JP4933124B2

JP4933124B2 - 免疫賦活作用を有するラクトコッカス属乳酸菌と粘稠性ラクトコッカス属乳酸菌並びにこれらを併用した粘稠性を有する発酵乳の製造方法

Info

Publication number: JP4933124B2
Application number: JP2006087312A
Authority: JP
Inventors: 英雅元島; 健治内田; 真奈岩本; 啓子明石; 慈輝大久保
Original assignee: YOTSUBA MILK PRODUCTS CO Ltd
Current assignee: YOTSUBA MILK PRODUCTS CO Ltd
Priority date: 2006-03-28
Filing date: 2006-03-28
Publication date: 2012-05-16
Anticipated expiration: 2026-03-28
Also published as: JP2007259729A

Description

本発明は、免疫賦活作用を有するラクトコッカス属乳酸菌と、菌体外多糖類を産生して粘稠性を示すラクトコッカス属乳酸菌並びにこれらを併用した粘稠性を有する発酵乳の製造方法に関する。詳しくは、伝統的な発酵乳の１種であるケフィア（Ｋｅｆｉｒ、ケフィールとも呼ばれる）から分離された免疫賦活作用を有するラクトコッカス属乳酸菌と、カスピ海ヨーグルトあるいはフィンランドでビーリ（Ｖｉｌｌｉ）と称される発酵乳などの、粘稠な性状を有する伝統的発酵乳から分離した、菌体外多糖類を産生することで発酵乳に粘稠性を付与する性質のあるラクトコッカス属乳酸菌に関し、さらに、これらを併用して免疫賦活作用が期待できる粘稠性を示す発酵乳の製造方法に関するものである。

ケフィアから分離したラクトコッカス属乳酸菌は、免疫賦活作用あるいは免疫賦活作用による抗腫瘍作用が期待できることが明らかにされている（特許文献１）。
ケフィアは、ケフィールとも呼ばれ、ロシアのコーカサス地方を起源とする伝統的発酵乳の１種である。日本では１９９４年ごろ、ブームとなり、『ヨーグルトきのこ』と俗称された。今日、ケフィアはロシアや東欧諸国を中心に工業的に生産されており、これらの国ではヨーグルト同様に良く知られている。ケフィアの製造には、伝統的にはケフィア粒（ケフィアグレインとも呼ばれる）と称される天然の発酵種がスターターとして用いられる。このケフィア粒は、現在、インターネット等を介して容易に入手可能である。
ケフィア粒は、ケフィアに特徴的な乳酸菌と酵母等の微生物が共生した弾力のある塊で、白色から乳白色、半透明を呈しており、数ミリから数センチの大きさがある。ケフィア粒は牛乳中であたかも１種類の菌のように増殖し、その過程で乳を発酵する。このケフィア粒は代々乳に植え継がれることで今日まで伝えられてきている。ケフィア粒に関する最も古い報告の一つは１８８１年に刊行されたもの（非特許文献１）である。

ケフィアの典型的な製造方法を示すと以下の通りである。
ケフィア粒を、殺菌して２０℃前後まで冷却した乳に適当量（１−１０％容量程度）接種する。次いで、２０℃前後で１昼夜保持すると、凝乳する。この凝乳を衛生的な金網等で漉し、ケフィア粒を回収する。この濾液が飲用に供するケフィアである。
ケフィア粒は少し増殖しているが、これは次の発酵に用いる。また、この漉しとった濾液をバルクスターターとして、さらに乳を発酵してケフィアとする場合もある。
このケフィア粒の菌叢は複雑で、まだ完全に解明されているわけではない。しかしながら、ケフィア粒から分離される典型的な乳酸菌は、ラクトバチルス・ケフィラノファシェンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、ラクトバチルス・ケフィラノファシェンス・サブスピーシーズ・ケフィールグラナム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓｓｕｂｓｐ．ｋｅｆｉｒｇｒａｎｕｍ）、ラクトバチルス・ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｋｅｆｉｒｉ）、ロイコノストック・ラクチス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス・ビオバー・ジアセチラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓｂｉｏｖａｒ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）などである。また、ケフィア粒には必ず酵母も数種類存在する（非特許文献２）。

我々は鋭意努力の結果、ケフィアから分離した特定のラクトコッカス属乳酸菌がマウスにおいて経口投与で免疫賦活作用があり、それによる抗腫瘍作用を期待できることを見出している（特許文献１）。

特開２００３−０４７４６２号公報Ｋｅｒｎ、Ｅ．Ｂｕｌｌ．ＤｅｌａｓｏｃｉｅｔｅｎａｔｕｒａｌｉｓｔｓｄｅＭｏｓｃｏｕ，ＬＶＩ（１８８１）１４１−１７７．醸協、第９３巻、第３号、ｐ１７６−１８３（１９９８）

一方、日本ではラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）が主要な菌叢をなしている粘稠な発酵乳が２００１年頃からマスコミやインターネットを通じて広がり、『カスピ海ヨーグルト』と俗称されるようになった。京都大学名誉教授、家森幸男氏の著書「カスピ海ヨーグルトの真実」（株式会社法研平成１４年９月１６日発刊）によると、家森教授が『１９８６年に旧ソ連コーカサス地方、いまのグルジア共和国から分析のため持ち帰ったものがもとになっているようです。』と書かれているが、人から人へと広がったため、今となっては起源を特定できない。
家森教授自身も『本当のところ私自身がカスピ海ヨーグルトにどれほどかかわりがあるのか、やはり謎ではあります』と著書中で述べている。現在ではカスピ海ヨーグルトは、全国的に広がり、日本に土着的な発酵乳となっている。種菌を入手するには、もっている人から直接分譲してもらうか、もしくはインターネットを介して種菌入手が可能となっている。
しかし、家庭で十分な管理を受けないで植え継がれているために、衛生性に大きな危惧があり、また、途中で種菌が途絶えてしまうという問題もある。
一方、このような粘稠な伝統的発酵乳として他に広く知られているものにフィンランド原産のビーリ（Ｖｉｌｌｉ）があり、これもラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）が粘稠性の原因の主体をなしていることが分かっている。

ケフィアは免疫賦活作用や抗腫瘍性が期待されるが、前記したように、酵母が存在するので、アルコール発酵してガス発生が起こり、容器が膨らむなどの流通上の問題点がある。
また、ケフィア粒を用いないでもケフィアと同様な免疫に対する効果が期待できる発酵乳を安定的に製造できれば、国民の健康増進に寄与できる。
一方、カスピ海ヨーグルトと俗称される発酵乳は、その独特な粘稠性が魅力である。
そこで、このような粘稠性をもつ乳酸菌とケフィアの免疫調整力が期待できる菌株を組み合わせれば、独特の食感を楽しみながら、しかも免疫調整作用が期待できる独特の発酵乳が開発できると考えた。
しかしながら、カスピ海ヨーグルトは土着的であっても、ブームにすぎないのであって、いつ消失するともかぎらない。本発明を安定的に実施するためには、粘稠性の菌株の正確な分離と同定、保存が必要である。また、ラクトコッカス属のスターターを発酵乳に使用する場合には、製造中にそれに対するバクテリオファージの攻撃を受けやすい。そのための予防のためにも、工夫が必要となってくる。

本発明の目的は、上記発酵乳の製造に適する免疫賦活作用を有するラクトコッカス属乳酸菌と、乳中で菌体外多糖類を産生して粘稠性を示すラクトコッカス属乳酸菌を提供すること、並びにこれら乳酸菌を併用した、免疫賦活作用を有し、かつ粘稠性を有する発酵乳の製造方法を提供することである。

そのために、近年日本国内で流行している「カスピ海ヨーグルト」と俗称されている自然発酵乳およびビーリと呼ばれるフィンランド原産の伝統的発酵乳から粘稠性を有するラクトコッカス属乳酸菌を分離して、この分離株をケフィア由来のラクトコッカス属乳酸菌と併用することが解決する手段となると考えた。これらの乳酸菌は共に発酵温度が２０℃前後であり、ケフィアと同じ温度帯で発酵されるので、併用する際に、都合が良い。
また、粘稠性を確実に賦与するためには、特定の粘稠株を分離同定する必要がある。そこで、我々は、自社で植え継いでいた複数のカスピ海ヨーグルト、および自社研究所保存のビーリから粘稠性を有する複数の乳酸菌を分離、同定した。その結果、それらが全てラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）であることを見出した。
さらに、これらの菌株を、マウスにおいて免疫賦活作用があるケフィア分離株であるＹＲＣ３７８０株と併用して発酵乳を試作したところ、いずれの場合も適度に粘稠性を有し、ホエー分離の起き難い、良好な風味を有する発酵乳を作ることができた。
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。

請求項１記載の本発明は、発酵乳の製造にあたり、ケフィアから分離した、免疫賦活作用を有する乳酸菌ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＹＲＣ３７８０株（ＦＥＲＭＰ−１８３２０）およびラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・ラクチス・ビオバー・ジアセチラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓｂｉｏｖａｒ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）ＹＲＣ３７８４株（ＮＩＴＥＰ−１４４）と、菌体外多糖類を産生して粘稠性を示す乳酸菌としてラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＹＲＣ３７０１株（ＮＩＴＥＰ−１４３）と、を組み合わせてスターターとして用いることを特徴とする発酵乳の製造方法である。

請求項２記載の本発明は、菌体外多糖類を産生して粘稠性を示す乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＹＲＣ３７０１株（ＮＩＴＥＰ−１４３）に追加して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＹＲＣ３７０２株（ＮＩＴＥＰ−１７４）、同ＹＲＣ３７０３株（ＮＩＴＥＰ−１７５）、および同ＹＲＣ３７０４株（ＮＩＴＥＰ−１７６）を用いる、請求項１記載の方法である。

本発明によれば、ケフィアから分離した免疫賦活作用を有するラクトコッカス属乳酸菌と、乳中で菌体外多糖類を産生して粘稠性を示すラクトコッカス属乳酸菌を提供される。さらに、これら乳酸菌を併用してスターターとして用いることにより、免疫賦活作用を有し、かつ粘稠性を有する発酵乳の製造方法が提供される。

本発明によって、日本国内でカスピ海ヨーグルトと俗称される自家製の発酵乳と、フィンランド原産のビーリと呼ばれる粘稠性の自然発酵乳は、粘稠性株としてラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリスが共通に存在し、これらの菌株は、極め性質が類似しているが、パルスフィールドゲル電気泳動の比較では、菌株としては多種類のものがあることが判明し、菌株として区別可能であることが示された。本発明では、パルスフィールド電気泳動のパターンを比較し、ＹＲＣ３７０１株、ＹＲＣ３７０２株、ＹＲＣ３７０３株およびＹＲＣ３７０４株が株として識別された。
これらの粘稠性株の１種、あるいは２種以上を組み合わせて、ケフィアより分離した免疫賦活力を期待できるラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリスＹＲＣ３７８０株と併用して、発酵乳を製造すると、ホエー分離を抑え、粘稠性を有した良好な風味の発酵乳を作ることができることが分かった。また、粘稠性株のラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリスの配合比を変えることで、発酵乳の粘度を調整することが可能である。
さらに、ケフィアから分離したラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・ラクチス・ビオバー・ジアセチラクチスＹＲＣ３７８４株が、マウスにおいて脾臓細胞のいくつかのサイトカイン産生を増強し、免疫賦活が期待できることも明らかとなった。この株を本発明のＹＲＣ３７０１株、ＹＲＣ３７０２株、ＹＲＣ３７０３株あるいはＹＲＣ３７０４株と併用すると、粘稠性を有し、しかも免疫賦活作用を期待できる発酵乳を製造できる。

上記したように、我々はカスピ海ヨーグルトおよびビーリから分離した粘稠性を有する複数の乳酸菌を同定したところ、それらが全てラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）であることを見出した。
そこで、これらの菌株について、パルスフィールドゲル電気泳動と呼ばれる手法で、菌株の識別を行い、代表的な菌株を選び、カスピ海ヨーグルト分離株をＹＲＣ３７０１、ＹＲＣ３７０３、ＹＲＣ３７０４と命名し、ビーリ分離株をＹＲＣ３７０２と命名した。これらの菌株ＹＲＣ３７０１、ＹＲＣ３７０２およびＹＲＣ３７０３、ＹＲＣ３７０４はいずれも乳を発酵すると、強い粘稠性を示した。

また、ケフィアから分離したラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・ラクチス・ビオバー・ジアセチラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓｂｉｏｖａｒ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）ＹＲＣ３７８４株では、マウスの経口投与試験によって、マウスの脾臓細胞のＮＫ活性を上げ、幾つかのサイトカインの産生を促進することを実験によって解明した。

そこで、今回分離したＹＲＣ３７８４株とＹＲＣ３７０１株を併用して発酵乳を試作したところ、特有の風味を有し、かつ適度に粘稠性を有し、ホエー分離の起きにくい、良質で、しかもケフィアの良好な風味を有する発酵乳を作ることができた。
このことによって、ケフィアと同等の保健効果が期待できる発酵乳を開発することができた。また、他の粘稠性を有する菌株と組み合わせた場合も同様の結果が得られた。

これらの粘稠性を示す乳酸菌株であるＹＲＣ３７０１株、ＹＲＣ３７０２株、ＹＲＣ３７０３株、ＹＲＣ３７０４株は、いずれも独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、それぞれＮＩＴＥＰ−１４３、ＮＩＴＥＰ−１７４、ＮＩＴＥＰ−１７５、ＮＩＴＥＰ−１７６である。また、ケフィアから分離したＹＲＣ３７８４株についても同様に寄託されており、その受託番号はＮＩＴＥＰ−１４４である。さらに、前記先願において見出したケフィアの分離株のうち、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＹＲＣ３７８０株は、独立法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭＰ−１８３２０である。この菌株も本発明に使用できる。

本発明のラクトコッカス属乳酸菌は、一般に製造中にバクテリオファージの攻撃を受けやすい。そういう意味では、このように同じような粘性を示すラクトコッカス属の菌株であっても、起源の異なる複数のラクトコッカス属を組み合わせることで、バクテリオファージの攻撃を受けにくくなるという効果も期待できる。
また、その他の乳酸菌も組み合わせることで、さらに品質の高い、発酵乳を製造できる可能性があることは容易に推測できる。
さらに、本発明における発酵乳は「乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（昭和２６年１２月２７日厚生省令）」の発酵乳規格に当てはまるものだけでなく、乳酸菌飲料や殺菌乳酸菌飲料にも容易に応用できる。

以下において、本発明を詳しく説明する。なお、ラクトコッカス属を含む乳酸菌の多糖類産生性に関しては、例えばＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＤａｉｒｙＪｏｕｒｎａｌ第１１巻（乳酸菌多糖類に関する特集号）、ＦｉｒｓｔＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎＥｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｆｒｏｍＬａｃｔｉｃＡｃｉｄＢａｃｔｅｒｉａ：ｆｒｏｍＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓｔｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．（２００１年）等の文献に記載されている。また、乳酸菌を分離する手法に関しても、適切な教科書が存在し、誰でも容易に実施可能である（例えば、Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｆ．Ａ．ａｎｄＬｏｖｅｌｏｃｋ，Ｄ．Ｗ．：ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓＳｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ１９７９を参照）。
さらに、本発明の実施に必要なケフィアに由来する乳酸菌株と、カスピ海ヨーグルト由来の多糖類産生性の乳酸菌株やビーリから分離した多糖類産生性の乳酸菌は、前記したように、いずれも所定の機関に寄託されている。

（実施例１）カスピ海ヨーグルトおよびビーリからの粘稠性ラクトコッカス属乳酸菌の分離
よつ葉乳業（株）で植え継いでいるカスピ海ヨーグルト由来の５種類（Ａ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｙ）の粘稠性乳酸菌、およびビーリ由来の１種類の粘稠性乳酸菌の分離に用いた培地や培養技術は、特開２００３−０４７４６２号公報に開示した通りである。粘稠性乳酸菌を分離するのに使用した発酵乳の検体リストを表１に示す。

各検体を段階希釈したものをＭ１７平面培地上に塗抹し、３０℃で２日間程度培養後、コロニーを釣菌した。カスピ海ヨーグルト検体Ａ、Ｈ、Ｋ、Ｙは生じたコロニーの形態が均一だったので、検体Ａについては代表的な１株、それ以外はランダムに各１０株ずつ分離し、検体Ｎについてはコロニー形態が大小の２種類が観察されたので大小（それぞれＮＬ、ＮＳとした）２種類のコロニーを各１０株ずつ分離した。また、ビーリにおいても、生じたコロニー形態が均一であったので、３株を分離した。
このように合計５４株について画線分離し、純化した。これらを滅菌１０％還元脱脂乳に接種し、２０℃で一昼夜培養後、撹拌して粘稠性を官能的に比較した。その結果、カスピ海ヨーグルトからの分離株は、Ａ検体は１株から１株、Ｈ検体から１０株中８株、Ｋ検体から１０株中９株、Ｎ検体からはＮＬ分離株で１０株中１株、ＮＳ分離株で１０株中８株、Ｙ検体からは１０株中１０株が粘稠性を示し、合計３７株が粘稠性を示した。市販ビーリ９２６−５検体からは３株の全てが粘稠性を示した。

（実施例２）粘稠性株の同定と性状
各検体から高い割合で、粘稠性を示す株が分離されたので、その代表的な分離株について同定を行った。これらの粘稠性株は全てグラム陽性の球菌でカタラーゼ陰性、１５℃で生育し、４５℃では生育できないことから、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属と推定された。
代表的な菌株について、後記実施例３で示したように、パルスフィールドゲル電気泳動でパターンを比較した。その結果、粘稠性株は少なくとも、４種類のバンドパターンに類型化できることが分かった。そこで、各検体からそれぞれ代表的な株を選んで、ＹＲＣ３７０１株、ＹＲＣ３７０２株、ＹＲＣ３７０３株、ＹＲＣ３７０４株と命名し、これらについて１６ＳｒＤＮＡ配列に基づく同定を実施した。

その結果、表２に示したように、全てラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）と同定された。また、ＡＰＩ５０ＣＨ（日本ビオメビュー）を用いて定法に従って糖発酵性試験も実施し、各株の基本的性状を調べた。その結果を表２に示す。
これらの株は全て、ガラクトース、グルコース、フラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ラクトースを発酵し、エスクリンについてはＹＲＣ３７０２株のみは発酵するが、他の株は弱く発酵した。また、サリシンに関してはＹＲＣ３７０２株のみ発酵し、その他のＹＲＣ３７０１株、ＹＲＣ３７０３株、ＹＲＣ３７０４株は発酵しなかった。これらの結果からも、全ての分離株はラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）であると同定された。

（実施例３）粘稠性株のパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）パターンの比較
各粘稠性株の特徴付けのために、実施例２ですでに言及しているように、ＹＲＣ３７０１株、ＹＲＣ３７０２株、ＹＲＣ３７０３株、ＹＲＣ３７０４株についてＰＦＧＥで泳動パターンを調べた。測定は、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製のパルスフィールド電気泳動試薬であるジーンパス試薬キット１（カタログ番号３１０−０１１１Ｃ）を用いて実施した。方法はキットに付属しているマニュアル（２００２年８月改訂版）に従った。電気泳動装置はＣＨＥＦ−ＤＲＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に２Ｌの０．５×ＴＢＥバッファー（５０μＭチオ尿素）を入れ、ポンプとチラーを作動させ、泳動バッファーは１４℃に設定した。アガロースゲルをストッパーの位置に合わせて置き、アガロースゲルとバッファーの温度を平衡化させた後、２００Ｖ、パルスタイム１〜２０秒、Ａ／Ｂ比１．０、泳動時間１６ｈで電気泳動した。
電気泳動後のアガロースゲルはｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅで染色し、ＤＮＡのバンドパターンを観察した。その結果、図１に示した結果を得た。なお、ＳｍａＩ分解物を泳動した。マーカーはＤＮＡラダー（４８．５Ｋｂずつ増える）である。また、対照としてスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）も泳動した。詳細はＢｉｏ−Ｒａｄ社製、ジーンパスのキットの説明に従った。

この結果、国内カスピ海ヨーグルト検体Ａから分離したＹＲＣ３７０１株、検体Ｈから分離したＹＲＣ３７０３株、検体ＮＬから分離したＹＲＣ３７０４株のＰＦＧＥパターンはそれぞれ異なることがわかった。
ＹＲＣ３７０１株と同じパルスフィールド電気泳動パターンを示す粘稠性株はＹ、Ｋ検体からも分離された。
また、よつ葉乳業（株）研究所で管理しているビーリから分離されたＹＲＣ３７０２株ともはっきりと異なる電気泳動パターンを示し、それぞれ株としては異なることが示された。

結論として、このような国内に自然発酵乳として土着化しているいくつかのカスピ海ヨーグルトとフィンランドのビーリ由来の粘稠性を有する乳酸菌は、粘稠性を示すという意味では互いに極めて類似しており、汎世界的に分布しているが、分離源が違うと菌株も異なることが多いと言える。
また、ＰＦＧＥパターンによって、これらの菌株を株ごとに判別可能なまでに特徴付けすることができた。
この特徴づけられたＹＲＣ３７０１株、ＹＲＣ３７０２株、ＹＲＣ３７０３株およびＹＲＣ３７０４株は、それぞれ独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、それぞれＮＩＴＥＰ−１４３、ＮＩＴＥＰ−１７４、ＮＩＴＥＰ−１７５、ＮＩＴＥＰ−１７６である。

（実施例４）乳酸菌株の粘稠性の比較
ＹＲＣ３７０１株、ＹＲＣ３７０２株、ＹＲＣ３７０３株およびＹＲＣ３７０４株をそれぞれ、１０％還元脱脂乳に接種して、２０℃一昼夜培養後、粘度計を用いて、粘度を比較した。また、スパチュラで撹拌後の糸曳きを官能的に比較した。対照として強い粘性を示さないＹＲＣ３７８０株を用いた。結果を表３に示す。

注：＊糸曳性の評価；＋＋＋：強い、＋＋：やや強い、＋：弱い、−：ほとんどない。

表３から明らかなように、対照としたＹＲＣ３７８０株に比べると、どの分離株も強い粘性を示し、糸曳き性を示した。それ故、これらの株のどれを用いても、発酵乳の粘性には同等の効果を与えることが推定された。

（実施例５）ケフィアからのラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・ラクチス・ビオバー・ジアセチラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓｂｉｏｖａｒ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）の分離
ケフィアからのラクトコッカス属乳酸菌については、特開２００３−０４７４６２号公報において詳細に記載した方法で分離することができる。
ここではさらに、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・ラクチス・ビオバー・ジアセチラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓｂｉｏｖａｒ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）の分離法を示す。

発酵製品から本菌種を分離することは、一般の成書を参照すれば誰でも可能であるが、特開２００３−０４７４６２号公報に示された方法でケフィアから、ラクトコッカス属乳酸菌を分離し、これをジアセチラクチス（ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）株の判別用のＫｅｍｐｌｅｒ＆ＭａｃＫａｙの培地［Ｋｅｍｐｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄＭｃＫａｙ，Ｌ．Ｌ．：Ｉｍｐｒｏｖｅｄｍｅｄｉｕｍｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｉｔｒａｔｅ−ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９，９２６−９２７（１９７２）］で培養し、濃青色に染色されるコロニーのものはクエン酸資化性を有する乳酸菌である。
ケフィアあるいはケフィア粒を用いて、これを希釈後、本培地に塗抹培養して、生じた濃青色のコロニーを分離しても良い。
本発明では、このようにしてラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・ラクチス・ビオバー・ジアセチラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓｂｉｏｖａｒ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）ＹＲＣ３７８４株を分離した。本菌は乳中に含まれるクエン酸を資化してジアセチルを生産するため、ケフィアを特徴づけるフレーバーの一要素となる。
この株のＰＦＧＥパターンを実施例３で示したのと同様な方法で分析し、図２にＹＲＣ３７０１，ＹＲＣ３７８０株のＰＦＧＥパターンと共に示した。
本菌株は独立行政法人製品評価基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＮＩＴＥＰ−１４４である。

（実施例６）ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・ラクチス・ビオバー・ジアセチラクチスＹＲＣ３７８４株の微生物学的特徴
本菌株は表４に示した性状が特徴である。パルスフィールドゲル電気泳動のパターンは実施例３に他の株と比較して示した通りである。この種の菌株はクエン酸を資化してジアセチルを産生し、発酵乳に芳香を与える。本発明の場合においても、発酵乳として培養すると、ケフィア風の独特の芳香を与える。

（実施例７）ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・ラクチス・ビオバー・ジアセチラクチスＹＲＣ３７８４株のマウスにおける免疫賦活作用
（１）材料と方法
４週齢（入荷時指定週齢）のＳＰＦ、Ｃ３Ｈ／Ｈｅｊマウス（♂）（日本クレア製）を使用した。
一群６匹で試験した。飼育は固形飼料（「ＣＡ−１」、日本クレア製）を滅菌処理して与えた。通常、設定温湿度：２４±１℃、５５±５％、高温ストレス期間条件：３７±２℃、５５±５％の条件で行った。
給水は水道水をフィルター濾過後に自由摂取させることで行った。試験対象物質は、Ａ：ケフィア分離株ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＹＲＣ３７８０株を培養して得た脱脂発酵乳凍結乾燥物、Ｂ：ケフィア分離株ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・ラクチス・ビオバー・ジアセチラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓｂｉｏｖａｒ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）ＹＲＣ３７８４株を培養して得た脱脂発酵乳凍結乾燥物を用いた。

試験群は６匹／群で行った。投与量は全て200ｍｇ(凍結乾燥物重量として)／ｋｇ（マウス体重）で行った。これは人に換算した場合に、50ｋｇ体重の人で発酵乳（全固形分１０％と仮定）として約100ｇを摂取する量に値する。各試験対象物質は、蒸留水に溶解し濃度を調整し、胃ゾンデを用いた強制経口投与にて１７日間（高温ストレス負荷期間を含む）連続して行った。なお、対照群には同容量の蒸留水を投与した。
高温ストレスは、市販の保温電球を用いて飼育室を３７℃に保ち、１４日間の試験対象物質投与翌日より３日間実施した。症状観察、体重測定および摂餌量の測定は、１０：００ａ．ｍ．〜１１：００ａ．ｍ．に毎日実施した。本飼育終了後、頸椎脱臼にて動物を屠殺後、脾臓を摘出した。

ＮＫ活性とは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性を調べるものである。この細胞は抗原や腫瘍細胞を直接攻撃する働きやＩＦＮ−γ産生能を持ち、一般に制ガン作用、免疫賦活作用の指標として用いられる。測定方法は、摘出した脾臓を５ｍｌの１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０ペトリ皿中で、スライドグラス２枚の磨りガラス部分で挟み込みすりつぶし、更に金属メッシュを通しリンパ細胞の浮遊細胞液とした。１６００ｒｐｍ、５℃、２分間の条件で遠心後、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０培地中に浮遊させた。
その後、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０培地で細胞数を調整し、^５１Ｃｒをラベルした標的細胞ＹＡＣ−１とＥ：Ｔ比［リンパ細胞数（Ｅ）と使用する標的細胞数（Ｔ）の比率のこと］５０：１で４時間培養し、上清中に遊離した^５１ＣｒからＮＫ活性を測定した。

（２）サイトカイン産生能の測定
サイトカインとは、免疫調節物質の総称である。ＩＬ−２はＮＫ細胞やそれと同様の働きをするマクロファージの活性化作用などを有する。ＴＮＦ−αのＴＮＦとは、腫瘍壊死因子の略で、その言葉のとおり腫瘍細胞を破壊する働きをするが、他の免疫作用も有するサイトカインである。ＩＦＮ−γもＩＬ−２と同様に、ＮＫ細胞やマクロファージの活性化作用を有するが、特にマクロファージの活性化に重要な因子である。このように、３種類とも、免疫応答に重要なサイトカインであり、ＮＫ活性と同様に免疫賦活作用の指標となる。
測定方法は、浮遊させた脾臓細胞を１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０培地で細胞数を２×１０６個／ｍｌに調整し、２４孔のプレートに２ｍｌ／ｗｅｌｌずつ分注した。さらに、ｃｏｎＡ１０μｇ／ｍｌ、ＬＰＳ１０μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中で７２時間培養後、その培養上清中のＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２の濃度を測定した。試験結果は平均値±標準誤差で表し、有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ'ｓｔ−Ｔｅｓｔを用いた。

（結果）正常マウスにＹＲＣ３７８４株を培養して得た脱脂発酵乳凍結乾燥物を１４日間前投与し、その後、高温ストレス負荷を３日間実施し、免疫能を低下させたモデル動物に対する免疫賦活作用について、ＮＫ活性およびサイトカイン産生能を測定し検討を行った。
試験結果は平均値±標準誤差で比較した。試験期間中の一般症状は、試験対象物質前投与１４日間においては毛並み、行動、排泄物に関して特に異常は観察されなかった。しかし、高温ストレス負荷を開始すると共に、対照群についてはストレスによる運動量の低下、試験対象物質投与群には騒獣行動などの暴れなどが観察された。
体重推移および摂餌量については、高温ストレス負荷１日目以降より全群においてストレス負荷による体重の減少および摂餌量の低下が観察された。しかしながら、ＹＲＣ３７８４株の脱脂発酵乳凍結乾燥物では、ストレス２日目以降に摂餌量の回復傾向が観察された。解剖時における観察では、対照群に高温ストレス由来の腸管の白色化と弾力性の低下が観察されたが、ＹＲＣ３７８０株およびＹＲＣ３７８４株の脱脂発酵乳凍結乾燥物投与群については、その症状は極めて軽度であった。

ＮＫ活性では、対照群２．８±０．２７％に比較して、ＹＲＣ３７８０株の脱脂発酵乳凍結乾燥物投与群で５％の危険率で有意に上昇し、ＹＲＣ３７８４株で１％の危険率で有意な上昇を示した（表５）。
各サイトカイン産生に対する影響では、ＹＲＣ３７８０株ではＩＬ−２産生、ＴＮＦ−α産生において対照に対してそれぞれ５％の危険率で有意に増加し、ＩＦＮ−γの産生においては有意な増加は見られなかった(表５)。一方、ＹＲＣ３７８４株においてはＩＬ−２の産生においては対照に比べて５％の危険率で有意に増加し、ＴＮＦ−αの産生とＩＮＦ−γの産生においてはそれぞれ１％の危険率で増加した（表５）。
ＹＲＣ３７８０株に関しては、すでに特開２００３−０４７４６２号公報に記載したように、免疫賦活作用があることが示されているが、本発明のＹＲＣ３７８４株の脱脂乳培養物についても免疫賦活作用を有する物質であることが確認された。

注：＊危険率５％で有意。＊＊危険率１％で有意

（実施例８）発酵乳の粘稠性とホエー分離に与えるスターター乳酸菌株の組み合わせの影響
まず、発酵乳の原材料は無脂乳固形分９％、乳脂肪分３％になるよう調製し、砂糖を４．５％加えた（表６）。この原材料を表６に示す配合割合で配合し、均質化してから、殺菌（９０℃、３０分）し、２２℃まで冷却後、表７に示した組み合わせになるように粘稠性のＹＲＣ３７０１株のスターターを０．１％〜０．４％（重量）、ケフィア分離株であるＹＲＣ３７８０株を用いて調製したスターターを２．６〜２．９％（重量）の割合で添加し、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの合計４種類の発酵乳を試作した。
それぞれ、発酵温度２２℃において１４時間培養を行った。発酵終了後、攪拌しながら３時間かけて１０℃まで冷却し、ゲルを破砕して均一化した。
これらのサンプルを用いて評価を行った（表８）。すなわち、粘稠性株を配合した割合による相違を官能評価によって比較した。粘度は東機産業ＲＢ８０型粘度計を用いて、回転数６０ｒｐｍローターＮｏ．１３あるいは１４を用いて、測定３０秒後の測定値をもって粘度とした。単位：ｃＰ（センチポアズ）。粘稠性を示さない発酵乳の代表例として市販のケフィア（よつ葉乳業製）を比較対照とした。

注；＋＋＋：強く感じる、＋＋：程よく感じる、＋：やや弱く感じる、±：弱く感じる、−：感じない。ＮＤ：測定しない。

表８の結果から明らかなように、粘稠性のＹＲＣ３７０１株スターターの配合量が多いものは粘性が高く、少ないものは粘性が低い傾向が見られた。よって、ＹＲＣ３７０１株の添加量に応じて粘性が高まることが分かった。
ホエーの分離性に与える影響を調べるために、実施例８で調製した発酵乳について、ゲルの破砕後すぐに１０℃まで冷却したサンプルと、ゲルの破砕後攪拌しながら３時間かけて１０℃まで冷却したサンプルについて、１０℃で２１日間保存し、分離しているホエーの量を計量し、その重量の全体に対する割合をもってホエーの分離程度として算出した。
結果を表９に示す。

その結果、粘稠性のＹＲＣ３７０１株スターターをＹＲＣ３７８０株と併用して培養することで、粘稠性を与え、保存中のホエー分離を抑制することができた。Ａ，Ｂ，Ｃ間では大きな差がなかったが、ＹＲＣ３７０１株の添加割合が低いＤに比べてはホエーの分離程度は低かった。

（実施例９）ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・ラクチス・ビオバー・ジアセチラクチスＹＲＣ３７８４株とラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリスＹＲＣ３７０１株を発酵乳に併用した場合の効果
ＹＲＣ３７８４株は、本発明の後記実施例１０に示したＹＲＣ３７８０株の代わりに、本乳酸菌をスターターとしてＹＲＣ３７０１株と併用すると、ＹＲＣ３７８４株によるジアセチル生産性によって、フレーバーが強くなり、ケフィア風味が賦与された。

ＹＲＣ３７０１株もＹＲＣ３７８４株もそれぞれ単独で乳酸発酵し、乳を凝固させるから、ＹＲＣ３７０１株に対するＹＲＣ３７８４株の割合を多くすればするほど、その添加割合に応じてジアセチル芳香臭は強くなる。ＹＲＣ３７８４株は、実施例７で示したように、マウスの経口投与において、免疫賦活作用が期待できるから、当然ながら、ＹＲＣ３７０１株と併用して発酵乳を作成した場合においても、その菌数の割合に応じて免疫賦活作用が期待できる。

（実施例１０）ＹＲＣ３７０２株、ＹＲＣ３７０３株、及びＹＲＣ３７０４株をＹＲＣ３７８０株と組み合わせた場合の発酵乳の試作結果
主にＹＲＣ３７０１株を使用して、ＹＲＣ３７８０株またはＹＲＣ３７８４株と組み合わせた例を実施例８と９で示したが、ここでは、ＹＲＣ３７０１株に加えて、他のＹＲＣ３７０２株、ＹＲＣ３７０３株、ＹＲＣ３７０４株とＹＲＣ３７８０株またはＹＲＣ３７８４株と組み合わせた発酵乳を試作した。組み合わせ、および発酵物の評価を表１１に示した。

実施例４で示したように、ＹＲＣ３７０１，ＹＲＣ３７０２，ＹＲＣ３７０３及びＹＲＣ３７０４株はそれぞれ、単独で培養しても粘稠性を示す株であるが、これらを表１１に示したように組み合わせてＹＲＣ３７８０株あるいはＹＲＣ３７８４株と併用しても発酵乳は強い粘度（粘着力）を示した。
特に複数の粘稠株を併用した方がやや粘度が高く、糸曳き性も強い傾向が示唆されたが、どの試作品においても風味が良好で、発酵乳として総合評価を行っても、良好であった。また、ラクトコッカス属乳酸菌は、一般的に極めてバクテリオファージに攻撃されやすい。バクテリオファージに攻撃されると、ｐＨの低下の遅延が起こり、商業的な発酵乳生産では致命的な経済的損失を被る可能性がある。それ故、由来の異なる粘稠性株を複数併用することによって、ファージに対する抵抗性が高くなることが期待できる。

本発明によれば、乳中で多糖類を産生して粘稠性を示す乳酸菌と、免疫賦活作用を有する乳酸菌が提供され、さらに、これらを用いることにより、免疫賦活作用が期待できる粘稠性を有する発酵乳の製造法が提供される。それ故、本発明は、発酵乳に限らず、広く乳酸菌飲料や殺菌乳酸菌飲料などを含む食品分野に有用である。

国内のカスピ海ヨーグルトから分離した粘稠性株とビーリから分離した粘稠性株のパルスフィールドゲル電気泳動パターンである。国内のカスピ海ヨーグルトから分離した粘稠性株ＹＲＣ３７０１株とケフィアから分離したＹＲＣ３７８０株、ＹＲＣ３７８４株のパルスフィールドゲル電気泳動パターンである。

符号の説明

［図１］
レーン１：分子量マーカー（Ｌａｍｂｄａｌａｄｄｅｒｓ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、ジーンパスグループ１）
レーン２：スタフィロコッカス・アウレウス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、ジーンパスグループ１）（比較対照用）
レーン３：ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリスＹＲＣ３７０２株（ビーリからの分離株：分離株名９２６−５−１）
レーン４：ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリスＹＲＣ３７０３株（国内カスピ海ヨーグルトＨ―１検体から分離）
レーン５：ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリスＹＲＣ３７０１（国内カスピ海ヨーグルトＡ検体から分離）
レーン６：ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリスＹＲＣ３７０４（国内カスピ海ヨーグルトＮＬ検体から分離したＮＬ―７株）
レーン７：サイズマーカー
［図２］
レーン１：ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリスＹＹＲＣ３７０１（国内カスピ海ヨーグルトＡ検体から分離）
レーン２：ケフィア分離株ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリスＹＲＣ３７８０株
レーン３：ケフィア分離株ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・ラクチス・ビオバー・ジアセチラクチスＹＲＣ３７８４株
レーン４：スタフィロコッカス・アウレウス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、ジーンパスグループ１）（比較対照用）
レーン５：分子量マーカー（Ｌａｍｂｄａｌａｄｄｅｒｓ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、ジーンパスグループ１）

Claims

発酵乳の製造にあたり、ケフィアから分離した、免疫賦活作用を有する乳酸菌ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＹＲＣ３７８０株（ＦＥＲＭＰ−１８３２０）およびラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・ラクチス・ビオバー・ジアセチラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓｂｉｏｖａｒ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）ＹＲＣ３７８４株（ＮＩＴＥＰ−１４４）と、菌体外多糖類を産生して粘稠性を示す乳酸菌としてラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＹＲＣ３７０１株（ＮＩＴＥＰ−１４３）と、を組み合わせてスターターとして用いることを特徴とする発酵乳の製造方法。
菌体外多糖類を産生して粘稠性を示す乳酸菌として、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＹＲＣ３７０１株（ＮＩＴＥＰ−１４３）に追加して、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）ＹＲＣ３７０２株（ＮＩＴＥＰ−１７４）、同ＹＲＣ３７０３株（ＮＩＴＥＰ−１７５）、および同ＹＲＣ３７０４株（ＮＩＴＥＰ−１７６）を用いる、請求項１記載の方法。