MXPA00011813A - Recubrimiento biologico con un efecto protector y curativo para el control de la descomposicion postcosecha. - Google Patents

Recubrimiento biologico con un efecto protector y curativo para el control de la descomposicion postcosecha.

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Abstract

Se proporcionan nuevos metodos y composiciones para el biocontrol de enfermedades de plantas, por medio del uso de un recubrimeinto biologico que confiere tanto un efecto protector como curativo para el control de descomposicion postcosecha. El recubrimiento incluye saless de quitosana, un microorganismo antagonico, y un cation. Una composicion de sales de quitosana, CaCLz y levadura es efectiva. Las actividades fungicidas combinadas de las sales de quitosana y el microorganismo antagonico hacen a las composiciones de la presente invencion superiores a recubrimientos previos. Cuando se aplican a la superficie de un producto vegetal cosechado, las composiciones tanto evitan como curan la descomposicion postcosecha.

Description

RECUBRIMIENTO BIOLÓGICO CON UN EFECTO PROTECTOR Y CURATIVO PARA EL CONTROL DE LA DESCOMPOSICIÓN POSTCOSECHA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud co-pendiente No. de Serie Provisional U.S. 60/088, 302. Nuevos métodos y composiciones se proporcionan para el biocontrol de enfermedades de planeas mediante el uso de un recubrimiento biológico que tiene tanto un efecto protector como curativo para el control de descomposición postcosecha. El recubrimiento incluye sales de quitosana, al menos un microorganismo antagónico, y un mitigador.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El mercado de U.S. para biocontrol de enfermedades postcosecha de frutos de árbol podría exceder $100 millones para el año 2000 ( Indus trial Bi oprocessing, Sept. 1992) . En Pos tharves t News and Informa ti on (1991) se estimó que se pierde aproximadamente 25% de frutas y verduras cosechadas debido a enfermedades en la postcosecha. Los fungicidas sintéticos han sido el REF.124719 principal medio para controlar enfermedades postcosecha de frutas y verduras. Sin embargo, la preocupación creciente del público en el carácter carcinógeno de fungicidas sintéticos, ha conducido al retiro de algunos fungicidas del mercado. El desarrollo de resistencia a fungicidas en patógenos ha limitado fungicidas químicos como un medio para controlarlos. El control de enfermedades de plantas no es un problema confinado a los E.U. El parlamento Europeo ha votado en favor de una prohibición total en el tratamiento postcosecha de frutas y verduras con pesticidas tan pronto como esta prohibición llegue a ser factible. El retiro de fungicidas comunes del uso en los Estados Unidos y otras partes del mundo está creando un mercado grande y nuevo para los agentes de control biológico ("biocontrol"). Baker (1987) ha definido el control biológico como "la disminución de inoculo o la actividad que produce la enfermedad de un patógeno realizado por medio de uno o más organismos, incluyendo la planta huésped pero excluyendo al hombre" . El costo de comercialización de un agente de control biológico es mucho menos caro que el costo de comercialización de un pesticida sintético, debido a que solo se requieren las pruebas toxicológicas Tier 1 (Hofstein et al . , 1 994 ) . También, si se selecciona apropiadamente un agente de control biológico, se requieren menos estudios nuevos de impacto ambiental. Los recubrimientos actuales (principalmente ceras) para productos postcosecha son algo efectivos en retardar la maduración, pero en general, no evitan la descomposición. Además, estos recubrimientos se sub escrutan como posibles peligros a la salud. Los fungicidas sintéticos que se han adicionado a los recubrimientos otra mitigar los problemas de descomposición se han retirado recientemente del mercado, y también hay presión pública para retirar los recubrimientos basados en petróleo debido a preocupaciones de salud y ambientales. Por lo tanto existe una necesidad crítica de alternativas para recubrimientos disponibles actualmente para productos agrícolas. Los recubrimientos necesitan ser fungicidas así como seguros para el consumidor y el ambiente. Se ha reportado que las levaduras antagonistas son agentes efectivos para el control biológico de enfermedades postcosecha (Wilson and El Ghaouth, 1993) . Sin embargo, los microorganismos antagonistas disponibles actualmente no han demostrado proporcionar control de descomposición postcosecha de frutas y verduras comparable al obtenido con fungicidas sintéticos. Las limitaciones incluyen la incapacidad de los microorganismos para curar infecciones establecidas previamente en las cosechas y para evitar la reanudación de enfermedades quiescentes. Recientemente, la quitosana, un polímero derivado • de animal, ha demostrado tener algún potencial como preservativo antifúngico. La quitosana, un polímero de ß-1 , 4-glucosamina, se produce comercialmente a partir de quitina de exoesqueletos de artrópodo, que se han desacetilado para proporcionar suficientes grupos amino libres para hacer al polímero fácilmente soluble en ácidos orgánicos diluidos. La quitosana y sus derivados se sabe que forman una película semipermeable (Averbach, 1978), que es inhibidora de un número de hongos patógenos (Alian and Hadwiger, 1979), y que activa un número de procesos biológicos en tejidos vegetales, incluyendo la estimulación de quitinasas, la acumulación de fitoalexinas , la síntesis de inhibidores de proteinasa, y la disminución de lignificación (El Ghaouth et al . , 1992, a, b) . La naturaleza policatiónica de la quitosana se cree que proporciona la base de su funcionalidad fisicoquímica y biológica. La quitosana se considera segura como se indica por pruebas de alimentación con animales domésticos. Cuando se aplicó como un recubrimiento, la quitosana controló la descomposición y retardo la maduración de fresa, pimiento, tomate, y pepino actuando como una barrera selectiva a la difusión de gas (Al Ghaouth et al . , 1991) . El control de la descomposición por la quitosana se .cree que se origina en parte, de su propiedad antifúngica. En realidad, estudios in vi tro mostraron que la quitosana no solo inhibió el crecimiento radical de los principales patógenos postcosecha, sino que también indujo severas alteraciones morfológicas en Rhizopus s tol onifer y Botryti s cinérea , así como aumentó la pérdida celular en ambos hongos, interfiriendo presumiblemente con membranas plasmáticas fúngicas (El Ghaouth et al . , 1992 b). Debido a la infección de productos tal como fruta, que puede presentarse ya sea antes de cosechar o durante la cosecha, se espera que un agente de control biológico ideal exhiba tanto una actividad protectora como curativa comparable a la observada con fungicidas sintéticos. Microorganismos antagónicos disponibles actualmente no parecen ser capaces de controlar infecciones establecidas previamente y son más efectivos cuando se aplican antes de la infección por el patógeno. Otras publicaciones de interés incluyen Droby et al . (1997); Freeman and Dror (1-994) y 096/13985, Pat . U.S. No. 5,670,368, WO92/18009.
Se necesitan nuevos medios seguros y efectivos para controlar enfermedades postcosecha. La presente invención proporciona tales medios.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a composiciones únicas que son una combinación de agentes antifúngicos con microorganismos antagonistas y un mitigador. La invención también se refiere a métodos para evirar y curar la descomposición postcosecha de plantas causada por varios hongos patógenos, aplicando las composiciones de la invención a plantas. Las combinaciones de la presente invención forman un "recubrimiento biológico". En una modalidad de una composición de la presente invención, el microorganismo antagonista es una levadura, en particular Candi da sa i toana , y los agentes antifúngicos" incluyen sales de quitosana complementadas con CaCl . Otros microorganismos adecuados incluyen bacterias, por ejemplo Pseudomona s syringa e y Ba cill us subti l i s . En una modalidad preferida, los aditivos bioquímicos son sales de quitosana complementadas con CaCl2 o propionato de quitosana complementado con CaCl2, y una levadura, en particular Candi da sai toana . Otros géneros adecuados de levadura incluyen Candi da spp, Cryptococcus spp, Pi chia spp, Debaryomyces spp, Bulleromyces spp, Sporobol omyces spp, y Rhodotorula spp. Otras sales adecuadas de quitosana incluyen acetato de quitosana, sorbato de quitosana, propionato de quitosana, lactato de quitosana, glutamato de quitosana, benzoato de quitosana. Un mitigador es un aditivo que hace a la levadura resistente a los efectos adversos de la quitosana y ácidos orgánicos. Son adecuados los cationes monovalentes y divalentes de Ca, Mg, Zn o K. El mitigador no se considera que afecta al patógeno. La combinación de la propiedad antifúngica de sales de quitosana e.g. acetato de quitosana y la actividad de biocontrol de microorganismos antagónicos tal como la levadura C. sai toana , en donde la levadura funciona contra el patógeno en presencia de las sales de quitosana complementadas con CaCl , proporciona consistencia y eficacia mejorada en el control de la descomposición postcosecha. Además, la combinación de la levadura antagonista (C. sai toana ) con sales de quitosana complementadas con CaCl2 ofrece control de la descomposición postcosecha de frutas y verduras superior al obtenido con levadura antagonista sola o sales de quitosana complementadas con CaCl solas. Esta mejora es inesperada y se demostró sinergismo. Se sabe que la quitosana nativa y ácidos orgánicos (acético, sórbico, propiónico, y láctico) inhiben el crecimiento de levaduras tal como Candi da spp y hongos filamentosos tal como Botryti s cinérea , Peni ci lli um expansum Link, y Peni cilli um di gi ta tum . De este mcdo se espera que la combinación de quitosana-ácido orgánico con C. sai toana afectará adversamente la actividad de biocontrol de la levadura seleccionada. Sin embargo, inesperadamente, la combinación producida mejoró el control de hongos patógenos. La combinación de levaduras antagónicas ( C . sai toana ) con sales de quitosana (acetato de quitosana) complementadas con CaCl2 podría aplicarse a cosechas ya sea antes o después de la infección, debido a que la combinación tiene efecto tanto protector como curativo contra los principales patógenos postcosecha y ofrece un nivel de control de descomposición mejor que el de fungicidas sintéticos. La complejidad del modo de acción exhibido por los agentes combinados de la presente invención hace el desarrollo de resistencia a patógenos, en las plantas receptoras, más difícil y presenta una barrera altamente compleja que tiende a abatir la enfermedad.
Un aspecto de la invención es un recubrimiento biológico para productos agrícolas que incluye, en cantidades efectivas para actividad de biocontrol, sales de quitosana, y al menos un microorganismo antagónico efectivo para el biocontrol de enfermedades postcosecha, y un mitigador que es un catión monovalente o divalente, e.g. CaCl2. La cantidad efectiva de sales de quitosana es de aproximadamente 10 µg/ml a aproximadamente 500 µg/ml, preferentemente de aproximadamente 20 µg/ml a aproximadamente 250 µg/ml, más preferentemente de aproximadamente 200 µg/ml. La cantidad efectiva de un microorganismo antagónico es de aproximadamente 107 unidades formadoras de colonia a aproximadamente 10s unidades formadoras de colonia; preferentemente aproximadamente 108 unidades formadoras de colonia. Otro aspecto de la invención es un método para proteger un producto contra la descomposición postcosecha, el cual incluye recubrir la superficie del producto mediante atomizado, sumergido, o empapado con una cantidad efectiva del recubrimiento biológico. La fruta y plantas que son receptoras de los métodos y composiciones de la presente invención incluyen fruta pomácea (e.g., manzana, pera); fruta de hueso (e.g., durazno, nectarina, ciruela); frutas cítricas (e.g., naranja, limón, toronja, mandarina); verduras (e.g., tomate, pimiento, pepino); cosechas de raíz (e.g., papa, zanahorias); frutos tropicales (e.g., mango, plátano, guayaba, pina, aguacate); fruta de melón .
DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención proporciona una combinación nueva de sales de quitosana con al menos un microorganismo que es antagonista para patógenos postcosecha, y un mitigador. Se sabe que la quitosana nativa afecta adversamente la viabilidad tanto de levaduras antagonistas como de patógenos postcosecha. Este conocimiento previo obstaculiza el uso de sales de quitosana como un aditivo potencial a agentes de biocontrol (tal como levaduras antagonistas). Sin embargo, la adición de cationes divalentes o monovalentes (un "mitigador") tal como CaCl2 a la combinación de Sales de quitosana con Candi da sa i toana permitió que se explote la propiedad antifúngica de la quitosana y que se aumente la actividad de biocontrol de la levadura antagónica (C. sai toana ) . La formulación de sal de quitosana que actúa como un vehículo para un microorganismo antagónico, con un recubrimiento que retarda la maduración, es inhibidor de patógenos postcosecha. Por ejemplo, la adición de un mitigador tal como CaCl2 a la combinación de sales de quitosana con C. saitoana permitió que se exploten la propiedad antifúngica de la quitosana y la actividad de biocontrol de C. saitoana . . Las sales de quitosana, acetato, sorbato, propionato, lactato, y glutamato, complementadas con CaCl2 son inhibidoras de patógenos postcosecha tal como B. cinérea y P. expansum, pero no muestran efecto en el crecimiento de C. saitoana (Tabla 1) . Esto se confirmó además por los resultados obtenidos con futa de manzana. Lesiones de manzana tratadas con una combinación de C. saitoana con sales de quitosana complementadas con CaCl2 mostraron una colonización intensa de la herida por C. saitoana (Tabla 2) . Las complejidades de esta combinación proporciona una composición única (producto) . Mientras que las levaduras que se han encontrado efectivas incluyen Candida saitoana (C. saitoana) , Candida oleophila (C. oleophila) , Candida sake (C. sake) , Candida tenius (C. tenius) , Candida utilis (C. utilis) , Pichia guilliermondii (P. guilliermondii) , es bueno dentro del nivel del experto en el arte para determinar si un microorganismo antagónico particular muestra la resistencia necesaria, combinando el microorganismo candidato con sales de quitosana complementadas con CaCl, en cultivo y observar si los microorganismos permanecen viables y crecen o no. La combinación de sal de quitosana-CaCl: con una levadura antagónica (C. sai toana ) o f rece control efectivo de una pudrición postcosecha principal de la fruta y da control superior en el uso de un antagonista o sales de quitosana-CaCl solos . La combinación de acetato de quitosana-CaCl2 con C. sai toana fue más efectiva para controlar la descomposición de fruta de manzana, naranja y limón (Tabla 3 y 4) que ya sea el microorganismo antagonista o acetato de quitosana-CaCl2 solos. Después de 14 días de almacenamiento, se enfermaron 23% de los limones tratados con la combinación de C . sa i toana con acetato de quitosana-CaCl: e inoculados con P . di gi ta tum (Tabla 4), mientras que se enfermaron 75% y 35% de la fruta tratada con 0.1% de acetato de quitosana-CaCl2 o C. sai toana e inoculados con P. di gi ta tum . Se enfermaron todas las manzanas del control inoculadas con P. di gi ta tum solo. El mismo patrón de control de descomposición por combinación también se observó en fruta de manzana y naranja (Tabla 3 y 4) . El efecto benéfico de CaCl2 se ilustra por el nivel pobre de control de enfermedad obtenido con la combinación de C. sai toana con acetato de quitosana con CaCl2 (Tabla 3).
Además de evitar la descomposición, la combinación de C. sai toana con acetato de quitosana-CaCl: también exhibió una actividad curativa contra los patógenos principales de frutas de manzana y cítricos (Tabla 5 y 6). En frutas de cítrico, la combinación de C sa i toana con acetato de quitosana-CaCl2 fue muy efectiva para controlar infecciones tempranas causadas por P. di gi ta tum . El nivel de control observado con la combinación de C. sai toana con acetato de quitosana-CaCl2 fue significativamente más alto que el obtenido con ya sea el antagonista o acetato de quitosana-CaCl2 solos (Tabla 5) . El control similar de la infección establecida por la combinación de acetato de quitosana-CaCl2 también se observó con frutas de manzana inoculadas con P. expansum (Tabla 6) . Los resultados de las pruebas piloto mostraron que la combinación de C. sai toana con acetato de quitosana-CaCl2 también fue efectivo para controlar la descomposición de manzanas. El nivel de control de enfermedad obtenido con la combinación fue comparable al obtenido con el fungicida recomendado Tiabendazol (Tabla 7). El efecto curativo de la combinación es una mejora sustancial en la combinación de C . , sai toana con glicolquitosana o carboximetilquitosana (Pat. U.S. No. 5,633,025). La combinación de C . sai toana con glicolquitosana o carboximetilquitosana proporciona solo protección y no tiene efecto en infecciones establecidas que se presentan antes del tratamiento. Debido a que la infección de la fruta puede presentarse ya sea antes de la cosecha o durante la cosecha, un producto biológico ideal se espera que exhiba tanto una actividad protectora como curativa comparable a la observada con fungicidas sintéticos. Los microorganismos antagonistas disponibles actualmente no parecen ser capaces de controlar infecciones establecidas previamente y son más efectivos cuando se aplican antes de la infección del patógeno. La falta de actividad curativa se ha identificado como una limitación principal de los métodos biológicos. La combinación de C. sai toana con sales de quitosana en presencia de CaCl2 ofrece una actividad tanto curativa como protectora contra la pudrición.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustran modalidades de la invención : Ejemplo 1: Preparación de Quitosana. Patógenos y Levadura La quitosana se disolvió 1:1 (p/v) en varios ácidos orgánicos (ácido acético, ácido sórbico, ácido propiónico, ácido láctico y ácido glutámico) . Manzanas maduras (cv. Red Delicious) se cosecharon a mano en la estación de investigación de Fruta de los Apalaches, Kearneysville, WV. Las frutas de naranja y limón se compraron y almacenaron a 4°C. La fruta se seleccionó para eliminar cualquier fruta con daños o infecciones evidentes. Cultivos de .Sotrytis cinérea , Peni ci l l i um expansum Link, y Peni cilli um di gi ta tum se mantuvieron en agar de papa dextrosa (PDA) . Las suspensiones de esporas se obtuvieron inundando cultivos de 2 semanas de edad de B . ci n érea , P. di gi ta tum y P. expansum con agua destilada estéril que contenía 0.1% (v/v) de Tween 80. La cuenta de esporas se determinó con un hemacitómetro, y la concentración de esporas se ajustó a aproximadamente 104 conidios por mi para Peni ci ll i um y aproximadamente 105 conidios por mi para Bo tryti s con agua destilada estéril. C. sai toana se creció a 27°C durante 48 h. Cultivos en matraz agitado de caldo nutriente de levadura se iniciaron con aproximadamente 104 UFC de levaaura, y se incubaron en un aparato agitador orbital a 200 rpm durante 48 h. Las células de levadura se colectaron por centrifugación a 3000 g durante 20 min, se resuspendieron en agua destilada estéril, y se centrifugaron. Los paquetes resultantes se dispersaron en agua destilada estéril y la concentración de la suspensión de levadura se ajustó a 108 UFC/ml Ejemplo 2: Efecto de Sales de Quitosana en el Crecimiento de levadura v Patógenos Las propiedades antifúngicas de las sales de quitosana (acetato, sorbato, propionato, lactato y glutamato) contra los patógenos Bo try i s ci n érea y peni cilli um expan sum se determinaron en una placa de microtitulación de 24 pozos. Soluciones de sales de quitosana al 0.1% (acetato, sorbato, propionato, lactato y glutamato) que contenían caldo de extracto de maltosa al 0.2% y CaCl2 al 0 o 0.5% se esterilizaron en autoclave y 100 µl de la solución se repartió en cada pozo. Cada pozo se inoculó con aproximadamente quinientas esporas de B . cinérea y P. expansum . Cuatro réplicas de ocho pozos se usaron para cada hongo por tratamiento. Las placas de microtitulación se incubaron en la obscuridad a 24°C. El por ciento de germinación de esporas se determinó después de 24 horas por técnicas conocidas por los expertos en el arte. Se evaluó el efecto de varias sales de quitosana (acetato, propionato, lactato y glutamato) en presencia o ausencia de CaCl2 al 0.5% en la supervivencia de C. sai toana en caldo de levadura maltosa. Matraces Erlenmeyer de cinco mililitros que contenían 0.1% de sales de quitosana (acetato, sorbato, propionato, lactato y glutamato) y 0.2% de caldo de levadura maltosa se complementaron con CaCl2 al 0 o 0.5% y se esterilizaron en autoclave. Cada matraz se inició con aproximadamente 105 UFC de levadura y los matraces se incubaron en un aparato agitador orbital a 200 rpm. Las muestras se colectaron cada día en un período de 5 días la dilución se puso en placas en duplicado en medio de agar de levadura-maltosa. Las placas se incubaron a 24°C y las colonias se contaron después de 48 h. También se determinó el efecto de varias sales de quitosana (acetato, sorbato y propionato) , en presencia de CaCl2 al 0.5%, en la supervivencia de C. sa i toana en heridas de manzana. La fruta se hirió, se trató con suspensiones celulares de C. sai toana en sales de quitosana (acetato, sorbato y propionato) al 0.1% que contenían CaCl2 al 0.5%, y se almacenaron a 24°C. Hubo cuatro réplicas de cinco frutas por tratamiento con aleatorización completa y las muestras se recolectaron después de 7 días, de dos réplicas de fruta por tratamiento. El tejido herido se raspó con una aguja de inoculación estéril. El material desalojado se suspendió en 10 mi de agua estéril, se maceró con una varilla de vidrio, se agitó en 'vórtex, la dilución se aplicó en placa por triplicado en medio de agar de levadura maltosa, y las placas se incubaron a 24°C. Las colonias se contaron después de 48 h. Las sales de quitosana complementadas con CaCl2 fueron inhibidoras para patógenos postcosecha. Se observó una inhibición completa de germinación de esporas de B . cin érea y P. expansum con sales de quitosana (acetato, propionato, lactato y glutamato) al 0.1% complementadas con CaCl2 al 0.5%. Las Tablas 1 y 2 muestran que el crecimiento de levadura antagonista, C. sai toana , no se afectó por las sales de quitosana complementadas con CaCl2.
Ejemplo 3: Control de la Descomposición por medio de la Combinación de sales de Ouitosana y CaCl2 con Levadura Las células de levadura de cultivos de 48 h de edad de C. sai toana formaron paquetes por medio de centrifugación, se resuspendieron en agua destilada estéril, y se centrifugaron. Los paquetes se suspendieron en sal de quitosana (acetato de quitosana) al 0.1% que contenía CaCl2 al 0.5% y la concentración de la suspensión de levadura se ajustó a 108 UFC/ l. Frutas de manzana, naranja y limón se hirieron individualmente. Para determinar la actividad protectora de la combinación, las heridas de la fruta se trataron primero con uno de los siguientes tratamientos : - suspensión celular de levadura; suspensión celular de levadura que contenía acetato de quitosana al 0.1% y CaCl2 al 0 o 0.5%; - acetato de quitosana al 0.1% que contenía CaCl2 al 0 o 0.5%; - control - agua estéril. Cincuenta microlitros de un tratamiento se colocaron en una herida y enseguida las heridas se pusieron a prueba inoculadas con 20 µl de una suspensión de esporas de un patógeno. La fruta se incubó a 243C en charolas de plástico a humedad relativa alta (aproximadamente 95% o superior). Las heridas de manzana se pusieron a prueba inoculando con P. expansum, mientras que las heridas de naranja y limón se pusieron a prueba inoculadas con P. di gi ta tum . Para cada tratamiento, 20 a 100 frutas se arreglaron en un diseño de bloques completamente aleatorio (Steele and Torrie, 1968) . El diámetro de la lesión y el por ciento de infección se determinaron para cada tratamiento después de 7 días de almacenamiento y las pruebas se repitieron dos veces. También se hicieron pruebas adicionales con frutas de manzana, limón y naranja para determinar la actividad curativa de la combinación. Las heridas de manzana se inocularon con P. expansum, mientras que las heridas de naranja y limón se pusieron a prueba inoculadas con P. di gi ta tum . Después de 24 h de incubación a 24°C, las heridas inoculadas se trataron con los diferentes tratamientos como se describió antes. Las frutas se incubaron a 24°C en charolas de plástico a humedad alta. Para cada tratamiento, 20 a 100 frutas se arreglaron en un diseño de bloques completamente aleatorio. El diámetro de la lesión y el por ciento de infección se determinaron para cada tratamiento después de 7 días de almacenamiento y las pruebas se repitieron dos veces. Los resultados del efecto protector en la descomposición de manzana, naranja y limón se muestran en las Tablas 3 y 4. La combinación de acetato de quitosana-CaCl2 con C. sai toana fue más efectiva para controlar la descomposición de fruta de manzana, naranja y limón (Tablas 3 y 4) que ya sea el antagonista o acetato de quitosana-CaCl2 solos. Después de 14 días de almacenamiento, se enfermaron 23% de los limones tratados con la combinación de C. sai toana con acetato de quitosana-CaCl2 e inoculados con P. di gi ta tum (Tabla 4). Mientras que se enfermaron 75% y 35% de la fruta tratada con 0.1% de acetato de quitosana-CaCl2 o C. sai toana e inoculados con P. di gi ta tum . Se enfermaron todas las manzanas del control inoculadas con P. di gi ta tum solo. El mismo patrón de control de descomposición por la combinación también se observó en fruta de manzana y naranja (Tablas 3 y 4) . El efecto benéfico de CaCl2 se ilustra por el nivel pobre de control de enfermedad obtenido con la combinación de C. sa i toana con acetato de quitosana sin CaCl2 (Tabla 3) . La falta de actividad curativa se ha identificado como una limitación principal de los métodos biológicos. Los agentes microbianos para biocontrol se espera que exhiban actividad curativa comparable a la observada con fungicidas sintéticos. Los resultados en las Tablas 5 y 6 muestran que el acetato de quitosana-CaCl? también exhibió una actividad curativa contra los principales patógenos de fruta de manzana y cítrico. En frutas de cítrico, la combinación de C. sai toana con acetato de quitosana-CaCl2 fue muy efectiva para controlar infecciones tempranas causadas por P. di gi ta tum (Tabla ? ) . El control similar de la infección establecida por la combinación de C. sai toana con acetato de quitosana-CaCl2 también se observó con fruta de manzana inoculada con P. expansum (Tabla 6) . La actividad curativa observada de la combinación muestra la sinergia entre el antagonista y acetato de quitosana-CaCl2.
El efecto de la combinación de sal de quitosana-CaCl2 con levadura en infección natural de fruta de cítrico también se evaluó bajo condiciones semi-comerciales que simulan procesos comerciales para 'frutas y verduras pero en una escala más pequeña. Las frutas de naranja de depósitos en el campo se lavaron en línea después de prácticas comerciales estándar (lavado estándar ?re Cloro, clasificación por tamaño y mancha de color, y aleatorización). Después, las frutas se lavaron y se trataron con los diferentes tratamientos usando un sistema de atomizado en línea. Cada tratamiento consiste de al menos 8 a 13 cajas de fruta; cada caja representa una réplica de aproximadamente 60 a 100 frutas. Las frutas se mantuvieron a 50-55°F, y el porcentaje de descomposición se determinó después de 3 semanas. Los resultados de las pruebas piloto mostraron que la combinación de C. sai toana con acetato de quitosana-CaCl2 fue efectivo para controlar la descomposición de naranja. El nivel de control de la enfermedad obtenido con la combinación fue comparable al obtenido con el fungicida recomendado Tiabendazol (Tabla 7). La adición de CaCl2 hace a otras levaduras antagonistas además de C. sa i toana , tal como Debaryomyces hansenii , Cryptococcus laurentii , Candida sake, Candida oleophila , Candida orientalis , Zygosaccharomyces bisporus , Dekkera bruxellensis , Dekkera naardensis , Pichia angusta que resisten a la quitosana nativa y ácidos orgánicos usados como disolventes para la quitosana (Tabla 8).
Tabla 1. Supervivencia de Candida saitoana en diferentes sales de quitosana Cuenta celular de Levadura (UFC/ml) Tratamiento 0 días 5 dias 0.1% Quitosana-glutamato 1.8 X 105 1.8 X 10- 0.1% Quitosana-glutamato 2.0 X 105 2.5 X 10' + 0.5% CaCl, 0.1% Quitosana-propionato 1.8 X 105 0.1% Quitosana-propionato 2.2 X 105 2.6 X 104 + 0.5% CaCl2 0.1% Quitosana-lactato 2.1 X 105 0.1% Quitosana-lactato + 2.2 X 105 2.8 X 104 0.5% CaCl2 0.1% Quitosana-Acetato 2.0 X 105 0.1% Quitosana-Acetato + 2.-2 X 10; 2.8 X 10: 0.5% CaCl2 a Soluciones de sal de quitosana que contenían CaCl2 al 0 o 0.5% se inocularon con 105 células de levadura por mi y las soluciones se almacenaron a temperatura ambiente. La supervivencia de levadura se determinó a diferentes tiempos en un período de 7 días.
Tabla 2. Supervivencia de Candi da sai toana en presencia de diferentes sales de quitosana Tratamiento Cuenta celular de levaduras (UFC/ l) 7 días C. sai toana sola 3.7 X 106 C . sa i toana + 0.1% propionato 3.1 X 106 de quitosana + CaCl2 C. sa i toana + 0.1% sorbato de 3.3 X 106 quitosana + CaCl2 C. sai toana + 0.1% acetato de 3.4 X 10d quitosana + CaCl2 a Las heridas de manzana se trataron con la combinación de células de levadura con diferentes sales de quitosana y CaCl2, y las frutas se almacenaron a temperatura ambiente. La supervivencia de la levadura se determinó después de 7 días de almacenamiento.
Tabla 3. Efecto protector de la combinación de Candi da sai toana con formulaciones de acetato de quitosana en la descomposición de fruta de manzana causada por Peni cillium expansum .
Tratamiento Fruta infectada ( P. expansum Control 7.8a 0.1% acetato de quitosana 82a 0.1% acetato de quitosana + 82a C. sai toana C . sai toana 47b 0.1% acetato de quitosana + 30c 0.5% CaCl2 + C. sai toana a Las heridas de manzana se trataron con los diferentes tratamientos y después se pusieron a prueba inoculando con 20 µl de Peni ci lli um expansum a 104 conidios por mililitro. Las frutas se evaluaron para síntomas de descomposición después de 7 días de almacenamiento a 24°C. b Las columnas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo a la prueba de rango múltiple de Duncan, P = 0.05.
Tabla 4. Efecto protector de la combinación de Candi da sai toana con la formulación de acetato de quitosana CaCl2 en la descomposición de fruta de naranja y limón causada por Peni cilli um expansum .
Tratamiento Fruta infectada {% Limón Naran a 0.1% acetato de quitosana + 100a 100a 0.5% CaCl2 C. sai toana 75b 66b 0.1% acetato de quitosana + 35c 33c 0.5% CaCl, + C. sai toana a Las heridas de naranja y limón se trataron con los diferentes tratamientos y después se pusieron a prueba inoculando con 20 µl de P. di gi ta t um a 104 conidios por mililitro. Las frutas se evaluaron para síntomas de descomposición después de 7 días de almacenamiento a 24°C. b Las columnas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo a la prueba de rango múltiple de Duncan, P = 0.05.
Tabla 5. Efecto curativo de la combinación de Ca ndi da sai toana con la formulación de acetato de quitosana CaCl2 en la descomposición de fruta de naranja y limón causada por Peni cilli um expansum .
Tratamiento Fruta infectada (% Limón Naranja Control 100a 100a C. sai toana 100a 100a 0.1% acetato de quitosana + 75b 66b 0.5% CaCl2 0.1% acetato de quitosana + 23c 20c 0.5% CaCl2 + C . sa i toana a Las heridas de naranja y limón se inocularon con 20 µl de P. di gi ta tum a 104 conidios por mililitro y 24 horas después, las heridas inoculadas se trataron con los diferentes tratamientos. Las frutas se evaluaron para síntomas de descomposición después de 7 días de almacenamiento a 24°C. b Las columnas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo a la prueba de rango múltiple de Duncan, P = 0.05.
Tabla 6. Efecto curativo de la combinación de Ca ndi da sai toana con la formulación de acetato de quitosana CaCl2 en la descomposición de fruta de manzana causada por Peni cilli um expansum .
Tratamiento Fruta infectada (%)b expansum Control 72a C . sai toana 72a 0.1% acetato de quitosana + 39b 0.5% CaCl2 + C . sai toana a Las heridas de manzana se pusieron a prueba inoculando con 20 µl de P. expansum a 104 conidios por mililitro y 24 horas después, las heridas se trataron con los diferentes tratamientos. Las frutas se evaluaron para síntomas de descomposición después de 7 días de almacenamiento a 24°C. b Las columnas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo a la prueba de rango múltiple de Duncan, P = 0.05.
Tabla 7. Efecto de la combinación de Candi da sai toana con la formulación de acetato de quitosana CaCl2 en la infección natural de fruta de naranja.
Tratamiento Fruta infectada (% Control 5.2a 0.1% acetato de quitosana + 0.5% CaCl2 + C. sai toana Tiabendazol (1000 ppm) 1.4b a Las naranjas de Valencia se trataron en las 48 h después de la cosecha bajo condiciones semi-comerciales usando una línea de procesamiento. Las naranjas de depósitos en el campo se lavaron en línea después de prácticas comerciales estándar y después se trataron con agua, suspensión de levadura que contenía 0.1% de acetato de quitosana + 0.5% de CaCl2, o Tiabendazol usando un sistema de atomizado en línea. Cada tratamiento consiste de al menos 8 a 13 cajas de fruta; cada caja representa una réplica de aproximadamente 60 a 100 frutas. El porcentaje de descomposición se determinó después de 3 semanas . b Las columnas con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo a la prueba de rango múltiple de Duncan, P = 0.05.
Tabla 8. Supervivencia de levaduras antagonistas diferentes en acetato de quitosana al 0.1% que contiene cloruro de calcio.
Cuenta Celular de Levadura (UFC/ml) Tratamientos YMB Acetato de quitosana + 0.5% CaCl- C. orientalis 1.1 X 106 1.3 X 104 Z. bisporus 1.1 X 105 5.7 X 104 D. bruxellensis 1.1 X 105 1.7 X 104 D. naardensis 1.6 X 105 6.3 X 104 P. angusta 4.0 X 105 7.0 X 104 Las soluciones de acetato de quitosana que contenían CaCl2 se inocularon con 105 células de levadura por mi, y las soluciones se almacenaron a temperatura ambiente. La supervivencia de levaduras se determinó después de 3 días. Se probaron las siguientes levaduras: Candida orientalis , Zygosaccharomyces bisporus , Dekkera bruxellensis , Dekkera naardensis, Pichia angusta .
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Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
  2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un recubrimiento biológico para productos agrícolas, caracterizado porque el recubrimiento comprende, en cantidades efectivas para actividad de biocontrol, sales de quitosana, al menos un microorganismo antagónico efectivo para el biocontrol de enfermedades postcosecha, y un catión monovalente o divalente que funciona como un "mitigador". 2. El recubrimiento biológico de las reivindicaciones 1 o 15, caracterizado porque el catión divalente es CaCl2.
  3. 3. El recubrimiento biológico de las reivindicaciones 1 o 15, caracterizado porque la cantidad efectiva de sales de quitosana es de aproximadamente 10 µg/ml a aproximadamente 500 µg/ml.
  4. 4. El recubrimiento biológico de las reivindicaciones 3 o 15, caracterizado porque la cantidad efectiva de sales de quitosana es de aproximadamente 20 µg/ml a aproximadamente 500 µg/ml.
  5. 5. El recubrimiento biológico de las reivindicaciones 4 o 15, caracterizado porque la cantidad efectiva de sales de quitosana es de aproximadamente 200 µg/ml.
  6. 6. El recubrimiento biológico de las reivindicaciones 1 o 15, caracterizado porque el microorganismo antagonista es una levadura.
  7. 7. El recubrimiento biológico de las reivindicaciones 6 o 15, caracterizado porque la levadura se selecciona del género Candida, Cryptococcus , Pichia, Debaryomyces , Bulleromyces , Sporobolomyces, Rhodotorula , Au reoba s i dium , Zygosaccharomyces , y Dekkera.
  8. 8. El recubrimiento biológico de las reivindicaciones 7 o 15, caracterizado porque la levadura se selecciona de una especie del género Candida que consiste de Candida oleophila , Candida saitoana , Candida sake, Candida tenius, Candida utilis, y Pichia guilliermondii .
  9. 9. El recubrimiento biológico de las reivindicaciones 8 o 15, caracterizado porque la levadura es Candida oleophila o Candida saitoana .
  10. 10. El recubrimiento biológico de las reivindicaciones 6 o 15, caracterizado porque la cantidad efectiva de la levadura antagonista es de aproximadamente 107 unidades formadoras de colonia a aproximadamente 108 unidades formadoras de colonia.
  11. 11. El recubrimiento biológico de las reivindicaciones 10 o 15, caracterizado porque la cantidad efectiva de al menos una levadura antagonista es -de aproximadamente 108 unidades formadoras de colonia.
  12. 12. Un método para proteger un producto contra la descomposición postcosecha, caracterizado porque el método comprende recubrir la superficie del producto con una cantidad efectiva del recubrimiento de las reivindicaciones 1 o 15.
  13. 13. Un método para curar un producto de descomposición postcosecha, caracterizado porque el método comprende recubrir las superficies del producto con una cantidad efectiva del recubrimiento de las reivindicaciones 1 o 15.
  14. 14. Uso del recubrimiento biológico de las reivindicaciones 1 o 15, para controlar enfermedades postcosecha .
  15. 15. Un recubrimiento biológico para productos agrícolas, caracterizado porque el recubrimiento comprende, en cantidades efectivas para actividad de biocontrol, sales de quitosana, al menos una levadura antagónica efectiva para el biocontrol de enfermedades postcosecha, y un catión divalefite que funciona como un "mitigador" .
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