KR19980070757A - 페르라산 탈탄산효소 - Google Patents

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Abstract

향미가 우수한 증류주의 제조에 유용한 페르라산(ferulic acid) 탈탄산 효소 활성를 제공하는 것을 과제로 한다.
배열번호 1 로 표기되는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질 또는 배열번호 1 로 표시되는 아미노산 배열에 있어서 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지며, 또한 페르라산 탈탄산 효소 활성을 갖는 단백질, 이 단백질을 코딩하는 유전자, 이 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 이 재조합 벡터를 함유하는 형질전환체, 이 형질전환체에서 유래하고, 또한 페르라산 탈탄산 효소 활성을 갖는 효소원을 이용하는 4-비닐과이어콜, 바닐린 또는 바닐린산 또는 증류주의 제조방법, 및 페르라산 탈탄산 효소 활성을 증대시킨 효모를 이용하는 증류주의 제조방법에 관한 것이다.

Description

페르라산 탈탄산효소
본 발명은, 페르라산 탈탄산효소 유전자를 도입한 효모를 이용한 향미 (香味) 가 우수한 증류주의 제조방법에 관한 것이다.
소주, 위스키, 브랜디 등의 증류주에 있어서, 향미가 우수한 증류주의 개발이 언제나 요구되어져 왔다.
우수한 향미를 갖는 증류주에는, 4-비닐과이어콜, 바닐린 또는 바닐린산이 다량 함유되어 있다.
바닐린 및 바닐린산은, 4-비닐과이어콜이 산화되어 생성된다 [일본 농예화학회지,70, 684-686, (1996)].
향미가 우수한 증류주를 제조하는 방법으로서, 히드록시 시나믹산 에스테르 가수분해효소 또는 이 효소를 고생산 (高生産) 하는 누룩곰팡이 (일본공개특허공보 평7-115957 호), 또는 페르라산 에스테라아제 [일본농예화학회지,70, 684-686, (1996)] 를 첨가하여 페르라산을 전국 (거르지 않은 술, 간장) 내에서 유리시키는 방법이 알려져 있다.
또한, 세포융합에 의하여 페르라산 탈탄산효소의 활성이 높은 효모를 취득하는 방법이 제안되고 있다 [95 년도 생물공학회대회요지집, 41 (1995)].
그러나, 페르라산 탈탄산효소의 활성이 높아진 효모는 수득되지 않고, 이러한 효모를 이용하여 향미가 우수한 증류주를 제조하는 방법은 알려지고 있지 않다.
페르라산 탈탄산효소는 페르라산을 탈탄산시켜 4-비닐과이어콜을 생성하는 반응을 촉매로 하는 효소이다.
페르라산은 계피산, 쿠마르산 등과 함께 페닐아크릴산의 일종이고, 곡물 등의 식물 세포벽을 구성하는 헤미셀룰로우스 획분 (畵分) 에 함유되는 아라비노크실란의 아라비노오스 측쇄 (側鎖) 에 에스테르가 결합되어 존재한다.
바실루스·퍼미러스 (Bachillus pumilus)[어플라이드·앤드·인바이러멘탈·미크로바이올로지 (Appl. Environ. Microbiol.),61, 326-332 (1995) 및 슈도모나스·플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens)[저널·오브·박테리올로지 (J. Bacteriol.),176, 5912-5918 (1994)] 의 페르라산 탈탄산효소는 단리정제 (單離精製) 되어 있다. 그러나 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속 등에 속하는 효모의 페르라산 탈탄산효소는 이 효소 활성 존재가 알려져 있는 만큼 단리정제는 이루어져 있지 않다.
바실루스·퍼미러스 (B.pumilus) 의 페르라산 탈탄산효소를 코딩하는 유전자 (이하, FDC 유전자로 표기)[Appl. Environ. Microbiol.,61, 4484-4486 (1995)] 가 잘 알려져 있다. 또한 사카로마이세스·세레비제 (S. cerevisiae) 에서는 페르라아크릴산 탈탄산효소를 코딩하는 유전자 (이하, PAD 1 유전자로 표기)[진 (Gene),142, 107-112 (1994)] 가 잘 알려져 있다.
본 발명은 향미가 우수한 증류주의 제조에 유용한 페르라산 탈탄산효소를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 서열 1 로 표기되는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질 또는 서열 1 로 표기되는 아미노산 배열에 있어서 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지며 페르라산 탈탄산 효소 활성을 갖는 단백질 (이하, 본 발명의 단백질로 표기), 이 단백질을 코딩하는 유전자 (이하, 본 발명의 유전자로 표기), 이 유전자를 함유하는 재조합 벡터 (이하, 본 발명의 재조합 벡터로 표기), 이 재조합 벡터를 함유하는 형질전환체 (이하, 본 발명의 형질전환체로 표기), 형질전환체에서 유래하면서 페르라산 탈탄산 효소 활성을 갖는 효소원의 존재 하에서, 수성매체 중에서 페르라산을 반응시키고 수성매체 중에서 생성된 4-비닐과이어콜, 바닐린 또는 바닐린산을 채취하는 것을 특징으로 하는, 4-비닐과이어콜, 바닐린 또는 바닐린산의 제조방법 (이하, 본 발명의 4-비닐과이어콜, 바닐린 또는 바닐린산의 제조방법으로 표기), 전국 내에서 이 형질전환체에서 유래하면서 페르라산 탈탄산효소 활성을 갖는 효소원을 첨가하는 것을 특징으로 하는 증류주의 제조방법 (이하, 본 발명의 단백질을 이용하는 증류주의 제조방법으로 표기), 및 페르라산 탈탄산효소 활성을 증대시킨 효모를 이용하는 것을 특징으로 하는 증류주의 제조방법 (이하, 본 발명의 효모를 이용하는 증류주의 제조방법으로 표기) 에 관한 것이다.
도 1 은 FDC 1 유전자를 함유하는 DNA 단편의 제한효소의 지도, 및 FDC1 유전자를 특정하기 위하여 실시한 서브클로닝 (subcloning) 의 결과 및 수득된 DNA 단편의 FDC 활성의 유무를 나타내는 도면,
도 2 는 FDC1 유전자 발현용 플라스미드의 제작 공정을 나타내는 도면이다.
본 발명의 단백질은 페르라산 탈탄산효소 활성을 갖기만 하면 서열 1 로 표시되는 아미노산 배열에 있어서 아미노산 잔기가 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 단백질일 수도 있다. 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 잔기의 수는 특별히 한정되지 않으나, 1 개에서 수십개, 특히 1 개에서 수 개까지의 아미노산 잔기인 것이 바람직하다. 또한, DNASIS ver 3.0 (히타치 소프트웨어 엔지니어링 제품) 을 사용하여 모든 아미노산 배열에 대하여 서열 1 로 표기되는 아미노산 배열와 심플호몰로지를 해석한 경우, 20 % 이상, 특히 40 % 이상의 호몰로지를 갖는 아미노산 배열인 것이 바람직하다.
본 발명의 유전자의 단리, 이 유전자의 염기배열에의 결정, 본 발명의 재조합 벡터, 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체 및 본 발명의 단백질을 제조하기 위한 유전자공학 또는 생물공학의 기본 조작에 대해서는 시판되는 실험서, 예를 들어 「유전자 매뉴얼」(코오단샤, 타카키 야스타카 (高木康敬) 편), 「유전자조작 실험법」(코오단샤), 「몰레큘러·클로닝 (Molecular Cloning) 」(콜드·스프링·하버·레버러토리 (Cold Spring Harbor Laboratory), 1982), 「몰레큘러·클로닝 제 2 판 (Molecular Cloning, 2nd ed.)」(콜드·스프링·하버·레버러토리 (Cold Spring Harbor Laboratory), 1989), 「메서드·인·엔자이몰로지 (Methods in Enzymol.)」(194, 1991), 「실험의학 별책·효모에 의한 유전자실험법」(요오도샤, 1994) 등에 기재된 방법에 의하여 실시할 수 있다.
본 발명의 유전자는 페르라산 탈탄산 효소 활성을 갖지 않는 효모 또는 이 효모활성이 현저하게 낮은 효모 (이하, 양자 모두 페르라산 탈탄산효소 활성을 실질적으로 갖지 않는 효모로 표기), 예를 들어 사카로마이세스·세레비제 K9 H14 주 (株) (이하, K9 H14 주로 표기) 에 이 효소 활성을 부여하는 유전자로 단리할 수 있다. 즉, FDC 유전자를 갖는 효모인 DNA 라이브러리에서 K9 H14 주를 형질전환시키고 페르라산 탈탄산효소 활성화가 부여된 효모에서 DNA 를 취득함으로써 FDC 유전자로 단리할 수 있다.
FDC 유전자를 갖는 효모인 DNA 라이브러리는 페르라산 탈탄산효소 활성을 갖는 효모, 예를 들어 와인효모인 사카로마이세스·세레비제 W3 주 (株) (이하, W3 주로 표기) 의 염색체 DNA 를 제한효소로 절단하고, 수득된 DNA 단편을 효모 내에서 유지시킬 수 있는 벡터와 연결시켜 만들 수 있다.
염색체 DNA 의 절단에 사용되는 제한효소로는, 염색체 DNA 를 절단할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 이용할 수 있으나, 바람직한 것은 10 Kbp 이하의 DNA 단편을 발생시키는 제한효소가 이용된다. 또한, 염색체 DNA 는 제한효소로 완전히 또는 부분적으로 절단할 수도 있다.
효모 내에서 유지시킬 수 있는 벡터로는 YCp 형 벡터, YEp 형 벡터, YRp 형 벡터, YIp 형 벡터 및 YAC (효모 인공 염색체) 벡터 등을 들 수 있다.
DNA 라이브러리인 K9 H14 주로의 형질전환은, 스페로플라스트법 [예를 들어 프로시딩스·오브·내셔널·아카데미·오브·사이언스 USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA),75, 1929-1933 (1978)], 아세트산 리튬법 [예를 들어 J. Bacteriol.,153, 163-168 (1983)], 일렉트로포레이션법 [예를 들어 Method in Enzymol.,194, 182-187 (1991)] 등, 유전자공학 내지 생물공학 분야에서 관용적으로 쓰는 방법에 따라 실시할 수 있다.
페르라산 탈탄산효소 활성이 부여된 효모를 선택하는 방법으로는 예를 들어 이하의 방법을 들 수 있다.
상기 방법에 의하여 수득되는 형질전환체를 YPD 액체배지 (1 % 효모엑기스, 2 % 펩톤, 2 % 글루코오스) 로 밤새 (20 ~ 24 시간) 배양하여 수득된 배양액 0.9 ㎖/1 페르라산용액을 0.1 ㎖ 첨가하여 밤새 (20 ~ 24 시간) 배양한다. 배양종료 후, 훈연 (smoking) 냄새가 나는 배양액을 관능적으로 선택하고, 또한 고속액체 크로마토그래피 [일본농예화학회지,69, 1587-1596, (1995)]로 4-비닐과이어콜을 검출할 수 있는 배양액을 선택한다. 선택한 배양액에서 형질전환 주를 회수하고, 회수하여 수득된 주를 페르라산 탈탄산효소 활성이 부여된 효모로서 선택한다.
페르라산으로는 트랜스 페르라산, 시스 페르라산의 양쪽 모두를 사용할 수 있으나, 트랜스 페르라산을 적절하게 사용한다.
페르라산 탈탄산효소 활성이 부여된 효모에서 플라스미드를 회수하는 방법 및 회수한 플라스미드를 대장균으로 형질전환시키는 방법으로는, 유전자공학 분야에서 관용적으로 사용되는 있는 방법을 이용할 수 있다. 상기 효모에서 플라스미드를 회수하는 방법으로는, 예를 들어 「실험의학 별책·효모에 의한 유전자실험법」 (요오도샤, 1994) 에 기재된 방법이, 회수한 플라스미드를 대장균으로 형질전환시키는 방법으로는, 예를 들어 Molecular Cloning, 2nd ed., (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) 에 기재되어 있는 방법을 들 수 있다.
상기 방법에 의하여 선택된 DNA 의 클론을 적당한 제한효소, 예를 들어 PstI 등으로 절단한 후에 pBluescript KS (+)(Stratagene 사) 등의 플라스미드에 클로닝하고, 다이데옥시법 및 DNA 시이퀀서 (파르마시아 LKB 사 제품, ALF DNA 시퀀서 Ⅱ) 를 이용함으로써 FDC 유전자 염기배열을 결정할 수 있다. 또한 W3 주에서 유래하는 FDC 유전자의 염기배열은 효모 게놈·프로젝트의 결과 [예를 들어 인터넷 http://genome-www.stanford.edu/sacchdb/] 로 수득할 수 있다.
이렇게 하여 결정되는 FDC 유전자의 염기배열로는, 예를 들어 서열 1 로 표시되는 염기배열을 들 수 있다.
서열 1 로 표시되는 염기배열이 페르라산 탈탄산효소를 코딩하는 것이 일단 확정되면, 그 후에는 화학합성에 의하여 또는 PCR (Polymerase Chain Reaction) 법에 의하여, 또는 이 염기배열을 갖는 DNA 단편을 프로브하여 혼성화 (hybridize) 시킴으로써 본 발명의 유전자를 얻을 수 있다.
본 발명의 유전자는 상기에서 만들어진 유전자를 다시 인위적으로 유전자의 염기배열의 일부를 변이, 예를 들어 결실, 치환 또는 삽입해서도 수득할 수 있다. 또한 아미노산에 대한 코돈 (codon) 선택은 임의적으로도 할 수 있다. 예를 들어 사용하는 숙주의 코돈 사용 빈도를 고려하여 결정할 수 있다 [예를 들어 누크레이크·액시드·리서치 (Nucleic Acids Res.),9. 43-74 (1981)]. 또한 염기배열의 변이는 사이트스펙시픽·뮤타제네시스[예를 들어 Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81, 5662-5666 (1984)] 등의 방법으로 실시할 수 있다.
본 발명의 유전자는 예를 들어 Methods in Enzymol.,194, 594-597 (1991) 에 기재된 방법을 이용하여 유전자의 파괴, 발현 제어, 발형량의 변이를 실시할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 유전자를 함유하는 DNA 단편을 제한효소 등을 이용하여 조제한 후에 이 DNA 단편을 발현벡터 내의 프로모터의 하류에 삽입하여 만들 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 유전자 염기배열을 숙주세포에서의 발현에 최적한 코돈이 되도록 필요에 따라 염기를 치환시켜 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 본 발명의 유전자 발현에는 전사종결배열 (轉寫終結配列) 이 반드시 필요한 것은 아니나, 적절한 것은 구조유전자 직하에 전사종결배열을 배치하는 것이 바람직하다.
본 발명의 형질전환체는 상기 발현벡터에 적합한 숙주세포 내에 본 발명의 재조합 벡터를 도입함으로써 수득할 수 있다.
숙주세포로는, 목적하는 유전자를 발현시킬 수 있는 것, 예를 들어Escherichia coli,Bacillus subtilis,Bacillus amyloliquefaciens,Brevibacterium flavum,Brevibacterium lactofermentum,Corynebacterium glutamicum,Microbacterium ammoniaphilum등의 에쉐르히어속, 세라티아속, 콜리네박테리움속, 프레비박테리움속, 슈도모나스속, 바실루스속 등에 속하는 세균,Saccharomyces cerevisiae,Schizosaccharomyces pombe,Kluyveromyces lactis,Trichosporon pullulans,Schwanniomyces alluvius등의 효모, 나마르바세포, COS 세포, CHO 세포 등의 동물세포, 담배세포, 홍당무세포 등의 식물세포 등, 어느 것이라도 사용할 수 있다.
발현벡터로는 상기 숙주세포에 자립복제가 가능 내지는 염색체 내로의 편입이 가능하며, 본 발명의 재조합 단백질을 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것도 사용할 수 있다.
대장균 등의 세균을 숙주세포로 사용하는 경우에는, 본 발명의 재조합 벡터는 이 미생물 내에서 자립복제가 가능함과 동시에 프로모터, 리보소옴 결합배열, 본 발명의 DNA, 전사종결배열으로 구성되는 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 포함되어 있을 수도 있다.
발현벡터로서는 예를 들어 pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (모두 Boehringer Mannheim 사 제품), pKYP200 [Agric. Biol. Chem.,48, 669-675 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem.,53. 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA,82, 4306 (1985)], pBluescript (Stratagene 사 제품) 등을 사용할 수 있다.
프로모터로는 대장균 등의 숙주세포 내에서 발현할 수 있는 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예를 들어trp프로모터 (Ptrp),lac프로모터 (Plac), PL프로모터, PR프로모터 등의, 대장균이나 파지 (phage) 등에서 유래하는 프로모터를 사용할 수 있다. Ptrp두 개를 직렬로 연결시킨 프로모터 (Ptrpx2),tac프로모터와 같이 인위적으로 설계변이된 프로모터 등을 사용할 수 있다.
리보소옴결합배열로는 대장균 등의 숙주세포 내에서 발현 가능한 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있으나, 리보소옴결합배열과 개시 코돈간을 적당한 거리 (예를 들어 6 ~ 18 염기) 로 조절하여 사용할 수 있는 것이 바람직하다.
세균에 대한 재조합 벡터의 도입방법에 있어서, 세균에 DNA 를 도입하는 방법으로는, 예를 들어 칼슘이온을 사용하는 방법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA,69, 2110-2114 (1972)], 프로토프라스트법 (일본 공개특허공보 소63-2483942 호) 등, 어느 방법도 사용할 수 있다.
효모를 숙주세포로 사용할 경우에는, 발현벡터로써 예를 들어 YEp13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419) 등을 사용할 수 있다.
프로모터로는 효모 내에서 발현시킬 수 있는 것으로는 예를 들어 헥소스키나제 등의 해당계 (解糖系) 의 유전자인 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 히트쇼크 단백질 프로모터, MFα 1 프로모터, CUP 1 프로모터 등, 어느 것이나 사용할 수 있다.
효모에 대한 재조합 벡터의 도입방법에 있어서, 효모에 DNA 를 도입하는 방법으로는 예를 들어 일렉트로 폴레이션법 [Methods in Enzymol.,194, 182-187 (1990)], 스페로플라스트법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA,84, 1929-1933 (1978)], 아세트산 리튬법 [J. Bacteriol.,153, 163-168 (1983)] 등, 어느 방법이라도 사용할 수 있다.
동물세포를 숙주세포로 하여 사용할 경우에는, 발현벡터로써 예를 들어 pcDNAI/Amp, pcDNAI, pcDM 8 (모두, 후나코시사 제품) 등을 사용할 수 있다. 이 경우에, 프로모터로는 동물세포 내에서 발현시킬 수 있는 것으로는 예를 들어 인간 CMV 의 IE (immediate early) 유전자의 프로모터 등, 어느 것이나 사용할 수 있다. 또한 인간 CMV 의 IE 유전자인 인헨서 (enhancer) 를 프로모터와 함께 사용할 수도 있다.
동물세포에 대한 재조합 벡터의 도입방법에 있어서, 동물세포에 DNA 를 도입하는 방법으로는 예를 들어 일렉트로 폴레이션법 [사이트테크놀로지Cytotechnolory),3, 133 (1990)], 인산칼슘법 (일본 공개특허공보 평2-227075 호), 리포펙션법 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA,84, 7413 (1987)] 등, 어떠한 방법이라도 사용할 수 있다.
식물세포를 숙주세포로 하여 사용할 경우에는, 발현벡터로서 예를 들어 pBI121 [Nucleic Acids Res.,12, 8771-8721 (1984)] 등을 사용할 수 있다. 이 경우, 프로모터로는 식물세포 내에서 발현시킬 수 있는 것으로는 예를 들어 칼리플라워·모자이크·바이러스인 35 S 프로모터 등 어느 것이라도 사용할 수 있다.
식물세포에 대한 재조합 벡터의 도입방법에 있어서, 식물세포에 DNA 를 도입하는 방법으로는 예를 들어 아그로박테리움·트메펙션즈 (Agrobacterium tumefaciens) 법 [Methods in Enzymol.,118, 627-640 (1986)], 고속미립자법 [플랜트·몰레큘러·바이올로지 (Plant Molecular Biology),11, 433-439 (1989)], 프로토프라스트법 [네이쳐 (Nature),319, 791-793 (1986)] 등, 어떠한 방법도 사용할 수 있다.
본 발명의 형질전환체는 본 발명의 단백질 제조, 4-비닐과이어콜, 바닐린 또는 바닐린산 등의 플레버의 제조 등에 사용된다. 또한, 숙주세포가 효모인 본 발명의 형질전환체는 향미가 우수한 증류주의 제조에 적절하게 사용된다.
본 발명의 단백질은 본 발명의 형질전환체를 배지에 배양하고 배양물 중에 본 발명의 단백질 생성 축적시켜 이 배양물에서 이 단백질을 채취함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 형질전환체를 배지에 배양하는 방법은, 이 형질전환체의 숙주세포를 배양할 때에 사용되는 통상의 방법에 의하여 이루어진다.
대장균 또는 효모균 등의 미생물을 숙주세포로 하여 수득된 이 형질전환체를 배양하는 경우, 배지로는 미생물이 자화 (資化) 할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질전환체를 효율적으로 배양할 수 있는 배지라면 천연배지, 합성배지의 어떠한 것도 사용할 수 있다.
탄소원으로는 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 당밀, 전분, 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판 등의 알코올류가 사용된다.
질소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산인 암모늄염 또는 그밖에 질소함유 화합물 이외에, 펩톤, 살코기액기스, 효모엑기스, 콘스티프리카, 카제인 가수분해물, 대두백 및 대두백 가수분해물, 각종 발효균체 또는 그 소화물 등을 사용할 수 있다.
무기물로는 인산 제일칼륨, 인산 제이칼륨, 인산 마그네슘, 황산 마그네슘, 염화나트륨, 황산 제일철, 황산 망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상적으로 진탕 배양 또는 심부통기 (深部通氣) 교반배양 등의 호기적 (好氣的) 인 조건 하에서 15 ~ 40℃ 에서 16 ~ 96 시간 동안 실시한다. 배양기간 중에 pH 는 3.0 ~ 9.0 으로 유지한다.
배양 중에는 필요에 따라 안피실린 또는 테트라사이클링 등의 항생물질을 배지에 첨가할 수도 있다.
프로모터로서는 유도성 프로모터를 사용한 발현벡터로 형질전환시킨 미생물을 배양할 때에는 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가할 수도 있다. 예를 들어lac프로모터를 이용한 발현벡터로 형질전환시킨 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오가라크토필라노시드 (IPTG) 등을trp프로모터를 이용한 발현벡터로 형질전환시킨 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 (IAA) 등을 배지에 첨가할 수도 있다.
동물세포를 숙주세포로 하여 수득된 형질전환체를 배양할 경우, 동물세포가 자화될 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질전환체의 배양을 효율적으로 행하는 배지로는 천연배지, 합성배지의 어느 것이라도 사용할 수 있으나, RPMI 1640 배지, Eagle 의 MEM 배지 또는 이들 배지에 소의 태아 혈정 등을 첨가한 배지 등이 통상적으로 사용된다.
배양은 통상 5 % 의 CO2존재 하, 35 ~ 37℃ 에서 3 ~ 7 일 동안 실시된다.
배양 중에는 필요에 따라 카나마이신, 페니실린 등의 항생물질을 배지에 첨가할 수도 있다.
식물세포를 숙주세포로 하여 수득된 형질전환체를 배양하는 경우, 식믈세포가 자화될 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질전환체의 배양을 효율적으로 행하는 배지로는 천연배지, 합성배지의 어느 하나를 사용할 수도 있으나, 무라시게·스쿠그 (MS) 배지, 화이트 (white) 배지 등이 통상적으로 사용된다.
배양은 일반적으로 진탕 배양 또는 심부통기 교반배양 등의 호기적 조건 하에서, 15 ~ 40℃ 에서 1 ~ 30 일 동안 실시된다. 배양기간 중 pH 는 3.0 ~ 9.0 으로 유지한다.
배양 중에는 필요에 따라 카나마이신, 페니실린 등의 항생물질을 배지에 첨가할 수도 있다.
배양종료 후, 본 발명의 형질전환체의 세포 내 또는 세포 외에 생산되는 본 발명의 단백질을 단리정제하기 위해서는 통상의 효소의 단리, 정제법을 사용할 수 있다. 세포 내에 본 발명의 단백질이 생산되는 경우에 이 배양액을 원심분리시킨 균체를 회수하고, 이 균체를 세정한 후에, 초음파분쇄기, 렌치프레스, 만통가우린호모게나이저, 다이노밀 등으로 균체를 분쇄하여 무세포 추출액을 수득한다. 이 무세포추출액을 원심분리하여 수득된 상청 (上淸) 에서 유안암모늄 등에 의한 염석 (鹽析), 디에틸아미노에틸 (DEAE) -세파로스 등의 음이온교환크로마토그래피, 부틸세파로오스, 페닐세파로오스 등의 소수성 (疏水性) 크로마토그래피, 분자 채를 사용한 겔여과법, 등전점 전기영동 (等電點電氣泳動) 등의 전기영동법 등의 수법을 이용하여 본 발명의 단백질 정제효소 표품(標品) 을 수득할 수 있다. 세포 외에 본 발명의 단백질이 생산되는 경우, 이 배양액에서 무세포추출액에서 정제하는 것과 동일한 방법으로 본 발명의 단백질인 정제효소 표품을 수득할 수 있다.
본 발명의 4-비닐과이어콜, 바닐린 또는 바닐린산의 제조방법에는 본 발명의 형질전환체에서 유래하고, 또한 페르라산 탈탄산효소 활성을 갖는 효소원으로서, 상기 방법에 의하여 수득되는 조정제 (粗精製), 또는 정제한 본 발명의 단백질 이외에, 본 발명의 형질전환체인 배양물, 균체, 균체처리물 등을 사용할 수 있다. 균체처리물로는 세정균체, 동결건조균체, 아세톤처리균체 등의 물리화학적, 생화학적으로 처리된 균체 등을 들 수 있다.
효소원은 수성매체 중에 통상적으로는 페르라산 탈탄산효소의 효소량 단위로 서 0.1 ~ 1000 단위/㎖ 의 농도범위에서 사용된다.
또한, 페르라산 탈탄산효소의 효소량 단위는 페르라산을 기질 (基質) 로 하여 50 mM 인산완충액 (pH 5.0) 중에서, 30℃, 1 시간 동안 반응을 행한 경우에 1 nmol 의 4-비닐과이어콜을 생성하는 효소량을 각각 ℓ 단위로 표시한다.
효소원으로 배양물, 균체 또는 균체처리물을 이용하는 경우에는 균체를 그대로 사용할 수도 있으나, 배양물 중에 세틸필리디움클로라이트, 세틸트리메틸암모늄브로마이드 등의 계면할성제 또는 톨루엔이나 크실렌 등의 유기용제를 첨가한 것을 이용하거나 아세톤처리균체를 이용할 수도 있다. 배양물 중에 계면활성제 또는 유기용제를 첨가하는 경우, 그 첨가량은 각각 0.05 ~ 1.0 % (w/v) 또는 1 ~ 20 % (v/v) 일 수 있다.
페르라산은 수성매체 중에 0.01 ~ 10 g/1 의 농도범위에서 통상적으로 사용된다.
반응은 배양물, 균체 또는 균체처리물의 양 및 페르라산의 양에 따라 다르나, 20 ~ 60℃, pH 2.5 ~ 10.0 에서 1 ~ 70 시간 동안 행해진다.
이렇게 하여 수득되는 이 수성매체 중에는 4-비닐과이어콜이 존재한다. 반응종료 후에 이 수성매체에서 배양물, 균체 또는 균체처리물 등을 필요에 다라 분쇄한 후에 침전물을 원심분리 등의 수단으로 제거하고, 수득되는 상청에서 추출, 증류, 각종 크로마토그래피, 재결정 등의 통상적인 방법을 사용하여 4-비닐과이어콜을 단리, 정제할 수 있다.
바닐린 또는 바닐린산은 이 수성매체 중 또는 이 수성매체에서 단리, 정제된 4-비닐과이어콜을, 예를 들어 에어레이션 등에 의하여 강제산화시키거나, 바실루스·섭틸리스 (B. subtilis), 콜리네박테리움·글루타미컴 (Corynebacterium Glutamicum) 등의 균체로 산화시킴 [저널·오브·인더스트리얼·마이크로바이올로지 (J. Ind. Microbiol),15, 457-471 (1995)] 으로써 바닐린 또는 바닐린산으로 변환시킬 수 있다.
바닐린 또는 바닐린산은 4-비닐과이어콜을 단리, 정제하는 방법과 동일한 방법을 이용하여 단리, 정제할 수 있다.
본 발명의 단백질을 이용한 증류주의 제조방법으로는 본 발명의 형질전환체에서 유래하고, 또한 페르라산 탈탄산효소 활성을 갖는 효소원을 전국 내에 페르라산 탈탄산효소의 효소량 단위로 하여 0.1 ~ 50 단위/㎖가 될 때까지 첨가하는 것 이외에는 탄소원을 누룩곰팡이 또는 당화효소로 당화시키고 효모를 첨가하여 알코올 발효시킨 후에 증류하는, 통상적인 증류주 제조방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 효모를 이용하는 증류주의 제조방법으로는 페르라산 탈탄산효소 활성을 증대시킨 효모를 이용하는 것 이외에는, 탄소원을 누룩곰팡이 또는 당화효소로 당화시키고 효모를 첨가하여 알코올 발효시킨 후에 증류하는, 통상적인 증류주 제조방법을 사용할 수 있다.
페르라산 탈탄산효소 활성을 증대시킨 효모란, 숙주세포 또는 친주 (親株) 가 되는 효모에 유전자 재조합기술, 돌연변이기술 등을 실시하여 수득되는, 숙주세포 또는 친주가 되는 효모에 비하여 페르라산 탈탄산효소 활성이 증대된 효모를 말한다.
유전자 재조합기술을 이용할 경우, 페르라산 탈탄산효소 활성을 증대시킨 효모는 페르라산 탈탄산효소를 코딩하는 유전자, 예를 들어 본 발명에 사용되는 유전자, 바실루스·푸미루스의 FDC 유전자 등을 함유하는 재조합 벡터를 상기 방법으로 만들고, 이것을 상기 방법에 의하여 숙주세포에 형질전환시킴으로써 제조할 수 있다.
돌연변이기술을 이용할 경우, 페르라산 탈탄산효소 활성을 증대시킨 효모는 친주에 자외선 조사 또는 에틸메탄술포네이트, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 등의 변이유발제를 처리하는 등, 통상적인 변이수단으로 변이시키고 수득된 변이주를 상기 페르라산 탈탄산효소 활성이 부여된 효모를 선택하는 방법과 동일한 방법으로 제조할 수 있다. 친주를 변이처리한 후에 친주가 충분히 성장할 수 없을 정도의 농도의 페닐아크릴산을 함유하는 배지, 예를 들어 페르라산을 1 mM 이상 함유하는 배지에서, 친주에 비하여 성장 가능성이 있는 변이주를 선택하면 페르라산 탈탄산효소 활성을 증대시킨 효모를 효율적으로 제조할 수 있다.
페르라산 탈탄산효소 활성을 증대시킨 효모를 제조하기 위하여 사용되는 숙주세포 또는 친주로는, 증류주 제조에 사용되는 효모일 경우 어떠한 효모도 사용할 수 있으나, 바람직하게는 사카로마이세스속에 속하는 효모, 더욱 바람직하게는 사카로스마이세스·세레비제에 속하는 효모를 사용할 수 있다. 또한 숙주세포로는, 페르라산 탈탄산효소 활성을 실질적으로 갖지 않는 사카로스마이세스·세레비제에 속하는 효모, 예를 들어 일본양조협회 7 호, 일본양조협회 9 호, K9 H14 주 (이상, 청주, 소주효모), IFO 2112, IFO 2114, IFO 2115 (이상, 위스키 효모) 를 사용하면 현저한 효과를 얻을 수 있다.
예를 들어 페르라산 탈탄산 효소 활성을 실질적으로 갖지 않는 효모를 숙주세포로 할 경우에는 본 발명의 형질전환체를 만드는 방법과 동일한 방법을 이용하여 만든 형질전환체에 기질로서 페르라산을 첨가하고, 관능적으로 또는 고속액체 크로마토그래피 등의 기기를 사용하여 정량적으로 4-비닐과이어콜을 검출하여 4-비닐과이어콜의 생성을 확인할 수 있었던 주를 선택함으로써 본 발명의 효모를 만들 수 있다.
상기 방법에 의하여 만들어진 본 발명의 효모로는 예를 들어 사카로스마이세스·세레비제 YSA7 주 (이하, YSA7 주로 표기) 를 들 수 있다. YSA7 주는 부다페스트조약에 따라 96 년 12 월 11 일부로 통산산업성 공업기술원 생명공학 기술연구원 (이바라기현 쓰쿠바시 히가시 1 쵸메 1 방 3 고) 에 FERMBP-5772 로 기탁되었다.
YSA7 주가 페르라산 탈탄산 효소 활성을 증대시킨 효모인 것을 이하에서 나타내었다.
[시험예 1] 페르라산 탈탄산 효소 활성
10 ㎖ 의 YPD 배지가 들어 있는 시험관에 YSA7 주, 그 친주인 K9 H14 주, K9 H14 주에 YEp24 를 도입한 형질전환체인 K9 H14-C 주를 각각 1 백금이식균 (白金耳植菌) 하여 30℃ 에서 22 시간 동안 진탕 배양하고, 수득된 배양액 0.9 ㎖ 에 1 g/1 페르라산용액을 0.1 ㎖ 첨가하고, 25℃ 에서 22 시간 동안 정치배양하였다. 배양종료 후, 배양액 상청 중의 4-비닐과이어콜함량을 이하에 나타내는 조건에서 고속액체 크로마토그래피로 정량 (定量) 하였다.
칼럼 : Wakosil 5C 18-200 (i. d. 4.6 × 250 ㎜)
칼럼온도 : 50℃
이동상 (移動相) : 10 mM 인산완충액 (pH 2.5)/메탄올 = 50/50 (v/v)
검출기 : 형광검출기 (Ex 280 ㎚, Em 320 ㎚)
시료 : 배양액 상청을 이동상으로 10 배 희석하고, 10 ㎕ 주입
결과를 제 1 표에 나타내었다.
균주 4-비닐과이어콜 생성량(ppm)
YSA7 주 4.88
K9 H14 주 Trace
K9 H14-C 주 Trace
상기 방법에 의하여 만들어진 페르라산 탈탄산 효소 활성을 증대시킨 효모를 이용한, 본 발명의 증류주의 제조방법을 이하에서 나타낸다.
탄소원으로는, 어떠한 당질 및 전분질도 사용할 수 있으나, 바람직한 것은 쌀, 보리, 조, 옥수수, 수수, 피, 기장 등의 곡류, 감자류, 메밀, 포도, 사과 등의 과실 또는 이것들에서 만들어진 누룩이며, 더욱 바람직한 것은 곡류 또는 이것들에서 만들어지는 누룩이 사용된다.
누룩곰팡이로는 쌀누룩, 보리누룩, 밀기울누룩 등에 사용되는 실형태의 균, 예를 들어 아스페르길스 (Aspergillus) 속, 리조퍼스 (Rhizopus) 속에 속하는 미생물이 사용된다.
당화효소로는 맥아에 함유되는 효소, 누룩곰팡이가 생산되는 효소, 또는 α아미라제, 글루코아미라제, 프로테아제 등의 효소제 등이 사용된다.
알코올발효로는 이하의 방법이 예시된다. 곡류를 사용할 경우에는 곡류인 전분질을 먼저 당화효소로 당분으로 분해하고, 이어서 효모를 첨가하여 발효시키는 병행 복발효 (竝行複醱酵) 를 행한다. 예를 들어 소주의 제조 시에는 일반적으로 발효를 개시할 때 누룩을 넣고 발효의 경과와 함께 나머지 탄소원을 추가하여 1 차 투여, 2 차 투여하는 단투여 (段投與) 를 행한다. 위스키 제조 시에는 일반적으로 맥아에 온도를 주어 당화시키고, 수득된 맥즙을 발효시키는 방법으로 행한다.
알코올발효는 통상적으로 pH 3.5 ~ 5.0, 온도 5 ~25℃, 투여종료 후부터 소주는 7 ~ 14 일 동안, 위스키는 3 ~ 4 일 동안, 브랜디는 7 ~ 14 일 동안 행한다.
알코올발효는 발효종료 후, 수득된 전국을 압착여과 또는 원심분리에 의하여 발효잔류물, 효모균체 등을 분리하여 수득된 액을 증류시킴으로써 에탄올 농축된 원주 (原酒) 의 형태로 한다. 전국을 압착여과 또는 원심분리시키기 전에 전국에 알코올을 첨가하고 이것을 원주로 할 수도 있다. 원주를 그대로 또는 혼합, 희석, 알코올 첨가 등으로 조정하여 알코올음료 형태로 한다.
이하에 실시예를 나타낸다.
[실시예 1]
페르라산 탈탄산효소를 코딩하는 유전자의 클로닝
(1) K9 H14 주에 대한 ura3 변이의 부여
청주 (소주) 효모인 사카로마이세스·세레비제 일본양조협회 9 호 (일본양조협회) 의 일배체주 (一倍體株) 이고, 또한 페르라산 탈탄산 효소 활성을 실질적으로 갖지 않는 주인 K9 H14 주에 플라스미드를 도입하기 위한 메이커 (maker) 로써, 보크(Boeke)등의 방법 [몰레큘러·앤드·제너럴·제네틱스 (Mol. Gen. Genet.), 197, 345 - 346 (1984)] 에 따라 ura3 변이를 부여하였다. 즉, K9 H14 주를 YPD 배지에 1 백금이식균하고 30℃ 에서 밤새 진탕 배양하였다. 수득된 배양액 100 ㎕ 을 FOA 플레이트 [0.67 % 의 이스트나이트로젠베이스 W/O 아미노산 (디프코사 제품), 0.1 % 의 5-플루오로오로틴산, 0.005 % 의 우라실, 2 % 의 글루코오스, 2 % 의 한천] 에 도포하고, 30 ℃ 에서 3 일간 배양했다. 배양 종료 후, 발생한 콜로니 중에서, 우라실 요구성이나 URA3 을 도구로써 갖는 플라스미드 YCp50 으로 형질전환된 경우에 우라실 요구성이 상보되며, 또한 페르라산 탈탄산 효소 활성이 없는 1 균주를 선발하여 K9 H14-3u 주로 하였다. 또한, 발효능 등의 성질에 대하여 K9 H14-3u 주는 K9 H14 주와 동등한 성질을 갖는다.
(2) 클로닝
와인효모 W3 주의 염색체를 BamHI 로 부분분해된 DNA 단편을 플라스미드 YCp50 의 BamHI 부위에 삽입하고, 유전자 라이브러리를 만들었다. 유전자 라이브러리를 이용하여 K9 H14-3u 주를 형질전환하고 우라실 비요구성으로 형질전환체를 선발하였다. 수득된 형질전환체를 YPD 액체배지에서 30℃ 에서 밤새 진탕 배양하고 수득된 배양액 0.9 ㎖ 에 1 g/1 페르라산용액 0.1 ㎖ 를 첨가하고 25℃ 에서 22 시간 동안 배양하였다. 배양종료 후, 배양액 냄새를 맡고 훈연(熏煙) 냄새가 강한 배양액을 선발하고, 배양액 상청을 고속액체 클로마토그래피를 행하여 4-비닐과이어콜의 생성을 확인하였다.
이 배양액에서 수득된 주를 페르라산 탈탄산활성이 부여된 주로 분할하고 그 주에서 재조합체인 플라스미드 pSA 11 를 추출하였다.
플라스미드 pSA11 에는 BamHI ~ BamHI 의 약 4 Kbp 의 DNA 단편이 삽입되어있었다. 플라스미드 pSA11 를 각종 제한효소로 절단하고, 수득된 DNA 단편을 전기영동으로 분리하여 분자량을 측정하고, 도 1 에서 나타낸 바와 같이 제한효소 지도를 작성하였다.
(3) 염기배열의 결정
플라스미드 pSA11 에 삽입되어 있는 BamHI ~ BamHI 의 4 Kbp 의 DNA 단편의 염기배열을 다이데옥시법 및 DNA 시이퀀서 (파르마시아 LKB 사 제품, ALP DNA 시이퀀서 Ⅱ) 를 이용하여 결정하였다. 그 결과, 서열 1 로 표시되는 염기배열로 이루어지는 유전자 (이하, FDC1 유전자로 표기) 를 오픈·리딩·프레임으로 포함하는, 서열 2 로 표시되는 염기배열이 결정되었다. 결정된 염기배열에서 예상되는 FDC1 유전자가 코딩하는 단백질은, 503 아미노산 잔여부로 이루어지는 것이었다. 서열 1 로 표시되는 이 염기배열은 효모 게놈프로젝트 [예를 들어 인터넷 http://genome-www.stanford. edu/sacchdb/] 에 의하여 공개되어 있는 염기배열 중에서, 제 IV 번 염색체의 배열 1512140 ~ 1513651 에 위치하는 염기배열과 동일한 것이었다. FDC1 유전자와 바실루스·퍼미러스의 FDC 유전자 [Appl. Environ. Microbiol.,61, 4484-4486 (1995)] 및 사카로스마이세스·세레비제의 페르라산 탈탄산효소를 코딩하는 유전자 (이하, PAD 1 유전자로 표기) [Gene, 142, 107-112 (1994)]를 DNASIS ver3.0 (히타치 소프트웨어 엔지니어링 제품) 을 이용하여 심플호몰로지를 해석한 결과, 전염기배열에서 각각 30 % 및 41 %, 염기배열을 번역하여 수득되는 전아미노배열기에서 각각 11.25 % 및 10.37 % 의 호몰로지밖에 없었다. 또한, BLAST 법에 의한 호몰로지 검색 [예를 들어 게놈네트의 데이터베이스 이용법, 쿄오리쓰 출판 (1996)] 을 행한 결과, FDC1 유전자와 바실루스·퍼미러스의 FDC 유전자 및 PAD1 유전자는 가능성이 있는 호몰로지를 발견할 수 없었다.
[실시예 2]
페르라산 탈탄산 효소 활성을 부여한 소주효소의 제작
(1) FDC1 유전자 발현용 플라스미드의 조제
약 5 μｇ 의 플라스미드 pSA11 을 H 완충액 [50 mM 트리스 염산완충액 (pH 7.5), 10 mM 염화마그네슘, 1 mM 디티오레이톨, 100 mM 염화나트륨] 20 ㎕ 에 용해시키고 10 단위의 제한효소 BamHI 및 SalI 을 첨가하여 37℃ 에서 밤새 반응시켰다. 반응생성물을 0.8 % 아가로스 전기영동으로 분리하여 약 3.6 kb 의 DNA 단편을 절단하고, GENECLEAN Ⅱ키트 (바이오 101 사 제품) 를 이용하여 추출정제하였다. 또한 플라스미드 pSA11 를 효모-대장균 셔틀벡터 YEp 24 에 대신하는 것 이외에는 상기와 동일한 방법을 이용하여 약 7.7 kbp 의 DNA 단편을 추출정제하였다. 플라스미드 pSA11 에서 유래하는 약 3.6 kbp 의 DNA 단편 1 μg 과 YEp24 에서 유래하는 약 7.7 kbp 의 DNA 단편 0.1 μg 으로 Ligation kit (타카라 슈우조) 를 이용하여 16℃ 에서 밤새 연결반응시켰다. 반응종료 후, 반응액 5 ㎕ 을 이용하여 컨피턴트·셀E.coliJM109 주 (토오요오호오사 제품) 를 형질전환시켰다. 수득된 형질전환 주를 안피실린 LB 한천배지 [1 % 박토토리프톤 (디후코사 제품), 0.5 % 효모엑기스, 1 % 염화나트륨, 1.5 % 한천, 50 μg/㎖ 안피실린] 에 도포하고 37℃ 에서 20 시간 동안 배양하였다. 배양종료 후, 발생한 콜로니를 단리하고 이것을 배양하여 수득된 플라스미드 DNA 을 추출정제하였다. 수득된 플라스미드를 제한효소 BamHI, SalI 로 절단하고 약 3.6 Kbp 의 DNA 단편을 확인할 수 있었던 것을 발현용 플라스미드 pSA 8 로 하였다 (도 2).
(2) FDC1 유전자의 소주효모에 대한 도입과 발현
K9 H14-3u 주를 YPD 배지 100 ㎖ 가 든 삼각 플라스크에 접종하고, 30℃ 에서 2 ~ 4 ×107세포/㎖ 가 될 때까지 진탕 배양하였다. 배양종료 후, 원심분리 (2500 rpm, 5 분) 로 균을 모으고, 수득된 균체를 아세트산리튬법으로 플라스미드 pSA8 에 접촉시켰다. 플라스미드 pSA8 에 접촉시킨 K9 H14-3u 주를 SD 한천배지 (0.67 % 이스트·질소·염기 W/O 아미노산, 2 % 글루코오스, 2 % 한천) 상에 접종시키고 30℃ 에서 2 ~ 5 일 동안 배양시켰다. 배양종료 후, 발생한 콜로니 중의 하나에서 K9 H14-3u 주의 우라실 요구성이 상보된 형질전환체인 YSA7 주를 취득하였다.
YSA7 주, K9 H14 주 및 K9 H14-C 주를 각각 YPD 배지 중에 접종하여 30℃ 에서 밤새 배양하고, 수득된 배양액 0.9 ㎖ 에 1 g/1 페르라산용액을 0.1 ㎖ 첨가하여 25℃ 에서 22 시간 동안 정치배양하였다. 배양종료 후, 배양액 상청 중의 4-비닐과이어콜 함량을 고속액체 크로마토그래피로 정량시킨 결과, K9 H14 주, K9 H14-C 주에서는 4-비닐과이어콜은 거의 생성되지 않았으나, YSA7 주에서는 4-비닐과이어콜의 생성을 확인할 수 있었다.
[실시예 3]
쌀소주의 제조
YSA7 주, K9 H14 주 및 K9 H14-C 주에 대하여 각각 총쌀 840 g 으로 쌀소주의 소량투여 제조를 실시했다. 투여배합을 표 2 에 나타내었다.
1 차 투여 2 차 투여 3 차 투여
총 쌀(g) 280 560 840
가케고메 (掛米)(g) 280 - 280
누룩쌀(g) - 560 560
급수(汲水)(㎖) 400 800 1200
알코올발효를 20℃ 에서 2 차 투여하고 10 일 동안 행한 후, 수득된 전국을 증류시켜 쌀소주를 제조하였다.
제조한 쌀소주는 국세청의 소정분석법에 따라 성분을 분석했다. 각각의 효모를 이용하여 제조한 쌀소주에 대하여 고속액체 크로마토그래피를 이용하여 에탄올함량 및 4-비닐과이어콜함량을 측정하고, 패널 7 인이 관능 평가하였다.
결과를 제 3 표에 나타내었다. 또한, 관능평가의 평점은 7 인의 평균점으로 하였다.
YSA 7 주 K9 H14 주 K9 H14-C 주
에탄올(%) 34.6 34.6 34.6
4VG (ppm) 2.0 0.8 0.8
관능평가* 2.5 3.0 3.0
* 5 점평가법 (1 : 양호, 5 : 불량)
제 3 표에 나타낸 바와 같이 YSA7 주를 이용하여 제조한 쌀소주는, 그 친주인 K9 H14 주를 이용하여 제조한 쌀소주보다도 4-비닐과이어콜함량이 매우 높아 관능적으로도 특징이 있는 향미를 갖고 있었다.
본 발명에 의면 향미가 우수한 증류주의 제조에 유용한 페르라산 탈탄산효소를 제공할 수 있다.
[서 열]
서열번호 : 1
배열길이 : 1512
배열형 : 핵산
고리의 수 : 일선 고리
트보로지 : 직선고리상
배열 종류 : 게놈 DNA
기원
생물명 : 사카로마이세스·세레비제 (Saccharomyces cerevisiae)
주명 : YSA7
배열의 특징
특징을 표시하는 기호 : CDS
존재위치 : 1.. 1512
배열을 결정짓는 방법 : E
서열번호 : 2
배열길이 : 3930
배열형 : 핵산
고리의 수 : 일선 고리
트보로지 : 직선고리상
배열 종류 : 게놈 DNA
기원
생물명 : 사카로마이세스·세레비제 (Saccharomyces cerevisiae)
주명 : YSA7
배열의 특징
특징을 표시하는 기호 : CDS
존재위치 : 532.. 2043
배열을 결정짓는 방법 : E
배열의 특징
특징을 표시하는 기호 : cleavage-site
존재위치 : 1..6,3925..3930
기타 정보 : BamHI 절단부위
특징을 결정짓는 방법 : S
배열의 특징
특징을 표시하는 기호 : cleavage-site
존재위치 : 656..661
기타 정보 : StuI 절단부위
특징을 결정짓는 방법 : S
배열의 특징
특징을 표시하는 기호 : cleavage-site
존재위치 : 1527..1732
기타 정보 : SpeI 절단부위
특징을 결정짓는 방법 : S
배열의 특징
특징을 표시하는 기호 : cleavage-site
존재위치 : 3555..3600
기타 정보 : SalI 절단부위
특징을 결정짓는 방법 : S

Claims (12)

  1. 하기 (a) 또는 (b) 의 단백질 :
    (a) 서열 1 로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질,
    (b) 아미노산 배열 (a) 에 있어서 아미노산이 결여, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 페르라산 탈탄산 효소 활성을 갖는 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서, 단백질을 코딩하는 유전자.
  3. 제 2 항에 있어서, 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
  4. 제 3 항에 있어서, 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체.
  5. 제 3 항에 있어서 재조합 벡터를 포함하는 효모.
  6. 제 4 항에 있어서, 형질전환체에서 유래하고 또한 페르라산 탈탄산 효소 활성을 갖는 효소원의 존재 하에, 수성매체 중에서 페르라산을 반응시켜 수성매체 중에 생성된 4-비닐과이어콜, 바닐린 또는 바닐린산을 채취하는 것을 특징으로 하는, 4-비닐과이어콜, 바닐린 또는 바닐린산의 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 효소원이 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 4 항의 형질전환체의 배양물, 균체, 균체처리물인 방법.
  8. 전국 내에서 제 4 항에 기재된 형질전환체에서 유래하고 또한 페르라산 탈탄산 효소 활성을 갖는 효소원을 첨가하는 것을 특징으로 하는 증류주의 제조방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 효소원이 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 4 항에 기재된 형질전환체의 배양물, 균체, 균체처리물인 증류주의 제조방법.
  10. 페르라산 탈탄산 효소 활성을 증대시킨 효모를 이용하는 것을 특징으로 하는 증류주의 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 페르라산 탈탄산 효소 활성을 증대시킨 효모가 페르라산 탈탄산효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 포함하는 효모인 증류주의 제조방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 페르라산 탈탄산 효소 활성를 증대시킨 효모가 제 5 항에 기재된 효모인 증류주의 제조방법.
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