KR102593901B1 - 제약-등급 20-히드록시엑디손 추출물, 그의 용도 및 그의 제법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 대략 90% 순수한 20-히드록시엑디손의 제제로부터의 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다: g) 메탄올 중 대략 90% 순수한 20-히드록시엑디손의 고온 용해, 여과 및 부분 농축, h) 1 내지 5 부피의 아세톤의 첨가, i) 교반하면서, 0 내지 5℃의 온도로 냉각, j) 수득된 침전물의 여과, k) 아세톤과 물로 연속 세정, 및 l) 건조.

Description

제약-등급 20-히드록시엑디손 추출물, 그의 용도 및 그의 제법

본 발명은 포유동물에서 동화작용 효과를 갖는, 정제된 20-히드록시엑디손 (20E)의 추출물, 및 특히 포유동물에서 근육량 및 근육의 힘뿐만 아니라 이동성을 증가시킴으로써 근육 기능의 개선을 위한 그의 치료학적 용도에 관한 것이다.

보다 특히 본 발명은 근육감소증 포유동물에서 또는 즉 수술 절차 후에 고정화되거나 즉 유전 기원의 근이영양증을 앓고 있는 포유동물에서 근육 기능의 저하를 개선 및/또는 방지할 수 있게 한다.

게다가, 본 발명은 20E의 대사 효과를 통해, 심혈관 질환 및 당뇨병을 포함한 심장-대사 질환을 퇴치할 수 있게 한다.

피토엑디손은 폴리히드록실화 스테롤의 주요 패밀리를 나타낸다. 이들 분자는 다양한 식물 종 (양치류, 겉씨식물, 속씨식물)에 의해 생성되며 특히 해충으로부터 이들 식물을 방어하는 데 관여한다.

다양한 식품 보충제에서 제안된 피토엑디손은, 자연에서의 그의 풍부함, 및 그의 화학적 합성의 곤란을 고려해 볼 때, 이 목적으로 재배된 식물로부터 추출된다. 이들 식물은 피토엑디손의 복잡한 칵테일 (예를 들어 [Bathori et al., 1999; Kokoska & Jankovska, 2009])을 생산하며 그의 추출물은 대부분의 20E뿐만 아니라 마이너(minor)로 칭해지는 피토엑디손의 세트, 뿐만 아니라 다른 화학적 패밀리에 속하는 구성요소를 함유하며, 피토엑디손의 합은 제제에 따라 추출물의 5 내지 90%를 나타낸다.

마이너 피토엑디손의 본질은 원료로서 사용된 식물 (Hunyadi et al., 2016), 수확이 수행되는 계절, 또는 심지어 이들이 재배되는 지역 (토양, 기후)에 의존하므로, 배치(batch)마다 실질적으로 변할 수 있다. 이들 변형은 정제 동안에 점진적으로 약화된다.

문헌의 데이터는 20E를 약간 세포 독성이 있는 것으로 기재하나, 이것이 순수한 분자에 적용되는 경우, 불완전하게 정제된 제제에 대해서는 사실이 아니다.

약물의 맥락에서 근육의 질에 20E의 유익한 효과의 이용을 목표로, 20E의 제약-등급 추출물을 이용 가능하게 하는 것이 필요하다.

90%로 정제된 추출물로부터의 20E (≥ 97%)의 제약-등급 추출물은 현재 크로마토그래피 방법 (BPLC, HPLC)의 이행에 의해서만 수득된다. 문헌 [Toth and Bathori (2008)]에 개시된 것과 같은 이들 방법은, 대략 몇 그램의 추출물의 양을 생산하는데 적합화된다.

본 발명의 목적

본 발명은 식물의 추출물 또는 식물 부분의 추출물을 목표로 하며, 상기 식물은 상기 식물의 건조 중량을 기준으로 적어도 0.5%의 20-히드록시엑디손을 함유하는 식물로부터 선택되고, 여기서 상기 추출물이 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%의, 20-히드록시엑디손을 포함하는 것을 특징으로 한다.

이하 BIO101로도 지칭되는, 본 발명에 따른 추출물은, 상기 추출물의 제약 용도의 안전성, 이용가능성 또는 유효성에 영향을 미칠 수 있는 불순물, 예컨대 마이너 화합물을 현저한 방식으로 함유하지 않는다.

본 발명의 한 특징에 따르면, BIO101이 없는 불순물은 19 또는 21개의 탄소 원자를 가진 화합물, 예컨대 루브로스테론, 디히드로루브로스테론 또는 포스트스테론이다.

BIO101이 생산되는 식물은 스템마칸타 카르타모이데스(Stemmacantha carthamoides) (류제아 카르타모이데스(Leuzea carthamoides)로도 지칭됨), 시아노티스 아라크노이데아(Cyanotis arachnoidea) 및 시아노티스 바가(Cyanotis vaga)로부터 유리하게 선택된다. 본 발명은 보다 특히 이들 식물의 뿌리로부터 BIO101을 수득하는 것을 목표로 한다.

본 발명은 특별히 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%의, 20-히드록시엑디손을 포함하는 스템마칸타 카르타모이데스의 뿌리 추출물에 관심이 있다.

본 발명에 따른 추출물을 통해, 20E은 제약 등급으로 정제되고 BIO101은 다양한 제약 용도로 사용될 수 있다.

유리하게는, BIO101은 근육감소증 포유동물 또는 즉 수술 절차 후에 고정화되거나, 즉 유전 기원의 근이영양증을 앓고 있는 포유동물의 근육 기능의 저하를 개선 및/또는 방지하기 위해 사용되도록 의도된다. 게다가, BIO101의 사용은 20E의 대사 효과를 통해, 심혈관 질환 및 당뇨병을 포함한 심장-대사 질환을 퇴치할 수 있게 한다.

BIO101은 근육 또는 심장-대사 질병의 치료에서 사용되도록 의도된다.

매우 특히, 본 발명은 근육감소증의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%의, 20-히드록시엑디손을 포함하는 스템마칸타 카르타모이데스의 뿌리 추출물에 관한 것이다.

마찬가지로, 본 발명은 매우 특히, 특히 유전 기원의 근이영양증의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%의, 20-히드록시엑디손을 포함하는 스템마칸타 카르타모이데스의 뿌리 추출물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 매우 특히 고정화 후, 즉 수술 후 상황에서 근육량 및 근육 기능의 손실의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97%의, 20-히드록시엑디손을 포함하는 스템마칸타 카르타모이데스의 뿌리 추출물에 관한 것이다.

보다 특히, BIO101은 환자에게 1회 이상의 용량으로 200 내지 1000 mg/일의 투여량으로 사용된다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 추출물 (BIO101)을 활성제로서 포함하는 조성물에 관한 것이다.

조성물은 바람직하게는 200 내지 1000 mg의 활성제 (BIO101)를 함유한다.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 대략 90% 순수한 20-히드록시엑디손의 제제로부터 본 발명에 따른 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다:

a) 메탄올 중 대략 90% 순수한 20-히드록시엑디손의 고온 용해, 여과 및 부분 농축,

b) 3 부피의 아세톤의 첨가,

c) 교반하면서, 0 내지 5℃의 온도로 냉각,

d) 수득된 침전물의 여과,

e) 아세톤과 물로 연속 세정, 및

f) 건조.

이 정제는 이 분자에 적절하고 산업적 규모로 수행될 수 있는 재결정화의 과정을 수반한다

유리하게는, 단계 a)의 여과는 0.2 μm 입자 필터를 통해 수행된다.

단계 a)의 부분 농축은 유리하게는 MeOH의 존재하에, 대략 50℃의 온도에서, 진공 증류에 의해 수행된다.

건조의 단계 f)는 대략 50℃의 온도에서 진공하에 수행된다.

유리하게는, 본 발명의 목적인 추출물의 제조 방법은 20E의 제약-등급 추출물을 수득할 수 있게 한다. 본 발명의 목적인 추출물의 제조 방법은 산업적 규모로 작업할 수 있게 한다.

본 발명의 다른 이점, 목적 및 특정한 특징은 첨부 도면을 참조하여, 본 발명의 목적인 장치의 적어도 하나의 구체적 실시양태에 대한 다음의 비제한적인 설명으로부터 분명해질 것이며, 여기서
- 도 1은 20-히드록시엑디손 (20E)의 구조를 개략적으로 나타낸다.
- 도 2는 본 발명에 따른 20E의 정제 방법을 개략적으로 도시한다.
- 도 3은 본 발명에 따른 추출물 (BIO101)의 단일 투여를 받은 개체의 다양한 코호트의 약동학적 프로파일을 도시한다.
- 도 4는 BIO101의 만성 치료가 노령 마우스의 최대 러닝 속도에 미치는 영향을 나타내는 도표이다.

주어진 본 설명은 비제한적이다.

1. 재결정에 의한 정제 방법

이 방법은 스템마칸타 카르타모이데스로부터 추출한 20E의 제제로부터 시작하여 개발되었으나, 다른 식물에서 비롯되는 20E의 제제에도 적용할 수 있다.

초기 제제로서 사용 가능한 90%-순수한 20E에 대한 데이터 시트가 부록에 기재되어 있다.

도 2에 도시된 정제 공정은, 제1 반응기에서, 40 L의 메탄올에 10 kg의 90%- 순수한 20E의 용해로 시작되었다.

이어서, 수득된 용액을 담갈색 착색이 나타날 때까지 45-50℃로 가열하였다. 이어서 용액을 제2 반응기에서 0.2 μm 입자 필터를 통해 여과하였다. 입자 필터를 상기 제2 반응기에서 5 L의 MeOH로 세정한 후, 용액을 50℃의 온도에서 진공 증류에 의해 25 L의 부피로 농축시켰다.

80 L의 아세톤을 45-50℃에서 반용매(anti-solvent)로서 첨가하였다. 20E의 결정화는 15-20℃로 냉각하고 15-25℃에서 16 내지 18시간 동안 교반한 다음에 0-5℃로 냉각시키고 적어도 4시간 동안 교반함으로써 야기시켰다. 침전물을 여과한 다음에, 이를 0-5℃로 미리 냉각시킨 20 L의 아세톤으로 세척하고, 이를 적어도 1.5시간 동안 기체 질소의 흐름에서 건조시켰다.

제2 반응기에 이렇게 수득된 생성물을 로딩하고, 이를 잔류 아세톤을 제거하기 위해 물 20 L 중의 현탁액에 다시 넣었다. 현탁액을 15-25℃에서 2시간 동안 교반한 다음에, 입자 필터를 통해 여과하고, 물질을 20 L의 정제수로 세척한 후에 이를 50℃ 이하의 온도에서 진공하에 건조시켰다.

2. 완제품의 분석

완제품 (BIO101)을 HPLC-MS/MS에 의해 분석하였다. 마이너 구성요소를 모액으로부터 HPLC에 의해 단리한 다음에 질량 분석법 및 NMR 분석법을 통해 분석하였다. BIO101의 건조 중량으로 0.05% 이상의 양으로 존재하는 중요한 구성요소가 독점적으로 피토엑디손인 것으로 밝혀졌다. 하기 표 1에 보고된 값은 뿌리 (스템마칸타 카르타모이데스)의 원료 추출물의 4 가지 구별되는 배치 및 완제품의 4 가지 구별되는 배치에 대한 평균에 상응한다. 뿌리의 원료 추출물에 대한 데이터와 관련하여, 값은 HPLC를 통해 관찰된 피토엑디손의 합과 비교되나, 실제로는 20E는 건조된 뿌리 (n = 2)의 알콜 추출물의 건조된 잔류물 중 15-21 중량%만을 나타낸다.

<표 1>

정제 방법의 모든 단계의 종료시, 특정 피토엑디손이 제거되었다는 점이 주목된다. 게다가, 신규 화합물인 스타치스테론 B가 나타났다. 후자는 20E의 14번 위치에서 3급 히드록실 손실이 원인인 탈수 생성물에 상응한다. 이 화합물은 정제 동안에 부분적으로 제거되며, 방법 동안에 어떠한 다른 신규 생성물이 나타나지 않았다.

4개의 제거된 분자와 관련하여, 이들은 20E의 측쇄의 커팅이 원인인 분자이고 따라서 이는 21C (포스트스테론) 또는 19C (루브로스테론, 디히드로루브로스테론) 분자이다. 20E에 반해서, 이들 분자는 안드로겐 또는 에스트로겐의 핵 수용체와 상호작용할 수 있으므로 (Lapenna et al., 2015), 완제품의 간섭의 임의의 위험 또는 심지어 유해 효과를 방지하기 위해 이들을 제거하는 것이 중대하다. 이 점은 20E에 비해 감소된 극성을 갖는 이들 분자가 후자보다 훨씬 더 높은 생체이용률을 가지므로 비례적으로 훨씬 더 양호 (대략 20배 더 양호)하기 때문에 훨씬 더 중요하다.

3. BIO101의 특성화

하기 표 2는 상기 수득된 추출물의 특성화를 제시한다.

<표 2>

4. BIO101의 안정성

25℃ 및 60% 상대 습도에서 보관된 BIO101의 안정성의 모니터링은 1년 후 불순물이 나타나지 않는 것으로 밝혀졌다.

30℃ 및 65% 상대 습도에서 보관된 BIO101에 대해서도 동일한 결과를 수득하였다.

따라서 수득된 생성물은 매우 안정적인 것으로 밝혀졌으며, 이는 분해되지 않으며 바람직하지 않은 불순물을 생성하지 않는다.

6개월 동안 40℃ 및 75% 상대 습도에서 BIO101 샘플에 대한 강제-분해 시험은, 정확히는 마이너 화합물의 양과 관련하여 그의 매우 높은 농도의 활성 성분으로 인해 BIO101의 우수한 거동을 확인해 주었다.

5. 조절 독성학의 요소

파피아 글로메라타(Pfaffia glomerata)에서 비롯되는 부분 정제된 20E의 제제로 수행된 연구는 유전독성 및 세포독성인 것으로 밝혀졌다 (Neves et al., 2016a,b). 이는 식물의 알콜 추출물 (De Souza et al., 2005)에 존재하고 사용된 20E의 제제에서 불완전하게 제거된 다른 화합물의 존재로 인한 것이다.

유전독성의 측면에서, 시험관내 및 생체내에서 BIO101에 대해 현행 ICH 및 OCDE 규칙에 따라 수득된 결과는 음성이었다. 동물에서, 28일 동안 만성 노출된 래트 및 개에서 시험된 최고 용량, 또는 각각 1000 및 1500 mg/kg에서 어떠한 독성도 관찰되지 않았다. 따라서, 상기 기재된 방법에 따라 수득된 정제된 20E (BIO101)는 심지어 고용량에서도 독성이 없었다. 수많은 "안전성 약제(safety pharmaco)" 검사 (거동, SNC, 호흡 기능, hERG 검사 및 심장 원격측정)가 이 점을 확인해 주었다.

26주 동안 래트 및 개에서 2회의 GLP 시험에서 경구로 BIO101의 만성 투여는 생성물의 우수한 내약성뿐만 아니라 그의 안전성 프로파일을 확인해 주었다.

6. 인간에서 약동학적 시험

인간에서, 문헌 [Simon & Koolman (1989)], 이어서 문헌 [Brandt (2003)] 및 마지막으로 문헌 [Bolduc et al. (2008)]은 단일 용량으로, 또는 5일에 걸쳐, 각각 0.2 mg/kg*일, 10 mg/kg*일 및 434 mg/일의 용량으로, 경구 투여 후, 부분 정제된 20E의 소변 제거의 동역학을 측정하였다. 이들 연구는 이 분자의 낮은 경구 생체이용률을 밝혔다.

BIO101을 사용한 동물 및 인간에서 수행된 시험은 경구 투여 후 이 분자의 낮은 생체이용률을 확인해 주었다. 상기 시험은 섭취된 분자가, 주로 대변을 통해, 48시간 후에 완전히 제거됨을 나타냈다.

I상 임상 시험의 맥락에서, 공복시 개체에서 100, 350, 700 및 1400 mg/일의 단일 투여 (SAD) 후 BIO101의 혈장 농도를 측정하였다. 이어서 14일에 걸친 반복 투여 (MAD)를 350 mg의 1일 1회 용량 또는 350 mg 및 450 mg의 1일 2회 용량 (아침 및 저녁)으로 수행하였다. 지원자의 다양한 코호트 (n=6)에 BIO101의 이러한 투여는 BIO101의 주요 약동학적 파라미터: C_max (단일 또는 반복 후 BIO101의 최대 혈장 농도), C_min (단일 또는 반복 투여 후 BIO101의 최소 혈장 농도), T_max (단일 또는 반복 투여 후 BIO101의 최대 혈장 농도에 도달하는데 필요한 시간), 및 혈장 노출의 수준과 동의어인 AUC (곡선하 면적)를 결정할 수 있게 하였다. 이들 결과는 하기 표 3에 제시하였으며, 값은 이들이 극한 값인 T_max를 제외하고 산술 평균 (CV%)에 상응한다.

<표 3>

SAD 코호트의 평균 프로파일은 도 3에 제시하였으며, 여기서 Y는 어린 지원자이고 O는 지원자이며, 그의 연령은 65세 내지 85세이다. 이 도면은 섭취 후 2 내지 3.5시간의 T_max, 섭취 용량에 따라 증가하며, 한편 20E의 낮은 생체이용률과 24시간 후 거의 완전히 사라지는, 활성 성분의 빠른 제거에 따라 모든 경우에 낮게 유지되는 C_max를 나타낸다. 20E의 반감기는 대략 3-4시간이다.

하기 표 4는 BIO101의 반복 투여 후 약동학적 파라미터를 나타낸다. 이 표는 섭취된 화합물의 혈장 축적의 부재뿐만 아니라 사용된 용량에 의한 해독작용의 메커니즘의 유도의 부재에 따라, 반복 투여가 제1일과 제14일 사이에 매우 유사한 프로파일을 갖는다는 것을 나타낸다.

<표 4>

값은 이들이 극한 값인 T_max를 제외하고 산술 평균 (CV%)에 상응한다. 달리 지시되지 않는 한 N=8; n= 이 관찰의 대상체의 수; NA=는 해당되지 않는다. * 대상체가 10일 후에 시험을 떠났다.

이들 결과는 BIO101의 만성적 사용과 양립되며, 이는 래트에서 1000 mg/kg*d 및 개에서 1500 mg/kg*d의 용량으로 6개월 동안 매일 투여한 후 독성이 없는 것으로 또한 실증되었다

7. BIO101의 생물학적 활성

시판 제제에 존재하는 20E의 동화작용 효과는 어린 동물에서 이미 입증되었지만, 근육량의 감소 (근육감소증) 및 특별히 이동성 문제를 야기하는 그의 수행능의 감소 (운동신경감소증(dynapenia))를 수반하는 노령의 상황에서 상기 효과가 사실인지는 공지되어 있지 않다. BIO101을 노령 마우스에게 만성적으로 투여하였고 동물의 최대 러닝 속도를 측정하여 노령 동물 및 미처리 성체의 속도와 비교하였다. 이 시험은 BIO101의 동화작용/비대성 효과가 최대 러닝 속도의 증가를 특징으로 하는 기능적 개선으로 해석됨을 입증하였다

성체 (12개월) 및 노령 (22개월) C57Bl6/J 암컷 마우스를 사용하였다. 노령 마우스의 군은 BIO101를 경구로 13주 동안 50 mg/kg*일의 용량으로 받았고 또 다른 군은 비히클을 받았다. 성체 마우스를 비히클에 노출시켰다. 모든 동물을 실험의 전체 지속시간에 걸쳐 지질이 풍부한 고칼로리 식이에 노출시켰다 (4442 kcal/kg; 단백질 19.8%, 지질 23% 및 탄수화물 39.5%). 13주 처리 후, 동물의 기능적 능력 (전체 활성)을 시험하였다. 그들은 러닝 운동에 적용되었고 최대 러닝 속도를 기록하였다.

결과는 도 4에 도시하였다. 예상된 방식으로, 미처리 노령 동물은 미처리 성체 동물보다 유의하게 더 느리게 (-20%, p <0.001) 달리는 것으로 관찰되었다. BIO101을 받은 노령 동물에 관해서는, 이들은 대조군 노령 동물 (비히클)보다 유의하게 더 빠르게 (+17%, p<0.05) 달렸다.

중요하게도, BIO101을 사용한 노령 동물의 처리는 동물의 노화로 인한 러닝 속도의 유의한 손실의 대부분을 보상한다는 것이 여기서 입증되었다. 실제로, 군 노령 + BIO101 (0.558 m/s에서 95% CI = 0.471)과 미처리 성체 (0.602 m/s에서 95% CI = 0.503)의 95% 신뢰 구간의 유의한 중첩이 있다. 따라서 BIO101을 사용한 처리는 미처리 노령 동물에서 관찰된 20% 대신에, 노화와 관련된 기능적 손실을 7%로 제한할 수 있게 하였다.

이들 연구는 근육 기능에 대한 BIO101의 활성 성분의 유익한 특성 (Chermnykh et al., 1988; Gorelick-Feldman et al., 2008; Toth et al., 2008)이 노령 포유동물의 상황에서 적용되며, BIO101을 사용한 노령 동물의 만성 처리가 노화로 인한 기능적 손실을 유의하게 보상할 수 있다는 것을 입증한다.

보다 광범위하게, 그리고 근육 기능에 대한 BIO101의 특성을 고려해 볼 때, 따라서 상기 근육 기능의 악화에 영향을 미치는 질병을 치료하기 위해 BIO101의 사용이 제안될 수 있다. 이들 질병은 근육감소증, 즉 유전 기원의 근이영양증 및 고정화 후, 즉 수술 후 상황에서 근육량 및 기능의 손실을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

참고문헌의 목록

부록

원료 분석 증명서의 예

제품명: 류제아 카르타모이데스 분말 추출물

라틴명: 류제아 카르타모이데스 (야생) DC

사용된 식물 부분: 잎 / 뿌리

추출 방법: 물 및 에탄올을 사용한 추출

Claims (12)

1. 크로마토그래피를 수행하지 않고 90% 순수한 20-히드록시엑디손의 제제로부터의 추출물을 제조하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하며:
   a) 메탄올 중 90% 순수한 20-히드록시엑디손의 용해, 45-50℃로 가열, 여과 및 부분 농축,
   b) 1 내지 5 부피의 아세톤의 첨가,
   c) 교반하면서, 0 내지 5℃의 온도로 냉각,
   d) 수득된 침전물의 여과,
   e) 아세톤과 물로 연속 세정, 및
   f) 건조
   상기 추출물은 적어도 97%의 20-히드록시엑디손을 포함하고, 상기 추출물은 루브로스테론, 디히드로루브로스테론 또는 포스트스테론을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는,
   방법.
2. 제1항에 있어서,
   단계 a)의 여과가 0.2 μm 입자 필터를 통해 수행되고,
   단계 a)의 부분 농축이 MeOH의 존재하에, 50℃의 온도에서, 진공 증류에 의해 수행되고,
   단계 f)의 건조가 50℃의 온도에서 진공하에 수행되는 것인
   방법.
3. 삭제
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