시약의 알데히드 사이에서만 통상적으로 일어난다는 점에서 어느 정도의 선택성은 달성된다. 그러나, 상대적으로 반응성이 좋은 1차 아민기를 많이 갖는 폴리펩티드(예컨대, 1차 아민-함유 라이신 잔기를 많은 갖는 폴리펩트드)에서는, 그럼에도 불구하고 콘쥬게이트 반응의 결과로 콘쥬게이트 형태들의 상대적으로 다분산적인 혼합물이 얻어진다.
알데히드기를 갖는 중합체성 시약의 대체물을 제공하기 위하여, 본 발명은 케톤 또는 관련 관능기를 갖는 중합체성 시약(예컨대, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 또는 디티오케탈)을 제공한다.
다른 것은 다양한 상황에서 사용될 수 있는 케톤 또는 관련 관능기를 갖는 중합체를 기재하였다. 그러나, 전형적으로 상기 기재된 중합체는 콘쥬게이션에는 적합하지 않다.
예컨대, 국제공개 96/33156는 벤조페논의 폴리(알킬렌 글리콜) 유도체 및 관련 방향족 부분(moiety)에 대해 기재한다. 상기 유도체는 광개시제로 유용한 것으로 기재되어 있다. 그러나, 방향족 부분의 소수성이 바람직하지 않게도 수용성을 감소시키기 때문에 활성제에의 콘쥬게이션에 유용한 중합체성 시약에는 방향족 고리가 부존재한다.
또한, 콘쥬게이트에 함유된 방향족 고리는 생체내에서 아렌 산화물 중간체로 대사될 수 있고, 이는 단백질, DNA 및 RNA 상에 존재하는 친핵성 기와 공유결합할 수 있으며, 그러므로써 세포독성을 유발할 수 있다. 문헌[Daly et al. (1979) Experientia 28(10): 1129-1149]을 참조하라.
미국특허 제 5,149,806호는 마이클 주게(Michael donor)로서 유용한 탄소산에 대해서 기재한다. 기재된 구조 중 하나는 아래와 같다:
이와 같은 구조가 콘쥬게이션 반응에 사용될 수 있다고 할지라도, 프로필렌 옥사이드 중합체는 콘쥬게이트의 생체 투여가 허용될 정도의 적절한 수용성 갖지 못한다.
이전에 알려진 다른 중합체성 시약은 유사한 결함을 갖는다.
따라서, 이 분야에 있어서, 무엇보다도, 다른 물질과의 콘쥬게이트를 제공하는데 유용한 중합체성 시약의 제공이 필요하다.
본 발명은 특히, 케톤 또는 관련 관능기(예컨대, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 또는 디티오케탈)를 함유하는 신규한 중합체성 시약을 제공함으로써 당업계의 이러한 요구 및 다른 요구를 해결하였다.
도 1은 콘쥬게이트 반응에서 케톤 관능기를 함유하는 중합체성 시약 및 이의 히드레이트간의 평형상태를 보여주는 도이다. 카르비놀아민 및 그에 대응하는 이민간의 축합을 나타내는 두번째 평형상태로 또한 나타난다.
도 2는 케톤 관능기를 함유하는 중합체성 시약로부터 케탈의 형성 및 케탈 관능기를 함유하는 중합체성 시약으로부터 콘쥬게이트의 형성을 보여주는 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 콘쥬게이션 방법을 도식화한 것이다.
이에 따라, 본 발명의 주된 목적은 관능기 및 수용성 중합체 단편(segment)을 함유하는 중합체성 시약을 제공하는 것이고, 여기서 상기 관능기는 하나 이상의 원자를 통하여 수용성 중합체 단편에 부착되어 있고, 여기서 상기 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 수용성 중합체 단편이 2,200 초과의 분자량을 갖는 그러한 중합체성 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 관능기가 케톤, 케톤 히드레이트, 헤미케탈, 및 케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 그러한 중합체성 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 수용성 중합체 단편이 폴리(에틸렌 글리콜)인 그러한 중합체성 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 여기 기재된 중합체성 시약을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 물질과 여기 기재된 바와 같은 중합체성 시약의 콘쥬게이트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 물질이 활성제인 그러한 콘쥬게이트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 여기 기재된 바와 같은 중합체-활성제 콘쥬게이트를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 물질과 여기 기재된 중합체 콘쥬게이트를 투여하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 추가적인 목적, 장점 및 신규한 특성은 하기에서 상세히 설명될 것이며 부분적으로는, 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련된 자에게 자명할 것이고 본 발명을 실시함으로써 알 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 한 구현예에서, 관능기 및 수용성 중합체 단편을 함유하는 중합체성 시약이 제공된다. 관능기 및 수용성 중합체 단편은 직접적인 공유결합 또는 하나 이상의 원자를 통하여 부착된다. 상기 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된다. 무엇보다도, 상기 중합체성 시약은 또 다른 물질(예컨대, 활성제)과 중합체-함유 콘쥬게이트를 형성할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 관능기 및 중량 평균 분자량이 2,200 초과의 수용성 중합체 단편을 함유하는 중합체성 시약이 제공되며, 여기서 상기 관능기는 직접적인 공유결합 또는 하나 이상의 원자를 통하여 수용성 중합체 단편에 부착되고 또한, 여기서 (a) 상기 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되며, 및 (b) 상기 중합체성 시약은 다음의 각각이 결여된 것이다: 방향족 부분; 프롤린 잔기; 시클릭 디엔온, 탄소수 8 이상의 포화 탄화수소 사슬; 및 -ONH2 기, 단, 상기 중합체성 시약은 하기
, , 및 케탈 유도체 중 어느 것도 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 관능기 및 수용성 중합체 단편을 함유하는 중합체성 시약이 제공되고, 여기서 상기 관능기는 직접적인 공유결합 또는 하나 이상의 원자를 통하여 수용성 중합체 단편에 부착되고 또한, 여기서 (a) 상기 관능기는 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되며, 및 (b) 상기 중합체성 시약은 탄소수 8 이상의 포화 탄화수소 사슬이 결여된 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 수용성 중합체 단편 및 관능기를 함유하는 중합체성 시약이 제공되고, 여기서 상기 관능기는 고리 구조의 일부이고 또한 여기서 상기 고리 구조는 직접적인 공유결합 또는 하나 이상의 원자를 통하여 수용성 중합체 단편에 부착되고 여기서, 상기 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되며, 또한, 중합체성 시약은 시클릭 디엔온이 결여된 것이다.
아래에서 더욱 상세히 설명될 것과 같이, 본 발명의 상기 중합체성 시약은 많은 상이한 형태를 포함한다. 예컨대 본 발명에 포함되는 단일작용성 중합체성 시약의 예는 다음과 같은 구조를 함유한다:
(화학식 I)
[식에서:
POLY1은 -0-R7로 정의되는 말단을 갖는 수용성 중합체 단편이고;
(a) 는 0 또는 1이고;
(b) 는 0 또는 1이고;
Xl는, 존재하는 경우, 스페이서 부분이고;
EWl는, 존재하는 경우, 전자 흡인기이고;
(z)는 0 또는 양의 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7이고;
각각의 R2는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼, 예컨대, H 또는 비방향족-함유 유기 라디칼이고;
각각의 R3는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼, 예컨대, H 또는 비방향족-함유 유기 라디칼이고;
R7은 H 또는 유기 라디칼, 예컨대, H 또는 비방향족-함유 유기 라디칼;
FG는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로부터 선택되는 관능기이고; 및
R1은 유기 라디칼, 예컨대, 비방향족-함유 유기 라디칼이고;
또한, 여기서 부분은 선택적으로 하나 이상의 이중 결합을 함유하고;
단, 상기 중합체성 시약은 다음 중 어느 것도 아니다:
또는
].
본 발명의 중합체성 시약은 또한 2개의 관능기 (동일하거나 상이한)를 함유하는 이관능성 중합체성 시약의 형태로 제공될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 포함되는 이관능성 중합체성 시약은 다음과 같은 구조를 함유한다:
(화학식 II)
[식에서:
POLY1 는 수용성 중합체 단편이고;
(a) 는 0 또는 1이고;
(b) 는 0 또는 1이고;
(c) 는 0 또는 1이고;
(d) 는 0 또는 1이고;
Xl은, 존재하는 경우, 스페이서 부분이고;
X2는, 존재하는 경우, 스페이서 부분이고;
EWl은, 존재하는 경우, 전자 흡인기이고;
EW2는, 존재하는 경우, 전자 흡인기이고;
(z)는 0 또는 양의 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7이고;
(y)는 0 또는 양의 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7이고;
각각의 R2는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼, 예컨대, H 또는 비방향족-함유 유기 라디칼이고;
각각의 R3는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼, 예컨대, H 또는 비방향족-함유 유기 라디칼이고;
각각의 R4는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼, 예컨대, H 또는 비방향족-함유 유기 라디칼이고;
각각의 R5는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼, 예컨대, H 또는 비방향족-함유 유기 라디칼이고;
-FG-Rl 은 (i) R1 으로 정의되는 말단을 갖고, 여기서 R1은 유기 라디칼이고, 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로부터 선택되는 관능기, 또는 (ii) 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기가 고리 구조의 일부인 비(非) 디엔온 고리구조이고; 및
-FG-R6 는 (i) R6 로 정의되는 말단을 갖고, 여기서 R1은 유기 라디칼이고, 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기, 또는 (ii) 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기가 고리 구조의 일부인 비(非) 디엔온 고리구조이다. 선택적으로, 화학식 II의 각각의 및 부분이 하나 이상의 이중결합을 갖는다].
또 다른 구현예에서, 본 발명은 2 이상의 수용성 중합체 단편(동일하거나 상이한) 및 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기를 함유하는 중합체성 시약을 제공한다. 예컨대, 중합체성 시약은 제 1 수용성 중합체 단편, 제 2 수용성 중합체 단편, 및 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기를 함유하고, 여기서 제 1 및 제 2 수용성 중합체 단편 각각은 직접적인 공유결합 또는 하나 이상의 원자를 통하여 상기 관능기에 부착되고 또한, 여기서, 상기 관능기가 케톤, 케톤 히드레이트, 헤미케탈 또는 케탈일 때: (a) 상기 중합체성 시약은 방향족 부분이 결여되거나; 또는 (b) 상기 중합체성 시약 내의 각 수용성 중합체 단편이 1000 달톤 이상의 중량 평균 분자량을 갖는다. 아래에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, 여기 기재된 두 수용성 중합체 단편을 함유하는 중합체성 시약은 선형일 수 있고, 문자 "V"의 형태를 취할 수 있어서 상기 문자의 각 선 단편은 하나의 수용성 중합체 단편을 함유하는 하나의 단일한 원자 사슬을 갖고 각 사슬은 상기 관능기의 탄소 원자에 부착된다. 2 이상의 수용성 중합체 단편을 함유하는 중합체성 시약의 비선형 형태도 또한 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 중합체성 시약을 함유하는 조성물이 제공된다. 바람직하게는, 상기 중합체성 시약 조성물은 산화 부생성물이 없거나 거의 없다. 중합체성 시약을 함유하는 중합체성 시약 조성물의 예는 다음과 같은 구조를 함유한다:
[식에서:
(a) 는 0 또는 1;
(b) 는 0 또는 1;
X1는, 존재하는 경우, 스페이서 부분이고;
EWl은, 존재하는 경우, 전자 흡인기이고;
(z)는 0 또는 양의 정수, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7이고;
각각의 R2는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼, 예컨대, H 또는 비방향족-함유 유기 라디칼이고;
각각의 R3는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼, 예컨대, H 또는 비방향족-함유 유기 라디칼이고; 및
(m)은 양의 정수, 예컨대, 11 내지 약 3000이고,
여기서, 상기 조성물은 실질적으로 산화 부생성물이 없다. 바람직하게는 상기 조성물은 또한 β-케토 에스테르, , 및 케탈 유도체 가 결여된다].
본 발명은 또한 중합체성 시약을 제조하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구현예에서 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다: (i) 중합을 개시하기에 적합한 하나 이상의 활성 음이온성 부위, 및 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 전구체 분자를 제공하고 ; (ii) 상기 전구체 분자의 음이온성 부위를 중합이 가능한 반응성 단량체와 접촉시킴으로써 반응성 단량체의 전구체 분자로의 중합을 개시하고 ; (iii) 추가적인 반응성 단량체를 전구체 분자에 첨가하여 하나 이상의 중합체 사슬을 형성하고; (iv) 상기 하나 이상의 중합체 사슬이 원하는 길이에 도달할 때까지 상기 첨가를 계속하고 ; (v) 반응을 종료함으로써 상기 관능기, 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 중합체성 시약을 얻고 ; 및 (vi) 선택적으로, 상기 관능기가 보호된 형태일 때, 관능기의 보호기를 제거한다.
다음 단계를 포함하는 중합체성 시약을 형성하는 또 다른 방법이 제공된다: (i) 보호된 2차 알콜 또는 티올 및 중합을 개시하기에 적합한 하나 이상의 활성 음이온성 부위를 함유하는 전구체 분자를 제공하고 ; (ii) 상기 전구체 분자의 음이온성 부위를 중합이 가능한 반응성 단량체와 접촉시킴으로써 반응성 단량체의 전구체 분자로의 중합을 개시하고; (iii) 추가적인 반응성 단량체를 전구체 분자에 첨가하여 하나 이상의 중합체 사슬을 형성하고; (iv) 상기 하나 이상의 중합체 사슬이 원하는 길이에 도달할 때 까지 상기 첨가를 계속하고 ; (v) 반응을 종료함으로써 보호된 2차 알콜 또는 티올을 함유하는 중간체를 얻고 ; (vi) 상기 중간체의 보호된 2차 알콜 또는 티올의 보호기를 제거하여 비보호 2차 알콜 또는 티올을 형성하고 ; (vii) 비보호 2차 알콜 또는 티올을 산화시켜, 상기 전구체 분자가 2차 알콜을 함유한 경우 케톤을 함유하는 중합체성 시약을 얻고, 또는 상기 전구체 분자가 2차 티올을 함유하는 경우 티온을 함유하는 중합체성 시약을 얻고; 및 (viii) 선택적으로, 상기 케톤 또는 티온을 추가적으로 변형시켜 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기를 얻는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다: (i) 하나 이상의 이소시아네이트 부분, 및 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 전구체 분자를 제공하고; 및 (ii) 적절한 조건하에서, 상기 전구체 분자 및 하나 이상의 히드록실기를 갖는 수용성 중합체 단편을 접촉시킴으로써 상기 관능기 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 중합체성 시약을 형성하고 ; 및 (iii) 선택적으로, 상기 관능기가 보호된 형태일 때, 상기 관능기의 보호기를 제거한다.
중합체성 시약을 제공하기 위한 본 발명의 또 다른 구현예에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 설명된다: (i) 하나 이상의 가용 친핵성기를 함유하는 수용성 중합체 단편을 제공하고 ; (ii) 하나 이상의 활성화기 및 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 전구체 분자를 제공하고; (iii) 적절한 조건하에서, 상기 전구체 분자를 상기 수용성 중합체 단편와 접촉시킴으로써, 상기 관능기 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 중합체성 시약을 형성하고 ; 및 (iv) 선택적으로, 상기 관능기가 보호된 형태일 때, 상기 관능기의 보호기를 제거한다.
중합체성 시약을 제조하기 위한 또 다른 구현예에서, 다음 단계를 포함하는 방법이 제공된다 : (i) 하나 이상의 가용 이탈기를 갖는 수용성 중합체 단편을 제공하고; (ii) 하나 이상의 친핵성기 및 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 전구체 분자를 제공하고 ; (iii) 적절한 조건하에서, 상기 전구체 분자를 상기 수용성 중합체 단편와 접촉시킴으로써, 상기 관능기 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 중합체성 시약을 형성하고 ; 및 (iv) 선택적으로, 상기 관능기가 보호된 형태일 때, 상기 관능기의 보호기를 제거한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 알콕시드 이온 또는 티올레이트 이온을 함유하는 수용성 중합체 단편을 하나 이상의 이탈기 및 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 전구체 분자와 반응시키는 단계를 포함하고 그로써 중합체성 시약을 제공하는 중합체성 시약을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 여기서 제공되는 바와 같은 중합체성 시약을 콘쥬게이트를 제공하기에 적절한 조건하에서 활성제와 접촉시키는 단계를 포함하는 콘쥬게이트를 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 약학적 첨가제와 조합된 본 발명의 콘쥬게이트를 함유하는 약학적 조성물이 제공된다. 상기 약학적 조성물은 모든 형태의 제형을 포함하며 특히 주사에 적합한 제형, 예컨대, 현탁액 및 용액 뿐 아니라 환원(reconstituted)될 수 있는 분말을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 중합체-활성제 콘쥬게이트가 제공된다. 따라서, 예컨대, 본 발명은 활성제의 질소 원자가 제 2 탄소 원자에 결합된 공유결합을 함유하는 콘쥬게이트를 제공하며, 여기서 상기 제 2 탄소는 하나 이상의 원자를 통하여 수용성 중합체 단편에 부착되고 상기 하나 이상의 원자는 상기 제 2 탄소의 베타 위치의 카르보닐 부분이 결여된다.
본 발명의 또 다른 구현에에서, 여기서 제공되는 콘쥬게이트를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 콘쥬게이트의 투여방법이 제공된다. 상기 콘쥬게이트는 종종 약학적 제제의 일부로 제공된다. 상기 콘쥬게이트를 투여하려는 임의의 접근이 사용될 수 있고 본 발명은 이와 관련하여 한정되지 않는다. 그러나, 상기 콘쥬게이트는 주사를 통해 투여되는 것이 바람직하다.
정의 및 개요
본 발명의 상세히 설명하기 전에 본 발명은 특정 중합체, 합성기법, 활성제, 및 이와 같은 것들에 한정되지 아니함이 이해되어야 한다.
명세서에서 뚜렷하게 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 단수형에는 복수 참조형이 포함된다. 따라서, 예컨대, "중합체성 시약"에 대한 참조는 단일한 중합체성 시약 뿐 아니라 둘 이상의 동일한 또는 상이한 중합체성 시약을 포함하고, "콘쥬게이트"에 대한 참조는 단일한 콘쥬게이트 뿐 아니라 둘 이상의 동일하거나 상이한 콘쥬게이트를 포함하고, "첨가제"에 대한 참조는 단일한 첨가제 뿐 아니라 둘 이상의 동일하거나 상이한 첨가제를 포함하는 것 등이다.
본 발명을 설명하고 청구하는데 있어서, 다음 용어들은 다음에 기재된 정의에 따라서 사용될 것이다.
여기서 사용되는, "PEG", "폴리에틸렌 글리콜" 및 "폴리(에틸렌 글리콜)"은 임의의 수용성 폴리(에틸렌 옥사이드)를 포함한다. 통상적으로, PEG는 다음과 같은 구조 "-O(CH2CH20)m" (여기서, (m)은 2 내지 4000인) 를 포함하는발명에 따라 사용되기 위한 것이다. 여기서 사용될 때, PEG는 또한 말단 산소가 치환되었는지 여부에 따라 "-CH2CH2-0(CH2CH20)m-CH2CH2-" 및 "-(CH2CH20)m-" 을 포함한다.
PEG가 추가적으로 스페이서 부분(아래에서 더욱 상세히 설명될)을 함유하는 경우, 스페이서 부분을 함유하는 원자는, 수용성 중합체 단편에 공유결합으로 부착될 때, 산소-산소 결합(즉, "-0-0-" 또는 퍼옥사이드 연결)을 형성하지 않는다. 본 명세서 및 청구항에 있어서, "PEG"라는 용어는 다양한 말단을 갖는 구조 즉, "말단-캡핑"기 등을 포함한다. "PEG"라는 용어는 또한 다수의, 다시 말해서, 50% 초과의, -CH2CH20- 반복 서브유닛을 함유하는 중합체를 의미한다. 특정 형태와 관련하여, PEG는 이하에서 상세히 설명하게 될 "분지형", "선형", "포크형", "다관능형" 등과 같은 구조 또는 형상 뿐 아니라 다양한 분자량의 임의의 수를 갖을 수 있다.
"말단-캡핑" 또는 ""말단 캡핑"이라는 용어는 여기서 중합체의 말단 부분을 갖는 중합체의 마지막 또는 말단을 참조하기 위하여 호환성 있게 사용된다. 전형적으로, 비록 필수적으로는 아닐지라도, 말단-캡핑 부분은 히드록시 또는 C1-20 알콕시기, 보다 바람직하게는 Cl-5 알콕시기를 함유한다. 따라서, 말단-캡핑 부분은 아릴, 헤테로아릴, 시클로, 헤테로시클로 등 뿐 아니라 알콕시 (예컨대, 메톡시, 에톡시 및 벤질옥시)를 포함한다. 또한, 이들의 포화된, 비포화된, 치환된 및 비치환된 형태가 계획되고 있다. 또한, 상기 말단-캡핑기는 실란이 될 수 있다. 상기 말단-캡핑기는 또한 유리하게 검출가능한 표지를 함유할 수 있다. 중합체가 검출가능한 표지를 함유하는 말단-캡핑기를 갖는 경우, 상기 중합체가 연결되는 중합체 및/또는 부분(예컨대, 활성제)의 양 또는 위치는 적절한 검출기를 통하여 측정가능하다. 이러한 표지로는, 제한 없이, 형광물질, 화학발광물질, 효소 표지화에 사용되는 부분, 비색제(염료와 같은), 금속 이온, 방사능 부분 등이 사용될 수 있다. 적절한 검출기는 광도계, 필름, 스펙트로미터 등을 포함한다. 상기 말단-캡핑기는 또한 유리하게는 인지질을 함유한다. 중합체가 인지질을 함유하는 말단-캡핑기를 갖는 경우, 중합체에 독특한 특성(유사하게 말단-캡핑된 중합체와 유기적 구조를 형성하는 능력과 같은)이 부여된다. 인지질의 예는, 제한 없이, 포스파티딜콜린이라고 불리는 인지질 형으로부터 선택되는 것들을 포함한다. 특이적 인지질은, 제한 없이, 디라우로일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테로일포스파티딜콜린, 베헤노일포스파티딜콜린, 아라키도일포스파티딜콜린, 및 레시틴을 포함한다.
"비자연 발생"은 온전히 그대로 자연에서 발견되지 않는 중합체를 의미한다. 그러나, 비자연 발생 중합체는 전체 중합체 구조는 자연에서 발견되지 않더라도 자연적으로 발생하는 하나 이상의 서브유닛 또는 서브유닛의 단편을 함유할 수 있다.
"수용성 중합체 단편" 및 "수용성 중합체"에서 "수용성"이라는 용어는 실온에서 물에 녹는 임의의 단편 또는 중합체이다. 통상적으로, 수용성 중합체 또는 단편은 여과 후 동일한 용액에 의해서 투과되어 약 75% 이상의, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 빛을 투과시킨다. 중량에 대해서, 수용성 중합체 또는 이의 단편은 약 35% (중량비로) 이상 물에 녹고, 보다 바람직하게는 약 50% (중량비로) 이상 물에 녹고, 더욱 더 바람직하게는 약 70% (중량비로) 물에 녹고, 더욱 더 바람직하게는 약 85% (중량비로) 물에 녹는다. 그러나, 가장 바람직하게는 상기 수용성 중합체 또는 단편은 95% (중량비로) 물에 녹거나 완전히 물에 녹는다.
PEG와 같은 본 발명의 수용성, 비자연적 발생 중합체와 관련하여, "명목 평균 분자량(Nominal average molecular weight)"은, 통상적으로 크기배제 크로마토그래피, 광분산기술, 또는 1,2,4-트리클로로벤젠에서의 고유속도측정(intrinsic velocity determination)에 의해서 결정되는 중합체의 질량평균분자량을 가리킨다. 본 발명의 중합체는 통상적으로 약 1.2 미만의, 더 바람직하게는 약 1.15 미만의, 더욱 더 바람직하게는 1.10 미만의, 훨씬 더 바람직하게는 1.05 미만의, 가장 바람직하게는 1.03 미만의 낮은 다분산성(polydispersity) 값을 갖는 다분산성(polydisperse)이다.
본 발명의 수용성, 비자연적발생 중합체와 관련하여, "티올 유도체"는 티올기(-SH), 티올레이트(-S-) 또는 보호된 티올, 즉, 보호된 형태의 티올기인 말단을 하나 이상 갖는 그러한 중합체를 의미한다. 통상적 티올 보호기는 티올에테르, 티올에스테르, 또는 디설피드를 포함한다. 티올을 위한 보호기의 예는 문헌[Greene, T. 및 Wuts, Peter G.M., "PROTECTIVE GROUPS IN ORGANICSYNTHESIS", Chapter 6, 3rd Edition, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999]에서 찾을 수 있다.
"활성" 및 "활성화된" 이란 용어는 특정 관능기와의 콘쥬게이트에서 사용될 때 또 다른 분자상의 친전자체 또는 친핵체와 쉽게 반응하는 반응성 관능기를 가리킨다. 이는 반응하기 위하여 매우 강한 촉매를 요하거나 매우 비실용적인 반응조건을 요하는 관능기들(즉, "비반응성" 또는 "비활성"기)과 대조적이다.
"보호된", "보호기" 및 "보호성기"는 특정 조건하에서 분자내의 특정 화학반응성 관능기의 반응을 방해하거나 막는 부분(즉, 보호기)의 존재를 가리킨다. 보호기는 사용될 반응 조건 및 만약 있다면, 추가적인 반응기 또는 보호기의 존재뿐 아니라 화학반응성기의 종류에 따라서 달라진다. 선행기술에 알려진 보호기는 문헌 [Greene, T. W., et al., PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS, 3rd ed. , John Wiley & Sons, Inc., New York, NY (1999)]에서 찾을 수 있다.
여기서 사용된 "관능기"라는 용어 또는 이의 임의의 유사어는 그의 보호된 형태(protected form)를 포함한다.
구조, 구조식, 분자 등을 기재하는데 있어서, "유기 라디칼"은 탄소원자가 부착 지점을 제공하는 탄소-함유 부분을 가리킨다. 유기 라디칼의 예는 알킬(즉, 저급 알킬), 치환 알킬(헤테로알킬, 및 사슬-치환 헤테로알킬을 포함하여), 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 헤테로시클리실, 치환 헤테로시클리실, 등을 포함한다.
구조, 구조식, 분자 등을 기재하는데 있어서, "비방향족-함유 유기 라디칼"은 앞서 기재된 "유기 라디칼", 그러나 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴, 및 예컨대, 아릴, 치환 아릴, 헤테로아릴, 치환 헤테로아릴 등의 방향족기를 함유하는 알킬 또는 다른 관능기를 제외한 유기 라디칼을 가리킨다.
"알킬"은 길이로 약 1 내지 15의 원자 범위인 탄화수소 사슬을 가리킨다. 그러한 탄화수소 사슬은 반드시는 아니지만 바람직하게는 포화되고, 통상적으로는 선형 사슬이 선호되나 분지형 또는 선형 사슬일 수 있다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, 3-메틸펜틸, 등을 포함한다. 여기서 사용되는 알킬은 시클로알킬 및 시클로알킬렌-함유 알킬도 포함한다.
"저급 알킬"은 1 내지 6의 탄소원자를 함유하는 알킬기를 가리키며, 선형 또는 분지형일 수 있으며 예컨대 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸, 및 t-부틸이다.
"시클로알킬"은 바람직하게는 3 내지 약 12의 탄소, 보다 바람직하게는 3 내지 약 8의 탄소로 이루어진, 가교, 융합, 또는 스피로 시클릭 화합물을 포함하는, 포화 또는 불포화 시클릭 탄화수소 사슬을 가리킨다. "시클로알킬렌"은 시클릭 고리계의 임의의 두 탄소에서 알킬 사슬에 결합함으로써 알킬 사슬에 삽입된 시클로알킬기를 가리킨다.
"알콕시"는 -O-R기를 가리키며, 여기서 R은 알킬 또는 치환 알킬, 바람직하게는 C1-6 알킬 (즉, 메톡시, 에톡시, 프로폭시 등)이다.
여기서 사용되는 "알케닐"은 에테닐, n-프로페닐, 이소프로페닐, n-부테닐, 이소부테닐, 옥테닐, 데세닐, 테트라데세닐 등과 같이 하나 이상의 이중결합을 갖는, 2 내지 15 원자 길이의 분지형 또는 비분지형 탄화수소기를 가리킨다.
여기서 사용되는 용어 "알키닐"은 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 옥티닐, 데시닐 등과 같이 하나 이상의 삼중결합을 갖는, 2 내지 15 원자 길이의 분지형 또는 비분지형 탄화수소기를 가리킨다.
"아릴"은 각각 코어 탄소수 5 내지 6인 하나 이상의 방향족 고리를 가리킨다. 아릴은 나프틸에서와 같이 융합된, 또는 비페닐에서와 같이 비융합된 다중 아릴 고리를 의미한다. 아릴 고리는 또한 하나 이상의 시클릭 탄화수소와 융합되거나 비융합될 수 있다. 여기서 사용되는 "아릴"은 헤테로아릴을 포함한다.
"헤테로아릴" 은 1 내지 4 개의 헤테로원자를 갖는 아릴기로, 바람직하게는 상기 헤테로아릴 고리의 각 헤테로원자는 황, 산소, 또는 질소 원자이다. 헤테로아릴 고리는 하나 이상의 시클릭 탄화수소, 헤테로시클릭, 아릴, 또는 헤테로아릴 고리와 융합될 수 있다.
"헤테로시클리실" 또는 "헤테로시클릭" 은 불포화 또는 방향족 특성을 갖거나 갖지 않고, 탄소가 아닌 하나 이상의 고리 원자를 갖는, 5-12 개 원자, 바람직하게는 5-7 개 원자의 하나 이상의 고리의 군을 의미한다. 바람직한 헤테로원자에는 황, 산소, 및 질소가 포함된다.
예컨대 "치환 알킬"에서와 같은 용어 "치환"은 하나 이상의, C3-8 시클로알킬, 예컨대, 시클로프로필, 시클로부틸, 등; 할로, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도; 시아노; 알콕시; 저급 페닐; 치환 페닐 등과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 비방해성 치환체로 치환된 부분(예컨대, 알킬기)을 가리킨다. "치환 아릴"은 치환체로서 하나 이상의 비방해성기를 갖는 아릴이다. 페닐 고리 상의 치환에 있어서, 치환체는 임의의 방위(즉, 오르토, 메타 또는 파라)를 가질 수 있다.
"치환 헤테로아릴" 은 하나 이상의 비방해성기를 치환체로서 갖는 헤테로아릴이다.
"치환 헤테로시클리실"은 비방해성 치환체로부터 형성된 하나 이상의 부사슬을 갖는 헤테로시클리실기이다.
"비방해성 치환체"는 분자 내에 존재하는 경우 통상적으로 분자내에 함유된 다른 관능기와 비반응성인 기이다.
"친전자체"는 이온성일 수 있고, 친전자성 중심, 즉 전자를 향하고, 친핵체와 반응할 수 있는 중심을 갖는 이온 또는 원자 또는 원자의 모임을 가리킨다.
"친핵체"는 이온성일 수 있고, 친핵성 중심, 즉 친전자성 중심을 향하고, 친핵체와 반응할 수 있는 중심을 갖는 이온 또는 원자 또는 원자의 모임을 가리킨다.
"생리적으로 분해가능한" 또는 "가수분해 가능한" 또는 "분해가능한" 결합은 생리 조건 하에서 물과 반응하는 (즉, 가수분해되는) 비교적 약한 결합이다. 바람직한 결합은 가수분해 반감기가 pH 8 및 25℃ 에서 약 30분 미만인 결합이다. 결합이 물에서 가수분해되는 경향은 두 중심원자를 이어주는 연결(linkage)의 일반적 종류에만 달려있는 것이 아니라, 이들 중심원자에 부착된 치환체에도 달려있다. 적절한 가수분해적으로 불안정한 또는 약한 연결은 이에 한정되는 것은 아니나, 카르복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 무수물, 아실록시알킬 에테르, 이민, 및 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다.
"효소적으로 분해가능한 연결"은 하나 이상의 효소에 의해서 분해될 수 있는 연결을 의미한다.
"가수분해적으로 안정한" 연결 또는 결합은, 수중에서 실질적으로 안정한, 즉 장기간에 걸쳐 상당한 정도까지 생리적 조건 하에서 가수분해를 겪지 않는 화학 결합, 전형적으로 공유 결합을 가리킨다. 가수분해적으로 안정한 연결의 예는 이에 한정되는 것은 아니나, 탄소-탄소 결합 (예컨대, 지방족 사슬 내), 에테르, 아미드, 우레탄 등이 포함된다. 일반적으로, 가수분해적으로 안정한 연결은 생리적 조건 하에서 1 일당 약 1-2 % 미만의 가수분해 속도를 보이는 연결이다. 대표적 화학 결합의 가수분해 속도는 대부분의 표준 화학 교과서에서 찾을 수 있다.
여기 기재된 "활성제"는, 생체 내 또는 시험관 내에서 입증될 수 있는 약리학적, 종종 유리한, 효과를 제공하는 임의의 제제, 약물, 화합물, 물질의 조성물, 또는 혼합물을 포함한다. 이는 식품, 보조식품, 펩티드, 영양제, 기능식품, 약물, 백신, 항체, 비타민, 및 다른 이로운 제제를 포함한다. 여기서 사용되는 이들 용어는 또한 환자 내에서 국소적인 또는 전신적인 효과를 생성하는 임의의 생리적 또는 약리학적 활성 물질을 포함한다.
"약학적으로 허용가능한 첨가제 또는 담체"는 선택적으로 본 발명의 조성물에 포함될 수 있고, 환자에게 어떠한 심각한 불리한 독물학상 영향을 야기하지 않는 첨가제를 가리킨다.
"약리학적 유효량", "생리학적 유효량", 및 "치료학적 유효량"은 여기에서, 호환적으로, 혈류 내에 또는 목표 조직에 요구되는 농도의 활성제를 공급하기에 필요한 중합체-활성제 콘쥬게이트의 양을 의미한다.
상기 정확한 양은, 예컨대, 특정 약물 또는 치료제, 치료제 조성물의 성분 및 물리적 특성, 의도된 환자 모집단, 환자 개인에 대한 고려 등 여러 요인에 의존하며, 여기 제공된 정보에 근거하여 당업계의 숙련된 자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다.
"다관능성"은 3 이상의 관능기를 내부에 갖는 중합체를 의미하며, 여기서 관능기는 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 다관능성 중합체성 시약은 통상적으로 약 3-100 관능기, 또는 3-50 관능기, 또는 3-25 관능기, 또는 3-15 관능기, 또는 3 내지 10 관능기를 함유하며, 중합체 골격 내에 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 관능기를 함유하게 된다.
여기에 기재되는 염기성 또는 산성 반응물은 중성, 전하성, 및 이들의 임의의 대응 염을 포함한다.
용어 "환자"는 활성제를 투여함으로써 예방되거나 치료될 수 있는 상태를 겪고 있거나, 그러한 상태가 생기기 쉬운 생명체를 가리키며, 인간 및 동물을 포함한다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는 일어날 수도 있고 일어나지 않을 수도 있는 순차적으로 기재된 상황을 의미하며, 이러한 기재는 상기 상태가 일어나는 경우 및 일어나지 않는 경우를 모두 포함하기 위한 것이다.
여기서 기재하는 상기 중합체성 시약은 수용성 중합체 단편 및 관능기를 함유한다. 상기 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 관능기는 직접 공유 결합을 통하여 상기 수용성 중합체 단편에 부착될 수 있다. 보다 통상적으로는, 그러나, 상기 관능기는 하나 이상의 원자를 통하여 수용성 중합체 단편에 부착된다. 따라서, 이의 가장 기본적인 형태에서, 여기서 기재하는 상기 중합체성 시약은 모두 다음을 함유하는 핵심 구조를 공유한다 :
POLY-------FG
여기서, POLY는 수용성 중합체 단편이고, FG는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기이고, 상기 점선은 관능기를 상기 수용성 중합체 단편에 부착시키기 위한 역할을 하는 직접적 공유결합 또는 하나이상의 원자를 나타낸다. 아래에서 더 상세하게 보이는 바와 같이, 여기서 기재하는 상기 중합체성 시약은 더욱 복잡한 구조를 가질 수 있다.
이론에 구애되기를 원치 않으나, 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 또는 디티오케탈을 함유하는 중합체성 시약은 예컨대 알데히드를 함유하는 중합체에 비하여 다른 물질(예컨대, 활성제)과 콘쥬게이션에 사용하는데 있어서 더욱 선택적인 것으로 생각된다. 여기서 기재하는 상기 중합체성 시약의 증가된 선택성에 기여하는 하나의 요인은 관능기들과 연합된 상대적인 안정성이다. 보다 안정하기 때문에, 상기 중합체성 시약의 관능기(들)은 상대적으로 보다 반응성이 좋은 부분과만 반응하려 하고 이로 인해 보다 큰 선택성을 제공한다.
알데히드와 같은 다른 관능기와 비교하여 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈의 증가된 안정성은 두 가지 효과의 작용으로 생각된다: 전자적 효과 및 입체적 효과. 전자적 효과의 측면에서, 상기 관능기에서의 전자 밀집(crowding)은 반응 도중에 발생할 수 있는 임의의 이온화 또는 잉여 전하의 부담을 공유할 수 있는 상기 관능기의 능력을 효과적으로 제공한다. 따라서, 예컨대, 케톤--카르보닐 탄소의 각 측면에 두개의 탄소원자를 갖는--은 카르보닐 부분과 연합된 전자-풍부 환경에 오직 하나의 탄소만을 갖는 대응 알데히드보다 더 잘 대처할 수 있다.
입체적 효과와 관련하여, 알데히드 및 케톤의 카르보닐기에 대한 친핵성 첨가 반응은 카르보닐 탄소를 sp2 혼성구조에서 sp3 혼성구조로 변화시킨다. 그러나 케톤와 관련된 제 2의 --및 상대적으로 거대한-- 탄소 원자의 존재는 상대적으로 거대한 활성제의 sp2 혼성 카르보닐 탄소로의 접근을 느리게 하고, 알데히드와 관련된 상대적으로 작은 수소 보다 sp3 혼성 탄소의 형성을 입체적으로 더욱 더 밀집시킨다. 그 결과로 이들 전자적 및 입체적 효과의 결합은 케톤 및 관련 관능기의 초기 에너지 상태를 감소시키고(즉, 안정화된 카르보닐 탄소를 제공함으로써, 전자적 효과) 전이 상태의 에너지를 높임으로써(즉, sp2로부터 Sp3 혼성화로의 변화, 입체적 효과), 이들의 활성화 에너지를 증가시킨다. 따라서, 케톤 및 관련 관능기는 상대적으로 더욱 안정하고 따라서 반응성이 낮다.
그러나, 놀랍게도, 케톤-, 케톤 히드레이트-, 티온-, 모노티오히드레이트-, 디티오히드레이트-, 헤미케탈-, 모노티오헤미케탈-, 디티오헤미케탈-, 케탈-, 또는 디티오케탈-함유 중합체성 시약의 증가된 안정성은 바람직한 것으로 밝혀졌다. 예컨대, 활성제는 몇몇 아민기를 가질 수 있고 각각은 중합체성 시약 상에 존재하는 카르보닐 부분에 대한 고유의 반응성을 갖는다. 비교적 낮은 반응성을 갖는 케톤-함유 중합체성 시약을 제공함으로써, 콘쥬게이션은 입체적 방해가 가장 적고 반응성이 가장 높은 활성제 상의 아민(들)과 케톤의 카르보닐 부분 사이에서 일어나는 것이 더욱 선호되고, 그러므로써 상이한 콘쥬게이션 형태의 수를 감소시킨다.
여기서 기재하는 중합체성 시약의 또 다른 유리한 점은 관능기가 (선형일 수 있는) 두 중합체 사슬 사이에 존재할 수 있고, 그러므로써, 두 중합체 사슬을 활성제에 직접적으로 부착된 단일 원자, 표면 또는 다른 부분을 통하여 부착시키는 능력을 제공할 수 있다는 것이다. 앞서 기재한 분지형 중합체성 시약은 콘쥬게이션을 위하여 반응성기(예컨대, 알데히드)를 갖는 스페이서 부분을 함유하고 두 중합체 사슬을 연결하기 위한 분지 원자를 분리하고 구별한다. 이러한 방법으로, 상기 수용성 중합체 단편은 활성제에 상대적으로 가까이 다가가고, 그러므로써, 수용성 중합체 단편이 콘쥬게이트로부터 분해될 때 활성제상에 남는 작은 "펜던트"기를 감소시키거나 완전히 제거한다.
II. 중합체성 시약의 특징
A. 관능기 ("FG")
앞서 언급된 바와 같이, 본 발명의 중합체성 시약은 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기와 관련된다. 구조적으로, 각 관능기("FG")는 아래에 나타낸 바와 같다. 하기 구조에서, R은 유기 라티칼, 예컨대, 알킬이고, "관능기 탄소"는 별표로 표시되어 있다.
비록 나타나진 않지만, 명명된 관능기를 제공하기 위하여 관능기 탄소의 각 측면에 탄소 원자가 부착된다
바람직하게는, 기재된 관능기는 상호간에 형태가 용이하게 전환된다. 따라서, 예컨대, 일부 또는 전부의 케톤이 물의 첨가로 케톤 히드레이트로 전환될 수 있다. 또한, 물의 존재하에서, 케톤은 일반적으로 대응하는 히드레이트와 평형상태로 존재한다. 이는 인근에 전자 흡인기를 갖는 케톤에서 특히 그러하다. 평형 때문에, 케톤-함유계에서 물의 양이 감소함에 따라, 케톤 히드레이트 종의 양은 감소한다. 따라서, 계에서 물의 양을 조절함으로써, 두 형태(즉, 케톤 및 케톤 히드레이트)의 양(또는 비율)에 영향을 미칠 수 있다.
전자 흡인기 및 전자 주는 기의 존재 또는 부존재, 및 인근의 입체적 방해와 같은 다른 인자는 또한, 상기 두 형태의 양 및 이들간의 비율에 영향을 미친다. 티온 및 모노티오히드레이트 형태 역시 유사한 양식을 제공한다.
유용하게도, 여기서 기재하는 중합체성 시약을 사용하는 콘쥬게이션 반응은 종종 관능기의 특정 용매화 상태와 무관하게 진행될 수 있다. 예컨대, 중합체성 시약의 주된 종이 케톤인지, 케톤 히드레이트인지는 차이가 없다: 콘쥬게이션 조건하에서 일방, 다른 일방, 또는 양자 모두의 사용이 중합체-활성제 콘쥬게이트를 형성하는 결과가 될 것이다. 이론에 구애되기를 원치 않으나, 활성제와의 콘쥬게이션 반응 도중에 케톤이 고갈됨에 따라 평형에 의해서 추가적인 케톤 히드레이트 종이 대응하는 케톤으로 전환될 것이기 때문에, 케톤 히드레이트--대응하는 케톤과의 평형상태인--가 사용될 수 있다. 일련의 반응이 도 1에 나타나 있다. 거기 나타난 바와 같이, 두 평형 반응이 관여된다: 중합체성 시약 내에서 케톤 및 케톤 히드레이트간의 평형, 및 활성제 상의 아민기가 카르비놀아민 및 대응하는 이민을 형성하는 것을 포함하는 축합 과정. 따라서, 콘쥬게이션이 케톤을 경유하여 진행될 수 있는 한, 대응하는 케톤 히드레이트 형태의 사용 또한 원하는 콘쥬게이트를 형성하는 결과를 가져올 수 있다. 다시 말해, 이론에 구애되기를 원치 않으나, 히드레이트 형태의 증가된 안정성(대응하는 케톤 형태에 비하여)은 케톤 형태의 활성제에 대한 콘쥬게이션에의 증가된 반응성에 대응한다.
또한, 케톤은 알콜의 첨가를 통하여 헤미케탈로 변환될 수 있다. 다시 말해서, 케톤-함유계에 알콜의 양이 감소하면, 헤미케탈 종의 양이 감소한다. 이러한 방법으로, 상기 논의된 것과 유사한 평형반응에서, 케톤-함유계에 알콜을 첨가함으로써 헤미케탈을 제공하는 것이 가능하고 헤미케탈-함유계로부터 알콜을 제거함으로써 케톤을 제공하는 것이 가능하다. 또한, 산촉매의 존재하에서, 알콜의 추가적 양은 헤미케탈을 케탈로 전환시킨다. 또한, 케톤은, 디올, 예컨대, HO-CH2CH2-OH의 첨가에 의해서 직접 케탈로 전환될 수 있다. 유리하게는, 이러한 및 다른 케탈은 종종 케톤 보호기로 작용한다.
도 2는 케톤 관능기를 함유하는 중합체성 시약으로부터 케탈이 형성되는 것 및 케탈 관능기를 함유하는 중합체성 시약으로부터 콘쥬게이트가 형성되는 것을 보여준다. 도 2에서, 케톤 관능기를 함유하는 중합체성 시약은 먼저 반응성의 헤미케탈 중간체로 전환되고, 그리고 나서, 케탈로 전환된다(본 도에서는 디메틸케탈). 또 2는 또한, 일련의 평형을 통하여, 어떻게 케탈이 아민-함유 활성제와의 콘쥬게이션 반응에서 직접적으로 이용되는지를 보여준다.
유사한 방법으로, 티온을 티온을 황-함유(예컨대, 황화수소) 환경에서 용매화시킴으로써 디티오히드레이트(때로, 디티오솔베이트로 참조되는)로 전환할 수 있다. 티온은 또한 티올의 존재하에 디티오헤미케탈로 전환될 수 있으며, 과량의 티올 존재하에 디티오케탈로 전환될 수 있다. 케톤과 유사한 방법으로, 티온은 디티올(예컨대, HS-CH2CH2-SH)의 첨가에 의해서 직접적으로 디티오케탈로 전환될 수 있다. 디티오케탈은 종종 티온 보호기로도 작용한다.
주어진 관능기를 다른 관능기로 전환하기 위한 예시적 방법이 제공되었으나, 상기 중합체성 시약은 상기 관능기가 형성되는 방법에 한정되지 않는다. 기술분야에서 통상의 기술을 가진자는 여기 기재된 관능기를 제공하기 위한 다른 접근법을 안다. 또한 주어진 임의의 관능기에 대한 참조는 상기 관능기 자체 및 상기 관능기의 보호된 형태를 포함한다.
B. 수용성 중합체 단편 ("POLY" 예컨대,"POLYl", "POLY2" 등)
본 발명의 중합체성 시약은 또한 하나 이상의 수용성 중합체 단편을 함유한다. 비펩티드이고 수용성이고, 2 내지 약 300 말단을 갖는 수용성 중합체 단편은 본 발명에서 특히 유용하다. 적합한 수용성 중합체 단편은 폴리(에틸렌 글리콜) ("PEG")과 같은 폴리(알킬렌 글리콜), 수용성을 갖는 에틸렌 글리콜 및 프로필렌글리콜의 공중합체, 폴리(올레핀 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리 (히드록시알킬메트아크릴아미드), 폴리 (히드록시알킬메트아크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-히드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 미국특허 제5,629,384에 기재된 것과 같은 폴리(N-아크릴로일모르폴린) 및 공중합체, 삼원공중합체, 및 이들의 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 목적상, 폴리(프로필렌 글리콜)은 수용성 중합체 단편로 작용하기에 불충분한 수용성을 갖는다. 결과적으로, 여기 기재하는 수용성 중합체 단편은 프로필렌 단량체를 함유하지 않는다.
그러나, 수용성 중합체 단편은, 반드시는 아니지만 바람직하게는, 폴리(에틸렌 글리콜)("PEG") 또는 이의 유도체인 것이 바람직하다.
그러나, 관련 중합체들이 또한 본 발명의 실시에 사용되기에 적합하고, 이러한 측면에서, 상기 용어 "PEG" 또는 "폴리(에틸렌 글리콜)"의 사용은 배제적이 아닌 포괄적 사용이 의도된 것임이 이해되어야 한다.
결론적으로, 상기 용어 "PEG"는, 알콕시 PEG, 이중작용성 PEG, 포크형 PEG, 분지형 PEG, 펜던트 PEG, 또는 내재적으로 분해가능한 연결을 갖는 PEG 를 포함하여 선형, 분지형 또는 다지형(multi-arm forms) 중 임의의 형태인 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하며, 아래에서 더욱 완전하게 설명된다.
본 발명에서 유용한 하나의 형태에서, 유리 또는 비결합 PEG는 말단에서 히드록실기로 종결되는 선형 중합체이다:
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)m'-CH2CH2-OH
[식에서, (m')은 통상적으로 0 내지 약 4,000의 범위이다].
상기 중합체, 알파-, 오메가-디히드록실폴리(에틸렌 글리콜)은 HO-PEG-OH와 같은 간단한 형태로 나타낼 수 있고, 여기서 상기 -PEG- 기호는 다음과 같은 구조적 단위로 나타낼 수 있다고 파악된다:
-CH2CH2O-(CH2CH2O)m'-CH2CH2-
[식에서, (m')은 앞서 정의한 바와 같다].
본 발명에서 유용한 또 다른 형태의 PEG는 메톡시-PEG-OH, 또는 간단히 mPEG로 한쪽 말단은 상대적으로 비활성인 메톡시기이고 또 다른 말단은 히드록실기이다. mPEG의 구조는 하기와 같다:
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)m'-CH2CH2-OH
[식에서, (m')은 앞서 정의한 바와 같다].
미국특허 제 5,932,462호에 기재된 것과 같은 다지형 또는 분지형 PEG 분자는 PEG 중합체로도 사용될 수 있다. 예컨대, PEG는 하기 구조를 가질 수 있다:
[식에서:
polya, 및 polyb 는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)과 같은 PEG 골격(backbone) (동일 또는 상이한)이고;
R" 는 H, 메틸과 같은 비반응성 부분, 또는 PEG 골격이고; 및
P 및 Q 는 비반응성 연결(linkages)이고. 바람직한 구현예에서, 상기 분지형 PEG 중합체는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 이중 치환된 라이신(lysine)이다].
이들 중합체는 선형이거나 앞서 기재된 임의의 형태(분지형, 포크형 등)이다.
또한, 상기 PEG는 포크형 PEG를 함유할 수 있다. 포크형 PEG의 예는 다음과 같은 구조로 나타낼 수 있다.
[식에서:
X 는 스페이서 부분이고, 각각의 Z 는 정해진 길이의 원자 사슬에 의해서 CH 에 연결된 활성 말단기이다]. 국제출원번호 PCT/US99/05333는 본 발명에서 사용될 수 있는 다양한 포크형 PEG의 구조를 공개한다
분지 탄소원자에 Z 관능기를 연결하는 원자 사슬은 구속기(tethering group)로 작용하며, 예컨대, 알킬 사슬, 에테르 사슬, 에스테르 사슬, 아미드 사슬 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
PEG 중합체는 PEG의 말단보다는 PEG의 길이를 따라 공유적으로 부착되는, 카르보닐과 같은 반응성 기를 갖는 펜던트 PEG 분자를 포함할 수 있다. 상기 펜던트 반응성 기는 PEG에 직접 또는 알킬렌 기와 같은 스페이서 부분을 통하여 부착될 수 있다.
앞서 기재한 형태의 PEG에 더하여, 중합체는 또한 상기 중합체 중 어느 하나를 포함하여 중합체 내에 하나 이상의 약하거나 분해가능한 연결을 가지도록 제조될 수 있다. 예를 들어, PEG는 가수분해 되기 쉬운 중합체 내의 에스테르 연결과 함께 제조될 수 있다. 하기에 나타난 바와 같이, 이러한 가수분해는 중합체를 더 적은 분자량을 갖는 조각(fragments)으로 분해한다:
중합체 골격 내에 포함될 수 있는 기타 가수분해적으로 분해가능한 연결은 다음을 포함한다 : 카르보네이트 연결; 아민 및 알데히드의 반응으로 생성되는 이민 연결 (예컨대 문헌 [Ouchi 등 (1997) Polymer Preprints, 38(1):582-3] 참고);알콜과 포스페이트기의 반응으로 형성되는 포스페이트 에스테르 연결; 통상적으로 히드라지드와 알데히드의 반응으로 형성되는 히드라존 연결 ; 통상적으로 알데히드와 알콜의 반응으로 형성되는 아세탈 연결 ; 예컨대 포르메이트와 알콜의 반응으로 형성되는 오르토 에스테르 연결 ; 중합체, 예컨대 PEG와 같은 중합체 말단의 아민기와 또 다른 PEG 사슬의 카르복실기에 의해 형성되는 아미드 연결 ; 예컨대 말단 이소시아네이트기를 갖는 PEG와 PEG 알콜의 반응으로 형성되는 우레탄 연결 ; 예컨대 PEG와 같은 중합체 말단의 아민기와 펩티드의 카르복실기에 의해 형성되는 펩티드 연결 ; 및 예를 들어 중합체 말단의 포스포르아미디트기와 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실기에 의해 형성되는 올리고뉴클레오티드 연결.
본 발명의 기술분야의 통상의 기술자는 용어 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 PEG 가 상기 모든 형태의 PEG를 나타내거나 포함한다는 것을 이해한다. 비록 상기 수용성 중합체 단편의 명목 평균 분자량이 변화하더라도, 상기 명목 평균 분자량은 다음 값: 100 Da 초과; 400 Da 초과; 500 Da 초과, 750 Da 초과; 900 Da 초과; 1,000 Da 초과, 1,400 Da 초과; 1,500 Da 초과, 1,900 Da 초과; 2,000 Da 초과; 2,200 Da 초과; 2,500 Da 초과; 3,000 Da 초과; 4,000 Da 초과; 4,900 Da 초과; 5,000 Da 초과; 6,000 Da 초과; 7,000 Da 초과; 7,500 Da 초과, 9,000 Da 초과; 10,000 Da 초과; 11,000 Da 초과; 14,000 Da 초과, 15,000 Da 초과; 16,000 Da 초과; 19,000 Da 초과; 20,000 Da 초과; 21,000 Da 초과; 22,000 Da 초과, 25,000 Da 초과; 및 30,000 Da 초과 중 하나 이상을 만족한다. 여기서 유용한 임의의 주어진 수용성 중합체 단편의 분자량의 최대 한도는 약 300,000 Da 미만이다.
수용성 중합체 단편의 명목 평균 분자량은 또한, 명목 평균 분자량의 범위 내의 값을 갖는 것으로 표현될 수 있다. 예시적 범위는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da; 약 500 Da 내지 약 80,000 Da; 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da ; 약 2,000 Da 내지 약 25,000 Da; 및 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da을 포함한다.
수용성 중합체 단편을 위한 명목 평균 분자량의 예는 약 100 Da, 약 200 Da, 약 300 Da, 약 400 Da, 약 500 Da, 약 600 Da, 약 700 Da, 약 750 Da, 약 800 Da, 약 900 Da, 약 1,000 Da, 약 2,000 Da, 약 2,200 Da, 약 2,500 Da, 약 3,000 Da, 약 4,000 Da, 약 4,400 Da, 약 5,000 Da, 약 6,000 Da, 약 7,000 Da, 약 7,500 Da, 약 8,000 Da, 약 9,000 Da, 약 10,000 Da, 약 11,000 Da, 약 12,000 Da, 약 13,000 Da, 약 14,000 Da, 약 15,000 Da, 약 20,000 Da, 약 22,500 Da, 약 25,000 Da, 약 30,000 Da, 약 40,000 Da, 약 50,000 Da, 약 60,000 Da, 및 약 75,000 Da을 포함한다.
"-CH2CH20- (CH2CH20)m-CH2CH2-"에 상응하는 구조가 제공될 수 있는 PEG와 관련하여, (m)을 위한 바람직한 값은: 약 3 내지 약 3,000 ; 약 10 내지 약 3,000 ; 약 15 내지 약 3,000 ; 약 20 내지 약 3,000 ; 약 25 내지 약 3,000 ; 약 30 내지 약 3,000 ; 약 40 내지 약 3,000 ; 약 50 내지 약 3,000 ; 약 55 내지 약 3,000 ; 약 75 내지 약 3,000 ; 약 100 내지 약 3,000 ; 및 약 225 내지 약 3,000을 포함한다.
여기서 사용되는 용어 "수용성 중합체 단편"는 생체적합성(biocompatible)이고 비면역원성인(nonimmunogenic) 수용성 중합체 단편을 포함하고, 생체적합성이 아니거나 비면역원성이 아닌 수용성 중합체 단편을 특히 배제한다. 생체적합성의 측면에 있어서, 물질이, 생체 조직과 관련하여, 단독으로 또는 다른 물질(예컨대, 활성제)과 함께 사용되어 해로운 효과보다 이로운 효과가 더 크다고 내과의와 같은 임상의에 의해서 판단되는 경우 생체적합성이 있다고 생각된다. 비면역원성의 측면에 있어서, 물질의 생체 내에서의 의도적 사용이 원하지 않는 면역 반응을 생성하지 않거나, 만약 면역 반응이 생성되어도, 그러한 반응이 임상적으로 심각하거나 중요하다고 임상의에 의해서 판단되지 않는 경우, 물질은 비면역원성이라고 생각된다. 여기서 기재하는 수용성 중합체 단편 및 콘쥬게이트는 생체적합성 및 비면역원성을 갖는 것이 특히 바람직하다. 여기서 사용되는 용어 "수용성 중합체 단편"는 또한 하나 이상의 케톤 부분을 함유하는 단량체로 이루어진 수용성 중합체 단편을 제외한다.
본 발명의 기술분야의 통상의 기술자는 본질적으로 수용성 중합체 단편에 관한 상기 논의가 절대 철저한 것이 아니며 단지 예시적인 것이며, 상기 설명된 성질을 갖는 모든 중합체 물질은 숙고된 것임을 인식할 것이다. 여기서 사용되는 용어 "중합체성 시약"은 일반적으로 수용성 중합체 단편 및 관능기를 포함하는, 분자 전체를 가리킨다. 상기 용어 "수용성 중합체 단편"는 일반적으로 중합체성 시약, 전구체 분자, 콘쥬게이트 등과 같은 보다 거대한 분자의 일부분을 논의하는데 사용되기 위하여 보유된다.
C. 하나 이상의 원자를 통한 부착
여기서 기재되는 중합체성 시약의 각 부분 (예컨대, 관능기, 활성제, 수용성 중합체 단편, 등) 및 다른 구조는 직접적인 공유결합을 통하여 직접적으로 서로 부착될 수 있다. 그러나, 보다 통상적으로는, 각 부분은 각 부분을 하나의 통일된 전체로 구속하는 작용을 하는 하나 이상의 원자를 통하여 부착된다
여기서 기재하는 중합체성 시약의 여러 부분 및 다른 구조를 부착하는 바람직한 원자는 탄소, 질소, 산소, 및/또는 황 원자로 이루어진 원자 사슬을 포함한다. 하나 이상의 탄소, 질소, 산소, 황, 및 수소와 같은 다른 원자가 이 원자 사슬에 부착될 수 있다.
상기 사슬은 짧은 경우 2 내지 5 원자 사슬을 포함할 수 있다. 보다 긴 사슬은 예컨대, 길이로 10, 15 또는 이를 초과하는 원자를 갖는 사슬을 생각할 수 있다. 따라서, 여기서 기재하는 분자의 부분을 부착하기 위하여 가능한 원자의 상이한 조합의 수는 매우 많다. 그러나, 통상적으로, 세개의 상이한 원자군이 여기서 기재하는 중합체성 시약의 여러 부분과 다른 분자를 연결하는 것과 관련되어 있다: 탄소 사슬, 전자 흡인기, 스페이서 부분. 각각은 차례로 논의될 것이다.
(i) 탄소 사슬, (예컨대, ,,및)
선택적으로, 하나 이상의 탄소 사슬이 중합체성 시약(또한, 중합체성 시약을 형성하기 위한 대응 콘쥬게이트, 전구체 분자 등)에 포함된다. 그러나, 통상적으로 상기 탄소사슬은 중합체성 시약의 관능기 바로 이웃에 위치한다. 그러나, 탄소 사슬이 부존재함에도 불구하고, 탄소 원자(스페이서 부분, 유기 라디칼, 전자 흡인기, 등으로부터의)는 관능기 탄소의 양 측면에 반드시 부착되어야 한다.
존재하는 경우, 상기 탄소 사슬은 전체 중합체성 시약이 수용성이 되는 한 임의의 수의 탄소원자를 가질 수 있다. 그러나, 통상적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 탄소가 상기 탄소 사슬에 존재한다. 바람직하게는, 상기 중합체성 시약(또한, 대응 전구체 분자, 콘쥬게이트 등)은 탄소수 8 이상인 탄화수소 사슬을 갖지 않게 될 것이다. 따라서, 여기서 구조적으로 정의되는 다양한 탄소 사슬의 측면에서, 각각의 (z), (y), 및 (x) 는 독립적으로, 0 이거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 및 7과 같은 양의 정수, 1 내지 7의 양의 정수, 2 내지 7의 양의 정수 등이다,
탄소 사슬 내의 각각의 탄소에는, 그 4가(價)의 특성 때문에, 2 개의 기가 부착된다. 여기서 구조적으로 정의된 바와 같이 이들 기는 R2, R3, R4, R5, R8 및 R9로 명시되었다. 이들 기 각각은, 존재하는 경우, 독립적으로 수소 또는 유기 라디칼이다. 바람직한 형태에서, R2, R3, R4, R5, R8 및 R9는, 존재하는 경우, 수소인 경우가 포함된다. 임의의 R2, R3, R4, R5, R8 및 R9가 독립적으로 선택될 수 있는 부분의 예시적 형태는 H, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 알키닐, 치환 알키닐, 아릴, 및 치환 아릴을 포함한다.
그럼에도 불구하고, 아래에서 추가적으로 설명하는 바와 같이, 바람직하게는 방향족 부분은 부존재한다.
임의의 R2, R3, R4, R5, R8 및 R9가 독립적으로 선택될 수 있는 특정 부분은 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 및 비닐을 포함한다. 또한, R2, R3, R4, R5, R8 및 R9 중 둘이 연합하여 시클릭 고리계를 형성할 수 있고, 이는 특정 탄소사슬 원자를 가교할 수 있다.
또 다른 예시적 형태는, 상기 탄소사슬을 관능기의 α 위치에 존재하는 사슬 내 탄소에 부착된 유기 라디칼(예컨대, 저급 알킬)을 갖는 것으로 정의하는 것을 포함한다. 유리하게는, 이 위치에 그러한 유기기가 존재하는 것이 중합체성 시약의 선택성을 증가시킨다. 이론에 구애되기를 원치 않으나, 유기 라디칼의 입체적 효과는 또한 관능기가 반응하는데 필요한 활성화 에너지를 증가시킨다. α 탄소 및 β 탄소를 보여주는 예시적 탄소 사슬 (말단 메틸기를 갖는 케톤에 부착된)은 아래에서 제공되며, 여기서, 메틸기가 α 탄소에 부착되어 있고, 탄소사슬 내의 다른 모든 치환기는 수소이다.
바람직하게는, 유기 라디칼이 관능기 탄소의 α 위치의 탄소에 부착되어 있을 때, 관능기 탄소의 β 위치의 원자는 전자 흡인기의 일부이다. 예시적 배열이 다음에 제공되며, 여기서 산소 원자는 전자 흡인기로 사용되었다.
상기 구조에서 비록 산소를 전자 흡인기로 사용하고 있으나, 산소 이외의 전자 흡인기(예컨대, 카르보닐)가 사용될 수 있다.
관능기 탄소의 α 위치의 탄소가 유기 라디칼(예컨대, 메틸)을 함유하고 있을 때 결과적으로 중합체성 시약은 비대칭 중심을 함유하게 된다. 그러나, 하나 이상의 비대칭 탄소를 포함하는 임의의 화합물 또는 구조와 관련하여, 특성 비대칭성은 여기에 명시적으로 예시하지 않는다. 따라서, 본 논의는 임의의 광학활성을 갖는 순수한 이성질체 형태를 모두 포함한다.
여기 기재된 화합물은, 거울상 이성질체의 혼합물 뿐 아니라, 이들의 라세믹 혼합물을 포함한다.
선택적으로, 2 이상의 탄소가 탄소 사슬 내에 존재할 때, 상기 탄소 사슬은 탄소-탄소 이중결합을 포함할 수 있다. 그러한 불포화 기는, 다음에 나타난 바와 같이, α,β-불포화 케톤의 β 탄소에 대한 친핵체의 콘쥬게이트 첨가 반응를 제공하는 중합체성 시약의 능력과 같은 추가적인 반응의 가능성을 제공할 수 있다.
α,β-불포화 케톤은 종종 엔온(enone)이라고 불리운다. 따라서, 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합이 탄소사슬의 임의의 위치에 포함될 수 있는 반면, 이중 결합이 존재하는 경우, 상기 이중 결합은 관능기 탄소(예컨대, 카르보닐 탄소)에 대하여 말단 α 및 β 탄소 사이에 존재하는 것이 바람직하다. 그러나, 하기에서 논의되는 바와 같이, 바람직하게는 엔온은 여기서 기재하는 중합체성 시약으로부터 부존재할 수 있다.
(ii) 전자 흡인기 ("EW" 예컨대, "EWl", "EW2", "EW3" 등)
전자 흡인기는 중합체성 시약 (또한, 대응 전구체 분자, 콘쥬게이트 등)내에 선택적으로 위치하며, 보다 거대한 분자의 다양한 부분을 연결하는 작용을 하는 원자들을 포함한다.
전자 흡인기는 음전성인(electronegative) 원자(들)를 함유하며, 어떤 경우에는, 전자 흡인기 내의 일부 원자들 간에 공명 상호작용(resonance interactions)을 갖는 임의의 원자 또는 기이다.
전자는 전자 흡인기의 음전성 원자(들)로 끌려가고, 그러므로써, 근처의 관능기의 화학에 영향을 미친다. 관능기 탄소의 이웃에(예컨대, "α") 또는 이로부터 2 내지 6 원자 거리 내에 전자 흡인기이 존재하면 실질적으로 전자를 잡아당김으로써 이 탄소를 불안정화시키며, 그러므로써, 관능기의 전체 반응성을 증가시킨다. 따라서, 예컨대, 케톤기 근처에 전자 흡인기이 존재하면 환원성 아민화 반응 및 친핵체의 첨가가 일어나는 다른 반응에서 아민에 대한 그 반응성을 증가시킨다.
그러나, 전자 흡인기의 존재 및/또는 위치는 관능기의 반응성을 지나치게 증가킴으로써, 예컨대, 콘쥬게이션 반응 동안, 상대적 선택성을 제공하는 능력을 방해하는 것은 바람직하지 않다.
선행기술 상의 통상적인 기술 중 하나로 주어진 임의의 전자 흡인기이, 또는 임의의 전자 흡인기의 위치가 관능기의 반응성을 지나치게 증가시키는지 여부를 결정할 수 있다. 예컨대, 여기서 논의 되는 콘쥬게이션 기술은, 각각이 상이한 전자 흡인기 및/또는 관능기 탄소로부터 상이한 거리에 존재하는 전자 흡인기를 갖는 상이한 중합체성 시약을 이용하여 수행될 수 있다.
예컨대, 단백질에 대한 단일 콘쥬게이션을 증거로 원하는 반응성을 제공하는 중합체성 시약은 지나친 반응성을 갖지 않는다.
임의의 전자 흡인기이 포함될 수 있으며, 본 발명은 이와 관련하여 제한되지 않는다. 일반적으로, 전자 흡인기는 -O-, -NH-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)-, -OC(O)-, -OC(O)-NH-, -NH-OC(O)-, -C(O)-, -C(S)- 및 -C(OR)H- 를 포함하며, 여기서 OR 은 알콕시 또는 히드록실 치환기이다. 구조의 측면에서 또한, 'EW1'로 지시되는 전자 흡인기는 바람직하게는 : -O-, -NH-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)-, -OC(O)-, -OC(O)-NH-, -NH-OC(O)-, -C(O)-, -C(S)-, 및 -C(OR)H- 으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 OR 은 알콕시 또는 히드록실 치환기이고, 반면에, "EW2" 및 "EW3"로 지시되는 전자 흡인기는 각각 바람직하게는 -O-, -NH-, -C(O) NH-, -NHC(O)-, -OC(O)-, -OC(O)-, -NH-OC(O)-, -OC(O)-NH-, -C(O)-, -C(S)- 및 -C (OR)H- 으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 OR 은 알콕시 또는 히드록실 치환기이다. 바람직한 전자 흡인기는 단독으로 또는 아미드 또는 카르바메이트의 일부로서의 -C(O)- 이다. 특히 바람직한 전자 흡인기는 -O- 이다.
(iii) 스페이서 부분 ("X", 예컨대, "X1", "X2", "X3", "X4", "X5" 등)
선택적으로, 여기서 제공하는 중합체성 시약(또한, 대응 전구체 분자, 콘쥬게이트 등)은 스페이서 부분을 포함한다. Xl 및 X4로 지시되는 임의의 스페이스 부분에 적합한 부분의 예는 -O-, -S-, -C(O)-, -O-C(O)-, -C(O)-O-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -O-CH2-, -CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-,-CH2-O-CH2-CH2-CH2-,-CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-O-CH2-, -CH2-C(O)-O-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-O-CH2-, -C(O)-O-CH2-CH2-, -NH-C(O)-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-[CH2]0-6-(OCH2CH2)0-2-, -C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, -O-C(O)-CH2-, -O-C(O)-CH2-CH2-, 및 -O-C(O)-CH2-CH2-CH2- 으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것이다.
X2, X3 및 X5로 지시되는 임의의 스페이서 부분에 적합한 부분의 예는 -O-, -S-, -C(O)-, -O-C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -NH-C(O)-O-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -O-CH2-, -CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-, CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-C(O)-, -CH2-O-C(O)-CH2-, -CH2-O-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-C(O)-, -CH2-C(O)-NH-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-O-, -CH2-CH2-NH-C(O)-O-, -CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-O-, -CH2-NH-, -CH2-CH2-NH-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-, -CH2-CH2-C(O)-,-CH2-C (O)-CH2-, -CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-, -(CH2CH2O)0-2-(CH2)0-6-NH-C(O)-O-, -C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, -C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-NH-, -CH2-C(O)-O-, -CH2-CH2-C(O)-O-, 및 -CH2-CH2-CH2-C(O)-O- 으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 포함한다.
상기 중에서, 예컨대, 1,3- 또는 1,4-시클로헥실렌과 같은 간단한 시클로알킬렌기는 2, 3, 또는 4 탄소 알킬렌기를 대체할 수 있다.
그러나, 본 공개의 목적을 위하여, 일련의 원자가 수용성 중합체 단편의 바로 이웃에 있고 상기 일련의 원자가 단순히 또 다른 단량체이라서 제안된 스페이서 부분이 중합체 사슬의 단순한 연장이 되는 경우 일련의 원자는 스페이서 부분이 아니다.
예컨대, 부분 구조 "POLY-X-" 및 POLY가 "CH30(CH2CH2O)m-" 로 정의되고, 여기서 (m)이 2 내지 4000 이고 X 가 스페이서 부분으로 정의되는 경우, 상기 스페이서 부분은 "-CH2CH2O-"로 정의될 수 없는데, 이는 그러한 정의가 단순히 중합체의 연장을 나타낼 것이기 때문이다. 그러나, 이러한 경우에, 허용가능한 스페이서 부분은 "-CH2CH2-"로 정의될 수 있다.
D. 기타 특징
이미 설명된 특징에 더하여, 상기 중합체성 시약은 (또한, 대응 전구체 분자 및 콘쥬게이트)는 기타 선택적인 특징을 가질 수 있다.
예컨대, 전체 중합체성 시약 (또한, 상기 중합체성 시약 내의 유기 라디칼)은 바람직하게는 방향족 부분이 결여된다. 여기서 사용될 때, 그 자체에 달려 있는 π 전자의 콘쥬게이트 시스템이 전혀 없는 경우 이는 방향족 부분이 결여된 것이다. 전형적인 방향족 부분은 벤젠 , " " 구조를 포함하는 것이다. 방향족 구조의 존재는 그러한 존재가 수용성을 감소시키고 생체 내에서 해로운 효과를 가져오기 때문에 바람직하지 않다. 같은 이유로, 상기 중합체성 시약은 또한 그들 구조 내에 할로겐 원자(예컨대, F, Cl, Br 및 I)를 결여하는 것이 바람직하다. 그러나, 할로겐 원자 또는 방향족 부분의 존재는, 보호기가 방향족 또는 할로겐 원자를 포함하는 중합체성 시약의 제조방법에서와 같은 특정 환경에서는 정당화될 수 있다. 또한, 적당한 양에서는 통상적으로 해롭지 않은 할로겐의 이온화 형태는 또한 염을 형성하는데 유용할 수 있다. 여기서 사용되는, 할로겐 원자가 결여된 중합체성 시약은 상기 중합체성 시약(또는 이로부터 형성된 콘쥬게이트 )이 할로겐 반대이온(counterion)을 갖는 염 형태로 존재하는 경우를 포함하지 않는다.
또한, 상기 중합체성 시약은 바람직하게는 시클릭 디엔온이 결여된다. 여기서 사용하기로는, 시클릭 디엔온은 카르보닐 탄소가 시클릭 구조의 일부가 되고 상기 카르보닐 탄소의 어느 한 측면의 α, β 탄소가 이중결합을 갖는 케톤이다. 도식적으로, 시클릭 디엔온의 핵심 구조는 일반적으로 다음과 같이 나타낼 수 있다:
중합체성 시약에서 결여되는 시클릭 디엔온의 예는 다음을 포함한다:
및 .
중합체성 시약 내의 이러한 이중 α,β-불포화 구조는 친핵체의 콘쥬게이트 첨가반응을 유발할 수 있다. 그러나, 콘쥬게이션에의 이러한 접근은 예컨대, 케톤을 통한 환원성 아미노화와 동일한 선택성을 갖지 못한다. 결과적으로, 상기 중합체성 시약은 시클릭 디엔온이 결여되는 것이 바람직하다. 또한, 실상은 상기 중합체성 시약이 엔온(즉, α,β-불포화 케톤)도 결여하는 것이다. 그러나, 다른 형태의 콘쥬게이션 접근을 원하는 경우, 엔온이 존재할 수 있다.
또한, 상기 중합체성 시약은 선택성을 방해할 수 있는 다른 반응성 기를 결여하는 것이 또한 바람직하다. 예컨대, 상기 중합체성 시약은 말단 옥실아민기(즉, -ONH2)를 결여하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 중합체성 시약은 또한 말단 하이드라진기(즉, -NHNH2)를 결여하는 것이 바람직하다.
일부의 경우에, 본 발명의 중합체성 시약은 특정 형태로 존재하지 않는다. 따라서, 예컨대, 상기 중합체성 시약은 다음 형태로 존재하지 않는다:
및 상기 형태의 케탈 유도체. "mw"는 에틸렌 옥사이드 부분의 중량평균분자량을 가리킨다는 것과 단량체 옆에 제공되는 "1-50"와 같은 범위는 상기 부분이 1 내지 50번 반복되는 상기 단량체를 함유하는 것임을 가리킨다는 것이 이해될 것이다.
E. 구조적으로 정의된 중합체성 시약
하기에 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 중합체성 시약은 여러 형태로 제공될 수 있다.
일부 경우에 있어서, 중합체성 시약은 형태에 있어서 선형이고, 단일 수용성 중합체 단편 및 단일 관능기를 포함한다. 이러한 형태의 예시적인 중합체성 시약은 하기 구조를 포함한다:
[화학식 I]
[식 중:
POLY1은 -O-R7과 같이 정의되는 말단을 갖는 수용성 중합체 단편;
(a)는 0 또는 1;
(b)는 0 또는 1;
X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기(electron-withdrawing group);
(z)는 2 내지 7의 정수;
R2로서 나타나는 각각은 독립적으로 H 또는 비방향족 함유 유기 라디칼;
R3로서 나타나는 각각은 독립적으로 H 또는 비방향족 함유 유기 라디칼;
R7은 H 또는 비방향족 함유 유기 라디칼;
FG는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로부터 선택된 관능기; 및
R1은 비방향족-함유 유기 라디칼이고;
나아가, 부분은 임의로 하나 이상의 이중결합을 함유하며,
단, 중합체성 시약이
또는
인 경우는 제외한다].
선형 배열 및 케톤을 갖는 예시적인 중합체성 시약은 하기 구조를 갖는다:
[화학식 Ia]
[식 중, R7, POLY1, X1, EW1, R1, R2, R3, (a), (b), 및 (z)는 화학식 I과 관련하여 앞서 정의한 바와 같다].
상응하는 케탈은 하기 구조를 갖는다:
[화학식 Ib]
[식 중, R7, POLY1, X1, EW1, R2, R3, (a), (b), (z), 및 R1은 화학식 I과 관련하여 앞서 정의한 바와 같으며, 나아가, 식 중, R10은 유기 라디칼 (바람직하게는 비방향족)이고, R11은 유기 라디칼 (바람직하게는 비방향족)이거나, 또는 R10 및 R11은 결합하여 시클릭 케탈 (바람직하게는 비방향족, 즉, 에틸렌 또는 치환된 에틸렌과 같은 알킬렌)을 형성한다].
선형 배열 및 케톤 히드레이트를 갖는 예시적인 중합체성 시약은 하기 구조를 갖는다:
[화학식 Ic]
[식 중, R7, POLY1, X1, EW1, R2, R3, R1, (a), (b), 및 (z)는 화학식 I과 관련하여 앞서 정의한 바와 같다].
이러한 형태의 중합체성 시약의 보다 구체적인 (그러나 비제한적인) 예들은:
로 이루어진 군으로부터 선택된 것들을 포함하며, 식 중 (m)은 약 3 내지 약 3000이다.
본 발명의 선형 중합체성 시약의 다른 예는 탄소 함유 관능기 및 수용성 중합체 단편으로 이루어진 중합체성 시약이며, 이 경우 탄소 함유 관능기의 탄소는 환구조의 일부이고, 나아가 이 경우, 환구조는 직접적인 공유 결합에 의해 또는 스페이서 부분을 통하여 수용성 중합체 단편에 부착되며, 이 경우 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된다.
환구조와 관련하여, 임의의 비방향족 고리도 사용될 수 있고, 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 예시적인 환구조는:
피페리디닐, 즉, ; 시클로헥실, 즉, ; 시클로펜틸, 즉, ; 비시클로[2,2,1]헵타닐, 즉, ; 비시클로[2,2,1]헥사닐, 비시클로[3,2,1]옥타닐, 비시클로[3,3,1]노나닐, 시클로부틸, 즉, ; 시클로헵틸, 즉, 및 시클로옥틸, 즉, 이들의 옥사 및 아자 형태 및 임의의 앞서 언급한 것들 중 임의의 디옥사 및 디아자 형태를 포함한다.
바람직하게, 환구조에 하나 이상의 이종원자가 존재하는 경우, 적어도 하나의 이종원자는 관능기 탄소의 알파 또는 베타 위치에 위치한다. 이종원자가 베타 위치에 위치하는 예시적인 이종원자 함유 환구조는: 옥사시클로헥실, 즉, ; 아자시클로펜틸, 즉, ; 옥사비시클로[2,2,1]헵타닐, 즉, , 및 디옥사시클로옥틸, 즉, 를 포함한다.
환구조에 있어서 어떠한 탄소도 관능기 탄소일 수 있지만, 관능기 탄소의 예시적인 위치는 별표로 나타내었다.
중합 활성 에스테르와 반응하여 분지형 산물을 형성하는데 유용한 환구조의 디아자 형태는 하기를 포함한다:
다시 말하지만, 환구조의 어떠한 탄소도 관능기 탄소일 수 있고, 이 경우 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된다.
케톤을 포함하는 환구조에 있어서 이종원자를 갖는 중합체성 시약의 예를 화학식 II로 나타낸다. 화학식 II에 있어서 환구조는 피페리도닐 시클릭 부분을 포함한다.
[화학식 II]
[식 중:
POLY1은 -O-R7과 같이 정의되는 말단을 갖는 수용성 중합체 단편;
(a)는 0 또는 1;
(b)는 0 또는 1;
X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
(z)는 0 또는 양의 정수;
R2로서 나타나는 각각은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
R3로서 나타나는 각각은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼; 및
R7은 H 또는 유기 라디칼이다].
상응하는 케탈 유도체는 하기 구조를 갖는다:
[화학식 IIa]
[식 중, R7, POLY1, X1, EW1, R2, R3, (a), (b), 및 (z)는 화학식 II와 관련하여 앞서 정의한 바와 같으며, 나아가, 식 중, R10은 유기 라디칼 (바람직하게는 비방향족)이고, R11은 유기 라디칼 (바람직하게는 비방향족)이며, 또는 R10 및 R11은 결합하여 시클릭 케탈 (바람직하게는 비방향족, 즉, 에틸렌 또는 치환된 에틸렌과 같은 알킬렌)을 형성한다].
선형 배열 및 케톤 히드레이트를 갖는 예시적인 중합체성 시약은 하기 구조를 갖는다.
[화학식 IIb]
[식 중, R7, POLY1, X1, EW1, R2, R3, (a), (b), 및 (z)는 화학식 II와 관련하여 앞서 정의한 바와 같다].
관능기를 포함하는 환구조가 중합체성 시약에 존재하는 경우, 환구조가 전자 흡인 또는 스페이서 부분에 직접 부착되는 것이 특히 바람직하다. 따라서, 예를 들어, 화학식 II, IIa, IIb와 관련하여, (z)가 0인 것이 바람직하다.
나아가, 전자 흡인기(EW1)가 카르보닐기인 것이 특히 바람직하다. 따라서, 이러한 형태를 취하는 바람직한 중합체성 시약은 하기 구조를 포함한다.
[화학식 IIc]
[화학식 IId]
[화학식 IIe]
[식 중, 화학식 IIc, IId 및 IIe 각각에서의 R7, POLY1 및 X1은 화학식 II와 관련하여 앞서 정의한 바와 같고, 화학식 IId에서의 R10 및 R11은 화학식 IIa와 관련하여 앞서 정의한 바와 같다].
이러한 형태의 예시적인 중합체성 시약은, 이에 한정되지는 않지만, 하기를 포함한다:
[식 중, (m)은 약 3 내지 약 3000이다].
일부 경우에 있어서, 중합체성 시약은 형태에 있어서 선형이고 단일 수용성 중합체 단편 및 하나 초과의 관능기를 포함한다. 이러한 형태의 예시적인 중합체성 시약은 하기 구조를 포함한다:
[화학식 III]
[식 중:
POLY1은 2,200 달톤 초과의 분자량을 갖는 수용성 중합체 단편;
(a)는 0 또는 1;
(b)는 0 또는 1;
(c)는 0 또는 1;
(d)는 0 또는 1;
X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
X2는, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
EW2는, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
(z)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
(y)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
R2로서 나타나는 각각은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
R3로서 나타나는 각각은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
R4로서 나타나는 각각은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
R5로서 나타나는 각각은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
FG-R1은 (i) R1 (식에서, R1은 유기 라디칼임) 로 정의되는 말단을 갖는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기이거나, (ii) 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기가 환구조의 일부인 비디엔온 환구조; 및
FG-R6는 (i) R6 (식에서, R6는 유기 라디칼임) 로 정의되는 말단을 갖는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기이거나, (ii) 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기가 환구조의 일부인 비디엔온 환구조이다].
이러한 형태의 특히 바람직한 중합체성 시약은 하기 구조를 포함한다:
[화학식 IIIa]
[식 중, POLY1, (a), (b), (c), (d), X1, X2, EW1, EW2, (z), (y), R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6는 화학식 III과 관련하여 앞서 정의한 바와 같다].
상응하는 화학식 (IIIa)의 케탈 함유 유형은 하기 구조를 포함한다:
[화학식 IIIb]
[식 중, POLY1, (a), (b), (c), (d), X1, X2, EW1, EW2, (z), (y), R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6는 화학식 III과 관련하여 앞서 정의한 바와 같으며, 나아가 식 중, R10은 유기 라디칼 (바람직하게는 비방향족)이고, R11은 유기 라디칼 (바람직하게는 비방향족)이며, R12는 유기 라디칼 (바람직하게는 비방향족)이고, R13은 유기 라디칼 (바람직하게는 비방향족)이거나, 또는 R10 및 R11은 결합하여 시클릭 케탈 (바람직하게는 비방향족, 즉, 에틸렌 또는 치환된 에틸렌과 같은 알킬렌)을 형성하고, R12 및 R13은 결합하여 시클릭 케탈 (바람직하게는 비방향족, 즉, 에틸렌 또는 치환된 에틸렌과 같은 알킬렌)을 형성한다].
상응하는 화학식 III의 케톤 히드레이트는 하기 구조를 포함한다:
[화학식 IIIc]
[식 중, POLY1, (a), (b), (c), (d), X1, X2, EW1, EW2, (z), (y), R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6는 화학식 III과 관련하여 앞서 정의한 바와 같다].
화학식 III에 따른 중합체성 시약의 예시적인 형태는:
를 포함하며, 식 중 (m)은 약 55 내지 약 3000이다.
케톤기 또는 이러한 형태의 하나를 유리하게 함유하는 시약의 다른 유형은 이종이관능성 (heterobifunctional) 중합체성 시약이다. 이 중, 다른 유형의 생체분자들과 반응하는 것들이 가장 많이 사용된다. 예를 들어, 어떤 것은 단백질 또는 폴리펩티드에 있어서 아민기와 반응할 수 있는 케톤 및, 다른 단백질 또는 폴리펩티드에 있어서 티올기와 반응할 수 있는 말레이미드 관능기를 가질 수 있다. 앞서 언급한 이종이관능성 중합체성 시약의 예시적인 형태를 하기에 나타낸다,
[식 중, (m)은 약 3 내지 약 3000이다].
중합체성 시약의 하나의 관능기가 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 이러한 것들 및 이밖의 이종이관능성 형태는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
유리하게, 본 발명의 중합체성 시약은 하나 초과의 수용성 중합체 단편을 포함할 수 있다. 종종, 이러한 중합체성 시약들은 통상적으로 "분지형"이라고 언급된다. 하기에서 더욱 자세히 나타나는 바와 같이, 분지화는 관능기 탄소에서 또는 관능기 탄소 이외의 위치에서 현재 기술되고 있는 중합체를 생성할 수 있다. 관능기 탄소에서 발생된 분지화는 선형 및 분지형 중합체성 시약을 제공하여, "V" 배열을 제공한다. 관능기 탄소 외의 부분에 의해 형성된 분지화는 통상적으로 비선형이고, 생성 중합체성 시약은 종종 문자 "Y"의 형태이다.
예시적인 분지형 중합체성 시약 (선형 또는 그외의)은 제 1 수용성 중합체 단편, 제2 수용성 중합체 단편 및 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기로 이루어지며, 이 경우 제1 및 제2 수용성 중합체 단편은 직접적인 공유결합 또는 하나 이상의 원자에 의하여 관능기에 부착되고, 나아가 이 경우, 관능기가 케톤, 케톤 히드레이트, 헤미케탈 또는 케탈인 경우: (a) 중합체성 시약은 방향족 부분이 없거나; 또는 (b) 중합체성 시약에 있어서 각 수용성 중합체 단편은 1000 달톤 이상의 중량 평균 분자량을 갖는다.
따라서, 예를 들어 본 발명의 분지형 중합체성 시약은 하기 구조를 포함한다:
[화학식 IV]
[식 중:
POLY1은 제 1 수용성 중합체 단편;
POLY2는 제 2 수용성 중합체 단편;
(a)는 0 또는 1;
(b)는 0 또는 1;
(e)는 0 또는 1;
EW3는, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
(z)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
(x)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
R2로서 나타나는 각각은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
R3로서 나타나는 각각은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
R8로서 나타나는 각각은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
R9로서 나타나는 각각은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼; 및
FG는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로부터 선택되는 관능기이다].
화학식 IV의 케톤 함유 중합체성 시약은 하기 구조를 포함한다:
[화학식 IVa]
[식 중, POLY1, POLY2, (a), (b), (e), (f), (z), (x), X1, EW1, EW3, 및 X3는 화학식 IV와 관련하여 앞서 정의된 바와 같다].
화학식 IV의 케탈 함유 유형은 하기 구조를 포함한다:
[화학식 IVb]
[식 중, POLY1, POLY2, (a), (b), (e), (f), (z), (x), X1, EW1, EW3, 및 X3는 화학식 IV와 관련하여 앞서 정의된 바와 같고, 나아가 식 중, R10은 유기 라디칼 (바람직하게는 비방향족)이고, R11은 유기 라디칼 (바람직하게는 비방향족)이거나, 또는 R10 및 R11은 결합하여 시클릭 케탈 (바람직하게는 비방향족, 즉, 에틸렌 또는 치환된 에틸렌과 같은 알킬렌)을 형성한다].
관능기가 케톤 히드레이트인 화학식 IV의 예시적인 중합체성 시약은 하기 구조를 포함한다:
[화학식 IVc]
[식 중, POLY1, POLY2, (a), (b), (e), (f), (z), (x), X1, EW1, EW3, 및 X3는 앞서 정의된 바와 같다].
화학식 IV, IVa, IVb, 및 IVc의 중합체성 시약으로부터 분명히 나타나는 바와 같이, 관능기 탄소는 분지점으로서의 역할을 하며, 두 개의 수용성 중합체 단편 각각은 이를 통하여 궁극적으로 부착된다. 이런 식으로, 중합체성 시약은 문자 "V"와 닮은 형태 또는 이의 평평한 형태를 갖는다. 각 수용성 중합체성 시약은 또한 추가로 분지되어 넷 이상의 수용성 중합체 단편들을 갖는 중합체성 시약을 제공할 수 있다.
분지형 중합체성 시약의 관능기 탄소는 또한 하기에 나타난 바와 같이 보다 복잡한 부분의 일부일 수 있다:
[식 중, (m)은 약 3 내지 약 3000이고, (a)는 0 또는 1, (e)는 0 또는 1, 존재하는 경우 X1은 스페이서 부분, 및 존재하는 경우 X3는 스페이서 부분이다]. 상기에 나타낸 3,7-디아자-비시클로[3,3,1]노난-9-온 이외의 디아자 환구조 또한 분지화에 적합한 부분을 제공할 수 있다.
본 발명의 분지형 중합체성 시약 형태의 일부 경우에 있어서, 관능기 탄소 이외의 부분이 분지화 부분으로서의 역할을 한다. 그러나 이런 경우에 있어서, 분지화 부분은 적어도 3개의 부착 위치를 제공하여야 하며, 하나의 부착 위치는 관능기, 제 1 수용성 중합체 단편 및 제 2 수용성 중합체 단편 각각과의 (직접적 또는 하나 이상의 원자를 통한) 결합을 제공한다.
본 발명의 분지형 중합체성 시약을 제공하기 위한 바람직한 분지화 부분은 하기 구조를 포함한다:
[식 중, POLY1 및 POLY2 각각은 (동일하거나 또는 다른) 수용성 중합체 단편이고, R"는 H, 메틸, 또는 수용성 중합체 단편과 같은 비반응성 부분; 및 X4 및 X5는 각각 (동일하거나 또는 다른) 스페이서 부분이다].
바람직한 분지형 부분들은
로 이루어진 군으로부터 선택되고,
식 중, 각 경우에 있어서, POLY1 및 POLY2는 앞서 정의한 바와 같고, (d)는 0, 1, 2, 또는 3이고, (e)는 0, 1, 2, 또는 3이다.
이러한 유형의 분지형 구조의 예는 하기 구조로 이루어진다:
[화학식 V]
[식 중:
POLY1은 제1 수용성 중합체 단편;
POLY2는 제2 수용성 중합체 단편;
(a)는 0 또는 1;
(b)는 0 또는 1;
X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
X4는 스페이서 부분;
X5는 스페이서 부분;
EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
(z)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
R2로서 나타나는 각각은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
R3으로서 나타나는 각각은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
R15는 H 또는 비방해성 유기 라디칼; 및
FG-R14는 (i) R14 (식에서, R14는 유기 라디칼임)로서 정의되는 말단을 갖는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기이거나, 또는 (ii) 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기가 환구조의 일부인 환구조이다].
일부 경우에 있어서, FG-R14는 R14 (식에서, R14는 유기 라디칼임)로서 정의되는 말단을 갖는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기를 나타낸다. 따라서, (FG-R1 및 FG-R6과 마찬가지로) FG-R14의 예시적인 형태는
를 포함한다.
다른 경우에 있어서, FG-R14는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기가 환구조의 일부인 환구조를 나타낸다.
환구조가 피페리도닐 구조인 예시적인 중합체성 시약은 하기를 포함한다:
식 중, 각 경우에 있어서, POLY1, POLY2, R2, R3, X1, X4, X5, (a), EW1, 및 (b)는 화학식 V와 관련하여 앞서 정의한 바와 같다.
본 발명의 수용성 중합체 단편으로서의 사용에 적합한 예시적인 분지형 중합체는 미국특허 제 5,932,462 호에 기재되어 있으며, 이중치환된 리신 잔류물 기재이다. 리신계 분지형 중합체의 두 구체적인 예는 에스테르-함유 유형:
아미드-함유 유형:
을 포함한다.
따라서, 예를 들어, 하기의 구조에 의해 포함되는 중합체성 시약은 화학식 V와 관련하여, POLY1 및 POLY2 각각을 PEG로 치환하고, 아미드-함유, 리신계 분지형 구조를 분지화 부분으로 사용함에 의해 생성된다:
[식 중, (a), (b), (z), X1, EW1, R2, R3, R14, FG는 화학식 V와 관련하여 앞서 정의한 바와 같고, (m)은 3 내지 약 3000이다].
또한, 하기 구조에 의해 포함되는 중합체성 시약은 화학식 IV와 관련하여, POLY1 및 POLY2 각각을 PEG로 치환하고, 아미드-함유, 리신계 분지형 구조를 분지화 부분으로 사용함에 의해 생성된다:
[식 중, R2, R3, R8, R9, (a), (b), (e), (f), (z), (x), X1, EW1, FG, EW3, 및 X3는 앞서 정의한 바와 같고, (m)은 3 내지 약 3000 이다].
둘 이상의 수용성 중합체 단편들을 포함하는 중합체성 시약은 상대적으로 긴 단일 중합체를 사용함 없이 보다 높은 분자량 종류를 유리하게 제공한다. 따라서, 예를 들어, 두개의 수용성 중합체 단편을 포함하는 중합체성 시약으로서, 각 단편이 약 5000 달톤의 명목 평균 분자량을 갖는 것은 약 10000 달톤의 총 분자량을 가질 수 있다.
둘 이상의 수용성 단편들로 이루어진 중합 유도체로부터 형성된 콘쥬게이트의 전달의 맥락에서, 개개의 수용성 중합체 단편들은 생체내에서 분리될 수 있다. 하나 이상의 수용성 중합체 단편들이 콘쥬게이트로부터 분리됨에 따라, 보다 작은 크기의 생성 콘쥬게이트는 종종 신체로부터의 콘쥬게이트의 향상된 청소율 (clearance)를 야기한다. 수용성 중합체 단편들의 분자량 (즉, 크기) 및/또는 중합체성 시약에 있어서 분리가능한 결합을 선택함으로써, 콘쥬게이트의 청소율 프로필을 조절하는 것이 가능하다. 해당 기술에서 통상의 지식을 가진 사람은 예를 들어, 다른 수용성 중합체 단편 중량 및 분리가능한 결합을 갖는 다양한 중합체성 시약을 준비하고, 중합체성 시약을 활성제와 콘쥬게이트시키고, 각각의 콘쥬게이트를 환자에게 주사하고, 이어서 청소율 프로필 (즉, 주기적인 혈액 및 소변의 표본 추출에 의해) 수득함에 의한 일상적인 실험에 근거하여 분리가능한 결합 뿐만 아니라 수용성 중합체 단편들의 적당한 분자량을 결정할 수 있을 것이다. 이에 따라 어떠한 (상응하는 콘쥬게이트 기재의) 중합체성 시약이 요구되는 청소율 프로필을 제공하는지를 결정하는 것이 가능하다.
중합체성 시약은 다른 형태를 취할 수도 있다. 예를 들어, 중합체성 시약은 직접적인 공유 결합 또는 하나 이상의 원자에 의하여 수용성 중합체 단편에 부착된 관능기로 이루어질 수 있고, 이 경우: (a) 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 및 티온의 디티오케탈, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되고, (b) 중합체성 시약은 탄소수 8 이상의 포화된 탄화수소 단편을 갖지 않는다. 관능기는 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 및 디티오케탈로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 중합체성 시약은 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 일반적으로 조성물은 하나 이상의 임의의 성분 외에 둘 이상의 동일하거나 다른 중합체성 시약을 포함한다. 어떤 상황에서는 조성물의 모든 불필요한 성분을 제거하는 것이 불가능할 수도 있지만, 본 명세서에서 설명되는 중합체성 시약의 조성물은 불필요한 성분이 없거나 또는 실질적으로 없는 것이 바람직하다.
불필요한 성분의 예들은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 종종 조성물의 계획된 용도 및/또는 중합체성 시약에 의존된다. 그러나, 구체적인 예들은 일반적으로, 불순물, 환자에게 주입되는 경우 해를 끼칠 수 있는 (즉, 독성인) 성분, 이전 합성 단계로부터 잔류하는 비반응 물질 등을 포함한다.
바람직하게 조성물은 실질적으로, 또는 보다 바람직하게는 완전히 산화부산물이 없다. 조성물은 종종 예를 들어 크로마토그래피를 통한 조성물의 정제에 의하여 산화 부산물이 실질적으로 없거나 또는 완전히 없게 되어, 임의의 불필요한 산화 부산물을 제거할 수 있다. 다른 접근법은 산화 단계를 사용하지 않고 중합체성 시약 및 조성물을 포함하는 임의의 다른 성분들을 제공하는 것이다. 또한, 대기의 산소가 조성물 또는 이의 임의의 성분과 반응하여 조성물에 있어서 산화 부산물을 생성하지 않도록 주의를 기울여야만 한다. 이러한 맥락에서, 산화 부산물이 실질적으로 없는 조성물은 적어도 75%(중량 기준)의 산화 부산물이 없으며, 보다 바람직하게는 적어도 85%(중량 기준)의 산화부산물, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 90%(중량 기준)의 산화 부산물, 보다 더더욱 바람직하게는 적어도 95%의 산화 부산물, 추가로 보다 더욱 바람직하게는 98%(중량 기준)의 산화 부산물이 없으며, 적어도 99.9%(중량 기준)의 산화부산물이 없는 것이 가장 바람직하다.
다른 문제점들 중, 산화 부산물은 중합체성 시약 조성물을 콘쥬게이션 반응에 있어서의 시약으로서 부적당하게 만든다. 예를 들어, 산화 부산물은 PEG와 같은 수용성 중합체 단편의 분리된 부분일 수 있으며, 이는 수용성 중합체 단편이 산화 조건에 노출되는 경우 발생할 수 있다. 또한, 산화 부산물은 산화 물질 그 자체일 수 있고, 이는 이어지는 합성단계에서 완전히 제거되지 않는다. 상기 물질은 조성물의 산물을 계속해서 산화시켜 수용성 중합체 단편의 불필요한 사슬 분리를 일으킨다. 따라서, 산화 부산물은 바람직하게는 본 명세서에서 설명되는 조성물에는 없어야 한다.
따라서, 본 발명은 또한 직접적인 공유 결합 또는 하나 이상의 원자에 의하여 수용성 중합체 단편에 부착된 관능기로 이루어진 중합체성 시약을 포함하는 조성물을 포함한고, 이 경우, 조성물은 실질적으로 산화 부산물이 없다.
실질적으로 산화 부산물이 없는 조성물의 성분일 수 있는 (반드시 그렇지는 않지만) 중합체성 시약의 예는 하기 구조로 이루어진다:
[화학식 VI]
[식 중:
(a)는 0 또는 1;
(b)는 0 또는 1;
X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
(z)는 1 내지 7;
R2로서 나타나는 각각은 독립적으로 H 또는 비방향족 함유 유기 라디칼;
R3로서 나타나는 각각은 독립적으로 H 또는 비방향족 함유 유기 라디칼; 및
(m)은 3 내지 약 3000, 보다 바람직하게는 11 내지 약 3000이고, 이 경우 조성물은 실질적으로 산화부산물, β-케토 에스테르,
및
의 케탈 유도체가 실질적으로 없다].
본 명세서에서 논의되는 케톤 이외의 관능기 (즉, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈)는 화학식 VI의 케톤 관능기로 치환될 수 있다.
III. 중합체성 시약의 제조 방법
중합체성 시약을 제조하는 다양한 방법들을 논의하기 전에, 상기 방법들은, 종종, 관능기의 보호된 형태의 사용에 의존한다는 점이 지적되어야만 한다. 케탈과 같은 일부 관능기는 보호를 요구하지 않을 수 있다. 게다가, 일부 관능기는 본 명세서에서 설명되는 중합체성 시약과 함께 다른 관능기의 보호된 형태로서의 역할을 한다 (즉, 케탈은 종종 케톤의 보호된 형태로서의 역할을 한다). 해당 기술에서 통상의 지식을 가진 자는 본 명세서에서 설명되는 중합체성 시약과 관련하여, 각 관능기에 대한 적합한 보호 형태를 알 것이다. 예를 들어, 케톤의 보호된 형태는 (시클릭 또는 디에테르 유형의) 케탈을 포함한다. 케탈은 케톤을 산 촉매의 존재하에 알콜, 디올, 티올 또는 디티올과 반응시켜 형성될 수 있다. (다른 케탈과 마찬가지로) 이렇게 형성된 케탈은 산 가수분해에 의하여 케톤으로 변형될 수 있다. 본 명세서에서 논의되는, 보호하거나 탈보호하는 다양한 관능기와 더불어 이외의 보호된 형태들은 Green et al. supra에 기재되어 있다.
중합체성 시약을 제조하기 위한 다양한 단계들은 적합한 용매에서 수행된다. 해당기술의 당업자는 주어진 임의의 반응단계에 어떠한 구체적인 용매가 적합한지 결정할 수 있을 것이다. 그러나, 종종, 상기 용매는 바람직하게는 비극성 용매 또는 극성 비양자성 용매이다. 비극성 용매의 비제한적인 예는 벤젠, 크실렌, 디옥산, 테트라하이드로퓨란 (THF), t-부틸 알콜 및 톨루엔을 포함한다. 특히, 바람직한 비극성 용매는 톨루엔, 크실렌, 디옥산, 테트라하이드로퓨란 및 t-부틸 알콜을 포함한다. 예시적인 극성 비양자성 용매는, 이에 제한되지는 않지만, DMSO (디메틸 술폭시드), HMPA (헥사메틸포스포아미드), DMF (디메틸포름아미드), DMA (디메틸아세트아미드), 및 NMP (N-메틸피롤리디논)을 포함한다.
본 발명의 중합체성 시약은 다양한 방법으로 합성될 수 있다. 한 방법과 관련하여 논의되는 공통적인 기술은 다른 방법에서 논의되는 유사한 기술에 적용할 수 있다는 것을 유의하여야 한다.
결과적으로, 주어진 방법에 대한 임의의 구체적인 기술의 논의는 그 방법에 제한되지 않으며, 따라서 그 기술을 사용한 각 방법에 적용된다.
일부 방법에 있어서, 중합체성 시약은 중합 접근법에 의하여 형성된다. 따라서, 예를 들어, 중합체성 시약은:
(i) 중합의 개시에 적합한 적어도 하나의 음이온성 부위 및 관능기 또는 이의 보호된 형태로 이루어진 전구체 분자를 제공하고, 이 경우 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(ii) 전구체 분자의 음이온성 부위를 중합이 가능한 반응성 단량체와 접촉시켜 전구체 분자 상에서 반응성 단량체의 중합을 개시시키고;
(iii) 전구체 분자에 추가의 반응성 단량체를 첨가하여 하나 이상의 중합체 사슬을 형성하고
(iv) 하나 이상의 중합체 사슬이 요구되는 길이에 도달할때까지 상기 첨가를 계속하고;
(v) 반응을 종결하여 관능기 또는 이의 보호된 형태로 이루어진 중합체성 시약을 생성하고; 및
(vi) 임의로, 관능기가 보호된 형태인 경우, 관능기를 탈보호시키는 단계로 이루어진 방법에 의하여 형성될 수 있다.
음이온성 부위는 중합을 위한 개시 부위로서의 역할을하며, 일반적으로, 필수적인 것은 아니지만, 알콕시드 부분이다. 알콕시드 부분은 유리하게는 상응하는 알콜을 탈양성자성 염기에 노출시켜, 알콜로부터 수소원자를 제거하여 요구되는 알콕시드 부분을 얻음에 의하여 수득된다.
화학식 IV에 상응하는 중합체성 시약을 형성하기 위하여, 하기 구조를 포함하는 전구체 분자가 사용될 수 있다:
[화학식 VIIa]
[식 중, (a), (b), (e), (f), (x), (z), EW1, EW3, R2, R3, R8, 및 R9은 화학식 IV와 관려하여 앞서 정의한 바와 같으며, 추가로 식 중, pFG는 관능기 또는 이의 보호된 형태이고, 이 경우 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된다].
화학식 I에 상응하는 중합체성 시약은 전구체 분자가 하기 구조를 포함하는 다음의 접근법을 포함하는 방법에 의하여 형성될 수 있다:
[화학식 VIIb]
[식 중, (a), (b), (z), EW1, R1, R2, 및 R3는 화학식 I과 관련하여 앞서 정의된 바와 같고 (발명의 요약 부분에서), 나아가 식 중, pFG는 관능기 또는 이의 보호된 형태이며, 이 경우 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된다].
만약 화학식 VIIa에 상응하는 디올이 사용되거나, 화학식 VIIb에 상응하는 알콜이 사용되면 (이 경우 수소 원자는 각 알콕시드 부분에 부착된다), 알콕시드 개시제 부위를 얻기 위하여 수소를 제거하는 추가의 단계 (예를 들어 알콜을 탈양성자성 염기로 처리하여)가 요구된다. 또한, 티올레이트 (즉, -S-)가 알콕시드 부분 대신에 사용될 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 상응하는 티올 또는 디티올은 염기에 존재하여, 중합에 있어서 적합한, 필요한 음이온성 부위를 제공할 수 있다.
이러한 접근법에 있어서 전구체 분자로서 사용에 적합한 구체적인 분자는 하기를 포함한다:
전구체 분자로서 사용하기에 적합한 이와 같은 그리고 이외의 분자들은 (위에 나타난 바와 같이 또는 이의 상응하는 알콜의 형태로) 시판가능하고 및/또는 통상적인 기술을 사용하여 합성될 수 있다.
중합에 적합한 개시 부위 (즉, 음이온성 부위)를 갖는 전구체 분자를 제공한 후, 이러한 접근법의 다음 단계는 전구체 분자의 개시 부위를 중합이 가능한 반응성 단량체와 접촉시켜 전구체 분자 상에서 반응성 단량체의 중합을 개시하는 단계를 포함한다. 임의의 반응성 단량체는, 생성 중합체 사슬이 수용성인 한, 중합체 사슬(들)을 "성장"시키는데 사용될 수 있다. 그러나, 반응성 단량체가 에틸렌 옥사이드임으로써 폴리(에틸렌 옥사이드) 사슬(들)을 제공하는 것이 특히 바람직하다. 이와 같은, 그리고 이외의 중합 기술들은 해당 기술의 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어, Odian, Chap. 7, Principle of Polymerization, 3rd ED., McGraw-Hill, 1991에서 참조된다.
한번 중합이 개시되면, 추가의 반응성 단량체들이 전구체 분자에 첨가되어 하나 이상의 중합체 사슬을 형성한다. 반응성 단량체의 첨가는 하나 이상의 중합체 사슬이 효과적으로 "성장"할 수 있도록 한다. 중합체 사슬(들)의 성장은 원하는 분자량이 달성될 때까지 계속되며, 이 때 반응은 종결된다. 종결은 알려진 다양한 임의의 기술에 의해 일어날 수 있다. 예를 들어, 반응 중간물을 중화하는 것은 중합체 사슬(들)의 성장을 정지시킬 수 있다. 또한, 반응성 단량체의 특정 중량 또는 양을 첨가하고 모든 반응성 단량체들이 소진될때까지 중합이 진행되도록 하는 것은 특정의 그리고 결정 가능한 분자량을 갖는 중합체 사슬을 야기한다. 상기 생성물은 관능기 또는 이의 보호된 형태를 포함하는 중합체성 시약이다.
임의로 및 말단 캡핑 단계를 수행하기에 앞서, (소수성 또는 친수성의) 친전자적 반응성 중합체가 중합체 사슬에 첨가될 수 있다.
에톡실레이션 방법의 증가된 이점은 리빙(living) 중합체 말단 (즉, 추가의 단량체들이 첨가될 수 있는 중합체의 종단)을 다른 중합체를 포함하는 다양한 부분으로 캡핑할 수 있도록 한다는 것이다. 이는 다양한 특성을 갖는 중합체들의 생성을 허용한다. 따라서, 소수성 중합체로 이미 형성된 수용성 중합체 단편을 캡핑하고, 친수성 및 소수성 영역을 갖는 최종 중합체를 생성하는 것이 가능하다. 많은 적용에 있어서 보다 중요하게는, 친전자적 반응성 PEG 유도체를 첨가하여 사슬 연장을 제공하는 것이 가능하며, 반면, 이와 동시에 가수분해적으로 분리가능한 단위가 첨가된다. 후자는 신체로부터 불필요한 청소율 프로필을 가질 수 있는 약리적 활성 단백질과 같은 활성 물질의 약물전달과 관련하여 중요하다. 이러한 사슬 연장 캡핑의 일반화된 예는 카르보네이트, 우레탄 또는 유사한 관능기 결합을 제공하는 단일치환된 PEG 유도체를 리빙 중합체와 반응시키는 것을 포함한다. 그러나, 중합체의 부착은 수용성 또는 면역원성(immunogenic)인 중합체 콘쥬게이트를 야기하지 않아야 한다.
중합체성 시약에 있어서 수용성 중합체 단편을 형성한 후, 말단-캡핑기는 통상적인 기술을 사용하여 임의로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 알킬 할라이드 (즉, 메틸 할라이드 또는 메틸 p-톨루엔술포네이트)는 중합체 사슬의 노출된 말단 (관능기 또는 이의 보호된 형태에 대해 멀리 떨어진 말단 또는 말단들) 과 반응될수 있다. 게다가, 하나 이상의 중합체 사슬은 추가의 중합체로 캡핑될 수 있다.
임의로, 중합체성 시약이 관능기의 보호된 형태를 포함하는 경우, 상기 관능기는 해당 기술에 알려진 방법에 의하여 제거될 수 있다. 예를 들어, (시클릭 또는 디에테르 유형의) 케탈 부분은 가수분해를 겪음에 따라 제거될 수 있다. 다른 보호기를 제거하는 방법에 대한 참조는 역시 [Green et al. supra]에 언급되어 있다.
중앙의 관능기 및 관능기의 각 측면에 수용성 중합체 단편을 갖는 중합체성 시약을 제공하기 위한 이와 같은 에톡실레이션계 접근법의 이점은 분자량 조절의 유연성 및 캡핑 단계에 있다. 예를 들어, 어떤 것은 중합하여 5000 달톤의 평균 분자량을 갖는 리빙 중합체를 생성하고 메틸레이팅 시약을 첨가하여 하이드록시 말단기를 캡핑할 수 있다. 이는 안정된 (상대적으로 비반응성의) 말단 기를 갖는 약 5000 달톤의 분자량을 갖지만 중합 유도체의 대략 중간 부분에서 관능성 부분을 갖는 중합체를 생성한다. 게다가, 어떤 것은 리빙 중합체를 사슬 연장제로 캡핑하여 보다 높은 분자량을 갖도록 하거나 또는 벤질과 같은 관능적 반응성 에테르기로 캡핑하여 말단기의 화학적 조절의 잠재력을 가질 수 있는, 제거가능한 기를 생성한다.
중합체성 시약을 제조하기 위한 또 다른 중합 기재 접근법은 보호된 2차 알콜의 사용을 포함한다. 구체적으로, 이러한 접근법 방법은
(i) 보호된 2차 알콜 또는 티올 및 중합을 개시하기에 적합한 적어도 하나의 음이온성 부위로 이루어진 전구체 분자를 제공;
(ii) 전구체 분자의 음이온성 부위를 중합이 가능한 반응성 단량체와 접촉시켜 전구체 분자 상에서 반응성 단량체의 중합을 개시;
(iii) 부가적인 반응성 단량체를 전구체 분자에 첨가하여 하나 이상의 중합체 사슬을 형성
(iv) 하나 이상의 중합체가 요구되는 길이에 도달할 때까지 상기 접촉을 계속하도록 함;
(v) 반응을 종결시켜 보호된 이차 알콜 또는 티올로 이루어진 중간물을 생성;
(vi) 중간물의 보호된 이차 알콜 또는 티올을 탈보호화시켜 비보호 2차 알콜 또는 티올을 형성;
(vii) 비보호 이차 알콜 또는 티올을 산화시켜, 전구체 분자가 이차 알콜로 이루어진 경우에는 케톤, 또는 전구체 분자가 이차 티올로 이루어진 경우에는 티온으로 이루어진 중합체성 시약을 제공; 및
(viii) 임의로, 케톤 또는 티온을 추가로 변형하여 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기를 생성하는 단계를 포함한다.
따라서, 중합 기술의 사용을 포함하는 단계 (ii), (iii), (iv), (v)의 단계와 관련하여, 상기에서 논의된 동일한 중합 기술들이 여기에서도 또한 동일하게 적용된다. 상술한 바와 같이, 음이온성 부위는 중합을 위한 개시 부위로서의 역할을 하며, 일반적으로, 반드시 그럴 필요는 없지만, 알콕시드 부분이다. 알콕시드 부분은 상응하는 알콜을 탈양성자 염기에 노출시켜 알콜로부터 수소원자를 제거시켜 원하는 알콕시드 부분을 수득함으로써 유리하게 얻을 수 있다.
이러한 접근법을 사용하여 화학식 IV의 분지형 중합체성 시약을 형성하기 위하여, 전구체 분자는 하기 구조를 포함할 수 있다:
[화학식 VIIIa]
[식 중, (a), (b), (e), (f), (x), (z), X1, X3, EW1, EW3, R2, R3, R8 및 R9은 화학식 IV와 관련하여 앞서 정의한 바와 같고, 나아가, 식 중 Y는 산소 또는 황 이고 "pg"는 Y가 산소인 경우 2차 알콜의 보호기이고, Y가 황인 경우 2차 티올의 보호기이다].
화학식 I에 상응하는 중합체성 시약은 전구체 분자가 하기의 구조를 포함하는 다음의 접근법을 포함하는 방법을 통하여 형성될 수 있다:
[화학식 VIIIb]
[식 중, (a), (b), (z), X1, EW1, R1, R2, 및 R3는 화학식 I과 관련하여 (발명의 요약 부분에서) 앞서 언급한 바와 같고, 나아가 식 중, Y는 산소 또는 황이고, "pg"는 Y가 산소인 경우 이차 알콜의 보호기이고, Y가 황인 경우 2차 티올의 보호기이다].
앞서 나타낸 바와 같이, 전구체 분자는 보호된 2차 알콜 또는 티올을 포함한다. 임의의 적합한, 해당 기술에서 2차 알콜 또는 티올의 보호에 적합한 것으로 알려진 보호기가 사용될 수 있으며, 예를 들어 벤질 에테르, 메티옥시메틸 에테르 (MOM), 메틸티오메틸 에테르 (MTM), 테트라히드로피라닐 에테르 (THP), 4-메톡시테트라히드로피라닐 에테르, 테트라히드로퓨라닐 에테르, 1-에톡시에틸 에테르, 1-메틸-1-메톡시에틸 에테르, 2-(페닐셀레닐)에틸 에테르, 알릴 에테르, o-니트로벤질 에테르, 트리페닐메틸 에테르, α-나프틸디페닐메틸에테르, p-메티옥시페닐디페닐메틸 에테르, 9-(9-페닐-10-옥소)안트릴 에테르 (트리틸론), 이소프로필디메틸실릴 에테르, t-부틸디메틸실릴 에테르 (TBDMS), 트리벤질실릴 에테르, 및 트리이소프로필실릴 에테르를 포함한다. 이 방법과 관련한 사용에서 특히 바람직한 보호기는 벤질 에테르이다.
이러한 접근법에 있어서 전구체 분자로서의 사용에 적합한 (상응하는 알콜 형태의) 구체적인 분자는 하기 화학식을 갖는 단일보호된 글리세롤을 포함한다:
[식 중, Y는 산소 또는 황이고, "pg"는 Y가 산소인 경우에는 2차 알콜을, 또는 Y가 황인 경우에는 티올을 보호하기에 적합한 보호기이다].
특히 바람직한 단일보호된 글리세롤은 하기에 나타나는 2-벤질옥시-1,3-프로판디올이다:
2-벤질옥시-1,3-프로판디올
이와 같은 그리고 이외의 단일보호된 글리세롤은 Sigma (St. Louise, MO)와 같은 상업적인 공급업체를 통해 입수 및/또는 통상적인 기술을 사용하여 합성할 수 있다.
임의로 친전자적 중합체를 추가적으로 부착시키고, 임의로 수용성 중합체 단편 또는 단편들의 말단 또는 말단들을 알킬레이트화 시킴과 함께 수용성 중합체 단편을 형성한 후, 상기 방법은 보호된 2차 알콜 또는 티올을 탈보호화시켜 비보호 2차 알콜 또는 티올을 형성하는 단계를 포함한다. 보호기는 해당 기술에서 알려진 방법을 사용해 제거될 수 있다. 예를 들어, 탈보호화 단계는 중간물을 H2 및 팔라듐, 팔라듐 옥사이드, 니켈, 백금 또는 납과 같은 금속 촉매에 노출시킴으로서 달성될 수 있다.
탈보호화 단계 후, 상기 방법은 임의의 방식에 의해서 수행될 수 있고, 이러한 관점에서 본 발명이 제한되지 않는 산화 단계를 수행하는 것을 포함한다. 적합한 산화 기술의 예는 산화될 중간물을 KMnO4, MnO2, K2Cr2O7, CrO3, 피리디늄, 클로로크로메이트, 피리디늄 플루오로크로메이트, 피리디늄 디크로메이트, RuO4, RuCl3, 테트라-n-프로필암모늄 퍼루테네이트, 디메틸 술폭시드, N-클로로숙신이미드, Ag2CO3, AG2O 및 Dess-Martin 퍼이오디난 (periodinane) 시약으로 이루어진 군으로부터 선택된 산화 시약과 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 중합체성 시약을 형성하기 위한 다른 접근법은 중합 접근법에 근거하지 않는다. 본 발명의 중합체성 시약을 제공하기 위한 일 비중합 접근법에 있어서, 상기 방법은 (i) 적어도 하나의 이소시아네이트 부분 및 관능기 또는 이의 보호된 형태로 이루어진 전구체 분자를 제공하고, 이 경우, 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되고, (ii) 적합한 반응 조건 하에, 전구체 분자 및 적어도 하나의 히드록실 또는 아민기를 포함하는 수용성 중합체 단편을 접촉시켜 관능기 또는 이의 보호된 형태를 포함하는 중합체성 시약을 형성하고; (iii) 임의로, 관능기가 보호된 형태인 경우, 관능기를 탈보호화시키는 단계를 포함한다.
이러한 세번째 접근법에 있어서, 적어도 하나의 이소시아네이트 부분 및 관능기 또는 이의 보호된 형태를 포함하는 다수의 전구체 분자가 사용될 수 있다.
이러한 접근법을 사용하여 화학식 IV의 분지형 중합체성 시약을 형성하기 위하여, 상기 반응은: (a) 하기 구조로 이루어진 전구체 분자:
[화학식 IXa]
[식 중, (a), (b), (e), (f), (x), (z), X1, X3, EW1, EW3, R2, R3, R8 및 R9은 화학식 IV와 관련하여 앞서 정의한 바와 같고, 나아가 식 중, pFG는 관능기 또는 이의 보호된 형태이고, 이 경우 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택됨]
를 (b) 하나의 말단 히드록실기를 포함하는 수용성 중합체 단편과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
수용성 중합체 단편은 이소시아네이트 전구체 분자에 적어도 2:1의 몰비로 첨가될 수 있다. 그러나, 과량의 수용성 중합체 단편이 존재하는 것이 바람직하다.
이러한 접근법을 사용하여 화학식 I의 중합체성 시약을 형성하기 위하여, 상기 반응은 (a) 하기 구조를 포함하는 전구체 분자:
[화학식 IXb]
[식 중, (a), (b), (z), X1, EW1, R1, R2, 및 R3는 화학식 (I)과 관련하여 (발명의 요약 부분에서) 앞서 정의한 바와 같고, 나아가 식 중, pFG는 관능기 또는 이의 보호된 형태이고, 이 경우 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로부터 선택됨]
를 (b) 하나의 말단 히드록실 또는 아민기를 포함하는 수용성 중합체 단편과 접촉시키는 것을 포함한다.
수용성 중합체 단편은 이소시아네이트 전구체 분자에 수용성 중합체성 시약의 적어도 1:1의 몰비로 첨가될 수 있다. 그러나, 과량의 이소시아네이트 전구체 분자가 존재하는 것이 바람직하다.
동종이관능성 중합체성 시약을 형성하기 위하여, 상기 반응은: (a) 화학식 IXb의 전구체 분자를; (b) 두 개의 말단 히드록실기를 포함하는 수용성 중합체 단편과 접촉시키는 것을 포함한다. 수용성 중합체 단편은 일반적으로 이소시아네이트 전구체 분자에 대하여 1:2 이하의 몰비로 존재한다.
중합체성 시약을 제조하기 위한 네번째 접근법에 있어서, (i) 적어도 하나의 이용 가능한 친핵성기를 갖는 수용성 중합체 단편을 제공하고; (ii) 적어도 하나의 활성화기 및 관능기 또는 이의 보호된 형태로 이루어진 전구체 분자를 제공하고, 이 경우 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되며; (iii) 적합한 반응 조건 하에, 전구체 분자를 수용성 중합체 단편과 접촉시켜 관능기 또는 이의 보호된 형태를 포함하는 중합체성 시약을 형성하고; 및 (iv) 임의로, 관능기가 보호된 형태인 경우, 관능기를 탈보호화 시키는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
적어도 하나의 이용 가능한 친행성기를 갖는 수용성 중합체 단편은 친핵성 기에서 종결시키는 임의의 중합체일 수 있다. 이러한 중합체는, 어떠한 제한 없이: 말단 아민 (즉, 아민-말단 PEG, 예를 들어, Nektar Therapeutics, Huntsville, AL에서 시판)을 포함하는 중합체를 포함한다. 전구체 분자의 활성화기는 이 용어가 해당 기술의 당업자에게 이해되는 바와 같이 임의의 적합한 활성화기일 수 있지만, 할라이드 (즉, 플루오라이드, 클로라이드, 요오다이드), 술포네이트 에스테르 (즉, 메탄술포네이트, p-톨루엔술포네이트 등), 및 N-숙신이미딜로 이루어진 군으로부터 선택된 활성화기가 바람직하다.
화학식 IV의 분지형 중합체성 시약은 다음의 접근법을 사용하여 적어도 하나의 이용가능한 친핵성기를 갖는 수용성 중합체 단편을; 하기 구조로 이루어진 전구체 분자와 접촉시킴에 의하여 형성될 수 있다:
[화학식 Xa]
[식 중, (a), (b), (e), (f), (x), (z), X1, X3, EW1, EW3, R2, R3, R8 및 R9은 화학식 IV와 관련하여 앞서 정의한 바와 같고, 나아가 식 중, 각 AC는 활성화기이며, pFG는 관능기 또는 이의 보호된 형태이고, 이 경우 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된다].
수용성 중합체 단편은 전구체 분자에 적어도 2:1의 몰비로 첨가된다. 그러나, 바람직하게는 과량의 수용성 중합체 단편이 첨가된다.
화학식 I의 중합체성 시약은 다음의 접근법을 사용하여 또한 제조될 수 있다. 따라서, 적어도 하나의 이용가능한 친핵성기를 갖는 수용성 중합체 단편은 하기 구조로 이루어진 전구체 분자와 접촉된다:
[화학식 Xb]
[식 중, (a), (b), (z), X1, EW1, R1, R2, 및 R3는 화학식 I과 관련하여 (발명의 요약 부분에서) 앞서 정의된 바와 같고, 나아가 식 중, AC는 활성화기 및 pFG는 관능기 또는 이의 보호된 형태이고, 이 경우 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된다]. 적어도 하나의 이용가능한 친핵성기를 갖는 수용성 중합체 단편은 전구체 분자에 대하여 수용성 중합체 단편의 적어도 1:1의 몰비의 동등한 양으로 첨가된다. 그러나, 과량의 수용성 단편이 존재하는 것이 바람직하다.
동종이관능성 중합체성 시약은 적어도 두개의 이용가능한 친핵성기를 갖는 수용성 중합체 단편을 화학식 Xb에 상응하는 구조를 갖는 전구체 분자와 반응시킴으로서 또한 제조될 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 전구체 분자에 대한 수용성 중합체 단편의 몰비는 일반적으로 1:2 이하이며, 일반적으로는 과량의 전구체 분자가 존재한다.
중합체성 시약을 제조하기 위한 다섯번째 접근법은:
(i) 적어도 하나의 이용가능한 이탈기를 갖는 수용성 중합체 단편을 제공하고;
(ii) 적어도 하나의 친핵성기 및 관능기 또는 이의 보호된 형태로 이루어진 전구체 분자를 제공하고, 이 경우 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되며;
(iii) 적합한 반응 조건 하에서, 전구체 분자를 수용성 중합체 단편과 접촉시켜 관능기 또는 이의 보호된 형태를 포함하는 중합체성 시약을 형성하고; 및
(iv) 임의로, 관능기가 보호된 형태인 경우, 관능기를 탈보호화하는 단계를 포함한다.
수용성 중합체 단편 상의 바람직한 이탈기는 1차인 것 (즉, 1차 할로)을 포함하지만, 2차인 이탈기들 또한 사용될 수 있다. 적합한 이탈기의 예는 할로겐 및 술포네이트 에스테르를 포함한다. 할로겐 중, 브로모, 클로로, 및 요오도가 바람직하고, 브로모 및 클로로가 특히 바람직하다. 술포네이트 에스테르와 관련하여, 메탄술포네이트 ("Ms"로 약칭됨), 트리플루오로메탄술포네이트, 트리클로로메탄술포테이트, 2,2,2-트리플루오로에탄술포네이트, 2,2,2-트리클로로에탄술포네이트, 노나플루오로부탄술포네이트, p-브로모벤젠술포네이트, p-니트로벤젠술포네이트, 및 p-톨루엔술포네이트가 특히 바람직하지만, 해당 기술의 당업자에게 알려진 다른 술포네이트 에스테르 및 유사하게 구성된 이탈기들 또한 사용될 수 있다.
다른 것들 중, 친핵성기를 포함하는 전구체 분자와 관련하여, 친핵성기는 수용성 중합체 단편과 결합된 이탈기와 반응할 수 있는 임의의 적합한 친핵성기이다. 일반적으로, 친핵성기는 알콕시드(R-O-) 또는 티오레이트(R-S-)이며, 각각, 상응하는 알콜 및 티올 형태로부터 수소를 제거시킴으로서 유도된다. 따라서, 화학식 VIIa 및 VIIb에 상응하는 구조를 포함하는 전구체 분자가 사용될 수 있다. 앞서 나타낸 바와 같이, 구체적인 알콕시드 부분의 예는 하기를 포함한다:
본 발명의 중합체성 시약을 제공하기 위한 여섯번째 접근법에 있어서, 적어도 하나의 알콕시드 이온 또는 티오레이트 이온을 갖는 수용성 중합체 단편을 적어도 하나의 이탈기 및 관능기 또는 이의 보호된 형태로 이루어진 전구체 분자와 반응시켜 중합체성 시약을 제공하는 단계를 포함하는 방법이 제공되고, 이 경우 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된다.
편리하게는, 적어도 하나의 알콕시드 또는 티올레이트 이온을 갖는 수용성 중합체 단편은 적합한 염기의 존재하에 적어도 하나의 히드록실 또는 티올기를 갖는 수용성 중합체 단편을 결합시킴으로서 제조된다. 따라서, 상기 염기는 POLY-OH를 POLY-O-로, 및 POLY-SH를 POLY-S-로 변형시킬 수 있다. 나아가, 이제는 알콕시드 또는 티올레이트 부분을 포함하는 수용성 중합체는 번갈아 SN2 반응을 통하여 적합한 이탈기로 이루어진 전구체 분자와 반응한다고 여겨지고 있다. 해당 기술의 당업자에 의해 인정될 수 있는 바와 같이, 이러한 접근법은 Williamson 에테르 합성에 상응하며, 일반적으로 Williamson 에테르 합성에서 사용되는 원리 및 기술들은 여기서도 역시 적용할 수 있다.
알콕시드 및 티올레이트를 형성하기에 적합한 염기의 비제한적인 예는 소듐, 소듐 히드록시드, 포타슘, 포타슘 히드록시드, 소듐 하이드라이드, 포타슘 하이드라이드, 소듐 메톡사이드, 포타슘 메톡사이드, 소듐 tert-부톡사이드, 포타슘 tert-부톡사이드, 소듐 카르보네이트, 및 포타슘 카르보네이트를 포함한다. 그러나, 이러한 단계에 따른 사용에 바람직한 염기는 소듐, 포타슘, 소듐 하이드라이드, 포타슘 하이드라이드, 소듐 메톡사이드, 포타슘 메톡사이드, 소듐 tert-부톡사이드, 및 포타슘 tert-부톡사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것들을 포함한다.
또한, 적어도 하나의 알콕시드 또는 티올레이트 이온을 갖는 수용성 중합체 단편은 편리하게는 앞서 설명한 바와 같은 중합 반응을 통하여 제공될 수 있다. 수용성 중합체 단편을 제공하기 위한 이러한 접근법에 있어서, 수용성 중합체 단편은 적어도 하나의 알콕시드 또는 티올레이트 이온을 갖는 것이 바람직하다.
반드시 필요하지는 않지만, 일반적으로, 과량의 전구체 분자가 적어도 하나의 알콕시드 또는 티올레이트 이온을 포함하는 수용성 중합체와 반응하는 것이 허용된다. 일반적으로, 전구체 분자의 양은 수용성 중합체 분자의 이용가능한 히드록실 및/또는 티올레이트 기의 수에 대한 최소한의 몰당량을 나타낸다. 이종관능성 중합체 종류 (즉, 둘 이상의 다른 말단 관능기를 포함하는 종류)는 전구체 분자의 비화학양론적 양을 사용하여 제조될 수 있다. 즉, 이종관능성 종류는 수용성 중합체 단편 상의 이용가능한 히드록실 또는 티올레이트기 총 몰 수가 전구체 분자의 총 몰수를 초과하는 경우에 형성된다.
알콕시드 부분을 포함하는 수용성 중합체 단편은 중합 공정을 통하여 합성적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 소듐 2-메톡시 에탄올레이트 (Na+:-OCH2CH2OCH3) 와 같은 알콕시드 염은 에틸렌 옥사이드의 중합을 개시할 수 있다. 중합체 사슬에 부가된 최종 단량체가 알콕시드와 같은 반응성기를 이탈한다고 가정하면 (에틸렌 옥사이드의 경우와 같이), 중합체 사슬은 앞서 논의한 바와 같이 전구체 분자와 반응될 수 있다.
(예를 들어, 적어도 하나의 알콕시드 이온 또는 티올레이트 이온을 각각 갖는 수용성 중합체를 제공하기 위한) 적어도 하나의 히드록실 또는 티올기를 갖는 임의의 수용성 중합체가 사용될 수 있다. 단 하나의 히드록실 또는 티올기를 포함하는 수용성 중합체가 사용될 수 있지만, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘 또는 그 이상의 히드록실 및/또는 티올 부분을 포함하는 중합체가 사용될 수 있다. 유리하게는, 수용성 중합체 단편 상의 히드록실 또는 티올 부분의 수가 증가할수록, 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈 부분을 제공하기 위하여 이용가능한 부위의 수가 증가한다. 수용성 중합체 단편에 결합한 히드록실 및/또는 티올 부분의 수의 상한의 비제한적인 예는 500, 100, 80 및 40을 포함한다.
IV. 콘쥬게이트
본 명세서에 기재된 중합체성 시약은 생물학적인 활성제 또는 표면에 대한 콘쥬게이션에 유용하다. 본 명세서에 기재된 중합체성 시약과의 반응에 적합한 예시적인 기는 일차 아민기 (즉, 리신 잔류물의 부사슬로부터의 일차 아민), 알콜 (즉, 세린 또는 트레오닌 잔류물의 부사슬로부터의 일차 알콜), 히드라진, 및 히드라지드이다. 추가적인 관능기는 케톤 (및 관련 관능기) 과 반응성이 있으며, 다른 분자, 즉, 활성제 상에 존재하는 경우 콘쥬게이션 반응에 채용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 중합체성 시약과 반응하기에 적합한 이러한 기들은 해당 기술의 당업자에게 알려져있다. 따라서, 본 발명은 콘쥬게이션 조건 하에 활성제를 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기를 포함하는 중합체성 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는 콘쥬게이트를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 콘쥬게이션 반응에 사용되는 바람직한 중합체성 시약은 본 명세서에 기재된 것들 (즉, 화학식 I, II, III, IV, V, 및 VI의 중합체성 시약)을 포함한다.
적합한 콘쥬게이션 조건은 시간, 온도, pH, 시약 농도, 시약 관능기, 활성제 상의 이용가능한 관능기(들), 용매, 및 중합체성 시약 및 활성제 사이의 콘쥬게이션을 생성하기에 충분한 것 등과 같은 조건이다. 해당 기술에 알려진 바와 같이, 구체적인 조건은, 다른 것들 중, 활성제, 요구되는 콘쥬게이션의 유형, 반응 혼합물에 있어서 다른 물질의 존재 등에 의존한다. 특별한 경우에 있어서 콘쥬게이션을 생성하기에 충분한 조건은 본 명세서의 독서, 관련 문헌의 참조, 및/또는 통상적인 실험에 근거하여 해당 기술의 당업자에 의해 결정될 수 있을 것이다.
예시적인 콘쥬게이션 조건은 예를 들어 4 내지 10의 pH, 및 예를 들어, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10.0의 pH에서 콘쥬게이션 반응을 수행하는 것을 포함한다. 상기 반응은 약 5분 내지 약 72 시간, 바람직하게는 약 30분 내지 약 48시간, 보다 바람직하게는 약 4시간 내지 약 24시간 수행되는 것이 허용된다. 콘쥬게이션이 일어나는 온도는 일반적으로, 반드시 그렇지는 않지만, 약 0℃ 내지 약 40℃이고, 종종 실온 또는 그 미만이다. 콘쥬게이션 반응은 종종 포스페이트 완충 용액, 소듐 아세테이트, 또는 이와 유사한 시스템을 사용하여 수행된다.
반응물 농도와 관련하여, 과량의 중합체성 시약은 일반적으로 활성제과 결합된다. 그러나, 일부 경우에 있어서, 활성제의 반응기에 대한 중합체성 시약 상의 반응기의 화학양론적인 양을 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 예를 들어 두개의 케톤기를 갖는 중합체성 시약 2 몰은 활성제의 각 몰마다 결합한다. 활성제에 대한 중합체성 시약의 예시적인 비는 약 1:1 (중합체성 시약: 활성물질), 1.5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 8:1, 또는 10:1의 몰비를 포함한다. 상기 콘쥬게이션 반응은 실질적으로 추가의 콘쥬게이션이 일어나지 않을 때까지 수행되는 것이 허용되며, 이는 일반적으로 반응 경과 시간의 진행을 모니터링함에 따라 결정될 수 있다.
반응의 진행은, 다양한 시간 지점에서 반응 혼합물로부터 일정 부분을 회수하고, SDS-PAGE 또는 MALDI-TOF 질량 분석법 또는 다른 적합한 분석 방법에 의해 반응 혼합물을 분석함으로써 모니터될 수 있다. 형성된 콘쥬게이트의 양 또는 콘쥬게이트되지 않은 잔류하는 중합체의 양에 대하여 일단 평탄역에 도달하면, 상기 반응은 완료된 것으로 가정된다. 일반적으로, 콘쥬게이션 반응은 수분으로부터 수시간 동안 (즉, 5분 내지 24시간 또는 그 이상 동안) 일어난다. 생성된 산물의 혼합물은 반드시 정제되어야하는 것은 아니지만, 바람직하게는 과량의 중합체성 시약, 콘쥬게이트되지 않은 반응물 (즉, 활성제) 및 불필요한 다중-컨쥬게이선 종류들로 분리된다. 생성 콘쥬게이트는 이어서 MALDI, 모세관 전기영동, 겔 전기영동, 및/또는 크로마토그래피와 같은 분석 방법을 사용하여 추가로 특성화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 방법이 중합체-활성제 콘쥬게이트를 제조하기 위하여 제공된다. 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군에서 선택된 관능기를 사용하는 콘쥬게이션 방법이 사용될 수 있다. 중합체-활성제 콘쥬게이트를 제조하기 위한 바람직한 콘쥬게이션 접근법은 환원성 아민화이다. 이론에 의해 구속되는 것을 원하지 않다고 할지라도, 상기 환원성 아민화 접근법은 중합체성 시약의 관능기에 아민-포함하는 활성제의 친핵성 첨가를 포함하는 것으로 믿어지고, 상기 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군에서 선택된 관능기이다. 환원성 아민화에 있어서, 중합체성 시약의 바람직한 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 헤미케탈 및 케탈을 포함한다. 본 기술 분야의 당업자는 환원성 아민화 기술에 익숙하다.
간단히 및 이론에 의해 구속되지 않고서, 예시적인 환원성 아민화 (여기서 상기 활성제는 아민을 함유하고 상기 중합체성 시약은 케톤을 포함함)는 먼저 카르비놀아민 중간체를 통하여 진행된다. 그리고 나서, 상기 카르비놀아민은 탈수 (축합)되어 이민이 된다. 그리고 나서 상기 이민은 적합한 환원제를 이용하여 교대로 환원되어 중합체-활성제 콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 예시적인 환원제는 소디움 시아노보로하이드라이드이다. 몇가지 경우에 있어서, HCl의 존재 하의 아연, 소디움 보로하이드라이드, 알콜성 KOH의 존재 하에 아이언 펜타카르보닐, 금속 촉매 존재 하의 수소(H2), 및 포름산과 같은 환원제가 사용될 수 있다. 반응은 개략적으로 도 3에 묘사되었다.
활성제와 중합체성 시약 사이의 결합에 특별히 주목한다: 상기 활성제의 아민이 상기 중합체성 시약의 이차 탄소에 결합된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구현예에서, 활성제의 질소 원자와 중합체성 시약의 이차 탄소 사이의 공유 결합을 포함하는 콘쥬게이트가 제공된다. 이차 탄소는 두 개의 다른 탄소 (도 3에서 R' 및 R"로 나타냄)에 직접 결합된 탄소이다. 상기 콘쥬게이트의 나머지 부분에 관하여, 이차 탄소는 직접적으로 또는 하나 이상의 원자를 통하여 수용성 중합체 부분에 결합된다. 따라서, 이차 탄소 원자는 일차 탄소 원자 (도 3에서 R'로 나타냄) 및 이차 탄소 원자 (도 3에서 R"로 나타냄)에 결합되는데, 여기서 상기 일차 탄소 원자 또는 이차 탄소 원자의 적어도 하나가 직접적으로 또는 하나 이상의 다른 원자를 통하여 수용성 중합체 부분에 결합된다.
콘쥬게이트를 형성하기 위하여 사용되는 중합체성 시약에 따라, 이차 탄소 (활성제의 질소가 아닌)에 결합된 원자 또는 원자들이 다양하다. 몇 가지 경우에 있어서, 메틸기가 이차 탄소에 결합된다 (즉, 이차 탄소 원자에 결합된 일차 탄소 원자 또는 이차 탄소 원자의 하나가 메틸이다). 다른 경우에 있어서, 수용성 중합체 부분이 이차 탄소 원자에 결합된 두 탄소 원자 (즉, 이차 탄소 원자에 결합된 일차 탄소 원자 또는 이차 탄소 원자)에 각각 결합되고, 이에 따라 이차 탄소 원자를 통해 연결된 두 개의 중합체-포함하는 "팔"을 제공한다. 이러한 경우에 있어서, 이차 수용성 중합체 부분을 포함하는 콘쥬게이트는 직접적으로 또는 하나 이상의 원자를 통하여 이차 탄소 원자에 결합된다. 또 다른 경우에 있어서, 수용성 중합체성 부분 자체는 화학식 V에서 나타낸 중합체성 시약이 활성제에 콘쥬게이션될 때 분지될 수 있다.
환원성 아민화에 있어서, 콘쥬게이트는 바람직하게 이차 탄소 원자에 결합된 하이드록실 부분이 없는데, 이는 친핵체의 예를 들어, α,β-불포화된 카르보닐의 카르보닐에 직접 첨가 (또는 "1,2 첨가")로부터 기인할 수 있다. 게다가, 콘쥬게이트는 바람직하게 이차 탄소 원자에 인접한 탄소에 결합된 카르보닐이 없는데 (즉, 이차 탄소 원자에 대한 카르보닐 β의 부재), 이는 콘쥬게이트 첨가 (또는 "1,4 첨가")로부터 기인할 수 있다.
도 3에 나타난 것과 같이, 일차 아민-포함하는 활성제로부터의 질소 (예를 들어, 단백질의 라이신 곁가지로부터의 일차 아민, 단백질의 N-말단 아민 등)는 콘쥬게이트 형성에 사용된다. 환원성 아민화를 통한 콘쥬게이션은 활성제가 이차 아민을 포함할 때 또한 발생될 수 있다. 이러한 경우에, 결과된 콘쥬게이트는 이차 탄소 (중합체성 시약)에 결합된 삼차 아민 (활성제로부터 유래된)을 또한 포함한다.
중합체성 시약을 활성제에 콘쥬게이션하기 위한 다른 접근법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, α,β-불포화된 관능기 (예를 들어, α,β-불포화된 케톤)가 있는 중합체성 시약은 직접 첨가에 참여할 수 있는데, 여기서 친핵체 (예를 들어, 아민)는 관능기에 직접 첨가 (또는 "1,2 첨가")를 통한 친핵성 첨가에 의해 반응할 수 있다. 게다가, 이러한 중합체성 시약은 콘쥬게이션 첨가 (또는 "1,4 첨가")에 참여할 수 있는데, 여기서 친핵체는 β 탄소에 결합하게 되고, α 탄소는 용매 또는 친핵체의 콘쥬게이트 산으로부터의 양성자를 받아 들인다. 시약의 구조는 반응이 어떻게 일어나느냐를 주로 말한다. 비닐 탄소에, 및 입체적으로 방해된 다른 알파 탄소에 있는 α,β-불포화된 케톤에 있어서, 콘쥬게이트 첨가 (1,4 첨가)가 우세할 것으로 기대된다.
형성에 사용되는 접근법에 관계없이, 중합체-활성제 콘쥬게이트는 다른 콘쥬게이트된 종들을 얻기 위해/분리하기 위해 정제될 수 있다. 선택적으로, 그리고 보다 바람직하게 콘쥬게이트를 형성하는데 사용되는 저분자량 (예를 들어, 약 20,000 달톤 미만, 보다 바람직하게는 약 10,000 달톤 미만) 중합체성 시약을 위하여, 생성 혼합물이 활성제 당 수용성 중합체 부분의 분포를 얻기 위하여 정제될 수 있다. 예를 들어, 생성 혼합물은 활성제 (예를 들어, 단백질) 당 1 내지 5의 PEGs의 임의의 위치의 평균, 전형적으로 활성제 (예를 들어, 단백질) 당 약 3의 PEGs의 평균을 얻기 위하여 정제될 수 있다. 최종 콘쥬게이트 반응 혼합물의 정제를 위한 전략은 예를 들어, 사용된 중합체성 시약의 분자량, 특정 활성제, 바람직한 복용량 투약 계획, 및 각 콘쥬게이트의 잔여 활성 및 체내 특성을 포함하는 요소의 수에 의존한다.
만약 바람직하다면, 다른 분자량의 콘쥬게이트가 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 동정될 수 있다. 다시 말하면, 겔 여과 크로마토그래피는 다르게 번호가 붙여진 중합체-대-활성제 비율 (예를 들어, 1-머(mer), 2-머, 3-머 등, 여기서 "1-머"는 활성제에 대해 1 중합체성 시약을 나타내고, "2-머"는 활성제에 대해 2 중합체성 시약을 나타낸다, 등)을 그들의 다른 분자량에 기초하여 (여기서 차이는 필수적으로 수용성 중합체 부분의 평균 분자량에 상응한다) 분리하는데 사용된다. 예를 들어, 100,000 달톤 단백질이 분자량이 약 20,000 달톤인 케톤-포함하는 PEG에 임의로 콘쥬게이션된 예시적인 반응에 있어서, 결과된 반응 혼합물은 수정되지 않은 단백질 (분자량이 약 100,000 달톤인), 모노PEG화된 단백질 (분자량이 약 120,000 달톤인), 디PEG화된 단백질 (분자량이 약 140,000 달톤인) 등을 포함할 수 있다.
상기 접근법은 분자량이 다른 PEG 및 다른 중합체-활성제 콘쥬게이트를 분리하는데 사용될 수 있으나, 상기 접근법은 일반적으로 단백질 내에 다른 중합체 결합 자리를 갖는 위치 이성질체를 분리하는데는 효과적이지 않다. 예를 들어, 회수된 PEG-머 조성물의 각각이 활성제 내의 다른 반응성 아미노기 (예를 들어, 라이신 잔기)에 결합된 PEGs를 포함할 수 있다고 하더라도, 겔 여과 크로마토그래피는 PEG 1-머, 2-머, 3-머 등의 혼합물 서로를 분리하는데 사용될 수 있다.
이런 유형의 분리를 수행하는데 적합한 겔 여과 컬럼은 아메르샴 바이오사이언스 (피스카타웨이, NJ)로부터 입수할 수 있는 슈퍼덱스™ 및 세파덱스™ 컬럼을 포함한다. 특정 컬럼의 선택은 바람직한 분별 범위에 따라 달라진다. 용출은 일반적으로 포스페이트, 아세테이트 등과 같은 적당한 버퍼를 사용하여 수행된다. 수집된 분류는 수많은 다른 방법으로 분석될 수 있는데, 예를 들어, (i) 단백질 함량을 위한 280 nm에서의 광학 밀도 (OD), (ii) 소 혈청 알부민 (BSA) 단백질 분석법, (iii) PEG 함량을 위한 아이오다인 시험법 (Sims et al. (1980) Anal.Biochenl, 107: 60-63), 및 (iv) 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아민 겔 전기영동 (SDS PAGE) 후의 바륨 요오다이드로 스테이닝이 있다.
위치 이성질체의 분리는 역상-고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) C18 컬럼 (아메르샴 바이오사이언스 또는 비닥)을 이용한 역상 크로마토그래피 또는 이온 교환 컬럼, 예를 들어 아메르샴 바이오사이언스로부터 입수할 수 있는 세파로스™ 이온교환 컬럼을 이용한 이온교환 크로마토그래피에 의해서 수행된다. 두 접근법은 같은 분자량 (위치 이성질체)의 중합체-활성제 이성질체를 분리하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 설명된 중합체성 시약은 필름, 화학적 분리 및 정제 표면, 고체 지지체, 금, 티타늄, 탄탈륨, 니오븀, 알루미늄, 스틸 및 그들의 산화물과 같은 금속 표면, 규소 산화물, 거대분자 (예를 들어, 단백질, 폴리펩티드 등), 및 작은 분자를 포함하는 많은 실재물에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 부가적으로, 중합체성 시약은 생화학적 센서, 생전자성 스위치 및 문에 또한 사용될 수 있다. 중합체성 시약은 친화력 분할을 위한 중합체-리간드 콘쥬게이트를 제조하기 위하여, 가교 또는 비-가교된 하이드로겔의 제조를 위하여, 및 생물반응기를 위한 중합체-코펙터 첨가물을 제조하기 위하여, 중합체-코팅된 표면 및 중합체 그라프트 제조를 위한 펩티드 합성용 담체로 또한 사용될 수 있다.
본 발명에서 제안된 중합체성 시약에 결합되는데 사용되는 생물학적인 활성제는 하기 중 임의의 하나 이상일 수 있다. 적합한 작용제는 예를 들어, 최면제 및 진정제, 심리적 활성 부여제, 안정제, 호흡기 약물, 진경제, 근육 이완제, 항파킨슨제 (도파민 길항제), 마취제, 항-염증제, 항불안제 (불안 완화제), 식욕 억제제, 항편두통제, 근육 수축제, 항-감염제 (항생제, 항바이러스제, 항진균제, 백신), 항관절염제, 항말라리아제, 제토제, 항간질제, 기관지확장제, 시토킨, 성장 인자, 항암제, 항혈전제, 항고혈압제, 심장혈관제, 항부정맥제, 항산화제, 항천식제, 피임제, 교감신경흥분제, 이뇨제, 지질 조절제, 항남성호르몬제, 항기생충제, 항응집제, 종양제, 항종양제, 저혈당제, 영양제 및 보충제를 포함하는 호르몬제, 성장 보충제, 항장염제, 백신, 항체, 진단제, 및 대조제로부터 선택될 수 있다.
보다 특히, 활성제는 작은 분자 (바람직하게 불용성 작은 분자), 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 항체 단편, 폴리사카라이드, 스테로이드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 지방, 전해질 등을 포함하는 많은 구조적 분류 중 하나에 해당될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 중합체에 결합시키기 위한 활성제는 천연 아미노기를 소유하거나, 또는 선택적으로 본 발명의 중합체에 콘쥬게이션되기에 적합한 하나 이상의 반응성 아미노기를 포함하도록 개질되어 있다.
공유 결합에 적합한 활성제의 특정 예로는 아스파리지나아제, 암독소비르 (amdoxovir (DAPD)), 앤티드, 비케플레민, 칼시토닌, 시아노비린, 데니루킨 디프티톡스, 에리스로포이에틴 (EPO), EPO 길항제 (예를 들어, 약 10-40 아미노산 길이로부터이고 WO 96/40749에 설명된 것처럼 특이한 코어 서열을 포함하는 펩티드), 도나아제 알파, 에리스로포에시스 자극 단백질 (NESP), 인자 V, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIM, 인자 IX, 인자 X, 인자 XII, 인자 XIII, 본 윌레브랜드 인자 (von Willebrand factor)와 같은 응집 인자, 세레데이즈, 세레자임, 알파-글루코시데이즈, 콜라겐, 시클로스포린, 알파 디펜신, 베타 디펜신, 엑스딘-4 (exedin-4), 그레눌로사이트 콜로니 자극 인자 (GCSF), 트롬보포이에틴 (TPO), 알파-1 프로티나아제 억제제, 엘카토닌, 그레눌로사이트 마크로파지 콜로니 자극 인자 (GMCSF), 피브리노겐, 필그라스팀, 성장 호르몬, 인간 성장 호르몬 (hGH), 성장 호르몬 방출 호르몬 (GHRH), GRO-베타, GRO-베타 항체, 본 몰포제닉 단백질-2, 본 몰포제닉 단백질-6, OP-1과 같은 본 몰포제닉 단백질, 산성 피브로블라스트 성장 인자, 염기성 피브로블라스트 성장 인자, CD-40 리간드, 헤파린, 인간 혈청 알부민, 저분자량 헤파린 (LMWH), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 오메가, 인터페론 타우, 콘센서스 인터페론과 같은 인터페론, 인터루킨-1 수용체, 인터루킨-2, 인터루킨-2 융합 단백질, 인터루킨-1 수용체 길합제, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-4 수용체, 인터루킨-6, 인터루킨-8, 인터루킨-12, 인터루킨-13 수용체, 인터루킨-17 수용체와 같은 인터루킨 및 인터루킨 수용체, 락토페린 및 락토페린 단편, 루테나이징 호르몬 방출 호르몬 (LHRH), 인슐린, 프로-인슐린, 인슐린 유사체 (예를 들어, 미국 특허번호 5,922,675에 언급된 모노-아실화된 인슐린), 아밀린, C-펩티드, 소마토스타틴, 옥테레오타이드를 포함하는 소마토스타틴 유사체, 바소프레신, 여포 자극 호르몬 (FSH), 인플루엔자 백신, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 인슐린트로핀, 마크로파지 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 알테플라아제, 유로키나아제, 레테플라아제, 스트렙토키나아제, 파미테플라아제, 라노테플라아제 및 테네테플라아제와 같은 플라스미노젠 활성제, 신경 성장 인자 (NGF), 오스테오프로테거린, 혈소판-유래된 성장 인자, 조직 성장 인자, 변형 성장 인자-1, 혈관 내피 성장 인자, 루케미아 저해 인자, 루케미아 성장 인자 (KGF), 아교 성장 인자 (GGF), T 세포 수용체, CD 분자/항원, 종양 괴사 인자 (TNF), 모노사이트 화학유인물질 단백질-1, 내피 성장 인자, 부갑상선 호르몬 (PTH), 글루카곤-유사 펩티드, 소마토트로핀, 티모신 알파 1, 라스브리케이즈, 티모신 알파 1 IIb/IIIa 억제제, 티모신 베타 10, 티모신 베타 9, 티모신 베타 4, 알파-1 안티트립신, 포스포디에스테라제 (PDE) 화합물, VLA-4 (매우 늦은 항원-4), VLA-4 억제제, 비스포스포네이트, 호흡기세포융합바이러스 항체, 낭 섬유증 막 조절제 (CFTR) 유전자, 디옥시레보뉴클리에이즈 (Dnase), 살균/침투 증가 단백질 (BPI), 및 항-CMV 항체를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적인 모노클로날 항체는 이타네르셉트 (etanercept) (IgG1의 Fc 부분에 결합된 인간 75 kD TNF 수용체의 세포외 리간드-결합 부분으로 이루어진 이량체 융합 단백질), 아브식시마브(abciximab), 아달리무마브(adalimumab), 아페리모마브(afelimomab), 알엠투쥬마브(alemtuzumab), B-림포사이트에 대한 항체, 아트리쥬마브(atlizumab), 바시릭시마브(basiliximab), 베바시쥬마브(bevacizumab), 비시로마브(biciromab), 베르틸리므마브(bertilimumab), CDP-571, CDP-860, CDP-870, 세툭시마브(cetuximab), 클레노릭시마브(clenoliximab), 다클리쥬마브(daclizumab), 에큐리쥬마브(eculizumab), 에드레콜로마브(edrecolomab), 에파리쥬마브(efalizumab), 에프라튜쥬마브(epratuzumab), 폰토리쥬마브(fontolizumab), 가빌리모마브(gavilimomab), 겜투쥬마브 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin), 이브리튜모마브 티욱세탄 (ibritumomab tiuxetan), 인플릭시마브(infliximab), 이노리모마브(inolimomab), 켈릭시마브(keliximab), 라베투쥬마브(labetuzumab), 레르델리무마브(lerdelimumab), 올리쥬마브(olizumab), 라디오라벨드림-1 (radiolabeledlym-1), 메텔리무마브(metelimumab), 메폴리쥬마브(mepolizumab), 미투모마브(mitumomab), 무로모나드-CD3 (muromonad-CD3), 네바큐마브 (nebacumab), 나탈리쥬마브 (natalizumab), 오듈리모마브(odulimomab), 오말리쥬마브(omalizumab), 오레고보마브(oregovomab), 팔리비쥬마브(palivizumab), 펨튜모마브 (pemtumomab), 펙셀리쥬마브(pexelizumab), 루마브-VEGF (rhuMAb-VEGF), 리 M시마브(rituximab), 사튜모마브 펜디타이드 (satumomab pendetide), 세비루마브 (sevirumab), 시플리쥬마브(siplizumab), 토시투모마브(tositumomab), I131토시투모마브(I131tositumomab), 트라스투쥬마브 (trastuzumab), 투비루마브 (tuvirumab), 비실리쥬마브(visilizumab), 타크린(tacrine), 메만틴(memantine), 리바스티그민 (rivastigmine), 갈라타민(galantamine), 도네페질(donepezil), 레베티라세탐 (levetiracetam), 레파그리나이드(repaglinide), 아토르바스타틴 (atorvastatin), 알레파셉트 (alefacept), 바르데나필 (vardenafil), 실데나필 (sildenafil), 및 발라시클로비르 (valacyclovir)를 포함한다.
공유 결합에 적합한 부가적인 작용제는 아데포비르 (adefovir), 알로세트론 (alosetron), 아미포세틴 (amifostine), 아미오다론 (amiodarone), 아미노카프로익 산 (aminocaproic acid), 아미노히프레이트 소디움 (aminohippurate sodium), 아미노글루테티미드 (aminoglutethimide), 아미노이불리닉 산 (aminolevulinic acid), 아미노살리실릭 산 (aminosalicylic acid), 암사크린 (amsacrine), 아나그레라이드 (anagrelide), 아나스트로졸 (anastrozole), 아리피프라졸 (aripiprazole), 아스파라지나제 (asparaginase), 안트라시클린 (anthracyclines), 벡사로텐 (bexarotene), 비칼루타미드 (bicalutamide), 블레오마이신 (bleomycin), 부세레린 (buserelin), 부설판 (busulfan), 카베르고린 (cabergoline), 카페시타빈 (capecitabine), 카보플라틴 (carboplatin), 카무스틴 (carmustine), 클로람부신 (chlorambucin), 실라스타틴 소디움 (cilastatin sodium), 시스플라틴 (cisplatin), 클라드리빈 (cladribine), 클로드로네이트 (clodronate), 시클로포스파마이드 (cyclophosphamide), 시프로테론 (cyproterone), 시타라빈 (cytarabine), 캠토테신(camptothecins), 13-시스 레티놀릭 산, 모든 트랜스 레티놀릭 산; 다카르바진 (dacarbazine), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 디퍼록사민(deferoxamine), 덱사메타손(dexamethasone), 디클로페낙 (diclofenac), 디에틸스틸베스트롤 (diethylstilbestrol), 도세탁셀 (docetaxel), 독소루비신 (doxorubicin), 두타스테라이드 (dutasteride), 이피루비신 (epirubicin), 에스트라뮤스틴 (estramustine), 에토포사이드 (etoposide), 엑세메스탄 (exemestane), 에제티미브(ezetimibe), 펙소페나딘 (fexofenadine), 플루다라빈 (fludarabine), 플루드로코티손 (fludrocortisone), 플루오로우라실, 플루옥시메스테론 (fluoxymesterone), 플루타미드 (flutamide), 폰다파리눅스 (fondaparinux), 플루베스트랜트(fulvestrant), 감마-하이드록시부틸레이트, 겜시타빈 (gemcitabine), 에피네프린, L-도파, 하이드록시유레아, 이다루비신(idarubicin), 이포스파마이드 (ifosfamide), 이마티니브(imatinib), 이리노테칸 (irinotecan), 이트라코나졸 (itraconazole), 고세레린 (goserelin), 레트로졸 (letrozole), 루코보린 (leucovorin), 레바미졸 (levamisole), 리시노프릴 (lisinopril), 로보티록신 소디움 (lovothyroxine sodium), 로무스틴 (lomustine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 메드록시프로게스테론 (medroxyprogesterone), 메게스트롤 (megestrol), 멜파란 (melphalan), 메르캅토퓨린 (mercaptopurine), 메타라미놀 비타트레이트 (metaraminol bitartrate), 메토트렉세이트 (methotrexate), 메토클로프라미드 (metoclopramide), 멕실레틴 (mexiletine), 미토마이신 (mitomycin), 미토탄(mitotane), 미톡산트론 (mitoxantrone), 날로손 (naloxone), 니코틴, 니루타미드 (nilutamide), 니티시논 (nitisinone), 옥트레오티드 (octreotide), 옥사리플라틴 (oxaliplatin), 파미드로네이트 (pamidronate), 펜토스타틴 (pentostatin), 필카마이신 (pilcamycin), 폴피머 (porfimer), 프레드니손 (prednisone), 프로카르바진 (procarbazine), 프로클로페라진 (prochlorperazine), 온단세트론, 팔로노세트론, 옥사리플라틴 (oxaliplatin), 랄티트렉스트 (raltitrexed), 시로리머스 (sirolimus), 스트렙토조신 (streptozocin), 타크로리머스 (tacrolimus), 피메크로리머스 (pimecrolimus), 타목시펜 (tamoxifen), 테가세로드 (tegaserod), 테모조로미드 (temozolomide), 테니포시드 (teniposide), 테스토스테론 (testosterone), 테트라하이드로케나비놀 (tetrahydrocannabinol), 탈리도미드 (thalidomide), 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸, 트레프로스티닐 (treprostinil), 트레티노인 (tretinoin), 발데콕시브 (valdecoxib), 세레콕시브, 로페콕시브 (rofecoxib), 발루비신 (valrubicin), 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데스틴 (vindesine), 비노렐빈 (vinorelbine), 보리코나졸 (voriconazole), 도라세트론 (dolasetron), 그라니세트론 (granisetron); 포르모테롤 (formoterol), 플루티카손 (fluticasone), 루프로리드 (leuprolide), 미다졸람 (midazolam), 알프라졸람 (alprazolam), 암포테리신 B (amphotericin B), 포도피로톡신 (podophylotoxins), 뉴클레오시드 항바이러스제, 아로일 히드라존 (aroyl hydrazones), 수마트립탄 (sumatriptan), 일렉트립탄 (eletriptan); 에리트로마이신 (erythromycin), 오레안도마이신 (oleandomycin), 트로리안도마이신 (troleandomycin), 록시트로마이신 (roxithromycin), 클라리트로마이신 (clarithromycin), 다베르신 (davercin), 아지트로마이신 (azithromycin), 플루리트로마이신 (flurithromycin), 디리트로마이신 (dirithromycin), 조사마이신 (josamycin), 스피로마이신 (spiromycin), 미데카마이신 (midecamycin), 로라타딘 (loratadine), 데슬로라타딘 (desloratadine), 루코마이신 (leucomycin), 미오카마이신 (miocamycin), 로키타마이신 (rokitamycin), 안다지트로마이신 (andazithromycin) 및 스위놀라이드 A (swinolide A)와 같은 마크로라이드; 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 오플록사신 (ofloxacin), 레보플록사신 (levofloxacin), 트로바플록사신 (trovafloxacin), 아라트로플록사신 (alatrofloxacin), 목시플록시신 (moxifloxicin), 노르플록사신 (norfloxacin), 에녹사신 (enoxacin), 그레파플록사신 (grepafloxacin), 가티플록사신 (gatifloxacin), 로메플록사신 (lomefloxacin), 스파플록사신 (sparfloxacin), 테마플록사신 (temafloxacin), 페플록사신 (pefloxacin), 아미플록사신 (amifloxacin), 플레록사신 (fleroxacin), 투수플록사신 (tosufloxacin), 프루리플록사신 (prulifloxacin), 이르록사신 (irloxacin), 파쥬플록사신 (pazufloxacin), 클리나플록사신 (clinafloxacin), 및 시타플록사신 (sitafloxacin)과 같은 플루오로퀴놀론; 젠타미신 (gentamicin), 네틸미신 (netilmicin), 파라메신 (paramecin), 토브라마이신 (tobramycin), 아미카신 (amikacin), 카나마이신 (kanamycin), 네오마이신 및 스트렙토마이신, 반코마이신, 테이코플라닌 (teicoplanin), 람포라닌 (rampolanin), 미데플라닌 (mideplanin), 코리스틴 (colistin), 다프토마이신 (daptomycin), 그라마시딘 (gramicidin), 콜리스티메테이트 (colistimethate)와 같은 아미노글리코시드; 폴리믹신 B (polymixin B), 카프레오마이신 (capreomycin), 바시트라신 (bacitracin), 페넴 (penems)과 같은 폴리믹신; 페니실린 G, 페니실린 V와 같은 페니실린-감수성 작용제를 포함하는 페니실린; 메티실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플록사실린, 나프실린과 같은 페니실린-저항성 작용제; 암피실린, 아목시실린 및 헤타실린, 실린 및 갈람피실린과 같은 그람 음성 미생물 활성제; 카베니실린, 티카르실린, 아즐로실린, 메즐로실린, 및 피페라실린과 같은 항슈도모날 페니실린; 세프포독심 (cefpodoxime), 세프프로질 (cefprozil), 세프트부텐 (ceftbuten), 세프티족심 (ceftizoxime), 세프트리옥손 (ceftriaxone), 세팔로틴, 세파피린, 세파렉신, 세프라드린, 세폭시틴 (cefoxitin), 세파만돌 (cefamandole), 세파졸린 (cefazolin), 세팔로리딘 (cephaloridine), 세파클로 (cefaclor), 세파드록실 (cefadroxil), 세팔로글리신 (cephaloglycin), 세프록심 (cefuroxime), 세포라나이드 (ceforanide), 세포탁심 (cefotaxime), 세파트리진 (cefatrizine), 세파세트릴 (cephacetrile), 세페파임 (cefepime), 세픽심 (cefixime), 세포니시드 (cefonicid), 세포페라존 (cefoperazone), 세포테탄 (cefotetan), 세프메타졸 (cefmetazole), 세프타지딤 (ceftazidime)과 같은 세팔로스포린, 로라카베프 (loracarbef), 및 목사락탐 (moxalactam), 아즈트레오남 (aztreonam)과 같은 모노박탐 (monobactams); 및 이미페넴 (imipenem), 메로페넴 (meropenem) 및 에르타페넴 (ertapenem)과 같은 카르바페넴 (carbapenems), 펜트아미디네세티오네이트 (pentamidineisetionate), 알부테롤 설페이트(albuterol sulfate), 리도카인 (lidocaine), 메타프로테레놀 설페이트 (metaproterenol sulfate), 베클로메타손 디프레피오네이트 (beclomethasone diprepionate), 트리암시놀론 아세트아미드, 부데소나이드 아세토나이드, 플루티카손 (fluticasone), 이프라트로피움 브로마이드, 플루니솔라이드 (flunisolide), 크로몰린 소디움 (cromolyn sodium), 및 에르고타민 타르트레이트 (ergotamine tartrate); 팍리탁셀 (paclitaxel)과 같은 탁센 (taxanes); SN-38, 및 티르포스틴 (tyrphostines)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 중합체에 결합하기 위해 필요한 바람직한 작은 분자는 적어도 하나의 자연적으로 발생된 아미노기를 갖는 것이다. 상기와 같은 바람직한 분자는 아미노히퓨레이트 소디움 (aminohippurate sodium), 암포테리신 B (amphotericin B), 독소루비신 (doxorubicin), 아미노카프로익 산 (aminocaproic acid), 아미노레불리닉 산 (aminolevulinic acid), 아미노살리실릭 산 (aminosalicylic acid), 메타라미놀 비타르트레이트 (metaraminol bitartrate), 파미드로네이트 디소디움 (pamidronate disodium), 다우노루비신 (daunorubicin), 레보티록신 소디움 (levothyroxine sodium), 리시노프릴 (lisinopril), 실라스타틴 소디움 (cilastatin sodium), 멕실레틴 (mexiletine), 세파렉신 (cephalexin), 데페록사민 (deferoxamine), 및 아미포스틴 (amifostine)을 포함한다.
본 발명의 중합체에 결합하기 위해 필요한 바람직한 펩티드 또는 단백질은 EPO, IFN-α, IFN-β, 콘센서스 IFN, 인자 VIII, 인자 IX, GCSF, GMCSF, hGH, 인슐린, FSH 및 PTH를 포함한다.
상기 예시적인 생물학적 활성제는 가능한 유사체, 작용제, 길항제, 억제제, 이성질체 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 것을 의미한다. 펩티드 및 단백질에 관하여서는, 본 발명은 그의 생물학적 활성 단편 뿐만 아니라 합성, 재조합, 천연, 글리코실화된, 및 비-글리코실화된 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 게다가, "활성제"라는 용어는 콘쥬게이션 후의 활성제 "잔류물" 뿐만 아니라 콘쥬게이션 이전의 활성제를 포함하는 것으로 의도된다.
V. 약학적 조성물
본 발명은 약학적 첨가제와 결합된 본 발명의 콘쥬게이트를 포함하는 약학적 제제를 또한 포함한다. 일반적으로, 콘쥬게이트 자체는 고체 형태 (예를 들면, 침전물)인데, 이것은 고체 또는 액체 형태일 수 있는 적당한 약학적 첨가제와 결합될 수 있다.
예시적인 첨가제는 탄수화물, 무기염, 항미생물제, 항산화제, 계면활성제, 버퍼, 산, 염기 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
당, 알디톨, 알도닉 산 (aldonic acid), 에스테르화된 당과 같은 유도된 당, 및/또는 당 중합체와 같은 탄수화물은 첨가제로서 존재할 수 있다. 특정한 탄수화물 첨가제는 예를 들어, 프락토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 솔보스 등과 같은 모노사카라이드; 락토스, 슈크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등과 같은 디사카라이드; 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트린, 스타치 등과 같은 폴리사카라이드; 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락시톨, 자일리톨, 솔비톨 (글루시톨), 피라노실 솔비톨, 미오이노시톨 등과 같은 알디톨을 포함한다.
첨가제는 시트르산, 소디움 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 소디움 설페이트, 포타슘 니트레이트, 소디움 포스페이트 모노베이직, 소디움 포스페이트 디베이직 및 이들의 혼합물과 같은 무기염 또는 버퍼를 또한 포함할 수 있다.
제제는 미생물의 성장을 방해하거나 예방하기 위해서 항미생물제를 또한 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 항미생물제의 제한되지 않는 예는 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토니움 클로라이드, 벤질 알콜, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알콜, 페닐머큐릭 니트레이트, 티머졸 및 이들의 혼합물을 포함한다.
항산화제가 제제에 또한 존재할 수 있다. 항산화제는 산화를 막기 위하여 사용되는데, 이에 따라 제제의 콘쥬게이트 또는 다른 성분들의 오염을 막는다. 본 발명에서 사용되는 적합한 항산화제는 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시안니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 히포포스포러스 산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 소디움 비설피트, 소디움 포름알데히드 설폭실레이트, 소디움 메타비설피트 및 이들의 혼합물을 포함한다.
계면활성제가 첨가제로서 포함될 수 있다. 예시적인 계면활성제는 하기를 포함한다: 폴리사카라이드, 예를 들어 "트윈 20" 및 "트윈 80", 및 플루로닉스, 예를 들어 F68 및 F88 (둘다 BASF, 마운트 올리브, 뉴 저지로부터 입수가능함); 솔비탄 에스테르; 지질, 예를 들어 인지질, 예를 들어 레시틴 및 다른 포스파티딜에탄올아민 (바람직하게 리포솜 타입이 아니지만), 지방산 및 지방성 에스테르; 스테로이드, 예를 들어 콜레스테롤; 및 킬레이트제, 예를 들어 EDTA, 아연 및 다른 적합한 양이온.
산 또는 염기가 제제에 첨가제로서 포함될 수 있다. 사용 가능한 제한적이지 않은 산은 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 젖산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것들을 포함한다. 적합한 염기의 예로는 소디움 히드록시드, 소디움 아세테이트, 암모늄 히드록시드, 포타슘 히드록시드, 암모늄 아세테이트, 포타슘 아세테이트, 소디움 포스페이트, 포타슘 포스페이트, 소디움 시트레이트, 소디움 포르메이트, 소디움 설페이트, 포타슘 설페이트, 포타슘 푸머레이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 염기를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
약학적 제제는 모든 유형의 제제를 포함하고, 특히 예를 들어, 현탁액 및 용액 뿐만 아니라 물을 타서 사용할 수 있는 파우더와 같이 주사용으로 적합한 것들을 포함한다. 조성물 내의 콘쥬게이트 (즉, 본 발명의 활성제 및 중합체 사이에서 형성된 콘쥬게이트)의 함량은 많은 요소들에 따라 다양할 수 있으나, 상기 조성물이 단위 용량 컨테이너 (예를 들어, 바이알)에 저장되었을 때 치료적으로 유효량이 되도록 하는 것이 바람직하다. 게다가, 약학적 제제는 시린지에 수용될 수 있다. 치료적인 유효량은 어떤 함량이 임상적으로 바람직한 종말점을 나타내는지를 결정하기 위하여 콘쥬게이트의 함량을 증가시킨 반복된 투여에 의해 실험적으로 결정될 수 있다.
조성물에서 각 첨가제의 함량은 첨가제의 활성 및 조성물의 특정 필요에 따라 다양할 수 있다. 전형적으로, 각 개별 첨가제의 최적 함량은 통상적인 실험, 즉 첨가제의 다양한 함량 (낮은 함량부터 높은 함량까지)을 포함하는 조성물의 제조, 안정성 및 다른 변수들의 시험, 및 중요한 부작용 없이 최적 성능이 얻어지는 범위를 결정을 통해서 결정된다.
그러나, 일반적으로 조성물에서 첨가제는 약 1 내지 약 99 중량%, 바람직하게는 약 5 내지 약 98 중량%, 보다 바람직하게는 약 15 내지 약 95 중량%, 가장 바람직하게는 30 중량% 미만으로 존재한다.
다른 첨가제와 함께 상기 약학적 첨가제들은 ["레밍톤: 약학의 과학 & 실습", 19 판, 윌리암스 & 윌리암스, (1995)], ["외과의사의 데스크 참고자료", 52 판, 의학 경제학, 몽발르, NJ (1998)], 및 [크리브, A. H., 약학적 첨가제의 안내서, 3 판, 미국 약학회, 워싱톤, D.C., 2000.]에 설명되어 있다.
본 발명의 약학적 제제는 전형적으로, 비록 반드시는 아니지만, 주사를 통해서 투여되고, 따라서 투여 전에 일반적으로 즉시 액체 용액 또는 현탁액으로 된다. 약학적 제제는 시럽, 크림, 연고, 정, 파우더 등과 같은 다른 형태 또한 가능하다. 폐, 직장, 경피, 점막, 경구, 경막, 피하, 동맥 속 등과 같은 다른 투여 모드 또한 포함된다.
상기에서 설명한 바와 같이, 콘쥬게이트는 정맥 주사 또는 덜 바람직하게 근육내 또는 피하 주사에 의해 비경구적으로 주사되어 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 적합한 제제 유형은 즉시 주사 용액, 사용 전에 용매와의 혼합을 위한 건조 파우더, 즉시 주사가능한 현탁액, 사용 전에 담체와 혼합하기 위한 건조 불용성 조성물, 및 에멀션 및 투여 전에 희석을 위한 액체 농축물 등을 포함한다.
VI. 투여 방법
본 발명은 본 발명의 콘쥬게이트를 콘쥬게이트 치료에 반응하는 상태로 고통받는 환자에게 투여하는 방법을 또한 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 주사를 통하여 콘쥬게이트 (바람직하게 약학적 제제의 부분으로 제공되는)의 치료적인 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 투여 방법은 특정 콘쥬게이트의 투여에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 어떤 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 특정 콘쥬게이트가 효과적으로 치료할 수 있는 조건을 인식할 것이다. 투여되는 실제 함량은 치료되는 상태의 심각성, 건강 케어 전문가의 판단, 및 투여되는 콘쥬게이트 뿐만 아니라 환자의 나이, 중량 및 일반적인 상태에 따라 다양할 수 있다. 치료적인 유효량은 본 발명 분야의 당업자 및/또는 적당한 참고문헌 및 논문에 공지되어 있다. 일반적으로, 치료적인 유효량은 약 0.001 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.01 mg/일 내지 75 mg/일, 및 보다 바람직하게는 0.10 mg/일 내지 50 mg/일이다.
어떤 주어진 콘쥬게이트 (또한, 바람직하게 약학적 제제의 부분으로 제공되는)의 단위 용량은 임상의의 판단에 따른 다양한 복용 계획, 환자의 필요량 등에 따라 투여될 수 있다. 특정 복용 계획은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 알려져 있고, 통상적인 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 예시적인 복용 계획은 하루에 5 번, 하루에 4 번, 하루에 3 번, 하루에 2 번, 하루에 1 번, 한주에 3 번, 한주에 2 번, 한주에 1 번, 한달에 2 번, 한달에 1 번, 및 이들의 혼합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일단, 임상적인 종말점에 이르면, 조성물의 복용은 중지된다.
본 발명의 콘쥬게이트 투여의 장점은 개별 수용성 중합체 부분이 쪼개질 수 있다는 것이다. 상기 결과는 중합체 크기 때문에 체내로부터의 제거가 잠재적으로 문제가 될 때 유용하다. 바람직하게, 각 수용성 중합체 부분의 쪼개짐은 우레탄, 아미드, 카르보네이트 또는 에스테르-포함하는 결합과 같은, 생리학적으로 쪼개질 수 있는 및/또는 효소학적으로 분해될 수 있는 결합의 사용을 통하여 촉진된다. 이런 방식으로, 콘쥬게이트의 제거 (개별 수용성 중합체 부분의 쪼개짐을 통한)는 바람직한 제거 특성을 제공하는 중합체 분자 크기 및 유형 관능기를 선택함으로써 조절될 수 있다. 당업자는 쪼개질 수 있는 관능기 뿐만 아니라 중합체의 적절한 분자 크기를 결정할 수 있다. 예를 들어, 당업자는, 통상적인 실험 방법을 이용하여, 먼저 다른 중합체 중량 및 쪼개질 수 있는 관능기를 가진 다양한 중합체 유도체를 제조하고, 그리고 나서, 상기 중합체 유도체들을 환자에게 투여하고 주기적인 혈액 및/또는 소변 시료를 채취하여 제거 프로필 (예를 들어, 주기적인 혈액 또는 소변 샘플링)을 얻음으로써 적절한 분자 크기 및 쪼개질 수 있는 관능기를 결정할 수 있다. 일단 각 시험 콘쥬게이트에 대한 일련의 제거 프로필이 얻어지면, 적합한 콘쥬게이트가 확인될 수 있다.
본 발명이 바람직한 특정 실시예와 관련하여 설명될 것이나, 실시예 뿐만 아니라 상기 상세한 설명이 본 발명의 범위를 축소시키는 것은 아니다. 다른 측면에서, 본 발명의 범위에 속하는 장점 및 변형들이 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 명백해 질 것이다.
본 발명의 실시에는, 달리 정의하지 않는 한, 본 발명의 범위에 속하는 유기 합성 등의 통상적인 기술이 사용될 것이다. 상기 기술은 본문에서 충분히 설명된다. 예를 들어, 상기 [J. 마취, 진보된 유기 화학: 반응 매커니즘 및 구조, 4 판 (뉴욕: 윌리-인터사이언스, 1992)]를 참고하라.
하기의 실시예에서, 사용된 숫자 (예를 들어, 함량, 온도 등)에 관한 정확성을 확실히 하기 위하여 노력이 기울여졌으나, 몇가지 실험적 오류 및 편차가 설명되었다. 달리 표시되지 않으면, 온도는 섭씨이고 압력은 해수에서의 대기압 또는 그 근처이다. 모든 분자량은 평균 분자량의 관점이고 달리 표시하지 않는 한 달톤 ("Da") 단위로 표시되었다. 여기서는 명세서에서와 마찬가지로 하기의 약어가 사용되었다:
DCC - 디시클로헥실 카르보디이미드
HOBT - 1-하이드록시벤조트리아졸
MALDI-TOF - 플라이트의 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화-시간
SDS-PAGE - 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동
K - 분자량을 설명하는 내용에 사용될 때, 예를 들어 (2K)는 1000을 나타낸다.
NMR - 핵 자기 공명
실시예 1
mPEG(2K Da)-메틸 케톤
방법 A : mPEG (2K Da)- α 에테르 결합을 갖는 메틸 케톤
mPEG (2K Da)-2-하이드록시프로판의 제조
무수 톨루엔 50 mL에 분별 증류적으로 건조된 mPEG2K 메실레이트 용액 (mPEG2KOMs, 넥타 테라퓨틱스, 2 g, 1 mmole)에 1,2-프로판디올 (1.522 g, 20 mmole) 및 소디움 하이드라이드 (미네랄 오일 내에 60%, 0.800 g, 20 mmole)이 첨가되었다. 반응 혼합물은 질소 분위기 하에서 20 시간 동안 80 ℃로 교반되었다. 비용해성 침전물이 여과되었고 상기 여과물은 진공 하에서 농축되어 건조되었다. 조생성물이 3 mL 디클로로메탄에 용해되었고 100 mL 이소프로필 알콜-디에틸 에테르 (1:1) 혼합물로 침전되었다. 최종 생성물은 진공 여과를 이용하여 수집되었고 진공에서 밤새 건조되었다. 수득량: 1.4 g. NMR (d6-DMSO) : 1.01 ppm (d,-CH3, 3H), 3.24 ppm (s,-OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, 중합체 골격), 4.54 ppm (d,-OH, 1H).
mPEG (2K Da)-2-메틸 케톤의 제조
무수 디클로로메탄 5 mL에 분자체 4A (0.5 g), 포타슘 카르보네이트 (0.34 g, 2.46 mmol) 및 N-클로로숙신이미드 (0.037 g, 0.277 mmol)의 교반된 현탁액에, 0 ℃에서 연속적으로 mPEG (2K Da)-2-하이드록시프로판 (0.5 g, 0.25 mmol) 및 N-tert-부틸벤젠술펜아미드 (0.009 g, 0.050 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물은 같은 온도에서 2 시간 동안 교반되었다. 그 후에, 용매는 감압 하에서 건조되어 증발되었다. 잔여물은 20 mL 물에 용해되었고, pH는 10 % H3P04로 4.5로 조절되었으며, 원하는 생성물은 디클로로메탄 (20 mL x 2)으로 추출되었다. 추출물은 무수 소디움 설페이트로 건조되었고, 진공 하에서 농축되었으며 20 ml의 이소프로필 알콜 및 디에틸 에테르 (1:1) 혼합물로 침전되었다. 침전된 생성물은 진공 여과를 이용하여 수집되었고 진공에서 밤새 건조되었다. 수득량: 0.35 g. NMR (d6-DMSO): 2.04 ppm (s,-CH3, 3H), 3.24 ppm (s,-OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, 중합체 골격), 4.11 ppm (s,-OCH2(C=O)-, 2H).
상황에 따라, 케톤은 다양한 양의 케톤 및 케톤 히드레이트로 존재한다. 케톤 및 케톤 히드레이트는 물의 존재 하에서 평형 상태이고, 양자 모두 중합체-활성제 콘쥬게이트를 형성하는데 사용될 수 있다 (단독 또는 혼합).
리소자임의 PEG화
리소자임 (3.0 mg)이 1 mL의 20 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 7.5)에 용해되었고, mPEG (2K Da)-메틸 케톤 (8.4 mg, 20 배 몰 과량)이 첨가되었다. 15 분 후에, 0.159 M의 NaCNBH3 (66 ㎕, 50 배 몰 과량) 용액이 첨가되었고 용액은 상온에서 17 시간 동안 교반되었다. SDS-PAGE에 의한 반응 혼합물의 분석은 PEG화된 리소자임이 형성되었음을 보여준다.
본 실시예는 다른 크기의 중합체를 이용하여 여러 번 반복되었다. 먼저, 다른 크기의 다양한 mPEG 메틸 케톤을 제공하기 위하여 다른 크기의 mPEG 메실레이트가 mPEG2K 메실레이트를 대신하여 사용되었다. 상세하게는, 하기의 다른 크기의 mPEG 메실레이트가 사용되었다: mPEG5K 메실레이트; mPEG10K 메실레이트; 및 mPEG20K 메실레이트. 일단 많은 다른 크기의 mPEG 메틸 케톤이 형성되면, 각각은 상기에서 설명한 과정을 이용하여 리소자임에 콘쥬게이션된다. mPEG2K 메틸 케톤에서 얻어진 것과 유사한 결과가 얻어졌다.
실시예 2
mPEG(5K Da)-메틸 케톤
방법 B : mPEG (5K Da)- α 에테르 결합을 갖는 메틸 케톤
에틸 2-벤질옥시락테이트의 제조
트리플루오로메탄술폰산 (1.0 mL)을 점진적으로 에틸 락테이트 (8.90 g, 75 mmole), 벤질 2,2,2-트리클로로아세트이미데이트 (22.7 g, 90 mmole), 무수 시클로헥산 (100 mL), 및 무수 디클로로메탄 (50 mL)의 교반된 혼합물에 넣었다. 혼합물은 아르곤 분위기 하에서 상온으로 밤새 교반되었다. 혼합물은 여과되었고, 여과물은 소디움 하이드로젠 카르보네이트 (250 mL)의 포화 용액 및 증류수 (250 mL)로 세척되었다. 그리고 나서, 용액은 무수 소디움 설페이트로 건조되었고 용매는 로터리 증발을 이용하여 갑압 하에서 증류되었다. 잔여물은 분별 진공 증류되어 9.6 g의 무색 생성물을 얻었다. NMR (CDCl3) : 1.21 ppm (t,-CH2 CH 3 , 3H), 1.32 ppm (d,-CH2-,3H), 4.13 ppm (m,-CH- 및 -CH 2 CH3, 3H), 4.50 ppm (m,-CH2-, 2H), 7.32 ppm (m,5H).
2-벤질옥시-1-프로판올의 제조
무수 테트라하이드로퓨란 (30 mL)에 에틸 2-벤질옥시락테이트 (9.5 g, 45.6 mmole)의 용액이, 상온의 아르곤 분위기 하에서 무수 테트라하이드로퓨란 (56 mL)에 리튬 알루미늄 하이드라이드 (1.06 g, 28 mmole)의 교반된 용액에 30 분 동안 적가되었다. 그 후에, 혼합물은 3 시간 동안 60 ℃에서 교반되었다. 30 ℃로 냉각된 후에, 신선하게 제조된 소디움 설페이트 포화 용액 (10 mL)이 천천히 첨가되었다. 혼합물은 여과되었고, 용매는 갑압 하에서 증류되었다. 잔여물은 디클로로메탄 (100 mL)에 용해되었고 용액은 무수 마그네슘 설페이트로 건조되었다. 그리고 나서, 용매는 갑압 하에서 증류되었다. 잔여물은 분별 진공 증류에 의해 6.2 g의 무색 액체 생성물을 얻었다. NMR (d6-DMSO): 1.90 ppm (d,-CH3,3H), 3.20-3.50 ppm (bm,-CH- 및 -CH2-, 3H), 4.53 ppm (s,-CH2-,2H), 4.63 ppm (t,-OH,1H), 7.33 ppm (m,5H).
mPEG (5K Da)-메실레이트의 제조
톨루엔 (150 mL) 속의 mPEG (5K Da)-OH (25.0 g, 5 mmole) 용액은 감압 하에서 톨루엔을 증발시킴으로써 분별 증류적으로 건조되었다. 건조된 mPEG (5K Da)-OH는 무수 톨루엔 (150 mL) 및 무수 디클로로메탄 (30 mL)의 혼합물에 용해되었다. 그 후에, 트리메틸아민 (0.9 mL, 6.5 mmole) 및 메탄술포닐 클로라이드 (0.45 mL, 5.8 mmole)가 첨가되었고, 혼합물은 질소 분위기 하의 상온에서 밤새 교반되었다. 그리고 나서, 용매는 감압 하에서 증류되었다. 그 후에, 잔여물은 디클로로메탄 (40 mL)에 용해되었고 650 mL의 이소프로필 알콜이 첨가되었다. 혼합물은 30 분 동안 0 ℃에서 교반되었고, 침전된 생성물은 여과되고 진공에서 건조되어 NMR에 의해 나타낸 100 % 치환된 22 g의 메실레이트 유도체를 생산하였다.
mPEG (5K Da)-벤질옥시프로판의 제조
톨루엔 (150 mL) 속의 mPEG (5K Da)-메실레이트 (15 g, 3 mmole) 용액은 감압 하에서 톨루엔을 증발시킴으로써 분별 증류적으로 건조되었다. 건조된 mPEG (5K Da)-메실레이트는 무수 톨루엔 (150 mL)에 용해되었고 2-벤질옥시-1-프로판올 (1.5 g, 9 mmole) 및 소디움 하이드라이드 (미네럴 오일 속에 60 % 분산, 0.36 g, 9 mmole)가 첨가되었고, 반응 혼합물은 질소 분위기 하에서 밤새 85 ℃로 교반되었다. 상온까지 냉각된 후에, 혼합물은 여과되었고 용매는 갑압 하에서 증류되었다. 잔여물은 디클로로메탄 (20 mL)에 용해되었고 350 mL의 이소프로필 알콜로 0-5 ℃에서 침전되었다. 침전된 생성물은 여과되어 감압 하에서 건조되었다. 수득량: 12.7 g. NMR (d6-DMSO): 1.10 ppm (d,-CH3,3H), 3.24 ppm (s,-OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, 중합체 골격), 4.53 ppm (s,-CH2-,2H), 7.33 ppm (m,5H).
mPEG (5K Da)-2-하이드록시프로판의 제조
mPEG (5K Da)-벤질옥시프로판 (8.8 g), 에틸 알콜 (120 mL) 및 팔라듐 (활성 탄소 10 %, 0.8 g)의 혼합물이 수소 45 psi 하에서 밤새 수소화되었다. 혼합물은 여과되었고 용매는 갑압 하에서 증류되었다. 조생성물은 디클로로메탄 (15 mL)에 용해되었고 300 mL의 이소프로필 알콜로 0-5 ℃에서 침전되었다. 침전된 생성물은 여과되어 감압 하에서 건조되었다. 수득량: 6.1 g. NMR (d6-DMSO): 1.01 ppm (d,-CH3,3H), 3.24 ppm (s,-OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, 중합체 골격), 4.54 ppm (d,-OH,1H).
mPEG(5K Da)-메틸 케톤의 제조
mPEG (5K Da)-2-하이드록시프로판 (4.0 g)이 디클로로메탄 (20 mL) 속의 다스-마틴 페리오디난 (0.44 g)의 용액에 첨가되었고, 혼합물은 상온에서 6 시간 동안 교반되었다. 그 후에, 용매는 갑압 하에서 증류되었다. 그리고 나서, 잔여물은 이소프로필알콜 (100 mL)에 용해되었고, 에틸 에테르 (50mL)가 첨가되었다. 혼합물은 15 분 동안 교반되었다. 침전된 생성물은 여과되고 감압 하에서 건조되었다. 수득량: 3.2 g. NMR (d6-DMSO) : 2.04 ppm (s,-CH3,3H), 3.24 ppm (s,-OCH3,3H), 3.51 ppm (s, 중합체 골격), 4.11 ppm (s,-OCH2(C=O)-, 2H).
상황에 따라, 케톤은 다양한 양의 케톤 및 케톤 히드레이트로 존재한다. 케톤 및 케톤 히드레이트는 물의 존재 하에서 평형 상태이고, 양자 모두 중합체-활성제 콘쥬게이트를 형성하는데 사용될 수 있다 (단독 또는 혼합).
리소자임의 PEG화
리소자임 (3.0 mg)이 1 mL의 20 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 7.5)에 용해되었고, mPEG (5K Da)-메틸 케톤 (7.5 mg)이 첨가되었다. 15 분 후에, 0.1 M의 NaCNBH3 (42 ㎕) 용액이 첨가되었고 용액은 상온에서 18 시간 동안 교반되었다. SDS-PAGE에 의한 반응 혼합물의 분석은 PEG화된 리소자임이 형성되었음을 보여준다.
본 실시예는 다른 크기의 중합체를 이용하여 여러 번 반복되었다. 먼저, 다른 크기의 다양한 mPEG 메틸 케톤을 제공하기 위하여 다른 크기의 mPEG 메실레이트가 mPEG5K 메실레이트를 대신하여 사용되었다. 상세하게는, 하기의 다른 크기의 mPEG 메실레이트가 사용되었다: mPEG5K 메실레이트; mPEG10K 메실레이트; 및 mPEG20K 메실레이트. 일단 많은 다른 크기의 mPEG 메틸 케톤이 형성되면, 각각은 상기에서 설명한 과정을 이용하여 리소자임에 콘쥬게이션된다. mPEG5K 메틸 케톤에서 얻어진 것과 유사한 결과가 얻어졌다.
실시예 3
mPEG(5K Da)-피페리돈 및 그의 상응하는 케톤 히드레이트
mPEG-피페리돈의 제조
디클로로메탄 (20 mL) 속의 mPEG (5K Da)-프로피온산의 숙신이미딜 에스테르 (넥타 테라퓨틱스, mPEG5K-SPA, 1.0 g, 2 mmole)에, 트리에틸아민 (0.084 mL, 6 mmole) 및 4-피페리돈 모노히드레이트 하이드로클로라이드 (0.077 g, 5 mmole)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 질소 분위기 하에서 밤새 상온에서 교반되었다. 불용성 침전물은 여과되었고 여과물은 증발되어 건조되었다. 조생성물은 디클로로메탄에 용해되었으며 이소프로필 알콜로 침전되었다. 최종 생성물은 진공 여과를 통해 수집되었으며 진공에서 밤새 건조되었다. 수득량: 0.88 g. NMR (d6-DMSO) : 2.32 ppm (t,-CH 2 -C(OH)2-CH 2 -), 2.42 ppm (t,-CH 2 -C(OH)2 CH 2 -), 2.66 ppm (t,-OCH2 CH 2 CON-), 3.24 ppm (s,-OCH3), 3.51 ppm (s, 중합체 골격).
상황에 따라, 케톤은 다양한 양의 케톤 및 케톤 히드레이트로 존재한다. 케톤 및 케톤 히드레이트는 물의 존재 하에서 평형 상태이고, 양자 모두 중합체-활성제 콘쥬게이트를 형성하는데 사용될 수 있다 (단독 또는 혼합).
리소자임의 PEG화
단백질 리소자임은 단백질과 콘쥬게이트를 형성하는 주어진 중합체성 시약의 능력을 보여주는 모델로 사용된다. 리소자임은 아민 잔기로 종결되는 측쇄를 갖는 6 개의 라이신 잔기를 포함하는 129 아미노산 분비 효소이다. 아민 잔기는 본 발명의 중합체성 시약을 위한 잠재적인 결합 자리를 나타낸다.
달걀의 흰자위로부터의 리소자임 (3 mg, 시그마, St. 루이스, MO, 제품 번호 L-6876)은 1 mL의 20 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 7.5, J. T. 베이커, 필립스버그, NJ)에 용해되었다. 리소자임 용액에 실시예 3의 mPEG5K-케톤 (21 mg, 리소자임에 대하여 20 배 몰 과량)이 첨가되었다. 바이랄은 상온에서 반응이 진행되도록 하기 위하여 로토 믹스™ 오비탈 쉐이커 (써몰린사, Dubuque, IA) 세트에 느린 속도로 위치시켰다. 15 분 후에, 0.066 mL의 159 mM 수용성 NaCNBH3 (예를 들어, 알드리치, St. 루이스, MO, 제품 번호 15,615-9)를 첨가하였다. NaCNBH3의 함량은 리소자임에 대하여 50-배 몰 과량을 나타내었다. 분취물 (20 ㎕)은 반응 혼합물로부터 정해진 시간 간격 (17 시간 및 41 시간)에 따라 회수되었고, 10% 트리스-HCl 레디 겔™ 사전 겔 (양자 모두 바이오-라드 실험실, 헤르큘, CA에서 입수할 수 있음)에 기초한 사전 겔 전기영동 시스템을 이용한 SDS-PAGE 및 옴니FLEX® MALDI-TOF 질량 스펙트로미터 (브루커 달토닉스, Inc., 벨레리카, MA)를 이용한 MALDI-TOF 질량 분석기에 의해 분석되었다. SDS-PAGE 분석은 결합된 1,2 및 3 PEG 부분을 가진 리소자임의 PEG 유도체의 존재를 나타내었다. MALDI-TOF 질량 분석기는 약 5000 Da 질량에서 차이가 있는 19,660 Da, 25,069 Da, 및 30,568 Da의 3 개의 PEG화된 리소자임의 유도체를 위한 피크를 나타내었다. MALDI-TOF에 의한 변형되지 않은 리소자임의 질량은 14,198 Da이었다.
본 실시예는 다른 크기의 중합체를 이용하여 여러 번 반복되었다. 먼저, 다른 크기의 다양한 mPEG 피페리돈을 제공하기 위하여 다른 크기의 mPEG-SPA가 mPEG5K-SPA를 대신하여 사용되었다. 상세하게는, 하기의 다른 크기의 mPEG-SPA가 사용되었다: mPEG2K-SPA; mPEG10K-SPA; 및 mPEG20K-SPA. 일단 많은 다른 크기의 mPEG 피페리돈이 형성되면, 각각은 상기에서 설명한 과정을 이용하여 리소자임에 콘쥬게이션된다. mPEG5K-피페리돈에서 얻어진 것과 유사한 결과가 얻어졌다.
실시예 4
mPEG 메틸 케톤
방법 C : mPEG (5K Da)- β 카르바미도기를 갖는 메틸 케톤
레블린산 (0.07 g, 6 mmole)이 무수 디클로로메탄 (20 mL)에 용해되었다. 그 후에, mPEG (5K Da)-아민 (넥타 테라퓨틱스, 2.0 g, 4 mmole), 트리에틸아민 (0.028 mL, 2 mmoles), 1-하이드록시벤조트리아졸 (0.027 g, 2 mmole) 및 1,3-디시클로헥실카르보디이미드 (0.12 g, 6 mmole)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 질소 분위기 하에서 밤새 상온으로 교반되었다. 비용해성 침전물이 여과되었고 상기 여과물은 진공 하에서 농축되어 건조되었다. 조생성물이 디클로로메탄에 용해되었고 이소프로필 알콜 (50 mL)로 침전되었다. 최종 생성물은 진공 여과를 이용하여 수집되었고 진공에서 밤새 건조되었다. 수득량: 1.72 g. NMR (d6-DMSO): 2.28 ppm (t,-NH-COCH 2 CH2COCH3, 2H), 2.32 ppm (s,-CH3, 3H), 2.62 ppm (t,-NH-COCH 2 CH2COCH3, 2H), 3.16 ppm (q.-CH2CH 2 NH-CO-, 2H), 3.24 ppm (s,-OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, 중합체 골격), 7.87 ppm (t,-NH-CO-CH2-, 1H).
상황에 따라, 케톤은 다양한 양의 케톤 및 케톤 히드레이트로 존재한다. 케톤 및 케톤 히드레이트는 물의 존재 하에서 평형 상태이고, 양자 모두 중합체-활성제 콘쥬게이트를 형성하는데 사용될 수 있다 (단독 또는 혼합).
리소자임의 PEG화
리소자임 (3.0 mg)이 1 mL의 20 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 7.5)에 용해되었고, 본 실시예에서 제조된 mPEG (5K Da)-케톤 (21 mg, 20 배 과량)이 첨가되었다. 15 분 동안 저어준 후에, 0.159 M의 NaCNBH3 (66 ㎕, 50 배 몰 과량) 용액이 첨가되었고 용액은 상온에서 20 시간 동안 교반되었다. SDS-PAGE에 의한 반응 혼합물의 분석은 PEG화된 리소자임이 형성되었음을 보여준다.
본 실시예는 다른 크기의 중합체를 이용하여 여러 번 반복되었다. 먼저, 다른 크기의 다양한 β 카르바미도기를 갖는 mPEG 메틸 케톤을 제공하기 위하여 다른 크기의 mPEG-아민이 mPEG5K 아민을 대신하여 사용되었다. 상세하게는, 하기의 다른 크기의 mPEG 아민이 사용되었다: mPEG2K-아민; mPEG10K-아민; 및 mPEG20K-아민. 일단 많은 다른 크기의 β 카르바미도기를 갖는 mPEG 메틸 케톤이 형성되면, 각각은 상기에서 설명한 과정을 이용하여 리소자임에 콘쥬게이션된다. β 카르바미도기를 갖는 mPEG5K 메틸 케톤에서 얻어진 것과 유사한 결과가 얻어졌다.
실시예 5
에톡시화를 통한 PEG2 케톤 (링커없는 PEG2 케톤): PEG (6K Da) 케톤
2-벤질옥시-1,3-비스(ω-하이드록시폴리(에틸렌 글리콜))프로판의 제조
시그마-알드리치 (St. Louis, Mo)로부터 입수 가능한 2-벤질옥시글리세롤은 에톡시화되어 2-벤질옥시-1,3-비스(ω-하이드록시폴리(에틸렌 글리콜))프로판, MW = 6K Da.을 형성하였다. 상기 구조에서 변수 (m)은 3,000 달톤의 중합체의 중량을 제공하는 숫자이므로, 따라서 필수적으로 6,000 달톤의 총 중량을 제공한다. 생성물의 NMR 분석은 그의 구조를 확인하였고 HPLC 및 GPC 분석은 그의 순도 및 분자량을 확인하였다. 상기 중합체는 하기의 반응식에 의해 형성되는 케톤을 위한 원료 물질로 사용된다.
2-벤질옥시-1,3-비스(ω-하이드록시폴리(에틸렌 글리콜))프로판, MW = 6K Da의 메틸화
400 mL의 톨루엔 속의 2-벤질옥시-1,3-비스(ω-하이드록시폴리(에틸렌 글리콜))프로판, MW = 6K Da (10 g, 1.67 mmol)이 감압 하에서 톨루엔을 증발시킴으로써 분별 증류적으로 건조되었다. 잔여물은 700 ml의 무수 톨루엔에 용해되었다. 용액에 포타슘 tert-부톡사이드 (tert-부탄올에 1.0 M 용액, 16 mL, 16.7 mmol) 및 메틸 p-톨루엔술포네이트 (3.5 mL, 23.3 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물은 질소 분위기 하에서 밤새 45 ℃로 교반되었다. 혼합물은 여과되었고 여과물은 감압 하에서 건조되어 증발되었다. 잔여물은 500 mL의 물에 용해되었고, NaCl (50 g)이 첨가되어 용액의 pH가 7.5로 조절되었다. 생성물은 디클로로메탄 (250 mL x 2)으로 추출되었다. 추출물은 소디움 설페이트로 건조되었고 진공 하에서 농축되었으며 이소프로필 알콜 및 디에틸 에테르 (7:3, 500 ml)의 혼합물로 침전되었다. 그 후에, 생성물은 진공에서 밤새 건조되었다. 수득량: 7.8 g. NMR (d6-DMSO): 3.24 ppm (s,-OCH3, 6H), 3.51 ppm (s, 중합체 골격), 4.61 ppm (s,-OCH 2 C6H5, 2H), 7.33 ppm (m,-OCH2 C 6 H 5 , 5H).
2-하이드록시-1,3-비스(ω-메톡시폴리(에틸렌 글리콜))프로판의 제조
2-벤질옥시-1,3-비스(ω-하이드록시폴리(에틸렌 글리콜))프로판, MW = 6K Da (5.0 g, 0.83 mmol)을 100 mL의 에틸 알콜에 용해시켰고, Pd(OH)2 (활성 탄소 5%, 0.25 g) 및 시클로헥센 (0.84 mL, 8.3 mmol)을 첨가하였다. 현탁액은 2 시간 동안 환류되었다. 촉매는 여과되었고 여과물은 증발되어 건조되었다. 잔여물은 디클로로메탄 (5 mL)에 용해되었고 300 ml의 디메틸 에테르로 침전되었다. 최종 생성물은 진공 여과를 통해 수집되었고 진공 하에서 밤새 건조되었다. 수득량: 4.6 g. NMR (d6-DMSO): 3.24 ppm (s,-OCH3, 6H), 3.51 ppm (s, 중합체 골격), 4.76 ppm (d,-CH-OH, 1H).
PEG2-(6K Da)-케톤의 제조
2-하이드록시-1,3-비스(ω-메톡시폴리(에틸렌 글리콜))프로판, MW = 6K Da (4.0 g, 0.67 mmol)이 디클로로메탄 (20 mL) 속의 데스-마틴 페리오디난 (0.37 g, 0.867 mmol)의 교반된 용액에 첨가되었다. 반응 혼합물은 상온에서 6 시간 동안 교반되었다. 그 후에, 그것은 농축되었고 생성물은 이소프로필 알콜 및 디에틸 에테르 (2:1, 300 ml)의 혼합물로 침전되었다. 침전물은 진공 여과를 통해 수집되었고 진공 하에서 밤새 건조되었다. 수득량: 3.8 g. NMR (d6-DMSO): 3.24 ppm (s,-OCH3, 6H), 3.51 ppm (s, 중합체 골격), 4.22 ppm (s,-O-CH 2 -C=O, 4H).
상황에 따라, 케톤은 다양한 양의 케톤 및 케톤 히드레이트로 존재한다. 케톤 및 케톤 히드레이트는 물의 존재 하에서 평형 상태이고, 양자 모두 중합체-활성제 콘쥬게이트를 형성하는데 사용될 수 있다 (단독 또는 혼합).
리소자임의 PEG화
리소자임 (3.0 mg)이 1 mL의 20 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 7.5)에 용해되었고, mPEG2-(6K Da)-케톤 (25 mg, 20 배 과량)이 첨가되었다. 15 분 후에, 0.159 M의 NaCNBH3 (105 ㎕, 50 배 몰 과량) 용액이 첨가되었고 용액은 상온에서 20 시간 동안 교반되었다. SDS-PAGE에 의한 반응 혼합물의 분석은 PEG화된 리소자임이 형성되었음을 보여준다.
본 실시예는 다른 크기의 mPEG2-(6K Da)-케톤을 이용하여 여러 번 반복되었다. 하기의 다른 크기의 mPEG2-(6K Da)-케톤이 사용되었다: mPEG2-(10K Da)-케톤; mPEG2-(20K Da)-케톤; 및 mPEG2-(40K Da)-케톤. 각 경우에 있어서, mPEG2-(6K Da)-케톤에서 얻어진 것과 유사한 결과가 얻어졌다.
실시예 6
mPEG2(40K Da)-피페리돈 및 그의 히드레이트
mPEG2(40K Da)-피페리돈 및 그의 히드레이트의 제조
디클로로메탄 (200 mL) 속의 PEG2-(40K Da) 산의 숙신이미딜 에스테르 (넥타 테라퓨틱스, 10 g, 0.25 mmole)에, 트리에틸아민 (0.100 mL, 0.72 mmole) 및 4-피페리돈 모노히드레이트 하이드로클로라이드 (0.100 g, 0.65 mmole)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 질소 분위기 하에서 밤새 상온에서 교반되었다. 그 후에, 용매는 감압 하에서 증류되었다. 잔여물은 디클로로메탄에 용해되었고 이소프로필 알콜 및 에틸 에테르의 혼합물로 침전되었다. 생성물은 진공 여과를 통해 수집되었으며 진공에서 밤새 건조되었다. 수득량: 9.5 g. NMR(d6-DMSO) : 2.33 ppm 및 2.43 ppm(t,-CH 2 -C(OH)2-CH 2 -, 4H), 3.24 ppm (s,- OCH3,6H), 3.51 ppm (s, 중합체 골격), 4.36 ppm(m,-CH 2 OCONH-, 4H), 7.18 ppm (t, -NH- 라이신, 1H), 8.04 ppm (d, -NH- 라이신, 1H).
상기에서 도식적으로 나타낸 바와 같이, 케톤은 다양한 양의 케톤 및 케톤 히드레이트로 존재한다. 케톤 및 케톤 히드레이트는 물의 존재 하에서 평형 상태이고, 양자 모두 중합체-활성제 콘쥬게이트를 형성하는데 사용될 수 있다 (단독 또는 혼합).
리소자임의 PEG화
리소자임 (3.0 mg)이 1 mL의 20 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 7.5)에 용해되었고, PEG2 (40K Da)-피페리돈 (168 mg, 20 배 과량)이 첨가되었다. 15 분 후에, 0.159 M의 NaCNBH3 (66 ㎕, 50 배 몰 과량) 용액이 첨가되었고 용액은 상온에서 24 시간 동안 교반되었다. SDS-PAGE에 의한 반응 혼합물의 분석은 PEG화된 리소자임이 형성되었음을 보여준다.
실시예 7
PEG2 케톤 : mPEG2 (40K Da)-두개의 α 아미도 링커를 갖는 케톤
아세토니트릴 (50 mL) 속의 mPEG (20K Da) 카르복실산의 숙신이미딜 에스테르 (12 g, 0.6 mmole)에, 1,3-디아미노아세톤 디하이드로클로라이드 모로히드레이트 (0.054 g, 0.3 mmole), 및 4-(디메틸아미노) 피리딘 (0.909 g)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 질소 분위기 하에서 48 시간 동안 상온에서 교반되었다. 그 후에, 용매는 감압 하에서 증류되었다. 잔여물은 디클로로메탄에 용해되었고 이소프로필 알콜 및 에틸 에테르의 혼합물로 침전되었다. 최종 생성물은 진공 여과를 통해 수집되었으며 진공에서 밤새 건조되었다. 수득량: 9.5 g. NMR (d6-DMSO): 3.24 ppm (s, -OCH3, 6H), 3.51 ppm (s, 중합체 골격), 4.00 ppm(s,-OCH 2 CONH-,4H), 4.29 ppm (d, NH-CH 2 (C=O)CH 2 -NH-, 2H), 6.68 ppm(t,-NH-CH2 (C=O)CH2 NH-, 2H).
실시예 8
mPEG (5K Da) 메틸 케톤, 방법 A: mPEG (5K Da)- 1 개의 α 아미도 링커를 갖는 메틸 케톤
아세토니트릴 (100 mL) 속의 mPEG (5K Da) 카르복실산의 숙신이미딜 에스테르 (10 g, 2 mmole)에, 1-아미노-2-프로판올 (0.9 g, 12 mmole), 및 4-(디메틸아미노) 피리딘 (1.5 g)을 첨가하였다. 반응 혼합물은 질소 분위기 하에서 밤새 상온에서 교반되었다. 그 후에, 용매는 감압 하에서 증류되었다. 잔여물은 200 ml 증류수에 용해되었다. NaCl (30 g)이 첨가되었으며 생성물은 디클로로메탄 (80 및 40 mL)으로 추출되었다. 추출물은 무수 소디움 설페이트로 건조되었고 감압 하에서 농축되었다. 그 후에, 생성물은 이소프로필 알콜 및 에틸 에테르의 혼합물로 침전되고 진공 여과를 통해 수집되었으며 진공에서 밤새 건조되었다. 수득량: 9.5 g.
상기 생성물 (7.0 g, 1.4 mmole)이 디클로로메탄 (70 mL)에 용해되었고 데스-마틴 페리오디난 (1.17 g)이 첨가되었다. 반응 혼합물은 질소 분위기 하의 상온에서 밤새 교반되었다. 그 후에, 반응 혼합물은 15%-NaCl 용액 (200 mL)으로 세척되었고, 무수 소디움 설페이트로 건조되었고, 감압 하에서 농축되었다. 그 후에, 생성물은 이소프로필 알콜 및 에틸 에테르의 혼합물로 침전되어 감압 하에서 건조한 후에 6.2 g의 흰색 고체를 얻었다. NMR (d6-DMSO) : 2.08 ppm (s, -CH3, 3H), 3.24 ppm (s,-OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, 중합체 골격), 3.94 ppm(s,-OCH 2 CONH-, 2H), 3.97 ppm(d,-NHCH 2 (C=O)-, 2H), 7.98 ppm (t,-NH-CH 2 (C=0)-, 1H).
상황에 따라, 케톤은 다양한 양의 케톤 및 케톤 히드레이트로 존재한다. 케톤 및 케톤 히드레이트는 물의 존재 하에서 평형 상태이고, 양자 모두 중합체-활성제 콘쥬게이트를 형성하는데 사용될 수 있다 (단독 또는 혼합).
실시예 9
PEG (5K Da)-α-하이드록시-ω-2-프로파논 디에틸 케탈 (알파 에테르 결합이 있는)
에틸 피루베이트 디에틸 케탈의 제조
에틸 피루베이트 (13.92 g, 0.120 moles), 트리에틸오르토포르메이트 (19.44 g, 0.131 moles) 및 p-톨루엔술폰산 모노히드레이트 (0.0432 g, 0.00227 moles)을 질소 분위기 하에서 밤새 45 ℃로 교반하였다. 그 후에, 상온까지 냉각한 후에, Na2C03 (1.20 g)을 첨가하였고 혼합물은 15 분 동안 교반하였다. 그리고 나서, 반응 혼합물은 여과되었고 에틸 알콜 및 잔여 트리에틸 오르토포르메이트는 감압 하에서 증류되었다. 잔여물은 분별 진공 증류되어 18.2 g의 순수한 에틸 피루베이트 디에틸 케탈을 얻었다. NMR (d6-DMSO): 1.27 ppm (t,CH3, 에틸 (케탈), 6H) 1.34 ppm (t,-CH3, 에틸 (에스테르), 3H), 1.40 ppm (s,-CH 3 -C-COO-, 3H), 3.45 ppm(q,-OCH 2 CH3, (케탈), 4H), 4.29 ppm(q,-OCH 2 CH3, (에스테르), 2H).
2,2-디에톡시프로판-1-올의 제조
에틸 에테르 (60 mL) 속의 에틸 피루베이트 디에틸 케탈 (16.0 g, 0.084 moles)의 용액이, 에틸 에테르 (150 mL) 속의 리튬 알루미늄 하이드라이드 (1.90 g, 0.050 moles)의 교반된 용액에 30 분 동안 적가되었다. 그 후에, 혼합물은 질소 분위기 하의 상온에서 1 시간 동안 교반되었다. 소디움 설페이트의 포화 용액 (20 mL)이 첨가되었고 혼합물은 15 분 동안 교반되었다. 그 후에, 혼합물은 여과되었고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조되었고, 용매는 증류되어 제거되었다. 잔여물은 분별 진공 증류되어 9.5 g의 순수한 2,2-디에톡시프로판-1-올을 얻었다. NMR (d6-DMSO): 1.17 ppm (t,-CH3, 에틸 (케탈), 6H), 1.31 ppm(s,-CH 3 -C-CH20H, 3H), 3.37 ppm(q,-OCCH 2 CH3, (케탈), 4H), 3.86 ppm(d,-CH20H, 2H), 4.45 ppm (t,-OH, 1H).
PEG (5K Da)-α-하이드록시-ω-2-프로파논 디에틸 케탈
2,2-디에톡시프로판-1-올 (0.366 g, 0.00247 moles), THF (200 mL), 및 포타슘 나프탈렌 0.3 mol/L-테트라하이드로퓨란 (THF) 용액 (20 mL, 0.006 moles)을 유리 반응기에 첨가하고 질소 분위기 하에서 3 분 동안 교반하였다. 에틸렌 옥사이드 (12.6 g 0.286 moles)이 용액에 첨가되었으며 반응 혼합물은 상온에서 48 시간 동안 교반되었다. 그 후에, 혼합물은 질소로 불순물이 제거되었고 0.1 M 포스페이트 버퍼 (pH = 8,150 ml)가 첨가되었다. THF 층은 분리되었고 폐기되었다. 나프탈렌은 에틸 에테르 추출에 의해 용액에서 제거되었다. 생성물은 디클로로메탄 (3 x 100 mL)으로 잔여물로부터 추출되었다. 추출물은 무수 소디움 설페이트로 건조되었고 약 50 mL로 농축되었다. 그 후에, 에틸 에테르 (300 mL)가 첨가되었고 혼합물은 15 분 동안 0 ℃에서 교반되었다. 침전된 생성물은 여과되었고 감압 하에서 건조되었다. 상기 구조에서 변수 (m)는 5,000 달톤의 중합체 중량을 제공하는 숫자이다. 수득량: 11.7 g. NMR (d6-DMSO): 1.17 ppm (t,-CH3, 에틸 (케탈), 6H), 1.31 ppm(s,-CH 3 -C-CH20-, 3H), 3.51 ppm (s, 중합체 골격), 4.57 ppm (t-OH,1H).
리소자임의 PEG화
리소자임 (3.0 mg)이 1 mL의 20 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 5.0)에 용해되었고, PEG (5K Da)-α-하이드록시-ω-2-프로파논 디에틸 케탈 (21 mg, 20 배 몰 과량)이 첨가되었다. 15 분 후에, 0.159 M의 NaCNBH3 (66 ㎕, 50 배 몰 과량) 용액이 첨가되었고 용액은 상온에서 20 시간 동안 교반되었다. SDS-PAGE에 의한 반응 혼합물의 분석은 PEG화된 리소자임이 형성되었음을 보여준다.
본 실시예는 다른 크기의 PEG (5K Da)-α-하이드록시-ω-2-프로파논 디에틸 케탈을 이용하여 여러 번 반복되었다. 하기의 다른 크기의 PEG-α-하이드록시-ω-2-프로파논 디에틸 케탈이 사용되었다: PEG (2K Da)-α-하이드록시-ω-2-프로파논 디에틸 케탈; PEG (10K Da)-α-하이드록시-ω-2-프로파논 디에틸 케탈; PEG (20K Da)-α-하이드록시-ω-2-프로파논 디에틸 케탈 및 PEG (40K Da)-α-하이드록시-ω-2-프로파논 디에틸 케탈. 각 경우에 있어서, PEG (5K)-α-하이드록시-ω-2-프로파논 디에틸 케탈에서 얻어진 것과 유사한 결과가 얻어졌다.
실시예 10
중합체-EPO 콘쥬게이트의 제조-EPO의 랜덤 PEG화
재조합 에리스로포이에틴, "EPO" (대장균에서 생산, 중국 햄스터 난소 세포와 같은 포유류 세포 또는 다른 소스)는 mPEG(5K)-메틸 케톤 (실시예 2에서 제조된)에 커플링되었다.
EPO (~2 mg)는 1 ml의 50 mM 포스페이트 버퍼 (pH 7.6)에 용해되고 mPEG (5K)-메틸 케톤이 5X 몰 EPO 농도에 첨가되었다. 환원제, NaCNBH3가 첨가되었고 용액은 아민 결합을 통하여 mPEG (5K)-메틸 케톤 시약을 단백질에 커플링시키기 위하여 상온에서 24 시간 동안 교반되었다.
반응 혼합물은 PEG화 정도를 결정하기 위하여 SDS-PAGE로 분석되었다. 1-머, 2-머 등의 PEG화 정도의 확인은 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight) 질량 분석기에 의해 이루어졌다. 천연 및 모노PEG화된 종들을 위한 피크들은 약 5,000 달톤 차이가 있다. 결과 반응 혼합물은 천연 및 모노PEG화된 단백질의 혼합물을 포함한다. 단백질에 대한 PEG 시약 비율의 증가는 폴리PEG화의 정도, 즉 2-머, 3-머 등의 형성을 증가시킨다.
상기는 PEG화된 EPO 생성물의 분포를 생산하는 본 발명의 실례의 단백질의 랜덤 PEG화를 보여준다. 바람직한 경우, 하기에서 설명할 바와 같이, 반응 혼합물은 또한 분리되어 개별 이성질체로 동정될 수 있다.
다른 분자량을 갖는 PEG 콘쥬게이트는 겔 여과 크로마토그래피에 의해 분리된다. 다른 PEG 콘쥬게이트 (1-머, 2-머, 3-머 등)는 그들의 분자량 (이 경우, 약 5,000 달톤 다른) 기초하여 분류된다. 상세하게는, 분리는 예를 들어, 슈퍼덱스™ 200 컬럼 (아메르샴 바이오사이언스)과 같은 측정된 분자량 범위에서 생성물의 효과적인 분리에 적합한 일련의 컬럼 시스템을 이용하여 수행된다. 생성물은 10 ml 아세테이트 버퍼로 1.5 ml/분으로 용출된다. 수집된 분획 (1 ml)은 단백질 함량을 위하여 280 nm에서 OD에 의해, 그리고 PEG 함량 (Sims et al. (1980) Anal.Bioche771. 107: 60-63)을 위한 요오드 테스트를 이용하여 분석된다. 게다가, 결과는 SDS-PAGE 겔에 전개시키고 바륨 요오다이드로 스테이닝하여 시각화할 수 있다. 용출된 피크에 상응하는 분획은 수집되고, 맴브레인을 이용한 초여과에 의해 농축되며 동결건조된다. 상기 방법은 같은 분자량의 콘쥬게이트는 분리/정제하나, 같은 분자량이나 다른 PEG화 자리 (즉, 위치 이성질체)를 갖는 콘쥬게이트의 분리를 제공하지는 않는다.
위치 이성질체의 분리는 RP-HPLC C18 컬럼 (아메르샴 바이오사이언스 또는 비닥)을 이용한 역상 크로마토그래피에 의해 수행된다. 이 과정은 같은 분자량의 PEG-생분자 이성질체 (위치 이성질체)를 분리하는데 효과적이다. 역상 크로마토그래피는 RP-HPLC C18 예비 컬럼을 이용하여 수행되고 물/0.05% TFA (용출액 A) 및 아세토니트릴/0.05% TFA (용출액 B)의 구배로 용출된다.
용출된 피크에 상응하는 분획은 수집되고, 증발되어 아세토니트릴 및 TFA를 제거하고, 용매를 제거하여 개별 위치 PEG-이성질체를 동정한다.
실시예 11
중합체-EPO 콘쥬게이트의 제조- EPO의 N-말단 PEG화
재조합 에리스로포이에틴, "EPO" (대장균에서 생산, 중국 햄스터 난소 세포와 같은 포유류 세포 또는 다른 소스)는 mPEG(5K)-메틸 케톤 (실시예 2에서 제조된)에 커플링되었다.
EPO (~2 mg)는 1 ml의 0.1 mM 소디움 아세테이트 (pH 5)에 용해되고 mPEG (5K)-메틸 케톤이 5X 몰 EPO 농도에 첨가되었다. 환원제, NaCNBH3가 첨가되었고 용액은 아민 결합을 통하여 mPEG (5K)-메틸 케톤 시약을 단백질에 커플링시키기 위하여 4 ℃에서 24 시간 동안 교반되었다.
반응 혼합물은 PEG화 정도를 결정하기 위하여 SDS-PAGE로 분석되었다. 1-머, 2-머 등의 PEG화 정도의 확인은 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight) 질량 분석기에 의해 이루어졌다. 천연 및 모노PEG화된 종들을 위한 피크들은 약 5,000 달톤 차이가 있다. 결과 반응 혼합물은 주로 천연 및 모노PEG화된 단백질의 혼합물을 포함한다. 모노PEG화된 종들은 유리 EPO 및 고분자량 종들을 제거하기 위하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된다.
N-말단 PEG화의 확인은 펩티드 맵핑에 의해 수행된다. 단백질에 대한 PEG의 비율의 증가는 폴리PEG화된 단백질을 생산하는, PEG화 정도를 증가시킨다.
상기는 우세하게 N-말단 단일 PEG화된 단백질을 생산하는 본 발명의 실례의 단백질의 PEG화를 보여준다.
실시예 12
GCSF의 N-말단 PEG화
재조합 과립구 콜로니 자극 요소, "GCSF" (대장균에서 생산, 중국 햄스터 난소 세포와 같은 포유류 세포 또는 다른 소스)는 mPEG(5K)-메틸 케톤 (실시예 8에서 제조된)에 커플링되었다.
GCSF (~2 mg)는 1 ml의 0.1 mM 소디움 아세테이트 (pH 5)에 용해되고 mPEG (5K)-메틸 케톤 (실시예 2에서 제조된)이 5X 몰 GCSF 농도에 첨가되었다. 환원제, NaCNBH3가 첨가되었고 용액은 아민 결합을 통하여 mPEG (5K)-메틸 케톤 시약을 단백질에 커플링시키기 위하여 4 ℃에서 24 시간 동안 교반되었다.
반응 혼합물은 PEG화 정도를 결정하기 위하여 SDS-PAGE로 분석되었다. 1-머, 2-머 등의 PEG화 정도의 확인은 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight) 질량 분석기에 의해 이루어졌다. 천연 및 모노PEG화된 종들을 위한 피크들은 약 5,000 달톤 차이가 있다. 결과 반응 혼합물은 주로 천연 및 모노PEG화된 GCSF의 혼합물을 포함한다. 모노PEG화된 종들은 유리 GCSF 및 고분자량 종들을 제거하기 위하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된다. N-말단 PEG화의 확인은 펩티드 맵핑에 의해 수행된다. 단백질에 대한 PEG의 비율의 증가는 폴리PEG화된 단백질을 생산하는, PEG화 정도를 증가시킨다.
실시예 13
인터페론-α의 N-말단 PEG화
재조합 인터페론-알파, "IFN-α" (대장균에서 생산, 중국 햄스터 난소 세포와 같은 포유류 세포 또는 다른 소스)가 mPEG(5K)-메틸 케톤 (실시예 8에서 제조된)에 커플링되었다.
IFN-α (~2 mg)는 1 ml의 0.1 mM 소디움 아세테이트 (pH 5)에 용해되고 mPEG (5K)-메틸 케톤이 5X 몰 IFN-α 농도에 첨가되었다. 환원제, NaCNBH3가 첨가되었고 용액은 아민 결합을 통하여 mPEG (5K Da)-메틸 케톤 시약을 단백질에 커플링시키기 위하여 4 ℃에서 24 시간 동안 교반되었다.
반응 혼합물은 PEG화 정도를 결정하기 위하여 SDS-PAGE로 분석되었다. 1-머, 2-머 등의 PEG화 정도의 확인은 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight) 질량 분석기에 의해 이루어졌다. 천연 및 모노PEG화된 종들을 위한 피크들은 약 5,000 달톤 차이가 있다. 결과 반응 혼합물은 주로 천연 및 모노PEG화된 단백질의 혼합물을 포함한다. 모노PEG화된 종들은 유리 IFN-α 및 고분자량 종들을 제거하기 위하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된다. N-말단 PEG화의 확인은 펩티드 맵핑에 의해 수행된다. 단백질에 대한 PEG의 비율의 증가는 폴리PEG화된 IFN-α를 생산하는, PEG화 정도를 증가시킨다.
실시예 14
인간 성장 호르몬의 N-말단 PEG화
재조합 인간 성장 호르몬, "hGH" (대장균에서 생산, 중국 햄스터 난소 세포와 같은 포유류 세포 또는 다른 소스)가 mPEG2 (40K Da)-케톤 (실시예 7에서 제조된)에 커플링되었다.
hGH (~2 mg)는 1 ml의 0.1 mM 소디움 아세테이트 (pH 5)에 용해되고 mPEG2 (40K Da)-케톤이 5X 몰 hGH 농도에 첨가되었다. 환원제, NaCNBH3의 5 내지 20-배 몰 과량이 첨가되었고 용액은 아민 결합을 통하여 mPEG2 (40KDa)-케톤 시약을 단백질에 커플링시키기 위하여 4 ℃에서 24 시간 동안 교반되었다.
반응 과정은 PEG화 정도를 결정하기 위하여 SDS-PAGE 또는 MALDI-TOF 질량 분석기로 분석되었다. 1-머, 2-머 등의 PEG화 정도의 확인은 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight) 질량 분석기에 의해 이루어졌다. 천연 및 모노PEG화된 및 다른 종들을 위한 피크들은 약 40,000 달톤 차이가 있다. 결과 반응 혼합물은 주로 천연 및 모노PEG화된 단백질의 혼합물을 포함한다. 모노PEG화된 종들은 유리 hGH 및 고분자량 종들을 제거하기 위하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된다. N-말단 PEG화의 확인은 펩티드 맵핑에 의해 수행된다. 단백질에 대한 mPEG2 (40K)-케톤의 비율의 증가는 폴리PEG화된 hGH의 개체군을 생산하는, PEG화 정도를 증가시킨다.
실시예 15
인터페론-β의 N-말단 PEG화
재조합 인터페론-베타, "IFN-β" (대장균에서 생산, 중국 햄스터 난소 세포와 같은 포유류 세포 또는 다른 소스)가 mPEG2 (40K Da)-케톤 (실시예 7에서 제조된)에 커플링되었다.
IFN-β (~2 mg)는 1 ml의 0.1 mM 소디움 아세테이트 (pH 5)에 용해되고 mPEG2 (40K Da)-케톤이 5X 몰 IFN-β 농도에 첨가되었다. 환원제, NaCNBH3의 5 내지 20-배 몰 과량이 첨가되었고 용액은 아민 결합을 통하여 mPEG2 (40K Da)-케톤 시약을 단백질에 커플링시키기 위하여 4 ℃에서 24 시간 동안 교반되었다.
반응 과정은 PEG화 정도를 결정하기 위하여 SDS-PAGE 또는 MALDI-TOF 질량 분석기로 분석되었다. 1-머, 2-머 등의 PEG화 정도의 확인은 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight) 질량 분석기에 의해 이루어졌다. 천연 및 모노PEG화된 및 다른 종들을 위한 피크들은 약 40,000 달톤 차이가 있다. 결과 반응 혼합물은 주로 천연 및 모노PEG화된 단백질의 혼합물을 포함한다. 모노PEG화된 종들은 유리 IFN-β 및 고분자량 종들을 제거하기 위하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된다. N-말단 PEG화의 확인은 펩티드 맵핑에 의해 수행된다. 단백질에 대한 mPEG2 (40K)-케톤의 비율의 증가는 폴리PEG화된 IFN-β의 개체군을 생산하는, PEG화 정도를 증가시킨다.
실시예 16
FSH의 N-말단 PEG화
재조합 여포 자극 호르몬, "FSH" (대장균에서 생산, 중국 햄스터 난소 세포와 같은 포유류 세포 또는 다른 소스)가 mPEG2 (40K Da)-케톤 (실시예 7에서 제조된)에 커플링되었다.
FSH (~2 mg)는 1 ml의 0.1 mM 소디움 아세테이트 (pH 5)에 용해되고 mPEG2 (40K Da)-케톤이 5X 몰 FSH 농도에 첨가되었다. 환원제, NaCNBH3의 5 내지 20-배 몰 과량이 첨가되었고 용액은 아민 결합을 통하여 mPEG2 (40K Da)-케톤 시약을 단백질에 커플링시키기 위하여 4 ℃에서 24 시간 동안 교반되었다.
반응 과정은 PEG화 정도를 결정하기 위하여 SDS-PAGE 또는 MALDI-TOF 질량 분석기로 분석되었다. 1-머, 2-머 등의 PEG화 정도의 확인은 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight) 질량 분석기에 의해 이루어졌다. 천연 및 모노PEG화된 및 다른 종들을 위한 피크들은 약 40,000 달톤 차이가 있다. 결과 반응 혼합물은 주로 천연 및 모노PEG화된 단백질의 혼합물을 포함한다. 모노PEG화된 종들은 유리 FSH 및 고분자량 종들을 제거하기 위하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된다. N-말단 PEG화의 확인은 펩티드 맵핑에 의해 수행된다. 단백질에 대한 mPEG2 (40K Da)-케톤의 비율의 증가는 폴리PEG화된 FSH의 개체군을 생산하는, PEG화 정도를 증가시킨다.
실시예 17
hGH의 N-말단 PEG화
재조합 인간 성장 호르몬 hGH (대장균에서 생산, 중국 햄스터 난소 세포와 같은 포유류 세포 또는 다른 소스)가 PEG(5K Da)-디에틸 케탈 (실시예 9에서 제조된)에 커플링되었다.
hGH (~2 mg)는 1 ml의 0.1 mM 소디움 아세테이트 (pH 5)에 용해되고 PEG(5K Da)-디에틸 케탈이 5X 몰 hGH 농도에 첨가되었다. 환원제, NaCNBH3의 5 내지 20-배 몰 과량이 첨가되었고 용액은 아민 결합을 통하여 PEG(5K Da)-디에틸 케탈 시약을 단백질에 커플링시키기 위하여 4 ℃에서 24 시간 동안 교반되었다.
반응 과정은 PEG화 정도를 결정하기 위하여 SDS-PAGE 또는 MALDI-TOF 질량 분석기로 분석되었다. 1-머, 2-머 등의 PEG화 정도의 확인은 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight) 질량 분석기에 의해 이루어졌다. 천연 및 모노PEG화된 및 다른 종들을 위한 피크들은 약 5,000 달톤 차이가 있다. 특히, PEG(5K)-디에틸 케탈 시약 때문에, 결과 반응 혼합물은 주로 천연 및 모노PEG화된 단백질의 혼합물을 포함한다. 모노PEG화된 종들은 유리 hGH 및 고분자량 종들을 제거하기 위하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된다. N-말단 PEG화의 확인은 펩티드 맵핑에 의해 수행된다.
실시예 18
암포테리신 B의 PEG화
작은 분자, 암포테리신 B의 아미노기는 mPEG(2K Da)-메틸 케톤의 결합에 의해 변형된다.
탈이온수 속의 암포테리신 B HCl 용액에 pH 6.5에서 0.1 M 포스페이트 버퍼에 용해된 2-배 몰 과량의 mPEG (2K Da)-메틸 케톤 (실시예 1)을 첨가하였다. 혼합물에 pH 6.5 포스페이트 버퍼 속의 NaCNBH3 용액 (1.5 내지 10-배 몰 과량)을 첨가하였고, 결과 용액은 아르곤 분위기 하의 상온에서 밤새 교반되었다.
반응 혼합물의 분취물은 1H NMR에 의한 반응의 진행을 모니터하기 위하여 다양한 시간 간격에서 회수된다. 완성되면, 반응 혼합물은 물을 첨가하여 또한 희석되고 NaCl이 포화를 달성하기 위하여 첨가된다. 그리고 나서, 생성물은 디클로로메탄으로 추출되고, 결합된 유기 추출물은 무수 소디움 설페이트로 건조되고, 건조제를 제거하기 위하여 여과되고, 용매는 로터리 증발에 의해 증발된다. 그리고 나서, 생성물은 디메틸 에테르의 첨가에 의해 침전되고 진공 하에서 밤새 건조된다. 회수된 생성물은 콘쥬게이션의 정도를 결정하기 위하여 겔 침투 크로마토그래피로 분석된다.
조생성물은 프로스 50 HS 양이온 교환 수지 (펄셉티브 바이오시스템즈, 프라밍함, MA)를 이용한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된다. 탈이온수로 컬럼을 세척한 후에, 생성물은 1N NaCl 용액으로 용출된다. 추출물을 포함하는 콘쥬게이트는 결합되고, 생성물은 디클로로메탄으로 추출된다. 유기 용액은 무수 소디움 설페이트로 건조되고, 여과되며, 용매는 로터리 증발에 의해 증발된다. 정제된 콘쥬게이트는 디에틸 에테르의 첨가로 정제된다.
필요한 경우, 생성물은 베타실 C18 컬럼 (키스톤 사이언티픽)을 이용한 역상 HPLC 크로마토그래피에 의해 또한 정제된다.

Claims (186)

  1. 관능기 및 중량 평균 분자량이 2,200 초과인 수용성 중합체 단편(segment)을 함유하는 중합체성 시약으로서, 상기 관능기가 직접적 공유 결합 또는 하나 이상의 원자에 의해 상기 수용성 중합체 단편에 결합되어 있고, 나아가 (a) 상기 관능기를 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군에서 선택하고, (b) 상기 중합체성 시약이 각각 하기를 함유하지 않으며: 방향족 부분; 프롤린 잔기; 시클릭 디엔온, 탄소수 8 이상의 포화 탄화수소 사슬; 및 ONH2 기, 단, 상기 중합체성 시약은
    가 아닌 것인 중합체성 시약.
  2. 제 1 항에 있어서, 수용성 중합체 단편이 폴리(에틸렌 글리콜)인 중합체성 시약.
  3. 제 2 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)이 히드록시, 알콕시, 치환 알콕시, 알케녹시, 치환 알케녹시, 알키녹시, 치환 알키녹시, 및 치환 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택된 말단-캡핑 부분으로 말단 캡핑된 중합체성 시약.
  4. 제 2 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)이 메톡시로 말단 캡핑된 중합체성 시약.
  5. 제 2 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 명목 평균 분자량이 약 2,500 달톤 내지 약 100,000 달톤인 중합체성 시약.
  6. 제 5 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 명목 평균 분자량이 약 4,900 달톤 내지 약 40,000 달톤인 중합체성 시약.
  7. 제 6 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 명목 평균 분자량이 약 9,900 달톤 내지 약 25,000 달톤인 중합체성 시약.
  8. 제 2 항에 있어서, 관능기가 케톤인 중합체성 시약.
  9. 제 2 항에 있어서, 관능기가 케톤 히드레이트인 중합체성 시약.
  10. 제 2 항에 있어서, 관능기가 헤미케탈인 중합체성 시약.
  11. 제 2 항에 있어서, 관능기가 케탈인 중합체성 시약.
  12. 제 2 항에 있어서, 임의의 할로겐 원자가 결여된 중합체성 시약.
  13. 제 2 항에 있어서, 메틸기가 관능기에 대하여 알파 또는 베타인 중합체성 시약.
  14. 하기 구조를 포함하는 중합체성 시약:
    [식 중:
    POLY1은 -O-R7 로 정의되는 말단을 갖는 수용성 중합체 단편;
    (a)는 0 또는 1;
    (b)는 0 또는 1;
    X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기(electron-withdrawing group);
    (z)는 2 내지 7의 정수;
    각 R2 는 독립적으로 H 또는 비방향족 함유 유기 라디칼;
    각 R3 은 독립적으로 H 또는 비방향족 함유 유기 라디칼;
    R7은 H 또는 비방향족 함유 유기 라디칼;
    FG는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로부터 선택된 관능기; 및
    R1은 비방향족-함유 유기 라디칼이고;
    나아가, 부분은 임의로 하나 이상의 이중결합을 함유하며,
    단, 중합체성 시약이
    또는
    인 경우는 제외한다].
  15. 제 14 항에 있어서, 수용성 중합체 단편("POLY")이 폴리(에틸렌 글리콜)인 중합체성 시약.
  16. 제 15 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)이 -CH2CH2-(OCH2CH2)m-OCH2CH2- (식에서, (m)은 약 55 내지 약 3,000 임) 인 중합체성 시약.
  17. 제 15 항에 있어서, R7 이 9 개 이하의 탄소 원자를 포함하는 비방향족-함유 유기 라디칼인 중합체성 시약.
  18. 제 15 항에 있어서, R7 이 H 또는 메틸인 중합체성 시약.
  19. 제 15 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 명목 평균 분자량이 약 2,500 달톤 내지 약 100,000 달톤인 중합체성 시약.
  20. 제 19 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 명목 평균 분자량이 약 4,900 달톤 내지 약 40,000 달톤인 중합체성 시약.
  21. 제 20 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 명목 평균 분자량이 약 9,900 달톤 내지 약 25,000 달톤인 중합체성 시약.
  22. 제 15 항에 있어서, 관능기가 케톤인 중합체성 시약.
  23. 제 15 항에 있어서, 관능기가 케톤 히드레이트인 중합체성 시약.
  24. 제 15 항에 있어서, 관능기가 헤미케탈인 중합체성 시약.
  25. 제 15 항에 있어서, 관능기가 케탈인 중합체성 시약.
  26. 제 15 항에 있어서, 관능기가 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약.
  27. 제 15 항에 있어서, 할로겐 원자가 결여된 중합체성 시약.
  28. 제 15 항에 있어서, 각 R2 및 R3 이 H 인 중합체성 시약.
  29. 제 16 항에 있어서, FG 의 α탄소에 결합된 R2 가 알킬이고, 다른 모든 R2 는 H 이며, 각 R3 은 H 인 중합체성 시약.
  30. 제 15 항에 있어서, (a) 는 1 이고, X1 은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약:
  31. 제 15 항에 있어서, (b) 가 1 이고, EW1 은 -O-, -NH-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)-, -OC(O)-, -OC(O)-NH-, -NH-OC(O)-, -C(O)-, -C(S)-, 및 -C(OR)H- (식에서, OR 은 알콕시 또는 히드록시 치환기이다) 로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약.
  32. 제 15 항에 있어서, R1 이 메틸인 중합체성 시약.
  33. 제 15 항에 있어서, R1 이 -CH=CH2 인 중합체성 시약.
  34. 제 15 항에 있어서, 하기로 이루어진 군에서 선택된 중합체성 시약:
    [식에서, (m)은 약 3 내지 약 3000이다].
  35. 수용성 중합체 단편 및 관능기를 함유하는 중합체성 시약으로서, 상기 관능기는 환구조의 일부이고, 상기 환구조는 직접적 공유 결합 또는 하나 이상의 원자에 의해 상기 수용성 중합체 단편에 결합되어 있고, 상기 관능기는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군에서 선택되며, 나아가 상기 중합체성 시약은 시클릭 디엔온을 함유하지 않는 중합체성 시약.
  36. 제 35 항에 있어서, 하기 구조를 포함하는 중합체성 시약:
    [식 중:
    POLY1은 -O-R7과 같이 정의되는 말단을 갖는 수용성 중합체 단편;
    (a)는 0 또는 1;
    (b)는 0 또는 1;
    X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    (z)는 0 또는 양의 정수;
    각 R2 는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R3 은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼; 및
    R7은 H 또는 유기 라디칼이다].
  37. 제 35 항에 있어서, 하기 구조를 포함하는 중합체성 시약:
    [식 중:
    POLY1은 -O-R7과 같이 정의되는 말단을 갖는 수용성 중합체 단편;
    (a)는 0 또는 1;
    (b)는 0 또는 1;
    X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    (z)는 0 또는 양의 정수;
    각 R2 는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R3 은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼; 및
    R7은 H 또는 유기 라디칼이다].
  38. 제 36 항 또는 제 37 항에 있어서, 수용성 중합체 단편("POLY")이 폴리(에틸렌 글리콜)인 중합체성 시약.
  39. 제 35 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)이 -CH2CH2-(OCH2CH2)m-OCH2CH2- (식에서, (m)은 약 3 내지 약 3,000 임) 인 중합체성 시약.
  40. 제 38 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)이 분지인 중합체성 시약.
  41. 제 36 항 또는 제 37 항에 있어서, R7 이 9 개 이하의 탄소 원자를 함유한 비방향족 유기 라디칼인 중합체성 시약.
  42. 제 36 항 또는 제 37 항에 있어서, R7 이 H 또는 메틸인 중합체성 시약.
  43. 제 38 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 명목 평균 분자량이 약 2,500 달톤 내지 약 100,000 달톤인 중합체성 시약.
  44. 제 43 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 명목 평균 분자량이 약 4,900 달톤 내지 약 40,000 달톤인 중합체성 시약.
  45. 제 44 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 명목 평균 분자량이 약 9,900 달톤 내지 약 25,000 달톤인 중합체성 시약.
  46. 제 35 항에 있어서, 관능기가 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약.
  47. 제 35 항에 있어서, 할로겐 원자가 결여된 중합체성 시약.
  48. 제 36 항 또는 제 37 항에 있어서, 방향족 부분이 결여된 중합체성 시약.
  49. 제 36 항 또는 제 37 항에 있어서, 엔온이 결여된 중합체성 시약.
  50. 제 36 항 또는 제 37 항에 있어서, (z) 가 0 이고, (b) 가 1 이고, EW1 은 -O-, -NH-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)-, -OC(O)-, -OC(O)-NH-, -NH-OC(O)-, -C(O)-, -C(S)-, 및 -C(OR)H- (식에서, OR 은 알콕시 또는 히드록시 치환기이다) 로 이루어진 기에서 선택되는 중합체성 시약.
  51. 제 50 항에 있어서, EW1 은 -C(O)- 인 중합체성 시약.
  52. 제 35 항에 있어서, 환구조가 피페리디닐, 시클로헥실, 시클로펜틸, 비시클로[2,2,1]헵타닐, 비시클로[2,2,1]헥사닐, 비시클로[3,2,1]옥타닐, 비시클로[3,1,1]헵타닐, 비시클로[3,3,1]노나닐, 시클로부틸, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 이의 옥사 및 아자 형태, 및 임의의 상기 구조의 디옥사 및 디아자 형태로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약.
  53. 제 35 항에 있어서, 하기로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약:
    [식 중, (m)은 약 3 내지 약 3000이고, (a)는 0 또는 1 이고, (e)는 0 또는 1 이고, X1 은 존재하는 경우, 스페이서 부분이며, X3 은 존재하는 경우, 스페이서 부분이다].
  54. 하기 구조를 포함하는 중합체성 시약:
    [식 중:
    POLY1은 2,200 달톤 초과의 분자량을 갖는 수용성 중합체 단편;
    (a)는 0 또는 1;
    (b)는 0 또는 1;
    (c)는 0 또는 1;
    (d)는 0 또는 1;
    X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    X2는, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    EW2는, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    (z)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
    (y)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
    각 R2 는 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R3 은 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R4 는 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R5 는 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    FG-R1은 (i) R1 (식에서, R1은 유기 라디칼임)로 정의되는 말단을 갖는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기이거나, (ii) 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기가 환구조의 일부인 비(非)디엔온(nondienone) 환구조; 및
    FG-R6는 (i) R6 (식에서, R6는 유기 라디칼임)로 정의되는 말단을 갖는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기이거나, (ii) 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기가 환구조의 일부인 비디엔온 환구조이다].
  55. 제 54 항에 있어서, 수용성 중합체 단편("POLY1")이 폴리(에틸렌 글리콜)인 중합체성 시약.
  56. 제 55 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)이 -CH2CH2-(OCH2CH2)m-OCH2CH2- (식에서, (m)은 약 55 내지 약 3,000 임) 인 중합체성 시약.
  57. 제 55 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 명목 평균 분자량이 약 2,500 달톤 내지 약 100,000 달톤인 중합체성 시약.
  58. 제 57 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 명목 평균 분자량이 약 4,900 달톤 내지 약 40,000 달톤인 중합체성 시약.
  59. 제 58 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 명목 평균 분자량이 약 9,900 달톤 내지 약 25,000 달톤인 중합체성 시약.
  60. 제 55 항에 있어서, FG-R1 및 FG-R6 의 각 관능기가 케톤인 중합체성 시약.
  61. 제 55 항에 있어서, FG-R1 및 FG-R6 의 각 관능기가 케톤 히드레이트인 중합체성 시약.
  62. 제 55 항에 있어서, FG-R1 및 FG-R6 의 각 관능기가 헤미케탈인 중합체성 시약.
  63. 제 55 항에 있어서, FG-R1 및 FG-R6 의 각 관능기가 케탈인 중합체성 시약.
  64. 제 55 항에 있어서, FG-R1 및 FG-R6 의 각 관능기가 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 모노티오헤미케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약.
  65. 제 55 항에 있어서, 할로겐 원자가 결여된 중합체성 시약.
  66. 제 55 항에 있어서, 방향족 부분이 결여된 중합체성 시약.
  67. 제 55 항에 있어서, 각 (y) 및 (z) 가 1 내지 7의 양의 정수이고, 각 R2, R3, R4, 및 R5 가 H 인 중합체성 시약.
  68. 제 55 항에 있어서, 각 (y) 및 (z) 가 2 내지 7의 양의 정수인 중합체성 시약.
  69. 제 55 항에 있어서, 각 (y) 및 (z) 가 1 내지 7의 양의 정수이고, FG-R1 의 α탄소에 결합된 R2 가 알킬, -FG-R6 의 α탄소에 결합된 R4 가 알킬이고, 모든 다른 R2 및 R4 는, 존재하는 경우, H 이며, 각 R3 및 R5 는 H 인 중합체성 시약.
  70. 제 55 항에 있어서, 각 FG-R1 및 -FG-R6 이, R1 (식에서, R1 은 메틸 및 -CH=CH2 로부터 선택되는 유기 라디칼임) 로 정의되는 말단을 갖는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군에서 선택된 관능기인 중합체성 시약.
  71. 제 55 항에 있어서, 각 FG-R1 및 -FG-R6 이 비디엔온 환구조로서, 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군에서 선택된 관능기가 상기 환구조의 일부이고, 나아가 상기 환구조가 피페리디닐, 시클로헥실, 시클로펜틸, 비시클로[2,2,1]헵타닐, 비시클로[2,2,1]헥사닐, 비시클로[3,2,1]옥타닐, 비시클로[3,1,1]헵타닐, 비시클로[3,3,1]노나닐, 시클로부틸, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 이의 옥사 및 아자 형태, 및 임의의 상기 구조의 디옥사 및 디아자 형태로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약.
  72. 제 55 항에 있어서, (b) 및 (d) 가 각각 1 이고, EW1 이 -O-, -NH-, -NHC(O) -, -C(O)NH-, -OC(O)-, -OC(O)-, -OC(O)-NH-, -NH-OC(O)-, -C(O)-, -C(S)-, 및 -C(OR)H- (식에서, OR 은 알콕시 또는 히드록시 치환기)로 이루어진 군에서 선택되고, EW2 는 -O-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -OC(O)-, -OC(O)-, -NH-OC(O)-, -OC(O)-NH-, -C(O)-, -C(S)- 및 -C(OR)H- (식에서, OR 은 알콕시 또는 히드록시 치환기)로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약.
  73. 제 55 항에 있어서, 각 (a) 및 (c) 가 1 이고, X1이 하기로 이루어진 군에서 선택되고:
    X2가 하기로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약:
  74. 제 54 항에 있어서, 하기로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약:
    [식 중, (m)은 약 55 내지 약 3000이다].
  75. 제 1 수용성 중합체 단편, 제 1 수용성 중합체 단편, 제 2 수용성 중합체 단편 및 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기를 포함하는 중합체성 시약으로서, 상기 각각의 제 1 및 제 2 수용성 중합체 단편은 직접적 공유결합 또는 하나 이상의 원자에 의하여 상기 관능기에 부착되고, 나아가 상기 관능기가 케톤, 케톤 히드레이트, 헤미케탈 또는 케탈인 경우: (a) 상기 중합체성 시약은 방향족 부분이 없거나; 또는 (b) 상기 중합체성 시약에 있어서 각 수용성 중합체 단편의 중량 평균 분자량은 1000 달톤 이상인 중합체성 시약.
  76. 제 75 항에 있어서, 하기 구조를 포함하는 중합체성 시약:
    [식 중:
    POLY1은 제 1 수용성 중합체 단편;
    POLY2는 제 2 수용성 중합체 단편;
    (a)는 0 또는 1;
    (b)는 0 또는 1;
    (e)는 0 또는 1;
    (f)는 0 또는 1;
    X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    X3는, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    EW3는, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    (z)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
    (x)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
    각 R2 는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R3은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R8은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R9는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼; 및
    FG는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로부터 선택되는 관능기이다].
  77. 제 75 항에 있어서, 하기 구조를 포함하는 중합체성 시약:
    [식 중:
    POLY1은 제 1 수용성 중합체 단편;
    POLY2는 제 2 수용성 중합체 단편;
    (a)는 0 또는 1;
    (b)는 0 또는 1;
    X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    X4는 스페이서 부분;
    X5는 스페이서 부분;
    EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    (z)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
    각 R2는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R3은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    R15는 H 또는 비방해성 유기 라디칼; 및
    FG-R14는 (i) R14 (식에서, R14는 유기 라디칼임)로서 정의되는 말단을 갖는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기이거나, 또는 (ii) 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기가 환구조의 일부인 환구조이다].
  78. 제 65 항 또는 제 66 항에 있어서, 각 수용성 중합체 단편("POLY1" 및 "POLY2")이 폴리(에틸렌 글리콜)인 중합체성 시약.
  79. 제 78 항에 있어서, 각 폴리(에틸렌 글리콜)이 -CH2CH2-(OCH2CH2)m-OCH2CH2- (식에서, (m)은 약 25 내지 약 3,000 임) 인 중합체성 시약.
  80. 제 78 항에 있어서, 각 폴리(에틸렌 글리콜)이 히드록시, 알콕시, 치환 알콕시, 알케녹시, 치환 알케녹시, 알키녹시, 치환 알키녹시, 아릴옥시 및 치환 아릴옥시로 이루어진 군에서 선택된 말단-캡핑 부분으로 말단 캡핑된 중합체성 시약.
  81. 제 78 항에 있어서, 각 폴리(에틸렌 글리콜)이 알콕시로 말단 캡핑된 중합체성 시약.
  82. 제 78 항에 있어서, 각 폴리(에틸렌 글리콜)이 메톡시로 말단 캡핑된 중합체성 시약.
  83. 제 78 항에 있어서, 각 폴리(에틸렌 글리콜)이 히드록시로 말단 캡핑된 중합체성 시약.
  84. 제 78 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 명목 평균 분자량이 약 2,500 달톤 내지 약 100,000 달톤인 중합체성 시약.
  85. 제 84 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 명목 평균 분자량이 약 4,900 달톤 내지 약 40,000 달톤인 중합체성 시약.
  86. 제 85 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)의 명목 평균 분자량이 약 9,900 달톤 내지 약 25,000 달톤인 중합체성 시약.
  87. 제 78 항에 있어서, 할로겐 원자가 결여된 중합체성 시약.
  88. 제 78 항에 있어서, 방향족 부분이 결여된 중합체성 시약.
  89. 제 76 항에 있어서, 각 (x) 및 (z) 가 1 내지 7의 양의 정수이고, 각 R2, R3, R4, 및 R5 가 H 인 중합체성 시약.
  90. 제 76 항에 있어서, 각 (x) 및 (z) 가 2 내지 7의 양의 정수인 중합체성 시약.
  91. 제 76 항에 있어서, (b) 및 (e) 가 각각 1 이고, EW1 이 -O-, -NH-, -NHC(O) -, -C(O)NH-, -OC(O)-, -OC(O)-, -OC(O)-NH-, -NH-OC(O)-, -C(O)-, -C(S)-, 및 -C(OR)H- (식에서, OR 은 알콕시 또는 히드록시 치환기)로 이루어진 군에서 선택되고, EW2 는 -O-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -OC(O)-, -OC(O)-, -NH-OC(O)-, -OC(O)-NH-, -C(O)-, -C(S)- 및 -C(OR)H- (식에서, OR 은 알콕시 또는 히드록시 치환기)로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약.
  92. 제 76 항에 있어서, 각 (a) 및 (f) 가 1 이고, X1 이 하기로 이루어진 군에서 선택되고:
    X3 이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약:
  93. 제 76 항에 있어서, 관능기가 케톤인 중합체성 시약.
  94. 제 76 항에 있어서, 관능기가 케톤 히드레이트인 중합체성 시약.
  95. 제 76 항에 있어서, 관능기가 헤미케탈인 중합체성 시약.
  96. 제 76 항에 있어서, 관능기가 케탈인 중합체성 시약.
  97. 제 76 항에 있어서, 관능기가 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약.
  98. 제 76 항에 있어서, 하나 이상의 부가적 수용성 중합체 단편을 추가로 포함하는 중합체성 시약.
  99. 제 77 항에 있어서, (z) 가 1 내지 7의 양의 정수이고, 각 R2 및 R3 이 H 인 중합체성 시약.
  100. 제 77 항에 있어서, (z) 가 2 내지 7의 양의 정수인 중합체성 시약.
  101. 제 77 항에 있어서, (z) 가 1 내지 7의 양의 정수이고, FG-R14 의 α탄소에 결합된 R2 및 R4가 알킬이고, 모든 다른 R2 및 R4 는 H 이며, 각 R3 및 R5 는 H 인 중합체성 시약.
  102. 제 77 항에 있어서, (b)가 1 이고, EW1 이 -O-, -NH-, -NHC(O) -, -C(O)NH-, -OC(O)-, -OC(O)-, -OC(O)-NH-, -NH-OC(O)-, -C(O)-, -C(S)-, 및 -C(OR)H- (식에서, OR 은 알콕시 또는 히드록시 치환기)로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약.
  103. 제 77 항에 있어서, (a)가 1 이고, 각 X1 및 X4 가 독립적으로 하기로 이루어진 군에서 선택되고:
    X5 가 하기로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약:
  104. 제 77 항에 있어서, 이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약:
    [식 중, 각 경우마다:
    POLY1, POLY2 는 상기 정의한 바와 같고;
    (d)는 0 내지 3; 및
    (e)는 0 내지 3이다].
  105. 제 77 항에 있어서, FG-R14 가, R1 (식에서, R1 은 메틸 및 -CH=CH2 로부터 선택되는 유기 라디칼임) 로 정의되는 말단을 갖는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군에서 선택된 관능기인 중합체성 시약.
  106. 제 77 항에 있어서, FG-R14 가 환구조로서, 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군에서 선택된 관능기가 상기 환구조의 일부이고, 나아가 상기 환구조가 피페리디닐, 시클로헥실, 시클로펜틸, 비시클로[2,2,1]헵타닐, 비시클로[2,2,1]헥사닐, 비시클로[3,2,1]옥타닐, 비시클로[3,1,1]헵타닐, 비시클로[3,3,1]노나닐, 시클로부틸, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 이의 옥사 및 아자 형태, 및 임의의 상기 구조의 디옥사 및 디아자 형태로 이루어진 군에서 선택되는 중합체성 시약.
  107. 제 106 항에 있어서, 하기로 이루어진 군에서 선택된 중합체성 시약:
    [식에서, (m)은 약 25 내지 약 3000 이고, POLY1, POLY2, X4 및 X5 는 앞서 정의한 바와 같다].
  108. 제 77 항에 있어서, 하나 이상의 부가적 수용성 중합체 단편을 추가로 포함하는 중합체성 시약.
  109. 제 74 항에 있어서, 하기 구조를 갖는 중합체성 시약:
    [식에서, (m)은 약 25 내지 약 3000 이고, (a) 는 0 또는 1, (e) 는 0 또는 1 이고, X1 는, 존재하는 경우 스페이서 부분이고, X3 는, 존재하는 경우 스페이서 부분이다].
  110. 수용성 중합체 단편을 함유하는 중합체성 시약으로서, 관능기가 직접적 공유 결합 또는 하나 이상의 원자에 의해 상기 수용성 중합체 단편에 결합되어 있고, 나아가 (a) 상기 관능기가 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군에서 선택하고, (b) 상기 중합체성 시약이 탄소수 8 이상의 포화 탄화수소 사슬을 함유하지 않는 중합체성 시약.
  111. 하기 구조로 이루어진 중합체성 시약을 포함하는 중합체성 시약 조성물로서:
    [식 중:
    (a)는 0 또는 1;
    (b)는 0 또는 1;
    X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    (z)는 1 내지 8;
    각 R2 는 독립적으로 H 또는 비방향족 함유 유기 라디칼;
    각 R3 은 독립적으로 H 또는 비방향족 함유 유기 라디칼; 및
    (m)은 11 내지 약 3000이다],
    상기 조성물에는 실질적으로 산화부산물, β-케토 에스테르,
    및
    의 케탈 유도체가 없는 중합체성 시약 조성물.
  112. 제 111 항에 있어서, 각 R2 및 R3 이 H 인 조성물.
  113. 제 111 항에 있어서, 카르보닐 탄소의 α탄소에 결합된 R2 가 알킬이고, 다른 모든 R2 는 H 이며, 각 R3 은 H 인 조성물.
  114. 제 111 항에 있어서, (a)가 1 이고, X1 이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 조성물:
  115. 제 111 항에 있어서, (b)가 1 이고, EW1 이 -NH-, -NHC(O)-, -C(O)NH-, -OC(O)-, -C(O)O-, -C(O)- 및 -C(S)-로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
  116. 제 111 항에 있어서, (m) 이 약 25 내지 약 3000 인 조성물.
  117. 제 116 항에 있어서, (m) 이 약 50 내지 약 3000 인 조성물.
  118. 제 117 항에 있어서, (m) 이 약 100 내지 약 3000 인 조성물.
  119. 제 118 항에 있어서, (m) 이 약 225 내지 약 3000 인 조성물.
  120. 제 110 항에 있어서, 중합체성 시약의 케톤 히드레이트 형태를 추가로 포함하는 조성물.
  121. 하기 단계를 포함하는 중합체성 시약의 제조 방법:
    (i) 중합을 개시하기에 적합한 하나 이상의 활성 음이온성 부위, 및 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 전구체 분자를 제공하는 단계;
    (ii) 상기 전구체 분자의 음이온성 부위를 중합이 가능한 반응성 단량체와 접촉시킴으로써 반응성 단량체의 전구체 분자로의 중합을 개시하는 단계;
    (iii) 추가적인 반응성 단량체를 상기 전구체 분자에 첨가하여 하나 이상의 중합체 사슬을 형성하는 단계;
    (iv) 상기 하나 이상의 중합체 사슬이 원하는 길이에 도달할 때까지 상기 첨가를 계속하는 단계;
    (v) 반응을 종료함으로써 상기 관능기 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 중합체성 시약을 수득하는 단계; 및
    (vi) 임의로, 상기 관능기가 보호된 형태일 때, 관능기의 보호기를 제거하는 단계.
  122. 제 121 항에 있어서, 전구체 분자가 하기 구조를 포함하는 방법:
    [식 중:
    (a)는 0 또는 1;
    (b)는 0 또는 1;
    (e)는 0 또는 1;
    (f)는 0 또는 1;
    X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    X3는, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    EW3는, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    (z)는 0 또는 1 내지 8의 정수;
    (x)는 0 또는 1 내지 8의 정수;
    각 R2 는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R3 은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R8 은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R9 는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼; 및
    pFG는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로부터 선택되는 관능기 또는 이의 보호된 형태이다].
  123. 제 121 항에 있어서, 전구체 분자가 하기 구조를 포함하는 방법:
    [식 중:
    (a)는 0 또는 1;
    (b)는 0 또는 1;
    X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    (z)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
    각 R2 는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R3 은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    pFG-R1은 (i) R1 (식에서, R1은 유기 라디칼임)로 정의되는 말단을 갖는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈 또는 상기 임의의 화합물의 보호 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기이거나, (ii) 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기가 환구조의 일부인 환구조이다].
  124. 제 121 항에 있어서, 전구체 분자가 하기로 이루어진 군에서 선택되는 방법:
  125. 제 121 항에 있어서, 반응성 단량체가 에틸렌 옥시드인 방법.
  126. 제 121 항에 있어서, 친전자 반응성(electrophilically reactive) 중합체를 수용성 중합체 단편의 말단에 부착하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  127. 제 121 항에 있어서, 관능기가 보호된 형태로 존재하고, 임의의 보호기 제거 단계를 수행하는 방법.
  128. 하기 단계를 포함하는 중합체성 시약의 제조 방법:
    (i) 보호된 2차 알콜 또는 티올 및 중합을 개시하기에 적합한 하나 이상의 음이온성 부위로 이루어진 전구체 분자를 제공하는 단계;
    (ii) 상기 전구체 분자의 음이온성 부위를 중합이 가능한 반응성 단량체와 접촉시킴으로써 반응성 단량체의 전구체 분자로의 중합을 개시하는 단계;
    (iii) 추가적인 반응성 단량체를 전구체 분자에 첨가하여 하나 이상의 중합체 사슬을 형성하는 단계;
    (iv) 상기 하나 이상의 중합체 사슬이 원하는 길이에 도달할 때까지 상기 첩촉을 계속하는 단계;
    (v) 반응을 종료함으로써 보호된 2차 알콜 또는 티올로 이루어진 중간체를 수득하는 단계;
    (vi) 상기 중간체의 보호된 2차 알콜 또는 티올의 보호기를 제거하여 비보호 2차 알콜 또는 티올을 형성하는 단계;
    (vii) 비보호 2차 알콜 또는 티올을 산화시켜, 상기 전구체 분자가 2차 알콜로 이루어진 경우에는 케톤으로 이루어진 중합체성 시약을 수득하거나, 또는 상기 전구체 분자가 2차 티올로 이루어진 경우에는 티온으로 이루어진 중합체성 시약을 수득하는 단계; 및
    (viii) 임의로, 상기 케톤 또는 티온을 추가적으로 개질시켜 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기를 수득하는 단계.
  129. 제 128 항에 있어서, 전구체 분자가 하기 구조로 이루어진 방법:
    [식 중:
    (a)는 0 또는 1;
    (b)는 0 또는 1;
    (e)는 0 또는 1;
    (f)는 0 또는 1;
    X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    X3는, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    EW3는, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    (z)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
    (x)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
    각 R2 는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R3 은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R8 은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R9 는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼; 및
    Y 는 O 또는 S 이고
    pg 는 Y 가 O 인 경우 2차 알콜의 보호기이고, Y 가 S 인 경우 2차 티올의 보호기이다].
  130. 제 128 항에 있어서, 전구체 분자가 하기 구조로 이루어진 방법:
    [식 중:
    (a)는 0 또는 1;
    (b)는 0 또는 1;
    X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    (z)는 0 또는 1 내지 8의 정수;
    각 R2 는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R3 은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    Y 는 O 또는 S;
    pg 는 Y 가 O 인 경우 2차 알콜의 보호기이고, Y 가 S 인 경우 2차 티올의 보호기이고;
    C-R1은 (i) R1 (식에서, R1은 유기 라디칼임)로 정의되는 말단을 갖는 탄소 원자, 또는 (ii) 환구조이다].
  131. 제 128 항에 있어서, 보호된 2차 알코올 또는 티올이, 벤질 에테르, 메티옥시메틸 에테르 (MOM), 메틸티오메틸 에테르 (MTM), 테트라히드로피라닐 에테르 (THP), 4-메톡시테트라히드로피라닐 에테르, 테트라히드로퓨라닐 에테르, 1-에톡시에틸 에테르, 1-메틸-1-메톡시에틸 에테르, 2-(페닐셀레닐)에틸 에테르, 알릴 에테르, o-니트로벤질 에테르, 트리페닐메틸 에테르, α-나프틸디페닐메틸 에테르, p-메티옥시페닐디페닐메틸 에테르, 9-(9-페닐-10-옥소)안트릴 에테르 (트리틸론), 이소프로필디메틸실릴 에테르, t-부틸디메틸실릴 에테르 (TBDMS), 트리벤질실릴 에테르, 및 트리이소프로필실릴 에테르로 이루어진 군에서 선택된 보호기에 의해 보호되는 방법.
  132. 제 131 항에 있어서, 보호기가 벤질 에테르인 방법.
  133. 제 128 항에 있어서, 반응성 단량체가 에틸렌 옥시드인 방법.
  134. 제 128 항에 있어서, 친전자 반응성 중합체를 수용성 중합체 단편의 말단에 부착하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  135. 제 128 항에 있어서, 보호기 제거 단계를 H2 및 금속의 존재하에서 수행하는 방법.
  136. 제 135 항에 있어서, 금속이 니켈, 플라티늄, 또는 납인 방법.
  137. 제 128 항에 있어서, 산화 단계를, KMnO4, MnO2, K2Cr2O7, CrO3, 피리디늄 클로로크로메이트, 피리디늄 플루오로크로메이트, 피리디늄 디크로메이트, RuO4, RuCl3, 테트라-n-프로필암모늄 퍼루테네이트, 디메틸 술폭시드, N-클로로숙신이미드, Ag2CO3, AG2O 및 Dess-Martin 퍼이오디난(periodinane) 시약으로 이루어진 군으로부터 선택된 시약으로 이루어진 산화 조건하에서 수행하는 방법.
  138. 하기 단계를 포함하는 중합체성 시약의 제조 방법:
    (i) 하나 이상의 이소시아네이트 부분 및 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기 또는 이의 보호된 형태로 이루어진 전구체 분자를 제공하는 단계; 및
    (ii) 적절한 조건하에서, 상기 전구체 분자 및 하나 이상의 히드록실기 또는 아민기를 갖는 수용성 중합체 단편을 접촉시킴으로써 상기 관능기 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 중합체성 시약을 형성하는 단계; 및
    (iii) 임의로, 상기 관능기가 보호된 형태일 때, 상기 관능기의 보호기를 제거하는 단계.
  139. 제 138 항에 있어서, 전구체 분자가 하기 구조를 포함하는 방법:
    [식 중:
    (a)는 0 또는 1;
    (b)는 0 또는 1;
    (e)는 0 또는 1;
    (f)는 0 또는 1;
    X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    X3는, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    EW3는, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    (z)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
    (x)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
    각 R2 는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R3 은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R8 은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R9 는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼; 및
    pFG는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로부터 선택된 관능기 또는 이의 보호된 형태이다].
  140. 제 138 항에 있어서, 전구체 분자가 하기 구조를 포함하는 방법:
    [식 중:
    (a)는 0 또는 1;
    (b)는 0 또는 1;
    X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    (z)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
    각 R2 는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R3 은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    pFG-R1은 (i) R1 (식에서, R1은 유기 라디칼임)로 정의되는 말단을 갖는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈 또는 상기 임의의 화합물의 보호 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기, 또는 (ii) 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기가 환구조의 일부인 환구조이다].
  141. 제 140 항에 있어서, 수용성 중합체 단편이 오직 하나의 말단 히드록실기만을 가짐으로써, 중합체성 시약에 단일 관능기 또는 이의 보호된 형태를 제공하는 방법.
  142. 제 140 항에 있어서, 수용성 중합체 단편이 두 개의 말단 히드록실기를 가짐으로써, 중합체성 시약에 두 개의 관능기 또는 이의 보호된 형태를 제공하는 방법.
  143. 제 138 항에 있어서, 관능기가 보호된 형태이고, 임의로 보호기 제거 단계를 수행하는 방법.
  144. 하기 단계를 포함하는 중합체성 시약의 제조 방법:
    (i) 하나 이상의 가용 친핵성기를 갖는 수용성 중합체 단편을 제공하는 단계;
    (ii) 하나 이상의 활성화기 및 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기 또는 이의 보호된 형태로 이루어진 전구체 분자를 제공하는 단계;
    (iii) 적절한 조건하에서, 상기 전구체 분자를 상기 수용성 중합체 단편과 접촉시킴으로써, 상기 관능기 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 중합체성 시약을 형성하는 단계; 및
    (iv) 임의로, 상기 관능기가 보호된 형태일 때, 상기 관능기의 보호기를 제거하는 단계.
  145. 제 144 항에 있어서, 하나 이상의 가용 친핵성기를 갖는 수용성 중합체 단편이 아민-말단의 폴리(에틸렌 글리콜)인 방법.
  146. 제 144 항에 있어서, 전구체 분자가 하기 구조를 포함하는 방법:
    [식 중:
    (a)는 0 또는 1;
    (b)는 0 또는 1;
    (e)는 0 또는 1;
    (f)는 0 또는 1;
    X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    X3는, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    EW3는, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    (z)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
    (x)는 0 또는 1 내지 7의 양의 정수;
    각 R2 는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R3 은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R8 은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R9 는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    pFG는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈인 관능기 또는 이의 보호된 형태이고,
    각 AC 는 활성화기이다].
  147. 제 144 항에 있어서, 전구체 분자가 하기 구조를 포함하는 방법:
    [식 중:
    (a)는 0 또는 1;
    (b)는 0 또는 1;
    X1은, 존재하는 경우, 스페이서 부분;
    EW1은, 존재하는 경우, 전자 흡인기;
    (z)는 0 또는 1 내지 8의 정수;
    각 R2 는, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    각 R3 은, 존재하는 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼;
    pFG-R1은 (i) R1 (식에서, R1은 유기 라디칼임)로 정의되는 말단을 갖는 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈 또는 상기 임의의 화합물의 보호 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기, 또는 (ii) 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기가 환구조의 일부인 환구조이고,
    AC 는 활성화기이다].
  148. 제 147 항에 있어서, 수용성 중합체 단편이 오직 하나의 말단 아민기만을 가짐으로써, 중합체성 시약에 단일 관능기 또는 이의 보호된 형태를 제공하는 방법.
  149. 제 147 항에 있어서, 수용성 중합체 단편이 두 개의 말단 아민기를 가짐으로써, 중합체성 시약에 두 개의 관능기 또는 이의 보호된 형태를 제공하는 방법.
  150. 제 144 항에 있어서, 관능기가 보호된 형태이고, 임의로 보호기 제거 단계를 수행하는 방법.
  151. 하기 단계를 포함하는 중합체성 시약의 제조 방법:
    (i) 하나 이상의 가용 이탈기를 갖는 수용성 중합체 단편을 제공하는 단계;
    (ii) 하나 이상의 친핵성기 및 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 관능기 또는 이의 보호된 형태로 이루어진 전구체 분자를 제공하는 단계;
    (iii) 적절한 조건하에서, 상기 전구체 분자를 상기 수용성 중합체 단편과 접촉시킴으로써, 상기 관능기 또는 이의 보호된 형태를 함유하는 중합체성 시약을 형성하는 단계; 및
    (iv) 임의로, 상기 관능기가 보호된 형태일 때, 상기 관능기의 보호기를 제거하는 단계.
  152. 제 151 항에 있어서, 이탈기가 1차 할로겐 또는 2차 할로겐인 방법.
  153. 제 151 항에 있어서, 이탈기가 술포네이트 에스테르인 방법.
  154. 제 153 항에 있어서, 술포네이트 에스테르가 메탄술포네이트, 트리플루오로메탄술포네이트, 트리클로로메탄술포테이트, 2,2,2-트리플루오로에탄술포네이트, 2,2,2-트리클로로에탄술포네이트, 노나플루오로부탄술포네이트, 파라-브로모벤젠술포네이트, 파라-니트로벤젠술포네이트, 및 파라-톨루엔술포네이트로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  155. 제 151 항에 있어서, 관능기가 보호된 형태이고, 임의로 보호기 제거 단계를 수행하는 방법.
  156. 하나 이상의 알콕시드 이온 또는 티올레이트 이온을 갖는 수용성 중합체 단편을, 하나 이상의 이탈기 및 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기 또는 이의 보호된 형태로 이루어진 전구체 분자와 반응시킴으로써, 중합체성 시약을 제공하는 단계를 포함하는 중합체성 시약의 제조 방법.
  157. 제 156 항에 있어서, 하나 이상의 알콕시드 이온 또는 티올레이트 이온을 갖는 수용성 중합체 단편을, 적절한 염기의 존재하에서 하나 이상의 히드록실기를 갖는 수용성 중합체를 결합함으로써 제조하는 방법.
  158. 제 157 항에 있어서, 적절한 염기를, 소디움, 소디움 히드록시드, 포타슘, 포타슘 히드록시드, 소디움 하이드라이드, 포타슘 하이드라이드, 소디움 메톡시드, 포타슘 메톡시드, 소디움 tert-부톡시드, 포타슘 tert-부톡시드, 소디움 카보네이트, 및 포타슘 카보네이트로 이루어진 군에서 선택하는 방법.
  159. 제 156 항에 있어서, 하나 이상의 알콕시드 이온 또는 티올레이트 이온을 갖는 수용성 중합체 단면을 중합 반응에 의해 제공하는 방법.
  160. 활성제의 질소 원자와 2차 탄소 원자 사이의 공유 결합을 포함하는 중합체-활성제 콘쥬게이트로서, 상기 2차 탄소 원자가 직접적으로 또는 하나 이상의 원자에 의해 수용성 중합체 단편에 부착된 콘쥬게이트.
  161. 제 160 항에 있어서, 2차 탄소 원자에 부착된 히드록실 부분이 결여된 콘쥬게이트.
  162. 제 160 항에 있어서, 2차 탄소 원자에 인접한 탄소 원자에 부착된 카르보닐 부분이 결여된 콘쥬게이트.
  163. 제 160 항에 있어서, (a) 2차 탄소 원자에 부착된 히드록실 부분, 및 (b) 2차 탄소 원자에 인접한 탄소 원자에 부착된 카르보닐 부분 모두가 결여된 콘쥬게이트.
  164. 제 160 항에 있어서, 메틸기가 2차 탄소 원자에 인접한 탄소에 부착된 콘쥬게이트.
  165. 제 160 항에 있어서, 수용성 중합체 단편이 분지인 콘쥬게이트.
  166. 제 160 항에 있어서, 직접적으로 또는 하나 이상의 원자에 의해 2차 탄소 원자에 부착된 제 2 수용성 중합체 단편을 포함하는 콘쥬게이트.
  167. 제 160 항에 있어서, 활성제가 폴리펩티드인 콘쥬게이트.
  168. 제 160 항에 있어서, 활성제가 폴리펩티드가 아닌 콘쥬게이트.
  169. 제 160 항의 콘쥬게이트 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 제제.
  170. 콘쥬게이션 조건하에, 활성제를, 직접적으로 또는 하나 이상의 원자에 의해, 케톤, 케톤 히드레이트, 티온, 모노티오히드레이트, 디티오히드레이트, 헤미케탈, 모노티오헤미케탈, 디티오헤미케탈, 케탈, 및 디티오케탈로 이루어진 군으로부터 선택된 관능기에 부착된 수용성 중합체 시약으로 이루어진 중합체 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는 중합체-활성제 콘쥬게이트의 제조 방법.
  171. 제 170 항에 있어서, 중합체성 시약이 제 1 항, 제 14 항, 제 35 항, 제 54 항, 제 75 항 및 제 110 항 중 어느 한 항에 포함되는 방법.
  172. 제 171 항에 있어서, 관능기가 케톤인 방법.
  173. 제 171 항에 있어서, 관능기가 케톤 히드레이트인 방법.
  174. 제 171 항에 있어서, 관능기가 헤미케탈인 방법.
  175. 제 171 항에 있어서, 관능기가 케탈인 방법.
  176. 제 171 항에 있어서, 관능기가 티온인 방법.
  177. 제 171 항에 있어서, 관능기가 모노티오히드레이트인 방법.
  178. 제 171 항에 있어서, 관능기가 디티오히드레이트인 방법.
  179. 제 171 항에 있어서, 관능기가 모노티오헤미케탈인 방법.
  180. 제 171 항에 있어서, 관능기가 디티오헤미케탈인 방법.
  181. 제 171 항에 있어서, 관능기가 디티오케탈인 방법.
  182. 제 171 항에 있어서, 활성제가 폴리펩티드인 방법.
  183. 제 171 항에 있어서, 활성제가 폴리펩티드인 방법.
  184. 제 171 항에 있어서, 활성제가 폴리펩티드가 아닌 방법.
  185. 제 121 항, 제 128 항, 제 138 항, 제 144 항, 제 151 항, 및 제156 항 중 어느 한 항에 따라 제조된 중합체성 시약.
  186. 활성제를, 제 1 항, 제 14 항, 제 35 항, 제 54 항, 제 75 항 및 제 110 항 중 어느 한 항에 포함되는 중합체성 시약과 접촉시켜서 제조된 중합체-활성제 콘쥬게이트.
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