KR20030057531A - 락토바실러스 파라카제이의 신규한 균주 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유제품에서 선생물질로 사용할 수 있으며, 위장관 통과에서 생존하며, 치즈 제조시 부가물로 사용하는 경우 향미가 좋은 치즈 생성물을 생성하는 락토바실러스 파라카제이 균주에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 락토바실러스 파라카제이 8700:2 균주, DSM 13434 및 락토바실러스 파라카제이 02A 균주, DSM 13432에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 균주를 함유하는 치즈와 같은 낙농 식품에 관한 것이다.
Description
스웨덴 치즈는 유산균(lactic acid bacteria)의 스타터 배양물에 의해 발효되는 저온살균한 우유로 제조된다. 산성화된 우유는 레닛(키모신)에 의해 응고되며, 응고된 우유는 절단 및 교반된다. 유장과 치즈 그레인의 혼합물은 부드럽게 가열한다. 유장은 분리하고, 치즈 그레인은 가염한 후 치즈로 압착하고 숙성시키는데; 유장 분리와 압착의 순서는 치즈의 종류에 따라 달라진다. 숙성중, 주 유산균의 제2 미생물총(microflora)이 자연적으로 성장한다.
스웨덴 경성 치즈 및 반경성 치즈는 숙성중에 자연적으로 성장하는 제2 미생물총(종종, 비스타터 유산균, NSLAB로 칭함)에 의해 주도될 것이다. 상기 자연적인 미생물총은 첨가된 스타터 배양물에 후속되며, 치즈를 성숙시키는 선택적인 조건 하에서 성장한다. NSLAB는 저온살균에서 생존한 후 원유와 함께 또는 치즈 제조를 위해 사용된 다른 성분과 함께 낙농 공장에 유입되는 것으로 생각된다. 스웨덴 치즈 및 노르웨이 치즈에서 주로 발견되는 NSLAB는 락토바실러스 속, 특히 락토바실러스 파라카제이에 속한다[참조: Lindberg, A.-M. 등, Bacterial flora of Norwegian and Swedish semi-hard cheese after ripening, with special reference toLactobacillus, Netherlands Milk & Dairy Journal 50 563-572 (1996)]. NSLAB는 숙성 수일 후에 성장을 시작하여 숙성 1개월이 지나면 약 106내지 107cfu/g에 이르며, 이 수치는 5개월 이상 유지된다. 체다 치즈는 락토바실러스가 주도 종인 NSLAB의 동일한 발생을 나타낸다. 체다 치즈에서 보고된 종의 예로는 락토바실러스 카제이(Lactobacillis casei), 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 들 수 있으나, 일반적으로 주도적인 종은 락토바실러스 카제이 또는 락토바실러스 파라카제이이다. NSLAB는 조절되지 않기 때문에, 치즈 품질 변화중 일부는 NSLAB의 조성의 변화가능성에 기인한다는 것은 설득력 있는 가정이다. 숙성 과정과 자연적인 NSLAB 미생물총의 성장을 조절하기 위해, 예를 들어 락토바실러스 균주의 순수한 배양물이 치즈 제조에서의 부가물로 사용되어 왔다. 일반적으로, 이러한 부가물은 치즈 제품의 향과 향미에 대한 영향; 예상하는 것은 불가능하지만 시행착오에 의해 테스트해야만 하는 효과를 보유할 수 있다.
유제품내 선생물적 미생물은 지난 10여년간 집중적인 연구 대상이었다. 선생물적 유기체, 예를 들어 락토바실러스 속 및 비피도박테리움 속 (Bifidobacteriumspp.)을 포함하는 유제품의 잠재적인 건강 증진 효과는 이러한 연구를 촉진시켰다. 선생물적 박테리아는 문헌[참조: Fuller, R., Probiotics in man and animal, Journal of applied Bacteriology, 66, 365-378 (1989)]에 기술되어 있는 바와 같이, 임의 수의 분해시 건강상의 잇점을 발휘하는, "숙주 동물의 미생물 균형을 개선시킴으로써 숙주 동물에 이로운 영향을 미치는 생 미생물 식품 첨가제"로 기술된다. 기능성 선생물질(probiotics)의 선택을 위한 바람직한 특징은 문헌[참조: Klaenhammer, T.R. 등, Selection and design of probiotics, International Journal of Food Microbiology 50, 45-47 (1999)]에 요약 및 기술되어 있다. 선택 기준은 4개의 기본적인 카테고리, 즉 비독성과 같은 적합성, 생존능과 같은 기술적 적합성, 장 내에서 생존하는 능력인 경쟁성, 성능 및 기능성으로 분류할 수 있다. 이들 기준이 생체내 기능에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 기작을 이해하는 것은 향후 해결해야하는 중요한 과제를 제시할 것이다.
이전의 연구로부터 비피도박테리아 뿐만 아니라 다수의 선생물적 락토바실러스 균주는 경성 치즈, 예를 들어 체다 치즈 및 고다 치즈 내에서 잘 생존할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
문헌[참조: Gomes, A.M. 등, Incorporation and survival of Bifidobacterium sp. strain Bo andLactobacillus acidophilusstrain Ki in a cheese product, Netherlands Milk & Dairy Journal 49, 71-95 (1995)]에는 스타터로서 엘. 애시도필러스(L. acidophilus)의 임의 균주 및 비피도박테리움의 임의 균주의 조합물을 이용하는 선생물적 고다 치즈의 제조에 대해 개시되어 있다. 상기한 2가지 종 모두 상대적으로 양호하게 생존하나, 감각 특성은 부정적으로 영향받은 것으로 확인되었다.
문헌[참조: Dinkar 등, Growth and viability ofBifidobacterium bifidumin Cheddar cheese, J Dairy Sci 77: 2854-2864 (1994)]에는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)이 체다 치즈 내로 혼입되는 것에 대해 개시되어 있다. 상기 박테리아를 치즈 제조의 후기 단계, 예를 들어 밀링 단계 또는 가염 단계 에서 부가물로서 첨가하는 경우, 6개월의 숙성 기간 후에 치츠 품질에 부정적인 영향을 미치지 않는 양호한 생존능(107cfu/g)이 얻어졌다. 상기 연구에 이어, 체다 치즈에서 8개월의 숙성 기간 동안 다수의 선생물적 락토바실러스 균주, 엘. 살리바리우스(L. salivarius) 및 엘. 파라카제이의 성능에 관한 시험을 수행하였다[참조: Gardiner 등, Development of a probiotic Cheddar cheese containing human-derivedLactobacillus paracaseistrains, Applied and Environmental Microbiology, 292-2199, 1998년 6월]. 연구 결과, 선생물적 엘. 파라카제이 균주는 치즈 내에서 많은 수로 성정하기 때문에 부가물로서 특히 적합하며, 감각 특성이 아니라 단백질분해에 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
본 발명은 발효 유제품, 특히 선생물적 치즈의 제조에 사용할 수 있는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei)의 신규한 균주에 관한 것이다.
도 1은 락토바실러스 파라카제이 8700:2 균주, DSM 13434의 REA-프로필 사진이다.
도 2는 락토바실러스 파라카제이 02A 균주, DSM 13432의 REA-프로필 사진이다.
도 3은 2가지 락토바실러스 파라카제이 균주 8700:2 및 02A 균주의 RAPD-프로필 사진이다.
본 발명은 치즈 제조에서 부가물로서 사용할 수 있는 락토바실러스 파라카제이의 신규한 선생물적 균주에 관한 것인데, 이 균주는 치즈에서 이로운 생존 특성 뿐만 아니라 치즈에 좋은 향미를 부여할 수 있는 능력을 보유하고 있다.
구체적으로, 본 발명은 유제품에서 선생물질로서 사용할 수 있는 락토바실러스 파라카제이의 균주에 관한 것인데, 이 균주는 위장관 통과에서 생존하며, 치즈 생성에서 부가물로서 사용하는 경우 향미가 좋은 치즈 제품을 생성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 관점에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 파라카제이 8700:2 균주 또는 그 변이체에 관한 것인데, 이는 독일 38124 브라운슈베이크 마스체로더 베크 1베에 소재하는 DSMZ-도이치 삼룽크 본 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨트렌 게엠베하에 2000년 4월 10일자로 기탁되었으며, 수탁번호로 DSM 13434를 부여받았다. 도 1은 이 균주의 REA-프로필, 즉 제한효소인HindIII(C 레인),ClaI(B 레인) 및EcoRI(A 레인)으로 절단한 후, 총 염색체 DNA로부터 얻은 제한 엔도뉴클레아제 분석 프로필을 나타내고 있다. STD는 크기 마커를 의미하는데, 고 분자량 마커(라이프 테크놀로지스)와 DNA 분자량 마커 VI(로슈 몰큘라 바이오케미칼스, 뵈링거 만하임)의 배합물이다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 파라카제이 02A 균주 또는 그 변이체에 관한 것인데, 이는 독일 38124 브라운슈베이크 마스체로더 베크 1베에 소재하는 DSMZ-도이치 삼룽크 본 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨트렌 게엠베하에 2000년 4월 10일자로 기탁되었으며, 수탁번호로 DSM 13432를 부여받았다. 도 2는 이 균주의 REA-프로필, 즉 제한효소인HindIII(C 레인),ClaI(B 레인) 및EcoRI(A 레인)으로 절단한 후, 총 염색체 DNA로부터 얻은 제한 엔도뉴클레아제 분석 프로필을 나타내고 있다. STD는 크기 마커를 의미하는데, 고 분자량 마커(라이프 테크놀로지스)와 DNA 분자량 마커 VI(로슈 몰큘라 바이오케미칼스, 뵈링거 만하임)의 배합물이다.
REA-분석은 문헌[참조: Johansson 등, International Journal of Systematic Bacteriology 10, 670-675 (1995)]에 따라 수행하였다.
도 3은 균주 02A(2 레인) 및 균주 8700:2(3 레인)의 RAPD-프로필을 나타내고 있다. 1 레인과 4 레인은 DNA 분자량 마커 VI(로슈 몰큘라 바이오케미칼스, 뵈링거 만하임)이다. RAPD-분석은 후술하는 '재료 및 방법'에 기술된 바와 같이 수행하였다.
본 발명의 신규한 균주는 임의의 낙농 식품, 예를 들어 발효 유제품, 요구르트 및 아이스크림, 스프레드 치즈, 프레쉬 치즈, 송아지 레닛으로 제조되고 지방 함량이 5 내지 50%인 경성 및 반경성 치즈, 지방 함량이 0.1 내지 40%인 연성 치즈 및 쿠아게(Quarge)와 쿠아지(Quarg)계 제품 뿐만 아니라 커드 내에 발효 드레싱 또는 생 박테리아를 보유하거나 보유하지 않는 케소(keso)에서 선생물질로서 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 균주의 바람직한 용도는 치즈의 제조에서 부가물로서 사용하는 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 신규 균주중 하나 이상의 균주를 함유하는 낙농 식품에 관한 것이다. 상기 식품중 선생물적 균주의 함량은 106내지 109cfu/g, 바람직하게는 107이상이다.
본 발명의 바람직한 관점에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 파라카제인 8700:2 균주, DSM 13434를 함유하며 향미가 개선된 경성 또는 반경성 치즈; 또는 락토바실러스 파라카제인 02A 균주, DSM 13432를 함유하며 향미가 개선된 경성 또는 반경성 치즈에 관한 것이다.
또한 본 발명의 다른 관점에 따르면, 본 발명은 종래의 요구르트 배양물과의 혼합물로 락토바실러스 파라카제이 8700:2 균주, DSM 13434 또는 락토바실러스 파라카제이 02A 균주, DSM 13432를 함유하는 요구르트에 관한 것이다.
치즈 모델에서 선생물적 균주의 스크리닝 테스트
장으로부터 유래한 15종의 상이한 락토바실러스 균주(락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균주 11종, 락토바실러스 파라카제이 균주 3종 및 락토바실러스 플랜타럼 균주 1종)을 치즈에서 성장 및 생존할 수 있는 능력 및 치즈 향미에 대한 영향을 모니터링하는 치즈 모델에서의 스크리닝 시험에서 테스트하였다. 상이한 균주는 문헌[참조: Molin, G. 등, Numerical taxonomy ofLactobacillusspp. associated with healthy and diseased mucosa of the human intestines, Journal of Applied Bacteriology 74, 314-323 (1993)]에 기술된 방법을 이용하여 인간의 장으로부터 얻었다.
본 실험의 결과로서, 상기 균주중 4종의 균주를 추가 연구를 위해 선택하였는데, 선택된 균주는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
| 균주 | 유기체 |
| 02A | 락토바실러스 파라카제이 |
| 04C | 락토바실러스 플랜타럼 |
| 8700:2 | 락토바실러스 파라카제이 |
| 8589:2 | 락토바실러스 파라카제이 |
30+ 라운드-아이 치즈에서 선생물적 균주의 스크리닝 테스트
본 연구는 락토바실러스 파라카제이 균주 3종 및 락토바실러스 플랜타럼 균주 1종의 성능을 조사하였는데, 이들 모두는 인간의 장 점막으로부터 분리하였으며, 건조 물질을 기준으로 지방 함량이 30% 이상인 라운드-아이 치즈에서 부가물로 사용하였다.
상기 테스트 균주는 상기 표 1에 나타낸 바와 같다.
재료 및 방법
치즈 제조
치즈는 400 ℓ대형 용기에서 저온살균된(73℃에서 15초)된 우유(스웨덴 외르비 스카네메여리어)를 이용하여 표준 프로토콜에 따라 제조하였다. 제조된 치즈는 건조 물질을 기준으로 지방 함량이 30%인 반경성 라운드-아이 치즈였다. 상기 치즈 우유는 테스트 균주 106cfu/ml로 접종하였다. 상기 테스트 균주는 유산 스타터 배양물로 접종후(30분) 해동된 동결 완충액으로부터 우유에 첨가하였다. 각각의 배치(batch)는 약 10 kg의 치즈 4개를 생성하였으며, 이들 중 3개는 12℃에서 숙성하였고, 나머지 하나는 처음 14일 동안은 16℃에서 그후에는 12℃에서 숙성하였다. 상기 치즈들은 플라스틱 호일 내에서 숙성시켰다. 치즈 제조는 4회 수행하였다. 4개의 배치는 각각 1주일 동안 제조하였는데, 3개의 배치는 상이한 부가물을 함유하도록 하였으며, 나머지 1개의 대조군 배치는 부가물을 함유시키지 않았다. 제조 순서는 각각 1주일 동안 무작위로 수행하였다. 총 22개의 배치, 즉 6개의 대조군 배치 및 4개의 부가물 배양물 각각을 함유하는 4개의 배치를 제조하였다.
치즈 분석
숙성 5개월 후에, 상이한 부가물을 함유하는 별도의 배치 2개와 대조군 배치 2개를 샘플링하였는데, 각각의 배치마다 1개의 치즈를 샘플링하였다. 나머지 4개의 대조군 배치 및 상이한 부가물을 함유하는 이중 배치는 숙성 6개월 후에 샘플링하였다(상이한 초기 온도에서 숙성된 각각의 배치로부터 2개의 치즈). 상기 치즈들은 그들의 감각 특성, 미생물학적 특성 및 물리화학적 특성에 대해 샘플링하였다.
치즈의 미생물학적 샘플링
샘플 10 g은 치즈의 중심으로부터 무균 상태로 수집하고, 스토마커(영국 에스이1 1피피 런던에 소재하는 시워드 메디칼 리미티드) 내에서 2% 구연산나트륨 용액 90 ml와 함께 2.5분 동안 균질화하였다. 통상적인 희석 및 플레이팅후, 28℃에서 4일 동안 항온처리한 브레인 하트 인퓨젼 아가(BHI; 디프코, 미국 스파크) 상에서 전체적인 호기성 생존 계수 및 혐기성 생존 계수를 수행하였다. 락토바실러스균주의 생존 계수는 28℃에서 4일 동안 혐기적으로 항온처리한 로고사 아가(독일 담스타트의 머크) 상에서 분석하였다.
치즈로부터 미생물의 분리
각각의 샘플로부터 7개의 콜로니를 무작위 채취하였다. 2개의 콜로니는 전체적인 생존 계수(BHI 아가)로부터 채취하였으며, 3개의 콜로니는 락토바실러스의 특정 생존 계수(로고사 아가)로부터 채취하였다. 20개 이상의 콜로니를 갖는 계수할 수 있는 플레이트를 사용하였다.
미생물학적 분석
REA-분석
문헌[참조: Johansson 등, (1995), 상기 문헌 참조]의 프로토콜에 따라 제한 엔도뉴클레아제 분석(REA)를 위해 염색체 DNA를 제조하였다. 상기 염색체 DNA는 CsCl 구배 내에서 EtBr을 이용하는 염료 부유 밀도 원심분리에 의해 공유적으로 폐환된 환형 플라스미드 DNA(대부분의 플라스미드 DNA)로부터 분리하였다. 일부 선형 및 개방된 환형 플라스미드 DNA가 여전히 제제물 내에 존재할 수 있지만, 단지 이들은 최종 결과에 중대한 영향을 미치지는 못한다. 염색체 DNA의 농도는 형광계(모델 TKO 100, 미국 샌프란시스코에 소재하는 호퍼 사이언티픽 인스트루먼츠)에서 모니터링하였다. DNA(0.75 mg)는 37℃에서 4시간 동안 10 유닛의HindIII,ClaI 또는EcoRI(뵈링거)를 이용하여 별도로 분해하였다. 겔의 전기영동 및 스캐닝은 문헌(Johansson 등)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 크기가 150-235 mm인 침지된 0.9% 아가로즈 수평 슬랩 겔을 이용하였다. 고 분자량 DNA 마커(분자량이 8.5 내지48.5 kb인 DNA 단편을 함유함; 베데스다 리서치 래보러터리즈, BRL) 0.2 mg과 함께 DNA 분자량 마커 VI(분자량이 0.2 내지 2.2 kb인 DNA 단편을 함유함; 뵈링거 만하임) 0.5 mg을 표준물로 사용하였다. 겔은 8.5℃에서 18 시간 동안 40 V의 일정한 전압으로 전기영동하였다. 완충제는 전기영동 기간 중에 재순환시켰다. 그후, 겔은 EtBr(2 mg/ml) 내에서 20분 동안 염색하고, 증류수 내에서 탈염색하고, UV 투사기(UVP Inco., 미국 산가브리엘 소재)를 이용하여 302 nm에서 시각화하고, 촬영하였다. 이러한 방식으로 겔 전기영동을 수행하면 분자량 약 1.8 kb 이하로 잘 분포되고, 상대적으로 잘 분리된 밴드를 얻을 수 있다. 광네가티브 상의 REA-패턴은 해상도가 200 dpi인 플랫베드 스캐너를 이용하여 컴퓨터로 스캐닝하였다. 겔 상은 바이오뉴메릭스 포맷(벨기에 코르트리크 소재의 어플라이드 매스)으로 전환시켰다. 상기 겔의 표준화 및 모든 추가 분석은 바이오뉴메릭스 1.0으로 수행하였다. 겔 트레이스는 피어슨 프로덕트 모멘트 코릴레이션 코이피션트(등록상표; Pearson product moment correlation coefficient)와 등차 평균에 의한 언웨이티드 페어 그룹법(unweighted pair group method by arithmetic averages; UPGMA)을 이용하여 분석하였다. 3개의 개열, 즉HindIII,ClaI 및EcoRI에 의한 개열로부터 유래한 데이타는 바이오뉴메릭스 1.0을 이용하여 각각의 균주에 대해 연합하였다.
RAPD-분석
모든 분리체는 무작위 증폭된 다형태 DNA법(method of randomly amplified polymorphic DNA), 즉 RAPD로 분류하였다[참조: Quednau 등, Current Microbiology, 36, 332-336 (1998)]. 미정제 세포 추출물은 BHI 아가 플레이트에서유래한 분리체에 대해서는 BHI 1 ml 내 및 로고사 아가 플레이트에서 유래한 분리체에 대해서는 락토바실러스를 함유하는 배지(LCM) 1 ml 내 28℃에서 하룻밤 항온처리한 배양물로부터 제조하였다. 순수 배양물의 세포는 멸균 밀리-Q(등록상표) 물(프랑스 몰쉐임 소재의 밀리포어 소시에테아노님) 1 ml 내에서 2회 세척하고, 직경 2 mm의 유리 비드를 구비한 에펜도르프 튜브 내에서 에펜도르프 믹서(5432; 독일 함부르크 소재의 에펜도르프)를 이용하여 분쇄하였다. 사용한 프라이머는 반응 혼합물내 농도가 15 mM인 서열 5'-ACGCGCCCT-3'이었다. RAPD 과정으로 현재 분류된 락토바실러스에 대해 겔 상에 다수의 적합하고 뚜렷한 밴드를 생성하였는데, 이는 이미 락토바실러스 플랜타럼에 대해 입증되어 왔던 것이다[참조: Johansson, M.L. 등, Randomly amplified polymorphic DNA(RAPD) for typing ofLactobacillus plantarumstrains, Letters in Applied Microbiology, 21, 155-159 (1995)].
겔의 밴드 패턴은 겔 콤파르(상표명) 4.2(벨기에 코르트리크 소재의 어플라이드 매스)를 이용하는 피어슨 프로덕트 모멘트 코릴레이션 코이피션트(등록상표) 및 등차 평균을 이용하는 언웨이티드 페어 그룹법(UPGMA; 롬브버그, 1984)으로 분석하였다. RAPD-패턴의 전산화된 클러스터 분석은 시각적인 비교와 연계하였다.
감각 평가
5개월 후, 치즈는 7명의 등급 판정자(6명은 전문적인 판정자이며, 1명은 룬트 대학 식품 공학과 직원)에 의해 다수의 속성(표면, 향, 일차 조직, 이차 조직, 향미의 품질, 및 향, 향미, 향미소실의 세기) 및 전체 품질을 고려하여 쾌락 스케일(분석후 0 내지 10 스케일로 해석함)에 대해 등급화하였다. 6개월후, 치즈는 4명의 전문 등급 판정자에 의해 표면의 품질, 조직의 품질, 향의 품질, 향미의 품질과 전체 품질 및 11개의 관련 속성의 세기를 고려하여 쾌락 스케일에 대해 등급화하였다. 치즈는 16℃로 연화하고, 3개의 무작위 숫자로 마킹하고, 무작위한 순서로 제공하였다.
결과
치즈 제조
제조중 치즈의 pH는 모든 테스트 군에서 유사하였다. 치즈의 조성은 예상한 바와 같이 테스트 군 사이에서 달랐는데, 그 이유는 상기 스케일로 치즈를 제조하는 데 있어서의 어려움 때문이다.
치즈의 미생물학적 분석
숙성 5개월후 샘플링한 치즈에서, 부가물을 이용하여 제조한 치즈는 참조용 치즈 보다 약 1 Lg cfu/g 더 높은 생존 계수를 보유하였다. 상기 수치는 하기 표 2에 나타냈다.
| 생존 계수, Lg(cfu/g 치즈) | |||
| 총 호기 | 총 혐기 | 락토바실러스 | |
| 대조군 | 6.85±0.33 | 7.27±0.02 | 6.81±0.00 |
| + 04C | 7.50±0.25 | 7.74±0.27 | 7.42±0.02 |
| + 8589:2 | 8.20±0.01 | 8.20±0.02 | 7.62±0.00 |
| + 8700:2 | 7.98±0.04 | 7.56±0.50 | 7.49±0.05 |
| + 02A | 7.72±0.04 | 7.65±0.43 | 7.58±0.00 |
숙성 5개월후, 샘플링된 모든 치즈에서 유래한 분리체(치즈 10개, 분리체 70개)는 12개의 상이한 RAPD-유형으로 분류하였다. 대조군 치즈로부터 유래한 분리체는 7개의 상이한 RAPD-유형으로 분류한 반면, 부가물 04C를 이용하여 제조한 치즈로부터 유래한 분리체는 5개의 상이한 RAPD-유형의 것이었으며, 부가물 02A를 이용하여 제조한 치즈로부터 유래한 분리체는 4개의 상이한 RAPD-유형의 것이었다. 부가물 8700:2 및 8589:2를 이용하여 제조한 치즈로부터 유래한 분리체는 각각 3개의 상이한 RAPD-유형의 것이었다. 모든 치즈는 공통적으로 하나의 RAPD-유형의 분리체를 보유하였다.
사용된 부가물 배양물 모두는 5개월 숙성후 치즈의 상응하는 이중 샘플 내에서 확인되었다. 부가물 배양물 04C, 8589:2 및 02A는 락토바실러스 선택성 아가에서만 재분리되었다(04C : 6개의 분리체로부터 2개; 8589:2 : 6개의 분리체로부터 3개; 02A : 6개의 분리체로부터 4개). 한 대조군 치즈에서, 04C와 동일한 RAPD-유형의 한 분리체가 확인되었으며, 다른 대조군 치즈에서는 02A와 동일한 RAPD-유형의 한 분리체가 확인되었다. 부가물 8700:2는 전체 계수 아가(8개의 분리체중 2개) 및 락토바실러스 선택성 아가(6개의 분리체중 6개)로부터 재분리되었다.
숙성 6개월후 샘플링한 치즈에서, 모든 테스트 군에 대한 전체 생존 계수는 12℃에서 숙성한 치즈에서의 생존 계수와 유사하였다(8.0-8.4 Lg(cfu/g 치즈)). 초기 16℃에서 숙성한 치즈에서, 전체 생존 계수는 12℃에서 숙성한 치즈에서의 생존 계수 보다는 일반적으로 낮았는데, 특히 대조군 치즈에서의 생존 계수 보다 낮았다(7.4-7.5 Lg(cfu/g 치즈)). 12℃에서 숙성한 치즈에서 락토바실러스의 선택적인 계수는 대조군(7.3 Lg(cfu/g 치즈))에서 보다 부가물을 이용하여 제조한치즈(7.6-7.8(cfu/g 치즈))에서 일반적으로 더 높았다. 숙성 6개월후 락토바실러스의 선택적인 계수는 초기 숙성 온도를 증가시켜도 영향이 없었다.
감각 평가
숙성 5개월후, 대조군 치즈는 부가물을 이용하여 제조한 치즈에 비해 (일차 및 이차) 조직에 대해 현저하게 가장 낮은 스코어를 보유하였다. 표면은 부가물 8589:2 및 02A를 이용하여 제조한 치즈에 비해 부가물 8700:2를 이용하여 제조한 치즈 및 대조군이 현저하게 가장 낮은 스코어를 보유하였다. 부가물 8700:2 및 02A를 이용하여 제조한 치즈는 향미의 품질 및 전체 품질 면에서 대조군 치즈에 비해 현저하게 더 높은 스코어를 보유하였다. 부가물 배양물을 이용하여 제조한 치즈 중에서, 8700:2를 이용하여 제조한 치즈는 전체적인 품질 면에서 가장 높은 스코어를 보유하였으며, 향미소실 세기에 대해 가장 낮은 스코어를 보유하였다. 02A를 이용하여 제조한 치즈는 향미의 품질과 세기 면에서 가장 높은 스코어를 보유하였다. 분석된 모든 치즈는 향의 품질과 세기 면에서 매우 유사한 스코어를 나타냈다(자료는 나타내지 않음).
하기 표 3에서, 2개의 배치로부터 유래한 한개의 치즈에 대해 제조중 pH, 건조 물질내 지방 및 비지방 고체내 수분을 (평균 ± 표준 편차)로 나타냈다. 감각 평가에 대한 스케일은 다음과 같다: 1 = 나쁜 품질, 낮은 세기; 10 = 양호한 품질, 높은 세기; 평균 ± 표준 편차.
숙성 6개월후, 테스트 군으로부터 취한 치즈들 사이의 유의적인 차이는 확인되지 않았다. 다만, 초기 숙성 온도가 증가되면 조직의 품질이 감소하고, 향미가개선되는 주 경향이 확인되었는데, 이는 특히 부가물을 이용하여 제조한 치즈에 대해서 두드러졌다.
1부가물은 첨가하지 않음
2상이한 문자로 표시한 군들 사이의 유의적인 차이(P=0.05)
3시고 씀
4씀
선생물적 특성의 테스트
또한, 치즈내에 전달되는 경우 장 통과에서 생존할 수 있는 균주의 능력을 조절하였고, 자연적으로 성장한 2차 미생물총과 비교하였다.
투여 연구
경구 투여
투여 연구를 위해 02A 및 8700:2 균주로 접종한 치즈를 선택하였다. 이 선택은 접종한 치즈의 뛰어난 향미 및 숙성중 치즈내에서 성장 및 생존할 수 있는 테스트 균주의 능력을 기준으로 수행하였다. 배양물은 치즈 내에 107cfu/g 이상으로 존재하였다. 경구 투여를 위한 지원자는 무작위로 3개의 군으로 나누었다: 1) 부가물을 첨가하지 않은 대조군 치즈를 섭취하는 군, 2) 02A로 접종한 치즈를 섭취하는 군 및 3) 02A를 접종한 치즈를 섭취하는 군. 제1군은 8명의 지원자(43 내지 51세의 남성 4명 및 여성 4명)로 구성되었으며, 제2군은 10명의 지원자(25 내지 55세의 남성 5명 및 여성 5명)으로 구성되었으며, 제3군은 11명의 지원자(26 내지 60세의 남성 6명 및 여성 5명)으로 구성되었다. 본 연구는 5주 동안 계속 수행하였다. 3주 및 4주 중에, 치즈 150 g을 매일 섭취하도록 하였는데, 이는 테스트 균주를 매일>0.5 x 109cfu 투여하는 것과 동일한 것이었다. 본 연구중, 지원자들은 선생물적 박테리아 또는 항생제를 함유하는 식품은 섭취하지 못하도록 하였다. 변 샘플은 투여 개시이전(2주), 투여 2주후(4주) 및 투여 종료후 1주(5주)에 수집하였다.
변으로부터 미생물의 분리
변을 통상적으로 희석하고 플레이팅한 후, 37℃에서 3일 동안 혐기적으로 항온처리한 로고사 아가 상에서 락토바실러스의 생존 계수를 분석하였다. 3개의 콜로니는 분류를 위해 각각의 샘플에서 무작위로 취하였다. 20개 이상의 콜로니를 보유하는 계수 가능한 플레이트를 사용하였다.
분리체의 분류
모든 분리체는 무작위 증폭된 다형태 DNA법(RAPD; Quednau 등, 1995 상기 문헌 참조)으로 분류하였다.
재분리
부가물을 이용하여 제조한 치즈로부터 유래한 분리체의 RAPD-패턴은 부가물의 RAPD-패턴 및 참조용 치즈로부터 유래한 분리체의 RAPD-패턴과 비교하였다. 부가물을 이용하여 제조한 치즈로부터 유래한 분리체는 부가물의 RAPD-유형과 동일한 것이었으며, 상기 부가물은 재분리될 수 있는 것으로 고려하였다.
각 지원자의 변으로부터 유래한 분리체의 RAPD-패턴은 부가물, 이 부가물 이용하여 제조한 치즈로부터 유래한 분리체 및 참고용 치즈로부터 유래한 분리체의 RAPD-패턴과 비교하였다. 부가물과 동일한 RAPD-패턴의 분리체가 치즈 섭취 이전이 아니라 치즈 섭취 이후의 변에서 확인되는 경우, 상기 부가물은 장에서 생존한 것으로 결론을 내렸다. 또한, 부가물과 동일한 RAPD-유형의 분리체가 치즈 섭취 이전이 아니라 치즈 섭취 1주 후의 변에서 확인되는 경우, 상기 부가물이 인간의 장에서 콜로니를 형성한 것으로 결론을 내렸다.
통계학적 분석
생존 계수 및 감각 스코어에서의 변화 및 유의적인 차이의 분석은 t-분포를 이용하여 신뢰 구간을 계산함으로써 수행하였다. 3개의 샘플링 시간에서 변내 생존 계수에서의 차이에 대한 유의성의 통계학적 평가는 SPSS 6.0(미국 시카고 소재의 SPSS 인크.)를 이용하는 윌콕슨 랭크 섬 테스트로 수행하였다.
경구 투여의 결과
투여 종료 직후에 02A 균주는 11명의 지원자중 6명의 지원자의 변에서 확인되었다. 8700:2 균주에 대한 상응하는 수치는 10명의 지원자중 10명이었다. 02A 균주와 8700:2 균주 모두 투여 종료 1주후에 이들 2개의 군에서는 지원자중 누구의 변에서도 확인되지 않았다. 대조군 치즈 또는 부가물을 이용하여 제조한 치즈에서 자연적으로 발생하는 RAPD-유형은 지원자중 어느 누구의 변에서도 확인되지 않았다. 다만, 02A와 동일한 RAPD-유형의 분리체는 투여 종료 직후에 대조군 치즈를 섭취한 2명의 지원자의 변에서 확인되었다. 또한, 04C와 동일한 RAPD-유형의 분리체는 투여 종료 1주후 2명의 지원자의 변에서 확인되었다. 이들 2명의 지원자는 부가물 02A를 이용하여 제조한 치즈 또는 대조군 치즈를 섭취한 지원자들이었다. 변내 락토바실러스의 생존 계수는 치즈 섭취후 모든 군에서 증가되었다. 이러한 증가는 부가물 배양물을 함유하는 치즈를 섭취한 군에 대해 통계적으로 유의한 것이었다.투여 종료후, 락토바실러스의 생존 계수는 부가물 배양물을 함유하는 치즈를 섭취한 군에서는 감소한 반면, 대조군 치즈를 섭취한 군에서는 증가하였다.
하기 표 4는 본 연구에서 3개의 군에 대한 락토바실러스의 선택적 계수를 나타낸다.
| 군 | 1대조군 치즈 | 2치즈 + 8700:2 | 3치즈 + 02A |
| 2주후 | 5.81±0.74 | 4.87±0.38 | 5.94±0.48 |
| 4주후 | 6.08±0.60 | 6.72±0.80 | 6.64±0.46 |
| 5주후 | 6.97±0.74 | 5.59±0.92 | 5.74±0.54 |
결론
상기 실험을 통해 2가지 균주 락토바실러스 파라카제이 8700:2, DSM 13434 및 락토바실러스 파라카제이 02A, DSM 13432는 치즈 제조를 위한 부가물 배양물로서 양호하게 사용되며, 숙성 5개월후 치즈로부터 재분리할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 균주들은 감각 특성에 긍정적인 효과를 보유하고 있는데, 이는 이들이 자연적으로 성장하는 2차 미생물총을 지배할 수 있다는 의미하다.
상기 투여 연구 결과, 상기 2가지 균주는 위장관 통과에서 생존함으로써 경쟁성의 요구를 충족시키는 것으로 보이며, 따라서 잠재적인 선생물적 균주의 선택 기준을 충족시키는 것을 확인할 수 있었다.
Claims (9)
- 유제품에서 선생물질로서 사용할 수 있는 락토바실러스 파라카제이 균주로서, 위장관 통과에서 생존하며, 치즈의 제조시 부가물로서 사용하는 경우, 향미가 좋은 치즈 생성물을 생성하는 것을 특징으로 하는 균주.
- 제1항에 있어서, 락토바실러스 파라카제이 8700:2, DSM 13434 또는 이의 변이체인 균주.
- 제1항에 있어서, 락토바실러스 파라카제이 02A , DSM 13432 또는 이의 변이체인 균주.
- 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 치즈 제조에서 부가물로서 사용하기 위한 균주.
- 제1항 내지 제3항중 어느 한 항의 균주를 106내지 109cfu/g, 바람직하게는 >107cfu/g의 양으로 함유하는 낙농 식품.
- 제5항에 있어서, 향미가 개선된 경성 또는 반경성 치즈이며, 락토바실러스파라카제이 8700:2 균주, DSM 13434를 함유하는 것을 특징으로 하는 낙농 식품.
- 제5항에 있어서, 향미가 개선된 경성 또는 반경성 치즈이며, 락토바실러스 파라카제이 02A 균주, DSM 13432를 함유하는 것을 특징으로 하는 낙농 식품.
- 제5항에 있어서, 요구르트이고, 종래의 요구르트 배양물과의 혼합물로 락토바실러스 파라카제이 8700:2 균주, DSM 13434를 함유하는 것을 특징으로 하는 낙농 식품.
- 제5항에 있어서, 요구르트이고, 종래의 요구르트 배양물과의 혼합물로 락토바실러스 파라카제이 02A 균주, DSM 13432를 함유하는 것을 특징으로 하는 낙농 식품.
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